OCHRATOXIN A – MYKOTOXIN V POTRAVINOVÝCH SUROVINÁCH ROSTLINNÉHO PŮVODU VE SVĚTLE NEJNOVĚJŠÍCH POZNATKŮ
Doc. MVDr. Vladimír Ostrý, CSc., Státní zdravotní ústav v Praze, Centrum zdraví, výživy a potravin, Palackého 3a, 612 42 Brno, e-mail:
[email protected] Ochratoxin A (dále OTA) patří mezi významné nefrotoxické mykotoxiny, jejichž cílovým orgánem jsou ledviny a vylučovací systém. Mezi další toxické účinky OTA patří imunotoxicita, neurotoxicita, teratogenita, genotoxicita a karcinogenita. OTA je spojován s nádory ledvin a nádorovým onemocněním varlat (Pfohl-Leszkowicz a Manderville, 2007; Wu aj., 2011). IARC FAO/WHO klasifikuje OTA jako možný karcinogen pro člověka (kategorie 2B) (IARC, 1993). V současnosti se ve vědeckém fóru diskutuje otázka OTA jako „kompletního“ karcinogenu pro člověka (Pfohl-Leszkowicz a Manderville, 2012). EFSA (2006) stanovil pro OTA tolerovatelný týdenní přívod (TWI) = 120 ng/kg t. hm./ týden. Z chemického hlediska patří OTA do skupiny ochratoxinů, kam ještě řadíme další ochratoxiny (B, C, D a α). V této skupině je OTA dominantní. Z hlediska způsobu biosyntézy patří OTA mezi pentaketidy. Lze ho obecně charakterizovat jako derivát 7-izokumarinu vázaný na aminoskupinu L-β-fenylalaninu (Malíř a Ostrý, 2003). Strukturní vzorec OTA je uveden na obr. 1. Obr. 1 Strukturní vzorec OTA
I když byl OTA objeven a chemicky charakterizován již v roce 1965, je mu věnována i nadále zvýšená pozornost odborné veřejnosti. Zejména když v polovině 90. let minulého století Zimmerli a Dick sledovali ve Švýcarsku v epidemiologické studii výskyt OTA v lidském krevním séru. Zjistili, že muži z oblastí jižněji od Alp v kantonu Ticino měli v krevním séru mnohem vyšší koncentrace OTA než ženy a muži žijící severněji od Alp a v dalších kantonech Švýcarska (Zimmerli a Dick, 1995). Při vyhledávání možných expozičních zdrojů OTA v potravinách byl OTA poprvé stanoven ve víně a hroznové šťávě (Zimmerli a Dick, 1996). Toto významné zjištění vyvolalo okamžitě další výzkum výskytu OTA ve víně v Evropě i ve světě. Multidisciplinární projekt "WINE-OCHRA RISK byl iniciován a řešen v rámci 5th Framework Programme EU v letech 2001-2005. Cílem projektu bylo hodnocení rizika OTA ve víně v Evropě se snahou o snížení a minimalizaci koncentrace OTA ve víně s využitím např. systému HACCP, GAP a GMP. Zde v první linii sehráli nezastupitelnou roli zejména rostlinolékaři. Výskyt OTA byl potvrzen v červených, rosé, bílých a dezertních vínech. Koncentrace OTA ve vzorcích vín se pohybovaly v závislosti na oblasti v rozsahu <0,01-7,6 μg/l. Vyšší koncentrace OTA byly stanoveny zejména v červených a rosé vínech (Varga a Kozakiewicz, 2006). Na základě současných znalostí se OTA vyskytuje v řadě potravin rostlinného (např. v obilovinách, kávě, kakau, pivu, luštěninách, koření, lékořici, kurkumě, zeleném čaji, fících, 1
rozinkách, hroznové šťávě, vínu a pivu), tak i živočišného původu (např. ve vepřovém mase, ve výrobcích z krve, v ledvinách a játrech) (Malíř a Ostrý, 2003; EFSA, 2006). OTA je limitován v potravinách v Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006 a č. 105/2010. Při produkci OTA se dosud uplatňovaly především dva rody Aspergillus (A. ochraceus, A. melleus) a Penicillium (P. verrucosum, P. nordicum). V tropických a subtropických oblastech je OTA v potravinách produkován zejména vláknitými mikroskopickými houbami rodu Aspergillus. Optimální teplota pro jeho produkci např. pro Aspergillus ochraceus (viz obr. 2) se pohybuje okolo 28 oC, i když může být touto vláknitou mikroskopickou houbou produkován v teplotním rozsahu 15-37 oC. Obr. 2 Růst Aspergillus ochraceus na Czapek Yeast Extract (CYA) agaru (25 oC, 7 dní)
V oblastech mírného podnebního pásu a v chladnějších oblastech je OTA produkován spíše vláknitými mikroskopickými houbami rodu Penicillium. Mikroskopické houby rodu Penicillium verrucosum (obr. 3) jsou schopny produkovat OTA již v rozmezí od 4 - 30 oC (Malíř a Ostrý, 2003). Obr. 3
Růst Penicillium verrucosum na Czapek Yeast Extract (CYA) agaru (25 oC, 7 dní)
2
Další významní producenti OTA, zástupci Aspergillus sekce Nigri, kteří mají spojitost s kontaminací hroznů révy vinné, byli izolováni a identifikováni v roce 1994 (Abarca aj., 1994). Následně byla produkce OTA u izolovaných kmenů Aspergillus sekce Nigri nezávisle konfirmována v dalších studiích (Teren aj., 1996; Abarca aj., 2001; Perrone aj., 2006). V rámci této sekce patří Aspergillus carbonarius (viz obr. 4) k nejvýznamnějším producentům OTA ve víně, rozinkách a mleté paprice (Abarca aj., 2003; Perrone aj., 2006). Obr. 4
Růst Aspergillus carbonarius na Czapek Yeast Extract (CYA) agaru (25 oC, 7 dní)
V letech 1999–2009 byla na Státním zdravotním ústavu v Brně realizována studie „MYKOMON“. Jedná se o specializované mykologické vyšetření, které je zaměřeno na sledování výskytu toxinogenních vláknitých mikroskopických hub, producentů OTA ve vybraných potravinách. Hlavním cílem studie „MYKOMON“ je popis, identifikace a charakterizace nebezpečí výskytu toxinogenních vláknitých mikroskopických hub v potravinách. Studie byla realizována v rámci projektu Monitoringu zdravotního stavu obyvatelstva ČR ve vztahu k životnímu prostředí MZSO), subprojektu dietární expozice člověka chemickým látkám (Ostrý aj., 2010). V obchodní síti v ČR bylo odebráno 21 typů potravin na 12 místech ve 4 odběrových termínech (březen, květen, září, listopad). Celkově bylo vyšetřeno 2016 vzorků potravin. V potravinách byl monitorován výskyt ochratoxinogenních vláknitých mikroskopických hub (Aspergillus ochraceus, Aspergillus sekce Nigri, Penicillium verrucosum, Penicillium nordicum) s využitím mykologických metod. V průběhu 11 let realizace studie MYKOMON byla získána frekvenční data o kvalitativním a kvantitativním výskytu toxinogenních vláknitých mikroskopických hub producentů ochratoxinu A v potravinách v ČR. Bylo izolováno 303 kmenů Aspergillus sekce Nigri (potenciálních producentů OTA) v černém čaji, ovocném čaji, kmínu, hladké mouce, hrubé mouce, dětské obilné kaši, sladké paprice, černém pepři, rozinkách, ovesných vločkách a rýži. Další významné toxinogenní druhy Penicillium verrucosum, Penicillium nordicum a Aspergillus ochraceus nebyly v testovaných potravinách izolovány. Dietární expozici člověka OTA lze hodnotit buď přímo, na základě nálezů OTA v biologickém materiálu (lidské krvi, moči a tkáních) nebo nepřímo, stanovením OTA v potravinách. OTA v krevním séru byl v ČR systematicky sledován v rámci MZSO – subsystému V. biologického monitoringu v letech 1994-2002 a v roce 2005 (Ostry aj., 2005). V roce 2010 byla na Státním zdravotním ústavu v Brně realizována studie stanovení OTA v lidské moči (Ostrý aj., 2010). Celkem bylo analyzováno 236 vzorků 24-hod. močí mužů a žen ve věku 45-60 let. OTA v moči byl stanoven metodou HPLC-FD s využitím imunoafinitních kolonek OCHRAPREP® (R-Biopharm Rhone, SRN) k vyčistění vzorku moči. Mez detekce metody (LOD) byla 1 ng/l a mez stanovitelnosti (LOQ) 2 ng/l. Výsledky s 3
vyššími koncentracemi OTA byly konfirmovány metodou LC-MS/MS. Výsledky celkové denní exkrece OTA močí jsou uvedeny v tab. Tab. Výsledky celkové denní exkrece OTA močí Pohlaví n /n+ Aritm. průměr a Median a 90% Perc. a
Muži 116/107 OTA (ng/den) 25,4 14,7 32,5
OTA (ng/kg t.hm./den) 0,30 0,17 0,43
Ženy 120/78 OTA (ng/day) 9,27 7,62 20,2
OTA (ng/kg t. hm./den) 0,15 0,12 0,30
a
koncentrace OTA <2,0 ng/l byla hodnocena jako ½ LOQ = 1,0 ng/l n+ počet pozitivních vzorků
Získaná data o exkreci OTA močí signalizují reálnou expozici OTA pro uvedené populační skupiny. Vysoké bylo také procento pozitivních vzorků moči na OTA u mužů (92 %) a žen (65 %) (Ostrý aj., 2010). Na základě nových poznatků o OTA jako kompletním karcinogenu, informaci o nových expozičních zdrojích OTA a výsledcích exkrece OTA v 24-hod. moči mužů a žen ve věku 45-60 let v ČR je v současné době realizován výzkumný projekt v rámci IGA MZ ČR, ve kterém bude provedeno hodnocení dietární expozice a charakterizace zdravotního rizika OTA pro jednotlivé populační skupiny v ČR. Jedná se o 10 populačních skupin ve věku 4-90 let obou pohlaví. Dále bude na základě získaných výsledků vyhodnoceno, jak se jednotlivé typy potravin – expoziční zdroje OTA podílejí na celkové dietární expozici OTA pro jednotlivé populační skupiny. Tato data pak mají význam mimo jiné i jako odborný podklad pro tvorbu hygienických limitů OTA v potravinách. Literatura: Abarca, M.L., Accensi, F., Bragulat, M.R., Cabanes, F.J.: Current importance of ochratoxin A producing Aspergillus spp. J. Food Prot., 2001, 64, 903-906. Abarca, M.L., Accensi, F., Bragulat, M.R., Castella, G., Cabañes, F.J.: Aspergillus carbonarius as the Main Source of Ochratoxin A Contamination in Dried Vine Fruits from the Spanish Market. J. Food Prot., 2003, 66, 504-506. Abarca, M.L., Bragulat, M.R., Castella, G., Cabañes, F.J.: Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var. niger. Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 2650-2652. EFSA: Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on request from the commission related to ochratoxin A in food. EFSA J., 2006, 365, 1-56. IARC: Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans: Some naturally occuring substances: Food items and costituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. Lyon, France: IARC, 1993, 56, 489-524. Malíř, F., Ostrý, V. (Eds.): Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. NCONZO, Brno, 2003. Ostry V, Malir F, Roubal T, Skarkova J, Ruprich J, Cerna M, Creppy EE.: Monitoring of mycotoxin biomarkers in the Czech Republic. Mycotoxin Res., 2005, 21, 49-52.
4
Ostry, V., Skarkova, J., Kavrik, R., Ruprich, J.: An occurrence of ochratoxin A and aflatoxin M1 biomarkers in human urine. In 32th Mycotoxin Workshop, Lyngby, Denmark, Society for Mycotoxin Research, 2010, p. 145. Ostrý, V., Škarková, J., Křemečková, P., Procházková, I. Ruprich, J.: Studie MYKOMON (1999-2009). In Sborník sdělení z 15. konference Monitoringu a Konference Hygieny životního prostředí. SZÚ Praha, 2010, s. 37. Perrone, G., Mule, G., Susca, A., Battilani, P., Pietri, A., Logrieco, A.: Ochratoxin A Production and Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis of Aspergillus carbonarius, Aspergillus tubingensis, and Aspergillus niger Strains Isolates from Grapes in Italy. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72, 680–685. Pfohl-Leszkowicz, A., Manderville, R.A.: Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans. Mol. Nutr. Food Res., 2007, 51, 61–99. Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA.: An Update on Direct Genotoxicity as a Molecular Mechanism of Ochratoxin A Carcinogenicity. Chem. Res. Toxicol., 2012, 25, 252-262. Teren, J., Varga, J., Hamari, Z., Rinyu, E., & Kevei, E.: Mycopathologia, Immunochemical detection of ochratoxin A in black Aspergillus strains. 1996, 134, 171-176. Varga, J., Kozakiewicz, Z.: Invited review: Ochratoxin A in grapes and grape-derived products. Trends Fd Sci. Technol., 2006, 17, 72–81. Wu, Q., Dohnal, V., Huang, L., Kuca, K., Wang, X., Chen, G., Yuan, Z.: Metabolic Pathways of Ochratoxin A. Current Drug Metabolism., 2011,12, 1-10. Zimmerli, B. and Dick, R.: Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood, serum, milk and some foodsuffs by HPLC with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup: methodology and Swiss data. J. Chromatogr. B, 1995, 666, 85-99. Zimmerli, B., Dick, R.: Ochratoxin A in table wine and grape-juice: occurrence and risk assessment. Food Addit. Contam., 1996, 13, 655- 668. Tato práce vznikla s finanční podporou IGA MZ ČR při řešení projektu NT 12051-3/2011 „Ochratoxin A - hodnocení zdravotního rizika pro vybrané populační skupiny v ČR“
5
