ORIGINÁLNÍ VYUŽITÍ REVERZNÍ OSMÓZY PŘI TESTOVÁNÍ TOXICITY ENVIRONMENTÁLNÍCH VZORKŮ

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ

ORIGINÁLNÍ VYUŽITÍ REVERZNÍ OSMÓZY PŘI TESTOVÁNÍ TOXICITY ENVIRONMENTÁLNÍCH VZORKŮ Diplomová práce

Kamila Krejčí

VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Mgr. MICHAL BITTNER, Ph.D.

Brno 2013

BIBLIOGRAFICKÝ ZÁZNAM Autor:

Bc. Kamila Krejčí Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Originální

využití

reverzní

osmózy

při

testování

toxicity

environmentálních vzorků

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Ekotoxikologie

Vedoucí práce:

RNDr. Mgr. Michal Bittner, Ph.D.

Akademický rok:

2013

Počet stran:

71

Klíčová slova:

estrogenní látky, endokrinní disrupce, reverzní osmóza, extrakce tuhou fází, in vitro testování

BIBLIOGRAPHIC ENTRY Author:

Bc. Kamila Krejčí Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental biology

Title of Thesis:

Original use of reverse osmosis for preparation of environmental samples for toxicity testing

Degree Programme: Experimental biology

Field of Study:

Ecotoxicology

Supervisor:

RNDr. Mgr. Michal Bittner, Ph.D.

Academic Year:

2013

Number of Pages:

71

Keywords:

estrogenic substances, endocrine disruption, reverse osmosis, solid phase extraction, in vitro testing

ABSTRAKT Látky vykazující estrogenní potenciál mají schopnost působit na endokrinní systém exponovaných organismů. Tyto látky jsou nezbytné pro přirozený vývoj všech organismů. Problém je však dávka, která se do organismů dostává. Estrogenní látky, které se vyskytují v odpadních vodách, a které čistírny odpadních vod neodfiltrují, mohou působit na organismy negativně. V rámci této studie byla navržena a optimalizována metoda hodnocení estrogenity vodných vzorků pomocí in vitro testu, ve kterých se využívala buněčná linie HeLa 9903, obsahující reportérový gen pro luciferázu. Dále byla navržena a testována reverzní osmóza (RO), a to jako metoda prekoncentrace vodného vzorku před samotným in vitro testováním. RO pro tyto účely nebyla doposud prostudována. Touto metodou byly připravovány vodné vzorky, a to zakoncentrováním vodného roztoku 17-estradiolu, který byl sledován pro svůj estrogenní potenciál. Výtěžnost metody RO byla porovnávána s výtěžností metody extrakce tuhou fází (SPE). Během testů bylo zjištěno, že je RO schopna zakoncentrovat vodný vzorek přibližně 93x a metoda SPE je schopna vodný roztok zakoncentrovat přibližně 12x. Jedná se však o prvotní výsledky, které bude nutno upřesnit (neboť se rozchází teoretické výpočty účinnosti RO s experimentálními zjištěními).

ABSTRACT Substances exhibiting estrogenic potential have the ability to act on the endocrine system of exposed organisms. These substances are essential for the natural evolution of organisms. However, the problem is the amount of the substance which is entering the organism. Estrogenic substances, that are present in wastewater, which are not filtered during treatment, could have a negative effect on organisms. In this study, there was designed and optimized method of evaluation of estrogenic aqueous samples by in vitro assay using the cell line HeLa 9903, which contains the reporter luciferase gene. Furthemore, there was also designed and tested the use of reverse osmosis (RO) method, as a method of water sample preconcentration prior to in vitro testing. RO has not been studied yet for this purpose. By this method, aqueous samples were prepared by concentrating of 17β-estradiol water solution, which were then monitored for their estrogenic potential. The RO method was compared with the SPE method. During the tests it was found that the RO separation method is capable of concentrating the aqueous sample approximately 93x and the SPE method is able to concentrate the aqueous solution approximately 12x. There are preliminary results that is necessary to valide (because there is discrepancy in theoretical and experimentel results).

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli RNDr. Mgr. Michalovi Bittnerovi, Ph.D. za všestrannou podporu, velkou ochotu, trpělivost a odborné vedení. RNDr. Barboře Jarošové bych ráda poděkovala za zasvěcení do metody extrakce tuhou fází. Za pomoc při práci v laboratoři děkuji Roswitě Liškové. Děkuji také SFZP grantu za finanční podporu. Poděkování patří rovněž celé mé rodině, která mě neocenitelně podporovala a dodávala mi potřebnou energii.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 17. května 2013 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

SEZNAM ZKRATEK CA

acetát celulózy, nejčastěji di- nebo tri-acetát (Cellulose acetate)

CSTEE

Vědecký výbor pro toxicitu, ekotoxicitu a životní prostředí (Comité Scientifique de Toxicologie, Ecotoxicologie et l'Environnement)

ČOV

čistírna odpadních vod

DAI

daidzein

DCC

suspenze aktivního uhlí pokrytá dextranem (dextran coated charcoal)

DES

diethylstillbestrol

dH2O

deionizovaná voda (zbavena rozpuštěných minerálních látek)

DMSO

dimethylsulfoxid (dimethyl sulfoxide)

DMEM

kultivační médium (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)

E1

estron

E2

17-estradiol

E3

estriol

EC50

efektivní koncentrace pro 50% účinek

EDCs

látky,

způsobující

endokrinní

disrupci

(Endocrine

Disrupting

Compounds) EEQ

estradiolový ekvivalent (estradiol equivalent)

ELISA

imunologická

metoda sloužících k detekci protilátek (Enzyme-

Linked ImmunoSorbent Assay) ERs

estrogenní receptor (Estrogen Receptors)

EtOH

ethanol

FBS

fetální bovinní sérum

GC

plynová chromatografie (Gas Chromatography)

GEN

genistein

GFP

zelený fluorescenční protein (Green Fluorescent Protein)

HeLa

buněčná linie pocházející z lidského karcinomu děložního čípku (Henrietta Lakcs)

HLB

reverzní fáze sorbentu kolony SPE (Hydrophilic Lipophilic Balanced)

HPLC

vysokorozlišovací kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography)

M

molární 9

MS

hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)

mm Hg

jednotka měření tlaku

IPCS

mezinárodní program chemické bezpečnosti (International Programme on Chemical Safety)

Log KOW

rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda

Luc

luciferáza

MeOH

methanol

PBS

fyziologický roztok používaný pro práci s buněčnými kulturami jako pufr (Phosphate Buffered Saline)

RLU

relativní luminiscenční jednotky (relative luminescence units)

RO

reverzní osmóza (Reverse Osmosis)

SDB

styrendivinylbenzen

SPE

extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction)

10

OBSAH ÚVOD.................................................................................................................................. 14 1.

TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................ 15 1.1 HORMONY JAKO ENDOKRINNÍ DISRUPTORY ............................................ 15 1.1.1

Endokrinní estrogenní disruptory – rozdělení ............................................................. 16

1.1.2

Testované estrogenní látky ......................................................................................... 18

1.1.3

Techniky detekce estrogenity ..................................................................................... 20

1.2 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ (SPE) ........................................................................ 21 1.2.1

SPE vodných vzorků .................................................................................................. 21

1.2.2

Jednotlivé kroky SPE ................................................................................................. 22

1.3 REVERZNÍ OSMOZA (RO) .................................................................................. 24 1.3.1

Principy a rozdělení membránových metod ................................................................ 24

1.3.2

Princip a vlastnosti RO............................................................................................... 25

1.3.3

Využití RO ................................................................................................................ 26

1.3.4

Srovnání výhod a nevýhod RO a SPE......................................................................... 28

1.4 IN VITRO TEST ...................................................................................................... 30

2.

1.4.1

Hodnocení estrogenity vodných vzorků ...................................................................... 30

1.4.2

In vitro metoda: Exprese reportérového genu ............................................................. 30

1.4.3

Testování estrogenity na buněčné linii HeLa 9903...................................................... 31

1.4.4

Testování estrogenity na buněčné linii MVLN............................................................ 32

MATERIÁL A METODY .......................................................................................... 33 2.1 CHEMIKÁLIE A MATERIÁL .............................................................................. 33 2.2 KULTIVACE HeLa 9903 A MVLN BUNĚK ........................................................ 37 2.2.1

Pasážování buněk....................................................................................................... 37

2.2.2

Nasazení, expozice buněk a měření ............................................................................ 37

2.3 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU SPE........... 39 2.3.1

Příprava vodných vzorků ........................................................................................... 39

2.4 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU RO ............ 41 2.4.1

Optimalizace in vitro metody pro testování vodných vzorků ....................................... 43

2.4.2

Ionizace E2 vlivem změny pH .................................................................................... 44

2.4.3

Testování estrogenní odpovědi připravovaných vzorků E2 ve vodném roztoku v závislosti na velikosti plastového povrchu a následných změnách pH ...................... 44

11

2.4.4

Experiment založený na sorbování vodných vzorků E2 metodou RO v závislosti na pH .................................................................................................................................. 45

2.4.5

Stanovení estrogenní odpovědi genisteinu a daidzeinu ................................................ 46

2.5 VYHODNOCOVÁNÍ .............................................................................................. 47

3.

2.5.1

Stanovení EC50........................................................................................................... 47

2.5.2

Statistické vyhodnocení dat ........................................................................................ 47

2.5.3

Kalibrační křivka ....................................................................................................... 48

VÝSLEDKY ................................................................................................................ 49 3.1 TESTOVÁNÍ ESTROGENNÍHO POTENCIÁLU ................................................ 49 3.1.1

Testování estrogenní odpovědi 3x koncentrovanějšího média vůči standardnímu médiu .................................................................................................................................. 49

3.1.2

Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou SPE ........................................................................................................................... 50

3.1.3

Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou RO ............................................................................................................................. 52

3.1.4

Testování estrogenního potenciálu vodných roztoků daidzeinu a genisteinu ................ 57

4.

DISKUZE .................................................................................................................... 58

5.

ZÁVĚR ........................................................................................................................ 62

6.

POUŽITÁ LITERATURA ......................................................................................... 63

7.

PŘÍLOHY ................................................................................................................... 71

12

CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST: »

Popis vlastností estrogenních látek

»

Popis principu a vlastností membránové separační metody reverzní osmózy (RO), stávající využití a možnosti RO v environmentální analýze

»

Popis principu a vlastností metody extrakce tuhou fází (SPE), stávající využití a možnosti SPE v environmentální analýze

»

Popis testování estrogenních látek pomocí in vitro biotestů buněčných kultur HeLa 9903 a MVLN

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST: »

Optimalizace in vitro metod pro testování vodných vzorků ze životního prostředí (otestování estrogenních látek na tkáňových kulturách)

»

Otestování RO jako separační metody - Použití komerčně dostupného modulu RO pro přípravu vzorků vody

»

Optimalizace metody RO - Ověření výtěžnosti metody RO pro některé standardní látky

»

Srovnání výtěžnosti metody RO s výtěžností SPE

13

ÚVOD U mnoha nových typů znečišťujících látek vyskytujících se v životním prostředí není doposud prostudována jejich toxicita. Jde o látky rozšířené téměř po celém světě, vyskytující se již v nízkých, ale biologicky aktivních koncentracích. Tyto látky se vyskytují i v některých farmacích, konkrétně se jedná o steroidní hormony např: estrogeny (používaných např. jako antikoncepce, řízení menopauzy a léčba prostaty a rakoviny), které jsou především zodpovědné za vývoj samičích sekundárních pohlavních znaků, také se podílejí na růstu kostí, pomáhají regulovat produkci cholesterolu v játrech, a také regulují přípravu organizmu pro reprodukci (Rokyta 2000). Zároveň jsou zodpovědné za negativní účinky na hormonální regulaci necílových organismů. Negativní účinky se již projevují v množství několik desítek či dokonce jednotek ng·l-1, a za takto nízkých koncentrací jsou těžko stanovitelné (Kidd et al. 2007). V komunálních odpadních vodách jsou detekovány látky estrogenního charakteru pocházející převážně z lidské moči. Mezi látky přítomné v ženské moči patří estriol, estradiol, estron a ethynylestradiol, který je součástí hormonálních antikoncepcí (D'Ascenzo et al. 2003). V odpadních vodách je ethynylestradiol přítomen řádově v koncentracích 101 ng.l−1 až 102 ng.l−1 (Hill and Janz 2003). Nejnovější standardizovanou biologickou metodou, která se využívá pro stanovení estrogenních látek ve vzorku je metoda extrakce tuhou fází (SPE). Principem metody je navázání znečišťujících látek na tuhý sorbent a poté se extrakcí organickým rozpouštědlem získá jejich zakoncentrovaný roztok. Metoda je finančně náročná a využívaná organická rozpouštědla mohou být toxická pro testovací buněčné linie, čímž dochází ke zkreslování výsledků. Z těchto důvodů se experimentálně zkoumají další možné metody, které by se daly pro tyto účely využít. Jeden z možných způsobů, jak získat zakoncentrované látky z vodních zdrojů, je možnost využití přípravy vzorků zakoncentrováním pomocí reverzní osmózy. Jde o separační metodu, která je běžně využívána pro jiné účely, např. odsolování mořské vody či filtraci brakické vody. Princip metody je založený na vytlačování rozpouštědla (nejčastěji vody) pomocí tlaku přes polopropustnou membránu, přes kterou projdou jen částice menší než 2 nm (Wagner 2001).

14

1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1 HORMONY JAKO ENDOKRINNÍ DISRUPTORY Během posledních desetiletí jsou vyvolávány obavy, týkající se možných škodlivých účinků po expozici některými chemickými látkami (přírodními a syntetickými), které jsou schopny modulovat nebo narušovat endokrinní systém. Narušení činnosti endokrinního systému chemickými látkami je především zaměřena na pozorování nežádoucích účinků na reprodukci u volně žijících živočichů a člověka (Jardim et al. 2012). Nejvíce ohrožení jsou vodní organismy žijící v přírodních vodách (Sumpter and Johnson 2005; Jobling et al. 2006). Chemické látky vykazující estrogenní aktivitu ovlivňují endokrinní systém a způsobují vývojové a reprodukční poruchy. Tyto chemické látky se označují jako "endokrinní disruptory", toto označení stanovila Evropská unie, Vědecký výbor pro toxicitu, ekotoxicitu a životní prostředí (CSTEE). Podle definice Evropské komise (1999) jsou endokrinní disruptory antropogenní i přírodní látky, které přímo nebo nepřímo ovlivňují hormonální systém a mohou působit za velmi nízkých koncentrací. Pracovní skupina pro endokrinní disruptory se dohodla na definici mezinárodního programu chemické bezpečnosti (IPCS) definovat endokrinní disruptory (EDCs) jako: Exogenní látky nebo směsi, které mají potenciální schopnost způsobit endokrinní disrupci u zasaženého organismu, jeho potomků nebo (sub)populací. Hypotéza, že chemické látky v životním prostředí můžou způsobit estrogenní účinky, není nová (Allen et al. 1924; Burlington and Lindeman 1950). Nicméně, během posledních dvaceti let, úroveň zájmu o nežádoucí účinky některých látek s estrogenními účinky (ovlivnění reprodukčního chování spojené s expozicí chemickým látkám způsobující endokrinní disrupci) vzrostla (Baker 2001). Mezi endokrinní disruptory patří někteří zástupci pesticidů (Soto et al. 1995), změkčovačů plastů, farmaceutik (antikoncepce, antibiotika, léky), těžkých kovů nebo průmyslových chemikálií (bisfenol A) (Krishnan et al. 1993). Zasažení do reprodukčního a vývojového systému organismů může mít za následek: sníženou účinnost rozmnožování, feminizaci samců, maskulinizaci samic, embryonální malformaci, sníženou vitalitu spermií nebo jiné vývojové a růstové poruchy (Anděl 2011; Zou et al. 2010).

15

Signálem endokrinní disrupce jsou obvykle poruchy vývoje hormonálního systému (špatný vývoj ovarií, nedokonalý vývoj gonád) nebo zvýšená hladina vitellogeninu (proteinu vaječného žloutku produkovaný pouze samicemi) u dospívajících samců (Hansen 1998). Projevem

endokrinní

disrupce

je

např.

vznik

imposexu

(to

je

změna

v rozmnožovacím systému indukovaná estrogenními látkami, při které dochází ke sterilitě v závislost na vzniku samčích pohlavních znaků u samic (tvorba penisu a chámovodu). Tato změna se projevila u samic předožábrých plžů. Je to projev expozice organickou látkou organocínu, který je součástí protihnilobných nátěrů na trupech lodí (Stroben et al. 1992). 1.1.1 Endokrinní estrogenní disruptory – rozdělení K ovlivnění funkčnosti endokrinního systému dochází za přítomnosti některých antropogenních i přírodních látek, které se dnes v ekosystému vyskytují, a působí tak chronickou expozici. Jeden typ ze skupiny látek s estrogenní povahou jsou tzv. environmentální estrogeny. Tyto látky mají shodný vliv na fyziologii a vývoj organismu s estrogenní kontrolou reprodukce organismů. Vyskytují se jak z antropogenních zdrojů (některé pesticidy, farmaka, odpadní produkty při různých výrobních procesech), tak z původu rostlinného, tzv: fytoestrogeny (Holoubek and Čadová 2000). Mezi nejčastěji vyskytující se estrogeny v odpadních vodách jsou přírodní estrogeny: estron (E1), 17β-estradiol (E2) a estriol (E3), a syntetický estrogen: 17α-ethinylestradiol (EE2) (Racz and Goel 2010). Přírodní estrogeny Mezi tyto přírodní estrogeny řadíme bioflavonoidy, různé mykotoxiny, vaječné steroidní hormony a taktéž lze zahrnout přírodní produkty rostlin a mikrobů (Holoubek and Čadová 2000). Přírodní estrogeny patří do skupiny steroidních hormonů, což je skupina biologicky aktivních sloučenin, které jsou syntetizovány z cholesterolu (Ying et al. 2002). E1, E2, E3 a jsou převážně ženské pohlavní hormony, vylučované především folikuly vaječníků, které jsou důležité pro udržení správných funkcí reprodukčních tkání, vitalitu prs, kůže a mozku,

zatímco

EE2

je

syntetický

steroid,

který

se

používá

jako

součást

antikoncepce. Všichni lidé, stejně jako zvířata, vylučují steroidní hormony (Desbrow et al. 1998; Hanselman et al. 2003; Zheng et al. 2008), v různých množstvích, v závislosti na věku, zdravotním stavu, stravě, nebo těhotenství (Lintelmann et al. 2003; Zheng et al. 2008). 16

Tyto hormony skončí v životním prostředí prostřednictvím vypouštění odpadních vod a likvidací živočišného odpadu. Estrogeny současně s gestageny (hormony ovlivňující druhou polovinu menstruačního cyklu a průběh těhotenství, nejvýznamnější z gestagenů je progesteron, produkovaný žlutým tělískem) řídí všechny důležité ženské reprodukční procesy, regulují menstruační (estrální) cyklus a hrají významnou roli v rozvoji endometria (děložní sliznice). Biologicky nejaktivnějším estrogenem je estradiol. Tyto látky se v organismu relativně rychle odbourávají, a proto byla syntetizována řada stabilnějších derivátů a analogů, jako jsou např. estradiol-valerát, EE2 (ten je spolu s gestageny součást celé řady kombinovaných preparátů používaných jako perorální antikoncepce, a mestranol, taktéž jako součást perorální antikoncepce (Hampl and Paleček 2002). Estrogeny se vyskytují, jak ve formě samičích pohlavních hormonech, tak částečně i v samčích pohlavních hormonech, kde regulují produkci a transport testikulární tekutiny. Estrogen v mužském reprodukčním systému je syntetizován nejméně třemi různými typy buněk; Sertoliho, Leydigovi a zárodečnými buňkami (Hess et al. 2001). Fytoestrogeny Fytoestrogeny jsou přírodní rostlinné látky, které jsou důležité pro správný vývoj a růst rostlin. Mají chemickou strukturu podobnou endogenním estrogenům. Díky této podobě se mohou vázat na estrogenní receptory (ERs) (Cassidy 2003; Pilsakova et al. 2010). Mnoho jedlých rostlin, z nichž některé jsou běžné v lidské stravě, jsou bohaté na fytoestrogeny. Nacházejí se v sojových bobech, v celozrnných cereálních výrobcích, v různých semenech a pravděpodobně v ořechách (Liu et al. 2010; Holoubek and Čadová 2000). Fytoestrogeny se dělí na dvě třídy: flavonoidy a lignany. Počet flavonoidů je větší než počet lignanů. Flavonoidy mají také vyšší relativní estrogenní aktivitu než lignany (Liu et al. 2010). Xenoestrogeny Xenoestrogeny jsou sloučeniny, které daný organismus sám neprodukuje. Jsou chemicky stabilní a schopné bioakumulovat se v organismech. Mezi tyto xenoestrogeny patří některá léčiva –

farmaceutické přípravky antropogenního původu a látky

pro metabolismus organismu cizí, které vstupují do životního prostředí mající estrogenní povahu, např. antikoncepce. Xenoestrogen je například diethylstilbestrol (DES), který byl podávaný během 1950 a 1960 v těhotenství, jako lék proti spontánním potratům (Hatch et al. 2011). 17

1.1.2 Testované estrogenní látky Vybraný testovaný zástupce přírodních estrogenů: 17-Estradiol V experimentální části se stanovoval, jako zástupce přirozených estrogenů, 17-estradiol (l,3,5-estratetratrien-3,17-diol; E2), který je nejúčinnějším estrogenním steroidem. U žen je E2 syntetizován v Graafových folikulech vaječníku, kůře nadledvinek a placentě. U mužů je syntetizován v nízkých koncentracích ve varlatech (Liehr 1990). Fyzikální vlastnosti a systematické názvy této látky jsou uvedeny v Tab. č: 1. Vybraní testovaní zástupci fytoestrogenů: Daidzein a Genistein Daidzein a genistein jsou fytoestrogeny patřící do třídy flavonoidů, skupiny isoflavonů a byli vybráni do experimentální části pro srovnání s estradiolem. Genistein se v nemalém množství vyskytuje převážně v luštěninách a sojových bobech. V potravinách vyrobených ze sóji je obsažen v rozmezí 0,2–1 mg.g-1, záleží na druhu výrobku (Huang et al. 2008). Genistein (GEN) může způsobit apoptózu, a tak může inhibovat růst rakovinných buněk, tím že inhibuje buněčné dělení (Cornwell et al. 2004). Genistein a některé jiné fytoestrogeny mají antioxidačními vlastnosti. Možnost léčby rakoviny, menopauzy, osteoporózy nebo kardiovaskulárních onemocnění se prozkoumává již řadu let (Polkowski and Mazurek 2000). Předpokládá se, že isoflavony jsou schopné předcházet rakovině. Redukují příznaky menopauzy, aterosklerózy, či jsou schopny snížit hladinu cholesterolu v krvi (Birt et al. 2001; Duffy et al. 2003; Watanabe et al. 2002). Daidzein (DAI) je taktéž přítomen v rostlinách, jako jsou sójové boby nebo jetel, který byl intenzivně studován pro jeho biologickou aktivitu anti-/estrogenních účinků (Jia et al. 2003; Guo et al. 2004). Stejně jako GEN, tak i DAI disponuje antioxidačními účinky (Liu et al. 2006).

.

18

Tab. č: 1 Fyzikálně-chemické vlastnosti estradiolu, genisteinu a daidzeinu (Cui et al. 2006; VegaMorales et al. 2010; HMDB 2005-2013; Lewis and Archer 1979).

Chemický název

Chemický vzorec

Mr

log KOW

log P

pKa,

Rozpustnost ve vodě (mg·l -1 při 20 °C)

17β-estradiolu (E2)

C18H24O2

272,4

3,94

3,57

10,71

21

Genistein

C15H10O5

270,2

2.84

3,04

6,61

120

Daidzein

C15H10O4

254,1

2,78

3,30

6,48

85

Obr. č: 1 Molekulová struktura vybraných látek s estrogenním účinkem. Zástupce přírodních estrogenů: 17-estradiol, a zástupci fytoestrogenů: genistein a daidzein (Holoubek and Čadová 2000).

19

1.1.3 Techniky detekce estrogenity Pro detekci estrogenity se již využívá řada biologických a chemických metod. Jedna z možných biologických metod, je metoda založena na aktivaci genu, kde jsou určité geny specificky regulovány působením estrogenů skrze estrogenový receptor. V jiné detekční metodě se využívá proliferace nádorových buněk. Je to např. hojně využívaná in vitro metoda tzv. E-SCREEN test, při které se používají buněčné linie odizolované z rakovinných buněk prsu. Buňky neproliferují, pokud jsou pěstovány bez estrogenních látek, jakmile se přidá látka s estrogenní aktivitou, proliferace se rozběhne. Často tato metoda slouží jako první screening estrogenity (Korner et al. 2001). Další možný způsob, jak detekovat estrogenitu, je využití vitellogeninu. Jako vaječný žloutek je přítomný u dospělých samic, jestliže je pak detekován u samců, pak to značí o expozici látkami s estrogenní aktivitou (Holoubek and Čadová 2000). Mezi nejpoužívanější chemické metody stanovení estrogenů z reálných vzorků vod patří metody chromatografické: vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) nebo plynová chromatografie (GC). Používají se různé způsoby detekce, nejčastěji je využíván hmotnostní detektor (MS). Při těchto metodách se často pro úpravu vzorku na analýzu využívá prekoncentračního kroku pomocí extrakce tuhou fází (SPE). Plynová chromatografie se vyznačuje vysokou separační účinností, rychlostí analýzy a možnosti použití vysoce citlivých detektorů. Je nutná derivatizace analytů. Derivatizací dochází ke zvýšení ionizační účinnosti analytů. Při kapalinové chromatografii lze analyzovat estrogeny přímo, bez derivatizačního kroku (Díaz-Cruz et al. 2003). V současnosti se také používají imunochemické metody založené na polyklonálních protilátkách, tzv. ELISA metody pro stanovení estrogenů. Vlastnímu stanovení většinou předchází úprava vzorků metodou SPE. Společně s SPE tvoří vysoce selektivní a citlivou metodu. V porovnání se stávajícími chromatografickými metodami není ELISA tak citlivá jako GC, ale nabízí výhody jednoduchosti v přípravě vzorků, jinak jsou výsledky metod srovnatelné (Cha et al. 2012; Fukata et al. 2006).

20

1.2 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ (SPE) Extrakce tuhou fází (SPE = Solid Phase Extraction) je běžně používanou technikou pro přípravu vzorků ze životního prostředí a vzorků potravin. Vzhledem k vysoké univerzálnosti je postup SPE využíván k mnoha účelům, jako je například k čištění, k izolaci stopových látek, také se využívá pro selektivní obohacení (zakoncentrování) vzorku či k odsolení vod (Paolo et al. 2012). Pro úpravu vodných vzorků se v současné době používá, díky své nenáročnosti. SPE se využívá při testování in vitro (i in vivo). Při SPE se látky naváží na tuhý sorbent, ze kterého jsou následně extrahovány malým množstvím methanolu či jiného rozpouštědla podobných vlastností, čímž dojde k významnému zkoncentrování látek. Takto zkoncentrovaný vzorek umožňuje dosáhnout již stanovitelných koncentrací látek v používaných biotestech (Guo et al. 2013; Paolo et al. 2012). 1.2.1 SPE vodných vzorků SPE je zavedená a hojně využívaná metoda pro extrakci estrogenů z vodných vzorků. Při SPE jsou používány disky nebo kolony (připomínající injekční stříkačky bez pohyblivého pístu) obsahující sorbent. Pokud bychom chtěli porovnat, jaký je rozdíl mezi diskem a kolonou, tak výhoda kolon je ta, že mají velkou možnost se přizpůsobit automatizaci jako je čištění, sušení, vyluhování látek (eluce) velkého množství vzorků. Naopak nevýhodou SPE s kolonami je ta, že vzorky mohou obsahovat nečistoty ze změkčovacích prostředků uvolňujících se z materiálů během vymývání. Použití disků při SPE má tu výhodu, že se nezanáší suspendovanou hmotou. Vykazují větší extrakční rychlost a lze dosáhnout co nejmenšího rizika možnosti kontaminace vzorků (Čechová 2010; Ingerslev et al. 2003). Pro analýzu povrchových vod jsou nejčastěji používány disky/kolony se sorbentem, který má polymerně vázanou oktadecylovou fázi. Takovéto disky/kolony jsou označované jako C18. Další dostupné disky/kolony mohou obsahovat sorbent z styrendivinylbenzenu (SDB) nebo grafitizovaného uhlíku, a které jsou komerčně dostupné jako Isolut ENV+ , SDB-XC a HBL (Trenholm et al. 2006; Laganá et al. 2004; Hernando et al. 2004). Tyto disky/kolony se využívají pro analýzu odpadních vod (Ingerslev et al. 2003; Kinnberg 2003).

21

Typický SPE postup, jak je znázorněno na obrázku Obr. č: 2, se skládá ze čtyř hlavních kroků. Prvním krokem je předúprava (kondicionování) kolonky, druhým krokem je dávkování vzorku, poté proběhne promytí kolony a v posledním kroku dojde k samotné eluci (vymývání) analytu. 1.2.2 Jednotlivé kroky SPE

Obr. č: 2 Schematické znázornění jednotlivých kroků metody SPE přes kolony (Paolo et al. 2012).

KONDICIONACE Pokud má sorbent v SPE koloně zadržovat analyty, je důležité kolonu připravit tak, že na pevné fázi vytvoříme vrstvičku kapaliny. Příprava kolony na interakci složek vzorku s pevnou fází, která je umožněna solvatací (obalení částic rozpuštěné látky molekulami rozpouštědla) pevné fáze. Tento solvatačný proces je prvním krokem extrakce a zahrnuje promytí kolony rozpouštědlem. Toto rozpouštědlo zabezpečuje solvataci sorbentu, a tím i interaktivitu se vzorkem. Ekvilibrace (stabilizování) se provádí pomocí rozpouštědla, které je svojí chemickou povahou vhodné pro daný vzorek. Provede se aktivace potřebným množstvím organického rozpouštědla (2-3 ml na 100 mg sorbentu), kolony se naplní dH2O a následuje aplikace samotného vodného roztoku vzorku (Paolo et al. 2012).

22

PŘIDÁNÍ VZORKU Je podstatné zachovat dostatečnou délku doby kontaktu vzorku se sorbentem. Kdyby vzorek protékal kolonou příliš rychle, může to mít za následek sníženou výtěžnost. Vzorek se převádí za použití podtlaku (max. 10 mm Hg), průtok max. 15 ml/min (voda by měla z kolony vykapávat, ne vytékat) (Paolo et al. 2012). PROMYTÍ KOLONY Po aplikaci vzorku bývá kolona promývána jiným rozpouštědlem. Cílem tohoto kroku se selektivní eluování nežádoucích sloučenin ze sorbentu tak, aby nebyly vyplavené sledované analyty. Pro tento účel jsou nejvhodnější rozpouštědla, ve kterých analyty rozpuštěné nebyly (Paolo et al. 2012). ELUCE Posledním krokem je eluce analytu vhodným rozpouštědlem do zásobní vialky. I při tomto kroku je nezbytné kontrolovat rychlost průtoku. Kdyby byl příliš vysoký průtok, měl by za následek sníženou výtěžnost analytu. Eluce může být provedena různými rozpouštědly: MeOH (Thomas et al. 2004), DMSO (Murk et al. 2002) nebo ethyl-acetátem (Ying et al. 2008). Dochází tím k selektivní desorpci testovaných látek z pevné fáze a následnému vymytí látek z kolonky. Po extrakci na tuhou fázi je analyt v roztoku, obsahuje minimum interferujících látek. Pokud je potřeba analyt více zakoncentrovat používá se pro to vakuové odparky nebo je možné vzorek odfoukat dusíkem, záleží na vybavení laboratoře (Paolo et al. 2012; Lambda 2013).

23

1.3

REVERZNÍ OSMOZA (RO) Reverzní osmóza je separační metoda a zároveň proces, ve kterém je pomoci tlaku

umožněn transport rozpouštědla (vody) membránou, kdy nízkomolekulární složky a rozpuštěné soli se na membráně zachytí. 1.3.1 Principy a rozdělení membránových metod Mezi hnací síly, které se využívají pro správnou funkci separace na polopropustné membráně, můžeme zařadit hnací síly založené na: rozdílu tlaku (k transportu látky přes membránu vede rozdílný tlak látky před a za membránou, odlišná rychlost transportu složek směsi vyplývá z rozdílné velikosti jejich molekul), na teplotním gradientu (teplotní rozdíl mezi fázemi), rozdílu koncentrací (látky mají různou rychlost pohybu přes membránu), síle elektrického pole (separace na základě polarity a sily náboje) (Jelínek and kol. 2009). Počet používaných membránových metod se neustále zvyšuje, mezi doposud nejvíce využívané patří: mikrofiltrace (MF), ultrafiltrace (UF), reverzní osmóza (RO), dělení plynů (GS), pervaporace (PV), membránová destilace a separace kapalnými membránami (LM), dialýza (D), elektrodialýza (ED) (Pohlová and Šafaříková 1998). Schéma rozdělení membránových metod, které jsou rozděleny podle využití hnacích sil, je znázorněno na Obr. č: 3.

Obr. č: 3 Membránové procesy - základní rozdělení podle hnací síly transportu (Jelínek and kol. 2009)

24

1.3.2 Princip a vlastnosti RO Separační metody se obecně využívají k izolování (separaci) dokazované nebo stanovované složky z analyzované směsi a k odstranění rušivých (interferujících) komponent analyzovaného roztoku (účel získání čistých složek). U skupiny membránových separačních metod dochází k selektivnímu transportu jedné složky přes polopropustnou membránu. Metoda má jednoduché schéma: vstupující kapalinné látky (nástřik) jsou děleny na retentát (obsahuje všechny složky, které neprošly membránou) a permeát (látky prošlé přes membránu, téměř čisté rozpouštědlo), znázorňuje Obr. č: 4 (Jelínek and kol. 2009).

Obr. č: 4 Schéma membránového procesu (Jelínek and kol. 2009).

Membrána umožňuje průchod určitým částicím vlivem rozdílných vlastností dělených látek. Tato membrána musí splňovat určité požadavky: selektivitu (vysoká rozdělovací

schopnost),

permeabilitu

(vysoký

měrný

výkon),

chemickou

a mechanickou pevnost. Model vinuté membrány RO je znázorněn na Obr. č: 5.

Obr. č: 5 Model trubkové membrány RO (Wagner 2001).

25

stálost

Důležitou roli zde také hrají velikost a tvar částic a pórů membrán, v některých případech je významný i vliv náboje nebo smáčivost povrchů separovaných částic a membrány a další faktory (Pohlová and Šafaříková 1998). Vlastnosti RO podle (Wagner 2001) jsou shrnuté v Tab. č: 2. Tab. č: 2 Vlastnosti RO podle (Wagner 2001).

Tloušťka vrstvy

Velikost póru

Materiál membrány

Membránový modul

Provozní tlak

1µm

<0,002µm

CA tenká vrstva

Tubulární, spirálovitě vinutá, deska a rám

15-150 bar

REVERZNÍ OSMÓZA

1.3.3 Využití RO Membránové metody jsou separační metody, které se vyvíjely během posledních desítek let. Od té doby si RO získává pozornost pro mnohé využití. Dnes jsou membrány RO jednou z hlavních technologií pro odsolování slané vody, taktéž se využívá pro filtraci brakické vody a získání tak vody, která je pitná. Tato metoda je používána po celém světě a díky novým vylepšeným technologiím pro získávání energie a obnovitelných zdrojů, umožní větší využití v odsolování pro tuzemské i venkovské obce, a zároveň poskytuje cenově dostupnější vodu pro oblasti, kde se pitná voda vyskytuje jen zřídka (Greenlee et al. 2009). Jako separační metoda si RO našla široké uplatnění, jak v průmyslu chemickém, potravinářském, farmaceutickém, tak v biologii, energetice a elektrotechnickém průmyslu. Lze ji využít při technologické úpravě odpadních vod (Mikulášek 1995). V podzemních vodách se pomocí RO čistí vody i od těžkých kovů, např. arsenu, který byl odstraněn z 99%. Byly použity dva typy modulů, jeden spirálně vinutý s polyamidovou membránou, který byl účinný z 98,5 % druhý s dutými vlákny z kompozitního polyamidu, který byl účinnější, pomocí něj se arsen odstranil z 99,2 % (Pawlak et al. 2006).

26

Membránové separační procesy, jakožto filtační metody, jsou již dnes plně aplikovány po celém světě, jsou ekonomicky rovnocennými náhradami klasických separačních procesů a jsou kvalitativně zdokonalovány. Jejich trvale se snižující energetická náročnost a provozní i investiční náklady získávají potenciál, jak využít tuto technologii a uplatnit ji za různých podmínek (Greenlee et al. 2009). Například jako čištění podzemních vod kontaminovaných skládkovými vodami (Honzajková et al. 2011). Spirálově vinutá membrána RO je původně vyrobena výhradně pro odsolování vody, ale spojení velmi kompaktního designu a nízké ceny, začalo být atraktivní pro testování i v jiných odvětvích. Jde o využívání v řadě průmyslových aplikací, ať už v mlékárenském průmyslu, v průmyslu výroby papíru a celulózy, nebo pro získání vysoce čisté vody. Je odolná proti vysoké teplotě i proti vysokým hodnotám pH (Wagner 2001). VYUŽITÍ PERMEÁTU A RETENTÁTU JAKO ROZDÍLNÉ SLOŽKY RO Využití permeátu K odsolování vody a k čištění brakických vod je v mnoha zemních nezbytné využívání RO (Park et al. 2012; Henmi et al. 2010). Uplatnění permeátu RO najdeme i v odvětví farmaceutického průmyslu, např. výroba antibiotik (Belkacem et al. 2008). I v chemickém průmyslu se využívá RO k selektivní separaci odpadních vod (Bódalo-Santoyo et al. 2003). Stále roste rozsah využití RO při zakoncentrovávání, využívá se k částečné demineralizaci, separaci proteinů, likvidaci bakterií, chlazení a recyklaci odpadních vod (Into et al. 2004; Kelly and Fuquay 2011). Využití retentátu (koncentrátu) Koncentrát z RO se využívá již desítky let, a to hlavně v potravinářském průmyslu zakoncentrováním ovocných a zeleninových šťáv (Pepper et al. 1985; Alvarez et al. 1997). Membránová

separace

je

široce

používána

či zakoncentrování syrovátky (Suárez et al. 1992).

27

v

zařízeních

na

zpracování

mléka

1.3.4 Srovnání výhod a nevýhod RO a SPE Výhody RO Pro přípravu vodných vzorků k biologickému testování při využití RO není nutno používat žádná toxická rozpouštědla. Metoda je šetrná ke zpracování vzorku s rozpuštěnými analyzovanými látkami, proto je možné charakterizovat zatížení životního prostředí studovanými látkami. Další výhodou by mohly být náklady na přípravu jednoho vzorku metodou RO, ty se pohybují více než řádově níž než při použití metody SPE. Pokud bychom srovnali pořizovací cenu komerčně dostupného modulu RO a čerpadla, které je hnacím motorem systému RO, cena by se pohybovala kolem 10 tis. Kč. Náhradní výměnné separační membrány stojí okolo 1-1,5 tis. Kč. S takovou to separační membránou lze otestovat přibližně 100 vzorků, tedy náklady na zpracování jednoho vzorku jsou přibližně 10 Kč (Buonomenna 2013; Tuček 2009). Bude tedy možné za náklady, které by se vynaložily při přípravě vodných vzorků metodou SPE, zakoncentrovat větší počet vodných vzorků při využití metody RO, mohou být například rychleji odhaleny zdroje znečištění. Výhody SPE SPE je zavedená a optimalizovaná metoda pro přípravu vodných vzorků pro in vitro (i in vivo) testování. Významné zkoncentrování látek umožňuje dosáhnout již stanovitelných koncentrací látek v používaných biotestech (Guo et al. 2013). Nevýhody RO Dochází k nežádoucímu ukládání abiotických a biotických materiálů na povrch membrány, označované jako membránové znečištění, které může snížit účinnost systému (Lee et al.). Takto bioznečištěná membrána je vede k poklesu toku permeátu (Schneider et al. 2005). Zanesení vede k nezvratnému poškození reverzně osmotických modulů a je potřeba výměny filtrů. S touto potřebou vzrostou provozní náklady (Hubner and kol. 2006).

28

Nevýhody SPE Použitá rozpouštědla při SPE (MeOH, DMSO) jsou toxická pro testování buněčné linie, proto je nezbytné, aby nepřesáhl jejich obsah 2% v konečném médiu (v praxi využíváme 0,5%). I z finančních důvodů je žádoucí snížit spotřebu těchto organických rozpouštědel (Guo et al. 2013). Cena na pořízení aparatury SPE se pohybuje od 12 – 40 tis. Kč za manifold a 10 – 20 tis. Kč za vakuovou pumpu. Před SPE je někdy zapotřebí zfiltrování vzorku, čímž dojde k navýšení ceny. Přibližná cena přípravy jednoho vodného vzorku se pohybuje okolo 600Kč (Chrom 2011).

29

1.4 IN VITRO TEST 1.4.1 Hodnocení estrogenity vodných vzorků Existuje řada druhů in vitro testů, kterými je možno určovat estrogenní potenciál jednotlivých látek nebo komplexních směsí. Mezi zavedené metody patří testy využívající vazby ligandu na receptor, kde je sledována kompetice s radioaktivně označeným přirozeným ligandem (Kelce and Wilson 1997; Murk et al. 2002). Další metoda je založena na schopnosti látek stimulovat receptorově závislou transkripční aktivitu, tzv. test s reportérovými geny (Kinnberg 2003). Z často používaných in vitro testů se používá rekombinantní kvasinkový test (Li et al. 2008), např: RYA test (recombinant yeast-based assays), ve kterém se využívá geneticky modifikovaný kmen Saccharomyces cerevisiae (Kinnberg 2003). Na oddělení RECETOXu se v in vitro testech využívají dvě linie lidských nádorových buněk, a to Hela 9903 a MVLN, kde je jako reportérový gen používán gen enzymu luciferázy. Mimo tyto dvě kultury se k testování estrogeny používají kvasinkové testy YES, využívající buněčnou kulturu Saccheromyces cerevisiae (Murk et al. 2002; Kinnberg 2003). 1.4.2 In vitro metoda: Exprese reportérového genu Mezi in vitro metody využívající reportérové geny patří metoda pro detekci estrogenní aktivity látek. Plazmidem obsahující reportérový gen jsou transfekované savčí buněčné linie. Aktivace specifického receptoru estrogenní látkou a jeho následné navázání na responzivní element vyvolá expresi reportérového genu. Buď se měří míra exprese mRNA nebo produkce specifického proteinového produktu (Joyeux et al. 1997). Využívají se reportérové geny kódující snadno detekovatelné proteiny, např. luciferáza (Luc), zelený fluorescenční protein (GFP, Green Fluorescent Protein), ß-galaktosidaza (Gal) aj. Pro expozici je možný výběr z buněčných linií, které jsou izolované z různých typů tkání, např. HeLa 9903 (lidský karcinom děložního čípku), linie BG-1 (lidský karcinom vaječníku), MVLN nebo T47D.luc (lidské linie karcinomu prsu) (NEIHS 2002).

30

1.4.3 Testování estrogenity na buněčné linii HeLa 9903 Autorka se v této diplomové práci zabývá testem in vitro, při kterém se využívá buněčná linie HeLa 9903. Podle laboratorních metod zavedených na oddělení RECETOXu využíváme metodu, která je založena na chemické aktivaci exprese genu pro luciferázu. Buněčná linie HeLa 9903 obsahuje reportérový gen kódující luciferázu. Látky estrogenní povahy se váží na endogenní estrogenní receptor přítomný v jádře, tím se aktivuje a vzniklý dimer se naváže na úseky DNA. Exprese luciferázového genu a vznik luciferázy je měřena v lyzovaných bunkách pomocí luminometru (Legler et al. 1999). Na Obr. č: 6 je schematicky znázorněn princip metody. Hladina luciferázy se detekuje chemiluminiscenčním stanovením enzymové aktivity, v buněčných liniích HeLa 9903 (Legler et al. 1999). Luciferáza je syntetizována a hned po aktivaci estrogenního receptoru za přítomnosti ATP katalyzuje luminiscenční reakci přeměny luciferinu (pigment emitující světlo) na oxidovanou formu, podle rovnic: luciferin + ATP  luciferyladenylát + PPi luciferyladenylát + O2  oxyluciferin + AMP + světlo (Freyberger and Schmuck 2005).

31

Obr. č: 6 Mechanismus reportérového testu v buněčných liniích kódující luciferázu (Hilscherova et al. 2000).

HeLa 9903 je buněčná linie, patřící mezi nejstarší a nejpoužívanější lidské buněčné linie používané ve vědeckém výzkumu (Rahbari et al. 2009). Tato linie byla odizolována z buněk

karcinomu

děložního

čípku

8. února

1951

(Scherer

et

al.

1953)

od pacientky Henrietty Lacks, která nakonec rakovině podlehla. Buněčná linie je schopná za optimálních podmínek neomezeně proliferovat, ale zároveň je choulostivá ke kontaminaci, kterou by mohla způsobit cizí buněčná linie používaná ve výzkumu (Capes-Davis et al. 2010). 1.4.4 Testování estrogenity na buněčné linii MVLN Pro nedostatečnou estrogenní odpověď vzorků daidzeinu a genisteinu na buněčné linii HeLa 9903, se testovala estrogenní odpověď také na buněčné linii MVLN, která je taktéž nositelem reportérového genu pro luciferázu. Princip testování je zcela stejný jako u buněčné linie HeLa 9903. Jedná se o transgenní buněčnou linii odvozenou z buněk MCF-7, které pocházejí z lidského karcinomu prsu (De Wet et al. 1987; Pons et al. 1990; Demirpence et al. 1993).

32

2. MATERIÁL A METODY Součástí praktické části této diplomové práce bylo osvojení si zásad pro samostatnou práci s in vitro testováním, testu založeném na expresi reportérového genu. V převážné většině se estrogenita vodných vzorků testovala na buněčné linii HeLa 9903, testování na buněčné linii MVLN se uskutečnilo jen pro porovnání estrogenní odpovědi fytoestrogeních látek, dainzeinu a genisteinu. Na základě zavedeného postupu in vitro testu na oddělení RECETOXu byl dodržen postup testování vzorků. Při testování estrogenity látek jsou buňky exponovány testovanými vzorky. Buňky, které jsou exponovány připravenou koncentrační řadou E2 v rozpouštědle, slouží jako kontrolní. To umožňuje sledování estrogenní odpovědi buněk. V teoretické části jsou popsány principy a teoretické postupy popisující přípravu vodných vzorků pro testování estrogenního potenciálu látek s estrogenní povahou pomocí in vitro testu, při kterém se využívala buněčná kultura HeLa 9903 nebo buněčná kultura MVLN.

2.1

CHEMIKÁLIE A MATERIÁL

Materiál běžného použití v laboratoři Sterilní 96jamkové mikrotitrační desky pro tkáňové kultury Médium DMEM, 10%FBS, dial. DCC Sterilní trypsin Sterilní PBS (pufrovaný fyziologický roztok) Kit pro stanovení luciferázy Steady-Glo (Promega, USA) Organická rozpouštědla: DMSO, EtOH, MeOH (100%) NaOH 1M, HCl 1M (na úpravu pH) Lyzační pufr (pro luciferázu) Expoziční roztoky E2 v EtOH ve výsledných koncentracích: 0,12pM; 0,41pM; 1,23pM; 3,7pM; 11,1pM; 33,3pM; 100pM; 500pM Expoziční roztoky daidzeinu a genisteinu v DMSO ve výsledných koncentracích: 0,1nM; 1nM; 10nM

33

LABORATORNÍ VYBAVENÍ Inkubátor – CO2 SANYO MCO 18AIC Flow-box – BOX BIOHAZARD BIOBAN 48, BOX LAMINÁRNÍ SAFEFLOW 12 Optický mikroskop Multikanálová pipeta – 8K na 50 – 1200 µl Cellometr (Auto T4) – CHT4 Nexeclom Bioscience Třepačka – Multi Functional Orbital Shaker PSU – 20i Luminometr – Luminoscan Acent DLReadyTM pH metr – Eutech Instruments pH 510 Analytické váhy – RADWAG XA 82/220/2X Systém RO s vinutou membránou (FILMTEC) TW 30-1812-36 SPE aparatura (manifold s regulací tlaku, těsnící zátky, teflonové hadičky) Elektrická vývěva – CDP 8800 AUATEC

PŘÍPRAVA CHEMIKÁLIÍ Fosfátový pufr - Phosphate Buffered Saline (PBS) Pro přípravu tohoto fyziologické roztoku na 1l dH2O se připraví tyto navážky: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,89 g Na2HPO4. 2H2O a 0,2 g KH2PO4. Po zhomogenizování roztoku se změří pH a pomocí 1M NaOH a1M HCl se upraví na hodnotu 7. Pro práci s tkáňovými kulturami je potřeba sterilního PBS, které se sterilizuje v zásobních láhvích autoklávováním. Příprava séra: dialýzovaný/stripovaný FBS (DCC FBS) Směs 500 ml stripovaného FBS a 10 g aktivního uhlí pokrytého dextranem se ve vodní lázni při 45 °C protřepává přibližně 12 hod. Směs se druhý den rozlije do 50ml kyvet, které se poté 15 min centrifugují při otáčkách 2000 g (3400 ot. /min. s rotorem S40). Po zcentrifugování se opatrně přepipetuje sérum do nových 50 ml kyvet tak, abychom usazené aktivní uhlí nezvířili. Sérum se poté používá pro přípravu média.

34

Kultivační médium - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix. F-12 (DMEM-F12) Pro kultivaci buněčné linie HeLa 9903 se používá kultivační médium bez fenolové červeně s přídavkem 10% DCC FBS. Pro kultivaci buněčné linie MVLN se používá kultivační médium s přídavkem 10% DCC FBS a 1% L-glutaminu. Pro testování s buněčnou linií MVLN se používá médium s přídavkem 10% DCC FBS a 1% L-glutaminu. Postup přípravy 3x koncentrovaného média: 3x koncentrovanější

médium bylo

připravováno

podle protokolu (PAA),

kdy se využilo médium v pevném sypkém skupenství. Připravit 3x koncentrovanější médium znamená 3x znásobit potřebné množství látek, které se pro přípravu média přidávají. Navážilo se 3,37g DMEM a 1,11g NaHCO3, přidaly se sterilně odebrané 3 ml L-glutaminu a doplnilo se na objem 100 ml dH2O. Podle protokolu se pH roztoku upravilo do rozmezí 6,8-7,5, poté se roztok ve flow-boxu zfiltroval přes sterilní filtr s póry o velikosti 0,22µm. Aby se minimalizovala možnost kontaminace, médium se obohatilo o antibiotikum gentamycin (4,5ml/100ml). Připravené 3x koncentrované médium se uchovalo v lednici při 4 °C pro expoziční využití pouze při in vitro biotestech. Sérum pro stanovení luminiscence Na 1 mikrotitrační desku je potřeba směs 0,6 ml komerčně dodávaného kitu PROMEGA Steady-Glo + 3 ml chudého kultivačního média (Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium Base) + 3 ml lyzačního pufru. Lyzační pufr pro luciferázu Navážky aminomethanu,

potřebných 30,8

g

2mM

chemikálií:

121,14

dithiothreitol

g

(DTT)

10nM a

76,08

tris-(hydroxymethyl)g

2mM

kysliny

ethylenglykoltetraoctové (EGTA), se doplní na 100 ml dH2O. Pomocí 1M NaOH a 1M HCl se upraví pH na hodnotu 7,8 a uchovává se v lednici při teplotě 4 °C.

35

Příprava zásobního roztoku NaOH NaOH je silná jednosytná zásada, je v roztoku úplně disociovaná. Platí proto,





že koncentrace iontů OH- je rovna koncentraci zásady: OH   c NaOH . pOH = 14 – pH = 14 – 12 = 2  [OH-] = 10-pOH = 10-2 = 0,01M NaOH cNaOH = 0,01M = 0,01mol/l (již potřebovaná koncentrace v roztoku E2), MNaOH = 39,997 g.mol-1, Vroz.= 5.10-3 l (zásobní roztok)  m = c · V · M = 1 mol·l-1 · 5·10-3 l · 39,997 g·mol-1 = 0,2 g NaOH. Pro přípravu 100 ml koncentrovaného NaOH o pH 12 se 4 g NaOH rozpustilo ve 100 ml H2O. Tento koncentrovaný roztok NaOH poté sloužil k naředění vzorků a promývání aparatury RO. Na objem 2,5l zásobní láhve se po 100 µl NaOH přidával, tak aby výsledné pH bylo 11. Příprava kalibrační řady E2 v EtOH (0,13pM - 500pM) Koncentrace zásobního roztoku E2: c E2 = 1 mg/ml nE2 = 1 mg/272,4 mg·mmol-1 = 3,67 µmol na 1 ml  0,00367 mol/l = 3,67 mM Ředění: n/200 = 3,67/200 = 0,01835 mM = 18,35·106 pM roztok E2 o konc. 1 mg/ml 100x naředit  1/100 (5 µl E2 + 495 µl rozt.) 100x naředit  1/10000 = 0,0001 g/l = 10 µg/l (ředění) 200x  0,5 µg/l Převedeno na molaritu: E2= 272,382  0,5/272,4 = 0,001835 µM = 1835 pM Mimo koncentrace 500pM a 100pM se kalibrační řada připravovala trojkovým ředěním: 33pM; 11pM; 3,7pM; 1,2pM; 0,4pM; 0,13pM. Kalibrační řada byla připravena v EtOH. Příprava roztoků daidzeinu a genisteinu o koncentracích 0,1nM, 1nM, 10nM v DMSO Získané vzorky roztoků genisteinu a daidzeinu měly výchozí koncentraci 1 mg/ml. Tyto koncentrace se naředily rozpouštědlem DMSO 1:1, koncentrace po zředění c = 0,5 mg/ml. Z této koncentrace se připravily roztoky daidzeinu a genisteinu o koncentracích 0,1nM, 1nM, 10nM.

36

2.2 KULTIVACE HeLa 9903 A MVLN BUNĚK V kultivačních lahvích s přidaným médiem DMEM s 10% FBS-DCC se tkáňové kultury kultivují, poté se uchovávají v inkubátoru s 5 % CO2 při 37 ˚C. Pasáž se provádí co dva až tři dny, dle míry konfluence (75-90 %), v poměru 1:3 až 1:6. Maximální počet pasáží buněk by neměla přesahovat 40 pasáží (potom je ohrožena integrita odpovědi na estrogen). 2.2.1 Pasážování buněk Buňky v kultivační láhvi se prohlíží pod mikroskopem a dle míry konfluence se provede pasáž. Další manipulace s buňkami probíhá ve sterilním flow-boxu, zde jsou třeba laboratorní rukavice a dezinfekční roztok. Do flow-boxu se umístí lahev s médiem, lahev se sterilním PBS, a mikrozkumavka s trypsinem. Je třeba dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci jak buněk, tak média nebo PBS. Skleněná vysterilizovaná Pasteurova pipeta se nad kahanem ožíhne a nasadí na hadičku odsávání. Obsah původního média kultivační lahve s buňkami se pipetou odsaje. Plastovou Pasteurovou pipetou se nasaje 2-3 ml PBS a buňky se opláchnou. Roztok se odsaje a oplach se zopakuje. Po odsátí pufru se do lahve napipetuje 0,5 ml trypsinu (malá kultivační lahev, 25 cm3). Zhruba po 5 min by měly být vidět uvolněné shluky buněk. Láhev se suspenzí se otevře a připipetuje se potřebné médium, 2,5 ml (inhibuje činnost trypsinu). Nastává důkladné rozsuspendování, aby směs byla co možná nejvíce homogenní. 20 µl této suspenze se aplikuje na speciální sklíčko, které se vkládá do cellometru, abychom zjistili počet buněk v potřebném objemu. Potřebný objem buněčné suspenze se odpipetuje do sterilní 10ml skleničky. Zbytek objemu buněčné suspenze, která zůstala v kultivační láhvi, se doplní 5 ml média. U láhve se ožíhne hrdlo, uzavře a umístí do inkubátoru, zde jsou uchovávány při 37 °C a 5 % CO2 (OECD 2009) . 2.2.2 Nasazení, expozice buněk a měření Buněčná suspenze o známé hustotě se doplní kultivačním médiem s 10% FBS na požadovaný objem, tak aby při pipetování 100 µl do každé jamky kultivační desky byla koncentrace buněk 15 tis. na jamku. Využívá se vnitřních 60 jamek z 96-jamkové desky a do krajních řad se pipetuje jen sterilní PBS pro udržení vlhkosti. Desky s buňkami se umístí do inkubátoru. Během inkubace (přibližně 3 hodiny) dojde k adherenci buněk na dno jamek a poté může být zahájena expozice. 37

Buňky se zkontrolují pod mikroskopem, aby se vyloučila akutní toxicita, kontaminace nebo jiný problém. Exponují se testované vzorky, negativní kontrola (čisté rozpouštědlo) a připravená koncentrační řada E2 v EtOH v koncentracích 0,13; 0,4; 1,23; 3,7; 11,1; 33,3; 100; 500 pM, jako pozitivní kontrola. Dávkování připravených vzorků je po 100 µl na jamku. Každá koncentrace vzorku se nanáší v triplikátu. Naexponované mikrotitrační desky se uchovají v inkubátoru. Po 24 hodinové expozici se přichystá reakční sérum pro stanovení luminiscence. Multiodsávačkou se odsaje původní médium a multipipetou se aplikuje 100 µl připraveného séra do každé jamky. Desky se umístí na třepačku a nechají se 20 minut třepat (130 ot/min). Neboť se používaly mikrotitrační desky s průhledným dnem, bylo zapotřebí dno podlepit bílou neprůhlednou páskou. Luminiscence se měří na luminometru - přesný postup podle návodu u přístroje. Aktivita luciferázy byla stanovena v relativních světelných jednotkách (RLU).

38

2.3 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU SPE 2.3.1 Příprava vodných vzorků Do 2,5l skleněné láhve bylo napipetováno 41 µl 17-estradiolu o koncentraci 0,1 µg/ml. Stejným způsobem se připravily další dvě skleněné láhve, získali jsme tři nezávislé opakování experimentu. Výsledné koncentrace roztoků E2 v 2,5l byly 2 mmol/l. Čtvrtá 2,5l láhev byla naplněna dH2O, sloužila jako negativní kontrola. Za rozpouštědlovou kontrolu při přípravě vodných roztoků E2 metodou SPE je považován vzorek dH2O, jako rozpouštěcí roztok E2.

Obr. č: 7 Laboratorní fotografie zachycující SPE metodu v kroku extrakce vodných vzorků E2.

Pracovní postup zakoncentrování vodného vzorku metodou SPE K různým typům kolon jsou pokyny uvedeny na příbalových informacích od výrobce. Při použití SDB kolon, značky HLB OASIS® (WATERS, CZ), se postupovalo takto: Roztoky s E2 a roztok kontrolní byly následně zakoncentrovány s využitím extrakce tuhou fází (SPE) s kolonami. 39

Byly použity 4 kolony značky HLB OASIS® (WATERS, CZ). Kolona se zaktivovala 2 ml 100% MeOH, poté proběhla ekvilibrace 4 ml dH2O. Následovala samotná extrakce vzorků připravených ve 2,5l láhvích. Jak je možné vidět na Obr. č: 7, extrakce probíhala pod tlakem, kdy se provozní tlak pohyboval v rozmezí 5-10 mm Hg. Průměrná rychlost kapání vzorků byla okolo 10 ml/min na kolonu. Důležité je, aby roztok z kolony nevytékal, ale vykapával. Rychlost kapání při extrakci vodného vzorku E2 byla 1l/30min. Přes jednu kolonu prošlo 2,5 l vodného roztoku za 1,5 hod.. Po extrakci se kolonky pomocí podtlaku nechaly 10 min sušit a pomocí 2 ml MeOH proběhla následná eluce. Eluát se v jiných postupech dále zakoncentrovává např. pod dusíkem nebo vakuovou odparkou, ale v našem případě jsme eluát již dále nezakoncetrovávali. Získané vzorky byly uchovávány v 4 °C.

40

2.4 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU RO Potřeba stanovovat toxicitu vodných vzorků pomocí biologických metod stále roste. Jako jednoduchá a levná metoda přípravy vodných vzorků by mohla mít RO široké uplatnění, kromě testů s buněčnými kulturami by se mohla využít v ekotoxikologických testech, kde se vodné vzorky připravují či zakoncentrovávají. V této diplomové práci se RO využívala k zakoncentrování vodného roztoku s aplikovanou estrogenní látkou (estradiolem). V dalších fázích se navrhovaly optimální podmínky RO pro zakoncentovávání vodných vzorků pro rutinní práci v laboratoři. Pracovní postup zakoncentrování vodného vzorku metodou SPE Pro experimenty se používaly separační membrány značky FILMTEC z komerčně dostupného modulu RO pro přípravu vodných vzorků, součástí systému DEMOS 402.

Tab. č: 3 Charakterizace a provozní limity membrány FILMTEC (Membranes 2013).

Membrána

Polyamidová tenkovrstvá kompositní membrána

Maximální provozní teplota.

45 ° C

Maximální provozní tlak

21 bar

Rozsah pH, trvalý provoz

2-11

Při samotném procesu RO se získali zakoncentrované vodné vzorky E2. Estrogenní odpovědi vzorků se testovaly pomocí in vitro testů na buněčné kultuře Hela 9903. Ověřovala se výtěžnost metody přídavkem známé koncentrace testované látky do dH2O a pomocí in vitro biotestů se otestovala estrogenní odpověď vzorků. Výsledky budou porovnány s výsledky získanými z analýzy stejných vzorků zakoncentrovaných standardní metodou SPE.

41

Obr. č: vzorků.

8

Laboratorní

fotografie

zachycující

aparaturu

RO

pro

přípravu

vodných

retentát (koncentrát)

permeát (prošel membránou) Modul s filt. membránou

Zásobní roztok zakoncentrovávání

Čerpadlo

Obr. č: 9 Schéma aparatury RO při zakoncentrovávání vodných vzorků. Při toku semipermeabilní membránou budou určité složky surové vody membránou procházet a určité složky se budou zakoncentrovávat před membránou. Dojde k rozdělení vstupního proudu (surové vody) na permeát a retentát (koncentrát).

42

2.4.1 Optimalizace in vitro metody pro testování vodných vzorků Pro kultivaci buněk tkáňových kultur a při expozici testovaných vzorků v experimentech se při testování na buněčných kulturách využívá tekuté kultivační médium DMEM. Přidává se k němu připravená směs fetálního bovinního séra stripovaného aktivním uhlím (FBS+DCC). Při standardním testování E2 se buňky exponují 1µl testovaného vzorku na jednu jamku na mikrotitrační destičce, tedy v 200 µl (100 µl s nakultivovanými buňkami + 100 µl DMEM média + 1 µl vzorku E2 v organickém rozpouštědle. Aby se mohl aplikovat větší objem vodného zakoncentrovaného vzorku, který by se exponoval na buněčnou linii při in vitro testování, tak bylo připraveno 3x koncentrovanější médium, které poté bylo zpětně naředěno zakoncentrovaným vodným roztokem získaným pomocí RO. Tím bylo docílena vyšší přítomnost E2 při expozici na buněčné linii. Při expozici buněčné kultury tímto 3x koncentrovanějším médiem je potřeba naředit toto médium, tak aby odpovídalo původní koncentraci média, a to následujícím postupem: ke 100 µl média na mikrodesce se přidá 100 µl předem připraveného expozičního roztoku. Tento roztok připravíme v Eppendorfově zkumavce v poměru 1:2 smícháním 130 µl 3x koncentrovaného média a 260 µl vodného vzorku. Tím dojde k naředění koncentrovaného média. Odpověď estrogenního potenciálu byla porovnávána pomocí kalibrační křivky, která byla připravena pomocí organického rozpouštědla, je tedy nutné přidat do testovaného vodného roztoku 1 % tohoto rozpouštědla. K 360 µl roztoku se přidalo 3,6 µl rozpouštědla, které bylo použito při přípravě kalibrační řady (E2 v EtOH).

43

2.4.2 Ionizace E2 vlivem změny pH Hodnota pH roztoku hraje důležitou roli při ionizaci látek ve vodě (Bódalo-Santoyo et al. 2003). Na základě disociační konstanty E2, která je pKa = 10,71 (Lewis and Archer 1979) a rozdělovacího koeficientu oktanol/voda KOW = 4,01 (nízká polarita, lipofilní charakter) (HMDB 2005-2013) se experimentálně testovalo zvýšení pH. Podle (Shareef et al. 2006) se rozpustnost E2 nemění, pokud je pH v rozmezí 4 - 7, ale je vyšší při pH 10. Zvýšením pH došlo k disociaci E2, čímž byla zvýšena rozpustnost ve vodě, aby se snížila hydrofobicita a tím i sorpce na plastové části aparatury (především membránu). Podle informací od výrobce, že má pH vliv na funkčnost membrány RO, bylo zapotřebí pro čištění aparatury RO používat promývací roztok (NaOH) o pH 11, ne vyšší (Membranes 2013). Cílem bylo dosáhnutím disociace E2 ve vodném roztoku a zároveň bylo důležité dodržení provozních pH hodnot membrány RO, proto se promývacím i testovaným roztokům upravovalo pH na 11. V následujících experimentech se testuje vliv ionizace E2 ve vodném roztoku na změně pH. Metodou RO se zakoncentrovával vodný roztok E2 z 2,5l dH2O na objem přibližně 150 ml vzorku. Teoretické zakoncentrování rozpouštěných látek při 100% účinnosti je tedy 16x. 2.4.3 Testování estrogenní odpovědi připravovaných vzorků E2 ve vodném roztoku v závislosti na velikosti plastového povrchu a následných změnách pH Jednoduchým experimentem se chtěla dokázat závislost ionizace E2 ve vodě, který má vlastnost sorbovat se na plastové povrchy, na změně pH roztoku. Pro experiment se zvolil roztok E2 o 1µg/l, který byl přidán do dH2O. Použila se plastová 1,5ml Eppendorfova mikrozkumavka a tři 50 ml plastové kyvety, které se lišily v postupu v úpravě pH. Množství E2 se určilo z výpočtů, tak aby ve výsledném roztoku (kterém byly exponované buňky v jamce) byla koncentrace 18,25 pM. Pro změnu pH roztoků se použilo 1M roztoku NaOH a 1M roztoku HCl.

44

Postup přípravy vzorků E2: Eppendorfova zkumavka: na přípravu 0,5 ml roztoku E2 se napipetuje: 495 µl dH2O + 5 µl 1µg/l E2 do 1,5ml plastové mikrozkumavky. Kyveta: na přípravu 0,5 ml roztoku E2 se napipetuje: 495 µl dH2O + 5 µl 1µg/l E2 do 50ml plastové kyvety. Kyveta pH 712: na přípravu 0,5 ml roztoku E2 se změnou pH na 12 se napipetuje: 490 µl dH2O + 5 µl 1µg/l E2 + 5 µl 1M NaOH do 50ml plastové kyvety. Kyveta pH 7127: na přípravu 0,5 ml roztoku E2 se změnou pH na 12, poté zpět na pH 7 se napipetuje: 485 µl dH2O + 5 µl 1µg/l E2 + 5 µl 1M NaOH do 50ml plastové kyvety, a po třepání se přidá 5 µl 1M HCl.

Takto připravené vzorky se umístily na třepačku po dobu 20 min. Poloha uložení vzorku na třepačku byla zvolena tak, aby se roztok dotýkal co nejvíce plastového povrchu. Po třepání se vzorky přímo testovaly in vitro biotestem na buněčné kultuře Hela 9903 výše uvedeným postupem. 2.4.4 Experiment založený na sorbování vodných vzorků E2 metodou RO v závislosti na pH Modul RO, samotná membrána včetně potřebných hadiček jsou z plastového materiálu, to by mohlo mít za následek sorbování E2 na plastový povrch. V případě, že pH roztoku ovlivňuje ionizaci E2 (a tím i hydrofobicitu) ve vodném vzorku, se testovallo zakoncentrováním vodného vzorku E2 metodou RO. První zakoncentrování roztoku E2 bez úpravy pH, druhé zakoncentrování roztoku E2 s úpravou pH na 11. Zakoncentrování vodného roztoku E2 bez úpravy pH pomocí RO Před samotným experimentem se proplachuje systém RO 2,5 l roztokem NaOH o pH 11, aby se odstranily případné usazené nečistoty a nasorbované látky. Poté se systém RO propláchne 2,5 – 5 l dH2O do neutrálního pH. Odebere se první vzorek, který prokáže čistotu aparatury. Všechny vzorky, které jsou odebírané, se pipetují do 2ml skleněných vialek. Pro nachystání samotného vodného roztoku je zapotřebí 2,5l skleněné láhve, která se naplní dH2O po rysku na objem 2,5l. Z láhve se odebere vzorek, čistá dH2O sloužící jako negativní kontrola. Do láhve se přidá 41 µl roztoku E2 o koncentraci 0,1 µl/ml. 45

Odebere vzorek, určující výslednou koncentraci 2 pmol/l v objemu 2,5l. Vodný vzorek E2 v láhvi, který má pH neutrální se pomocí RO nechá zakoncentrovávat. Před koncem zakoncetrováním se odebere vzorek permeátu. Doba zakoncetrovávání 2,5l láhve je 40 min. Získaný zakoncentrovaný vodný vzorek E2 má objem 150 ml, z něj se odebere vzorek zakoncentrovaného vodného roztoku E2. Zakoncentrování vodného roztoku E2 s úpravou pH na 11 pomocí RO Postup je zcela totožný s postupem: zakoncentrování vodného roztoku E2 bez úpravy pH pomocí RO, až po část, kdy se do láhve přidá 41 µl roztoku E2 o koncentraci 0,1 µl/ml. Před tímto krokem se odebere vzorek rozpouštědlové kontroly, který se připraví smícháním 2,5l dH2O a takového množství NaOH, které upraví pH vodného roztoku E2 na hodnotu 11. Teprve poté se přidá 41 µl roztoku E2 o koncentraci 0,1 µl/ml, odebere se vzorek i s přidaným E2. Opět se vodný roztok E2 v láhvi zakoncentruje pomocí systému RO. Všechny vzorky se odebírají totožně, pipetují se do 2 ml skleněných vialek. Pro oba postupy se používala čistá 2,5l skleněná láhev. Všechny získané vzorky se otestovaly pomocí in vitro testu. 2.4.5 Stanovení estrogenní odpovědi genisteinu a daidzeinu Pro srovnání výtěžnosti E2, zakoncentrovaných vodných vzorků získaných metodami RO a SPE, jsme zvolili dva fytoestrogeny (genistein a daidzein). V bakalářské práci (Vyhňáková 2011) se testoval estrogenní potenciál vybraných vzorků fytoestrogenů pomocí in vitro testů s MVLN buněčnou linií. Mezi stanovované fytoestrogeny patřil i genistein. Vyhňáková stanovila hodnotu EC50 genisteinu na 0,7 nM. Na základě těchto informací se připravili roztoky genisteinu a daidzenu v DMSO koncentracích 0,1nM; 1nM; 10nM, a otestovala se jejich estrogenní odpověď na buněčné linii HeLa 9903.

46

2.5 VYHODNOCOVÁNÍ Měřením pomocí luminometru, který měřil každou desku třikrát, se získaly výsledky v relativních luminiscenčních jednotkách (RLU), které se poté vyhodnocovaly pomocí programu MS Excel. Odpovědi vzorků byly převedeny na procenta maximální odpovědi pozorované pro kalibrační křivku E2. Chybové úsečky v grafech označují směrodatnou odchylku triplikátu měření v jedné desce. Jde o standardizovaný postup pro ověření variability in vitro testu v hodnotách odpovědi a ke srovnání hodnot odpovědi jednotlivých testů (Villeneuve et al. 2002). Změřené hodnoty v RLU byly přeneseny a znormalizovány na 100% odpověď maximálního efektu E2. K vyhodnocení výsledků zakoncentrování RO a SPE byla použita rovnice logaritmické regrese, kterou byla vypočtena z kalibrační křivky E2. Estrogenní účinek testovaných vzorků je vyjádřen % maximálního efektu E2 (E2 max). Pomocí těchto výsledků se spočítala EC50. 2.5.1 Stanovení EC50 Hodnota EC50 je koncentrace toxikantu, při které se projeví 50% účinek s porovnání s kontrolou. Pomocí logaritmické regrese z grafu lze vyhodnotit závislost míry indukce E2, kterou je možné vidět na Obr. č: 10. Pro výpočet hodnoty EC50 bylo využito tohoto modelu logaritmické regrese kalibrační křivky E2 max (Obr. č: 11), vytvořená na základě křivky dávka – odpověď (Korner et al. 2000). 2.5.2 Statistické vyhodnocení dat Statistickým programem GraphPad Prism se provedly statistické výpočty na základě směrodatných odchylek pomocí jednovýběrového t-testu. Hodnoty sloupců se srovnávaly s nulovou hodnotou a výsledkem bylo prokázání statistické významnosti, kde * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

47

2.5.3 Kalibrační křivka

Obr. č: 10 Kategorický graf znázorňuje závislost luminiscenčního záření na estrogenní aktivitě připravené kalibrační řady E2 (500pM = 100%), která je měřená pomocí buněčné linie HeLa9903. Expoziční doba 24h. Chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku.

Obr. č: 11 Graf znázorňující logaritmickou závislost míry indukce E2 max na koncentraci E2

48

3. VÝSLEDKY 3.1 TESTOVÁNÍ ESTROGENNÍHO POTENCIÁLU 3.1.1 Testování estrogenní odpovědi 3x koncentrovanějšího média vůči standardnímu médiu Podle grafu, který je znázorněn na Obr. č: 12 je odpověď estrogenity speciálně připravovaného 3x koncentrovaného média v porovnání se standardně připraveným médiem téměř totožná. Výsledné hodnoty EC50, které jsou pro 3x koncentrovanější médium 1,5 pM a pro standardně připravené médium 2,4 pM, jsou zanedbatelného rozdílu. Pro tyto výsledky se pro následující experimenty s metodou RO používalo toto 3x koncentrovanější médium při expozici vzorků s estrogenním potenciálem.

Obr. č: 12 Kategorický graf závislosti procentuální míry luminiscence na koncentraci E2. Porovnání estrogenní odpovědi při použití standardního DMEM média a 3x koncentrovanějšího média, připraveného podle uvedeného postupu, pro využití vodných vzorků. Bodové hodnoty představují průměr z triplikátů. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. Tab. č: 4 Tabulka hodnot EC50 standardně připravovaného média DMEM a EC50 3x koncentrovaného média získané pomocí výpočtů z logaritmické regrese z hodnot E2. EC50

stand. DMEM

2,4 pM

EC50

3x konc. DMEM

1,5 pM

49

3.1.2 Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou SPE 3.1.2.1 Výtěžnost metody SPE při zpracování vodného roztoku E2 Výtěžnost metody SPE při zakoncentrování vodných roztoků pro měření estrogenního potenciálu pomocí in vitro testu s buněčnou kulturou HeLa 9903. Na Obr. č: 13 je zobrazena výtěžnost zprůměrovaných třech nezávislých opakování.

*

*

Obr. č: 13 Kategorický graf znázorňující procentuální závislost míry indukce estrogenního receptoru na odpovědi luciferázy testovaných vodných vzorků připravené metodou SPE. Negativní kontrola znázorňuje vodný vzorek bez E2 (dH2O) zakoncentrovaný SPE metodou. Rozpouštědlová kontrola znárorňuje vodný vzorek (dH2O) před zakoncentrováním. Roztok E2 znázorňuje odběr vodného vzorku s přidaným E2 před zakoncentrováním. SPE extrakt znázorňuje výtěžnost E2 metody SPE. Sloupce představují průměr ze tří nezávislých opakování. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

50

Tab. č: 5 Koncentrace vzorků E2 získané metodou SPE. varianta

konc.[pM]

negativní kontrola

-

rozpouštědlová kontrola

-

vzorek SPE

1,72

SPE extrakt

21,20

Z výpočtů koncentrací E2 je možné metodou SPE při neutrálním pH vodné vzorky přibližně 12x zakoncentrovat. Výtěžnost zpracování vodných vzorků E2 metodou SPE byla nad 73 %. Příloha č: 1 zobrazuje výtěžnost zakoncentrovaných vodných roztoků E2 metodou SPE ze třech nezprůměrovaných nezávislých opakování.

51

3.1.3 Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou RO Cílem této studie je zavést levnější, snadno proveditelnou a k životnímu prostředí šetrnou metodu přípravy vodních vzorků primárně určených pro testování přítomnosti estrogenních látek pomocí zavedených in vitro biotestů. 3.1.3.1 Testování estrogenní odpovědi E2 ve vodném roztoku v závislosti na velikosti plastového povrchu a následných změnách pH Na základě pochybností, vůči sorbování E2 na plastové povrchy, které jsou detailněji vysvětleny v kapitole 3.4.3., se jednoduchým experimentem chtěla dokázat závislost ionizace E2 ve vodě na velikosti plastového povrchu. Experiment se postavil na změnách pH vodného roztoku E2.

*

* *

*

Obr. č: 14 Kategorický graf znázorňující vliv pH na ionizaci E2 ve vodném roztoku a tím i sorpci na plastové povrchy. Sloupec s označením epp.zk, znázorňuje estrogenní odpověď E2 připravený v Eppendorfově mikrozkumavce, kde nebylo upraveno pH. Kyveta 7 znázorňuje estrogenní odpověď roztoku E2, který byl připravený v plastové kyvetě, kde nebylo upraveno pH. Kyveta 7-12 znázorňuje estrogenní odpověď roztoku E2, který byl připravený v plastové kyvetě a jeho pH se změnilo na hodnotu 12. Sloupec s označením kyveta 7-12-7 znázorňuje estrogenní odpověď roztoku E2, kterému bylo pH změněno na pH 12, a poté zpět na pH 7. Sloupce představují průměr z triplikátů. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

52

Tab. č: 6 Vypočtené koncentrace vodných vzorků E2 pomocí logaritmické regrese kalibrační křivky E2 materiál pH

konc. [pM]

epp.zk pH 7

10,53

kyveta pH 7

6,94

kyveta s pH 7-12

17,34

kyveta s pH 7-12-7

4,85

Na základě experimentu, jenž bylo cílem zjistit vliv plastového povrchu na sorbování E2 za změn pH, autorka soudí, že se estrogenní odpověď vzorku připravovaného v plastové kyvetě jeví nižší než estrogenní odpověď roztoku E2 nachystaného v Eppendorfově mikrozkumavce, při nezměněném pH (7). Mohl by to být důkaz sorbování E2 na plastové povrchy. Pokud se roztoku E2 v plastové kyvetě upravilo pH na 12, projevila se vyšší estrogenní odpověď, ionizace E2 byla vyšší. V kyvetě, kde se pH roztoku E2 prvně upravilo na pH 12 a po protřepání se pH upravilo opět na pH 7, byla estrogenní odpověď opět nižší. E2 se nasorbovalo na plastový povrch kyvety. Závěrem tohoto experimentu bylo, že se pro další přípravy vodných vzorků zakoncentrováním pomocí metody RO experimentovalo s úpravami pH. 3.1.3.2 Výtěžnost metody RO při zpracování vodného roztoku E2 s vlivem změny pH První testy ukázaly vliv pH na ionizaci E2 ve vodném roztoku. Ve startovních experimentech se prováděly experimenty s 50l plastovým kanistrem, v in vitro testu byly odpovědi estrogenní aktivity nulové. Samotná RO probíhala přibližně 8 hodin, proto se upravily podmínky a pro experimenty se začal využívat plastový barel o objemu 5 l. Zde již byly detekce estrogenního potenciálu vodných vzorků, ale né zcela validní, tedy reprodukovatelné. Finální vzhled aparatury RO obsahoval skleněnou 2,5l láhev, ve které byl připraven roztok E2 v EtOH s dH2O. Na Obr. č: 15 je možné vidět vliv pH vodného roztoku E2 na jeho ionizaci a schopnost sorbovat se na plastové povrchy separační membrány RO a plastové povrchy přívodných a odvodných hadiček.

53

*

*

*

*

Obr. č: 15 Kategorický graf znázorňující vliv pH roztoku na ionizaci E2 ve vodném roztoku a tím i na sorpci E2 na plastové povrchy. Sloupce označené vz. 0D – 4D jsou výsledky vzorků odebraných při zakoncentrování roztoku E2 metodou RO, kde bylo pH neutrální. Sloupce označené vz. 0E – 4E jsou výsledky vzorků odebraných při zakoncentrování roztoku E2 metodou RO, kde bylo pH upraveno na hodnotu 11, jednotlivé sloupce jsou detailněji popsány v Tab. č: 7. Sloupce představují průměr z triplikátů. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

Tab. č: 7 Vypočtené koncentrace vodných vzorků 0D – 4D a 0E – 4E pomocí logaritmické regrese kalibrační křivky E2. vz.0D - 4D: roztoku E2, pH neutrální

konc. [pM]

vz.0 - odběr z konc. hadičky po proplachu

-

vz.1 - odběr z 2,5l dH2O

-

vz.2 - odběr z 2,5l dH2O po přidání 41 µl EtOH

1,3

vz.3 - odběr zakoncentrovaného roztoku

1,5

vz.4 - odběr z permeátu

-

vz.0E - 4E: roztoku E2, pH upraveno na 11

konc. [pM]

vz.0 - odběr z konc. hadičky po proplachu

-

vz.1 - odběr z 2,5l dH2O + NaOH pH 11

-

vz.2 - odběr z 2,5l dH2O po přidání 41 µl EtOH vz.3 - odběr zakoncentrovaného roztoku vz.4 - odběr z permeátu

0,8 1051,6 -

54

Při neutrálním pH se vodný roztok E2 téměř nezakoncentroval, je tedy možné nasorbování testované látky na povrch plastového materiálu systému RO. Naopak estrogenní odpověď zakoncentrovaného vzorku, kde se upravovalo pH na 11 vykazuje neobvykle vysokou indukci (která je však mimo kalibrační rozsah, je tedy potřeba brát tuto hodnotu jen jako orientační). Přítomnost NaOH by na tuto indukci neměla mít vliv, neboť i při pH 11, vzorek č. 1 (odběr z 2,5 l dH2O, před přidáním E2, ale po přidání NaOH), tuto indukci nevykazoval. Po změření pH výsledných vzorků se pH pohybovalo kolem 11. 3.1.3.3 Testování estrogenního potenciálu vodných vzorků E2 získaných metodou RO se změnou pH na 11 Estrogenita vodného roztoku E2 s předem připravenou koncentrací byla měřena in vitro testem na buněčné kultuře HeLa 9903.

*

*

*

* *

Obr. č: 16 Kategorický graf znázorňující procentuální závislost míry indukce estrogenního receptoru na odpovědi luciferázy testovaných vodných vzorků. Sloupce označené kř: 1/27; kř 1/9; kř 1/3 zobrazují trojkovou řadou naředěný koncentrovaný vzorek E2 (vz.4G = zás.) odebraný při zakoncentrování roztoku E2 metodou RO, kde bylo pH upraveno na hodnotu 11, jednotlivé sloupce jsou detailněji popsány v Tab.č.8. Sloupce představují průměr z triplikátů. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

55

Tab. č: 8 Vypočtené koncentrace vodných vzorků 0G – 5G pomocí logaritmické regrese kalibrační křivky E2 vz.0G - 5G: roztoku E2, pH upraveno na 11

konc. [pM]

vz.0 - odběr z konc. hadičky po proplachu NaOH o pH 11

-

vz.1 - odběr z konc. hadičky po proplachu dH2O

-

vz.2 - odběr z 2,5l dH2O o pH 11

-

vz.3 - odběr z 2,5l dH2O po přidání 41 µl EtOH o pH 11

1,2 111,1 x

vz.4 - odběr zakoncentrovaného roztoku vz.5 - odběr z permeátu

0,3

Koncentrační řada vz. 4G pH upraveno na 11

konc. [pM]

1/27 - doplnění roz. NaOH o pH 11

0,4

1/9 - doplnění roz. NaOH o pH 11

0,6

1/3 - doplnění roz. NaOH o pH 11

1,6

vz.4G - nezředěný vzorek x

279,7

- Statistická hodnota je nevýznamná, ale estrogenní potenciál je zřejmý

Estrogenní odpověď zakoncentrovaného vodného vzorku E2 dosáhla 114% indukce luminiscence v porovnání s maximem E2 (500pM). Tento experiment byl testovaný ve více opakováních, ale i vysoké směrodatné odchylky triplikátu jednoho vzorku v desce (v grafu vyznačené

chybové

úsečky)

ukazovaly

vysokou

variabilitu

estrogenní

odpovědí

připravovaných vzorků E2. Z vodného roztoku E2 o koncentraci 1,2 pM je metoda RO schopna zakoncentrovat vodný vzorek na koncentraci 111,1 pM, je tedy vodný roztok přibližně 93x zakoncentrovaný. Toto je však v rozporu s teoretickým výpočtem, kdy při zkoncentrování vodného roztoku dojde k 16násobnému zakoncentrování vodného vzorku (z 2500 ml na 150 ml). Tento nesoulad je nutno brát v potaz a dalšími experimenty vyřešit. Hodnota EC50 získaného zakoncentrovaného vzorku E2 získaného pomocí metody RO byla vypočtena z logaritmické regrese ředící řady vzorku 4G srovnáním s kalibrační křivkou, a orientačně se pohybuje kolem 70 pM, hodnota byla vypočtena z grafu, který je zobrazen na Obr. č: 16. V porovnání hodnoty EC50 kalibrační řady E2, která se pohybuje kolem 4,5 pM, je hodnota EC50 zakoncentrovaného vzorku mnohonásobně vyšší.

56

3.1.4 Testování estrogenního potenciálu vodných roztoků daidzeinu a genisteinu Estrogenita vodných roztoků připravených koncentrací daidzeinu a genisteinu byla měřena in vitro testem na buněčné kultuře MVLN (původně i na buněčné kultuře HeLa 9903, avšak s negativním výsledkem).

Obr. č: 17 Kategorický graf znázorňující estrogenní aktivitu testovaných vzorků daidzeinu (DAI) a genisteinu (GEN), která je měřená pomocí buněčné linie MVLN. „Blank DMSO“ označuje rozpouštědlovou kontrolu. Chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku.

Estrogenní odpověď vodných vzorků daidzeinu a genisteinu ani v jednom případě nepřesáhla 10 % indukce luminiscence v porovnání s maximem E2 (500pM) a proto není možné vypočítat relativní estrogenní potenciál porovnáním EC50 vodných vzorků daidzeinu a genisteinu s E2. Data se na základě směrodatných odchylek srovnávaly s nulovou hodnotou a výsledkem hodnoty nebyly statisticky významné. Vzhledem k tomuto negativnímu výsledku, a to jak na buněčné kultuře HeLa 9903, tak i MVLN, nebylo možno provádět další experimenty se zakoncentrováním metodou RO.

57

4. DISKUZE Cílem této studie bylo experimentálně otestovat separační metodu RO jako možnou metodu pro zakoncetrovávání vodných roztoků. Látky, testované v této studii patří do třídy přirozených estrogenů a fytoestrogenů, které se vyskytují ve vodném prostředí. Pro posouzení estrogenity látek vyskytujících se ve vodném prostředí, se v této diplomové práci použila metoda založená na stanovení estrogenní aktivity vzorku in vitro testem převážně s buněčnou linii HeLa 9903, který sloužil jako vhodný typ buněk pro hodnocení estrogenity vodných vzorků pro látku 17-estradiol. Pro stanovení estrogenity dvou zástupců fytoestrogenů bylo využito in vitro testů i s buněčnou linii MVLN. In vitro pokusy v některých případech nevykazovaly optimální podmínky pro testování, což mohlo ovlivnit výsledky testovaných vodných vzorků. Pro stanovení estrogenů ze vzorků vod se tradičně používají metody chromatografické, konkrétně vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) nebo plynová chromatografie (GC). Jako nejčastější způsob detekce je využíván hmotnostní detektor (MS). Při těchto metodách se pro úpravu vzorku na analýzu využívá prekoncentračního kroku pomocí extrakce tuhou fází (SPE) (Díaz-Cruz et al. 2003). Jedním z dalších úkolů této diplomové práce byla optimalizace podmínek při zakoncentrování vodných roztoků s E2 metodou RO, což zahrnovalo i přizpůsobení podmínek fyzikálně-chemickým vlastnostem látky E2. Zaměřili jsme se především na úpravu objemu vodného roztoku E2 při zakoncentování RO a testování změn pH roztoků, jejichž důvodem jsou dále uvedená pozorování. Vědci potvrdili, že hydrofobicita látky E2 ovlivní sorpci látky na plastové povrchy systému RO (Kiso et al. 2000). Ozaki a Li uvádí, že velikost molekuly je jedním z nejdůležitějších faktorů zadržení látek na membráně RO (Ozaki and Li 2002). Japonská studie (Kimura et al. 2004) zkoumala možné schopnosti membrán RO separovat estrogenní látky (EDC) a farmaceuticky aktivní látky (PhACs), narušující činnost endokrinních systémů organismů. Mezi testovanými látkami byl i 17-estradiol. Testovali polaritu látky, a zdali má retenční schopnost vliv na separaci testovaných látek přes membránu. Kimura ve své studii používal dva typy membrán RO, a to od výrobce Dow FilmTec XLE z polyamidu, výtěžnost E2 z vodného roztoku byla 83%, a druhý typ membrány byl z acetát celulózy od výrobce Toray SC-3100, se kterou dosáhli pouze 29%

58

výtěžku E2 ve vodném roztoku. Při těchto pokusech se neexperimentovalo se změnami pH vodných roztoků. Hodnota pH roztoku hraje, ale důležitou roli při ionizaci látek ve vodě (BódaloSantoyo et al. 2003). Na základě disociační konstanty E2, která je pKa = 10,71 (Lewis and Archer 1979) a rozdělovacího koeficientu oktanol/voda KOW = 4,01 (hydrofobicita) (HMDB 2005-2013) se experimentálně testovala změna pH vodného roztoku E2, konkrétně zvýšením na hodnotu 11. Výsledek experimentu je možno vidět na Obr. č: 14, ve kterém je znázorněn vliv pH na ionizaci E2 ve vodném roztoku a tím i sorpci na plastové povrchy. V plastových nádobách, kde se pH upravilo na hodnotu 12, je možné detekovat přibližně 3x větší estrogenní potenciál, čili menší sorpci na plastový povrch. Další postup experimentu byl stanoven na základě poznatků, že ionizací E2 dochází k jeho disociaci, při pH vyšším než pH 10, a následnému zvýšení rozpustnosti E2 ve vodě, čímž je snížená sorpce na plastové části aparatury (především membránu). Zároveň je podle (Shareef et al. 2006) důležité dodržení provozních hodnot pH membrány RO, protože pH roztoku má vliv na samotnou funkčnost membrány RO. Bylo tedy zapotřebí, používat roztok NaOH o maximální hodnotě pH 11, který sloužil pro čištění aparatury RO i pro upravování pH vodných roztoků E2. Z experimentů, při kterých se testoval vliv pH roztoku na výtěžnost vodných roztoků E2 zakoncentrováním metodou RO, je zřejmé, že dosažením disociace E2 ve vodném roztoku a zároveň udržením neutrálního pH došlo k sorbci E2 na plastové povrchy. Dále bylo zjištěno, že je separační metoda RO schopna zakoncentrovat vodný vzorek přibližně 93x. Hodnoty jsou však pouze orientační, neboť příliš vysoká indukce (111 %) estrogenního potenciálu u zakoncentrovaných vodných roztoků E2 získaných metodou

RO

a velká

variabilita

směrodatných

odchylek

u

těchto

výsledků

je nepravděpodobná, a proto je nutné provézt další pozorování této metody. Kromě úspěšnosti výsledků z extrakce byla také stanovována hodnota EC50 zakoncentrovaného vzorku E2 získaného pomocí metody RO. Tato hodnota byla vypočtena z logaritmické regrese ředící řady vzorku 4G (Tab. č: 8) a ve srovnání s kalibrační křivkou, se pohybuje kolem 70 pM. Porovnáním hodnoty EC50 kalibrační řady E2 v EtOH, která se pohybuje kolem 4,5 pM, je hodnota EC50 zakoncentrovaného vzorku mnohonásobně vyšší (přibližně 16x).

59

Metoda RO je schopna zakoncentrovat vodný roztok pouze na 150 ml (tzv. „mrtvý“ objem membrány RO), pokud by měl výchozí roztok objem 2,5 l, jako v našem případě, vodný roztok by se zakoncentoval přibližně 17x. Proto pro testování vodných vzorků E2 bylo speciálně připravené 3x koncentrované médium, díky kterému se mohl na buněčné kultury v in vitro testu exponovat větší objem vodného vzorku E2. Pro srovnání EC50 3x koncentrovaného média (1,5 pM E2) s hodnotou EC50 standardně připraveným médiem (2,4 pM E2) nebyl pozorován významný rozdíl. Náplní praktické části bylo také porovnání výtěžností, a to výtěžnosti separační metody RO s výtěžností metody SPE, která je běžně používanou metodou zakoncentrování vodných vzorků. Z výsledků koncentrací E2 je možné metodou SPE při pH neutrálním vodné vzorky přibližně 12x zakoncentrovat. Výtěžnost zpracování vodných vzorků E2 metodou SPE byla nad 73 %. Na Obr. č: 13 je možné vidět graf, ve kterém jsou znázorněny již zprůměrované hodnoty E2 z jednotlivých vodných vzorků E2, přičemž v příloze č. 1 na Obr. č: 18 je zobrazena výtěžnost metody SPE při zakoncentrování vodných roztoků E2 v originálním zobrazení. Čeští kolegové (Kozlík et al. 2011) docílili větší výtěžnosti E2 z vodného roztoku. Pro analýzu pěti významných estrogenních znečišťujících látek ve vodách zvolili metodu kapilární kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (CLC-MS-MS). Pro přípravu vzorků použili optimalizovanou metodu SPE s kolonou IX-Pak C18, která jim umožnila zakoncentrování všech testovaných estrogenů s vysokým výnosem, pro E2 téměř 98%, jako extrakční činidlo použili MeOH. V této diplomové práci se porovnávala výtěžnost separační metody RO (106%) a metody SPE, jejíž výtěžnost byla nižší. Pro vysokou indukci estrogenní odpovědi zakoncentrovaných vodných vzorků metodou RO nemáme zdůvodnění. Takto nečekaně vysoká výtěžnost metody RO je nemožná, a proto je nutné dále prozkoumat, čím je toto nadměrné navýšení výtěžnosti způsobeno. I přesto lze na základě těchto výsledků, předpokládat, že je ionizace látek důležitým faktorem pro mechanismus RO membrány. Pro ověření výtěžnosti metody RO bylo v plánu připravit vodné vzorky zakoncentrováním RO dvou zástupců fytohormonů s estrogenním potenciálem, daidzeinu a genisteinu. Autorka bakalářské práce (Vyhňáková 2011) testovala estrogenní potenciál vybraných vzorků fytoestrogenů pomocí in vitro testů s MVLN buněčnou linií, kde mezi stanovované fytoestrogeny patřil i genistein. Vyhňáková stanovila hodnotu EC50 genisteinu na 0,7 nM. 60

V našem případě jsme použili ke stanovení estrogenity obou zástupců fytoestrogenů in vitro test s buněčnou linii Hela 9903 i s buněčnou linii MVLN. Výsledky testů prokázaly, že připravené koncentrace těchto dvou látek byly pro detekci příliš nízké a odpovídaly pouze 10% indukci. Výsledky testů studie Gutendrofa a Westendorfa (2001), kde testovali estrogenní potenciál genisteinu in vitro testem na buněčné kultuře MVLN, však stanovily hodnotu EC50 genisteinu na 50 nM (Gutendorf and Westendorf 2001). Proto je zřejmé, že zvolené koncentrace těchto fytoestrogenů byly příliš nízké, avšak z časových důvodů již nebylo možno v dalších experimentech s vyššími koncentracemi pokračovat. Budoucnost metody RO Pro pokračování v optimalizaci metody RO jako separační (a prekoncentrační) metody vodných vzorků by autorka navrhovala testování membrán RO různých velikostí a výrobců, a s tím související možnost zmenšování „mrtvého“ objemu modulu reverzní osmózy, kterým by se získal ještě koncentrovanější vodný roztok. Dále by bylo vhodné experimentálně vyzkoušet zakoncentrování dalších estrogenních látek. Nadějná metoda RO by mohla mít slibnou budoucnost, např. při aplikaci metody RO pro zakoncentrování a následnou detekci estrogenních látek z odpadních vod z čistíren, proto je důležité v tomto testování pokračovat.

61

5. ZÁVĚR V předložené diplomové práci byla vypracována literární rešerše s přehledem metodik, které slouží k přípravě a testování vodných vzorků obsahující látky s estrogenním potenciálem. Podařilo se splnit téměř všechny stanovené cíle, jakožto optimalizaci in vitro metod pro testování vodných vzorků s estrogenním potenciálem ze životního prostředí, použití komerčně dostupného modulu RO pro přípravu vzorků vody i ověření výtěžnosti metody RO pro některé standardní látky. Jedním z cílu této diplomové práce bylo studium separační metody reverzní osmózy, která svými možnostmi, přípravou a zakoncentrováním vodných roztoků za účelem získání zakoncetrovaných vzorků látek s estrogenním potenciálem, není zcela prozkoumána. Pomocí in vitro testu na buněčné kultuře Hela 9903 se podařilo stanovení estrogenního potenciálu přírodního estrogenu 17-estradiol ve vodě. Výtěžnost metody RO se porovnávala s výtěžností metody SPE, která je pro přípravu a zakoncentrování estrogenních látek již optimalizovanou metodou. Výtěžnost zpracování vodných vzorků E2 metodou SPE byla nad 73 %. V porovnání tedy s metodou RO, která měla výtěžnost 114 % je výtěžnost metody SPE nižší, přičemž pro takto vysokou výtěžnost RO zatím

nemáme dostatečné zdůvodnění. Nepřiměřeně vysoká výtěžnost metody RO je

neobvyklá, a proto je nutné dále prozkoumat, čím je to způsobeno. In vitro tetstováním bylo zjištěno, že je separační metoda RO schopna zakoncentrovat vodný vzorek přibližně 93x (což souvisí se zmíněnou výtěžností a je to tedy nutno ještě prověřit) a metoda SPE je schopna vodný roztok zakoncentrovat přibližně 12x (výseldné zakoncentrování při měření in vitro biotestem). Závěrem této práce je možné shrnout výsledky testů, které potvrzují možnost použití reverzní osmózy jako metody pro zakoncentrovávání vodných roztoků, ale pro zavedení, jako standardně využívané laboratorní metody pro přípravu a zakoncentrování vodných vzorků, jsou nutné další optimalizace.

62

6. POUŽITÁ LITERATURA Allen, E., B. F. Francis, L. L. Robertson, C. E. Colgate, C. G. Johnston, E. A. Doisy, W. B. Kountz et al. 1924. The hormone of the ovarian follicle; its localization and action in test animals, and additional points bearing upon the internal secretion of the ovary. American Journal of Anatomy 34:133-181. Alvarez, V., S. Alvarez, F. A. Riera, and R. Alvarez. 1997. Permeate flux prediction in apple juice concentration by reverse osmosis. Journal of Membrane Science 127:25-34. Anděl, P. 2011. Ekotoxikologie, bioindikace a biomonitoring. ISBN 978-80-9037879-7. Baker, V. A. 2001. Endocrine disrupters--testing strategies to assess human hazard. Toxicol In Vitro 15:413-419. Belkacem, M., K. Bensadok, A. Refes, P. M. Charvier, and G. Nezzal. 2008. Water produce for pharmaceutical industry: role of reverse osmosis stage. Desalination 221:298-302. Birt, D. F., S. Hendrich, and W. Wang. 2001. Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacology & Therapeutics 90:157-177. Bódalo-Santoyo, A., J. L. Gómez-Carrasco, E. Gómez-Gómez, F. Máximo-Martín, and A. M. Hidalgo-Montesinos. 2003. Application of reverse osmosis to reduce pollutants present in industrial wastewater. Desalination 155:101-108. Buonomenna, M. G. 2013. Nano-enhanced reverse osmosis membranes. Desalination 314:73-88. Burlington, H., and V. F. Lindeman. 1950. Effect of DDT on testes and secondary sex characters of white leghorn cockerels. Proc Soc Exp Biol Med 74:48-51. Capes-Davis, A., G. Theodosopoulos, I. Atkin, H. G. Drexler, A. Kohara, R. A. MacLeod, J. R. Masters et al. 2010. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer 127:1-8. Cassidy, A. 2003. Potential risks and benefits of phytoestrogen-rich diets. Int J Vitam Nutr Res 73:120-126. Cornwell, T., W. Cohick, and I. Raskin. 2004. Dietary phytoestrogens and health. Phytochemistry 65:995-1016. Cui, C. W., S. L. Ji, and H. Y. Ren. 2006. Determination of steroid estrogens in wastewater treatment plant of a controceptives producing factory. Environ Monit Assess 121:409-419. Čechová, E. 2010. Identifikace a stanovení obsahu steroidů v environmentálních matricích. Bakalářská práce. MU. 63

D'Ascenzo, G., A. Di Corcia, A. Gentili, R. Mancini, R. Mastropasqua, M. Nazzari, and R. Samperi. 2003. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci Total Environ 302:199-209. De Wet, J. R., K. V. Wood, and M. DeLuca. 1987. Firefly luciferase gene: Structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology 7:725-737. Demirpence, E., M.-J. p. Duchesne, E. Badia, D. Gagne, and M. Pons. 1993. MVLN Cells: A bioluminescent MCF-7-derived cell line to study the modulation of estrogenic activity. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 46:355-364. Desbrow, C., E. J. Routledge, G. C. Brighty, J. P. Sumpter, and M. Waldock. 1998. Identification of estrogenic chemicals in STW effluent. 1. Chemical fractionation and in vitro biological screening. Environmental Science and Technology 32:1549-1558. Díaz-Cruz, M. S., M. J. López de Alda, R. López, and D. Barceló. 2003. Determination of estrogens and progestogens by mass spectrometric techniques (GC/MS, LC/MS and LC/MS/MS). Journal of Mass Spectrometry 38:917-923. Duffy, R., H. Wiseman, and S. E. File. 2003. Improved cognitive function in postmenopausal women after 12 weeks of consumption of a soya extract containing isoflavones. Pharmacology Biochemistry and Behavior 75:721-729. Freyberger, A., and G. Schmuck. 2005. Screening for estrogenicity and antiestrogenicity: a critical evaluation of an MVLN cell-based transactivation assay. Toxicology Letters 155:1-13. Fukata, H., H. Miyagawa, N. Yamazaki, and C. Mori. 2006. Comparison of Elisaand LC-MS-Based Methodologies for the Exposure Assessment of Bisphenol A. Toxicology Mechanisms and Methods 16:427-430. Greenlee, L. F., D. F. Lawler, B. D. Freeman, B. Marrot, and P. Moulin. 2009. Reverse osmosis desalination: water sources, technology, and today's challenges. Water Res 43:2317-2348. Guo, F., Q. Liu, G.-b. Qu, S.-j. Song, J.-t. Sun, J.-b. Shi, and G.-b. Jiang. 2013. Simultaneous determination of five estrogens and four androgens in water samples by online solid-phase extraction coupled with high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1281:9-18. Guo, J. M., B. X. Xiao, D. H. Liu, M. Grant, S. Zhang, Y. F. Lai, Y. B. Guo et al. 2004. Biphasic effect of daidzein on cell growth of human colon cancer cells. Food and Chemical Toxicology 42:1641-1646. Gutendorf, B., and J. Westendorf. 2001. Comparison of an array of in vitro assays for the assessment of the estrogenic potential of natural and synthetic estrogens, phytoestrogens and xenoestrogens. Toxicology 166:79-89. Hampl, F., and J. Paleček. 2002, Farmakochemie: ISBN 80-7080-495-5. Praha, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. 64

Hanselman, T. A., D. A. Graetz, and A. C. Wilkie. 2003. Manure-Borne Estrogens as Potential Environmental Contaminants: A Review. Environmental Science and Technology 37:5471-5478. Hansen, P. D. 1998. Vitellogenin - a biomarker for endocrine disruptors. Trends in analytical chemistry 17:7. Hatch, E. E., R. Troisi, L. A. Wise, L. Titus-Ernstoff, M. Hyer, J. R. Palmer, W. C. Strohsnitter et al. 2011. Preterm birth, fetal growth, and age at menarche among women exposed prenatally to diethylstilbestrol (DES). Reprod Toxicol 31:151-157. Henmi, M., Y. Fusaoka, H. Tomioka, and M. Kurihara. 2010. High performance RO membranes for desalination and wastewater reclamation and their operation results. Water Sci Technol 62:2134-2140. Hernando, M. D., M. Mezcua, M. J. Gomez, O. Malato, A. Aguera, and A. R. Fernandez-Alba. 2004. Comparative study of analytical methods involving gas chromatography-mass spectrometry after derivatization and gas chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of selected endocrine disrupting compounds in wastewaters. Journal of Chromatography A 1047:129-135. Hess, R. A., D. Bunick, and J. Bahr. 2001. Oestrogen, its receptors and function in the male reproductive tract - a review. Mol Cell Endocrinol 178:29-38. Hill, R. L., Jr., and D. M. Janz. 2003. Developmental estrogenic exposure in zebrafish (Danio rerio): I. Effects on sex ratio and breeding success. Aquat Toxicol 63:417429. Hilscherova, K., M. Machala, K. Kannan, A. L. Blankenship, and J. P. Giesy. 2000. Cell bioassays for detection of aryl hydrocarbon (AhR) and estrogen receptor (ER) mediated activity in environmental samples. Environ Sci Pollut Res Int 7:159-171. HMDB. 2005-2013. http://www.hmdb.ca/in, Dr. David Wishart - HMDB project PI. přístup: 26.3.2013 Holoubek, I., and L. Čadová. 2000. Environmentální Estrogeny. Klinická onkologie 13. Honzajková, Z., M. Kubal, M. Podhola, T. Patočka, M. Šír, and P. Kocurek. 2011. Membránové technologie a jejich použití při čištění podzemních vod a skládkových výluhů. . Chemické listy 105:245-250. Huang, Z. R., C. F. Hung, Y. K. Lin, and J. Y. Fang. 2008. In vitro and in vivo evaluation of topical delivery and potential dermal use of soy isoflavones genistein and daidzein. Int J Pharm 364:36-44. Hubner, P., and kol. 2006, Úprava vody pro průmyslové účely.: ISBN 80-7080-6249, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze.

65

Cha, M., H. Lee, J.-S. Kim, and E. Kim. 2012. Environmental assessment of estrogenic pollutants in Nam River of Korea using indirect competitive ELISA and E-screen assay. Toxicology and Environmental Health Sciences 4:262-268. Chrom, A. 2011. http://www.azetchrom.sk, přístup 2.5.2013. Ingerslev, F. H., N. Hansen, L. Hollesen, and J. Larsen. 2003. Evaluation of Analytical Chemical Methods for Detection of Estrogens in the Environment. The Environmental Protection Agency 44:1-69. Into, M., A.-S. Jansson, and G. r. Lengden. 2004. Reuse of industrial wastewater following treatment with reverse osmosis. Journal of Membrane Science 242:21-25. Jardim, W. F., C. C. Montagner, I. C. Pescara, G. A. Umbuzeiro, A. M. Di Dea Bergamasco, M. L. Eldridge, and F. F. Sodré. 2012. An integrated approach to evaluate emerging contaminants in drinking water. Separation and Purification Technology 84:3-8. Jelínek, L., and kol. 2009. Desalinační a separační metody v úpravě vody. ISBN 97890-7080-705-7 VŠCHT Praha. Jia, T.-L., H.-Z. Wang, L.-P. Xie, X.-Y. Wang, and R.-Q. Zhang. 2003. Daidzein enhances osteoblast growth that may be mediated by increased bone morphogenetic protein (BMP) production. Biochemical Pharmacology 65:709-715. Jobling, S., R. Williams, A. Johnson, A. Taylor, M. Gross-Sorokin, M. Nolan, C. R. Tyler et al. 2006. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. Rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environmental Health Perspectives 114:32-39. Joyeux, A., P. Balaguer, P. Germain, A. M. Boussioux, M. Pons, and J. C. Nicolas. 1997. Engineered cell lines as a tool for monitoring biological activity of hormone analogs. Anal Biochem 249:119-130. Kelce, W. R., and E. M. Wilson. 1997. Environmental antiandrogens: developmental effects, molecular mechanisms, and clinical implications. J Mol Med (Berl) 75:198-207. Kelly, P. M., and W. Fuquay. 2011. Milk Protein Products | Membrane-Based Fractionation, Pages 864-872 Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition). San Diego, Academic Press. Kidd, K. A., P. J. Blanchfield, K. H. Mills, V. P. Palace, R. E. Evans, J. M. Lazorchak, and R. W. Flick. 2007. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc Natl Acad Sci U S A 104:8897-8901. Kimura, K., S. Toshima, G. Amy, and Y. Watanabe. 2004. Rejection of neutral endocrine disrupting compounds (EDCs) and pharmaceutical active compounds (PhACs) by RO membranes. Journal of Membrane Science 245:71-78. Kinnberg, K. 2003. Evaluation of in vitro assays for determination of estrogenic activity in the environment. Danish Environmental Protection Agency Working Report 43. 66

Kiso, Y., Y. Nishimura, T. Kitao, and K. Nishimura. 2000. Rejection properties of non-phenylic pesticides with nanofiltration membranes. Journal of Membrane Science 171:229-237. Korner, W., U. Bolz, W. Submuth, G. Hiller, W. Schuller, V. Hanf, and H. Hagenmaier. 2000. Input/output balance of estrogenic active compounds in a major municipal sewage plant in Germany. Chemosphere 40:1131-1142. Korner, W., P. Spengler, U. Bolz, W. Schuller, V. Hanf, and J. W. Metzger. 2001. Substances with estrogenic activity in effluents of sewage treatment plants in southwestern Germany. 2. Biological analysis. Environ Toxicol Chem 20:2142-2151. Kozlík, P., Z. Bosáková, E. Tesařová, P. Coufal, and R. Čabala. 2011. Development of a solid-phase extraction with capillary liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of estrogens in environmental water samples. Journal of Chromatography A 1218:2127-2132. Krishnan, A. V., P. Stathis, S. F. Permuth, L. Tokes, and D. Feldman. 1993. Bisphenol-A: an estrogenic substance is released from polycarbonate flasks during autoclaving. Endocrinology 132:2279-2286. Laganá , A., A. Bacaloni, I. De Leva, A. Faberi, G. Fago, and A. Marino. 2004. Analytical methodologies for determining the occurrence of endocrine disrupting chemicals in sewage treatment plants and natural waters. Analytica Chimica Acta 501:79-88. Lambda. 2013. http://www.lambda.sk/pdf/metodiky/SPE.pdf, Laboratorní návod, přístup 26.4.2013. Lee, W., C. H. Ahn, S. Hong, S. Kim, S. Lee, Y. Baek, and J. Yoon. 2010. Evaluation of surface properties of reverse osmosis membranes on the initial biofouling stages under no filtration condition. Journal of Membrane Science 351:112-122. Legler, J., C. E. van den Brink, A. Brouwer, A. J. Murk, P. T. van der Saag, A. D. Vethaak, and B. van der Burg. 1999. Development of a stably transfected estrogen receptormediated luciferase reporter gene assay in the human T47D breast cancer cell line. Toxicol Sci 48:55-66. Lewis, K. M., and R. D. Archer. 1979. pKa values of estrone, 17 beta-estradiol and 2-methoxyestrone. Steroids 34:485-499. Li, X.-M., F.-N. Luo, G.-X. Liu, and P.-T. Zhu. 2008. Bioassay of Estrogenic Activity of Effluent and Influent in a Farm Wastewater Treatment Plant Using an in vitro Recombinant Assay with Yeast Cells. Biomedical and Environmental Sciences 21:381-388. Liehr, J. G. 1990. Genotoxic effects of estrogens. Mutat Res 238:269-276. Lintelmann, J., A. Katayama, N. Kurihara, L. Shore, and A. Wenzel. 2003. Endocrine disruptors in the environment: (IUPAC technical report). Pure and Applied Chemistry 75:631-681.

67

Liu, H., C. Zhang, and W. Zeng. 2006. Estrogenic and antioxidant effects of a phytoestrogen daidzein on ovarian germ cells in embryonic chickens. Domestic Animal Endocrinology 31:258-268. Liu, Z. H., Y. Kanjo, and S. Mizutani. 2010. A review of phytoestrogens: their occurrence and fate in the environment. Water Res 44:567-577. Membranes, A. 2013. http://www.appliedmembranes.com/residential_tapwater.htm, přístup 26.4.2013. Mikulášek, P. 1995. Aplikace tlakových membránových procesů při zpracování odpadních vod. EKO-Ekologie a společnost 6:26;29. Murk, A. J., J. Legler, M. M. van Lipzig, J. H. Meerman, A. C. Belfroid, A. Spenkelink, B. van der Burg et al. 2002. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ Toxicol Chem 21:16-23. NEIHS. 2002. Current Status of Test Methods for Detecting Endocrine Disruptors: In vitro Estrogen Receptor Transcriptional Activation Assay. National Institute of Environmental Health Sciences, the National Toxicology Program Interagency Center for the Evalution of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). OECD. 2009, Test No. 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals, OECD Publishing. Ozaki, H., and H. Li. 2002. Rejection of organic compounds by ultra-low pressure reverse osmosis membrane. Water Research 36:123-130. PAA. 2013. www.paa.com, DMEM, high Glucose (4,5g/L), PAA Laboratories GmbH přístup:11.4.2013. Paolo, L., P. Deborah, G. F. Natale, and N. e. Oscar. 2012, Current Trends in Sample Treatment Techniques for Environmental and Food Analysis: Chromatography - The Most Versatile Method of Chemical Analysis. Park, P. K., S. Lee, J. S. Cho, and J. H. Kim. 2012. Full-scale simulation of seawater reverse osmosis desalination processes for boron removal: Effect of membrane fouling. Water Res 46:3796-3804. Pawlak, Z., S. Żak, and L. Zabłocki. 2006. Removal of hazardous metals from groundwater by Reverse Osmosis. Polish J. of Environ. Stud 15:579-583. Pepper, D., A. C. J. Orchard, and A. J. Merry. 1985. Concentration of tomato juice and other fruit juices by reverse osmosis. Desalination 53:157-166. Pilsakova, L., I. Riecansky, and F. Jagla. 2010. The physiological actions of isoflavone phytoestrogens. Physiol Res 59:651-664. Pohlová, I., and M. Šafaříková. 1998. Membránové procesy. EKODISK VTEI 09. 68

Polkowski, K., and A. P. Mazurek. 2000. Biological properties of genistein. A review of in vitro and in vivo data. Acta Pol Pharm 57:135-155. Pons, M., D. Gagne, J. C. Nicolas, and M. Mehtali. 1990. A new cellular model of response to estrogens: A bioluminescent test to characterize (anti) estrogen molecules. BioTechniques 9:450-459. Racz, L., and R. K. Goel. 2010. Fate and removal of estrogens in municipal wastewater. Journal of Environmental Monitoring 12:58-70. Rahbari, R., T. Sheahan, V. Modes, P. Collier, C. Macfarlane, and R. M. Badge. 2009. A novel L1 retrotransposon marker for HeLa cell line identification. Biotechniques 46:277-284. Rokyta, R. 2000. Estrogeny, paměť, bolest a ochrana neuronů. Vesmír 79:670-671. Shareef, A., M. J. Angove, J. D. Wells, and B. B. Johnson. 2006. Aqueous Solubilities of Estrone, 17B-Estradiol, 17A-Ethynylestradiol, and Bisphenol A. J Chem Eng Data 51:879-881. Scherer, W. F., J. T. Syverton, and G. O. Gey. 1953. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. J Exp Med 97:695-710. Schneider, R. P., L. M. Ferreira, P. Binder, and J. R. Ramos. 2005. Analysis of foulant layer in all elements of an RO train. Journal of Membrane Science 261:152-162. Soto, A. M., C. Sonnenschein, K. L. Chung, M. F. Fernandez, N. Olea, and F. O. Serrano. 1995. The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens: an update on estrogenic environmental pollutants. Environ Health Perspect 103 Suppl 7:113-122. Stroben, E., J. Oehlmann, and P. Fioroni. 1992. The morphological expression of imposex in Hinia reticulata (Gastropoda: Buccinidae): a potential indicator of tributultin pollution. Marine Biology 113:625-636. Suárez, E., F. San Martín, R. Alvarez, and J. Coca. 1992. Reverse osmosis of whey. Determination of mass transfer coefficients. Journal of Membrane Science 68:301-305. Sumpter, J. P., and A. C. Johnson. 2005. Lessons from endocrine disruption and their application to other issues concerning trace organics in the aquatic environment. Environmental Science and Technology 39:4321-4332. Thomas, K. V., J. Balaam, M. R. Hurst, and J. E. Thain. 2004. Identification of in vitro estrogen and androgen receptor agonists in North Sea offshore produced water discharges. Environ Toxicol Chem 23:1156-1163. Trenholm, R. A., B. J. Vanderford, J. C. Holady, D. J. Rexing, and S. A. Snyder. 2006. Broad range analysis of endocrine disruptors and pharmaceuticals using gas chromatography and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chemosphere 65:1990-1998. 69

Tuček, J. 2009. http://www.filtracevody.cz/store/, přístup 2.5.2013. Vega-Morales, T., Z. Sosa-Ferrera, and J. J. Santana-Rodriguez. 2010. Determination of alkylphenol polyethoxylates, bisphenol-A, 17alpha-ethynylestradiol and 17beta-estradiol and its metabolites in sewage samples by SPE and LC/MS/MS. J Hazard Mater 183:701-711. Villeneuve, D. L., J. S. Khim, K. Kannan, and J. P. Giesy. 2002. Relative potencies of individual polycyclic aromatic hydrocarbons to induce dioxinlike and estrogenic responses in three cell lines. Environ Toxicol 17:128-137. Vyhňáková, M. 2011. Bakalářská práce - Estrogenní látky přírodního původu. MU Wagner, J. 2001. Membrane Filtration Handbook. Practical Tips and Hints Second Edition:1-127. Watanabe, S., S. Uesugi, and Y. Kikuchi. 2002. Isoflavones for prevention of cancer, cardiovascular diseases, gynecological problems and possible immune potentiation. Biomedicine & Pharmacotherapy 56:302-312. Ying, G. G., R. S. Kookana, and A. Kumar. 2008. Fate of estrogens and xenoestrogens in four sewage treatment plants with different technologies. Environ Toxicol Chem 27:87-94. Ying, G. G., R. S. Kookana, and Y. J. Ru. 2002. Occurrence and fate of hormone steroids in the environment. Environment International 28:545-551. Zheng, W., S. R. Yates, and S. A. Bradford. 2008. Analysis of steroid hormones in a typical dairy waste disposal system. Environmental Science and Technology 42:530-535. Zou, E., D. B. Editors-in-Chief Michael, and M. Janice. 2010. Aquatic Invertebrate Endocrine Disruption, Pages 112-123 Encyclopedia of Animal Behavior. Oxford, Academic Press.

70

7. PŘÍLOHY Příloha č: 1 Obr. č: 18 je zobrazena výtěžnost metody SPE při zakoncentrování vodných roztoků pro měření estrogenního potenciálu pomocí in vitro testu s buněčnou kulturou HeLa 9903 ze třech nezávislých opakování.

*

*

*

*

*

*

Obr. č: 18 Kategorický graf znázorňující sloupce vyjadřující estrogenní aktivitu estradiolu jednotlivých vodných vzorků, získaných metodou SPE, byla měřena pomocí buněčné linie Hela9903. Negativní kontrola znázorňuje vodný vzorek bez E2 (dH2O) zakoncentrovaný SPE metodou. Označní sloupce roz.kon. znárorňuje rozpouštědlovou kontrolu vodného vzorku (dH2O) před zakoncentrováním. Roztok E2 znázorňuje odběr vodného vzorku s přidaným E2 před zakoncentrováním. SPE extrakt znázorňuje výtěžnost E2 metody SPE. Sloupce představují průměr z triplikátů. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku. * označuje hodnoty odlišné od nuly na hladině významnosti p < 0,05.

71