Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers

Woord vooraf Dit eindwerk werd mede mogelijk gemaakt door de hulp van een aantal personen. Mijn dank gaat hierbij uit naar AZ Groenininge die mij de kans gegeven hebben om mijn stage te realiseren. In het bijzonder zou ik Dr. Frank Martens en Apr. Sarah Cooreman, assistent klinisch bioloog willen bedanken, voor de begeleiding gedurende mijn onderzoek. Verder wil ik ook de laboranten bedanken die altijd voor me klaar stonden om me te helpen bij al mijn problemen en voor de goede sfeer en steun. Ook wil ik meneer Piet Dedeckere bedanken voor de steun, de hulp en voor het geven van wijze raad en het nalezen van dit eindwerk. Vervolgens wil ik ook mijn ouders en mijn vriend bedanken voor de steun die ze mij tijdens mijn stageperiode hebben gegeven, en aan alle personen die ik eventueel over het hoofd heb gezien.

Melissa Billiau

1


Samenvatting Het doel van dit eindwerk is het bepalen van de invloed van toevoegstofffen op de creatininebepaling. Als toevoegstoffen wordt gebruik gemaakt van gluteraldehyde (GA), natriumnitriet (NaNO2) , pyridinium chlorochromaat (PCC), jodium oplossing (lugol), natriumhypochloriet (chloorwater), uropyrine® en ascorbinezuur (vitamine C). Daartoe werd gebruik gemaakt van de Integra 400 voor de bepaling van creatinine volgens de Jaffemethode en de enzymatische methode. Er werd telkens een vergelijking gemaakt tussen de twee methoden na bijmenging van een bepaalde toevoegstof, en een vergelijking gemaakt tussen de zuivere urine en toevoegstof binnen dezelfde gebruikte methode. Uit het experimenteel gedeelte worden er volgende besluiten genomen: De LOQ van de Jaffemethode bedraagt 0,020 g/L en die van de enzymatische methode 0,009 g/L. De enzymatische methode meet 14% hoger dan de Jaffemethode, en wordt bij voorkeur aangewend bij sterk verdunde creatinineconcentraties. Aan de hand van de GC-MS resultaten kon worden aangetoond dat de concentraties aan toevoegstoffen, vermeld in de literatuurstudie, effectief werkzaam zijn. In die concentraties werden de vervalste urines geanalyseerd voor creatinine bij verschillende concentratieniveau’s ( 4 g/L, 1 g/L en 0,20 g/L) door middel van de Jaffemethode en de enzymatische methode. De stoffen die een beduidend negatief effect hebben (>5%) op de creatininebepaling met de Jaffemethode zijn: PCC, jodium, chloorwater, uropyrine (100 mg/L) en ascorbinezuur. De stoffen die een negatief effect hebben (>5%) op de creatininebepaling met de enzymatische methode zijn: PCC, jodium, chloorwater, uropyrine (10 en 100 mg/L) en ascorbinezuur.

Melissa Billiau

2


Het onderzoek leverde wisselende resultaten op met gluteraldehyde en het is aangeraden de experimenten hiermee verder te verfijnen. Er kan ook eventueel verder onderzocht worden naar de werking van toevoegstoffen in een concentratie die niet visueel zichtbaar zijn en het terug vinden van de verschillende toevoegstoffen in urine.

Melissa Billiau

3


Lijst met afkortingen en symbolen ATP:

adenosinetrifosfaat

BE:

Benzodiazepines

BSTFA:

bis-(Trimethylsilyl) trifluoroacetamide

cTHC:

carboxyl- tetrahydrocannabinol

GA:

gluteraldehyde

GC-MS:

gaschromatografie-massaspectrometrie

HTIB:

2,4,6-triiodo-3-hydroxybenzoëzuur.

HPLC-DAD: High performance liquid chromatography – diode array detector ISE:

ion selectieve elektrode

KIMS:

Kinetic Interaction of Microparicles in a Solution

LOQ:

Limit of quantitation

MDA:

methylenedioxyamphetamine

MDEA:

methylenedioxy-N-ethylamphetamine

MDMA:

Methylenedioxymethamphetamine

MSTFA:

N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

NaNO2:

natriumnitriet

PCC:

Pyridinium chlorochromaat

THC:

tetrahydrocannabinol

cTHC:

11 nor, Δ9-THC-carboxylzuur, een metaboliet van THC

TAPS:

N-tri-(hydroxymethyl)-methyl-3-aminopropanesulfonic zuur

TVS:

toevoegstof

Ucr:

Creatinine bepaling in urine.

Z:

zuivere urine Melissa Billiau

4


Verklarende woordenlijst Duplobepaling:

het 2 x uitvoeren van de test in de zelfde run op het zelfde

staal. Derivatisatie:

het chemische wijzigen van de stof om detectie mogelijk te maken.

Silyleren:

het toevoegen van een trimethyl silylgroep aan een molecule met hydroxylfunctie of amino-functie.

Melissa Billiau

5


Lijst met figuren Figuur 2.1: structuurformule creatinine ...................................................................................... 12 Figuur 2.2: principe recovery experiment .................................................................................. 13 Figuur 2.3: structuurformule gluteraldehyde .............................................................................. 14 Figuur 2.4: test strip Intect 7 ...................................................................................................... 15 Figuur 2.5: structuurformule pyridinium chlorochromaat ........................................................... 16 Figuur 2.6: structuurformule phenazopyrdine ............................................................................ 19 Figuur 2.7: structuurformule ascorbinezuur ............................................................................... 20 Figuur 3.1: Integra 400 .............................................................................................................. 21 Figuur 3.2: onderdelen Integra 400 ........................................................................................... 23 Figuur 3.3: gaschromatograaf-massaspectrometer ................................................................... 29

Melissa Billiau

6


Lijst met tabellen Tabel 4.1: % afwijking van de initiële drugconcentraties door toevoegstoffen met KIMS en GC-MS ..................................................................................................................................... 35 Tabel 4.2: effect van toevoegstof op resultaat Jaffemethode beoordeeld op p<0,0001 ............ 36 Tabel 4.3: effect van toevoegstof op resultaat enzymatsiche methode beoordeeld op p<0,0001 .................................................................................................................................... 37

Melissa Billiau

7


Inhoudsopgave Woord vooraf ..................................................................................................................... 1 Samenvatting ..................................................................................................................... 2 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 4 Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 5 Lijst met figuren ................................................................................................................. 6 Lijst met tabellen ............................................................................................................... 7 Inhoudsopgave .................................................................................................................. 8 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................. 10

2

Literatuurstudie ................................................................................................. 12

2.1

Creatinine ............................................................................................................ 12

2.2

Proefopstelling .................................................................................................... 13

2.3

De gebruikte toevoegstoffen ................................................................................ 14

2.3.1

Gluteraldehyde (GA) ........................................................................................... 14

2.3.2

Natriumnitriet (NaNO2) ......................................................................................... 15

2.3.3

Pyridinium chlorochromaat (PCC) ...................................................................... 16

2.3.4

Jodiumoplossing (lugol oplossing) ....................................................................... 17

2.3.5

Natriumhypochloriet (chloorwater) ...................................................................... 18

2.3.6

Uropyrine ® .......................................................................................................... 19

2.3.7

Ascorbinezuur (Vitamine C) ................................................................................. 20

3

Materialen en methoden .................................................................................... 21

3.1

Materiaal nodig voor de creatinine bepaling ........................................................ 21

3.1.1

Integra 400........................................................................................................... 21

3.2

Bereiding van toevoegstoffen om drugs in urine te maskeren ............................. 25

3.2.1

Creatinine ............................................................................................................ 25

3.2.2

Glutaraldehyde oplossing .................................................................................... 26

3.2.3

Natriumnitriet oplossing ....................................................................................... 26

3.2.4

Pyridinium chlorochromaat oplossing .................................................................. 26

3.2.5

Jodium oplossing ................................................................................................. 26

3.2.6

Natriumhypochloriet oplossing ............................................................................. 27

Melissa Billiau

8


3.2.7

Uropyrine ® oplossing ......................................................................................... 27

3.2.8

Ascorbinezuur ( Vitamine C ) ............................................................................... 27

3.2.9

Liquicheck TM........................................................................................................ 28

3.3

Materiaal nodig voor de drugbepaling op de controle urine ................................. 29

3.3.1

Gaschromatograaf-massaspectrometer (GC-MS) ............................................... 29

3.4

Bewerkingen als voorbereiding van de drugdetectie .......................................... 29

3.4.1

Voorbehandeling voor de analyse van THC-carboxylzuur. ................................. 29

3.4.2

Voorbehandeling voor de analyse van amfetamine ............................................. 30

3.4.3

Voorbehandeling voor de analyse van opiaten. ................................................... 31

4

Resultaten .......................................................................................................... 33

4.1

Bepaling van limit of quantification (LOQ) ........................................................... 33

4.2

Invloed van de toevoegstoffen op de detectie van drugs in urine ........................ 34

4.3

Meten van de invloed van de toevoegstoffen op de creatininebepaling .............. 36

5

Conclusie ............................................................................................................ 38

Literatuurlijst .................................................................................................................... 40 Bijlagen ............................................................................................................................. 43 Bijlage 1 – Massaspectrum van opiaten van de standaardurine, massaspectrum opiaten na toevoeging van PCC ..................................................................................................... 43 Bijlage 2 – Resultaten gepaarde T-test en Box en Whisker plots voor het niveau van 3-4 g/L ...................................................................................................................................... 45 Bijlage 3 – Resultaten van gepaarde T-test en Box en Whisker plots voor het niveau van 1g/L .................................................................................................................................... 54 Bijlage 4 – Resultaten van de gepaarde T-test en Box en Whisker plots van het niveau 0.20 g/L. ............................................................................................................................. 63 Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 72

Melissa Billiau

9

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepaling in urine van druggebruikers

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Eén van de belangrijkste analysen voor het achterhalen van urinevervalsing bij druggebruikers is de creatininebepaling op urine. Deze analyse laat toe de exogene of endogene bijmenging van water aan te tonen. Urine kan worden uitverdund door overmatig drinken van water waardoor de creatinine daalt tot beneden zijn onderste fysiologische referentiewaarde (0,18 g/L). In andere gevallen wordt water extern toegevoegd wat aanleiding geeft tot onmeetbare creatininewaarden en waarbij in sommige gevallen het onduidelijk is of het wel om urine gaat. Urinevervalsing beperkt zich niet alleen tot het uitverdunnen met water. Ook worden stoffen toegevoegd, die ofwel door hun hoog reactief of oxiderend vermogen niet alleen de detectie van de aanwezige drugs verstoren, maar ook de creatininebepaling op zich kunnen beïnvloeden. Dit kan onder andere door vernietiging van de samenstellende componenten van de enzymatische creatininebepaling. Vermits in eerste instantie de aangekomen urines zintuigelijk worden beoordeeld, moeten de toevoegstoffen in die mate worden opgelost in de urine dat dit niet onmiddellijk door inspectie kan opgemerkt worden. Maar toch moeten zij in voldoende mate worden toegevoegd om de druganalysen te verstoren.

Daarom werd het onderzoek als volgt opgevat: Melissa Billiau

10

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepaling in urine van druggebruikers

1. Evaluatie van de Jaffe en de enzymatische bepaling van creatinine in urine. Aantonen van verschilpunten tussen beide testen. Bepaling van de onderste kwantificatiegrens (LOQ). 2. Aanmaak van controle urine door samenvoeging van verschillende urinestalen van gekende niet-druggebruikers (laboranten). Hieraan worden er stoffen toegevoegd zoals aangegeven in de literatuur en op basis van hun minimale efficiënte werking. 3. Na de simulatie van het normale transport en de bewaartijd van urine na collectie, worden de toegevoegde drugs opgespoord door middel van een immunoassay en GC-MS. Zo kan het effect van de toegevoegde stoffen op de drugconcentraties worden vastgesteld. 4. Bereiden van een reeks urine’s met oplopende creatininewaarden waarin de verschillende soorten toevoegstoffen worden opgelost. Het effect van de toevoegstof op de creatininebepaling wordt gemeten.

Melissa Billiau

11

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Literatuurstudie

2

Literatuurstudie

In de literatuurstudie wordt creatinine kort besproken tesamen met het principe van de proefopstelling dat wordt toegepast tijdens het experimenteel gedeelte. Vervolgens wordt er dieper ingegaan op de verschillende toevoegstoffen, hun mechanisme van verstoring van de verschillende drugtesten en de manier waarop deze stoffen kunnen aangetoond worden. 2.1

Creatinine (11)

Creatinine (figuur 2.1) is een afbraakproduct van creatinefosfaat en creatine. Creatine wordt gesynthetiseerd in de nieren, lever en pancreas uit de aminozuren arginine en glycine. Na transport via bloed naar andere organen, zoals de spieren wordt creatine gefosforyleerd tot de energierijke verbinding creatinefosfaat. De spontane omzetting van creatinefosfaat naar creatinine gebeurt voornamelijk tijdens de spiercontractie.

Figuur 2.1: structuurformule creatinine

De hoeveelheid creatinine (C4H9N3O2) in het lichaam wordt in belangrijke mate bepaald door de spiermassa. Dit betekent dat de dagelijkse geproduceerde hoeveelheid vrij constant is (in hetzelfde individu). Hierdoor varieert de creatinineconcentratie binnen een smalle marge. Schommeling wordt teweeg gebracht door dieët en vleesconsumptie. De creatinineconcentratie kan worden bepaald in serum,plasma en urine.

Melissa Billiau

12


Creatinine wordt uitgescheiden via de nieren na glomerulaire filtratie en een beperkte tubulaire secretie. De concentratie in het bloed kan dus in eerste instantie stijgen door het slecht functioneren van de nieren. De creatinineconcentratie in de urine wordt uitgedrukt in g/L en kan worden bepaald volgens de: • Jaffemethode • enzymatische methode 2.2

Proefopstelling (5)

De proefopstelling dat van toepassing is in het experimenteel gedeelte steunt op recovery experimenten. Recovery testen worden klassiek gebruikt bij een validatie. Het principe wordt in figuur 2.2 weergegeven.

Figuur 2.2: principe recovery experiment

Het principe van revovery gaat als volgt in zijn werk. De recoverybepaling gebeurt ten opzichte van een staal dat enkel zuivere urine bevat, en waaraan enkel water is toegevoegd. Om de invloed van de toevoegstoffen te meten wordt er op identiek dezelfde wijze gewerkt maar wordt er een oplossing van de toevoegstof toegevoegd. De Recovery wordt berekend met volgende formule: [ (Ucr(TVS)-Ucr(Z)) / Ucr(Z)) ] * 100

Melissa Billiau

13


2.3

De gebruikte toevoegstoffen

2.3.1

Gluteraldehyde (GA) (6)

“Urinaid” is een product dat kan aangeschaft worden via het internet en dat als actief component GA bevat. GA (C5H8O2) is een dialdehyde (figuur 2.3).

Figuur 2.3: structuurformule glyteraldehyde

2.3.1.1 Werkingsprincipe (10) GA denatureert proteinen en zodoende ook de antistoffen van toepassing in de immunoassay. Wanneer GA wordt toegevoegd aan de urine in een concentratie tussen de 0,75% en de 2,00%, dan kan dit leiden tot het toenemen van het aantal vals-negatieve resultaten in de druganalyse. 2.3.1.2 Opsporing van de GA (7) GA kan onder andere worden opgespoord met fluorescentie test: Gedurdende één uur wordt 0,5 mL urine verwarmd (96 – 98°C) met 1 mL fosfaatbuffer (pH 3 ; 7,5 mmol/L), verzadigd met thiobarbituraat. Na afkoeling wordt er 5 mL n-butanol toegevoegd. Wanneer GA aanwezig is verschijnt een groene fluorescentie in de organische fase.

Melissa Billiau

14

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Literatuurstudie 2.3.2

Natriumnitriet (NaNO2)

2.3.2.1 Werkingsprincipe (10) In de literatuur vinden we dat NaNO2 aangewend wordt in een concentratie van 50 mmol/L en dat het geen effect heeft op de immunoassay testen. NaNO2 oxideert cTHC, zodat het niet meer kan aangetoond worden met de GC-MS. 2.3.2.2 Opsporing van NaNO2 (13) Het opsporen van NaNO2 kan gebeuren aan de hand van een test strip. Intect 7 is een test strip die creatinine, nitriet, gluteraldehyde, pH , dichtheid, chloorwater en PCC kan aantonen. Wanneer NaNO2 aanwezig is verschijnt er een paarse kleur.

Figuur 2.4: test strip Intect 7

Nitriet kan ook worden aangetoond door de in situ aanmaak van een gekleurde diazoniumverbinding (met o.a. anilineanaloog en naftol).

Melissa Billiau

15


Pyridinium chlorochromaat (PCC) (1,2)

Pyridinium chlorochromaat (C5H5NHClCrO3) is het actief bestanddeel dat aanwezig is in “Urine Luck”. Dit is een commercieel verkrijgbaar product dat zijn toepassing kent als een krachting oxidans in de synthetische organische scheikunde en ook gesignaleerd wordt bij urinevervalsing.

Figuur 2.5: structuurformule pyridinium chlorochromaat

2.3.3.1 Werkingsprincipe (10) In de literatuurstudie worden de effecten van PCC in concentraties van 50 g/L en 100 g/L beschreven. PCC heeft voornamelijk een invloed op cTHC. PCC zal deze molecule oxideren en het massaspectrum wijzigen. Ook op de immunoassay heeft PCC een invloed. 2.3.3.2 Opsporing van PCC PCC kan worden aangetoond door de typische pyridinegeur na alkaliniseren. Het vrijgestelde pyridine kan ook opgespoord worden via head space GC-MS. Een andere methode om PCC te detecteren in urine is mogelijk via het aantonen van CrVI met behulp van 10 g/L 1,5 difenylcarbazone in methanol. Aan 1 mL urine worden twee druppels van deze indicator toegevoegd. In aanwezigheid van PCC verschijnt een paarse kleur.

Melissa Billiau

16


Jodiumoplossing (lugol oplossing)

Lugol is een jood-kaliumjodide oplossing die in de kwalitatieve analyse wordt gebruikt voor het aantonen van zetmeel. Wanneer jodium aan een zetmeeloplossing wordt toegevoegd dan treedt er een blauwe kleur op. 2.3.4.1 Werkingsprincipe (10) Jodium heeft een oxiderende werking op drugs in urine. De oxidatie verloopt wel vlotter bij lage pH. Jodium heeft slechts een matig effect op de immunoassay. Het effect is beduidend op morfine en op cTHC bij de GC-MS analyse. 2.3.4.2 Opsporing van jodium (8) Jodium kan aangetoond worden door spectrofotometrische detectie via de reactie met 2,2’–azino-bis(3-ethylbenzohizaoline-6-sulfonzuur) (ABTS). Twee mL ABTS oplossing wordt samen met 50 µL HCl (0,3 mol/L) toegevoegd aan het staal. Wanneer lugol aanwezig is wordt een groene kleur waargenomen. De absorbantie wordt gemeten bij 415 nm. Wanneer, na bewaring van de urine, het jodium volledig omgezet is naar jodide, dan kan door toevoeging van chloor, jodium worden gegenereerd en als dusdanig worden aangetoond. Hierbij wordt de zetmeelmethode verkozen.

Melissa Billiau

17


Natriumhypochloriet (chloorwater) (12)

Natriumhypochloriet (NaOCl) is een oxidans. Bleekwater bevat ongeveer 5% NaOCl, ook wel javel genoemd. Het wordt gevormd door de reactie van chloorgas met NaOH. 2 NaOH + Cl2 → NaCl + NaOCl + H2O NaOCl wordt vooral gebruikt om af te bleken, te reiningen en te ontsmetten, maar kan ook aangewend worden als vervalsingsproduct bij drugonderzoek. 2.3.5.1 Werkingsprincipe 10 Net zoals jodium heeft chloorwater een oxiderende werking. Het heeft een matig tot geen aantoonbaar effect op de immunoassay. Maar door chloorwater worden de drugmoleculen geoxideerd, waardoor zij ontsnappen aan de detectie met de GC-MS. Chloorwater is het meest efficiënt op morfine en cTHC. 2.3.5.2 Opsporing van natriumhypochloriet Chloorwater kan onder andere worden opgespoord met Intect 7 (figuur 2.4). Wanneer chloorwater aanwezig is kleurt de testzone blauw. Bij afwezigheid blijft de testzone wit. Bij aanzuren ontstaat Cl2 –gas (typische geur).

Melissa Billiau

18


Uropyrine ® (14)

Phenazopyridine is de generische naam van een geneesmiddel dat afgeleverd wordt als Uropyrine® . Phenazopyridine wordt voorgeschreven bij behandeling van urineweginfecties. De interferentie is te verwachten van het phenazopyridine en zijn metabolieten na perorale inname. Vandaar ook de geringere concentraties in de urine (zie verder). Kenmerkend is de oranje urine.

Figuur 2.6: structuurformule phenazopyridine

2.3.6.1 Werkingsprincipe (10) Uropyrine heeft geen invloed op de immunoassay testen, maar wel wordt gezegd dat het een invloed kan hebben bij de bepaling van drugs bij analyse met GC-MS. 2.3.6.2 Opsporing van uropyrine In het laboratorium wordt phenazopyridine opgespoord met HPLC-DAD.

Melissa Billiau

19


Ascorbinezuur (Vitamine C)

Ascorbinezuur of vitamine C (C6H8O6) is een wateroplosbaar vitamine met reducerende werking.

Figuur 2.7: structuurformule ascorbinezuur

2.3.7.1 Werkingsprincipe Over het specifieke werkingsprincipe van vitamine C op drugs in urine of hun bepalingsmthoden wordt in de literatuur weinig verteld, misschien ook om dat het niet expliciet wordt aangehaald als toevoegstof. Maar aangezien vitamine C een reducerende werking heeft kan worden verwacht dat het een mogelijke invloed heeft op de immuoassay. Wat uit het experimenteel onderzoek is waargenomen kan worden teruggevonden in hoofdstuk resultaten ( H4 ). 2.3.7.2 Opsporing van de vervalsende stof Er bestaan verschillende kleurstesten om vitamine C op te sporen: o Nessler reagens: zwarte kleur o Benedicts reagens: rode kleur o Palladium chloride: zwarte kleur Ook detectie met LC-MS is mogelijk.

Melissa Billiau

20

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Materialen en methoden

3

Materialen en methoden

In dit hoofdstuk wordt de werking van het gebruikte toestel en de gebruikte materialen besproken. Er wordt een overzicht gegeven van de bereiding van de verschillende toevoegstoffen.

3.1 Materiaal nodig voor de creatinine bepaling 3.1.1 Integra 400

Integra 400 is een chemie analyzer op de markt gebracht door ROCHE (figuur:3.1). In de afdeling toxicologie wordt het toestel in de eerste plaats gebruikt voor screening. Er wordt een screening gedaan wanneer er vermoedens zijn van druggebruik. Wanneer een positief screeningresultaat wordt genoteerd dan komt het staal in aanmerking voor GC-MS analyse ter confirmatie.

Figuur 3.1: Integra 400

Melissa Billiau

21


Het toestel heeft vier verschillende meettechnieken: • Fluroscentiepolarisatie (FP) • Poteniometrie (ISE) - indirect - direct • Fotometrie • Turbidimetrie De bepaling van creatinine volgens de Jaffemethode en enzymatische methode gebeurt door meting van een fotometrische bepaling.

Melissa Billiau

22


3.1.1.1 Beschrijving van het toestel De onderdelen van de Integra 400 worden in de onderstaande figuur 3.2 weergegeven. Het omvat een pipetteermodule (1). De reagentia worden geplaatst op de daarvoor voorziene gekoelde zone (2) (3). Naast de gekoelde zone zijn er plaatsen voorzien om de stalen te plaatsen (4). De voorraad cuvetten vindt men in cuvettenreservoir (7), en de gebruikte cuvetten komen terecht in een voorzien reservoir (5). De barcode lezer (6) leest de barcode op de rekken en op de stalen. Na toevoegingen van de reagentia wordt de concentratie gemeten via de fotometer (8).

Figuur 3.2: onderdelen Integra 400

Melissa Billiau

23


3.1.1.2 Creatinine bepaling met de Jaffemethode (3) o Principe van de test: In alkalische oplossing reageert creatinine met picrinezuur en vormt een geel-rood complex. Creatinine + picrinezuur → geel – rood complex De kleurintensiteit van het gevormde complex wordt gemeten bij 512 nm en is rechtevenredig met de concentratie aan creatinine in het staal. o Aanwezige bestandelen volgens bijsluiter - Kaliumhydroxide - Fosfaat - Picrinezuur 3.1.1.3 Bepaling met de enzymatische methode (4) o Principe van de test: De enzymatische methode is gebaseerd op bepaling van waterstofperoxide na de omzetting van creatinine onder invloed van creatininase, creatinase en sarcosine oxidase (SOD). Uit het ontstane waterstofperoxide wordt negatief zuurstof vrijgesteld die reageert met 4-aminophenazone (PAP reactie), en dit vormt een gekleurd oxidatieproduct. De kleurintensiteit is rechtevenredig met de concentratie aan creatinine. De meting gebeurt bij een golflengte van 552 nm. o Aanwezige bestandelen volgens bijsluiter - TAPS - Creatinase - Sarcosine oxidase - Ascorbaat oxidase - HTIB - Creatininase Melissa Billiau

24


- Peroxidase - 4-aminophenazone - Kaliumferrocyanide 3.2

Bereiding van toevoegstoffen om drugs in urine te maskeren

3.2.1

Creatinine

Om urine te verkrijgen met verschillende creatinineconcentraties wordt zuivere creatinine aan de urine toegevoegd. Omdat we uitgaan van een urine met een concentratie van 1 g/L werd dit telkens in rekening gebracht om de gewenste concentratie te bekomen. Voor elke concentratie wordt er een oplossing gemaakt van 25 mL. Er wordt schematisch weergegeven hoeveel creatinine er telkens moeten worden afgewogen per oplossing: o Voor een oplossing van 8 g/l creatinine → 0,175 g o Voor een oplossing van 2 g/l creatinine → 0,025 g o Voor een oplossing van 0,40 g/l creatinine → 5 ml uit oplossing van 2 g/l gehaald en aanlengen tot gewenst volume met water.

Melissa Billiau

25

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Materialen en methoden 3.2.2

Glutaraldehyde oplossing

De oplossingen worden gemaakt uit een waterige oplossing met 25% gluteraldehyde HCO(CH)2CHO. Om een oplossing van 5% guteraldehyde te maken wordt 20 mL uit de waterige oplossing van 25 % gehaald en die aangelengd met urine tot 100 mL. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine 3.2.3

Natriumnitriet oplossing

Natriumnitriet wordt gemaakt in een concentratie van 100 mmol/L. Hiervoor wordt er 3,45 g afgewogen voor 50 mL urine. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine 3.2.4

Pyridinium chlorochromaat oplossing

Voor het maken van een oplossing van 50 mL met een concentratie van 100 g/L PCC, wordt 5,1 g afgewogen vanuit de commerciële PCC van 98 %. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine 3.2.5

Jodium oplossing

De jodium stockoplossing met een concentratie van 78,7 mmol/L wordt gemaakt door 2 g I2 en 3 g KI op te lossen in 100 mL water. Voor het maken van een lugol oplossing met een concentratie van 10 mmol/L, wordt er 12,71 mL van de stockoplossing aangelengd tot 100 mL. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine

Melissa Billiau

26


Natriumhypochloriet oplossing

De oorspronkelijke chloorwater oplossing bevat 5,25 % chloor, dit komt overeen met 579 mmol/L. Om een chlooroplossing te maken met een concentratie van 116 mmol/L wordt er 20 mL oorspronkelijke chlooroplossing gehaald en aangelengd tot 100 mL water. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine 3.2.7

Uropyrine ® oplossing

De oplossing van 200 mg/L uropyrine wordt bereid vanuit de stockoplossing van 1 mg/mL. Voor het maken van 100 mL met een conencentratie van 200 mg/L wordt 20 ml stockoplossing aangelengd met water tot 100 mL. Voor een oplossing te bereiden met een concentratie van 20 mg/L, wordt 2 mL stockoplossing aangelengd met water tot 100 mL. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine 3.2.8

Ascorbinezuur ( Vitamine C )

Om een oplossing van 100 g/L te bereiden wordt 5 g vitamine C afgewogen en aangelengd tot 50 ml water. Verdunning voor de recovery test: 1/1 verdund met urine

Melissa Billiau

27


Liquicheck TM

Liquicheck

TM

is een urinecontrole voor drugsanalyse van de firma BIORAD, die

hier zal aangewend worden om de invloed van de toevoegstoffen op de drugconcentratie in urine na te gaan. Deze controle urine bevat gekende concentraties aan verschillende soorten drugs en hun metabolieten: o Amfetamine, MDMA, MDA, MDEA, metamfetamine o THC-carboxylzuur, metaboliet van cannabis o Morfineglucuronide o Codeïne o Methadone o Benzyolecgonine, metaboliet van cocaine

Melissa Billiau

28


3.3

Materiaal nodig voor de drugbepaling op de controle urine

3.3.1 Gaschromatograaf-massaspectrometer (GC-MS) In het laboratorium wordt GC-MS (figuur: 3.3) uitgevoerd in het kader van conformatie analyse.

Figuur 3.3: gaschormatograaf-massaspectrometer

Massaspectrometer

Gaschromatograaf

Vermits dit apparaat enkel aangewend werd om de degelijkheid van de urinevervalsing uit te testen, wordt op het principe van de GC-MS niet verder ingegaan.

3.4

Bewerkingen als voorbereiding van de drugdetectie (16,17)

3.4.1

Voorbehandeling voor de analyse van THC-carboxylzuur.

De werkwijze gaat als volgt: Melissa Billiau

29


Hydrolyse en extractie: o 5 mL urine + 0,5 mL NaOH (1 N) samenvoegen in een proefbuis o Het geheel één uur laten hydrolyseren bij 60°C o De proefbuizen laten afkoelen en vervolgens 0,5 mL HCl (5N) toevoegen en homogeniseren o Voeg 3 mL n-Hexaan toe en laat gedurende 30 min roteren o Centrifugeer 5 min bij 3000 rpm o Breng de hexaanlaag over met een pipet in een konische proefbuis o De organische fase droogdampen Gc-MS: o Aan het residu wordt 50 µL BSTFA/TMCS toegevoegd o Het geheel wordt afgesloten en laat men 30 min reageren bij 70°c. o De proefbuizen laten afkoelen en de inhoud wordt overgebracht in een vial met insert o Analyseer met GC-MS

3.4.2

Voorbehandeling voor de analyse van amfetamine

De werkwijze gaat als volgt: Extractie en derivatistatie:

Melissa Billiau

30


o Een hoeveelheid staal wordt overgebracht in een Tox A tube en gevortexd. Een Tox A tube bestaat uit een gebufferde oplossing. o Centrifugeer vijf minuten bij 3000 rpm en breng de organische fase over in een proefbuis o Er worden twee druppels zure methanol toegevoegd, om de amfetamine niet te verliezen o Damp de organische fase droog o Voeg 20 µL pyridine en 30 µL azijnzuurandhydride toe , laat het geheel 30 min reageren op 70 °C o Droog het derivatistatieragens GC-MS: o Het residu wordt opgelost in 50 µL ethylacetaat o Het geheel wordt vervolgens overgebracht in een vial met insert. o Analyseer met GC-MS

3.4.3

Voorbehandeling voor de analyse van opiaten.

De werkwijze gaat als volgt: Extractie en derivatistatie: o Breng het staal op pH 5 en voeg 30 µL βglucuronidase toe Melissa Billiau

31


o Laat het geheel één nacht incuberen in een warmwaterbad o Centrifugeer de stalen en voeg aan 5 mL urine 2 mL fosfaatbuffer ( pH 6, 100mM) toe en vortex het geheel. o Breng het staal op de kolom en voeg één à twee druppels/ min methanol/fosfaatbuffer toe. o Voeg achter eenvolgens 6 mL water , 3 mL HCl ( 100 mM) en 9 mL methanol toe aan de kolom o Om cocaïne en BE van de kolom te laten komen wordt er 2 ml dichloormethaan-isopropanol toegevoegd + 2 % ammoniak. Cocaïne en BE worden opgevangen in proefbuis. o Damp de organische fase droog o Het residu wordt opgelost in 50 µL acetonnitrille + 50 µL MSTFA o Het geheel wordt afgesloten en laat men 30 min reageren bij 70°c. GC-MS: o Het geheeld wordt vervolgens overgebracht in een vial met insert. o Analyseer met GC-MS

Melissa Billiau

32

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Resultaten

4

Resultaten

In dit hoofdstuk worden de resultaten van de creatininebepaling met behulp van de Jaffemethode en de enzymatische methode op de Integra 400 besproken, evenals de resultaten van de GC-MS voor de bepaling van opiaten, cTHC en amfetamine in de liquicheck, controle urine. 4.1

Bepaling van limit of quantification (LOQ)

De LOQ wordt bepaald van urine met een concentratie van 0,030 g/L, 0,025 g/L, 0, 020 g/L, 0,015 g/L, 0.010 g/L en 0,005 g/L. Iedere concentratie wordt vijf maal bepaald met de Jaffemethode en vijf maal met de enzymatische methode. De LOQ is de laagste concentratie waarop een variatiecoëfficiënt (CV) kan bekomen worden die < 15%. De LOQ van de Jaffemethode wordt bij benadering bepaald en gelijkgesteld aan 0,020 g/L. Omwille van de hogere specificiteit van de enzymatische test mag men stellen dat elke kwantitative waarde hoger dan 0,009 g/L de aanwezigheid van creatinine bevestigt. Op deze wijze kan men zeer sterk verdunde urine nog onderscheiden van een nepvloeistof. Op dit concentratieniveau van creatinine zijn echter nog onvoldoende interferentietesten uitgevoerd. Uit het onderzoek volgt eveneens dat de creatinineconcentraties bepaald met de enzymatische methode gemiddeld 14 % hoger zijn dan deze aangetoond met de Jaffemethode.

Melissa Billiau

33


4.2

Invloed van de toevoegstoffen op de detectie van drugs in urine

Om aan te tonen dat gewerkt wordt met de concentraties aan toevoegstoffen die echt interferen met de druganalysen, worden immunoassays uitgevoerd op de Integra 400 en confirmatieanalysen met GC-MS. Op de Integra 400 wordt de concentratieverandering

nagegaan

voor

opiaten,

BE,

amfetamine

en

THC-

carboxylzuur. Met GC-MS wordt de oppervlakte verandering van de m/z – piek gemeten van een bepaalde drug. De testen worden uitgevoerd op de urinecontrole, Liquicheck

TM

C4, enerzijds 1/1 verdund met water als controle en anderzijds

1/1 met een oplossing van een toevoegstof. In tabel 4.1 wordt de procentuele afwijking weergegeven per toevoegstof. Dit zowel met de KIMS en de GC-MS methode. De gebruikte toevoegstoffen zijn GA (2,5%), NaNO2 (50 mmol/L), PCC (50 g/L), jodium (5 mmol/L), chloorwater (58 mmol/L), uropyrine (10 en 100 mg/L) en ascorbinezuur (50 g/L). De vergelijking gebeurt aan de hand van de procentuele afwijking die als volgt wordt berekend: [ (Gem C4+T – Gem C4) / Gem C4 ] * 100

Melissa Billiau

34

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Resultaten Tabel 4.1: % afwijking van de initiele drugconcentraties door toevoegstoffen met KIMS en GC-MS

GA1 NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100 mg/L) Ascorbinezuur

Amf BE IA GC-MS IA GC-MS +101 -100 -7 -92 +24 +5 -3 +7 -66 -84 +49 -96 +47 0 -1 +21 -41 -88 +9 0 -43 -60 -27 -94

IA -85 +2 -19 -14 -99 -33

Morf cTHC GC-MS IA GC-MS -93 -11 -98 -100 +31 -100 -100 +33 -100 -17 -89 -99 -88 -86 -100 -91 -17 -99

-46

-48

-16

-93

-23

-87

-4

-97

-74

-100

+21

+217

0

+267

+37

-51

Conclusie: De getallen uit tabel 4.1. geven aan dat de aangewende concentraties uit de literatuur een beduidende invloed hebben op het analytisch resultaat. Onder deze omstandigheden zal de deugdelijkheid van de creatininebepaling worden getest.

1

GA werd uit het onderzoek gehaald omwille van schommelende waarnemingen, verder onder-

zoek is noodzakelijk.

Melissa Billiau

35


4.3

Meten van de invloed van de toevoegstoffen op de creatininebepaling

Om na te gaan wat nu uiteindelijk de invloed is van de toevoegstoffen op de creatininebepaling, wordt er met de Jaffe methode en met de enzymatische methode de creatinine 21 maal bepaald. Er worden testen gedaan met creatinineconcentratie’s in de groot orde van 4 g/L, 1 g/L en 0,20 g/L. De vergelijking gebeurt aan de hand van de gepaarde T-test. Er wordt een gepaarde T-test uitgevoerd van de jaffe/enzymatische methode van de zuivere urine versus de jaffe/enzymatische methode van de urine voorzien van een toevoegstof. In de volgende tabel wordt er een overzicht gegeven van de bevindingen van de Jaffemethode. Tabel 4.2: effect van toevoegstof op resultaat Jaffemethode beoordeeld op p< 0,0001

Conc TVS NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100mg/L) Ascorbinezuur

0,163 g/L 0,813 g/L 3,248 g/L ↑ 4% ↓ 7% ↓ 10% ↓ 12% ↓ 4% ↓ 5% ↓ 14%

↓ 2% NS ↓ 12% ↓ 12% NS NS ↓ 7%

NS ↓ 3% ↓ 3% ↓ 8% ↓ 4% ↓ 8% ↓ 3%

Conclusie1: Negatief effect van > 5%: PCC, jodium, chloor, Uropurine (100 mg/L) en ascorbinezuur. Variërend van 7% tot 12% afhankelijk van de creatinineconcentratie. Niet significante verschillen worden aangegeven met “NS”.

Melissa Billiau

36


In tabel 4.3 wordt er een overzicht gegeven van de bevindingen van de enzymatische methode. Tabel 4.3: effect van toevoegstof op resultaat enzymatische methode beoordeeld op p< 0,0001

Conc TVS NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100mg/L) Ascorbinezuur

0,183 g/L 0,951 g/L 3,954 g/L ↑ 4% ↓ 55% ↓ 10% ↓ 55% ↓ 7% ↓ 8% ↓ 55%

NS NS ↓ 12% ↓ 12% ↓ 3% ↓ 4% ↓ 11%

↑ 1% ↓ 2% ↓ 3% ↓ 8% ↓ 9% ↓ 12% ↓ 2%

Conclusie1: Negatief effect van > 5%: PCC, jodium, chloor, uropyrine (10 mg/L), uropyrine (100 mg/L). Variërend van 7% tot 55% afhankelijk van de creatinineconcentratie. Niet significante verschillen werden aangegeven door “NS”. Let op de toenemende relatieve interferentie van ascorbinezuur bij dalende creatinineconcentraties. Dit wijst op de oververzadiging van het ascorbaatoxydase uit de test door vitamine C. Ook sterk oxiderende agentia brengen schade toe aan de enzymen uit de enzymatische creatininetest.

Melissa Billiau

37

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Conclusie

5

Conclusie

In dit eindwerk werd de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepaling in urine bij druggebruikers onderzocht. Het onderzoek werd verricht in het laboratorium toxicologie van AZ Groeninge te Kortrijk. Uit de experimenten werd voor de Jaffemethode een LOQ afgeleid van 0,020 g/L en voor de enzymatische methode een LOQ van 0,009 g/L. De enzymatische methode meet 14 % hoger dan de Jaffemethode. Wanneer men dus te maken heeft met een verdacht urinestaal, is het aangewezen om de creatininebepaling uit te voeren met de enzymatische methode, omwille van de lagere LOQ. Dit echter wanneer een extreme verdunning van het staal met water vermoed wordt, en de jaffemethode een creatinineconcentratie aangeeft van minder dan 0,020 g/L. Via de GC-MS werd aangetoond dat de concentraties van de verschillende toevoegstoffen, zoals vermeld in de literatuur, effectief de juiste zijn. Mogelijk zijn nog lagere concentraties effectief vermits de huidig aangewende concentraties toch nog bijmenging of vervalsing kunnen doen vermoeden na visuele inspectie. Wij doelen hier vooral op de intens oranjerode kleur van PCC en Uropyrine. Eens de effectiviteit van de geselecteerde concentraties van de toevoegstoffen vaststond, konden wij het effect ervan nagaan op de resultaten van de twee soorten creatininebepalingen. Er werden verschillende concentratieniveau’s voor creatinine onderzocht namelijk 4 g/L, 1g/L en 0,20 g/L. De toevoegstoffen die een beduidend negatief effect hebben (>5%) op de creatininebepaling met de Jaffemethode zijn: PCC, jodium, chloorwater, uropyrine (100 mg/L) en ascorbinezuur. De stoffen die een beduidend negatief effect hebben (>5%) op de creatininebepaling met de enzymatische methode zijn: PCC, jodium, chloorwater, uropyrine (10 en 100 mg/L) en ascorbinezuur.

Melissa Billiau

38

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Conclusie

Het onderzoek leverde wisselende resultaten op voor glutaraldehyde en het is aangeraden de experimenten met GA verder te verfijnen. Nu kunnen wij hiervoor nog geen betrouwbare cijfers meedelen (toch vermeld in bijlage). Er kan ook eventueel verder onderzoek verricht worden naar de effectiviteit van toevoegstoffen in een concentratie die niet visueel zichtbaar is, en dan hun invloed op de creatininebepaling verder nakijken. Het onderzoek heeft aangetoond dat de bepaling van creatinine op vervalste urine niet steeds te betrouwen is. Onder deze omstandigheden is het zeker te mijden het resultaat van creatinine aan te wenden om de concentraties aan cTHC in urine te normaliseren en de resultaten uit te drukken in µg/g creatinine. Anderzijds heeft de enzymatische test zijn superioriteit aangetoond bij zeer lage creatinineconcentraties.

Melissa Billiau

39

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Literatuurlijst

Literatuurlijst 1. Pyridinium chlorochromate [ www ], 14 februari 2008, Wikipedia. URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Pyridinium_chlorochromate Gezien: 28 maart 2008 (afbeelding) 2. Alan H.B. Wu, Ben Bristol, Karen Sexton, Gina Cassella-McLane, Verena Holtman, Dennis W. Hill ( 1999 ). Adulteration of Urine bij “ Urine Luck”. Clinical Chemistery, 45:7, 1051-1057 3. Roche Diagnostics ( 2004 ). Creatinine Jaffé. Urine Mannheim: Roche Diagnostics 4. Roche Diagnostics ( 2002 ). Creatinine plus ver.2. 5. James O. Westgard, PhD, Elsa F. Quam, BS, MT ( ASCP ), Method Validation – The Interference and Recovery Experiments [ www ], Westgard Qc. URL: http://www.westgard.com/lesson27.htm Gezien: 11 april 2008 6. S. George, R.A. Braithwaite. (1996). The effect of Gluteraldehyde Adulteration of Urine Specimens of Syva EMIT II Drugs-of-Abuse Assays. Journal of Analytical Toxicology, vol 20, 195-196. 7. Anthony wu, Janet Schmalz, William Bennett. (1994). Identification of UrinAid-Adulterated Urine Specimens by Fluorometric Analysis. Clinical Chemistry, vol 40 nr. 5, 845-846. 8. Buddha D. Paul, Aaron Jacobs. (2005). Spectrophotometric Detection of Iodide and Chromic (III) in Urine after Oxidation to Iodine and Chromate (Vi). Journal of Analytical Toxicology, vol 29. 658-663.

Melissa Billiau

40


9. Buddha D. Paul, Aaron Jacobs. (2002). Effect of Oxidizing Adulterants on Detection of 11-Nor- Δ 9-THC-9-Carboxylic Acid in Urine. Journal of Analytical Toxicology, vol 26. 460-463 10. Dr. F. Martens. Valkuilen in de laboratoruimdiagnostiek van middelengebruik. Niet-gepubliceerde powerpoint, Kortrijk, laboratorium AZ groeninge. 11. Creatinine [www], 2008, Wikipedia. URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Creatinine Gezien: 1 mei 2008 (afbeelding) 12. Sodium hypochlorite [www], 2008, Wikipedia. URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Sodium_hypochlorite Gezien: 24 maart 2008 13. BioScan , Intect TM 7 [www], Bioscan Screening Systems. URL: http://www.2introspect.com/drug_testing/adulterant_testing.html gezien: 28/05/2008 14. Phenazopyridine [www], 14 april 2008, Wikipedia. URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Phenazopyridine gezien: 28/05/2008 (afbeelding) 15. Ascorbinezuur [www], 14 mei 2008, Wikipedia URL: http://nl.wikipedia.org/wiki/Ascorbinezuur Gezien: 12 mei 2008 (afbeelding) 16. K. Croes, N. Vrydags, Chromatografische analyse van fenylalkylaminen in urine/maagvocht D.M.V. GC-MS. Niet gepubliceerde SOP, Kortrijk, Laboratorium AZ Groeninge. 17. K. Croes, N. Vrydags, Chromatografische analyse van cTHC in urine/maagvocht D.M.V. GC-MS. Niet gepubliceerde SOP, Kortrijk, Laboratorium AZ Groeninge Melissa Billiau

41


Melissa Billiau

42

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Bijlagen

Bijlagen Bijlage 1 – Massaspectrum van opiaten van de standaardurine, massaspectrum opiaten na toevoeging van PCC

Melissa Billiau

43


Massaspectrum opiaten na het aanbrengen van PCC

Melissa Billiau

44

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Bijlagen Bijlage 2 – Resultaten gepaarde T-test en Box en Whisker plots voor het niveau van 3-4 g/L

Jaffe methode: Gem Zuivere urine 3.248 GA 2,257 NaNO2 3.257 PCC 3,140 Jodium 3,147 Chloor 0,713 Uropyrine (10 mg/L) 3,118 Uropyrine (100 mg/L) 2,972 Ascorbinezuur 3,138

Stdev 0.030 0,047 0.038 0,016 0,031 0,008 0,017 0,029 0,027

Afwijking %

P

-0,990 +0.009 -0,108 -0,100 -0,099 -0,130 -0,276 -0,110

P < 0,0001 P= 0.3027 P < 0,0001 P < 0,0001 P < 0,0001 P < 0,0001 P < 0,0001 P < 0,0001

-30 NS -3 -3 -8 -4 -8 -3

Enzymatische methode: Zuivere urine GA NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100 mg/L) Ascorbinezuur

Melissa Billiau

Gem 3.954 2.673 4.012 3.698 3.817 3.629 3.594 3.476 3.865

Stdev 0.030 0.070 0.043 0.025 0.043 0.031 0.026 0.041 0.053

Afwijking %

P

-1.280 +0.058 -0.255 -0.137 -0.325 -0.360 -0.478 -0.089

P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001

-32 +1 -6 -3 -8 -9 -12 -2

45


Box-and-whisker 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 Jaf*Z*4.00

Jaf*GA*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en GA.

Box-and-whisker 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 Enz*Z-4.00

Enz*GA*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en GA.

Melissa Billiau

46



Jaf*NO2*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en NaNO2.

Box-and-whisker 4.08 4.06 4.04 4.02 4.00 3.98 3.96 3.94 3.92 3.90 Enz*Z*4.00

Enz*NO2*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en NaNO2.

Melissa Billiau

47


Box-and-whisker 3.30

3.25

3.20

3.15

3.10 Jaf*Z*4.00

Jaf*PCC*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en PCC.

Box-and-whisker 4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 Enz*Z-4.00

Enz*PCC*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en PCC.

Melissa Billiau

48


Box-and-whisker 3.30

3.25

3.20

3.15

3.10 Jaf*Z*4.00

Jaf*I2*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en jodium.

Box-and-whisker 4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 Enz*Z*4.00

Enz*I2*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en jodium.

Melissa Billiau

49


Box-and-whisker 3.30 3.25 3.20 3.15 3.10 3.05 3.00 2.95 2.90 Jaf*Z*4.00

Jaf*Cl2*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en chloor.

Box-and-whisker 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 Enz*Z-4.00

Enz*Cl2*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en chloor.

Melissa Billiau

50


Box-and-whisker 3.30 3.25 3.20 3.15 3.10 3.05 Jaf*Z*4.00

Jaf*Uro10*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en uropyrine (10 mg/L).


Enz-Uro*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (10 mg/L).

Melissa Billiau

51



Jaf*Uro100*4.00


Box-and-whisker 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 Enz*Z-4.00 Enz*Uro100*4.00 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (100 mg/L).

Melissa Billiau

52



Jaf*VitC*4.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en ascorbinezuur.


Enz*VitC*4.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en ascorbinezuur.

Melissa Billiau

53

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Bijlagen Bijlage 3 – Resultaten van gepaarde T-test en Box en Whisker plots voor het niveau van 1g/L

Jaffe methode:

Gem 0.813 1,4293 0,7975 0,8105 0,7161 0,7136 0,8218 0,8026 0,7531

Stdev 0.009 0,027 0,006 0,010 0,008 0,008 0,006 0,006 0,025

Gem Zuivere urine 0.951 GA 1.636 NaNO2 0.948 PCC 0.956 Jodium 0.838 Chloor 0.837 Uropyrine (10 mg/L) 0.926 Uropyrine (100 mg/L) 0.904 ascorbinezuur 0.839

Stdev 0.014 0.058 0.009 0.013 0.009 0.007 0.009 0.009 0.010

Zuivere urine GA NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100 mg/L) ascorbinezuur

Afwijking %

P

+0,6163 -0,0155 -0,0026 -0,0970 -0,0995 +0,0087 -0,0104 -0,0599

P < 0,0001 P < 0,0001 P = 0,4808 P < 0,0001 P < 0,0001 P = 0,0022 P = 0,0015 P < 0,0001

+75 -2 NS -12 -12 -3 NS -7

Enzymatische methode:

Melissa Billiau

Afwijking %

P

+0.685 -0.003 +0.005 -0.113 -0.114 -0.025 -0.047 -0.112

P <0,0001 P= 0.3026 P = 0.0166 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001 P <0,0001

+72 NS NS -12 -12 -3 -4 -11

54



Jaf*GA*1.00



Enz*GA*1.00


Melissa Billiau

55



Jaf*NO2*1.00

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en NaNO2.


Enz*NO2*1.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en NaNO2.

Melissa Billiau

56


Box-and-whisker 0.830 0.825 0.820 0.815 0.810 0.805 0.800 0.795 0.790 0.785 Jaf*Z*1.00

Jaf*PCC*1.00



Enz*PCC*1.00

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en PCC.

Melissa Billiau

57



Jaf*I2*1.00


Box-and-whisker 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 0.88 0.86 0.84 0.82 Enz*Z*1.00

Enz*I2*1.00


Melissa Billiau

58



Jaf*Cl2*1.00


Box-and-whisker 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 0.88 0.86 0.84 0.82 Enz*Z*1.00

Enz*Cl2*1.00


Melissa Billiau

59



Jaf*Uro10*1.00


Box-and-whisker 0.97 0.96 0.95 0.94 0.93 0.92 0.91 0.90 Enz*Z*1.00 Enz*Uro10*1.00 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (10 mg/L).

Melissa Billiau

60


Box-and-whisker 0.830 0.825 0.820 0.815 0.810 0.805 0.800 0.795 0.790 Jaf*Z*1.00 Jaf*Uro100*1.00 Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en uropyrine (100 mg/L).

Box-and-whisker 0.97 0.96 0.95 0.94 0.93 0.92 0.91 0.90 0.89 Enz*Z*1.00 Enz*Uro100*1.00 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (100 mg/L).

Melissa Billiau

61



Jaf*VitC*1.00



Enz*VitC*1.00


Melissa Billiau

62

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Bijlagen Bijlage 4 – Resultaten van de gepaarde T-test en Box en Whisker plots van het niveau 0.20 g/L.

Jaffe methode:

Zuivere urine GA NaNO2 PCC Jodium Chloor Uropyrine (10 mg/L) Uropyrine (100 mg/L) ascorbinezuur

Gem 0.163 0,1422 0,1690 0,1510 0,1456 0,1561 0,1561 0,1551 0,1397

Stdev Afwijking % P 0.003 0,003 -0,0209 -12 P < 0,0001 0,003 +0,005905 +4 P < 0,0001 0,003 -0,0121 -7 P < 0,0001 0,004 -0,01752 -10 P < 0,0001 0,006 -0,006952 -12 P = 0,0001 0,005 -0,006952 +4 P = 0,0001 0,003 -0,0080 -5 P < 0,0001 0,013 -0,02343 -14 P < 0,0001

Enzymatische methode:

Gem Zuivere urine 0.183 GA 0.098 NaNO2 0.191 PCC 0.172 Jodium 0.164 Chloor 0.081 Uropyrine (10 mg/L) 0.170 Uropyrine (100 mg/L) 0,1680 ascorbinezuur 0.079

Melissa Billiau

Stdev Afwijking % P 0.003 0.009 -0.084 -46 P <0,0001 0.002 +0.008 +4 P <0,0001 0.004 -0.010 -55 P <0,0001 0.002 -0.019 -10 P <0,0001 0.001 -0.102 -55 P <0,0001 0.002 -0.013 -7 P <0,0001 0,004 -0,015 -8 P < 0,0001 0.002 -0.103 -55 P <0,0001

63



Jaf*GA*0.20



Enz*GA*0.20


Melissa Billiau

64



Jaf*NO2*0.20

Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en NaNo2.

Box-and-whisker 0.195 0.190 0.185 0.180 0.175 0.170 0.165 Enz*Z*0.20 Enz*NO2*0.20 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en NaNo2.

Melissa Billiau

65



Jaf*PCC*0.20


Box-and-whisker 0.190 0.185 0.180 0.175 0.170 0.165 Enz*Z*0.20 Enz*PCC*0.20 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en PCC.

Melissa Billiau

66



Jaf*I2*0.20


Box-and-whisker 0.190 0.185 0.180 0.175 0.170 0.165 0.160 Enz*Z*0.20

Enz*I2*0.20


Melissa Billiau

67



Jaf*Cl2*0.20


Box-and-whisker 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 Enz*Z*0.20

Enz*Cl2*0.20


Melissa Billiau

68



Jaf*Uro10*0.20


Box-and-whisker 0.190 0.185 0.180 0.175 0.170 0.165 0.160 Enz*Z*0.20 Enz*Uro10*0.20 Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (10 mg/L).

Melissa Billiau

69


Box-and-whisker 0.168 0.166 0.164 0.162 0.160 0.158 0.156 0.154 0.152 0.150 Jaf*Z*0.20 Jaf*Uro100*0.20 Box en whisker plot van de Jaffemethode van zuivere urine en uropyrine (100 mg/L).

Box-and-whisker 0.190 0.185 0.180 0.175 0.170 0.165 0.160 0.155 0.150 Enz*Z*0.20 Enz*Uro100*0.20

Box en whisker plot van de enzymatische methode van zuivere urine en uropyrine (100 mg/L).

Melissa Billiau

70



Jaf*VitC*0.20



Enz*VitC*0.20


Melissa Billiau

71

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers Voor akkoord verklaring

Voor akkoord verklaring

Naam Familienaam stagementor

Naam Familienaam stagebegeleider

Melissa Billiau

72

Onderzoek naar de invloed van toevoegstoffen op de creatininebepalinging in urine van druggebruikers

Recommend Documents