OVĚŘENÍ CELKOVÉHO DEKLAROVANÉHO POČTU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ VE VYBRANÝCH FARMACEUTICKÝCH PREPARÁTECH

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin

OVĚŘENÍ CELKOVÉHO DEKLAROVANÉHO POČTU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ VE VYBRANÝCH FARMACEUTICKÝCH PREPARÁTECH Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce:

Vypracovala:

Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D.

Bc. Simona Pokorná

Brno duben 2012

zadání

Prohlášení Prohlašuji, deklarovaného

že

jsem

celkového

zadanou počtu

diplomovou probiotických

práci

na

bakterií

téma ve

„Ověření vybraných

farmaceutických preparátech“ vypracovala samostatně za použití literárních pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně dne ……...………………….. Podpis autora diplomové práce…………………………..

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí mé diplomové práce Ing. Doubravce Rožnovské Ph.D. za odborné vedení. Velké poděkování patří také Ing. Pavle Sládkové Ph.D. za poskytnutou pomoc, ochotu, trpělivost a čas, který mi věnovala při zpracování této diplomové práce. Nemalé poděkování bych chtěla vyjádřit i celé mé rodině a přátelům, kteří mi byli po celou dobu studia oporou.

ABSTRAKT Probiotika jsou živé mikroorganismy, které při konzumaci v dostatečném množství příznivě ovlivňují střevní mikroflóru hostitele, čímž vykazují dobrý vliv na lidské zdraví. Probiotické bakterie se na našem trhu nacházejí jako součást mnoha potravin, především pak zakysaných mléčných výrobků nebo jako farmaceutické doplňky stravy. Hlavním úkolem této práce bylo zajistit osm různých farmaceutických preparátů s obsahem probiotik. U těchto výrobků byly stanoveny počty mikroorganismů pomocí kvantitativních a kvalitativních kultivačních metod a výsledky následně porovnány s celkovými

deklarovanými

Analyzovanými

počty

mikroorganismy

bakterií byly

uváděnými

bakterie

rodu

výrobcem

na

Bifidobacterium,

obalu. rodu

Lactobacillus, z něj pak druhy L. acidophilus, L. casei a L. rhamnosus, dále pak druhy Streptococcus thermophilus a Bacillus coagulans. Ve farmaceutických produktech byly detekovány všechny zkoumané probiotické mikroorganismy, které výrobce uváděl na obalu. Avšak jejich zjištěné počty u všech preparátů kromě jediného neodpovídaly počtům deklarovaných výrobcem.

Klíčová slova: probiotika, doplňky stravy, Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Bacillus coagulans

ABSTRACT Probiotika are live micro-organisms which when ingested in sufficient quantities, favourably affect the intestinal microflora host, thereby showing a good influence on human health. Probiotické bacteria in our market are located as part of many foods, particularly fermented of milk products or as pharmaceutical supplements. The main task of this work was to ensure eight different pharmaceutical preparations containing probiotik. These products have been laid down, the numbers of microorganisms using quantitative and qualitative cultivation methods and results were subsequently compared with the total numbers of bacteria indicated by the manufacturer, as declared on the packaging. Bacteria of the genus that have microorganisms have been of the genus Bifidobacterium, Lactobacillus from him, then the species L. acidophilus, L. casei and L. rhamnosus, species of Streptococcus thermophilus and Bacillus coagulans. In pharmaceutical products were detected by all the probiotické micro-organisms which producer claimed on the package. But the numbers for all products except one did not correspond to those declared by the manufacturer.

Keywords: probiotika, supplements, Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Bacillus coagulans

OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 10 2.1 Funkční potraviny................................................................................................... 10 2.2 Probiotika ................................................................................................................ 12 2.2.1 Probiotika – definice slova ................................................................................ 12 2.2.2 Požadované vlastnosti a podmínky působení probiotik ..................................... 13 2.2.3 Příznivé účinky probiotik na zdraví ................................................................... 14 2.2.4 Hodnocení bezpečnosti probiotik ...................................................................... 16 2.2.5 Legislativa a označování probiotik .................................................................... 17 2.2.6 Bakterie mléčného kvašení ................................................................................ 18 2.3 Charakteristika vybraných rodů a druhů probiotických bakterií..................... 19 2.3.1 Rod Lactobacillus .............................................................................................. 20 2.3.1.1 Lactobacillus acidophilus..................................................................................................... 22 2.3.1.2 Lactobacillus casei ............................................................................................................... 23 2.3.1.3 Lactobacillus rhamnosus ...................................................................................................... 24

2.3.2 Rod Bifidobacterium .......................................................................................... 25 2.3.3 Rod Streptococcus ............................................................................................. 26 2.3.3.1 Streptococcus thermophilus.................................................................................................. 27

2.3.4 Rod Bacillus ....................................................................................................... 28 2.3.4.1 Bacillus coagulans ............................................................................................................... 28

2.4 Formy probiotických preparátů na trhu .............................................................. 29 2.4.1 Potraviny s obsahem probiotik .......................................................................... 29 2.4.2 Probiotické doplňky stravy ................................................................................ 31 2.5 Vybrané identifikační metody probiotických mikroorganismů ......................... 34 2.5.1 Kultivační metody.............................................................................................. 34 2.5.2 Biochemické metody ......................................................................................... 35 2.5.3 Molekulárně – biologické metody ..................................................................... 35 3 CÍL PRÁCE................................................................................................................ 38

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ..................................................................................... 39 4.1 Materiál.................................................................................................................... 39 4.1.1 Použité farmaceutické probiotické preparáty .................................................... 39 4.1.2 Použité chemikálie ............................................................................................. 44 4.1.3 Použité pomůcky................................................................................................ 44 4.2 Metodika .................................................................................................................. 45 4.2.1 Kultivační média ................................................................................................ 45 4.2.1.1 Stanovení rodu Lactobacillus (ČSN ISO 560642) ............................................................... 45 4.2.1.2 Stanovení druhu Lactobacillus acidophilus (ČSN ISO 560642) .......................................... 46 4.2.1.3 Stanovení druhu Lactobacillus rhamnosus (ČSN ISO 560642) ........................................... 48 4.2.1.4 Stanovení druhu Lactobacillus casei (ČSN ISO 560642) .................................................... 49 4.2.1.5 Stanovení rodu Bifidobacterium (ČSN ISO 467046) ........................................................... 50 4.2.1.6 Stanovení druhu Streptococcus thermophilus (ČSN ISO 9232) ........................................... 51 4.2.1.7 Stanovení druhu Bacillus coagulans (ČSN EN 15784) ........................................................ 52

4.2.2 Statistické vyhodnocení ..................................................................................... 53 5 VÝSLEDKY ............................................................................................................... 54 5.1 Porovnání závislosti počtu probiotických bakterií na době skladování ............ 55 5.1.1 Vzorek č. 1 ......................................................................................................... 55 5.1.2 Vzorek č. 2 ......................................................................................................... 57 5.1.3 Vzorek č. 3 ......................................................................................................... 59 5.1.4 Vzorek č. 4 ......................................................................................................... 61 5.1.5 Vzorek č. 5 ......................................................................................................... 63 5.1.6 Vzorek č. 6 ......................................................................................................... 65 5.1.7 Vzorek č. 7 ......................................................................................................... 67 5.1.8 Vzorek č. 8 ......................................................................................................... 69 6 DISKUZE ................................................................................................................... 71 7 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 74 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...................................................................... 75

1 ÚVOD „Probiotika budou pro medicínu 21. století tím, čím byly pro medicínu 20. století antibiotika a mikrobiologie.“ Trávicí trakt člověka je osídlen řadou různorodých mikroorganismů, které se do jeho

organismu

dostávají

potravou

a

vytvářejí

tak

mikroflóru

střeva.

Gastrointestinální mikroflóra představuje vysoce složitý ekosystém. Udává se, že povrch střeva je zhruba 150 – 200 m2, přičemž pro srovnání má pokožka na povrchu našeho těla asi jen 2 m2. Tímto je tedy poskytnut nezbytný prostor pro interakce během trávicího procesu i pro kolonizaci a adhezi mikroorganismů ke střevnímu epitelu. Tyto mikroorganismy, jejichž počet je až desetinásobkem oproti počtu tělních buněk, mají řadu významných funkcí. Především pak ovlivňují metabolické procesy. Intestinální mikroflóra obsahuje mikroorganismy jak člověku prospěšné, tak i takové, které mohou jedinci škodit. Mezi těmito mikroby se vytváří rovnovážný stav. Převládnou-li bakterie patogenní, projeví se to onemocněním, které však nemusí mít souvislost pouze s onemocněním trávicího traktu člověka, ale celého jeho organismu. Kladně na mikroflóru trávicího traktu a k potlačení špatného vlivu patogenních mikroorganismů působí právě probiotické bakterie. Probiotika jsou zdraví prospěšné živé kultury, které společně s prebiotiky a symbiotiky můžeme zařadit mezi tzv. funkční potraviny. Přesněji řečeno jde o jejich funkční

složky.

Prebiotika jsou

oligosacharidy,

které fungují

jako

potrava

pro probiotické bakterie, díky nimž tyto mikroorganismy o mnoho lépe prosperují. Kombinací těchto dvou funkčních složek, tedy probiotik a prebiotik, vznikají symbiotika. V posledních letech stoupá zájem jak odborné, tak i laické veřejnosti o probiotické potraviny včetně doplňků stravy. Důvodem je fakt, že cílené užívání probiotických produktů může mít kladný vliv na lidské zdraví. Vznikají tak nově definovaná pravidla se zaměřením na různá pole působnosti probiotik. Mezi něž se mimo jiné řadí i ověřování deklarovaného počtu životaschopných probiotických bakterií v různých produktech nacházejících se na našem trhu.

9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Funkční potraviny O funkčních potravinách se začalo diskutovat na počátku 90. let díky organizaci ILSI (International Life Science Institute), která Evropské komisi představila projekt známý pod zkratkou FUFOSE (Functional Food Science in Europe). Na základě tohoto projektu byl v roce 1999 přijat konses „Scientific Concepts of Functional Foods in Europe“, jehož součástí bylo zavedení pracovní definice pro funkční potraviny. Hlavní body této definice jsou: -

Funkční potravina je svým charakterem běžnou potravinou, není to kapsle, tableta ani jiná forma doplňku stravy.

-

Prokázání příznivých účinků na zdraví člověka musí být založeno na vědeckém podkladě.

-

Funkční potravina má kromě své nutriční hodnoty příznivé účinky na lidské zdraví a/nebo snižuje riziko onemocnění.

-

Funkční potraviny jsou konzumovány jako součást běžné stravy.

Mezi nejčastěji využívané druhy funkčních potravin v praxi se řadí: -

potraviny, kde jsou přidány složky, které mají příznivý vliv na lidské zdraví,

-

potraviny, kde jsou odstraněny složky, které mohou mít nepříznivý vliv na zdraví člověka,

-

potraviny, ve kterých některé přirozeně se vyskytující složky jsou chemicky modifikovány,

-

potraviny, kde biologická dostupnost jedné nebo více složek je zvýšena.

Do první skupiny potravin, kde jsou kladně působící složky dodávány, spadají mléčné zakysané výrobky, do kterých jsou právě probiotika a prebiotika přidávána jako jejich funkční složky (WINKLEROVÁ, 2009). Probiotika jsou živé kultury mikroorganismů prospěšně působící na svého hostitele zlepšením vlastností jeho vlastní střevní mikroflóry. Laicky řečeno jsou to tzv. „přátelské bakterie“ (GROFOVÁ, 2007). Podrobnější informace o probatikách jsou uvedeny v následujících kapitolách. 10

Prebiotika jsou nestravitelné látky obsažené v potravinách, které pozitivně ovlivňují růst nebo aktivitu střevních bakterií, a to především bifidobakterií a laktobacilů. Tímto podporují dobré složení mikroflóry tlustého střeva, čímž vykazují celkově

příznivý

vliv

na

zdraví

a

pohodu

člověka

(NEVORAL,

2008).

Do tzv. „tračníkové potravy“ se řadí zejména různé formy vlákniny, jako je celulóza, pektiny, xylany, pak oligosacharidy, hlavně fruktooligosacharidy, například inulin, dále laktulóza a laktosacharóza. Reakčními produkty štěpení prebiotik pomocí mikrobiálních enzymů jsou krátké mastné kyseliny, některé aminokyseliny, polyaminy, růstové faktory, vitaminy a antioxidanty. Všechny tyto látky se významně podílejí na výživě střevní sliznice a dalších metabolických procesech (FRIČ, 2005). Předpokládá se, že doporučený denní příjem prebiotik se pohybuje okolo 0,3 g u mužů a 0,4 g u žen na kilogram jejich tělesné hmotnosti. Vyšší příjem by mohl vyvolávat nadýmání a průjmy (KALAČ, 2003). Tab. 1: Komerční vývoj různých druhů prebiotických sacharidů (McSWEENEY and FOX, 2009) Prebiotika

Rok*

Laktulóza

1953

Fruktooligosacharidy

1983

Sojové - oligosacharidy

1983

Galaktooligosacharidy

1985

Laktitol

1987

Inulin

1990

Laktosacharóza

1993

Xylooligosacharidy

1994

Rezistentní škrob

1996

β-glukany

1998

Obilné (cereální) oligosacharidy

1998

Polysacharidy

1998

Vláknina

1999

* uvádí se první rok komerčního využití sacharidických směsí jako prebiotik

11

2.2 Probiotika V těle průměrného člověka žije kolem několika desítek až sta biliónů bakterií. Každé tělo má jiný počet buněk a stejné tělo má v každý nový okamžik jejich jiný počet. Tedy i počet probiotických a i patogenních bakterií se liší člověk od člověka a den ode dne. Probiotické bakterie se nacházejí v našem trávicím traktu, avšak střevní trakt novorozence je sterilní a musí být teprve osídlen. Po osídlení zůstávají bakteriální kolonie až do konce života, ale jejich počet je i nadále ovlivňován různými faktory. Ke snížení počtu kolonií dochází například po léčbě antibiotiky, ve stresovém období života, aj. Přirozenou střevní mikroflóru lze obnovit příjmem stravy obsahující probiotické bakterie (MACHALA, 2008). 2.2.1 Probiotika – definice slova Slovo probiotika je odvozené z latiny a řečtiny (pro = pro, bios = život), doslovně tedy tento termín znamená „pro život“, neboli látky vhodné „pro život“. Tento termín byl poprvé použit dvojicí Lilly a Stiwell v roce 1965, kteří takto definovali substance, které jsou vylučovány určitým mikroorganismem a podporují růst jiného mikroorganismu. Termín „probiotika“ označuje látky, které jsou opakem antibiotik, a proto byl vytvořen podle vzoru slova „antibiotika“. Toto slovo začalo být používáno i v širších souvislostech (PETR a KALOVÁ, 2006). Označení probiotika v dnešním slova smyslu použil až Parker v roce 1974, kdy navrhl hypotézu, že probiotika jsou organismy a substance, které mají blahodárný účinek na živočišný organismus, protože pozitivně ovlivňují střevní mikroflóru. Tuto definici poté v roce 1989 obnovil Fuller, který označil probiotika jako živé mikrobiální přídavky ke stravě, které ovlivňují hostitele zlepšením jeho intestinální mikrobiální rovnováhy. Pojem nadále rozšířil Havenaar a kol. v roce 1992, který řekl, že probiotika jsou mono nebo smíšené kultury mikroorganismů, které, jestliže se aplikují člověku nebo zvířeti, pozitivně ovlivňují svého hostitele zlepšením vlastností jeho původní mikroflóry (LEE and SALMINEN, 2009). Během let prošla definice slova probiotika ještě mnoha změnami. Mezi novější se řadí definice z

roku 2001 ustanovená FAO/WHO (Food and Agriculture

Organization/World Health Organization – Organizace pro výživu a zemědělství/

12

Světová zdravotnická organizace), která říká, že probiotika jsou živé mikroorganismy, které po konzumaci v jejich dostatečném počtu prospěšně ovlivňují zdraví hostitele (VERDENELLI a kol., 2009). 2.2.2 Požadované vlastnosti a podmínky působení probiotik Obecně lze říci, že při výběru vhodných kmenů probiotických bakterií pro praktické využití se musí přihlížet ke třem okruhům kritérií (KALAČ, 2003): -

obecným hlediskům, jež zahrnují jejich původ, spolehlivou identifikaci, bezpečnost a odolnost vůči mutacím a stresům vyvolaným prostředím a vůči nepříznivým podmínkám, kterým jsou bakterie vystaveny při průchodu gastrointestinálním traktem,

-

technickým hlediskům, mezi něž se řadí růstová schopnost během jejich kultivace, životnost během aplikace do potravin a jejich následné dopravy a skladování,

-

funkčním hlediskům, tedy přínosu pro konzumenta. Detailněji lze vlastnosti, které musí probiotické bakterie splňovat, popsat

následovně. Vlastnosti lze využít i jako kritéria právě pro výběr nových probiotických organismů, jelikož počet organismů popisovaných jako probiotika představuje pouze nepatrný zlomek těch, které mohou být potenciálně k dispozici (KVASNIČKOVÁ, 2000, WEBB, 2006): -

druhová kompatibilita (probiotické organismy určené pro člověka, by měly být izolovány z lidského trávicího traktu, neboť některé účinky probiotických bakterií vedoucí k podpoře zdraví mohou být u různých živočišných druhů odlišné),

-

schopnost přežít průchod trávicím traktem a dosáhnout střeva v životaschopném stavu,

-

rezistence vůči kyselinám a žluči,

-

dobrá adhezní schopnost ke střevnímu epitelu,

-

krátká generační doba růstu, aby probiotické bakterie mohly střevo rychle kolonizovat (některé bakterie se špatnou přilnavou schopností k intestinálnímu epitelu jsou stále dočasně schopny kolonizovat střeva kvůli jejich krátké generační době růstu), 13

-

tvorba antimikrobních látek, které působí antagonisticky vůči patogenním a kariogenním bakteriím, brání jejich rozvoji,

-

zdravotní nezávadnost (aktuální probiotika jsou obecně považována za bezpečná a jsou nepatogenní a netoxická, avšak ve vzácných případech mohou být zdrojem infekce u lidí s oslabeným imunitním systémem),

-

stabilita (udržení si životaschopnosti, schopnosti kolonizace a dobrých organoleptických vlastností, během výroby a skladování, po dobu trvanlivosti potraviny nebo potravního doplňku),

-

znát údaje o účincích, které závisejí na dávce.

Probiotické bakterie nekolonizují střevo natrvalo, ale jen dočasně a většinou jsou detekovatelné jen po dobu konzumace potraviny s probiotiky. Další podmínkou působení tedy je dosažení potřebné koncentrace probiotických bakterií ve střevě. Udávané množství těchto bakterií by mělo být v tenkém střevě vyšší než 106 KTJ/g a v tlustém střevě 108 KTJ/g. Z toho důvodu je nutné, aby denzita těchto bakterií v přijímané

potravině

či

doplňku

stravy

činila

1010

KTJ/g

(ŠPELINA

a WINKLEROVÁ, 2009). 2.2.3 Příznivé účinky probiotik na zdraví Zdravotní význam probiotických bakterií se projevuje od narození člověka. Již v trávicím traktu kojenců se usídlí probiotické mikroorganismy. S přibývajícím věkem se střevní mikroflóra mění, přibývá i výskyt škodlivých mikrobů, kteří zvyšují množství toxických látek ve střevě a tím i nebezpečí nádorového onemocnění. Probiotické bakterie tento mechanismus utlumují. Snižují také vstřebávání cholesterolu a tím i nepřímo ovlivňují hladinu cholesterolu v krvi, zlepšují toleranci laktózy a mohou ovlivňovat lidskou imunitu v pozitivním slova smyslu (BLATTNÁ a kol., 2005). Zdravotní účinky probiotik jsou často přičítány kladnému vlivu na střevní mikroflóru a slizniční i systémovou imunitu, tzv. imunomodulační účinky. Tyto účinky byly pozorovány v in vitro studiích, na zvířecích modelech a v klinických studiích. U lidí se účinky prokázaly zkrácením doby či zmírněním příznaků u onemocnění jako je Crohnova nemoc, ulcerózní kolitida, laktózová intolerance, infekce Helicobacter pylori, atopická dermatitida, potravinová alergie, gastroenteritida spojená s infekcí rotaviry a průjem spojený s podáváním antibiotik. 14

Mezi nespecifické imunitní účinky probiotik lze počítat celkové zvýšení odolnosti organismu, které může být výsledkem pozitivní konkurence probiotických bakterií nad patogenními v místě přilnutí na střevní epitel a produkce tzv. bakteriocinů. Některé probiotické kmeny mohou ovlivňovat buněčnou imunitu, jak naznačuje analýza produkovaných cytokinů, dále byla pozorována zvýšená fagocytóza a aktivita NK buněk (natural killer) tzv. přirozených zabíječů (ŠPELINA, 2006). Probiotické kultury mají také detoxikační schopnost. Jsou totiž schopny měnit některé toxiny ve střevech na neškodné látky. Dále produkují všechny vitaminy skupiny B, vyrábějí vitamín K2 a pomáhají strávit jídla obsahující vitamin K1. Několik studií rovněž zjistilo, že probiotika mírně snižují krevní tlak (MACHALA, 2008). Mnohé imunomodulační účinky probiotických bakterií byly prokázány teprve nedávno. Mezi ty nověji popisované patří jistý vliv na patogenezi alergických onemocnění a jejich využití v prevenci a terapii těchto onemocnění, jako je atopický ekzém a dermatitida, průduškové astma a alergická rinitida. Jednou ze základních příčin v posledních letech zvýšeného výskytu alergických onemocnění a i jiných chorob souvisejících s poruchou imunitního systému člověka je špatné složení stravy a způsob života lidí, což má za následek změny ve složení jejich střevní mikroflóry. Podáváním právě probiotických kultur můžeme intestinální flóru vhodně regulovat (LISÁK, 2012). Zdravotní přínosy probiotických bakterií, z nichž některé se považují za prokázané, další za pravděpodobné, lze shrnout následovně (KALAČ, 2003): -

ustavení či obnovení vyvážené mikroflóry tlustého střeva,

-

zvýšení odolnosti proti osídlení střeva mikroorganismy vyvolávajícími průjem,

-

snížení hladiny krevního celkového a LDL cholesterolu (prevence srdečně cévních onemocnění - SCO),

-

v trávicím traktu snížení tvorby bakteriálních enzymů s mutagenními účinky a vyvolávající růst nádorů,

-

zmírnění nesnášenlivosti vůči laktose u osob s touto poruchou

-

posílení imunitního systému,

-

zvýšené vstřebávání vápníku,

-

syntéza některých vitamínů,

-

tvorba bakteriocinů potlačující choroboplodné bakterie

15

2.2.4 Hodnocení bezpečnosti probiotik Bezpečnost probiotik můžeme testovat různými metodami. Při posuzování bezpečnosti každého probiotického kmene je nevyhnutelné vykonat jeho přesnou identifikaci, aby bylo možné posoudit všechna rizika spojená s mikroorganismem a zabránit zařazení podmíněně patogenních mikroorganismů do komerčních produktů. V in vitro podmínkách je možné testovat vlastnosti mikroorganismů, které jsou charakteristické pro patogeny nebo rizikové faktory vyskytující se u patogenů (BOMBA, 2011). V roce 2002 doporučila pracovní skupina odborníků z FAO/WHO, aby byly kmeny

probiotických

bakterií

charakterizovány

pomocí

následujících

testů

(ŠPELINA, 2006): -

určení rezistence k antibiotikům,

-

hodnocení některých metabolických aktivit,

-

hodnocení vedlejších účinků během klinických zkoušek,

-

test na tvorbu toxinů (pokud kmen patří k druhu, u něhož se produkce toxinů vyskytuje),

-

test na hemolytickou aktivitu (pokud kmen patří k druhu, u něhož se tato aktivita projevuje),

-

hodnocení absence efektivity u imunokompromitovaných zvířat. V Evropě byl vypracován obecně použitelný postup k hodnocení bezpečnosti

mikroorganismů používaných v potravinách a krmivech. Sestavila jej pracovní skupina skládající se z členů evropského Vědeckého výboru pro potraviny, Vědeckého výboru pro výživu zvířat a Vědeckého výboru pro rostliny. Jde o systém posuzování, který by umožňoval „kvalifikovaný předpoklad bezpečnosti“ tzv. QPS (Qualified presumption of safety). Schéma postupu pro udělení, popřípadě neudělení, tohoto statusu je následující (ŠPELINA a WINKLEROVÁ, 2009): -

identifikace mikroorganismu na požadované taxonomické úrovni, tedy určení rodu, druhu a kmene,

-

stupeň obeznámenosti, tzv. familiarity, což jsou praktické zkušenosti z využívání zkoumaného mikroorganismu pro určité účely již v minulosti,

16

-

získání genetických dat, biochemických charakteristik a údajů o patogenitě u organismů

běžně

nevyužívaných.

Jde-li

o

taxonomickou

skupinu

s patogenními vlastnostmi, status QPS nelze udělit. Pokud je však patogenita mikroorganismu vázána pouze na určité kmeny nebo se projevuje za extrémních podmínek, je možné v postupu dále pokračovat, -

živý organismus bude součástí konečného produktu a bude konzumován nebo jej bude použito pro výrobu fermentačního produktu, který nemá obsahovat živé mikroorganismy,

-

živé mikroorganismy nemají mít schopnost produkovat antibiotika, která jsou podobná těm používaným v medicíně (humánní i veterinární),

-

bakterie z taxonomických skupin, které jsou známé svou produkcí toxinů, mají mít prokázanou neschopnost takové tvorby.

Většina probiotických bakterií, které se využívají v klinické praxi, jsou za normálních fyziologických okolností běžnou součástí gastrointestinálního traktu člověka a pro svého hostitele nepředstavují žádné riziko. Avšak i běžná střevní mikroflóra může být určitým rizikovým faktorem pro vznik infekce u chronicky nemocných či jinak oslabených jedinců, proto podávání probiotických kmenů znamená pouze velmi malé navýšení tohoto rizika. Výrobci produktů s probiotickými kulturami využívají sofistikovaných metod v oblasti zajištění nezávadnosti a celkové bezpečnosti těchto kultur (BRONSKÝ, 2008). 2.2.5 Legislativa a označování probiotik O zavádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh není v rámci celé Evropské unie k dispozici žádný legislativní předpis. A to ani v případě kojenecké a dětské výživy, kde jsou probiotické bakterie výrobci relativně často přidávány. Na probiotika lze částečně aplikovat Nařízení Evropského parlamentu a Rady o nových potravinách a nových složkách potravin (č.258/97/ES) (ŠPELINA, 2006). V současné době jsou ve většině zemí povolena pouze obecná zdravotní tvrzení o potravinách obsahující probiotika. Pracovní skupina FAO/WHO doporučuje, aby při označování potravin bylo povoleno i detailnější zdravotní tvrzení týkající se užívání probiotik. Tato specifická zdravotní tvrzení by měla být vyznačena na štítku a propagačních materiálech. Například konkrétní tvrzení, které uvádí, že „probiotika 17

snižují výskyt a závažnost rotavirových průjmů u kojenců“, by pro spotřebitele byla více informativní než obecné tvrzení, které uvádí, že „probiotika prospívají střevní mikroflóře“. Tímto by se zabránilo zavádějícím informacím. Doporučuje se také, aby výrobce nesl odpovědnost za výrobek, že zdravotní tvrzení jsou pravdivá a nejsou zavádějící. FAO/WHO doporučuje, aby byly vyznačeny tyto informace (Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002): -

rod, druh a kmen příslušného probiotického mikroorganismu

-

minimální počet životaschopných mikroorganismů jednotlivých probiotických kmenů na konci doby trvanlivosti

-

účinnou dávku probiotik (velikost porce) v souladu se zdravotním tvrzením

-

zdravotní tvrzení

-

doporučené podmínky skladování

-

kontaktní údaje firmy

2.2.6 Bakterie mléčného kvašení Na organismus člověka kladně působí především bakterie mléčného kvašení, které jsou obsaženy v zakysaných (kysaných) mléčných výrobcích, např. v jogurtech, kysaných mlékách (acidofilní, kefírové, jogurtové, kyška, s bifidokulturou) aj. Řadí se sem mikroorganismy typu Lactobacillus, Bifidobacterie, některé grampozitivní koky a kvasinky typu Sacharomycces boulardii. Tyto mikroorganismy jsou označovány jako probiotika (BLATTNÁ a kol., 2005). Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou klasifikovány společně podle tvorby stejného produktu metabolismu, a to kyseliny mléčné. BMK se řadí do několika rodů, které jsou děleny na druhy, jež mohou být dále rozčleněny na poddruhy, variety, příp. kmeny. BMK lze rozdělit do dvou kategorií, a to dle tvorby konečných produktů jejich metabolismu nebo optimální teploty. První kategorie, kdy se bakterie mléčného kysání dělí podle produkce metabolitů, obsahuje skupinu homofermentativních a skupinu heterofermentativních BMK. Homofermentativní bakterie produkují kyselinu mléčnou jako základní konečný produkt metabolismu (70 – 90 %). Druhá skupina, tedy heterofermentativní BMK, vytváří společně s kyselinou mléčnou (minimálně 50 %) i další vedlejší produkty jako je kyselina octová, oxid uhličitý (CO2) a ethanol. 18

V druhé kategorii, která se dělí dle optimální teploty růstu mikroorganismů, se nacházejí mezofilní a termofilní bakterie mléčného kysání. Kdy mezofilní bakterie rostou nejlépe při teplotách mezi 25 až 30 °C, zatímco termofilní bakterie preferují teploty 40 až 44 °C a rostou větší rychlostí než bakterie mezofilní (GAJDŮŠEK, 2002). Tab. 2: Rody bakterií mléčného kysání, jejich fermentační typ a produkty (GÖRNER a VALÍK, 2004)

Rod (skupina)

Typ fermentace

Hlavní produkty (molární poměr)

Lactococcus

homofermentativní

laktát

Streptococcus

homofermentativní

laktát

Pediococcus

homofermentativní

laktát

Lactobacillus

homofermentativní

laktát

Thermobacterium

homofermentativní

laktát

Streptobacterium

homofermentativní

laktát

heterofermentativní*

laktát : acetát

heterofermentativní

laktát : acetát : CO2 1:1:1

Leuconostoc

heterofermentativní

laktát : acetát : CO2 1:1:1

Bifidobacterium

heterofermentativní

laktát : acetát

Betabacterium

1:1

2:3

* při fermentaci pentóz

2.3 Charakteristika vybraných rodů a druhů probiotických bakterií Mikroorganismy, které se mohou považovat za probiotika, lze rozčlenit do dvou skupin. První skupina zahrnuje bakteriální druhy, které jsou obecně považovány za bezpečné, a jejich aplikace tedy nepředstavuje pro člověka žádné riziko. Řadí se sem druhy bakterií ze tří nejvýznamnějších mikrobiálních rodů této skupiny, a to rodu Bifidobacterium, Lactobacillus a Lactococcus. Avšak do této kategorie se též zahrnují rody

Enterococcus

a

Streptococcus.

Druhá

skupina

obsahuje

probiotické

mikroorganismy, které představují nepatogenní izoláty rodů, které zahrnují i potenciálně patogenní kmeny. Mezi tyto izoláty patří např. Escherichia coli, Clostridium butyricum nebo kvasinka Saccharomyces boulardii (KREJSEK a kol., 2007).

19

Tab. 3: Nejčastěji používané probiotické mikroorganismy (NEVORAL, 2005) Lactobacily

Bifidobakterie

Gram pozitivní koky

Kvasinkové mikroorganismy

L. acidophilus

L. casei, spec.

B. bifidum

B. adolescentis

Lactococcus Lactis subsp.

Saccharomyces

cremonis

boulardii

Streptococcus salivarius subsp.

rhamnosus

thermophilus

(Lactobacillus GG) L. casei Shirota

B. animalis

Enterococcus faecium

L. delbrueckii subsp.

B. infantis

S. diacetylactis

L. reuteri

B. longum

S. intermedius

L. brevis

B. thermophilum

E. coli (sérotyp O83:K24:H1)

bulggaricus

L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum 299v

2.3.1 Rod Lactobacillus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Lactobacillaceae Rod: Lactobacillus Rod Lactobacillus je z biotechnologického a potravinářského hlediska nejdůležitějším rodem, který je v přírodě velmi rozšířen.

Zahrnuje fakultativně

anaerobní anebo mikroaerofilní nepohyblivé, nesportující, grampozitivní, tyčinkovité

20

bakterie mléčného kysání, které jsou většinou rovné nebo mají tvar kokobacilů (GÖRNER a VALÍK, 2004, ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Laktobacily se nalézají na různých stanovištích, kde jsou k dispozici zkvasitelné sacharidy. Například na místech jako jsou sliznice člověka a zvířat, tedy v ústní dutině, střevě a vagíně. Dále se vyskytují na rostlinách nebo na materiálu rostlinného původu, v hnoji a také na umělých stanovištích, jako jsou kanalizace. V neposlední řadě jsou obsaženy ve fermentovaných potravinách či potravinách, které již podléhají své zkáze (WOOD and HOLZAPFEL, 1995). Rod Lactobacillus je původně roztříděn do tří tradičních skupin, a to na termobakterie, streptobakterie a betabakterie. Novější rozdělení tohoto rodu, a to dle fermentačních schopností jednotlivých druhů, vypadá následovně: -

První kategorií jsou obligátně homofermentativní laktobacily, které fermentují hexózy na kyselinu mléčnou z 90 % a pentózy a glukonáty nefermentují. Lze do této skupiny zařadit všechny termobakterie a další nově popsané druhy. Řadí se sem L. delbreckii ssp. delbrueckii, L. delbreckii ssp. bulgaricus, L. delbreckii ssp. lactis, L. helveticus. L. acidophilus, L. salivarius, L. farciminis a L. yamanashiensis.

-

Druhou kategorií jsou fakultativně heterofermentativní laktobacily, které také zkvašují hexózy téměř vždy na kyselinu mléčnou, ale při nedostatku glukózy produkují kyselinu octovou, ethanol a kyselinu mravenčí. Pentózy jsou fermentovány pomocí indukovatalné fosfoketolázy. Tato skupina obsahuje všechny streptobakterie a další nově popsané druhy. Patří sem L. alimentarius, L. bavaricus (L. sake), L. casei ssp. casei, L. casei ssp. pseoudoplantarum, L. casei ssp. rhamnosus. L. casei sspl. tolerans, L. curvatus, L. maltaromaticus, L. plantarum a L. sake (L. bavaricus).

-

Třetí

kategorií

jsou

obligátně

heterofermentativní

laktobacily,

které

při fermentaci hexóz produkují kyselinu mléčnou, kyselinu octovou, ethanol a CO2. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou. V této skupině se nacházejí všechny betabakterie a ostatní později popsané druhy. Obsahuje druhy jako L. bifermentas, L. brevis, L. buchneri, L. confusus, L. divergens, L. fructivorans, L. hadotolerans, L. kadleri, L. kefir, L. reuteri, L. sanfrancisciscensis a L. viridescens. 21

Rod Lactobacillus je velmi náročný na živiny a růstové faktory. Kromě fermentovatelných sacharidů jako zdroj uhlíku a energie, vyžadují i nukleotidy, aminokyseliny a vitamíny skupiny B. Nejlépe se jim daří na slabě kyselých médiích s počáteční hodnotou pH mezi 6,4 až 4,5 a růst se zastavuje při dosažení hodnot pH 4,0 až 3,6. Jejich růst kladně stimuluje zvýšený obsah CO2 v prostředí (okolo 5 %), i když většina druhů je značně aerotoleratních. Nejlepší teplotní podmínky pro růst jsou mezofilní teploty s horní hranicí cca 40 °C, ale některé tzv. termofilní druhy mají horní hranici 55 °C. Existují i druhy, které rostou při teplotách pod 15 °C. Avšak dobré růstové podmínky se liší od druhu a kmene. Některé druhy a kmeny laktobacilů produkují bakteriociny, což jsou bílkoviny, které devitalizují citlivé kmeny většinou toho stejného bakteriálního druhu. Laktobacily jsou citlivé vůči většině antibiotik působících na grampozitivní bakterie. Dále také bakteriální druhy tohoto rodu vykazují konzervační účinky, protože při fermentaci snižují hodnotu pH v prostředí, což je pro mnohé jiné bakterie nevyhovující (GÖRNER a VALÍK, 2004). Význam rodu spočívá v širokém využití v potravinářství, při přípravě mléčných výrobků i sýrů, při konzervaci zeleniny i některých krmiv (kysání zelí a okurek, silážování jetelovin, aj.), vyskytuje se v pekařském kvásku, ale může působit i jako kontaminant ve vinařství, pivovarství a lihovarství (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rod Lactobacillus se dříve fylogeneticky členil na tři skupiny, dnes se rozčleňuje na skupin devět, na skupinu L. acidophilus, L. reuteri, L. casei, L. plantarum, L. buchneri, L. perolens, L. salivarius, L. pediococcus a L. vitulinus – cateformis (LJUNGH and WANDSTRÖM, 2009). 2.3.1.1 Lactobacillus acidophilus Tento druh patří do velmi významné skupiny L. acidophilus, která byla také dříve nazývána L. delbrueckii (LJUNGH and WANDSTRÖM, 2009). Buňky mají tvar tyčinek se zakulacenými konci o velikosti 0,6 - 0,9 a 1,5 - 6,0 µm, které se vyskytují jednotlivě, v párech nebo v krátkých řetízcích. Bakterie druhu L. acidophilus jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní, jejich optimální pH se pohybuje mezi 5,5 až 6,0, ideální teplota růstu je 37 °C, přičemž nerostou pod 10 °C a nad 45 °C, jsou obligátně homofermentativní a zkvašují glukózu, fruktózu, laktózu, galaktózu, sacharózu 22

i maltózu. Mají však vyšší nároky na růstové faktory, vhodné jsou vitaminy, jako je riboflavin,

kyselina

pantotenová,

kyselina

listová

a

vitamin

B12

(WOOD

and HOLZAPFEL, 1995, HUI et al. 2007). Lactobacillus acidophilus je součástí normální ústní flóry, gastrointestinálního traktu a vaginy. Za normálních okolností je tento druh nepatogenní, avšak je uváděn jako původce endokarditid, endometritid, abscesů, pleuropulmonárních infekcí a bakteriémií.

S těmito

infekcemi

jsou

spojovány i

jiné druhy laktobacilů.

L. acidophilus, jakožto převažující složka poševní mikroflóry, také velmi účinně brání ascendentnímu pronikání infekce do dělohy (VOTAVA a kol., 2003). Mezi nejvýznamnější pozitivní dieteticko – léčebné účinky tohoto rodu patří potlačování nežádoucí mikroflóry gastrointestinálního traktu, jelikož dobře lne k humánnímu střevnímu epitelu a produkuje antibiotické látky s účinkem proti patogenním bakteriím a také substance s antimykotickým působením. Snižuje aktivitu fekálních enzymů, snižuje i fekální mutagenitu, zamezuje průjmu v souvislosti s radioterapií, pomáhá při zácpě a celkově tedy vyvažuje střevní mikroflóru (DWORKIN et al., 2006, KVASNIČKOVÁ, 2000). 2.3.1.2 Lactobacillus casei Tato probiotická bakterie spadá do skupiny L. casei a dříve byla označována jako Lactobacillus casei subsp. casei, později byla překlasifikována pouze na Lactobacillus casei. Avšak taxonomické zařazení této bakterie se vyznačuje určitými rozpory (ŠVEC, 2005). Bakterie tvoří nepohyblivé tyčinky často s kulatým zakončením o velikosti 0,7 až 1,1 a 2,0 až 4,0 µm, které se mohou spojovat do řetízků. Jsou mikroaerofilní, grampozitivní, fakultativně heterotrofní a jejich optimální teplota růstu je 3 °C. Riboflavin, kyselinu listovou, kyselinu panthotenovou a niacin potřebují ke svému růstu nezbytně. Velmi dobře rozkládají bílkoviny, zvláště pak kasein, od něhož je odvozeno druhové jméno této probiotické bakterie, a to až na aminokyseliny (BERGEY and BOONE, 2009, KLABAN, 2001). Mezi popsané funkční účinky druhu Lactobacillus casei provedené in vivo patří, ochrana proti infekčnímu agens díky snížení kolonizace střev patogenními 23

mikroorganismy, aktivace místní a systémové imunity, snížení klinických příznaků rotavirových průjmů a snížení hladiny triglyceridů a cholesterolu. Tyto účinky lze i zahrnout na většinu bakteriálních druhů patřících do L. casei skupiny. V potravinářském průmyslu je tento druh ceněný pro svoje využití jako startovací kultury v sýrařství, při výrobě fermentovaných mlék a pro celkové zvyšování kvality potravin. Lactobacillus casei kolonizuje jak přírodní, tak i uměle vytvořené prostředí. U člověka se vyskytuje v ústech, zažívacím ústrojí a pochvě (ALONSO and SAAD, 2007). 2.3.1.3 Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus, neboli také Lactobacillus GG je pravděpodobně nejlepší studovanou probiotickou bakterií, která byla poprvé popsána Gobrachem a Goldinem v roce 1987. Tato probiotická bakterie byla dříve považována za poddruh bakterie Lactobacillus casei, byla tedy označována jako L. casei subsp. rhamnosus, ale pozdější genetická studie ukázala, že jde o samostatný druh, proto je nyní nazývána pouze jako L. rhamnosus. Avšak do skupiny L. casei se řadí stále. Buňky jsou nepohyblivé tyčinky se zakulacenými konci o velikosti 0,8 až 1,0 a 2,0 až 4,0 µm, které se vyskytují jednotlivě či v řetízcích. Tento druh je fakultativně anaerobní a byl izolován z mléčných výrobků, lidí a klinického materiálu. Jeho pozitivní klinické účinky jsou dokumentovány u průjmových onemocnění, jako je cestovatelský průjem, nebo u léčby recidivující infekce bakterie Clostridium difficile a rotavirové infekce u dětí. Využívá se k prodloužení trvanlivosti mléčných produktů, především pak jogurtů (BERGEY and BOON, 2009, TANNOCK, 2002). Základními kritérii, kvůli kterým se druh Lactobacillus GG izoluje, jsou jeho dobrá odolnost vůči žaludečním kyselinám a velmi dobrá adherence na epitelové buňky střeva. Ukázalo se, že tento bakteriální druh obývá střevní mikroflóru i minimálně jeden týden po jeho posledním požití ústy. Mezi zdravotní účinky spadá, že snižuje aktivitu prokarcinogenních enzymů, zlepšuje slizniční bariéru střeva a také podporuje výskyt ostatních laktobacilů a bifidobakteií. Uvádí se také, že mléko obohacené o LGG snižuje riziko respiračních infekcí a rozvoj zubního kazu u dětí (LEE and SALMINEN, 2009).

24

2.3.2 Rod Bifidobacterium Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Actinobacteria Třída: Actinobacteriadae Řád: Bifidobacteriales Čeleď: Bifidobacteriaceae Rod: Bifidobacterium Bifidobakterie, dříve známé jako Bacillus bifidus, jsou skupina mikroorganismů, ve které v současné době existuje více než 33 druhů. Tyto bakteriální druhy byly zjištěny pomocí molekulárních a biochemických metod, z nichž 12 je v souvislosti s gastrointestinálním traktem. Bifidobakterie jsou grampozitivní, nesporotvorné, nepohyblivé, nepravidelně tvarované, kataláza-negativní a sacharolytické anaerobní mikroorganismy, které fermentací sacharidů produkují kyselinu octovou a kyselinu mléčnou (v poměru 3:2) bez vedlejší tvorby CO2. Přičemž kyselina octová má silnější antagonistický účinek proti patogenním mikroorganismům než kyselina mléčná. Jejich optimální teplota růstu se pohybuje mezi 36 až 38 °C a jako ideální hodnota pH se udává rozmezí od 6,5 do 7. Bifidobakterie jsou však inhibovány teplotními hodnotami do 25 °C a nad 45 °C. Typickým enzymem tohoto rodu je fruktózo-6-fosfát fosfoketoláza, která je odpovědná za odbourávání glukózy a její produkce je využívána k rozhodující identifikaci bifidobakterií. Bakterie tohoto rodu jsou schopny syntetizovat aminokyseliny, jako je kyselina glutamová a asparagová, nebo dále vitamíny, jako je riboflavin, thiamin a biotin. Dnes je rod Bifidobacterium předmětem intenzivního Mezinárodního výzkumu pro svou zásadní roli ve fermentovaných potravinách, zejména pro jejich schopnost produkovat různé antimikrobiální látky podporující probiotické vlastnosti (ROBINSON, 2002, ZINEDINE and FAID, 2007). Druhy zařazené do rodu Bifidobacterium jsou následující, B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, 25

B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B, psychraerophilum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii, B. subtile, B. thermacidophilum and B. thermophilum. Z toho následující druhy obsahují i dva poddruhy, B. animalis (subsp. animalis and lactis), B. pseudolongum (subsp. globosum and pseudolongum), B. thermacidophilum (subsp. thermoacidophilum a porcinum), a druh B. longum obsahuje tři odlišné biotypy (longum, infantis a suis) (LEE and SALMINEN, 2009). 2.3.3 Rod Streptococcus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Streptococcaceae Rod: Streptococcus Podle starší taxonomie se rod Streptococcus člení na šest skupin, skupinu pyogenních streptokoků, orálních streptokoků, anaerobních streptokoků, enterokoků, mléčných streptokoků a jiných streptokoků (S. thermophilus). V novějším rozřazení druhů v rámci rodu Streptococcus došlo k úplnému vynechání anaerobních streptokoků a k povýšení dalších dvou skupin na samostatné rody. První povýšenou skupinou jsou mléčné streptokoky,

což

jsou

nehemolyzující

nepatogenní

druhy používané

v mlékárenském průmyslu, které jsou nově zařazeny do rodu Lactococcus, například druhy L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris a L. plantarum. Druhou skupinou jsou streptokoky vyskytující se často ve střevním traktu člověka a jiných savců, které jsou nyní přeřazeny do rodu Enterococcus, například L. faecium, L. gallinarum a L. durans. (GÖRNER a VALÍK, 2004, ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

26

Buňky rodu Streptococcus mají tvar koků, jsou tedy kulovité až vejčité o průměru menším než 2 µm. Koky se vyskytují nejčastěji v řetízcích, ale také ve dvojicích či jednotlivě. Jsou grampozitivní, většinou nepohyblivé a fakultativně anaerobní. Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou s velmi malým množstvím plynu. Některé druhy zkvašují i organické kyseliny a aminokyseliny. V rámci tohoto rodu je zahrnuta řada druhů pro člověka a zvířata patogenních, ale i těch využívaných v potravinářském průmyslu (GÖRNER a VALÍK, 2004). 2.3.3.1 Streptococcus thermophilus Streptococcus salivarius ssp. thermophilus spadá do skupiny jiných streptokoků, i když by se svými vlastnostmi lépe hodil do skupiny mléčných streptokoků. V mlékárenském průmyslu se využívá pro jeho schopnost zkvašovat laktózu na kyselinu mléčnou společně s jinými bakteriemi mléčného kysání ve formě termofilních zákysů (GÖRNER a VALÍK, 2004). Bakterie tohoto druhu jsou grampozitivní, kulovitého až vejčitého tvaru o velikosti 0,7 až 0,9 µm v průměru a tvoří dlouhé řetízky zhruba o 10 až 20 buňkách (ROBINSON, 2002). Optimální teplota růstu tohoto streptokoka se pohybuje okolo 45 °C, ale je odolný i vůči teplotě 67, 5 °C po dobu 50 minut a některé kmeny vydrží dokonce 80 °C po dobu 15 minut. Druh Streptococcus thermophilus je důležitý pro výrobu jogurtů a některých druhů sýrů (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1985). Jeho kladnou vlastností je rychlé zvyšování kyselosti, čehož je využíváno při výrobě sýrů, a zápornou, že nesnáší zvýšené koncentrace NaCl (>2 %). Je velmi citlivý na antibiotika a jiné inhibiční látky, proto je v mlékárenství využíván k zjišťování přítomnosti právě těchto látek v mléce (GÖRNER a VALÍK, 2004).

27

2.3.4 Rod Bacillus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Bacillales Čeleď: Bacillaleae Rod: Bacillus Rod Bacillus je velice rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Druhy tohoto rodu tvoří nejčastěji grampozitivní peritrichní tyčinky. Bakterie jsou enzymově bohatě vybavené, tedy schopné rozkládat nejrůznější organické sloučeniny. Obsahují amylolytické, pektolytické i proteolytické enzymy. Některé druhy produkují antibioka, z nichž některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově, například bacitracin. Určité druhy slouží také pro průmyslovou přípravu enzymů (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2.3.4.1 Bacillus coagulans Tento druh byl izolován a popsán již v roce 1933 a byl pojmenován jako Lactobacillus sporogenes. Až později byl překlasifikován na Bacillus sporogenes a následně přejmenován na Bacillus coagulans. Je sporotvorný, pohyblivý a kataláza pozitivní, z těchto důvodů musí být zařazen v rámci rodu Bacillus, i když se od tohoto rodu liší elipsoidním tvarem spor a jejich umístěním v jednom z buněčných polů, nedostatkem cytochrom oxidázy a neschopností redukce dusičnanů na dusitany. Dále je Bacillus coagulans fakultativně anaerobní, grampozitivní, má tvar tyčinek, které jsou spojeny v řetízcích různých délek. Jeho optimální teplota růstu se pohybuje mezi 35 až 50 °C a vyhovuje mu pH v rozmezí 5,5 až 6,5. Tvoří kyselinu mléčnou bez vedlejší produkce plynu, čímž by se mohl řadit mezi rod Lactobacillus. Produkcí této kyseliny a dalších produktů, jako jsou termostabilní enzymy, může být využit na průmyslové úrovni.

28

Existuje málo údajů o odolnosti této bakterie vůči kyselinám a žluči. Avšak spory tohoto druhu jsou odolné vůči nepříznivému prostředí, tudíž by měly odolat průchodu kyselým prostředí žaludku a dostat se až do střeva, kde by mohlo dojít ke sporulaci. Tvorba spor je také výhodou u lyofilizovaných doplňků stravy, jelikož spory dobře přežívají průmyslové zpracování a zajišťují dlouhodobou životaschopnost bakterie i po dobu skladování. V jedné studii se také prokázalo, že ke žluči je slabě tolerantní. Bacillus coagulans se bohužel vykazuje špatnou adherencí na střevní epitel. Také se předpokládá vliv tohoto bakteriálního druhu na potlačení patogenních bakterií, ale tento účinek musí být ještě objasněn. V některých studiích však již byla prokázána tvorba netěkavých látek s inhibičním účinkem vůči enterokokům rezistentních na vankomycin. V jedné humánní studii se také projevil pozitivní účinek ke snížení celkového cholesterolu, avšak toto zjištění ještě nelze označovat za průkazné. Bacillus coagulans je na některých výrobcích stále označován jako Lactobacillus sporogenes, což je z taxonomického hlediska nesprávné zařazení a do budoucna by se takovéto označení mělo úplně vyloučit. O probiotickém působení tohoto bakteriálního druhu existují zatím omezené solidní vědecké důkazy, ale jsou k dispozici dvě významné výhody. Prvním pozitivem je jeho velká stabilita při výrobě a skladování

a

druhou

výhodou

jsou

nízké

výrobní

náklady

(VECCHI

and DRAGO, 2006).

2.4 Formy probiotických preparátů na trhu Existuje mnoho způsobů, jak dodávat do střevního traktu probiotické kultury, jejichž přítomnost či nepřítomnost v dostatečném počtu může znamenat rozdíl mezi zdravím a nemocí. Mezi způsoby, jak dostat probiotika tam, kde člověku mohou pomáhat, se řadí příjem probiotických mikroorganismů pomocí stravy, nejčastěji konzumací mléčných výrobků a druhou možností je užívání potravních doplňků ve formě kapslí či tablet (MACHALA, 2008). 2.4.1 Potraviny s obsahem probiotik Probiotika, jakožto látky nenutriční povahy, které jsou však svým působením organismu prospěšné, jsou jako funkční složky součástí tzv. funkčních potravin. Takováto potravina vykazuje kromě vlastního nutričního účinku ještě další prospěšný 29

vliv na jednu či více cílových funkcí organismu, jako je například snížení rizika určitých onemocnění (MÜLLEROVÁ, 2003). Probiotické potraviny během posledních několika let zaznamenaly značný rozmach. I v České republice se spotřebitelům dostaly více do podvědomí. Mezi těmito potravinami mají hlavní slovo kysané neboli fermentované mléčné výrobky s přídavkem probiotických mikroorganismů. Kysané mléčné výrobky mají svůj původ v mnoha lidových mléčných nápojích vznikajících přirozenou fermentací mléka, která byla způsobena mikroorganismy obsaženými v syrovém mléce. Dnes jsou při výrobě probiotických potravin využívány pouze čisté mlékařské kultury, které jsou označené jako probiotické. K fermentaci se v současnosti požívají bakterie mléčného kysání, z nichž majoritní zastoupení mají bakterie rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Nyní se k probiotickým produktům řadí téměř všechny zakysané mléčné výrobky tekuté a jogurtového typu. Využití probiotik se přenáší i na další skupiny potravinářských výrobků například snídaňové cereálie a šťávy, masné výrobky, nápoje a kvašené výrobky obecně (BARTOŠOVÁ, 2009). Dle znění vyhlášky č. 77/2003 Sb. se kysaným mléčným výrobkem rozumí mléčný výrobek, který je získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů uvedených v následující tabulce a je tepelně neošetřený po kysacím procesu. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurt (nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový), jogurtové mléko, acidofilní mléko, kefír, kefírové mléko, kysané mléko nebo smetanový zákys, kysaná nebo zakysaná smetana, kysané podmáslí a kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou (Vyhláška č. 77/2003 Sb.).

30

Tab. 4: Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhláška č. 77/2003 Sb.) Druh výrobku

Použité mikroorganismy

Acidofilní mléko

Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení

Jogurty *)

Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí, a kysané smetany Kefír

Kefírové mléko

Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou

zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Sacharomyces cerevisce, Sacharomyces exitus a dále Leuconoctoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními a temofilními bakteriemi mléčného kvašení

Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g 106 Lactobacillus acidophilus 107

106

bakterie mléčného kvašení 106 a kvasinky 104

bakterie mléčného kvašení 106 a kvasinky 102

106 bifidobakterie

*) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo texturovou charakteristiku výrobku. Musí však být zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury.

2.4.2 Probiotické doplňky stravy Doplněk stravy, je produkt, který obsahuje směs jednotlivých potravních doplňků, které u zdravého člověka mají zajistit jediné, a to dostatečný příjem toho kterého potravního doplňku, který chybí v běžné stravě, anebo nějaké přírodní, nebo

31

dokonce uměle vytvořené, ale pro lidský organismus vlastní, nebo stravou přijímané látky, která svým efektem má jistým způsobem ovlivnit některý z fyziologických procesů, probíhajících u zdravého člověka (FOŘT, 2005). Další z možností jak organismu dodat užitečné probiotické bakterie je pomocí kvalitních

koncentrovaných

výživových

doplňků.

Měly

by

být

podávány

v enterosolventní kapsli, která je odolná proti kyselému prostředí žaludku. Tímto je zajištěno jejich přežití při průchodu žaludkem až do tenkého a tlustého střeva. V kapsli se probiotické mikroorganismy nacházejí v lyofilizované formě. Lyofilizace je proces sušení, kdy se touto nadstandardní technologií získává 100 % přírodní produkt, který je mimořádně mikrobiologicky čistý. Původní biochemické i morfologické vlastnosti bakterií se při tomto procesu nemění a i několik let si zachovávají svoji životnost. Po natrávení obalu kapsle ve střevě se lyofilizované probiotické mikroorganismy uvolní, naberou vlhkost z intestinálního prostředí a začnou se rozmnožovat. Kvalitní výživové doplňky obsahují zároveň i prebiotika, které jsou potravou pro probiotické bakterie (HORÁKOVÁ, 2012). Na účinnost farmaceutických kapslí či tablet existují různé názory. Jeden říká, že jen malé procento doplňků s probiotiky obsahuje dostatečný počet živých probiotických kultur. Další průzkum zase vypovídá o tom, že probiotika samotná jsou méně úspěšná v uchycení se uvnitř gastrointestinálního traktu člověka než probiotika na povrchu potravin. Dále existuje tvrzení, že některé přípravky mohou být účinné u některých lidí a jiné u jiných (KALAČ, 2003). Další publikace uvádí, že podmínku dostatečného počtu životaschopných probiotických bakterií nejlépe splňují doplňkové výživové přípravky, které jsou podávány ve formě želatinových kapslí perorálně. Kapsle jsou totiž naplněny dostatečným počtem mikroorganismů v lyofilizovaném stavu, což zaručuje jejich životnost na minimálně jeden rok. Oproti tomu životnost probiotických bakterií v zakysaných mléčných výrobcích je časově omezená, například bifidobakterie v různých jogurtech přežívají nejdéle 8 – 10 dní od výroby. Další výhodou je, že do kapslí se mohou kromě probiotických bakterií přidat vitaminy či stopové prvky (FERENČÍK a kol. 2005).

32

Tab. 5: Vybrané probiotické doplňky stravy dostupné na trhu (Společnost pro probiotika a prebiotika, 2012) Název

Složení

KTJ 9

Bifiform Kid (od 3 let)

Lb. rhamnosus, B. animalis subsp. lactis

1 × 10 v 1 tabletě

Bion 3

Lb. acidophilus, B. bifidum, B. longum

10 × 106

Bion 3 Junior

Lb. gasseri, B. longum, B. bifidum

5 × 106

Bion 3 Senior

Lb. gasseri, B. longum, B. bifidum

1 × 107

BioPRO

Lb. acidophilus (DDS-1), Sporolactobacillus

nelze zjistit

sp. B. bifidum, B. longum, E. faecium, fruktooligo sacharidy za banánů, růstový faktor laktobacilů a vitamin B5 Biopron 9

B. bifidum, B. breve, B. longum, Lb.

9 × 109 v denní

acidophilus, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb.

dávce

rhamnosus, L. lactis ssp. lactis, S. thermophilus Biopron Junior

Lb. acidophilus, Bifidobacterium

5 × 109 sáček

Flora care

Lb. acidophilus, Lb. salivarius, Lactococcus

1 × 109 bakterií/g

lactis, E. faecium, L. casei, B. lactis, B. longum, B. infantis Nutrolin – B

Lb. sporogenes, Vit. B1, B2, B6, PP

4 × 107/5 ml sirupu

Lactovita

Lb. sporogenes, Vit. B1, B2, B6, PP

4 × 107/1 tableta

Laktobacily 5

Lb. rhamnosus, B. breve, Lb. casei, Lb.

6 × 109

acidophilus, B. longum Probio – fix

Lb. acidophilus, Bifidobacterium

4 × 109

Probiosan

Chlorella pyrenedoisa, inulin, Lb.

0,5 × 109

acidophilus, E. faecium Protexin Restore

Protexin Vitality

Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus,

5 × 109 bakterií/

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, S.

denní dávka/ 1

thermophilus, B. infantis, B. breve, FOS

sáček

Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus,

1 × 109 bakterií/

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, S.

denní dávka

thermophilus, B. infantis, B. breve, FOS Sanasol Probiotikum

B. longum, Lb. rhamnosus, S. thermophillus

5 × 107 v 1 sáčku

Symbilakt

Lb. acidophilus

1 × 109

33

2.5 Vybrané identifikační metody probiotických mikroorganismů Probiotické výrobky obsahují živé kultury mikroorganismů. Při hodnocení kvality takovýchto potravin a potravních doplňků je nejdůležitějším bodem stanovit počet živých buněk, který je deklarován na obalu a měl by vydržet až do konce záruční doby. V dnešní době jsou k určení počtu živých probiotických mikroorganismů nejčastěji využívány kultivační metody, jelikož nekultivační postupy jsou stále ve stádiu pokusů. Při stanovování počtu probiotických mikroorganismů se jako hlavní problém ukazuje omezená selektivita řady médií. Dalším důležitým kritériem k určení kvality probiotických výrobků je správná identifikace použité kultury. Dle současných požadavků Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) musejí být mikroorganismy identifikovány na úroveň druhu a charakterizovány pomocí genetického fingerprintu (RADA a kol., 2010). 2.5.1 Kultivační metody Nejčastěji využívanými metodami v mikrobiologii obecně jsou metody, které jsou vázány na použití tekuté či pevné živné půdy. Pro uvedené typy kultivačních médií jsou předdefinované speciální metodiky průkaznosti a stanovení jednotlivých ukazatelů aktivity mikroorganismů (AMBROŽOVÁ, 2004). Tekuté půdy jsou složené z vody a v ní rozpuštěné směsi živin a růstových faktorů o různém složení i množství. Tyto půdy se používají zejména k pomnožení mikroorganismů pro účely další diagnostiky. Pevné půdy se skládají z agarázového gelu obohaceného o směs živin. Pevné půdy jsou nejčastěji uchovávány na Petriho miskách, kde mikroorganismy vytváří tzv. kolonie. Kolonie je pomnožená skupina bakterií pocházející většinou z jedné bakterie nebo pevného seskupení několika bakterií (KTJ - kolonii tvořící jednotka). Takováto skupina mikroorganismů je jednoho druhu, má společné vlastnosti a tvoří reprezentativní vzorek bakteriální populace, která je nezbytná pro další vyhodnocování. Půdy dále mohou být členěny dle účelu využití na univerzální neboli základní půdy, půdy diagnostické, půdy selektivní, půdy selektivně diagnostické a půdy speciální. Při kultivaci je také třeba nastavit jisté podmínky vhodné pro zkoumaný mikroorganismus. Mezi tyto podmínky kultivace se řadí například dostatek živin,

34

vlhkost, ideální teplota, optimální pH a správná atmosféra, vzhledem ke vztahu ke kyslíku (SMÍŠEK, 2009). Existují dvě kategorie kultivačních metod a to, kvantitativní a kvalitativní. Pomocí kvantititativní metody se zjišťuje počet mikrobiálních buněk a pomocí kvalitativní metody se určuje přítomnost či nepřítomnost bakteriálních buněk. Specifičtější metodou je plotnová metoda, které je využívána pro průkaz (kvalitu) nebo pro stanovení počtu (kvantitu) určitých skupin, rodu nebo druhu životaschopných bakterií (www.biomikro.vscht.cz). 2.5.2 Biochemické metody Ke správné identifikaci mikroorganismů nestačí jen rozlišení morfologických, mikroskopických a makroskopických znaků, ale je třeba ověřit si i celou řadu dalších biologických vlastností studovaných mikroorganismů. Mezi hlavní fyziologické znaky patří pohyblivost, vztah ke kyslíku, vztah k teplotě a růst v různých koncentracích NaCl. Avšak principem biochemických metod je průkaz enzymatické aktivity zkoumaných mikroorganismů pomocí jednoduchých testů. Praxe je ale taková, že studovaný mikroorganismus často nelze jednoznačně určit. Z důvodu toho, že mikroorganismy získané z přirozeného prostředí nemívají stejné vlastnosti jako sbírkové kmeny, liší se od sebe v jednom či i ve více znacích. Při těchto identifikačních metodách je také vyžadována přítomnost zaškoleného pracovníka se zkušenostmi v této oblasti zkoumání (BURDYCHOVÁ a SLÁDKOVÁ, 2007). 2.5.3 Molekulárně – biologické metody Klasické metody identifikace, které jsou v mikrobiologii využívány, mají někdy jistá omezení. Limituje je například nízká senzitivita, omezená schopnost identifikování špatně kultivovatelných či nekultivovatelných mikroorganismů nebo potřeba získat čisté bakteriální kultury. V těchto případech lze využít právě metod molekulární biologie, které jsou kultivačně nezávislé, rychlé, citlivé a specifičtější. Principem těchto molekulárních technik je detekce specifické části RNA nebo DNA u sledovaného mikroorganismu (BURDYCHOVÁ a SLÁDKOVÁ, 2007).

35

PCR - Polymerázová řetězová reakce Mezi v současnosti nejběžněji využívanou molekulárně – biologickou metodu identifikace patří právě PCR - polymerase chain reaction, tedy polymerázová řetězová reakce, která slouží k získání potřebného množství specifické DNA pro další analýzy. Tato metoda může být definována jako „řízené kopírování DNA v laboratorních podmínkách“. Kopírování DNA probíhá cyklicky ve třech teplotních fázích v přístroji zvaném thermocycler, který umožňuje přesné střídání teplot v určitých časových intervalech, což je pro správný průběh celého procesu nezbytné. První fáze PCR reakce, označována jako „denaturace“, začíná tepelnou denaturací vzorku DNA na dva jednoduché řetězce, tento úsek probíhá při teplotě 95 °C. Druhá fáze je nazývána jako „anelace“. V této části se teplota sníží zhruba na 50 až 60 °C a úsek, který má být amplifikován, je vyhledán krátkými specifickými úseky DNA, tzv. primery, které nasednou pouze před a za cílovou repetici DNA. Třetí fáze pojmenovaná jako „elongace“ probíhá při teplotě 72 °C. V této části reakce je úsek DNA kopírován pomocí přítomného enzymu DNA polymerázy, která se označuje jako Taq polymeráza, jelikož je nejčastěji izolována z bakterie Thermus aquaticus. Celý tento cyklus se mnohokrát opakuje. Po každém cyklu dojde k zdvojnásobení počtu kopií úseku mezi nasednutými primery a množství kopií určené sekvence DNA tedy roste logaritmicky. Konečný roztok pak obsahuje obrovské množství zcela identických kopií vybraného úseku, tzv. fragmentů. Reakční objem se obvykle pohybuje mezi 20 až 100 µl. Pro průběh reakce jsou nezbytné následující součásti, vzorek zkoumané DNA, syntetické oligonukleotidy, jako primery, dále Taq polymerázu, PCR pufr, směs všech 4 deoxynukleotidtrifosfátů dNTP a Mg2+ ionty. (BARTŮŇKOVÁ a kol. 2011, RAK a kol. 2008). Specifické metody PCR Mimo klasické PCR reakce existují i její další specifické metody. Mezi tyto reakce se řadí například reverzně transkriptázová PCR (RT – PCR), kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR), a jiné. RT – PCR je univerzální a velmi citlivá metoda, pomocí níž lze detekovat a v určitých případech i kvantifikovat mRNA pro určitý gen. Při této metodě je nejprve mRNA pomocí některé z reverzních transkriptáz přepsána do cDNA. Po ukončení 36

tvorby prvního vlákna cDNA je přítomná reverzní transkriptáza inaktivována a syntetizované úseky DNA jsou dále namnoženy pomocí standardní PCR (BARTŮŇKOVÁ a kol. 2011). qPCR je v klinické diagnostice široce využívanou metodou hlavně díky její jednoduchosti použití. Stala se téměř nezbytností pro vědecký výzkum, ale i pro kontrolu kvality potravin a jiné analýzy. Tato modifikace polymerázové řetězové reakce umožňuje přesné měření změny jediné kopie DNA v milionu kopií v méně než jedné hodině (Akademie věd ČR, 2009). Elektroforéza v agarózovém gelu Principem elektroforézy je rozčlenění fragmentů DNA ve stejnosměrném elektrickém poli v gelu agarózy, který vytváří molekulové síto. Pohyblivost fragmentů DNA v gelu zapříčiňuje několik faktorů. Prvním a tím nejdůležitějším vlivem je skutečnost, že si molekula DNA nese celkový záporný náboj. Ten jí udává zbytek kyseliny fosforečné, jenž je součástí její struktury. Z tohoto důvodu se DNA pohybuje od katody k anodě, tedy od záporného ke kladnému pólu. Rychlost molekuly je dána její samotnou velikostí. Při elektroforéze lze pozorovat polohu jednotlivých fragmentů DNA a tím stanovit jejich velikost. Dalším faktorem je hustota agarázového gelu, nejběžněji se využívá gel o koncentraci 0,6 až 3,0 %. Elekroforézu dále ovlivňuje intenzita elektrického pole, složení elektroforetického pufru a teplota (BURDYCHOVÁ a SLÁDKOVÁ, 2007).

37

3 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo ověření celkového deklarovaného počtu probiotických bakterií ve vybraných farmaceutických preparátech. Dalším úkolem bylo popsat účinky probiotik na lidské zdraví a naučit se mikrobiologickému stanovení sledovaných probiotik (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus

casei,

Lactobacillus

thermophilus a Bacillus coagulans).

rhamnosus,

Bifidobacterium,

Streptococcus

Následujícím úkolem bylo získané výsledky

mikrobiologických analýz statisticky vyhodnotit.

38

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Materiál Pro účely této diplomové práce bylo z tržní sítě zakoupeno osm vzorků farmaceutických preparátů s obsahem různých druhů probiotických bakterií. Zakoupené preparáty byly v polovině minimální deklarované doby trvanlivosti (24 měsíců), tedy asi jeden rok po jejich výrobě. Vzorky byly skladovány při pokojové teplotě (21 °C), čímž byly splněny požadavky všech výrobců. 4.1.1 Použité farmaceutické probiotické preparáty Vzorek č. 1: (kapsle) Celkové složení maltodextrin, želatinová kapsle, bakteriální kultura, enterický povlak kapsle (vrstva bílkovin pro průchod živých organismů přímo do střev), zvlhčovadlo (stearát hořečnatý), stabilizátor (pektin), antioxidant (kyselina askorbová) Obsah bakteriálních kultur v 1 g 6 × 109 KTJ/g - Lactobacillus rhamnosus (3,3 × 109), Lactobacillus casei (9 × 108), Lactobacillus acidophilus (3 × 108), Bifidobacterium breve a Bifidobacterium longum (1,5 × 109). Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C Dávkování 1 – 2 kapsle denně, doporučuje se užívat současně s antibiotickou léčbou, zachovat odstup cca. 2 hodiny od užití ATB a pokračovat v užívání ještě aspoň týden po dobrání.

39

Vzorek č. 2: (kapsle) Celkové složení maltodextrin, fruktooligosacharidy (Inulin), rostlinná kapsle, bakteriální kultura, antioxidant (kyselina askorbová), protispékavá látka (stearát hořečnatý) Obsah bakteriálních kultur v 1 g 1 × 109 KTJ/g - Lactobacillus rhamnosus (4,5 × 108), Lactobacillus acidophilus (1,5 × 108), Lactobacillus casei (1,5 × 108), Bifidobacterium infantis a Bifidobacterium bifidum (2,5 × 108). Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C Dávkování Pro děti od 1 měsíce 1 – 2 kapsle denně vysypat do kojeneckého mléka, případně do jídla. Zachovat odstup cca. 2 hodiny od podání antibiotik.

Vzorek č. 3: (kapsle) Celkové složení bakteriální kolonie, thiamin mononitrát (vit. B1), riboflavin (vit. B2), nikotinamid (vit. B3), pyridoxin hydrochlorid (vit. B6), kyselina listová (vit. B9), kyanokobalamin (vit. B12), kukuřičný škrob (plnidlo), jedlá želatina, talek/mastenec (plnidlo), protihrudková přísada - mastenec (E533b.) Obsah bakteriálních kultur v 1 g 4 × 107 KTJ - Bacillus coagulans Skladování Při teplotě do 25 °C

40

Dávkování 1 kapsle denně pro doplnění výživy, 1 kapsle 1 - 3x denně při zažívacích obtížích až do jejich odeznění. Maximálně 3 kapsle denně. Při léčbě antibiotiky podávat po celou dobu jejich užívání.

Vzorek č. 4: (kapsle) Celkové složení probiotický komplex 9 kmenů vitálních mikroorganismů, fruktooligosacharidy, želatina, oxid titaničitý (barvivo) Obsah bakteriálních kultur v 1 g 9 × 109 KTJ - Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus. Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C Dávkování 1 kapsle 1 - 2x denně po jídle.

Vzorek č. 5: (kapsle) Celkové složení bakteriální kultury, Vaccium macrocarpon – brusinkový extrakt, fruktooligosacharidy, stearan hořečnatý, vitamin C, želatina Obsah bakteriálních kultur v 1 g 12 × 109 KTJ - Lactobacillus casei (3,4 × 109), Lactobacillus rhamnosus (2,4 × 109), Lactobacillus acidophilus (1,8 × 109), Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum

41

a Bifidobacterium bifidum (1,8 × 109), Streptococcus thermophilus (6,0 × 108), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum a Lactococcus lactis Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C Dávkování 1 kapsle 1x denně

Vzorek č. 6: (rozpustný prášek) Celkové složení bakteriální kultury, Pyridoxin hydrochlorid (vit. B6, mono a di-glyceridy mastných kyselin), Thiamin hydrochlorid (vit. B1, mono a di-glyceridy mastných kyselin), kyanokobalamin (vit. B12, maltodextrin, citronan sodným, kyselina citronová), kyselina listová, fruktóza, stearan hořečnatý, srážený oxid křemičitý, broskvová příchuť Obsah bakteriálních kultur v 1 g ≥ 1,5 × 109 KTJ/g - Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum. Skladování Při teplotě do 30 °C Dávkování 1 – 2 sáčky denně, nejlépe ráno a večer

Vzorek č. 7: (potahové tablety) Celkové složení Bakteriální kultury, askorban vápenatý, tokoferolacetát alfa, nikotinamid, retinolacetát, pyridoxiniumchlorid,

cholekalciferol,

thiaminnitrát, 42

riboflavin,

kyanokobalamin,

kyselina listová, biotin, dihydrát molybdenanu sodného, hexahydrát chloridu chromitého, jodid draselný, oxid křemičitý, síran manganatý, pantothenan vápenatý, oxid hořečnatý, chlorid draselný, fosforečnan vápenatý, síran železnatý, oxid zinečnatý, selnan sodný, uhličitan vápenatý, pojiva: mikroskpická celulóza (E460), polyvidon (E1201), plniva: inulin, glukóza, hydroxypropylmethylcelulóza (E464), mazadla: glyceroldistearát (E471), stearan hořečnatý (E470b), rozvolňovala: krospovidon (E1202), karmelóza sodná (E468); potah tablety: hydroxypropylcelulóza (E463), hydroxypropylmetylcelulóza (E463); Barviva: oxid železitý (E172), brilantní modř (E133); maltodextrin, dextrin, talek (E553b), koloidní bezvodý oxid křemičitý (E551); všehojivý (ženšenový) extrakt, lutein, borůvkový extrakt. Obsah bakteriálních kultur v 1 g 1 × 107 KTJ - Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C Dávkování 1 potahová tableta denně (pro dospělé ve věku nad 50 let)

Vzorek č. 8: (kapsle) Celkové složení bakteriální kultury, dextrosa, mikrokrystalická celulosa (E460), bramborový škrob, stearan hořečnatý (E470b), inulin, oligosacharidy Obsah bakteriálních kultur v 1 g 1 × 109 KTJ - Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium animalis Skladování Při pokojové teplotě do 25 °C

43

Dávkování Pro dospělé a děti nad 12 let: 1 kapsle 3x denně; Pro děti od 4 let do 12 let: 1 kapsle 2x denně. 4.1.2 Použité chemikálie -

Ethanol

-

Fyziologický roztok Solution de RINGER (Noack, Francie)

-

Pomnožovací médium Nutrient Base

-

Indikátor BCP

-

Antibiotika

4.1.3 Použité pomůcky -

Sterilní skalpel a pinzeta

-

Sterilní sáčky pro homogenizaci

-

Sterilní laboratorní sklo

44

4.2 Metodika Mikrobiologický rozbor byl proveden dle ČSN EN ISO 7218 (560103) a kultivační půdy byly chystány dle normy ČSN P ENV ISO 11133-1 (560099). Mikrobiologické rozbory byly prováděny ve 30. denních intervalech od dne zakoupení výrobku (0. den) po 150. den skladování. Každá mikrobiologická analýza byla provedena ve třech opakováních a průměry z těchto tří měření byly použity k následnému statistickému vyhodnocení. Kultivace byla prováděna plotnovou metodou pomocí

roztěru,

při

níž

byly

stanovovány

vybrané

skupiny

probiotických

mikroorganismů. Identifikace jednotlivých izolátů proběhla ve spolupráci s Českou sbírkou mikroorganismů v Brně. 4.2.1 Kultivační média 4.2.1.1 Stanovení rodu Lactobacillus (ČSN ISO 560642) Kultivace bakteriálního rodu Lactobacillus byla provedena na médiu Rogosa SL Agar (HiMedia, Indie). Složení média Rogosa SL Tryptosa

10,0 g/l

Kvasničný extrakt

5,0 g/l

Dextróza

10,0 g/l

Arabinóza

5,0 g/l

Sacharóza

5,0 g/l

Octan sodný

15,0 g/l

Citran amonný

2,0 g/l

Dihydrogenfosforečnan draselný

6,0 g/l

Síran hořečnatý

0,57 g/l

Síran manganatý

0,12 g/l

Síran železnatý

0,03 g/l

Polysorbát 80

1,0 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

45

Příprava živné půdy Rogosa SL Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 75,0 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byl obsah reagenční láhve zahřát na 90 – 100 °C po dobu 2 – 3 minuty. Po rozvaření půdy byla láhev s Rogosa SL půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipraveného Rogosa SL agaru. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin anaerobně v anaerostatu. Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních.

4.2.1.2 Stanovení druhu Lactobacillus acidophilus (ČSN ISO 560642) Kultivace bakteriálního druhu Lactobacillus acidophilus byla provedena na MRS médiu (Biokar Diagnostics, Francie) s přídavkem antibiotika Clindamycinu (Sigma – Aldrich, USA).

46

Složení agaru MRS Polypepton

10,0 g/l

Masový extrakt

10,0 g/l

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

Glukosa

20,0 g/l

Tween 80

1,08 g/l

Fosfát draselný

2,0 g/l

Octan sodný

5,0 g/l

Citrát amonný

2,0 g/l

Síran hořečnatý

0,2 g/l

Síran manganatý

0,05 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

Příprava živné půdy MRS Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 70,3 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s MRS půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Následně po zchladnutí média bylo přidáno antibiotikum Clindamycin, a to ve výsledné koncentraci 0,5 mg/l. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipraveného MRS média s přídavkem antibiotika Clindamycinu. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin anaerobně v anaerostatu.

47

Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních.

4.2.1.3 Stanovení druhu Lactobacillus rhamnosus (ČSN ISO 560642) Kultivace bakteriálního druhu Lactobacillus rhamnosus byla provedena na MRS médiu (Biokar Diagnostics, Francie) s přídavkem antibiotika Vankomycinu (Sigma – Aldrich, Německo). Složení MRS agaru Viz kapitola 4.2.1.2 Příprava živné půdy MRS Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 70,3 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s MRS půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Následně po zchladnutí média bylo přidáno antibiotikum Vankomycin, a to ve výsledné koncentraci 2 mg/l. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipraveného MRS média s přídavkem antibiotika Vankomycin. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin anaerobně v anaerostatu.

48

Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních.

4.2.1.4 Stanovení druhu Lactobacillus casei (ČSN ISO 560642) Kultivace bakteriálního druhu Lactobacillus casei byla provedena na půdě Medium – MRS – IM – SORBITOL AGAR (HiMedia, Indie). Složení agaru Médium – MRS – IM – SORBITOL AGAR na 1000 ml

na 400 ml

Tryptone

10,0 g/l

4,0 g

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

2,0 g

Tween 80

1,0 g/l

0,4 g

Fosfát draselný

2,6 g/l

1,04 g

Octan sodný

5,0 g/l

2,0 g

Hydrogen – citrát - diamonný

2,0 g/l

0,8 g

Síran hořečnatý

0,2 g/l

0,08 g

Síran manganatý

0,05 g/l

0,02 g

Sorbitol

20,0 g/l

8,0 g

Bakteriologický agar

13,0 g/l

5,2 g

Příprava živné půdy Médium – MRS – IM – SORBITOL AGAR Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kde byl agar ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s živnou půdou MRS – SORBITOL vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 46 °C. Následně po zchladnutí média bylo upraveno jeho pH na 6,9 ± 0,1 a byl přidán indikátor BCP solution. Obvyklá dávka indikátoru je 1 ml do 100 ml média a je přidáván přes filtr kvůli sterilitě.

49

Příprava indikátoru BCP Složení: Bromeregol purple

2g

Ethanol 96 °C

220 g (ml)

Destilovaná voda

780 ml

Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipraveného MRS – SORBITOL média s indikátorem BCP. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 42 °C po dobu 96 hodin anaerobně v anaerostatu. Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních.

4.2.1.5 Stanovení rodu Bifidobacterium (ČSN ISO 467046) Kultivace bakteriálního rodu Bifidobacterium byla provedena na BSM médiu (Fluka, Švýcarsko) se suplementem BSM (Fluka, Švýcarsko). Složení agaru BSM Výrobcem nebylo na obalu uvedeno. Příprava živné půdy BSM Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 55,5 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu 50

(Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s BMS půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Následně po zchladnutí média byl přidán suplement BSM, a to ve výsledné koncentraci 0,116 g/l. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipraveného BMS média se suplementem BMS. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 42 °C po dobu 96 hodin anaerobně v anaerostatu. Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních. 4.2.1.6 Stanovení druhu Streptococcus thermophilus (ČSN ISO 9232) Kultivace bakteriálního druhu Streptococcus thermophilus byla provedena na médiu Streptococcus Thermophilus Isolation Agar (HiMedia, Indie). Složení média Streptococcus Thermophilus Isolation Agar Hydrolyzát kaseinu

10,0 g/l

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

Sacharóza

10,0 g/l

Fosfát draselný

2,0 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

Příprava živné půdy Streptococcus Thermophilus Isolation Agar Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 42 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 51

10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s médiem Streptococcus Thermophilus Isolation Agar vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipravené živné půdy Streptococcus Thermophilus Idolation Agar. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin anaerobně v anaerostatu. Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních.

4.2.1.7 Stanovení druhu Bacillus coagulans (ČSN EN 15784) Kultivace bakteriálního druhu Bacillus coagulans byla provedena na médiu Thermoacidurans Agar (HiMedia, Indie). Složení půdy Thermoacidurans Agar Pepton

5,0 g/l

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

Dextróza

5,0 g/l

Fosfát draselný

4,0 g/l

Bakteriologický agar

20,0 g/l

52

Příprava živné půdy Thermoacidurans Agar Živné médium bylo připraveno ve skleněné reagenční láhvi, kam bylo pomocí laboratorní váhy (220A, Schoeller instruments, Praha, ČR) naváženo 39 g dehydratované půdy a přelito 1000 ml destilované vody. Agar byl ponechán zhruba 10 minut v klidu, aby nabobtnal. Poté byla reagenční láhev vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780 Schoeller instruments, Praha, ČR) a její obsah byl při teplotě 121 °C po dobu 20 minut vysterilován. Po ukončení procesu sterilace byla láhev s médiem Themoacidurans Agar vložena do vodní lázně (Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) o teplotě 45 °C. Kultivace Na začátku bylo provedeno dekadické ředění, kdy byl rozpuštěn 1 g příslušného vzorku v 9 ml fyziologického roztoku. Do Petriho misek byl pak odpipetován vždy 1 ml vzorku z příslušného ředění. Následně bylo inokulum zalito cca 10 ml předpřipravené půdy Thermoacidurans Agar. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány v termostatu (Sanyo, Schoeller instruments, Praha, ČR) při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin anaerobně v anaerostatu. Hodnocení Po skončení inkubace byly pro výpočet použity misky, které neobsahovaly více než 300 KTJ ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Pro identifikaci jednotlivých izolátů bylo z každé misky odebráno pět suspektních kolonií. Tyto kolonie byly 3x přečištěny na specifických selektivních živných půdách a předány České sbírce mikroorganismů v Brně, která identifikace provedla. 4.2.2 Statistické vyhodnocení Mikrobiologické ukazatele byly měřeny ve třech opakováních u každého sledovaného vzorku, průměry z těchto tří měření byly použity ke statistickému vyhodnocení. Program Statistica 8 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) byl použit pro výpočet regresí (včetně testování lineární a kvadratické funkce). 53

5 VÝSLEDKY V diplomové práci bylo analyzováno osm vzorků farmaceutických preparátů od různých výrobců, které jsou volně dostupné v obchodní síti českých lékáren. Vzorky byly testovány na selektivních půdách na kvantitativní a kvalitativní zastoupení vybraných probiotických mikroorganismů rodu Bifidobacterium, rodu Lactobacillus, z něj pak konkrétně druhy L. acidophilus, L. casei a L. rhamnosus, dále druhu Streptococcus thermophilus a Bacillus coagulans. Vzorky byly pozorovány od zakoupení po dobu 150 dní skladování při pokojové teplotě. Zkoumané preparáty byly zakoupeny zhruba v polovině minimální deklarované doby trvanlivosti (24 měsíců), tedy asi jeden rok po jejich výrobě.

54

5.1 Porovnání závislosti počtu probiotických bakterií na době skladování 5.1.1 Vzorek č. 1 Tab. č. 6: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 1 (KTJ/g) Probiotické MO

L. rhamnosus

L.acidophilus

L. casei

Bifidobacterium

0

3,6 × 109

9,2 × 108

8,9 × 107

1,8 × 109

30

3,4 × 109

9,0 × 108

8,9 × 107

1,5 × 109

60

3,1 × 109

8,9 × 108

8,4 × 107

1,1 × 109

90

2,8 × 108

8,2 × 108

8,3 × 107

9,6 × 108

120

2,4 × 108

7,6 × 107

7,8 × 107

9,5 × 108

150

1,8 × 107

7,4 × 107

7,7 × 107

9,3 × 108

Dny

Vzorek č. 1 10

počty MO log KTJ/g

9,5 9 L rham.

8,5

L. acid.

8

L.casei

7,5

Bifi

7 6,5 6 0

20

40

60

80

100

120

140

160

doba skladování (dny)

Obr. 1: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. rhamnosus: R: y = 9,5862 + 0,0014x - 0,0001x2; R2 = 0,91; P < 0,0001 L. acidophilus: R: y = 8,9 + 0,04x - 0,0008x2; R2 = 0,74; P < 0,0001 L. casei: R: y = 7,9 - 0,0004x - 0,000001x2; R2 = 0,91; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 9,2 - 0,0046x + 0,00002x2; R2 = 0,96; P < 0,0001 55

Testovaný výrobek č. 1 obsahoval bakteriální rod Bifidobacterium a tři zástupce rodu Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus). Celkové počty těchto bakterií byly sledovány v průběhu 150. dnů opakovaně v 30. denních intervalech. Rod Bifidobacterium byl detekován v počtech odpovídajících tvrzení výrobce a vyšších po dobu skladování 60. dní. Od 60. dne dochází k poklesu počtu bifidobakterií o jeden logaritmický řád a toto snížení přetrvává až do 150 dne skladování. Ze zástupců rodu Lactobacillus dodrželi deklarované hodnoty L. rhamnosus (3,3 × 109 KTJ/g) i L. acidophillus (3,0 × 108 KTJ/g). U L. rhamnosus došlo po 60. dni skladování ke snížení počtu bakterií o jeden logaritmický řád a pokles byl zaznamenán až do 150. dne, kde se deklarované počty výrobcem snížili o dva logaritmické řády. Oproti tomu L. casei ani na počátku měření nesplňoval deklarované počty výrobcem (9 × 108 KTJ/g). Nejvyšší počáteční hodnota byla naměřena 8,9 × 107 KTJ/g. Tato hodnota byla konstantní po celou dobu sledování výrobku. U analyzovaného farmaceutického probiotického preparátu č. 1 byla prokázána přítomnost bakterií deklarovaných probiotických

rodů bakterií

a druhů, nebyly

ale

výrobcem

dodrženy.

deklarované

Změny

počtů

počty všech

jednotlivých zastoupených

probiotických bakterií v průběhu skladování (0 až 150 dnů) jsou vysoce statisticky průkazné (P < 0,0001).

56

5.1.2 Vzorek č. 2 Tab. č. 7: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 2 (KTJ/g) Probiotické MO

L. rhamnosus

L.acidophilus

L. casei

Bifidobacterium

0

4,4 × 108

1,5 × 108

1,3 × 109

1,9 × 107

30

4,4 × 108

1,5 × 108

1,3 × 109

1,9 × 107

60

4,4 × 108

1,5 × 108

1,3 × 109

1,9 × 107

90

4,2 × 108

1,4 × 107

1,3 × 109

1,8 × 107

120

4,0 × 107

1,3 × 107

1,2 × 109

1,7 × 107

150

3,9 × 107

1,0 × 106

1,2 × 109

8,4 × 106

Počet dnů

Vzorek č. 2 9,5 9

počty MO log KTJ/g

8,5 8

L rham.

7,5

L. acid.

7

L.casei Bifi

6,5 6 5,5 5 0

50

100

150

doba skladování (dny)

Obr. 2: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. rhamnosus: R: y = 8,6 + 0,0043x - 0,00008x2; R2 = 0,72; P < 0,0001 L. acidophilus: R: y = 8,2 + 0,0024x - 0,0001x2; R2 = 0,90; P < 0,0001 L. casei: R: y = 9,1 - 0,0003x -0,00001x2; R2 = 0,86; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 7,2 + 0,003x - 0,00003x2; R2 = 0,76; P < 0,0001

57

Vzorek č. 2 měl stejné zastoupení probiotických bakterií jako vzorek č. 1, pouze se lišili jejich celkové deklarované počty výrobcem. Sledovaný probiotický rod Bifidobacterium nesplňoval hned při počáteční analýze deklarované počty výrobcem (2,5 × 108 KTJ/g), ale byl o jeden logaritmický řád nižší. Tyto počty zůstávají zachovány až do 120. dne skladování. Analýza na konci doby skladování preparátu prokázala pokles o další logaritmický řád. Zástupci rodu Lactobacillus dodrželi deklarované hodnoty výrobcem až do 60. dne skladování, přičemž L. casei si tyto doporučené hodnoty udržel po celou dobu skladování. U L. rhamnosus se počty bakterií na konci doby skladování snížili o jeden logaritmický řád a u L. acidophilus o řády dva. U analyzovaného farmaceutického probiotického preparátu č. 2 byla prokázána přítomnost bakterií deklarovaných rodů a druhů, ale výrobcem deklarované počty jednotlivých probiotických bakterií nebyly dodrženy, stejně jako u vzorku č. 1. Změny počtů všech zastoupených probiotických bakterií v průběhu skladování (0 až 150 dnů) jsou vysoce statisticky průkazné (P < 0,0001).

58

5.1.3 Vzorek č. 3 Tab. č. 8: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 3 (KTJ/g) Probiotické MO

B. coagulans

Počet dnů 0

8,0 × 107

30

7,5 × 107

60

7,5 × 107

90

7,5 × 107

120

7,4 × 107

150

7,4 × 107

Vzorek č. 3

počty MO log KTJ/g

7,92 7,9 7,88 7,86

B. coagulans

7,84 7,82 7,8 0

20

40

60

80

100

120

140

160

doba skladování (dny)

Obr. 3: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. B. coagulans: R: y = 7,9 - 0,0006x + 0,000003x2; R2 = 0,77; P < 0,0001

59

Vzorek č. 3 obsahoval jediný probiotický druh Bacillus coagulans. Výrobce deklaruje výskyt tohoto druhu v množství 4 × 107 KTJ/g a tento deklarovaný počet byl splněn po celou dobu sledování (0 až 150 dní). Měnící se naměřené počty bakterií Bacillus coagulans po celou dobu skladování vzorku č. 3 jsou statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001).

60

5.1.4 Vzorek č. 4 Tab. č. 9: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 4 (KTJ/g) L. casei

S.

Probiotické MO

L.

L.

Bifidobacterium

Dny

rhamnosus

acidophilus

0

4,2 × 109

6,1 × 109

8,8 × 109

9,3 × 107

1,2 × 1010

30

4,1 × 109

6,1 × 109

8,8 × 109

9,3 × 107

1,1 × 1010

60

4,1 × 109

6,1 × 109

8,8 × 109

9,3 × 107

1,1 × 1010

90

3,4 × 109

9,0 × 108

8,7 × 109

9,1 × 107

1,0 × 1010

120

2,4 × 109

9,0 × 108

8,7 × 109

8,9 × 107

1,0 × 1010

150

1,4 × 109

9,0 × 107

8,6 × 109

8,9 × 106

9,5 × 109

thermophilus

Vzorek č. 4 11

počty MO log KTJ/g

10 L rham.

9

L. acid.

8

L.casei

7

Bifi

6 5 0

50

100

150

doba skladování (dny)

Obr. 4: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. rhamnosus: R: y = 9,6 + 0,0021x - 0,00003x2; R2 = 0,99; P < 0,0001 L. acidophilus: R: y = 9,8 + 0,0029x - 0,000099x2; R2 = 0,89; P < 0,0001 L. casei: R: y = 9,9 - 0,000007x; R2 = 0,95; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 7,9 + 0,01x - 0,0001x2; R2 = 0,66; P < 0,0001 S. thermophilus: R: y = 10,1 - 0,0008x; R2 = 0,87; P < 0,0001

61

Sledovaný preparát č. 4 měl stejné složení jako vzorky č. 1 a č. 2, ale navíc ještě obsahoval probiotický kmen Streptococcus thermophilus. Na počátku analýzy až po 120. den sledování byl zastoupen tento probiotický druh v počtech o jeden logaritmický řád vyšších něž bylo deklarováno výrobcem na obalu výrobku. Ve 150. dni poklesly počty bakterií Streptococcus thermophilus o jeden logaritmický řád, ovšem v tomto případě byly dodrženy deklarované počty výrobcem. Zástupci rodu L. rhamnosus a L. casei dodrželi předepsané počty dané výrobcem a to po celou dobu sledování. Pokles byl zaznamenán u L. acidophilus ve 150. dni o jeden logaritmický řád a u rodu Bifidobacterium, kde již od počátku byly počty sníženy o dva logaritmické řády. Ve 150. dni byl naměřen další pokles o jeden logaritmický řád. Ani tento výrobek nesplňoval tvrzení o počtech zastoupených probiotických bakterií na etiketě výrobku. Změny v počtech sledovaných probiotických mikroorganismů byly statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001).

62

5.1.5 Vzorek č. 5 Tab. č. 10: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 5 (KTJ/g) L. casei

S.

Probiotické MO

L.

L.

Bifidobacterium

Dny

rhamnosus

acidophilus

0

2,0 × 109

1,4 × 109

3,5 × 109

1,3 × 109

7,5 × 108

30

1,5 × 109

1,4 × 109

3,3 × 109

1,2 × 109

7,4 × 108

60

1,3 × 109

1,2 × 109

3,3 × 109

1,2 × 109

7,3 × 108

90

9,2 × 108

1,1 × 109

3,1 × 109

9,2 × 108

7,3 × 108

120

9,2 × 108

1,1 × 108

2,9 × 109

9,1 × 108

7,3 × 108

150

9,1 × 108

1,1 × 108

2,7 × 109

9,1 × 108

7,3 × 108

thermophilus

Vzorek č. 5 10

počty MO log KTJ/g

9,5 L rham.

9

L. acid.

8,5

L.casei Bifi

8

St.thermo.

7,5 7 0

50

100

150

200

doba skladování (dny)

Obr. 5: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. rhamnosus: R: y = 9,3 - 0,005x + 0,00002x2; R2 = 0,95; P < 0,0001 L. acidophilus: R: y = 9,2 + 0,003x - 0,00008x2; R2 = 0,76; P < 0,0001 L. casei: R: y = 9,5 - 0,0003x - 0,000002x2; R2 = 0,97; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 9,1 - 0,002x + 0,000003x2; R2 = 0,76; P < 0,0001 S. thermophilus: R: y = 8,9 – 0,0002x + 0,000001x2; R2 = 0,80; P < 0,0001 63

Skladba probiotických bakterií vzorku č. 5 je totožná se vzorkem č. 4, pouze deklarované počty výrobcem se liší. Na rozdíl od vzorku č. 4 nejlepších výsledků dosahoval nejen druh S. thermophilus, ale i druh L. casei. Po celou dobu sledování (0 až 150 dnů) si zachovali počty deklarované výrobcem (6 x 108 a 3,4 x 109 KTJ/g). Stejně tak dodrželi deklarované počty KTJ/g i ostatní zástupci tohoto farmaceutického preparátu. Ale pouze do 90. dne skladování. Následně dochází u všech k poklesu o jeden logaritmický řád. Početní změny jednotlivých zástupců v průběhu skladování byly statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001). Ve srovnání s předešlými preparáty lze tento hodnotit jako více vyhovující i přes mírný pokles některých zástupců.

64

5.1.6 Vzorek č. 6 Tab. č. 11: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 6 (KTJ/g) Probiotické MO

L. acidophilus

Bifidobacterium

S. thermophilus

0

1,1 × 109

2,6 × 108

9,8 × 108

30

1,0 × 109

2,6 × 108

9,6 × 108

60

9,5 × 108

2,5 × 108

9,3 × 108

90

9,5 × 108

2,4 × 108

9,3 × 108

120

9,3 × 108

2,4 × 108

9,3 × 108

150

9,3 × 108

2,2 × 108

9,3 × 108

Počet dnů

Vzorek č. 6 9,1 9 8,9

počty MO log KTJ/g

L. acid.

8,8

Bifi

8,7

St.thermo .

8,6 8,5 8,4 8,3 0

50

100

150

200

doba skladování (dny)

Obr. 6: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. acidophilus: R: y = 9,0 - 0,001x + 0,000005x2; R2 = 0,93; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 8,4 - 0,00007x - 0,000002x2; R2 = 0,94; P < 0,0001 S. thermophilus: R: y = 9,0 – 0,0004x + 0,000002x2; R2 = 0,95; P < 0,0001

65

Vzorek č. 6 byl zastoupen třemi probiotickými rody a druhy (Bifidobacterium, L. acidophilus a S. thermophilus). Ze stanovovaných probiotických mikroorganismů dodržel předepsané počty KTJ/g pouze L. acidophilus. 60. až 150. den došlo ke snížení hodnot o jeden logaritmický řád. U rodu Bifidobacterium a S. thermophilus byly shodně od počátku do konce doby skladování naměřeny hodnoty nižší o jeden logaritmický řád. Měnící se počty analyzovaných probiotických bakterií byly statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001). Deklarované počty v tomto potravním doplňku nesplňovaly hned od počátku požadavky nastavené výrobcem, což může být způsobeno technologií výroby, kdy výrobce používá stejné zařízení pro výrobu různých výrobků (ŠPANOVÁ a kol. 2011).

66

5.1.7 Vzorek č. 7 Tab. č. 12: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 7 (KTJ/g) Probiotické MO

Lactobacillus

Bifidobacterium

0

1,1 × 107

8,1 × 106

30

1,1 × 107

8,0 × 106

60

1,1 × 107

8,0 × 106

90

1,1 × 107

8,0 × 106

120

1,1 × 107

8,0 × 106

150

1,0 × 107

8,0 × 106

Počet dnů

Vzorek č. 7

počty MO log KTJ/g

7,1

7 Lactobacillus Bifidobacterium

6,9

6,8 0

50

100

150

200

doba skladování (dny)

Obr. 7: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Lactobacillus: R: y = 7,0 - 0,00006x - 0,000001x2; R2 = 0,96; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 6,9 - 0,00007x; R2 = 0,87; P < 0,0001

67

Vzorek č. 7 zastupovaly pouze dva probiotické rody (Lactobacillus a Bifidobacterium). Deklarované počty bakterií 1 × 107 KTJ/g rodu Lactobacillus byly udrženy po celou dobu skladování. KTJ/g. Zatímco rod Bifidobacterium od počátku až po 150. den dosahoval z předepsaného počtu 1 × 107 KTJ/g pouze počty 1 × 106 KTJ/g. Ani v tomto případě nebyly deklarované terapeutické počty probiotických bakterií dodrženy. Všechny hodnoty naměřené po celou dobu skladování byly statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001).

68

5.1.8 Vzorek č. 8 Tab. č. 13: Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 8 (KTJ/g) Probiotické MO

L. acidophilus

Bifidobacterium

0

4,4 × 109

2,5 × 108

30

4,4 × 109

2,3 × 108

60

4,4 × 109

2,3 × 108

90

4,4 × 109

2,2 × 108

120

7,4 × 108

2,1 × 108

150

6,2 × 108

8,9 × 107

Počet dnů

Vzorek č. 8 9,8 9,6

počty MO log KTJ/g

9,4 9,2 L. acidophilus

9

Bifidobacterium

8,8 8,6 8,4 8,2 0

50

100

150

200

doba skladování

Obr. 8: Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. L. acidophilus: R: y = 9,6 + 0,004x - 0,00007x2; R2 = 0,77; P < 0,0001 Bifidobacterium: R: y = 8,4 + 0,003x - 0,00003x2; R2 = 0,73; P < 0,0001

69

U vzorku č. 8 výrobce deklaruje na obalu počty probiotických bakterií druhu L. acidophilus 1 x 109 KTJ/g a rodu Bifidobacterium 1 x 109 KTJ/g. Druh L. acidophilus tyto počty splňoval až do 90. dne skladování a následně dochází k jeho snížení o jeden logaritmický řád. Rod Bifidobacterium stanovené počty nedodržoval o jeden logaritmický řád od 0. až po 120. den skladování. Ve 150. dni klesají počty rodu Bifidobacterium ještě o jeden logaritmický řád. Snižování počtů u obou sledovaných bakterií bylo statisticky vysoce průkazné (P < 0,0001).

70

6 DISKUZE V dnešní moderní době nacházejí probiotika uplatnění jak ve fermentovaných výrobcích převážně mléčných, tak ve farmaceutických doplňcích stravy. Cílem této diplomové práce bylo ověření celkového deklarovaného počtu probiotických bakterií ve vybraných farmaceutických preparátech. Pro stanovení vybraných sledovaných probiotických bakterií byly použity selektivní živné půdy. Analyzováno bylo celkem osm vybraných farmaceutických preparátů a analýza probíhala od zakoupení po dobu 150 dnů v měsíčních intervalech. Všechny pořízené preparáty se pohybovaly zhruba v polovině své minimální doby trvanlivosti, která je stanovená na 24 měsíců. Z hlediska kvalitativního zastoupení splnily všechny analyzované výrobky požadavky na deklarované druhy mikroorganismů, tzn. ve sledovaných výrobcích byly identifikovány

probiotické

druhy

L.

acidophilus,

L.

casei,

L.

rhamnosus,

S. thermophilus, B. coagulans a rod Bifidobacterium. Výše uvedené bakteriální druhy a rody jsou označovány a využívány jako probiotika. Ta jsou definována jako živé mikroorganismy, které pokud jsou přijímané alespoň v množství terapeutické dávky příznivě ovlivňují zdravotní stav konzumenta (adheze ke střevnímu epitelu, produkce antimikrobiálních látek, schopnost imunomodulace a schopnost zabraňovat rozvoji patogenních mikroorganismů) (NAGY et al., 2011). Tyto probiotické bakterie bývají nejčastěji používanými mikroorganismy, které se uplatňují ve výživě lidí i zvířat. Z hlediska

kvantitativního

zastoupení

sledovaných

probiotických

mikroorganismů byly v některých případech shledány nesrovnalosti s počty probiotik deklarovaných výrobcem. U výrobků č. 2, 4, 6, 7 a 8 nebyly splněny počty bakterií rodu Bifidobacterium, již na počátku sledovaného období. Nedodržení deklarovaného počtu bakterií rodu Bifidobacterium je možné odůvodnit tím, že při výrobě farmaceutických preparátů, tedy převedení bakteriálních kultur do lyofilizovaného stavu, může tyto mikroorganismy negativně ovlivnit vysoká teplota sušení. Například při použití teploty nad 120 °C u bifidobakterií byla jejich životaschopnost výrazně snížena (OʹRIORDAN et al., 2001). Jako materiály využívané pro potahování probiotických kapslí je možné používat například alginát sodný, kukuřičný škrob, chitosan či různé směsi bílkovin (MUTHUKUMARASAMY et al., 2006, HOMAYOUNI et al., 2008). 71

Ve studii (SOTO et. al., 2011) byla pozorována vyšší životaschopnost bakterií L. casei v kapslích potažených směsí alginátu a škrobu. Ve studii (SABIKHI et al., 2010) testovali použití alginátu sodného a škrobu jako ochranu před nepříznivými podmínkami zažívacího traktu (pH 1 – 2) a vysokou koncentrací solí žlučových kyselin (1 – 2 %). V pokusu bylo zjištěno, že takto zapouzdřené bakterie vykazovaly životaschopnost až o čtyři logaritmické řády vyšší než bakterie bez enkapsulace. Výrobce námi pozorovaných produktů typ obalového materiálu neuvádí, proto je možné se domnívat, že životaschopnost probiotických bakterií může být ovlivněna právě tímto faktorem. U bakterií rodu Bifidobacterium bývá snížena životaschopnost i v jiných probiotických produktech, např. u kysaných mléčných výrobků. Kromě u jednoho vzorku, u všech analyzovaných vzorků byly detekovány počty bakterií rodu Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus), které odpovídaly počtům deklarovaným výrobcem. Bakterie rodu Lactobacillus mají schopnost přilnout ke slizničním povrchům střev a jejich následné dlouhodobé či krátkodobé kolonizace. Mnoho druhů bakterií ze skupiny Lactobacillus je také schopno produkovat přírodní antibiotika s širokým spektrem působnosti a jiné příznivé účinky laktobacilů zahrnují zlepšení imunity, lepší vstřebávání živin a omezení vázání patogenů ve střevech. Laktobacily také pomáhají snížit intoleranci laktózy (GILLILAND and KIM, 1984, SWARTZBURG, 2011). L. rhamnosus se vyskytoval ve čtyřech z celkově analyzovaných vzorků, z toho ve třech preparátech docházelo k průkaznému poklesu počtů těchto bakterií po 60. – 90. dnech skladování. L. casei se vyskytoval ve čtyřech z osmi vzorků, z toho ve třech preparátech byly splněny požadavky na počty bakterií v průběhu celé doby sledování. V případě vzorku č. 4 byly počty bakterií L. casei a L. rhamnosus splněny po celou dobu sledování (0 - 150 dní). Bakterie L. acidophilus byly deklarovány u šesti analyzovaných vzorků, z toho u pěti z nich byl zaznamenán pokles jejich počtů již po 60. – 90. dni sledování, u šestého již po 30. dni. Tolerance sledovaných druhů vůči podmínkám technologického zpracování nebyly dosud publikovány, ale můžeme se domnívat, že některé druhy bakterií mohou být na způsob tohoto zpracování citlivější (např. lyofilizace). Z provedených analýz vyplývá, že vzorek č. 6 nesplňoval podmínky deklarované výrobcem. Porovnáním konzistence výrobku č. 6 s ostatními výrobky byla pozorována 72

odlišná technologie výroby, což mohlo negativně ovlivnit životaschopnost sledovaných bakterií. Počty těchto bakterií nebyly splněny již od počátku (Bifidobacterium, S. thermophilus), příp. od 30. dne skladování (L. acidophilus). Rozdílná technologie výroby byla pozorována také u vzorku č. 7 (který byl ve formě tablet), což mohlo ovlivnit počty bifidobakterií, které byly již od počátku nízké. Druh Streptococcus thermophilus se nacházel ve třech zkoumaných vzorcích č. 4, 5, 6. U dvou vzorků č. 4 a č. 5 byly dodržené deklarované počty výrobcem po celou dobu analyzování. Po kvalitativní i kvantitativní stránce byl nejlépe hodnocen výrobek č. 3 se zastoupením jediného probiotického druhu Bacillus coagulans, který byl detekován od počátku (0. den) až do konce (150. den) sledovaného období v deklarovaném počtu. Jedním z možných faktorů, které mohly ovlivnit dobré přežívání bakterií tohoto druhu v lyofilizovaných tabletách je, že Bacillus coagulans vytváří spory. Spory jsou odolné vůči nepříznivému prostředí, dobře přežívají průmyslové zpracování a zajišťují dlouhodobou životaschopnost bakterie i po dobu skladování (VECCHII and DRAGO, 2006). Dr. Mercola z USA během své praxe zjistil, že nejúčinnějšími probiotickými přípravkami jsou ty, které obsahují právě druh B. coagulans. Tento druh má schopnost přežít i vysoce kyselé prostředí žaludku daleko lépe, než jiné kultury (MACHALA, 2008). Rod Bacillus je pro své vlastnosti považován za nejvýhodnější probiotikum také ve výživě prasat, protože je nejstabilnější, jak při zpracování krmiva (peletizace), tak při zkrmování (VÁCLAVKOVÁ a LUSTYKOVÁ, 2011). B. coagulans vykazuje silnou antimikrobiální aktivitu proti bakteriím Clostridium difficile a Clostridium perfringens, neboť potlačují průjmová onemocnění jak u lidí, tak u zvířat (KELLER et al., 2010).

73

7 ZÁVĚR V diplomové práci byly shrnuty informace, které se týkají problematiky probiotik. Byly popsány jejich vlastnosti, podmínky působení, příznivé účinky na zdraví člověka jako hostitele a dále také bezpečnostní a legislativní požadavky na probiotika. Blíže pak byly charakterizovány rody a druhy probiotických bakterií, které jsou součástí experimentální části práce (rod Lactobacillus, z něj druhy L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, dále rod Streptococcus, z něj druh S. thermophilus, také rod Bacillus, z něj druh B. coagulans a rod Bifidobacterium). Pozornost také byla věnována formám preparátů, ve kterých jsou probiotika na našem trhu k dostání. Na závěr byly stručně popsány vybrané možnosti identifikace probiotických bakterií. Experimentální část diplomové práce se zabývala ověřováním celkových počtů výše uvedených probiotických bakterií, které výrobce deklaruje na obalu produktu. Tyto počty byly ověřovány u osmi farmaceutických preparátů zakoupených v síti lékáren v ČR. K analýze byla zvolena mikrobiologická kultivace na selektivních půdách. Následně byla vyhodnocována rodová a druhová identifikace probiotických mikroorganismů a jejich celkové počty životaschopných buněk. Tento experiment byl zahájen zhruba v polovině minimální deklarované doby trvanlivosti, tedy asi jeden rok po výrobě probiotického preparátu a byl sledován po dobu 150 dní. Získané výsledky byly statisticky zpracovány a vyhodnoceny. V této

práci

mikroorganismů

bylo

odpovídalo

zjištěno, údajům

že

kvalitativní

deklarovaným

zastoupení výrobcem.

probiotických Naproti

tomu

kvantitativní zastoupení jednotlivých sledovaných rodů a druhů tvrzením výrobců až na jeden produkt neodpovídalo. Po kvantitativní stránce tedy došlo ke klamání spotřebitele, neboť zastoupení jednotlivých sledovaných rodů a druhů tvrzením výrobce neodpovídalo. I přesto, že u většiny analyzovaných výrobků došlo v průběhu skladování ke snížení deklarovaných počtů probiotických bakterií, lze konstatovat, že terapeutické minimum, které zajišťuje zdravotní prospěšnost, bylo dodrženo. Toto minimum činí 1 × 106 KTJ/g. Tyto početní rozdíly mohou být zapříčiněny rozdílnými technologiemi výroby, které výrazně ovlivňují životaschopnost bakterií.

74

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ALONZO, F. C. B. and SAAD. Bactérias do grupo Lactobacillus casei: caracterização, viabilidade como porbióticos em alimentos e sua importância para a saúde humana. Archivos Latinoamericanos de Nutricion. Organo Oficial de la Sociedad Latinoamericana de Nutrición. 2007 AMBROŽOVÁ, J. Mikrobiologie v technologii vod. 1. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko technologická v Praze. 2004. 252 s. ISBN 80-7080-534-x BARTŮŇKOVÁ, J. PULÍK, M. a kol. Vyšetřovací metody v imunologii. 2. vyd. Praha: Grada Publishing, a. s. 2011. 172s. ISBN 978-80-247-3533-7 BERGEY, D. H. and BOONE, D. R. Bergeyʹs Manual of Systematic Bacteriology 3. 2. vol. Springer Dordrecht. 2009. 1450s. ISBN 978-0-367-95041-9 BLATTNÁ, J. DOSTÁLOVÁ, J. PERLÍN, C. TLÁSKAL, P. Výživa na začátku 21. století aneb o výživě aktuálně a se zárukou. Praha: Společnost pro výživu, Nadace NutriVIT. 2005. 79s. ISBN 80-239-6202-7 BURDYCHOVÁ, R. a SLÁDKOVÁ, P. Mikrobiologická analýza potravin. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita. 2007. 218 s. ISBN 978-80-7375116-6 DWORKIN,

M.

FALKOW,

S.

ROSENBERG,

E.

SCHLEIFER,

K.

H.

STACKEBRANDT, E. The Prokaryotes:Bacteria:Firmicutes, Cyanobacteria. 4. vol. Springer. 2006. 1140s. ISBN 0-387-25494-3 FERENČÍK, M. ROVENSKÝ, J. SHOENFELD, Y. MAŤHA, V. Imunitní systém – Informace pro každého. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, a. s. 2005. 236s. ISBN 80247-1196-6 FOŘT, P. Zdraví a potravní doplňky. Praha: Euromedia Group, k. s. 2005. 398s. ISBN 80-249-0612-0 GAJDŮŠEK, S. Mlékařství II. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita. 2002. 142s. ISBN 80-7157-342-6. GAJDŮŠEK, S. KLÍČNÍK, V. Mlékařství. Brno: Vysoká škola zemědělská. 1985. 128s. 75

GILLIAND, S. E., and KIM, H. S. Effect of viable starter culture bacteria in yogurt on lactose utilization in humans. Journal of Dairy Science. 1984. GÖRNER, F. a VALÍK, Ĺ. Aplikovaná mikrobiológia poživatín. Bratislava: Malé centrum. 2004. 528s. ISBN 80-967064-9-7. GROFOVÁ, Z. Nutriční podpora – Praktický rádce pro sestry. Grada Publishing a. s. 2007. 248s. ISBN 978-80-247-1868-2 HOLZAPFEL, W. H. and WOOD, B. J. B. The lactic acid bakteria: The genera of lactic acid bakteria. 2. vyd. Blackie Academic and Proffesional. 1995. ISBN 0-7514-0215-x HOMAYOUNI, A., AZIZI, A., EHSANI, M. R., YARMAND, M. S.,RAZOVI, S. H., Effect of microencapsulation and resistant starch on the probiotik survival and sensory properties of synbiotic ice team. Food Chem. 111. 2008, 50-55 HUI, Y. H. CHANDAN, R. C. CLARK, S. CROSS, N. DOBBS, J. HURTS, W. J. NOLLET, L. M. L. SHIMONI, I. SINHA, N. SMITH, E. B. SURAPAT, S. TITCHENAL, A. TOLDRA, F. 2. vol. Handbook of Food Products Manufacturing. John Wiley & Sons. 2007. 850s. ISBN 978-0-470-12525-0 KALAČ, P. Funkční potraviny – kroky ke zdraví. České Budějovice: DONA s.r. o. 2003. 130s. ISBN 80-7322-029-6 KELLER, D. FARMER, S. McCARTNEY, A. GIBSON, G. Bacillus coagulans as a probiotik. Food Science and Technology: Functional Foods. 2010 KLABAN, V. Svět mikrobů. Ilustrovaný lexikon mikrobiologie životního prostředí. 2. Vyd. 2. Hradec Králové: Gaudeamus. 2001. 416s. ISBN 80-7041-687-4. KVASNIČKOVÁ, A. Sacharidy pro funkční potraviny: probiotika, prebiotika a symbiotika. Praha: UZPI. 2000. s. ISBN 80-7271-001-x LEE, Y. K. and SALMINEN, S. Handbook of probiotics and prebiotics. John Wiley & Sons. 2009. 596s. ISBN 978-0-470-13544-0 LJUNGH, A. and WANDSTRÖM, T. Molecular biology – From Genomics to Probiotics. Caister Academic Press. 2009. 205s. ISBN: 978-1-904455-41-7

76

MACHALA, K. Kvašená zelenina pro zdraví a vitalitu – léčivé účinky, recepty, historie. Olomouc: Nakladatelství ANAG. 2008. 155s. ISBN 978-80-7263-482-8. McSWEENEY, P. L. H. and FOX, P. F. Advanced dairy chemistry 3 – Lactose, Water, Salts and Minor Constituenst. Springer Science+Business Media. 2009. 784. ISBN 9780-387-84864-8. MUTHUKUMARASAMY, P., WOJTAS, P. A., HOLLEY, R. A. Stability of Lactobacillus reuteri in different type sof microcapsules. J. Food Sci. 71. 2006. 20-24. MÜLLEROVÁ, D. Zdravá výživa a prevence civilizačních nemocí ve schématech – z pohledu jednotlivce i populačních skupin. 1. vyd. Praha: Triton s.r. o. 2003. 99s. ISBN 80-7254-421-7 NAGY, I., WINKLEROVÁ, V., a LUKEŠOVÁ, O., Probiotika, prebiotika, synbiotika a jejich vztah k imunitě. Výživa a potraviny (4). 2011. 86 -87. OʹRIORDAN, K. ANDREWS, D. BUCKLE, K. CONWAY, P. Evaluation of microcapsulation of a Bifidobacterium strain with starch as an approach to prolonging viability during storage. J Appl Microbiol. 2001 PETR, P. a KALOVÁ, H. Nutraceutika – vybrané kapitoly z nutraceutické teorie a praxe. 1. vyd. České Budějovice: Vysoká škola evropských a regionálních studií, o. p. s. 2006. 47s. ISBN 80-86708-17-9. RADA, V. ROČKOVÁ, Š. BUNEŠOVÁ, V. VLKOVÁ, E. Hodnocení probiotických výrobků - Sborník přednášek V. sympozia společnosti pro probiotika a prebiotika. 1. vyd. Praha: ČZU. 2010. 18s. ISBN 978-80-213-2072-7. RAK, R. MATYÁŠ, V. ŘÍHA, Z. a kol. Biometrie a identita člověka ve forenzních a komerčních aplikacích. Brno: Grada Publishing, a. s. 2008. 664s. ISBN 978-80-2472365-5 ROBINSON, R. K. Dairy mikrobiology handbook – The mikrobiology of milk and milk products. John Wiley & Sons. 2002. 765s. ISBN 0-471-38596-4 SABIKHI, L. BABU, R. THOMPKINSON, D.K. KAPILA, S. Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions. Food Bioprocess Technol. 2010. 77

SOTO, L. P. FRIZZO, L. S. AVATANEO, E. ZBRUN, M. V. BERTOZZI, E. SEQUEIRA, G. SIGNORINI, M. L. ROSMINI, M. R. Design of macrocapsules to improve bacterial viability and supplementation with a probiotik for young calves. Animal Feed Science and Technology. 2011. ŠILHÁNKOVÁ, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vyd. Praha: Academia, nakladatelství Akademie věd České republiky. 2002. 363s. ISBN 80-2001024-6. ŠPANOVÁ, A. BALOGOVÁ, P. KRISTOVÁ, M. TRACHTOVÁ, Š. VÍDEŇSKÁ, P. ZOVČÁKOVÁ, M. RITTICH, B. Identifikace probiotických baktérií v doplňcích stravy a vaginálních tabletách s využitím PCR – Sborník přednášek VI. sympozia společnosti pro probiotika a prebiotika. 1. vyd. Praha: ČZU. 2011. 23 s. ISBN 978-80-213-2173-1 ŠVEC, P. DRABL, V. SEDLÁČEK, I. Ribotyping of Lactobacillus casei Group Strains Isolated from Dairy Products. Czech Collection of Microorganisms. Faculty of Scince. Masaryk University. 2005 TANNOCK, G. Probiotics and Prebiotics – Where are we going?. Caister Academic Press. 2002. 333s. ISBN 0-9542464-1-1. VÁCLAVKOVÁ, E. a LUSTYKOVÁ, A. Probiotika ve výživě prasat. VECCHI, E. and DRAGO, L. Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabelling? International Journal of probiotics and prebiotics. 2006 VERDENELLI, M. C., GHELFI, F., SILVI, S., ORPIANESI, C., CECCHINI, C., and CRESCI, A. Probiotics properties of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei isolated from human faeces. European Journal of Nutritio. 2009. VOTAVA, L. a kol. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun. 2003. 495s. ISBN 80-902896-6-5 WEBB, G. P. Dietary supplements and functional fouds. Blackwell Publishing. 2006. 242s. ISBN 1-4051-1909-8 WINKLEROVÁ, D. Funkční potraviny a legislativa. Časopis Výživa a potraviny. 2009

78

ZINEDINE, A. and FAID, M. Isolation and Characterization of Strains of Bifidobacteira with Probiotic Proprieties In vitro.World Journal of Dairy & Food Sciences. 2007 Elektronické zdroje [on-line]: AKADEMIE VĚD ČR. Sjednocená pravidla pro kvalitativní polymerázovou řetězovou reakci zlepšující kvalitu výzkumných studií. 2009. [cit. 2012-4-3] Dostupné z: BARTOŠOVÁ, L. Účinky živých bakterií v potravinách. Státní zemědělská a potravinářská inspekce. 2009. [cit. 2012-3-21] Dostupné z : BOMBA, A. Bezpečnosť probiotik. 2011 [cit. 2012-3-13] Dostupné z: BRONSKÝ, J. Využití probiotik v pediatrii. Zdravotnické noviny. 2008. [cit. 2012-319] Dostupné z: FRIČ, P. Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi. 2005 [cit. 2012- 3-15] Dostupné z: GUIDELINES FOR THE EVALUATION OF PROBIOTICS IN FOOD, 2002 [cit. 2012-3-13] Dostupné z: < ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf> HORÁKOVÁ, K. Probiotika – užívání probiotik. Dr. Natura. 1998 – 2012 [cit. 2012-321] Dostupné z:< http://www.drnatura.cz/probiotika.php> KREJSEK, J. KUDLOVÁ, M. KOLÁČKOVÁ, M. NOVOSAD, J. Nutrice, probiotika a imunitní systém: II. část: Nutrice, přirozená slizniční mikroflóra a individuální imunitní reaktivita. Pediatrie pro Praxi. 2007. [cit. 2012-4-1] Dostupné z: KULTIVAČNÍ METODY STANOVENÍ MIKROORGANISMŮ. [cit. 2012-04-03] Dostupné z: LISÁK, V. Probiotika. 2012 [cit. 2012-3-20] Dostupné z: 79

NEVORAL, J. Prebiotika, probiotika a symbiotika. Pediatrie pro praxi. 2005. [cit. 2012-4-1] Dostupné z: NEVORAL, J. Probiotika a prebiotika. Medical Tribune – Scéna medicíny – informace, excerpta, zajímavosti. 2008 [cit. 2012-3-20] Dostupné z: SMÍŠEK, J. Kultivace bakterií na pevných půdách. Lékařská bakteriologie. 2009. [cit. 2012-04-03] Dostupné z: SPOLEČNOST PRO PROBIOTIKA A PREBIOTIKA. 2007 – 2012. [cit. 2012-3-15] Dostupné z: SWARTZBURG, R. Probiotic Strains, 2011 [cit. 2012-04-04] Dostupné na: ŠPELINA,V. Informace vědeckého výboru pro potraviny ve věci: Probiotika a startovací kultury. Vědecký výbor pro potraviny. 2006 [cit. 2012-3-13] Dostupné z: ŠPELINA, V. a WINKLEROVÁ, D. Principy hodnocení účinnosti a bezpečnosti probiotik a charakteristika registrovaných doplňků stravy s obsahem probiotik a probiotik. Pediatrie pro praxi. 2009. [cit. 2012-3-13] Dostupné z: VYHLÁŠKA Č. 77/2003 Sb. Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje.[cit. 2012-3-21]Dostupné z: Použité normy ČSN ISO 7218 (560103) Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení

80

ČSN P ENV ISO 11133-1 (560099). Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro přípravu a výrobu kultivačních půd – Část 1: všeobecné pokyny pro zabezpečování jakosti při přípravě kultivačních půd v laboratoři. ČSN ISO 17792 (5606439) Mléko, mléčné výrobky a mezofilní startovací kultury – Stanovení počtu bakterií mléčného kvašení fermentujících citráty – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 25 °C ČSN ISO 20128 (560642) Mléčné výrobky – Stanovení počtu presumptivního Lactobacillus acidophilus na selektivní živné půdě – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 37 °C ČSN EN 15785 (467046) Krmiva – Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Bifidobacterium ČSN EN 15784 Krmiva – Izolace a stanovení počtu presumptivních bakterií rodu Bacillus ČSN ISO 9232 – Jogurt – Identifikace charakteristických mikroorganismů (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus)

81

SEZNAM TABULEK Tab. 1. Komerční vývoj různých druhů prebiotických sacharidů. Tab. 2. Rody bakterií mléčného kysání, jejich fermentační typ a produkty Tab. 3. Nejčastěji používané probiotické mikroorganismy Tab. 4. Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích Tab. 5. Vybrané probiotické doplňky stravy dostupné na trhu Tab. 6. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 1 (KTJ/g) Tab. 7. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 2 (KTJ/g) Tab. 8. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 3 (KTJ/g) Tab. 9. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 4 (KTJ/g) Tab. 10. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 5 (KTJ/g) Tab. 11. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 6 (KTJ/g) Tab. 12. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 7 (KTJ/g) Tab. 13. Kvantitativní zastoupení probiotických bakterií ve vzorku č. 8 (KTJ/g)

82

SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 2. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 3. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 4. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 5. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 6. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 7. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování. Obr. 8. Porovnání závislosti počtu sledovaných mikroorganismů na době skladování.

83