A búza tartalékfehérjék tulajdonságainak in vitro és in vivo vizsgálata rizs modell rendszerben

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

A búza tartalékfehérjék tulajdonságainak in vitro és in vivo vizsgálata rizs modell rendszerben PhD értekezés

Készítette: Oszvald Mária

Témavezetők: Dr. Tömösközi Sándor BME, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Dr. Tamás László ELTE, Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Konzulens: Dr. Békés Ferenc CSIRO, Plant Industry, Ausztrália

2007

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ............................................................................................................................. 6 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ......................................................................................................... 7 2.1. A búza és a rizs jellemzése................................................................................................ 7 2.1.1. A búza tartalékfehérjék jellemzése.......................................................................... 8 2.1.1.1. HMW- Glutenin alegységek............................................................................... 10 2.1.1.2. LMW gluteninek................................................................................................. 13 2.1.1.3. Polimer gluteninek ............................................................................................. 14 2.1.1.4. A búza monomer fehérjéi ................................................................................... 15 2.1.1.5.Minőség és összetétel ........................................................................................... 17 2.1.2. A rizs fehérjéi......................................................................................................... 18 2.1.2.1. A rizs prolaminok ............................................................................................... 18 2.1.2.3. A rizs globulinok................................................................................................. 20 2.1.3. A rizsfehérjék izolálása és elválasztása................................................................. 20 2.2. Az endospermium fehérjék funkcionális vizsgálata..................................................... 22 2.2.1. Búzaliszt minősítő módszerek ............................................................................... 22 2.2.1.1. Tészta- és lisztminősítésre alkalmas mikro-módszerek ..................................... 23 2.2.2. A rizstészta reológiai jellemzése ............................................................................ 24 2.2.3. A rizstészta funkcionális vizsgálata komplex rendszerben .................................. 25 2.2.4. A végtermékek reológiai vizsgálata....................................................................... 25 2.3. Tartalékfehérje alegységek hatása a tészta funkcionális tulajdonságokra ................ 26 2.3.1. In vitro fehérje összetétel módosítása a búza tésztában ....................................... 26 2.3.1.1. A fehérje addíció hatása..................................................................................... 28 2.3.1.2. Redukció és oxidáció hatása a tészta funkcionális tulajdonságaira ................ 29 2.3.1.3. Funkcionális tulajdonságok változása inkorporáció hatására......................... 29 2.3.1.4. HMW-GS összetétel változtatása genetikai transzformációval......................... 30 2.4. Genom összetétel megváltoztatása in vivo géntechnológiai módszerekkel ................ 31 2.4.1. A növényi transzformációs rendszerek ................................................................. 32 2.4.1.2. Agrobacterium tumefaciens közvetítette transzformáció.................................. 34 2.4.2. A transzgén expresszió szabályozása .................................................................... 35 2.4.3. Transzgénikus növények szelekciója .................................................................... 36 2.4.4. Növényi regeneráció.............................................................................................. 37 2.4.5. A rizs genetikai transzformációja ......................................................................... 37 2.5. Glutén intolerancia.......................................................................................................... 38 3. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................................... 40 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ................................................................................................... 41 4.1. Felhasznált anyagok........................................................................................................ 41 4.2. Bruttó beltartalmi vizsgálatok ....................................................................................... 41 4.3.Búza tartalékfehérjék izolálása....................................................................................... 42 4.3.1. HMW és LMW glutenin alegységfrakciók izolálása............................................ 42 4.4. Rizsminták fehérje összetételének vizsgálata ............................................................... 42 4.4.1.Mintaelőkészítés, fehérje extrakció........................................................................ 42 4.4.1.1.Fehérje izolálás transzgénikus magból .............................................................. 43 4.4.2. Gélelektroforézis.................................................................................................... 43 4.4.3. Méretkizárásos –HPLC (SE-HPLC)..................................................................... 43 3.5. Rizslisztekből készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata ...................... 44 4.6. Fehérje összetétel változtatása in vitro módszerekkel ................................................. 45 4.6.1. Fehérje frakciók in vitro addíciója rizslisztbe ...................................................... 45 4.6.1.1 Sikérrel dúsított rizsliszt vizsgálata ..................................................................... 45

2

4.6.1.2. Búza HMW és LMW-GS fehérjék addíciója ..................................................... 45 3.6.2. Fehérjék redukciója és re-oxidációja ................................................................... 45 4.6.2.1. Inkorporáció ....................................................................................................... 46 4.7. Fehérje összetétel megváltoztatása in vivo módszerekkel ........................................... 46 4.7.1. A rizs genetikai transzformációja ......................................................................... 46 4.8. A transzgén integrálódás és expresszó bizonyítása ...................................................... 47 4.8.1. DNS vizsgálatok..................................................................................................... 47 4.8.1.1 PCR reakció......................................................................................................... 47 4.8.1.2 RT-PCR reakció .................................................................................................. 48 4.8.2. Fehérjevizsgálati módszerek ................................................................................. 49 4.8.2.1. Western blot analízis .......................................................................................... 49 4.9. Statisztikai elemzések...................................................................................................... 50 5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ......................................................................................... 51 5. 1. Az alapanyagok és fehérje frakciók kémiai jellemzése............................................... 51 5.2. A rizslisztből készült tészta dagasztási vizsgálatai ....................................................... 51 5.2.1. A rizslisztek farinográfos vizsgálata ..................................................................... 51 5.2.1.1. Búza sikér adagolásának hatása a rizslisztből készült tészta dagasztási jellemzőire........................................................................................................................ 52 5.2.2. A Mikro-valorigráfos méréstechnika alkalmazása rizslisztre.............................. 53 5.3. A rizsliszt fehérjék összetételének jellemzése ....................................................... 55 5.3.1. SDS-PAGE............................................................................................................. 55 5.3.2. Tartalékfehérjék SE-HPLC vizsgálata ................................................................. 56 5.3.3. A tartalékfehérjék összetételének összefüggései a dagasztási tulajdonságokkal 59 5.4. A fehérje-összetétel in vitro módosításának hatása az összetételre és a reológiai tulajdonságokra...................................................................................................................... 61 5.4.1. Izolált búzafehérje-frakciók jellemzése ................................................................ 61 5.4.2. Redukció/oxidáció paramétereinek optimalizálása rizsfehérjékre ...................... 63 5.4.2.1. A redukció/oxidáció hatása tartalékfehérjék összetételére ............................... 66 5.4.3. A búzafehérje frakciók addíciójának hatása........................................................ 69 5.4.3.1. HMW és LMW glutenin frakciók addíciója ...................................................... 69 5.4.4. HMW és LMW glutenin alegységek inkorporációja............................................ 71 5.4.5. In vitro fehérjemódosítások hatásának komplex értékelése ................................ 74 5.4.6. Az in vitro addíció és inkorporáció hatásának összehasonlító értékelése ........... 75 5.5. A fehérje-összetétel In vivo módosítása -HMW Dx5 alegység expressziója transzgénikus rizsben............................................................................................................. 76 5.5.1. Transzgénikus növények szelekciója és regenerációja ........................................ 76 5.5.2. Transzgénikus növények analízise........................................................................ 77 5.5.2.2. mRNS vizsgálat -RT-PCT .................................................................................. 79 5.5.3. A fehérje expresszió vizsgálata.............................................................................. 80 5.5.3.1. Western blot analízis .......................................................................................... 81 6. ÖSSZEFOGLALÓ ................................................................................................................... 84 6.1. Rizslisztek analitikai és reológiai vizsgálata ................................................................. 84 6.2. Búza glutenin alegységfehérjék vizsgálata rizs modellben.......................................... 84 6.3. Összefüggések a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok között ....................................................................................................................................... 85 6.4. Búza tartalékfehérjék in vivo expressziója.................................................................... 85 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ......................................................................................................... 87 7. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................................ 88 8. FÜGGELÉK ......................................................................................................................... 103

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE bp- bázispár BAP- benzil-amino-purint BD- tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a maximumhoz húzott egyenes közötti területérték a mikro-Valorigráfon kapott görbén, Resistance BreakDown (VU*s) CBB- Coomassie-Brillant-Bue CYS- cisztein aminosav DNS- dezoxi-ribonukleinsav DNTP- dezoxi-nukleotid trifoszfát DDT- farinográfos tésztakialakulási idő, dagasztási időszükséglet (Dough Development Time) DTT- dithiothreitol E. coli- Escherichia coli FU- farinográf egység (Farinografh Unit) GO- glükóz-oxidáz HMW-GS- nagy molekulatömegű glutenin alegység (High Molecular Weight Glutenin Subunit) IAA- jódacetamid kb- kilobázis kDa- kilodalton LMW-GS- kis molekulatömegű glutenin alegység (Low Molecular Weight Glutenin Subunit) 2-ME- 2-merkaptoetanol MT- a maximális tésztaellenállásig eltelt, ún. csúcs tésztakialakulási idő farinográfon kapott görbén, Mixing Time (sec) NAA- naftilecetsavat PCR- polimeráz láncreakció RT-PCR- reverz transzkriptáz PCR PR- maximális tésztaellenállás a Farinográffal kapott görbén, Peak Resistance PVDF- polivinilidén difluorid RNS- ribonukleinsav RP-HPLC- fordított fázisú nagy nyomású folyadék kromatográfia (Reverse Phase - High Pressure Liquid Chromatography) SDS- Na-dodecil-szulfát

4

SDS-PAGE- Na-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis SE-HPLC- méretkizárásos nagy nyomású folyadék kromatográfia (Size Exclusion- High Pressure Liquid Chromatography) ST- stabilitás, az a hossz, mely a PR előtti és utáni görbeelhajlásig tart a mikro-Valorigráfon kapott görbén, STability (sec) TCA- triklór ecetsav UPP%- oldhatatlan polimer fehérje (Unextractable Polymer Protein) WA- vízfelvétel (Water Absorption)

5

1. BEVEZETÉS A gabonafélék ősidőktől fogva nagy szerepet játszanak az emberi táplálkozásban. Napjainkban a népesség energia bevitelének mintegy 50 %, a fehérje bevitelének pedig 45 %a gabonákból származik. A gabonafélék magvaiban a tartalék- vagy raktározott fehérjék, melyek az összes fehérjének hozzávetőlegesen a felét teszik ki, az endospermiumban raktározódnak. A magfehérjék nem csak az élelmiszer- és a takarmányipar, hanem az alapkutatás számára is értékes anyagot képviselnek, mert génjeik a növény életciklusának csak

pontosan

biotechnológiai

meghatározott módszerek,

és

szakaszában

működnek.

elválasztás-technikák

A

különböző

fejlődésének

biokémiai,

következtében

a

tartalékfehérjék vizsgálatára számos lehetőség kínálkozik. A gabonafélék közül ma is az egyik legértékesebb és legnagyobb területen termelt gabona a búza. A lisztjének dagasztása során kialakuló sikér fehérje-összetétele meghatározza a tészta funkcionális tulajdonságait és a belőle készíthető termékek sütőipari minőségét. Ezért a búza tartalékfehérjéinek szerkezete, összetétele és reológiai viselkedése az egyik legszélesebb körben kutatott terület. A sikérfehérjék funkcionális tulajdonságainak közvetett vizsgálati módszereken alapuló meghatározása során az “alapliszt“-hez adagolt egyedi fehérjék hatását követhetjük, de a módszer alkalmazásának korlátja, hogy az “alapliszt“ endogén sikérfehérje komponensei befolyásolják a mérési eredményeket. A búza tartalékfehérjéinek vizsgálatára ideális megoldás lehet egy olyan alapliszt használata, mely nem tartalmazza a búzaliszt egyik komponensét sem. Ilyen alapliszt lehet például a rizsliszt. A dolgozatban in vitro funkcionális vizsgálatok segítségével, illetve in vivo molekuláris biológiai módszereket felhasználva arra szeretnénk választ kapni, hogy a rizs fehérje mátrixba beépített búza tartalékfehérjék hogyan befolyásolják a rizstészta dagasztási tulajdonságait. A búza tartalékfehérjék reológiai hatásvizsgálata mellett a cöliákia problémájának megoldására is szolgálhat egy új tulajdonságokkal rendelkező, búza tartalékfehérjét is expresszáló rizs létrehozása. A búzaliszt és a belőle készült termékek az endospemium tartalékfehérjéinek egy része miatt ugyanis nem minden ember számára fogyaszthatók. A cöliákiával szemben, a lisztérzékenység a víz - és a sóoldható fehérjék egyes csoportjaihoz köthető allergiás betegség. Ezek a fehérjék a rizsben nincsenek jelen.

6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A búza és a rizs jellemzése A Triticeae tribus családba tartoznak a legfontosabb termesztett gabonanövényeink: a búza, az árpa és a rozs. A búza (Triticum aestivum L.) hexaploid faj, benne három homológ, de egymással nem rekombináló (azaz homoeológ) genom található: az A, a B és a D genom. A tetraploid T. durum (durum búza) csupán az A és a B genomot hordozza. Az A és a D genom valószínűleg a T. monococcum és T. tauschii diploid fajokból eredeztethetők, míg a B genom donora nehezebben azonosítható, de feltehetően az Aegilops fajok S genomjából származik. A Triticeae fajainak rokonságát kiválóan demonstrálják a tartalékfehérjék, amelyek különböző típusai nagyfokú hasonlóságot mutatnak a fajok között. A tartalékfehérjék a legtöbb növénynél a szaporítószervekben halmozódnak fel, de kisebb hányadban a vegetatív részekben is raktározódnak [Shewry é mtsai. 1995]. Fő szerepük a nitrogéntárolás, de emellett a kén- és szénraktározásban is jelentőségük van. Specifikus biológiai aktivitásuk eddig még nem ismert. A búza genetikai összetétele meghatározó a minőségi tulajdonságok kialakításában, de a környezettel való kölcsönhatásnak, azaz a gének expresszójának is fontos szerepe van. Így a sütőipari termékek gyártása szempontjából a minőség meghatározásában a tartalékfehérje gének molekuláris szerkezetének, a gének expresszójának és a fehérjék közötti kölcsönhatásoknak van meghatározó szerepe [Bushuk, 1998; Shewry és mtsai. 1999]. Valamennyi gabonaféle között a búza egyedülálló abban a tulajdonságában, hogy fehérjéi sikérképzésre alkalmasak. Ennek következtében őrleményéből laza állományú, könnyen emészthető sütőipari termékek készíthetők [Gianibelli és mtsai. 2001]. A búzamag egyedi tulajdonsága elsősorban az endospermium sikért kialakító fehérjéiben rejlik. A búza egyedi tésztakialakítási képessége miatt az egyik legfontosabb fehérjeforrás az emberi táplálkozásban. A búza mellett a rizs (Oryza sativa L.) szintén vezető élelmiszer a világon. A népességnek több mint a fele számára (60%) alapvető táplálék. A rizs őshazája Délkelet-Ázsia, termesztése Magyarországon a XVIII. században kezdődött. A termesztett rizs rendszertanilag az Oryza nembe tartozik. A húsz Oryza fajból kettő van köztermesztésben. A két termesztett faj, az Oryza sativa L. és az Oryza glaberrima a mélyen elárasított területektől a száraz lankáig megterem [Lu és Chang, 1980]. Mind a két fajtának 12 kromoszómája van. A rizsnemesítés hosszú története során kialakuló környezeti különbségek és szelekció következtében jelentős változatosság figyelhető meg a rizsfajták között. A hosszú domesztikáció alatt az Oryza sativa 7

L. fajtának két alfaja alakult ki, az indica és a japonica. A két alfaj igen sok tulajdonságban különbözik egymástól, mégsincs olyan kritériumrendszer, melyek alapján a két csoport teljes biztonsággal elkülöníthető. 2.1.1. A búza tartalékfehérjék jellemzése A búza tartalékfehérjéit Beccari már 1745-ben a sikér izolálása során tanulmányozta. Ezt a rozsban és árpában található hasonló fehérjék izolálása követte, feltételezve, hogy ezek a nehezen oldódó speciális fehérjék tartalékfehérjék [Scopes, 1982]. A XX. század elején a gabonamag fehérjékre Osborne [1907] egy egymást követő extrakción és a különböző oldhatóságon alapuló csoportosítást alakított ki. A fehérjéket az albuminok (vízben oldhatók), a globulinok (sóban oldhatók), a prolaminok (alkoholban oldhatók) és a glutelinek (gyenge sav- és lúgban oldhatók) csoportjába sorolta. Chen és Bushuk [1970] egy ötödik frakciót adtak az eredeti, Osborne által meghatározotthoz azáltal, hogy a glutenin fehérjéket két további frakcióra bontották: az egyik oldható híg ecetsavban, a másik oldhatatlan

ebben

az

oldószerben.

Bár

Osborne

munkássága

mérföldkő

volt

a

gabonakémiában, fontos megjegyezni, hogy ezek a frakciók különböző polipeptidek komplex keverékei, amelyek átfedést mutathatnak az oldhatóságban. A kromatográfiás technika megjelenésével kiderült, hogy az Osborne által meghatározott prolaminok a gabonafélékben (a búzában a gliadinok) monomer fehérjék, míg a glutelinek (a búzánál gluteninek) polipeptid-polimerek, amelyek redukcióval alegységekre bonthatók. A későbbi vizsgálatok azt bizonyították, hogy a búza glutenin alegységei (akárcsak az árpa és rozs glutelin alegységei) prolamin-jellegű, azaz alkoholban oldható polipeptidek, ellentétben a rizs glutelin alegységekkel, melyek globulin típusú fehérjék. A genetikai vizsgálatok, illetve a polipeptideket kódoló gének megismerése vezetett el a Shewry és mtsai. [1999] által kidolgozott nomenklatúrához, ahol az oldhatóságot figyelmen kívül hagyva a monomer prolaminokat (gliadin) és a prolamin- jellegű alegységeket egységesen prolaminnak nevezik. Ezáltal a prolamin szó így kettős értelmezést kapott a szakirodalomban, ami a mai napig konfliktusokat okoz. A búza tartalékfehérjéi kovalens és nem kovalens kötéseken keresztül a sikér komplex formáját adják. Hagyományosan a sikérfehérjék az alkohol-víz elegyben való oldhatóságuk alapján két nagyjából azonos mennyiségben megtalálható csoportra osztható: az oldható gliadin, és a nem oldható glutenin fehérjékre. Míg a gliadinok egyedi polipeptid láncok (monomerek), addig a gluteninek a polipeptidek (glutenin alegységek) polimerizálódott szerkezetei, melyeket diszulfidkötések tartanak össze. 8

A fehérjék polimer szerkezetének nagyon magas molekulatömege a felelős a glutenin fehérjék oldhatatlanságáért, valamint a funkcionális tulajdonságokban betöltött szerepükért. A tartalékfehérjéknek monomer és polimer formában történő csoportosítása szemlélteti speciális szerepüket a tészta egyes funkcionális tulajdonságainak kialakításában. A gliadinokat általában a sikér nyújthatóságért felelős fehérjeként tartják számon [Bushuk és Tkachuk, 1991], míg a gluteninek a sikér rugalmasságát befolyásolják. A tartalékfehérjék „új csoportosítása” szerint, az aminosav szekvencia és összetétel alapján a búzában található prolaminok három csoportra oszthatók: a kén gazdag, a kén szegény és a nagy molekulasúlyú (HMW) prolaminokra, illetve ezeken belül további kisebb csoportok különböztethetők meg [Shewry és mtsai. 1999] (1. táblázat). A kétféle osztályozás között az oldhatóság és polimerizációs hajlam szintjén van kapcsolat. Az oldhatósági szempontok alapján gliadinnak nevezett csoportot nagyrészt monomerek alkotják, ezek legfeljebb intramolekuláris (azaz molekulán belüli) diszulfidhidakkal rendelkeznek. Az alkoholban nem oldódó gluteninek polimer formában vannak jelen, ezek intermolekuláris (azaz molekulák közötti) diszulfidhidakat is tartalmaznak. Ezek a polimer lánc redukciója után, tehát alegységekre bontva, szintén alkoholos oldatba vihetők. 1. táblázat. Tartalékfehérjék csoportosítása [Shwery és mtsai. 1999.] TÍPUS HMW PROLAMIN

ÁRPA D- hordein

KÉN SZEGÉNY KÉN α-TÍPUS GAZDAG γ-TÍPUS AGGREGATÍV

C- hordein γ-hordein B-hordein

TÍPUS

BÚZA HMW glutenin ω-gliadin α−gliadin γ−gliadin LMW glutenin

ROZS HMW szekalin ω-szekalin γ−szekalin -

A glutenin polimer molekulákat intermolekuláris diszulfidhidak stabilizálnak. A polimerek redukciójának hatására a megjelenő alegységeket az SDS- poliakrilamid gélelektroforézissel történő mobilitásuk alapján a két csoportba sorolhatjuk: a nagy molekulatömegű (HMW-GS) és kis molekulatömegű (LMW-GS) glutenin alegységeket. A kén szegény prolaminok a teljes prolamin tartalomnak hozzávetőlegesen 10-20%-át alkotják. Kis mennyiségben, vagy egyáltalán nem tartalmaznak cisztein vagy metionin aminosavakat, de glutamin, prolin és fenilanalin tartalmuk magas. Szerkezetüket tekintve túlnyomórészt monomerek, molekulatömegük 30 és 80.000 Da között változik. Valamennyi gabonafélében (búza, árpa, rozs) a kén gazdag prolaminok adják a mennyiségileg legnagyobb 9

alkotórészt, a teljes frakciónak átlagosan 70-80%-át. Aminosav összetételüket tekintve magas cisztein és metionin, illetve glutamin- és prolin tartalom jellemző rájuk. A kén gazdag prolaminok monomer és polimer komponenseket is tartalmaznak, a monomerek molekulatömege 30.000 – 55.000 Da között változik. 2.1.1.1. HMW- Glutenin alegységek A glutenin polimerek 20 millió Da-t is meghaladó molekulatömegükkel a természetben előforduló legnagyobb fehérjemolekulák közé tartoznak [Wrigley, 1996]. Ezek a fehérjék glutenin alegységek polimerjeinek heterogén keverékei, melyek diszulfidkötésekkel kapcsolódnak össze. Az S-S kötések redukcióját követően az SDS poliakrilamid gélelektroforézisen történő mobilitásuk alapján a felszabadult monomer fehérjék négy nagy csoportba oszthatók. Az A csoport fehérjéi a HMW gluteninek, molekulatömegük 65-120 kDa. A B (42-51 kDa) és a C (30-40 kDa) csoport tagjai az LMW glutenin alegységek, valamint a γ és α gliadinok csoportjába tartozó, azoktól egy extra CYS-ben különböző polipeptidek, amelyek a polimerizáció lánc-terminációjában játszanak fontos szerepet. A D csoport fehérjéi is az LMW glutenin alegységek csoportjához tartoznak, melyek rokonságban állnak az ω- gliadinokkal, hasonló módon a C csoportba tartozó γ és α gliadin származékokkal (1. ábra). 1. ábra: Polimer fehérjék redukált alegységeinek SDS gélelektorforézise [Gupta és MacRitchie, 1991] (A: HMW-GS, B-,C-,D-: LMW-GS. Nyíl: D alegység)

A HMW glutenin alegységek mennyiségüket tekintve viszonylag kis részét, a teljes prolamin tartalomnak mindössze 10%-át képezik a búzában [Halford és mtsai. 1992]. A HMW glutenin

10

alegységek, a sikér viszkoelasztikusságában, ezáltal a sütőipari termékekhez felhasznált tészta funkcionális tulajdonságaiban betöltött szerepe miatt, az egyik legátfogóbban tanulmányozott és ennél fogva a legjobban ismert prolamin csoport [Gras és mtsai. 2001; Shewry és mtsai. 1989, 1992, 1995]. A HMW glutenin alegységek a legfőbb meghatározói a sikér rugalmasságának, mert szerkezetük és relatív mennyiségük meghatározza a glutenin polimerek méreteloszlását. Aminosav összetételükre a magas prolin és glutamin, valamint az alacsony lizin tartalom a jellemző. A cisztein aminosavak szabad szulfidril csoportjainak fontos szerepe van a molekulaszerkezet kialakításában. A HMW glutenin alegységek egy, az elektroforetikus mobilitás alapján kidolgozott számozási rendszer segítségével azonosíthatók [Payne és Lawrence, 1983]. A fehérjék nevében szereplő növekvő számok eredetileg a fehérjék SDS-PAGE mobilitásukhoz kapcsolódott, ám az újabb alegységek azonosításával ez a logika már nehezen volt követhető. Az újabb nomenklatúra a genetikai elvek szerint épül fel, a gének kromoszómális elhelyezkedéséről és az alegység típusáról ad információt. A HMW-GS fehérjék expresszióját az 1-es kromoszóma (1A, 1B és 1D) hosszú kaján lokalizált Glu-1 gének szabályozzák [Bietz és mtsai. 1975]. Ezeket a lokuszokat Glu-A1, GluB1, illetve Glu-D1-nek hívják. Valamennyi lókusz két gént jelöl, melyek két különböző típusú HMW glutenin alegységet, egy nagy molekulatömegű x- típusú, és egy kis molekulatömegű y- típusú alegységet kódolnak [Herberd és mtsai. 1986; Payne, 1987]. Az elektroforetikus kísérletekben jelentős polimorfizmus figyelhető meg a HMW glutenin alegységek számában és elektroforetikus mobilitásában mind a kenyér, mind a durum búza esetében [Lawrence és Shepherd, 1980; Waines és Payne, 1987]. Payne és Lawrence [1983] negyedszázaddal ezelőtt a Glu-A1 lokuszon 3, a Glu-B1-én 11, a Glu-1D-én 6 allélikus formát irt le, ma ezek száma meghaladja a százat. A legtöbb allél variációja a Glu-B1-nek van, ezt követi a Glu-D1, míg a Glu-A1- esetén 10 allél ismeret. Ezek az állélek, illetve ezek kombinációinak előfordulási gyakorisága rendkívüli módon különböző, és – többek között a nemesítési gyakorlat, illetve az

egyes

génkombinációk

minőséget

meghatározó

szerepe

miatt

–

országonként/földrészenként eltérő. Mivel a 1Ay ritka kivételtől eltekintve mindig csendes, a kenyérbúzák általában 5, a durum búzák 3 alegységet tartalmaznak [Payne, 1987]. Az 1Dx, az 1Dy és a 1Bx alegység jelen van minden fajtában, míg az 1Ax és/vagy az 1By alegységek csak néhányban.

11

A gluteninek x és y típusú HMW alegységeinek szerkezeti felépítése hasonló. A két alegységtípus az ismétlődő szekvenciák szerkezetében, méretében, és a rezidumokon elhelyezkedő cisztein molekulák számában különbözik (2. ábra). 2. ábra. A HMW gluteninek szerkezete [Gianibelli és mtsai, 2001]

Az alegységfehérjékben a központi ismétlődő hidrofil jellegű szekvenciákat a hidrofób természetű N- és C- terminálison rövid, nem ismétlődő szekvenciák határolják. Az Nterminális domén 81-89 rezidumot tartalmaz az x-típusú alegységekben, 104 rezidumot az ytípusúakban, míg 42 rezidum található a C terminális régió valamennyi HMW glutenin alegység fehérjében. Az alegységek N- és C terminálisán elhelyezkedő cisztein molekulák intermolekuláris

diszulfidkötések

kialakítására

képesek,

meghatározva

ezzel

a

viszkoelasztikus fehérjehálózat háromdimenziós szerkezetét. A HMW glutenin alegységekben 4-7 cisztein aminosav molekula van, néhányuk részt vesz a glutenin stabilizálását szolgáló intermolekuláris diszulfidkötésekben [Shewry és Tatham, 1997]. Valamennyi alegység esetében három vagy öt CSY molekula van az N-terminálison, és egy a C-terminálison. Továbbá egy CSY van a központi régión néhány alegység, mint pl. a 1Dx5 esetében. Ez a plusz cisztein aminosav az oka annak, hogy az 5-ös alegység fontosabb szerepet játszik a 10es alegységhez képest az 5+10 által kialakított erősebb tészta sajátságaiban. Ezzel szemben a 1Dx5 mellett egyedül a Bánkúti 1201-ben találtak az 1Ax2*B –alegységben ilyen láncközi cisztein molekulát [Juhász és mtsai. 2001]. A HMW glutenin polimerek központi régiója konformációját tekintve β fordulatokban gazdag, míg a két terminális régió α-hélix szerkezetű. Tatham és mtsai. [1985] által felépített modellben a β fordulatok felelősek a HMW glutenin molekulák elasztikus tulajdonságáért. Payne és mtsai. [1979] SDS szedimentációs vizsgálatok alapján közönséges búzafajták keresztezéséből származó utódokon a minőség és az összetétel közötti összefüggéseket tanulmányozták. Kimutatták, hogy az allél-összetételben jelentkező különbségek hatással vannak a sikér minőségére. Az allélikus variációk közül a kenyér búza Glu-1D helyen kódolt 5+10 illetve a 2+12 alegység párja szignifikánsan eltérő minőségi hatásai csak egy- egy példa a számos lehetséges allélikus variációra. Funkcionális kísérletek bizonyították, hogy a Glu-1D

12

génen kódolt Dx5+Dy10 HMW glutenin alegység pár nagyobb, míg a 2+12-es allél pár általában gyengébb tésztaerősséget jelent. Hasonló hatása van a Glu-1B x17+y18 alegység párnak, mely erős, míg a x20+y20 alegység pár gyenge tésztát eredményez. A tészta erősségében

megjelenő

eltérések

az

egyes

alegységek

másodlagos

szerkezetének

különbségéből és ennek megfelelően a glutenin polimerek molekulaméret-eloszlásából adódnak [Gupta és MacRitchie, 1994]. 2.1.1.2. LMW gluteninek Az LMW-GS fehérjék a teljes magfehérjéknek mintegy egyharmadát, a teljes glutenin tartalomnak 60%-át teszik ki [Bietz és Wall, 1973]. Nagy mennyiségük ellenére az LMW glutenin alegységek kevésbé kutatott fehérjecsoport, mint a HMW gluteninek. Ennek egyik oka, hogy egydimenziós gélen nehezen azonosíthatók. Az átfedések okozta azonosítási problémák megoldására szolgált Singh és Sheperd [1988] kétlépéses SDS-PAGE analízise [Jackson és mtsai. 1983]. Hasznos információt adhatnak az LMW-ék tanulmányozásában az RP-HPLC kísérletek is, bizonyítva, hogy az LMW-GS fehérjék a felszíni hidrofóbicitása hasonló a gliadinokhoz, illetve nagyobb HMW glutenin alegységeknél [Gupta és Sheperd, 1993]. A modern kapilláris elektroforézis lehetővé tette valamennyi glutenin alegység pontosabb jellemzését [Bean és Lookhart, 2000]. Az LMW glutenin alegységek nomenklatúrája a genetikai analízisen, valamint a gének kromoszóma lokalizációján alapszik. A nomenklatúra kidolgozása az alegységek relatív elektroforetikus mobilitása alapján történik. A gén szekvencián alapuló azonosításhoz - ami pontosabb lenne az alegységek jelölésére - azonban egyelőre még nem rendelkezünk elegendő adattal [Lew és mtsai. 1992]. Az N- terminális szekvenciának megfelelően az LMW glutenin alegységek két fő csoportra és mindkettőn belül három alcsoportra oszthatók: az első csoport megfelel a „tipikus” LMW-GS-nek (LMW-i, LMW-s és LMW-m), míg a második csoport fehérjéi szekvenciájukban hasonlóak az α-, γ- és ω- gliadinokhoz [Gianibelli és mtsai. 2001]. Az i-típus, az s-típus és az m-típus jelzi az első aminosavat: izoleucin, szerin vagy metionin. Csaknem valamennyi B alegység LMW-m vagy LMW-s N-terminális szekvenciával rendelkezik, míg a C alegységek szekvenciája az α- és γ-gliadinokhoz hasonló. A D típusú glutenint először Jackson és mtsai. [1983] figyelték meg. A D- glutenin fehérje gének a 1D kromoszóma Gli-D1 lokuszán kódoltak. Masci és mtsai. [1993] tovább jellemezték a D-típusú LMW glutenineket. Az N-terminális szekvencia és az elektroforetikus mobilitás alapján a glutenin D-alegységek nagyon hasonlítanak a kén szegény ω-

13

gliadinokhoz [Masci és mtsai. 1991a,b], melyek feltehetően az ω- gliadinok egy cisztein mutációja, ahol egy cisztein molekula keresztkötést tesz lehetővé a glutenin polimerben. Az LMW-GS fehérjék termelődését az 1A, 1B és 1D kromoszóma rövid karján, a Glu-A3, Glu-B3 és a Glu-D3 gének szabályozzák. Az LMW-GS fehérjemolekulák (kivéve a D-alegységet) másodlagos szerkezete nagy hasonlóságot mutat a kénben gazdag gliadinok szerkezetével [Tatham és mtsai. 1987; D’Ovidio és mtsai. 1995]. Az LMW-GS fehérjék N-terminális ismétlődő szekvenciája βfordulatokban gazdag, míg a rövid nem ismétlődő szekvenciákat α-hélix fordulatok jellemzik [Thompson és mtsai. 1992]. Az LMW- GS fehérjék az N-terminális végükön egy ciszteint tartalmaznak. Tao és Kasadra [1989], majd Lew és mtsai. [1992] korai kísérleteik alapján azt feltételezték, hogy az ismétlődő szekvenciák merevsége miatt az LMW gluteninek nem alakítanak ki intramolekuláris diszulfidkötéseket a C-terminálison lévő ciszteinekkel. Ma már részletes ismeretekkel rendelkezünk a ciszteinek intra- illetve intermolekuláris diszulfidkötésekben való részvételéről [Shewry és mtsai. 1999]. A C-terminális régióban 7 cisztein aminosav van, amelyek közül legalább egy páratlan, így alkalmas lehet az intermolekuláris kötések kialakítására. 2.1.1.3. Polimer gluteninek A fehérje alegységeket kódoló helyek kiterjedt polimorfizmusa, az allélek kombinációja nagy változatosságot biztosít a polipeptidek összetételében. A fehérje-összetétel mennyiségi és minőségi tulajdonságait ismeretlen számú gének reakciója, illetve a környezeti hatások együttesen határozzák meg („GxE”). Az egyik legfontosabb szempont ebben a folyamatban a glutenin alegységekből történő polimerizálódás folyamata. A búza polimer fehérjék polipeptidek keverékéből épülnek fel. Mivel a polimereknek a molekulatömege több millió daltont is elérheti, így a fehérjék molekulatömeg eloszlását és a precíz szerkezetét nehéz meghatározni. A glutenin formáció jobb megértéséhez több modell is létezik [Ewart, 1972; Graveland és mtsai. 1985; Kasarda, 1989; Wieser, 2007]. Ewart [1977] „lineáris glutenin hipotézise” szerint a glutenin alegységek lineáris polimerekből állnak, melyeket láncok közötti diszulfidkötések tartanak össze, amihez HMWGS vagy LMW-GS fehérjék kapcsolódhatnak véletlenszerűen. Graveland és mtsai. [1985] olyan modellt építettek fel, melyben az x-és y-típusú HMW-GS fehérjék fej-farok formában kapcsolódva alakítják ki a glutenin polimerek gerincét (3. ábra). A kísérletek eddig részben

14

ezt a modellt támasztották alá. Bizonyított, hogy a HMW-GS és az LMW-GS fehérjék elkülönülten polimerizálódnak és mindkét esetben lineáris polimer gerincet képeznek. A HMW-GS szegregációja az LMW-GS fehérjéktől a szintézis során azonban még nem teljesen ismert. Az egyetlen keresztkötés, amit találtak a két HMW prolamin fehérje között, egy diszulfidkötés az y-típusú HMW-GS HCb és az LMW-GS SCg rezidumai között [Wieser és mtsai. 2006]. A modell fontos állítása, hogy polimer fehérjékben a HMWx-HMWy-HMWx gerinchez oldalágként kapcsolódnak az LMW-GS-ek. Ez az első modell, mely állítása szerint az elágazási pont az HMWy-on van, a tetramer HMWx-HMWy-HMWx-HMWy pedig a „stabil” építőköve a teljes polimernek. Hamer és van Vielt [2000] kovalens és nem kovalens kötéseket is tartalmazó modellt indítványozott. Modelljük szerint a molekuláris szinten felül további nem kovalens - és diszulfidkötések által stabilizált bonyolult polimer aggregációk vannak jelen. A polimer elmélet alapján Singh és MacRitchie [2001] szerint a magasan polimerizált glutenint legjobban egy bonyolult polimer hálózatként lehet leírni, amelynek polimer-kémiai és reológiai viselkedés szempontjából fontos szerep jut a lineáris láncok „összegabalyodásának”. 3. ábra. Modell a sikért felépítő fehérjék szerepére [Wieser és mtsai 2006.]

2.1.1.4. A búza monomer fehérjéi A gliadinok egyszálú polipeptidek heterogén keverékei, melyek természetes alakjukban alkohol/víz elegyben oldódnak. A gliadin monomer fehérjék hidrogénkötések és hidrofób kölcsönhatások révén kapcsolódnak össze. Savas poliakril-amid gélen (pH 3,1) való mobilitásuk alapján megkülönböztetünk α−,β−,γ−, és ω- gliadinokat [Metakovsky és mtsai. 1984].

15

Molekulatömeg tartományuk 30.000 és 75.000Da között van. Egydimenziós elektroforézissel a búzamag gliadinok 20-25 komponensre választhatók szét [Bushuk és Zillman, 1978; Wirgley és mtsai. 1982; Metakovsky és mtsai. 1984] (4. ábra). A kétdimenziós elektroforézis a gliadinok jobb elválasztását tette lehetővé, mintánként a százat meghaladó gliadin polipeptid kimutatásával illetve azonosításával. Kiterjedt polimorfizmusának következtében ezt a fehérjecsoportot széles körben használják hexaploid és tetraploid búzák azonosítására, fajtaazonosításra. 4. ábra. Hexaploid búza gliadinok savas SDS –PAGE képe [Gianibelli és mtsai. 2001].

Az α, a β- és az γ- típusú gliadinok a kénben gazdag, míg az ω−gliadinok a kénben szegény prolaminok csoportjába sorolhatók. A ω−gliadinok szerkezetüket tekintve homológok a rozs ω-szekalinnal és az árpa D-hordeinnel (1. táblázat) [Tatham és Shewry, 1995]. A gliadinokat kódoló gének az 1-es és 6-os kromoszóma rövid karján találhatók [Wrigley és Shepherd, 1973; Brown és Flavell, 1981]. Ezek a szorosan kapcsolódó gének az 1 kromoszóma három homológ lokuszán, a Gli-A1, Gli-B1, and Gli-D, valamint a 6 kromoszóma Gli-A2, Gli-B2, and Gli-D2 lokuszán találhatók. A Gli-1 gének kódolják az összes ω- és a legtöbb γ -gliadint, míg a Gli-2 gének az összes α-, a legtöbb β- és néhány γgliadint. A gliadin fehérjék ω-típusú csoportjának jellegzetessége a magas glutamin- és prolin tartalom. A metionin aminosavak mennyisége kevesebb, mint 0.1%, a cisztein molekulák teljesen hiányoznak, így ezek a fehérjék nem képesek SS típusú kötések kialakítására. Az ωgliadinoknak nincsen kompakt szerkezetük. Főleg β fordulatokban gazdagok, csak kevés αhélix és β lemez fordul elő bennük. [Tatham és Shewry, 1985]. Felszíni hidrofóbicitásuk 16

nagyobb, mint az α- illetve γ típusú gliadinoké [Kasarda és mtsai. 1983; Tatham és Shewry, 1995]. Az α/β- és a γ-típusú gliadinok glutamin, prolin és leucin tartama viszonylag magas [Kasarda és mtsai. 1983]. Hat, illetve nyolc cisztein aminosav következtében a gliadin molekulák

kénben

gazdagok,

ennek

következtében

3

illetve

4

intermolekuláris

diszulfidkötések kialakítására képesek [Kasarda és mtsai. 1984; Köhler és mtsai. 1993; Müller és Wieser, 1995; 1997]. Az α és a γ típusú gliadinok szerkezete számos különböző méretű doménra tagolódik. Az Nterminális régió egy rövid domén 5-14 aminosavat, míg a központi ismétlődő domén 100 aminosavat is tartalmazhat. A C-terminális, nem ismétlődő domén lizinben és argininben gazdag [Thompson és mtsai. 1994; Müller ésWieser ,1997]. Nincs szabad cisztein molekulájuk, valamennyi SS kötés intramolekuláris, megakadályozva ezzel, hogy a gliadinok a glutenin polimer szerkezetébe beépüljenek. A γ gliadinok az ismétlődő szekvenciák βfordulatokban, míg a nem ismétlődők α-hélixben gazdagok [Tatham és mtsai. 1990]. 2.1.1.5. Minőség és összetétel A minőséghez kapcsolódó fehérje-összetétel különböző szempontok szerint vizsgálható. Ilyen a fehérjetartalom, a polimer/monomer fehérje arány, a HMW/LMW glutenin alegységek aránya, az x- és az y- típusú HMW glutenin alegységek aránya és a polimer fehérjék méreteloszlása. Ha a lisztmintában jó „egyensúly” van a különböző összetevők között, akkor megfelelnek a minőséghez szükséges kritériumoknak. A polimer és monomer fehérjék aránya (glutenin/gliadin arány), illetve a polimer méreteloszlás közvetlenül kapcsolódhat a tészta erősség és nyújthatóság mértékéhez. A tészta tulajdonságai szignifikánsan összefüggnek a fehérjetartalommal, ezért a glutenin/gliadin arány egyensúlya lehetővé teszi az azonos fehérjetartalmú minták összehasonlítását. Azonos glutenin/gliadin arány esetében a polimer frakció HMW/LMW-GS aránya határozhatja meg szignifikánsan a tészta erősséget és nyújthatóságot. Például a HMW/LMW alegység arány csökkenése következtében gyengébb tésztaerősség és megnövekedett nyújthatóságot jellemző [Lawrence és Sheperd, 1980]. A fehérjealegység arány manipulálása a tésztában az x- és y-típusú HMW glutenin alegységek arányának szisztematikus változtatásával is lehetséges [Butow és mtsai. 2003a], miközben fenntartható az azonos értékű fehérjetartalom, glutenin/gliadin illetve HMW/LMW alegység arány. Az egyéni polipeptidek relatív aránya szintén meghatározhatja a minőségi jellemzőket.

17

A fenti mennyiségi mutatók mellett a minőség és fehérje-összetétel közötti viszony legfontosabb paramétere annak a 12 genomikus allélnek az összetétele a mintán belül, amely a 3 nagy raktározási fehérjecsoportot kódolja. Az utóbbi években számos olyan módszer kidolgozására került sor, amelyek az allél-összetétel és a fehérjetartalom felhasználásával alkalmasak egyes minőségi paraméterek (sikérerősség, nyújthatóság) előrejelzésére [Cornish és mtsai. 2006]. 2.1.2. A rizs fehérjéi A rizs jelentős fehérjeforrás azokban az ázsiai országokban, ahol ritkán fogyasztanak húst. A rizsfehérjék a mag különböző részeiben, így a héjban és a korpában is megtalálhatók, de a legtöbb fehérje az endospermium sejtjeiben, a keményítő szemcsék között, a fehérjetestekben raktározódik [Cagampang és mtsai. 1966; Lasztity, 1996]. A rizsfehérjék táplálkozási szempontból értékesek, habár lizin hiányosak, ezért a fogyasztása során aminosav kiegészítés szükséges [Chrastil, 1992]. Zsírtalanított rizsből extrakciós folyamattal - az Osborne szerinti oldhatóság alapján- a következő fehérjék nyerhetők ki: az albuminok, majd ezt követi a híg sóoldatok, a híg lúgok és a 70% alkohol hatására kinyert fehérjefrakciók a globulinok, a glutelinek és a prolaminok. [Padhye és Salunkhe, 1979]. A

rizs

glutelin/globulin

és

prolamin

tartalékfehérjék

elkülönült

fehérjetestekben

raktározódnak. Már Bechtel és Juliano [1980] is megfigyelt két morfológiailag eltérő fehérjetestet a fejlődő rizs endospermiumában, egy gömbölyűt koncentrikus réteggel és egy szabálytalan alakút. A két fehérjetest pontos összetételét először Tanaka és mtsai. [1980] állapították meg gradiens centrifugálásával. A könnyebb fehérjetest frakciót PB-I-nek, míg a sűrűbbet PB-II-nek nevezték el. A biokémiai és immuonocitogenetikai vizsgálatok szerint a PB-I prolaminban, míg a PB-II glutelinben és globulinban gazdag [Krishnan és mtsai. 1986]. A fehérjetestekben a glutelin molekulák proteolítikusan savas (α), illetve bázikus (β) polipeptidé

formálódnak,

melyek

intermolekuláris

diszulfidkötésekkel

kovalensen

kapcsolódnak egymáshoz [Yamagata és mtsai. 1982]. 2.1.2.1. A rizs prolaminok A gabonafélék legnagyobb mennyiségű tartalékfehérjéi általában a prolaminok, azonban a rizs ettől eltérően prolaminban szegény, de glutelin fehérjékben gazdag [Muench és Okita, 1997]. A rizs prolaminok szerkezetileg homológok a búza és az árpa endospermium prolaminokkal, mégis olyan tulajdonságokkal rendelkeznek, ami megkülönbözteti őket más gabonaféléktől, 18

például jól oldódnak alkohol/víz elegyben. A prolamin fehérjék 70% etanolos oldatban extrahálva a teljes fehérjetartalom 5-10 %-át adják [Juliano, 1972], bár az újabb kutatások szerint a prolaminok a teljes fehérjék akár 18-20%-ában is jelen lehetnek [Li és Okita, 1993]. A rizs prolaminok extrakciója 55%-os n- propanolban sokkal hatékonyabb, mint 70%-os etanolban [Sugimoto és mtsai. 1986]. A ciszteinben gazdag prolaminok azonosítása redukálószerek használatát tette szükségessé ezeknek fehérjéknek a teljes feloldásához [Ogawa és mtsai. 1987]. A rizs prolaminok molekulatömege (hozzávetőlegesen 10.000 és 16.000 Da) sokkal kisebb más gabonafélék (búza és az árpa) prolaminjaihoz viszonyítva, kivéve a kukoricát, ahol a zein prolamin a rizs prolaminok molekulasúly tartományába esik [Okita és mtsai. 1988; Shewry és Tatham, 1990]. A fehérjék tartalmaznak egy 13.000-14.000 Da molekulatömegű polipeptidet és két kisebb, egy 10.000 és egy 13.000 Da molekulatömegű alegységet is. 2.1.2.2. A rizs glutelinek A legtöbb gabonaféle elsődleges nitrogén forrása a prolamin fehérjék, ezzel szemben a rizs legfontosabb tartalékfehérjéi a glutelinek. Az Osborne által kidolgozott frakcionálásnak megfelelően a glutelinek a rizsmag mennyiségileg legnagyobb fehérje frakciója (a teljes fehérjetartalom 70-80%-a). Elsődleges szekvenciájukban nagyfokú hasonlóságot mutatnak a 11S globulinokkal, a hüvelyesek legfőbb tartalékfehérjéivel [Zhao és mtsai. 1983; Wen és Luthe, 1985]. Míg más növényekben a 11S globulinok sajátos hexamert alkotnak, a rizs glutelinek

nagy

része

diszulfidkötések

révén

polimerizálódik,

majd

hidrofób

kölcsönhatásokkal makromolekuláris komplexeket képez [Utsumi, 1992]. A glutelin fehérjék tanulmányozása nagymértékű oldhatatlanságuk, nagy molekulatömegük és alkotóelemeik heterológiája következtében általában bonyolult. A glutelinek prekurzor molekulaként szintetizálódnak, majd poszt-transzlációs folyamatokban két kisebb, egy α−savas és egy β−bázikus alegységre bomlanak 30-39, illetve 19-25 kDa molekulatömeggel [Juliano, 1985]. Redukálószerek hatására, mint a DTT vagy 2-ME további alegységekre bonthatók [Juliano és Boulter, 1976]. A búzával szemben a rizs polimer fehérjéinek molekulatömege kisebb. A glutelin polipeptidek molekulatömege 64-500 kDa, melyeket a búza prolaminokhoz hasonlóan diszulfidkötések és hidrogén kölcsönhatások kapcsolnak össze nagy makromolekulává. Feltehetően a diszulfidkötésekkel polimerizálódott fehérjék aggregációja [Sugimoto és mtsai. 1986], valamint a glikozilálás [Wen és Luthe, 1985] felelős a glutelin frakció korlátozott oldhatóságáért. 19

2.1.2.3. A rizs globulinok A rizs polimer szerkezetű raktározási fehérjék alegységei globulin fehérjék. A polimer formában lévő globulinok mellett monomer globulinok is jelen vannak. A monomer globulin mennyiségileg a második legnagyobb fehérjefrakció a rizsben, a teljes endospermium fehérjéknek mintegy 8-10%-a [Juliano, 1985]. A globulin fehérjékben nagy mennyiségben vannak jelen kéntartalmú aminosavak [Krishnan és mtsai. 1992]. A globulin polimer molekulák sok intermolekuláris diszulfidkötéssel kapcsolódnak össze [Pan és Reeck, 1988]. A globulinokat alkotó két polipeptid molekulatömege 26 kDa és 16 kDa [Komatsu és Hirano, 1992; Tanaka és mtsai. 1980]. A 23-27 kDa polipeptid (α globulin) szerkezetében hasonlít a búza HMW glutenin alegység fehérjéhez [Cagampang és mtsai. 1966; Komatsu és Hirano, 1992]. Egyes tanulmányok szerint a rizs globulinok az intermolekuláris kötések mellett egy intramolekuláris diszulfidkötést is tartalmaznak, ami a globulinokban jelenlévő két cisztein molekula között jön létre [Komatsu és Hirano, 1992]. A diszulfidkötések mellet a hidrofób aminosavak által kialakított hidrogénkötéseknek is szerepe van a rizs globulinok konformációjának kialakításában [Ellpola és mtsai. 2006]. A rizs globulinok másodlagos szerkezete a korábbi eredmények szerint α-hélixből áll. A natív globulin fehérjék újabb, infravörös spektroszkópiával végzett kutatásai során megállapították, hogy a globulinok másodlagos szerkezetét túlnyomórészt β- lemezek és fordulatok építik fel, melyet α-hélixek és random spirálok követnek. A fehérjék konformációjának kritikus szerepe van a funkcionális tulajdonságok meghatározásában. A konformációs változások követése bonyolult az olyan fehérjéknél, mint a globulinok, kismértékű oldhatóságuk és a biológiai aktivitás következtében. A globulin fehérjék mennyisége szignifikánsan befolyásolhatja a rizs minőségét [Krishnan és mtsai. 1992]. 2.1.3. A rizsfehérjék izolálása és elválasztása A rizsfehérjék hatékony izolálásának lehetőségét számos kísérletben tanulmányozták. A NaOH hatékony oldószer, bár használata során a fehérjék denaturálódhatnak [Shewry és Miflin, 1985]. Hatékonyabb és kíméletesebb az extrakciót jelent a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) és a 2-ME együttes alkalmazása [Juliano és Boulter, 1976; Tecson és mtsai. 1971]. A 2% SDS és a 2% SDS/6M urea /0-1,5% DTT jelenlétében elválasztott rizs endospermium fehérjék jól azonosítható alegységekre bomlanak [Udaka és mtsai. 2000].

20

A glutelinek molekulatömeg eloszlását Sephadex G-200 kromatográfiás eljárással határozták meg [Tecson és mtsai. 1978]. Snow és Brooks [1989] rizs glutelineket választott el Sepharose CL-6B gél oszlopkromatográfián, ahol a nyers rizsfehérje extraktum négy frakcióra vált szét. Hamada és mtsai. [1998] egy reprodukálható kromatográfiás eljárást írt le a rizskorpa fehérjéinek

elválasztására,

mely

lehetővé

tette

a

fehérje

molekulatömeg-eloszlás

meghatározását, valamint az egyéni polipeptidek jellemzését és további frakcionálását. Az anioncserélő- és a gélkromatográfia kombinációjával Zarins és Chrastil [1992] 33, 22, és 14 kDa nagyságú glutelin alegységeket választott szét. Katsube-Tanaka és mtsai. [2004] szintén glutelin polimereket és az alacsonyabb molekulaméretű frakciókat választott el Sephacryl S300HR tölteten. A rizsfehérjék vizsgálatára használt módszerek során legtöbb esetben a fehérjealegységek átfedték egymást [Bietz, 1986]. Redukálószer (DTT, 2-ME) és/vagy detergens (SDS) hatására a fehérjék alegységeikre bonthatók, majd SDS gélelektroforézissel (SDS-PAGE) [Sarker és mtsai. 1986; Sugimoto és mtsai. 1986, Hussain és mtsai. 1989], illetve RP-HPLC-vel elválaszthatók [Chen, 1991]. A fehérjék redukált vagy natív molekulatömeg eloszlása jól jellemezhető SE-HPLC-vel végzett vizsgálatokkal [Hamada, 1996; Van Der Borght és mtsai. 2006] (5. ábra). 5. ábra. Rizsliszt SE-HPLC profilja redukálószer nélkül. I-VI elválasztott fehérjefrakciók [Van der Borgh és mtsai, 2006]

A SE-HPLC analízis során kapott frakciók gélelektroforézises vizsgálata jól mutatja, hogy a fehérjék LMW komponense egy α −(32 kDa) és egy β−(25 kDa) alegységből származhat (5. ábra: IV-V). A következő nagy molekulatömegű komponens két alegységet tartalmaz intermolekuláris diszulfid hidakkal összekapcsolva, ami dimer, trimer, illetve magasabban polimerizált formában is jelen lehet (5. ábra: I-III). A legalacsonyabb molekulatömegű frakció (15-20 kDa) albumint, globulint és prolamint tartalmaz (5. ábra: VI). Az SE-HPLC során

21

kapott HMW aggregátumok csak részben bomlottak fel a redukció során. Ennek oka feltehetően a diszulfidhidak hozzáférhetetlensége, más kötőerők jelenléte vagy a szulfhidril csoportok oxidációja. A rizs endospermium fehérjék oldhatatlansága a polipeptidek között lévő hidrofób, hidrogén és diszulfidkötéseknek köszönhető. 2.2. Az endospermium fehérjék funkcionális vizsgálata 2.2.1. Búzaliszt minősítő módszerek A búzalisztek sütőipari minőségének meghatározása a lisztből víz hozzáadásával készült tészta dagasztási paramétereinek meghatározásával történik. A laboratóriumi dagasztók (mixerek) a dagasztás során fellépő, a tészta kialakulása során folyamatosan változó ellenállást regisztrálják. Világviszonylatban kétfele mérési módszer van használatban, amelyek alapvetően a dagasztás által közvetett energia mennyiségben, vagyis a dagasztás intenzitásában, illetve a dagasztólapát kialításában különböznek egymástól. Az eredetileg magyar szabadalomként kidolgozott z-karú laboratóriumi dagasztók (a gyártó és forgalmazó cégtől függően a Farinográf és Valorigráf) mellett az álló és mozgó tűkkel operáló Mixográf a két általánosan használt típus. A Farinográf és a Valorigráf két ellentétes irányban és eltérő sebességgel forgó z-karból és a hozzátartozó csészéből álló dagasztó berendezések. A kirajzolt görbe (valorigram) tájékoztat a reológiai tulajdonságokban bekövetkezett változásokról (6. ábra). 6. ábra. A valorigram és a belőle leolvasható paraméterek

A vízadagolás pillanatától kezdődően - egy kaotikus szakasz után- a görbe növekvő tendenciája jelzi a tésztaképződés megindulását. A vízadagolástól a maximális konzisztencia eléréséig eltelt idő a minta dagasztási szükséglete, míg a regisztrált maximális ellenállásérték az úgynevezett maximális konzisztencia. A maximális konzisztenciát elérve, ha a dagasztást

22

folytatjuk, ennek értéke csökken. Ez a hosszabb-rövidebb ideig tartó plató a tészta stabilitását jellemzi [D’Appolonia és Kunerth, 1984]. Az ellágyulás mértéke, vagyis a konzisztenciacsökkenés meredeksége az úgynevezett tolerancia indexet adja meg. 2.2.1.1. Tészta- és lisztminősítésre alkalmas mikro-módszerek A fajták nemesítési folyamatainak kezdeti szakasza, a genetikai módosítás lehetőségeinek tanulmányozása, illetve a változások molekuláris szinten történő magyarázatához szükséges vizsgálatok olyan kutatási területek, ahol a minta korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre. A hagyományos műszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékek, valamint mikromódszerek alkalmazása lehetővé teszik, hogy néhány grammnyi liszt minőségi paramétereit, illetve a paramétereknek néhány mg tisztított fehérjekomponens adagolása hatására bekövetkezett változásait követni tudjuk [Békés és mtsai. 2003]. A műszerek méretcsökkentés fejlesztésének eredménye volt a 10g-Farinográf [D’Appolonia és Kunerth, 1984], a 2g-Mixográf [Rath és mtsai. 1990], a mikro-Extenzográf [Rath és mtsai. 1994], a mikro-valorigráf [Haraszi és mtsai. 2004], a mikro malom [Békés és mtsai. 2000] és a mikro-sütési eljárások [Shogren és Finney, 1984]. A mikro műszerek fejlesztése és az eredmények automatikus regisztrálása jobb reprodukálhatóságot és objektívebb értékelést tesz lehetővé. Az ilyen méretű műszerekkel olyan kísérleteket lehetett elvégezni, melyek korábbi technológiáikkal nem voltak megvalósíthatók [Gras és Békés, 1996; Gras és mtsai. 2000]. A mikro vizsgálatokra alkalmas műszerek egyik tagja a mikro-valorigráf (mikro z-arm mixer) (7. ábra). A mikro z-arm mixer állandó fordulatszámon, a tengelyen ébredő erővel arányos és a motor teljesítményében bekövetkező áramerősség-változást méri [Gras és Békés, 1996; Haraszi és mtsai. 2004]. 7. ábra. A mikro z-arm mixer prototípusa

23

Az alapgörbén meghatározható paraméterek a stabilitás (ST), a maximális tésztaellenállásig eltelt idő (MT), a maximális tésztaellenállás (PR), valamint a tésztaellágyulás (BD) (7 ábra). A kísérletek igazolták, hogy a mikro-valorigráffal elért eredmények hasonlóak a hagyományos készülék eredményeihez, illetve jól alkalmazhatók nemesítési és kutatási célokra egyaránt [Tömösközi és mtsai. 2000a,b]. A mikro z-arm mixerrel kapott görbe karakterisztikája megegyezik a hagyományos valorigrammal, a keverési paraméterek közül azonban a tésztakialakulás idejében enyhe eltérés volt tapasztalható. A maximális keverési ellenállás és a vízfelvevő képesség közötti negatív, lineáris összefüggés lehetővé teszi a vízfelvétel meghatározását alap és kevert lisztek esetében egyaránt [Gras és mtsai. 2000]. 2.2.2. A rizstészta reológiai jellemzése A búzával összehasonlítva, a rizsfehérjék nem képesek sikér kialakítására és a fermentáció során keletkezett CO2 visszatartására, így a kenyér illetve más sütőipari termékek előállítása rizslisztből technológiai nehézségekbe ütközik [Sivaramakrishnan és mtsai. 2004; Gurjal és Rossell, 2004]. A kutatások szerint különböző hidrokolloidok, mint például a hidroxipropilmetil-cellulóz (HPMC) vagy a glicerin monosztearát alkalmas lehet a sikérfehérjék részleges helyettesítésére [Jong és mtsai. 1968]. A HPMC inkorporációja a tészta szerkezetébe lehetővé teszi az úgynevezett rizskenyér elkészítését [Kang és mtsai. 1997; Nishita és mtsai. 1976; Gurjal és mtsai. 2003]. A HPMC egy filmréteget képez a rizsliszttel, ami visszatartja a CO2-t növelve ezzel a cipó térfogatot. A rizsfehérje keresztkötések, illetve a polipeptid láncok közötti kovalens kötések a fehérje funkciójának megváltozásával járnak. Ezáltal a rizsfehérjék felhasználásának lehetőségei is bővülnek [Gerrard, 2002]. Oxidálószerek vagy oxidatív enzimek, mint a GO vagy a peroxidáz, melyek jelenleg is használatosak a sütőiparban, a sütőipari termékek optimális térfogat növekedését teszi lehetővé [Hilhorst és mtsai. 1999; Minussi és mtsai. 2002]. A GO a glükóz oxidációját katalizálja, mely során glükuronsav és hidrogén peroxid keletkezik [Vemulapalli és mtsai. 1998]. A hidrogén-peroxid a fehérjék szabad SH csoportok oxidációjával diszulfidkötéseket képez, módosítva ezzel a fehérje polimer-szerkezet, az oldhatóságot, és a funkcionális tulajdonságokat. A CO módosíthatja a rizstészta elasztikus és viszkózus tulajdonságát is. [Gurjal és Rosell, 2004]. Jenlétében nagyobb erő szükséges a rizslisztből készült tészta deformációjához.

24

A rizslisztből készült tészta reológiai vizsgálatára kevés adat áll rendelkezésre. A reológiai vizsgálatok egy része stressz reométerrel történt, ahol a rotációs- és nyírási stressz, a csúszás és az oszcilláció határozható meg. 2.2.3. A rizstészta funkcionális vizsgálata komplex rendszerben A rizs tartalékfehérjék szerepe a rizslisztből készült tészta reológiai tulajdonságainak kialakításában még nem teljesen tisztázott. Rizslisztből és vízből dagasztással készíthető rizstészta, amelynek tulajdonságai különféle enzimek adagolásával módosítható. A búzaliszt minősítésénél rutinszerűen alkalmazott Farinográf (Brabender, Germany) a rizslisztből készült tészták jellemzésére is alkalmas lehet [Sivaramakrishnan és mtsai. 2004]. A 2.2.1. alfejezetben leírtak szerint, a búzatészta esetében a Farinográffal kapott farinogramon a dagasztással szembeni ellenállás maximális kohézióképességet és a nyújthatóságot jelenti, ami a dagasztási idővel csökken. A vízabszorpció meghatározásakor a rizslisztből készült tészta farinogram görbéje hasonló, mint a búzaliszté, de az 500 FU ellenállásérték elérése hosszabb időt vesz igénybe [Sivaramakrishnan és mtsai. 2004]. A búzától szignifikánsan különböző hidratációs és reológiai

tulajdonságok

következtében

az

eredetileg

búzára

kidolgozott

műszer

alkalmazásakor módszertani problémával is számolni kell. A mérés során a rizsliszt szemcséi a keverő edény és a kés közötti résekbe szorulhatnak, ami megnövelheti a mért forgatónyomatékot. 2.2.4. A végtermékek reológiai vizsgálata Korábban úgy tartották, hogy a rizs étkezési tulajdonságait és minőségét a keményítő, illetve az amilóztartalom határozza meg, ugyanis az őrölt rizsmag szárazanyag tartalmának 95%-a keményítő [Halick és Kelly, 1959; Juliano, 1985]. További vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a keményítő mellett más komponensek is szerepet kapnak a fizikai tulajdonságok kialakításában. A keményítő mellett kevesebb figyelem jutott a fehérjékre, mint a fizikai tulajdonságokat is meghatározó faktorra. A fehérjék azonban a főtt rizs néhány olyan tulajdonságát befolyásolhatják, melyekre a keményítőnek nincsen hatása. Chrastil [1992] szerint a fehérje-keményítő közötti lineáris kölcsönhatás az egyik legfontosabb faktor a ragadósság kialakításában. Feltételezhetően a fehérjék hatással vannak még a felszíni keménységre, illetve a korábbi tanulmányok szerint a nagyobb fehérjetartalmú rizs nagyobb szilárdságú, mint az alacsonyabb fehérjetartalmú [Chrastil, 1994].

25

A rizs fizikai-kémiai tulajdonságainak is szerepe van a sütőipari végtermék minőségének kialakításában [Nishita és Beau, 1979]. Például a rizskenyér készítéséhez a magas amilóztartalommal rendelkező rizsfajtákból származó liszt a legalkalmasabb. A rizs gazdasági értéke erősen összefügg a szerkezeti tulajdonságaival. Ezek fontos hatással lehetnek a rizstermékekben történő felhasználhatóságra. Például a japán ’sushi’ gyenge, ragadós rizst igényel, míg az indiai stílusú ételek rendszerint erősebb, nem ragadós rizsből készülnek [Bhattacharjee és Kulkarni, 2000]. A fontosságuk ellenére nem teljesen ismert, hogy milyen faktorok játszanak szerepet a ragadósság, illetve a keménység kialakításában. Bár Champagne és mtsai. [1999] megfigyelték, hogy a hasonló keményítőtartalommal és összetétellel rendelkező fajtáknak is lehetnek eltérő szerkezeti és csirizesedési tulajdonsága. Ezek a tanulmányok kapcsolatot mutatnak a rizs teljes fehérjetartalma és a rizs fizikai tulajdonságai között, mégsem egyértelmű, hogy az egyes fehérjefrakciók hogyan hatnak a rizs ilyen tulajdonságaira [Lim és mtsai. 1999]. Baxter és mtsai. [2004] szerint a prolaminok mennyisége szignifikánsan befolyásolja a rizstészta viszkozitását, valamint a rizsliszt gélek keménységét, a ragadósságát és a nyúlósságát. A viszkozitás során az ellágyulásban megfigyelt növekedés a víz-keményítő komplexhez hozzáadott prolamin hatására bekövetkező keményítő szemcsék repedésének a következménye, mivel a prolaminok hatására a keményítő szemcsék vízkötőgépessége növekedett. 2.3. Tartalékfehérje alegységek hatása a tészta funkcionális tulajdonságokra 2.3.1. In vitro fehérje összetétel módosítása a búza tésztában A búzalisztből készült tészta dagasztási tulajdonságai és sütőipari felhasználását nagy részben a sikérfehérjék határozzák meg [Pomeranz, 1988]. A sikérfehérjék tésztaerősségére, illetve a sütőipari minőségre gyakorolt hatásának vizsgálata a kísérleti megoldás elveit tekintve két csoportba osztható (8. ábra) [Cornish és mtsai. 2006]. 1: Közvetett, korrelatív kísérleti megközelítés, ahol statisztikailag szignifikáns kapcsolatokat keresünk a minőségi paraméterek és a sikérfehérje típusok (allélek) és arányok között [Campbell és mtsai. 1985]; 2: Közvetlen, frakcionálás/rekonstrukciós elvű kísérletek, ahol funkcionális tulajdonságoknak egyes fehérjefrakciók addíciója és/vagy inkorporációja során történt változása alapján következtetünk az adagolt fehérjék szerepére [MacRitchie, 1987; MacRitchie és mtsai. 1991].

26

8. ábra. A liszt minőség és a kémiai összetétel kapcsolata [Cornish es mtsai. 2006].

A búzaliszt rekonstrukciós kísérleteiben a liszt kémiai komponenseinek mennyiségi és minőségi összetételét változtathatjuk meg az egyes összetevők izolálásával, majd a liszt rekonstrukciójával. Ilyen kísérletek bizonyították, hogy a búzafajták között megjelenő lényeges különbség elsődlegesen a fehérje-összetétellel van összefüggésben. Rekonstrukciós kísérletekkel határozták meg a fehérjetartalom, a fehérjeméret, valamint a sikérfehérjék molekulatömeg eloszlásának szerepét és hatását a tészta tulajdonságaira [Harris és Sibbit, 1942; Finney, 1943; MacRitchie, 1987]. Az addíciós és inkorporációs elvű in vitro kísérletek segítettek a fehérjék mennyiségének a tészta minőség kialakításában betöltött szerepének a megismerésében. Az elmúlt néhány évben a funkcionális tulajdonságok vizsgálatára kialakított új technikák lehetővé tették kis mennyiségű (5-10 mg) búza tartalékfehérje hatásának a vizsgálatát. Az addíció esetén a vizsgálandó fehérje alegységet egyszerűen hozzáadagoljuk az alapliszthez, míg inkorporáció során az alapliszt polimer fehérjéinek részleges redukcióját követően adagoljuk a beépítendő alegységet, amely az ezt követő oxidáció után beépül az alapliszt fehérje mátrixába. Az egyes fehérjék/polipeptidek izolálása búzalisztből sokszor nehézkes és időigényes, sok esetben nem megoldható. Ennek megoldása lehet a fehérje más organizmusokban történő expressziója. A vizsgálni kívánt búza tartalékfehérje gént egy idegen genomban, például az Eschericia coli, élesztő vagy rovar sejtjeiben, egy búzafehérje-mentes rendszerben történő termelése megkönnyíti a fehérje tisztítást és izolálást [Tamás és mtsai. 1998; Tamás és Shewry, 2006].

27

2.3.1.1. A fehérje addíció hatása A tartalékfehérjék hatásának vizsgálatai a tészta tulajdonságaira elsősorban a glutenin fehérjékre fókuszáltak. Később bizonyították, hogy a tészta nyújthatósága nagymértékben függ a gliadinok mennyiségétől, illetve a glutenin/gliadin arányától is [Wieser, 1994; Wrigley és mtsai. 1982; Branlard és Dardevet, 1985a,b; Campabell és mtsai. 1985; Schropp és Wieser, 1996, Uthayakumaran és mtsai. 2001]. A gliadin mintázat és a technológiai tulajdonságok közötti összefüggések meghatározása nem olyan egyszerű, mint a HMW glutenin alegységek esetében. A gliadinok az LMW gluteninekhez hasonlóan nagy, többgénes családokban kódoltak és úgynevezett blokkokban öröklődnek, így az egy gliadin fehérjének tulajdonított hatásban valószínűleg a többi gliadin vagy LMW glutenin molekuláknak is szerepe lehet. A liszthez adagolt gliadin a dagasztási tulajdonságait tekintve egy gyengébb és kevésbé stabil tésztát eredményez, ami a dagasztási idő és a maximum rezisztencia csökkenésében illetve az ellágyulás mértékének növekedésében nyilvánul meg [MacRitchie, 1987; Fido és mtsai. 1996; Hussain és Lukow, 1997]. A különböző gliadin csoportok hatása a tészta dagasztási tulajdonságaiban eltérő mértékű. [Fido és mtsai. 1997, Murray és mtsai. 1998]. A gliadin frakciók addíciójának hatására a dagasztási idő mellett a tészta maximális ellenállása (PR) is csökken. A gliadinok arányának növelésével megemelkedett cipótérfogatot is tapasztaltak [Weegels és mtsai. 1994]. A HMW glutenin alegységek jelenléte vagy hiánya, mennyisége és összetétele a glutenin polimerben szoros összefüggésben van a sütőipari tulajdonságokkal [Payne és mtsai. 1979; Payne, 1987; Field és mtsai. 1983; Payne és mtsai. 1984; Ng és Bushuk, 1988]. A kutatásokból kiderült, hogy az LMW glutenin alegységek is szignifikánsan összefüggésbe hozhatók a kenyér és a durum búzából készült tészta minőségével, elsősorban a stabilitásával és nyújthatóságával [Gupta és mtsai. 1989; 1994; Sissons és mtsai. 1998; Pogna és mtsai. 1990; Ruiz és Carrillo, 1993]. A monomer glutelin alegységek egyszerű addíciója során nem vizsgálható az alegységek valódi hatása a tészta funkcionális tulajdonságaira, mert az alegységek nem épülnek be a glutenin polimer szerkezetébe, ezért nem is változtatják meg a fehérje polimer molekulaméreteloszlást. Ennek következtében hatásuk a tészta reológiai tulajdonságaira hasonló a gliadin monomerek addíciójának hatásával.

28

2.3.1.2. Redukció és oxidáció hatása a tészta funkcionális tulajdonságaira Ugyan az expresszált fehérje közvetlen addíciója az alapliszthez lehetővé teszi az egyéni fehérje komponensek szerepének vizsgálatát a funkcionális tulajdonságok alakulására, de egyszerű addíciója során nem vizsgálható az alegységek valódi hatása. Ezért az addíció helyett a fehérjéknek az alapliszt sikér polimer hálózatába történő beépítéséhez kémiai inkorporációra van szükség. Békés és mtsai. [1994] kidolgoztak egy módszert, ahol a sikérfehérjék részleges redukciója, majd re-oxidációja után a tészta funkcionális tulajdonságai szignifikánsan nem változtak meg. Redukálószer hatására a sikérfehérjék átlagos molekulatömege az intermolekuláris diszulfidkötések bontása következtében csökken. Kis mennyiségben alkalmazott redukálószer (DTT vagy a cisztein) hatására a diszulfidkötések elhasadtak, ami a tészta dagasztási paramétereinek romlását (MT, PR csökkent, a BD nőtt) eredményezte. A kísérletekben a redukálószert olyan mennyiségben alkalmazták, amely a glutenin szerkezetnek csak részleges redukcióját eredményezte [Ng és mtsai. 1991; Werner és mtsai. 1992], ezért a szignifikáns változások ellenére a liszt-víz keverék még mindig tésztaként viselkedett Miller és mtsai. [1999] bizonyították, hogy az oxidáció növeli a tészta erősségét. Az oxidáció során a szulfhidril csoportok feltehetően diszulfidkötéseket alakítanak ki, növelve ezzel a tészta fehérjéinek átlagos molekulatömegét. [Békés és mtsai. 1994]. A tésztában bekövetkező redukció a polimerek átlagos molekulatömegének csökkenésével jár, míg az oxidációt követően a fehérjék molekulatömege az eredeti tartományba áll vissza. Békés és mtsai. [1994b] négy oxidálószerrel (kálium-bromát, kálium-jodát, káliumpermanganát és hidrogén peroxidáz) vizsgálták a redukált tészta eredeti funkcionális tulajdonságainak visszaállításának lehetőségét. A kísérletek alapján a kálium-permanganát és a kálium-jodát szignifikánsan hatékonyabb volt, mint a másik két oxidálószer. Az oxidáció után, a tésztában bekövetkező változások ellenére a tészta viselkedése jelentősen hasonlított az eredeti, kontroll tésztáéhoz. 2.3.1.3. Funkcionális tulajdonságok változása inkorporáció hatására A tésztára alkalmazott megfelelően beállított redukciós- oxidációs módszer, úgynevezett modell rendszerként szolgálhat, mely alkalmas lehet glutenin alegységek inkorporációjának hatására bekövetkezett változások vizsgálatára. Továbbá az inkorporációs technika lehetővé teszi, hogy a különböző allél-variációk hatását kísérletekben is tanulmányozzuk, anélkül, hogy egyéb genetikai különbségek befolyásolnák azt.

29

Az egyéni HMW glutenin alegységek, mint pl. a HMW 1Bx20 alegység inkorporációja egy jobb dagasztási tulajdonságokkal rendelkező erősebb tésztát eredményezett [Békés és mtsai. 1993]. Az alegységfehérje hatására megnövekedett a dagasztási idő és a maximális konzisztencia [Gras és mtsai. 1992]. Békés és mtsai. [1995] igazolták, hogy az 5+10 alegység inkorporációja egy null–Glu-D1 típusú mutáns lisztbe nagyobb mértékben növelte a tészta erősségét, mint az azonos mennyiségű 2+12-es alegység pár. A 2, 12, 5 és 10 HMW glutenin alegységek egyéni inkorporációjának hatása kisebb volt, mint a alegység párok estében (2+12 vagy 5+10) [Békés és mtsai. 1995]. A különböző HMW glutenin alegységek inkorporációja bizonyította, hogy a funkcionális tulajdonságokban nem csak az összetétel, hanem a mennyiség is meghatározó paraméter [Schropp és mtsai. 1995; Schropp és Weiser 1996; Sapirstein és Fu, 1996]. A mennyiségi különbségek abból erednek, hogy a HMW-GS gének eltérő lokuszon kódoltak. A Glu-B1 és Glu-D1 helyeken kódolt géneknek nagyobb hatása van a funkcionális tulajdonságokra, mert ezek általában mindkét alegységet termelik, míg a Glu-A1 helyeken csak egy alegység kódolt [Uthayakumaran és mtsai. 2000]. A polipeptidek mérete fontos paraméter az inkorporáció során. Minél nagyobb a beépített glutenin alegység hossza, annál nagyobb a tészta dagasztási időszükséglete [Veraverbeke és mtsai. 1998; Tamás és mtsai. 2002]. A beépített LMW-GS hatására is nő a dagasztási idő értéke, bár a hatása kevésbe jelentős, mint a HMW glutenin alegységek esetében [Lee és mtsai. 1999a]. Olyan genetikai vonalak esetében, melyek egy, kettő vagy mind a három Glu3-ban hiányosak az LMW glutenin alegységek inkorporációja pozitívan, bár sokkal kevésbé befolyásolják a tészta erősséget, mint a HMW alegységek [Gupta és mtsai. 1995]. 2.3.1.4. HMW-GS összetétel változtatása genetikai transzformációval A genetikai technikák fejlődése jó lehetőséget kínál olyan fajták létrehozásához, melyek a HMW-GS fehérjéket új kombinációban tartalmazzák, javítva ezzel a búza sütőipari tulajdonságait. A genetikai transzformáció az egyes gének nagyobb kópiaszámban történő beépítésével lehetővé teszi a minőséghez kapcsolódó fehérjék mennyiségi növelését. Olyan fehérjék, melyek nem kedvezőek az élelmiszerek termelésében, vagy az ipari folyamatokban, a géncsendesítés folyamatával kiüthetők [Maruta és mtsai. 2001]. A genetikai transzformációval más fajtákból származó vagy mesterségesen szintetizált új gének is bejuttathatók a búzába. Korábbi kísérletekben már sikeresen transzformáltak búzát HMW-GS alegységekkel [Altpeter és mtsai. 1996; Blech és Anderson, 1996; Barro és mtsai. 1997; Alvarez és mtsai. 2000]. 30

Barro és mtsai. [2003] a HMW glutenin alegységek közül, a 1Dx5 és 1Ax1 alegységek funkcionális tulajdonságainak hatását vizsgálták transzgénikus búzában. Mindkét alegység expressziója az endogén HMW-GS fehérjék tulajdonságainak csökkenéséhez vezetett. Az 1Ax1 alegység szignifikánsan növelte a sikér és a tészta sütőipari minőségét. Az 1Bx7 alegység túltermelése a normál búza fajtában extra tésztaerősséget és jobb sütőipari minőséget eredményezett a hasonló fehérjetartalommal, illetve glutenin/gliadin arányú búzával szemben [Butow és mtsai. 2003b; Juhász és mtsai. 2001]. Más esetben az 1Dx5 alegységet kódoló gén kópiaszámának növelése a transzgénikus búzában olyan erős tésztát adott, hogy annak dagasztása hagyományos módon nem volt lehetséges [Blecht és Anderson, 1996; Blecht és mtsai. 2007.]. A HMW 1Ax1 és az 1Dx5 alegységekkel transzformált durum búza 2 g Mixográfon végzett vizsgálatai azt mutatták, hogy az alegységek expressziója erősebb és stabilabb tésztát eredményezett, bizonyítva, hogy a jobb sütőipari termékek előállítása céljából a transzformálás alkalmas a durum búza módosítására [He és mtsai. 1999]. A beépített HMW glutenin gének funkcionalitást mutattak transzgénikus dohányban, búzában és tritordeumban [Shani és mtsai. 1994; Rooke és mtsai. 1999]. Sangtong és mtsai. [2002] a HMW 1Dx5 gén expresszióját és öröklődését tanulmányozták transzgénikus kukoricában. 2.4. Genom összetétel megváltoztatása in vivo géntechnológiai módszerekkel A Föld népességének folyamatos növekedése következtében olyan fenntartható, új mezőgazdasági technológiai fejlesztések váltak szükségessé, melyek lehetővé teszik az évenkénti élelmiszer-előállítás közel 50%-os növekedését a következő 30-40 évben (OECD, 2000). Az úgynevezett első generációs GM növények elsősorban agronómiai és környezetvédelmi célt szolgáltak, amikor növényi kártevőknek (gomba-, vírus-, baktérium-és rovar rezisztens), illetve növényvédőszereknek ellenálló növényeket hoztak léte. A második generációs fejlesztések már táplálkozási célt is szolgáltak. Kedvezőbb beltartalmi értékekkel rendelkező, jobb ízű, nagyobb esszenciális zsírsavtartalmú vagy hosszabb eltarthatósággal rendelkező transzgénikus élelmiszereket jelentettek meg a piacon [Rilay és Hoffman, 1999]. A harmadik generációs GM növények fejlesztése már nem elsősorban ipari, hanem szerves molekulák előállítására és hatóanyag termelésre, fejlesztésére összpontosul (pl. ehető vakcinákat termelő növények) [Oszvald és mtsai. 2007].

31

A növényi biotechnológia alappillérjei a sejt-és szövettenyésztési módszerek, melyek a vegetatív és generatív sejtek, szövetek, szervek és embriók in vivo tenyésztését jelenti kontrollált körülmények között. A szövettenyésztési módszerekkel a növények minden része, szerve, szövete, sejtje megfelelő feltételek és sterilitás esetén mesterségesen életben tarthatók és tenyészthetők [Tulecke, 1953]. A magasabb rendű növények minden szerve adott feladatot lát el. A differenciálódott sejtekben a teljes genetikai állománynak csak egy töredéke működik, melynek aktivitása az adott feladattól függ. Ha a módosításhoz használt célszövet már differenciálódott sejteket tartalmaz, akkor először annak sejtosztódáson keresztül történő de-differenciálódását kell indukálni és fenntartani. Erre a célra általánosan használt vegyületek a növényi hormonok. A módosítást követő növényregeneráció során az egyedfejlődés indukálása a cél. A növényregeneráció lehetséges útjai a szomatikus embriógenezis, az in vitro merisztéma- és szervdifferenciálódás. A merisztémák differenciálódása a morfogenezis leggyakoribb útja. Első lépésben a kalluszokból szállítószövet elemek differenciálódnak, majd a hormonoktól függően alakul ki a szerv típusa, azaz a morfogenezis iránya. Az alkalmazott növényi hormonok koncentrációjának megfelelően hajtás vagy gyökérregeneráció következik be. A növényregenerációt az alkalmazott táptalajok, a szövettenyésztési feltételek, valamit a növény genotípusa is befolyásolja [Potrykus, 1990]. 2.4.1. A növényi transzformációs rendszerek A genom módosításának egyik lehetséges módja a genetikai transzformálás. Két klasszikus transzformációs technikát különböztetünk meg [Kohli és mtsai. 2003]. Az úgynevezett közvetlen transzformációs rendszereket, mint a mikro-injektálás [Crossway és mtsai. 1986], a polietilén-glikol közvetítette protoplaszt transzformáció [Datta és mtsai. 1992], az elektroforézis [Fromm és mtsai. 1985], illetve az egyszikűeknél gyakran használt biolisztikus módszer [Christou, 1995; Songstad és mtsai. 1995; Barcelo és Lazzeri, 1998]. A közvetett transzformációs technikák az idegen gén beviteléhez vírus, illetve bakteriális eredetű vektorokat használnak. Az elmúlt évtizedben rutinszerűvé vált közvetett génbeviteli módszer a kétszikűek transzformációjához gyakran használt Agrobacterium tumefaciens közvetítette T-DNS transzformáció [Komari és Kubo, 1999]. Az idegen gének integrációs mechanizmusa az Agrobacterium közvetítette transzformáció és a közvetlen DNS beviteli technikáknál sem teljesen ismert. Az integráció helye és a transzgén lokusz szerkezete jelentős változatosságot mutathat a független transzgénikus vonalakban, ami hatással lehet a génexpresszió szintjére és stabilitására [Park és mtsai. 1996]. 32

2.4.1.1. A biolisztikus transzformáció Az egyszikű növények esetében a DNS bevitelére leggyakrabban használt módszer a biolisztikus transzformáció vagy más néven a génbelövés (9. ábra). A ma már rutinszerűen használt transzformációs technika úttörő volt a gabonák transzformációjában [Fromm és mtsai. 1990; Vasil és mtsai. 1992]. Ezt a transzformációs módszert sikeresen alkalmazták például a szója, búza, árpa, kukorica és rizs transzformálására [Wang és mtsai. 1988; Wu, 1989; Coa és mtsai. 1991]. 9. ábra. Génbelövő készülék (Genebooster, Gödöllő)

A biolisztikus módszer transzformációs hatékonysága részben olyan fizikai paramétereken múlik, mint az aranyrészecske gyorsasága, mérete és száma, valamint a részecskékhez kötött DNS mennyisége [Sanford és mtsai. 1993]. A transzformációs hatékonyságot befolyásoló paraméter még a célszövet típusa, a táptalaj, annak ozmotikus viszonyai, vagy a táptalajon eltöltött inkubációs idő [Klein és Jones, 1999]. A biolisztikus transzformációban leggyakrabban használt célszövetek az embriogén eredetű szomatikus szövetek, mint az éretlen embriók, vagy izolált szkutellumok [Bommineni és Jauhar, 1997]. Azonos vagy különböző plazmidon kódolt gének egy időben történő bevezetésére is alkalmas a biolisztikus módszer [Vasil és mtsai. 1992]. Chen és mtsai. [1998] 13 különböző gén egyidejű transzformálását demonstrálták rizsben. A transzformációhoz használt gének többsége azonos helyre integrálódik a genomba, majd feltehetően egy egységként öröklődik a következő generációkban. Az öröklődés során fellépő szegregáció lehetővé teszi az antibiotikum/herbicid rezisztencia gének eliminációját, ami úgynevezett markermentes növényeket eredményez.

33

A biolisztikus transzformáció előnyei, hogy a transzformáció szövettenyésztési szakasza rövid, a DNS molekula elméletileg minden élő szövetbe, sejtbe bejuttatható. Néhány ilyen úton transzformált növény esetében a transzgén nagy kópiaszámát és komplex integrációját figyeltek meg [Register és mtsai. 1994]. A módszer hátránya, hogy a gyakori csoportos beépülések növelhetik a géncsendesítés és a DNS átrendeződés lehetőségét, ami nem kívánatos a transzgénikus növényekben [Pawlovski és Somers, 1998]. Több alkalommal írtak le transzgén átrendeződést biolisztikus transzformáció esetében, mint az Agrobacterium közvetítette transzformációnál [Songstag és mtsai. 1995], habár néhány tanulmány szerint a transzgén átrendeződésben, illetve a transzgén integrációs mintában nincs különbség az egyes transzformációs technikák között [Kohli és mtsai. 1999]. 2.4.1.2. Agrobacterium tumefaciens közvetítette transzformáció A gyökér golyvásodását előidéző gramm-negatív baktérium a növényeket a sebzési helyükön tumort illetve hajszál gyökeresedést indukálva fertőzi meg [Komari és Kubo, 1999]. A tumor szövetek opinokat termelnek, ami összefügg a Ti plazmid jelenlétével, melynek egy szakasza, a T-DNS átkerül a növényi sejtekbe, és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-ébe. A T-DNS-t körülvevő határszekvenciák által közrefogott bármely DNS darab hatékonyan bejut és integrálódik a növényi genomba. A kétszikűek sikeres transzformálása után csak 10 évvel [Barton és mtsai. 1983] sikerült Agrobacterium-mal fertőzött éretlen embrióból transzgénikus rizs növényt regenerálni [Chan és mtsai. 1993]. Ennek egyik oka az egyszikű gabonafélék fertőzésekor fellépő gyenge válaszreakció, ami a sikeres transzformáció elengedhetetlen feltétele. Az Agrobacterium közvetítette transzformációnak nagy előnye a többi módszerrel szemben, hogy jól meghatározott DNS fragment bejutatását teszi lehetővé, míg a közvetlen transzformációs módszerek esetében az integráció helyét nem lehet szabályozni. Az Agrobacterium közvetítette és a biolisztikus transzformációs módszerben közös, hogy azonos szövet használható a transzformációhoz [Stoger és mtsai. 1998], illetve mindkét módszer hatékonysága függ az alkalmazott növény genotípusától [Lee és mtsai. 1999b]. Az optimális transzformációs gyakoriság eléréséhez egy genotípus- specifikus transzformációs módszer kidolgozása az egyik legnagyobb kihívást jelentő feladat a kutatók számára [Koprek és mtsai. 1996; Machii és mtsai. 1998].

34

2.4.2. A transzgén expresszió szabályozása A génátírás kvalitatív és kvantitatív viszonyait meghatározó információ a DNS-spirál különböző régióiban, kódolt formában van jelen. Ezek a DNS szakaszok olyan fehérjék kötődését teszik lehetővé, amelyek pozitívan, és negatívan is befolyásolhatják a transzkripciót. Általánosságban ezeket a DNS-szakaszokat promótereknek hívjuk. A szakirodalom gyakran a strukturális géntől 5’ irányban elhelyezkedő több száz vagy több ezer bázispárnyi szakasz egészét promóternek tekinti. Szűkebb értelemben az eukarióta promóterek tipikusan két fontos elemet tartalmaznak: a TATA-boxot és a CCAAT-boxot [Shahmuradov és mtsai. 2003]. Az átírás mennyiségi és minőségi viszonyait nagymértékben befolyásoló génszakaszokat modulátor elemeknek nevezik. A pozitív hatásúak az enhancer (segítő), a negatív hatásúak a silencing (csendesítő) elemek. Ezek több száz, akár ezer bázispárnyi távolságra is lehetnek az átírás kezdőpontjától, sőt akár 3’ irányban (downstream) is előfordulhatnak, például egy intronban vagy a kódoló szakasz után. A növények transzformálásához alkalmazott promóterek lényegében két nagy csoportra oszthatók: az úgynevezett konstitutív és specifikus promóterekre. A konstitutív promóterek a növény összes szövetében aktívak, ha nem is egyenlő mennyiségben, de mindenhol termelhetik az utánuk kapcsolt RNS-t, illetve az erről átíródó fehérjét. Ezért alkalmasak például herbicid, peszticid és patogén rezisztenciát biztosító gének kifejeztetésére a transzgénikus növényben, mivel ezeknél a fejlődés során végig szükség lehet a transzgén termékére. Ezek a promóterek hatékonyan működnek a transzformálás után, a regenerációs fázisban alkalmazott szelektív ágens elleni védelem biztosítására is, ahol a rezisztenciát biztosító gén megfelelő működése a sikeresen módosított növény túlélésének feltétele [Baga és mtsai. 1999]. Ilyen, a növényeknél gyakran alkalmazott konstitutív promóterek a CaMV 35S, Act1, Ubi1 promóter és a pEmu, bár ezek gyakran eltérő módon viselkednek a különböző egyszikű és kétszikű növények esetében. A CaMV 35S a karfiolmozaik-vírusból, az Ubi1 a kukorica ubiquitin génjéből származik. A pEmu a kukorica alkohol dehidrogenáz (Adh1) promóterének 5’ végét és első intronját tartalmazza, az Act1 a rizs egyik aktin génje, promóterként egy 1,3 kb méretű 5’-flanking régiót, az 5’ nem kódoló exont, az azt követő első intront és az iniciációs kodont tartalmazó 2. exon elejét szokták használni. Növények esetében többfajta specifikus promóter ismeret. Léteznek például stressz-indukált, fény szabályozott és szövetspecifikus promóterek is [Baga és mtsai. 1999]. Ezek a promóterek általában csak bizonyos szövetben vagy szövetekben aktívak. A promóterek specifikussága irányulhat bizonyos fejlődési fázisra, környezeti behatásra is. Az ilyen promóterek 35

transzformációs munkában való használatának az előnye, hogy a transzgén nem termelődik a növény minden szövetében az összes fejlődési fázis során, ezzel energiát takarít meg a növény számára. A szövetspecifikus promóterek működéséhez szükség van arra, hogy a megfelelő helyen és időben (vagyis a célzott szövetben és a kívánt fejlettségi állapotban) jelen legyenek a velük kapcsolatba lépő, ugyancsak specifikus faktorok. Ezért nem biztos, hogy az egyik fajban jól működő specifikus promóter a másikban is hasonló aktivitási mintázatot mutat, ami némiképp korlátozza ezen promóterek felhasználhatóságát. Közeli rokon fajok esetében ez a probléma általában nem jelentkezik, így például az eddig vizsgált endospermium specifikus promóterek a Triticeae tribusz tagjai között hasonlóan működtek. Specifikus promóter egy példája a kukorica alkohol dehidrogenáz (Adh1) promóter, amelynél a génátírást anaerob stressz indukálja. Az Adh1 promóter a GUS (Escherichia coli β-glükuronidáza, uidA) riporter génhez kapcsolva, annak jelentős aktivitását eredményezte anaerob környezetben, transzgenikus rizs gyökerében, míg a többi szövetben lényegesen alacsonyabb szinten működött. 2.4.3. Transzgénikus növények szelekciója Az új tulajdonságot hordozó és kifejező transzgénikus növények létrehozása nemcsak a transzformációs eljárásnak a hatékonyságától függ, hanem a bejuttatott hasznos gének expressziós szintjétől, az in vitro szelekciótól, valamint a transzformáció követhetőségének lehetőségétől is. A transzformáció döntő lépése, hogy ki kell válogatni, és fel kell szaporítani azokat a sejteket, melyekben az idegen gén nemcsak integrálódik a nukleáris genomba, hanem expresszálódik is. A legtöbb szelekciós stratégia azon alapszik, hogy a nem transzgénikus, vad típusú sejtek osztódását szelektíven gátolják, anélkül, hogy a transzformáns sejtek növekedését gátolnák. Erre a célra konstitutív promóterhez kapcsolt valamilyen antibiotikum/drog/herbicidrezisztenciagént alkalmaznak [Uchimiya és mtsai. 1986; Zhang és Wu, 1988]. Az E.coli-ból izolált bakteriális hpt (hygromycin-foszfotranszferáz) rezisztenciát biztosító gént sikeresen használták transzgénikus rizs in vitro szelekciójára [Shimamoto és mtsai. 1989; Matsuki és mtsai. 1989; Datta és mtsai. 1990]. A regenerált növények önbeporzása után a magok hygromycin B tartalmú táptalajon kicsíráztak.

36

2.4.4. Növényi regeneráció A transzformáció után új tulajdonságokkal rendlelkező életképes növényeket a növényi regeneráció során kapunk. A 80-as évek elején számos gazdaságilag fontos egyszikű növény esetében (rizs, kukorica, búza, cukornád, árpa) írtak le sikeres növényregenerációt, azonban a regeneráció hatékonysága ekkor még alacsony volt [Vasil, 1987]. Az egyszikű növények regenerációja bonyolultabb folyamat, mint a kétszikűek esetében. Ez részben annak köszönhető, hogy hatékony regenerálás az éretlen embriók vagy sejtek csak egy korlátozott szakaszában indukálható. Éretlen embrióból preparált protoplaszt kultúrákból kerültek ki az első regenerált gabona sejtek [Vasil és Vasil, 1981], majd a regenerációs rendszerek fejlesztésével érett embrióból, sejt szuszpenzióból, kalluszból, fiatal levélből, mikrospórákból, és hajtás csúcspontokból is lehetővé vált a regeneráció [Vasil, 1987]. A regenerációra optimális szövetek nagy variabilitást mutatnak a különböző gabonafélék és gyakran az azonos fajták között is. A szövettenyésztés körülményeinek további szempontjai az alkalmazott hőmérséklet és megvilágítás intenzitása. A kallusz indukció során alkalmazott hőmérséklet befolyásolja a zöld és az albínó növények regenerációs gyakoriságát [Wang és mtsai. 1988]. Ha a hőmérséklet a normális növekedési érték fölé emelkedik, a regeneráció során kapott albínó növények száma növekszik. A szövettenyésztés során alkalmazott fényviszonyok a teljes sötétségtől a teljes megvilágításig változnak. A sötétben tartott kallusz indukciót, több órás megvilágítás követi a regeneráció során [Tamás és mtsai. 2004]. A kutatók körében már régóta ismert a szomaklonális variabilitás fogalma, mely az in vitro tenyészetett sejtekből történő regenerálódás folyamán következik be. A szomaklonális variabilitás kialakulására több hipotézis is létezik. A fenotípusosan is megjelenő genetikai változások a DNS sokszorozódásnak, a gének inaktivitásának, a traszpozícónak, illetve a szövettenyésztési idő aránytalan hosszának eredménye. 2.4.5. A rizs genetikai transzformációja Az első transzgénikus rizs elkészítése óta a rizs biotechnológiája hatalmas lépést tett előre [Tyagi és mtsai. 2000; McElroy és Brettel, 1994; Shimamoto és mtsai. 1993]. A kisméretű genomnak, a sok expresszáló gén ismert szekvenciájának köszönhetően a rizs alkalmas rendszer hasznos gének bevezetésére, illetve a növényi biotechnológia különböző alapproblémáinak megközelítésére, mint például a génszabályozás alapjainak magyarázatára [Izawa és mtsai. 1996].

37

A rizs kallusz indukciója és regenerációja szempontjából a legfontosabb faktor a donor növény genotípusa. Tíz japonica fajtából csak hat adott kalluszt az indukció során [Davoyan, 1987]. A vizsgált Oryza.rufipogon, a tertraploid Orzya.latifolia és az Oryza.sativa fajták több mint 100 genotípusa alapján elmondható, hogy a genotípus befolyásolja a kalluszok indukcióját és a morfogenézisét. A japonica rizs nagyobb mértékű kallusz növekedésre képes, mint az indica [Nam és Heszky, 1968]. 2. táblázat. Különböző génnel módosított néhány transzgénikus rizs növény GÉN TERMÉK PAT (bar) delta-endotoxin (cryIA(b) choline oxidase (codA) phytoene synthase thaumatin-like protein OPCI1 Cry1C, Cry2A, Cry9C Ltb-coe urea

FENOTÍPUS Rezisztencia a phosphinothricin ellen (Basta) rezisztencia a sárga szár -fúró ellen hideg- és só-tűrés glycinin provitamin A intermedier felhalmozódás rezisztencia a hüvely penész ellen szárazságtűrés herbicid rezisztencia Vakcinálás Helycobacter piroly rezisztencia

HIVATKOZÁS Datta és mtsai. 1992 Datta és mtsai. 1998 Sakamoto és mtsai. 1998 Burkhardt és mtsai. 1997 Momma és mtsai. 1999 Datta és mtsai. 1999 Guo és mtsai. 2007 Oszvald és mtsai. 2007 Okuzaki és mtsai. 2007

A kutatások során létrehozott transzgénikus rizs növények különböző géneket integráltak. Ilyenek voltak a herbicid vagy rovar rezisztenciát biztosító gének, a minőséget javító gének illetve a biotikus vagy abiotikus stresszt biztosító gének transzformációja, illetve a géntermékek expressziója. Néhány példát a 2. táblázat tartalmaz. 2.5. Glutén intolerancia A lisztérzékenység egész életen át tartó, a vékonybélbolyhok súlyos károsodással járó betegség, mely bármely életkorban jelentkezhet. A cöliákia mint autoimmun betegség a szervezet saját fehérjéit támadó kóros immunreakció következtében jön létre. Kialakulása örökletes. Hasi fájdalommal, hányással, hasmenéssel, haspuffadással, bőrkiütéssel és egyéb súlyos tünetekkel jár. A cöliákia betegségének molekuláris mechanizmusa és genetikája is ismert. A betegség egy olyan folyamat, ami a T sejt válasz eredményeként jön létre a hiányzó transzamináz reakció során felgyülemlett toxikus polipeptidek jelenléte miatt [Anderson és mtsai. 2000]. A szöveti transzglutamináz (tTG) a fehérjék poszt-transzlációs módosítását katalizálja kalciumfüggő 38

keresztkötéses reakciókban, melyben ellenálló izo-peptid kötéseket hoz létre. A búzában felhalmozódó gliadinok (korábban úgy gondolták, hogy csak az α-gliadinok, ma már ismeretes, hogy valamennyi gliadin fehérje toxikus) a tTG-vel kémiailag módosított peptideket hoznak létre, melyek erősen kötődnek a HLA-DQ2 molekulához, amit a bélben lévő T sejtek felismernek [Shan és mtsai. 2002; Kin és mtsai. 2004]. Az epitópok, az autoimmun reakciót kiváltó szekvenciák, amelyben a glutamin/glutaminsav reakció nem tud végbemenni, nagy számban található meg a gliadinok és az LMW glutenin alegység fehérjékben. Később kiderült, hogy a HMW GS-ben is [Molberg és mtsai. 2003]. A végső immunológiai tünet ebben az esetben csak a vérben megnövekedett IgA/IgG arány. A cöliákia kezeléséhez teljes gluténmentes diéta betartása szükséges [Gallagher és mtsai. 2004].

Az

allergének

eliminálása

biotechnológiai

módszerekkel

helyspecifikus

rekombinációval, géncsendesítéssel megvalósítható. A cöliákiás betegségtől, amely tehát toxikológiai jellegű mechanizmuson keresztül manifesztálódik, élesen elkülönítendő egy másik allergiás tünet együttessel jelentkező betegség, amelynek tipikus immunológiai jellegzetessége a cöliákiás betegeknél a vérben megemelkedett IgA és IgG-vel szemben a megnövekedett IgE szint. Az ilyen búzaallergiában szenvedők száma mintegy ötszöröse a cöliákiás betegeknek. A betegek szinte kivétel nélkül tudnak spelta (Triticum spelta) búzát fogyasztani, míg búzát, árpát, rozst nem a tünetek megjelenése nélkül. A spelt búza gyakorlatilag a kenyérbúzával azonos prolamin alléleket tartalmaz, így egyértelmű, hogy a búza-allergia nem prolamin fehérjékhez kötött betegség, ezért ez a betegpopuláció búzafehérjékkel, nevezetesen HMW GS-sel dúsított rizst minden további nélkül fogyaszthatnak.

39

3. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk célja egy olyan új modell rendszer kidolgozása és felhasználása a reológiai kutatásokban,

mellyel

búza

tartalékfehérjék

funkcionális

tulajdonságait

tudjuk

tanulmányozni nem búzaliszt alapú háttérben. Az eddig használt módszerekkel szemben ez az alapliszt a rizs, mely nem tartalmazza a búzaliszt egyik komponensét sem. Ez a kidolgozandó modell lehetővé teszi, hogy a búza tartalékfehérjék tulajdonságát, illetve a fehérjéknek a tészta szerkezetére gyakorolt hatását olyan körülmények között vizsgáljuk, melyekre korábban az endogén búzafehérjék hatása miatt nem volt lehetőség. A rizs, mint modellnövény kiválasztását a munka szempontjából az is indokolja, hogy könnyen

transzformálható,

illetve

a

búza

és

a

rizsfehérjék

poszt-transzlációs

mechanizmusa hasonló. A célkitűzés megvalósításához az alábbi konkrét célokat fogalmaztuk meg:

1. Rizsfehérjék összetételének és a rizstészta funkcionális tulajdonságainak vizsgálata, különös tekintettel a dagasztási jellemzőkre. 2. Az

rizsliszt

fehérje-összetételének

és

a

rizstészta

reológiai

paramétereinek

meghatározására alkalmas módszerek kidolgozása, illetve a búzaminősítésnél alkalmazott mikro módszerek adoptálása. 3. A

búza

tartalékfehérjék

rizs

modellben

történő

vizsgálatához

szükséges

redukciós/oxidációs módszer kidolgozása. 4. A fehérje-összetétel megváltoztatása a tartalékfehérjék in vitro adagolásával és inkorporációjával. 5. Búza tartalékfehérjék in vivo expressziója transzgénikus rizsvonalak létrehozásával. 6. Összefüggések keresése a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok között.

40

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Felhasznált anyagok A rizsminták fehérje-összetétele és funkcionális tulajdonságai közötti viszonyt tanulmányozó kísérletek valamint a funkcionális tulajdonságok in vitro módszerekkel történő módosítását célzó vizsgálatok különféle kereskedelmi forgalomban lévő rizsminták, illetve fajtaazonos minták felhasználásával történt. A felhasznált minták eredetét tekintve, magyar (Biorysa, Sandora, Janka, M-60 és Dáma) és ausztrál (Langi, Illadong, Reiziq, Brown, Klyeema és Doongara) fajtákkal dolgoztunk, amelyeket a szarvasi Halászati és Öntözési Kutatóintézet illetve a NSW Department of Agriculture Research Institue, (Wagga Wagga) bocsájtotta rendelkezésünkre. A Farinográfos adagolási kísérletekhez kereskedelmi forgalomból származó sikért, (vitális glutent) használtunk. Az addíciós és inkorporációs kísérletekben használt izolált fehérjefrakciókat a magyar Mv Suba (MTA, Mezőgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár), az egy HMW glutenin fehérje alegységeket tartalmazó, de azonos LMW összetételű nemesített Galahad6, Galahad7és Galahad8 búzafajtákból állítottuk elő. Míg az Mv Suba egy közepes sütőipari minőségű kenyérbúza, a Galahad fajták tipikus keksz-alapanyagok, amelyek gyenge tésztaerőssége és a szokásosnál nagyobb nyújthatósága abból származik, hogy csak egyetlen HMW glutenin alegységet (a névben található szám az alegység nevét jelzi) tartalmaznak. Ezen mintákat a cambridge-i PBI (Plant Breeding Institute) intézetben Prof. Peter Payne nemesítette, majd engedélyével az ausztrál CSIRO Plant Industry kutatóintézet bocsájtotta rendelkezésünkre. Az in vivo szövettenyésztésben és transzformációban az Oryza sativa L. egy koreai genotípusát, a Donkin fajtát használtuk. A transzformáció során használt, a búza genomi könyvtárból izolált 1Dx5 HMW glutenin alegységfehérje génjét professzor Peter Shewry (Rothamsted Research, Harpenden, UK) bocsájtotta rendelkezésünkre. 4.2. Bruttó beltartalmi vizsgálatok A rizsminták beltartalmi jellemzésére az AOAC szabvány módszereit alkalmaztuk. A fehérjetartalmat Duma módszerével [AOAC 1998a], a zsírtartalmat a módosított Soxhlet extrakció elvei szerint [AOAC 1998b], a hamutartalmat gravimetriásan, a nedvességtartalmat tömegvisszaméréssel [AOAC 1998c,d] határoztuk meg.

41

4.3. Búza tartalékfehérjék izolálása 4.3.1. HMW és LMW glutenin alegységfrakciók izolálása A búza tartalékfehérje HMW és LMW alegységeket 3 gramm Mv Suba lisztből, illetve az egyedi HMW és LMW alegységeket 3-3 g Galahad6, Galahad7 és Galahad8 lisztből kiindulva Verbuggen és mtsai. módszere [1998] szerint állítottuk elő. Első lépésben 50 (v/v)%- n- propanollal 30 percig 3x ismételve rázattuk. Az extraktumot 15 percig 2500g-n centrifugáltuk. A keletkezett csapadékot 50 (v/v)% n-propanol és 1% DTT oldatban oldottuk, majd 30 percig 60°C-on inkubáltuk. Az inkubálás után az oldatot 30 percig centrifugáltuk (10000g). A kapott felülúszó alkoholtartalmát n-propanollal 60%-ra állítottuk, majd 1% DTT jelenlétében 1 órán keresztül 4°C-on tartottuk. Ezután az oldatot ismét centrifugáltuk (30 perc, 10000g). Az így kapott csapadék tartalmazta az Mv Suba búzaliszt HMW alegységeit, illetve a Galahad fajták egyéni HMW alegységét. A centrifugálás után kapott felülúszó alkoholtartalmát n-propanollal 85%-ra állítottuk be, majd 1 órán keresztül 4°C-on tartottuk. Ezután a fent leírtaknak megfelelően jártunk el. A centrifugálás után kapott csapadék tartalmazta a búzalisztek LMW glutenin alegységben gazdag fehérjefrakcióját. Az izolált HMW fehérjefrakciót 2x 500 µl 60 (v/v)% n-propanollal, míg az LMW fehérjefrakciót 2x500 µl 85 (v/v)% propanollal mostuk. Mindkét fehérjefrakciót a további kísérletekhez fagyasztva szárítottuk. Az izolált frakciók fehérjetartalmát Duma módszerrel, összetételét SDS gélelektroforézissel ellenőriztük. 4.4. Rizsminták fehérje összetételének vizsgálata 4.4.1. Mintaelőkészítés, fehérje extrakció A rizslisztek fehérjéinek kinyerésére Furukawa és mtsai. [2003] módszerét alkalmaztuk. A vizsgálatokhoz használt rizslisztek fehérjéit 50 mg lisztből 1,5 mL 2% SDS –t (nátriumdodecyl szulfát) tartalmazó Trisz-HCL pufferrel (pH=8.0) 30 percig 60°C-os vízfürdőn extraháltuk. Ezután a szuszpenziót centrifugáltuk (30 perc, 10000g). A további kísérletekben felülúszót használtuk (4.4.2. alfejezet). A rizsliszt fehérjefrakcióinak izolálására alkalmas körülményeket teremtve, azaz a diszulfidkötések (merkaptoetanol), illetve a másodlagos kötések (SDS) megbontásával a rizsfehérje alegységek jellemzésére alkalmas preparátumokat is előállítottuk. Ez esetben az extrakció során használt extrahálószerhez 5% 2-ME-t adtunk, majd a továbbiakban a fent leírt módon jártunk el. 42

4.4.1.1. Fehérje izolálás transzgénikus magból A regenerált rizsnövények magjait, a mag embrió részét leválasztva, egy dörzsmozsárban porrá törtük. Az alkoholban oldható fehérjealegységek kinyerése során a mintákhoz 160 µl 55 (v/v)% i-propanolt, 1M Tris-HCL –t (pH 8,0) és 10mM DTT-t tartalmazó puffert adtunk, majd 30 percig 65 °C-os vízfürdőben inkubáltuk. Az inkubáció után minden mintához 160 µl puffert és 40 mM IAA-ot adtunk. A mintákat 20 percig ismét 65 °C-os vízfürdőben tartottuk, majd az oldatot centrifugáltuk (30 perc, 120000g). A felülúszóban lévő fehérjéket tiszta Eppendorf csőben jéghideg acetonnal 1:4 arányban kicsaptuk. Az oldatot -20 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd 4 °C-on centrifugáltuk (10000g. 15 perc). A felülúszót elöntöttük, a csapadékot SDS minta pufferben oldottuk. 4.4.2. Gélelektroforézis A fehérjefrakciók molekulaméret szerinti szétválasztását poliakrilamid gélen, SDS jelenlétében végeztük. A 4.4.1 alfejezetben leírtak szerint készített rizsfehérje minták molekulaméret szerinti jellemzése Laemmli [1970] SDS-PAGE módszerével történt. A fehérjeminták koncentrációját UV-spektrofotométerrel megmértük, majd azonos (10mg/ml) koncentrációjú oldatokat készítettünk. A mintákat 30µl SDS minta pufferben 4-5 percig 950Cos vízfürdőn tartottuk, majd centrifugáltuk (4400 rpm, 3perc). Az előkészített mintákat 1 mm vastagságú 12% akrilamid tartalmú szeparáló gélre a molekulasúly standardból (Fermentas 20-100 kDa) 5µl-t, a fehérjeizolátumokból 7-10µl-t vittünk fel. Az elektroforézis két géles rendszer esetében a gyűjtő gélben 40mA, a szeparáló gélben 60mA állandó áramerősséggel folyt. A géleket egy éjszakán keresztül CBB -G-t tartalmazó festő-fixáló oldatban festettük, majd a fehérjesávok megjelenéséig ecetsavas oldattal mostuk. A gélelektroforézises képek elemzése Phoretix 1D Advanced, Version 4,01 (East Post Scientific LTD) sofware segítségével történt. 4.4.3. Méretkizárásos –HPLC (SE-HPLC) A rizsfehérjék molekulaméret eloszlásának vizsgálatára az addigi irodalmi ismeretek alapján a Singh és mtsai. [1990] búzafehérjékre kidolgozott SE-HPLC módszert alkalmaztuk. A HPLC analízishez a rizsliszt- illetve tészta- mintákból háromféle kinyerést végeztünk. A kétlépéses extrakció során először 10 mg liszthez 1 ml pH 6.9-es foszfát-puffert adtunk, majd

43

az oldatot 30 percig rázattuk, végül centrifugáltuk (10 perc, 12000g). A felülúszót 45 µm átmérőjű szűrőn szűrtük. Az így kinyert fehérje oldatot ’oldható’ frakciónak neveztük el. A centrifugálás után visszamaradt csapadékot 1 ml pufferben 30 másodpercig 50%-os amplitúdóval, szobahőmérsékleten szonikáltuk, majd a fehérjeoldatot centrifugáltuk (10 perc, 12000g) és szűrtük. Ezt a fehérjeoldatot ’oldhatatlan’ frakcióknak hívtuk. A teljes fehérjét egy lépésben, 10 mg mintából 1 ml pufferrel 50%os amplitúdóval 45 másodpercig tartó szonikálssal nyertük ki, melyet a fent leírtak szerint centrifugálás, és szűrés követett. Az így kinyert fehérjéket Alliance, Waters 2695 típusú HPLC készüléken méretkizárásos HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S4000, 300 x 7, 80 mm, 5 micron clone) oszlopon elválasztottuk. A mintákat acetonitril, desztillált víz és TFA (50:50:01) keverékében eluáltuk. Az analízis ideje 10 perc volt. A méréseket három párhuzamossal hajtottuk végre. A kapott kromatogramok értékelése a műszer EZChrom Elite szoftvere segítségével történt. 3.5. Rizslisztekből készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata A rizslisztből készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálatára a Brabender Farinográf 50g-os változatát használtuk. (Brabender, ICC). 40 gramm rizsliszt és esetlegesen más adalékok előzetes keverése után egy osztott bürettából az optimális konzisztencia eléréséhez (500 F.U.) szükséges vizet adagoltuk. A vízabszorpció meghatározása után felvettük a lisztek standard görbéjét. A görbe regisztrálása 30 percen keresztül történt. A mért reológiai paramétereket szoftver (Brabander Farinograph® Software) segítségével határoztuk meg. A limitált mennyiségben rendelkezésünkre álló fehérje preparátumok esetében a funkcionális kísérleteket, és a kontroll vizsgálatokat egy magyar-ausztrál kooperációban kidolgozott és gyártott mikro-Valorigráf (továbbiakban mikro-z-arm mixer) prototípusán végeztük [Haraszi és mtsai. 2004; Tömösközi és mtsai. 2000b]. A mérésekhez használt liszt állandó mennyisége 4 g volt. A vízfelvétel meghatározása egy bevezető mérés formájában történt. A mikro z-arm mixer által szolgáltatott jelek regisztrálása az Scom, a dagasztási jellemzők meghatározása az IZARM program (CSIRO, Ausztrália) segítségével történt. A mérést valamennyi minta esetében állandó fordulatszámon (88-89 rpm) végeztük. A dagasztási görbe regisztrálása 30 percig három párhuzamos méréssel történt. A regisztrált görbék alapján a dagasztási paramétereket az említett szoftverek segítségével határoztuk meg.

44

4.6. Fehérje összetétel változtatása in vitro módszerekkel 4.6.1. Fehérje frakciók in vitro addíciója rizslisztbe 4.6.1.1. Sikérrel dúsított rizsliszt vizsgálata A rizsliszthez adott sikérfehérjék hatását Farinográfon vizsgáltuk. Az alaplisztekhez a fehérjetartalom 10, 20 és 30%-ának megfelelő mennyiségű sikért kevertünk úgy, hogy a lisztfehérje rendszer teljes tömege 40g legyen. A liszt-sikér keveréket előzetesen 3 percig homogenizáltuk, majd valamennyi mérés esetében az adott alaplisztnél megállapított optimális vízfelvételnek megfelelő vizet adagoltuk. Minden mérést háromszor, 30 percig végeztünk. A regisztrált görbe paramétereit Brabender® Farinograph szoftver segítségével értékeltük. 4.6.1.2. Búza HMW és LMW-GS fehérjék addíciója A fehérjefrakciókkal kevert kínai típusú rizsliszt funkcionális tulajdonságait mikro-z-arm mixer-rel mértük. Az Mv-SUBA HMW-GS és LMW-GS gazdag, illetve az egyes HMW (G6, G7, G8) fehérje alegységfrakciókat úgy kevertük az alapliszthez, hogy összes tömege 4 g volt. A lisztet és a fehérje komponenseket előzetesen a mixer csészéjében 3 percig homogenizáltuk, majd 30 másodpercig tartó keverés után a megfelelő mennyiségű vizet hozzáadtuk, a görbét regisztráltuk. Minden mintát háromszor 30 percig dagasztottunk, a görbéket az Izarm szoftverrel értékeltük. Az addíció és az inkorporáció során kapott eredmények érdemi összehasonlításához az addíció során is az inkorporációra kidolgozott módszert (lásd 4.6.2 alfejezet) alkalmaztuk. 3.6.2. Fehérjék redukciója és re-oxidációja A rizsliszt fehérjéire alkalmazott redukciós-oxidációs módszer egy módszerfejlesztés eredménye. Az előzetesen a Békés és mtsai. [1994] kidolgozott módszer búzalisztfehérjék vizsgálatára volt alkalmas. A mikro z-arm mixer csészéjébe 4 g lisztet mértünk. A lisztfehérje rendszerhez 1 ml 2 mg/ml DTT oldatot és 1,85 ml desztillált vizet adagoltunk egy időben. A tésztát a vízzel és a redukálószerrel 30 másodpercig kevertettük, majd 4 percig a keverőlapátok leállításával pihentettük. Ezután a tésztát 250 µl 5 mg/ml-es kálium-jodát (KIO3) oxidálószert tartalmazó oldattal 30 másodpercig dagasztottuk, majd 6 percig ismét pihentettük. A pihentetés után a tésztát a 30 perces teljes mérési idő eléréséig dagasztottuk. A mérést három párhuzamossal végeztük.

45

4.6.2.1. Inkorporáció A búza tartalékfehérjék inkorporációját rizslisztbe a kidolgozott redukciós-oxidációs módszer felhasználásával végeztük el. Az alapliszthez HMW-GS gazdag, LMW-GS gazdag és az egyes HMW (G6, G7 és G8) glutenin alegység fehérjefrakciókat kevertünk a 4.6.1.2 fejezetnek megfelelően. A dagasztás során a tésztához 1 ml 2 mg/ml DTT oldatot illetve a hozzáadott fehérjetartalomtól függően módosított mennyiségű vizet adtunk. A továbbiakban 4.6.2. fejezet alapján jártunk el. 4.7. Fehérje összetétel megváltoztatása in vivo módszerekkel 4.7.1. A rizs genetikai transzformációja A transzformációhoz használt rizsnövényből érett magokat steril lombikban, 70%-os etanollal, majd 50%-os háztartási hipóval 20 percig sterilizáltunk. A rázatás után a rizsszemeket, steril desztillált vízben 5-6 alkalommal mostuk. A sterilizálás után a magokat steril körülmények között N6 kallusz indukáló táptalajra helyeztük [Chu és mtsai. 1975]. Az embriókat 7-9 napig 25 °C-on gyengébb megvilágítás mellett (10-30 µE-2s-1) tartottuk [Lin és Zhang, 2005]. A transzformációt megelőző napon, a kifejlődött kalluszokat az endospermiumról leválasztottuk, majd sötétben N6CO táptalajon inkubáltuk. A kalluszokat 24 órán belül biolisztikus módszerrel transzformáltuk A biolisztikus transzformációhoz a hazai fejlesztésű, szabadalmaztatott GENEBOOSTERTM–t használtuk (ELAK Bt, Budapest, MBK, Gödöllő). A 50 mg 0,6 µm átmérőjű aranyszemcséket előzetesen 1 ml abszolút etanolban 3 percig intenzíven rázattuk majd centrifugáltuk (5 perc, 10000g). Az alkoholt elöntöttük, az aranyszemcséket desztillált vízben 3x mostuk, majd 50% glicerin oldatba keverve tároltuk. A transzformációhoz 1 µg/µl DNS molekulákat 0,1 mM-os frissen preparált spermicid és 2,5 M-os CaCl2 oldat segítségével 50 mg/ml-es koncentrációjú aranyrészecskékhez kötöttük. Az így elkészített aranyszemcsékkel minden célszövetre, 1100 psi nyomással, vákuum alatt a fékező rácstól 9 cm távolságra két lövést adtunk le. A transzformációhoz használt expresszós vektor tartalmazta a HMW 1Dx5 glutenin alegységet kódoló gént és a htp hygromycin rezisztenciát biztosító szelekciós gént. A 8,2 kb nagyságú Dx5 fehérjét kódoló gént EcoRI restrikciós endonukleázokkal hasítottuk, majd a pCAMBIA-1300 vektorba ligáltuk. A plazmidot E. coli baktériumban nagy mennyiségben felszaporítottuk, majd Qiagen plasmid DNS izoláló kit segítségével kinyertük. A

46

transzformációs vektorban a HMW 1Dx5 fehérjét kódoló gén a saját endospermium specifikus promóterét, a htp gént a CaMV35S promóter után kapcsolva, valamint a nos terminátor régiót tartalmazta (10. ábra). 10. ábra. Transzformációhoz használt expressziós vektor sematikus rajza

A transzformáció után a kalluszokat négy-öt napig sötétben tartottuk, majd az integrálódott gént tartalmazó kalluszok kiválasztására hygromycin tartalmú N6SEh táptalajra helyeztük. A kalluszokat szelekciós táptalajon 3-4 hétig erőteljesebb megvilágítás mellett (45-55 µE-2s-1) 25 °C-on tartottuk. Rendszerint a harmadik/negyedik héten a kalluszok felületén megjelenő kallusz kezdeményeket leválasztottuk és friss szelekciós táptalajon egy-két hétig növesztettük. A következő lépésben a szelektált kalluszokból hajtás- és gyökér regenerációt indukáltunk. A kalluszokat MS (Murashige és Skoog, 1962) 2 mg/l BAP és 1 mg/l NAA hormont tartalmazó regeneráló táptalajra helyeztünk A hajtással rendelkező növényeket MS hormonmentes táptalajon gyökereztettük. A teljesen regenerálódott rizsnövények üvegházban nevelkedtek. A szövettenyésztési kísérletek során alkalmazott táptalajok összetételét a Függelék F1. táblázat tartalmazza. 4.8. A transzgén integrálódás és expresszó bizonyítása 4.8.1. DNS vizsgálatok 4.8.1.1. PCR reakció A bejuttatott gének integrációjának bizonyítására első lépéseként a feltételezetten transzgénikus növények leveleiből DNS-t izoláltunk. AGS (Aqua Genomic Solution, product No.: 1011, Lot: 03052006 ) kit felhasználásával 25 mg levélmintát folyékony nitrogénben kvarchomokkal dörzsöltünk. Az elroncsolt levél szövetet 250 µl AGS oldatban homogenizáltuk. Az oldathoz majd 30 µl i-propanolt adtunk, majd 60oC-on 15 percig rázattuk, végül centrifugáltuk (4 perc, 12000 g). A DNS-t a felülúszóból azonos térfogatúi i-propanollal kicsaptuk, majd az oldatot centrifugáltuk (2 perc, 12000g). A csapadékot 1 ml 70%-os etanollal háromszor mostuk, majd ismét centrifugáltuk (12000g). A DNS molekulákat 37oCos termosztátban szárítottuk, majd 50 µl 10 mM Trisz –ben (pH 8.0) 37oC-on oldatba vittük. A DNS oldatok koncentrációját 260 nm-en UV spektrofotométerrel határoztuk meg. 47

A transzformált gének beépülését PCR reakcióval bizonyítottuk. A PCR reakciókhoz a BioRad iCycler Thermal Cycler típusú készülékét használtuk. A reakciót 10 µl végtérfogatban 20 mg DNS-sel, 1 µl PCR pufferrel (Dynezyme), 2 x 1µl primerrel, 0,2 µl dNTP-vel, 0,2 µl, enzimmel (Dynezyme) és 5,6 µl MilliQ-val végeztük. 3. táblázat. PCR reakcióban használt primerek szekvenciája RIZS PROLAMIN PRIMEREK Rp6F Rp6R BÚZA GLU1 DX5 PRIMEREK Prim51 Prim52

5’-GCC TAG CAA CCT TCA CAATC-3’ 5’-GAA ACC TGC TGC GGA CAAG-3’

SZELEKCIÓS HTP PRIMEREK htp-F htp-R

5’-CAGAAGAAGATGTTGGCGAC-3’ 5’-TTATCGGCACTTTGCATCGG-3’

5’-CATCGGCTTAGGTGTAG-3’ 5’-ATTGTTGTTGGATTCTACTAC-3’

Az izolált növényi DNS-re három különböző reakciót végeztünk. A rizs saját prolamin génjének, a HMW Dx5 fehérje gén és a htp szelekciós gén sokszorozásához a génre specifikus primereket használtunk [D’Ovidio és mtsai. 1995] (3. táblázat). A reakciók során alkalmazott körülményeket a 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat. PCR reakció körülményei GÉN

PRIMER

Rp6FRp6R Rizs prolamin Búza Glu1 prim51-52 1Dx5 Szelekciós HtpF-HtpR Htp

KAPCSOLÁSI HŐM.

KAPCSOLÁSI IDŐ

ELONGÁCIÓS HŐM.

ELONGÁCIÓS

o

IDŐ

o

55 C

20 sec

72 C

30 sec

58 oC

25 sec

72oC

30 sec

55 oC

20 sec

72oC

30 sec

A PCR reakció után a termékeket 1,5 %-os agaróz gélen futattuk, majd a DNS termékeket etidium-bromiddal megfestve UV fényben analizáltuk. 4.8.1.2. RT-PCR reakció A rizs magban expresszálódó mRNS vizsgálatára RT-PCR reakciót végeztünk. A magok endospermiumából Li és Trick [2005] szerint teljes RNS-t izoláltunk, majd az RNS molekulákat az izolálás során fellépő DNS szennyeződések lebontására DNaseI enzimmel kezeltük. A reakció elegyet (50 µg RNS-hez, 1 µl 10xDNase puffer, 1 µl RNase inhibitor, 1

48

egység/µl enzim), 37 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd az RNS molekulákat az oldatból 3M nátrium

acetát

hozzáadása

után

fenol:kloroform:izoamilalkohol

(25:24:1)

elegyben

visszanyertük. Az RNS molekulákat az oldatból i-propanollal 30 percig -20°C-on tárolva kicsaptuk, majd centrifugáltuk (30 min, 4 °C, 12 000 g). A csapadékot Rnase - mentes vízben oldottuk. Az 1-2 µg DNase-zal kezelt RNS molekulából cDNA syntesis kit (Fermentas) segítségével cDNS-t szintetizáltunk. Első lépésben a RNS molekulákat 10 percig 65°C-on denaturáltuk, majd a reakcióelegyet (RNase inhibitor, RT puffer, dNTP, DTT, AmV RT enzim) 42°C-on 1 óráig inkubáltuk. Az enzim működését 5 perces forralással inaktiváltuk. Az így kapott cDNS molekulával a transzgénre specifikus primerekkel PCR reakciót végeztünk. A reakció termékeket agaróz gélen analizáltuk. 4.8.2. Fehérjevizsgálati módszerek 4.8.2.1. Western blot analízis A fehérje expresszió bizonyítása egy speciális antigén-antitest reakción alapuló western blot analízissel történt. Első lépésben a transzgénikus növények endospermiumából kinyert fehérjéket a 4.4.2 alfejezetnek megfelelően SDS-PAGE –vel elválasztottuk, majd a fehérjéket egy nitrocellulóz (PVDF) membránra transzferáltuk. A szűrőpapírok között elhelyezett membránt és az akrilamid gélt tartalmazó „szendvicsben” a fehérjéket BioRAD Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell készülékben 130 mA állandó áramerősségen 15 percig „Towbeen” puffer segítségével transzferáltuk. A fehérjéket a transzfer után egy éjszakán keresztül 10% zsírmentes tejport tartalmazó TBST oldatban blokkoltuk. Ezután a membránt 3x 15 percig TBST oldatban mostuk, majd az első, HMW fehérjékre specifikus antitestet 1:200 hígításban tartalmazó TBST oldatban 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a membránt 3x 15 percig mostuk, majd TBST oldatban 1:7000 arányban hígított másodlagos (nyúl) antitesttel egy óráig kezeltük Majd a membránt 3x mostuk, a transzferált antigén specifikus fehérjék megjelenítéséhez 10 ml TMN oldatban oldott 132 µl NBP és 100 µl BCPI szubsztráttal és enzimmel kezeltünk. A színesen megjelenő sávokat analizáltuk.

49

4.9. Statisztikai elemzések A mérési eredmények értékelését különböző statisztikai módszerekkel (korrelációs számítások, variancia analízis), a STATISTICA version 7.0 software (Statsoft Inc., USA) segítségével végeztük el.

50

5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 5. 1. Az alapanyagok és fehérje frakciók kémiai jellemzése A vizsgált kereskedelmi forgalomból származó, illetve fajtaazonos rizsminták beltartalmi összetételüket tekintve hasonlónak mutatkoztak (Függelék F2. táblázat). Szignifikáns különbséget egyedül a lisztek fehérjetartalma között tapasztaltunk. A magyar nemesített fajták fehérjetartalma 4,7-5,6 %, míg az ausztrál fajtáké 6,1-7,7 % között változott. A kereskedelmi forgalomból származó lisztek az ausztrál fajták fehérjetartalmához álltak közelebb. A rizs fizikai tulajdonságait jelző szemméret, illetve a főzési tulajdonságokat meghatározó keményítő- pontosabban az amilóztartalom különböző volt az egyes fajtáknál. Az ausztrál fajták

alacsonyabb

(17-20%),

míg

a

magyar

fajták

inkább

közepes

(24-25%)

amilóztartalommal rendelkeznek. 5.2. A rizslisztből készült tészta dagasztási vizsgálatai 5.2.1. A rizslisztek farinográfos vizsgálata A rizslisztből készült tészták funkcionális vizsgálatára a búzalisztnél hagyományosan is használt Farinográfos módszert alkalmaztuk, hogy tanulmányozzuk, van-e különbség az egyes rizstészták reológiai jellemzőiben. A kereskedelmi forgalomban kapható liszteken (A-D minták) a Brabender Farinograph-E típusú készülékkel elvégzett vizsgálatok során kapott farinogramok lefutásában jelentős eltérést tapasztaltunk (Függelék F1. ábra). Az egyes dagasztási paraméterek értékeit az 5. táblázat tartalmazza. 5. táblázat. A rizslisztek Farinográf vizsgálatának reológiai paraméterei MINTA A B C D

PR (F.U.) 501 554 508 530

DDT (SEC) 782 730 122 532

A mért dagasztási idők átlaga 122 és 782 sec között változott. A dagasztással szembeni ellenállás értékei (PR) valamennyi minta esetében 500FU értékhez közeli volt (501-554 FU). Az A és B minta esetében a hosszú hidratációs folyamat után egy meglehetősen stabil tészta alakult ki, ahol az ellágyulást nem lehetett érzékelni. Ezzel szemben a C-D minták tésztáin mért dagasztási idő rövidebb volt, és a tészták ellágyulása is számottevő értékű. A C minta a

51

többitől eltérően nagyon gyorsan kialakult, majd ellágyult, állagát tekintve nagyon ragadós volt. Az előzetesen meghatározott optimális vízfelvétel következtében a dagasztási ellenállás értékei standard búzának megfelelő értékek között változtak. Az irodalmi adatok szerint a búza esetében a 210 sec feletti dagasztási idő erős, 330 sec felett pedig nagyon erős tesztára utal [Finney és Shogren, 1972]. Ezt figyelembe véve a C minta kivételével valamennyi mintánk erős tésztatulajdonsággal rendelkezett. A rizstésztákra megfigyelt

hosszabb

hidratációs

folyamat

megegyezik

a

rizstészták

farinográfos

vizsgálatainak korábban leírt eredményeivel. A rizstészták Farinográffal végzett vizsgálatai nem minden esetben adtak elegendő információt azokreológiai tulajdonságairól. A búzatésztákra jellemző stabilitás és ellágyulás mértéke az A és B minták esetében például nem volt meghatározható. Ez összhangban van azokkal az irodalmi adatoknak, ahol adalékanyag nélkül a búzánál értelmezett dagasztási idő sem volt értelmezhető [Sivaramakrishnan és mtsai. 2004]. A limitáló tényezők ellenére a kísérletek bizonyították, hagy a rizslisztek Farinográfos dagasztási kísérlete alkalmas lehet a rizs bizonyos funkcionális tulajdonságainak, illetve a rizslisztek közötti különbségek meghatározására. A továbbiakban azt a kérdést vizsgáltuk, hogy a rizs fehérjéknek milyen szerepe lehet a rizstészta reológiai tulajdonságainak kialakításában. 5.2.1.1. Búza sikér adagolásának hatása a rizslisztből készült tészta dagasztási jellemzőire A rizsfehérjéknek a tészta reológiai viselkedésében betöltött szerepét a búzára kidolgozott fehérje addíciós módszerrel vizsgáltuk [Uthayakumaran és mtsai. 2000]. Különböző mennyiségű kereskedelmi forgalomból származó búzasikért (vitális gluten) in vitro adagolása után Farinográffal végzett kísérletben követtük a rizstészták funkcionális tulajdonságaiban bekövetkező változásokat. Az A-D mintákhoz a sikért a dagasztás előtt a száraz rizsliszthez adagolva a fehérjetartalmat 5 és 10 %-kal növeltük. Ezekben a kísérletekben a liszthez adagolt vízmennyiség- a fehérjetartalomtól függetlenül- állandó volt. A sikér adagolása megváltoztatta a minták dagasztási paramétereit. A dagasztással szembeni ellenállás, a mért dagasztási idők értékei az adagolt fehérjemennyiség függvényében csökkenő tendenciát mutattak (11. ábra). A rizslisztnél tapasztalt eredmények a búzaliszttel kapcsolatos irodalmi adatokkal szoros összefüggést mutattak. Az addíciós kísérletek eredményei alapján 52

azt a következtetést vonhatjuk le, hogy Farinográf alkalmas módszer lehet a rizsliszt néhány funkcionális

tulajdonságainak

meghatározására,

illetve

a

fehérjék

a

dagasztási

tulajdonságokban betöltött szerepének vizsgálatára. 11. ábra. Rizslisztek addíciós vizsgálata Farinográfon két rizsmintára (B és C)

5.2.2. A Mikro-valorigráfos méréstechnika alkalmazása rizslisztre A Farinográffal kapott kedvező tapasztalatok után a rizslisztek reológiai tulajdonságainak részletesebb megismeréséhez, a lisztek összehasonlításához, valamint a rizs genetikai transzformációja során kapott szemtermés limitált mennyisége miatt a búzaliszt minősítés hagyományos mikro-módszerei közül a Farinográffal analóg elvű mikro z-arm mixert használtuk. A rizslisztek dagasztási görbéjét egy standard búzatészta görbéjéhez viszonyítva a farinográfos kísérletekben is tapasztalt hosszú hidratációs folyamat jellemzi. Amint az irodalmi adatokból ismert búzaliszt esetében, ez a görbe korai szakaszánál tapasztalt nagyobb mértékű „zaj” formájában mutatkozik, Ennek a különböző szintű hidratációs hátterű „zaj” miatt egy ún. „hidratációs” (Hyd) paramétert vezettünk be, amely tehát a tészta-kialakulás előtt a hidratációhoz szükséges időt jelenti. A vizsgált fajták dagasztási paramétereit a 6. táblázat foglalja össze. A mért dagasztási idők széles intervallumban változtak (463-1086 sec). A fajták több mint 25%-nál a mért DDT értékek meghaladták a 1000 sec-t, és mindösszesen 2 fajta volt jellemezhető 700s alatti dagasztási idővel. A dagasztással szembeni ellenállás értékei (PR) 339 és 633 között nagy variabilitást mutattak.

53

6. táblázat. A különböző rizslisztek reológiai paraméterei BIORYZA-6 M-60 DAMA JANKA SANDORA BROWN KYEEMA LANGI DOONGARA REIZIQ ILLADONG

DDT (SEC) 1026 699 1077 893 881 846 753 789 862 1086 463

PR (A.U) 455 339 383 420 466 525 587 502 633 496 587

HYD (SEC) 520 405 330 200 220 402 530 365 250 250 245

A lisztek hidratációs ideje 200 sec és 530 sec között változott. A hidratációhoz szükséges idő a minták 45%-ban 250 sec vagy ennél kisebb érték volt. A vizsgált fajták alapján a magyar nemesített fajták hosszabb hidratációs idővel, alacsonyabb PR értékkel, és hosszabb dagasztási idővel rendelkeztek, mint az ausztrál fajták. A magyar rizslisztek viselkedése a dagasztás folyamán hasonló az irodalomban is leírt rizslisztekkel. Az ausztrál rizsfajták esetében a DDT illetve a HYD értékek átlagosan alacsonyabbak voltak, míg a dagasztással szembeni ellenállás értéke nagyobb volt. Ezen lisztek dagasztása során felvett görbéi jellegükben hasonítottak a búzaliszt dagasztási görbéjéhez. Az eredmények alapján megállapítottuk, hogy a mikro z-arm mixer alkalmas a különböző rizsfajtáknak a reológiai tulajdonságuk alapján történő csoportosításra. A rizslisztek dagasztási görbéiben megjelenő különbségekből a fehérjék összetételére, a reológiai tulajdonságok meghatározásában játszott szerepére nem volt lehetőség közvetlen tapasztalatot szerezni. A farinográfos addíciós kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a fehérjéknek fontos szerepe van a rizstészta funkcionális tulajdonágainak kialakításában. Ennek igazolására a rizsliszt fehérjék részletes jellemzésére szükség volt.

54

5.3. A rizsliszt fehérjék összetételének jellemzése 5.3.1. SDS-PAGE A rizsfehérjék összetételét, és a fehérje alegységek eloszlását redukálószer (2-ME) nélkül, illetve redukálószer jelenlétében vizsgáltuk. A lisztek fehérje-összetételét mutatja be a 12. ábra. 12. ábra. A rizsliszt fehérjék SDS –PAGE képe. (A) redukálószer (β-ME) nélkül (B) redukálószer jelenlétében

A

B

119kDa 79kDa

119kDa

47kDa 79kDa

37-39 kDa glutelin

33kDa

47kDa

22-23 kDa glutelin

24kDa

prolamin

33kDa

M 1 2

3 4

5 6 7

8

9 10 11

M 1 2

3 4

5 6 7

8

9 10 11

M: molekulasúly standard, 1-11 rizslisztek: Biorysa”, “Dama”, “Janka”, “M-60”, “Sandora”, “Dongara”, “Illadong”, “Brown”, “Langi”, “Klyeema”, és “Reiziq”. A rizs polimer fehérjéi, a polimerizálódni képes globulin fehérjékből felépülő glutelinek 47 kDa-nál nagyobb molekulatömegűek. Az 12/A ábra felső és középső nyila a 120 kDa-t is meghaladó glutelin polimereket, a legalsó nyíl a globulin oligomereket jelenti. A redukálószer nélkül extrahált fehérjék közül a 47 kDa –nál nagyobb molekulaméretű rizsfehérjék a legtöbb esetben eltűnnek a redukálószer (β-ME) hozzáadása után. A fehérjék redukciója után a 47 kDa-nál kisebb molekulaméretű fehérjék jelzik, hogy ezek a rizsfehérje polipeptidek eredetileg diszulfid hidakkal stabilizált polimer formában vannak jelen a lisztben. Az 5/B ábrán feltüntetett nyilak közül a legalsó a legkisebb molekulatömeggel (13-16 kDa) rendelkező prolaminokat, az azt követő a 22-23 kDa nagyságú glutelin alegységeket jelzi, a legfelső nyíl a 37-39 kDa nagyságú, ugyancsak glutelin alegységeket mutatja. A fehérjék 5. ábrán bemutatott SDS-PAGE eredményei megegyeznek a Furukawa és mtsai.[2003] által, a rizs endospermium fehérjéinek összetételéről írott eredményekkel. Az SDS-PAGE vizsgálatok során az egyes lisztfajták nem mutattak szignifikáns különbséget a fehérjealegység összetételben, illetve eloszlásban. Az esetleges különbségeket ezért más

55

módszerrel kíséreltük meg jellemezni. A fehérjék molekulaméret szerinti eloszlását, a polimer/monomer fehérje arányát hasonlítottuk össze a különböző mintákban. 5.3.2. Tartalékfehérjék SE-HPLC vizsgálata A fajtaazonos rizslisztekben SE-HPLC-vel vizsgáltuk az összfehérje extraktum relatív glutelin, globulin, prolamin és albumin tartalmát. A kísérletek kezdetén a szakirodalomban a rizslisztek ilyen jellemzéséről nem volt adat. A munka során jelent meg Van der Borgh és mtsai.-nak [2006] publikációja, amelynek célkitűzései és az elévégzett kísérletek metodikai megoldásai átfedésben voltak az általunk végzett kísérletekkel. A megjelent irodalom segítségünkre volt az eredmények értékelésében. A fehérje extraktumok „oldható”, illetve - egy szonikálási lépést követően nyert „oldhatatlan” frakcióinak kromatogramján megjelenő négy csúcsot a 13/A-B ábra mutatja be. Az első három frakció retenciós ideje: 2,8, 3,3 és 3,9 perc. Feltételezéseink szerint, amit a később megjelent Van der Borght és mtsai. [2006] publikáció megerősített, ezen frakciók az α és β glutelin alegység-fehérjék különböző mértékben oligomerizálódott termékei, vagyis trimer- dimer- és monomer fehérjék, amelyekben a 151 kDa, illetve 105 kDa molekulasúlyú monomerek intermolekuláris diszulfidhidak révén kapcsolódnak össze. Az utolsó (negyedik) frakció 5,2 perces elúciós idővel kisebb polipeptidek, albuminok, monomer globulinok és prolaminok keveréke. 13. ábra. Rizslisztek SE-HPLC kromatogramja: (A) „oldható” és (B) „oldhatatlan” frakciók (C) az SE-HPLC frakciók redukált/alkilált fehérjéinek SDS-PAGE elektroforézissel

I frakció: -α-β glutelin trimer, II frakció: -α-β glutelin dimer, III frakció: -α-β glutelin monomer –IV frakció: monomerek T: teljes fehérje, M: molekulastandard 56

A fentiek bizonyítására az egyes SE-HPLC frakciók preparatív elválasztását követően elektroforetikus kísérleteket végeztünk Oscar Larroque (CSIRO Plant Indsutry, Ausztrália) közreműködésével (13/C. ábra). A redukált/alkilezett HPLC frakciók jellemzése az eredeti hipotézis megerősítése mellett további részleteket tárt fel a fehérjék összetételéről illetve szerkezetéről. Az első frakciót két, egy gyorsabban és egy lassabban elváló rész-frakcióként gyűjtöttük össze (If illetve Is). Ezen frakcióknak az elektroforetikus képe azt mutatta, hogy az α és β glutelin alegységek két régiója között megjelenik egy extra sáv. Ez a fehérje nem látható a minták nem redukált körülmények között futtatott elektroforetikus képen, amiből arra következtettünk, hogy ezek a fehérjék feltehetően a glutenin polimerek komponensei. Az elektroforézis eredményéből az is látható, hogy a kisebb fehérjék már a III frakció monomerjeivel, az α és β glutelin alegységekkel együtt kezdenek eluálódni. A fehérjefrakciók előkészítéséhez használt extrakció hatékonyságát a visszamaradt csapadék fehérjetartalmából Dumas módszerével [AOAC, 1998a] határoztuk meg. A kinyerés hatékonysága átlagosan 92,7% volt, ami összevethető az eredetileg búza endospermium fehérjékre kidolgozott extrakció hatékonyságával [Singh és mtsai. 1990]. A görbe alatti területek integrált értékeinek felhasználásával kapott tartalékfehérje frakciók mennyiségei viszonylag széles tartományban változtak. A kapott átlageredményeket a 7. táblázat foglalja össze. 7. táblázat. A különböző lisztek SE-HPLC mérése során kapott relatív görbe alatti területek Oldható α/β−GLUTELIN (%) MINTA

(%)

Oldhatatlan α/β-GLUTELIN (%) (%)

trimer Dimer monomer alb/glob trimer dimer monomer alb/glob UPP%

BIORYZA-6

33,1

10,2

28,2

28,6

42,7

16,6

27,6

13,0

60,5

M-60

30,4

10,8

30,6

28,2

29,5

15,4

32,3

22,8

46,6

DAMA

30,4

11,8

27,5

30,3

46,0

10,7

28,0

15,2

62,8

JANKA

29,9

12,4

30,4

27,2

37,1

13,2

31,7

18,0

58,6

SANDORA

38,2

12,0

21,5

28,3

41,2

26,9

10,6

21,4

55,7

BROWN

25,9

11,3

31,8

31,0

33,8

14,8

29,4

22,0

53,2

KYEEMA

23,5

13,4

34,2

28,8

30,0

17,2

31,0

21,8

54,3

LANG

25,0

12,8

27,2

35,0

35,2

14,9

29,0

20,9

53,7

DOONGARA

26,3

12,3

29,5

32,0

26,1

15,4

34,1

24,4

45,5

REIZIQ ILLADONG

27,3 24,4

11,5 11,6

25,3 29,9

35,9 34,1

36,5 36,0

16,4 16,1

24,9 29,7

22,1 18,2

59,7 46,0

57

A kapott eredmények mennyiségi értékelése számos, a búza- és rizsfehérje komponensek közötti kölcsönhatások eltérő mértékére és természetére utaló következtetés levonására adnak alkalmat. A minta-előkészítés során alkalmazott kétlépéses extrakció által történt megoszlás az „oldható” és „oldhatatlan” frakció között eltérő az irodalomból ismert búza és az általunk vizsgált rizs esetében. Míg valamennyi monomer búzafehérje (albumin/globulin frakció és gliadinok) szonikálás nélkül is kinyerhető, addig a rizsfehérje monomerek körülbelül egyharmada (Kuktaite és mtsai. [2004] adataihoz hasonlóan), nem nyerhető ki szonikálás nélkül. Ezek a különbségek feltehetően inkább a fehérje-fehérje kölcsönhatásokból származnak, nem pedig az egyes fehérje molekulák szerkezeti különbségéből. Ezen kölcsönhatások jellemzésére a minták oldhatósági százalékának, illetve az oldhatatlan polimer fehérjék százalékos mennyiségeinek (UPP%) [Gupta és mtsai. 1993] adatait alkalmaztuk. Az oldhatósági % paramétert az egyes SE-HPLC frakciók mennyiségi arányát kifejező paraméterként definiáltuk. A két paramétert a következő képletek írják le: (Ti)oldható

Oldhatósági % = 100 *

UPP %

= 100 *

(Ti)oldhatatlan

(

(T1+ T2 )oldható (T1+ T2 )oldható + (T1+ T2 )oldhatatlan

)

ahol T az egyes fehérjefrakciók csúcsaihoz tartozó görbe alatti terület. Mint a definícióból látható, az UPP % Gupta és mtsai. [1993] által a búzára javasolt formuláját rizsre adaptálva módosítani kell, mert a rizsben a búzafehérjékkel ellentétben, mind az első mind a második fehérjecsúcs tartalmaz oligomer (nem monomer) fehérjéket. A teljes fehérje relatív összglutelin tartalma (trimer/dimer/monomer) 64,1 % és 72,8 % között változott az oldható frakcióban, 75,6% és 87% között az oldhatatlan frakcióban. A minták oldható glutelin trimerek relatív mennyisége 24,4% és 28,2%, az oldhatatlan glutelineké 26,1% és 46,0% közötti érték volt. A dimer glutelin tartalom nem mutatott nagy varianciát sem az oldható, sem az oldhatatlan frakciókban. A monomer glutelinek relatív tartalma 27,6% és 34,2% között mozgott mind a két extraktumban. A fajták között a „Sandora” rizsliszt mutatott szignifikáns eltérést a frakciók relatív mennyiségében. Ebben a fajtában a legnagyobb mennyiségben a glutelin trimerek, legkisebb mennyiségben a monomer glutelinek vannak jelen. A monomerek (albuminok/globulinok/prolaminok) mennyisége a glutelin fehérjék teljes mennyiségének 15-56% -a volt. Az oldhatatlan polimer frakció relatív mennyiségét (UPP%) az oldhatatlan fehérje frakcióban mért polimer frakció és az összfehérje

58

frakcióban mért polimer frakció arányaként határoztuk meg. Ennek értékei 45,5% és 62,8% között változtak. A teljes görbe alatti területek és fehérjefrakciók számított relatív mennyiségére statisztikai módszerrel varianciaanalízist végeztünk (Függelék F3. táblázat). A lisztek oldhatósági% és az UPP% értékeire elvégzett statisztikai elemzés alapján a két jellemző között szignifikáns negatív korreláció áll fenn (r = -0.788, n-1, p=0,05). Ez azt jelenti, hogy a nagy mennyiségű oldhatatlan polimereket tartalmazó mintákban az oldhatóságot a monomer fehérjék negatívan befolyásolják. A kisebb oldhatóság annak a jele, hogy a nagy polimer fehérjék a monomer fehérjékkel könnyebben kölcsönhatásba léphetnek. A rizslisztek UPP% értéke alapján rokonsági kapcsolat állítható fel a fajták között. A dendogram szerint a fajták két nagy csoportra oszthatók, de a „Sandora” rizsliszt ebben a paraméterben szignifikánsan különbséget mutat a többi fajtához képest. A rizslisztek a fehérjefrakciók relatív mennyisége alapján is csoportosíthatók. A cluster analízis eredményét a Függelék F2. ábrája mutatja. 5.3.3. A tartalékfehérjék összetételének összefüggései a dagasztási tulajdonságokkal A rizsfehérjék analitikai és funkcionális jellemzése után a tartalékfehérje mennyiségi paraméterei és a tészták dagasztási paraméterei közötti összefüggéseket vizsgáltuk. Az irodalmi összefoglalóból tudjuk, hogy a tartalékfehérje összetétel mellett az egyes frakciók illetve alegységek mennyisége is fontos szerepet játszik a búza technológiai tulajdonságainak kialakításában [Gupta és mtsai, 1989; 1994]. Ezek alapján feltételeztük, hogy a rizs reológiai jellemzői is erős korrelációt mutatnak a fehérjefrakciók eloszlásával, a monomer/polimer aránnyal. A fehérjék szerepét a tészta dagasztási paramétereinek kialakításában a fehérjefrakciók relatív mennyisége és a mikro z-arm mixerrel mért dagasztási paraméterek közötti kapcsolattal bizonyítottuk. A tartalékfehérje frakciók abszolút és relatív mennyiségére, valamint a tészták reológiai paramétereire statisztikai elemzést végeztünk (8. táblázat). A vizsgált oldható és oldhatatlan fehérje extraktum összfehérje mennyisége szignifikáns korrelációt mutatott a dagasztási idővel. A korrelációs vizsgálatok eredményeiből arra következtettünk, hogy a nagy polimerek mennyisége számottevően befolyásolja a tészták dagasztási idejét. Szignifikáns korrelációt figyeltünk meg az DDT értéke és a glutelin trimerek frakciójának mennyisége között a teljes fehérje extraktumban. Ez azt jelenti, hogy a nagyobb mennyiségű, illetve nagyobb méretű polimer molekulák jelenléte megnöveli a tészta az optimális konzisztenciájú, vagyis maximális ellenállású dagasztásához szükséges időt. 59

Irodalomból ismert, hogy a polimer frakció mennyisége pozitív korrelációt mutat a tészta erősségével, ami erős korrelációban van a tészta dagasztási idejével. A fehérjefrakciók és a tészták dagasztással szembeni ellenállása változatos, de a búzára meghatározott trenddel azonos kapcsolatot mutatott. Az ’oldható’ fehérjék negatív, az összfehérje pozitív korrelációban van a PR értékekkel, míg az ’oldhatatlan’ fehérjék esetében nem volt szignifikáns kapcsolat a PR érték és a frakciók mennyisége között. A PR értékek és a fehérjék polimer mennyisége közötti kapcsolat ellentétes volt a többi dagasztási paraméterhez képest. Nem volt szignifikáns összefüggés a glutelin monomer és az egyéb monomer fehérjék mennyisége és PR értékek között, viszont erős negatív korreláció volt a glutelin trimerek mennyiségével az ’oldható’ és az összfehérjék esetében. Az ’oldható’ fehérjefrakció negatív korrelációja a PR értékkel azzal magyarázható, hogy az oldható fehérjetartalom növekedésével a ciszteinek és a diszulfid kötések aránya is csökken, ami csökkenti a tészta ellenállását [Dunn és mtsai. 2000]. 8. táblázat. Korreláció a fehérje frakciók relatív mennyisége és a dagasztási paraméterek között. *<0.1, **<0.05 és ***<0.01 szignifikancia szint α/β GLUTELIN α/β GLUTELIN timer (%) dimer (%)

α/β GLUTELIN monomer (%)

MONOMEREK (%)

TELJES TERÜLET (%)

oldható

PR DTT HYD

0,68** -0,42 0,05

0,55*** -0,35 -0,21

PR DTT HYD

-0,01 0,65** 0,24

0,39 0,09 0,05

PR DTT HYD

0,36 0,27 0,21

0,49 -0,13 -0,09

0,77* -0,60 0,30 oldhatatlan 0,49 -0,02 0,42 teljes 070** -0,37 0,39

068** -0,45 0,11

0,82* 0,00 0,13

061** 0,00 0,15

0,57*** 0,28 0,36

068** -0,30 0,13

081* -0,27 0,25

Az irodalomból ismert, hogy a búzaliszt az optimális dagasztással szembeni ellenállásához szükséges víz mennyiségét a fehérje és pentozán tartalom, valamint a keményítősérülés befolyásolja a legnagyobb mértékben. A rizsliszt esetében nem találtunk kapcsolatot a hidratációs (Hyd) paraméter és az összfehérje értéke között, amiből arra következtettünk, hogy a rizs esetében a fehérjék szerepe az egyéb komponensek mellett kisebb a hidratációs folyamatokban és a víz abszorpcióban.

60

Az oldhatatlan polimerfehérje frakciók mennyisége, az oldhatósági% értéke és a dagasztási paraméterek közötti korrelációs kapcsolatot a 9. táblázat tartalmazza. 9. táblázat. Korreláció az UPP%, az Oldhatósági % és a dagasztási paraméterek között. *<0.1 és ***<0.01 szignifikancia szint PR DTT HYD

UPP% -0,44 0,87*** 0,11

OLDHATÓSÁGI % 0,52* -0,91*** -0,1

A korrelációs vizsgálatok pozitív kapcsolatot mutattak a DDT és fehérjefrakciók UPP% étéke között, míg negatív korreláció volt a dagasztási idő és az oldhatósági % értékeiben. Vagyis azok a minták, melyek UPP%-a magas volt nagyobb dagasztási idővel rendelkeztek. A mikro z-arm mixerrel végzett dagasztási kísérletek és az SE-HPLC eredmények igazolták, hogy a búzatésztához hasonlóan a rizstészta reológiai paramétereit a fehérje összetétele is befolyásolja. Az egyes tartalékfehérje frakciók illetve alegységek mennyisége meghatározó a dagasztási tulajdonságok kialakításában. A búza irodalomból ismert, hogy a sikér kialításában fontos szerepe van a nagyon nagyméretű oldhatatlan polimer fehérjék mennyiségének (UPP%), illetve a polimer/monomer, azaz a glutenin/gliadin aránynak. A rizslisztekre meghatározott UPP% és a dagasztási idő közötti pozitív korreláció bizonyítja, hogy a rizsfehérje polimerek mennyiségének szerepe van a technológiai tulajdonságok meghatározásában. A vizsgát fajtaazonos minták között a magyar nemesített fajták UPP% átlagosan magasabb volt, mint az ausztrál fajtáké. A magas UPP% -kal rendelkező (60,5%, ill. 62,8%) Bioryza-6 vagy a Dáma fajták dagasztási ideje is kiemelkedően magas volt (1026 és 1077 sec) a többi fajtához képest. A rizsliszt esetében az UPP% értékét a glutelin fehérjék trimer illetve dimer formáinak mennyisége határozza meg. A tészta funkcionális tulajdonságait, a tészta minőségét a rizs esetében tehát a glutelinek mennyisége befolyásolja. 5.4. A fehérje-összetétel in vitro módosításának hatása az összetételre és a reológiai tulajdonságokra 5.4.1. Izolált búzafehérje-frakciók jellemzése A búza tartalékfehérjéknek a rizstészta funkcionális tulajdonságaira gyakorolt hatását a búzalisztből izolált fehérjefrakciókkal végeztük.

61

A Mv Suba a jelenlegi magyar búzaszortiment egyik kiemelkedő javító minőségű búzafajtája, amely nagy fehérjetartalommal és kimagasló fehérjeminőséggel rendelkezik. Az OMMI adatai alapján a fehérjetartalma 15,6%, sütőipari minőségi faktora A1. Kiváló a sikérterülése, a sikérindexe és az esésszáma. Alveográfos W-értéke alapján a „kiváló” csoportba sorolható (350 -400×10–4 J). Az izolált HMW alegységeket a 14. ábra mutatja. 14. ábra. A Mv-SUBA búzalisztből izolált HMW-GS fehérjék SDS-PAGE képe A

B

119 kDa

Ax2* Dx5+Dy10 Bx7+Dy9

Bx6

79 kDa

Bx7 Bx8

M

Mv-SUBA

M

G6

G7

G8

M: molekulasúly standard, G6: Galahad6; G7: Galahad7; G8: Galahad8 lisztminta A Mv Suba HMW összetételére az Ax2*, a D kromoszómán kódolt x-típusú 5-ös alegység, illetve az y típusú 10-es alegység, valamint a B kromoszóma x7-es és y9-es alegysége a jellemző. Az Mv Suba liszt jó technológia tulajdonságai elsősorban allél-összetételének köszönhető. A HMW Dx5-Dy10 alegységek, illetve Bx7-By9 együttes jelenléte bizonyítottan erősebb, jó sütőipari tulajdonságokkal rendelkező tésztát eredményez. A Galahad fajta egy hagyományosan termő, gyenge búza, mely 3 HMW glutenin alegységet tartalmaz. A három HMW tartalékfehérje alegység név szerint a következő: Glu-B1 lokusz x génje által kódolt 7-es alegység, a Glu-D1 lokusz x génjének 2-es alegysége és az y gén által kódolt 12-es alegységfehérje. A Glu-B1 helyen kódolt y gén, és a Gul-A1 x és y gének nem funkcionálnak. Payne [1999] nemesített kettős hiánymutáns vonalai közül a Galahad-7 (G-7) csak egy, a 7-es HMW alegységet tartalmazza, amit a Glu-B1 lokusz x génje kódol. Az 1D kromoszóma, mely tartalmazza a Glu-1D lokuszt, és valamennyi fajtában megtalálható, ebből a fajtából hiányzik. A Gallahed-6 és -8 búzafajták genomjukban nem tartalmazzák 1B kromoszómán kódolt 7 alegységet csak a 6 illetve 8-as alegységet. Az izolált egyes HMW glutenin alegységek elektroforetikus képét a 12/B. ábra mutatja.

62

Az izolált fehérjefrakciók segítségével az egyes HMW glutenin alegységek egyéni, a többi alegység befolyásoló hatása nélküli közvetlen vizsgálata is lehetővé vált. A lisztfehérjék vizsgálata során az egyik legnagyobb kihívás olyan fehérje izolálási feltételek biztosítása, melyek során nem változik meg a fehérjék funkcionális tulajdonsága [MacRitchie, 1987]. A sikér frakciók gyakran tartalmaznak nagyszámú hasonló fizikai kémiai tulajdonságokkal rendelkező polipeptideket, ezért sok esetben a frakcionálási stratégiák kombinációit kell alkalmazni [Tatham és Shewry, 1995]. Fontos, hogy a fehérje izolálás során alkalmazott oldószerek illetve pufferek ne okozzanak irreverzibilis változást a polipeptidek szerkezetében és a tulajdonságaikban. Az utóbbi évek törekvései a funkcionalitást nem befolyásoló fehérje-izolálási metodikák kiválasztására/optimalizálására lehetőséget teremtenek az izolált egyedi fehérjék hátasainak összehasonlítására a fehérjék eredeti tulajdonságainak módosulása nélkül [Skerritt és mtsai. 1996].

5.4.2. Redukció/oxidáció paramétereinek optimalizálása rizsfehérjékre A búza glutenin alegységek szerepét a rizstészta funkcionális tulajdonságainak kialakításában az alegységek polimerbe történő beépítésével vizsgáltuk. Az alegységek beépítéséhez egy, rizsre specifikus módszert dolgoztunk ki, amely a fehérjék diszulfidkötéseit megbontó, majd a kötéseket felépítő redukciós/oxidációs folyamat optimalizálásának Békés és mtsai. [1994] által búzára kidolgozott módszerén alapul. Az optimális paraméterek meghatározásához a módszer gyors kidolgozhatósága érdekében az ’Illadong’ fajtaazonos rizslisztet választottunk, melynek dagasztási ideje a mikro z-arm mixerben végzett kísérletek során rövid volt. Az irodalomból ismert, hogy redukálószer és a liszt keveredésének a tésztakialakulás előtt kell megtörténnie. Kísérleteinkben az adagolás pillanatától 30, illetve 45 másodpercig regisztráltuk a görbét. A rizslisztekre jellemző lassú hidratációs folyamat miatt az optimális időszükségletet 45 másodpercben állapítottuk meg. A redukálószerként alkalmazott DTT koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy a tészta fehérjéinek redukciója csak részleges, később visszafordítható legyen, azaz a tészta a redukció után továbbra is megtartsa tésztajellegét. Az alkalmazott DTT oldat térfogatának meghatározásához 450 µl és az 1 ml 2 mg/ml oldatot kevertünk a dagasztással szembeni ellenállás maximális értékének az eléréséhez szükséges víz mennyiséghez. Az 1ml 2 mg/ml DTT-t tartalmazó redukálószerrel tapasztaltunk szignifikáns változást a dagasztási paraméterekben. A fehérjék részleges redukcióját eredményező DTT

63

koncentrációt 2 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml és 30 mg/ml oldatotok felhasználásával állapítottuk meg. A tészta funkcionális paramétereinek változását a 10. táblázat tartalmazza. 10. táblázat. A rizstészta dagasztási paraméterei különböző mennyiségű redukálószer hatására PR (V.U)

DDT (SEC) BD (V.U*SEC)

ST (SEC)

KONTROLL 624 252 80 24 2mg/ml DTT 621 177 83 12 10mg/ml DTT 564 156 112 10 20mg/ml DTT 534 122 119 7 30mg/ml DTT 519 117 137 4 2, 10, 20, 30 mg/ml DTT: az alapliszthez adagolt DTT oldat koncentrációja A redukálószer szignifikánsan befolyásolta a tészta erősséget. A kezelt tészta dagasztási ideje a kontroll tészta dagasztási idejének 70%-46%-ával csökkent. A dagasztással szembeni ellenállás és a tészta stabilitás értékei az alkalmazott redukálószer mennyiségétől függően csökkentek, átlagosan 621-519 VU illetve 24-4 sec között változtak. A tésztaellágyulás értéke a redukálószerrel kezelt tésztáknál növekedett. A fehérjék részleges redukciójához a vizsgált koncentrációk közül a 2 mg/ml DTT oldatot találtuk optimálisnak. A magasabb koncentrációban alkalmazott redukálószer a polimer teljes megbontását eredményezheti, megszüntetve ezzel a reológiai tulajdonságok szempontjából esetleg fontos másodlagos kölcsönhatásokat, amelyek a re-oxidáció alkalmával nem vagy csak részlegesen alakulnának vissza. A 20 mg/ml felett alkalmazott redukálószer esetében nem tapasztaltunk szignifikáns változást a tészta funkcionális tulajdonságaiban. A reakcióhoz szükséges idő optimalizálásához a tésztát 2, 4 és 6 percig pihentettük. A dagasztási időben megfigyelt változásokat a 15. ábra mutatja. 15. ábra. A különböző reakcióidők összefüggései a dagasztási idővel

250

150 100

kontroll

2mg/ml DTT

6 perc

0

4 perc

50

2 perc

MT (sec)

200

64

A dagasztási idő 2 perces reakció idő után is mintegy 38%-kal csökkent, de a hosszabb reakció idő 45%-os csökkenést is eredményezett a dagasztási idő értékében. A 4 és a 6 perc redukció utáni változások nem mutattak szignifikáns változást a reológiai paraméterekben. Ebből arra következtettünk, hogy a 4 perc reakcióidő elegendő a fehérjék diszulfidkötéseinek részleges megbontásához. A fehérjék redukciója után a diszulfidkötések újbóli kialakításához szükséges paramétereket határoztuk meg úgy, hogy a kezelt (redukált, majd re-oxidált) tészta dagasztási paraméterei minél jobban megközelítse a kezeletlen minta értékeit. Az oxidálószer mennyiségét 2,5 mg/ml, illetve 5 mg/ml koncentrációjú kálium-jodát oldatok hozzáadásával állapítottuk meg. A KIO3 hatására az előzetesen redukált tészta erősödött, a PR és DDT értéke nőtt. Az 5mg/ml KIO3 hatására a tészta dagasztási paraméterei (DDT, PR) közelebb álltak a kontroll tésztáéhoz (16. ábra). Az oxidáció hatására a tészta regisztrált dagasztási görbéje arányaiban megegyezett a kezeletlen minta görbéjével. Az oxidálószer optimális térfogatát 250 µl-ben állapítottuk meg. Az

oxidáció

hatását

a

tészta

dagasztási

paramétereire

három

időintervallumban

tanulmányoztuk. A kétféle koncentrációjú oxidálószer és a három oxidáció idejének hatását a tészta dagasztási idejére a 16. ábra mutatja be. 16. ábra. Oxidáció idejének összefüggése a dagasztási idővel

350 300 250 200 150 100 50 0

kontroll

2 mg/ml KIO3

5 mg/ml KIO3

2perc 4 perc 6 perc

MT (sec)

500 450 400

A 2 és 4 perces oxidációs idő után bekövetkezett változások nem érték el a kontroll tészta dagasztási paramétereinek értékét. Az 5 mg/ml KIO3 hatására a dagasztási idő 2 és 4 perces oxidáció után is a kezeletlen tészta DDT értékének csak 88% illetve 93%-a. A tésztafehérjék redukált diszulfidhídjainak 6 percig tartó oxidációja után a dagasztással szembeni ellenállás és

65

a dagasztási idő értéke közel azonos volt a kontroll tésztáéval. Ezért a fehérjék diszulfidkötéseinek újbóli kialakításához a 6 perces oxidációs időt alkalmaztuk. A rizstészta fehérjeire optimalizált redukciós/oxidációs folyamat paramétereit összefoglalóan a 10. táblázat tartalmazza. 11. táblázat. Redukció és oxidáció a rizsfehérjékre KEVERÉS-1 REDUKÁLÓSZER MENNYISÉGE REDUKCIÓ IDE: KEVERÉS-2 OXIDÁLÓSZER MENNYISÉGE OXIDÁCIÓ IDEJE

45 sec 2 mg/ml DTT 4 perc 30 sec 5 mg/ml KIO3 6 perc

Az irodalmi összefoglalóból ismert, hogy a Békés és mtsai. [1994] által kidolgozott redukciós/oxidációs lépéseken alapuló rekonstrukciós eljárás kidolgozását a fehérjék szélesebb körű vizsgálata tette szükségessé. A diszulfidhidak megbontásával, majd újraépítésével lehetővé vált a fehérjék in vitro körülmények közötti polimerizálása. Az oldhatatlan polimer molekulák mennyisége (UPP%) összefüggésben van a tészta erősségével és technológiai tulajdonságaival. A diszulfidkötéseket megbontva csökken a polimer molekulák száma, ami arányosan csökkenti a tészta erősségét. Az oxidáció hatására a redukált tészta dagasztási paraméterei a kiindulási értékkel csaknem azonosak lehetnek. Az általunk vizsgált rizsliszt esetében a búzánál megfigyelt eredményeket tapasztaltunk a fehérjék redukciója, illetve oxidációja során. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az általunk a rizslisztből dagasztott tésztára kidolgozott technika alkalmas a rizs vagy más fehérjék in vitro beépítésére a rizsfehérje polimer mátrixba, illetve a funkcionális tulajdonságokra gyakorolt hatásainak vizsgálatára. 5.4.2.1. A redukció/oxidáció hatása tartalékfehérjék összetételére A fehérjék redukciója és oxidációja következtében megváltozott tartalékfehérje összetételt SE-HPLC-vel vizsgáltuk. A kezelés hatására a dagasztási görbén, illetve a fehérje extraktumok kromatogramján bekövetkezett változásokat a 17. ábra szemlélteti. Amint ezt az előző fejezetben részletesen tárgyaltuk, a dagasztási paraméterek értékeiben és a dagasztási görbe jellegében szignifikánsan változik a redukció hátasára, amely a reoxidációval eredeti formájára visszahozható. A dagasztási görbékkel párhuzamosan az

66

oldható és oldhatatlan extraktumok fehérjefrakcióinak mennyiségi aranyai is számottevően változnak. 17. ábra. A redukció és oxidáció hatása dagasztási tulajdonságokra és fehérje összetételre. (A) mikro z-arm mixer, (B) SE-HPLC profilja. A

I

B III

BD

IV

II

oldható

DDT

oldhatatlan

III

IV

I II

I

III

IV

II

A redukciót és az oxidációt követően a tartalékfehérjék megváltozott összetétet az oldható, oldhatatlan és a teljes fehérjemennyiségre vonatkoztatva a 12. táblázat tartalmazza. A redukálószer az oldható extaktumban megnövelte a glutelin monomerek (frakció III) mennyiségét, míg a glutelin trimerek és dimerek mennyisége csökkent. A csökkenés 5,5%-a volt a redukálatlan tésztának. A glutelin monomerek mennyiségének növekedése 54,7% volt. Emellett 3,3% növekedést tapasztaltunk az egyéb monomereket tartalmazó frakcióban. Az oldhatatlan extraktum fehérjéinek mennyisége hasonlóan változott. A polimer glutelinek

67

mennyisége 35,1 %-kal csökkent. Az albumin/globulin/prolamin fehérjék frakciója megduplázódott, 149,9 %-kal több fehérjét tartalmazott, mint a kontrol tészta. 12. táblázat. Fehérjefrakciók %-os mennyisége a redukció/oxidáció során ’OLDHATÓ' % FRAKCIÓK I+II III IV ÖSSZES

OLDHATATLAN' %

TELJES %

UPP%

100 100 100 100

23,64

87,2 139,8 122,6 114,8

17,3

99,4 89,6 89,2 93,4

28,79

KONTROLL

100 100 100 100

100 100 100 100 REDUKÁLT

I+II III IV ÖSSZES

94,5 154,7 103,3 115,9

63,9 109,1 249,7 111,2 OXIDÁLT

I+II III IV ÖSSZES

98,8 97,9 91,8 92,6

113,7 72,2 72,1 95,9

A tartalékfehérjék összmennyisége a redukció következtében a glutelin trimer/dimer formában

87,2%-ra

csökkent,

a

monomer

glutelinek

mennyisége

39%-kal,

az

albumin/globulinok/prolamin fehérjéké 22,6% -kal nőtt. Az oxidáció az oldható és oldhatatlan fehérje extraktumokban is növelte a glutelin trimer/dimer mennyiséget, ami csaknem megközelítette a kontrollnak megfelelő 100%-ot. A monomer glutelinek és az egyéb monomer fehérjék is nagyobb arányban voltak jelen. Az összfehérje mennyisége a frakciókban 89,4% és99,4% között változott, ami megközelítette az eredeti kezeletlen tészta fehérje-összetételét. Az UPP% a redukció hatására az eredeti 23,64%-ról 17,3% csökkent, majd az oxidációval 28,79%-ra nőtt. A kiindulási értéknél nagyobb UPP% feltehetően túloxidálásnak az eredménye. Az irodalmi összefoglalóból ismert, hogy a redukálószerek, mint a DTT vagy a 2-ME a fehérjék közötti inter- vagy intramolekuláris diszulfidkötések felszakadnak, a fehérjék alegységeikre esnek szét. Ezáltal a fehérjék átlagos molekulatömege is csökken. A rizs polimer glutelin fehérjéinek redukciója után az alegységek a monomer glutelinek frakciójában

68

halmozódik fel (Frakció III). Az egyéb monomer fehérjék frakciójában megnövekedett fehérjemennyiség oka lehet, hogy az eredetileg dimer formában lévő glutelinek, vagy a polimerizációra képes globulinok vagy prolaminok alegységeire esnek szét. A fehérjék oxidációja során a fehérjék cisztein molekulái között visszarendeződnek a diszulfidkötések. Az újból megjelenő inter- és intramolekuláris diszulfidkötések megnövelik a polimer fehérjék mennyiségét. Ezek a fehérjék a glutelin trimer illetve dimer formákat tartalmazó frakcióban halmozódtak fel. Az oxidáció után létrejött fehérje-összetétel eloszlás megközelítőleg azonos volt a kontroll tésztáéval. A búzatészta technológiai tulajdonságainak kialakításában fontos szerepe van az irodalmi összefoglalóban is megemlített polimer/monomer (glutenin/gliadin) fehérjék arányának, illetve az oldhatatlan polimer fehérjék mennyiségének. A rizslisztre kidolgozott módszerünk hatása mind a tészta dagasztási paraméterei, mind a fehérje-összetétel eloszlásra megegyezik az irodalomban a búza fehérjékre kidolgozott módszer eredményeivel. A redukció csökkentette a polimer fehérjék mennyiségét, az UPP% értéket, ami a tészta erősség csökkenéséhez vezetett. A részlegesen redukált tészta oxidációja indukálta a fehérjék polimerizációját, ami növelte az UPP%-ot és a tészta erősségét. Ebből arra a következtetésre jutottunk, hogy polimer és a monomer glutelinek aránya a rizsliszt esetében is befolyásolja a dagasztási tulajdonságokat. 5.4.3. A búzafehérje frakciók addíciójának hatása A rizstésztára kidolgozott re-oxidációs technika segítségével a búza glutenin alegységfehérjék hatásának vizsgálatára addíciós és inkorporációs kísérleteket végeztünk. A tartalékfehérje alegységek addíciója a tésztafehérjék polimer szerkezetének megbontása nélkül történt, míg a búzafehérjék inkorporációja során a tészta fehérjemátrixának megbontása után építettük be az alegységeket a polimer láncba. Az addíciós és inkorporációs kísérletek során kapott étékekre varianciaanalízist végeztünk (Függelék F4-F5. táblázat). 5.4.3.1. HMW és LMW glutenin frakciók addíciója Az addíció során a rizs alapliszthez a HMW és LMW glutenin fehérjefrakciókat a fehérjetartalomnak 5, 10 és 20%-ában kevertük. Az alapliszt fehérjetartalma 7 % volt, ezért a lisztbe 14, 28 és 56 mg HMW és LMW glutenin alegységfehérje frakciókat homogenizáltunk. A tészta dagasztását redukáló és oxidáló szerek helyett desztillált vízzel végeztük. A fehérjefrakciók addíciója utáni tészták dagasztási paramétereit 13. táblázat tartalmazza.

69

13. táblázat. Rizstészta dagasztási paraméterei glutenin alegységek addíciója után MINTA STANDARD HMW-5% HMW-10% HMW-20% LMW-5% LMW-10% LMW-20%

PR (V.U) SZÓÁS DDT (SEC) SZÓRÁS BD (V.U*SEC) SZÓRÁS S T (SEC) SZÓRÁS 627 26,41 356 17,98 98 8,21 102 8,56 594 22,12 327 19,41 109 10,42 82 7,51 591 15,86 310 20,87 119 15,87 70 8,32 575 25,96 286 16,87 144 12,45 59 7,24 606 17,81 268 18,64 106 11,36 81 6,69 582 19,54 219 20,10 89 10,24 73 6,58 536 21,24 187 15,62 257 9,8,68 63 7,02

HMW-5%-HMW-20%: alapliszthez 5% -20% mennyiségben adagolt HMW-GS-t tartalmazó rizstészta; LMW-5%-LMW-20%: alapliszthez adagolt 5%-20% mennyiségben LMW-GS fehérjét tartalmazó rizstészta. A búza fehérjealegységek addíciója szignifikáns változást eredményezett a tészta dagasztási paramétereiben. A 5% HMW glutenin alegység adagolása 10%-kal csökkentette a dagasztási időt, míg a maximális mennyiségben adagolt HMW-GS (20%) hatására mintegy 20%-os csökkenést tapasztaltunk. Az LMW glutenin alegységeknek az alapliszthez történő hozzáadása során a HMW glutenin alegységnek megfelelő változást tapasztaltunk a dagasztási idő értékében. A legnagyobb mértékű változást a DDT esetében, mindegy 48%-os csökkenés a 20%-ban adagol LMW glutenin alegységek hatása. A tészták dagasztással szembeni ellenállás értéke 575-627 között változott. A kontroll tészta PR értékéhez viszonyítva a glutenin alegységek addíciója csökkentette a tészták PR értékét. Emellett az adagolt tartalékfehérjék akár 40%-kal is csökkentették a tészta stabilitását. A tészta ellágyulás értéke a fehérjék hatására növekedett a kontroll tésztához képest. A tészták dagasztási görbéje a fehérjefrakciók addíciójának hatásra gyorsabban kialakuló, kisebb stabilitású, gyenge tésztát mutatott. A dagasztási görbéket a Függelék F3. ábra mutatja. A HMW alegységek adagolása a rizstészta funkcionális paramétereire hasonló eredménnyel járt, mint az irodalomból ismert búzaliszt esetében megfigyelt változások [Uthayakumaran és mtsai 1997, 1998, 1999]. Amint ezt az irodalmi összefoglalóban tárgyaltuk, a glutenin alegységek egyszerű addíciója során a fehérjék nem épülnek be a rizsfehérjék polimer mátrixába, így hatásuk tészta dagasztási paramétereire hasonló a monomer gliadin fehérjékhez. A glutenin alegységfrakciók adagolása megváltoztatja az alapliszt polimer/monomer fehérjéinek arányát úgy, hogy az alegységfrakciók megnövelik a monomer fehérjék mennyiségét, ami hatással van a tészta technológiai tulajdonságaira is. Függetlenül attól, hogy HMW

vagy

LMW

glutenin

fehérjefrakciókat

adagoltunk,

gyengébb

dagasztási

tulajdonságokkal rendelkező tésztát kaptunk.

70

A dagasztási idő, a stabilitás valamint a dagasztási ellenállás értékeiben bekövetkezett csökkenés,

az

ellágyulás

mértékének

növekedése

a

fehérjealegységek

adagolása

következtében megváltozott polimer/monomer aránynak a következménye. Eredményeink szerint már 5% HMW glutenin alegység hozzáadása az alapliszthez elegendő volt a rizsliszt dagasztási tulajdonságainak szignifikáns változásához. A paraméterekben bekövetkezett változás arányos az adagolt fehérjefrakció mennyiségével. Az irodalmi adatokból is ismert, hogy az azonos mennyiségű HMW és LMW glutenin alegységek addíciójának hatása azonos, de különböző mértékű változást eredményez a tészta reológiai paramétereinek értékében. Az LMW-GS fehérjék hatása nagyobb, mint a HMW-GS fehérjéké. 5.4.4. HMW és LMW glutenin alegységek inkorporációja A HMW és LMW glutenin alegység fehérjefrakciók hatását inkorporáció segítségével a rizstészta

polimer

mátrixába

építve

is

megvizsgáltuk.

A

mérést

megelőzően

a

fehérjetartalomnak 5-10 és 20%-ában a fehérje alegységeket a liszttel homogenizáltuk. A rizsfehérjékre kidolgozott módszerrel redukáltuk a liszt és a hozzákevert búzafehérje alegységeket, majd a diszulfidhidak összekötésével beépítettük őket a rizsfehérje polimer szerkezetébe. Az inkorporáció változást eredményezett tészták dagasztási paramétereiben és a görbék jellegében is. A dagasztási görbéket a Függelék F4. ábra mutatja be. Az inkorporáció után vizsgált dagasztási paraméterek értékeit a 14. táblázat tartalmazza. 14. táblázat. Rizstészta dagasztási paraméterei glutenin alegységek inkorporációja után MINTA PR (VU) SZÓRÁS DDT (SEC) SZÓRÁS BD (VU*SEC) 28,24 20,53 619 360 130 RED-OX 15,15 18,95 582 391 116 HMW-5% 20,62 19,23 605 437 104 HMW-10% 19,21 18,24 606 467 67 HMW-20% 16,41 21,01 588 380 111 LMW-5% 22,12 17,98 626 398 102 LMW-10% 15,86 19,41 598 430 86 LMW-20% 25,96 20,87 594 379 124 G6-5% 17,81 16,87 578 385 116 G6-10% 19,54 18,64 542 389 125 G7-5% 21,24 20,10 564 401 105 G7-10% 22,89 21,05 545 410 123 G8-5%

SZÓRÁS

12,65 10,14 11,21 9,42 12,87 8,45 11,36 13,24 12,68 10,51 10,56 11,12

ST (SEC) SZÓRÁS

98 120 153 180 111 145 172 108 132 110 128 109

12,45 11,04 12,32 10,85 11,20 10,56 9,98 12,08 11,54 10,45 9,54 12,01

HMW-5%-HMW-20%: alapliszthez 5% -20% mennyiségben beépített HMW-GS-t tartalmazó rizstészta; LMW-5%-LMW-20%: alapliszthez inkorporált 5%-20% LMWGS fehérjét tartalmazó rizstészta; G6-5%-10%: alaplisztbe 5-10%-ban inkorporált HMW Bx6 alegységet, G7-5-10%: 5-10%-ban inkorporált HMW Bx7alegység, G8-5%: 5%-ban inkorporált HMW Bx8 alegységet tartalmazó rizstészta. 71

Az inkorporációs kísérletek során az Mv Suba lisztből izolált HMW és LMW glutenin alegységek mellett a Galahad fajták egy-egy HMW glutenin alegységfehérjét tartalmazó frakciókat is felhasználtuk. A beépített fehérje alegységek mennyisége ellentétes hatást gyakorolt a mért paraméterekre, mint az addíció esetében. A dagasztási idő átlagértéke a beépített HMW-GS frakciók hatására növekedett. A legnagyobb értékű változást, a kontrollhoz viszonyított 41%-os növekedést a 20%-ban beépített HMW összfehérje frakció esetén tapasztaltunk. Az LMW glutenin alegységek beépítése szintén szignifikáns növekedést okozott a dagasztási idő értékében. A nemesített Galahad-7 fajtából származó HMW Bx7-es alegységfehérje 5%-ban történő beépítésével 8,5%-kal volt magasabb a dagasztási idő. A Bx6 illetve Bx8 HMW alegységek beépítése a polimer mátrixba szintén megváltoztatta a dagasztási időt. 28 mg HMW Bx8 alegységfehérje 15%-os növekedést eredményezett a DDT értékében. A dagasztás utáni tészta stabilitás növekedése az inkorporált fehérjefrakciók következtében 10% és 56% között volt. A HMW glutenin alegységek beépítésével létrejött tészta nagyobb stabilitási értékkel rendelkezett, mint az LMW-GS-t tartalmazó tészták. A BD értékek az inkorporáció után csökkentek, értékük 125 és 67 VU*sec között változott annak függvényében, hogy milyen gluten alegységfehérjét építettünk be. Az eredmények alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a búzafehérje frakciók inkorporációja mennyiségétől és minőségétől függetlenül erősebb tésztát eredményezett. A dagasztási paraméterekben bekövetkezett változás értéke viszont függött a fehérje frakció allél-összetételétől. A statisztikai számítások alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a beépített búzafehérje szignifikáns hatással van a rizstészta funkcionális paramétereire (Függelék F4-5. táblázatok). Az in vitro kísérletekben a glutenin alegységfehérjék addíciója során elvárható, hogy az in vivo körülmények során fellépő tulajdonságokat modellezzék, de csak akkor, ha a sikér diszulfidkötések által kiterjedt hálózatába épülnek. Az irodalmi adatokból ismert, hogy a búzalisztbe történő HMW és LMW glutenin alegységek in vitro inkorporációja erősebb, stabilabb tésztát eredményez. A technológiai tulajdonságokban bekövetkező változás mértéke függ a fehérjék minőségétől és mennyiségétől. A glutenin alegységek inkorporációja a rizstészta dagasztási paramétereit búzánál is tapasztalt irányban változtatta meg. Az Mv SUBA összes HMW –GS alegységfehérje beépítése pozitívabb hatással volt a dagasztási paraméterekre, mint az LMW-GS fehérjék [Gupta és mtsai. 1995]. Az Mv Suba búzalisztben a HMW glutenin alegység allélok közöl a Dx5+Dy10, 72

Bx7+By9 és az Ax2* vannak jelen. A HMW glutenin alegységek között nagy homológia és hasonló felépítés következtében az allélikus változatok hasonló módon, pontmutációkkal, deléciókkal vagy inszerciókkal alakultak ki egymásból. Erre példa egy egyszerű 6, illetve 9 aminosavkodonból álló inszerció, amely az 1Ax1gén eltérését eredményezi az 1Ax2* géntől. Az 1Ax2* gén és az 1Ax2 által kódolt HMW glutenin alegységfehérje között csak a központi domén hosszában van különbség, melynek nincsen mérhető hatása a tészta nyújthatóságára, illetve sütőipari minőségére [Gobaa és mtsai. 2007]. Az MV Subában is jelenlévő HMW Dx5+Dy10 allél-pár szerepe a technológiai tulajdonságok kialakításában, az irodalomban jól ismert. Ennek elsődleges oka a Dx5 extra CYS aminosava, amely minőségileg megváltoztatja a polimer formálás lehetőségét. A két alegységfehérje együttes jelenléte nagyobb változásokat eredményez, mint a két alegység hatásának az átlaga, ami eddig részleteiben nem ismert szinergikus hatások jelenlétet bizonyítja [Békés és mtsai. 1994]. Ezeknek az alegységfehérje frakcióknak rizslisztbe történő inkorporációja következtében a dagasztási paraméterek értékei a búzalisztnél tapasztaltaknak megfelelően változtak. A HMW glutenin alegységeknek a minőségben betöltött szerepe miatt pozitív változást vártunk a rizstészta esetében is. A B kromoszómán kódolt x6 alegység hatása az x7, illetve az x8 fehérje alegységekhez képest kisebb mértékű. Az irodalomból ismert, hogy az egyéni HMW –GS inkorporációjának kisebb hatása van, mintha a fehérjék 1:1 arányban lennének jelen. Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az egyéni HMW glutenin alegységek közül, az 5%-ban beépített Bx8 gén által kódolt fehérje okozott a legnagyobb értékű változást a rizstészta dagasztási paramétereiben (Függelék F5. ábra). A HMW és LMW glutenin alegységek inkorporációja következtében létrejött változások polimer/monomer arány eltolódásnak a következménye. A HMW és LMW glutenin alegységek a tészta polimer szerkezetébe való beépülése növeli az átlagos molekulatömeget. A búza kísérletekből ismert, hogy a polipeptidek mérete egy fontos paraméter az inkorporáció során. Minél hosszabb a beépített glutenin alegység, annál hosszabb a tészta dagasztási ideje [Veraverbeke és mtsai. 1998, Tamás és mtsai 2002]. A rizslisztekre végzett dagasztási kísérletekben bizonyítottuk az UPP% és az DDT közötti erős korrelációt. A búza alegység fehérjék inkorporációja következtében megnövekedett UPP% (lásd. 5.4.5. alfejezet) hosszabb dagasztási időt eredményezett. Az irodalomban a búzalisztre leírt hasonló addíciós és inkorporációs kísérletekkel ellentétben a rizstészta esetében a fehérje adagolások következtében megváltozott optimális 73

vízfelvételhez szükséges víz mennyisége csökkent. Ennek lehetséges oka, hogy az adagolt fehérjével a liszt+adagolt fehérje keverék összes polaritása csökken, így kevesebb víz kell a hidratációhoz. A búzakísérletekből ismert, hogy azonos fehérjemennyiségben akár gliadint, glutenint vagy sikért adagoltunk, a WA ugyanolyan mértékben változik. A WA értékét befolyásoló hatások nagyságát ugyanis a fehérje polaritása határozza meg [Singh és Singh, 2006]. 5.4.5. In vitro fehérjemódosítások hatásának komplex értékelése A búza glutenin alegységek addíciós és inkorporációs kísérletei után a rizstészta molekulatömeg eloszlását SE-HPLC-vel vizsgáltuk (Függelék F6-F7. táblázat). Az összterület és az UPP% értékét a 15. táblázat tartalmazza. 15. táblázat. Fehérje-összetétel a tartalékfehérjék addíciója (add) és inkorporációja (inc) után KONTROLL REOXIDÁLT INC-LMW5% INC-LMW10% INC-LMW20% INC-HMW5% INC-HMW10% INC-HMW20% INC-G6-5% INC-G6-10% ADD-LMW-5% ADD- LMW-10% ADD-LMW-20% ADD-HMW-5% ADD- HMW-10% ADD- HMW-20% ADD- G6-5%

UPP% 23,64 24,39 26,49 27,23 35,50 31,07 38,00 39,89 27,89 31,74 22,95 23,69 21,48 22,97 22,64 22,16 22,99

SZÓRÁS

0,56 1,05 0,89 1,25 1,56 1,10 1,54 1,05 0,58 0,69 1,08 0,56 0,74 0,34 0,69 0,87 1,02

ÖSSZTERÜLET 1209721 1209721 1285641 1362318 1429874 1298974 1382471 1469782 1274620 1341752 1275413 1342156 1412562 1262310 1335428 1398451 1269874

SZÓRÁS

12564 25041 21054 18452 17684 18975 19458 20145 21005 20478 19568 20314 18456 17489 18475 19584 21021

Kontroll: alapliszt. Inc: inkorporáció. Alaplisztbe 5%-20%-ban beépített HMW-GS, LMW-GS, HMW Bx6 fehérje alegységeket tartalmazó tészták. Add: addíció: kontroll liszthez 5%-20%-ban hozzáadagolt HMW-GS, LMW-GS és Bx6 fehérje alegységeket tartalmazó tészták. A HMW-GS és az LMW-GS fehérjék addíciója és inkorporációja során az adagolt fehérje alegység mennyiségétől függetlenül, a görbék alatti teljes terület a kontrolhoz viszonyítva nőtt.

74

A tartalékfehérjék addíciója, illetve beépítése megváltoztatta az UPP% értékét, azaz az oldhatatlan polimer fehérjék mennyiségét is. Az addíció után az UPP% értéke nem változott szignifikánsan az alap tészta oldhatatlan polimer fehérjéinek mennyiségéhez képest. Értéke 21,48% és 23,69% között változott. A glutenin alegységek beépítése pozitívan befolyásolta a tészták UPP% értékét. Az 5% LMW-GS inkorporációja 7,8%-kal, míg az 5% HMW-GS beépítése 27%-kal növelte meg az UPP%-ot. A legnagyobb változást a mintegy 56 mg HMW glutenin alegység beépítése eredményezte, ahol 68,7%-os volt az oldhatatlan polimer fehérje mennyiségének növekedése. Az egyéni HMW glutenin alegységek az alapliszthez viszonyítva szintén szignifikáns eltérést mutattak az UPP% érzékében. A búza kísérletekből ismert, hogy az UPP% az inkorporáció során a hozzáadott mennyiség függvényében nőtt, mind a HMW, mind az LMW glutenin alegységek esetében [MacRitchie és Gupta, 1993]. Az UPP% érték növekedése azonos mennyiségű HMW-GS polimer hálózatba építése után nagyobb volt, mint az LMW-GS esetében. Az addíció folyamatában a fehérjealegységek nem épülnek be a polimer láncba, így nem növelik az oldhatalan polimer fehérjék mennyiségét sem. Az inkorporáció során a diszulfidkötések megbontása, majd újraoxidálása lehetővé teszi az alegységek beépítését növelve ezzel a polimerláncok hosszát. Az SE-HPLC eredmények értékelése során a következő megfigyeléseket tettük. Mind az HMW, mind az LMW glutenin alegységek, amíg nem oxidáljuk őket, vagy valamilyen okból kifolyóan nem oxidálódnak, az ’oldhatatlan’ monomer fehérjék frakciójában (IV. frakció) halmozódnak fel. Az oxidációt követően a búza tartalékfehérjék az ’oldhatatlan’ glutelin trimert tartalmazó frakcióban (I. frakció) jelentek meg. Emellett az oxidáció esetén mind az ’oldható’ mind az ’oldhatatlan’ glutelin dimerek mennyisége (II. frakció) kismértékben csökken. Ennek oka, hogy az eredetileg monomer α és β glutenin alegységek (III frakció) egy jelentős része is oxidálódik. Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a rizslisztbe történő inkorporáció során nemcsak a búzafehérjéket építjük be a polimer szerkezetbe, hanem a rizs eredeti fehérjeit is. 5.4.6. Az in vitro addíció és inkorporáció hatásának összehasonlító értékelése A rizsliszt fehérje-összetételének in vitro megváltoztatása során megfigyelt eredményekből arra következtethetünk, hogy az összetétel megfelelő módosítása hatással van a rizstészta dagasztási paramétereire. A fehérje-összetétel megváltoztatásának egyik módja a fehérjék polimer/monomer arányának módosítása a fehérjék adagolásával a polimer megbontása nélkül, illetve a rizsfehérje polimer mátrixba történő beépítésével. Az addíció és inkorporáció 75

ellentétest hatását a rizstészta dagasztási paramétereire a 18. ábra mutatja be, ahol 20% HMW-GS-t adagoltunk, illetve inkorporáltunk az alaplisztbe. 18. ábra. Az lapliszthez 20%-ban adagolt és beépített HMW-GS hatásának összehasonlítása a rizstészta dagasztási görbéin

DDT

Ha a fehérjeadagolással a polimer/monomer arányt a monomerek mennyiségének növelésével változtatjuk (addíció), akkor a tészta viszkozitása csökken, míg a polimer arány növelésével (inkorporáció) a tészta erősödik. Ehhez legalább 5%-ban növelni kell a polimerek mennyiségét, amit vagy plusz polimer molekulák jelenlétével, vagy polimerizációra képes monomerjellegű rizsfehérjék polimerizálásával biztosíthatunk. A búzafehérjék rizsfehérje polimerbe építése komolyabb biotechnológiai feladatot igényel, aminek egyik lehetősége a búzafehérjék génjeinek in vivo transzformációja. 5.5. A fehérje-összetétel In vivo módosítása -HMW Dx5 alegység expressziója transzgénikus rizsben 5.5.1. Transzgénikus növények szelekciója és regenerációja Az in vitro kísérletek mellett a rizsliszt polimer/monomer arányát in vivo beépített HMW glutenin alegységekkel is megváltoztattuk. A búzaminőség meghatározásában betöltött szerepe miatt a rizst HMW-Dx5 glutenin alegységet kódoló GluD1-1d génnel transzformáltuk. A transzformációt többször, kb. négyszáz kalluszon megismételtük, majd a kalluszokat szelektáltuk. A belövés után az 50 mg/ml hygromicin tartalmú táptalajon csak azok a

76

kalluszok tudtak növekedni, melyek nukleáris genomjába integrálódott a htp gén (19/A ábra). Egy sikeres belövés után, a szelektált kalluszok kb. 50 % maradt életben. A hajtások megjelenése után, a gyökérregeneráció hormonmentes táptalajon, a táptalaj gyakori cseréje mellett történt (19/B. ábra). A kalluszokból végül 32 független rizsvonalat regeneráltunk. Földbe kiültetve növényházban mindet felneveltük. A regenerált putatív transzgénikus növények közül 12 növényben mutattuk ki a transzformációra használt gének jelenlétét. A 12 növényből összesen 5 vonal (#19, #20, #21, #23 és #26) volt fertilis, azaz hozott magot. 19. ábra: A rizs szövettenyésztés fázisai A

B

(A) kalluszok szelekciója (B) regenrált transzgénikus növények. A regenerált növények maghozatala alacsony volt. A #19-es számú rizsnövényekről 12, a #20-as számú 5, a #21-es 15, a #23-as 30 a #26-as növényről hozzávetőleg 50 szem magot tudtunk betakarítani. A magok felszaporítására, illetve a szegregáció vizsgálatára, a magokat földbe vetettük, majd üvegházban a növényeket felneveltünk. Az elvetett magok 85%-a kicsírázott és növénnyé fejlődött. A transzgén öröklődését az utódnemzedék növényeiben molekuláris biológiai módszerekkel vizsgálatuk. 5.5.2. Transzgénikus növények analízise 5.5.2.1. DNS vizsgálatok A transzformáció során a rizs genomiális DNS-be bejutott gének jelenlétét PCR reakcióval bizonyítottuk. A reakcióhoz használt templát DNS molekulát mind a 32 regenerált növény leveléből izoláltuk. A PCR reakciót végeztünk minden mintára a rizs prolamin gének közül a 6-os jelű fehérje génjére specifikus Rp6F és Rp6R primerekkel. A transzformációhoz használt vektoron kódolt hygromycin rezisztenciát biztosító htp gén jelenlétét a génre specifikus HtpF 77

és HtpR primer párral, a 1Dx5 HMW- fehérjét kódoló GluD1-1d gént a prim51-52 specifikus primerekkel [D’Ovidio és mtsai. 1994] teszteltük. A rizs prolamin a rizs természetes fehérjéje, ezért úgynevezett belső ellenőrző génként használtuk. A prolamin gén kimutatása mind a 32 független rizsvonal esetében pozitív eredményt adott, ami azt jelenti, hogy a kinyert DNS megfelelő tisztaságú a transzgén kimutatására. A transzgénre végzett PCR reakcióban kapott negatív eredmény tehát valóban a transzgén hiányát jelenti. Pozitív eredményt hozott a szelekciós markergénre végzett analízis is. Valamennyi transzgénikus vonal tartalmazta a htp génről képződött 500 bp fagmentet. A Glu1D-d1 génről képződött 450 bp méretű termék nem minden htp génre pozitív növényben képződött. A vizsgált vonalak 37,5 %-a tartalmazta a DNS fragmentet, ami nem képződött a kontroll mintában (20. ábra). 20. ábra. PCR reakció a HMW-dx5 transzgénre a T0 generációs rizsnövényekre. 450 bp PC NC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 PC: pozitív kontroll, NC: negatív kontroll. 1-12: Transzgénikus vonalak.

12

A transzformált növényekben a gén jelenlétének igazolására végzett PCR reakció alapján az alkalmazott transzformációs módszer hatékonysága a tanszgénre vonatkoztatva 3%-os volt. Ez az érték közel azonos az irodalmi adatokból ismert egyszikűek biolisztikus módszerrel történő transzformációs gyakoriságával [Chen és mtsai. 1998]. A transzgént tartalmazó növények 40%-a volt fertilis. Az alacsony fertilitás oka lehet, hogy a növények hosszabb időt töltöttek a szövettenyésztési szakaszokban. Sikeres fehérje expresszió esetén az idegen fehérje jelenléte szintén hatással lehet a növények egyedfejlődésére [Dohran, 2006]. Az első generációban nevelt transzgénikus növények magjainak egy részéből utódnemzedéket neveltünk. A T1 növényekre végzett PCR reakciók eredményét a 16. táblázat tartalmazza. A T1 növények közül a #19-es vonalból 3, a #20-ból egy, a #21-ból 2, a #23-ból 5, és a # 26-os vonalból 8 növényt vizsgáltunk. A rizs prolamin gén minden minta esetében kimutatható volt a T1 generációs növényekben is. A htp génre a vizsgált minták közül négy növényre negatív eredményt kaptunk (16. táblázat, piros). A Glu1D-1d gén két minta esetében nem adott pozitív jelet a PCR reakcióban (16. táblázat, zöld jelzés). Az utódnemzedékekben is kimutatható transzgén a gén stabil öröklődését mutatja. Megfigyeltük, hogy annak ellenére, hogy a szelekciós markergén és a transzgén transzformációja azonos vektoron történt, a transzgénikus

78

növények utódnemzedékében a gének szétváltak, és külön is öröklődtek. Ennek oka a transzgénikus növények öröklődés során is bekövetkező rekombináció [Chawla és mtsai. 2006]. 16. táblázat. A T1 generációs növények PCR analízise. NÖVÉNYI MINTA JELE

T1/19-1 T1/19-2 T1/19-3 T1-20 T1-21/1 T1-21/2 T1-23/1 T1-23/2 T1-23/3 T1-23/4 23/5

PRIMEREK RP6F-R + + + + + + + + + + +

PRIM51-52

+ + + + + + + + + + +

NÖVÉNYI MINTA HTPF-R + + + + + + + + +

JELE

T1-23/6 T1-26/1 T1-26/2 26/2 26/3 T1-26/4 26/4 26/5 T1-26/6 T1-26/7 T1-26/8

PRIMEREK RP6F-R + + + + + + + + + + +

PRIM51-52 + + + + + + + + +

HTPF-R + + + + + + + + +

Rp6-F-R primerek a prolamin 6 génre, prim51-51 a GluD1-d1 gén, a HtpF-R primerek a htp génre specifikusak. Piros: htp negatív; zöld: Glu1D-1d negatív növények. A PCR reakció eredményei alapján a htp gén az utódnemzedékekben 5:1, a Glu1D-d1 gén 11: 1 arányban öröklődtek. 5.5.2.2. mRNS vizsgálat -RT-PCT A transzgének jelenléte után, a DNS molekuláról történő mRNS transzkripciót vizsgáltuk. Az alkalmazott génkonstrukció a Glu-1D gént saját promóterével tartalmazza. Az endospermium specifikus promóter a fehérje expresszió csak az endospermiumban indukálja, ezért a transzkripció is az endospermiumban zajlik. Ezért a PCR pozitív növények leveléből, gyökeréből és éretlen endospermiumából teljes RNS –t preparáltunk. Az RT-PCR reakcióban az mRNS molekuláról szintetizált cDNS –ről pim51-prim52 primerekkel egy 450 bp hosszú fragment képződött (21. ábra). 21. ábra. RT-PCR a transzgénikus rizs növényekre

450 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 1: mRNS endospermium #21, 2: mRNS endospermium #26, 3: levél cDNS, 4: gyökér sDNS, 5: cDNS endospermium #21, 6: cDNS endospermium #26. 7: pozitív kontrol, 8: cDNS negatív kontrol. 79

A transzgénikus rizs növények közül két vonalat vizsgáltunk az RT-PCR-rel. A levél és gyökér RNS mintáiról nem képződött a várt fragment. A #21 és #26-os transzgénikus vonalak endospermium RNS-ről képződött a 450 bp hosszú fragment. A vizsgált két minta közül, azonos mennyiségű cDNS esetében a #26-os vonal 500 bp nagyságú fragmentjének intenzitása erősebb volt, ami feltételezhetően az mRNS expresszió magasabb szintjét jelenti az endospermiumban. A RT- PCR reakció bizonyította a transzkripciót a Glu-1D-1d génről, illetve a HMW-Dx5 glutenin alegység fehérje endospermium specifikusságát. 5.5.3. A fehérje expresszió vizsgálata Az mRNS expresszió után a transzlációt vizsgáltuk az endospermiumban. Három független

rizsvonal tartalékfehérjéit SDS- poliakrilamid gél segítségével azonosítottuk. A kontrollként használt rizsfehérje extraktumhoz képest egy új fehérje sáv volt megfigyelhető az SDS-PAGE gélen bizonyítva, hogy a T0 növények magjukban egy extra fehérjét termelnek (22. ábra). A mintákban megjelenő fehérje elektroforetikus mobilitása lassabb, mint a HMW Dx5 alegység számított molekula tömege, bár hasonló a kontrolként használt búza megfelelő endogén fehérje mobilitásával. Az irodalmi adatokból ismert, hogy a HMW glutenin alegység fehérjék pálcika alakjuk miatt szabálytalan mobilitással rendelkeznek az SDS-PAGE gélen [Shewry és mtsai. 1992]. 22. ábra. Transzgénikus rizsek SDS-PAGE vizsgálata HMW-Dx5

Ax2 Dx5 Bx7 By9 Dy10

1 2 3 4 5 6 1: búza kontrol, 2: rizs kontrol, 3: regenerált, nem transzgénikus rizs, 4: 4-6 transzgénikus vonalak: #26, #23, #21.

A transzgénikus növények közül a #21, #23 és #26-as vonalból izolált fehérjéket vizsgáltuk. A expresszió szintjét az SDS-PAGE gél denzitometriás mérésével becsültük meg. A denzitométer alapján a #21 rizs növények nagyon alacsony szinten expresszálták az 1Dx5HMW-GS alegység fehérjét, mindösszesen az i-probanolban oldható teljes magfehérjék 0,75%-ában. A #23 és #26 vonalak ellenben magasabb expressziós szintet mutattak, számszerűen a teljes alkoholban oldható fehérjék 3,19 és 3.81%-ában.

80

5.5.3.1. Western blot analízis A transzgénikus rizs növények HMW-Dx5 glutenin alegység fehérje expresszióját western blot analízissel is vizsgáltuk. A különböző szövetekből 2% SDS és 100 mM DTT jelenlétében izolált fehérjéket a gélből történő transzfer után a membránon búza HMW glutenin poliklonális antitesttel reagáltattuk. Az antigén-antitest reakció határára megjelent sávok a fehérje expressziót igazolták. A levélből, a gyökérből izolált fehérje minták nem léptek reakcióba a specifikus antitesttel (23. ábra). 23. ábra. Western blot analízis 100 kDa

HMW-Dx5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1: molekulasúly standard (100 kDa), 2: búza endospermium, 3 negatív kontrol, 4: transzgénikus levél, 5: transzgénikus gyökér, 6-7: transzgénikus rizs; #21, 8-9: transzgénikus rizs; #26. A kísérletben búza endospermium fehérjéket használtunk pozitív, és nem transzformált rizsfehérjét negatív kontrollként. A denzitás mérés eredményeinek megfelelően a transzgénikus vonalak különbséget mutattak a membránon megjelenő sávok intenzitásában. Azonos koncentrációjú teljes fehérje esetében az expresszált HMW-Dx5 alegység fehérje a #26-os transzgénikus rizs vonalakban nagyobb expressziós szintet mutatott. Az általunk sikeresen létrehozott transzgénikus rizs megközelítően 3-4%-ban termeli a HMW Dx5 glutenin alegységfehérjét. Az expresszált fehérjének a rizstészta dagasztási paramétereire gyakorolt hatásának vizsgálatához egy arra alkalmas módszer szükséges. Az in vitro kísérletek eredményei azt bizonyították, hogy a mikro z-arm mixer rizslisztre történő alkalmazása lehetővé teszi a fehérje-összetétel módosítása után létrejövő változások követését. Mivel a búza tartalékfehérjéknek a rizsfehérje polimer mátrixba való in vitro beépítésére elvégzett kísérleteink szerint az egyéni HMW glutenin alegységfehérjék 5-%-os inkorporációja már hatással van a rizstészta dagasztási paramétereire, ezért feltételezzük, hogy a módszerünk alkalmas a transzgénikus rizsben ilyen mennyiségben expresszált fehérjék hatásának a vizsgálatára is.

81

A irodalmi összefoglalóból is ismert, hogy a rizst, mint modell- és haszonnövényt számos alkalommal használták különböző gének genetikai transzformációjára. A transzformációs kísérletek főként rovar vagy herbicid rezisztencia biztosítására, biotikus vagy abiotikus stresszel szembeni ellenállásra irányultak. Ezen túl provitamin-A bioszintézis, a keményítő bioszintézis, illetve a vas raktározása volt a genetikai transzformáció célja. Az eddigi irodalomban nem jelent meg olyan publikáció, melyben a rizs bármilyen búza tartalékfehérje (LMW, HMW glutelin, gliadin) gén sikeres rizs transzformációját bizonyítja. Nem búza tartalékfehérje gének rizsbe történő transzformációjára néhány példa a szezámmag 2S albumin tartalékfehérje génje [Lee és mtsai. 2003], napraforgómag albumin fehérjéje génje [Hagan és mtsai. 2003] vagy bab tartalékfehérje génje a rizs tápérték növelésére [Zheng és mtsai. 1995]. A munkánk során létrehozott HMW-Dx5 glutenin alegységet termelő transzgénikus rizs megfelelő modell lehet a búza vagy más gabonafélék tartalékfehérjéinek vizsgálatára. A transzgénikus rizs számos felhasználási lehetőséggel rendelkezik. A transzformáció célja lehet a genetikai sokféleség megőrzése, esetlegesen szélesítése, a növényi produktivitás fenntartható növelése, mint például a herbicid-, gomba- és rovarrezisztens genotípusok, vagy a termésstabilitás javítása hideg-, aszály- és sótűrő genotípusok létrehozása. Továbbá az egészséges táplálkozást elősegítő élelmiszer előállítása: például vitamintartalom növelése, a növényi tápanyagtranszport javítása, esszenciális aminosavak termeltetése, a bioaktív komponensek növelése. Bioenergetikai célra vagy az életminőség javítására hatékonyan felhasználható genetikailag módosított növények előállítása. A molekuláris növénynemesítés célja olyan DNS-szintű változások előidézése, melyek közvetlen és tudatos genomi szintű beavatkozással javítják a növény agronómiai teljesítményét, beltartalmi jellemzőit, vagy új, korábban nem létező tulajdonság kifejlesztését teszik lehetővé. Alkalmazásával a fenotípusosan vizsgálható tulajdonságokat nem fedik el, vagy befolyásolják a környezeti tényezők, ami állandó problémát okoz a klasszikus növénynemesítőknek. Ezáltal a molekuláris nemesítés lényegesen hatékonyabb lehet a növény- és populációszinten történő hagyományos szelekcióhoz képest, sőt klasszikus nemesítési módszerekkel meg nem valósítható genetikai változásokat lehet előidézni. A génexpreszszió szisztematikus vizsgálatának hatékonyságát növeli a microarray technológia. Meghatározhatók és nyomon követhetők lesznek az egyes folyamatokban részt vevő gének. A növényi genom mélyebb megértése részletesebb bepillantást enged meg a biokémiai folyamatokba, a fehérjék és metabolitjaik rendszerébe, azok kölcsönhatásainak megértésébe. 82

A HMW-Dx5 glutenin alegységet termelő transzgénikus rizs legfontosabb felhasználási lehetősége olyan élelmiszer előállítása, melyet a lisztérzékenységben szenvedő betegek is fogyaszthatnak. A rizs további HMW glutenin alegység génekkel történő transzformációja növelheti a rizsliszt sütőipari minőségét, mely lehetővé teheti az ún. rizskenyér létrehozását.

83

6. ÖSSZEFOGLALÓ 6.1. Rizslisztek analitikai és reológiai vizsgálata A rizs fehérje-összetétele és funkcionális tulajdonságai közötti viszony tanulmányozására 11 fajtaazonos liszt tartalékfehérje összetétel és a rizslisztből készített tészta reológiai tulajdonait vizsgáltuk. A kísérleti munka során mind a fehérjék analitikai jellemzése mind a reológiai tulajdonságok elemzésekor számos új, a rizs vizsgálata kapcsán eddig nem használt paramétert adaptáltunk illetve dolgoztunk ki, többnyire a búzakutatásban rutinszerűen alkalmazott módszerekre alapozva. A rizs alapvető tartalékfehérjéje, a globulin- alegységekből felépülő glutelin, illetve az egyéb monomer fehérjék mennyiségében nagy variabilitást tapasztaltunk. A rizs polimer illetve polimerizációra képes glutelin fehérjék a teljes tartalékfehérjéknek mintegy 70-80%-át teszik ki. A fehérjék oldhatósága illetve SE-HPLC-vel elkülöníthető frakcióinak mennyiségi viszonyai alapján két új, a funkcionális tulajdonságokkal szoros összefüggést mutató paramétert, az oldhatósági%-ot, illetve a polimer-fehérjék méreteloszlásának jellemzésére alkalmas UPP%-ot vezettünk be. A rizslisztből készíthető tészta dagasztási tulajdonságait a búzánál sikerrel alkalmazott mikro z-arm

mixeres

technikával

jellemeztük.

Munkánk

során

a

rizslisztek

dagasztási

tulajdonságainak jellemzésére bevezetünk egy ún. hidratációs paramétert, mely a tészta kialakulás előtt a hidratációs időt jelzi. A rizstészta dagasztási paraméterei és a fehérjefrakciók mennyisége közötti viszony tanulmányozása során megállapítottuk, hogy - a búzatészta tulajdonságaival analóg módon – szoros összefüggés mutatható ki a lisztben tálalható nagyméretű polimerek UPP%-ban kifejezett mennyisége és a rizstészta dagasztási tulajdonságai között. 6.2. Búza glutenin alegységfehérjék vizsgálata rizs modellben A búza tartalékfehérjék rizs modellben történő vizsgálatához kidolgoztunk egy, a vizsgálni kívánt izolált fehérjefrakcióknak a rizspolimerbe történő in vitro beépítésén alapuló módszert. A rizsliszt polimerjeinek részleges redukcióját követően, a fehérjék az oxidációs lépese során a rizsfehérje alapú polimer integráns részévé válnak, módosítva a rizstészta dagasztási tulajdonságait. A módszert addíciós kísérletekkel kiegészítve, ahol a fehérjéket egyszerűen hozzáadagoltuk az alapliszthez, mód van a fehérjék egyedi, illetve polimer-alegység formában megjelenő funkcionális tulajdonságainak összevetésére. HMW és LMW glutenin alegységek 84

beépítése a polimer szerkezetbe ellentétes irányban változtatta a dagasztási paramétereket. Az alapliszt fehérjetartalmának már 5%-ában adagolt illetve beépített fehérjék szignifikáns változást mutattak a rizstészta technológiai paramétereiben. Egyedi HMW glutenin alegységek (HMW-Bx6, Bx7 és By8) inkorporációja során mód nyílt a fehérje méretének és szerkezeti tulajdonságainak hatását összevetni a dagasztási paraméterek változásának mértékével. A vizsgált alegységfehérjék közül a Bx8-as HMW-GS fehérje beépítése eredményezte a legnagyobb változást a dagasztási paraméterek értékében. Az adagolás, illetve beépítés dagasztásra gyakorolt hátasával párhuzamosan a fehérjék polimer-kémiai tulajdonságait is követtük, megállapítva, hogy az UPP% és a dagasztási jellemzők közötti kapcsolat fontos szerepet. A különböző búza tartalékfehérje frakciók beépítésére alkalmas rekonstrukciós technika új alternatívát jelent a lazított szerkezetű rizskenyér előállítására, másrészt hasznos in vitro kísérleti bizonyíték arra, hogy az in vivo módszerekkel, genetikusan módosított, búza fehérje géneket tartalmazó rizs-minták alkalmasak lehetnek új típusú élelmiszerek előállítására. 6.3. Összefüggések a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok között Az eredmények összefoglalásaként elmondható, hogy a rizs tartalékfehérjék mennyisége, polimer/monomer aránya, az oldhatatlan polimer fehérje frakció mennyisége szerepet játszik a tészta dagasztási tulajdonságainak kialakításban. A rizs, mint modell rendszer alkalmas a búza tartalékfehérjéknek a technológiai paraméterek kialakításában betöltött szerepének a vizsgálatára. A kísérletek rendelkezésünkre álló hiánymutáns búzavonalakból izolált egyes HMW glutenin elegységek 5-10%-os beépülése a rizsfehérje mátrixba megváltoztatta annak funkcionális tulajdonságait. Ebből az következik, hogy az in vivo transzgénikus rizsben expresszált HMW glutenin alegységfehérje ilyen mértékű termelődése hatással lehet a rizs dagasztási tulajdonságaira. A dagasztási paraméterekben bekövetkező változás az általunk kidolgozott módszerrel kimutatható. 6.4. Búza tartalékfehérjék in vivo expressziója A búza tartalékfehérjék a rizstészta dagasztási paramétereire gyakorolt hatásának tanulmányozására in vivo transzgénikus rizs vonalakat hoztunk létre. A HMW-GS fehérjék közül, a minőségben betöltött meghatározó szerepe miatt, a Glu-1Dx5 HMW glutenin gént transzformáltuk sikeresen rizsbe. A transzgén stabil öröklődését és expresszióját több

85

generációban is kimutattuk. Az első generációs transzgénikus vonalakban expresszált HMW1Dx5 fehérje mennyiségét az alkohol-oldható fehérjék 3-4%-ára becsültük. A jövőben a HMW-Dx5 alegység fehérjét termelő transzgénikus növények magjaiból őrölt liszt tulajdonságait mikro z-arm mixeres kísérletekben vizsgáljuk. Ezekkel a kísérletekkel választ kaphatunk olyan kérdésre, mint az in vivo expresszált búzafehérje mennyisége megfelelő-e a rizs dagasztási tulajdonságainak megváltoztatásához, vagy a transzgén milyen kópiaszáma biztosítja a megfelelő fehérje expessziót. Az általunk létrehozott HMW Dx5 fehérjét termelő rizs csak egy előnemesítési folyamat eredménye, amiből nemesítési folyamatokban elit fajtákkal összekeresztezve megfelelő terméshozamú és rezisztenciájú fajta hozható létre. A további kísérletekben – a búzához hasonlóan- olyan vizsgálatok lennének szükségesek, melyek arra irányulnak, hogy a milyen rizsfehérje komponensek és hogyan befolyásolják a funkcionális tulajdonságokat. Célszerű lehet ezek ismerete alapján kiválasztott rizsfajtákkal végezni a transzformációt, növelve ezzel az ideális minőségű rizs elérésének lehetőségét. Ismeretes, hogy a búzatészta funkcionális tulajdonságait az is befolyásolja, hogy a lisztben milyen HMW glutenin alegységek és milyen allél variációkban vannak jelen. A rizsliszt ideális technológiai tulajdonságainak kialakításának egyik útja lehet a rizs növény több HMW glutenin

alegységet

kódoló

gén

(pl.

Dy10-Dx5

párosításban) in

vivo genetikai

transzformációja. Növelheti még a rizstészta dagasztási tulajdonságait a búza HMW és LMW glutenin alegységek egyidejű in vitro inkorporációja is. Az ilyen fehérjéket termelő rizsfajta olyan fogyasztói kör számára teremthet lehetőséget sütőipari termékek fogyasztására, akik panaszaik miatt eddig nem élvezhették. A jövőben a HMW glutenin alegységben dúsított rizs lehetséges alkalmazási területeit, illetve a célkitűzésben megfogalmazott gluten intoleranciával rendelkező betegek számára az új rizsfajta fogyasztásának lehetőségét esetleges toxikológiai vizsgálatok is igazolhatják.

86

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Nagy köszönettel tartozom szüleimnek, továbbá mindazoknak, akik hozzájárultak a dolgozatom elkészüléséhez. Köszönettel

tatozom

munkám

feltételeinek

megteremtésért

a

BME

Alkalmazott

Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszéknek, az ELTE Molekuláris Biológia és Növényélettan Tanszéknek, illetve a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológia Központnak. Köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Tömösközi Sándornak, és további témavezetőimnek Dr. Tamás Lászlónak, Dr. Békés Ferencnek és Dr. Jenes Barnabásnak a munkám során nyújtott szakmai és emberi segítségért. Köszönöm Balogh Györgyinek (ELTE), Kaszta Karolinának (MBK), Kaszta Miklósnak (MBK), Szűcsné Makay Erikának (BME) a kísérletekben nyújtott technikai segítséget. Az SE-HPLC-ás vizsgálatok gyakorlati kivitelezésében Keresztényi Eszter (MTA, Mezőgazdasági Kutatóintézet, Martonvásár) volt segítségemre. Az SE-HPLC vizsgálatok során a frakciók vizsgálatát Oscar Larroque (CSIRO, Plant Indsutry, Australia) végezte. A statisztikai számításokat Dr. Kemény Sándor (BME, Vegyipari Műveletek Tanszék) segítette. Köszönettel tartozom a Magyar-Koreai Műszaki Együttműködési Központ Alapítványnak, és Dr. Czoboly Ernőnek, az alapítvány elnökének az anyagi segítségért, ami két alkalommal is lehetővé tette, hogy hosszabb-rövidebb időt tölthessek Dél-Koreában, Professor Yang MoonSik laboratóriumában.

87

7. IRODALOMJEGYZÉK Anderson, R.P., Degano, P., Gorkin, A.J., Jewell, D.P. and Hill, A.V.S. 2000. In vivo antigen challenge in celiac disease identifies a single transglutaminase-modified peptide as the dominant gliadin T-cell epitope. Nature Medicine. 6: 337-342. Altpeter, F., Vasil, V., Srivastava, V. and Vasil, K.I. 1996. Integration and expression of the igh molecular weight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nat. Biotechnol. 14: 11551159. Alvarez, M.L., Guelman, S., Halford, N.G., Lustig, S., Reggiardo, M.J., Ryabushkima, N., Shewry, P., Stein, J. and Vallejos, R.H. 2000. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits. Theor. Appl. Genet. 100: 319-327. AOAC Official Method 979. 09. Protein In Grains. 998a. AOAC International. AOAC Official Method 920. 39. Fat (Crude) Or Ether Extract In Animal Feed. 1998b. AOAC International. AOAC Official Method 923. 03. Ash of Flour. 1998c. AOAC International. AOAC Official Method 934. 01. Moisture in Animal Feed. 1998d. AOAC International. Barcelo, P. and Lazzeri P.A. 1998. Direct gene transfer: chemical, electrical and physical methods In: Lindsey K (ed) Transgenic Plant Research (pp 1–34). Harwood Academic, The Netherlands. Baga, M., Glaze, S., Mallard, C.S. and Chobbar, R.N. 1999. A starch-branching enzyme gene in wheat produces alternatively spliced transcripts Plant Molecular Biotechnology. 40: 1019-1030. Barro, F., Rooke, L., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Lazzeri, P.A., Shewery, P.R. and Barcelo, P. 1997. Transformation of wheat with high-molecular-weight subunit genes results in improved functional properties. Nat. Biotechnol. 15: 1295-1299. Barro, F., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Ballesteros, J. and Martin, A. 2003. Functional properties of flours from filed grown transgenic wheat lines expressing the HMW glutenin subunit 1Ax1 and 1Dx5. Molecular Breeding. 12: 223-229. Barton, K.A., Binns, A.N., Matzke, A.J.M. and Chilton, M.D. 1983. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA and transmission of T-DNA to R1 progeny. Cell. 32: 1033-1043. Baxter, G., Blanchard, C. and Zhao, J. 2004. Effects of prolamin on the textural and pasting properties of rice flour and starch. Journal of Cereal Science. 40: 205-211. Bean, S.R., and Lookhart, G.L. 2000. Ultrafast capillary electrophoresis analysis of cereal storage proteins and its applications to protein characterization and cultivar differentiation. J. Agric. Food Chem. 48: 344-353. Beccari, J.B. 1745. De Frumento. De Bononiensi Scientarium et Artium. Instituto atque Academia Commentarii: Bologna. 2: 122-127. Bechtel, D.B. and Juliano, B.O. 1980. Formation of protein bodies in the starchy endosperm of rice (Orysa sativa): a reinvestigation. Annals of Botany London. 45: 503-509. Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., Hickman, D.R. and Tatham, A.S. 1993. Effects of a high Mr glutenin subunit (1Bx20) ont he dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science. 19: 3-7. Békés, F., Anderson, O., Gras, P.W., Gupta, R.B., Tam, A., Wrigley, C.W. and Apples, R. 1994. The contribution to mixing properties of 1D glutenin subunits expressed in a bacterial system. Proc.'Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering', (Eds. Henry, R., and Ronalds, J.), pp: 97-104. Békés, F. and Gras, P.W. 1994a. Effects of individual HMW glutenin subunits on mixing properties. In ’Gluten Proteins 1993’. Association of Cereal Research, Detmold, Germany. 170-179.

88

Békés, F., Gras, P.W. and Gupta, R.B. 1994b. Mixing properties as a measure of reversible reduction and oxidation of doughs. Cereal Chemistry. 71: 44-50. Békés, F., Gras, P.W. and Gupta, R.B. 1995. The effects of purified cereal polypeptides on mixing properties of dough. Pages 92-98 in: Proc. 45th Australian Cereal Chemistry Conf. Y.A. Williams and C.W. Wrigley, eds. RACI: Noth Melbourne, Australia. Békés, F., Southan, M.S., Tömösközi, S., Nanasi, J., Gras, P.W., Varga, J., McCorquodale, J. and Osborne, B.G. 2000. Comparative studies on a new micro scale laboratory mill. Proc. 49. RACI Conference, Eds.: Panozzo, J.F., Ratcliffe, M., Wootton, M., Wrigley, C.W., pp.: 483-487., RACI, Melbourne. Békés, F., Lukow, O., Uthayakumaran, S. and Mann, G. 2003. Small-scale dough testing methods. In: Shewry, P.R., Lookhart, G. (Eds.), Wheat Gluten Protein Analysis. AACC, St. Paul, USA, pp. 173–198. Bhattacharjee, P. and Kulkarni, P.R. 2000. A comparative study ont he physical characteristics and cooking quality parameters of commercial brands of Basmati rice. International Journal of Food Science and Nutrition. 51: 295-299. Bietz, J.A. and Wall, J.S. 1973. Isolation and characterization of gliadin-like subunits from glutenins. Cereal Chem. 50: 537-547. Bietz, J.A. and Wall, J.S. 1975. The effect of various extractions on the subunit composition and association of wheat glutenin. Cereal Chem. 52: 145-155. Bietz, J.A. 1986. High performance liquid chromatography of cereal proteins. Adv. Cereal Sci. Technol. 8: 105-170. Branlard, G. and Dardevet, M. 1985a. Diversity of grain proteins and bread wheat quality:1. Correlation between gliadin bands and flour quality characteristics. Journal of Cereal Science. 3: 329-343. Branlard, G. and Dardevet, M. 1985ab Diversity of grain proteins and bread wheat quality: 2. Correlation between high molecular weigh subunits of glutenin and flour quality characteristics. Journal of Cereal Science. 3: 345-354. Blecht, A.E. and Anderson, O.D. 1996. Expression of novel high-molecular-weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nat. Biotechnol. 14: 875-879. Blecht, A.E., Lin, J., Nguyen, S., Chan, R., Anderson, O.D. and Dupont, F.M. 2007. Transgenic wheats with elevated levels of Dx5 and/or Dy10 high-molecular-weight glutenin subunits yield doughs with increased mixing strength and tolerance. Journal Of Cereal Science. 45: 172-183. Bommineni, V.R. and Jauhar, P.P. 1997. An evaluation of target cells and tissues used in genetic transformation of cereals. Maydica. 42: 107-120. Brown, J.W.S. and Flavell, R.B. 1981. Fractionation of wheat gliadin and glutenin subunits by two-dimensional electrophoresis and the role of group 6 and group 2 chromosomes in gliadins synthesis. Theor. Appl. Genet. 59:349-359. Burkhardt, P.K., Beyer, P., Wünn, J., Klöti, A., Armstrong, G.A., Schledz, M., von Lintig, J.V. and Potrykus, I. 1997. Transgenic rice (Oryza sativa) endosperm expressing daffodil (Narcissus pseudonarcissus) phytoene synthase accumulates phytoene, a key intermediate of provitamin A biosynthesis. Plant J. 11: 1071-1078. Bushuk, W. 1998. Wheat breeding for end-product use. Euphytica. 100: 137-145. Bushuk, W. Interactions: The Keys To Cereal Quality, 1st ed. Hamer, R.J. and Honesey, R.C. Eds. American Association of Cereal Chemistry: St. Paul. Mn. 1998. Chapter 2. Bushuk, W. and Tkachuk, R. Eds. 1991. Gluten proteins 1990. Am. Assoc. Cereal Chemistry: St. Paul, Mn. Bushuk, W. and Zillman, R.R. 1978. Wheat cultivars identification by gliadin electropheregrams. I. Apparatus method and nomenclature. Can. J. Plant Sci. 58:505-515.

89

Butow, B.J., Tatham, A.S., Savage, A.W.J., Gilbert, S.M., Shewry, P.R., Solomon, R.G. and Békés, F. 2003a. Creating a balance – the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. Journal of Cereal Science. 38: 181-187. Butow, B.J., Ma, W., Gale, K.R., Rampling, L., Larroque, O., Morell, M.K. and Békés, F. 2003b. Molecular discrimination of Bx7 alleles demonstrates that highly expressed highmolecular weight glutenin allele has major impact on wheat flour dough strength. Theoretical and Applied Genetics. 107: 1524-1532. Cagampang, G.B., Cruz, L.J., Espiritu, S.G., Santiago, R.G., Juliano, B.O. 1966. Studies on the extraction and composition of rice proteins. Cereal Chemistry. 43: 145-155. Campabell, W.P., Wrigley, C.W., Cressey, P.J. and Slack, C.R. 1985. Statistical correlations between quality attributes and grain-protein composition for 71 hexaploid wheats use as breeding parent. Cereal Chemistry. 64: 293-299. Champagne, E.T., Bett, K.L., Vinyard, B.T., McClung, A.M., Barton, F.E., Moldenhauer, K., Linscombe, S. and McKenzie, K. 1999. Correlation between cooked rice texture and Rapid Visco Analyses measurements. Cereal Chemistry. 76 (5): 764-771. Chan, M.T., Chang, H.H., Ho, S.L., Tong, W.F. and Yu, S.M. 1993. Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric α-amylase promoter/βglucuronidase gene. Plant Mol. Biol. 22: 491-506. Chawly, R., Ariza-Nieto, M., Wilson, A.J., Moore, S.K. and Srivastava, V. 2006. Transgene expression produced by biolistic-mediated, site-specific gene integration is consistently inherited by the subsequent generations Plant Biotechnology Journal. 4: 209-218. Chen, S.H. 1991. Comparative study of pollen proteins of rice by isoelectric focusing and high performance liquid chromatography. Cereal Chemistry. 68: 91-94. Chen, C.H. and Bushuk, W. 1970. Nature of proteins in triticale and its parental species. I. Solubility characteristics and amino acid composition of endosperm proteins. Can. J. Plant Sci. 50:9-14. Chen L., Marmey P., Taylor, N.J., Brizard, J.P., Espinoza, C., D’Cruz, P., Huet, H., Zhang, S., de Krochko, A., Beachy, R.N. and Fauquet C.M. 1998. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants. Nature Biotechnol. 16: 1060-1064. Chrastil, J. 1992. Correlation between the physicochemical and functional properties of rice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 40: 1683-1686. Chrastil, J. 1994. Stickiness of oryzenin and starch mixtures of preharvest and postharvest rice grains. Journal of Agriculture Food Chemistry. 42: 2147-2151. Christou, P. 1995. Strategies for variety-independent genetic transformation of important cereals, legumes and woody species utilizing particle bombardment. Euphytica. 85: 13-27. Chu, C.C., Wang, C.C., Sun, C.S., Hsu, C., Yin, K.C. and Chu, C.Y. 1975. Established an efficient medium for anther culture of rice though competitive experiments on the nitrogen sources, Sci. Sin. 18: 659. Coa, J., Zhang, W.G., McElroy, D. and Wu, R. 1991. Assessement of rice genetic transformation techniques. In Rice Biotechnology 8Kush, G.S. and Toeissen, G. eds) IRRI, Manila, The Philippines. pp 175-198. Cornish, G.B., Békés, F., Eagles, H.A. and Payne, P.I. 2006. Chapter 8. Prediction of Dough Properties for Bread Wheats. In: Gliadin and glutenin. The unique balance of wheat quality., Eds.: Wrigley, C.W., Békés, F. and Bushuk, W. pp 243-280. AACCI Press, St Paul, Min., USA. Crossway, A., Oakes, J.V., Irvine, J.M., Ward, B., Knauf, V.C. and Shewmaker, C.K. 1986. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Gent. 202: 179-185.

90

Datta, S.K., Datta, K., Soltanifar, N., Donn, G. and Potrykus, I. 1992. Herbicide-resistant indica rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts. Plant Mol. Biol. 20: 619-629. Datta, K., Vasquez, A., Tu, J., Torrizo, L., Alam, M.F., Oliva, N., Abrigo, E., Khush, G.S. and Datta, S.K. 1998. Constitutive and tissue-specific differential expression of cryIA(b) gene in transgenic rice plants conferring resistance to insect pest. Theor. Appl. Genet. 97: 20-30. Datta, K., Velazhahan, R., Oliva, N., Ona, I., Mew, T., Khush, G.S., Muthukrishnan, S. and Datta, S.K. 1999. Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5) gene in transgenic rice plants enhances environmentally friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease. Theor. Appl. Genet. 98: 1138-1145. Davoyan, E.I. 1987. Genetic determination of process of callus formation and induction of regenerates in teh tissue culture of rice. Genetica. 23: 303-310. D’Appollonia, B.L. and Kunerth, W.H. Eds. 1984. The Farinograph handbook, AACC, St. Paul, MN, ISBN-0-913250-37-6. Dorhan, P.M. 2006. Foreign protein degradation and instability in plants and plant tissue cultures. Trends in Biotechnology. 24 (9): 426-432. D’Ovidio, R., Simeone, M., Masci, S., Porceddu, E. and Kasarda, D.D. 1995. Nucleotide sequence of a γ-type glutenin gene from a durum wheat: Correlation with a γ-type glutenin subunit from the same biotype. Cereal Chem. 72: 443-449. Durham, R.K. 1925. Effect of hydrogen preoxidase on relative viscosity measurements of wheat and flour suspensions. Cereal Chemistry. 2: 297-305. Dunn, T.S., Fitzgerald, M.A. and Batten, G.D. 2000. Apanicle culture system to manipulate protein in rice grain. In ‘11th Word Cereals and Bread Congress, Rice Satellite Symposium’.Queensland, Australia. pp 15. Ellepola, S.W., Choi, S.M., Phillips, D.L. and Ma, C.Y. 2006. Raman spectroscopic study of rice globulin. Journal of Cereal Science 43: 85-93. Ewart, J.A.D. 1972. A modified hypothesis for the structure and rheology of glutenin. J. Sci. Food Agric. 23: 687-699. Ewart, J.A.D. 1977. Re-examination of the linear glutenin hypothesis. J. Sci. Food Agric. 28:191-199. Fido, R.J., Békés, F., Gras, P. and Thatam, A.S. 1996. Effects of α−, β−, γ− and ω− gliadins on the dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science, 26: 271-277. Fido, R.J., Békés, F., Gras, P.W. and Tatham, A. 1997. The effects of added gliadin classes on the mixing properties and extension of dough. Journal of Cereal Science. 26: 271-277. Field, J.M., Shewry, P.R. and Miflin, B.J. 1983. Solubilisation and characterization of wheat gluten proteins: correlation between the amount and aggregated proteins and baking quality. Journal of the Science and Food Agriculture. 34: 370-377. Finney, K.F. 1943. Fractionating reconstituting techniques as tools in wehat flour research. Cereal Chemistry. 20: 381-390. Fitzgerald, M.A., Martin, M., Ward, R.M., Park, W.D. and Shead, H.J. 2003. Viscosity of rice flour: a rheological and biological study. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51: 2295-2299. Fromm, M., Taylor, L.P. and Walbot, V. 1985. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant-cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 5824–5828. Fromm, M.E., Morrish, F., Armstrong, C., Williams, R., Thomas, J. and Klein, T.M. 1990. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of maize plants. Bio/Technol. 8: 833–839.

91

Furukawa, S., Mizuma, T., Kiyokawa, Y., Masumura, T., Tanaka, K. and Wakai, Y. 2003. Distribution of storage proteins in low-glutenin rice seed determined using a fluorescent antibody. Journal of Bioscience and Bioeng. 96: 467-473. Gallagher, E., Gormley, T.T. and Arendt, E.K. 2004. Recent advances in the formulation of gluten-free cereal-based products. Trends in Food Science & Technology 15: 143–152. Gerrard, J.A. 2002. Protein cosslinking in food methods, consequences, applications. Trends in Food Science & Technology 13: 391-399. Gobaa, S., Kleijer, G. and Stamp, P. 2007. 2., a new high molecular weight glutenin subunit coded by Glu-A1: its predicted structure and its impact on bread-making quality Plant Breeding. 126: 1-4. Gianibelli, M.C., Larroque, O.R., MacRitchie, F. and Wrigley, C.W. 2001. Biochemical, genetic and molecular characterization of wheat endosperm proteins. Online review. AACC. Gras, P.W., Békés, F., Gupta, R.B. and MacRitchie, F. 1992. in ’Proceedings of the 24nd RACI Cereal Chemistry Conference’ (V.J. Humphrey-Taylor, ed.) RACI, Parkville, Australia. pp 171-180. Gras, P.W. and Békés, F. 1996. Small scale testing: the development of instrumentation and application as a research tool, page 506-510 in Proceedings of the International Gluten Workshop, 6th Wriegley, C.W. (ed) Royal Australian Chemical Institute, Noth Melbourne, Australia. Gras, P.W., Varga, J., Rath, C., Tömösközi, S., Fogod, D., Salgo, A. and Békés, F. 2000. Screening for improved water absorption and mixing properties using four grams of flour: A new small-scale Farinograph –type mixer. In Proceeding of 11th International Cereal and Bread Congress, Broadbeach, QLd, Australia. Gras, P.W., Anderssen, R.S., Keentok, M., Békés, F., and Apples, R. 2001. Gluten protein functionality in wheat flour processing: a review. Aust. J. Agric. Res. 52: 1311-1323. Graveland, A., Bosveld, P., Lichtendonk, W.J., Marseille, J.P., Moonen, J.H.E. and Scheepstra, A. 1985. A model for the molecular structure of glutenins from wheat flour. J. Cereal Sci. 3: 1-16. Guo, X., Huang, C., Jin, S., Liang, S., Nie, Y. and Zhang, X. 2007. Agrobacterium mediated transformation of Cry1C, Cry2C and Cry9 genes into Gossypiusm hisutum and plant regeneration. Biologia Plantarum. 51: 242-248. Gupta, R.B., Singh, N.K. and Shepherd, K.W. 1989. The cumulative effect of allelic variation in LMW and HMW glutenin subunits on physical dough properties in progeny of two bread wheats. Theor. Appl. Genet. 77: 57-64. Gupta, R.B., and MacRitchie, F. 1991. A rapid one-step one-dimensional SDS-PAGE procedure for analysis of subunit composition of glutenin in wheat. J. Cereal Sci. 14:105109. Gupta, R.B., Batey, I.L. and MacRitchie, F. 1992. Relationship between protein composition and functional properties of wheat flours. Cereal Chemistry. 69: 125-131. Gupta, R.B. and Shepherd, K.W. 1993. Production of multiple wheat rye 1RS translocation stocks and genetic analysis of LMW subunits of glutenin and gliadins in wheat using these stocks. Theor. Appl. Genet. 85: 719-728. Gupta, R.B. and MacRitchie, F. 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19: 19-29. Gupta, R.B., Popineau, Y., Lefebvre, J., Cornec, M., Lawrence, G.J. and MacRitchie, F. 1995. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. 2. changes in polymeric protein – formation and dough/gluten properties associated with the loss of low M(R) or hight M(R) glutenin subunits. Journal of Cereal Science. 21: 103-116.

92

Gurjal, H.S., Guardiola, I., Carbonell, J.V. and Rossell, C.M. 2003. Effect of cyclodextrin glycoxyl transferase on dough rheology and bread quality from rice flour. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51: 3814-3818. Gurjal, H.S. and Rossel, C.M. 2004. Improvement of breadmaking quality of rice flour by glucose oxidase. Food Research International. 37: 75-81. Hagan, N.D., Upadhyaya, N., Tabe, L.M. and Higgins, T.J.V. 2003. The redistribution of protein sulfur in transgenic rice expressing a gene for a foreign, sulfur-rich protein Plant Journal. 34:1-11. Halford, N.G., Field, J.M., Blair, H., Urwin, P., Moor, K., Robert, L., Thompson, R., Flavell, R.B., Tatham, A.S. and Shewry, P.R. 1992. Analysis of HMW glutenin subunits encoded by chromosome 1A of bread wheat (Triticum eastivum L.) indicates quantative effects on grain quality. Theor. Appl. Genet. 83: 373-379. Halick, J.V. and Kelly, V.J. 1959. Gelatinization and pasting characteristics of rice varieties as related to cooking behavior. Cereal Chemistry. 36: 91-98. Hamada, J.S. 1996. Separation and molecular mass distribution of rice proteins by sizeexclusion high-performance liquid chromatography in a dissociating buffer. Journal of Chromatography A. 734: 195-203. Hamada, J.S., Spanier, A.M., Bland, J.M. and Diak, M. 1998. Preparative separation of valueadded peptides from rice bran proteins by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 827: 319-327. Hamer, R.J. and van Vliet, T. 2000. Understanding the structure and properties of gluten: An overview. Pages 125-131. in Wheat Gluten. P.R. Shewry and A.S. Thatam. Eds. Royal Society of Chemistry: Cambrige, UK. Haraszi, R., Gras, P.W., Tömösközi, S., Salgo, A. and Békés, F. 2004. The application of a micro Z-arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chem. 81: 550-560. Harris, R.H., Sibbitt, L.D. 1942. The comparative baking qualities of HRS wheat starches and glutens as prepared by the gluten –starch blend making method. Cereal Chemistry. 19: 763-772. He, G.Y., Rooke, L., Steele, S., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Barcelo, P., Shewry, P.R. and Lazzeri, P.A. 1999. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var: durum) with high-molecular-weight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Molecular Breeding. 5: 377-386. Herberd, N.P., Bartels, D. and Thomson, R.D. 1986. DNA restrictions fragment variation int he gene family encoding HMW glutenin subunits of wheat. Biochemical Genetics. 24: 579-596. Hilhorst, R., Dunnewind, B., Orsel, R., Stegeman, P., van Vliet, T., Gruppen, H. and Schols, H.A. 1999. Baking performance, rheology, and chemical composition of wheat dough and gluten affected by xylanase and oxidative enzymes. Journal of Food Science. 64: 808-813. Hussain, A., Scanlon, M.G., Juliano, B.O. and Bushuk, W. 1989. Discrimination of rice cultivars by polyacrylamide gel electrophoresis and high liquid chromatography. Cereal Chemistry. 66: 353-356. Hussain, A., Lukow, O.M. 1997. Influence of gliadin-rich subfactions of glenlea wheat on the mixing characteristics of wehat flour. Cereal Chemistry. 74: 791-799. Izawa, T. and Shimamoto, K. 1996. Becoming a model plant: The importance of ice top lant science. Trand in Plant Scienc. 1: 95-99. Jackson, E.A., Holt, L.M. and Payne, P.I. 1983. Characterisation of high-molecular-weight gliadin and low-molecular-weight glutenin subunits of wheat endosperm by twodimensional electrophoresis and chromosomal localisation of their controlling genes. Theor. Appl. Genet.66:29-37.

93

Jong, G., Slim, T., Creve, H. 1968. Bread without gluten. Baker’s Digest. 42: 24-27. Juliano, B.O. 1972. The rice caryopsis and its composition, in Rice Chemistry and Technology, (ed D.F. Houston), Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul, MN. 16-74. Juliano, B.O. and Boulter, D. 1976. Extraction and Composition of rice endosperm glutelin. Phytochemistry. 15: 1601-1606. Juliano, B.O. 1985. Rice Chemistry and Technology, 2nd ed.; American Association of Ceral Chemists. St. Paul, NM. Juhász, A., Tamás, L., Karsai, J., Vida, L.G., Lang, L. and Bedő, Z. 2001. Identification, cloning and characterisation of a HMW glutenin gene from old Hungarain wheat variety, bankuti 1201. Euphytica. 119: 75-79. Kang, M-Y., Choi, Y.H., Choi, H.C. 1997. Effects of gums, fats and glutens adding on processing and quality of milled rice bread. Korean Journal of Food Science and Technology. 29: 700-704. Kasarda, D.D., Autran, J.C., Lew, E.J.L., Nimmo, C.C. and Shewry, R.P. 1983. N-terminal amino acid sequences of ω-gliadins and ω-secalins; Implications for the evolution of prolamin genes. Biochim. Biophys. Acta 747: 138-150. Kasarda, D.D., Okita, T.W., Bernardin, J.E., Baecker, P.A., Nimmo, C.C., Lew, E.J.L., Dietler, M.D. and Green, F. C. 1984. Nucleic (cDNA)and amino acid sequences of α-type gliadins from wheat (Triticum aestivum). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 4712-4716. Kasarda, D.D. 1989. Glutenin structure in relation to wheat quality. Pages 277-302 in: Wheat is Unique. Y. Pomeranz, ed. Am. Assoc. Cereal Chemistry: St. Paul, MN. Kim, C.Y, Quarsten, H., Bergseng, E., Khosla, C. and Sollid, L.M. 2004. Structural basis for HLA-DQ2-mediated presentation of gluten epitopes in celiac disease. PNAS 12: 4175– 4179. Klein, T.M. and Jones, T.J. 1999. Methods of genetic transformation: the gene gun In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop (pp 21–42), Kluwer Academic, London. Kohli, A., Griffiths, S., Palacios, N., Twyman, R.M., Vain, P., Laurie, D.A. and Christou, P. 1999. Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination. Plant J. 17: 591–601. Kohli, A., Twyman, R.M., Abranches, R., Wegel, E., Stoger, E. and Christou, P. 2003. Transgene integration, organization and interaction in plants Plant Molecular Biology. 52: 247-258. Köhler, P., Belitz, H.D. and Weiser, H. 1993. Disulphide bonds in wheat gluten: Further cysteine peptides from high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) subunits of glutenin and from ω-gliadins. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 196: 239-247. Komari, T. and Kubo, T. 1999. Methods of genetic transformation: Agrobacterium tumefaciens In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop (pp 43–82), Kluwer Academic, London. Komatsu, S. and Hirano, H. 1992. Rice seed globulin: a protein similar to wheat seed glutelin. Phytochemistry. 10: 3455-3459. Koprek, T., Hänsch, R., Nerlich, A., Mendel, R.R. and Schulze, J. 1996. Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue culture response. Plant Sci. 119: 79–91. Krishnan, H.B., Franceschi, V.R. and Okita, T.W. 1986. Immunochemical studies on the role of the Golgi complex in protein-body formation in rice seeds. Planta. 169: 471-80. Krishnan, H.B., White, J.A. and Pueppke, S.G. 1992. Characterization and localization of rice (Orysa sativa L.) seed globulins. Plant Science. 81: 1-11.

94

Katsube-Tanaka, T., Duldulao, J.B.A., Kimura, Y., et al. 2004. The two subfamilies of rice glutelin diffe in both primary and higher-order structures. Biochimica et Biophysica Acta Proteins and Proteomics. 1699: 95-102. Kuktaite, R., Lasson, H. and Jhonsson, E. 2004. Variation in protein composition of wheat flour and its relationship to dough mixing behavior. Journal of Cereal Science. 40: 31-39. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage. Nature. 227: 680-685. Lasztity, R. 1996. The chemistry of cereal proteins, second ed. CRC Press, Boca Raton. Lawrence, G.J. and Shepherd, K.W. 1980. Variation in glutenin protein subunits of wheat. Aust. J. Biol. Sci. 33: 221-233. Lee, Y.K., Békés, F., Gras, P., Ciaffi, M., Morell, M.K. and Appels, R. 1999a. The lowmolecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. IV. Functional properties of products from individual genes. Theor. Appl. Genet. 98: 149-155. Lee, S.H., Shon, Y.G., Lee, S.I., Kim, C.Y., Koo, J.C., Lim, C.O., Choi, Y.J., Han, C.D., Chung, C.H., Choe, Z.R. and Cho, M.J. 1999b. Cultivar variability in the Agrobacteriumrice cell interaction and plant regeneration. Physiol. Plantarum. 107: 338–345. Lee, T.T.T., Wang, M.M.C., Hou, R.C.W., Chen, L.J., Su, R.C., Wang, C.S. and Tzen, J.T.C. 2003. Enhanced metionin and cysteine levels in transgenic rice seeds by the accumulation of sesame 2S albumin. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 67: 1699-1705. Lew, E.J.L., Kuzmicky, D.D. and Kasarda, D.D. 1992. Characterization of low molecular weight glutenin subunits by reversed-phase high-performance liquid chromatography, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, and N-terminal amino acid sequencing. Cereal Chemistry. 69: 508-515. Li, X. and Okita, T.W. 1993. Accumulation of prolamins and glutelins during rice seed development: a quantitative evaluation. Plant and Cell Physiology. 34: 358-390. Li, Z., Trick, H.N. 2005. Rapid method for high-quality RNA isolation from seed endosperm containing high levels of starch. Biotechniques. 38: 872-876. Lin, Y.J. and Zhang, O.F. 2005. Optimising the tissue conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Reports. 23: 540-547. Lim, H.S., Lee, J.H., Shin, D.H., Lim, H.S. 1999. Comparation of protein extraction solutions for rice starch isolation and effects of residual protein content on starch pasting properties. Starch/Stake. 53: 14-20. Lu, J.J. and Chang, T.T. 1980. Rice is its temporal and spatial perceptivities. Page 1-74. in Rice: Production and Utilization. B.S. Luh, ed. Avi Publishing Co., Inc., Wesport, CT. 925.pp Machii, H., Mizuno, H., Hirabayashi, T., Li, H. and Hagio, T. 1998. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. 53: 67–74. MacRitchie, F. 1987. Evaluation of combinations from wheat protein fractions to dough mixing and breadmaking. Journal of Cereal Science. 6: 259-268. MacRitchie, F., Kasandra, D.D. and Kuzmicky, D.D. 1991. Characterization of wheat protein fractions differing in contributions to breadmaking quality. Cereal Chemistry. 68: 122-130. Maruta, Y., Ueki, J., Saito, H., Nitta, N. and Imaseki, H. 2001. Transgenic rice with reduced glutelin content by transformation with glutelin A antisense gene. Mol. Breed. 8: 273-284. Masci, S., Lafiandra, D., Porceddu, E., Lew, E.J.L., Tao, H.P. and Kasarda, D.D. 1993. Dglutenin subunits: N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine. Cereal Chem. 70: 581-585. Masci, S., Porceddu, E. and Lafiandra, D. 1991a. Two-dimensional electrophoresis of 1Dencoded B and D glutenin subunits in common wheats with similar omega gliadins. Biochem. Genet. 29: 403-413.

95

Masci, S., Porceddu, E., Colaprico, G. and Lafiandra, D. 1991b. Comparison of the B and D subunits of glutenin encoded at the Glu-D3 locus in two biotypes of the common wheat cultivar Newton with different technological characteristics. J. Cereal Sci. 14: 35-46. Matsuki, R., Onodera, H., Yamauchi, T. and Uchimiya, H. 1989. Tissue-specific expression of the Rolc promoter of the RI plasmid in transgenic rice plants. Mol Gen Genet. 220: 1216. Metakovsky, E.V., Novoselskaya, A.Y. and Sozinov, A.A. 1984. Genetic analysis of gliadin components in winter wheat using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Theor. Appl. Genet. 69: 31-37. McElroy, D. and Brettell, R.I.S. 1994. Foreign gene expression in transgenic cereals, Trends Biotechnol. 12: 62–68. Miller, K.A. and Hoseney, R.C. 1999. Effect of oxidation ont he dynamic rheological properties of wheat flour-water doughs. Cereal Chemistry. 76: 100-104. Minussi, R.C., Pastore, G.M. and Duran, N. 2002. Potential applications of lactase in the food industry Trends in Food Science and Technology. 13: 205-216. Molberg, O., Flaete, N.S., Jensen, T., Lundin, K.E.A., Arentz- Hansen, H., Anderson. O., Uhlen, A.K., and Sollid, L.M. 2003. Intestinal T-cell responses to high-molecular-weight glutenins in celiac disease . Gastroenterology. 125: 337-344. Momma, K., Hashimoto, W., Ozawa, S., Kawai, S., Katsube, T., Takaiwa, F., Kito, M., Utsumi, S. and Murata, K. 1999. Quality and safety evaluation of genetically engineered rice with soybean glycinin: Analyses of the grain composition and digestibility of glycinin in transgenic rice. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 314–318. Muench, D.G. and Okita, T.W. 1997. The storage proteins of rice and oat, in Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development (eds B.A. Larkins and I.K. Vsil), Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. pp 289-330. Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: 473–497. Murray, D.J., Békés, F., Gras, P.W., Copeland, L.A., Savage, A.W.J. and Tatham, A.S. 1998. Hydrogen bonding and the structure/function relationships of wheat flour gliadins. In Cereals-98-Proceedings of the 48th RACI Cereal Chemistry Conference (Eds l O’Brain, AB Blakeney, AS. Ross, CW Wirgley). pp. 12-16. (RACI: North Melbourne). Müller, S. and Wieser, H. 1995. Disulphide bonds of α-type gliadins. J. Cereal Sci. 22: 21-27. Müller, S. and Wieser, H. 1997. The location of disulphide bonds in monomeric γ-gliadins. J. Cereal Sci. 26: 169-176. Nam, L.S. and Heszky, L.E. 1986. Rice tissue culture and application to breeding 1. Introduction of high totipotent and haploid callus from the different genotypes of rice (Orysa sativa L.). Cereal Research Communication. 12: 197-203. Nishita, K.D., Roberts, R.L., Bean, M.M. 1976. Development of a yeast leavened rice bread formula. Cereal Chemistry. 53: 626-635. Nishita, K.D., Bean, M.M. 1979. Physico-chemical properties of rice in relation to rice bread. Cereal Chemistry. 56: 185-189. Ng, P.K.W., Xu, C. and Bushuk, W. 1991. Model of glutenin structure based on farinograph and electrophoretic results. Cereal Chemistry. 68: 321. Ng, P.K.W. and Bushuk, W. 1988. Statistical Relationship between high molecular weight subunits of glutenin and breadmaking quality of Canadian-grown wheats. Cereal Chemistry. 65: 408-413. Ogawa, M., Kumamaru, T., Satoh, H., Iwata, N., Omura, T., Kasai, Z. and Tanaka, K. 1987. Purification of protein body I of rice seed and its polypeptide composition. Plant Cell Physiol. 28: 1517-1527.

96

Okita, T.W., Krishnam, H.B. and Kim, W.T. 1988. Immunological relationship among the major seed proteins of cereals. Plant Science. 57: 103-111. Okuzaki, A., Shimizu, T., Kabu, K., Kawai, K. and Triyama, K. 2007. A novel mutated acetolactate synthase gene conferring specific resistance to pyrimidinyl carboxy herbicides in rice Plant Molecular Biology. 64: 219-224. Osborne, T.B. 1907. The protein of the wheat kernel. Publication No. 84.Carnegie Institute: Washington, DC. Oszvald, M., Kang, T.J., Tömösközi, S., Tamás, C., Tamás, L., Kim, T.G. and Yang, MS. 2007. Expression of a synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of E. coli heat labile enterotoxin in rice endosperm, Molecular Biotechnology. 35: 215-224. Padhye, V.W. and Salunkhe, D.K. 1979. Extraction and characterization of rice proteins. Cereal Chemistry. 56: 389-393. Pan, S.J. and Reeck, G.G. 1988. Isolation and characterization of rice alpha-globulin. Cereal Chemistry. 65: 316-319. Park SH, Pinson SRM & Smith RH (1996) T-DNA integration into genomic DNA of rice following Agrobacterium inoculation of isolated shoot apices. Plant Mol. Biol. 32: 1135– 1148. Pogna, N.E., Redaelli, R., Vaccino, P., Biancardi, A.M., Dal Belin Peruffo, A., Curioni, A., Metakovsky, E.V. and Pagliaricci, S. 1995. Production and genetic characterization of near-isogenic lines in the bread-wheat cultivar Alpe. Theor. Appl. Genet. 90:650-658. Payne, P.I. and Corfield, K.G. 1979. Subunit composition of wheat glutelin proteins isolated by gel filtration in a dissociating medium. Planta. 145: 83-88. Payne, P.I. and Lawrence, G.J. 1983. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-A1, Glu-B1, and Glu-D1 which code for the high molecular-weight subunits of glutenin in hexaploid wheat. Cereal Res. Commun. 11: 29-35. Payne, P.I., Corfield, K.G. and Blackman, J.A. 1979. Identification of high-molecular weight subunit of glutenin whose presence correlates with bread-making quality in wheats of related pedigree. Theoretical and Applied Genetics. 55: 153-159. Payne, P.I., Holt, L.M. and Law, C.N. 1981. Structural and genetic studies on the highmolecular-weight subunits of wheat glutenin. I. Allelic variation in subunits among varieties of wheat (Triticum aestivum). Theor. Appl. Genet. 60: 229-236. Payne, P.I., Holt, L.M., Jackson, E.A. and Law, C.N. 1984. Wheat storage proteins: Their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Philos. Trnas. R.Soc. lond. B.Biol. Sci. 304: 359-371. Payne, P.I. 1987. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread-making quality. Annual Review of Plant Physilolgy. 38: 141-153. Payne, P.I. and Seekings, J.A. 1996. Characterization of Galahad-6, Galahad-7 and Galahad-8, isogenic lines that contain only one HMW glutenin subunit. Pages 14-17. in: Proc.Int. Gluten Workshop, 6th, C. W.Wirgley, ed. RACI: North Melbourne, Australia. Payne, P.I. 1999. Soft-milling wheats which produce dough with low elasticity. Unilever / United States Patent 5,859,315. Pogna, N.E., Autran, J.C., Mellini, F., Lafiandra, D. and Feillet, P. 1990. Chromosome 1Bencoded gliadins and glutenin subunits in durum wheat: genetics and relationship to gluten strength. J. Cereal Sci. 11: 15-34. Pomeranz, Y. 1988. Composition and functionality of wheat flour components. Pages 219370. in: Wheat: Chemistry and Technology. Am. Assoc. Cereal Chemistry. St. Paul. MN. Potrykus, I. 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technol. 8: 535–542. Rasper, V.F. and Peterson, K.R. Eds. 1991. The Extensograph handbook, AACC, St. Paul, MN: ISBN-0-913250-72-4.

97

Rath, C.R, Gras, P.W., Wrigley, C.W. and Walker, C.E. 1990. Evaulation of dough propertries from two grams of flour using the Mixograph principle, Cereal Foods World. 35: 572. Rath, C.R., Gras, P.W., Zhen, Z., Apples, R., Békés, F. and Wrigeley, C.W. 1994. A prototype extension tester for two gram dough samples. In ‘Proc. 44th Aust. Cereal Chem. Conference RACI (eds. JF Panozzo, PG Downie). pp 122-126. Melborne. Register, J.C., Peterson, D.J., Bell, P.J., Bullock, W.P., Evans, I.J., Frame, B., Greenland, A.J., Rooke, L., Békés, F., Fido, R., Barro, F., Gras, P., Tatham, A.S., Barcelo, P., Lazzeri, P. and Shewry, PR. 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science. 30: 115-120. Rilay, A. and Hioffman, P.A. 1999. Value-enchanced crops: biotechnology’s next stage. Agricultural Outlook. Economic Research Service. Ruiz, M. and Carrillo, J.M. 1993. Linkage relationships between prolamin genes on chromosomes 1A and 1B of durum wheat. Theor. Appl. Genet. 87: 353-360. Sakamoto, A., Murata, A. and Murata, N. 1998. Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold. Plant Mol. Biol. 38: 10111019. Sanford, J.C., Smith, F.D. and Russell, J.A. 1993. Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods Enzymol. 217: 483-509. Sangtong, V., Moran, D.L., Chikwamba, R., Wang, K., Woodman-Clikeman, W., Long, M.J., Lee, M. and Scott, M.P. 2002. Expression and inheritance of the wheat Glu-1Dx5 gene in transgenic maize. Theor Appl Genet. 105: 937-945. Sapirstein, H.D. and Fu, B.X. 1996. Characterization o fan extra-strong wheat functionality of 1) gliadin- and glutenin-rich fractions, 2) total HMW and LMW subunits of glutenin assessed by reduction-oxidation. In ’Gluten ’96, Proceedings of the 6th International Gluten Workshop’, (C.W: Wrigley, ed.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne. Australia. 212-216. Sarker, S.C., Osawa, M., Takahashi, M. and Adada, K. 1986. The processing of a 57 kDa precursor peptide to subunits of rice glutelin. Plant Cell Physiol. 27: 1579-1586. Schropp, P., Belitz, H.D. and Weiser, H. 1995. Reoxidation of high molecular weight subunits of glutenin, Cereal Chem. 72: 406-410. Schropp, P. and Weiser, H. 1996. Effects of high molecular weight subunits of glutenin on the rheological properties of wheat gluten. Cereal Chemistry. 73: 410-413. Scopes, R.K., Protein purification: Principles and practice, Springer-Verlag, New York, 1982. Shan, L., Molberg, R., Parrot, I., Hausch, F., Filiz, F., Gray, M.G., Sollid, L.M. and Khosla, C. 2002. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 297: 2275-2279. Shani, N., Rosenberg, N., Kasadra, D.D. and Galili, G. 1994. Mechanisms of assemly of wheat high-molecular-weight glutenins inferred from expression of wild-type and mutant subunits in transgenic tobacco. Journal of Biological Chemsitry. 269: 8924-8930. Shewry, P.R. and Miflin, B.J. 1985. Seed storage proteins of economically important cereals. In: Pomeranz, Y. (Ed.) Advances in Cereal Science and Technology, vol. VII. AACC, Mn, USA. pp 143-162. Shewry, P.R., Halford, N.G. and Tatham, A.S. 1989. The high molecular weight subunits of wheat, barley and rye: genetics, molecular biology, chemistry and role in wheat gluten structure and functionality. In Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology. Vol. 6. Ed B.J. Miflin. Oxford University Press, Oxford. pp 163-219. Shewry, P.R. and Tatham, A.S. 1989. New light on an old technology: the structure of wheat gluten and its role in breadmaking. Outlook on Agriculture. 18: 65-71. Shewry, P.R. and Tatham, A.S. 1990. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evaluation. Biochemical Journal. 267: 1-12.

98

Shewry, P.R. and Thatam, A.S. 1997. Disulphide bonds in wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science 25: 207-227. Shewry, P.R., Halford, N.G. and Tatham, A.S. 1992. The high molecular weight subunits of wheat glutenin. Journal of Cereal Science. 15: 105-120. Shewry, P.R., Napier, J.A. and Tatham, A.S. 1995. Seed proteins-structures and biosynthesis. Plant Cell. 7: 945-956. Shewry, P.R., Miles, M.J., Thomson, N.H. and Tatham, A.S. 1997. Scanning Probe Microscopes-Application in Cereal Science. Cereal Chemistry. 74: 193-199. Shewry, P.R., Tatham, A.S. and Halford, N.G. 1999. The prolamins of the Triticeae. Pages 35-78 in: Seed Proteins. P. R. Shewry and R. Casey, eds. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T., Fujimoto, H. 1989. Fertile rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature. 338: 274-276. Shimamoto, K., Miyazaki, C., Hashimoto, H., Izawa, T., Itoh, K., Terada, R., Inagaki, Y., Iida, S. 1993. Trans-activation and stable integration of the maize transposable element Ds cotransfected with the Ac transposase gene in transgenic rice plants, Mol. Gen. Genet. 239: 354-360. Shahmuradov, I.A., Gammerman, A.J., Hancok, J.M., Bramley, P.M:, Spépvyev, V.V. 2003. PlantProm: a database of plant promoter sequences Nucleid Acid Resaerch. 31: 114-117. Sivaramakrishnan, H.P., Senge, B. and Chattopadhyay, P.K. 2004. Rheological properties of rice dough for making rice bread. Journal of Food Engineering. 62: 37-45. Shogren, M.D. and Finney, K.F. 1984. Bread-making test for 10 grams of flour. Cereal Chemistry. 61: 418-423. Singh, N.K. and MacRitchie, F. 2001. Application of polymer science to properties of gluten. J. cereal Sci, 33:231-243. Singh, N.K. and Shepherd, K.W. 1988. Linkage mapping of the genes controlling endosperm proteins in wheat. 1. Genes on the short arms of group 1 chromosomes. Theor. Appl. Genet. 66: 628-641. Singh, N.K., Donovan, G.R., MacRitchie, F. 1990. Use of sonication and size-exclusion high performance chromatography in the study of wheat proteins. I. Dissolution of total proteins in the absence of reducing agents. Cereal Chemistry. 67: 150-161. Sissons, M.J., Békés, F. and Skerritt, J.H. 1998. Isolation and functionality testing of low molecular weight glutenin subunits. Cereal Chemistry. 75: 30-36. Skerritt, J.H., Békés, F. and Murray, D. 1996. Isolation treatments of gliadin and glutenin fractions on dough mixing properties. Cereal Chem. 75. 644-649. Snow, S.D. and Brooks, J.R. 1989. Fractionation of rice glutelin polypeptides using gel filtration chromatography. Journal of Food Science. 54: 730-733. Songstad, D.D., Somers, D.A. and Griesbach, R.J. 1995. Advances in alternative DNA delivery techniques. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 40: 1–15. Stoger, E., Williams, S., Keen, D. and Christou, P. 1998. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression. Transgenic Res. 7: 463–471. Sugimoto, T., Tanaka, K., Kasai, Z. 1986. Molecular species in the protein body II (PB-II) of developing rice endosperm. Agric. Biol. Chem. 50: 3031-3035. Tamaki, M., Ebata, M., Tashiro, T. and Ishikiawa, M. 1989a. physio-ecological Studies on Quality Formation of rice Kernel I. Effects of nitrogen top-dressed at full heading time and air temperature during ripening period on quality of rice kernel. Japanese Journal of Crop Science. 58: 653-658. Tamaki, M., Ebata, M., Tashiro, T. and Ishikiawa, M. 1989b. physio-ecological Studies on Quality Formation of rice Kernel II. Changes in quality of rice kernel during grain development. Japanese Journal of Crop Science. 58: 659-663.

99

Tamás, L., Békés, F., Greenfield, J., Tatham, A.S., Gras. P.W., Shewry, P.R. and Apples, R. 1998. Heterologous expression and dough mixing studies of wild-type and mutant C hordeins Journal fo Cereal Science. 27: 15-22. Tamás, L., Gras, P.W., Solomon, R.G., Morell, M.K., Apples, R. and Békés, F. 2002. Chain extension and termination as a function of cysteine content and the length of the central repetitive domain in storage proteins Journal of Cereal Science. 36: 313-325. Tamás, C., Szucs, P., Rakszegi, M., Tamás, L. and Bedo, Z. 2004. Effect of combined changes in culture medium and incubation conditions on the regeneration from immature embryos of elite varieties of winter wheat Plant Cell Tissue and Organ Culture. 79: 39-44. Tamás, L. and Shewry, P.R. 2006. Heterologous expression and protein engineering of wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science. 43: 259-274. Tanaka, K., Sugimoto, T., Ogawa, M. and Kasai, Z. 1980. Isolation and characterization of two types of protein bodies in the rice endosperm, Agric. Biol. Chem. 44: 1633-1639. Tao, H.P. and Kasarda, D.D. 1989. Two-dimensional gel mapping and N-terminal sequencing of LMW-glutenin subunits. J. Exp. Bot. 40: 1015-1020. Tatham, A.S. and Shewry, P.R. 1985. The conformation of wheat gluten proteins. The secondary structures and thermal stabilities of alpha-, beta-, gamma- and omega- gliadins. J. Cereal Sci. 3: 103-113. Tatham, A.S., Field, J.M., Smith, J.S. and Shewry, P.R. 1987. The conformation of wheat gluten proteins. II. Aggregated gliadins and low molecular weight subunits of glutenin. J. Cereal Sci. 5: 203-214. Tatham, A.S., Masson, P. and Popineau, Y. 1990b. Conformational studies of peptides derived by enzymatic hydrolysis of a γ-type gliadin. J. Cereal Sci. 11:1-13. Tatham, A.S. and Shewry, P.R. 1995. The S-poor prolamins of wheat, barley and rye. J. Cereal Sci. 22: 1-16. Tecson, E.M.S., Esmanan, B.V., Lontok, L.P. 1978. Studies on the extraction and composition of rice endosperm glutelin and prolamin. Cereal Chemistry. 48: 181-186. Thompson, S., Bishop, D.H.L., Tatham, A.S. and Shewry, P.R. 1994. Exploring disulphide bond formation in a low molecular weight subunit of glutenin using a baculovius expression system. Pages 345-355 in: Gluten Proteins 1993. Association of Cereal Research: Detmold, Germany.20 Thomson, N.H., Miles, M.J., Tatham, A.S. and Shewry, P.R. 1992. Molecular images of cereal proteins by STM. Ultramicroscopy 42- 44:1118-1122. Tömösközi, S., Varga, J., Gras, P.W., Rath, C., Nánási, J., Fogor, D., Békés, F. and Salgó, A. 2000a. Quality test of wheat using a new small-scale Z-arm mixer, in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN 0-85404-865-0, Univ. of Bristol, UK. Tömösközi, S., Varga, J., Gras, P.W., Rath, C., Salgó, A., Nánási, J., Fogor, D. and Békés, F. 2000b. Scale down possibilities in development of dough testing methods. in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN 0-85404-865-0, Univ. of Bristol, UK. Tulecke, W.R. 1953. The pollen of Ginko biloba. In vitro culture and tissue formation. Am. J. Bot. 44: 602-608. Tyagi, A.K. and Mohanty, A. 2000. Rice transformation for crop improvement and functional genomics. Review. Plant Science. 158 :1-18. Uchimiya, T., Fushimi, H., Hasimoto, H., Harada, K., Syono, Y. and Sugawara. 1986. Expression of a foreign gene in callus derived from DNA-treated protoplasts of rice (Oryza sativa L.), Mol Gen Genet. 204: 204-207. Udaka, J., Koga, T., Tsuji, H., Kimoto, M. and Takumi, K. 2000. Efficient extraction and some properties of storage proteins (prolamin and glutelin) in ancient rice cultivars. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 46: 84-90.

100

Uthayakumaran, S., Békés, F. and Gras, P.W. 1997. Effect of varying protein content and gliadin to glutenin ratio on the functional properties of wheat dough. In ’Proceedings of the 47th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia. 212-216. Uthayakumaran, S., Gras, P.W. and Békés, F. 1998. A systematic study of the wheat storage proteins and their functionality. In ’Proceedings of the 48th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia. 150-155. Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoddard, F.L. and Békés, F. 1999. Effect of varying protein content and glutenin-to-gliadin ratio on the functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry. 76: 389-394. Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoodard, F.L. and Békés, F. 2000. Optimized methods for incorporating glutenin subunits into wheat dough for extension and beaking studies. Cereal Chemistry. 77: 731-736. Uthayakumaran, S., Tömösközi, S., Savage, A.W.J., Tatham, A., Gianibelli, M.C., Stoddard, F.L. and Békés, F. 2001. Effects of gliadin fractions on the functional properties of wheat dough depend on molecular size and hydrophobicity. Cereal Chem. 78: 138-141. Utsumi, S. 1992. Plant food protein engineering. In J.E. Kinsella (Ed.) Advances in Food and Nutrition Research, vol 36, Academic Press. San Diego, CA. pp 89-208. Van Der Borght, A., Vandeputte, E., Derycke, V., Brijs, K., Daenen, G. and Delcour, J.A. 2006. Extractability and chromatographic separation of rice endosperm proteins. Journal of Cereal Science. 44: 68-74. Vasil, V. and Vasil, I.K. 1981. Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of pearl millet (Pennisetum americanum). Ann. Bot. 47: 669-678. Vasil, I.K. 1987. Developing cell and tissue culture systems for the improvement of cereal and grass crops. J. Plant Physiol. 128: 193–197. Vasil, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E. and Vasil, I.K. 1992. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technol. 10: 667–674. Vemulapalli, V., Miller, K.A., Hoseney, R.C. 1998. Glucose oxidase in breadmaking system. Cereal Chemistry. 75: 439-442. Veraverbeke, W.S., Verbruggen, I.M. and Delcour, J.A. 1998. Effects of increased high molecular weight glutenin subunits content of flour on dough mixing behaviour and breadmaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46: 4830-4835. Verbuggen, I.M., Veraverbeke, W.S, Vandamme, A. and Delour, J.A. 1998. Simultaneous isolation of wheat high molecular weight and low molecular weight glutenin subunits Journal of Cereal Science. 28: 25-32. Waines, J.G. and Payne, P.I. 1987. Electrophoretic analysis of the high molecular- weight glutenin subunits of Triticum monococcum, T. urartu, and the A genome of bread wheat (T. aestivum). Theor. Appl. Genet. 74: 71-76. Wang, Y.C., Klein, T.M., Fromm, M., Cao, J., Sanford, J.C. and Wu, R. 1988. Transient expression of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bombardment. Plant. Mol. Biol. 11: 433-439. Weegels, P.L., Marseille, J.P., Bosveld, P. and Hamer, R.J. l994. Large-scale separation of gliadins and their bread-making quality. Journal of Cereal Science. 20: 253-264. Wen, T.N. and Luthe, D.S., 1985. Biochemical characterization of rice gluten. Plant Physiology. 78: 172-177. Werner, W.E., Adalsteins, A.E. and Kasarda, D.D. 1992. Composition of high molecularweight glutenin subunit dimmers formed by partial reduction of residue glutenin. Cereal Chemistry. 69: 535.

101

Wieser, H., Seilmeier, W. and Kieffer, R. 1994. Relationship between the amount of gluten protein on rheological properties of different wheat cultivars. Pages 141-150. in: Gluten prteins 1993. Assoc. Cereal Res.:Detmold, Germany. Wieser, H., Bushuk. W. and MacRitchie. 2006. Gluten: A Balance of Gliadin and Glutenin. In Wrigley, C.W., Békés, F. & Bushuk, W. (Eds.) “Gliadin and Glutenin: The Unique Balance of Wheat Quality”, AACC. Press, St Paul, USA, pp. 213-240. Wieser, H. 2007. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiology. 24: 115-119. Wrigley, C.W., Robinson, P.J. and Williams, W.T. 1982. Association between individual gliadin proteins and quality, agronomic and morphological attributes of wheat cultivars. Australian Journal of Agricultural Research. 33: 409-418. Wrigley, C.W. 1996. Giant proteins with flour power. Nature 381: 738-739. Wu, R. 1989. Methods for transforming plant cells. In: Plant Biotechnology (Kung, S.D and Arntzen C.J eds.) Butterworths, MA. pp 35-51. Yamagata, H., Sugimoto, T., Tanaka, K. and Kasai, Z. 1982. Biosynthesis of storage proteins in developing rice seeds, Plant Physiol. 70: 1094-1100. Zarins, Z. and Chrastil, J. 1992. Separation and purification of rice oryzenin subunits by anion-exchange chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 40: 15991601. Zhang, W. and Wu, R. 1988. Efficient plant regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign genes in the plants. Theor Appl Genet. 76: 835-840. Zhao, W.M., Gatehouse, J.A. and Bouler, D. 1983. The purification and partial amino acid sequence of a polypeptide from the glutelin fraction of rice grains; homology to pea legume. FEBS Lett. 162: 62-102. Zheng, Z.W., Shumi, K., Tanaka, K. and Murai, N. 1995. The bean seed storage protein betaphaseolin is synthesized, processed and accumulated in the vacuolar type-II protein bodies of transgenic rice endosperm. Plant Physiology. 109: 777-786.

102

8. FÜGGELÉK F1. táblázat:A szövettenyésztésben alkalmazott táptalajok összetétele N6CI N6 makro (Duchefa) N6 vitamin (Duchefa) Szacharóz 2,4-D (2,5 mg/ml) Kitináz (20 mg/ml) Gerlite/agar pH N6CO= N6CI + Glülóz pH N6SEh=N6CI+ Hygromycin (50mg/ml) MS MS makro (Duchefa) MS vitamin (Duchefa) Szacharóz Kazein-hidrát BAP (2 mg/ml) NAA (2 mg/ml) Gerlite/agar pH MSR MS makro (Duchefa) MS vitamin (Duchefa) Szacharóz Gerlite/agar pH

4,263 g 1 ml 30g 4 ml 400µl 3g 5.8 30g 5.2 1 ml 4,426 g 1 ml 30g 2g 4 ml 2 ml 8g 5.8 4,426 g 1 ml 30g 8g 5.8

103

F2. táblázat: Rizslisztek brutto beltartalmi összetétele

VIETNÁMI KÉMIA KUNSÁGI „A-RIZS” JANKA M-60 BIORYSA DÁMA SANDORA DOONGARA ILLADONG KYEEMA REIZIQ LANGI BROWN

NEDVESSÉG

FEHÉRJÉK (%)

ZSÍR (%)

HAMU (%)

(%) 14,2 13,3 13,1 14,3 11.5 11,3 11,1 10,9 10,8 12,1 12,5 11,9 11,8 12,1 13,1

7,37 6,95 6,52 6,54 5,2 5,6 6,6 4,7 5,2 7,1 6,1 6,5 6,6 7,6 7,7

0.58 0.08 0.25 0.49 0,60 0,48 0,36 0,57 0,51 0,23 0,34 0,25 0,41 0,51 0,67

0.25 0.08 0.45 0.37 0,34 0,51 0,42 0,38 0,24 0,28 0,31 0,15 0,27 0,17 0,64

104

F3. táblázat: ANOVA vizsgálat az SE-HPC frakciók görbe alatti területének étékeire SZABADSÁGI FOKOK OLDHATÓ FRAKCIÓ I TERÜLET OLDHATÓ FRAKCIÓ II TERÜLET OLDHATÓ FRAKCIÓ III TERÜLET OLDHATÓ FRAKCIÓ IV TERÜLET OLDHATÓ TELJES TERÜLET OLDHATÓ FRAKCIÓ I % OLDHATÓ FRAKCIÓ II % OLDHATÓ FRAKCIÓ III % OLDHATÓ FRAKCIÓ IV %

OLDHATÓ FRAKCIÓ I TERÜLET SS 11 3,407682E+10 3,117038E+10 1,250985E+11 2,047401E+11

MS

F

P

3,097893E+09 30,4090 0,000000 2,833671E+09 12,3910 0,000064 1,137259E+10 113,4008 0,000000 1,861273E+10 6,8557 0,001207

9,235553E+11 8,395957E+10 34,3309 0,000000 386,93 26,720 276,35 324,72

35,18 2,429 25,12 29,52

OLDHATATLAN FRAKCIÓ I TERÜLET OLDHATATLAN FRAKCIÓ II TERÜLET OLDHATLAN FRAKCIÓ III TERÜLET OLDHATLAN FRAKCIÓ IV TERÜLET

6,521363E+10 3,315383E+10 9,638190E+10 6,005322E+10

OLDHATATLAN TELJES TERÜLET

3,974162E+11 3,612875E+10

7,7063 0,6187 6,9199 1,5344

0,000694 0,782542 0,001155 0,236414

5,928512E+09 20,4800 0,000004 3,013985E+09 2,9169 0,039470 8,761991E+09 17,2531 0,000011 5,459384E+09 17,8293 0,000009 9,5082

0,000248

902,02 494,608 901,18 352,175

82,00 44,964 81,93 32,016

9,6441 5,8174 63,6633 60,6237

0,000231 0,002555 0,000000 0,000000

TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ I TEÜLET TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ II TEÜLET TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ III TEÜLET TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ IV TEÜLET

9,990470E+10 1,143119E+11 3,818294E+11 4,424509E+11

9,082246E+09 1,039199E+10 3,471176E+10 4,022281E+10

22,20 13,154 64,68 10,323

0,000003 0,000047 0,000000 0,000164

TELJES FEHÉRJE TELJES TEÜLET

2,031845E+12 1,847132E+11

20,692

0,000004

OLDHATATLAN FRAKCIÓ I % OLDHATATLAN FRAKCIÓ II % OLDHATLAN FRAKCIÓ III % OLDHATLAN FRAKCIÓ IV %

TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ I % TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ II % TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ III % TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ IV %

556,11 476,146 513,22 579,04

50,56 43,286 46,66 52,64

12,762 37,896 34,95 9,912

0,000055 0,000000 0,000000 0,000201

UPP OLDHATÓSÁGI %

873,21 490,57

79,38 44,60

30,07 17,01

0,000001 0,000012

105

F4. táblázat: A független változó ( adagolt fehérje mennyiségének) hatása a mikro z-arm mixeren mért tészta funkcionális paramétereire az addíció során (*:p<0,05).

PR MENNYISÉG ERROR DDT MENNYISÉG ERROR BD MENNYISÉG ERROR ST MENNYISÉG ERROR

SS

SZABADSÁGI FOKOK

MS

F

P

21231404 216 33 460531,6 9172,4 4639,0 809402,5 31531,2 1934,5 5569,600 120,429 3,000

1 3 3 1 3 3 1 3 3 1 3 3

21231404 72 11 460531,6 3057,5 1546,3 809402,5 10510,4 644,8 5569,600 40,143 1,000

1959822 7

0,000* 0,076

297,8217 1,9772

0,000* 0,2948

1255,212 16,299

0,000* 0,0233

5569,600 40,143

0,000* 0,0063

F5. táblázat: A független változó ( adagolt fehérje mennyiségének) hatása a mikro z-arm mixeren mért tészta funkcionális paramétereire az inkorporáció során (*p<0,05).

PR MENNYISÉG ERROR DDT MENNYISÉG ERROR BD MENNYISÉG ERROR ST MENNYISÉG ERROR WILKS WILKS

SS

SZABADSÁGI FOKOK

MS

F

P

27418500 26975 60716 595332,6 6212,0 2656,1 920202,2 31931,0 5118,1 9173,878 590,417 147,250 0,000329 0,048137

1 3 8 1 3 8 1 3 8 1 3 8 4 12

27418500 8992 7590 595332,6 2070,7 332,0 920202,2 10643,7 639,8 9173,878 196,806 18,406 3799,514 2,420

3612,686 1,185

0,000* 0,374961

1793,137 6,237

0,000* 0,017000

1438,364 16,637

0,000* 0,000845

498,4110 10,6923

0,000* 0,003581

5,00000 13,52026

0,000* 0,061133

106

107

F6. táblázat: SE-HPCL görbe alatti területei az a HMW/LMW-GS fehérjék adagolása után

OLDHATÓ FRAKCIÓ I OLDHATÓ FRAKCIÓ II OLDHATÓ FRAKCIÓ III OLDHATÓ TELJES OLDHATATLAN FRAKCIÓ I TERÜLET OLDHATATLAN FRAKCIÓ II TERÜLET OLDHATLAN FRAKCIÓ III OLDHATATLAN TELJES TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ I TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ II TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ III

TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ TELJES

ADDADD-HMWHMW-5% 10% 462919 456725,5 342695 328453 353565 333634,5 1159179 1118813

ADD-HMW-

ADD-LMW-

ADD-LMW-

ADD-LMW-

20% 433189,5 299242 194334,5 926766

5% 414017 324462 352707 1091186

10% 453822 323106 314190 1091118

20% 454238 343696,5 427287 1225221,5

ADD-G-5%

452723 346744 342421 1141888

137879,5

119181,5

164121

145205,5

143610

129313

193941

128524,5 54496,5 320900,5 600798,5 471219,5 408061,5 1480079,5

121624,5 35606,5 276412,5 575907 450077,5 369241 1395225,5

124507 46916 335544 597310,5 423749 241250,5 1262310

129986 73099,5 348291 559222,5 454448 425806,5 1439477

88490,5 65552,5 297653 597432 411596,5 379742,5 1388771

168886,5 107096 405295,5 583551 512583 534383 1630517

135542,5 62822 392305,5 646664 482286,5 405243 1534193,5

108

F7. táblázat: SE-HPCL görbe alatti területei az a HMW/LMW-GS fehérjék inkorporálása után

OLDHATÓ FRAKCIÓ I OLDHATÓ FRAKCIÓ II OLDHATÓ FRAKCIÓ III OLDHATÓ TELJES OLDHATATLAN FRAKCIÓ I TERÜLET OLDHATATLAN FRAKCIÓ II TERÜLET OLDHATLAN FRAKCIÓ III OLDHATATLAN TELJES

TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ I TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ II TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ III TELJES FEHÉRJE FRAKCIÓ TELJES

INC-HMW-

INC-HMW-

INC-HMW-

INC-LMW-

INC-LMW-

INC-LMW-

INC-G6-

INC-G6-

5% 417605 301298,5 306546,5 1025450 179549

10% 314821 219998,5 157033 691852,5 184874

20% 415364 309562 328253,5 1053179,5 168730

5% 398250,5 333997 316417 1048664,5 136261,5

5% 371380 287009,5 335961 994350,5 178801,5

20% 412215,5 278698 307056,5 997970 146561

5% 411235 343524,5 339381 1094140,5 151217

10% 399115,5 316084 326487,5 1041687 177126,5

142005 61591,5 383145,5 298577 221651,75 184069 704297,75

134580 39005 358459 499695 354578,5 196038 1050311,5

104802 15759 289291 584094 414364 344012,5 1342470,5

103242 52632,5 292136 534512 437239 369049,5 1340800,5

106080 21929 306810,5 550181,5 393089,5 357890 1301161

190616 125006 462183 558776,5 469314 432062,5 1460153

136845 52417 340479 562452 480369,5 391798 1434619,5

138124,5 60589,5 375840,5 576242 454208,5 387077 1417527,5

109

110

F2. ábra. Cluster analízis: Rizslisztek kapcsolata az SE-HPLC fehérjefrakciók alapján. (A) ’oldható’ frakciók; (B) ’oldhatatlan’ frakciók; (C)’ teljes fehérje frakciók A

B

C

D

PhD értekezés 2007

111

F1. ábra. Rizslisztek Farinográffal készített dagasztási görbéi

PhD értekezés 2007

112

F5. ábra. Egyéni HMW-GS (G6, G7, G8) fehérjefrakciók inkorporációja rizstésztába

PhD értekezés 2007

113

F3. ábra. Glutenin alegységfehérjék (HMW-GS és LMW-GS) addíciója rizslisztbe

PhD értekezés 2007

114

F4. ábra. Glutenin alegységfehérjék (HMW-GS és LMW-GS) inkorporációja rizslisztbe

PhD értekezés 2007

115