Ochratoxin A molekuláris interakcióinak vizsgálata in vitro modell rendszerekben Doktori (PhD) – értekezés
Dr. Poór Miklós
Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Doktori iskola vezetője: Prof. Dr. Kovács L. Gábor Programvezető: Prof. Dr. Miseta Attila Témavezető: Dr. Kőszegi Tamás
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Laboratóriumi Medicina Intézet
2014.
1
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke.................................................................................................................. 5 I. Bevezetés ................................................................................................................................ 8 II. Irodalmi áttekintés ................................................................................................................. 9 II. 1. Ochratoxin A: előfordulás, általános és fizikai-kémiai tulajdonságok .......................... 9 II. 2. Toxikokinetika ............................................................................................................. 11 II.2.1. Abszorpció ............................................................................................................. 11 II.2.2. Disztribúció ............................................................................................................ 12 II.2.2.1. Kötődés plazmaalbuminhoz ............................................................................ 12 II.2.2.2. Enterohepatikus körforgás ............................................................................... 14 II.2.2.3. Szöveti megoszlás............................................................................................ 14 II.2.3. Metabolizmus ......................................................................................................... 15 II.2.3. Exkréció ................................................................................................................. 17 II.2.3.1. Renális exkréció .............................................................................................. 17 II.2.3.2. Fekális exkréció ............................................................................................... 18 II.2.3.3. Exkréció tejben ................................................................................................ 18 II. 3. Toxikodinámia ............................................................................................................. 18 II.3.1. Proteinszintézis gátlása........................................................................................... 20 II.3.2. Celluláris energiaprodukció gátlása ....................................................................... 20 II.3.3. Genotoxikus hatás – DNS-adduktok képzése ........................................................ 21 II.3.4. Oxidatív/nitrozatív stressz indukciója .................................................................... 23 II.3.5. Ca2+-homeosztázis felborítása ................................................................................ 25 II.3.6. Apoptózis és jelátvitel hatások ............................................................................... 26 II.3.7. Mitózisra gyakorolt negatív hatások ...................................................................... 27 II.3.8. Sejtciklus: G1- és G2-blokk ................................................................................... 27 II. 4. Prevenció, detoxikáció ................................................................................................. 28 II.4.1. Abszorpció gátlása, elimináció fokozása ............................................................... 28 2
II.4.1.1. Adszorbensek ................................................................................................... 28 II.4.1.2. Nátrium-hidrogénkarbonát .............................................................................. 28 II.4.1.3. Kolesztiramin................................................................................................... 29 II.4.1.4. Piroxikám......................................................................................................... 29 II.4.1.5. Enziminduktorok – a metabolizmus fokozása ................................................. 29 II.4.1.6. OTA leszorítása szérumalbuminról ................................................................. 29 II.4.2. Toxikodinámiás hatások ellensúlyozása ................................................................ 30 II.4.2.1. Fenilalanin, aszpartám ..................................................................................... 30 II.4.2.2. Antioxidánsok/antioxidáns rendszer támogatása ............................................. 31 III. Célkitűzések ....................................................................................................................... 33 IV. Anyagok és vizsgálati módszerek ...................................................................................... 34 IV. 1. Reagensek ................................................................................................................... 34 IV. 2. Műszerek .................................................................................................................... 34 IV. 3. Sejtkultúrák ................................................................................................................ 35 IV. 4. Celluláris paraméterek meghatározása ....................................................................... 36 IV.4.1. Összfehérje-meghatározás fluorescaminnal ......................................................... 36 IV.4.2. ATP-koncentráció meghatározása luciferin-luciferáz reakcióval......................... 36 IV.4.3. ATP/ADP-arány meghatározása HPLC-UV módszerrel ...................................... 37 IV.4.4. Calcein viabilitás vizsgálat ................................................................................... 37 IV.4.5. Propidium-jodid – Annexin V viabilitás teszt ...................................................... 38 IV.4.6. Sejtciklus analízis ................................................................................................. 38 IV.4.7. Intracelluláris ROS-meghatározás ........................................................................ 39 IV. 5. Statisztika ................................................................................................................... 39 V. Eredmények, következtetések ............................................................................................. 40 V. 1. Ochratoxin A interakciója szérumalbuminnal ............................................................. 40 V. 2. OTA leszorítása albuminról gyógyszerekkel ............................................................... 44 V. 3. OTA leszorítása albuminról flavonoid aglikonokkal .................................................. 47 3
V. 4. OTA interakciója alkálifémekkel és alkáliföldfémekkel ............................................. 49 V. 5. OTA2--Mg2+ interakció alkalmazása HPLC-FLD rendszerre ...................................... 55 V. 6. OTA interakciója cink(II)-ionokkal ............................................................................. 57 V. 7. OTA interakciója ciklodextrinekkel ............................................................................ 58 V. 8. OTA hatásai MDCK sejteken ...................................................................................... 60 V. 9. Diosmetin hatása OTA-val kezelt sejteken .................................................................. 63 VI. Megbeszélés ....................................................................................................................... 66 VII. Új megállapítások ............................................................................................................. 71 VIII. Saját közlemények listája ................................................................................................ 72 IX. Irodalom ............................................................................................................................. 74 X. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................ 91 XI. Mellékletek......................................................................................................................... 92
4
Rövidítések jegyzéke 3-BP
3-bromopiruvát
4-OH-OTA
4-hidroxi-Ochratoxin A
10-OH-OTA
10-hidroxi-Ochratoxin A
ABC
ATP-binding cassette fehérjék
ACN
acetonitril
AP-1
aktivátor protein 1
ATM
ataxia telangiectasia mutated protein kinase
AUC
area under the curve / görbe alatti terület
BEN
Balkán Endémikus Nefropátia
BSA
bovine serum albumin / marha szérumalbumin
C8-dG
C8-deoxiguanozin-addukt
C-OTB-dG
C-kapcsolt C8-dG Ochratoxin B - addukt
CAM
Calcein-acetoximetil észter
CAT
catalase / kataláz
CD
ciklodextrin
CD46
cluster of differentiation 46 (komplement regulátor protein)
CD55
cluster of differentiation 55 / complement decay-accelerating factor
CD59
cluster of differentiation 59 / MAC (membrane attack complex) – inhibitory protein
CDK
ciklin-dependens kináz
cDNS
complementer-DNS
Chk2
Checkpoint kinase 2
CPS
counts per second
ctrl
control / kontroll
CYP450
cytochrom P450 enzimrendszer
DDAH
dimetilarginin-dimetilamino-hidroláz
dG
deoxiguanozin
DIOS
diosmetin
DNS
dezoxiribonukleinsav
ERK
extracellular regulated kinase
EtOH
etanol
FITC
fluoreszcein-izotiocianát
FLD
fluoreszcens detektor
GADD
Growth Arrest and DNA Damage gén
GSH
glutation (redukált) 5
GSSG
glutation (oxidált)
GST
glutation-S-transzferáz
HAT
hiszton-acetiltranszferáz
hOAT1
humán organic anion transporter 1
hOAT3
humán organic anion transporter 3
hOAT4
humán organic anion transporter 4
HPLC
high performance liquid chromatography
HSA
humán szérumalbumin
IL-6
interleukin 6
iNOS
indukálható nitrogén-monoxid-szintáz
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
JNK
c-Jun N-terminális kináz
LD50
lethal dose 50%
LO-OTA
lactone-opened Ochratoxin A
LOD
limit of detection
LOQ
limit of quantification
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MDR
multiple drug resistance / multi-drug resistance
mRNS
messenger ribonukleinsav
MRP2
Multidrug resistance-associated protein 2
MS
mass spectrometer / tömegspektrométer
NAC
N-acetil-cisztein
NFκB
nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NMR
nuclear magnetic resonance / mágneses magrezonancia
Nrf2
nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2
NSAID
non-steroidal anti-inflammatory drug / nemszteroid gyulladáscsökkentő
O-OTA-dG
O-kapcsolt C8-dG Ochratoxin-addukt
OAT
organic anion transporter
OATP
organic anion-transporting polypeptide
O2˙¯
szuperoxid gyök-anion
OH˙
hidroxilgyök
OmA
oligomycin A
ONOO¯
peroxinitrit
OTA
Ochratoxin A
OTA-
Ochratoxin A - monoanion
2-
OTA
Ochratoxin A - dianion
OT α
Ochratoxin alfa
6
OTB
Ochratoxin B
OTC
Ochratoxin C
OTHQ
Ochratoxin A hydroquinone
OTQ
Ochratoxin A quinone
p21
cyclin-dependent kinase inhibitor 1 / CDK-interacting protein 1
p38
p38 mitogen-activated protein kinase
p53
protein 53 / tumor protein 53
PBS
phosphate buffered saline
PCP
pentaklórfenol
PEPCK
phosphoenolpyruvate carboxykinase
PGHS
prostaglandin H2 - szintáz
PI
propidium iodide
pKa
savi disszociációs állandó
QABCD
(2-hidroxi-3-N,N,N-trimetilamino)-propil-β-ciklodextrin-klorid
RLU
relative light unit
RNS
ribonukleinsav
RSA
rat serum albumin / patkány szérumalbumin
RSD
relative standard deviation / relatív szórás
SOD
szuperoxid-dizmutáz
TLC
thin layer cromatography / vékonyréteg-kromatográfia
TNFα
tumornekrózis-faktor α
7
I. Bevezetés Az Ochratoxin A (OTA) főként a Balkán régióban előforduló, elsősorban nefrotoxikus hatású mikotoxin, amely táplálék útján jut be a humán szervezetbe. Az expozíció ugyan különböző módszerekkel csökkenthető, de a toxin teljes eradikációja egyelőre lehetetlennek tűnik. Számos vizsgálat történt annak érdekében, hogy megértsük az OTA biokémiai viselkedését: in vitro és in vivo kísérletek eredményei alapján rengeteg elméletet ismerünk, azonban még napjainkban is kevés ténnyel rendelkezünk. Ennek oka talán a toxin rendkívül komplex hatásmechanizmusában rejlik. Az OTA a szervezetben számos anyaggal lép interakcióba, köztük ionokkal, különböző peptidekkel és fehérjékkel. Ezen kölcsönhatások között valószínűleg az egyik legjelentősebb a toxin kötődése albuminhoz, ami az OTA toxikokinetikájában komoly szereppel bír. Véleményem szerint az OTA molekuláris interakcióinak további vizsgálata indokolt, és szükséges ahhoz, hogy hatékony prevenciós stratégiát lehessen kidolgozni a toxinnal szemben. Értekezésemben röviden, de részletekbe menően be fogom mutatni az OTA toxikokinetikáját és toxikodinámiáját: melyek a fontosabb pontok, illetve mik a feltételezett/lehetséges hatásmechanizmusok az eddig publikált közlemények alapján. Emellett rámutatok arra, hogy az OTA toxikokinetikáját befolyásoló interakciók vizsgálata kulcsfontosságú. Bemutatom az általunk végzett vizsgálatokat: kompetitív interakciókat, OTA-albumin, OTA-kation és OTAciklodextrin kölcsönhatásokat, valamint sejtkísérleteket. Továbbá taglalom azok potenciális jelentőségét, illetve lehetséges hasznosíthatóságát.
8
II. Irodalmi áttekintés II. 1. Ochratoxin A: előfordulás, általános és fizikai-kémiai tulajdonságok Az Ochratoxinok elsősorban Penicillium és Aspergillus fajok szekunder anyagcseretermékei (van Der Merwe és mtsai 1965; Pohland és mtsai 1992) (1. ábra). Kémiai szerkezetük alapján Ochratoxin A, B és C toxinokat különböztetünk meg, ezek közül az Ochratoxin A (OTA) magasan a legtoxikusabb származék (2. ábra). Az OTA alapvázát egy dihidro-izokumarin molekula adja, amelyhez egy fenilalanin-struktúra kapcsolódik, amidkötésen keresztül. Emellett felfedezhető egy para-klórfenol molekularész is. Fehér, kristályos, szagtalan por, szerves poláris oldószerekben jól, míg vízben kevéssé oldódik. Főbb adatok, fizikai-kémiai mutatószámok: - összegképlet: C20H18O6NCl - IUPAC-elnevezés: L-phenylalanine-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo1H-2-benzopyran-7-yl)carbonyl]-(R)-isocoumarin - moláris tömeg: 403,82 g/mol - olvadáspont: 168-173 °C - savi disszociációs állandók (pKa): 4,2-4,4 (karboxilcsoport) és 7,0-7,3 (fenolos hidroxilcsoport). Főként a Balkán-félsziget emelhető ki, mint az OTA endémiás zónája, azonban világszerte kimutatható (Pohland és mtsai 1992). Az OTA elsősorban gabonafélékben, gyümölcsökben (pl. szőlő) fordul elő, amelynek következményeként jelen van az állati takarmányban is, így több szinten gyűrűzik be a táplálékláncba. Kimutatható mennyiségben jelen van pékárukban, kávéban, borban, sörben, hús- és tejtermékekben, de még tojásban is. Széles előfordulása és magas hőstabilitása miatt az OTA napjainkban is jelentős probléma (Duarte és mtsai 2009). Az Európai Unió (EC No. 123/2005) és az Egyesült Államok egyaránt maximálta a toxin mennyiségét az élelmiszerekben. Léteznek különböző eljárások, amelyek segítségével a kontamináció csökkenthető (Amézqueta és mtsai 2009; Ciconová és mtsai 2010). Ezek között értelemszerűen az aratás/szüretelés előtti megoldások a leghatékonyabbak, tehát a fungális infekció csökkentése, esetleg a gombák toxintermelésének mérséklése. Azonban óvatosnak kell lennünk, hiszen egyes vegyszerek amellett, hogy redukálják a gombaflórát, képesek fokozni azok toxintermelését. Mindenesetre az OTA teljes eradikációja a táplálékláncból a jelenleg ismert módszerekkel egyelőre lehetetlennek tűnik. 9
1. ábra: Az OTA bioszintézisének lépései. A gombák toxintermelése nagymértékben függ a környezeti hatásoktól (hőmérséklet, csapadék, stb.), alacsonyabb átlaghőmérsékletű régiók esetében elsősorban Penicillium fajok, míg melegebb vidékeken főként Aspergillus speciesek felelősek a toxintermelésért.
10
2. ábra: Az Ochratoxinok kémiai szerkezete. Az OTA-t felépítő fenilalanin-struktúrát kék, a dihidroizokumarin-vázat piros, a lazított hidrogénatomokat pedig lila színnel jelöltük. A kevésbé toxikus származékok esetében a szerkezeti eltéréseket zöld színnel jeleztük: az Ochratoxin B (OTB) nem tartalmaz klór-szubsztituenst, míg az Ochratoxin C (OTC) esetében a karboxilcsoporthoz egy etilszubsztituens kapcsolódik észterkötésen keresztül.
II. 2. Toxikokinetika A toxin enterális úton jut a szervezetbe, orális biohasznosulása rendkívül magas, emberben 93% (Studer-Rohr és mtsai 2000). A vérkeringésbe jutva nagy affinitással kötődik szérumalbuminhoz, ez a fő oka az OTA rendkívül hosszú plazmafelezési idejének. Az OTA alacsony koncentrációban van jelen a vérben: egészséges populációkban az átlagos szérumszint 0,25-5 nmol/liter, de endémiás zónákban ez meghaladhatja akár a 100-150 nmol/litert is (Radic és mtsai 1997; Peraica és mtsai 1999; Özcelik és mtsai 2001; Lino és mtsai 2008). A toxin elsődleges célszerve a vese, főként vizelettel ürül ki a szervezetből.
II.2.1. Abszorpció Az előző részben leírt pKa-értékek jól tükrözik, hogy az OTA fiziológiás pH-n monoanion (OTA-) és dianion (OTA2-) formában van jelen. A nemionos forma csak savas közegben fordul elő, például a gyomorban. A korábban publikált állatkísérletek alapján a nemionos és monoanion forma szívódik fel a gyomorból, valamint a jejunumból passzív módon (Galtier 1978; Kumagai és Aibara 1982; Roth és mtsai 1988). Továbbá in vitro duodenális
11
felszívódást modellező vizsgálatok igazolták, hogy az apikális → bazolaterális irányba történő transzport a domináns, valamint arra utalnak, hogy a H+-dipeptid-kotranszporter, organikus anion transzpoter (OAT) és az organikus anion transporting polipeptid (OATP) nem játszanak szerepet a toxin bélből történő abszorpciójában (Berger és mtsai 2003). Emellett fontos megemlíteni, hogy az OTA a multidrog-rezisztens transzporterek közé tartozó MRP2 szubsztrátja, amely újabb eredmények alapján gátolhatja a toxin felszívódását, mivel az apikális oldalra történő efflux-mechanizmus limitálja az OTA abszorpcióját (Berger és mtsai 2003). A felszívódó toxin mennyisége specieszenként jelentős eltérést mutat, sertésben 66%, rágcsálókban még ennél is alacsonyabb (Galtier és mtsai 1981).
II.2.2. Disztribúció II.2.2.1. Kötődés plazmaalbuminhoz Miután a toxin a véráramba jut, több mint 99%-ban szérumfehérjékhez, nagyrészt albuminhoz kötődik, ami facilitálja a nemionos forma passzív abszorpcióját. Főként a rendkívül erős albuminkötődés eredményezi az OTA hosszú féléletidejét a szervezetben: a toxin plazmafelezési ideje emberben a leghosszabb, cirka 1 hónap (Hagelberg és mtsai 1989; Studer-Rohr és mtsai 2000). Az erythrocyták csak nyomokban tartalmaznak OTA-t (Galtier 1978). Egy albumin-deficienciás patkányokkal végzett kísérlet kiválóan demonstrálta az albumin hatását az OTA toxikokinetikájára: 20-70-szer magasabb volt az OTA vizelettel történő exkréciója, mint normál patkányok esetében (Kumagai 1985). A gyors elimináció limitálhatja a célsejtek (főként a vese és a máj) általi toxinfelvételt. Mivel világossá vált, hogy az albumin milyen jelentős szerepet játszik az OTA toxikokinetikai viselkedésében, számos vizsgálat történt annak érdekében, hogy pontosabban karakterizálják az interakciót. Fény derült arra, hogy az OTA főként dianion formában kötődik humán szérumalbuminhoz (HSA), és az elsődleges kötőhely a IIA aldoménen (Sudlow’s Site I) helyezkedik el (Il’ichev és mtsai 2002a,b; Perry és mtsai 2003, 2004). A másodlagos kötőhely a IIIA aldoménen (Sudlow’s Site II) található, de ennek affinitása jelentősen elmarad az elsődlegesétől, ezért ennek biológiai relevanciája valószínűleg elhanyagolható. Az elsődleges kötőhely szinte teljesen egybeesik a szintén kumarin-vázzal rendelkező orális antikoaguláns warfarinéval (Il’ichev és mtsai 2002c). Az izokumarin szerkezeti rész az A291, L238, I260, I264, I290, R257 és S287 aminosavak mentén elhelyezkedő apoláris zsebben lokalizálódik (röntgenkrisztallográfiás vizsgálatok hasonló eredményt mutatnak a warfarin esetében is). A fenilcsoportot a K199, H242, Y211, L238 és W214 aminosavak veszik körbe. A karbonil- és a fenolos hidroxil12
csoportok oxigénjei R257, a karboxilcsoport R218 és/vagy R222 felé orientálódik (3. ábra). Módosított albuminnal végzett kísérletek is megerősítették az R257-es és az R218-as argininek kitüntetett szerepét az interakcióban. Az R257-es arginin képes deprotonálni a fenolos hidroxilcsoportot, így a HSA a toxinnal egy rendkívül stabil ion-párt képez (Perry és mtsai 2004), ez kiválóan magyarázza, hogy miért az OTA dianion formája preferált az albumin-kötődésben. A fluoreszcens mérésekből számolt kötési állandók rámutatnak arra is, hogy az OTA-HSA komplex stabilitása elképesztően magas: az asszociációs konstans meghaladja a 107 liter/mol-os értéket, összehasonlításként ez kb. százszor magasabb kötési affinitást jelent, mint amit a warfarin esetében állapítottak meg (Poór és mtsai 2012, 2013a, 2013c, 2014, Li és mtsai 2014). Néhány vizsgálat arra utal, hogy vannak a szérumban egyéb, az albuminnál kisebb méretű fehérjék, amelyek szintén képesek kötni az OTA-t: 20 kDa méretű proteineket mutattak ki humán és sertés szérumban, amelyek még az albuminnál is stabilabb komplexet képeznek a toxinnal (Stojković és mtsai 1984, Schwerdt és mtsai 1999). Ezek mennyisége ugyan alacsony, azonban az ilyen méretű proteinek képesek a glomeruláris filtrációra, így akár a toxin patomechanizmusában is szerepet játszhatnak.
3. ábra: Az OTA2- legalacsonyabb energiájú konformerének kötődése a humán albuminhoz (forrás: Perry és mtsai 2004). Az apoláris zseb körüli, kötésben involvált aminosavak zöld színnel jelöltek.
13
II.2.2.2. Enterohepatikus körforgás Több állatkísérletes tanulmány számol be főként rágcsálók kapcsán az OTA enterohepatikus körforgásáról (Kumagai és Aibara 1982; Roth és mtsai 1988; Fuchs és mtsai 1988; Sreemannarayana és mtsai 1988). Mindegyik esetben szekunder disztribúciót írnak le, mind a vérszint, mind a béltartalom esetében, mivel a bélbe történő biliáris szekréciót reabszorpció követi. Egerekben a toxin konjugált formájának szekrécióját mutatták ki, amely feltehetően a mikroflóra általi hidrolízist követően szívódik vissza (Roth és mtsai 1988). Az OTA enterohepatikus körforgása kedvez a toxin szisztémás redisztribúciójának a különböző szövetekben. II.2.2.3. Szöveti megoszlás Állatokban az OTA szöveti megoszlása species-függő és nagyban befolyásolja a toxin mennyisége, az adagolás módja, továbbá fontos szempont az egészségi állapot és a táplálék összetétele is melyben az OTA elfogyasztásra kerül. Abban azonban az eddigi tanulmányok egyetértenek, hogy a vese és a máj a fő célszervek (Ferrufino-Guardia és mtsai 2000; Madsen és mtsai 1982; Mortensen és mtsai 1983; Hald 1991). Emellett a toxin jelen van izom- és zsírszövetben, továbbá kimutatható az agy több régiójában is (Belmadani és mtsai 1998). Mindenesetre az OTA féléletideje még mindig a vérben a leghosszabb (Hagelberg és mtsai 1989; Studer-Rohr és mtsai 2000; Li és mtsai 1997). A vese és a máj kiemelt szerepe talán azzal magyarázható, hogy e két célszerv specializált transzporttal képes fölvenni az OTA-t: vese esetében az OAT-t, míg májsejteknél az OATP-t azonosították felelősként a toxinfelvételért (Jung és mtsai 2001; Kontaxi és mtsai 1996). Továbbá patkányokban kimutatták, hogy alacsony dózisú OTA hatására több OAT izotípus expressziója is megnő a vesében (Zlender és mtsai 2009). Érdemes megemlíteni, mint egyéb lehetséges okot, hogy proximális tubulus-sejtekben kimutattak egy 62 kDa méretű OTA-kötő proteint, amely kis mennyiségben van jelen, de részben felelős lehet a toxin szöveti akkumulációjáért (Schwerdt és mtsai 1999). A toxin valószínűleg aktív transzporttal jut át a placentán: emberben a fötális szérumban az OTA-koncentráció kétszerese az anyáénak, valamint a placentában is magasabb volt a koncentráció az anya vérszintjéhez viszonyítva (Zimmerli és Dick 1995; Miraglia és mtsai 1998). In vitro eredmények arra utalnak, hogy a hOAT4 szerepet játszhat a placentáris transzportban (Cha és mtsai 2000).
14
II.2.3. Metabolizmus Az OTA metabolizmusa igen összetett, mind fázis I, mind fázis II típusú reakciók involváltak benne (4. ábra). Nagy részük alacsonyabb toxicitású metabolitokat eredményez, azonban egyes esetekben a toxikus aktiváció lehetősége is felmerült. Számos korábbi tanulmány igazolja, hogy a gasztrointesztinális traktusban az OTA egy része a jóval kevésbé toxikus Ochratoxin α-ra (OTα) hidrolizál. Fény derült arra is, hogy a karboxipeptidáz A, a tripszin, az α-kimotripszin és a katepszin C enzimek egyaránt képesek az OTA-t hasítani OTα-ra (Pitout 1969; Doster és Sinnhuber 1972). Az, hogy a folyamat nagy része a vastagbélben valamint a végbélben megy végbe, továbbá, hogy a mértéke antibiotikumokkal hatékonyan gátolható, arra utal, hogy a mikroorganizmusok fontos szerepet játszanak a hidrolízisben (Madhyastha és mtsai 1992a; Hoehler és mtsai 1999). A hidrolízis mértéke nagyban függ az étrendtől, mindemellett egyéb szövetekben alacsonyabb a jelentősége (Suzuki és mtsai 1977, Kanisawa és Suzuki 1978; Stormer és mtsai 1983; Hansen és mtsai 1982; Galtier és mtsai 1979). Egy másik lehetőség a hidrolízisre, hogy bázikus körülmények között a laktongyűrű felnyílik, amely az 5. ábrán látható struktúrát, az LO-OTA-t (lactone-opened OTA) eredményezi (Xiao és mtsai 1996a). Az LO-OTA egy magas toxicitású, lassan kiürülő származék, celluláris hatásmechanizmusa jelenleg ismeretlen, azonban patkányokban már kimutatták ezt a típusú metabolitot is (Li és mtsai 1997, 2000). Az OTA mikroszomális oxidációjának egyik terméke a 4-hidroxi-OTA (4-OH-OTA), amelynek toxicitása alacsonyabb az OTA-énál (Stormer and Pederson 1980; Stormer és mtsai 1981; Oster és mtsai 1991; Hutchinson és mtsai 1971; Creppy és mtsai 1983). A másik gyakran előforduló metabolit a 10-hidroxi-OTA (10-OH-OTA), ennek toxicitása is lényegesen elmarad az anyavegyületétől (Xiao és mtsai 1996b; Zepnik és mtsai 2001; Pinelli és mtsai 1999; El Adlouni 2000). A fázis I típusú biotranszformációs reakciók feltehetően főként CYP-enzimek révén mennek végbe (Ringot és mtsai 2006). Egyes tanulmányok szerint az OTA deklorinációt követően OTB-vé (Ochratoxin B) is metabolizálódhat, az OTB jelentősen alacsonyabb toxicitását számos vizsgálat igazolta (Grosse és mtsai 1995; Chu és mtsai 1972; Kasmuller és mtsai 2004).
15
4. ábra: Az Ochratoxin A főbb metabolikus termékei.
5. ábra: Balra a LO-OTA, jobbra az OTA hexóz/pentóz konjugátumának kémiai szerkezetét tüntettük föl.
16
Az OTA fázis II reakciói között megemlíthető a szulfát (Roth és mtsai 1988), glükuronid (Kühn és mtsai 1995), pentóz/hexóz (5. ábra) (Gross-Steinmeyer és mtsai 2002; Zepnik és mtsai 2003) és glutation (Malaveille és mtsai 1994; Dai és mtsai 2002) konjugáció is. Ezek többsége valószínűleg detoxifikációs lépés; azonban glutation esetében a vélemények megoszlanak: a detoxikációs hatása mellett a ROS-produkció fokozódásában is szerepet játszhat, ezt a II.3-as részben bővebben tárgyaljuk.
II.2.3. Exkréció II.2.3.1. Renális exkréció Az OTA roppant erős plazmafehérje-kötődése miatt a toxin glomeruláris filtrációja alacsony. Tubuláris szekrécióval ürül vizeleten keresztül, azonban a vese összes szakaszán számolni kell reabszorpcióval is. Ezek a folyamatok főként carrier-mediáltak, amelyekben számos transzporter vehet részt. Több in vitro és in vivo kísérlet is arra utal, hogy az OTA transzportjában a különböző organikus anion transzporterek kulcsszerepet játszanak (Gekle és Silbernagl 1994; Groves és mtsai 1998, Kusushura és mtsai 1999). Az OAT1 gátlása piroxikámmal vagy para-aminohippursavval a nefrotoxikus tünetek csökkenését eredményezi (Tsuda és mtsai 1999). Humán hOAT1 (főként vesében fordul elő) és hOAT3 (elsősorban máj- és agyszövetre jellemző) transzporterek közreműködését is leírták (Jung és mtsai 2001). Továbbá több közlemény említi a H+-dipeptid-kotranszportert is, mint lehetséges résztvevőt a toxin reabszorpciójában (Dahlman és mtsai 1998; Zingerle és mtsai 1997; Schwerdt és mtsai 1997). Az OTA egy része feltehetően facilitált diffúzióval hagyja el a vesesejteket, de MRP2 és hOAT4 transzporterek is involváltak lehetnek az efflux-mechanizmusokban (Bahnemann és mtsai 1997; Leier és mtsai 2000; Babu és mtsai 2002). In vivo kísérletek igazolják, hogy a toxin a nefron összes szakaszából képes felszívódni és a reabszorpció sok esetben nem mutat pH-függést (Dahlman és mtsai 1998). A reabszorpció a proximális egyenes csatorna és a Henle-kacs felszálló szára esetében pH-független, tehát a transzportnak carrier-mediáltnak kell lennie. A disztális tubulus és a gyűjtőcsatorna esetében főként a nem-ionos forma passzív diffúziója lehet a fő uptake mechanizmus. A filtrált és szekretált OTA folyamatos reabszorpciója is szerepet játszhat a toxin akkumulációjában.
17
II.2.3.2. Fekális exkréció Mind az OTA, mind metabolitja, az OTα fekális exkréciójával is számolni kell. A széklettel történő kiválasztás legjelentősebb részéért a biliáris exkréció felelős (Kumagai és Aibara 1982; Roth és mtsai 1988; Fuchs és mtsai 1988). Emellett az intestinális szekréciónak is lehet szerepe, ez történhet például MRP2 transzporter által, ami feltehetően az OTA-ra és annak konjugátumaira is igaz (Sreemannarayana és mtsai 1988; Berger és mtsai 2003; Suzuki és mtsai 1977; Nip és Chu 1979; Xiao és mtsai 1991). II.2.3.3. Exkréció tejben A toxin koncentrációját a plazmaszinthez viszonyítva (tej/plazma koncentráció arány) 0,1 és 0,7 között állapították meg, fajtól és különböző körülményektől függően (Galtier és mtsai 1977; Breitholtz-Emanuelsson és mtsai 1993a). Tehéntej esetében dózisfüggő, heterogén eredményeket publikáltak (Ribelin és mtsai 1978). Svédország különböző területeiről gyűjtött tejminták 14%-ában jelen volt az OTA, de OTα-t nem detektáltak (Breitholtz-Emanuelsson és mtsai 1993b). Több esetben is kimutattak OTA-t humán anyatejben, a toxin koncentrációja rendkívül nagy fluktuációt mutat (Gareis és mtsai 1988; Micco és mtsai 1995), de igazolták a korrelációt a toxinbevitel és a tejben exkretált OTA koncentrációja között (Skaug és mtsai 2001). Egy újabb humán vizsgálat arra figyelmeztet, hogy az OTA koncentrációja az anyatejben a szülést követő első napokban a legmagasabb (Muñoz és mtsai 2014): ilyenkor akár 10-15 ng/testtömeg kg/nap is lehet a csecsemők anyatejjel történő toxin expozíciója (később ez kb. 5 ng/testtömeg kg/napra csökken). A toxin kimutatható mennyiségben jelen lehet még a csecsemők vizeletében is.
II. 3. Toxikodinámia Jelenlegi ismereteink alapján az OTA a Balkán Endémiás Nefropátia (BEN) egyik fő okozója, de emellett számos egyéb toxikus hatását is leírták (Ringot és mtsai 2006; Pfohl-Leszkowicz és Manderville 2012). A BEN egy 6-10 éves progressziójú tubulointersticiális nefropátia. Amellett, hogy a betegséggel kapcsolatban felmerült az arisztolochiasav, a szelénhiányos táplálkozás, valamint bizonyos genetikai tényezők szerepe is, az OTA-t tartják az egyik fő felelősnek (Pfohl-Leszkowicz 2009). Ennek okai: - a betegség patomechanizmusa hasonlít a sertés nefropátiára, amit szintén az OTA okoz, - az OTA endémiás régióiban (6. ábra) a toxinkoncentráció több százszorosa is lehet a normál szintnek; a nefropátiás betegekben az OTA koncentrációja magas,
18
- az OTA endémiás zónáiban a BEN incidenciája 150-szerese a nem-endémiás zónákban (Balkán régió) tapasztaltakhoz képest, - az OTA egyes endémiás régióiban a lakosság akár több, mint 5%-a is érintett lehet. Felmerül a kérdés, hogy a maradék 95%-nál miért nem okoz látszólag problémát a relatíve magas toxinexpozíció. Ennek oka lehet genetikai természetű vagy egyszerűen az életmód/táplálkozás; erre jelenleg nem tudunk biztos választ adni. A BEN mellett az OTA karcinogén sajátsága is egyre inkább igazoltnak látszik. A húgyúti tumorok előfordulása 90-szerese Bulgária endémiás zónáiban, a nem-endémiás területekhez viszonyítva (Chernozemsky 1991). Az OTA-t az IARC (International Agency for Research on Cancer) a 2B alcsoportba, azaz a potenciális humán karcinogének közé sorolja (IARC 1993). Az NCI/NTP (National Cancer Institute/Natianal Toxicological Program) tanulmánya alapján az OTA a valaha vizsgált legpotensebb renális karcinogének közé tartozik rágcsálókban (Boorman 1989). Az NTP vizsgálatai alapján a toxin iniciátor és promóter szerepet is betölthet a tumorképződésben (Kuiper-Goodman és mtsai 2010). Továbbá a húgyúti hatások mellett egyes szerzők a gasztrointesztinális traktusban előforduló tumorokkal is kapcsolatba hozták az OTA-t Kína egyes területein (Cui és mtsai 2010).
6. ábra: Az OTA főbb endémiás zónái a Balkán régióban (forrás: Tatu és mtsai 1998). Jól megfigyelhető, hogy az érintett területek (lila) víz közelében fordulnak elő. A nefrotoxicitáson és karcinogenitáson túl hepatotoxikus, neurotoxikus, immunotoxikus és teratogén hatásokról is beszámol a szakirodalom (Ringot és mtsai 2006). Mivel az OTA hatása rendkívül komplex, a pontos hatásmechanizmust jelenleg nem ismerjük. Számos 19
elmélet létezik az toxin patomechanizmusával kapcsolatban; az eddigi sejt- és állatkísérletes eredményeket alább összegezzük. II.3.1. Proteinszintézis gátlása Számos sejt- és állatkísérlet mutatott rá, hogy az OTA képes gátolni a proteinszintézist. Mivel a toxin fenilalanin szerkezeti részt tartalmaz, felmerült, hogy a háttérben kompetitív interakciók állhatnak a fenilalanin és az OTA között. Eleinte ezt feltételezték fenilalanil-tRNS-szintáz esetében is, miután kimutatták, hogy az OTA képes gátolni az enzimet (Creppy és mtsai 1984; Dirheimer és Creppy 1991). További vizsgálatok azonban rávilágítottak, hogy az izokumarin-struktúra fontosabb szerepet játszik az interakcióban. Amellett, hogy a gátlás fenilalanin hozzáadásával nem ellensúlyozható, a kumarin szerkezei rész kisebb módosítása is jelentősen befolyásolja a hatás mértékét (Bruinink és mtsai 1997; Bruinink és Sidler 1997). Docking kísérletek szintén a kumarin-rész fontos szerepét igazolták, sőt a konklúzió szerint a fenilalanin-struktúra valószínűleg nem is szükséges a gátlás eléréséhez (McMaster és Vedani 1999). Az OTA a fenilalanil-tRNS-szintáz mellett a fenilalanin-hidroxiláz enzimet is képes gátolni. Úgy tűnik, hogy a toxin hamis szubsztrátként viselkedik, hiszen fenilalanin helyett tirozint tartalmazó OTA-t mutattak ki in vivo (Creppy és mtsai 1990). Ebben az esetben a fenilalaninrész esszenciális az interakcióhoz, mivel az OTα nem képes gátolni az enzimet (Richardson és Fisher 1993). Az OTA fenilalanin szerkezeti része mind az aktivációs, mind a szubsztrátkötő helyet képes okkupálni. Érdekes, hogy egy patkánykísérletben a fenilalanin-hidroxiláz erős gátlása volt kimutatható a májban, emellett vesében nem tapasztalták az említett hatást (Zanik-Grubisic és mtsai 2000). Az előző két esetben nem-specifikus fehérjeszintézis-gátlásról beszéltünk, azonban fontos megemlíteni azt is, hogy az OTA módosíthatja különböző fehérjék expresszióját is, ami specifikus hatásokat is eredményezhet (Vettorazzi és mtsai 2013).
II.3.2. Celluláris energiaprodukció gátlása Az OTA negatív hatása a fehérjeszintézisre több intracelluláris enzim mennyiségének csökkenését is eredményezheti. Többek között ez is lehet az oka például a foszfoenolpiruvátkarboxikináz (PEPCK) aktivitáscsökkenésének, ami a glükoneogenezis egyik kulcsenzime (Meisner és Meisner 1981; Meisner és Krogh 1986). Később arra is fény derült, hogy az OTA már mRNS-szinten beavatkozik az enzim expressziójába (Meisner és Polsinelli 1986; Thekkumkarra és Patel 1989). 20
A mitokondriális diszfunkció az OTA toxicitásának egy korai jele (Aleo és mtsai 1991). A morfológiai eltérések mellett a mitokondriális membránpotenciál csökkenése és a légzési láncra gyakorolt negatív hatás figyelhető meg (Suzuki és mtsai 1975; Sorrenti és mtsai 2013). A toxin által eredményezett ATP-depléció fő okai feltehetően a foszfát-transzport, valamint az elektrontranszport-lánc gátlása lehetnek (Meisner és Chan 1974; Wei és mtsai 1985).
II.3.3. Genotoxikus hatás – DNS-adduktok képzése Számos kísérlet utal arra, hogy az OTA bioaktivációt követően genotoxikus hatással bír. A bioaktivációs elmélet lényege, hogy a toxinból elektrofil származék képződik, amely kovalensen kötődik a DNS-hez, aminek eredménye mutagenitás és tumor-formáció. A teóriák alapja főként a strukturális hasonlóságra épít a pentaklórfenollal (PCP). A lehetséges mechanizmusokat a 7. ábrán foglaltuk össze. A PCP-ból CYP450 által közvetített oxidatív deklorinációt követően kinoidális struktúra képződik, amely ezt követően képes kovalensen kötődni például szulfhidril-csoportokhoz, továbbá 2’-deoxiguanozin- (dG) vagy más DNS-adduktok képződéséhez vezethet (Waidyanatha és mtsai 1996; Nguyen és mtsai 2005; Vaidyanathan és mtsai 2007). Az OTA CYP450 okozta oxidációja során keletkező OTA-kinonból (OTQ) a detoxikáció során GSHkonjugátum, vagy aszkorbát-dependens redukció során OTA-hidrokinon (OTHQ) képződhet (Dai és mtsai 2002; Gillman és mtsai 1999). Az OTHQ-t patkányok és emberek vizeletében egyaránt kimutatták (Mally és mtsai 2004; Manderville és Pfohl-Leszkowicz 2008; PfohlLeszkowicz 2009). Egy másik elmélet szerint peroxidáz aktivitású enzimek révén az OTA-ból fenoxi-gyök képződik (Samokyszyn és mtsai 1995). Glutation jelenlétében a fenoxi-gyök visszaalakulhat OTA-vá, azonban eközben szuperoxid gyök-anion (O2˙¯) keletkezik (Murray és mtsai 2007; Stoyanovosky és mtsai 1996). A O2˙¯ pedig Fenton-reakciót indukálhat (mivel a szuperoxid gyök anionból SOD-katalizált reakcióban hidrogén-peroxid képződik), amelynek terméke hidroxilgyök (OH˙) lesz, ami szintén DNS-károsodáshoz vezethet. Ez a mechanizmus magyarázattal szolgálna arra is, hogy sejtkísérletek során hogyan depletálja a GSH-t az OTA (Kamp és mtsai 2005). Emellett számolni kell annak a lehetőségével is, hogy a fenoxi-gyök direkt módon C8-deoxiguanozin-adduktot (C8-dG) képez, ahogy ezt már korábban leírták PCP esetében is (Dai és mtsai 2003a; Dai és mtsai 2005). Az OTA elektrokémiai oxidációjából nyert eredmények arra utalnak, hogy a toxin esetében a fenoxi-gyök képződése valóban végbemehet hasonlóan a PCP-hez (Calcutt és mtsai 2001). 21
7. ábra: Az OTA bioaktivációs reakciói elektrofil származékok keletkezéséhez vezethetnek, amelynek eredménye kovalens DNS-adduktok képződése. A reduktív deklorináció szintén reaktív tulajdonságú aril-gyököket eredményezhet (Mohn és Kennedy 1992). Ez pedig purinbázisok C8-típusú adduktjainak képződéséhez vezet (Lawson és mtsai 1995; Hiramoto és mtsai 1995; Gannett és mtsai 1999). De egyéb reduktív hatású anyagok is eredményezhetik az aril-gyök keletkezését OTA-ból, ami szintén összefügghet a C8-dG-adduktok formációjával. Emellett meg kell jegyezni, hogy az aril-gyök reakciója hidrogéndonorral OTB képződéséhez is vezethet. A potenciálisan képződő dG-adduktok kémiai szerkezetét a 8. ábra mutatja be. Az OTA fotoreakciója dG mellett, valamint az OTA és dG reakciója Fe2+ vagy torma-peroxidáz/H2O2 jelenlétében C-kapcsolt C8-dG-adduktot (C-OTB-dG) eredményezett, ezt NMR-rel és tömegspektrometriával (MS) is igazolták (Dai és mtsai 2003b). A C-OTB-dG-addukt képződhet mind fenoxi-, mind aril-gyök közvetítésével. Emellett szintén MS-technikával kimutatták, hogy az OTA fotolízise által keletkező fenoxi-gyökből O-kapcsolt C8-dG-addukt (O-OTAdG) is képződhet (Il'ichev és mtsai 2001; Faucet és mtsai 2004). Végül a harmadik lehetséges származék az OTHQ-dG-addukt (Dai és mstai 2002; Manderville és Pfohl-Leszkowicz 2008), amely az OTHQ dG-nal történő fotoreakciójának a terméke (mivel az OTHQ fotolízisével OTQ képződik).
22
8. ábra: A lehetséges OTA-dG-adduktok kémiai szerkezete. Számos in vitro és in vivo kísérletet végeztek el főként izotóp (32P) és LC-MS-technikákkal, hogy igazolják vagy cáfolják az adduktok jelenlétét. A vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy főként a C-OTB-dG-addukt fordul elő (Mantle és mtsai 2010). Azonban az addukképződés jelenleg is vita tárgyát képezi: a vizsgálatok egy részében egyértelmű bizonyítékot találtak, míg egyéb kísérletekben képtelenek voltak DNS-adduktokat kimutatni, reprodukálni a pozitív eredményeket (Manderville 2005; Tozlovanu és mtsai 2006; Dai és mtsai 2004; Mally és mtsai 2005; Delatour és mtsai 2008).
II.3.4. Oxidatív/nitrozatív stressz indukciója A korábbiakban publikált tanulmányok egyetértenek abban, hogy az OTA megemelkedett szabadgyök-szinteket eredményez in vitro és in vivo egyaránt. A hatásmechanizmus azonban már komoly fejtörést okoz, hiszen tucatnyi elmélet létezik a témával kapcsolatban. A toxin által eredményezett megemelkedett ROS-termelődést és az oxidatív eredetű DNS-károsodást számos vizsgálat igazolta (Hoehler és mtsai 2006, 2007; Gautier és mtsai 2001; Schaaf és mtsai 2002; Kamp és mtsai 2005). Az oxidatív DNS-károsodásra indirekt módon utal a pozitív Comet-esszé, továbbá 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanozin-adduktokat (8-O-dG) is sikerült kimutatni, ami az oxidatív károsodás egyik jellemző biomarkere (Shigenaga és mtsai 1989). 23
Az előző részben tárgyalt bioaktivációs termékek is szerepet játszhatnak a megemelkedett ROS-képződésben, mivel mindegyikük: az OTHQ, az aril-gyök és a fenoxi-gyök képződése is O2˙¯ termelődését eredményezheti (7. ábra). In vitro és in vivo vizsgálatok egyaránt arra utalnak, hogy az OTA-indukált lipidperoxidáció történhet szimultán NADPH- és aszkorbát-dependens módon is, Fe3+ iont használva kofaktorként. Az OTA-Fe3+ komplex képződése facilitálja a Fe3+ redukcióját NADPHCYP450 reduktáz jelenlétében. A képződő OTA-Fe2+ komplex szabadgyökök formációjához vezet, aminek az eredménye lipidperoxidáció és DNS-károsodás (Rahimtula és mtsai 1988; Omar és mtsai 1990) (9. ábra).
9. ábra: Az OTA-indukált lipidperoxidáció feltételezett mechanizmusa Fe3+ és NADPHCYP450 reduktáz jelenlétében. Újabb vizsgálatok alapján a Zn2+ is szerepet játszhat az OTA hatásmechanizmusában, pontosabban a sejtek toxicitás elleni védekezésében. A toxin képes depletálni az intracelluláris cinket, valószínűleg cink-transzporterekre és metallotioneinekre kifejtett hatások révén (Ranaldi és mtsai 2009). Májsejtek esetében kimutatták, hogy az OTA jelentősen növeli a ROS-szintet és több metallotionein expresszióját, valamint csökkenti a szuperoxid-dizmutáz (SOD) aktivitását és a kataláz (CAT) mRNS expresszióját (Zheng és mtsai 2013). Zn2+-szupplementációval a ROS-koncentráció és az általa eredményezett oxidatív eredetű DNS-károsodás jelentősen enyhíthető volt in vitro, továbbá a Zn2+ a SOD aktivitását is fokozta. Emellett OTA-kezelés hatására a sejtek antioxidáns védelmének redukciójával kell számolni: azon túl, hogy a SOD aktivitása csökken, alacsonyabb az AP-1 (aktivátor protein 1) valamint a Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2) aktivációja, amelyek többek között a glutation-S-transzferáz (GST) transzkripciójának szabályozói (Marin-Kuan és mtsai 2006; 24
Cavin és mtsai 2007; Boesch-Saadatmandi és mtsai 2008). Ennek fényében nem meglepő, hogy a GST szintjének szignifikáns csökkenését is kimutatták. Újabb vizsgálatok arra utalnak, hogy az OTA gátolja az Nrf2 fehérje expresszióját, az Nrf2 transzlokációját a sejtmagba, valamint a DNS-hez való kötődését is (Limonciel és Jennings 2014). Végül fontos megemlékezni arról, hogy a reaktív nitrogénszármazékok mennyisége is megemelkedhet a toxinkezelést követően. Mivel az OTA hatására az iNOS (indukálható nitrogén-monoxid-szintáz) expressziója, továbbá a DDAH (dimetilarginin-dimetilaminohidroláz) expressziója és aktivitása emelkedik, fokozódik a nitrogén-monoxid (NO˙) szintézis, valamint nő a nitrit/nitrát-szint (Cavin és mtsai 2009; Sorrenti és mtsai 2013). A megnövekedett NO˙-koncentráció nitrozatív stresszt indukálhat, mivel O2˙¯ hatására peroxinitrit-anion (ONOO¯) képződhet, ami pedig nitrogén-dioxid (NO2˙) és hidroxilgyök (OH˙) termékek képződését eredményezi. II.3.5. Ca2+-homeosztázis felborítása Valószínűleg az OTA által okozott lipidperoxidáció hatására megnő a plazmamembrán permeabilitása kálciumionok iránt, így megemelkedik a Ca2+-influx, valamint az intracelluláris raktárakból is felszabadulhat Ca2+ (Khan és mtsai 1989; Dopp és mtsai 1999). Egyéb eredmények arra utalnak, hogy vesesejtek esetében az alacsony dózisú OTA képes növelni az ATP-függő Ca2+-csatornák aktivitását az endoplazmatikus retikulumban (Chong és Rahimtula 1992). Hoehler és munkatársai szerint azonban a jelenség a sejtkárosodás egyik korai jele; a megemelkedett intracelluláris kalciumszint és az OTA jelenléte eredményezhetik az oxidatív foszforiláció szétkapcsolódását, ami pedig csökkent ATP-szintézist és fokozott ROS-produkciót okoz (Hoehler és mtsai 1996, 1997). További vizsgálatok rámutattak, hogy az OTA már nanomoláris koncentrációban is negatívan befolyásolja a Ca2+- és cAMPhomeosztázist,
így
interferálva
a
hormonális
kálcium-jelátvitellel,
ami
módosult
sejtproliferációt eredményez (Benesic és mtsai 2000). Továbbá annak is felmerült a lehetősége, hogy a sejtek zsugorodása lehet az oka az emelkedett intracelluláris kalciumszintnek. Egy következő tanulmány rávilágított arra, hogy az OTA irreverzibilisen kötődik az aktin-filamentumokhoz, így idő- és koncentrációfüggő módon sejtzsugorodást és a filamentumok depolarizációját okozza (Dopp és mtsai 1999). Az OTA aktinkötődése pedig a mikrofilamentumok rövidülését és aggregációját vonja maga után. Ez a hatás azonban nem mutatott korrelációt a felborult Ca2+-homeosztázissal. Mivel a citoszkeletális hatás N-acetilciszteinnel
(NAC)
ellensúlyozható,
feltehetően
egyes
kritikus
szulfhidril-csoportok
oxidációjára vezethető vissza a folyamat. 25
II.3.6. Apoptózis és jelátvitel hatások Az OTA által eredményezett sejthalál oka lehet apoptózis és nekrózis egyaránt, ezekről számos in vitro és in vivo tanulmány is beszámol (Albassam és mtsai 1987; Wei és Sulik 1993; Atroshi és mtsai 2000; Gekle és mtsai 1998; Schwerdt és mtsai 1999). Már nanomoláris toxin-koncentrációk esetében is kimutatták az apoptózis gyakori jellemzőit: mint például a DNS-fragmentációt, a kromatin-kondenzációt és az emelkedett caspase-3-aktivitást (Schwerdt és mtsai 1999; Gekle és mtsai 2000). Később cDNS-microarray technikával végzett vizsgálatok rámutattak annak lehetőségére, hogy az apoptózis oka az OTA hatására módosult génexpresszió (Lühe és mtsai 2003). Mégpedig olyan gének kifejeződésének változása, amelyek szerepet játszanak a DNS-károsodás okozta tumorképződésben (GADD153, GADD45) vagy az apoptózis szabályozásában (clusterin). További kísérletek eredményei alapján arra a következtetésre jutottak, hogy az apoptózis független a mitokondriális membránpotenciáltól és a cytochrom c kiáramlásától, azonban korrelációt mutattak az intracelluláris pH-val, valamint a caspase-3-aktivitással (Horvath és mtsai 2002; Schwerdt és mtsai 2004). Emellett patkány-hepatocytákban az OTA hatására történő MAPK-, ERK- és p38-aktivációt figyeltek meg (Horvath és mtsai 2002). JNK-aktivációt is leírtak vesesejtekben (Gekle és mtsai 2000; Sauvant és mtsai 2005). A felsorolt jelátviteli utak szerepet játszhatnak az apoptózis-indukcióban. Az OTA képes volt modulálni különböző komplement regulátorfehérjék működését is, mint példáil a CD46, CD55 és CD59, amelyek hatással vannak a membránintegritásra, sejtviabilitásra és a sejtproliferációra is (Müller és mtsai 2003). Az, hogy az OTA apoptotikus vagy nekrotikus hatást közvetít, feltehetően a koncentrációtól függ (Sauvant és mtsai 2005). Elképzelhető, hogy az oxidatív károsító hatás is szerepet játszik a sejthalálban, ez jelenleg nem tisztázott (Atroshi és mtsai 2000; Petrik és mtsai 2003). Más kísérletekben emelkedett TNFα- és IL-6-szinteket tapasztaltak OTAkezelést követően patkánymáj-perfuzátumban (Al-Anati és mtsai 2005; Weidenbach és mtsai 2000), az NFκB (nuclear factor kappa B) jelátviteli út szerepet játszhat a folyamatban. Továbbá receptor-függő jelátviteli kaszkád szerepét mutatták ki a megemelkedett TNFαmennyiség okaként Kupffer- és parenchimális patkány májsejtekben (Petzinger és Weidenbach 2002). Vannak olyan eredmények, amelyek arra utalnak, hogy az OTA hatással lehet a sejt-sejt kommunikációra is: megváltozott sejtadhéziót és gap junction intracelluláris kommunikációt tapasztaltak vesesejtekben (Mally és mtsai 2006).
26
II.3.7. Mitózisra gyakorolt negatív hatások Más vélemények szerint a toxin a non-mutagén, non-DNS-reaktív csoportba tartozik. Ennek alapján az OTA-indukált karcinogenezis a mitózis zavarára valamint kromoszómainstabilitásra vezethető vissza (Rached és mtsai 2006; Mally és Dekant 2009; Adler és mtsai 2009; Czakai és mtsai 2011). Ez a feltételezés a vesesejtek (patkánykísérletekben megfigyelt) korai patológiai változásaira alapoz: karyomegáliát és nagy poliploid-sejtek jelenlétét tapasztalták, amelyek a sejtosztódás károsodását eredményezhetik (Mantle és mtsai 1991; Simon 1996; Maaroufi és mtsai 1999). Humán vesesejteken végzett vizsgálatokban blokkolt metafázis/anafázis-tranzíciót, aberráns mitotikus formációt és óriássejteket figyeltek meg (Rached és mtsai 2006; Adler és mtsai 2009). Emellett a mikrotubuláris rendszer zavarát és a hiszton-acetiltranszferáz (HAT) gátlását is kimutatták OTA esetében (Czakai és mtsai 2011).
II.3.8. Sejtciklus: G1- és G2-blokk Egyre több tanulmány világít rá az OTA sejtciklusra gyakorolt negatív hatásaira (O'Brien és mtsai 2001; Kamp és mtsai 2005; Palma és mtsai 2007). Cui és munkatársai kimutatták, hogy a toxinkezelés eredményeként szignifikáns, szelektív G2-blokk tapasztalható gyomor epithelium-sejtekben (Cui és mtsai 2010). A hatás okaként a ciklin-CDK rendszerre való negatív hatást jelölték meg: CDK25, CDK2 és ciklinB1 csökkent expresszióját tapasztalták, mind fehérje-, mind mRNS-szinten, valamint a ciklinB1-CDK2 komplex alacsonyabb mennyiségét mutatták ki. Az is kiderült, hogy a MAPK-családba tartozó ERK és p38 aktivációja kulcsszerepet játszik az előbb leírt hatásban (Wang és mtsai 2012). Újabb vizsgálatukkal felhívták a figyelmet arra, hogy az oxidatív károsodás is szerepet játszik a folyamatban, mivel a hatás NAC-nel hatékonyan ellensúlyozható volt (Cui és mtsai 2013). Emellett azt is igazolták, hogy az ATM-Chk2 és ATM-p53-p21 jelátviteli útvonalak is involváltak (10. ábra), amit az is megerősített, hogy az ATM-gátló hatással bíró koffeinnel szintén gátolható volt a sejtciklusra gyakorolt negatív hatás. Egy másik vizsgálatban, amelyet hPBMC (human peripherial blood mononuclear cell) sejteken végeztek el szignifikáns G1blokkot mutattak ki, amelynek háttérében a CDK4 és a ciklinD1 csökkent expresszióját állapították meg. NAC hozzáadására szintén ellensúlyozható volt a jelenség (Liu és mtsai 2012). A vizsgálatok több esetben jelentős oxidatív károsodást és apoptózist is jeleztek. Véleményünk szerint további vizsgálatok indokoltak más sejtvonalak bevonásával.
27
10. ábra: Az Ochratoxin A által indukált G2-blokk molekuláris mechanizmusa. A toxin okozta megemelkedett ROS-koncentráció DNS-károsodáshoz vezet. Az ATM-Chk2- és ATM-p53-p21útvonalak foszforiláció során aktiválódnak, ami a CDK25, a CDK2 és a ciklinB1 expressziójának csökkenését okozza, amelyek G2/M fázis regulációs proteinek. Az eredmény G2-blokk lesz.
II. 4. Prevenció, detoxikáció II.4.1. Abszorpció gátlása, elimináció fokozása II.4.1.1. Adszorbensek Különböző adszorbensek felhasználásával, az OTA bélből történő abszorpciója mérsékelhető. Ezt a módszert érthető okokból inkább állatok esetében alkalmazzák. Maga a pozitív eredmény, és annak mértéke egyaránt megkérdőjelezett (García és mtsai 2003; Trailović és mtsai 2013). A módszer korántsem szelektív, így alkalmazása hosszú távon problémát okozhat. II.4.1.2. Nátrium-hidrogénkarbonát Ahogy azt a korábbiakban már tárgyaltuk, az OTA főként nemionos és monoanion formában szívódik fel a bélből. Ezért NaHCO3-tal bizonyos mértékben gátolható a folyamat, még akkor is, ha ilyenkor a jejunális abszorpció fokozódik (Yong és mtsai 1987). Emellett ahogy a lipofil, savas karakterű molekulák esetében általában, az OTA urinális exkréciója is fokozható a vizelet lúgosításával. Mivel ilyenkor az OTA nagyobb frakciója kerül ionizált formába a vizeletben, a toxin vízoldhatósága növekszik, ami emelkedett vizelettel történő exkréciót eredményez. Azonban hosszútávon a NaHCO3 értelemszerűen nem alkalmazható. 28
II.4.1.3. Kolesztiramin Több vizsgálat is igazolja, hogy az ioncserélő gyanták közé tartozó kolesztiramin a bélben képes az OTA-t megkötni, így gátolja annak felszívódását és fokozza a széklettel történő exkrécióját (Madhyastha és mtsai 1992b; Kerkadi és mtsai 1999). Ennek eredményeként a toxin-expozíció kolesztiraminnal rövidtávon ellensúlyozható. Mivel a kolesztiramin epesavakat is köt és így fokozza a koleszterinszintézist, huzamosabb alkalmazása mellékhatásokhoz vezet. II.4.1.4. Piroxikám A piroxikám többféleképpen is képes lehet ellensúlyozni az OTA negatív hatásait, ezek közül az egyik lehetséges mód a toxin vesesejtekbe történő felvételének akadályozása, hiszen mint az OAT szubsztrátja, kompetitíve gátolhatja az OTA transzportját (Baudrimont és mtsai 1995). Azonban a piroxikám maga is nefrotoxikus hatású, ezért hosszú távon alkalmatlan a toxin negatív hatásának ellensúlyozására. II.4.1.5. Enziminduktorok – a metabolizmus fokozása Egyes kutatások arra az eredményre jutottak, hogy mikroszomális enziminduktorok, mint a fenobarbitál és a 3-metilkolantrén csökkentik az OTA toxicitását: az LD50-értékek növekedését tapasztalták rágcsálókban; emellett a CYP450-gátló hatású piperonil-butoxid fokozta a toxikus hatást (Moroi és mtsai 1985; Chakor és mtsai 1988). Más kísérletekben a fenobarbitál OTA-val történő együttes adagolása esetén fokozott DNS-addukt- és tumorképződést figyeltek meg (Suzuki és mtsai 1986; El Adlouni és mtsai 2000). Az eredmények arra is utalhatnak, hogy egyes CYP450 enzimek által képzett metabolitok kevésbé toxikusak, míg mások hosszabb távon karcinogén hatásúk lehetnek. II.4.1.6. OTA leszorítása szérumalbuminról Korábbi vizsgálatok alapján az OTA leszorítása albuminról protektív hatású lehet (Kumagai 1985). Mivel főként az albumin a felelős az OTA rendkívül hosszú biológiai életidejéért, kézenfekvő a feltételezés, hogy e hatás ellensúlyozásával nagymértékben fokozhatjuk a toxin eliminációját, így meggátolva az OTA szöveti akkumulációját. Persze ilyenkor azzal is számolni kell, hogy a vérben és vizeletben egyaránt megemelkedik a szabad toxin szintje. Azonban az OTA koncentrációja roppant alacsony a szervezetben, ezért feltehetőleg nem kell számolni akut toxicitással, továbbá sok esetben az OTA felvétele a célsejtekbe specializált transzporttal történik, amelynek mértéke limitált. Így lehetőség nyílik arra, hogy jelentősen fokozzuk a toxin eliminációját a szervezetből. Több nem-szteroid gyulladáscsökkentő 29
(NSAID) esetében mutattak ki protektív hatást OTA-val szemben (aspirin, piroxikám, indometacin), amelyek kapcsán valószínűsítették a leszorításos interakció kedvező eredményét is, azonban egyéb lehetséges okok is felmerültek (Obrecht-Pflumio és mtsai 1996; Baudrimont és mtsai 1995, 1997a). Emellett azt is meg kell jegyezni, hogy fenilbutazon esetében negatív hatást tapasztaltak (Galtier és mtsai 1980). A piroxikám és az aszpartám (11. ábra) strukturális analógiát mutatnak az OTA-val így hatékony kompetitornak bizonyultak a toxinnal szemben az albuminkötődésért (Creppy és mtsai 1995): mindkét anyag nem metabolizálódott frakciója képes leszorítani az OTA-t albuminról.
11. ábra: A piroxikám és az aszpartám kémiai szerkezete.
10 napos szimultán OTA- és aszpartám-kezelés esetében jóval alacsonyabb OTAkoncentrációkat tapasztaltak mind a vérben, mind a vesében, mint a kizárólag toxinnal kezelt csoport esetében (Creppy és mtsai 1996). Ez feltehetőleg az albuminról történő leszorítással magyarázható. Továbbá csökkent az OTA akkumulációja az agyban, májban és a herékben, valamint fokozódott az OTα- és a hidroxilált OTA-metabolitok mennyisége is, amelyeknek – ahogy azt a korábbiakban már tárgyaltuk – lényegesen alacsonyabb a toxicitása és rövidebb a felezési ideje, mint az anyavegyületé.
II.4.2. Toxikodinámiás hatások ellensúlyozása II.4.2.1. Fenilalanin, aszpartám Mivel az OTA nemszelektív proteinszintézis gátló hatása részben kompetitív interakción alapul, fenilalaninnal és a fenilalanin-szerkezetet tartalmazó aszpartámmal ez sikerrel ellensúlyozható (Creppy és mtsai 1980, 1984; Baudrimont és mtsai 1997b, 2001). Az 30
aszpartám nagyrészt fenilalaninra metabolizálódik, de kb. 10-12%-ban változatlan formában cirkulál
a
vérben.
Aszpartám
együttes
adagolása
esetében
az
OTA
csökkent
albuminkötődését, gyorsabb kiürülését, a nefrotoxikus és genotoxikus hatások redukcióját tapasztalták (Creppy és mtsai 1995, 1996). A mechanizmus valószínűleg összetett: kinetikai és dinámiás interakciók együttes eredménye lehet. II.4.2.2. Antioxidánsok/antioxidáns rendszer támogatása A szakirodalomban számos olyan publikációt találunk, amelyekben az OTA oxidatív károsító hatását, és az így eredményezett DNS-károsodást/citotoxicitást próbálták ellensúlyozni különböző antioxidánsokkal, illetve a sejtek antioxidáns védelmének erősítésével. SOD és kataláz enzimekkel, valamint a glutation-rendszer támogatásával (NAC hozzáadásával) több esetben is sikerült csökkenteni az OTA előbb említett kedvezőtlen hatásait (Creppy és mtsai 1996). Hasonlóan sikeres, főként sejtkísérletes adatokat közöltek αtokoferol (E-vitamin), aszkorbinsav (C-vitamin), valamint retinol (A-vitamin) kapcsán (Kumari és Sinha 1994; Hoehler és Marquardt 1996; Grosse és mtsai 1997; Baldi és mtsai 2004). Egyes növényi kivonatok felhasználásával ugyancsak pozitív hatást sikerült elérni állatkísérletekben (Abdel-Wahhab és mtsai 2008; Chakraborty és Verma 2010). Vesesejtek epigallokatechin-galláttal és epikatechin-galláttal történő előkezelése alacsonyabb ROSszinteket,
a
DNS-fragmentáció
mérséklődését,
valamint
a
viabilitás
növekedését
eredményezte (Costa és mtsai 2007). Érdekes módon az együttes vagy toxin-expozíciót követő kezelésnél már nem tapasztalták a pozitív hatásokat. Rozmaringsav OTA-val történő együttes adása során csökkent mortalitást, ROS-produkciót, DNS- és proteinszintézis-gátlást és caspase3-aktivitást tapasztaltak májsejtekben in vitro (Renzulli és mtsai 2004). Hasonló pozitív hatásokat eredményezett a cianidin-3-O-β-D-glükoziddal (C3G) történt előzetes, valamint a toxinnal történő együttes kezelés is (Russo és mtsai 2005; Guerra és mtsai 2005). Állatkísérletes adatok pedig rámutattak, hogy az OTA által okozott nitrozatív stressz is enyhíthető C3G-dal, mivel képes ellensúlyozni a fokozott DDAH- és iNOS-aktivációt a vesében, amelyet az OTA-kezelés eredményezett (Sorrenti és mtsai 2012). Szilibininnel (flavonolignán) ellensúlyozható volt az OTA-indukált apoptózis in vitro (Essid és mtsai 2012), míg a likopin (karotinoid) in vivo hatékonyan gátolta a toxin által eredményezett DNSkárosodást (Aydin és mtsai 2013). Mindemellett fontos megjegyezni, hogy az említett polifenolok esetében egyéb interakciók lehetősége is fennáll.
31
Végül itt lehet megemlíteni, hogy az OTA depletálva az intracelluláris cinket szintén oxidatív úton fejthet ki negatív hatásokat. Az ily módon történő fokozott ROS-produkció talán cinkszupplementációval valamilyen szinten ellensúlyozható (Zheng és mtsai 2013).
32
III. Célkitűzések Ahogy azt az eddigiekben taglaltuk: ugyan számos kísérleti eredmény és elmélet olvasható a szakirodalomban, mégis az OTA pontos hatásmechanizmusa jelenleg nem feltárt. Nem tudjuk, hogy a hosszú távú expozíció során mi az a hatás, illetve mik azok a hatások emberben, amelyek a legfontosabb jelentőséggel bírnak a toxin patomechanizmusában. Ahhoz, hogy az OTA által okozott negatív hatásokat ellensúlyozni tudjuk, a toxin viselkedésének mélyebb szintű megértése szükséges. Éppen ezért vizsgálataink során az alábbi célokat tűztük ki:
Az OTA fizikai-kémiai viselkedésének pontosabb megismerése: interakciók vizsgálata ionokkal, fehérjékkel és egyéb endogén molekulákkal.
Az OTA-albumin interakció kvantitatív vizsgálata, alacsony toxicitású potenciális kompetitor-molekulák azonosítása.
OTA abszorpciójának csökkentésére vagy eliminációjának fokozására potenciálisan alkalmas molekulák keresése.
OTA toxikus hatásainak vizsgálata in vitro sejtes modellben.
OTA toxikodinámiás hatásainak ellensúlyozására alkalmazható molekulák keresése.
33
IV. Anyagok és vizsgálati módszerek
IV. 1. Reagensek A felhasznált vegyszerek és oldószerek minden esetben analitikai vagy spektroszkópiai minőségűek voltak. Sigma-Aldrich (Magyarország): ochratoxin A (OTA), baicalein, catechin, fisetin, flavone, galangin, genistein, morin, naringenin, marha szérumalbumin (BSA), humán szérumalbumin (HSA), patkány szérumalbumin (RSA), glipizide, furosemide, nifedipine, simvastatin, verapamil, warfarin, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; 4500 mg/L glükóz), fötális borjúszérum (FBS), adenozin-5′-trifoszfát (ATP), adenozin-difoszfát (ADP), penicillin/streptomicyn-oldat, tripszin-oldat, nátrium-dodecil-szulfát (SDS), Triton X100, propidium-jodid (PI), ribonukleáz A (RNAse A). Indofine (USA): daidzein, luteolin. Extrasynthese (Franciaország): diosmetin, acacetin, hesperetin. Fluka (Magyarország): apigenin, chrysin, myricetin, quercetin. Roche (Magyarország): Biolumineszcens ATP Assay Kit CLSII. Serva (Németország): fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), fluorescamine (Fluram). Invitrogen (Magyarország): calcein-acetoximetil-észter (CAM), 6-karboxi-2',7'dikloro-dihidrofluoreszcein-diacetate
(C400).
Hungaropharma
(Magyarország):
acetilszalicilsav, ibuprofen, indometacin, fenobarbital, fenilbutazon, fenitoin, teofillin. CycloLab Kft. (Magyarország): β-ciklodextrin (BCD), (2-hidroxi-3-N,N,N-trimetilamino)propil-β-ciklodextrin-klorid (QABCD). BD Pharmingen (USA): FITC-AnnexinV. Az OTAból 5000 μM-os, a flavonoidokból 1000 μM-os, a gyógyszerekből 2500 μM-os törzsoldatokat készítettünk spektroszkópiai minőségű, 96%-os etanollal (Reanal, Magyarország), az oldatokat 4°C-on, fénytől védve tároltuk.
IV. 2. Műszerek Fluoreszcens spektroszkópiai és fluoreszcencia-polarizációs méréseinkhez egy Hitachi F4500 fluoreszcens spektrofotométert, valamint egy Fluorolog τ3 típusú spektrofluorimetriás rendszert (Jobin-Yvon/SPEX) használtunk. A méréseket levegő jelenlétében, +25°C-on (a termodinamikai vizsgálatok kivételével) végeztük. A fluoreszcencia polarizációt (P) az alábbi egyenlet alapján határoztuk meg: P
( I VV G I VH ) ( I VV G I VH )
(1)
34
ahol IVV és IVH a mért emissziós intenzitások a szűrők vertikális-vertikális, valamint vertikálishorizontális pozíciója esetén, és G az adott mintára műszeresen meghatározott optikai korrekciós faktor. A mérések során legalább 15 pontot vettünk fel és ezek átlagából határoztuk meg a P-értéket. Mivel a fluoreszcencia polarizáció a fluorofór rotációs/mozgási szabadságát
jellemzi,
a
módszer
kiválóan
alkalmas
fluoreszcens
kismolekulák
makromelekulákkal történő kölcsönhatásának vizsgálatára. Az OTA és az OTA2--Mg2+ komplex kromatográfiás meghatározásához integrált HPLCrendszert alkalmaztunk (Agilent 1100), amely kvaterner pumpából, gáztalanítóból, automata mintaadagolóból, injektorból, termosztálható oszloprekeszből és fluoreszcens detektorból áll. Az adatok rögzítéséhez és kiértékeléséhez Agilent ChemStation (Rev.B.03.02-SR2) programot használtunk. Az elválasztás LiChroCART® típusú oszlopon (4 mm × 125 mm, 5 µm-os pórusméret, Merck Purospher STAR® RP-18e) történt, előtét kolonna alkalmazása mellett (TR-C-160-K1; ABLE Jasco). A lumineszcens ATP-meghatározás egy Berthold Lumat LB9507 luminométerrel történt. Az áramlási citometriás vizsgálatokhoz Beckman-Coulter FC500 típusú flow citométert alkalmaztunk, az adatok elemzése CXP szoftver felhasználásával történt. A ROS-méréshez Promega GloMax®-Multi Microplate Multimode Readert használtunk. Az ATP- és ADP-koncentráció kromatográfiás meghatározását egy Dionex Ultimate 3000 (Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA) típusú HPLC-vel végeztük, ami bináris grádiens pumpából (HPG-3200SD), mintaadagolóból (WPS-3000RS), termosztálható oszloprekeszből (TCC-3000RS) és UV/VIS detektorból (MWD-3000RS) áll.
IV. 3. Sejtkultúrák Az OTA hatását immortalizált, kitapadó, tubuláris vesesejteken végeztük: MDCK (Madine, Darby canine kidney; ATCC: CCL 34; cocker spániel, epitheliális). A sejttenyészetet DMEM típusú, magas glükóztartalmú (4,5 g/l) médiumban tartottuk fenn és inkubáltuk, ami 10% FBS-t, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomicint (100 µg/ml) tartalmazott. A sejteket 25 cm2-es steril flaskákban (VWR) tartottuk fenn. A kísérleteket 96-lyukú steril lemezeken (VWR) végeztük az áramlási citometriás mérések kivételével, amelyekhez 6-lyukú steril lemezeket (VWR) használtunk. A sejttenyésztés és inkubálás 37°C-on, 5% CO2 jelenlétében történt. A steril munkákat egy Aireguard-126300 (Nuaire) típusú vertikális áramlású lamináris boxban végeztük.
35
IV. 4. Celluláris paraméterek meghatározása IV.4.1. Összfehérje-meghatározás fluorescaminnal A fluorescamin (Fluram) egy spirovegyület, amely önmagában nem rendelkezik fluoreszcens aktivitással, azonban primer aminokkal reagálva fluoreszcens vegyületet képez. A reakció szobahőmérsékleten, pillanatszerűen, alkalikus pH-n megy végbe (pH = 9,2 a legideálisabb). Az el nem reagált Fluram vizes közegben néhány másodperc alatt nem-fluoreszcens származékká hidrolizál. A módszer rendkívül érzékeny, már 1 μg/ml fehérjekoncentráció is pontosan meghatározható. Az inkubációs idő leteltét követően a sejteket kétszer mostuk 150µl PBS-sel, majd lyukanként 150µl feltáró puffert (0,2 M-os borát puffer, 10 mM MgSO4, 0,1% Triton X 100, 0,2 mM PMSF, pH = 9,2) adtunk hozzájuk. Ezt követően 15 percig inkubáltuk szobahőn, majd a lizátumból 75 µl-t 2000 µl mérőpufferhez adtunk (0,2 M-os borát puffer, pH = 9,2). Alapos homogenizálást követően 50µl Fluram-oldattal (10 mM, DMSO-ban oldva) egészítettük ki a rendszert folyamatos vortexelés közben. Az így kapott minták több órán keresztül stabil fluoreszcens jelet adtak. A fluorimetriás mérést 394 nm gerjesztési és 475 nm emissziós hullámhosszakon
végeztük.
Az
összprotein-koncentráció
meghatározása
BSA-ra
vonatkoztatva történt, kalibrációs egyenes felvételét követően. IV.4.2. ATP-koncentráció meghatározása luciferin-luciferáz reakcióval A luciferin jellemzően – egyéb fajok mellett – a szentjánosbogárban előforduló vegyület. ATP-függő biolumineszcens reakcióban luciferáz enzim hatására oxiluciferin képződik belőle, a folyamatot fotonemisszió kíséri. Mivel a reakció 1:1 arányú sztöchiometriával jellemezhető, az emittált fotonok mennyisége arányos az ATP-koncentrációval, így kiválóan alkalmas annak kvantitatív luminometriás meghatározására, akár néhány nmol/l-es szinten. A sejteket kétszer mostuk 150 µl PBS-sel, majd lyukanként 150 µl feltáró puffert (0,2 M-os borát puffer, 10 mM MgSO4, 0,1% Triton X 100, 0,2 mM PMSF, pH = 9,2) adtunk hozzájuk. Ezt követően 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Majd 100 µl luciferin-luciferáz reagenshez 850 µl mérőpuffert (0,1 M TRIS-acetát puffer, 10 mM MgSO4, 2 mM Na2EDTA, 0.1% Triton X 100, pH = 7,75) és 50 µl sejt-lizátumot adtunk és óvatos homogenizálást követően 5 másodpercig mértük a fényemissziót luminométerrel (L1). Majd ugyanahhoz a mintához hozzáadtunk 20 µl belső standardot (100 µM APT-Na2 vizes oldat) és ismét
36
megmértük a lumineszcenciát (L2). Ezt követően az alábbi képlet alapján határoztuk meg az ATP-koncentrációt: ATP[nM ] 24,2[nM ]
L1 ( L2 L1)
(2)
A 24,2-es szorzófaktor a belső standard aktuális koncentrációját jelenti a mintában.
IV.4.3. ATP/ADP-arány meghatározása HPLC-UV módszerrel A médium eltávolítását követően a sejteket 4°C-os PBS-sel mostuk, majd 100 μl hideg (4°C) 10%-os (m/m) perklórsavval történt az extrakció (5 perc, jégben). Minden 100 μl extraktumhoz 30 μl hideg (4°C) 20%-os (m/m) KOH-oldatot (ami 1.5 M K2HPO4-ot is tartalmazott) adtunk és vortexelést követően 2 percig inkubáltuk jégen. Majd az így képződött kálium-perklorát csapadékot lecentrifugáltuk (4°C, 10.000 g, 5 perc). A felülúszóból 40 μl-t injektáltunk. Az elválasztás Kochanowski és mtsai (2006) módszere alapján történt, kisebb módosításokkal. Az A-eluens 100 mM-os koncentrációjú kálium-foszfát puffert (pH = 6,5) és 8 mM tetrabutil-ammónium-szulfátot, míg a B-eluens 70% A-eluenst és 30% metanolt tartalmazott. Az elválasztás 40ºC-on történt egy Supelco Discovery C18 oszlop (150 x 4.6 mm, 5 µm pórusátmérő, Sigma-Aldrich) felhasználásával, 1 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva. A grádiens-profil változása a következők szerint történt: 0-5 percig 100% Aeluens, majd 5-20 percig a B-eluenst lineárisan 77%-ra emeltük, és 20.5-28 percig ismét 100% A-eluenst alkalmazunk. A kromatogramokat λ = 254 nm-en vettük föl.
IV.4.4. Calcein viabilitás vizsgálat A calcein-acetoximetil észtert (CAM) gyakran alkalmazzák viabilitás-vizsgálatokhoz. A celluláris felvételt követően az észterkötést intracelluláris észterázok hasítják. Az így képződő calcein a sejtben marad és erős fluoreszcens jelet ad. Mivel az elhalt sejtek nem rendelkeznek intracelluláris észteráz-aktivitással, az élő sejtek szelektív jelölődése történik, így információt kapunk azok mennyiségéről. A médium eltávolítását követően a sejteket kétszer mostuk PBS-sel. Majd 150 µl 1,6 µM CAM-t tartalmazó PBS-t adtunk hozzá és 60 percig 37°C-on, sötétben inkubáltuk. Ezt követően ismét mostuk a mintákat PBS-sel és 150 µl lízis puffert (0,1% SDS, PBS-ben oldva) adtunk hozzá. 5 perc inkubálást követően (szobahőmérsékleten) 100 µl lizátumot adtunk 2000 µl PBS-hez. Az így kapott oldatot homogenizálást követően fluorimetriásan mértük (λexc = 480 nm; λem = 515 nm). 37
IV.4.5. Propidium-jodid – Annexin V viabilitás teszt Az egyik leggyakrabban alkalmazott viabilitás vizsgálat a propidium-jodid (PI) – Annexin V teszt. A módszer alkalmas arra, hogy egyszerre határozzuk meg az élő, apoptotikus és nekrotikus sejtek mennyiségét egy rendszeren belül áramlási citometriával. A PI-dal a nekrotikus sejteket jelöljük: mivel ezek membránja nem intakt, az anyag bejut a sejtmagba, ahol nukleinsavakhoz kötődik; az ép sejtmembránon a PI nem jut át. Az apoptózis foszfatidilszerin externalizációval jár, az Annexin V ezeket a struktúrákat ismeri föl. Az Annexin V fluoreszcens festékkel konjugált formában használható jelölésre, ez esetünkben fluoreszceinizotiocianát (FITC) volt. Az inkubálás lejártát követően a sejtekről eltávolítottuk a médiumot és félretettük későbbi analízis céljából. A mintákat kétszer mostuk PBS-sel. A sejtek feltripszinezését követően a sejtszuszpenziót egyesítettük az előzetesen eltávolított felülúszóval és centrifugálás után (10.000 g, 3 sec.) ismét mostuk PBS-sel. Ezt újabb centrifugálás követte. Majd a sejteket felvettük 100 µl Annexin V-kötő pufferben (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4) és hozzáadtunk 10 µl PI-oldatot (50 µg/ml), valamint 5 µl FITC-Annexin V reagenst. A mintákat 15 percig, szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk az áramlási citometriás mérés előtt.
IV.4.6. Sejtciklus analízis Ha a sejteket jelölés előtt permeabilizáljuk, minden sejt festődik PI-dal, így a festék alkalmas lesz a sejtciklus vizsgálatára. A módszer elve az, hogy a sejtek a sejtciklus aktuális fázisától függően 2n vagy 4n DNS-tartalommal rendelkeznek. Így meghatározhatjuk, hogy mekkora frakció van aktuálisan G0/G1, S és G2/M fázisban. A jelölés során ribonukleáz enzimet alkalmazunk, hogy elkerüljük az RNS jelöléséből potenciálisan adódó hibát. A sejteket hideg PBS-sel mostuk, majd tripszinezést követően centrifugáltuk (10.000 g, 3 sec.) és ismét mostuk 1 ml PBS-sel. Ezt követően a sejteken kb. 100 µl PBS-t hagytunk és cseppenként 900 µl jéghideg etanolt adtunk hozzá, folyamatos homogenizálás közben. Majd ismét centrifugáltuk, és mostuk a sejteket 1 ml PBS-sel. Végül egy utolsó centrifugálást követően a mintákat felvettük 500 µl jelölő-oldatba (50 µg/ml PI, 1 mg/ml ribonukleáz A, 0.1% Triton X 100, PBS-ben oldva) és 30 percig, szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk.
38
IV.4.7. Intracelluláris ROS-meghatározás Az intracelluláris ROS mennyiségének meghatározása az oxidációra érzékeny 6-karboxi-2',7'diklórdihidro-fluoreszcein-diacetát (C400) fluoreszcens-festékkel történt. A C400 egy nemfluoreszcens acetilált fluoreszcein-származék, amelynek észterkötéseit intracelluláris észterázok hasítják, miután bekerül a sejtbe, azonban fluoreszcens tulajdonsága csak szabadgyökös oxidációt követően lesz. A kezelés végeztével a médiumot lecseréljük 150 µl friss DMEM-re és inkubáljuk 4 µM C400-zal 37 °C-on 2 órán keresztül sötétben. A fluoreszcens mérést plate readerrel végeztük 490/510-570 nm gerjesztési és emissziós hullámhosszakon.
IV. 5. Statisztika A statisztikai analízist SPSS (IBM, Version 20) szoftverrel végeztük. Eredményeinket minden esetben legalább három, egymástól független mérésből számoltuk. Az ábrákon és táblázatokban az átlagokat és szórásokat (SD) tüntettük föl. A szignifikancia megállapításához one-way ANOVA típusú analízist használtunk (p < 0,05).
39
V. Eredmények, következtetések V. 1. Ochratoxin A interakciója szérumalbuminnal Az Ochratoxin A vizes oldatban a pH-tól és a mikrokörnyezettől függően három különböző formában lehet jelen: nemionos, monoanion (OTA-) és dianion (OTA2-) formában. Extracelluláris fiziológiás körülmények között egyértelműen a dianion forma dominál, aminek csak az egyik oka, hogy a 7,4-es pH meghaladja a toxin pKa-értékeit. A másik ok, az alkálifémek meglehetősen magas koncentrációja (Poór és mtsai 2013b); ezt rövidesen bővebben is részletezzük. Az OTA- a nemionos formával megegyező fluoreszcens sajátságokat mutat: λexc = 332 nm-es és λem = 451 nm.
12. ábra: Felül az OTA (2 µM) monoanion (ammóniu-macetát puffer; pH = 5; λexc = 332 nm, λem = 451 nm) és dianion (TRIS-HCl puffer; pH = 9; λexc = 380 nm, λem = 443 nm) gerjesztési (balra) és emissziós (jobbra) spektrumai. Alul az OTA (1 µM) gerjesztési (balra) és emissziós (jobbra) spektrumai albumin nélkül (λexc = 380 nm, λem = 443 nm) és 2 µM HSA jelenlétében (λexc = 393 nm, λem = 446 nm), PBS-ben (pH = 7,4).
40
Ezzel szemben az OTA2- gerjesztési és emissziós maximumai eltérnek a másik két formáétól (λexc = 380 nm és λem = 443 nm). Azt is fontos kiemelni, hogy a dianion forma lényegesen magasabb fluoreszcens jelet ad, mint a nemionos vagy a monoanion formák. Ahogy azt a korábbiakban már tárgyaltuk, az OTA dianion formában kötődik a HSA-hoz. Ennek az eredménye a spektrum további módosulása lesz: az OTA-HSA komplex 393 és 446 nm gerjesztési és emissziós hullámhossz-maximumokkal jellemezhető és a fluoreszcens intenzitás is nagymértékben növekszik a kötődés eredményeként. A fentebb említett spektroszkópiai eltéréseket a 12. ábrán foglaltuk össze. Az OTA a különböző albumin-specieszekhez rendkívül eltérő affinitással kötődik. A későbbiekben leírt módszer (V.4.: 11. egyenlet) felhasználásával PBS-ben (pH = 7,4) határoztuk meg az OTA-albumin komplexek kötési állandóit humán (HSA), marha (BSA) és patkány szérumalbumin (RSA) esetében 25°C-on. Az eredmények a következők: logKOTA-HSA = 7,65 ± 0,36, logKOTA-BSA = 6,48 ± 0,22 és logKOTA-RSA = 6,17 ± 0,12 (ahol K a dm3/mol-ban kifejezett asszociációs konstans). Ez annyit jelent, hogy a toxin a BSA-nál 15-ször, míg az RSA-nál 30-szor stabilabb komplexet képez HSA-val, ami megdöbbentően magas eltérés. Annak érdekében, hogy vizsgálni tudjuk különböző anyagok kompetitív interakcióit OTA-val az albumin-kötődésért, fontos, hogy kvantitatív módon jellemezzük az OTA-HSA kölcsönhatást. Il’ichiev és mtsai (2002b) fluoreszcens polarizáció (a továbbiakban csak polarizáció) alapú modellt dolgoztak ki az OTA interakcióinak vizsgálatára, nevezzük ezt az alkalmazást A-módszernek:
( P Pf ) [ ( Pb P) P Pf ]
(3)
b b f f
(4)
ahol α a toxin kötött frakciója, P a mintában mért polarizáció, Pf és Pb a teljesen szabad és a 100%-ban kötött OTA polarizációs értékei, εf és εb a szabad és a kötött toxin moláris abszorpciós koefficiensei, míg ϕf és ϕb a szabad és az albumin-kötött OTA kvantumhatásfokai.
A
θ
értékének
meghatározása
a
korábban
publikált
adatok
felhasználásával történt (Il'ichev és mtsai 2001, 2002a, 2002b). A szabad toxinnak, kismolekula lévén, mozgási szabadsága vizes oldatban magas, így a polarizációja alacsony (P ~ 0.010). Amikor a fluoreszcens kismolekula (pl. az OTA) egy makromolekulához kötődik (esetünkben a HSA-hoz) rotációs szabadsága nagymértékben lecsökken, tehát polarizációs értéke jelentősen megnő (esetünkben: P ~ 0,330). A méréseket 1µM OTA-val és növekvő HSA-koncentrációkkal végeztük PBS-ben (pH = 7,4; λexc = 393 nm, λexc = 446 nm). Mivel a szabad és albumin-kötött dianion forma hullámhossz-maximumai hasonlóak, csak együtt 41
tudjuk mérni őket, így a polarizáció fokozatos emelkedését látjuk. A 13. ábra kiválóan demonstrálja az OTA kötődését albuminhoz. Az eredmények alapján kb. 1,5-1,6-szoros albuminkoncentráció szükséges ahhoz, hogy a toxin teljes mennyisége kötött állapotba kerüljön.
13. ábra: Az OTA (1 µM) fluoreszcencia polarizációjának (balra) és fluoreszcencia intenzitásának (jobbra) változása növekvő HSA-koncentráció mellett PBS-ben (pH = 7,4; λexc = 393 nm, λem = 446 nm). Annak érdekében, hogy igazoljuk a korábban leírt módszer pontosságát, fluoreszcencia intenzitás alapú modellekkel vetettük össze. A következő alkalmazást nevezzük Bmódszernek. Ebben az esetben is az albumin-kötött toxin hullámhossz-maximumain végeztük el a méréseket, ismét PBS-t használtunk, hogy közelítsük az extracelluláris fiziológiás körülményeket. Az értékelés az emissziós intenzitásokból történt (13. ábra). Először kalibrációs egyenest vettünk fel a teljesen szabad és kötött (az OTA-hoz képest kétszeres HSA koncentrációt alkalmaztunk) toxinra. Az egyenesek egyenletei:
If = a1 * cf + b1 (5)
Ib = a2 * cb + b2 (6)
ahol If és Ib a szabad és a kötött OTA adott koncentrációhoz tartozó intenzitásai, cf és cb a szabad és kötött toxin koncentrációi, a1 és a2 a meredekségek, b1 és b2 pedig a tengelymetszetek. Az 5-ös és a 6-os egyenletek felhasználásával felírhatók a következő összefüggések:
ΣI = If + Ib = (a1 * cf + b1) + (a2 * cb + b2) (7)
Σc = cf + cb (8)
ahol ΣI a mért intenzitás, Σc pedig az OTA összkoncentrációja a mintában.
42
A 7-es és 8-as összefüggésekből a következő egyenleteket kapjuk:
cb = [ΣI – a1 * Σc – (b1 + b2)] / (a2 – a1) (9) kötődési arány (%) = 100 * cb / Σc (10) Így a kötött toxin koncentrációja meghatározható. A harmadik alkalmazást nevezzük C-módszernek. Korábbi méréseink kapcsán azt tapasztaltuk, hogy a komplexképződés alacsonyabb pH-értéken, kisebb ionerősség mellett hasonlóképpen megy végbe, mint PBS-ben. 4,7-es pH-jú ammónium-acetát pufferben a dianion forma nincs jelen. Mivel az OTA csak dianion formában kötődik albuminhoz (vagy legalábbis a monoanion kötődése után rögtön deprotonálódik), HSA hozzáadására a gerjesztési spektrumokban jelentkező nagy eltérés miatt (334 és 393 nm) szelektíven tudjuk gerjeszteni az albumin-kötött frakciót, és így elkülöníthetjük egymástól a szabad monoanion és a kötött dianion formát. Ezáltal a kötött frakció koncentrációja kalibrációs egyenes segítségével egyszerűen megállapítható. Az eredményeket az 1. táblázatban összegeztük. A tény, hogy a három alkalmazás remekül korrelál, arra utal, hogy valóban képesek vagyunk az OTA-HSA kölcsönhatás mértékének pontos, kvantitatív követésére. Mivel a polarizáció kevésbé érzékeny az összetett rendszerek esetében potenciálisan fellépő spektroszkópiai zavaró hatásokra, a kompetitív interakciók vizsgálatára a továbbiakban a fluoreszcencia polarizáció alapú módszert választottuk. HSA konc. (μM)
A-módszer
B-módszer
C-módszer
0.10 0.25 0.38 0.50 0.63 0.75 0.88 1.00 1.13 1.25 1.38 1.50 1.63
8.4 (±0.8) 19.6 (±0.6) 29.0 (±2.0) 37.1 (±4.0) 48.0 (±0.3) 60.9 (±2.0) 67.7 (±2.4) 76.3 (±3.4) 85.6 (±0.8) 92.2 (±2.1) 97.1 (±1.9) 98.7 (±0.9) 100.0 (±0.0)
7.5 (±0.8) 18.9 (±0.4) 28.2 (±1.5) 37.1 (±1.2) 48.1 (±1.8) 58.5 (±1.0) 68.6 (±3.5) 78.1 (±1.5) 86.8 (±4.0) 94.7 (±2.2) 97.8 (±1.9) 98.8 (±1.3) 99.9 (±2.8)
7.7 (±0.4) 18.9 (±0.6) 28.3 (±0.4) 37.4 (±0.7) 47.1 (±0.8) 57.0 (±0.2) 66.1 (±0.9) 76.3 (±0.6) 85.9 (±0.3) 95.0 (±0.2) 98.0 (±0.3) 99.4 (±0.4) 100.1 (±0.3)
1. táblázat: Az OTA kötődése HSA-hoz PBS-ben (pH = 7,4; A- és B-módszer), valamint ammónium-acetát pufferben (pH = 4,7; C-módszer): A toxin (1 μM) kötött frakcióját százalékban fejeztük ki, növekvő HSA-koncentráció jelenlétében (0.10-1.63 μM). Az átlagokat három teljesen független mérésből számoltuk; zárójelben a szórások láthatóak.
43
V. 2. OTA leszorítása albuminról gyógyszerekkel Egyes gyógyszerek – ahogy azt az irodalmi áttekintésben már tárgyaltuk – képesek leszorítani az OTA-t albuminról. Munkánk e részében azt tűztük ki célul, hogy további olyan gyógyszermolekulákat azonosítsunk, amelyek hatékony kompetitorok lehetnek OTA-val szemben. Vizsgálatainkhoz főként olyan gyógyszereket válogattunk össze, amelyeknek albuminkötődése kb. 90% vagy annál magasabb, de pár alacsonyabb kötődésű ligandot is teszteltünk (2. táblázat). A felhasznált molekulák mindegyike (az ibuprofen kivételével) Sudlow’s Site I ligand, tehát a HSA IIA aldoménjén helyezkedik el a primer kötőhelyük, hasonlóan az OTA-hoz. Gyógyszer neve Acetilszalicilsav Ibuprofen Indometacin Furosemide Glipizide Nifedipine Phenobarbital Phenylbutazone Phenytoin Simvastatin Theophylline Verapamil Warfarin
Terápiás hatás NSAID NSAID NSAID diuretikum orális antidiabetikum vérnyomáscsökkentő antiepileptikum NSAID antiepileptikum antihiperlipidémiás szer asztmaellenes szer vérnyomáscsökkentő antikoaguláns
Plazmafehérjekötődés (%) 49 >99 90 96-99 98,4 96 51 96-99 89 94 56 90 99
Terápiás csúcskoncentráció a vérben (μg/ml) 24,4 ± 4,0 61,1 ± 5,5 ~ 2,4 1,7 ± 0,9 0,465 ± 0,139 0,079 ± 0,044 13,1 ± 4,5 50-100 5-10 0,056 ± 0,025 15 ± 2,8 ~ 0,272 R: 0,9 ± 0,4 S: 0,5 ± 0,2
2. táblázat: Az alkalmazott gyógyszermolekulák számunkra fontosabb farmakokinetikai tulajdonságai (források: Hardman és mtsai 2001, Higham és mtsai 1981). 1 µM OTA-t és szaturáció feletti HSA koncentrációt (1,7 µM) alkalmaztunk. A fluoreszcencia polarizációs méréseket az albumin-kötött OTA hullámhossz-maximumain végeztük (λexc = 393 nm, λem = 446 nm). Az anyagok sem önmagukban, sem albumin jelenlétében nem adtak fluoreszcens jelet a legmagasabb koncentrációban sem (100 µM) az alkalmazott körülmények között. A vizsgálatok PBS-ben történtek, a kísérleti anyagokból 2500 µM-os etanolos törzsoldatokat készítettünk. A végső etanolkoncentráció nem haladta meg a 4%-ot a mintákban, a kontrollok azonos mennyiségű alkoholt tartalmaztak. Az OTAHSA komplex rendkívül magas stabilitása miatt az 1 µM OTA-val szemben lényegesen magasabb: 40, 70 és 100 µM-os gyógyszerkoncentrációkat alkalmaztunk. Mivel a toxin a nMos koncentrációskála alján van jelen a vérben, a százszoros többlet egyáltalán nem eltúlzott. A 44
13 vizsgált kompetitor közül az acetilszalicilsav, nifedipine, phenobarbital, phenytoin, theophylline és verapamil nem mutatott kölcsönhatást az alkalmazott koncentrációkban. Ezzel szemben az ibuprofen, indometacin, furosemide, glipizide, phenylbutazone, simvastatin és warfarin hatékony kompetitornak bizonyult (14. ábra).
14. ábra: Az OTA kötött frakciója %-ban kifejezve 40 (zöld), 70 (kék) és 100 µM (piros) kompetitor hozzáadása esetén. A leszorítás mértékéből jól látható, hogy az indometacin és phenylbutazone a leghatékonyabb kompetitorok. A pontos adatok és szórások az 1. számú mellékletben találhatóak. Jól látható, hogy az indometacin és a phenylbutazone hatása volt a legmagasabb, őket a warfarin, furosemide és ibuprofen követi, végül a simvastatin és glipizide esetében alacsonyabb, de még jelentősnek mondható leszorítást tapasztaltunk. Érdekes, hogy az ibuprofen is látványos eredményt produkált, annak ellenére, hogy kötőhelye a HSA IIIA aldoménjén helyezkedik el. Ezt valószínűleg allosztérikus moduláció okozhatja. További érdekesség, hogy a szintén kumarin-vázas warfarin alulmarad a két leghatékonyabb NSAIDdal szemben (indometacin és phenylbutazone). Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy ha a hatékony kompetitorokat párokban adjuk az OTAalbumin komplexhez, akkor additív vagy esetleg attól eltérő interakció tapasztalható-e. 40-40 µM-t alkalmaztunk mindkét hatóanyagból és az így kapott mérési eredményeket
45
összehasonlítottuk a korábban 40 µM-ra meghatározott leszorítások összegeivel. Valódi kompetitív interakció esetében a hatásnak additívnek, esetleg valamivel alacsonyabbnak kellene lennie. Ezzel szemben több esetben a leszorítás mértékének növekedését azaz potencírozó szinergizmust tapasztaltunk az általunk képezett hipotetikus összegekhez képest. Az adatok a 15. ábrán láthatóak, ahol az előzőekhez képest ellentétesen, nem a kötött, hanem a leszorított OTA frakciókat ábrázoltuk. Ezek az eredmények szintén utalhatnak arra, hogy egyes kompetitorok esetében allosztérikus modulációról, nem pedig valódi kompetitív interakcióról van szó. Érdekes módon például 40+40 µM indometacin és phenylbutazone együttes alkalmazása mellett csaknem másfélszer akkora leszorítást tapasztaltunk, mint az előzőekben 100 µM indometacin esetében.
15. ábra: Az OTA leszorított frakciója %-ban kifejezve 40+40 µM gyógyszer-kombinációk esetében. Sárgával a mért értékeket, míg barnával az előzőekben 40 µM-ra meghatározott értékek összegeit jelöltük. A szórások egyetlen esetben sem haladták meg a 4%-ot. [FUR=furosemide; GLIP=glipizide; IBU=ibuprofen; INDO=indometacin; SIM=simvastatin; PHENBU=phenylbutazone; WAR=warfarin]
46
V. 3. OTA leszorítása albuminról flavonoid aglikonokkal Az utóbbi években fény derült arra, hogy a flavonoidok antioxidáns és egyéb szerteágazó celluláris hatásaik mellett jelentős mértékben képesek kötődni szérumalbuminhoz is. Ez, valamint a tény, hogy a flavonoidok toxicitása meglehetősen alacsony, azaz nagyobb mennyiségben is alkalmazhatóak ismert mellékhatások nélkül, alkalmassá tehetik arra ezt a molekulacsoportot, hogy az OTA albuminról való leszorításával fokozzuk a toxin eliminációját. Kísérleteink alábbi részében 12 különböző flavonoid aglikont vizsgáltunk a flavon, flavonol, flavanon és izoflavon csoportokból (16. ábra). A méréseket az előző pontban (V.2.) leírtaknak megfelelően végeztük el, azzal a különbséggel, hogy a flavonoidokból 1000 µM-os koncentrációjú etanolos törzsoldatot készítettünk és 10, 25 valamint 50 µM volt a végkoncentrációjuk a mintákban. A flavonoidok közül 50 µM koncentrációban csak a daidzein és a morin adott fluoreszcens jelet az alkalmazott körülmények között. Azonban ennek mértéke alacsony volt (a daidzeinnél 6,5%-a, míg a morinnál 1,5%-a az 1 µM-os koncentrációjú OTA-HSA komplex intenzitásának) és nem változott albumin hozzáadására, így véleményünk szerint ez nem befolyásolja jelentősen méréseinket az említett két anyag esetében. Eredményeinket a 17. ábrán foglaltuk össze. A feltüntetett adatok kiválóan tükrözik, hogy a vizsgált flavonoidok közül a flavonok és a flavonolok hatékony kompetitorok, míg a flavanonok és a daidzein (izoflavon) szinte teljesen hatástalannak bizonyultak az alkalmazott koncentrációkban. Ez az eredmény arra utal, hogy a C2-C3 kettőskötés, valamint annak konjugációja a C4 karbonilcsoporttal kritikus a kölcsönhatás szempontjából. A daidzein annak ellenére, hogy tartalmazza az említett kettőskötést, nem képes leszorítani a toxint. Ennek sztérikus okai lehetnek, mivel a nagy térkitöltésű fenilcsoport C3 pozícióban helyezkedik el az izoflavonoidok esetében. A vizsgált flavonoidok közül a galangin bizonyult magasan a leghatékonyabb kompetitornak, őt a quercetin követi. Mindkét származékban jelen van a C3 hidroxilcsoport (így a flavonolok családjába tartoznak), amelynek valószínűleg fontos szerepe van az interakcióban. A C3 hidroxilcsoport pozitív hatását az említett kölcsönhatásra a quercetin-luteolin és a galangin-chrysin párok összehasonlítása egyaránt igazolja, amelyek kizárólag a C3-helyzetű hidroxilcsoportban térnek el egymástól. Eredményeink arra is rávilágítanak, hogy a kölcsönhatás szempontjából az a legkedvezőbb, ha a B-gyűrű egyáltalán nem tartalmaz szubsztituenst. Erre kiváló példa, hogy a flavonok között a chrysin, míg a flavonolok esetében a galangin a leghatékonyabb kompetitor. Emellett a szubsztituensek száma és helyzete is fontos: a C3’- és C4’-helyzetű hidroxilcsoportokat tartalmazó quercetin esetében lényegesen magasabb leszorítást értünk el, mint a szintén flavonol morin és 47
myricetin hatására. Ennek oka a C2’- és C4’- helyzetű szubsztitúció (morin) valamint a C3’-, C4’- és C5’-helyzetű szubsztitúció (myricetin) lehet a B-gyűrűn, ahol az orto- és a két metahelyzetű szubsztituens sztérikus okok miatt gyengítheti a kompetíciós képességet. A 4’-Ohelyzetű metilcsoport jelenléte az acacetin-apigenin esetében nem okozott jelentős eltérést, azonban luteolinnal lényegesen nagyobb mértékű leszorítást értünk el, mint az említett szerkezeti elemet tartalmazó diosmetinnel.
16. ábra: A tesztelt flavonoid aglikonok és a flavonoid-alapváz kémiai szerkezete. 48
17. ábra: Az OTA kötött frakciója %-ban kifejezve 10 (zöld), 25 (kék) és 50 µM (piros) flavonoid hozzáadása esetében. A leszorítás mértékéből jól látható, hogy a galangin és a quercetin a leghatékonyabb kompetitorok. A pontos adatok és szórások a 2. számú mellékletben megtekinthetők.
V. 4. OTA interakciója alkálifémekkel és alkáliföldfémekkel Mivel ebben a részben alkálifémek és alkáliföldfémek hatását vizsgáltuk az OTA-ra, a legtöbb mérés esetében 0,1 M-os koncentrációjú TRIS-HCl (pH = 7,4) puffert használtunk. A kísérletekhez Li+-, Na+-, K+-, Mg2+-, Ca2+- és Ba2+-ionok kloridsóit alkalmaztuk. Alkálifémek jelenlétében a toxin gerjesztési és emissziós maximumai nem változnak, azonban azt tapasztaltuk, hogy 332 nm-en csökken, míg 380 nm-en nő a gerjesztési jel. Emellett 380 nmes gerjesztés esetén az emissziós intenzitás is emelkedik. Az alább leírt spektroszkópiai változások oka az OTA-monoanion koncentrációjának csökkenése, valamint a dianion forma mennyiségének növekedése (mivel 9,0-es pH-n az alkáliföldfémek hozzáadása nem eredményezett változást az OTA spektrumaiban). A hatás erősségét Li+ > Na+ ~ K+ sorrenddel jellemzhetjük (18. ábra). Ezzel szemben az alkáliföldfémek esetében a spektrumok lényeges változását tapasztaltuk, mind hullámhossz, mind intenzitások tekintetében. Magnéziumionnál 375 és 427 nm-t, kálciumionnál 375 és 433 nm-t, míg báriumionnál 377 és 439 nm-t állapítottunk meg, mint gerjesztési és emissziós maximumokat (18. ábra).
49
18. ábra: Az OTA (2 µM) gerjesztési (balra) és emissziós (jobbra) spektruma pH = 7,4 TRISHCl pufferben fémionok nélkül és azok jelenlétében (100-100 mM).
19. ábra: Az OTA (2µM)-BSA (3,5µM) gerjesztési (balra fent) és emissziós (jobbra fent) spektruma önmagában, valamint 100 mM CaCl2 és MgCl2 jelenlétében; továbbá az OTABSA komplex fluoreszcencia polarizációja (lent) növekvő alkáliföldfémion-koncentráció mellett pH = 7,4 TRIS-HCl pufferben (λexc = 395 nm, λem = 445 nm).
50
A 18. ábrán feltüntetett spektrumokat 100 mM alkáliföldfémion-koncentráció jelenlétében mértük (a koncentráció további emelése már nem befolyásolta a spektrumokat). Az alkalmazott körülmények között a kölcsönhatás során a monoanion forma teljes mértékben eltűnik a rendszerből. Eredményeink arra utalnak, hogy a vizsgált ionok esetében az OTAdianion a preferált forma. A következő lépésben az alkálifém- és alkáliföldfém-ionokat OTA-BSA komplexhez adtuk szintén TRIS-HCl pufferben (pH = 7,4). A mérésekhez 2 µM OTA-t és 3,5 µM BSA-t alkalmaztunk. Azért a marha albumint használtuk, mert ez lényegesen kisebb affinitással kötődik az OTA-hoz, mint a humán, így látványosabb hatást érhetünk el vele. 0-100 mM-os fémion-koncentrációkat alkalmaztunk, a méréseket az OTA-BSA komplex gerjesztési és emissziós maximumán végeztük (λexc = 395 nm, λem = 445 nm). Alkálifém-ionok hatására sem a fluoreszcens jel, sem a polarizáció nem változik. Alkáliföldfém-ionok esetében azonban a spektrumok és a polarizációs értékek is a kötött frakció csökkenését jelzik (19. ábra). Eredményeink jól demonstrálják, hogy Ba2+-, Ca2+- és főleg a Mg2+-ionok esetében jelentősen csökken az OTA albumin-kötött frakciója. Ezt persze részben okozhatják az ion-albumin kölcsönhatások is, de a spektrumok arra utalnak, hogy az alkáliföldfém-ionok versengenek az albuminnal a komplexképződésért, és a lényegesen magasabb fémion-koncentrációk eredményeként képesek komplexbe vinni az OTA egy részét, még a BSA-val szemben is. Mivel az alkáliföldfém-ionok stabilabb komplexet képeznek OTA2--val, mint az alkálifémek ionjai, az alkáliföldfém-ion – OTA komplexekkel foglalkoztunk bővebben. Először a kötési állandókat határoztuk meg. 2 µM OTA-hoz emelkedő koncentrációban adtuk a fémionokat (50 µM-100 mM). A méréseket ismét TRIS-HCl (pH = 7,4) pufferben végeztük, 380 nm-es gerjesztést alkalmazva. A spektrumok háttérkorrekcióját OriginPro8 szoftver (OriginLab Corp., Northampton, MA) felhasználásával végeztük. A kötési állandók meghatározása Hyperquad2006 (Protonic Software) programmal történt 1:1 sztöchiometriájú modellt alkalmazva (Poór és mtsai 2013c, 2013d): I I0
2 ( I HG I 0 ) 1 1 [ H ]0 [G]0 [ H ]0 [G]0 4 [ H ]0 [G]0 2 [ H ]0 K K
(11)
ahol, I az OTA fluoreszcens emissziós jelintenzitása alkáliföldfém-ionok jelenlétében, I0 az OTA emissziós intenzitása alkáliföldfém-ionok nélkül, IHG a tiszta OTA-ion komplex emissziós intenzitása (amit a Hyperquard2006 programmal határoztunk meg), K a komplex kötési állandója, [H]0 és [G]0 az OTA és az alkáliföldfém-ionok kezdeti koncentrációja.
51
A komplexek kötési állandóit dm3/mol-ban értjük és ennek logaritmusát adtuk meg. A logKértékek a következőek szerint alakultak: OTA-Mg2+ = 3,40 ± 0,01, OTA-Ca2+ = 2,78 ± 0,01, OTA-Ba2+ = 1,92 ± 0,02. Mivel a magnéziumion 4-szer stabilabb komplexet képez OTA-val, mint a kálciumion, továbbá 30-szor stabilabbat, mint a báriumion, a továbbikban főként az OTA2--Mg2+ komplexszel foglalkoztunk. A komplex termodinamikáját pH = 7,4-es TRIS-HCl és PBS pufferekben vizsgáltuk. A stabilitási állandókat az előzőekben leírtak szerint határoztuk meg 20, 25, 30, 35 és 40 °C-on. A termodinamikai paraméterek megállapítása a van’t Hoff egyenlet felhasználásával történt: (12) ahol K a kötési állandó, H az entalpia, S az entrópia, R az egyetemes gázállandó, T pedig a termodinamikai hőmérséklet. Az eredmények a 20. ábrán és a 3. táblázatban tekinthetők meg. Érdekes módon TRIS-HCl pufferben lényegesen magasabb kötési állandókat határoztunk meg, mint PBS esetében. Ennek oka az lehet, hogy a PBS nagy mennyiségben tartalmaz alkálifém-ionokt (csaknem 150 mM), és még akkor is, ha az OTA-val képezett komplexük stabilitása számottevően alacsonyabb, képesek versengeni a magnéziumionnal. Az azonban mindkét esetben jól látszik, hogy a komplexképződés entrópia által vezérelt folyamat.
Ez
arra
utal,
hogy
a
magnéziumionok
hidrátburkának
elvesztése
entrópianövekedéssel jár és valószínűleg az OTA-n lévő kötőhelyükről is lépnek ki vízmolekulák.
20. ábra: Balra az OTA spektrumai emelkedő magnéziumion-koncentráció mellett (25 °C-on, pH = 7,4 TRIS-HCl pufferben), valamint jobbra a van’t Hoff - összefüggés grafikus alkalmazása látható TRIS-HCl (fekete) és PBS (piros) pufferekben (pH = 7,4). 52
logK Puffer TRIS-HCl PBS
20 °C
25 °C
30 °C
35 °C
40 °C
3.43 ± 0.03 2.99 ± 0.01
3.40 ± 0.01 3.00 ± 0.01
3.34 ± 0.01 2.99 ± 0.01
3.36 ± 0.01 2.97 ± 0.01
3.34 ± 0.01 2.96 ± 0.01
ΔH (kJ·mol-1)
ΔS (J·mol-1·K-1)
-8 ± 0
38 ± 1
-3 ± 1
47 ± 5
3. táblázat: Az OTA2--Mg2+ komplex logK-értékei 20-40 °C-on, és az ebből számolt entalpiaés entrópiaváltozások pH = 7,4-es TRIS-HCl és PBS pufferben. Ezt követően a pH hatását vizsgáltuk az OTA-magnézium interakcióra. A méréseket 2 µM OTA-val és 100 mM MgCl2-dal végeztük. Vizsgálatainkhoz 4,0-9,0-es pH-jú 0,03 M-os koncentrációjú ammónium-acetát puffereket alkalmaztunk. Az eredményeket a 21. ábra szemlélteti. A felvett gerjesztési és emissziós spektrumok egyaránt igazolják, hogy magnéziumion nélkül pH = 4,0 és pH = 5,0 esetében a dianion forma nincs jelen, pH = 6,0-on már megjelenik az OTA2- is, és pH = 9,0 szükséges ahhoz, hogy a toxin teljes mennyisége dianion formába kerüljön (a spektrumok pH = 9,0 fölött nem változnak tovább). Azonban magnéziumion jelenlétében a komplexképződés már pH = 4,0-en megindul és pH = 7,0-et elérve a teljes OTA-frakció magnézium komplex formájában van jelen.
21. ábra: OTA (2 µM) gerjesztési spektrumai magnéziumion nélkül (balra) és 100 mM Mg2+ jelenlétében (jobbra) 4,0-9,0-es pH-jú 0,03 M-os ammónium-acetát pufferben.
53
A következő lépésben MOPAC2009 (11.366W verzió) program segítségével határoztuk meg a kötési energiákat, PM6 szemiempírikus kalkulációt alkalmazva. A geometriai optimalizációt követően az OTA legalacsonyabb energiaszintű konformációival végeztük el a számításokat monoanion és dianion formára egyaránt. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze. Meglepő módon az először meghatározott értékek arra utaltak, hogy a báriumion a magnéziumionhoz hasonló, a kálciumionnál magasabb kötési energiával kapcsolódik az OTA-hoz. Az alacsonybb felületi töltéssűrűségnek elvileg a kötési energia csökkenését kellene eredményeznie, azonban a báriumion nagyobb mérete miatt kölcsönhatásba lép a benzol-gyűrűvel is, ami stabilizálja a komplexet. Emellett azonban az is kiderült, hogy a magnéziumion hidrátburkát 7 vagy maximum 8 vízmolekula alkotja. A hidrátburkot alkotó vízmolekulák számértéke a kálcium- és főként a báriumionok nagyobb mérete miatt ezen utóbbi ionok esetében lényegesen nagyobb lehet, ami egy bizonyos számérték fölött klaszterek képződését is eredményezheti. Ez pedig nehezebbé teszi az ion hidrátburokból való kiszakítását, ami az OTA-val történő kölcsönhatásnak az alapfeltétele. A nettó energiaváltozásokat 8 vízmolekulára számoltuk ki: az így kapott értékek tendenciái kiválóan korrelálnak kísérleti eredményeinkkel. Emellett a számolt adatok azzal a megfigyelésünkkel is összhangban vannak, hogy az alkáliföldfém-ionok jelentős preferenciát mutatnak a dianion forma iránt. Az OTA2--Mg2+ komplex szerkezetét a 22. ábrán tüntettük föl.
2+
Mg Ca2+ Ba2+
OTA-1462 -1136 -1567
OTA2-2169 -1725 -2064
8 H2 O -1248 -830 -1634
ΔE1 -214 -306 67
ΔE2 -921 -895 -430
4. táblázat: Alkáliföldfém-ionok kötési energiái (kJ/mol) az OTA monoanion- és dianionformáival, valamint az ionok interakciós energiái 8 vízmolekulát tartalmazó hidrátburokban. ΔE1 és ΔE2 pedig az alábbi folyamat energiaváltozásai OTA-monoanion és -dianion esetében: (fémion)aq → OTA–(fémion) komplex + vízmolekulák. Végül az OTA-magnéziumion kölcsönhatást PBS-ben (pH = 7,4) vizsgáltuk, hogy lássuk, extracelluláris fiziológiáshoz hasonló körülmények között milyen arányok szükségesek a kölcsönhatás létrejöttéhez. A Mg2+ már 50-szeres koncentrációban láthatóan balra tolta el az OTA spektrumát és növelte a toxin fluoreszcenciáját, tehát jól láthatóan kölcsönhatásba léptek egymással. Ahhoz, hogy az OTA teljes mennyisége magnézium komplexbe kerüljön 15.000szeres Mg2+-koncentrációra volt szükség. 54
22. ábra: Az OTA2--Mg2+ komplex szerkezete: a pozitív töltésű ion a negatív töltésű oxigénatomok és az aromás csoport(ok) felé orientálódik. (A többi vizsgált kation OTA2--val képezett komplexének szerkezete a 3. számú mellékletben tekinthető meg.)
V. 5. OTA2--Mg2+ interakció alkalmazása HPLC-FLD rendszerre Ahogy azt az előző részben tárgyaltuk, az OTA-magnéziumion interakció eredményeként jelentős mértékben nő a toxin fluoreszcenciája. Ez a kísérleti tapasztalat, valamint a komplexstabilitás mértéke arra utal, hogy a kölcsönhatás feltehetően alkalmas lehet fluoreszcens analitikai módszerek érzékenységének növelésére. Ennek bizonyítása érdekében HPLC-FLD műszeren teszteltük feltételezésünket. Miután igazoltuk, hogy vékonyrétegen működik a komplexképződés, savas és bázikus eluensben is megtörtént az OTA HPLCmérése, annak érdekében, hogy a nemionos, a dianion és a magnézium-kötött dianion formára is legyenek eredményeink. Az 5000 μM-os koncentrációjú OTA-törzsoldat (etanolban) hígításával 2,5-1000 nM közötti koncentráció-tartományban (2,5, 5, 10, 50, 100, 500 és 1000 nM) standardokat készítettünk. Az oldatokat 4°C-on, fénytől védve tároltuk. Mivel a toxin nemionos, valamint a dianion formája között jelentős a fluoreszcens eltérés, savas és bázikus eluenst is alkalmaztunk. Savas mozgófázisként egy korábbi összehasonlító vizsgálatban leghatékonyabbnak ítélt eluenst alkalmaztunk (Afsah-Hejri és Jinap 2013): Acetonitril / CH3COONa puffer, 5mM, pH = 3,0 / Metanol (30/40/30, v/v%), a későbbiekben nevezzük ezt „A”-elunsnek (λexc = 333 nm, λem = 460 nm). Alkalikus mozgófázisként trietilamin puffert (trietilamin-hidroklorid/trietilamin, 5 mM, pH = 9.8) és acetonitrilt (ACN) használtunk. A grádiens elúció a következők szerint alakult: 0-10 percig az ACN-t lineárisan 17,5%-ról (v/v) 25,0%-ra (v/v) növeltük, míg a trietilamin puffert 82,5%-ról (v/v) 75%-ra (v/v) csökkentettük. Majd 10-12 perc között visszaálltunk a kezdeti állapotra. Nevezzük ezt a mozgófázist „B”-eluensnek. A harmadik 55
esetben 5 mM MgCl2-ot oldottunk fel a „B”-eluens puffer-komponensében (trietilamin puffer), és az elúció az előzőekben „B”-eluensre leírtak szerint történt, ezt a továbbiakban „C”-eluensként említjük.
23. ábra: Az OTA kromatogramjai (25 nM) a három különböző eluens esetében: A – savas eluens, B – alkalikus eluens Mg2+ nélkül, C – alkalikus eluens Mg2+-nal. A „B”- és „C”-eluenseknél 386 nm-en gerjesztettük a mintát, míg 440 nm-en mértük az emisszióját, mivel mind a szabad, mind a magnéziumiont kötött OTA2- fluoreszcens hullámhossz-maximumai jelentősen eltérnek a nemionos formáétól. Mindhárom esetben 5 µl mintát injektáltunk, az elválasztást 30°C-on végeztük, 0,85 ml/perces áramlási sebesség mellett. Az értékelés a fluoreszcens spektrumok görbe alatti területeiből (AUC) történt. A módszerek mindegyik esetben lineárisak voltak a 2,5-1000 nM-os koncentrációtartományban, a pontosság-adatok (intra- és inter-day) RSD-értéke nem haladta meg az 5%ot. A három módszer összehasonlítása 25 nM-os OTA-koncentráció esetében a 23. ábrán látható. Egészen jelentős különbség tapasztalható a különböző eluensek alkalmazása kapcsán. A számolt detektálhatósági határ (LOD) és meghatározhatósági határ (LOQ) is nagymértékben eltér (5. táblázat). Eredményeink alátámasztják, hogy a magnéziumion valóban alkalmas arra, hogy jelentősen fokozzuk vele az OTA fluoreszcens meghatározásának érzékenységét, még kromatográfiás eljárások esetében is.
56
LOD LOQ
"A"-eluens (nM) 10 20
"B"-eluens (nM) 2 5
"C"-eluens (nM) 1 2,5
5. táblázat: Az általunk meghatározott LOD- és LOQ-értékek a három alkalmazott eluens esetében, azonos detektorbeállítások mellett.
V. 6. OTA interakciója cink(II)-ionokkal Más kétértékű kationok esetleges kölcsönhatásait is vizsgáltuk az OTA-val: cink(II)-ionok esetében jelentősnek mondható kölcsönhatásra bukkantunk. A V.4. fejezetben leírtak szerint pH = 6,3-as 0,03 M-os ammónium-acetát és pH = 7,4-es 0,1 M-os TRIS-HCl pufferben végeztük méréseinket. Ismét azt tapasztaltuk, hogy a Zn2+ hasonlóan a Mg2+-hoz az OTA dianion formája iránt mutat preferenciát (24. ábra). Ebben az esetben is a gerjesztési és emissziós hullámhossz-maximumok változását (λexc = 370 nm, λem = 431 nm), valamint a fluoreszcens jel növekedését figyeltük meg (25. ábra). Az OTA2--Zn2+ komplex esetében logK = 3,78 (±0,02) értéket határoztunk meg 25°C-on (a 11. egyenlet felhasználásával). Ez az OTA2--Mg2+ komplex stabilitási állandójának csaknem 2,5-szerese. Termodinamikai méréseink alapján a kölcsönhatás – a magnéziumhoz hasonlóan – entrópia-vezérelt folyamat (ΔS = 34,0 ± 9,8). Az OTA2--Zn2+ komplex feltételezett szerkezetét a 4. mellékletben tüntettük föl.
24. ábra: 1 µM OTA gerjesztési (balra) és emissziós (jobbra) spektrumai növekvő ZnCl2koncentrációk (0-10 mM) jelenlétében pH = 6,3-as 0,03 M-os ammónium-acetát pufferben (λexc = 370 nm, λem = 431 nm). 57
25. ábra: 1 µM OTA emissziós spektrumai növekvő ZnCl2-koncentrációk (0-5 mM) mellett pH = 7,4-es 0,1 M-os TRIS-HCl pufferben (λexc = 370 nm, λem = 431 nm).
V. 7. OTA interakciója ciklodextrinekkel Néhány korábbi publikáció beszámol az OTA interakciójáról β- és γ-ciklodextrinekkel. A komplexek stabilitása azonban elég alacsony és az interakció sok esetben nem, vagy csak minimális fluoreszcencia-változással jár (Maragos és mtsai 2008, Amadasi és mtsai 2007, Hashemi és Alizadeh 2009). Többféle kémiailag módosított β-CD-t teszteltünk annak érdekében, hogy olyan származékot találjunk, ami stabilabb komplexet képez OTA-val a korábbiakban leírtaknál, és emellett preferenciát mutat az OTA dianion formája iránt. Egyértelműen a QABCD ([2-hidroxi-3-N,N,N-trimetilamino]-propil-β-ciklodextrin-klorid) bizonyult a legeredményesebb származéknak, ezért a következőekben ezeket az eredményeinket ismertetem. Elsőként 20 mM QABCD-t adtunk 1 µM OTA-hoz pH = 5,2-es és pH = 9,0-es 0,03 M-os ammónium-acetát pufferben: az alkalmazott CD nem okozott spektrális változást sem a monoanion, sem a dianion forma esetében. Ez jól demonstrálja, hogy a toxin inklúziója QABCD által nem eredményez eltérést annak fluoreszcenciájában. Azért, hogy megvizsgáljuk az esetleges preferenciát a toxin monoanion vagy dianion formája iránt 1 µM OTA-t alkalmaztunk pH = 6,4-es 0,03 M-os ammónium-acetát pufferben, mivel így az OTA- és az OTA2- is jelen van a rendszerben. A 26. ábrán jól látható, hogy növekvő QABCD-koncentráció mellett az egyensúly jelentősen eltolódik a dianion forma irányába, amit az OTA2--val történő komplexképződés eredményez. Ez arra utal, hogy a dianion formával lényegesen stabilabb a kölcsönhatás a monoanion formához képest. Mivel az inklúzió nem jár fluoreszcencia-változással, más módszert kellett találnunk a kölcsönhatás vizsgálatára. A ciklodextrinek mérete elég nagy ahhoz, hogy kötődés esetén 58
lényegesen megemeljék az OTA fluoreszcencia polarizációját, éppen ezért az említett technika a CD-ek esetében is hasznosnak bizonyult. A kölcsönhatást pH = 5,2-es ammóniumacetát pufferben vizsgáltuk monoanion, míg pH = 9,0-esben dianion formára, azért, hogy a lehetséges kompetíciót elkerüljük a két forma között. A mérésekhez 1 µM OTA-t és növekvő koncentrációjú QABCD-t alkalmaztunk, az OTA saját hullámhossz-maximumait használva. Az OTA2- polarizációjának változását QABCD hatására a 27. ábra mutatja be. A polarizációs adatokból a 3-as és 4-es egyenletek felhasználásával 1:1 sztöchiometriájú modellt alkalmazva (n = 1) határoztuk meg a stabilitási állandókat a következő összefüggés segítségével (Il’ichiev és mtsai 2002b):
K
(13) [(1 ) (n CCD COTA )]
ahol COTA és CCD az OTA és a QABCD összkoncentrációja az oldatban. A kapott logK-értékek a következők: OTA--QABCD = 2,33 ± 0,19 és OTA2--QABCD = 4.46 ± 0.09. Ez azt jelenti, hogy a QABCD kb. 130-szor stabilabb komplexet képez a toxin dianion formájával, mint a monoanionnal. Ezután a β-CD kötési állandóját határoztuk meg OTA2--nal az előzőekkel megegyező módon: 2,16 ± 0,06-ot állapítottunk meg, mint logK-értéket. Tehát a QABCD 200-szor stabilabb komplexet képez OTA-dianionnal, mint a natív β-CD. Eredményeink jól demonstrálják, hogy amennyiben az inklúziót ionos kölcsönhatással erősítjük, stabilabb komplexet nyerünk. Ezt a feltételezést a molekuláris modellezés is megerősítette (5. melléklet).
26. ábra: 1µM OTA gerjesztési (balra; λem = 443 nm) és emissziós (jobbra; λexc = 380 nm) spektruma növekvő QABCD-koncentráció mellett pH = 6,4-es 0,03 M-os ammónium-acetát pufferben.
59
27. ábra: 1 µM OTA fluoreszcencia polarizációs értékei növekvő QABCD-koncentráció jelenlétében pH = 9,0-es 0,1 M-os TRIS-HCl pufferben (λexc = 380 nm; λem = 443 nm). Vizsgáltuk
továbbá
az
OTA2--Mg2+
interakciót
QABCD
jelenlétében
(PBS-ben).
Eredményeink szerint a QABCD a magnéziumionnál erősebb kompetitor. Az OTA-QABCD komplex (1 µM OTA + emelkedő QABCD koncentráció) stabilitási állandóját meghatároztuk 15 mM MgCl2 jelenlétében is (a 11. egyenlet felhasználásával). Ebben az esetben 1,50 (± 0,01) adódott logK értéknek. Az V.4. alfejezetben már tárgyaltuk, hogy az OTA2--Mg2+ komplex logK-értéke pH = 7,4-es PBS pufferben 3,00. Mivel ez egy kicserélődési reakció, a két érték összeadásával 4,50-ot kapunk, ami jól korrelál a korábban fluoreszcencia polarizációval meghatározott stabilitási állandóval. Az OTA2--QABCD komplex stabilitása jóval alacsonyabb a toxin humán albuminnal képezett komplexénél, ezért csak nagyon magas QABCD-koncentrációkkal tudjuk az OTA-t leszorítnai HSA-ról (6. melléklet).
V. 8. OTA hatásai MDCK sejteken Alábbi kísérleteinkben lyukanként 1,5 * 104 sejtet raktunk ki 96-lyukú lemezekre 150 µl médiumban (Bürker-kamrával leszámolva) és 16 óra múlva kezdtük meg az inkubálást. 0-15 µM közötti OTA-koncentrációval kezeltük a sejteket 24 órán keresztül, 150 µl médiumtérfogatokat alkalmazva. A mérési módszereket és azok elméleti hátterét a IV.4. részben foglaltuk össze. A 28. ábrán a lyukanként mért összfehérje-koncentrációkat, calceinfluoreszcenciákat, valamint az ATP/fehérje- és ROS/fehérje-arányokat tüntettük fel. OTA hatására mindegyik érték koncentráció-függő, jelentős változást mutatott. A calcein-értékek lineárisan korreláltak az inkubálás lejártát követően Bürker-kamrával meghatározott sejtszámokkal. Méréseink alapján az összfehérje-koncentráció a sejtszámmal hasonló 60
mértékben változik. Ez azt jelenti, hogy az általunk alkalmazott kísérleti modellben jelentős mértékben csökken az élő sejtek száma a kontrollhoz képest, azonban az irodalomban leírt nemspecifikus fehérjeszintézis-gátlás nem túl kifejezett. Ezzel szemben a proteinre vonatkoztatott ATP-szint szignifikáns mértékben csökken. Továbbá a ROS/fehérje-arány jelentős emelkedése is megfigyelhető. Az OTA apoptotikus/nekrotikus, valamint sejtciklusra gyakorolt hatását 6-lyukú lemezeken vizsgáltuk, lyukanként 8 * 105 sejtet raktunk ki 1000 µl médiumban és 16 óra múlva történt az inkubálás. A médiumot 2000 µl frissre cseréltük és többféle OTA-koncentrációval inkubáltuk 24 órán keresztül. Az PI – FITC AnnexinV próba eredményét a 29. ábra demonstrálja. Jól látható, hogy az apoptotikus sejtek száma nő, azonban jelentős emelkedés csak extrém koncentrációk esetében tapasztalható (itt magasabb, 50 µM-os OTA-koncentrációt is alkalmaztunk, hogy igazoljuk a jelölés eredményességét). Ezzel szemben az OTA sejtciklusra gyakorolt negatív hatását már 5 µM OTA esetében is tapasztaltuk: a G2/M-fázis koncentráció-függő emelkedését figyeltük meg, miközben a G0/G1-fázisú sejtek száma csökken, valamint az S-fázisúak száma gyakorlatilag változatlan (30. ábra).
28. ábra: OTA hatása a sejtszámra, valamint az intracelluláris fehérje-, ATP- és ROSkoncentrációkra 24 órás inkubációt követően (*p ˂ 0,05).
61
29. ábra: OTA apoptotikus hatása MDCK-sejteken 24 órás kezelést követően.
30. ábra: OTA hatása a sejtciklusra MDCK-sejteken 24 órás inkubációt követően: már 10 µM OTA szignifikáns G2/M -blokkot eredményez (*p ˂ 0,05).
62
V. 9. Diosmetin hatása OTA-val kezelt sejteken Számos vegyületet teszteltünk annak érdekében, hogy egy olyan anyagra leljünk, amivel ellensúlyozható az OTA negatív hatása MDCK-sejteken. A diosmetin (DIOS) nevű flavonoidaglikon esetében meglepő hatást tapasztaltunk. Az anyag már önmagában adva is 6 és 12 órás inkubációkat követően szignifikánsan emelte az intracelluláris ATP-szintet a kezelt sejtekben, majd 24 órát követően az ATP-koncentráció visszatért a kontroll szintjére (31. ábra). Lumineszcens eredményeinket a HPLC-UV módszerrel (perklórsavas extrakciót) végzett méréseink is megerősítették: 12 órás inkubációt követően (10 µM DIOS-t alkalmazva) az ATP-koncentráció és az ATP/ADP- arány szignifikáns emelkedését tapasztaltuk (p < 0,05; 7. melléklet). Emellett a calcein esszé és az összfehérje meghatározása igazolta, hogy eközben az élő sejtek száma változatlan a kontrollhoz viszonyítva. A DIOS hatásmechanizmusának megértése céljából különböző gátlószereket alkalmaztunk: nátrium-fluoridot (glikolízis gátlása), 3-bromopiruvátot (glikolízis és piruvát-dehidrogenáz gátlása), valamint oligomicin A-t (ATP-szintáz gátlása). Érdekes módon a NaF és a 3-bromopiruvát nem volt képes felfüggeszteni a DIOS által eredményezett ATP-emelkedést, azonban oligomicin A adására a hatás teljesen megszűnt (32. ábra). Fontos megemlíteni azt is, hogy a diosmetinen kívül további 16 flavonoid aglikont teszteltünk (acacetin, apigenin, baicalein, catechin, chrysin, daidzein, fisetin, flavon, galangin, genistein, hesperetin, luteolin, morin, myricetin, naringenin, quercetin), amelyek esetében nem volt szignifikáns változás, vagy még csökkent is a sejtek ATP-tartalma (8. melléklet). Ezt követően a DIOS hatását OTA-kezelt sejteken teszteltük. MDCK-sejtek esetében az OTA 24 óra alatt fejt ki jelentős hatást alacsonyabb koncentrációkban (5-15 µM), míg a DIOS kedvező hatása 6-12 órás kezelést követően mutatkozik meg. Ebből kifolyólag az MDCKsejteket 12 órán keresztül inkubáltuk 15 µM OTA-t tartalmazó médiumban (150 µl/well), majd a médium lecserélése nélkül hozzáadtunk DIOS-t (lyukanként 50 µl médiumban) úgy, hogy a végkoncentrációk 5, 10 és 15 µM legyenek. Ezt a lépést további 12 óra inkubáció követte. A 33. ábra demonstrálja, hogy mindhárom DIOS-koncentráció jelentősen emelte az intracelluláris ATP-szinteket az OTA-val kezelt sejtekben. Olyannyira, hogy 15 µM DIOS esetében teljes mértékben sikerült visszaállítani a sejtek ATP-tartalmát a kontroll szintjére. Emellett a ROS-szinteket is meghatároztuk a sejtekben: a DIOS önmagában és OTA-val együttesen kezelt sejtek esetében is szignifikánsan, de csak kis mértékben csökkentette a ROS-koncentrációt (34. ábra). Azonban az OTA sejtciklusra gyakorolt negatív hatását nem tudtuk diosmetinnel ellensúlyozni.
63
31. ábra: DIOS hatása az intracelluláris ATP-konentrációra MDCK-sejteken 6, 12 és 24 órás inkubálást követően (*p < 0,05). Az ATP/fehérje-arányt (+SD) a kontrollhoz viszonyítva %ban fejeztük ki.
32. ábra: 10 µM DIOS hatása az intracelluláris ATP-konentrációra MDCK-sejteken önmagában, valamint nátrium-fluorid (NaF), 3-bromopiruvát (3-BP) és oligomicin A (OmA) jelenlétében 12 órás inkubációt követően (*p < 0,05). Az ATP/fehérje-arányt (+SD) a kontrollhoz viszonyítva %-ban fejeztük ki.
64
33. ábra: MDCK-sejtek ATP-tartalma 24 órás kezelést követően OTA-val és OTA+DIOS-nel (12 órás inkubáció OTA-val, majd szupplementáció DIOS-nel és további 12 óra inkubáció; *p < 0,05). Az ATP/fehérje-arányt (+SD) a kontrollhoz viszonyítva %-ban fejeztük ki.
34. ábra: MDCK-sejtek intracellulári ROS-koncentrációja 24 órás kezelést követően OTA-val és OTA+DIOS-nel (12 órás inkubáció OTA-val, majd szupplementáció DIOS-nel és további 12 óra inkubáció; *p < 0,05). A ROS/fehérje-arányt (+SD) a kontrollhoz viszonyítva %-ban fejeztük ki. 65
VI. Megbeszélés Mivel az albuminkötődés az OTA toxikokinetikájában egy kulcsmomentum, érdeklődésünk egyik kiemelt tárgyát képezi. Az OTA-HSA komplex stabilitási állandóját háromféleképpen is meghatároztuk (fluoreszcencia intenzitás, polarizáció és kioltás alapján): mindhárom esetben hasonló, 107 dm3/mol fölötti K-értéket kaptunk (Poór és mtsai 2012, 2014, Li és mtsai 2014). Ez az érték az albumin-ligand komplexek között kiemelkedően magas és magyarázatot ad a toxin extrém hosszú plazmafelezési idejére (Studer-Rohr és mtsai 2000). Szintén különlegesnek számít az eltérés a három albumin species esetében (humán, marha és patkány albumin), ilyen szintű különbségekre nem találtunk egyéb példát a szakirodalomban (Poór és mtsai 2014). A korábbi eredmények alapján számítani lehetett számottevő eltérésekre, de ezek az adatok különböző vizsgálatokból származtak (Perry és mtsai 2003). A fluoreszcencia polarizáció elvén alapuló módszer (Il’ichiev és mtsai 2002b) kiválóan alkalmazhatónak bizonyult az OTA-HSA interakció esetében. Vizsgálatunkban sikerült több olyan gyógyszert is találnunk, amelyek igen hatásos kompetitornak bizonyultak a toxinnal szemben. Amint azt a korábbiakban leírtuk, néhány közlemény beszámolt már a warfarin és egyes NSAID-ok kölcsönhatásairól OTA-val. De a furosemide, glipizide és simvastatin azonosítása, valamint a phenobarbital és acetilszalicilsav kizárása (mivel erről a két anyagról több esetben valószínűsítették már az esetleges leszorításos interakciót) mint kompetitorok új információt jelentenek. Véleményünk szerint érdemes lenne megvizsgálni, hogy az említett kompetitorok valamelyikét krónikusan alkalmazó páciensek körében változik-e és ha igen, akkor hogyan változik az endémiás nefropátia vagy a húgyúti tumorok előfordulása az endémiás zónákban. Habár az esetleges pozitív vagy negatív hatást egyéb kölcsönhatások is eredményezhetik, mégis lehetőséget jelentene arra, hogy humán adatokhoz jussunk. A flavonoidok potenciális alkalmazása OTA-val szemben biztatónak tűnik. Számos olyan korábban publikált eredményről tudunk, amelyekben az OTA valamely negatív hatását ellensúlyozni tudták egyes növényi eredetű polifenolokkal. E közleményekben többnyire a flavonoidok antioxidatív/scavenger hatását emelik ki. Emellett egyes flavonoidok képesek gátolni az OAT és OATP traszportereket (Hong és mtsai 2007, Wong és mtsai 2011, Wang és mtsai 2005), amelyek szerepet játszanak az OTA celluláris felvételében. A teljesség kedvéért ezt ki kell egészíteni azzal, hogy egyes flavonoidok szintén gátolni képesek olyan multidrogrezisztens transzportereket, mint amilyen az MRP2 (Sergent és mtsai 2005, Brand és mtsai 2006). Ez nem előnyös, mivel azt valószínűsítik, hogy az MRP2 szerepet játszhat az OTA
66
bélbe és vizeletbe történő szekréciójában (Berger és mtsai 2003). A flavonoidok HSA-val képezett komplexeinek stabilitása többnyire meghaladja a gyógyszerekét (Xiao és mtsai 2011, Poór és mtsai 2013c), tehát alacsonyabb mennyiségben is alkalmasak az OTA leszorítására. Eredményeink ezt a legtöbb aglikon esetében megerősítik. Jelenlegi ismereteink alapján a flavonoidok toxicitása alacsony, tehát elvileg nagyobb mennyiségben is alkalmazhatjuk őket anélkül, hogy komolyabb mellékhatásokkal kellene számolnunk. A flavonoidok first-pass metabolizmusa magas (Havsteen 2002). A farmakodinámiás hatások a metabolizmus során általában csökennek, azonban több olyan flavonoid metabolitot írtak le pl. quercetin esetében, amelyek albuminkötődése csak kis mértékben csökken, vagy legalábbis nem szűnik meg (Dangles és mtsai 2001). Ez javíthatja a kinetikai interakció kiaknázhatóságát. Vannak olyan állatkísérletes eredmények, amelyek az albuminról való leszorítás pozitív hatására utalnak, de jelenleg nincs erre döntő bizonyíték. Másrészt a magasabb vérszint feltehetőleg emelkedett metabolizmussal is jár. Nem tudhatjuk, hogy a detoxikáció (pl. 4-OHOTA és 10-OH-OTA) mellett fog-e képződni nagyobb mennyiségben egyéb, magas toxicitású, reaktív metabolit is. Jelenleg azonban nem ismerünk olyan kutatást, amely egyértelműen azonosítaná a leszorításos interakció negatív hatását. Véleményem szerint érdemes lenne in vivo modellben tesztelni a hipotézist, hogy választ kaphassunk kérdéseinkre. A közelmúltban jelent meg egy közlemény, amelyben a quercetin hatását vizsgálták az OTA toxikokinetikájára patkányokban, a flavonoid MRP2-gátló aktivitása okán (Abbas és mtsai 2013). Nem tapasztaltak szignifikáns eltérést, azonban fontos megjegyezni, hogy a kísérletben alkalmazott quercetin mennyisége a toxinhoz viszonyítva túl alacsony volt ahhoz, hogy reális esély legyen a kompetíció kialakulására az albuminkötődés kapcsán. Vizsgálataink rámutatnak, hogy az OTA, és főként annak dianion formája kölcsönhatásba lép különböző alkálifém- és alkáliföldfém-ionokkal. Az OTA2--alkálifémion komplexek stabilitása rendkívül alacsony, így feltehetően biológiai jelentőségük sem számottevő. Ezzel szemben
az
OTA2--Mg2+
komplex
3,4-es
logK-értéke
már
korántsem
tűnik
elhanyagolhatónak. A komplex széles pH-tartományban képes kialakulni és vizsgálataink arra utalnak, hogy mind az extracelluláris, mind az intracelluláris Mg2+ mennyisége arányaiban elegendőnek tűnik ahhoz, hogy az OTA egy részét kötésben tartsa a szervezetben. A 104-szer stabilabb OTA-HSA komplexszel szemben a Mg2+ nem versenyképes (és a többi alkálifémvagy alkáliföldfém-ion sem), legalábbis fiziológiás koncentrációban semmiképpen. Azonban eredményeink alapján az OTA szabadnak hitt (nem fehérje-kötött) frakciója a vérben nagy részben magnéziumion-kötött formában lehet jelen. A kölcsönhatás biológiai jelentősége jelenleg ismeretlen. 67
Mivel az OTA2--Mg2+ komplex viszonylag stabil, valamint az interakció az OTA fluoreszcenciájának jelentős mértékű növekedésével jár, a jelenséget analitikai módszerek érzékenyítésére próbáltuk felhasználni. Számos eljárást dolgoztak ki az OTA kvantitatív meghatározása céljából (Scott 2002, Turner és mtsai 2009, Meulenberg 2012). Napjainkban a leggyakorabban alkalmazott műszer a HPLC-FLD, mivel ennek költsége lényegesen alacsonyabb az LC-MS-nél, és az OTA rendkívül intenzív fluoreszcenciája lehetővé teszi azt, hogy hasonló érzékenységgel mutassuk ki a toxint fluoreszcens detektorral, mint tömegspektrométerrel. Emellett a szükséges eluensek szintén sokkal olcsóbbak, mintha különféle immunológiai kiteket alkalmaznánk. Sokáig savas eluenst használtak az OTA kimutatására, a pH = 2-3 körüli értéken a toxin nemionos formáját detektálták (Valenta 1998, Scott 2002, Afsah-Hejri és Jinap 2013). Később rájöttek arra, hogy magasabb pH (9-10) mellett, TLC és HPLC-FLD esetében is jelentős mértékben nő az érzékenység (Pittet és Royer 2002, Dall'Asta és mtsai 2004, Toscani és mtsai 2007). Ez érthető, hiszen az OTA2fluoreszcens emissziós intenzitása jócskán meghaladja mind a nemionos, mind a monoanion formáét, ahogy ezt a V.1-es alfejezetben tárgyaltuk. Hasonlóan a szakirodalomban leírtakhoz, az érzékenység jelentős növekedését figyeltük meg az alkalikus eluens alkalmazása esetén (a savas eluenshez képest). Ha a bázikus eluenst kiegészítjük magnézium-kloriddal, akkor az eltérés ugyancsak szembetűnő. A Mg2+ alkalmazása alkalikus eluensekben azért lehet nagy jelentőségű, mert duplájára emelhetjük a detektálás érzékenységét, anélkül, hogy az eljárás költségei emelkednének, emellett a módszer a mintaelőkészítést sem befolyásolja. Az alkálifém- és alkáliföldfém-ionokon túl egyéb kationokat is megvizsgáltunk. Ezek közül a cink(II)-ionok esetében találtunk jelentősebb kölcsönhatást. Az OTA direkt interakciója Zn2+ionokkak új információ. Az OTA2--Zn2+ interakcióra kétszer akkora stabilitást határoztunk meg, mint az OTA2--Mg2+ komplex esetében. Mivel újabb közlemények arról számolnak be, hogy az OTA egyes negatív hatásai cink(II)-ionokkal ellensúlyozhatók (Sorrenti és mtsai 2012, Zheng és mtsai 2013), talán lehet valamilyen szerepe az OTA2--Zn2+ kölcsönhatásnak. A ciklodextrineket már régóta használják vízben rosszul oldódó anyagok oldhatóságának növelésére (Szejtli 1988). Ezek a vegyületek különböző testápolók, kozmetikai termékek gyakran alkalmazott komponensei. A jelenség azon alapul, hogy a belül hidrofób tulajdonságú zseb, másodrendű kölcsönhatások révén képes egy megfelelő méretű és szerkezetű vendégmolekulát megkötni, és így a kívül hidrofil ciklodextrin oldatban is tartja azt (Dodziuk 2008). Attól függően, hogy hány glükopiranóz-molekulából épülnek föl (6, 7 vagy 8), beszélhetünk α-, β-, és γ-ciklodextrinekről. Gyógyászati felhasználásuk még nem rendelkezik nagy múlttal, azonban folyamatosan emelkedik azon akár perorális, akár intravénás 68
készítmények száma, amelyek ciklodextrint tartalmaznak. Léteznek olyan kémiailag módosított ciklodextrinek is, amelyek akár hasonló stabilitású komplexet is tudnak képezni egy specifikus ligandummal, mint amilyet az OTA képez a HSA-val (Zhang 2003, Yang and Keam 2009). Egy megfelelő szerkezetű CD-nel, amely kellő stabilitással képes kötni a toxint, megakadályozhatnánk az OTA abszorpcióját. Továbbá i.v. adva leszoríthatnánk a toxint az albuminról, és az 1-2 kDa-os CD-ek könnyedén filtrálódnak a vizelettel. Itt is az OTA2- a számunkra érdekes: mivel a vérben ez a forma lép kölcsönhatásba albuminnal, emellett korábbi vizsgálatok alapján a nemionos, esetleg a monoanion forma képes felszívódni a bélből (Galtier 1978, Kumagai és Aibara 1982, Roth és mtsai 1988), tehát ha dianionformában csapdáznánk a toxint, valószínűleg hatékonyan csökkenthetnénk az OTA abszorpcióját. Ezen okokból kezdtünk el különböző szerkezetű, kémiailag módosított β-CD származékokat tesztelni. A natív β-CD OTA-dianionnal képezett komplexének stabilitása nagyon alacsony (logK ~ 2,2). Ezt a korábbi publikációk és saját méréseink egyaránt igazolják (Maragos és mtsai 2008, Amadasi és mtsai 2007, Hashemi és Alizadeh 2009). Ezért az OTA inklúzióját elektrosztatikus kölcsönhatással próbáltuk erősíteni. Az ötlet bevált: amellett, hogy az alkalmazott származék (QABCD) jelentős preferenciát mutat az OTA dianion formája iránt (kb. 130-szorosat a monoanionhoz képest), a komplex stabilitása 200-szorosára emelkedett a β-CD-hez viszonyítva. Az így elért 4,46-os logK-érték jelentős előrelépés, de még mindig lényegesen elmarad az OTA-HSA komplex stabilitásától. Talán további módosításokkal még fokozható a hatékonyság. Mindenesetre azt a komplexstabilitást sikerült elérni, amelyet a szakirodalomban a kolesztiramin-OTA interakcióra leír, amivel jelentősen csökkenteni tudták az OTA abszorpcióját in vivo (Kerkadi és mtsai 1999, Madhyastha és mtsai 1992). MDCK-sejteken végezett in vitro kísérleteinkben az OTA nem fejtett ki jelentős negatív hatást a fehérjeszintézisre. A calcein viabilitás teszt eredményei jól korreláltak a Bürkerkamrával történő számolással: a sejtszám jelentős redukciója történt 24 órás kezelést követően. Vizsgálataink rámutattak arra is, hogy a hatásban a sejthalál (legyen az apoptotikus vagy nekrotikus) nem játszik jelentős szerepet az alkalmazott 5-15 µM-os koncentrációkban. Ezek alapján minden jel arra utal, hogy az alacsonyabb sejtszámot a sejtciklus gátlása, esetleg az energiaprodukció zavara okozza. Az ATP-szintek jelentős csökkenése már kisebb koncentrációkban is tapasztalható. Ezt diosmetinnel gyakorlatilag a kontroll szintjére vissza tudtuk állítani, azonban a sejtciklusra kifejtett negatív hatás nem változott. A diosmetinnél lényegesen magasabb antioxidatív hatással bíró flavonoidok mint pl. a quercetin (Villa és mtsai 1992, Morel és mtsai 1993, Husain és mtsai 1987, Seyoum és mtsai 2006, Ramyaa és Padma 2013), ugyanúgy hatástalannak bizonyultak, ami arra utal, hogy a sejtciklus blokádját 69
nem az OTA által indukált oxidatív károsodás eredményezi. Egy nemrég megjelent közleményben szintén arról számolnak be, hogy az oxidatív stressz nincs összefüggésben a toxin által vesesejtekben indukált negatív hatásokkal (Taniai és mtsai 2014). A bevezetésben taglalt antioxidáns hatású anyagok alkalmazásakor, a legtöbb esetben valamilyen viabilitási paramétert határoztak meg, de arra nem volt direkt adat, hogy a kontrollhoz képest tulajdonképpen mennyi sejt maradt életben az OTA-val kezelt csoportban. Felmerül a kérdés: Vajon „megmenthető-e” a sejtek egy része, vagy csak bizonyos biokémiai paramétereik javíthatók? További sejtkísérleteinkben az OTA sejtciklusra gyakorolt negatív hatásának részletesebb vizsgálatát tervezzük. A DIOS pozitív hatása az ATP-rendszerre rendkívül meglepő: korábbi vizsgálatok a celluláris energiaprodukcióra kifejtett negatív eredményekről számoltak be több flavonoid aglikonnal kapcsolatban is. Escherichia coli (E. coli) ATP-szintáz tisztított F1, valamint membrán-kötött F1Fo komplexei esetében számos bioflavonoid gátló hatását írták le (Chinnam és mtsai 2010). Teaflavinokkal
hasonló
eredményt
értek el
(E.
coli
ATP-szintáz), valamint
az
elektrontranszport-lánc gátlását is megfigyelték (Li és mtsai 2012). HL-60 sejtekben csökkent ATP-szinteket és a mitokondrium dózisfüggő hiperpolarizációját tapasztalták naringeninnel történő kezelést követően (Kanno és mtsai 2006). Egyes C-metilált flavonoidoknál az oxidatív foszforiláció szétkapcsolásáról számoltak be (Mathiesen és mtsai 1996), valamint a légzési lánc gátlását írták le quercetinre és galanginra (Dorta és mtsai 2005) patkánymáj mitokondrium esetében. A diosmetin kivételével mi is kisebb-nagyobb mértékű negatív hatást figyeltünk meg a többi tesztelt aglikon esetében (főleg hosszabb inkubációk alkalmazásakor), így eredményeink korrelálnak a korábbi megfigyelésekkel. A DIOS egy elég speciális szerkezetű 4’-O-metil-struktúrát tartalmazó flavon aglikon, amely 3’-hidroxilcsoportot is tartalmaz. Az ATP-szintre gyakorolt pozitív hatása úgy tűnik, hogy az ATP-szintázzal, vagy legalábbis a terminális oxidációval lehet kapcsolatban, mivel a glikolízis vagy citrátkör gátlásával nem, míg oligomycin adásával gátolható a jelenség. Vizsgálataink alapján a megfigyelt hatás nincs vagy csak kis mértékben van kapcsolatban a DIOS antioxidáns hatásával, ez nem elhanyagolható információ, mivel a sejt oxidatív státusza befolyásolhatja az ATP-szintézist (Schafer és mtsai 2009). A DIOS pontos hatásmechanizmusának megállapításához további vizsgálatokra van szükség, azonban eredményeink jól tükrözik, hogy egyes ATP-depletáló anyagokkal szemben, mint amilyen a NaF vagy az OTA in vitro sikerrel alkalmazható.
70
VII. Új megállapítások
Igazoltuk a korábban publikált fluoreszcencia polarizációs technikán alapuló módszer adekváltságát OTA-HSA kölcsönhatás esetében.
Azonos
modellben
megállapítottuk
az
OTA
humán,
marha
és
patkány
szérumalbuminnal képezett komplexeinek stabilitási állandóját.
Leírtuk, hogy a furosemide, glipizide és simvastatin képes az OTA-t leszorítani HSAról, valamint azt, hogy a phenobarbital és acetilszalicilsav nem tartozik a hatékony kompetitorok közé, ellentétben a korábbi feltételezésekkel.
Kimutattuk, valamint kémiailag és kvantitatíve jellemeztük egyes flavonoid aglikonok kompetíciós képességét OTA-val szemben a HSA-hoz való kötődésért.
Igazoltuk és jellemeztük az OTA interakcióját alkalifém-, alkáliföldfém-, valamint cink(II)-ionokkal. Az OTA2--Mg2+ komplex képződésekor történő fluoreszcencia növekedés elvén alapuló új, magasabb érzékenységű kromatográfiás eljárást dolgoztunk ki HPLC-FLD műszerre.
A korábban publikált OTA-CD komplexeknél lényegesen stabilabb interakciót találtunk az OTA-QABCD esetében. Emellett a QABCD erős preferenciát mutat a dianion forma iránt, eltérően a korábban leírt származékoktól.
Rámutattunk, hogy MDCK-sejtek esetében az OTA fő toxikus hatása a G2-fázis blokádja, amit antioxidánsokkal nem tudunk sikerrel ellensúlyozni.
Kimutattuk a diosmetin ATP-rendszerre gyakorolt pozitív hatását, és sikerrel használtuk föl az interakciót az OTA által indukált ATP-depléció visszafordítására.
71
VIII. Saját közlemények listája Jelen PhD dolgozat alapjául szolgáló közlemények Poór M, Kunsági-Máté S, Bencsik T, Petrik J, Vladimir-Knežević S, Kőszegi T, Flavonoid aglycones can compete with Ochratoxin A for human serum albumin: A new possible mode of action. INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES 51 (2012) 279-283. [IF: 2,596] Poór M, Kunsági-Máté S, Czibulya Z, Li Y, Peles-Lemli B, Petrik J, Vladimir-Knežević S, Kőszegi T, Fluorescence spectroscopic investigation of competitive interactions between ochratoxin A and 13 drug molecules for binding to human serum albumin. LUMINESCENCE 28 (2013) 726-733. [IF: 1,273] Poór M, Kunsági-Máté S, Matisz G, Li Y, Czibulya Z, Peles-Lemli B, Kőszegi T, Interaction of alkali and alkaline earth ions with Ochratoxin A. JOURNAL OF LUMINESCENCE 135 (2013) 276-280. [IF: 2,144] Poór M, Li Y, Matisz G, Kiss L, Kunsági-Máté S, Kőszegi T, Quantitation of species differences in albumin-ligand interactions for bovine, human and rat serum albumins using fluorescence spectroscopy: A test case with some Sudlow's site I ligands. JOURNAL OF LUMINESCENCE 145 (2014) 767-773. [IF: 2,144] Poór M, Veres B, Jakus PB, Antus C, Montskó G, Zrínyi Z, Vladimir-Knežević S, Petrik J, Kőszegi T, Flavonoid diosmetin increases ATP levels in kidney cells and relieves ATP depleting effect of ochratoxin A. JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B: BIOLOGY 132 (2014) 1-9. [IF: 3,110] Poór M, Kuzma M, Matisz G, Li Y, Perjési P, Kunsági-Máté S, Kőszegi T, Further aspects of ochratoxin A – cation interactions: complex formation with zinc ions and a novel analytical application of ochratoxin A – magnesium interaction in HPLC-FLD system. TOXINS (BASEL) (2014) Accepted manuscript. [IF: 2,129] Li Y, Czibulya Z, Poór M, Lecomte S, Kiss L, Harte E, Kőszegi T, Kunsági-Máté S, Thermodynamic study of the effects of ethanol on the interaction of ochratoxin A with human serumalbumin. JOURNAL OF LUMINESCENCE 148 (2014) 18-25. [IF: 2,144] Jelen PhD dolgozat alapjául szolgáló előadások és poszterek Poór M, Kőszegi T, Kunsági-Máté S, Competitive Interaction between Flavonoid Aglycons and Ochratoxin A During their Binding to Human Serum Albumin. The Third Asian Spectroscopy Conference (Xiamen, Kína, 2011.11.28-2012.12.01.) [poszter] Poór M, Kőszegi T, Li Y, Czibulya Z, Kunsági-Máté S, Investigation of competitive interaction between Ochratoxin A and drug molecules for serum albumin. 10th Conference of Colloid Chemistry (Budapest, Magyarország, 2012.08.29-2012.08.31.) [poszter]
72
Poór M, Li Y, Matisz G, Kőszegi T, Kunsági-Máté S, Interaction of Ochratoxin A with alkaline earth ions. 1st Symposium on Weak Molecular Interactions (Pécs, Magyarország, 2013.03.05-2013.03.06.) [előadás] Egyéb közlemények Poór M, Li Y, Kunsági-Máté S, Petrik J, Vladimir-Knežević S, Kőszegi T, Molecular displacement of warfarin from human serum albumin by flavonoid aglycones. JOURNAL OF LUMINESCENCE 142 (2013) 122-127. [IF: 2,144] Poór M, Li Y, Kunsági-Máté S, Varga Z, Hunyadi A, Dankó B, Chang FR, Wu YC, Kőszegi T, Protoapigenone derivatives: albumin binding properties and effects on HepG2 cells. JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B: BIOLOGY 124 (2013) 2026. [IF: 3,110] Egyéb előadások és poszterek Poór M, Kunsági-Máté S, Li Y, Kőszegi T, A new possible mechanism of flavonoid-drug interaction: flavonoids are able to displace warfarin from human serum albumin. 20th IFCCEFLM European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Milano, Olaszország, 2013.05.19-2013.05.23) [poszter]
73
IX. Irodalom 1.
Abbas Z, Blank R, Wein S, Wolffram S, Effect of quercetin on the toxicokinetics of ochratoxin A in rats, Food Addit. Contam. Part A 30 (2013) 861–866.
2.
Abdel-Wahhab MA, Abdel-Azim SH, El-Nekeety AA, Inula crithmoides extract protects against ochratoxin A-induced oxidative stress, clastogenic and mutagenic alterations in male rats, Toxicon 52 (2008) 566–573.
3.
Adler M, Müller K, Rached E, Dekant W, Mally A, Modulation of key regulators of mitosis linked to chromosomal instability is an early event in ochratoxin A carcinogenicity, Carcinogenesis 30 (2009) 711–719.
4.
Afsah-Hejri L, Jinap S, Influence of different mobile phase compositions on detection of Ochratoxin A, Food Control 31 (2013) 244–250.
5.
Al-Anati L, Katz N, Petzinger E, Interference of arachidonic acid and its metabolites with TNFα release by ochratoxin A from rat liver, Toxicology 208 (2005) 335–346.
6.
Albassam MA, Bhatnagar R, Shrma AK, Prior MG, Histopathologic and electronic microscopic studies on the acute toxicity of ochratoxin A in rats, Vet. Pathol. 24 (1987) 427–435.
7.
Aleo MD, Wyat RD, Schnellmann RG, Mitochondrial dysfunction is an early event in ochratoxin A but not oosporein toxicity to rat renal proximal tubules, Toxicol. Appl. Pharmacol. 107 (1991) 73–80.
8.
Amadasi A, Dall’Asta C, Ingletto G, Pela R, Marchelli R, Cozzini P, Explaining cyclodextrin–mycotoxin interactions using a ‘natural’ force field, Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) 4585-4594.
9.
Amézqueta S, González-Peñas E, Murillo-Arbizu M, López de Cerain A, Ochratoxin A decontamination: A review, Food Control 20 (2009) 326–333.
10.
Atroshi F, Biese I, Saloniemi H, Significance of apoptosis and its relationship to antioxidants after ochratoxinAadministration in mice, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 3 (2000) 281–291.
11.
Aydin S, Palabiyik SS, Erkekoglu P, Sahin G, Başaran N, Giray BK, The carotenoid lycopene protects rats against DNA damage induced by Ochratoxin A, Toxicon 73 (2013) 96–103.
12.
Babu E, Takeda M, Narikawa S, Kobayashi Y, Enomoto A, Tojo A, Cha SO, Takashi S, Sakthisekaran D, Endou H, Role of human anion transporter 4 in the transport of ochratoxin A, Biochem. Biophys. Acta 1590 (2002) 64–75.
13.
Bahnemann E, Kerling HP, Ensminger S, Scwerdt G, Silbernagl S, Gekle M, Renal transepithelial secretion of ochratoxin A in the non-filtering toad kidney, Toxicology 120 (1997) 11–17.
14.
Baldi A, Losio MN, Cheli F, Rebucci R, Sangalli L, Fusi E, Bertasi B, Pavoni E, Carli S, Politis I, Evaluation of the protective effects of alpha-tocopherol and retinol against ochratoxin A cytotoxicity, Br. J. Nutr. 91 (2004) 507–512.
15.
Baudrimont I, Murn M, Betbeder AM, Guilcher J, Creppy EE, Effect of piroxicam on the nephrotoxicity induced by ochratoxin A in rats, Toxicology 95 (1995) 147–154. 74
16.
Baudrimont I, Ahouandjivo R, Creppy EE, Prevention of lipid peroxidation induced by ochratoxin A in Vero cells in culture by several agents, Chem. Biol. Interact. 104 (1997a) 29–40.
17.
Baudrimont I, Betbeder AM, Creppy EE, Reduction of the ochratoxin A-induced cytotoxicity in Vero cells by aspartame, Arch. Toxicol. 71 (1997b) 290–298.
18.
Baudrimont I, Sostaric B, Yenot C, Betbeder AM, Dano-Djedje S, Sanni A, Steyn PS, Creppy EE, Aspartame prevents the karyomegaly induced by ochratoxin A in rat kidney, Arch. Toxicol. 75 (2001) 176–183.
19.
Belmadani A, Tramu G, Betbeder AM, Steyn PS, Creppy EE, Regional selectivity to ochratoxin A, distribution and cytotoxicity in rat brain, Arch. Toxicol. 72 (1998) 656– 662.
20.
Benesic A, Mildenberger S, Gekle M, Nephritogenic ochratoxin A interferes with hormonal signalling in immortalized human kidney epithelial cells, Pflügers Arch. 439 (2000) 278–287.
21.
Berger V, Gabriel AF, Sergent T, Trouet A, Larondelle Y, Schneider YJ, Interaction of ochratoxin A with human intestinal Caco-2 cells: possible implication of a multidrug resistance-associated protein (MRP2), Toxicol. Lett. 140–141 (2003) 465– 476.
22.
Boesch-Saadatmandi C, Loboda A, Jozkowicz A, Huebbe P, Blank R, Wolffram S, Dulak J, Rimbach G, Effect of ochratoxin A on redox-regulated transcription factors, antioxidant enzymes and glutathione-S-transferase in cultured kidney tubulus cells, Food Chem. Toxicol. 46 (2008) 2665–2671.
23.
Boorman G, NTP Technical Report on the Toxicology and Carcinogenesis Studies of Ochratoxin A (CAS No. 303-47-9) in F344/N Rats (Gavage Studies), NIH Publication No. 89-2813, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Research Triangle Park, NC., 1989.
24.
Brand W, Schutte ME, Williamson G, van Zanden JJ, Cnubben NHP, Groten JP, van Bladeren PJ, Rietjens IMCM, Flavonoid-mediated inhibition of intestinal ABC transporters may affect the oral bioavailability of drugs, food-borne toxic compounds and bioactive ingredients, Biomed. Pharmacoth. 60 (2006) 508–519.
25.
Breitholtz-Emanuelsson A, Palminger-Hallen I, Wohlin PO, Oskarsson A, Hult K, Olsen M, Transfer of ochratoxin A from lactating rats to their offspring: a short term study, Nat. Toxins 1 (1993a) 347–352.
26.
Breitholtz-Emanuelsson A, Olsen M, Oskarsson A, Palminger I, Hult K, Ochratoxin A in cows milk and human milk with corresponding blood samples, J. AOAC Int. 76 (1993b) 842–846.
27.
Bruinink A, Rasony T, Sidler C, Reduction of ochratoxin A toxicity by heat-induced epimerization. In vitro effects of ochratoxins on embryonic chick meningeal and other cell cultures, Toxicology 118 (1997) 205–210.
28.
Bruinink A, Sidler C, The neurotoxic effect of ochratoxin A are reduced by protein binding but not affected by l-phenylalanine, Toxicol. Appl. Pharmacol. 146 (1997) 173–179.
29.
Calcutt MW, Gillman IG, Noftle RE, Manderville RA, Electrochemical oxidation of ochratoxin A: correlation with 4-chlorophenol, Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) 1266– 1272. 75
30.
Cavin C, Delatour T, Marin-Kuan M, Holzhäuser D, Higgins L, Bezençon C, Guignard G, Junod S, Richoz-Payot J, Gremaud E, Hayes JD, Nestler S, Mantle P, Schilter B, Reduction in antioxidant defenses may contribute to ochratoxin A toxicity and carcinogenicity, Toxicol. Sci. 96 (2007) 30–39.
31.
Cavin C, Delatour T, Marin-Kuan M, Fenaille F, Holzhäuser D, Guignard G, Bezençon C, Piguet D, Parisod V, Richoz-Payot J, Schilter B, Ochratoxin A-mediated DNA and protein damage: roles of nitrosative and oxidative stresses, Toxicol. Sci. 110 (2009) 84–94.
32.
Cha SH, Sekine T, Kusushura H, Yu E, Kim JY, Kim DK, Sugiyama Y, Kanai Y, Endou H, Molecular cloning and characterization of multispecific organic anion transporter 4 expressed in the placenta, J. Biol. Chem. 275 (2000) 4507–4512.
33.
Chakor K, Creppy EE, Dirheimer G, In Vivo Studies on the Relationship Between Hepatic Metabolism and Toxicity of Ochratoxin A, Arch. Toxicol. 12 (1988) 201–204.
34.
Chakraborty D, Verma R, Ameliorative effect of Emblica officinalis aqueous extract on ochratoxin-induced lipid peroxidation in the kidney and liver of mice, Int. J. Occup. Med. Environ. Health 23 (2010) 63–73.
35.
Chernozemsky IN, Balkan endemic nephropathy and the associated tumours of the urinary system: a summary of epidemiological features in Bulgaria, IARC Sci. Publ. 1991 (115) 3–4.
36.
Chinnam N, Dadi PK, Sabri SA, Ahmad M, Kabir MA, Ahmad Z, Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a differential manner, Int. J. Biol. Macromol. 46 (2010) 478-486.
37.
Chong X, Rahimtula AD, Alterations in ATP-dependent calcium uptake by rat renal cortex microsomes following ochratoxin A administration in vivo or addition in vitro, Biochem. Pharmacol. 44 (1992) 1401–1409.
38.
Chu FS, Noh I, Chang CC, Structure requirements for ochratoxin A intoxication, Life Sci. 11 (1972) 503–508.
39.
Ciconová P, Laciková A, Máté D, Prevention of Ochratoxin A Contamination of Food and Ochratoxin A Detoxification by Microorganisms – A Review, Czech J. Food Sci. 28 (2010) 465–474.
40.
Costa S, Utan A, Cervellati R, Speroni E, Guerra MC, Catechins: natural free-radical scavengers against ochratoxin A-induced cell damage in a pig kidney cell line (LLCPK1), Food Chem. Toxicol. 45 (2007) 1910–1917.
41.
Creppy EE, Schlegel M, Röschenthaler R, Dirheimer G, Phenylalanine prevents acute poisoning by ochratoxina in mice, Toxicol. Lett. 6 (1980) 77–80.
42.
Creppy EE, Kern D, Steyn PS, Vleggaar R, Roschenthaler R, Dirheimer G, Comparative study on the effect of ochratoxin A analogues on yeast aminoacyl-t-RNA synthetases and on the growth and protein synthesis of hepatoma cells, Toxicol. Lett. 19 (1983) 217–224.
43.
Creppy EE, Röschenthaler R, Dirheimer G, Inhibition of protein synthesis in mice by ochratoxin A and its prevention by phenylalanine, Food Chem. Toxicol. 22 (1984) 883–886.
76
44.
Creppy EE, Chakor K, Fisher M, Dirheimer G, The mycotoxin ochratoxin A is a substrate for phenylalanine hydroxylase in isolated rat hepatocytes and in vivo, Arch. Toxicol. 64 (1990) 279–284.
45.
Creppy EE, Baudrimont I, Betbeder AM, Prevention of nephrotoxicity of ochratoxin A, a food contaminant, Toxicol. Lett. 82–83 (1995) 869–877.
46.
Creppy EE, Baudrimont I, Belmadani A, Betbeder AM, Aspartame as a Preventive Agent of Chronic Toxic Effects of Ochratoxin a in Experimental Animals, Toxin Reviews 15 (1996) 207–221.
47.
Cui J, Xing L, Li Z, Wu S, Wang J, Liu J, Wang J, Yan X, Zhang X, Ochratoxin A induces G(2) phase arrest in human gastric epithelium GES-1 cells in vitro, Toxicol. Lett. 193 (2010) 152–158.
48.
Cui J, Liu J, Wu S, Wang Y, Shen H, Xing L, Wang J, Yan X, Zhang X, Oxidative DNA damage is involved in ochratoxin A-induced G2 arrest through ataxia telangiectasia-mutated (ATM) pathways in human gastric epithelium GES-1 cells in vitro, Arch. Toxicol. 87 (2013) 1829–1840.
49.
Czakai K, Müller K, Mosesso P, Pepe G, Schulze M, Gohla A, Patnaik D, Dekant W, Higgins J.M.G., Mally A., Perturbation of mitosis through inhibition of histone acetyltransferases: the key to ochratoxin A toxicity and carcinogenicity? Toxicol. Sci. 122 (2011) 317–329.
50.
Dahlman A, Dantzker WH, Silbernagl S, Gekle M, Detailed mapping of ochratoxin A reabsorption along the rate nephron in vivo: the nephrotoxin can be reabsorbed in all nephron segments by different mechanisms, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286 (1998) 157–162.
51.
Dai J, Park G, Wright MW, Adams M, Akman SA, Manderville RA, Detection and characterization of a glutathione conjugate of ochratoxin A, Chem. Res. Toxicol. 15 (2002) 1581–1588.
52.
Dai J, Wright MW, Manderville RA, An oxygen-bonded c8-deoxyguanosine nucleoside adduct of pentachlorophenol by peroxidase activation: evidence for ambident c8 reactivity by phenoxyl radicals, Chem. Res. Toxicol. 16 (2003a) 817–821.
53.
Dai J, Wright MW, Manderville RA, Ochratoxin a forms a carbon-bonded c8deoxyguanosine nucleoside adduct: implications for c8 reactivity by a phenolic radical, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003b) 3716–3717.
54.
Dai J, Park G, Perry JL, Il'ichev YV, Bow DA, Pritchard JB, Faucet V, PfohlLeszkowicz A, Manderville RA, Simon JD, Molecular aspects of the transport and toxicity of ochratoxin A, Acc. Chem. Res. 37 (2004) 874–881.
55.
Dai J, Sloat AL, Wright MW, Manderville RA, Role of phenoxyl radicals in DNA adduction by chlorophenol xenobiotics following peroxidase activation, Chem. Res. Toxicol. 18 (2005) 771–779.
56.
Dall'Asta C, Galaverna G, Dossena A, Marchelli R, Reversed-phase liquid chromatographic method for the determination of ochratoxin A in wine, J. Chromatogr. A 1024 (2004) 275–279.
57.
Dangles O, Dufour C, Manach C, Morand C, Remesy C, Binding of flavonoids to plasma proteins, Methods Enzymol. 335 (2001) 319-333.
77
58.
Delatour T, Mally A, Richoz J, Ozden S, Dekant W, Ihmels H, Otto D, Gasparutto D, Marin-Kuan M, Schilter B, Cavin C, Absence of 2'-deoxyguanosine-carbon 8-bound ochratoxin A adduct in rat kidney DNA monitored by isotope dilution LC-MS/MS, Mol. Nutr. Food Res. 52 (2008) 472–482.
59.
Dirheimer G, Creppy EE, Mechanism of action of Ochratoxin A, IARC Sci. Publ. 115 (1991) 171–186.
60.
Dodziuk H, Cyclodextrins and Their Complexes, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany, 2008.
61.
Dopp E, Müller J, Hahnel C, Schiffmann D, Induction of Genotoxic Effects and Modulation of the Intracellular Calcium Level in Syrian Hamster Embryo (SHE) Fibroblasts caused by Ochratoxin A, Food Chem. Toxicol. 37 (1999) 713–721.
62.
Dorta DJ, Pigoso AA, Mingatto FE, Rodrigues T, Prado IMR, Helena AFC, Uyemura SA, Santos AC, Curti C, The interaction of flavonoids with mitochondria: effects on energetic processes, Chem. Biol. Interact. 152 (2005) 67-78.
63.
Doster RC, Sinnhuber RO, Comparative rate of hydrolysis of ochratoxin A and B in vitro, Food Cosmet. Toxicol. 10 (1972) 389–394.
64.
Duarte SC, Pena A, Lino CM, Ochratoxin A non-conventional exposure sources — A review, Microchem. J. 93 (2009) 115–120.
65.
El Adlouni C, Pinelli E, Azemar B, Zaoui D, Beaune P, Leszkowicz AP, Phenobarbital increases of DNA adduct and metabolites formed by ochratoxin A: role of CYP 2C9 and microsomal glutathione-S-transferase, Environ. Mol. Mutagen. 35 (2000) 123–131.
66.
Essid E, Dernawi Y, Petzinger E, Apoptosis Induction by OTA and TNF-α in Cultured Primary Rat Hepatocytes and Prevention by Silibinin, Toxins (Basel) 4 (2012) 1139– 1156.
67.
Faucet V, Pfohl-Leszkowicz A, Dai J, Castegnaro M, Manderville RA, Evidence for covalent DNA adduction by ochratoxin A following chronic exposure to rat and subacute exposure to pig, Chem. Res. Toxicol. 17 (2004) 1289–1296.
68.
Ferrufino-Guardia EV, Tangni EK, Larondelle Y, Ponchaut S, Transfer of ochratoxin A during lactation: exposure of suckling via the milk of rabbit does fed a naturallycontaminated feed, Food Addit. Contam. 17 (2000) 167–175.
69.
Fuchs R, Radic B, Peraica M, Hult K, Plestina R, Enterohepatic circulation of ochratoxin A in rats, Period. Biol. 90 (1988) 39–42.
70.
Galtier P, Baradat C, Alvinerie M, Etude d’elimination d’ochratoxin A par le lait chez la lapine, Ann. Nutr. Alim. 31 (1977) 911–918.
71.
Galtier P, Contribution of pharmacokinetic studies to mycotoxicology – Ochratoxin A, Vet. Sci. Commun. 1 (1978) 349–358.
72.
Galtier P, Charpenteau JL, Alvinerie M, Labouche C, The pharmacokinetic profile of ochratoxin A in the rat after oral and intravenous administration, Drug Metabol. Dispos. 7 (1979) 429–434.
73.
Galtier P, Camguilhem R, Bodin G, Evidence for in vitro and in vivo interaction between ochratoxin A and three acidic drugs, Food Cosmet. Toxicol. 18 (1980) 493– 496.
78
74.
Galtier P, Alvinerie M, Charpenteau JL, The pharmacokinetic profiles of ochratoxin A in pigs, rabbits and chickens, Food Cosmet. Toxicol. 19 (1981) 735–738.
75.
Gannett PM, Powell JH, Rao R, Shi X, Lawson T, Kolar C, Toth B, C8-Arylguanine and C8-aryladenine formation in calf thymus DNA from arenediazonium ions, Chem. Res. Toxicol. 12 (1999) 297–304.
76.
García AR, Avila E, Rosiles R, Petrone VM, Evaluation of two mycotoxin binders to reduce toxicity of broiler diets containing ochratoxin A and T-2 toxin contaminated grain, Avian Dis. 47 (2003) 691–699.
77.
Gareis M, Martlbauer E, Bauer J, Gedek B, Determination of ochratoxin A in breast milk, Zeitschr. Lebensm. Undersch. Forsch. 186 (1988) 114–117.
78.
Gautier JC, Holzhaeuser D, Markovic J, Gremaud E, Schilter B, Turesky RJ, Oxidative damage and stress response from ochratoxin A exposure in rats, Free Radical Biol. Med. 30 (2001) 1089–1098.
79.
Gekle M, Silbernagl S, The role of the proximal tubule in ochratoxin A nephrotoxicity in vivo. Toxicodynamics and toxicokinetics aspects, Ren. Physiol. Biochem. 17 (1994) 40–49.
80.
Gekle M, Gabner B, Freudinger R, Mildenberg S, Silbernagl S, Pfaller W, Schrameck H, Characterization of an ochratoxin A dedifferentiated and cloned renal epithelial cell line, Toxicol. Appl. Pharmacol. 152 (1998) 282–291.
81.
Gekle M, Schwerdt G, Freudinger R, Mildenberg S, Wilflingseder D, Pollack V, Dander M, Schramek H, Ochratoxin A induces JNK activation and apoptosis in MDKC-C7 cells an nanomolar concentrations, J. Pharmacol. Exp. Ther. 293 (2000) 837–844.
82.
Gillman IG, Clark TN, Manderville RA, Oxidation of ochratoxin A by an Feporphyrin system: model for enzymatic activation and DNA cleavage, Chem. Res. Toxicol. 12 (1999) 1066–1076.
83.
Gross-Steinmeyer K, Weymann J, Hege HG, Metzler M, Metabolism and lack of DNA reactivity of the mycotoxin ochratoxin A in cultured and human primary hepatocytes, J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 935–938.
84.
Grosse Y, Baudrimont I, Castegnaro M, Creppy EE, Dirheimer G, Pfohl-Leskowicz A, Ochratoxin A metabolites and DNA-adducts formation in monkey kidney cell, Chem. Biol. Interact. 95 (1995) 175–187.
85.
Grosse Y, Chekir-Ghedira L, Huc A, Obrecht-Pflumio S, Dirheimer G, Bacha H, Pfohl-Leszkowicz A, Retinol, ascorbic acid and alpha-tocopherol prevent DNA adduct formation in mice treated with the mycotoxins ochratoxin A and zearalenone, Cancer Lett. 114 (1997) 225–229.
86.
Groves CE, Morales M, Wright SH, Peritubular transport of ochratoxin A in rabbit renal proximal tubules, J. Pharmacol. Exp. Ther. 284 (1998) 943–948.
87.
Guerra MC, Galvano F, Bonsi L, Speroni E, Costa S, Renzulli C, Cervellati R, Cyanidin-3-O-beta-glucopyranoside, a natural free-radical scavenger against aflatoxin B1- and ochratoxin A-induced cell damage in a human hepatoma cell line (Hep G2) and a human colonic adenocarcinoma cell line (CaCo-2), Br. J. Nutr. 94 (2005) 211– 220.
79
88.
Hagelberg S, Hult K, Fuchs R, Toxicokinetics of Ochratoxin A in Several Species and its Plasma-binding Properties, J. Appl. Toxicol. 9 (1989) 91–96.
89.
Hald B, Porcine nephropathy in Europe, IARC Sci. Publ. 115 (1991) 49–56.
90.
Hansen CE, Dueland S, Drevon CA, Stormer FC, Metabolism of ochratoxin A by primary culture of rat hepa-tocytes, Appl. Environ. Microbiol. 43 (1982) 1267–1271.
91.
Hardman JG, Limbird LE, Goodman Gilman A, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, tenth ed. The McGraw-Hill Companies, New York, 2001, 1924–2021.
92.
Hashemi J, Alizadeh N, Investigation of solvent effect and cyclodextrins on fluorescence properties of ochratoxin A, Spectrochim. Acta A 73 (2009) 121–126.
93.
Havsteen BH, The biochemistry and medical significance of the flavonoids, Pharmacol Ther. 96 (2002) 67-202.
94.
Higham C, Aarons L, Holt PJ, Lynch M, Rowland M, A chronic dose-ranging study of the pharmacokinetics of phenylbutazone in rheumatoid arthritic patients, Br. J. Clin. Pharmacol. 12 (1981) 123–129.
95.
Hiramoto K, Kaku M, Sueyoshi A, Fujise M, Kikugawa K, DNA base and deoxyribose modification by the carbon-centered radical generated from 4(hydroxymethyl)-benzenediazonium salt, a carcinogen in mushroom, Chem. Res. Toxicol. 8 (1995) 356–362.
96.
Hoehler D, Marquardt RR, McIntosh AR, Xiao H, Free radical generation as induced by ochratoxin A and its analogs in bacteria (Bacillus brevis), J. Biol. Chem. 271 (1996) 27388–27394.
97.
Hoehler D, Marquardt RR, Influence of vitamins E and C on the toxic effects of ochratoxin A and T-2 toxin in chicks, Poult. Sci. 75 (1996) 1508–1515.
98.
Hoehler D, Marquardt RR, McIntosh AR, Hatch GM, Induction of free radicals in hepatocytes, mitochondria and microsomes of rats by ochratoxin A and its analogs, Biochim. Biophys. Acta 1357 (1997) 225–233.
99.
Hoehler D, Sudekum KH, Wolfram S, Frohlich AA, Marquardt RR, Metabolism and excretion of ochratoxin A fed to sheep, J. Anim. Sci. 77 (1999) 1217–1223.
100. Hong SS, Seo K, Lim SC, Han HK, Interaction characteristics of flavonoids with human organic anion transporter 1 (hOAT1) and 3 (hOAT3), Pharmacol. Res. 56 (2007) 468–473. 101. Horvath A, Upham BL, Ganev V, Trosko JE, Determination of the epigenetic effects of ochratoxin in a human kidney and a rat liver epithelial cell line, Toxicon 40 (2002) 273–282. 102. Husain SR, Cillard J, Cillard P, Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids, Phytochem. 26 (1987) 2489-2491. 103. Hutchinson RD, Steyn PS, Thompson DL, The isolation and structure of 4hydroxyochratoxin A and 7-carboxy-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methylisocoumarin from Penicillium viridicatum, Tetrahedron Lett. 43 (1971) 4033–4036. 104. IARC, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, No. 56, Ochratoxin A. Monographs on the
80
Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, International Agency for Research on Cancer, Lyon, 1993, 489–521. 105. Il'ichev YV, Perry JL, Manderville RA, Chignell CF, Simon JD, The pH-Dependent Primary Photoreactions of Ochratoxin A, J. Phys. Chem. B 105 (2001) 11369–11376. 106. Il’ichev YV, Perry JL, Simon JD, Interaction of Ochratoxin A with Human Serum Albumin. Preferential Binding of the Dianion and pH Effects, J. Phys. Chem. B 106 (2002a) 452–459. 107. Il’ichev YV, Perry JL, Rüker F, Dockal M, Simon JD, Interaction of ochratoxin A with human serum albumin. Binding sites localized by competitive interactions with the native protein and its recombinant fragments, Chem. Biol. Interact. 141 (2002b) 275–293. 108. Il’ichev YV, Perry JL, Simon JD, Interaction of Ochratoxin A with Human Serum Albumin. A Common Binding Site of Ochratoxin A and Warfarin in Subdomain IIA, J. Phys. Chem. B 106 (2002c) 460–465. 109. Jung KY, Takeda M, Kim DK, Tojo A, Narikawa S, Yoo BS, Hosoyamada M, Cha SH, Sekine T, Endou H, Characterization of ochratoxin A transport by human organic anion transporters, Life Sci. 69 (2001) 2123–2135. 110. Kamp HG, Eisenbrand G, Schlatter J, Würth K, Janzowski C, Ochratoxin A: induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell lines and primary cells, Toxicology 206 (2005) 413–425. 111. Kanisawa M, Suzuki S, Induction of renal and hepatic tumours in mice by ochratoxin A, a mycotoxin, Gann. 69 (1978) 599–600. 112. Kanno S, Tomizawa A, Ohtake T, Koiwai K, Ujibe M, Ishikawa M, Naringenininduced apoptosis via activation of NF-κB and necrosis involving the loss of ATP in human promyeloleukemia HL-60 cells, Toxicol. Lett. 166 (2006) 131-139. 113. Kasmuller S, Cavin C, Chakraborty A, Darroudi F, Majer BJ, Huber WW, Ehrlich VA, Structurally related mycotoxins ochratoxin A, ochratoxin B, and citrinin differ in their genotoxic activities and in their mode of action in human-derived liver (HepG2) cells: implication for Risk Assessment, Nutr. Cancer 50 (2004) 190–197. 114. Kerkadi A, Barriault C, Marquardt RR, Frohlich AA, Yousef IM, Zhu XX, Tuchweber B, Cholestyramine protection against ochratoxin A toxicity: role of ochratoxin A sorption by the resin and bile acid enterohepatic circulation, J. Food Prot. 62 (1999) 1461–1465. 115. Khan S, Martin M, Bartsch H, Rahimtula AD, Perturbation of liver microsomal calcium homeostasis by ochratoxin A, Biochem. Pharmacol. 38 (1989) 67–72. 116. Kochanowski N, Blanchard F, Cacan R, Chirat F, Guedon E, Marc A, Goergen JL, Intracellular nucleotide and nucleotide sugar contents of cultured CHO cells determined by a fast, sensitive, and high-resolution ion-pair RP-HPLC, Anal. Biochem. 348 (2006) 243-251. 117. Kontaxi M, Echkardt U, Hagenbuch B, Stieger B, Meier PJ, Petzinger E, Uptake of the mycotoxin ochratoxin A in liver cells occurs via the cloned organic anion transporting polypeptide, J. Pharmacol. Exp. Ther. 279 (1996) 1507–1513.
81
118. Kuiper-Goodman T, Hilts C, Billiard SM, Kiparissis Y, Richard IDK, Hayward S, Health risk assessment of ochratoxin A for all age-sex strata in a market economy, Food Addit. Contam. 27 (2010) 212–240. 119. Kumagai S, Aibara K, Intestinal absorption and secretion of ochratoxin A in the rat, Toxicol. Appl. Pharmacol. 64 (1982) 94–102. 120. Kumagai S, Ochratoxin A: Plasma concentration and excretion into bile and urine in albumin-deficient rats, Food Chem. Toxicol. 23 (1985) 941–943. 121. Kumari D, Sinha SP, Effect of retinol on ochratoxin-produced genotoxicity in mice, Food Chem. Toxicol. 32 (1994) 471–475. 122. Kusushura H, Sekine T, Utsunomiya-Tate NM, Tsuda M, Kojima R, Cha SH, Sugiyama Y, Kanai Y, Endou H, Molecular cloning and characterization of a new multispecific organic anion transporter from rat brain, J. Biol. Chem. 274 (1999) 13675–13680. 123. Kühn I, Valenta H, Rohr K, Determination of ochratoxin A in bile of swine by highperformance liquid chromatography, J. Chromatogr. B 668 (1995) 333–337. 124. Lawson T, Gannett PM, Yau WM, Dalal NS, Toth B, Different Patterns of Mutagenicity of Arenediazonium Ions in V79 Cells and Salmonella typhimurium TA102: Evidence for Different Mechanisms of Action, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 2627–2635. 125. Leier I, Hummel-Eisenbeiss J, Cui Y, Keppler D, ATP-dependent paraaminohippurate transport by apical multidrug resistance protein MRP2, Kidney Int. 57 (2000) 1636–1642. 126. Li B, Vik SB, Tu Y, Theaflavins inhibit the ATP synthase and the respiratory chain without increasing superoxide production, J. Nutr. Biochem. 23 (2012) 953-960. 127. Li Y, Czibulya Z, Poór M, Lecomte S, Kiss L, Harte E, Kőszegi T, Kunsági-Máté S, Thermodynamic study of the effects of ethanol on the interaction of ochratoxin A with human serumalbumin, J. Lumin. 148 (2014) 18-25. 128. Li S, Marquardt RR, Frohlich AA, Vitti TG, Crow G, Pharmacokinetics of ochratoxin A and its metabolites in rats, Toxicol. Appl. Pharmacol. 145 (1997) 82–90. 129. Li S, Marquardt RR, Frohlich AA, Identification of ochratoxin and some of their metabolite in bile and urine of rats, Food Chem. Toxicol. 38 (2000) 141–152. 130. Limonciel A, Jennings P, A Review of the Evidence that Ochratoxin A Is an Nrf2 Inhibitor: Implications for Nephrotoxicity and Renal Carcinogenicity, Toxins (Basel) 6 (2014) 371-379. 131. Lino CM, Baeta ML, Henri M, Dinis AMP, Pena AS, Silveira MIN, Levels of ochratoxin A in serum from urban and rural Portuguese populations and estimation of exposure degree, Food Chem. Toxicol. 46 (2008) 879–885. 132. Liu J, Wang Y, Cui J, Xing L, Shen H, Wu S, Lian H, Wang J, Yan X, Zhang X, Ochratoxin A induces oxidative DNA damage and G1 phase arrest in human peripheral blood mononuclear cells in vitro, Toxicol. Lett. 211 (2012) 164–171. 133. Lühe A, Hildebrandt H, Bach U, Dingerman T, Ahr HJ, A new approach to studying ochratoxin A (OTA)-induced nephrotoxicity: expressing profiling in vivo and in vitro employing cDNA microarrays, Toxicol. Sci. 73 (2003) 315–328.
82
134. Maaroufi K, Zakhama A, Baudrimont I, Achour A, Abid S, Ellouz F, Dhouib S, Creppy EE, Bacha H, Karyomegaly of tubular cells as early stage marker of the nephrotoxicity induced by ochratoxin A in rats, Hum. Exp. Toxicol. 18 (1999) 410– 415. 135. Madhyastha MS, Marquardt RR, Frohlich AA, Hydrolysis of ochratoxin A by the microbial activity of digesta in the gastrointestinal tract, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23 (1992a) 468–472. 136. Madhyastha MS, Frohlich AA, Marquardt RR, Effect of dietary cholestyramine on the elimination pattern of ochratoxin A in rats, Food Chem. Toxicol. 30 (1992b) 709–714. 137. Madsen A, Mortensen HP, Hald B, Feeding experiments with ochratoxin A contamined barley for bacon pigs, influence on pig performance and residues, Acta Agric. Scand. 32 (1982) 225–239. 138. Malaveille C, Brun G, Bartsch H, Structure-activity studies in E. coli strains on ochratoxin A (OTA) and its analogues implicate a genotoxic free radical and a cytosolic thiol derivative as reactive metabolites, Mutat. Res. 307 (1994) 141–147. 139. Mally A, Zepnik H, Wanek P, Eder E, Dingley K, Ihmels H, Völkel W, Dekant W, Ochratoxin A: lack of formation of covalent DNA adducts, Chem. Res. Toxicol. 17 (2004) 234–242. 140. Mally A, Pepe G, Ravoori S, Fiore M, Gupta RC, Dekant W, Mosesso P, Ochratoxin a causes DNA damage and cytogenetic effects but no DNA adducts in rats, Chem. Res. Toxicol. 18 (2005) 1253–1261. 141. Mally A, Decker M, Bekteshi M, Dekant W, Ochratoxin A alters cell adhesion and gap junction intercellular communication in MDCK cells, Toxicology 223 (2006) 15– 25. 142. Mally A, Dekant W, Mycotoxins and the kidney: modes of action for renal tumor formation by ochratoxin A in rodents, Mol. Nutr. Food Res. 53 (2009) 467–478. 143. Manderville RA, Pfohl-Leszkowicz A, Bioactivation and DNA adduction as a rationale for ochratoxin A carcinogenesis, World Mycotoxin J. 1 (2008) 357–367. 144. Manderville RA, A case for the genotoxicity of ochratoxin A by bioactivation and covalent DNA adduction, Chem. Res. Toxicol. 18 (2005) 1091–1097. 145. Mantle PG, McHugh KM, Adatia R, Gray T, Turner DR, Persistent karyomegaly caused by Penicillium nephrotoxins in the rat, Proc. R. Soc. B 246 (1991) 251–259. 146. Mantle PG, Faucet-Marquis V, Manderville RA, Squillaci B, Pfohl-Leszkowicz A, Structures of covalent adducts between DNA and ochratoxin a: a new factor in debate about genotoxicity and human risk assessment, Chem. Res. Toxicol. 23 (2010) 89–98. 147. Maragos CM, Appell M, Lippolis V, Visconti A, Catucci L, Pascale M, Use of cyclodextrins as modifiers of fluorescence in the detection of mycotoxins, Food Addit. Contam. Part A 25 (2008) 164-171. 148. Marin-Kuan M, Nestler S, Verguet C, Bezençon C, Piguet D, Mansourian R, Holzwarth J, Grigorov M, Delatour T, Mantle P, Cavin C, Schilter B, A toxicogenomics approach to identify new plausible epigenetic mechanisms of ochratoxin a carcinogenicity in rat, Toxicol. Sci. 89 (2006) 120–134.
83
149. Mathiesen L, Malterud KE, Sund RB, Uncoupling of respiration and inhibition of ATP synthesis in mitochondria by C-methylated flavonoids from Myrica gale L, Eur. J. Pharmac. Sci. 4 (1996) 373-379. 150. McMaster DR, Vedani A, Ochratoxin A binding to phenlylalanine-tRNA synthetatse: computational approach to the mechanism of ochratoxicoses and its antagonism, J. Med. Chem. 42 (1999) 3075–3086. 151. Meisner H, Chan S, Ochratoxin A, an inhibitor of mitochondrial transport systems, Biochemistry 13 (1974) 2795–2800. 152. Meisner H, Meisner P, Ochratoxin A an in vivo inhibitor of renal phosphoenolpyruvate carboxykinase, Arch. Biochem. Biophys. 208 (1981) 146–153. 153. Meisner H, Krogh P, Phosphoenolpyruvate carboxykinase as a selective indicator of ochratoxin A induced nephropathy, Dev. Toxicol. Environ. Sci. 14 (1986) 199–206. 154. Meisner H, Polsinelli P, Changes of renal mRNA species abundance by ochratoxin A, Biochem. Pharmacol. 35 (1986) 661–665. 155. Meulenberg EP, Immunochemical methods for ochratoxin A detection: a review, Toxins (Basel) 4 (2012) 244–266. 156. Micco C, Miraglia M, Brera C, Corneli S, Ambruzi A, Evaluation of ochratoxin A level in human milk in Italy, Food Addit. Contam. 12 (1995) 351–354. 157. Miraglia M, Brera C, Corneli S, Cava E, Montanino G, Miraglia E, Occurence of ochratoxin A (OTA) in maternal serum, placenta and funiculumdkjdot, in: M. Miraglia, H. van Egmond, C. Brera, J. Gilbert (Eds.), Proceedings of IX International IUPAC Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins – Developments in Chemistry, Toxicology and Food Safety, Alaken Inc., USA, 1998, 165–179. 158. Mohn WW, Kennedy KJ, Reductive dehalogenation of chlorophenols by Desulfomonile tiedjei DCB-1, Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992) 1367–1370. 159. Morel I, Lescoat G, Cogrel P, Sergent O, Pasdeloup N, Brissot P, Cillard P, Cillard J, Antioxidant and iron-chelating activities of the flavonoids catechin, quercetin and diosmetin on iron-loaded rat hepatocyte cultures, Biochem. Pharmacol. 45 (1993) 1319. 160. Moroi K, Suzuki S, Kuga T, Yamazaki M, Kanisawa M, Reduction of ochratoxin A toxicity in mice treated with phenylalanine and phenobarbital, Toxicol. Lett. 25 (1985) 1–5. 161. Mortensen HP, Hald B, Larsen AE, Madsen A, Ochratoxin A contaminated barley for sows and piglets. Pig performance and residues in milk and pigs, Acta Agric. Scand. 33 (1983) 349–352. 162. Muñoz K, Blaszkewicz M, Campos V, Vega M, Degen GH, Exposure of infants to ochratoxin A with breast milk, Arch. Toxicol. 88 (2014) 837–846. 163. Murray AR, Kisin E, Castranova V, Kommineni C, Gunther MR, Shvedova AA, Phenol-induced in vivo oxidative stress in skin: evidence for enhanced free radical generation, thiol oxidation, and antioxidant depletion, Chem. Res. Toxicol. 20 (2007) 1769–1777. 164. Müller G, Burkert B, Rosner H, Köhler H, Effects of the toxin ochratoxin A and some of its metabolites on human kidney cell lines, Toxicol. In Vitro 17 (2003) 441–448.
84
165. Nguyen TN, Bertagnolli AD, Villalta PW, Bühlmann P, Sturla SJ, Characterization of a deoxyguanosine adduct of tetrachlorobenzoquinone: dichlorobenzoquinone-1,N2etheno-2'-deoxyguanosine, Chem. Res. Toxicol. 18 (2005) 1770–1776. 166. Nip WK, Chu FS, The fate of ochratoxin A in goats, J. Environ. Sci. Health B 14 (1979) 319–333. 167. Obrecht-Pflumio S, Grosse Y, Pfohl-Leszkowicz A, Dirheimer G, Protection by indomethacin and aspirin against genotoxicity of ochratoxin A, particularly in the urinary bladder and kidney, Arch. Toxicol. 70 (1996) 244–248. 168. O'Brien E, Heussner AH, Dietrich DR, Species-, sex-, and cell type-specific effects of ochratoxin A and B, Toxicol. Sci. 63 (2001) 256–64. 169. Omar RF, Hasinoff BB, Mejilla F, Rahimtula AD, Mechanism of ochratoxin A stimulated lipid peroxidation, Biochem. Pharmacol. 40 (1990) 1183–91. 170. Oster T, Jayyosi Z, Creppy EE, El Amri HS, Batt AM, Characterization of pig liver purified cytochrome P-450 isoenzymes for Ochratoxin A metabolism studies, Toxicol. Lett. 57 (1991) 203–214. 171. Özcelik N, Kosar A, Soysal D, Ochratoxin A in human serum samples collected in Isparta-Turkey from healthy individuals and individualssuffering from different urinary disorders, Toxicol. Lett. 121 (2001) 9–13. 172. Palma N, Cinelli S, Sapora O, Wilson SH, Dogliotti E, Ochratoxin A-induced mutagenesis in mammalian cells is consistent with the production of oxidative stress, Chem. Res. Toxicol. 20 (2007) 1031–1037. 173. Peraica M, Domijan AM, Fuchs R, Lucic A, Radic B, The occurrence of ochratoxin A in blood in general population of Croatia, Toxicol. Lett. 110 (1999) 105-112. 174. Perry JL, Christensen T, Goldsmith MR, Toone EJ, Beratan DN, Simon JD, Binding of ochratoxin A to human serum albumin stabilized by a protein-ligand ion pair, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 7884–7888. 175. Perry JL, Goldsmith MR, Peterson MA, Beratan DN, Structure of the Ochratoxin A Binding Site within Human Serum Albumin, J. Phys. Chem. B 108 (2004) 16960– 16964. 176. Petrik J, Zanic-Grubisic T, Barisic K, Pepeljnjak S, Radic B, Ferencic Z, Cepelak I, Apoptosis and oxidative stress induced by ochratoxinAin rat kidney, Arch. Toxicol. 77 (2003) 685–693. 177. Petzinger E, Weidenbach A, Mycotoxins in the food chain: the role of ochratoxins, Liv. Prod. Sci. 76 (2002) 245–250. 178. Pfohl-Leszkowicz A, Ochratoxin A and aristolochic acid involvement in nephropathies and associated urothelial tract tumours, Arh. Hig. Rada Toksikol. 60 (2009) 465–483. 179. Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA, An update on direct genotoxicity as a molecular mechanism of ochratoxin a carcinogenicity, Chem. Res. Toxicol. 25 (2012) 252–262. 180. Pinelli E, El Adlouni C, Pipy B, Quartulli F, Pfohl-Leskzowicz A, Roles of cyclooxygenase and lipoygenases in ochratoxin A genotoxicity in human epithelial lung cells, Environ. Toxicol. Pharmacol. 7 (1999) 95–107.
85
181. Pitout MJ, The hydrolysis of ochratoxin A by some proteolytic enzymes, Biochem. Pharmacol. 18 (1969) 485–491. 182. Pittet A, Royer D, Rapid, low cost thin-layer chromatographic screening method for the detection of ochratoxin A in green coffee at a control level of 10 microg/kg, J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 243–247. 183. Pohland AE, Nesheim S, Friedman L, Ochratoxin A: a review, Pure Appl. Chem. 64 (1992) 1029–1046. 184. Poór M, Kunsági-Máté S, Bencsik T, Petrik J, Vladimir-Knežević S, Kőszegi T, Flavonoid aglycones can compete with Ochratoxin A for human serum albumin: A new possible mode of action, Int. J. Biol. Macromol. 51 (2012) 279-283. 185. Poór M, Kunsági-Máté S, Czibulya Z, Li Y, Peles-Lemli B, Petrik J, VladimirKnežević S, Kőszegi T, Fluorescence spectroscopic investigation of competitive interactions between ochratoxin A and 13 drug molecules for binding to human serum albumin, Luminescence 28 (2013a) 726-733. 186. Poór M, Kunsági-Máté S, Matisz G, Li Y, Czibulya Z, Peles-Lemli B, Kőszegi T, Interaction of alkali and alkaline earth ions with Ochratoxin A, J. Lumin. 135 (2013b) 276-280. 187. Poór M, Li Y, Kunsági-Máté S, Petrik J, Vladimir-Knežević S, Kőszegi T, Molecular displacement of warfarin from human serum albumin by flavonoid aglycones, J. Lumin. 142 (2013c) 122-127. 188. Poór M, Li Y, Kunsági-Máté S, Varga Z, Hunyadi A, Dankó B, Chang FR, Wu YC, Kőszegi T, Protoapigenone derivatives: albumin binding properties and effects on HepG2 cells, J. Photochem Photobiol B: Biology 124 (2013d) 20-26. 189. Poór M, Li Y, Matisz G, Kiss L, Kunsági-Máté S, Kőszegi T, Quantitation of species differences in albumin-ligand interactions for bovine, human and rat serum albumins using fluorescence spectroscopy: A test case with some Sudlow's site I ligands, J. Lumin. 145 (2014) 767-773. 190. Rached E, Pfeiffer E, Dekant W, Mally A, Ochratoxin A: Apoptosis and aberrant exit from mitosis due to perturbation of microtubule dynamics? Toxicol. Sci. 92 (2006) 78– 86. 191. Radic B, Fuchs R, Peraica M, Lucic A, Ochratloxin A in human sera in the area with endemic nephropathy in Croatia, Toxicol. Lett. 91 (1997) 105–109. 192. Rahimtula AD, Béréziat JC, Bussacchini-Griot V, Bartsch H, Lipid peroxidation as a possible cause of ochratoxin A toxicity, Biochem. Pharmacol. 37 (1988) 4469–4477. 193. Ranaldi G, Caprini V, Sambuy Y, Perozzi G, Murgia C, Intracellular zinc stores protect the intestinal epithelium from Ochratoxin A toxicity, Toxicol. In Vitro 23 (2009) 1516–1521. 194. Ramyaa P, Padma VV, Ochratoxin-induced toxicity, oxidative stress and apoptosis ameliorated by quercetin – Modulation by Nrf2, Food Chem. Toxicol. 62 (2013) 205– 216. 195. Renzulli C, Galvano F, Pierdomenico L, Speroni E, Guerra MC, Effects of rosmarinic acid against aflatoxin B1 and ochratoxin-A-induced cell damage in a human hepatoma cell line (Hep G2), J. Appl. Toxicol. 24 (2004) 289–296.
86
196. Ribelin WE, Fukushima K, Still PE, The toxicity of ochratoxin A to ruminants, Can. J. Comp. Med. 42 (1978) 172–176. 197. Richardson SCB, Fisher MJ, Characterization of phenylalanine hydroxylase from rat kidney, Int. J. Biochem. 233 (1993) 499–506. 198. Ringot D, Chango A, Schneider YJ, Larondelle Y, Toxicokinetics and toxicodynamics of ochratoxin A, an update, Chem. Biol. Interact. 159 (2006) 18–46. 199. Roth A, Chakor K, Creppy EE, Kane A, Roschenthaler R, Dirheimer G, Evidence for an enterohepatic circulation of ochratoxin A in mice, Toxicology 48 (1988) 293–308. 200. Russo A, La Fauci L, Acquaviva R, Campisi A, Raciti G, Scifo C, Renis M, Galvano G, Vanella A, Galvano F, Ochratoxin A-induced DNA damage in human fibroblast: protective effect of cyanidin 3-O-beta-d-glucoside, J. Nutr. Biochem. 16 (2005) 31–37. 201. Samokyszyn VM, Freeman JP, Maddipati KR, Lloyd RV, Peroxidase-catalyzed oxidation of pentachlorophenol, Chem. Res. Toxicol. 8 (1995) 349–355. 202. Sauvant C, Hildegard H, Gekle M, The nephrotoxin ochratoxin A induces key parameters of chronic interstitial nephropathy in renal proximal tubular cells, Cell Physiol. Biochem. 15 (2005) 125–134. 203. Schaaf GJ, Nijmeijer SM, Maas RFM, Roestenberg P, De Groene EM, FinkGremmels J, The role of oxidative stress in the ochratoxin A mediated toxicity in proximal tubular cells, Biochim. Biophys. Acta 1588 (2002) 149–158. 204. Schafer ZT, Grassian AR, Song L, Jiang Z, Gerhart-Hines Z, Irie HY, Gao S, Puigserver P, Brugge JS, Antioxidant and oncogene rescue of metabolic defects caused by loss of matrix attachment, Nature 461 (2009) 109 –113. 205. Schwerdt G, Gekle M, Freudinger R, Mildenberger S, Silbernag S, Apical-tobasolateral transepithelial transport of ochratoxin A by two subtypes of Madin–Darby canine kidney cells, Biochem. Biophys. Acta 1324 (1997) 191–199. 206. Schwerdt G, Freudinger R, Silbernagl S, Gekle M, Ochratoxin A – binding proteins in rat organs and plasma and in different cell lines of the kidney, Toxicology 135 (1999) 1–10. 207. Schwerdt G, Freudinger R, Schuster C, Silberbnagl S, Gekle M, Inhibition of mitochondria and extracellular acidification enhance ochratoxin A-induced apoptosis in renal collecting duct-derived MDCK-C7 cells, Cell. Physiol. Biochem. 14 (2004) 47–56. 208. Scott PM, Methods of analysis for ochratoxin A, Adv. Exp. Med. Biol. 504 (2002) 117–134. 209. Sergent T, Garsou S, Schaut A, Saeger SD, Pussemier L, Peteghem CV, Larondelle Y, Schneider YJ, Differential modulation of ochratoxin A absorption across Caco-2 cells by dietary polyphenols, used at realistic intestinal concentrations, Toxicol. Lett. 159 (2005) 60–70. 210. Seyoum A, Asres K, El-Fiky FK, Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids, Phytochem. 67 (2006) 2058-2070. 211. Shigenaga MK, Gimeno CJ, Ames BN, Urinary 8-hydroxy-20-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 9697–9701.
87
212. Simon P, Ochratoxin and kidney disease in the human, Toxin Reviews 15 (1996) 239– 249. 213. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad OD, Presence of ochratoxin A in human milk in relation to dietary intake, Food Addit. Contam. 18 (2001) 321–327. 214. Sorrenti V, Di Giacomo C, Acquaviva R, Bognanno M, Grilli E, D'Orazio N, Galvano F, Dimethylarginine dimethylaminohydrolase/nitric oxide synthase pathway in liver and kidney: protective effect of cyanidin 3-O-β-D-glucoside on ochratoxin-A toxicity, Toxins (Basel) 4 (2012) 353–363. 215. Sreemannarayana O, Frohlich AA, Vitti TG, Marquardt RR, Abramson D, Phillips GD, Studies of the tolerance and disposition of ochratoxin A in young calves, J. Anim. Sci. 66 (1988) 1703–1711. 216. Stojković R, Hult K, Gamulin S, Plestina R, High affinity binding of ochratoxin A to plasma constituents, Biochem. Int. 9 (1984) 33–38. 217. Stormer FC, Pederson JI, Formation of (4R)- and (4S)-hydroxyochratoxin A from ochratoxin A by rat liver microsomes, Appl. Environ. Microbiol. 39 (1980) 971–975. 218. Stormer FC, Storen O, Hansen CE, Pedersen JI, Hvistendahl G, Aarsen AJ, Formation of (4R)- and (4S)-hydroxyochratoxin A from ochratoxin A by liver microsomes from various species, Appl. Environ. Microbiol. 42 (1981) 1051–1056. 219. Stormer FC, Storen O, Hansen CE, Pedersen JI, Aarsen AJ, Formation of (4-R)- and (4S)-hydroxyochratoxin A and 10-hydroxyochratoxin A from ochratoxin A by rabbit liver microsomes, Appl. Environ. Microbiol. 45 (1983) 1183–1187. 220. Stoyanovosky DA, Goldman R, Jonnalagadda SS, Day BW, Claycamp HG, Kagan VE, Detection and characterization of the electron paramagnetic resonance-silent glutathionyl-5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide adduct derived from redox cycling of phenoxyl radicals in model systems and HL-60 cells, Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 3–11. 221. Studer-Rohr I, Schlatter J, Dietrich DR, Kinetic parameters snd intraindividual fluctuations of Ochratoxin A plasma levels in human, Arch. Toxicol. 74 (2000) 499– 510. 222. Suzuki S, Kozuka Y, Satoh T, Yamazaki M, Studies on the nephrotoxicity of ochratoxin A in rats, Toxicol. Appl. Pharmacol. 34 (1975) 479–490. 223. Suzuki S, Satoh T, Yamakazi M, The pharmacokinetics of ochratoxin A in rats, Japan J. Pharmacol. 27 (1977) 735–744. 224. Suzuki S, Moroi K, Kanisawa M, Satoh T, Effect of drug metabolizing enzyme inducers on carcinogenesis and toxicity of ochratoxin A in mice, Toxicol. Lett. Suppl. 31 (1986) 206. 225. Szejtli J, Cyclodextrin Technology, Kluwer, Doordrecht, Germany, 1988. 226. Taniai E, Yafune A, Nakajima M, Hayashi SM, Nakane F, Itahashi M, Shibutani M, Ochratoxin A induces karyomegaly and cell cycle aberrations in renaltubular cells without relation to induction of oxidative stressresponses in rats, Toxicol. Lett. 224 (2014) 64-72. 227. Tatu CA, Orem WH, Finkelman RB, Feder GL, The etiology of Balkan endemic nephropathy: still more questions than answers, Environ. Health Perspect. 106 (1998) 689–700. 88
228. Thekkumkarra TJ, Patel MS, Ochratoxin A decrease the activity of phosphoenolpyruvate carboxykinase and its mRNA content in primary cultures of rat kidney proximal convoluted tubular cells, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 916–920. 229. Toscani T, Moseriti A, Dossena A, Dall'Asta C, Simoncini N, Virgili R, Determination of ochratoxin A in dry-cured meat products by a HPLC-FLD quantitative method, J. Chromatogr. B 855 (2007) 242–248. 230. Tozlovanu M, Faucet-Marquis V, Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA, Genotoxicity of the hydroquinone metabolite of ochratoxin A: structure-activity relationships for covalent DNA adduction, Chem. Res. Toxicol. 19 (2006) 1241–1247. 231. Trailović JN, Stefanović S, Trailović SM, In vitro and in vivo protective effects of three mycotoxin adsorbents against ochratoxin A in broiler chickens, Br. Poult. Sci. 54 (2013) 515–523. 232. Tsuda M, Takashi S, Takeda M, Cha SH, Yoshikatsu K, Kimura M, Endou H, Transport of ochratoxin A by renal multi-specific organic anion transporter 1, J. Pharmacol. Exp. Ther. 289 (1999) 1301–1305. 233. Turner NW, Subrahmanyam S, Piletsky SA, Analytical methods for determination of mycotoxins: a review, Anal. Chim. Acta 632 (2009) 168–180. 234. Vaidyanathan VG, Villalta PW, Sturla SJ, Nucleobase-dependent reactivity of a quinone metabolite of pentachlorophenol, Chem. Res. Toxicol. 20 (2007) 913–919. 235. Valenta H, Chromatographic methods for the determination of ochratoxin A in animal and human tissues and fluids, J. Chromatogr. A 815 (1998) 75–92. 236. Van Der Merwe KJ, Steyn PS, Fourie L, Part II. The constitution of ochratoxins A, B, and C, metabolites of Aspergillus ochraceus wilh, J. Chem. Soc. (1965) 7083–7088. 237. Vettorazzi A, van Delft J, López de Cerain A., A review on ochratoxin A transcriptomic studies, Food Chem. Toxicol. 59 (2013) 766-783. 238. Villa P, Cova D, De Francesco L, Guaitani A, Palladini G, Perego R, Protective effect of diosmetin on in vitro cell membrane damage and oxidative stress in cultured rat hepatocytes, Toxicology 73 (1992) 179-189. 239. Waidyanatha S, Lin PH, Rappaport SM, Characterization of chlorinated adducts of hemoglobin and albumin following administration of pentachlorophenol to rats, Chem. Res. Toxicol. 9 (1996) 647–653. 240. Wang Y, Liu J, Cui J, Xing L, Wang J, Yan X, Zhang X, ERK and p38 MAPK signaling pathways are involved in ochratoxin A-induced G2 phase arrest in human gastric epithelium cells, Toxicol. Lett. 209 (2012) 186–192. 241. Wang X, Wolkoff AW, Morris ME, Flavonoids as a novel class of human organic anion-transporting polypeptide OATP1B1 (OATP-C) modulators, Drug Metab. Dispos. 33 (2005) 1666–1672. 242. Wei YH, Lu TN, Wei RD, Effect of ochratoxin A on rat liver mitochondrial respiration and oxidative phosphorilation, Toxicology 36 (1985) 119–123. 243. Wei X, Sulik KK, Pathogenesis of craniofacial and body wall malformations induced by ochratoxin A in mice, Am. J. Med. Genet. 47 (1993) 862–871.
89
244. Weidenbach A, Schuh K, Failing K, Petzinger E, Ochratoxin A induced TNF-release from the isolated and blood-free perfused rat liver, Mycotox. Res. 16 (2000) 189–193. 245. Wong CC, Botting NP, Orfila C, Al-Maharik N, Williamson G, Flavonoid conjugates interact with organic anion transporters (OATs) and attenuate cytotoxicity of adefovir mediated by organic anion transporter 1 (OAT1/SLC22A6), Biochem. Pharmacol. 81 (2011) 942–949. 246. Xiao H, Marquardt RR, Frohlich AA, Philips GD, Vitti TG, Effect of hay and a grain diet on the rate of hydrolysis of ochratoxin A in the rumen sheep, J. Anim. Sci. 69 (1991) 3706–3714. 247. Xiao H, Madhyastha S, Marquardt RR, Li S, Vodela JK, Frohlich AA, Kemppainen W, Toxicity of OTA, its opened lactone form and several of its analogs: structureactivity relationships, Toxicol. Appl. Pharmacol. 137 (1996a) 182–192. 248. Xiao H, Marquardt RR, Abramson RR, Frohlich AA, Metabolites of ochratoxins in rat urine and in a culture of Aspergillus ochraceus, Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996b) 648–655. 249. Xiao J, Zhao Y, Wang H, Yuan Y, Yang F, Zhang C, Yamamoto K, Noncovalent interaction of dietary polyphenols with common human plasma proteins, J. Agric. Food Chem. 59 (2011) 10747–10754. 250. Yang LPH, Keam SJ, Sugammadex A Review of its Use in Anaesthetic Practice, Drugs 69 (2009) 919–942. 251. Yong S, Albassam M, Prior M, Protective effects of sodium bicarbonate on murine ochratoxicosis, J. Environ. Sci. Health B 22 (1987) 455–470. 252. Zanik-Grubisic T, Zrinski R, Cepelak I, Petrik J, Radic B, Pepeljnijak S, Studies of ochratoxin A-induced inhibition of phenylalanine hydroxylase and its reversal effect by phenylalanine, Toxicol. Appl. Pharmacol. 167 (2000) 132–139. 253. Zepnik H, Pahler A, Schauer U, Dekant W, Ochratoxin A-Induced tumor formation: is there a role of reactive ochratoxin A metabolites? Toxicol. Sci. 59 (2001) 59–67. 254. Zepnik H, Volkel W, Dekant W, Toxicokinetics of the mycotoxin ochratoxin A in F 344 rats after oral administration, Toxicol. Appl. Pharmacol. 192 (2003) 36–44. 255. Zhang MQ, Drug-specific cyclodextrins: the future of rapid neuromuscular block reversal? Drugs Future 28 (2003) 347-354. 256. Zheng J, Zhang Y, Xu W, Luo Y, Hao J, Shen XL, Yang X, Li X, Huang K, Zinc protects HepG2 cells against the oxidative damage and DNA damage induced by ochratoxin A, Toxicol. Appl. Pharmacol. 268 (2013) 123–131. 257. Zimmerli B, Dick R, Determination of ochratoxin A at ppt level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column clean-up; methodology and Swiss data, J. Chromatogr. B 666 (1995) 85–99. 258. Zingerle M, Silbernagl S, Gekle M, Reabsorption of the nephrotoxin ochratoxin A along the rat nephron in vivo, J. Pharmacol. Exp. Ther. 280 (1997) 220–224. 259. Zlender V, Breljak D, Ljubojević M, Flajs D, Balen D, Brzica H, Domijan AM, Peraica M, Fuchs R, Anzai N, Sabolić I, Low doses of ochratoxin A upregulate the protein expression of organic anion transporters Oat1, Oat2, Oat3 and Oat5 in rat kidney cortex, Toxicol. Appl. Pharmacol. 239 (2009) 284–296. 90
X. Köszönetnyilvánítás Elsősorban köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Kőszegi Tamás egyetemi docensnek az útmutatásért és állandó fáradhatatlan munkájáért, segítőkészségéért. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Kovács L. Gábornak és Prof. Dr. Miseta Attilának, a Laboratóriumi Medicina Intézet előző és jelenlegi vezetőinek, akik lehetővé tették, hogy munkámat intézetükben végezzem és mindig támogattak. Emellett kiemelt köszönettel tartozom Dr. Kunsági-Máté Sándornak, az Általános és Fizikai Kémia Tanszék vezetőjének a molekuláris kölcsönhatások vizsgálatában nyújtott segítségért, szakmai tanácsaiért. Köszönetet mondok Dr. Matisz Gergelynek a kémiai számításokban és molekulamodellezésben, Yin Li-nek a termodinamikai számolásokban, valamint Dr. Kuzma Mónikának és Dr. Montskó Gergelynek a kromatográfiás mérésekben nyújtott segítségükért. Továbbá köszönettel tartozom a Laboratóriumi Medicina Intézet, az Általános és Fizikai Kémia Tanszék és a Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet munkatársainak, akik közreműködtek és/vagy segítették munkámat, valamint az összes kooperációs partnerünknek. Végül köszönettel tartozom családomnak és kedvesemnek, akik támogatása nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre.
91
XI. Mellékletek
Fluoreszcencia polarizáció (P) Kontroll Acetilszalicilsav Ibuprofen Indometacin Furosemide Glipizide Nifedipine Phenobarbital Phenylbutazone Phenytoin Simvastatin Theophylline Verapamil Warfarin
40 μmol/L 0,332 0,329 0,314 0,289 0,306 0,315 0,324 0,326 0,286 0,326 0,312 0,330 0,328 0,295
70 μmol/L 0,328 0,328 0,297 0,244 0,283 0,306 0,321 0,326 0,260 0,322 0,301 0,327 0,325 0,274
100 μmol/L 0,327 0,321 0,279 0,203 0,266 0,292 0,314 0,322 0,237 0,315 0,296 0,323 0,321 0,253
Az OTA kötött frakciója (%)
Kontroll Acetilszalicilsav Ibuprofen Indometacin Furosemide Glipizide Nifedipine Phenobarbital Phenylbutazone Phenytoin Simvastatin Theophylline Verapamil Warfarin
40 μmol/L 100,0 ± 0,0 98,5 ± 1,5 89,2 ± 3,4 76,4 ± 2,8 84,4 ± 1,8 90,3 ± 2,4 95,0 ± 2,4 96,7 ± 2,3 74,4 ± 1,2 97,1 ± 2,1 88,7 ± 1,8 98,8 ± 1,8 97,6 ± 3,2 78,6 ± 2,7
70 μmol/L 100,0 ± 0,0 99,8 ± 2,3 82,6 ± 2,1 58,8 ± 2,7 76,1 ± 2,4 87,9 ± 1,7 95,9 ± 1,1 98,8 ± 1,8 65,6 ± 1,8 96,4 ± 0,8 84,5 ± 1,8 99,5 ± 1,4 98,3 ± 1,3 71,7 ± 0,9
100 μmol/L 100,0 ± 0,0 97,2 ± 2,7 74,6 ± 2,7 45,0 ± 2,2 69,9 ± 2,1 82,5 ± 2,4 93,6 ± 2,5 97,6 ± 3,8 59,0 ± 1,8 92,6 ± 2,8 83,6 ± 2,8 96,7 ± 2,3 95,7 ± 2,9 65,0 ± 2,7
1. melléklet: A mért fluoreszcencia polarizációk, valamint az OTA albumin-kötött frakciója %-ban kifejezve 40, 70 és 100 µM kompetitor hozzáadása esetén.
92
Fluoreszcencia polarizáció (P)
Kontroll acacetin apigenin chrysin daidzein diosmetin fisetin galangin hesperetin luteolin morin myricetin naringenin quercetin
10 μmol/L 0,331 0,326 0,325 0,319 0,329 0,329 0,301 0,299 0,332 0,322 0,325 0,326 0,331 0,305
25 μmol/L 0,330 0,298 0,303 0,292 0,325 0,317 0,245 0,237 0,329 0,299 0,304 0,311 0,329 0,269
50 μmol/L 0,320 0,267 0,270 0,247 0,311 0,292 0,181 0,138 0,322 0,257 0,257 0,292 0,317 0,210
Az OTA kötött frakciója (%)
Kontroll acacetin apigenin chrysin daidzein diosmetin fisetin galangin hesperetin luteolin morin myricetin naringenin quercetin
10 μmol/L 100,0 ± 0,0 97,1 ± 0,8 96,4 ± 1,3 91,9 ± 2,7 98,4 ± 1,3 98,2 ± 1,1 82,1 ± 2,3 81,4 ± 4,0 99,9 ± 0,5 94,9 ± 2,0 96,2 ± 1,3 97,1 ± 1,7 99,4 ± 1,6 84,2 ± 1,7
25 μmol/L 100,0 ± 0,0 83,6 ± 2,0 86,5 ± 2,2 79,5 ± 1,9 97,7 ± 1,5 93,0 ± 0,8 58,8 ± 1,5 57,5 ± 3,3 99,3 ± 2,1 82,8 ± 1,1 85,9 ± 0,6 90,0 ± 1,9 99,3 ± 1,4 68,4 ± 1,1
50 μmol/L 100,0 ± 0,0 71,0 ± 3,1 74,8 ± 3,8 62,3 ± 2,2 93,7 ± 1,6 85,4 ± 2,0 40,2 ± 0,7 26,8 ± 1,9 100,5 ± 1,9 69,7 ± 3,0 66,6 ± 6,3 86,3 ± 2,0 97,2 ± 2,2 48,5 ± 5,5
2. melléklet: A mért fluoreszcencia polarizációk, valamint az OTA albumin-kötött frakciója %-ban kifejezve 10, 25 és 50 µM flavonoid hozzáadását követően.
93
3. melléklet: A vizsgált OTA-kation komplexek szerkezete.
4. melléklet: Az OTA2--Zn2+ komplex szerkezete (a modellezés a TeraChem 1.5K és a Gaussian 09 programok felhasználásával történt). 94
5. melléklet: OTA2--QABCD komplex kémiai szerkezete. A modellezés HyperChem 8.0 programmal történt (HyperChem® Professional 8.0, Hypercube, Inc., USA).
6. melléklet: QABCD hatása az OTA (1µM)-HSA (1,7µM) interakcióra PBS-ben (pH = 7,4): a toxin fluoreszcencia polarizációjának csökkenése egyértelműen jelzi, hogy a QABCD képes versengeni az albuminnal az OTA-ért. Azonban ehhez extrém magas ciklodextrinkoncentrációkra van szükség, az OTA-HSA komplex rendkívül magas stabilitása miatt (λexc = 393 nm, λem = 446 nm).
95
7. melléklet: 10 µM DIOS hatása az intracelluláris ATP- és ATP/ADP-szintre a kontrollhoz viszonyítva MDCK-sejteken 12 órás inkubálást követően (*p < 0,05; perklórsavas feltárás után, HPLC-vel meghatározva).
8. melléklet: 10 µM flavonoid aglikon hatása az intracelluláris ATP-koncentrációkra a kontrollhoz viszonyítva MDCK-sejteken 12 órás inkubálást követően (*p < 0,05; detergenses feltárás után, luminometriás meghatározással).[ctrl=kontroll; ACA=acacetin; API=apigenin; BAI=baicalein; CAT=catechin; CHRY=chrysin; DAI=daidzein; DIOS=diosmetin; FIS=fisetin; FLA=flavone; GAL=galangin;GEN=genistein; HES=hesperetin; LUT=luteolin; MOR=morin; MYR=myricetin; NAR=naringenin; QUE=quercetin]
96
