A PROTOKLOROFILLID FORMÁK SZERKEZETE, IN VIVO ÉS IN VITRO EGYMÁSBA ALAKULÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI ÉS HULLÁMHOSSZFÜGGŐ FOTOKÉMIAI REAKCIÓI

A PROTOKLOROFILLID FORMÁK SZERKEZETE, IN VIVO ÉS IN VITRO EGYMÁSBA ALAKULÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI ÉS HULLÁMHOSSZFÜGGŐ FOTOKÉMIAI REAKCIÓI Doktori Értekezés

Készítette: Kósa Annamária

Témavezető: Dr. Böddi Béla tanszékvezető egyetemi tanár az MTA doktora

ELTE Biológia Doktori Iskola Vezetője: Dr. Erdei Anna Kísérletes Növénybiológia Doktori Program Programvezető: Dr. Szigeti Zoltán ELTE Növényszervezettani Tanszék Budapest 2010

Tartalomjegyzék A gyakran használt rövidítések jegyzéke .……………………………..……..……..4 1. Bevezetés ……………………………………………………………………...…...5 2. Irodalmi áttekintés…………………………………………………….…….……7 2.1.A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim szerkezete és működése…………..…..7 2.2. A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált zárvatermő csíranövények leveleiben………….…………………………………………………………12 2.2.a A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai levelekben………………………………………………………………………………………....12 2.2.b A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása levelekben…………………………..…17

2.3. A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált borsó csíranövény epikotiljában………………………………………………………………………………..…21 2.3.a A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai borsó epikotilban………………………………………………………………………………………..…….21 2.3.b A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása borsó epikotilban……...……………....24 2.3.c Klorofill típusú pigmentek, mint fotodegradációs folyamatok szenzibilizátorai………..……26

2.4. Az etioplasztiszfejlődést befolyásoló külső tényezők……...…………...……………………27 2.4.a A citokinin hatása etiolált növények zöldülésre……………………………………..….….…...28 2.4.b A nitrogénhiány hatásai a plasztiszok ultrastruktúrájára……………….………………….…29

3. Célkitűzések………………………………………………………………….…….31 4. Anyagok és módszerek………………………………………………….…….…..34 4.1. Növényi anyagok………………………………………………………………………….…34 4.2. Homogenátum készítése borsó epikotiljából és leveléből, és a homogenátumokkal végzett kísérletek…………………………………………………………………………..…35 4.3. Borsó hajtástenyészet…………………………………………………………………….…37 4.4. Hidrogén-peroxid és szuperoxid anion kimutatása specifikus jelölőfestékekkel és borsó epikotilok kezelése exogén hidrogén-peroxiddal…………………………………....37 4.5. Pigmentkivonás………………………………………………………………………….….38 4.6. Megvilágítás………………………………………………………………………………....39 4.7. Fluoreszcencia spektroszkópia………………………………………………………….…41 4.8. Számítógépes spektrumanalízis……………………………………………….……….…..42 4.9. Elektronmikroszkópia………………………………………………………………….…..42

1

5. Eredmények………………………………………………………………………43 5.1. Az etiolált borsó epikotil fluoreszcencia emissziós sajátságai…………….……….……...43 5.1.a A legfelső, középső és legalsó epikotil szegmensek összehasonlítása…….…………………...43 5.1.b A 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok sávarányainak változása az epikotilok korával…………………………………………………………………………………………..…..45

5.2. A 636 nm-es emissziós maximumú protoklorofillid forma átalakulása megvilágítás hatására borsó epikotilban……………………………………………………………...…..46 5.2.a Fehér fényű felvillanásos megvilágítás hatása……….………………………………….……46 5.2.b Folytonos, kis intenzitású fehér fény hatása…………………………………………………48 5.2.c 632.8 nm-es lézerfény hatása……………………………………………………………....….49

5.3 Etiolált levelek és izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek átalakulása 632.8 és 654 nm-es lézerfény hatására………………………………………………….…..52 5.3.a Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekben….…….…..52 5.3.b Etiolált búza levelek megvilágítása lézer flash-ekkel…………………………………..…..54 5.3.c Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekből izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek fototranszformációjára……………57 5.3.d Búza és borsó levél összehasonlítása………………………………………………………..58

5.4 A 636 nm-es protoklorofillid komplex in vitro aggregáltatása etilált borsó epikotilokban………………………………………………………………………….…....60 5.4.a Fagyasztás-felmelegítés ciklusok hatása az epikotilok fluoreszcencia emissziójára és etioplasztiszainak ultrastruktúrájára……………………………………………………….60 5.4.b Epikotil homogenátumok készítése glicerint és szacharózt tartalmazó közegben…….….62 5.4.c Az epikotilok pklid komplexeinek arányváltozásai a homogenizálás hatására……….…..66 5.4.d A homogenizáló közeg összetételének hatása a P655-re……………………………………68 5.4.e A homogenátumban kialakult P655 jellemzése……………………………………………..68 5.4.f Az ATP hatása a P655 keletkezésére…………………………………………………………71 5.4.g Fagyasztott-felmelegített epikotil P655 komplexének regenerálása homogenizálással…..72

5.5 Az etiolált borsó epikotilok levelekéhez képest nagyobb fényérzékenységének vizsgálata………………………………………………………………………………..….74 5.5.a Etiolált borsó csíranövények természetes fényre helyezése után bekövetkező szemmel látható változások………………………………………………………………………….....75 5.5.b A keletkező reaktív oxigénformák és szöveti lokalizációjuk……………………………....75 5.5.c A pklid-ek teljes kifehéredése és regenerációja……………………………..…………..…..78

5.6 A protoklorofillid formák arányainak megváltoztatása………………………………...80 5.6.a Exogén citokinin hatása etiolált szervtenyészetek spektroszkópiai tulajdonságaira és etioplasztiszainak ultrastrukturájára………………………………………………………80 5.6.b Különböző mértékű nitrogénhiány hatása szervtenyészetben fejlődött borsó szárak etioplasztiszainak kialakulására…………………………………………………………….83 5.6.b.1 A különböző nitrogéntartalmú táptalajokon fejlődött borsó növénykék morfológiai tulajdonságai……………………………………………………………………………..84 5.6.b.2 A különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon fejlődött borsó növénykék szárának összehasonlítása………………………………………………………………..84

2

6. Az eredmények megvitatása………………………………………………88 6.1. Az egyes pklid komplexek variabilitása borsó epikotilokban…………………………..88 6.2. A borsó epikotil 636 nm-nél emittáló pklid formájának egy része monomer pklid-PORNADPH hármas komplex…………………………………………………………………89 6.2.a A P636 flash-fotoaktivitása………………………………….……………………………….89 6.2.b A P636 mesterséges aggregáltatása……….…………….…………………………………..93 6.2.c A P655 re-aggregációja P636-ból……………………………………………………………99

6.3. A 655 nm-nél emittáló pklid komplex megvilágításával közvetlenül lehet 676 nm-en emittáló klid vagy kl formát előállítani………………………………………………….101 6.4. A nem közvetlenül átalakuló monomer pklid-ek élettani szerepe……………………...104 6.4.a A nem flash-fotoaktív monomer pklid-ek fotooxidációs, fotodestrukciós folyamatok fotoszenzibilizátorai………………………………………………………………………….104 6.4.b Kis fényintenzitáson történő zöldülés……………………………………………………….106

6.5. A teljes bleachelés utáni regeneráció………………………………..……………………107 6.6 A pklid komplexek arányait befolyásoló tényezők a növénynevelés során……………..109 6.6.a A szervtenyészetben fejlődött etiolált borsó szárak és az etiolált epikotil összehasonlítása……………………………………………………………………………...109 6.6.b Az exogén citokinin hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira………………………………………….110 6.6.c A nitrogén hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira………………………………………………………………..111

7. Következtetések……………………………………………………………113 8.A Összefoglalás……………………………………………………………..118 8.B Summary…………………………………………………………………119 9. Irodalomjegyzék…………………………………………………………...120 10. Köszönetnyilvánítás……………………………………………………...146 11. Függelék…………………………………………………………………..147

3

A gyakran használt rövidítések jegyzéke BAP

benzil-amino purin

Cxxx

klorofillid komplex, melynek fluoreszcencia emisszós maximuma xxx nm-nél van

DAB

diaminobenzidin

kl

klorofill

klid

klorofillid

NBT

nitrobluetetrazolium

PFD

foton flux denzitás

pkl

protoklorofill

pklid

protoklorofillid

PLT

prolamelláris test

POR

fénytől függő NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz (EC 1.3.1.33)

PT

protilakoid

Pxxx

protoklorofillid komplex, melynek fluoreszcencia emisszós maximuma xxx nm-nél van

ROS

reaktív oxigén fajták

4

1. Bevezetés

A klorofillok alapvető szerepet játszanak a fényenergia kémiai energiává történő átalakításában a fotoautotróf szervezetekben. Az élő szervezetekben a klorofillok pigmentprotein komplexeket alkotnak, amelyek a kloroplasztiszokban fotokémiai rendszerekben lokalizáltak. A fotoszintézis fotokémiai reakcióihoz kapcsoltan a klorofillok egy része irreverzibilisen fotooxidálódik/degradálódik, ezért a növények anyagcseréje szempontjából alapvetően fontos, hogy a klorofill bioszintézise pótolja a lebomló molekulákat. A klorofill bioszintézis kulcslépése a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim által katalizált protoklorofillid - klorofillid átalakulás. Ez a redukciós lépés zárvatermő növényekben csak fény hatására megy végbe. Ezért a sötétben nevelt zárvatermő csíranövényekben protoklorofillid halmozódik fel, kloroplasztiszok helyett pedig etioplasztiszok fejlődnek. Az etioplasztiszok belső membránrendszere szabályos szerkezetű prolamelláris testekből és kevésbé rendezett protilakoidokból áll. A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim részt vesz a prolamelláris testek kialakításában. In vivo körülmények között a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim, a NADPH koenzim és a protoklorofillid hármas komplexeket alkot. Ez a hármas komplex képezhet monomer egységet vagy dimerré, illeve oligomerré aggregálódhat úgy, hogy ennek következtében a protoklorofillidek π-elektronfelhői is kölcsönhatásba kerülhetnek. Ezért spektroszkópiai módszerekkel jól elkülöníthetőek. Ezekről az aggregált állapotú formákról sok információ van a szakirodalomban. Egyértelműen bizonyították róluk, hogy ms-os időtartamú felvillanásos megvilágításra a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim egységek aktív centrumában kötött protoklorofillidek klorofillidekké redukálódnak. Számos olyan kérdés tisztázatlan azonban, mint például az előforduló protoklorofillid komplexek pontos száma vagy aggregációs állapota, illetve az ezeket befolyásoló faktorok. A monomer protoklorofillidet tartalmazó formák (amelyekről kiderült, hogy természetes fényviszonyok között olyan növényi szövetekben is előfordulnak, amelyek más szövetek által leárnyékolva fejlődnek) szerkezetéről, zöldülésben való szerepéről és fotoaktivitásáról pedig csak feltételezések vannak az irodalomban. Munkánk során etiolált szárakban és levelekben in vivo és in vitro vizsgáltuk a protoklorofillid komplexek fotokémiai aktivitását, egymásba

5

történő átalakulásuk lehetőségeit, és a nevelési körülmények hatását a különböző komplexek arányaira. Munkánk során 632.8 nm-es He-Ne lézerfénnyel és 654 nm-es lézerdióda fénnyel, a megvilágítás idejét és foton flux denzitás értékét, valamint a minta hőmérsékletét változtatva, megkíséreltük szelektíven átalakítani az egyes protoklorofillid formákat. Glicerint és szacharózt tartalmazó pufferekben kísérletet tettünk a rövid hullámhosszú protoklorofillid formák aggregáltatására. Megfigyeltük a protoklorofillid formák regenerációját előzetesen kifehérített, majd sötétbe helyezett mintákban. Tanulmányoztuk a citokinin és a nitrogén ellátottság szerepét a prolamelláris test membránrendszerének kialakulásra borsó szervtenyészetekben.

6

2. Irodalmi áttekintés

A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim szerkezete és működése A klorofill (kl) bioszintézis egyik kulcslépése a protoklorofillid (pklid) átalakulása klorofilliddé (klid), ami a porfirin váz D pirrol gyűrűjében a C17 és C18 szénatomok közötti kettőskötés telítődését jelenti. A folyamatot a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz (POR) enzim katalizálja, amely koenzimként NADPH-t használ (Griffiths 1978). Zárvatermő növényekben az enzim katalitikus aktivitása fényfüggő. Más taxonokba sorolható fotoszintetizáló szervezetekben fény-független pklid redukciós rendszer is van. Ezekben a zárvatermőkre jellemző pklid reduktáz (LPOR vagy light - POR) mellett található egy azzal azonos funkciójú, de eltérő molekulaszerkezetű, alegységösszetételű, genom kódolású és katalitikus mechanizmusú enzim (DPOR vagy dark - POR) is. Anaerob fotoszintetizáló baktériumokban csak a DPOR fordul elő (Fujita 1996, Masuda and Takamiya 2004). Jelen dolgozat csak a fényfüggő LPOR enzimmel foglalkozik, ezért a továbbiakban a POR rövidítés csak az LPOR-t (EC 1.3.1.33) jelenti. A POR enzim széles körben elterjedt a legtöbb aerob fotoszintetizáló szervezetben a cianobaktériumoktól a szárazföldi növényekig; aminosav szekvenciája a különböző csoportokban nagymértékben azonos (Fujita 1996, Armstrong 1998). A POR in vivo az enzimek között különleges tulajdonságokkal rendelkezik: az általa katalizált reakció 1 ms-os megvilágítás alatt végbemegy (Böddi et al. 2003), maximális sebesség – 14 °C-on mérhető, de – 80 °C-on is képes működni az enzim (Sironval and Brouers 1970). 77 K-en történő megvilágítás hatására fotokémiai intermedierek keletkeznek (Lebedev and Timko 1998). Egy növény egész élete folyamán képes kl-t szintetizálni, erre szüksége van a növekedése és a pigmentek turn overe miatt is (Brown et al. 1991). Ennek ellenére azt tapasztalták, hogy etiolált csíranövények megvilágítása után a POR gén expressziójában gyors negatív reguláció következik be (Forreiter et al. 1990). Ezzel nem összeegyeztethető módon olyan eredményekről is beszámoltak, hogy a POR mRNS-ének szintjére változó hatással volt a fény: egyes fajok esetében változatlan maradt a szint, másoknál csökkent (Meyer et al. 1983). Az ellentmondást feloldotta, hogy árpában (Hordeum vulgare L.) és lúdfűben (Arabidopsis

7

thaliana (L.) Heynh) két, fény által szabályozott izoformáját mutatták ki az enzimnek: a POR A-t és a POR B-t (Armstrong et al. 1995, Holtorf et al. 1995). Aminosav szekvenciájukat tekintve nagyon hasonlóak, kivéve az N-terminális régiót. Mindkét izoforma mRNS-e szintetizálódik etiolált csíranövényekben, de a POR B mRNS-e tovább akkumulálódik fényen, még a POR A mRNS-e gyorsan degradálódik megvilágítás után. Úgy gondolták, hogy ezek eltérő aránya okozza etiolált csíranövényekben, hogy a különböző fajok POR transzkriptumai eltérően reagálnak fényre (Armstrong et al. 1995). Ezt a képet némileg módosította a POR C kimutatása Arabidopsisból. Etiolált növényekben nem detektálható az mRNS-e, de megvilágítás után megnő a mennyisége (Oosawa et al. 2000). Tehát a POR B és a POR C gének expressziója nemcsak a csíranövények fejlődése során mutatható ki, hanem a növény későbbi élete folyamán ezek a gének felelősek a nagy mennyiségű kl bioszintézisért. Érdekes eredmény, hogy Arabidopsis porB és porC dupla mutánsokban, melyek etioplasztiszaiban kisebb prolamelláris testek (PLT) alakulnak ki, kloroplasztiszaikban pedig a tilakoidok kevesebb gránumot alkotnak, a POR A ektopikus overexpressziójával

helyreállítható a

normális fejlődés és a kl bioszintézis (Paddock et al. 2010). Találtak olyan fajokat, amelyekben a POR gének szerveződése, illetve expressziója a fény hatására különbözik az előzőekben leírtaktól. Például uborka (Cucumis sativa L.) etiolált szikleveleiben folyamatos megvilágítás hatására nő a POR mRNS és fehérje szintje (Kuroda et al. 1995). A fényindukált POR gén expressziója megmarad érett levelekben is, ami jól összeegyeztethető a kl akkumulációval (Kuroda et al. 2000). Kiderült, hogy uborkában csak egyetlen POR gén van (Fusada et al. 2000). Borsóban (Pisum sativum L.) szintén egy gén kódolja az enzimet, de POR ellen termeltetett antiszérummal két különböző polipeptidet találtak (Spano et al. 1992, Sundqvist and Dahlin 1997). A POR enzimek transzkripciója a sejtmagban történik, a citoplazmában történő transzláció után egy nagyobb molekulasúlyú prekurzor transzportálódik a plasztiszokba (kloro- vagy etioplasztisz). Ezt a sztrómában működő peptidáz hasítja. A búzából (Triticum aestivum L.) kinyert érett protein kb. 36 kDa (Teakle and Griffiths 1993). A POR enzim aminosav szekvenciája alapján a rövid szénláncú alkohol dehidrogenáz enzimcsalád tagja (Wilks and Timko 1995). Az ebbe a csoportba tartozó enzimek másodlagos szerkezetére jellemző egy központi, hét szálból felépülő β-lemez, amelyet kilenc α-hélix vesz körül (Townley et al. 2001) (I1. ábra). A POR sajátos vonása a csoporton belül egy nagy extra hurok (loop) az ötödik és hatodik β-szál között. Ez egy hidrofób régió, amiről azt feltételezték,

8

hogy a membránokhoz (Birve et al. 1996) vagy más proteinekhez való kötődésben lehet szerepe (Reinbothe et al. 2003).

I1. ábra: A POR enzim másodlagos szerkezete, koenzim (sárga)- és szubsztrát (zöld)-kötőhelye. (Townley et al. 2001)

Az elképzelések szerint a POR harmadlagos szerkezetét tekintve globuláris protein. Nterminális régiójában egy tipikus NAD(P)-kötő motívum (Rossmann-fold: βαβαβ struktúra) van, ami biztosítja a kofaktor-kötőzsebet (Birve et al. 1996). Pklid redukciós mutánsok komplementációs vizsgálata alapján tudják, hogy konzervatív Tyr és Lys aminosav oldalláncok esszenciálisak a POR aktivitásához. Feltételezik, hogy a Tyr mint protondonor, a Lys pedig a Tyr pKa értékének csökkentésében fontos, ami lehetővé teszi a deprotonációját (Wilks and Timko 1995). A konzervatív Tyr és Lys a hatodik α-hélixen (α -F) van, ami a szubsztrátkötőhely egy részét alkotja. Feltételezik róluk, hogy szerepük van a szubsztrát és kofaktor kötésének megfelelő orientációjában (Lebedev et al. 2001). A POR által katalizált reakciónak a biokémiában szokatlanul nagy sebessége ráirányította a figyelmet az enzim katalitikus aktivitásának a vizsgálatára. Különböző spektroszkópiai módszerekkel kimutatták, hogy fotofizikai és fotokémiai intermedierek léteznek a fs – ms időskálán a pklid és klid között (Franck and Mathis 1980, Iwai et al. 1984, Lebedev and Timko 1999, Heyes et al. 2003, Heyes and Hunter 2005, Sytina et al. 2009). Ez azt jelenti, hogy a porfirin gyűrű 17-18 C atomja közötti kettőskötés több lépésben telítődik. Egyes intermedierekről kimutatták, hogy átmeneti ionként és/vagy szabad gyökként („ion-gyök 9

komplex”) fluoreszcencia kioltóként („quencher”) viselkednek (Belyaeva et al 2001). Az elmúlt évek kutatási eredményei alapján elfogadott elmélet szerint megvilágításkor a pklid C17-C18-as kettőskötésén átmeneti töltésszeparáció valósul meg, ami előmozdítja a hidrid ion transzferjét a NADPH kofaktorról a pklid C17-es szénatomjára, ezt követően pedig lezajlik a fentebb említett proton átvitel a szomszédos Tyr-ról a C18-as szénatomra (Heyes et al. 2006). Mindez a pikoszekundumos időskálán (Zhong 2007) (I2. ábra).

I2. ábra: A POR enzim röntgen-krisztallográfia alapján kapott szerkezeti modellje és az aktív centrumának kialakításában szerepet játszó Tyr és Lys aminosav oldalláncának, a szubsztrátként kötött pklid-nek és a NADPH koenzimnek egymáshoz viszonyított térbeli orientációja. A szaggatott vonalak azt jelzik, hogy a pklid C17-C18 szénatomjai között található kettőskötés telítéséhez a NADPH-ról két elektron és egy proton (hidrid), a Tyr oldalláncáról pedig egy proton származik. (Zhong 2007)

Olyan mutánsokkal végzett kísérletek, amelyekben a Cys-t Ser-re cserélték ki, mutatják, hogy a Cys 119 a NADPH kötésben lehet fontos (Townley et al. 2001), a Cys 281 a feltételezett aktív hely része. A Cys 308 egyik kötőhely kialakításában sem szerepel, de közel van az aktív helyhez, így hatást gyakorolhat a pklid kötésére vagy redukciójára. Elképzelhető, hogy a háromdimenziós struktúra fenntartásában van szerepe (Aronsson et al. 2001). A POR enzim egységeken két kötőhelyet feltételeznek, melyek közül az egyik az aktív centrum (Klement et al. 1999, Franck et al. 2000, Buhr et al. 2008). A POR enzim szubsztrátspecificitásának vizsgálatát etiolált búza etioplasztiszának PLT-éből izolált enzimeken végezték, különböző szubsztrátok hozzáadásával. A POR képes volt katalizálni pklid-a, Zn protofeoforbid-b fotoredukcióját; de nem fogadott el szubsztrátként protoklorofill10

a-t, protoklorofill-b-t (Schoch et al. 1995) illetve pklid-a’–t (ciklopenton gyűrű izoméria) vagy bármilyen pklid-a-tól eltérő C132-szubsztituált komponenst (Helfrich et al. 1996). További vizsgálatokat végeztek zab (Avena sativa L.) etioplasztiszokból származó pigmentmentes POR-on. Azok a pklid analógok, melyek oldalláncai az A vagy B pirrol gyűrűn voltak, aktív szubsztrátnak bizonyultak, de a D vagy E gyűrűn oldalláncokkal rendelkező analógok nem szubsztrátjai a POR-nak (Klement et al. 1999). Ezzel jó összhangban vannak Rüdiger és mtsai (2005) a POR aktív centrum topológiájának megismerésére irányuló in vitro vizsgálatának eredményei. A szerzők kémiailag módosított pklidek reakcióképességét tanulmányozták maltózkötő proteinnel fúziós konstrukcióként expresszáltatott borsó POR-ral. A szubsztrátok úgy kötődnek a POR aktív centrumában, hogy a C, D és E pirrol gyűrűik a kötőzseb belsejében helyezkednek el, míg az A és B gyűrűk az enzim felszíne felé irányultak, sőt onnan ki is nyúlhatnak. A rekombináns enzimmel szemben a natív esetében nem feltétlenül valósul meg az A és B gyűrűk közegnek való kitettsége, mivel az etioplasztiszokban a POR nagyrészt aggregált formában van jelen, így nem marad szabad hely az enzim felszínén. A reakciósebességnek a szubsztrát és kofaktor koncentrációktól, valamint a fényintenzitástól való függésének vizsgálata azt mutatta, hogy egy pklid és egy NADPH molekula szerepel a fotoaktív reakciókomplex kialakításában, a reakció pedig monokvantumos mechanizmuson keresztül folyik (azaz egy foton elég, hogy kiváltsa a két elektron hidridként való transzferjét) (Griffiths et al. 1996, Lebedev and Timko 1999). Összetett rendszerekben in vitro is sikerült létrehozni olyan mesterséges komplexeket, amelyek a natív struktúrához hasonlóan fotoaktivitást is mutattak. Tisztított POR apoenzimet, NADPH-t, a pklid Zn analógját, plasztisz lipideket és nagy koncentrációjú glicerint használtak (Klement et al. 2000). Ezek a munkák azt mutatták, hogy a natív komplexek kialakulásában nemcsak a pigment-pigment és a pigment-fehérje kölcsönhatások fontosak, hanem az etioplasztisz membránjaiban található lipidek is. Az itt található, főleg glikolipidek pontos szerepe nem tisztázott, de a glikolipidek és a POR enzim közötti kölcsönhatás feltétele annak, hogy a PLT-k szabályos, köbös membránszerkezete kialakuljon. A POR enzim valószínűleg Trp maradékokon keresztül kapcsolódik a lipidek poláros „fej” csoportjaihoz (Birve et al. 1996).

11

Heyes és Hunter (2004) a POR enzim katalitikus aktivitásának in vitro vizsgálata alapján egy ciklikus sémát állított össze (I.3. ábra)

I3. ábra: A POR enzim katalitikus ciklusa in vitro megfigyelések alapján. (Heyes and Hunter 2004) A számok az abszorbciós és fluoreszcencia emissziós maximumokat jelölik nm-ben kifejezve.

A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált zárvatermő csíranövények leveleiben

A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai levelekben Az Irodalmi áttekintésben eddig ismertetett eredmények mind enzimológiai, molekuláris biológiai vizsgálatokon alapulnak. Ismert viszont, hogy a POR enzim egységei natív struktúrákba rendeződnek, melyek eltérő spektrális tulajdonságokkal rendelkeznek, így a sötétben nevelt zárvatermő csíranövények leveléről mért abszorpciós és fluoreszcencia emissziós spektrumok összetettek (Shibata 1957, Cohen and Rebeiz 1981). A kék tartományban (400-500 nm) ez az összetettség részben azzal magyarázható, hogy a pklid Soret (By(0-0) és Bx(0-0)) sávjai karotinoidok abszorpciós sávjaival fednek át. A vörös tartomány 610 nm feletti régiójában viszont sötétben nevelt levelekben csak a pklid pigmenteknek van

12

abszorpciós és fluoreszcencia emissziós sávja (Houssier and Sauer 1969). Az a tény, hogy ennek ellenére egymással átfedve, együtt, több sáv figyelhető meg, arra utal, hogy a pklid in vivo többféle komplexet alkot (Kahn et al. 1970, Schoefs 2000a). Ezt a fajta spektrális variabilitást a kromofórok eltérő molekuláris kölcsönhatásai okozzák. Mivel az egyes komplexek szerkezetéről a szakirodalomban sokáig nem volt pontos információ, bevezették a „forma” kifejezést és fogalmat. Sőt, mivel spektrálisan nem lehet in vivo elkülöníteni, nem különböztették meg a pklid-et és annak észtereit (amit ma protoklorofillnak (pkl) nevezünk) sem, és összefoglaló néven „pkl-ként” jelölték. A „forma” kifejezést olyan molekulakomplexekre használták, amelyekben a kromofór azonos (pklid vagy annak észtere), de különböző molekuláris kölcsönhatásokban vesz részt. A tényleges szerkezetre való tekintet nélkül, ezeket a „formákat” csak vörös abszorpciós és/vagy fluoreszcencia emissziós maximumukkal jellemezték. Manapság a „forma” mellett a „komplex” elnevezés is elterjedt, és ezzel a szerkezetre vonatkozó információt is próbálják megadni. A spektrális sokféleséget okozó tényezők közé sorolható a pigmentek aggregációja (Böddi et al. 1989), az etioplasztiszokon belüli eltérő lokalizációja (Ryberg and Sundqvist 1982), és különböző proteinekhez való kötődése. Az egymáshoz kapcsolódó POR enzim egységei között a pklid molekulák közvetlen közelében NADPH található, amelynek redox állapota befolyásolja a maximumok pozícióját (El Hamouri 1984, Franck et al. 1999). A POR proteinek aggregációjának hatására az általuk kötött pklid molekulák is közel kerülnek egymáshoz, köztük kölcsönhatások alakulhatnak ki, ezeket modellezték in vitro rendszerekben. Specifikus, közvetlen kölcsönhatás jöhet létre egy pigmentmolekula ciklopentanon gyűrűjén lévő C131 ketocsoport és egy másik molekula Mg atomja között (Brouers 1979). Nem specifikus kölcsönhatások alakulhatnak ki pusztán a π - elektronfelhőik átfedése miatt, oldalláncok közvetlen kapcsolódása nélkül is (Böddi et al 1986). Közvetett kölcsönhatás olyankor valósul meg, ha a pigmentmolekulákat hídként, két funkciós csoporttal rendelkező molekula köti össze (víz, vagy in vitro rendszerekben dioxán). A vízmolekulák száma és megkötésük módja befolyásolhatja a spektrális tulajdonságokat. A fenti kölcsönhatások ismétlődése révén dimérnél nagyobb aggregátumok is kialakulhatnak (Böddi et al 1983).

13

Az aggregáció és a spektrális sajátosságok közötti összefüggések tanulmányozására különböző mesterséges rendszereket alakítottak ki. Izolált, spektroszkópiai tisztaságú pkl vagy pklid aggregációját vizsgálták, és elő tudtak állítani fehérje és NADPH nélküli rendszerekben a natív pkl és/vagy pklid formákkal megegyező abszorpciós maximumú pigmentaggregátumokat: Vizsgálták a pigmenteket apoláros oldószerekben (Seliskar and Ke 1968, Brouers 1972), szilárd filmek multimolekuláris rétegeiben (Böddi et al. 1980) és Triton X-100 micelláris oldataiban (Böddi et al 1983, Myśliwa-Kurdziel et al. 2007) is. A szilárd filmekben megfigyelték a különböző nagyságú pigmentaggregátumok egymásba történő átalakulását, a 640 és 650 nm-es abszorpciós maximumú formák különböző térszerkezetű módosulatait (Böddi et al. 1980). Triton X-100 micelláris oldatában az egy micellára jutó pigmentmolekula szám megváltoztatható. Ilyen módszerrel sikerült kimutatni, hogy legalább 10 pkl(id) kell a 650 nmes abszorpciós maximumú forma kialakulásához (Böddi et al 1983). Ezek a rendszerek csak modellezik a spektrális tulajdonságok és az aggregáció kapcsolatát, a nagymértékű spektrális hasonlóság ellenére nem feltétlenül várható teljesen azonos struktúra (például azonos módon történő kölcsönhatás az oldalláncok között). In vivo vizsgálatokat is folytattak a POR aggregációs állapotával kapcsolatban. A PLTek kialakulása és a 655 nm-es pklid forma megjelenése között in vivo korreláció figyelhető meg (Butler and Briggs 1966, Klein and Schiff 1972), ami arra utal, hogy a PLT és a fotoaktív pklid keletkezése a POR aggregációjának a következménye (Böddi et al. 1989, Sundqvist and Dahlin 1997). A POR aggregációs állapotának vizsgálatára a PLT-ekben, különböző crosslinkereket (kémiai keresztkötést kialakító vegyületeket) használtak. A poliakrilamid gélelektroforézissel szétválasztható komplexek között a legnagyobb mennyiségben a POR dimerje volt, de nagyobb aggregátumokat: tetramért, hexamért és oktamért is kimutattak. Ráadásul, olyan nagy komplexek is kialakultak, amelyek be sem tudtak lépni a gélbe (Wiktorsson et al. 1993). (Maltózkötő proteinnel fúziós konstrukcióként expresszáltatott borsó POR esetében in vitro is kimutattak dimerizációt (Martin et al. 1997).) A foszforiláció kedvez a POR proteinek aggregációjának az etioplasztiszokban, de a pontos mechanizmus nem tisztázott (Wiktorsson et al. 1996, Kovacheva et al. 2000).

14

A natív állapotról mért komplex spektrumok a spektroszkópiában régóta ismert módszerekkel összetevőikre bonthatók (különbségi spektrumok számolásával, deriválással vagy Gauss komponensekre történő bontással) (Böddi et al. 1991, 1997, Horton and Leech 1975). Mivel a különböző pklid komplexek lokalizációja eltérő az etioplasztiszokon belül, az őket kötő membránpartikulumok elkülöníthetők egymástól és spektrumaik mérésével azonosíthatóak a PLT-ekben és protilakoidokban (PT) lokalizált komplexek. A PT-ok spektrumának fő emissziós sávja 633, míg a PLT-oké 656 nm környékén van. Ezzel a módszerrel a pklid komplexek tehát fizikailag is megkülönböztethetők egymástól (Ryberg and Sundqvist 1982). Etiolált levelek és azokból izolált etioplasztisz belső membránok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumainak analízisével a következő maximumokkal rendelkező pklid formákat mutatták ki: 633, 644-645, 655-657 és 670 nm (Böddi et al. 1992, 1993). Részletes fluoreszcencia spektroszkópiai adataikat az 1. táblázat mutatja. Etiolált búzaleveleken 10 K-en végzett mérésekből kimutatták, hogy van egy további, kis amplitúdójú, 628 nm-es emissziós maximumú sáv is (Kis-Petik et al. 1999). I1. táblázat: Etiolált levelekben, illetve izolált etioplasztisz belső membránokban általánosan előforduló protoklorofillid formák 77 K fluoreszcencia spektroszkópiai jellemzői (Böddi 1994)

Gerjesztési maximum (nm) 436 443 451 463

Félértékszélesség (nm) 12.6 10.7 11.8 12.6

Emissziós (0-0) sáv (nm) 633 645 657 670

Félértékszélesség (nm) 14.5 14.3 10.5 20.1

Emissziós szatellit (1-0) sáv (nm) 693 710 726 740

Félértékszélesség (nm) 20.8 17.3 17.7 21.0

A különböző sávok amplitúdó arányai és a maximumok pozíciói függnek a vizsgált növények korától (Schoefs et al. 1994), nevelési körülményeitől és fajuktól (Schoefs et al. 2000a). Levelek spektrumában általában a 655-657 nm-es sáv dominál, de nagyon fiatal (2 naposnál fiatalabb) (Schoefs and Franck 1993) és öregedő (Avarmaa et al. 1984) etiolált növények esetében a 631-633 nm-es sáv nagy intenzitású. A 633 nm-es emissziós maximumú pklid forma monomer állapotú pklid-et (vagy pkl molekulát) tartalmaz. A szakirodalom szerint ebben a formában a pigmentek többsége nem a POR enzimhez kötött (Kis-Petik et al. 1999). Erre a sávra nagy félértékszélesség jellemző, ami 15

a pigmentmolekulák nagyfokú rezgési szabadságát mutatja. Ez azt jelenti, hogy a környezetükkel csak gyenge kölcsönhatásban vannak (Böddi et al 1989). Kimutatták, hogy a PT membránokban lokalizáltak (Ryberg and Sundqvist 1982). A 644-645 nm-nél emittáló formáról cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiai (Mathis and Sauer 1972), izolációs és in vitro rekonstitúciós módszerek (Martin et al. 1997, Ouazzani Chahdi et al. 1998) eredményei alapján feltételezik, hogy két POR - pklid – NADPH hármas komplex által alkotott dimer. A PLT-ek felületéről szonikálással leválasztott membránfrakcióban mutatták ki nagyobb arányban ezt a komplexet (Böddi et al. 1989). A 655-657 nm-es pklid komplexben található a pklid és a POR enzim többsége etiolált levelekben. Szerkezetéről bizonyított, hogy oligomer, vagyis több hármas komplex (nagy) aggregátuma (Böddi et al. 1989, Wiktorsson et al. 1993). A POR enzim egységek közötti aggregáció következtében az aktív centrumokban kötött pklid molekulák közel kerülnek egymáshoz, köztük exciton kölcsönhatások alakulnak ki (Böddi et al. 1989). A fehérje aggregáció olyan molekuláris környezetet biztosít az egységek által közrezárt térben, amelyben olyan pklid molekulák is felhalmozódnak, amelyek nem az aktív centrumokhoz kötődnek, de elektronfelhőikkel a fenti exciton kölcsönhatásokban vesznek részt (Böddi 1994). A NADPH molekulák komplexen belüli helyzete szigorúan meghatározott, mivel részt vesznek a fotoredukcióban és az aggregátumok, illetve a PLT membránok összetartásában is (Ryberg and Dehesh 1986, Engdahl et al. 2001). A komplex a PLT-ek belsejében található (Böddi et al. 1989). A 670 nm-es fluoreszcencia emissziós sáv összetett, a 655-657 nm-es forma vibrációs sávjának és egy ismeretlen szerkezetű, 674 nm-nél abszorbeáló pigment sávjának átfedéséből jön létre (Kis-Petik et al. 1999). Az etioplasztiszok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumában leírtak ennél hosszabb hullámhosszaknál megjelenő sávokat is (Sironval et al. 1967). A régió Gauss komponensekre bontásával kapott maximumok a következők: 682, 692, 712 és 730 nm (Böddi et al. 1992). A kapott sávokat a rövidebb hullámhosszaknál emittáló pklid komplexek vibrációs szatellit sávjainak lehet tekinteni (I1. táblázat, Kis-Petik et al. 1999, Schoefs et al. 2000a). Mások szerint ezek külön ú. n. „távoli vörös pklid formák” Qy(0-0) átmeneteinek megfelelő fő sávjai (Ignatov and Litvin 2002, Stadnichuk et al. 2005, Amirjani and Sundqvist 2006).

16

A kriogenikus hőmérsékleten kimutatható, 628 nm-es emissziós maximumú formáról az ismeretes, hogy nem POR enzimhez kötött, sőt, más fehérjéhez való kapcsolódása sem bizonyított. Feltehetően olyan monomer állapotú pkl és/vagy pklid, amely gyengén kötött a molekuláris környezetében (Kis-Petik et al. 1999).

A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása levelekben A különböző komplexekben található pklid molekulák fotoaktivitása eltérő. Néhány ms-os megvilágításra csak azok a pklid molekulák redukálódnak klid-dé, amelyek hármas komplexet alkotnak NADPH-val és a POR enzimmel, aminek az aktív centrumában helyezkednek el (Griffiths 1978, Lebedev and Timko 1998). Ezeket a pklid-eket flash– fotoaktívnak nevezik, jelezve ezzel, hogy a reakció a ms-os időskálán játszódik le. A 655-657 nm-es oligomer és 644-645 nm-es dimer komplex pklid-jeiről bizonyított, hogy ebbe a csoportba sorolhatók (Böddi et al. 1990) (I4. ábra). A 644 és 655 nm-nél emittáló pklid komplexek 1-2 ms-os megvilágításával első lépésben POR – klid – NADP+ egységeket tartalmazó aggregátumok alakulnak ki: a 644-645 nm-es komplexből közvetlenül keletkező dimer 682 nm-nél, a 655-657 nm-es komplexből kialakuló oligomer pedig 686-688 nm–nél emittál (Böddi and Franck 1997, Franck et al. 1999). Ezek a komplexek két független, eltérő molekuláris módosulásokkal járó útvonalon alakulnak tovább (Schoefs 2001, Schoefs and Franck 2008): P628-629 P633-636 P644

C682

P655

C688

I4. ábra: A protoklorofillid különböző molekulakomplexeinek feltételezett egymásba történő átalakulási lehetőségei, és flash-fotoaktivitása irodalmi adatok alapján (hivatkozások a szövegben). Pxxx/Cxxx: xxx nm-nél emittáló protoklorofillid/klorofillid komplex (77 K fluoreszcencia spektrumok alapján)

17

(1) Az egyik lehetőség, hogy a hármas komplexekben az oxidált állapotú koenzim NADPH-ra cserélődik (Heyes et al. 2008) (vagy redukálódik vissza), és kialakul egy 694–696 nm-nél emittáló POR – klid - NADPH oligomer (Oliver and Griffith 1982, Franck et al. 1999). A 686–688 nm-es oligomer forma esetében bizonyított ez az átalakulás, de a 682 nm–es dimer forma ilyen irányú módosulását is feltételezik. Ezt a lépést a nagy aggregátumok szétesése követi a Shibata–shift (lásd később) lejátszódása közben, aminek az eredménye egy 680 nm–nél emittáló POR - klid - NADPH komplex vagy más proteinhez kötött klid (Shibata 1957). (2) A másik lehetőség, hogy a klid molekula elhagyja az aktív centrumot, helyére pedig pklid kerül (Schoefs et al. 2000b). Az eltávozó klid molekula 675–676 nm-nél emittál (gyors észterifikációjával kl-a keletkezik, ami ugyanitt emittál) (Domanski and Rüdiger 2001); a keletkező POR – pklid – NADP+ hármas komplexeket tartalmazó dimer illetve oligomer emissziós maximuma pedig 637-638 nm, illetve 649-650 nm (Böddi and Franck 1997). A klid „kiesése” az aktív centrumból gyors folyamat (kb. 5 s a fototranszformáció után). A 686–688 nm-es komplexben található klid-nek csak kis hányada megy keresztül ezen a lépésen. Ilyenkor a pklid a POR egységek által közrezárt térben található, nem aktív központban kötött, pklid molekulákból pótlódik (Böddi 1994). Hosszabb idejű megvilágítás esetén a hármas komplexek regenerációja a nem fotoaktív pklid formák pigmentjeiből történhet (Kahn et al. 1970, Schoefs et al. 2000b). Tehát az in vivo kísérleteken alapuló munkák eredményei alapján általában több, páthuzamosan zajló fototranszformációs utat feltételeznek, szemben az I3. ábrán látható ciklikus reakciósémával. Utóbbi esetében egyébként a szerzők nem foglalkoznak azzal, hogy a POR-pklid-NADPH komplexben a spektrális tulajdonságai alapján dimer pklid-et lehetne feltételezni, amit megerősít az is, hogy fototranszformációjának eredményeként 684 nm-nél emittáló klid komplex alakul ki. A különböző fototranszformációs útvonalak arányát több tényező is befolyásolja. Ilyen a rövid és hosszú hullámhossznál emittáló pklid formák aránya, mely függ a vizsgált növényi fajtól és szervtől (Amirjani et al. 2006), a növény korától (Schoefs and Franck 1993) és ehhez kapcsolódóan a PLT-ek fejlettségi állapotától (Schoefs et al. 1994).

18

A szakirodalomban tényként kezelik, hogy az etiolált levelekben található monomer állapotú pklid in vivo flash megvilágításkor változatlan marad (Schoefs and Franck 2003), sőt a neki megfelelő fluoreszcencia emissziós sáv intenzitása megnövekszik (Dujardin and Sironval 1970, Böddi et al. 1991). Ez utóbbi jelenséget azzal magyarázzák, hogy átalakulnak a mellette levő, energiamigrációban akceptorként szereplő hosszabb hullámhosszú formák, és az energiamigráció megszűnése megemeli a monomer fluoreszcencia hozamát. Érdemes azért kiegészítésként megemlíteni, hogy az energiatranszfer a rövid hullámhosszú monomer pklid formákról a hosszabb hullámhossznál emittálók irányába korlátozott, az etioplasztiszon belüli eltérő lokalizációjuk miatt (Amirjani and Sundqvist 2006). A 633 nm-es sávot monomer pklidhez és monomer pkl-hoz is rendelik (Lindsten et al. 1988). A pkl esetében érthető a fotoaktivitás hiánya, mert a POR nem fogadja el az észteresített pigmentet szubsztrátként (Schoch et al. 1995). A monomer pklid-ek esetében feltételezik, hogy legalább egy részük a POR enzim aktív központjában kötött és a NADPH-val együtt a fentiekhez hasonló hármas komplexet alkot (Grevby et al. 1989). Ilyen szerkezet feltételezése mellett viszont flashfotoaktívnak kellene lennie, ami Mc Ewen és mtsai (1996) szerint nem kizárható. Ezzel szemben az általánosan elfogadott hipotézis alapján minden fototranszformáció a dimer és oligomer pklid komplexeken keresztül megy végbe (Domanski and Rüdiger 2001). A monomerek egyetlen szerepe ezek szerint csak a nagyobb, flash-fotoaktív komlexek regenerálása (Kahn et al. 1970, Hendrich and Bereza 1993). Ilyen esetben feltételezik a monomer pklid-ek transzlokációját a PT membránokból a POR aktív centrumokba (Schoefs et al. 2000b). Érdemes megemlíteni egy jóval korábban közölt fototranszformációs sémát (Mathis és Sauer 1973), melyben feltételezték a monomer pklid-ek egy kisebb mennyiségének a közvetlen átalakulását 672 nm-nél abszorbeáló klid-dé. In vitro kísérletekben megfigyelték a rövid hullámhossznál (633 nm környékén) emittáló pklid-ek fototranszformációját (Schoefs and Franck 2003). Birve és mtsai (1996) etiolált búza levelekből izoláltak POR frakciókat, melyek 630 nm-es fluoreszcencia emissziós maximumuk alapján monomer pklid-et tartalmaztak. Ezek flash-sel történő megvilágításának eredményeként 675 nm-nél emittáló klid keletkezett. A fenti az in vitro eredmények alapján felvetődhet a kérdés a monomer pklid-et tartalmazó komplexek esetleges fotoaktivitásáról.

19

Etiolált levelek flash-megvilágítása után néhány másodperccel tehát a keletkező POR klid - NADPH komplexek többsége 694-696 nm-nél mutat fluoreszcencia emissziós maximumot. Ez a maximum sötétben, szobahőmérsékleten 20-40 perc alatt 680 nm-re tolódik el. A jelenséget először Shibata írta le abszorpciós spektroszkópiával (Shibata 1957), ezért a szakirodalomban „Shibata-shift”-nek, vagyis Shibata-féle eltolódásnak nevezik. (A megfelelő abszorpciós maximum 684 nm-ről 672 nm-re tolódik.). A spektrális változás pontos molekuláris háttere tisztázatlan, de biztosra vehetjük, hogy több, párhuzamosan zajló folyamat okozza

(Rassadina

et

al.

2004).

A

spektroszkópiai

mérések

a

pigmentek

molekulaszerkezetének változását mutatják, ebben az esetben főleg azt, hogy a porfirin vázas vegyületek dezaggregálódnak (Butler and Briggs 1966, Artus et al. 1992, Böddi et al. 1990, Wiktorsson et al. 1993). Ezt többféle hatás okozhatja: a POR konformációváltozása (Wiktorsson et al. 1993), a PLT szerkezetének megbomlása, a klid kiszabadulása a POR aktív központjából, a klid észterifikációja (Rassadina et al. 2004) és a kl-a ELIP (early light induced proteins = zöldülés kezdetekor expresszálódó fehérjék) fehérjékhez való kötődése (Adamska 1997). A PLT lebomlásával a korábbi köbös struktúra lamelláris szerkezetet vesz fel. A membrán háromdimenziós lipidszerkezetének megváltozása fontos szerepet játszik a spektrális eltolódásban, mivel hatással van a POR konformációváltozásaira (Smeller et al. 2003). Újabb eredmények alapján a fluoreszcencia sáv kék felé történő eltolódásának kiváltásához elegendő a makrodomén minimális térbeli változása (Solymosi et al. 2007). A pklid655 → klid686 → klid696 → kl680 átalakulási út lineáris reakciósorozatot ír le. Mint a fentiekben láttuk, emellett párhuzamosan a pklid 644 nm-es formája is flashfotoaktív, 682-684 nm-nél emittáló klid komplexszé alakul. A két párhuzamos reakcióút aránya a megvilágító fény intenzitásától függ (Böddi et al. 1991). A telítésinél kisebb fényintenzitást alkalmazva csak részleges fototranszformáció megy végbe. Kis intenzitású, ms-os időtartamú megvilágítás mellett 1 – 2 %-os fototranszformációnál a 644 nm-es pklid forma átalakulása dominál, (e fölött pedig a 655 nm-es formáé). Az alacsony fényintenzitás hatására a PLT-ek felszínén a 644 nm-es forma fototranszformációja megy végbe (miközben csak kevés 655 nm-es forma alakul át). Ezután sötétben a klidet tartalmazó membránpartikulumok ledisszociálnak az etioplasztisz felszínéről. Emiatt a PLT felszínének egy újabb rétege fellazul, és regenerálódik a 644 nm-es forma, ami egy újabb reakcióban ismét átalakulhat. Tehát alacsony fényintenzitás mellett a 644 nm-es forma aktívabb a

20

fototranszformációban, mint a 655 nm-es. Ezt mutatta a fototranszformáció kinetikájának a tanulmányozása is: az átalakulás kezdeti szakaszában a 644 nm-es forma átalakulása gyorsabb (Böddi 1994).

A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált borsó csíranövény epikotiljában

A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai borsó epikotilban A kl szintézis irodalmában található adatok szinte kizárólag levelekkel foglalkoznak (Masuda and Takamiya 2004, Belyaeva and Litvin 2009). Klorenchima szövet viszont megtalálható fiatal, zöld szárakban, vagy szár-eredetű szervekben (módosult szár, epikotil, hipokotil, levélnyél) is. A száraknak tehát jelentős lehet a szerepe a fotoszintézisben (Valladares et al. 2003). Psorothamnus spinosus szár fotoszintetikus aktivitása a teljes növény asszimilációjának 40 – 75%-a lehet (Nilsen et al. 1989). A zöld szárral rendelkező növényfajok esetén a levél és a szár eltérő mértékben vesz részt a szén megkötésében. Például egy pillangós cserje, a Retama sphaerocarpa esetében, aminek a levelei rövid életűek, a széndioxid fixáció majdnem teljes mértékben a szárban megy végbe (Haase et al. 1999). Vastagodott, fás szárak parenchima sejtjeiben is előfordulhatnak kloroplasztiszok (SzujkóLacza et al. 1971), amelyek aktivitása révén a szár fotoszintézise jellegzetes évszakos változást mutat. A szárak fotoszintetikus aktivitása miatt is indokolt a zöldülésük vizsgálata. Etiolált borsó csíranövényeknek megnyúlt, fehéres színű epikotilja van (I5A. ábra), ami alacsony fényintenzitáson megzöldül (I5B. ábra). Ha a borsó rügyecskéje a csírázás kezdetétől fényen fejlődik, az epikotil helyett nóduszokkal tagolt, zöld hajtás alakul ki (I5C. ábra).

21

A

B

C

I5. ábra: Sötétben és fényen csíráztatott borsó csíranövények zöldülése. A: 8 napos, 10 cm-es etiolált borsó csíranövény. B: 4 napig sötétben nevelt, majd alacsony (20 µmol m-2 s-1) fényintenzitáson 6 napig zöldített kb. 8 cm-es borsónövény. C: 4 napos, csíráztatásától természetes (200 µmol m-2 s-1) fényen nevelt 3 cm-es borsó csíranövény.

Etiolált borsó epikotilokból kivont pigmentek abszorpciós és fluoreszcencia emissziós spektrumai azt mutatják, hogy bennük a fő pigment a pklid és/vagy a pkl. Az extraktumok HPLC-vel (high pressure/performance liquid chromatography = nagy nyomású/felbontású folyadékkromatográfia) való vizsgálatából kiderült, hogy a pklid van túlsúlyban, mellette kis mennyiségben a pkl is kimutatható. A pklid tartalom friss tömegre vonatkoztatva a levélének 3 – 10%-a (vagyis 0.17 – 0.56 µg/g friss tömeg). A pklid mennyisége nemcsak fajfüggő, hanem változik az epikotil különböző szakaszaiban is. A legalacsonyabb az epikotil alsó régiójában, felfelé fokozatosan növekszik (Böddi et al. 1994). Az epikotilban a levélétől eltérő spektrális tulajdonságú pklid formákat mutattak ki, ezek fluoreszcencia emissziós maximumai rövidebb hullámhosszaknál vannak (I6. ábra). 77 K fluoreszcencia spektroszkópiával mért spektrumok (440 vagy 460 nm-es gerjesztéssel) Gaussbontásával sávokat különítettek el, amelyek maximuma 629; 636 illetve 649 nm-nél voltak (Böddi et al. 1994). 10 K-en mért fluoreszcencia emissziós spektrumok analíziséből kiderült, hogy a 649 nm-es maximumú sáv összetett, két különböző pklid komplexnek felel meg. Az egyik 644-646, a másik 656 nm-nél emittál (Böddi et al. 1998). A fő fluoreszcencia sáv 440 nm-es gerjesztésnél 632 nm-en, 460 nm-es gerjesztésnél 636 nm-en van, tehát a levelekkel szemben borsó epikotilban a rövid hullámhossznál emittáló formák vannak túlsúlyban. Ez a dominancia valamennyi általunk vizsgált borsó epikotil jellemzője, kisebb eltérések a 644 és

22

655 nm-nél emittáló formák arányaiban vannak, melyek mértéke főleg a növény korától függ. Az epikotilra meglepően magas fluoreszcencia hozam jellemző: középső szakaszában 13szoros értéket mértek a levélhez képest, pedig a pklid tartalom a levélének csak tizede volt (Böddi et al. 1994).

I6. ábra: Sötétben nevelt 6.5 napos etiolált borsó csíranövény epikotilja középső szegmensének (folytonos vonal) és levelének (szaggatott vonal) fluoreszcencia emissziós spektruma. A spektrumokat 77 K-en regisztrálták 440 nm-es gerjesztéssel. (Böddi et al. 1994)

Sötétben nevelt bab (Phaseolus vulgaris L.) csíranövények hipokotiljában szintén túlsúlyban vannak a monomer pklidet tartalmazó formák (Mc Ewen et al. 1994). Fás növények sötétben hajtatott szárában is általánosak a rövid hullámhosszon emittáló formák, ezek túlsúlya esetén alacsony pigmenttartalom jellemző (Skribanek et al. 2000). A borsó epikotil 629 és 636 nm-nél emittáló formáiról konvencionális 10 K-en mért, és lézer spektroszkópiai mérésekkel (FLN, fluorescence line narrowing - fluoreszcencia sávkiélesedés) is bizonyították, hogy kétféle spektrális tulajdonságú, monomer állapotú pklidet tartalmaznak (Böddi et al. 1998). Dezaggregációt okozó hatásokra nem változnak ezek a sávok, ami szintén bizonyítja, hogy monomer pigmenthez tartoznak (Böddi et al. 1994). A 628–630 nm-es pklid forma általánosan elterjedt sötétben nőtt szárakban és szár-eredetű szervekben, mellette változó mennyiségben lehet a többi pklid forma. A 636-638 nm-es forma

23

is rendszeresen előfordul szárakban, de az előző formáénál kisebb mennyiségben (Skribanek et al. 2000). A borsó epikotil 645 és 656 nm-es formáiról feltételezik, hogy aggregátumok lehetnek, szerkezetük pedig megegyezik a levélben található közel azonos hullámhosszaknál emittáló komplexekével (Böddi et al. 1998). A 652–654 nm-es forma általános szárakban, mennyisége változó, sávjának intenzitása általában a főcsúcsénak harmada, de lehet ugyanakkora is (Skribanek et al. 2000). (Túlsúlya esetén magasabb pklid-tartalom, és a levelekéhez hasonló zöldülés jellemző.) Érdekes megemlíteni, hogy szárakban nem fordul elő 657 nm-nél emittáló komplex. Ennek az lehet az oka, hogy a szárak klorenchima szöveteiben a PLT belső membránrendszere, ahol ez a komplex lokalizált, eltér a levelekétől (Skribanek and Böddi 2000). Borsó epikotilban az etioplasztiszok szerkezete proplasztiszéhoz hasonló (többségében egyszerű belső membránokat tartalmaznak), csak a plasztiszok 6-11%-a tartalmaz kezdetleges PLT-eket, míg levelekben 31% ez az érték. Az epikotilban az etioplasztiszok száma is kisebb, 15 - 44%-a a levélének (Böddi et al. 1994).

A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása borsó epikotilban Mivel a pklid formák aránya szárakban és levelekben eltérő, a zöldülési folyamataik is különböznek. Az irodalomban közölt eddigi adatok azt mutatják, hogy a túlsúlyban levő rövid hullámhosszú pklid formák nem flash–fotoaktívak. A kisebb arányban jelenlévő oligomer komplexek viszont felvillanásos megvilágításra átalakulnak, lezajlik bennük a pklidek fotoredukciója, aminek következtében új sáv jelenik meg 680–690 nm-nél (Böddi et al. 1996). Folytonos intenzív megvilágítás (500-600 µmol m-2 s-1) a száraknál 10 perc alatt pigment degradációt, fél óra alatt turgorvesztést és a szár görbülését, további megvilágítás esetén pedig barnulást és a növény pusztulását okozza (Erdei et al. 2005). (Gyorsan fásodó száraknál csak pigmentdegradáció történik (Skribanek and Böddi 2000).) Ennek okaként azt jelölték meg, hogy a monomerek érzékenyek fényre, megvilágításukkor fotooxidáció zajlik fotoredukció helyett (ld. később).

24

A 629 és 636 nm-es sávok néhány órás, kis fényintenzitású (15 µmol m-2 s-1) megvilágítással átalakíthatók, ekkor egy 680 nm-es maximumú sáv jelenik meg a fluoreszcencia spektrumban (Skribanek and Böddi 2001). Ez a folyamat 0 °C alatt nem megy végbe epikotilban, (levélben ilyen körülmények között csaknem 100%-os a fototranszformáció) (Böddi et al 1996). A fotokémiai reakció 0 ºC körül nem hőmérsékletfüggő (Smith and Benitez 1954, Sironval and Brouers 1970), tehát a fototranszformációban szerepet játszó más hőmérsékletfüggő folyamatok válnak sebesség-meghatározóvá. Ilyen lehet a klid diffúzióval történő eltávozása az aktív helyről, és a pklid enzimhez történő diffúziója. Ezt a hipotézist alátámasztja az a tény is, hogy etiolált epikotilban kevesebb POR enzim van, mint levélben, de megvilágítás után hat órával alig csökken a mennyisége, miközben levelekben a POR nagyrésze ennyi idő alatt lebomlik (Böddi et al. 1996).

A folyamat az alábbi séma szerint képzelhető el (Böddi 1994): A modell szerint a 629 nm-es forma olyan pklid molekulákat tartalmaz, melyek nem enzimhez kapcsolódnak. A 636 nm-es formában a POR enzim monomer vagy dimer egységeihez úgy kapcsolódnak

pklidek,

hogy

nincs

a

pigmentmolekulák között exciton kölcsönhatás, tehát monomer állapotúak. Ilyen szerkezet alapján feltételezhető, hogy a 636-os forma pklid-je megvilágításra 680 nm-nél emittáló klidI7. ábra: Sötétben nevelt borsó csíranövény epikotiljában alacsony fényintenzitáson végbemenő zöldülési folyamat javasolt sémája (Böddi 1994 alapján). Pklid pool= protoklorofillid raktár, E= NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim, Klid= klorofillid, a számok a komplexek fluoreszcencia emissziós maximumát jelölik nm-ben.

dé alakul, ami azután elhagyja az aktív centrumot. Ezt követően a 629 nm-es formából (mint pklid raktárból) egy újabb pklid juthat el diffúzióval a POR enzimhez, ami így újabb reakciót katalizál.

A fenti hipotézis elfogadásához kísérletes bizonyítékokra van szükség.

25

Klorofill típusú pigmentek, mint fotodegradációs folyamatok szenzibilizátorai A fotoszintetikus apparátus működése közben a fényelnyelés következtében kialakuló gerjesztett állapot fotodegradációt vált ki, ha az energia nem tud natív módon felhasználódni. A kl-ok esetében ez akkor fordul elő, ha a reakciócentrumok túlaktiváltak (például túl nagy fényintenzitás esetén). A gerjesztett kl-ról nem tud átadódni az elektrontranszportláncba, mert az redukált állapotban van. A pklid esetében a NADPH hiánya vagy a pigment POR aktív centrumon kívüli lokalizációja miatt a gerjesztett állapot nem fotoredukciót, hanem fotooxidációt eredményez. Éppen ezért a kl-ok és intermediereik bioszintézise, a tetrapirrolok ismert fototoxikus tulajdonságai miatt, szigorúan szabályozott folyamat. A kloroplasztisz redox állapotának szabályozása és a reaktív oxigén fajták (ROS) elleni védelem a bioszintézis út fontos elemei (Stenbaek and Jensen 2010). Általánosságban, a biológiai rendszerekben, mikor endogén vagy exogén ú.n. fotoszenzibilizátorok (= foton abszorbeálása után viszonylag hosszú

élettartamú,

triplet

gerjesztett

állapotú

fényérzékenyítő

molekula)

adott

hullámhosszúságú fény abszorpciója után molekuláris oxigénnel energiatranszfer útján reagálnak, szinglet oxigén keletkezik. Ezt a folyamatot II-es típusú fotoszenzitizációnak nevezik. Az I-es típusú fotokémiai reakció esetén a fotoszenzibilizátor proton vagy elektronátadással közvetlen kölcsönhatásba lép a környezetében található molekulákkal, aminek eredményeként szabad gyökök, majd másodlagosan ROS molekulák termelődnek (Foote1991). Érdemes megemlíteni, hogy bizonyos körülmények között a szinglet oxigénnek a közvetlen károsító hatása mellett szerepe van az oxidatív stresszválaszban szereplő jelátviteli utak aktiválásában (op den Camp et al. 2003). A sötétben fejlődött zárvatermők szöveteinek többsége fényérzékeny, különösen a nem flash-fotoaktív

pklid-et

nagy

mennyiségben

tartalmazók,

melyekben

a

pklid

fotoszenzibilizátorként szinglet oxigén képződését váltja ki, ami fotooxidatív károkat okoz (Böddi et al. 2005, összefoglaló: Reinbothe et al. 1996, Sperling et al. 1997, Sperling et al. 1998). Levelekben a nem flash-fotoaktív pklid-ek felhalmozását és ezzel együtt nagyobb fényérzékenységet figyeltek meg például δ-aminolevulinsav kezelés hatására (Sundqvist 1969), illetve különböző Arabidopsis mutánsokban (Lebedev et al. 1995, op den Camp et al. 2003).

26

Reinbothe és mtsai (1999) feltételezik az etioplasztiszok prolamelláris testjeiben POR A és POR B összekapcsolódásával ú.n. fénygyűjtő POR-pklid komplexek (light-harvesting POR:Pchlide

complex:

LHPP)

kialakulását,

melyeknek

fotoprotektív

szerepet

is

tulajdonítanak. Az in vitro kialakított LHPP-kben a POR A-hoz kötödő “pklid b” molekuláról energiatranszfer történik a POR B-n kötödő “pklid a”-ra, ami indukálja a “pklid a” “klid a”-vá történő konverzióját. Így gátolt a pklid b fotoredukciója és a pklid molekulák triplet állapotba kerülése, ami szinglet oxigén képződéséhez vezetne (Buhr et al. 2008). Az LHPP-k in vivo létezése azonban vitatott a szakirodalomban (Armstrong et al. 2000). Általánosan elfogadott, hogy a pigmentek makrodoménekbe való szerveződése az etiolált levelek PLT-eiben gátolja a fotooxidációs folyamatokat (Armstrong et al. 2000). Ezzel szemben a száreredetű szervekben, mint az epikotilok, a korábbiakban leírtaknak megfelelően csak kevés és kisméretű PLT fordul elő (Böddi et al. 1994, McEwen et al. 1994, Skribanek et al. 2008), a pklid-ek pedig nagyrészt monomer állapotban vannak (Böddi et al. 1994, 1998, McEwen et al. 1994, Skribanek et al. 2000, 2008). Ezzel magyarázható az erős fénnyel megvilágított borsó epikotil középső régiójában megfigyelt szinglet oxigén termelődés, lipidperoxidáció, és az ezek következtében fellépő turgorvesztés és irreverzibilis görbülés (Erdei et al. 2005). A triplet állapotú pklid-ek a környező fehérjékkel és lipidekkel közvetlen kölcsönhatásba léphetnek, ami arra utal, hogy ebben a folyamatban a szinglet oxigén mellett, az I-es típusú fotokémiai reakcióban szereplő ROS molekulák is nagy valószínűséggel termelődhetnek.

Az etioplasztiszfejlődést befolyásoló külső tényezők A plasztiszok differenciálódását a különböző növényfajokban az eltérő genetikai programon kívül az is befolyásolja, hogy milyen szerv melyik szövetében alakulnak ki (összefoglaló: Böddi 2005). Emellett fejlődésükre számos külső környezeti tényező is hat: a fény szabályozó szerepe mellett közismert a különböző tápanyagok, például a nitrogén elérhetősége (Whatley 1971). Ezen kívül meg lehet említeni a vírusfertőzést (Harsányi et al. 2002), a hidegkezelést (Böddi et al. 1997), a különböző nehézfémek, mint a kadmium (Böddi

27

et al. 1995) vagy a higany (Lenti et al. 2002, Solymosi et al. 2006) hatását, de a sótressz is befolyásolja az etioplasztiszok fejlődését (Abdelkader et al. 2007).

A citokinin hatása etiolált növények zöldülésre A citokininekről régóta ismert, hogy elősegítik az etiolált csíranövények zöldülését (Fletcher and McCullagh 1971), a szeneszcens levelek visszazöldülését, és így a kloroplasztiszok fejlődését (Zavaleta-Mancera et al. 1999b). Az utóbbi évek sejttani, spektroszkópiai és biokémiai vizsgálataival tisztázták a hatásmechanizmusuk egyes részleteit. A dolgozatban a POR enzim szerveződésével és működésével kapcsolatba hozható eredményekre térek ki. Izolált kloroplasztiszokban sokféle citokinin származékot mutattak ki, ezek mennyisége fény hatására akár háromszorosára nőtt (Benková et al. 1999). Etiolált uborka (Cucumis sativus L.) szikleveleiben szintetikus citokinin (6-aminobenziladenin) jelentősen megnövelte a POR mRNS szintjét a transzkripciós aktivitás fokozásával (Kuroda et al. 1996). Ez de novo fehérjeszintézis indukciót okozott a citoplazmában. A benziladenin kezelés a POR mRNS szintjét kb. nyolcszorosára növelte, még a POR proteinét csak kb. kétszeresére. Tehát a citokinin a POR gén expresszióját transzlációs és/vagy poszttranszlációs szinteken is szabályozza (Kuroda et al. 2001). Sárga csillagfürt (Lupinus luteus L.) etiolált szikleveleiben N6 - benzil - amino purin kezelés hatására bekövetkező gyorsabb zöldülés együtt járt a POR enzim nagyobb mennyiségével és lassabb degradációjával (Kusnetov et al. 1998). Ezzel összhangban van az az irodalmi adat, hogy szeneszcens dohány (Nicotiana rustica L.) levelek visszazöldítésének gyorsítására alkalmazott benzil-amino purin fokozta a POR gén expresszióját (Zavaleta-Mancera et al. 1999a). Ezzel szemben kifejlődött búza (Triticum aestivum L.) levelek N6 - benzil - amino purinban, sötétben történő áztatásával a klorofill tartalom 6 nap után a kiindulási mennyiség 60%-a maradt, de a POR protein mennyisége nem nőtt. Tehát búza esetében a klorofill szint fenntartása a degradációjának gátlásán és nem új bioszintézisen keresztül valósult meg (Zavaleta-Mancera et al. 2007). Az öregedő dohány és búza levelek szöveteinek eltérő reakcióját a citokininre a

28

szerzők

azzal

magyarázzák,

hogy

a

kétszikűekkel

szemben

a

pázsitfűfélék

szövettenyészeteiben a sejtek plaszticitása és totipotenciája lecsökken. A sötétben nevelt borsó (Pisum sativum L.) lip1 mutánsokat rövid epikotil és a vad típusénál nagyobb levelek jellemzik. Kloroplasztisz méretű etioplasztiszaikban nincsenek PLT-ek (Seyedi et al. 1999). Citokinin (2-izopentenil-adenin) kezelés hatására az etiolált lip1 mutáns borsó csíranövényekben csökkent a plasztiszok mérete, és helyreállt a PLT és a 655 nm-es fotoaktív pklid képzése (Seyedi et al. 2001). Etiolált lúdfű (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) csíranövényekben a citokinin (izopentenil-adenin) hatására a plasztiszok nagyobb méretűek és szabályosabb (lencse) alakúak lettek. PLT-ek nem alakultak ki, viszont a kezelés egyszerű membránok (amit a szerzők tilakoidnak, bi-tilakoidnak neveznek) fejlődésének kedvezett. Más szerzők eredményei szerint etiolált lúdfű csíranövényekben a POR három izoformája közül egyik sem reagál citokinin kezelésre (Fusada et al. 2005). Mivel a tilakoid lipidek közel 80%-át galaktolipidek (monogalaktozil-diacil-gliceridek és digalaktozil-diacilgliceridek) alkotják (Ryberg et al. 1983), valószínűsítik, hogy a citokininek a tilakoid membránok fejlődését sötétben galaktolipid akkumuláción keresztül indukálják (Chory et al. 1994). Ezek a galaktolipidek a zöldülés során, fény hatására halmozódnak fel, de uborka sziklevelekben benziladenin kezeléssel sikerült sötétben is kiváltani a szintézisüket. Ezzel párhuzamosan a benziladenin fokozta a pklid akkumulációt, de önmagában kl szintézist nem indukált (Yamaryo et al. 2003), mert ehhez DPOR aktivitás, vagy fény jelenléte is kellett volna. A citokinin tehát eltérő módon hatott a különböző fajú etiolált csíranövények POR enzim szintjére (Masuda and Takamiya 2004), plasztisz fejlődésére és pklid tartalmára. Emiatt egyes szerzők feltételezik, hogy a POR citokinin-függő aktivációja csak az olyan fajokban működik, melyek egyféle POR gént tartalmaznak, mint a borsó vagy az uborka (Fusada et al. 2005).

A nitrogénhiány hatásai a plasztiszok ultrastruktúrájára Nitrogénhiányos környezetben tipikus tünet a növények leveleinek sárgulása és csökkent mérete (Diaz et al. 2006, Zhao et al. 2005), mivel csökken a klorofill és a karotinoid tartalom, valamint a klorofill a/b arány (Sundqvist és mti, 1980) és ennek megfelelően a nettó

29

fotoszintézis mértéke is (Lawlor és mti, 1987). Leírták a klorofill metabolizmus génjeinek, köztük a POR enzim génjének a nitrogénhiányos körülmények közötti alulműködését is (Bi et al. 2007). A nitrogénmentes tápoldaton nevelt növények leveleiben található kloroplasztiszok ultrastruktúrája szintén jelentősen eltér az összes makroelemet tartalmazó Hoagland oldaton tartott

növényekétől

(Doncheva

et

al.

2001).

A

kloroplasztiszok

sztrómájában

keményítőszemcsék és plasztoglobulusok halmozódnak fel (Doncheva et al. 2001). A plasztoglobulusok feltehetően a degradálódott tilakoid membránok hidrofób komponenseinek maradványaiból összeálló lipidcseppek (Biswal és Biswal, 1988, Matile, 1992) és a tilakoidok alkotóelemeinek, főleg a lipideknek a tárolására szolgálhatnak (Steinmüller és Tevini, 1985). A plasztoglobolusok számának növekedése tehát több lipid tárolására utal (Kutik és mti, 1993). A keményítőszemcsék felhalmozódását az okozhatja, hogy több fotoszintetikus termék keletkezik, mint amennyi elszállítódik (Appenroth et al. 2003, Doncheva et al. 2001). Ez szacharóz felhalmozódáshoz vezet, ami a szacharóz szintéziséért felelős enzimekre gyakorolt gátló hatás által, elősegíti az újonnan megkötött szén keményítővé alakítását (Carmak és mti, 1994), amit az élettani funkcióiban károsodott növényi sejt nem tud hasznosítani (Nyitrai et al. 2007). A nitrogénhiány növekedésével fokozatosan nő a szár fotoszintézisben betöltött szerepe a levéléhez képest (Nilsen 1992). Ez felveti a kérdést, hogy hogyan hat a nitrogénhiány a szárak plasztiszainak fejlődésére. Magvas növények esetén a szén és nitrogén-ellátás biztosított a csírázáshoz és a fejlődés kezdeti szakaszában, azonban az etioplasztiszfejlődés szén- és nitrogén ellátottságtól való függése a szakirodalomban kevés figyelmet kapott (El Amrani et al. 1994). Tehát felvetődik a kérdés, hogy a nitrogénhiány hogyan befolyásolja az etioplasztiszok szerkezetét és a pklid formák arányait.

30

3. Célkitűzések

I. Etiolált növényekben változatos a pklid komplexek megjelenése és aránya, attól függően, hogy milyen körülmények között nevelt, milyen korú és fajú növény melyik szervét vizsgálják. Azonban, ha ezek a tényezők azonosak, akkor is lehet eltérést tapasztalni a fluoreszcencia emissziós spektrumokban, a komplexek természetes variabilitása miatt. Munkánk során kísérleteink jelentős részét etiolált borsó epikotilokon végeztük, ezért jogosan vetődött fel a kérdés, hogy az egyes pklid komplexei milyen mértékben variálnak egymáshoz képest. Ennek megválaszolására, száz minta 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumának átlagtól való átlagos abszolút eltérését terveztük kiszámítani. II. Az irodalomban feltételezik, hogy a rövid hullámhosszaknál emittáló pklid formák részben olyan komplexeket tartalmaznak, amelyekben a monomer állapotú pklid POR enzimhez kötött. A feltételezés szerint ilyen komplex lehet az etiolált borsó epikotilban található 636 nm-nél emittáló forma. Ezzel nem összeegyeztethető, hogy a monomer pklid komplexeket általánosan nem tartják flash-fotoaktívnak, csak közvetett átalakulásukat tekintik lehetségesnek. A

kérdés

tisztázására

az

említett

komplex

flash-fotoaktivitását

akartuk

tanulmányozni, hogy ezzel pontosabb információkat kapjunk a szerkezetére vonatkozóan. A rövid hullámhosszú, 632.8 nm-es He-Ne lézer megvilágítás alacsony PFD mellett ígéretes lehetőségnek tűnt a komplex esetleges szelektív átalakítására. III. Az irodalomban a flash-fotoaktív pklid komplexek között in vivo dinamikus egyensúlyt feltételeznek. Felmerülhet a kérdés, hogy ha a borsó epikotilban a P636 POR enzimhez kötött monomer pklid komplex, akkor képes-e in vivo dinamikusan átalakulni hosszabb hullámhosszú pklid komplexekké. Ennek vizsgálatára, borsó epikotilokat ugyanolyan mennyiségű fotonnal, de eltérő ideig terveztünk megvilágítani 632.8 nm-es lézerfénnyel. Ugyanis egy statikus rendszerben az várható, hogy ilyen körülmények között ugyanolyan jellegű fotoredukció menjen végbe, míg egy dinamikus rendszerben eltérő klid termékek

keletkeznének.

Természetesen

feltételeznünk

kell,

hogy

párhuzamosan 31

energiamigráció is végbemegy az egymás közelében lokalizált P644 és P655 komplexek között. IV. Az irodalomból ismert, hogy fagyasztás-felmelegítés hatására, etiolált levelek etioplasztiszaiban rendezetlenné válik a PLT-ek struktúrája, és ezzel párhuzamosan a fluoreszcencia emissziós spektrumokban csökken a P655 komplex sávjának intenzitása és rövidebb hullámhossz felé tolódik el a maximuma. Feltételezik, hogy a folyamat hátterében a komplex dezaggregációja állhat. Felmerült a kérdés, hogy ha mesterséges, fehérjeaggregációt kiváltó közegben történő elhomogenizálás után kezeljük fagyasztásfelmelegítéssel az etiolált borsó epikotilokat, akkor megakadályozható-e a 655 nm-es sáv eltűnése és a PLT-ek lebomlása. A monomer pklid komplexek túlsúlya miatt választottuk az epikotilt, mert az esetleges aggregációjuk így jobban kimutatható. Érdekes lehetőségnek tűnt ennek a kísérletnek a fordítottja is, vagyis hogy az epikotilokat fagyasztás-felmelegítés után homogenizáljuk el az aggregációt fokozó közegben és vizsgáljuk az esetleges re-aggregációt. Ilyen módon többet tudhatunk meg a monomer és oligomer komplexek szerkezetéről. V. Etiolált levelekben általánosan előfordul a 633 nm környékén emittáló monomer pklid komplex. A borsó epikotilban található P636-hoz hasonlóan, nem tartják flashfotoaktívnak. Különböző hullámhosszú lézer (632.8 és 654 nm-es) megvilágítások alkalmazásával terveztük tanulmányozni a P633 és más pklid komplexek átalakulásának a lehetőségeit etiolált búza leveleken és izolált etioplasztisz belső membránokon, mivel a búza a kl bioszintézis kutatások egyik modellnövénye. VI. Természetes fényre került etiolált borsó epikotilokban korábban szinglet oxigén termelődést és lipid peroxidációt mutattak ki, aminek következtében egy etiolált borsó növény már 30 perccel a fényre kerülése után veszít a turgorából, és a középső régiójában meggörbül. Feltételezhető, hogy a szinglet oxigén mellett más reaktív oxigénformák is termelődnek a megvilágítás közben. További érdekes kérdés ezen oxigénformák keletkezési helyének kimutatása.

32

VII. A pklid komplexek fototranszformációját követően, a folyamatos kl bioszintézis biztosítása szempontjából, fontos a fotoaktív komplexek regenerálódása. A szakirodalomban ezt általában etiolált, majd egyetlen felvillanással megvilágított leveleken vizsgálják. Felmerült a kérdés, hogy mi történik, ha folytonos, nagy intenzitású fénnyel az összes pigmentet kifehérítjük. Ezután is lehetséges-e a regenerálódásuk, és ha igen, akkor milyen sorrendben. A szárak nagyobb fényérzékenységét (levelekhez képest) kihasználva, etiolált borsó epikotilokon végeztük a kísérleteket. VIII. A sötétben nevelt borsó epikotiljában található 629 nm-nél emittáló komplex nem POR enzimhez kötött, monomer pklid-et tartalmaz. Emiatt az irodalomban azt feltételezik róla, hogy az aggregált komplexek megvilágítás utáni regenerációjában lehet szerepe, erre azonban nincsen kísérletes bizonyíték. Ezért célul tűztük ki, hogy etiolált epikotilokkal végzett kísérleteinkben külön figyelmet fordítunk ennek a komplexnek a vizsgálatára. IX. Levelek vizsgálatával kapott irodalmi adatok alapján az egyféle POR génnel rendelkező növényfajoknál (mint a borsó) egyértelműen kimutatható a citokinin hatása az enzim szintjének növekedésére, ezzel párhuzamosan pedig az etioplasztiszok szerkezetére, és a 655 nm-es pklid komplex mennyiségére, tehát a zöldülés folyamatára. Etiolált szárakra kisméretű, kevésbé rendezett struktúrájú PLT-eket tartalmazó etioplasztiszok, és kevés 655 nm-es pklid komplex jellemző. Felmerült a kérdés, hogy a citokinin a levelekben leírtakhoz hasonló módon stimulálja-e a PLT kialakulását etiolált borsó szárában. X. A nitrogénhiány hatására fellépő morfológiai, és az ezek hátterében álló élettani változásokat részletesen jellemezték a szakirodalomban fényen nevelt növények levelei esetében. Sötétben nevelt nitrogénhiányos növényekről nem találhatunk részletes jellemzést a szakirodalomban. Mivel az etioplasztiszokban a PLT jellegzetes membránrendszerének jelentős részét a POR enzimfehérjéje adja, feltételezhető volt, hogy a nitrogénhiány e struktúra kialakulásában is zavart okoz. Munkánk során célul tűztük ki a különböző mértékű nitrogénhiány hatásának vizsgálatát etiolált borsó szárak etioplasztisz fejlődésére és pklid komplexeinek mennyiségére és arányára.

33

4. Anyagok és módszerek 4.1. Növényi anyagok

Kísérleteink többségében sötétben csíráztatott borsó (Pisum sativum L. cv. Zsuzsi) csíranövények epikotilját vizsgáltuk. A magokat nedves szűrőpapíron 2 napig előcsíráztattuk, majd a csíranövényeket vízkultúrában, szobahőmérsékleten neveltük 5 – 21 napos (5 - 35 cm hosszú) korukig. A

636

nm-es

emissziós

maximumú

pklid

komplex

fotoaktivitásának

tanulmányozásához az epikotilok középső szegmenseinek kb. 2-3 cm-es szakaszait használtuk. Azokat hosszában ketté, illetve háromfelé vágtuk; az egyik darab sötét mintaként szolgált, a többit megvilágítottuk. Ugyanennek a komplexnek in vitro aggregációját és re-aggregációját is vizsgáltuk, ehhez az epikotilok középső részeiből homogenátumot készítettünk (alább részletezve). A pklid komplexek biológiai variabilitásának vizsgálatakor az epikotilok alsó szegmenseit (2 cm-re a magtól), középső szakaszait és felső régióit (2 cm-re a csúcsi levéltől) használtuk. A ROS-ok kimutatásakor a 10-15 cm-es csíranövény felső és alsó 2-3 cm-es részeit levágtuk és a maradék kb. 6-9 cm-es epikotil darabot használtuk. Exogén citokinin és nitrogénhiány szárakra történő hatásának vizsgálatára borsó hajtástenyészetet alkalmaztunk. A részletek a szervtenyésztés módszereinél találhatók. Etiolált levelek pklid komplexeinek fotoaktivitását 8 - 14 napos búza (Triticum aestivum L. cv GK Öthalom) leveleken, 8-10 napos etiolált borsó csíranövények levelein és búzából izolált etioplasztisz belső membránokon vizsgáltuk. A búzaszemeket 1 napos, csapvízben történő áztatás és levegőztetés után 800 cm3-es főzőpohárban, nedves papírvattán vagy vízkultúrában neveltük. Előbbi esetben a főzőpoharakat „Folpack” fóliával fedtük be, ami a levegő részére áteresztő, de a vízpára számára nem. A növényeket teljes sötétben, szobahőmérsékleten neveltük. Az etioplasztisz belső membránok (PLT és PT-dúsított praparátumok) izolálását és tisztítását Böddi et al. (1989) publikációban közölt módszerek alapján végezték A mintavétel a sötétben nevelt növényekről a kl-szintézisre nézve inaktív zöld fénynél történt.

34

4.2. Homogenátum készítése borsó epikotiljából és leveléből, és a homogenátumokkal végzett kísérletek

Az epikotil darabokat (gondosan elkerülve a pálhaleveleket tartalmazó nóduszokat) 50% (v/v) glicerint és 50% (m/v) szacharózt tartalmazó Na2HPO4 – KH2PO4 pufferben (pH 7.2), hűtött dörzsmozsárban homogenizáltuk 0 °C-on. A közeg hatásának vizsgálatára a kísérletsorozat egy részében a homogenizáló pufferből a glicerint és/vagy a szacharózt kihagytuk. A proteázok esetleges lebontó hatásának kiküszöbölésére proteáz inhibitor koktélt (Sigma – Aldrich P9599) tettünk a homogenizáló közegbe a gyári előírás szerint a következő arányban: 30 g növényi szövet, 1 cm3 koktél 100 cm3 végtérfogatban. A homogenátumot 4 réteg gézlapon megszűrtük, fluoreszcencia mérőcsövekbe pipettáztuk, és 2 - 10 napig – 14 °Con, sötétben tároltuk. A különböző hullámhosszúságú lézer megvilágítások hatékonyságának vizsgálatához készített borsó levél homogenátumok esetében ugyanígy jártunk el, de azokat frissen megvilágítottuk, majd acetonos pigment kivonatokat készítettünk belőlük. Az epikotil homogenátumok pontos glicerin és szacharóz koncentrációjának meghatározásához figyelembe vettük az epikotilok átlagos víztartalmát, amit a következőkben leírtak szerint határoztunk meg. Megmértük hat epikotil darab friss tömegét, majd fagyasztva szárítottuk (Unicryo-MC 4L, Uniequip, Martinsried, Németország) őket a tömegállandóság eléréséig. A víztartalom a friss tömeg 79.4 és 94.9 %-a között változott. Egy másik kísérletsorozatban elhomogenizáltunk 3 g epikotilt 50 % (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben (pH 7.2), majd refraktométerrel (Modell 1 Carl Zeiss, Jena, Németország) meghatároztuk a szacharóz koncentrációt, ami 35.8 és 38.1 % közötti értékeket mutatott. Figyelembe véve az epikotilok víztartalmát, a glicerin és a szacharóz koncentrációja a homogenátumokban 36.4 % (STDEVP 0.8) (v/v) glicerin és 36.4 % (STDEVP 0.8) (m/v) szacharóz. (STDEVP: Microsoft Excel SZÓRÁSP függvénye). Az eredmények ismertetésekor és megvitatásakor a szövegben 40 % szerepel. A foszfát puffer kiindulási pH-ja a homogenátumban 6.36-ra csökkent (pH mérő: Orion Model 420A, USA). Az ATP hatásának vizsgálatakor 50 % (v/v) glicerint és 20 % (m/v) szacharózt tartalmazó TrisHCl (pH 7.4) pufferben homogenizáltuk az epikotilokat. Ezután a 35

homogenátum egyik részéhez ATP-t adtunk 1.5 mM koncentrációban, míg a másik részéhez nem (kontroll). A kísérletet kétszer ismételtük. A fagyasztás-felmelegítés után elhomogenizált epikotilok esetében a következő módon jártunk el. A kb. 3 cm-es epikotil darabokat egyesével kezeltük. Minden epikotilt a folyékony nitrogénben történő spektrummérés után kb. 10 perc alatt szobahőmérsékleten, sötétben felengedtünk, majd újra folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és újabb spektrumot vettünk fel róluk (FfEpi). Ezután az epikotilokat egyesével elhomogenizáltuk foszfát pufferben (pH 7.2), vagy 50% (v/v) glicerint és 50% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben, vagy csak 50% (v/v) glicerint tartalmazó foszfát pufferben, majd megmértük a friss homogenátumok spektrumait. A kísérletet közegenként 5 ismétlésben végeztük el. A homogenátumban található feltételezett aggregátumok stabilitásának vizsgálatára a 4 napos sötét inkubálás után a – 14 °C-os mintákat azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, majd sötétben felmelegítettük szobahőmérsékletűre (293 K) kb. 5 perc alatt, ezután a mintákat tartalmazó mérőcsöveket, folyékony nitrogénbe mártva, újra 77 K-re fagyasztottuk. Ezt a ciklust ötször ismételtük minden minta esetében, és az összes lefagyasztás után fluoreszcencia spektrumokat mértünk. A kísérletet háromszor ismételtük. Megvizsgáltuk, hogy a 4 napig inkubált homogenátumok spektrumai hogyan változnak, ha megvilágítás után különböző ideig szobahőmérsékleten, sötétben tartjuk a mintákat (Shibata-féle eltolódás vizsgálata). A homogenátumot 1 cm-es küvettába töltöttük, és 10 s-ig 100 µmol m-2 s-1 intenzitású fehér fénnyel megvilágítottuk. Ezután a küvettát a fluoriméterbe helyeztük, és 0; 1,5; 3; 6; 10; 15; 20; 25 és 30 perc múlva szobahőmérsékleten spektrumokat regisztráltunk. Más kísérletekben etiolált borsó epikotilokban és 4 napig inkubált homogenátumokban hasonlítottuk össze a Shibata-féle eltolódást. Az epikotilokat 10 s hosszan 100 µmol m-2 s-1 intenzitású fehér fénnyel világítottuk meg, a homogenátumokat 160J/2 ms energia kibocsátású vakuval, majd 30 perc sötét inkubáció után 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokat mértünk róluk.

36

4.3. Borsó hajtástenyészet A borsó magokat 0.5%-os HgCl2-ba tettük 4 percre, majd háromszor mostuk desztillált vízben. Ezután a magokat táptalajra helyeztük. Más kísérletekben a felszíni sterilizálás után a magokból kimetszettük az embriót - a sziklevél nagy részét eltávolítva belőle - és azt tettük a táptalajra. Murashige-Skoog (MS) táptalajt használtunk (Murashige and Skoog 1962), amelyhez a következő hormonokat adtuk: Benzil-amino purin (BAP): 1.0 mg/l

(4.4 µM)

Indolvajsav (IBA):

0.1 mg/l

(0.5 µM)

Naftilecetsav (NAA):

0.1 mg/l

(0.5 µM)

A természetes fény/sötét periódus mellett kifejlődött, 5 - 8 cm-es zöld hajtásokat nodális szegmentekre daraboltuk; majd új táptalajra helyeztük, és sötétben tartottuk 2-3 hónapig. Ennyi idő kellett az 5 - 10 cm-es etiolált hajtások kifejlődéséhez. Az új táptalaj a citokinin plasztiszfejlődésre tett hatásának vizsgálatakor 1.0 mg/l vagy 0.3 mg/l vagy 0 mg/l BAP-t tartalmazott. A nitrogénhiány hatásának vizsgálatakor a táptalajban 1 mg/l volt a BAP koncentráció, a nitrogénmennyiséget pedig az A1. táblázatban feltüntetett adatoknak megfelelően változtattuk: A1. táblázat: Borsó hajtástenyészetek fenntartásához alkalmazott MS táptalajok nitrogéntartalma

Kontroll, teljes nitrogén 2/3 nitrogén 1/3 nitrogén Nitrogénmentes

KNO3 (mg/l) 1900 1267 633.5 0

NH4NO3 (mg/l) 1650 1100 550 0

4.4. Hidrogén-peroxid és szuperoxid anion kimutatása specifikus jelölőfestékekkel és borsó epikotilok kezelése exogén hidrogén-peroxiddal

A hidrogén-peroxid felhalmozódása diaminobenzidin (DAB) segítségével kimutatható, mert hidrogén-peroxid jelenlétében a peroxidáz enzim oldhatatlan barna csapadékká oxidálja (Malmgren and Olson 1977, Thordal-Christensen et al. 1997). A halványsárga NBT (nitroblue 37

tetrazolium) pedig a szuperoxiddal reagálva a szürkéskék formazán képződéséhez vezet (Beyer and Fridovich 1987). Mindkét csapadék képződése szemmel látható. A DAB festés előtt a csíranövényeket 20 percig megvilágítottuk, majd a középső 6-9 cm-es régiójukat üvegcsőbe tettük és 5 mM DAB oldattal infiltráltuk egy fecskendő segítségével. Ezt követően 18 órán át sötétben tartottuk a mintákat. Az NBT festés esetében először üvegcsőben infiltráltuk az epikotil darabokat 0.6 mM NBT oldattal, ezután 30 percig sötétben inkubáltuk, majd 600 µmol m-2 s-1 intenzitású fehér fénnyel világítottuk meg. A formazán képződését 10 perc után már látni lehetett. Exogén hidrogén-peroxid kezeléskor a 0.7 mM hidrogén-peroxidot tartalmazó foszfát puffert (pH 7.2) tű és fecskendő segítségével juttattuk be az etiolált borsó csíranövényekbe olyan módon, hogy a hossztengelyük mentén, spirál alakban haladva, kb. 1 cm-ként megszúrtuk az epikotilokat. A kontrol növényekbe csak foszfát puffert injektáltunk. Ezután minden növényt 30 percig sötétben tartottunk.

4.5. Pigmentkivonás

A pklid fotoredukció mértékének összehasonlításához borsó epikotilokban és homogenátumokban, hosszában felezett epikotilokat használtunk. Az epikotilok egyik felét megvilágítottuk (10 s 100 µmol m-2s-1), majd 80% (v/v) vizes acetonos oldatban, sötétben, 0 °C-on, dörzsmozsárban eldörzsöltük. Az epikotilok másik feléből glicerint és szacharózt tartalmazó közegben homogenátumot készítettünk, majd 4 napig -14 °C-on inkubáltuk, majd megvilágítottuk.

Ezt

követően

a

homogenátumot

tiszta

acetonhoz

adtuk

olyan

térfogatarányban, hogy az aceton végső koncentrációja szintén 80% (v/v)-os legyen (Arnon 1949). A mintákat leszűrtük, és fluoriméteren megmértük. Mivel csak a pklid és klid pigmentek arányait hasonlítottuk össze, kvantitatív koncentráció meghatározást nem végeztünk. A frissen készített, az inkubált és a fagyasztott-felmelegített homogenátumok pigmenttartalmának összehasonlításához 0.3 cm3 homogenátum és 2.7 cm3 dietil-éter keverékét sötétben, rázógépen rázattuk 2 órán át. A dietil-éteres fázisok emissziós spektrumát megmértük, majd a fluoreszcencia jel intenzitását hasonlítottuk össze 627 nm-nél.

(A 38

kísérletet megismételtük 80 és 90% (v/v)-os acetonnal is, de a csapadékképződés zavarta a kvantitatív összehasonlítást.) Az etiolált borsó szervtenyészetek szárát eldörzsöltük sötétben, 0 °C-on, 80% (v/v)-os vizes acetonos oldatban, majd a pklid-ek kis koncentrációja miatt abszorpciós spektrumok helyett

fluoreszcencia

emissziós

spektrumokat

mértünk

róluk.

A

pklid

tartalom

meghatározásához kalibrációs görbét használtunk. A görbét a következő módon készítettük. Protoklorofillt nagy koncentrációban tartalmazó tökmaghéjból 80%-os acetonnal kivontuk a pigmenteket, majd a kivonatról abszorpciós spektrumot (Shimadzu UV-2101 PC, Shimadzu Corp., Kyoto, Japán) mértünk 550-800 nm között és meghatároztuk a pigmenttartalmát (Brouers and Michel-Wolwertz 1983) módszerének megfelelően. A kivonatból hígítási sort készítettünk és szobahőmérsékleten fluoreszcencia emissziós spektrumokat mértünk az oldatokról. A fluoreszencia spektrumok 630 nm-es pklid maximumának változásából a koncentráció

függvényében

megszerkesztettük

a

kalibrációs

görbét.

A

szárak

pigmentkoncentrációit a kalibrációs görbe használatával határoztuk meg. A pigmentkivonást minden minta esetében kétszer ismételtük meg, majd az eredményeket átlagoltuk.

4.6. Megvilágítás

Fehér, folytonos fénnyel történő megvilágításokhoz wolframizzót használtunk. Az izzó maximális PFD értéke (a mintától kb. 10 cm-es távolságra elhelyezve) 1300 µmol m-2 s-1 volt, kisebb intenzitású megvilágításoknál ezt az értéket neutrális szűrőkkel csökkentettük. Fehér fényű flash megvilágításokhoz Chinon-8000 (Yokohama, Japán) fényképészeti vakut alkalmaztunk. A vaku eredeti energia kibocsátása 160 J/ 0.002 s volt, amit neutrális szűrők segítségével 6 J/ 0.002 s-ra csökkentettünk. Rövid hullámhosszú monokromatikus megvilágításokhoz He – Ne lézert (S101 Globios MOM, Budapest) használtunk, ami 632.8 nm-es hullámhosszú és 1.25-ös félértékszélességű fénnyel világított. Az energia kibocsátást neutrális szűrőkkel csökkentettük. Hosszú hullámhosszú monokromatikus megvilágításoknál lézer diódát (kwb Art. Nr. 0645-00, Stuhr, Németország) alkalmaztunk, amely 654 nm-es fényt bocsátott ki. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, a kétféle lézerfény sávjával melyik pklid komplexek gerjesztési sávja fed át, megmértük egy etiolált epikotil és egy etiolált búza levél 39

gerjesztési spektrumát (A1. ábra). Ezek mérését szobahőmérsékleten végeztük, mivel többségükben a mintákat is ugyanilyen hőmérsékleten világítottuk meg. A spektrumokat Gauss komponensekre bontottuk az irodalomból ismert komponensszámmal és sávhelyzettel (Böddi et al. 1992, 1998). Mérés közben a flash-fotoaktív P644 (639 illetve 640.7 nm-es gerjesztésű) és P655 (650 illetve 650.5 nm-es gerjesztésű) egy része átalakulhatott, tehát eredetileg ezek sávjai magasabbak voltak a sötét mintában.

A1. ábra: Sötétben nevelt borsó epikotil (fent) és búza levél (lent) szobahőmérsékleten mért fluoreszcencia gerjesztési spektruma (10 spektrum átlagából számolt). Az emissziós monokromátort 725 nm-re állítottuk 20 nm-es réssel; a gerjesztő rés 1 nm volt. Folytonos vonalak: kísérleti spektrum, és a 632.8 nm-es, illetve 654 nm-es lézerfény spektruma. Szaggatott vonalak: a kísérleti spektrumok Gauss komponensei. A számok a maximumok pozícióját jelölik nm-ben.

40

A fényintenzitás értékeket LI-189 típusú Li – Cor fotométerrel (Li-Cor Inc., Lincoln, NE, USA) mértük. A legtöbb mintát szobahőmérsékleten világítottuk meg, néhány kísérletsorozatban viszont – 15 °C, -20 °C, illetve – 60 °C-on. A minták lefagyasztása folyékony nitrogénben a megvilágítás után 5 s-mal történt.

4.7. Fluoreszcencia spektroszkópia

A fluoreszcencia emissziós és gerjesztési spektrumokat Jobin Yvon – Horiba Fluoromax 3 (Párizs, Franciaország) típusú spektrofluoriméterrel mértük. Az emissziós spektrumok mérésének ideje alatt a minták többségükben folyékony nitrogénben voltak. Az emissziós és gerjesztő rés nagyságát 2, illetve 5 nm-re állítottuk. A gerjesztő fény hullámhossza 430 nm volt az acetonos és dietil-éteres pigment extraktumok, 440 és/vagy 460 nm a többi minta esetében. Az integrációs idő 0.2 s volt a kétféle hullámhosszúságú lézerfény hatásának vizsgálatakor a borsó epikotilok és a búzalevelek mérésekor, az összes többi esetben 0.1 s. Mintánként 3 – 10 spektrum átlagát számoltattuk automatikusan

a

műszerrel,

kivéve

a

homogenátum

Shibata-féle

eltolódásának

nyomonkövetésekor szobahőmérsékleten, ahol csak 2 spektrum átlagát. Az adatgyűjtés 0.25 nm-enként történt borsó epikotilok és búzalevelek mérésekor, más mintáknál 0.5 nm-enként. A méréseket 2 – 20 különböző növényből vett mintán ismételtük meg. Ez alól kivétel a borsó epikotilokról számolt átlagspektrum (E1. ábra), amelynek kiszámításához 100 növény fluoreszcencia

spektrumát

átlagoltuk.

Az

emissziós

spektrumokat

korrigáltuk

a

spektrofluorométer hullámhossz függvényében változó érzékenységére. A gerjesztési spektrumokat szobahőmérsékleten mértük, mert a minták megvilágítása is ilyen hőmérsékleten történt. Az emissziós monokromátort 725 nm-re állítottuk, szélessége 20 nm volt, a gerjesztő résé pedig 1 nm. Az acetonos és dietil-éteres pigment extraktumokat és a megvilágított, majd sötétben tartott epikotil homogenátumok egy részét 1 cm-es küvettában szobahőmérsékleten mértük.

41

4.8. Számítógépes spektrumanalízis

A spektrumokat SPSERV V.3.11 programmal (Bagyinka Csaba, MTA SZBK Biofizikai Intézet) dolgoztuk fel. Öt pontos lineáris simítást, alapvonal korrekciót, különbségi spektrum számítást és Gauss komponensekre való bontást végeztünk. A bontás a hullámszám függvényében történt, az illesztés hibája minden esetben 1% alatt volt. A bontás eredményeit a program automatikusan visszaszámolta hullámhossz függvényébe a könnyebb értehetőség kedvéért. A háromdimenziós és topológiai leképezések SURFER Version 5.02 (Golden Software, Inc.) programmal készültek. A borsó epikotilok átlagspektrumát és az átlagtól való eltérést (= az adatpontoknak az átlaguktól való átlagos abszolút eltérése, az Excel AVEDEV/ÁTL. ELTÉRÉS függvénye) Microsoft Excel 2000 programmal számítottuk ki (E1. ábra).

4.9. Elektronmikroszkópia

Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz a mintákat glutáraldehidben (2%, 3 óra) és ozmium-teroxidban (1%, 2 óra) fixáltuk, 70 mM foszfát puffert (pH 7.2) alkalmazva. A homogenátumok estében a glutáraldehides fixálás után a mintákat lecentrifugáltuk (5 perc, 16 000 g), a keletkezett csapadék feloldásakor agar oldattal elkevertük, majd a megszilárduló agart kis darabokra vágtuk. Ezután kerültek csak a minták az ozmium-tetroxidba. A dehidratációt etanol (25; 50; 70; 90; 96; 100 %) sorral végeztük. Ezt követően a mintákat propilénoxidban, Durcupán ACM I. (Fluka Chemie, AG) és propilénoxid keverékében, majd 1 éjszakán át Durcupán ACM I.-ben tartottuk. Ezután Durcupán ACM II.-be kerültek, majd polimerizáltattuk a műgyantát (2.5 nap, 60 ºC). A metszést Reichert-Jung ULTRACUT E ultramikrotommal (Bécs, Ausztria) végeztük. A metszetek kontrasztosítása uranil-acetáttal és ólóm-citráttal (Reynolds 1963) történt. A metszeteket Hitachi 7100 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Hitachi Corp., Tokyo, Japán) vizsgáltuk (75 kV gyorsítófeszültséget alkalmazva).

42

5. Eredmények

5.1. Az etiolált borsó epikotil fluoreszcencia emissziós sajátságai Munkánk egyik tervezett fő célja a monomer pklidet tartalmazó komplexek fotobiológiai szerepének és a többi pklid komplexszel való kapcsolatának vizsgálata volt. Ezek tanulmányozására a szakirodalomban általánosan használt leveleknél alkalmasabbnak bizonyultak a szárak, mivel bennük a monomer állapotú pklid komplexek dominálnak (I6. ábra), ezért kísérleteink nagy részét etiolált borsó csíranövények epikotiljain végeztük. Ezekben két különböző spektrális tulajdonságú, 630 és 636 nm körül emittáló monomer komplexet (P630 és P636; a továbbiakban Pxxx/Cxxx = xxx nm-nél emittáló pklid/klid komplex) mutattak ki, melyek aránya a hosszabb hullámhosszú formákhoz képest változik az epikotilok hossztengelye mentén (Böddi et al. 1994). 5.1.a A legfelső, középső és legalsó epikotil szegmensek összehasonlítása Száz etiolált borsó csíranövény alsó, középső és felső epikotil régiójának, 440 nm-es gerjesztéssel mért átlagspektrumai nagyon hasonlítanak egymásra. A 632 nm-es maximum és a 655 nm-nél megjelenő váll fluoreszcencia intenzitás aránya a felső régió átlagspektrumában 4.5, a középsőében 5.0, az alsóról mértben pedig 4.6. Tehát a monomer pklid komplexek legnagyobb arányban az epikotilok középső régiójában találhatóak, kísérleteinkben ezt a szakaszt használtuk. Az E1A. ábra a száz növény középső epikotil régiójáról felvett spektrumok átlaga Gauss-komponensekre bontva. A különböző régiók emissziós spektrumainak hasonlóságával szemben a 100 különböző etiolált borsó csíranövény legfelső (a), középső (b) és legalsó (c) epikotil szegmenseinek 77 K-en mért fluoreszcencia emissziós spektrumainak átlaguktól való átlagos abszolút eltérése (E1B ábra) jelentősen különbözik egymástól. A felső epikotil régió átlag eltérés „spektruma” (E1B ábra, a görbe) volt a legkisebb intenzitású. A rövidebb hullámhosszú régióban a 629 és 636 nm-es komponensek átfedéséből kialakuló sáv volt megfigyelhető, míg a hosszabb hullámhosszú pklid komplexek fluoreszcencia emissziós tartományában egy jól

43

ÁTL. ELTÉRÉS E1. ábra: A: 100 különböző etiolált borsó csíranövény középső epikotil szegmensének átlagspektruma (folytonos vonal), és annak Gauss komponensei (szaggatott vonal). Az analízis egyszerűsítése érdekében az átlagspektrumot elosztottuk a maximumával. Valamennyi spektrumot 77 K-en regisztráltuk 440 nm-es gerjesztéssel. A számok a spektrum, illetve a Gauss komponensek maximumai nm-ben kifejezve. B: 100 különböző etiolált borsó csíranövény legfelső (a), középső (b) és legalsó (c) epikotil szegmenseinek 77 K-en mért fluoreszcencia emissziós spektrumainak átlaguktól való átlagos abszolút eltérése. A spektrumokat az átlag eltérés kiszámítása előtt az integráljukra normáltuk.

elkülönülő 655 nm-es maximum. A középső régió spektrumaiban a 636 nm-es sáv variabilitása volt a legnagyobb (E1B ábra, b görbe), de jelentősen változékony volt a fluoreszcencia jel relatív intenzitása 626 és 656 nm környékén is. Érdemes megjegyezni, hogy a három vizsgált régió átlagos eltérés „spektrumai” közül ennek a középső epikotil szegmensre számoltnak volt a legnagyobb a relatív intenzitása. A legalsó régió átlagos eltérés spektrumának pklid régiójában egy 635 és egy 656 nm-es maximummal rendelkező sáv különült el (E1B ábra, c görbe), illetve megjelent egy 674 nm körüli maximummal rendelkező sáv is a kl(id) fluoreszcencia tartományban. Megjegyzendő, hogy az átlag eltérés spektrumokban jelentkező sávok helyzetei nem mindig egyeznek meg az átlagspektrumok

44

sávhelyzeteivel. Ez annak köszönhető, hogy a Gauss komponensek átfedő régióinak átlagos eltérés értékei másképpen változnak, mint a komponensek maximumai közelében, ahol kicsi vagy nincs átfedés. 5.1.b A 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok sávarányainak változása az epikotilok korával A további pontokban (Eredmények II., IV., V.) ismertetett kísérleteinkben 5-18 napos etiolált borsó csíranövények középső epikotil régióit használtuk, leggyakrabban 6-13 napos növényekkel dolgoztunk. Érdekes volt tehát megvizsgálni, hogy a középső régió rövid és hosszú hullámhossznál emittáló pklid komplexeinek biológiai változékonysága mennyire függ a csíranövények korától. csíranövényeket,

a

Három csoportban, külön vizsgálva 6, 9 és 13 napos

középső

epikotil

régióikról

mértünk

fluoreszcencia

emissziós

spektrumokat, majd azokat az integráljukra történő normálás után az egyes csoportokon belül átlagoltuk (E1. táblázat). A három csoport átlagspektruma egymáshoz hasonló volt, a korral párhuzamosan nőtt a spektrumokban a 655 nm-es váll relatív aránya a 632 nm-es maximumhoz képest (E1. táblázat, 7. oszlop). A spektrumok átlagtól való átlagos eltérése, ugyanúgy, mint a különböző epikotil régiók összehasonlításakor, az átlagspektrumokhoz képest nagyobb különbségeket mutatott. Minden vizsgált középső epikotil szegmens esetében a 636 nm-es sáv variabilitása volt a legnagyobb, a 655 nm-es sáv biológiai változékonysága csak az idősebb, 13 napos epikotilok esetén közelítette meg a rövidebb hullámhosszú pklid komplexekét. E1. táblázat: A rövid és hosszú hullámhosszú pklid formák relatív fluoreszcencia intenzitásának változása etiolált borsó epikotilok középső szegmensében a kor függvényében. A 632 és 655 nm-es sávok relatív amplitúdóit 10-10 darab 6, 9 és 13 napos csíranövények epikotiljáról mért, majd integráljára normált 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok átlagából határoztuk meg (a táblázat 2. és 5. oszlopa). A spektrumokat 440 nm-es gerjesztéssel mértük. A spektrumok átlaguktól való átlagos abszolút eltérés „spektrumai” az E1B ábra b görbéjéhez hasonlóan a rövid hullámhosszú pklid régióban két maximumot mutattak (a táblázat 3. és 4. oszlopa), illetve elkülönült bennük egy 656 nm-es sáv is (a táblázat 6. oszlopa). A 632 nm-es Átl. eltérés Átl. eltérés Átl. eltérés A 655 nm-es maximum A borsó 626 nm 636 nm 656 nm 632/655 váll relatív relatív csíranövény környékén környékén környékén arány amplitúdója amplitúdója kora (nap) (/100) (/100) (/100) (/100) (/100) 1,5895 0,0153 0,0335 0,2799 0,0090 6 5,7 9

1,5370

0,0228

0,0283

0,3133

0,0086

4,9

13

1,5120

0,0229

0,0242

0,3294

0,0208

4,6

45

5.2. A 636 nm-es emissziós maximumú protoklorofillid forma átalakulása megvilágítás hatására borsó epikotilban

5.2.a Fehér fényű felvillanásos megvilágítás hatása A

borsó

epikotil

különösen

alkalmas

a

monomer

P636

fotoaktivitásának

tanulmányozására, mivel a P655 csak kis mennyiségben van benne jelen, így fototranszformációja nem fedi el a rövidebb hullámhosszaknál emittáló komplexek átalakulásait. A pklid redukciójának kiváltására etiolált levelekben, általában nagy intenzitású, fehér fényű flash megvilágítást alkalmaznak, mert így szinkronizáltan átalakul az összes fotoaktív pklid klid-dé. A szakirodalmi adatokkal való összehasonlíthatóság miatt első kísérletsorozatunkban mi is ilyen megvilágítást alkalmaztunk. Etiolált borsó epikotil megvilágítása 160 J/ 0.002 s energia kibocsátású vakuval viszont a teljes fluoreszcencia jel nagymértékű csökkenését okozta: a megvilágított minta spektrumának integrálja csak 46%-a volt a sötét mintáénak. Annak ellenére, hogy a pklid és a klid fluoreszcencia hozama eltérő, a változás mértéke és jellege arra utal, hogy a pigmentek kifehéredtek („bleaching” ment végbe), vagyis lebomlottak. A klid régióban (660-720 nm) látható aszimmetria kevés klid képződését jelzi 692 nm környékén, ami a P655 fotoredukciójának eredménye (E2. ábra). A fent leírt kifehéredés ellenére kísérleteinket flash megvilágítással folytattuk, mert a pklid flash megvilágításra történő átalakulása egyértelmű bizonyítéka annak, hogy az adott pigment a POR enzim aktív centrumában kötött. Tehát a szárak felvillanásos megvilágítás hatására lejátszódó zöldülésének vizsgálata közvetlen információkat tud adni a POR enzimhez kötött pklidekről. A bleaching mértékének csökkentése céljából viszont neutrális szűrőket alkalmazva, kisebb intenzitású, 6 J/ 0.002 s energiájú fénnyel világítottuk meg az etiolált epikotilokat. A nem megvilágított (sötét) (E3. ábra, A görbe) és flash fénnyel megvilágított minták (E3. ábra, B görbe) 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumait maximumra normálás után kivontuk egymásból. Az így kapott „megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumban 635.5 és 641.0 nm-es maximumú negatív sávok, illetve 678.5 és 686.5 nm-es pozitív sávok jelentek meg. A negatív sávok az átalakult P636 és P644 komplexnek, a pozitív sávok pedig a keletkezett C678 és C684 komplexnek felelnek meg (E3. ábra, C görbe).

46

E2. ábra: Sötétben nevelt borsó csíranövények hosszában felezett epikotiljának 77 K fluoreszcencia emissziós spektruma flash megvilágítás előtt (a, és hatszoros nagyítása: A) valamint megvilágítás után (b, és hatszoros nagyítása: B). A flash fény intenzitása 160 J/ 2 ms volt. Gerjesztési hullámhossz: 440 nm.

E3. ábra: Sötétben nevelt borsó csíranövények epikotiljának 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai megvilágítás előtt (A) és után (B), illetve ezek különbségi spektruma (C). Az A és B spektrumot ugyanannak a hosszában elvágott epikotilnak a darabjairól mértük, a spektrumokat a maximumukra normáltuk a különbségi spektrum (B-A) képzése előtt. A számok a maximumok pozícióját jelölik nm-ben. A flash fény intenzitása 6 J/ 2 ms volt. Gerjesztési hullámhossz: 440 nm.

47

5.2.b Folytonos, kis intenzitású fehér fény hatása Mivel még a csökkentett intenzitású polikromatikus flash megvilágítás is okozott pigment kifehéredést és csak kisebb mértékű fotoredukciót váltott ki, kísérleteink következő sorozatában kis intenzitású (10 µmol m-2s-1), folytonos (10 s) fehér fénnyel világítottuk meg a mintákat. Ennek hatására a „megvilágított (E4. ábra, B görbe) mínusz sötét (E4. ábra, A görbe)” különbségi spektrumban negatív sávok jelentek meg 638.0, 641.5 és 655.0 nm-es emissziós maximumokkal. Ezek a nekik megfelelő pklid komplexek fototranszformációját mutatják. A különbségi spektrumban megfigyelhető pozitív sávok klid keletkezését jelzik. A régió Gauss bontásával a következő maximumú sávok különíthetők el: 675.5, 684.0 és 690.0 nm (E4. ábra, C görbe).

E4. ábra: Etiolált borsó csíranövény hosszában elfelezett epikotiljának 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai megvilágítás előtt (A), 10 s időtartamú, 10 µmol m-2 s-1 megvilágítás után (B) és a különbségi spektrumuk (C). A spektrumokat a maximumukra normáltuk a különbségi spektrumuk (B – A) számítása előtt. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt. A 650-700 nm régiót Gauss komponensekre bontottuk (hosszú periódusú szaggatott vonalak). A számok a maximumok pozícióját jelölik nm-ben.

48

5.2.c 632.8 nm-es lézerfény hatása Azért, hogy a P636 fototranszformációját a többi komplex átalakulásától elkülönítve tudjuk vizsgálni, a következő kísérletekben a mintákat monokromatikus, 632.8 nm-es fényt kibocsátó lézerrel világítottuk meg. Ez a hullámhossz nagyon közel van a P636 szobahőmérsékleten mérhető 632.5 nm-es gerjesztési maximumához (A1. ábra). Az Anyagok és módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően (A1. ábra) a P636-C678 átalakulás teljesen szelektív kiváltása nem megvalósítható in vivo körülmények között, de a monokromatikus megvilágítás lecsökkentheti a többi fototranszformációs folyamat mértékét, és így kimutatható volt a P636 fotoaktivitása. A következő kísérletben 15 µmol m-2 fluxusú fénnyel világítottunk meg epikotil darabokat úgy, hogy a fény intenzitását és a megvilágítási időt változtattuk. 150 µmol m-2s-1 intenzitású 100 ms időtartamú lézer flash megvilágítás hatására a P636 átalakult. Ezt mutatja a „megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumban a negatív sáv 636 nm-nél és a megfelelő pozitív sáv 678 nm körül a klid régióban. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető a P644 fototranszformációja is (E5. ábra, A görbe). Ugyanezeknek a komplexeknek az átalakulása még kifejezettebb volt, mikor a megvilágító lézerfény intenzitását 15 µmol m-2s-1-ra csökkentettük, a megvilágítási időt pedig 1 s-ra növeltük (E5. ábra, C görbe). A fényintenzitás további csökkentése 1.5 µmol m-2s-1-ra, a megvilágítási idő párhuzamos növelésével 10 s-ra, a P644 fotokonverziójának megnövekedését eredményezte (E5. ábra, D görbe). A P636 átalakulásának mértéke megegyezett az előző, 15 µmol m-2s-1/1 s megvilágításnál megfigyeltekkel. A P636 és P644 fotoredukciója mellett a P655 transzformációja is megfigyelhető volt 0.75 µmol m-2s-1 intenzitású 20 s-os megvilágítás eredményeként (E5. ábra, F görbe). Hosszú idejű (10 perces), 0.75 µmol m-2s-1 intenzitású lézerfény (450 µmol m-2 fluxus) hatékonyan váltotta ki a P655 fototranszformációját, és a C692 akkumulációját (E5. ábra, G görbe). Az összes különbségi spektrumban a 636-os negatív sáv mindig együtt fordult elő a 678-as pozitív sávval. Ennek ellenére felmerült a lehetőség, hogy a szobahőmérsékleten történő megvilágítás alatt a P636 fototranszformációja, az irodalomban általánosan elfogadott reakcióséma szerint, a P644 és P655 formákon keresztül megy végbe. Ennek ellenőrzésére

49

több mintát – 15 °C-on világítottunk meg, mert ilyen hőmérsékleten a membránokban történő molekuláris mozgások, mint a P636 – P644 – P655 átalakulás, nagymértékben gátoltak. 150 µmol m-2s-1 intenzitású, 100 ms hosszú lézer megvilágítás hatására nagyon hasonló különbségi spektrumot kaptunk ahhoz, mikor a mintákat ugyanilyen intenzitású és időtartamú fénnyel szobahőmérsékleten világítottuk meg (E5. ábra, B görbe). 10 s hosszú; 1.5 µmol m-2s-1 intenzitású, – 15 °C-on történő megvilágítás szintén kiváltotta a P636 fototranszformációját (E5. ábra, E görbe). Az ugyanilyen körülmények között történő szobahőmérsékletű megvilágítás hatásától eltért abban, hogy a P644 és P655 jelentős mértékű fotoredukcióját is kiváltotta.

E5. ábra: Fototranszformáció etiolált borsó csíranövények epikotiljában 632.8 nm-es lézerfény hatására. Minden esetben egy hosszában elfelezett epikotilnak a két darabját használtuk sötét és megvilágított mintának. A róluk mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokat a maximumukra normáltuk, majd a (megvilágított mínusz sötét) különbségi spektrumukat kiszámoltuk, ezek láthatóak az ábrán. Az egyes spektrumokat 5 mérés átlagából számítottuk. A megvilágítások intenzitása/időtartama: 150 µmol m-2 s-1/ 100 ms (A és B); 15 µmol m-2 s-1/ 1 s (C); 1.5 µmol m-2 s-1/10 s (D és E); 0.75 µmol m-2 s-1 /20 s (F); 0.75 µmol m-2 s-1/ 10 perc (G). A – F esetben a fény fluxusa 15 µmol m-2; a G megvilágításnál 450 µmol m-2. Az A, C, D, F és G spektrumokat olyan mintákról mértük, melyek megvilágítása szobahőmérsékleten történt (folytonos vonalak); a B és E spektrumok pedig – 15 °C-on megvilágított mintákról készültek (szaggatott vonalak). A függőleges vonalak 636 és 678 nm-nél vannak.

50

A pklid komplexek fotoredukciója időbeni lefutásának részletesebb vizsgálatához etiolált epikotilokat 1 µmol m-2s-1 intenzitású lézerfénnyel világítottunk meg 10, illetve 20 s hosszan. A 10 s-os megvilágítás hatására a P636 és a P644 alakult át, a „megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumban negatív sávként jelentkeztek (E6. ábra, A görbe). Ez a különbségi spektrum nagyon hasonlít az E5. ábra C és D spektrumára. A hosszabb (20 s) megvilágítás kiváltotta a P655 fototranszformációját is. A spektrum strukturáltsága lehetővé tette a Gauss komponensekre történő bontást. A negatív sávok maximumai 637, 644 és 656 nm-nél voltak, a pozitív sávok pedig 674, 682 és 690 nm-nél jelentek meg (E6. ábra, B görbe). A 20 s hosszan megvilágított minták spektrumából kivonva a 10 s-ig megvilágított minták spektrumát, olyan különbségi spektrumot kaptunk, amelyben 636 és 650 nm körül negatív sávok voltak, a klid régióban pedig 670 nm felett pozitív sávok (E6. ábra, C görbe). Ez arra utal, hogy a P636 fototranszformációja még a megvilágítás 10. és 20. másodperce között is folytatódik, de ilyenkor már a P655 átalakulása a legkifejezettebb.

E6. ábra: Sötétben nevelt borsó csíranövények epikotiljában 632.8 nm-es lézerfény (1 µmol m-2 s-1 intenzitású) hatására bekövetkező pklid fotoredukció. A: 10 s, B: 20 s megvilágítás. Az ábrán “megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumok láthatóak. Minden összetartozó megvilágított és sötét minta ugyanannak a hosszában elfelezett epikotil darabnak a két része; ezekről mértünk 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokat, amelyeket a különbségi spektrumok képzése előtt a maximumukra normáltuk. A C spektrum a “B”-“A” különbségi spektruma. A “B” spektrumot Gauss komponensekre bontottuk (szaggatott vonalak). A vonalkázott Gauss komponensek a 636 nm-es protoklorofillid forma közvetlen átalakulását emelik ki 678 nmes klorofillid formává.

51

5.3 Etiolált levelek és izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek átalakulása 632.8 és 654 nm-es lézerfény hatására Mivel a P636 átalakul flash megvilágítás hatására borsó epikotilban, felvetődik a kérdés, hogy az etiolált levelekben kimutatott monomer pklid komplex (P633) az általánosan elfogadott fototranszformációs sémák szerint miért nem. Az irodalomban található hipotézisek szerint ugyanis legalább egy részük hármas komplexet alkothat POR enzimmel és NADPHval (Schoefs 2001). Ennek a kérdésnek a vizsgálatára etiolált búza leveleket világítottunk meg a borsó epikotilokhoz hasonlóan fehér és 632.8 nm-es lézerfénnyel. Tekintettel arra, hogy a borsó epikotilban a 632.8 nm-es lézerfény több kísérleti beállításban is kiváltotta a P655 fototranszformációját is (E5. ábra E, F, G spektrumok és E6. ábra B, C spektrumok), és ez a komplex túlsúlyban van az etiolált levelekben, 654 nm-es lézer megvilágítást is alkalmaztunk összehasonlításként. A megvilágításokat szobahőmérsékleten és 0 °C alatti hőmérsékleten is elvégeztük annak érdekében, hogy tanulmányozzuk a pklid formák egymásba történő átalakulásának lehetőségeit is. 5.3.a Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekben Szobahőmérsékleten, 10 s hosszú, 5 µmol m-2s-1 foton flux denzitású fehér, illetve lézer (632.8 és 654 nm) fénnyel történő megvilágítás hatására jelentős eltéréseket figyeltünk meg sötétben nevelt búza levelek 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban. Minden esetben 674.5 és 684.5 nm-nél emittáló klid formák keletkeztek, de eltérő arányokban (E7. ábra, A-C spektrumok). A legnagyobb arányú C674.5 kialakulást a 632.8 nm-es lézer váltotta ki (E7. ábra, B spektrum), míg a legnagyobb mértékű fototranszformáció a 654 nm-es lézer hatására zajlott le (E7. ábra, C spektrum). Ha a megvilágítás az említett fehér és kétféle hullámhosszúságú lézerfénnyel -20 ºC-on történt, az minden kísérletben egy 684.5 nm-nél emittáló klid komplex kialakulását eredményezte (E7. ábra, D-F spektrumok). A szobahőmérsékleten zajló megvilágításhoz hasonlóan, - 20 ºC-on is a 654 nm-es lézer volt a leghatékonyabb (E7. ábra, F spektrum).

52

E7. ábra: Sötétben nevelt 9 napos búza levelek 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai 5 s hosszú 5 µmol m-2s-1 foton flux denzitású fehér (A, D), 632.8 nm-es lézer (B, E), illetve 654 nm-es lézer (C, F) megvilágítás után. A megvilágítás szobahőmérsékleten (A-C) vagy –20 °C-on történt (D – F). A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt, a spektrumokat a totál integrál értékükre normáltuk.

Még alacsonyabb hőmérsékleten (-60 ºC-on) történő megvilágítás kis intenzitású (0.75 µmol m-2s-1) lézerfénnyel 10 s időtartamig, az előző kísérlethez hasonlóan C684.5 termék felhalmozódását

eredményezte

függetlenül

a

megvilágító

monokromatikus

fény

hullámhosszától (E8. ábra, B panel). Azonban a fototranszformáció mértékében jóval nagyobb volt az eltérés a 654 nm-es lézerfény javára, összehasonlítva a -20 ºC-on kivitelezett megvilágítással. Ezzel szemben, szobahőmérsékleten a kétféle lézer jelentősen eltérő hullámhossznál emittáló klid formák kialakulásához vezetett: a rövid hullámhosszú lézer C676, míg a hosszú hullámhosszú C689.5 keletkezését váltotta ki (E8. ábra, A panel).

53

E8. ábra: A megvilágítás alatti hőmérséklet hatása a klid keletkezésre 8 napos etiolált búza levelekben. A 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokat olyan mintákról mértük, amelyeket előzőleg 0.75 µmol m-2 s-1 foton flux denzitású 632.8 nm-es (szaggatott vonalak) vagy 654 nm-es (folytonos vonalak) lézerfénnyel világítottunk meg szobahőmérsékleten (A) vagy – 60 °C-on (B) 10 s hosszan. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt, a spektrumokat a totál integráljukra normáltuk.

5.3.b Etiolált búza levelek megvilágítása lézer flash-ekkel Annak eldöntésére, hogy szelektíven felhalmozható-e, és ha igen, akkor milyen mértékben a rövid hullámhosszú klid forma (C676), nagy intenzitású (200 µmol m-2s-1 PFD) 632.8 nm lézer felvillanásokkal (20 ms) világítottunk meg etiolált búza leveleket (E9A. ábra). Összehasonlításként elvégeztük a kísérletet 654 nm-es lézerfényt alkalmazva is, amely a C691.5 akkumulálódásához vezetett (E9A. ábra). A relatív fluoreszcencia emisszió értékek 674 és 691 nm környékén a felvillanások számának függvényében telítési görbét mutatnak (E9B. ábra). Érdemes azonban megjegyezni, hogy tíz flash esetén a 632.8 nm-es lézer hatására a C674.5 mellett C691.5 is keletkezett, illetve a 654 nm-es lézer a C691.5 mellett kiváltott valamennyi C674.5 keletkezést is.

54

E9A.ábra: Rövid (674 nm) és hosszú (691 nm) hullámhossznál emittáló klid formák fokozatos felhalmozódása nagy intenzitású (200 µmol m-2 s-1 PFD) 632.8 nm-es (szaggatott vonalak) és 654 nm-es (folytonos vonalak) lézer felvillanások sorozatának eredményeként. Az összesen 10 lézer flash hossza egyenként 20 ms volt, amit 2 s sötét periódus követett mindkét lézer alkalmazásánál. A 8 napos búza levelekről mért 77K fluoreszcencia emissziós spektrumokat a maximumukra normáltuk, majd „megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumokat képeztünk. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt. A lézer flashek számát a spektrumok bal oldalán található számok jelzik. E9B. ábra: A fluoreszcencia jel intenzitása látható 674 és 691 nm-nél a lézer felvillanások számának függvényében. (Az adatokat integráljukra normált spektrumokból olvastuk le.) Az adatpontokra harmadfokú polinomiális illeszkedett a legjobban.

55

Ez felvetette azt a lehetőséget, hogy a keletkező klid komplex tulajdonságait esetleg csak a megvilágító fény intenzitása befolyásolja és független annak hullámhosszától. Ennek megfelelően a következő kísérletsorozatban két egymást követő 632.8, illetve 654 nm-es lézer flash-t alkalmaztunk, különböző foton flux denzitásokkal 60 µmol m-2s-1-tól 240/360 µmol m2 -1

s -ig (E10. ábra). A kis intenzitású (60-120 µmol m-2s-1) 632.8 nm-es lézer felvillanások

hatására csak C674.5 keletkezett (E10. ábra, B és C, szaggatott görbék). Hasonlóan, 675 nm körül emittáló klid volt a fő termék szintén kis intenzitású (60 µmol m-2s-1 PFD), de 654 nm-es lézer flashek alkalmazásakor (E10. ábra, B folytonos spektrum). Ugyanakkor, nagy intenzitású (360 µmol m-2s-1) 632.8 nm-es lézer flashek hatására (nem mutatott spektrum), ugyanúgy, mint kevésbé nagy intenzitású (240 µmol m-2s-1) 654 nm-es lézerfény esetén (E10. ábra, D folytonos sepktrum) is C690.5 jött létre.

E10. ábra: Két lézer flash eredményeként keletkező rövid és hosszú hullámhosszú klid formák arányának függése a megvilágító fény intenzitásától és hullámhosszától 14 napos etiolált búza levelekben. A flashek egyenként 20 msig tartottak, közöttük 2 s sötét periódus volt. Megvilágításra 632.8 nm-es (szaggatott görbék) és 654 nm-es (folytonos görbék) lézerfényt alkalmaztunk a következő PFD értékekkel: 60 µmol m-2 s-1 (B), 120 µmol m-2 s-1 (C), 240 µmol m-2 s-1 (D). A 77K fluoreszcencia emissziós spektrumokat 440 nm-es gerjesztéssel mértük és a teljes integráljukra normáltuk. Összehasonlításként egy etiolált levél spektrumát (A) is feltüntettük.

56

5.3.c Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekből izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek fototranszformációjára A hőmérsékleten, a megvilágító fény hullámhosszán és intenzitásán kívül más tényezők is befolyásolják a fototranszformációt, a keletkezett klid tulajdonságait. Izolált etioplasztisz belső membránok esetében a közeg és a NADPH mennyisége alapvető fontosságú körülmény. Akár PLT-ekben, akár PT-okban dúsított izolált etioplasztisz belső membránokat világítottunk meg 10 s hosszan 5 µmol m-2s-1 foton flux denzitású fénnyel, mindkét hullámhosszú lézer hosszú hullámhosszú klid sávot eredményezett 690-691.5 nm környékén a 77K fluoreszcencia emissziós spektrumokban. Csupán a fototranszformáció mértékében volt kevés különbség (E11. ábra A és B panel). Ezen eredmények arra utaltak, hogy

alapjában

szabályozta

véve a

az

izoláló

közeg

fototranszformációt.

Összehasonlításul az E11. ábra C panel azonos körülmények között megvilágított etiolált búza levél homogenátum (40 % v/v glicerin és 40 % m/v szacharóz) spektrumát mutatja, melyben a fototranszformáció eredményeként egy 687.5 nm-es sáv jelent meg. A fototranszformációt befolyásoló

leglényegesebb

különbség

az

etioplasztisz belső membránok izoláló közege és a homogenizáláskor alkalmazott között, hogy utóbbiból hiányzott az exogén NADPH. E11. ábra: Izolált prolamelláris testek (A), protilakoidok (B) és 9 napos etiolált búza levelekből készített homogenátum (C) 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai 5 s hosszú 10 µmol m-2 s-1 intenzitású megvilágítás előtt (pontozott vonalak) és után (632.8 nm-es lézerrel: szaggatott vonalak, 654 nm-es lézerrel: folytonos vonalak). A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt, a spektrumokat a teljes integráljukra normáltuk. A homogenizálásra használt foszfát puffer 50% (v/v) glicerint és 50% (m/v) szacharózt tartalmazott.

57

5.3.d Búza és borsó levél összehasonlítása Az előbbiekben leírt in vitro eredményekkel ellentétben, az in vivo megfigyelések alapján a rövid és hosszú hullámhosszú pklid-ek aránya az etiolált mintákban befolyásolja a fototranszformáció kimenetelét, ezért érdekes volt összehasonlítani az etiolált búza leveleket a több rövid hullámhosszú pklid-et tartalmazó borsó levelekkel. Nagy intenzitású (100 µmol m-2s-1 felett) folytonos (5 s) lézerfény hatására, függetlenül annak hullámhosszától és attól, hogy etiolált búza vagy borsó levelet világítottunk meg, minden esetben 692-693.5 nm-es emissziós maximumú klid termék keletkezett. A kis intenzitású 632.8 nm-es fény pedig már a sok P655-öt tartalmazó búza levél esetében is rövid hullámhossznál emittáló klid-et eredményezett (E8. ábra, szaggatott vonal), borsó levél ilyen megvilágításakor szintén 676 nm-es maximummal rendelkező klid alakult ki. Viszont ha megvilágító fénynek kis intenzitású (10 µmol m-2s-1), folytonos (5 s) 654 nm-es lézerfényt választottunk, akkor eltérő eredményt kaptunk borsó és búza levelek esetében. Búza levelekben így hosszú hullámhosszú klid termék alakult ki (E12. ábra, folytonos vonal), hasonlóan a megvilágított borsó levelekben is, de azok spektrumában megjelent egy váll 678 nm-nél (E12. ábra, szaggatott vonal).

E12. ábra: Sötétben nevelt 8 napos búza (folytonos vonal) és borsó (szaggatott vonal) levelek 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai 5s 10 µmol m-2 s-1 foton flux denzitású 654 nm-es lézer megvilágítás után. A 440 nm-es gerjesztéssel mért spektrumok a teljes integráljukra lettek normálva.

58

A következő kísérletsorozatban a már bemutatott, megvilágított PLT és PT preparátumok (E11. ábra), illetve frissen készített borsó levél homogenátumok acetonos pigment kivonatait hasonlítottuk össze (E13. ábra). (A homogenátum készítését az indokolta, hogy az egyszerre megvilágított egy-egy levélből készített pigmentkivonat túl híg lett volna, további előnye a homogenátumnak, hogy több levélből készült, így egy átlagot mutat. Búza helyett azért kerül a megvilágított borsó levél homogenátum pigmentkivonatának jellemzése bemutatásra, mert a búzából izolált etioplasztisz belső membránok spektrumának klid régiója jobban eltér egy megvilágított borsó levélétől, mint egy búzáétól, ahogyan az E11. és E12. ábrákon látható.) A megvilágítás minden esetben 5 s hosszú volt és 10 µmol m-2s-1 intenzitású a 632.8 (jobbra emelkedő vonalkázású oszlopok) és a 654 nm-es (balra emelkedő vonalkázású oszlopok) lézer egyedüli használatakor. Mikor mindkét lézerrel egyszerre történt a megvilágítás, az intenzitás 5+5 µmol m-2s-1 (üres oszlopok), illetve 10+10 µmol m-2s-1 (keresztbe vonalkázott oszlopok) volt. Az extraktumok alapján a 654 nm-es lézer nagyobb mennyiségű klid-et eredményezett, mint a 632.8-as, ez alól csak az inkubált borsó levél homogenátum volt kivétel. Nem volt erősítési effektus megfigyelhető, mikor a kétféle hullámhosszú lézert egyszerre alkalmaztunk 5+5 µmol m-2s-1 intenzitással, ahhoz képest, mikor külön-külön 10 µmol m-2s-1 intenzitással. E13. ábra: Etiolált búza levélből izolált prolamelláris testek (PLT), protilakoidok (PT), illetve frissen készített etiolált borsó levél homogenátumok (0-n hom) megvilágítás utáni acetonos pigment kivonatairól szobahőmérsékleten mért fluoreszcencia emissziós spektrumok relatív intenzitása 670 nm-nél. Az alkalmazott 5 s hosszú megvilágítások hullámhossza és intenzitása: „a”: 632.8 nm, 10 µmol m-2 s-1; „b”: 654 nm, 10 µmol m-2 s1 ; „c”: 632.8 és 654 nm, 5+5 µmol m-2 s-1; „d”: 632.8 és 654 nm, 10+10 µmol m-2 s-1. A spektrumokat 430 nm-es gerjesztéssel mértük, a 630 nm-es maximumukra normáltuk, majd “megvilágított mínusz sötét” különbségi spektrumokat képeztünk. Az oszlopok magassága a különbségi spektrumok 670 nm-nél leolvasott intenzitás értékeinek felel meg, minden adat három független mérés átlaga. Az oszlopok tetején látható hibajelek a szórást (Microsoft Excel SZÓRÁSP/STDEVP) mutatják.

59

5.4 A 636 nm-es protoklorofillid komplex in vitro aggregáltatása etilált borsó epikotilokban 5.4.a Fagyasztás-felmelegítés ciklusok hatása az epikotilok fluoreszcencia emissziójára és etioplasztiszainak ultrastruktúrájára A biológiai membránok érzékenyek a fagyasztás-felmelegítés ciklusokra, így pl. a folyékony nitrogénben lefagyasztott, majd szobahőmérsékleten felengedett mintákban gyakran sérülnek.

Ennek a jelenségnek a tanulmányozására borsó epikotilban, 4 cm hosszú

szegmenseket vágtunk ki 15-18 cm hosszúságú csíranövények epikotiljának középső részéből. A kimetszett szegmensek 0.5 cm-es szakaszait elektronmikroszkópos minták készítésére használtuk, a maradék 3.5 cm-es darabokat pedig lefagyasztottuk folyékony nitrogénben. Miután fluoreszcencia emissziós spektrumokat mértünk az utóbbiakról (E14. ábra, A spektrum), szobahőmérsékleten sötétben hagytuk felengedni a mintákat. Egy újabb 0.5 cm-es szakaszt levágtunk elektronmikroszkópos vizsgálatra, a maradék 3 cm-es szegmenseket pedig ismét folyékony nitrogénbe helyeztük, és emissziós spektrumot vettünk fel róluk (E14. ábra, B spektrum). Bár a fluoreszcencia jel intenzitása a minták felengedése előtt mért spektrumokhoz (E14.

ábra,

A

spektrum)

képest

a

teljes

vizsgált

tartományban

lecsökkent,

a

legszembetűnőbben a 655 nm-es sáv relatív amplitúdója lett kisebb (E14. ábra, beillesztett rész). E14. ábra: Etiolált borsó epikotil középső szegmensének 77 K fluoreszcencia emissziós spektruma folyékony nitrogénben történő lefagyasztása után (A), majd ezt követően 10 perc sötétben történő szobahőmérsékleten tartás és ismételt lefagyasztás után (B). Beillesztett kisebb ábra: „B mínusz A” különbségi spektrum. A különbségi spektrum képzése előtt a spektrumokat a 632.5 nm-es csúcsra normáltuk, hogy jól látható legyen a 655 nm-es sáv intenzitásának relatív változása. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt.

60

A fagyasztás-felmelegítés drasztikus károkat okozott a vizsgált epikotil sejtek minden membránjában. A kontroll (kezeletlen) minták sejtjei szabályos etioplasztiszokat tartalmaztak (E15. ábra, A kép), esetenként jól fejlett PLT-ekkel (E15. ábra, A kép, kinagyított rész). A fagyasztás-felmelegítés következtében a sejtek membránjainak nagy része szétesett (E15. ábra, B kép), a képeken látható keményítő szemcsék körüli membrándarabok lebomlott PLT-ekből származhatnak (E15. ábra, B kép, kinagyított rész).

E15. ábra: Etiolált borsó epikotil sejtek fagyasztás-felmelegítéses kezelés előtt (A) és után (B) készített elektronmikroszkópos képei. A kinagyított részek az intakt (A) és a kezelés hatására szétesett (B) PLT membránokat emelik ki. A bar jelzések 1 µm-nek felelnek meg.

61

5.4.b Epikotil homogenátumok készítése glicerint és szacharózt tartalmazó közegben A fent említett membránkárosodások megakadályozására alkalmasnak véltük a glicerint és/vagy szacharózt tartalmazó foszfát puffert, mivel széles körben alkalmazzák ezeket az anyagokat krioprotektánsként különböző biológiai minták esetében, membrán és fehérjeszerkezet stabilizáló hatásuk miatt (Lillford és Holt 2002, Ouellet 2007, Heidarvand és Maali Amiri 2010). Epikotilok középső szegmenseit homogenizáltuk el 40 % (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben.

E16. ábra: Etiolált borsó epikotil (A spektrumok) és epikotilokból készített homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai. A homogenátumról spektrumot mértünk közvetlenül a preparálás után (B spektrumok), majd 4 napos, -14 °C-os sötét inkubáció után (C spektrumok). Az A spektrumokat a B spektrumok maximumára normáltuk, a B és C spektrumok intenzitásán nem változtattunk. A gerjesztési hullámhossz 440 (A panel) vagy 460 (B panel) nm volt. Homogenizáló közeg: 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36)

62

A frissen készített homogenátumok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai nagyon hasonlítottak a kontroll epikotil darabokéihoz (E16. ábra, A és B rész, A spektrumok), azonban a 655 nm-es sáv relatív amplitúdója kismértékben nőtt, és 654.5 nm-re tolódott (E16. ábra, A és B rész, B spektrumok). Ennél a kísérletnél 440 és 460 nm-es gerjesztést is alkalmaztunk, mivel míg az előbbi lehetővé teszi a rövidebb hullámhossznál emittáló pklid formák együttes megfigyelését, addig a monomer komplexek közül külön a P636 és az oligomer P655 is jobban látható 460 nm-es gerjesztéssel (Böddi et al. 1993). Nemcsak a pklid komplexek arányai, hanem az etioplasztiszok ultrastruktúrája is hasonló volt az epikotilokban és a homogenátumokban. A homogenátumokról készített elektronmikroszkópos felvételeken ép etioplasztiszok és PLT-ek voltak láthatóak (E17. ábra, A kép). Annak vizsgálatára, hogy a homogenizálás során bekövetkező változásokat követően mennyire stabil a 655 nm-es pklid forma, a frissen

készített

homogenátumot

fluoreszcencia mérőcsövekbe töltöttük, majd sötétbe, - 14 °C-ra tettük. A homogenátumot a mérőcsövekben fagyasztottuk le, hogy a mélyhűtőből

kivéve,

felmelegítés

nélkül

rögtön áttehetőek legyenek a folyékony nitrogénnel töltött mintatartóba a spektrumuk méréséhez. (A felmelegítés miatt a komplexek szerkezete

ugyanis

megváltozhat,

ami

dezaggregációt is okozhat.) A készítés napján, és az azt követő 10 napon rendszeresen mintát vettünk és megmértük a – 14 °C-on inkubált homogenátum

spektrumát

460

nm-es

gerjesztéssel. H4. ábra: Etiolált borsó epikotilokból készített homogenátumok elektronmikroszkópos fotói: közvetlenül a homogenizálást követően (A), és ugyanaz a homogenátum 5 nap -14 °C-os sötét inkubáció után (B). A friss homogenátumot öt ciklusban fagyasztás-felmelegítésnek vetettük alá (C). A homogenizáló közeg 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36) volt. A bar jelzések 1 µm-nek felelnek meg.

63

A spektrumokat a 637 nm-es csúcsra normáltuk, és összehasonlítottuk bennük a P655 sávjának relatív intenzitását. A 655 nm-es sáv relatív amplitúdója a 4-6. napig nőtt, utána lassú csökkenést mutatott. A 4 nap után mért fluoreszcencia spektrumokat az E16A. és E16B. ábra C spektrumai szemléltetik. Az 5 napig sötétben inkubált homogenátum elektronmikroszkópos képein intakt, szabályos membrán szerkezettel rendelkező etioplasztiszok és PLT-ek láthatóak (E17. ábra, B kép). A fagyasztás-felmelegítés ciklusok, az epikotiloknál tapasztaltakkal ellentétben, nem váltották ki a 655 nm-es emissziós sáv relatív amplitúdójának csökkenését a frissen készített homogenátumok spektrumában. Ezzel szemben, a 655 és 636 nm-es sávok aránya (mindkét sáv egyértelműen látható 460 nm-es gerjesztéssel) fokozatosan nőtt minden ciklus után (E18. ábra). Az elektronmikroszkópos felvételek azt mutatják, hogy bár az etioplasztisz burkolómembránok sérültek, a PLT-ek kristályszerű elrendeződése megmaradt (E17. ábra, C kép).

E18. ábra: A fagyasztás-felmelegítés ciklusok hatása egy frissen készített borsó epikotil homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumára. A homogenátumot folyékony nitrogénben lefagyasztottuk (A), majd sötétben 10 perc alatt szobahőmérsékletűre melegítettük és ismét lefagyasztottuk (B). Ezt a kezelést még négyszer megismételtük (C-F spektrumok). A homogenizáló közeg 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36) volt. A spektrumokat a 637 nm-es maximumukra normáltuk. A gerjesztési hullámhossz 460 nm volt.

64

Annak eldöntésére, hogy a 4 napos inkubációs vagy a fagyasztás-felmelegítéses kezelések alatt történt-e pigment degradáció, a friss és kezelt homogenátumokból dietil-éterrel kivontuk a pigmenteket. A dietil-éterben a pklid-nek megfelelő 627 nm-es emissziós sávok amplitúdóinak összehasonlításából következtethettünk a pigmentek mennyiségének esetleges változására, mivel minden mintánál azonos mennyiségű és töménységű homogenátumból indultunk ki. A kezelt minták extraktumainak spektrumában a 627 nm-es sáv intenzitása kevesebb, mint 2.5 %-ot változott, ami arra utal, hogy nem történt számottevő pigment lebomlás. A – 14 °C-on történő, 4 napos inkubálás és a fagyasztás-felmelegítés serkentő hatása a P655 keletkezésére tovább fokozódott, mikor a két kezelést egymás után alkalmaztuk. Az erősítés mértéke akkor volt a legnagyobb, mikor a mintákat először sötétben tartottuk, majd ezután vetettük alá fagyasztás-felmelegítéses ciklusoknak (E19. ábra).

E19. ábra: A 4 napos, - 14 °C-os sötét inkubáció, a fagyasztás-felmelegítés ciklusok és ezek kombinációjának hatása a P655 kialakulására etiolált borsó epikotilokból készített homogenátumokban. A frissen preparált homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektruma (A), ugyanannak a homogenátumnak a spektruma 5 ciklus fagyasztás-felmelegítés (a mintákat minden ciklusban folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd 10 perc alatt sötétben szobahőmérsékletűre melegítettük fel) után (B). A „C” spektrumot a „B” mintáról mértük 4 napos - 14 °C-os sötét inkubáció után. A „D” spektrum az „A” homogenátumból kivett és 4 napig sötétben - 14 °C-on inkubált, majd folyékony nitrogénben lefagyasztott mintáról készült. Ezt követően ugyanezt a mintát két ciklus fagyasztás-felmelegítésnek vetettük alá (E). A homogenizáló közeg 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36) volt. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt. A spektrumokat a maximumukra normáltuk. Beillesztett ábra: Ugyanazokról a mintákról felvett emissziós spektrumok, de 460 nm-es 65 gerjesztéssel. A spektrumokat a 655 nm-es maximumukra normáltuk.

5.4.c Az epikotilok pklid komplexeinek arányváltozásai a homogenizálás hatására A 655 nm-es sáv relatív intenzitásnövekedésének további részletezése céljából összehasonlítottuk ugyanannak a homogenátumnak a friss állapotban, illetve 4 nap inkubálás után mért fluoreszcencia emissziós spektrumát és „inkubált mínusz friss” különbségi spektrumot képeztünk. Mivel ugyanarról a mintáról és ugyanabban a mintatartó csőben mértük a spektrumokat, a spektrumok abszolút értékeit hasonlítottuk össze és a különbségi spektrumot is így képeztük (E20. ábra, C spektrum).

E20. ábra: Etiolált borsó epikotilokból készített homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektruma közvetlenül a preparálás után (A) és 4 nap - 14 °C-os sötét inkubáció után (B), illetve a „B mínusz A” különbségi spektrum (C). A homogenizáló közeg 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36) volt. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt.

A különbségi spektrumban volt egy negatív sáv 634 nm-nél, és egy pozitív 654-nél. Ez utóbbi pozitív sáv a különbségi spektrumban, jó összhangban van azzal a megállapítással, hogy a négy napig inkubált homogenátumok emissziós spektrumát (E16A. ábra, C spektrum; E19. ábra, D spektrum; E20. ábra, B spektrum) összehasonlítva az etiolált epikotiléval (E14. ábra, A spektrum; E16A. ábra, A spektrum) és a friss homogenátuméval (E16A. ábra, B spektrum; E19. ábra, A spektrum; E20. ábra, A spektrum), szembetűnő a P654.5 komplex sávjának jelentős növekedése. A többi komplexnek megfelelő sávok intenzitásának változása

66

csak

a

spektrumok

további

analízisével,

Gauss

komponensekre

bontásával

volt

tanulmányozható. A friss homogenátum spektrumában a következő maximumokkal rendelkező Gauss komponensek voltak elkülöníthetőek: 629, 636, 644 és 655 nm. Ugyanannak a homogenátumnak négy nap inkubálás után, inkubálás és két ciklus fagyasztásfelmelegítés után, illetve egy intakt epikotilról mért fluoreszcencia emissziós spektrumokat Gauss komponensekre bontottuk. A 629, 636, 644 és 655 nm maximumú komponensek integráljainak összegét tekintettük 100%-nak, és ennek megfelelően ábrázoltuk az egyes komponensek integrálját oszlopdiagramon (E21. ábra). A komponensek integráljait összehasonlítva látható, hogy a 655 nm-es maximummal rendelkező komponens relatív integráljának növekedésével párhuzamosan a 636 nm-es sávé csökkent.

E21. ábra: Etiolált borsó epikotilok és különbözőképpen kezelt epikotil homogenátumok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban elkülöníthető Gauss komponensek relatív integrál értékei. Epikotilok: üres oszlopok, frissen készített homogenátumok: jobbra emelkedő vonalkázású oszlopok, 4 napig - 14 °C-on sötétben inkubált homogenátumok: keresztben vonalkázott oszlopok, 4 napos inkubáció után 2 ciklusban fagyasztottfelmelegített homogenátumok: balra emelkedő vonalkázású oszlopok. Az X tengelyen számok jelzik a négy vizsgált Gauss komponens maximumának pozícióját, ezen komponensek integráljainak összegét tekintettük 100 %-nak minden spektrum esetében. A homogenizáló közeg 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát puffer (pH 6.36) volt. A Gauss bontáshoz használt spektrumok mérésekor a gerjesztési hullámhossz 440 nm volt.

67

5.4.d A homogenizáló közeg összetételének hatása a P655-re A homogenizáló közeggel kapcsolatban felmerült a kérdés, hogy önmagában csak a glicerin vagy a szacharóz képes-e stabilizálni a 655 nm-nél emittáló pklid komplexet, ezért epikotilokat homogenizáltunk el olyan foszfát pufferben, amely 40 % szacharózt vagy 40 % glicerint tartalmazott, majd a homogenátumokat 4 napig inkubáltuk sötétben, – 14 ºC-on. A csak szacharózt tartalmazó friss homogenátum 77K fluoreszcencia emissziós spektrumában a 655 nm-es sáv intenzitása jelentősen lecsökkent, 4 napig tartó inkubálása után pedig további csökkenés volt megfigyelhető. A csak glicerines homogenátumban megőrződött a struktúra, vagyis a 655 nm-es sáv amplitúdója hasonló volt az intakt epikotil spektrumában megfigyelhetőhöz, azonban 4 nap inkubálás után nem növekedett ennek a sávnak az intenzitása. 5.4.e A homogenátumban kialakult P655 jellemzése Felvetődött annak a lehetősége, hogy az inkubált homogenátumban kialakult P655 komplex az eredetivel megegyező aggregációs állapotú, de eltérő struktúrájú műtermék. (Vagyis a pklid mesterséges in vitro, nem specifikus pigment-aggregátuma, vagy a POR-tól független olyan fehérjeaggregátum, ami a pklid aggregációját is segíti, és nem POR-pklidNADPH egységekből felépülő komplex). A -14 °C-os sötét inkubáció alatt keletkezett, 655 nm környékén emittáló pklid forma fotoaktivitásának tanulmányozására a homogenátumokat 160J/2 ms fehér fényű flash-sel világítottuk meg, majd 5 s múlva folyékony nitrogénben fagyasztottuk le. A megvilágítás eredményeként a 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokból eltűnt a 655 nm-es sáv, és ezzel párhuzamosan megjelent egy 690 nm környékén (E22. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a fagyasztás-felmelegítés ciklusokkal kezelt minták esetében is. A megvilágítással kiváltott pklid fotoredukció nagyobb mértékű volt a 4 napig inkubált homogenátumokban, mint az epikotilokban a pigment kivonatok fluoreszcencia emissziós spektrumai alapján. A kivonatok spektrumait szobahőmérsékleten mértük, a 630 nm-es maximumukra normáltuk (ez a pklid-nek és pkl-nek megfelelő sáv), így a 670 nm-es sáv (a klid és kl-a emissziós sávja a pigment kivonatokban) amplitúdója arányos volt a relatív kl(id)

68

koncentrációkkal az egyes mintákban. Eredményként azt kaptuk, hogy a homogenátumokban kialakult kl(id) koncentrációja a pklid-éhez képest, kb. kétszerese volt az epikotilokban keletkezettének.

E22. ábra: Etiolált borsó csíranövények epikotiljából készített, 4 napig -14˚C-on sötétben inkubált homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektruma flash megvilágítás előtt (A) és után (B). A spektrumokat a maximumukra normáltuk. Gerjesztési hullámhossz: 460 nm. A megvilágítás 160J / 2ms energia kibocsátású vakuval történt. A számok a maximumok pozícióját jelölik nm-ben. A homogenizálásra használt foszfát puffer (pH 6.36) 40% (V/V) glicerint és 40% (m/V) szacharózt tartalmazott.

Az aggregáció lejátszódásának közvetett módon történő ellenőrzésére 4 napig – 14 °Con inkubált, 40% (V/V) glicerint és 40% (m/V) szacharózt tartalmazó homogenátum mintákat szobahőmérsékletűre melegítettünk, majd 1 cm-es küvettába pipettáztuk. Ezután 10 s hosszan 100 µmol m-2s-1 intenzitású fénnyel megvilágítottuk őket, majd a fluoriméterbe helyeztük és szobahőmérsékleten spektrumokat mértünk róluk 0; 1.5; 3; 6; 10; 15; 20; 25; 30 perc után. Így minden spektrum mérése közben 1.5 percig 440 nm-es fény világította meg a mintákat. A spektrumokból egy háromdimenziós felszínt, és annak topológiai leképezését szerkesztettük meg (E23. ábra). Az ábrán a jelintenzitás növekedésével fokozatosan világosodó színskálát alkalmaztunk. A fluoreszcencia jel intenzitása 636 nm környékén kismértékben csökkent a sötét inkubálás során. Szembetűnő változások a klid régióban játszódtak le. A megvilágítás hatására kialakult 687-688 nm-es maximum, amely oligomer kl(id) komplexeknek feleltethető

69

meg, kb. 10 perc alatt 679 – 680 nm-re tolódott el, és ezután már nem változott jelentősen a pozíciója. A folyamat időbeli lefutása mintánként változott, mivel nem lehetett azonos pklid komplex koncentrációt biztosítani, de a maximum minden esetben 679 – 680 nm-ig tolódott el. A sáv fokozatos, rövidebb hullámhossz felé tolódása hasonló az etiolált levelekben végbemenő Shibata-féle eltolódáshoz. Meg kell azonban jegyezni, hogy csak részleges „Shibata-shift” ment végbe a glicerines-szacharózos közegben. Amíg etiolált epikotilokban 30 perc alatt végbement, 4 napig inkubált majd megvilágított és 30 percig szobahőmérsékleten, sötétben tárolt homogenátumok 77 K spektrumában egyértelműen látható volt a 690 nm-es maximum, vagyis a flash megvilágítás után azonnal kialakuló klid sáv. Azonban a klid vagy kl sávok amplitúdójának pontos meghatározása bonyolult, mivel erősen átfednek az át nem alakult pklid formák vibrációs sávjaival.

340000 320000 300000 280000 260000 240000 220000 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0

E23. ábra: Négy napig -14˚C-on sötétben inkubált, majd 10 s hosszan 100 µmol m-2 s-1 foton flux denzitású fehér fénnyel megvilágított homogenátum 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumában kialakult 687 nm-es maximum kék felé történő eltolódása. A topológiai leképezést és háromdimenziós spektrumfelületet a megvilágítástól számított 0, 1.5, 3, 6, 10, 15, 20, 25 és 30 perc után mért spektrumokból számoltuk, mialatt a mintát szobahőmérsékleten, sötétben tartottuk, de a fluoriméter 440 nm-es gerjesztő fénye minden mérésnél újra megvilágította.

70

5.4.f Az ATP hatása a P655 keletkezésére Irodalmi adatok alapján az ATP növeli a fotoaktív (650 nm-es abszorpciós maximumú)/nem-fotoaktív (630 nm-es abszorpciós maximumú) pklid arányt izolált etioplasztiszokban (Horton and Leech 1972, 1975). Ezért következő kísérletünkben 40% (v/v) glicerint és 20% (m/v) szacharózt tartalmazó közegben készítettünk homogenátumot, melynek egy részéhez 1.5 mM koncentrációban ATP-t adtunk. Összehasonlítva az ATP-t tartalmazó homogenátum 77K fluoreszcencia emissziós spektrumát (E24. ábra, B spektrum) az ATP-t nem tartalmazóéval (E24. ábra, A spektrum), a 655 nm-es sáv relatív intenzitásának növekedése és a 632 nm-es sáv balra tolódása volt megfigyelhető. Az „ATP-t tartalmazó mínusz nem tartalmazó” különbségi spektrumban (E24. ábra, B-A spektrum:beillesztett rész) egy negatív sáv jelent meg 636 nm-es maximummal és egy pozitív 655 nm-nél a pklid régióban. A 620 nm körüli pozitív sáv a normálás eredménye volt. Az ATP-t tartalmazó homogenátum 10 s hosszú megvilágítása 150 µmol m-2s-1 intenzitású fehér fénnyel, az ATP mentes homogenátumhoz hasonlóan a 655 nm-es sáv eltűnését és ezzel párhuzamosan egy 690 nm-es sáv kialakulását eredményezte a spektrumokban.

E24. ábra: Etiolált borsó epikotilból készített homogenátumok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai. A homogenizálásra használt TrisHCl puffer (pH7.4) 50% (v/v) glicerint és 20% (m/V) szacharózt tartalmazott. A homogenátum elkészítésekor egyik részéhez (B) adtunk ATP-t 1.5 mM koncentrációban, míg a másik részéhez nem (A). A beillesztett rész a „B-A” különbségi spektrum. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt. A spektrumok két független kísérlet átlagspektrumait mutatják, a spektrumokat átlagolás előtt az integráljukra normáltuk.

71

5.4.g Fagyasztott-felmelegített epikotil P655 komplexének regenerálása homogenizálással A következő kísérletekben a glicerint és szacharózt tartalmazó puffer előzőekben bemutatott aggregáltató tulajdonságát felhasználva tanulmányoztuk, hogy a natív oligomer elrendeződés mennyire állítható helyre dezaggregáltatás után. Az etiolált borsó epikotilok középső szegmenseit (3 cm-es darabokat) folyékony nitrogénben lefagyasztottunk, majd a fluoreszcencia emissziós spektrumuk megmérése után

(E25A. ábra, a spektrum)

szobahőmérsékleten 10 perc alatt felengedtük, és ismét lefagyasztottuk (E25A. ábra, b spektrum).

E25. ábra : A: Etiolált borsó epikotil 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumának (a) változása fagyasztás-felmelegítés 77 K és 293 K között (b), majd 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben történő homogenizálás (c) hatására. A spektrumokat a maximumukra normáltuk. Gerjesztési hullámhossz: 440 nm. B: Az A ábrán bemutatott spektrumokat öt epikotil minta esetében megmértük és Gauss komponensekre bontottuk. A kb. 3 cm-es epikotil darabokat egyesével kezeltük. Minden Gauss komponensekre bontott spektrumban négy komponens (629, 636, 644 és 655 nm-es maximumokkal) integrálját vizsgáltuk. Az etiolált epikotilok spektrumában kapott %-os értéket tekintettük az adott epikotil minta adott komponense esetében 100%nak. Az X tengelyen található számok a Gauss komponensek maximumait mutatják nm-ben, az oszlopok tetején a hibajelek pedig az átlagtól való átlagos abszolút eltérést.

72

Az E14. ábrához hasonlóan a fagyasztás-felmelegítés utáni spektrumban lecsökkent a 655 nm-es sáv relatív fluoreszcencia jel intenzitása. Az E25A. ábrán olyan 16 napos csíranövény epikotiljának spektrumai láthatóak, amelyben etiolált állapotban sok volt a 655 nm-es komplex, míg az E14. ábrán fiatalabb, 8 napos etiolált epikotil spektrumai vannak feltüntetve, etiolált állapotban kevesebb P655-tel. Az epikotilokat a fagyasztás-felmelegítés után egyesével elhomogenizáltuk 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben, majd ismét 77 K emissziós spektrumot mértünk róluk (E25. ábra, c spektrum). A homogenátumok spektrumában az etiolált epikotiléhoz hasonló 632/655 sávarányt kaptunk. A folyamat részletesebb analíziséhez az etiolált, fagyasztott-felmelegített és elhomogenizált epikotilok spektrumait Gauss komponensekre bontottuk, majd kiszámítottuk a 629, 636, 644 és 655 nm-es komponensek integráljait. Az etiolált epikotilok spektrumaiban kapott értékeket tekintettük 100%-nak minden komponensnél külön-külön. Az E25B. ábrán látható, hogy a fagyasztás-felmelegítés után a 655 nm-es komponens sávjának már említett csökkenése mellett, a legszembetűnőbb változás a 636 és 644 nm-es komponensek integráljának a relatív növekedése. A homogenizálás után a 655 nm-es komponens relatív integrálja közel azonos volt az etiolált epikotilokban kapott értékekkel, míg a 644 nm-es komponensé nagyobb, a 636 nm-es komponensé pedig kisebb volt. A közeg hatásának további vizsgálatára egyesével elhomogenizáltunk fagyasztottfelmelegített epikotilokat, az előzőekben alkalmazott 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferhez képest csak glicerint, illetve negatív kontrollként sem glicerint, sem szacharózt tartalmazó foszfát pufferben. Csak szacharózt tartalmazó puffert a korábbi kísérletek alapján nem alkalmaztunk, mert ilyen közegben a fagyasztás-felmelegítés nélkül elhomogenizált epikotilok spektrumában jelentősen lecsökkent a 655 nm-es sáv intenzitása. Az E26. ábra a 655 nm-es Gauss komponens integráljának relatív változását mutatja

fagyasztás-felmelegítés,

homogenizálás

hatására

az

illetve etiolált

a

különböző

epikotil

említett

közegekben

történő

spektrumában

kapotthoz

képest.

Összehasonlításként szerepel az ábrán az E25B. ábra azon oszlopa, amely a 655 nm-es Gausskomponens

relatív

integrálját

mutatja

a

glicerines-szacharózos

közegben

történt

homogenizálás után (4040Hom). A fagyasztás-felmelegítés után a 655 nm-es sáv integrálja lecsökkent átlagban a 73%-ára (FfEpi), ami nagyon hasonló az E25B. ábrán látott 75%-os

73

értékhez. A két kísérlet között csak a minták számában volt különbség. Ezt követően a foszfát pufferben történő homogenizálás hatására a 655 nm-es komponens integrálja alig változott (76%, H12. ábra: 00Hom). A 40% glicerint tartalmazó puffer esetén nagyon hasonló eredményt kaptunk (40GHom), mint a szacharózt is tartalmazó puffernél. 140

Rel. integrál értékek (%)

120 100 80 60 40 20 0 EtEpi(15)

FfEpi(15)

00Hom(5)

4040Hom(5)

40GHom(5)

A 655 nm-es maximumú Gauss-komponens

E26. ábra: Etiolált borsó epikotilok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban a 655 nm-es Gauss komponens integráljának relatív változása fagyasztás-felmelegítés, majd különböző közegekben történő homogenizálás hatására. A kb. 3 cm-es epikotil darabokat egyesével kezeltük. Minden Gauss komponensekre bontott spektrumban négy komponens (629, 636, 644 és 655 nm-es maximumokkal) integráljának az összegéhez viszonyítottuk a 655 nm-es komponens integrálját. Az etiolált epikotilok (EtEpi) spektrumában kapott %-os értéket tekintettük az adott epikotil minta esetében 100%-nak. Minden epikotilt a folyékony nitrogénben történő spektrummérés után kb. 10 perc alatt szobahőmérsékleten, sötétben felengedtünk, majd újra folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és újabb spektrumot vettünk fel róluk (FfEpi). Ezután az epikotilokat egyesével elhomogenizáltuk pH 7 foszfát pufferben (00Hom) vagy 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó foszfát pufferben (4040Hom) vagy 40% (v/v) glicerint tartalmazó foszfát pufferben (40GHom), majd megmértük a friss homogenátumok spektrumait. A gerjesztési hullámhossz minden spektrum esetében 440 nm volt. Az X tengelyen a zárójelben található számok a minták számát mutatják, az oszlopok az átlagot, a hibajelek az oszlopok tetején pedig az átlagtól való átlagos abszolút eltérést.

5.5 Az etiolált borsó epikotilok levelekéhez képest nagyobb fényérzékenységének vizsgálata A megnövekedett fényérzékenység különböző szinteken vizsgálható. Követhető a növényeken látható morfológiai változások megfigyelésével, a pigmentek minőségében és mennyiségében végbemenő változások mérésével, és az ezekkel párhuzamosan kialakuló

74

reaktív oxigénformák kimutatásával és lokalizációjával. Érdekes kérdés az is, hogy a minták újbóli sötétbe helyezésével mennyire állíthatóak helyre a fotooxidatív károsodások, például az egyszerű spektroszkópiai módszerekkel követhető pigmentek szintjén. 5.5.a Etiolált borsó csíranövények természetes fényre helyezése után bekövetkező szemmel látható változások Etiolált

csíranövények

fényre

helyezésekor

jelentős különbség van a levelek és a szárak zöldülésében. Nyolc napos etiolált borsó csíranövényeket 10 napig természetes fény-sötét perióduson (600-800 µmol m-2s-1 PDF nappali fény) továbbnevelve azt tapasztaltuk, hogy a leveleik bezöldültek, de az epikotilok középső régiója elhalt (E27. ábra). Korábbi eredmények (Erdei et al. 2005) alapján a folyamat hátterében a monomer pklid-ek túlsúlya áll, melyek fotoszenzibilizátorként működve szinglet oxigén termelődéshez, lipid peroxidációhoz és így membránkárosodásokhoz vezetnek. Ennek következtében egy etiolált borsó növény már 30 perccel a természetes fényre (minimum 115 µmol m-2s-1 PDF) kerülése után veszít a turgorából és a középső régiójában meggörbül.

E27. ábra: Tizennyolc napos, 10 napig sötétben, majd természetes fény-sötét perióduson (600-800 µmol m-2s-1 PDF nappali fény) nevelt borsó csíranövény.

5.5.b A keletkező reaktív oxigénformák és szöveti lokalizációjuk Felmerült a lehetőség, hogy a már említett szinglet oxigén mellett más reaktív oxigénformák is létrejöhetnek az etiolált epikotilok megvilágítása közben, melyek

75

keletkezésének szöveti szintű lokalizációja további érdekes kérdés volt. Ilyen jellegű vizsgálatokra alkalmasak a különböző ROS-specifikus jelölő festékek, mint a szuperoxid anion gyökök kimutatására alkalmas NBT vagy a hidrogén-peroxiddal reakcióba lépő DAB, melyeket vákuum infiltrációval juttattunk be az etiolált epikotil darabokba. Az E28. ábrán etiolált, hét napos borsó epikotilok NBT-vel infiltrált, 3 cm-es középső szegmensei láthatóak intakt állapotban (A és C kép) és keresztmetszetben (B és D kép). Az egyik epikotilt 600 µmol m-2s-1 PDF fehér fénnyel világítottuk meg (E28. ábra, A és B kép), mialatt a másikat továbbra is sötétben tartottuk (E28. ábra, C és D kép). A megvilágítás során -.

már 10 perc alatt az epikotil darab kékre színeződött (E28. ábra, A kép), ami az NBT és a O2

reakciójának eredményeképpen kialakuló formazán keletkezését mutatta. Az epikotil -.

keresztmetszetén látszik, hogy a O2 az epidermisz alatti kéreg régió sejtsoraiban alakult ki (E28. ábra, B kép). A nem megvilágított mintában a kék csapadék hiánya (E28. ábra, C és D -.

kép) bizonyítja, hogy a O2 termelődése nem a minta darabolásának vagy az infiltrációnak a következménye.

E28. ábra: Hét napos etiolált borsó csíranövények epikotiljának középső 3 cm-es szakaszai felülnézetben (A és C), jobbra mellettük pedig a középső részükből ezután készített keresztmetszetük látható (B és D). Az epikotil szakaszokat 0.6 mM NBT-vel infiltráltuk, majd 30 percig sötétben tartottuk. Az egyik mintát (A és B) ezt követően 10 percig 600 µmol m-2s-1 PDF természetes fénnyel világítottuk meg, mialatt a másikat (C és D) továbbra is sötétben tartottuk (kontroll).

76

A H2O2 termelődésének vizsgálatára szintén hét napos, etiolált borsó csíranövények középső, 3 cm-es epikotil szakaszait 600 µmol m-2s-1 PDF fehér fénnyel 20 percen át megvilágítottuk, majd a DAB infiltrálása után 18 órára sötétbe helyeztük (E29. ábra, A és B kép). A kontrollként használt epikotil darabokat megvilágítás nélkül infiltráltuk a jelölő festékkel, majd 18 órára sötétbe tettük (C és D kép). A megvilágított epikotil vöröses-barna elszíneződése H2O2 keletkezésre utalt (E29. ábra, A kép). A keresztmetszeten látható, hogy a festődés az epidermisz alatt, a levélnyomnyalábok környékén és a központi hengerben volt a legerőteljesebb. Érdemes megjegyezni, hogy az említett régiók nem feltétlenül mind elsődleges termelődési helyek, mivel a H2O2 diffúzióval átjuthat a sejtmembránokon. A nem megvilágított minták esetében nem történt színváltozás (E29. ábra, C és D kép), ami igazolja, hogy a ROS termelődést nem a minta kezeléséből adódó sérülések váltották ki.

E29. ábra: Hét napos etiolált borsó csíranövények epikotiljának középső 3 cm-es szakaszai felülnézetben (A és C), jobbra mellettük pedig a középső részükből ezután készített keresztmetszetük látható (B és D). Az egyik mintát (A és B) 20 percen keresztül 600 µmol m-2s-1 PDF fehér fénnyel megvilágítottuk, majd 5 mM DAB-bal infiltráltuk és 18 órára sötétbe helyeztük. A másik mintát (C és D) megvilágítás nélkül infiltráltuk, majd szintén sötétben tartottuk 18 órán át (kontroll).

A fényre került etiolált epikotil görbülési folyamata során kimutatott oxigénformák közül a H2O2 esetében (a viszonylagos stabilitása és hosszú féléletideje, membránokon való átjutása miatt) tesztelhető volt az a feltételezés, hogy exogén adott ROS molekulákkal kiváltható-e sötétben a csíranövények görbülése. Az E30. ábrán látható B-vel jelzett növényt

77

sötétben H2O2-vel injektáltuk, aminek következtében meggörbült. A hasonlóan kezelt csíranövények esetében általában 15-20 perc után már látható volt a turgorcsökkenés, majd 30 perc alatt meggörbültek. A kontrollként alkalmazott növények esetében, mint amilyen az E30. ábrán A-val jelölt borsó, az injektáláshoz foszfát puffert használtunk, amely nem váltott ki görbülést, ahogyan a fotók készítésekor történő 1-2 perces, 30-50 µmol m-2s-1 PDF intenzitású fénnyel történő megvilágítás sem.

E30. ábra: Hét napos etiolált borsó csíranövények. A B növényt 0.7 mM H2O2-t tartalmazó foszfát pufferrel (50mM, pH 7.2) injektáltuk be kb. cm-enként, míg az A (kontroll) növényt foszfát pufferrel, és mindkettőt további 30 percig sötétben tartottuk a kép készítése előtt. (Az injektálás halvány zöld fénynél történt, amely sem fototranszformációt, sem bleachinget nem okozott.)

5.5.c A pklid-ek teljes kifehéredése és regenerációja A fent leírt eredményekkel jól összeegyeztethető az az irodalmi adat, hogy az etiolált szárak (a levelekéhez képest nagyobb fényérzékenységük miatt) csak kis fényintenzitáson, lassan zöldíthetők (Skribanek and Böddi 2001). Ennek a folyamatnak a vizsgálatára etiolált borsó csíranövényeket világítottunk meg kis intenzitású (10 µmol m-2s-1) fehér fénnyel 16 órán keresztül. Mintát vettünk az epikotilból a megvilágítás előtt, majd a megvilágítás kezdetétől számítva 2, 4, 6 és 16 óra után. A minták fluoreszcencia emissziós spektrumain látható volt, hogy a monomer pklid-et tartalmazó komplexek sávja 6 óra megvilágítás után szinte teljesen eltűnt (nem mutatott spektrum). Ezzel párhuzamosan megfigyelhető volt 680 nm-nél egy arányosan növekvő kl(id) sáv. Négy óra megvilágítás után a 680 nm feletti régióban megjelenő sávok a fotoszintetikus apparátus kl-protein komplexeinek keletkezését jelezték, ezek a 16 órás mintában már teljesen kialakultak. A megvilágításhoz használt kis fényintenzitás, és a klid sáv arányos megjelenése miatt kizárható volt, hogy a pigmentek

78

kifehéredése okozta a monomerek sávjának eltűnését, tehát a pklid lassú fotoredukciója történt kl(id)dé. Ezzel szemben a nagy fényintenzitásra helyezett etiolált borsó csíranövények görbülése közben a pigmentek is kifehérednek (Erdei et al. 2005). Nagy intenzitású (1300 µmol m-2s-1) fehér fénnyel kilenc napos etiolált borsó csíranövények középső epikotil régiójában 60-70 perc alatt degradálódott az összes pigment (E31. ábra, B spektrum). Ennek kapcsán merült fel az a célkitűzés, hogy teljes kifehéredést (bleaching) okozó fénnyel történő megvilágítás után vizsgáljuk a különböző komplexek regenerálódásának sorrendjét. A megvilágítást követően a mintákat négy órán át sötétben tartottuk szobahőmérsékleten, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és fluoreszcencia emissziós spektrumokat mértünk róluk (E31. ábra, C spektrum). A spektrumok maximuma 654-655 nm környékén volt, és általában megjelent bennük egy váll 633 nm-es maximummal. A kialakult P655 teljes flash-fotoaktivitást mutatott.

E31. ábra: Kilenc napos etiolált borsó csíranövények 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai 60 perc 1300 µmol m-2s-1 PDF fehér fénnyel történő megvilágítás előtt (A), után (B), és a megvilágítást követő 4 óra (C), illetve 24 óra (beillesztett spektrum) sötétben tartás után.

79

Érdemes megemlíteni, hogy ez a regenerációs folyamat csak 7-9 napos etiolált csíranövények epikotiljaiban ment végbe, melyek megvilágítás előtt mért fluoreszcencia emissziós spektrumaiban a 633 és 655 nm-es maximumú sávok aránya tíznél kisebb értéket mutatott, tehát a 655 nm-es váll jól látható volt. A regenerálódásra képes minták spektrumaiban a négy óra után kialakult 655 nm körüli sáv intenzitása az etiolált epikotilok spektrumában mérhető azonos maximumú sáv intenzitásának maximum 10%-át érte el. A rövidebb hullámhossznál emittáló pklid komplexek bleaching utáni újbóli kialakulása 18-24 órát vett igénybe (E31. ábra, beillesztett spektrum), 4 óra után még nem regenerálódtak. 5.6 A protoklorofillid formák arányainak megváltoztatása

5.6.a Exogén citokinin hatása etiolált szervtenyészetek spektroszkópiai tulajdonságaira és etioplasztiszainak ultrastrukturájára A citokinin hatását a POR enzim mennyiségére és az etioplasztiszok fejlődésére főleg leveleken tanulmányozták. Etiolált levelekre szabályos, rácsos szerkezetű PLT-eket tartalmazó etioplasztiszok jellemzőek. A bennük található pklid komplexek között pedig a P655 van túlsúlyban. Általában az etiolált szárakban, és így borsó epikotilban is, fejletlenek az etioplasztiszok, vagyis inkább csak PLT kezdemények találhatóak bennük, a belső membránrendszerüket főleg PT-ok alkotják (ld. E15A. ábra). Ezzel összhangban a PLT-ekben lokalizált P655 aránya is kicsi, a rövidebb hullámhossznál emittáló, PT-okban elhelyezkedő monomer pklid-eket tartalmazó komplexek vannak túlsúlyban (ld. E1. ábra). Ezért a borsó szára alkalmas kísérleti objektumnak tűnt a külsőleg adagolt citokinin hatásának vizsgálatára. Egy sötétben nevelt növény hormonkezelése többféle módon történhet. Gyakran a kezelni kívánt növényi szervet eltávolítják az etiolált csíranövényről, majd hormont tartalmazó oldaton úsztatják. Ennél hatásosabb módszer, mikor a növényt az adott hormont tartalmazó tápközegen nevelik. Kísérleteink során szervtenyészetben nevelt borsóhajtásokat vizsgáltunk. A felhasznált MS táptalajban az alkalmazott citokinin-analóg (BAP = benzil- amino purin) mennyisége variálható volt. A hajtástenyészetet olyan borsó embrióból indítottuk, amelyről a

80

sziklevelek nagy részét eltávolítottuk. Így a sziklevélből származó tápanyagok pótlására a táptalaj anyagait korábban felvette a fejlődő csíranövény. A természetes fényen kifejlődött, átlagban 5-8 centiméteres hajtásokat (E32. ábra) nodális szegmentekre darabolás után, az eredetivel egyező összetételű táptalajra helyeztük, és a tenyészeteket sötétbe tettük. A 2-3 hónap alatt fejlődő etiolált hajtások elágazóak voltak (E33. ábra), a vegetatív szaporítás miatt genetikailag egyezőek. Így ezek a hajtások használhatóak voltak parallelként.

E32. ábra (balra): Szervtenyészetben fényen nevelt kb. 3-6 cm-es borsó növénykék. E33. ábra (jobbra): Szervtenyészetben fényen nevelt borsó növénykék nodális szegmentjeit új táptalajra helyeztük, és 2-3 hónapig sötétben tartottuk. Az ábra a kifejlődött etiolált hajtásokat mutatja. (A zöld hajtásrészletek az átrakott szegmentek elöregedő maradványai.)

A citokinin-analógot nem tartalmazó táptalajon a hajtástenyészet nem volt fenntartható. Kétféle táptalajt alkalmaztunk, ezek csak a BAP koncentrációjában különböztek egymástól. A kétféle táptalajon nevelt növények fluoreszcencia emissziós spektrumai láthatóak az E34. ábrán. A spektrumok összehasonlításakor szembetűnő, hogy a citokinin hatására megnőtt a P655 mennyisége a növények szárában. Az etioplasztiszok szerkezete az E35. ábra elektronmikroszkópos felvételein vizsgálható. A mintavétel ugyanazokból a növényekből történt, amelyek spektrumai az E34. ábrán láthatóak.

81

E34. ábra: Különböző mennyiségű citokinin–analógot tartalmazó táptalajú szervtenyészetekben nevelt etiolált borsó növénykék száráról és leveléről mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok. A: 0.3 mg/dm3 benzil-amino purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke szárának spektruma (szaggatott vonal), B: 1 mg/ dm3 benzil amino-purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke szárának spektruma (folytonos vonal), C: 1 mg/ dm3 benzil amino-purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke levelének spektruma (pontozott vonal).

Az elektronmikroszkópos képeken látszik, hogy a kis mennyiségű BAP-ot tartalmazó táptalajon nevelt borsó szárában az etioplasztiszok fejletlenek voltak, a PLT-eknek csak kezdeményei voltak megfigyelhetőek bennük (E35. ábra, A kép). Ezzel szemben

a

BAP-ot

nagyobb

koncentrációban

tartalmazó táptalajon nőtt borsó szárára rendezett szerkezetű PLT-eket tartalmazó etioplasztiszok voltak jellemzőek (E35. ábra, B kép), amelyek a levélére hasonlítottak (E35. ábra, C kép). Érdemes azonban megjegyezni, hogy a nagy mennyiségű citokinint tartalmazó táptalajon nevelt (kontroll MS táptalaj: 1 mg/dm3

BAP)

borsó

növények

szárának

hossztengelye mentén a különböző pklid komplexek aránya változó volt. E35. ábra: Különböző mennyiségű citokinin–analógot tartalmazó táptalajú szervtenyészetekben nevelt etiolált borsó növénykék szárában és levelében található etioplasztiszokról készített transzmissziós elektronmikroszkópos felvételek. A: 0.3 mg/dm3 benzil-amino purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke szárának etioplasztisza, B: 1 mg/ dm3 benzil amino-purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke szárának etioplasztisza, C: 1 mg/ dm3 benzil amino-purint tartalmazó MS táptalajon nevelt növényke levelének etioplasztisza

82

A 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokban a 655/633 sávarány az előzőekben vizsgált középső régióban volt a legnagyobb (E36. ábra, B spektrum), a felső szárrészekben (az etiolált borsó epikotilok felső szakaszaival szemben) csak kevés P655 volt kimutatható (E36. ábra, A spektrum), az alsó szárrészekről mért spektrumokban pedig klid sávok is megjelentek (E36. ábra, C spektrum).

E36. ábra: Szervtenyészetben, MS táptalajon nevelt etiolált borsó növénykék szárának felső (A), középső (B) és alsó (C) régióiról mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok.

5.6.b Különböző mértékű nitrogénhiány hatása szervtenyészetben fejlődött borsó szárak etioplasztiszainak kialakulására

A nitrogénhiány gátló hatását a plasztiszok fejlődésére növényekben, a citokininnél leírtakhoz hasonlóan, általában néhány hetes csíranövények leveleinek kloroplasztisz differenciációján vizsgálják (Whately 1971). A plasztisz-differenciáció és a klorofill bioszintézis kutatásban gyakran vizsgálnak sötétben nevelt növényeket. Etiolált növények esetében érdekes kérdés, hogy a szár, a levélhez képest jelentősen kisebb pigmenttartalma miatt, attól eltérő módon reagálhat a nitrogénhiányra. Annak tanulmányozására, hogy hogyan hat a különböző mértékű nitrogénhiány szárak etioplasztiszainak fejlődésére, az előzőekben ismertetett, a citokinin mennyiségi hatásának vizsgálatára alkalmazott szervtenyészetben nevelt borsóhajtás alkalmas objektumnak látszott. A teljes nitrogénmennyiséget (1900mg/l KNO3 és 1650 mg/l NH4NO3) tartalmazó táptalajon kívül olyan közegeket is alkalmaztunk, amelyek nitrogéntartalma ennek kétharmada vagy harmada volt, és nitrogénmentes táptalajon is neveltünk növényeket. A kontroll MS táptalaj összetétele megegyezett a korábban leírt, citokinines kísérleteknél alkalmazott kontroll táptalaj összetételével. 83

5.6.b.1 A különböző nitrogéntartalmú táptalajokon fejlődött borsó növénykék morfológiai tulajdonságai Minden alkalmazott táptalajon, még a nitrogénmentesen is sikerült sötétben nevelt hajtásokat kialakítani. Ezek hossza 2 és 25 cm között változott, és az etioláltság ismert morfológiai tüneteit mutatták: sárgás-fehéres hajtások fejlődtek apró levelekkel és megnyúlt internódiumokkal. Adott összetételű táptalaj esetén sem egyezett meg a kialakult növénykék hossza, de általánosan elmondható, hogy a nitrogénhiány mértékének növekedésével a növények mérete egyre inkább csökkent. 5.6.b.2 A különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon fejlődött borsó növénykék szárának összehasonlítása A kontroll (teljes MS) táptalajon nevelt növények fluoreszcencia emissziós spektrumai (E37. ábra, D spektrum) és etioplasztiszainak ultrastruktúrája (E38. ábra, d kép) hasonló kinézetű volt, mint a korábban ismertetett, kontroll mennyiségű citokinin-analógot tartalmazó táptalajon nőtt növényeké (E34. ábra, B spektrum és E35. ábra, B kép), ami érthető a megegyező tápközeg összetétel miatt. A kontrollhoz képest kétharmad mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajon nőtt szárak fluoreszcencia emissziós spektrumai (E37. ábra, C spektrum) nem különböztek lényegesen a kontroll növényekétől, de ennek ellenére az etioplasztiszok belső membránjainak fejlettségében eltérések mutatkoztak (E38. ábra, c kép). A PLT-ek lazább szerkezetűek voltak és lipidcseppek is megjelentek az etioplasztiszokban. A kontroll táptalaj nitrogénmennyiségének harmadát tartalmazó közegen tartott szárak fluoreszcencia emissziós spektrumaiban jelentősen csökkent a 655 nm-es pklid komplexnek megfelelő sáv intenzitása (E37. ábra, B spektrum). Ezzel párhuzamosan nem voltak elkülöníthető PLT-ek az elektronmikroszkópos képeken, csak egyszerű belső membránok jelentek meg. Szintén jellegzetesek voltak a felhalmozódott lipid cseppek (E38. ábra, b kép).

84

E37. ábra: Különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon nevelt etiolált borsó hajtások szárának középső régiójáról mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok. Az alkalmazott MS táptalajok nitrogént egyáltalán nem (A), vagy a kontrollhoz (D) képest egyharmad (B) vagy kétharmad (C) mennyiségben tartalmaztak. A gerjesztési hullámhossz 440 nm volt.

E38. ábra: Különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon nevelt etiolált borsó hajtások középső szárrégiójának etiopasztiszairól készített elektronmikroszkópos képek. Az alkalmazott MS táptalajok nitrogént egyáltalán nem (a), vagy a kontrollhoz (d) képest egyharmad (b) vagy kétharmad (c) mennyiségben tartalmaztak. A bar jelzések 0.6 µm-nek felelnek meg.

85

A nitrogénmentes táptalajon fejlődött etiolált szárak középső régiójának fluoreszcencia emissziós spektrumaiban a 655 nm-es sáv csak vállként jelent meg (E37. ábra, A spektrum). Ezzel jól összeegyeztethető, hogy nem alakultak ki PLT-ek az etioplasztiszokban, csak PT jellegű membránok jelentek meg. A többi, kontrollhoz képest kisebb mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajon nevelt növényke etioplasztiszaihoz hasonlóan, lipidcseppek láthatóak az elektronmikroszkópos képen (E38. ábra, a kép). A spektrumok Gauss bontása, majd a 655 nm-es maximumú komponens integráljának kiszámítása és összevetése a teljes spektrum integráljával, azt mutatta, hogy a P655 relatív mennyisége közel fele volt a nitrogénmentes táptalajon nevelt növények szárában, mint a kontroll esetében (E2. táblázat). Az eredmények értékelésénél fontos azonban figyelembe venni, hogy a pklid tartalomban nagy eltérések vannak a különböző nitrogéntartalmú táptalajon nevelt növények szárai között az acetonos pigment kivonatok alapján. Az E2. táblázatban a Gauss komponensek esetén átlagspektrumok (3 mérés) bontásából származó adatok szerepelnek, a pigment tartalmak pedig két mérés átlagát mutatják. E2. táblázat: Különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon nevelt etiolált borsó hajtások szárában mért pklid tartalom, és a 655 nm-es emissziós maximumú sáv relatív aránya a szárakról mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokban. Az alkalmazott MS táptalajok nitrogént egyáltalán nem, vagy a kontrollhoz képest egyharmad vagy kétharmad mennyiségben tartalmaztak. A Gauss komponensek esetén 440 nm-es gerjesztéssel mért átlagspektrumok (3 mérés) bontásából származó adatok szerepelnek, a pigment tartalmak pedig két mérés átlagát mutatják

Nitrogén mennyiség a táptalajban

A 655 nm-es Gauss komponens integrálja a teljes spektrum integráljának %-ában

Pklid tartalom (µg/g friss tömeg)

kontroll

20

2,5

2/3

18

1,1

1/3

12

0,1

nitrogénmentes

9

0,1

A hajtástenyészetben nőtt szárakkal szemben az etiolált levelek 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban még a nitrogénmentes táptalaj esetében is a 654-655 nm-es sáv dominált (E39. ábra, folytonos vonal). Ezzel a spektrális jellemzővel jól összeegyeztethető

86

módon, az elektronmikroszkópos felvételeken jól fejlett PLT-ek láthatóak a levelek etioplasztiszaiban (E39. ábra, beillesztett kép).

E39. ábra: Nitrogénmentes táptalajon nevelt, kb. 7 cm-es borsó növénynek a leveléről (folytonos vonal) és szárának középső szakaszáról (szaggatott vonal) mért 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumai. Az etiolált levelet spektrummérés után 10 percre 5 µmol m-2 s-1 fehér fényre tettük és ismételten 77 K spektrumot vettünk fel róla (pöttyözött vonal). A gerjesztési hullámhossz miden esetben 440 nm volt. Beillesztett kép: egy nitrogénmentes táptalajon nevelt etiolált növény leveléről készült elektronmikroszkópos felvétel. A bar jelzés 1 µm-nek felel meg.

87

6. Az eredmények megvitatása

Az eredmények megvitatása előtt szeretnék kitérni arra, hogy azoknak a publikációknak az eredményeiből, melyek megszületésében második vagy harmadik szerzőként vettem részt, csak azokat a részleteket emeltem ki, amelyek beleillenek a jelen értekezés fő gondolatmenetébe. Ettől függetlenül az eredmények megvitatása kapcsán előkerültek olyan kérdések, melyek megválaszolásához utalok a publikációk olyan eredményeire is, melyek nem szerepelnek az Eredmények fejezetben. Az élethez nélkülözhetetlen fotoszintézis zavartalan működéséhez elengedhetetlen a kl-ok folyamatos bioszintézise. Zárvatermő növényekben a kl bioszintézis fontos szabályozási pontja a pklid-ek fényfüggő fotoredukciója. A pklid-ek fototranszformációja nemcsak a pigmentek

szintjén

jelentős,

hanem

a

növények

morfológiájára,

plasztiszainak

ultrastruktúrájára is alapvető hatással van. A szakirodalmi adatok döntő többsége etiolált növények leveleinek megvilágításáról szól. Ennek ellenére nincsen teljesen általánosan elfogadott

séma

a

levelekben

végbemenő

protoklorofillid-klorofillid

fotoredukciós

útvonalakról (Belyaeva and Litvin 2009). A nem-levél eredetű szervek zöldülése jóval kevesebb figyelmet kapott a szakirodalomban, így a bennük túlsúlyban előforduló monomer pigmentek, mint a borsó epikotil P629 és P636 komplexeinek élettani szerepe tisztázatlan.

6.1 Az egyes pklid komplexek variabilitása borsó epikotilokban A különböző pklid komplexek arányai függenek a vizsgált növényi szövettől, szervtől, fajtól (Böddi et al. 2004), és a növény korától is (Schoefs et al. 2000a). Az epikotilokkal folytatott kísérleteknél azonos korú, azonos szegmensből vett minták sem voltak egyformák ilyen tekintetben, még egy hosszában elfelezett epikotil darab két feléről mért spektrum sem mindig egyforma. Emiatt érdekes volt megvizsgálni és összehasonlítani a pklid komplexek variabilitását.

88

A legnagyobb variabilitása a P636 forma sávjának volt az epikotil középső szegmensében (E1. ábra, B panel, b görbe). Ennek a formának a mennyiségét a bioszintetikus folyamatok sebessége mellett az etioplasztiszok fejlettségi állapota is befolyásolja, az átlagtól való átlagos eltérésének mértéke pedig korfüggő (E1. táblázat). Ugyanez elmondható a P655 komplexekről, mivel ezek integráns alkotói a PLT-eknek, tehát mennyiségük szoros összefüggést mutat a PLT kialakulásával (Ryberg and Sundqvist 1982, Sundqvist and Dahlin 1997), a membránok lipid összetételével (Klement et al. 2000) vagy az aggregáció mértékével (Böddi et al. 1983, 1989). Bár érdemes megjegyezni, hogy Selstam és mtsai (2007) izolált etioplasztiszokon

végzett

vizsgálatai

alapján

fagyasztás-felmelegítés

vagy

nagy

sókoncentráció alaklamazásával a PLT-ek rendezett szerkezete megbomlik, de ennek ellenére a 650 nm-es abszorpciós maximumú pklid komplex spektrális tulajdonságai alig mutatnak változást. A kialakulását befolyásoló számos tényező miatt a 655 nm-es forma heterogén lehet (Schoefs et al. 2000a, Kis-Petik et al. 1999, Mysliwa-Kurdziel et al. 1999). Ráadásul a 644 nm-es komplex sávja 440 nm-es gerjesztést alkalmazva nemcsak az átlagspektrumban, hanem az átlagtól való átlagos abszolút eltérés „spektrumokban” sem látszik, ami a hatékony energiamigrációval magyarázható a P655-re. Tehát ez utóbbi forma sávjának amplitúdója, az átlagtól való átlagos abszolút eltérés „spektrumban”, közvetett módon a P644 variabilitását is magába foglalja. A P629 mennyiségének változására, mivel feltételezhetően nem POR-hoz kötött monomer pigmentről van szó (Böddi et al. 1998), leginkább a pklid bioszintézis „feedback” szabályozása lehet hatással (Schiff and Epstein 1966). Érdemes megemlíteni, hogy az epikotilok alsóbb régiójában az átlagtól való átlagos abszolút eltérés „spektrumban” megjelenő 674 nm-es sáv nem pklid komplexhez tartozik, hanem az embrióból származó kl-a, amit sötétzöld sziklevelekkel rendelkező növények esetében leírtak (Böddi et al. 1999).

6.2 A borsó epikotil 636 nm-nél emittáló pklid formájának egy része monomer pklid-POR-NADPH hármas komplex 6.2.a A P636 flash-fotoaktivitása A pklid fotokonverziója etiolált zárvatermő növények leveleiben jól jellemzett folyamat, azonban más szervek zöldüléséről kevés adat található a szakirodalomban. Mivel a

89

nem levél eredetű szervek csak kis mennyiségben tartalmaznak P644 és P655-657 komplexeket, flash megvilágítás hatására elenyésző mértékű változások mennek végbe bennük, de kis intenzitású, folytonos fénnyel kiváltható a pklid-ek eltűnése és az ezzel párhuzamosan zajló klid és kl akkumuláció (Böddi et al. 1996). A flash megvilágítás közvetlenül átalakítja a POR enzim egységek aktív centrumaiban kötött pklid-eket. Tehát a nem levél eredetű szervek felvillanásos megvilágítás hatására bekövetkező zöldülésének részletes vizsgálata, további információkkal szolgálhat a POR-hoz kötött pklid komplexekről. Szárakban a P644 és P655-657 pklid-jének flash-fotoaktivitása bizonyított (Skribanek and Böddi 2001), de a P629 és P636 komplexek közvetlen szerepe a kl bioszintézisben még nem tisztázott. A nem levél eredetű szervek nagyobb fényérzékenysége, azaz a fotodegradációs folyamatok elindulása a levelekénél megfigyeltekhez képest alacsonyabb fényintenzitáson (Skribanek et al. 2000), megnehezíti ezeket a vizsgálatokat, mivel a levelek zöldítéséhez alkalmazott fényintenzitás mellett a fototranszformáció és a bleaching egymással párhuzamosan zajlik bennük. Alacsony fényintenzitásokon csökken a kifehéredés mértéke, de a pklid-ek fototranszformációja csak részleges. Ráadásul a különböző pklid komplexek más módon reagálnak, vagyis az egyes komplexek kifehéredése és klid-dé alakulása egymástól eltérő mértékű. Nincs kvantitatív összefüggés a pklid sávok csökkenésének mértéke és az újonnan keletkezett klid emissziós maximumok amplitúdója között, mert a pklid-ek és klid-ek fluoreszcencia hozama eltérő, illetve hatékony energiamigráció zajlik a P644-ről a P655-re és a C684-ről a C692-re (Kahn et al. 1970, Sironval and Brouers 1980). Mivel P655 csak kis mennyiségben található az epikotilokban, az átalakulásakor lejátszódó spektrális változások nem fedik el a rövidebb hullámhossznál emittáló pklid komplexek fotoredukciója során kialakuló változásokat, vagyis ezen a kísérleti objektumon a rövidebb hullámhosszú pklid-ek fotoaktivitása is tanulmányozható. Megfigyeléseink szerint a borsó epikotilban nagy intenzitású flash megvilágítás hatására bleaching következett be, amit a jelentős fluoreszcencia jelintenzitás csökkenés mutatott az egész vizsgált spektrumrégióban (E2. ábra). Kis intenzitású polikromatikus felvillanásos megvilágítás esetén, a P636 és P644 átalakulása is megfigyelhető volt, még azokban a fiatal epikotil mintákban is, amelyek szinte nem tartalmaztak P655-öt (E3. ábra). Hozzá kell tenni azonban, hogy a fototranszformáció mértéke nagyon kicsi volt, és ráadásul a pklid formák széles vibrációs szatellit sávjai (Böddi et al. 1992) erősen átfedtek a klid

90

termékek fő emissziós (0-0) sávjaival. Ezért volt indokolt a („megvilágított mínusz sötét”) különbségi spektrumok képzése (E3. ábra, C spektrum). A maximumhelyek ezekben a spektrumokban nem mindig ugyanott jelentkeznek a különböző komplexek sávjainak átfedése miatt. A különbségi spektrumok értékelésénél figyelembe kell venni azt a tényt is, hogy azokat csak normálás után lehet számolni, mert a szilárd minták 77 K-en történő mérése esetén a fluoreszcencia nem mérhető kvantitatívan. Ráadásul a különböző pklid komplexek aránya változott a mintákban, annak ellenére is, hogy az összehasonlított spektrumokat ugyanannak a hosszában elfelezett epikotil szegmensnek a két feléről mértük. Jelenleg folytatott szövettani vizsgálataink szerint a pklid eloszlása nem egyenletes az epikotilban, csak véletlenszerűen lehet a hosszában történő elfelezéssel azonos, vagy hasonló mintát kapni. Az egyes pklid komplexek eloszlásának különbségeit az eltérő szövetek között, etiolált szőlő szárban részletesen jellemezték (Böddi et al. 2004). A 630 nm-es maximumra történő normálás megváltoztatta a különbségi spektrumokban a pklid és klid komplexek sávjainak amplitúdó arányait, pontosabban a pklid sávok relatív amplitúdóját csökkentette, míg a klid sávokét növelte. A pozitív sáv 625-630 nm-nél a normálás következtében jelent meg a különbségi spektrumban, tehát ez nem jelzi a P629 keletkezését. Flash megvilágítás hatására tehát csak kismértékű fototranszformáció ment végbe az etiolált epikotilokban. A hatékonyabb fotoredukció eléréséhez, anélkül, hogy kifehéredés történne, kis intenzitású, folytonos megvilágító fényt alkalmaztunk (E4. ábra). Ilyen módon sikerült csökkenteni a bleaching mértékét, de a fototranszformáció mértéke nem különbözött jelentősen a flash megvilágításnál tapasztalttól. A megvilágítási idő növelésével sem lehetett azonban nagyobb mértékű klid felhalmozódást kiváltani. Három pklid komplex alakult át, és három klid komplex keletkezett, ami a következő transzformációkra utal: P636 → C676-678, P644 → C684-686, P655 → C690-692. A kialakuló klid komplexek sávarányai az epikotilok fejlettségi állapotával változtak, vagyis meghatározó volt az etiolált mintákban a különböző pklid formák aránya. A P644 és P655 átalakulása ismert leveleken végzett kísérletekből, de a P636 → C676-678 fototranszformációt in vivo korábban nem írták le. In vitro, szolubilizált etioplasztisz membrán preparátumban kimutatták egy rövid hullámhossznál, 632 nm-nél abszorbeáló pklid forma

91

fototranszformációját egy 672 nm-nél abszorbeáló klid formává (Griffiths 1975), de a P636 fotoaktivitásáról nincsenek ilyen irodalmi adatok. Érdemes megemlíteni, hogy a rövid megvilágítási idő és utána a minták 5 s-on belüli 77 K-re történő lefagyasztása miatt, a P644 és P655 fototranszformációs termékei (klid – POR – NADPH dimerek és oligomerek) mellett olyan intermedierek is előfordulhattak, melyekben a NADP+ re-redukciója vagy cseréje még nem történt meg. Levelekben a NADP+-t tartalmazó dimer klid komplexek emissziós maximuma 682 nm, míg a hasonló oligomereké 686 nm (Böddi and Franck 1997), tehát spektrálisan átfednek a P644 és P655 fotoredukciós termékeivel. Ez magyarázatot adhat a 6. ábra B spektrumán látható eredményre, mely szerint a nagymértékű P655 átalakulás ellenére kevés C690-692 keletkezett. A megvilágítás utáni néhány másodperces várakozásra a lefagyasztás előtt viszont szükség volt, különben a fotokémiai intermedierek fluoreszcencia kioltó hatása (Belyaeva and Litvin 1981) miatt a jel intenzitása kicsi lett volna. A P636 → C676-678 átalakulás megfigyelhető volt -15 ºC-on megvilágított mintákban is (E5. ábra, B és E spektrum). Ilyen hőmérsékleten, a membránokon belüli molekulamozgások, mint a P636-P655 interkonverzió gátlódnak, tehát ez az eredmény bizonyítja a P636 közvetlen átalakulását. A 10 s hosszú; 1.5 µmol m-2 s-1 intenzitású, – 15 °Con történő megvilágítás (E5. ábra, E görbe) az ugyanilyen körülmények között történő szobahőmérsékletű megvilágítás hatásától eltért abban, hogy a P644 és P655 jelentős mértékű fotoredukcióját is kiváltotta. Ez magyarázható azzal, hogy a 655-657 nm-nél emittáló pklid forma fototranszformációjának mértéke 37 és – 18 °C között fokozatosan nő (Sironval and Brouers 1970). Hosszabb idejű megvilágítás esetén a 632.8 nm-es lézerfény ellenére is átalakult a P655 (E5. ábra, F és G spektrum; E6. ábra, B és C spektrum). Ez a megfigyelt jelenség a pklid komplexek interkonverziója (ld. később: IV.2. rész) mellett azzal is magyarázható, hogy a P655 650 nm-nél található gerjesztési (abszorpciós) sávjához rendelhető lehetséges Qx(0-0) átmenet a 630 nm körüli régióban található, tehát ezen keresztül a 632.8 nm-es lézerfény gerjeszthette a P655-öt. A lézerfénnyel történő megvilágítás ígéretes módszernek tűnt az egyes pklid formák transzformációs folyamatainak elkülönítésére, ami az előbbi okok miatt nem volt lehetséges, de a P636 közvetlen fotoaktivitását sikerült kimutatni.

92

A P636 flash megvilágításra végbemenő fotoredukciója azt bizonyítja, hogy ez a forma a POR enzim, pklid és NADPH hármas komplexe. Fototranszformációjának eredményét a „megvilágított mínusz sötét” spektrumokban egy 674-679 nm közötti maximumú klid sáv mutatja (E3. ábra és E5. ábra, A görbe). Etiolált levelekben fehér flash megvilágítás hatására a túlsúlyban levő P655-657 átalakulásának eredményeként keletkezett C692-696 sávja mellett a fluoreszcencia spektrumban megjelenik egy váll 676 nm-nél, amelynek intenzitása változó. Az irodalomban található hipotézis szerint ez a váll „szabad” monomer állapotú kl-a-nak felel meg, ami közvetlenül a fototranszformáció után a C696 komplexből „esik ki”, majd rögtön észteresítődik (Domanski and Rüdiger 2001, Schoefs and Franck 1993). A jelen munkában megfigyelt C678 nem lehet csak ilyen „kiesett” pigment, mivel olyan minták spektrumaiban is megtalálható volt, amelyekben alig volt P655 (E3. ábra), illetve C692-696 nélkül is megjelent (E5. ábra, A, C, D görbe). A monomer pklid sáv jelentős része változatlan maradt a megvilágítás hatására. Ez azt jelzi, hogy nem minden pklid molekula kötődik POR enzim aktív centrumhoz és/vagy nem minden komplexben van NADPH.

6.2.b A P636 mesterséges aggregáltatása

A

borsó

levelében

és

epikotiljában

található

POR

enzim

immunológiai

kimutathatósága (Western blott) alapján azonosnak tekinthető (Böddi et al. 1994), aktivitása mégis eltérő; ezeknek a szerveknek a zöldülése nagymértékben különbözik egymástól. A levelekben a POR enzim nagyobb aktivitását az aggregált komplexek túlsúlyának tulajdonítják (Armstrong et al. 2000). Szintén az aggregációval kapcsolatos kérdés, hogy a 635 és 650 nmnél abszorbeáló formák között feltételezett dinamikus egyensúly (Kahn and Nielsen 1974) magyarázható-e

a

pklid-et

tartalmazó

molekuláris

egységek

aggregációjával

és

dezaggregációjával. Tekintetbe véve a 655 nagyfokú érzékenységét a hőkezelésre (Henningsen 1970, Böddi et al. 1994, Mysliwa-Kurdziel et al. 2003), vagy a fagyasztás-felmelegítésre (Henningsen 1970), dezaggregációval magyarázzák a forma sávjának kék felé történő eltolódását ilyen kezelések hatására (Butler and Briggs 1966). Etiolált árpa levelek abszorpciós spektrumában a 650 nm-es maximumú sáv fagyasztás-felmelegítés ciklusok után 635 nm-re tolódott, ami gátolható volt 30%-os glicerinnel (Butler and Briggs 1966). A P655 jelenlétét a jól 93

szerveződött PLT membrán szerkezet előfeltételének tartják (Sperling et al. 1998), de a közvetlen kapcsolatok a membránszerkezetek és spektrális tulajdonságok között még tisztázatlanok. A legfontosabb oka a bizonytalanságnak, hogy nem ismeretes, hogy a PLT membránszerkezetében hol helyezkednek el a P655 komplexek. Olyan modellre lenne szükség, amelyben figyelembe lehetne vennia POR-pklid-NADPH egység, az ebből képződő dimerek, oligomerek méretét, és ki lehetne mutatni, hogy a PLT tubuláris rendszerének mely pontjaiban férnek el ezek a komplexek. Jelenleg nem ismeretesek ezek az adatok. A fenti magyarázatnak megfelelően, etiolált bab levelekben a fagyasztás-felmelegítés megbontja a PLT membránok csöves szerkezetét (Henningsen 1970). Selstam és mtsai (2007) kukoricából izolált PLT-eken szintén a PLT szerkezetének egyre rendezetlenebbé válását tapasztalta a fagyasztás-felmelegítés ciklusok számának növelésével. Azonban érdekes módon a PLT-ek abszorpciós spektrumában nem változott a 640 és 650 nm-es abszorpciós sávok aránya tíz fagyasztás-felmelegítés ciklus után sem, csak kis abszorpció csökkenés volt a mért tartományban. A levelekhez hasonlóan a borsó epikotil PLT membránjai is érzékenyek hőre (Böddi et al. 1994) és a fagyasztás-felmelegítésre (E15. ábra), ezzel párhuzamosan pedig a spektrumukból a 655 nm-es sáv is eltűnik (E14. ábra). A 40% (v/v) glicerint és 40% (m/v) szacharózt tartalmazó epikotil homogenátumokban kimutattuk a P636 direkt átalakulását P644 és P655 formákká (E16, E21. ábra). Mivel a P636/P655 arány nagyobb az epikotilokban, mint a levelekben, az előbbiekből készített homogenátumokban jobban látható ez a folyamat. A P644 és P655 kialakulásának sebességét nagyban befolyásolta, hogy mennyi epikotilt homogenizáltunk el egységnyi térfogatú (10 ml) pufferben. Ez magyarázható azzal, hogy a különböző pklid komplexek aránya változik az epikotil korával és a hossztengelye mentén (Böddi et al. 1994), illetve az epikotilok változó víztartalmával. A csíranövények változatos hossza a különböző élettani állapotukra utalt. Így a mintavétel nem volt kvantitatívvá tehető, ezért nem mutattunk átlagspektrumokat vagy statisztikai számításokat. Az ábrák tendenciákat szemléltetnek, melyek minden párhuzamos kísérletben azonosak voltak. A homogenátumokban és a fagyasztás-felmelegítéssel, vagy a kettő kombinációjával keletkezett P655 nagyon fontos tulajdonsága a teljes fotoaktivitása flash vagy 10 s hosszú megvilágításra (E22. ábra). Sőt, az acetonos extraktumok alapján a klid-ek relatív mennyisége

94

a homogenátumokban nagyobb volt, mint az intakt epikotilokban. Ez arra utal, hogy a mesterségesen kialalkult komplex pklid molekulái a POR egységek aktív centrumaihoz kötöttek és NADPH is elérhető volt. A pklid formák arányainak (vagyis a nekik megfeleltethető Gauss komponensek integráljainak) összehasonlítása (E21. ábra) azt mutatta, hogy P644 és P655 keletkezett a P636-ból. Az előző részben leírtak alapján a P636 egy része monomer POR egység. Másfelől a P644 feltehetően dimer (Martin et al. 1997, Ouazzani et al. 1998), a P655 pedig oligomer (Böddi et al. 1989, Wiktorsson et al. 1993). Így a P636-P644 és a P636-P655 átalakulások pigment és protein aggregációnak tekinthetők. A pigment extrakció eredményei, vagyis hogy az inkubáció és a fagyasztás-felmelegítés alatt nem zajlott pigment lebomlás, alátámasztják, hogy a fentebb említett spektrális változások aggregáció, és nem a különböző pklid formák eltérő degradációs sebességének eredményei. Leírták a POR apoenzim, NADPH és a pklid zink analógjának in vitro aggregációját, mely folyamatot plasztisz lipidekkel és glicerinnel serkenteni lehetett (Klement et al. 2000). A lipid összetétel és szerkezet alapvető szerepű a PLT membránok felépítésében, mely kihat a P655 kialakulására is (Selstam 1998). A glicerin jól ismert a proteinek szerkezetét stabilizáló és védő hatásáról, a mechanizmusról azonban számos elképzelés létezik. Egy széles körben elfogadott elmélet szerint a glicerin molekulák körülveszik a proteineket, de nem lépnek közvetlen kölcsönhatásba az aminosav oldalláncokkal, hanem fokozzák a fehérjék felületi hidratációját (Gekko and Timasheff 1981, Parsegian et al. 2000). Ez szabadenergia növekedéshez vezet (Caliskan et al. 2003, Ruan et al. 2003), ami termodinamikailag kedvezőtlen. A rendszer ennek csökkentésére törekszik, ezért lecsökkenti az oldószer-protein érintkezési felületét (Gekko and Timasheff 1981), vagyis fokozza a fehérje aggregációt. Más teória szerint a kisméretű glicerin molekulák nem kizáródnak a fehérjefelszínekről, hanem bejutnak a proteinek belső, hidrofil üregeibe (Caliskan et al. 2003), így kiszorítva a vizet ezekből az üregekből, aminek eredményeként a fehérjék térfogata csökken, viszont az intramolekuláris kötések száma nő (Priev et al. 1996). Megint más magyarázat, hogy a glicerin ozmolitként ozmotikus potenciálkülönbséget vált ki az oldószer és a fehérje belsejében vagy felszíni hasadékaiban levő víz között (Ruan et al. 2003). A glicerin taszíthatja a protein felszíni

95

hidrofób csoportjait, melyek ennek következtében a fehérje belseje felé mozdulnak el, amitől szintén csökken a fehérjék térfogata (Adeishvili 2001). Mindezek a szerkezeti változások fokozzák a fehérjék aggregációját (Gekko and Timasheff 1981). A glicerin mellett különböző szénhidrátok is ismertek, mint fehérje szerkezet stabilizálók (Wright et al. 2003). Vizes oldatban a szacharóz vagy a trehalóz is elősegíti a fehérjék felületi hidratációját (Lee and Timasheff 1981, Cottone et al. 2002), és hasonlóan a glicerinhez, fokozza a víz kijutását a fehérjék belső üregeiből (Ruan et al. 2003). Másfelől a szacharóz molekulák nagyobbak, így csak a perifériájukon keresztül tudnak hatni a globuláris fehérjékre (Caliskan et al. 2003). Az oldható fehérjék (Gekko and Timasheff 1981, Parsegianet al. 2000) és biológiai membránok (Westh 2003) szerkezetét stabilizáló és aggregációjukat kiváltó tulajdonságai alapján a glicerintől szignifikáns hatás volt várható a POR egységek, és így a pklid molekulák aggregációs állapotára is (Butler and Briggs 1966). A glicerines és szacharózos közeg hatására a POR egységek minden bizonnyal lecsökkent térfogattal és aggregációval reagáltak, amit a 655 nm-es sáv amplitúdójának növekedése mutatott (E16. ábra A és B). Azonban a diffúzión keresztüli aggregáció az alkalmazott viszkózus közegben és -14 ºC-on nagymértékben lelassulhatott. Másfelől, a P636 egységeket hordozó membránpartikulumok konformációs változásai ilyen feltételek mellett is végbemehettek. Mivel a P636 a hosszabb hullámhossznál emittáló pklid-ekkel ellentétben valószínűleg a PT-ok lamelláris membránjaiban és/vagy kisebb és lazább szerkezetű PLT-ekben lokalizált (Böddi et al. 1994), az említett konformációs változások alapvető jelentőségűek lehetnek. A glicerin okozta térfogatcsökkenés (Priev et al. 1996) kiválthatta a P636 komplexeket hordozó membránrégiók feltekeredését, így az aktív centrumokban kötött pklid molekulák annyira egymás közelébe kerülhettek, hogy a π elektronrendszereik között exciton kölcsönhatás alakulhatott ki, amely a fluoreszcencia emissziós maximumukat 644 vagy 655 nm-re tolta el (E20 és E21. ábra). A fagyasztás-felmelegítés gyorsíthatta ezeket a konformációváltozásokat, mivel a minták szobahőmérsékletre történő felengedése/felmelegítése gyors molekuláris mozgásokat tett lehetővé. Így a glicerin molekulák hatékonyabban juthattak be a fehérjék belső üregeibe (Caliskan et al. 2003) kiváltva az említett térfogatcsökkenést és aggregációt (Priev et al. 1996) a POR proteinek (és a hozzájuk kötött pklid-ek) esetében is, aminek eredményeként a

96

spektrumokban megnőtt a 644 és 655 nm-es sáv amplitúdója (E18. ábra). A -14 ºC-on végzett inkubáció alatt több P655 keletkezett, mint a fagyasztás-felmelegítés hatására. Érdekes módon, a két kezelés kombinációja jóval hatékonyabb volt, mint bármelyik önmagában (E19. ábra). A napokig tartó inkubáció alatt a glicerin molekulák olyan POR egységek vagy membránpartikulumok közelébe juthattak, melyek fontos szerepet játszottak a P644 és P655 kialakulását indukáló konformáció változásokban. A fagyasztás-felmelegítés fellazíthatta ezt a szerkezetet, és további konformáció változásokat okozhatott. Az inkubált és a több ciklusban fagyasztott-felmelegített homogenátumról készített elektronmikroszkópos felvételek (E17. ábra, B és C kép) alátámasztják ezt az elképzelést. Ugyanis a fagyasztott-felmelegített homogenátumokban az etioplasztiszok burokmembránja sérült, így a glicerin molekulák könnyebben elérhették a PLT membránokat és a membránokhoz kötött fehérjéket. Ennek következtében a glicerin molekulák bejuthattak a membránpartikulumok és POR egységek belső üregeibe is, ami további P644 és P655 kialakuláshoz vezethetett. A szacharóz molekula szerkezetstabilizáló hatása más mechanizmussal magyarázható annak nagyobb mérete miatt. Körülveszik a membrán partikulumokat és/vagy POR egységeket és fokozzák azok felületi hidratációját (Lee and Timasheff 1981), ami késlelteti a lebomlást és a dezaggregációt. Kísérleteinkben a szacharóz jelenléte erősítette a glicerin szerkezetvédő hatását. Egy nemrég közölt munkában (Durin et al. 2009) a szerzők felvetik a lehetőségét, hogy 40 (v/v) % glicerint tartalmazó oldatban a POR mesterséges hármas komplexei aggregálódnak. Durin és mtsai (2009) glicerint különböző koncentrációban tartalmazó oldószerben vizsgálták a Thermosynechococcus elongatus cianobaktériumból származó POR-ral kialakított mesterséges POR-pklid-NADPH hármas komplexeken a fényfüggő reakció első lépéseit. Eredményeik alapján a fényfüggő POR reakció első katalitikus lépése, vagyis a hidrid transzfer a NADPH-ról a pklid 17-es szénatomjára, aminek eredménye egy 696 nm-nél abszorbeáló, nem fluoreszkáló intermedier (Heyes et al. 2006), olyan fehérje mozgásokkal jár, melyek kinetikáját a környező oldószer viszkozitása nem befolyásolja (Durin et al. 2009). Ezzel szemben a második lépésnek a kinetikáját, mely a proton transzfer a Tyr maradékról a pklid 18-as szénatomjára, és így a 681 nm-nél abszorbeáló és 684 nm-nél fluoreszkáló KlidPOR-NADP+ komplex kialakulása (Heyes and Hunter 2005), befolyásolja az oldószer glicerin koncentrációja. Mikor az oldat összeállításakor a glicerin helyett szacharózt használtak, úgy hogy eközben a viszkozitáson nem változattak, hasonló kinetikát kaptak, tehát a különböző

97

koncentrációban alkalmazott glicerin okozta eltérő kinetika az oldatok más viszkozitásának és nem a speciális glicerin és POR közötti kölcsönhatásoknak tudhatók be (Durin et al. 2009). Csak részleges Shibata-shift ment végbe a glicerines-szacharózos közegben. Az eltolódás lehetséges okai között natív rendszerekben szerepel a PLT membránpartikulumok (Ryberg and Sundqvist 1988, Domanskii et al. 2003) vagy a POR egységek (Böddi et al. 1990) dezaggregációja vagy konformációjuk megváltozása (Wiktorsson et al. 1993, Smeller et al. 2003). A közeg szerkezetstabilizáló hatása a mi homogenátumainkban elég erős volt ahhoz, hogy meggátolja a Shibata-shift teljes végbemenetelét a -14 ºC-on, 4 napig inkubált majd megvilágított mintákban (E23.ábra). Érdemes megjegyezni, hogy három ciklusban fagyasztott-felmelegített majd megvilágított minták esetén még kevésbé ment végbe a Shibatashift. Az eltolódás teljesen meggátolható 87%-os glicerin alkalmazásával (Zhong et al. 1996). Az a tény, hogy az általunk alkalmazott közegben részlegesen végbemegy a Shibata-shift, jól összeegyeztethető azokkal az eredményekkel, melyek szerint a kék felé történő eltolódáshoz elegendőek kismértékű konformációs változások is (Wiktorsson et al. 1993, Smeller et al. 2003). A frissen készített homogenátumhoz ATP-t adva tovább lehetett fokozni a közeg aggregáltató hatását (E24. ábra, beillesztett rész), vagyis további P636 komplexek alakultak P655-té. Ez jó összhangban van azokkal az eredményekkel, melyek szerint a foszforiláció fokozza a POR proteinek aggregációját az etioplasztiszokban, de a mechanizmus még nincs tisztázva (Wiktorsson et al. 1996, Kovacheva et al. 2000). A P636-nak csak egy részét lehetett hosszabb hullámhosszú pklid komplexekké aggregáltatni (E19.ábra, beillesztett rész), illetve 632.8 nm-es lézerfénnyel közvetlenül klid-dé átalakítani. Ezek a megfigyelések a P636 heterogenitására utalnak, vagyis a flash-fotoaktív komplexek olyan pklid molekulákat tartalmaznak, melyek a POR egységek aktív centrumaiban kötöttek, míg a pklid-ek egy másik populációja az aktív centrumon kívüli másik kötőhelyhez (Klement et al. 1999, Franck et al. 2000, Buhr et al. 2008), illetve nem POR-hoz (Kahn et al. 1970) vagy nem fehérjéhez (Sperling et al. 1998) kötött lehet. Tehát csak a flashfotoaktív P636 egységek aggregálódtak flash-fotoaktív P655-té, ami alátámasztja, hogy a P636 legalább egy része monomer POR hármas komplex. Az aggregátumokon belül, kis távolságú molekuláris mozgások lehetővé teszik, hogy ciklikusan menjen végbe a reakció, mert az aktív centrumon kívüli NADPH és pklid a fototranszformáció után be tud kötni az aktív helyre.

98

A munka eredményei bizonyítják, hogy a flash-fotoaktív monomer pklid komplexekből összeálló, hosszú hullámhossznál emittáló flash-fotoaktív pklid komplexek oligomerek. Másfelől az eredményeink igazolják a glicerin és a szacharóz szerkezetet stabilizáló és/vagy aggregációt kiváltó tulajdonságait. Mivel ezek a vegyületek izoláló közegek gyakran használt komponensei, érdemes figyelembe venni a jelenlétüket pl. izolált fehérjék jellemzésénél. Érdekes megemlíteni, hogy az aggregációt kiváltó közegben nem kaptunk 655 nm-nél hosszabb hullámhosszú pklid komplexeket. Ez ellentmond az irodalomban található olyan adatoknak (Stadnichuk et al. 2005), hogy a pklid feltételezett további aggregációjával létrejönnének az ú.n. távoli vörös pklid formák, így alátámasztva azt az általános nézetet, hogy az etioplasztiszok spektrumaiban a 670 nm feletti emissziós sávok valójában vibrációs szatellit sávok. Nem zárható ki azonban, hogy in vivo a pklid molekulák olyan környezetben helyezkednek el, ami lehetővé teszi a korábban in vitro modellekben megfigyelt hosszú hullámhosszú pklid komplexek kialakulását. Erre jelenleg nincs kísérletes bizonyíték.

6.2.c A P655 re-aggregációja P636-ból A fagyasztott-felmelegített etiolált epikotil szegmensek fluoreszcencia emissziós spektrumában jelentősen lecsökkent a 655 nm-es sáv intenzitása (E25A. ábra, b spektrum), és etioplasztiszaikban szétestek a PLT-ek (E15. ábra, B kép). Ennek ellenére, az epikotil darabok glicerines-szacharózos közegben történő elhomogenizálása után, a spektrumukban újra megjelent a 655 nm-es sáv (E25A. ábra, c spektrum). Ráadásul, a 632 nm-es sávhoz viszonyított relatív aránya megegyezett az etiolált epikotil spektrumában kapottal (E25A. ábra, a spektrum). Az etiolált, fagyasztott-felmelegített, majd elhomogenizált epikotilok spektrumainak (E25A. ábra) Gauss bontásából (E25B. ábra) kiderült, hogy a 655 nm-es sáv amplitúdójának csökkenésével párhuzamosan a 636 és 644 nm-eseké nőtt, míg a 655 nm-es maximumú Gauss komponens integráljának növekedését a 636 és 644 nm-es maximumú komponensek integráljának csökkenése kísérte. Ezen kívül a homogenizálás után kialakult 655 nm-es sáv 10 s megvilágítás hatására eltűnt a spektrumból, és megjelent egy 690 nm-es klid sáv. Ha ezeket az adatokat összevetjük az előzőekben ismertetett, inkubált és/vagy fagyasztottfelmelegített homogenátumok vizsgálatával kapott eredményekkel, levonható az a következtetés, hogy a fagyasztott-felmelegített mintákban a P655 oligomer komplexek a

99

flash-fotoaktív P636 monomer és P644 dimer komplexekre estek szét. Az ezt követő homogenizálás során pedig a monomer és dimer komplexek re-aggregációjával alakultak ki újra a P655 oligomerek. Érdemes megfigyelni, hogy az etiolált állapothoz képest a homogenátumokban hogyan változott az egyes komplexeknek megfelelő Gauss komponensek relatív integrálja (E25B. ábra), mert ebből következtetni lehet az egyes komplexek egymáshoz viszonyított mennyiségének

változásaira.

(Abszolút

mennyiségre

vonatkozó

következtetéseket

fluoreszcencia emissziós spektrumok elemzése alapján nem lehet levonni.) A 629 nm-es komponens változott a legkevesebbet, ami azt mutatja, hogy nem volt szerepe a folyamatban, vagyis nem aggregálódott, de a homogenátum készítése alatt nem is bomlott le. A P655-nek megfelelő komponens integrálja lényegében nem változott, míg a 636 nm-es maximumú komponens integrálja csökkent, a 644 nm-es komponensé pedig nőtt. Ennek kapcsán felmerülhet a kérdés, hogy egy mesterséges közegben miért az etiolált állapotnak megfelelő arányú P655 komplex alakul ki újra. Meg kell jegyezni, hogy a fagyasztás-felmelegítés után a 655 nm-es komponens integrálja kb. 75%-ára csökkent le (E26. ábra, FfEpi oszlop), tehát többségében megmaradt, annak ellenére, hogy a PLT-ek nagyrészt szétestek (E15. ábra, Bkép). Ehhez hasonlóan, fagyasztás-felmelegítés ciklusokkal kezelt izolált PLT-ekben, a megbomlott membrán struktúra ellenére is megmarad a 650 nm-es abszorpciós maximumú pklid komplex (Selstam et al. 2007). Ez arra enged következtetni, hogy a PLT kisebb membrán partikulumainak épen maradása már képes lehet biztosítani a P655 komplexek megmaradását. Klement és mtsai (2000) izolált etioplasztisz preparátumokból az etioplasztisz belső membrán komponenseinek szinte teljes eltávolítása után kapott POR-pklid komplexeket vizsgáltak, különböző koncentrációjú glicerint tartalmazó közegekben. Az abszorpciós spektrumok maximuma 30 % (m/v)-os glicerines közegben (ez 24 % (v/v) értéknek felel meg) 641 nm, míg 80% (m/v)-os (ez 64 % (v/v) értéknek felel meg) glicerines oldatban 649 nm volt. A 641 nm-es abszorpciós maximum a 638 és a 650 nm-es maximumú pklid forma sávjának átfedéséből jön létre (Klement et al. 2000). (Jelen értekezésben a különböző pklid formák a fluoreszcencia emissziós maximumuk megjelölésével szerepelnek, ami a 638 nm-es abszorpciós maximumú pklid komplex esetén 644 nm (P644), a 650 nm-es abszorpciós

100

maximumú komplexnél pedig 655 nm (P655)). Ezek alapján az eredmények alapján a glicerin koncentrációjától függ az aggregációt kiváltó hatása, amely megvalósulhat a PLT membránok jelenléte nélkül is. A

kísérleteinkben

alkalmazott

homogenizáló

közeg

összetételének

hatásáról

elmondható, hogy ha a homogenizáláshoz csak glicerint használtunk szacharóz nélkül, akkor is hasonló eredményeket kaptunk (E26. ábra, 40GHom oszlop). Viszont a glicerin és szacharóz nélküli foszfát pufferben elhomogenizált epikotilokban (E26. ábra, 00Hom oszlop) nem történt aggregáció, a P655 aránya a mintákban megegyezett a fagyasztás-felmelegítés után kapott értékkel (E26. ábra, FfEpi oszlop). Mindezek alapján tehát a borsó epikotilokban a fagyasztás-felmelegítés hatására szétesett PLT membránok kisebb, épen maradt régióiban lokalizálódhatott a P655 komplexek többsége, a kisebb részük pedig P644 és P636 komplexekre esett szét. Az ezt követően készített homogenátumokban, a glicerines közeg hatására a P636 monomerek és P644 dimerek aggregálódtak. A kialakult pklid komplex arányokat valószínűleg az alkalmazott glicerin koncentrációja befolyásolhatta.

6.3 A 655 nm-nél emittáló pklid komplex megvilágításával közvetlenül lehet 676 nm-en emittáló klid vagy kl formát előállítani Rövid hullámhosszú (632.8 nm-es) lézerfényt, illetve rövid megvilágítási időket alkalmazva etiolált búza levelekben, rövid hullámhosszú, 676 nm-nél emittáló klid termékeket kaptunk (E8A. ábra, szaggatott vonal; E9 és E10. ábra). Etiolált levelek telítési fényintenzitással történő felvillanásos megvilágításakor a fő termék 690 nm felett emittáló, hosszú hullámhosszú klid, de a spektrumban mindig megjelenik egy váll 676-677 nm környékén. A fényintenzitás csökkentésével a klid sávok arányai megváltoztathatók: 1-2%-os parciális fototranszformáció kiváltásakor a fő klid maximum 680 nm alatti (Böddi et al. 1991). Szintén túlsúlyba kerülhet a rövid hullámhosszú klid olyan minták esetében, melyekben a rövid hullámhosszú pklid-ek aránya nagy, és ezzel párhuzamosan etioplasztiszaikban kevés, kisméretű PLT található. Ez előfordul fiatal, néhány napos (Schoefs and Franck 1993, 2008) vagy öregedő levelek esetén (Avarmaa et al. 1984), illetve az Arabidopsis det340 mutánsban, melyben nincs POR A, sem P655, és etioplasztiszaiból hiányzanak a PLT-ek (Lebedev et al.

101

1995). Fényen nevelt, majd sötétbe helyezett növények levelében is csak rövid hullámhosszú pklid-eket (632 és 644 nm-es emissziós maximumokkal) írtak le, melyek fluoreszcencia emissziós sávjai megvilágításkor eltűnnek a spektrumokból, ezzel párhuzamosan pedig egy 675 nm-es emissziós maximumú klid vagy kl keletkezik (Siffel et al. 1987). A kialakuló klidből gyors észterifikációval kl-a keletkezhet (Domanski and Rüdiger 2001), melyet a klid-től spektrálisan nem lehet elkülöníteni. Etiolált levelek esetében a 675 nm-es klid/ kl kialakulására egyfelől magyarázat lehet az

oligomer

klid-POR-NADP+

komplexekből

való

kiesés.

Vagyis

a

P655

fototranszformációjakor az elsőként kialakuló fluoreszkáló intermedierek (C688), a két lehetséges útvonal közül, nagyobbrészt a klid kiesés irányába alakulnak tovább (Schoefs 2000, részletezve az Irodalmi bevezetőben). A másik lehetséges mód a borsó epikotil P636 komplexéhez hasonlóan a P633 közvetlen átalakulása, melyet a szakirodalom nem zár ki (Mc Ewen et al. 1996). Az E9. ábrán látható eredmények alapján nemcsak a fentebb említett tényezők (megvilágító fény intenzitása, pklid komplexek arányai, PLT szerkezete), hanem a megvilágító fény hullámhossza is megszabja, hogy milyen klid termék keletkezik szobahőmérsékleten. A rövid hullámhosszú lézer flash sorozat eredményeként C676 halmozódott fel, míg a 654 nm-es lézerfény 689-694 nm-nél emittáló klid komplexek keletkezését váltotta ki. Érdemes megjegyezni, hogy a rövid hullámhosszú klid kialakulása telítésre vezetett (E9B. ábra), a tizedik 632.8 nm-es lézer flash után a klid sáv hosszabb hullámhosszak irányába tolódott el. Ehhez hasonlóan, 240 µmol m-2s-1 –nál nagyobb PFD esetén, két rövid hullámhosszú lézer felvillanás eredményeként, a fő termék 690 nm környékén emittáló klid volt. Az eredmény értékelésekor figyelembe kell venni azt a tényt, hogy bár a 632.8 nm-es lézer nem fed át a P655 gerjesztési (abszorpciós) sávjával (M1. ábra), de a hozzá rendelhető korábbiakban már említett, 630 nm környéki Qx(0-0) átmenetével igen. Ezen keresztül tehát gerjesztheti a 632.8 nm-es fény a P655 komplexeket. Ez utóbbi megállapításnak ellentmond, hogy 10-nél kevesebb flash (E9. ábra) vagy kisebb fényintenzitás (E10.ábra B, C spektrumok) esetén nem alakult ki C690-691. Elképzelhető, hogy a P633-ról energiamigráció történik a P655-re, bár a komplexek eltérő lokalizációja miatt ez a folyamat korlátozott (Amirjani and Sundqvist 2006), tehát csak nagy fényintenzitás vagy sok flash alkalmazásakor kerül rá sor.

102

Másik lehetőség, hogy közvetett módon végbemehet, ami feltételezi, hogy a P644 energiamigrációs „hidat” képez a két forma között A flash megvilágítások következtében konformációs változások is végbemehetnek a PLT membránokban, ez megváltoztathatja az energiamigráció geometriai feltételeit. A borsó epikotilban kapott eredmények kapcsán, melyek szerint a rövidebb hullámhosszú fotoaktív pklid komplexek előbb átalakulnak, mint a P655, felmerült az a lehetőség, hogy a PT-okban lokalizált P633 és a PLT-ek felszínén található P644, a rövid hullámhosszú lézer megvilágítás mellett, „leárnyékolja” a PLT-ekben található P655-öt. Ez az elképzelés igaz lehet a búza levelek esetében is. Hasonló adatok találhatóak az irodalomban: kis intenzitású, fehér fényű flash-eket alkalmazva a P644 átalakulása megelőzi a P655-ét (Böddi et al. 1991, 2003), ami magyarázható azzal, hogy a PLT felszíni régiói, amelyekben átalakul a P644 klid-dé, az egyes flash-eket követően, sötétben ledisszociálnak a PLT-ekről, így lehetővé téve a P644 regenerációját (Böddi 1994). Ezzel magyarázható eredmény, hogy a 654 nm-es lézerfénnyel, kis intenzitású flash megvilágítás hatására (E10. ábra B, folytonos spektrum) rövid hullámhosszú klid keletkezett. További, ezzel a hipotézissel jól összeegyeztethető megfigyelés, hogy 654 nm-es lézerfénnyel, azonos körülmények között megvilágított búza és borsó levelek közül a borsóban arányában több C678 keletkezett (E12. ábra). A borsó levélben ugyanis lazább szerkezetű PLT és több rövid hullámhosszú pklid komplex található (Mysliwa-Kurdziel et al. 2003). Viszont ennek az elméletnek ellentmond az a Kovacevic és mtsai (2007) által közölt eredmény, mely szerint P657 nemcsak a PLT-ek belsejében, hanem a sztrómában is előfordul, izolált, majd szacharóz grádiens centrifugálással sztróma és különböző membrán frakciókra szétválasztott árpa etioplasztiszok vizsgálata alapján. Sőt, telítési fényintenzitással történő megvilágítás hatására a PLT és a sztróma frakció 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumában főként 697 nm-nél emittáló klid jelenik meg, míg a PT frakció spektrumában a 676 nm-es klid sáv volt domináns. Meg kell jegyezni azonban, hogy több metodikai és értelmezési probléma miatt ennek a publikációnak az eredményei és következtetései megkérdőjelezhetők. A közölt spektrumok azt is mutathatják, hogy a membránok frakcionálása sikertelen volt abban a munkában. Ezzel szemben az E11. ábrán látható, hogy etiolált búzából izolált PLT (E11A. ábra) és PT-dúsított (E11B. ábra) etioplasztisz belső membránpreparátumok kis intenzitású, 632.8 és

103

654 nm-es lézerfénnyel történő megvilágításakor, mindig 690 nm feletti klid maximumot kaptunk a fluoreszcencia emissziós spektrumokban. Búza levelekből készített homogenátum, az etioplasztisz belső membránokkal azonos körülmények között zajló megvilágításakor 687.5 nm-es klid-et kaptunk (E11C. ábra). A homogenizáló közegben, ellentétben az etioplasztisz belső membránok izoláló közegével, nem volt NADPH. Így a fototranszformáció során kialakuló C688 oxidálódott koenzime nem tudott kicserélődni vagy visszaredukálódni (Schoefs 2000, Heyes et al. 2008). Szintén a NADP+-t tartalmazó oligomer klid komplex keletkezését figyeltük meg -60 ºC-on megvilágított búza levelekben, függetlenül a megvilágító fény hullámhosszától (E8. ábra B). Ilyen hőmérsékleten gátoltak a membránmozgások, a keletkező klid nem tud eltávozni a komplexből. Sőt, in vitro rendszerben kimutatták (Lebedev and Timko 1999, összefoglaló: Heyes et al. 2005), hogy a klid-POR-NADP+ komplexből a NADP+ kilépéséhez 220-260 K hőmérséklet szükséges. Érdekes eredmény, hogy a megvilágított PLT, PT és borsó levél homogenátumokból acetonnal kivont pigmentek spektrumainak vizsgálata alapján (E13. ábra), a 654 nm-es lézer a leghatékonyabb a fototranszformáció kiváltásában. A két lézer együttes alkalmazása azonos PFD értékek mellett az izolált etioplasztisz belső membránok esetén kevésbé volt hatékony, mint külön-külön a kétféle hullámhosszúságú lézer, tehát nem volt erősítési effektus. Ezzel szemben a borsó levél homogenátum esetén volt. Ennek oka lehet, hogy a lazább szerkezetű PLT-ek és a P633 nagyobb aránya hatékonyabb energiamigrációt tesz lehetővé a rövidebb hullámhosszú pklid komplexekről a hosszabbakra. Eredményeink alapján nincs bizonyíték a P633 közvetlen átalakulására búza levélben, a felhalmozodó C676 inkább a hosszú hullámhosszú pklid komplexek fototranszformációjával kialakuló oligomerekből való kieséssel jöhet létre.

6.4 A nem közvetlenül átalakuló monomer pklid-ek élettani szerepe 6.4.a A nem flash-fotoaktív monomer pklid-ek fotooxidációs, fotodestrukciós folyamatok fotoszenzibilizátorai Korábban kimutatták (Erdei et al. 2005), hogy a természetes fényre került borsó epikotil meggörbülésének hátterében részben szinglet oxigén hatására bekövetkező

104

fotooxidatív folyamatok állnak. Sőt, nagyon kis intenzitású fény (2 µmol m-2 s-1) hatására is gyors pklid degradáció következik be etiolált borsó epikotilokban (Böddi et al. 2005). Ennek egyik lehetséges okaként a szerzők az epikotilokban az aktív centrumokon kívüli „külső” NADPH hiányát jelölik meg. A „külső” NADPH szerepe egyrészt az oxidált állapotú koenzim pótlása (Heyes et al. 2008), ami lehetővé teszi a fotoaktív komplexek regenerációját számos cikluson keresztül (Franck et al. 1999), másrészt antioxidánsként szerepet játszhat a ROS-ok eliminálásában (Kirsch and de Groot 2001). További szerepe a PLT membránszerkezet stabilitásának a fenntartása (Ryberg and Dehesh 1986). Ebben a munkában sikerült specifikus festésekkel kimutatni a szuperoxid anion gyök (E28. ábra) és a hidrogén-peroxid (E29. ábra) jelenlétét is a görbülést kiváltó intenzitású fénnyel megvilágított epikotilokban. A legintenzívebb ROS termelés az epikotil középső régiójában volt kimutatható, sőt a sötétben, a hossztengely mentén egyenletesen beinjektált hidrogén-peroxid is a középső szakaszban váltott ki görbülést (E30. ábra). A jelenség valószínűsítető oka, hogy ebben a régióban nagy a monomer pklid-ek aránya (Böddi et al. 1994), melyek fotoszenzibilizátorként viselkednek. Felsőbb régiókban fejlettebb etioplasztiszok és ezzel párhuzamosan több oligomer pklid komplex található (Böddi et al. 2004), melyek nem váltanak ki ROS termelődést (Armstrong et al. 2000). Az alsó epikotil szakaszokban erőteljesebb a lignifikáció és sokkal kevesebb pigmentet tartalmaznak, mint a felsőbb régiók (Böddi et al. 1994). Érdekes megemlíteni, hogy az epikotil keresztmetszetén vizsgálva a hidrogén-peroxid és szuperoxid anion termelődési helyeit (E28 és E29. ábra), ezek egybeestek azokkal a régiókkal (hipodermisz, a levélnyomnyalábok körüli parenchima sejtek és a központi henger edénynyalábjainak környéke), ahol fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatok alapján a legtöbb pklid lokalizálódik. A mikroszkópos munka eredményeire nem tértem ki az Eredmények fejezetben, azokat a Hideg et al. 2010 publikáció részletesen tartalmazza. Összességében tehát megállapítható, hogy a természetes fényre került etiolált borsó epikotilban a korábban kimutatott (Erdei et al. 2005), a gerjesztett állapotú pklid-ekről oxigénre történő energiatranszfer eredményeként kialakuló szinglet oxigén mellett (II.-típusú reakció), a szintén működő pklid érzékenyített I.-típusú reakcióban szuperoxid és hidrogénperoxid is keletkezik. Mindkét reakcióban a pklid a szenzibilizátor. Érdemes megjegyezni, hogy az etiolált borsó epikotil homogenátumokban az aggregációval párhuzamosan megnövekedett mértékű fototranszformáció jól ősszeegyeztethető azzal az

105

elképzeléssel, hogy az oligomerizáció védelmet nyújt a fotooxidáció ellen (Armstrong et al. 2000).

6.4.b Kis fényintenzitáson történő zöldülés Etiolált borsó csíranövények epikotiljának kis fényintenzitáson (10 µmol m-2s-1) történő zöldítésekor hat óra alatt eltűnt a monomer pklid sáv. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető volt 680 nm-nél egy arányosan növekvő kl(id) sáv, ami miatt kizárható volt, hogy a pigmentek kifehéredése okozta a monomerek sávjának eltűnését, tehát a pklid lassú fotoredukciója történt kl(idd)é. Ez azt jelenti, hogy a nem POR aktív centrumban kötött monomer pklid-ek is átalakulnak. Az E5. ábrán bemutatott kísérletsorozatban ugyanolyan mennyiségű fotonnal, de különböző hosszúságú idő alatt világítottuk meg a borsó epikotilokat. Egy statikus rendszerben azt várhatnánk, hogy ugyanolyan jellegű fotoredukció menjen végbe. Ezzel szemben ugyanaz a foton-mennyiség hosszú idő alatt abszorbeálódva a hosszú hullámhosszú komplexek átalakulását váltotta ki a monokromatikus, rövid hullámhosszú megvilágítás ellenére. Ez csak úgy magyarázható, hogy a komplexek között dinamikus átalakulások játszódtak le (Kahn and Nielsen 1974, Böddi and Franck 1997). Ezek az átalakulások összefüggésben vannak a komplexek eltérő lokalizációjával. A rövidebb hullámhosszokon emittáló komplexek a PT membránokban (P636) (Böddi et al. 1994, 1998), illetve a PLT-ek felületén (P644) találhatóak, míg a P655 integráns alkotórésze a PLT-eknek (Böddi et al. 1989). Ennek megfelelően a P636 és P644 közvetlenül abszorbeálni tudja a megvilágító fény fotonjait, és „leárnyékolják” a P655-öt. A pklid komplexek lehetséges interkonverziói (P636 → P644, P636 → P655 és P644 → P655), és az etioplasztisz belső membránokon belüli molekuláris mozgások befolyásolhatják a különböző komplexek átalakulási arányait. Szintén a pklid komplexek eltérő lokalizációjával és lehetséges interkonverzióival magyarázható az a kísérleti eredmény, hogy a P636 és a P644 átalakulása megelőzi a P655 fotoredukcióját (E6. ábra). Ez jól összeegyeztethető az irodalomban korábban közöltekkel, levelekben ugyanis diódasoros

fluorométerrel

végzett

gyorskinetikai

mérésekkel

kimutatták,

hogy

a

fototranszformáció első másodperceiben a P644 átalakulása megelőzi a P655-ét (Böddi et al. 2003). Ilyen átalakulások végbemenetelére utal az E6. ábra C („20 mínusz 10”) különbségi

106

spektruma. A P655 nagymértékű átalakulásában a 20 másodperc és 10 perc időtartamú megvilágítás hatására (E5. ábra, F és G görbe) szintén jelentős szerepet játszhattak ilyen reakciók. A

borsó

epikotilok

77

K

fluoreszcencia

emissziós

spektrumainak

Gauss

komponensekre való felbontásával és lézer spektroszkópiai mérésekkel (az irodalmi áttekintésben említett FLN- Böddi et al. 1998) kimutatták a P629 létezését. A P629 pkl vagy pklid monomer, a fluoreszcencia emissziós maximuma hasonló, mint a szerves poláros oldószerekben mért pkl/pklid-é (Houssier and Sauer 1969). Kísérleteinkben a P629 átalakulása nem történt meg, viszont a kifehéredése igen. Ez megerősíti azt a feltevést, hogy a pigment nem fehérjéhez kötött ebben a komplexben (Böddi et al. 1998), így csak regenerálni tudja a fototranszformációjuk után a hosszabb hullámhossznál emittáló pklid komplexeket, pótolva a pigmenteket a POR egységek aktív centrumaiban flash megvilágítást követő sötét inkubáció vagy folytonos, kis intenzitású fénnyel történő megvilágítás során (Schoefs et al. 2000b). A P644 és P655 borsó epikotil homogenátumokban történő in vitro képződése rámutat arra, hogy a folyamat in vivo is végbemehet, vagyis alátámasztja az irodalomban korábban (Kahn and Nielsen 1974) felvetett dinamikus interkonverziót a natív pklid komplexek között.

6.5 A teljes bleachelés utáni regeneráció Ellentmondásos adatok vannak a szakirodalomban a POR hármas komplexek stabilitásáról a pklid-ek fototranszformációja után. Vannak olyan adatok, amelyek a POR stabilitásának csökkenéséről számolnak be (Dehesh and Apel 1983, Kay and Griffiths 1983, Schoefs and Franck 1993, Reinbothe et al. 1995), míg más eredmények a POR enzim több flash-megvilágítás/sötét regeneráció cikluson keresztüli működését mutatják (Franck et al. 1993). Egyetlen POR gént (Spano et al. 1992, Sundqvist and Dahlin 1997) tartalmazó növények esetében (pl. borsó, uborka) logikus a feltételezés, hogy a POR nem degradálódhat fény hatására, mert az a kl bioszintézis elégtelen működéséhez vezetne. Ezért nem meglepő, hogy ilyen növények esetében megvilágítás hatására a POR fehérje szintjének növekedését tapasztalták (Kuroda et al. 1995, 2000).

107

Etiolált növényi szövetek fényre kerülésekor azonban figyelembe kell venni, hogy a fototranszformáció mellett bleaching (E2. ábra) és fotooxidáció is történik (E27. ábra), különösen a nagy mennyiségű monomer pigmentet tartalmazó szárakban. Az előzőekben már tárgyalt eredményekből kiderült, hogy ilyenkor ROS molekulák keletkeznek, melyek károsítják a pigment, protein és lipid molekulákat is (Erdei et al. 2005). Ilyen körülmények között tehát kérdéses a POR enzim stabilitása olyan (egyetlen POR gént tartalmazó) növényekben is, melyekben kisebb fényintenzitás még növelheti is a génexpressziót vagy a fehérje mennyiségét. Etiolált epikotilok nagy intenzitású fénnyel történő megvilágítása egy óra alatt szinte az összes pigment lebomlásához vezetett (E31. ábra, B görbe). Ehhez hasonló eredményt kaptak (Lebedev et al. 1995) P655 komplexeket nem tartalmazó, etiolált (det340) mutáns Arabidopsis levelek természetes fehér fényre helyezése után.

A fellépő bleaching

eredményeként 5 óra alatt teljesen eltűntek a pigmentek. A mi kísérleteinkben az volt az érdekes, hogy a pigmentek lebomlása ellenére is a POR fehérje kb. fele megmaradt. (Ez utóbbi eredményre nem tértem ki az Eredmények fejezetben, mert a munkában csak társszerzőként vettem részt, de a Szenzenstein et al. 2010 publikáció részletesen tartalmazza a kísérletek eredményeit.) Sőt, az epikotilok bleaching utáni sötét regeneráltatása során az elsőként regenerálódó pklid komplex a P655 volt (E31. ábra, C görbe). Annak ellenére, hogy etiolált borsó epikotilban a monomer komplexek vannak túlsúlyban, a de novo pigment bioszintézis eredményeként mégis rögtön oligomerek alakultak ki. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a kialakuló monomer komplexek azonnal aggregálódtak. Másik lehetőség, hogy a bleaching alatt az oligomer komplexekben a pigmentek molekuláris fehérje és lipid környezete megmaradt, ahova be tudtak kötni az újonnan szintetizálódott pklid-ek. Tekintetbe véve, hogy a bleaching után is megmaradt a POR fehérje közel fele, majd a regeneráció végére elérte az etiolált állapotnak megfelelő mennyiséget, és hogy regeneráció végbemenetelének ténye és mértéke a 655 nm-es komplex megvilágítás előtti relatív mennyiségétől függött, valószínűbb a második magyarázat. Tehát a PLT membránok pigment és protein komponensei között erős fény hatására felborult az eredeti egyensúly, valószínűleg kialakultak pigment nélküli („üres”) POR enzim egységek, ahova rögtön be tudtak kötni az újonnan szintetizálódó pklid-ek.

108

6.6 A pklid komplexek arányait befolyásoló tényezők a növénynevelés során Exogén citokinin és különböző mértékű nitrogénhiány hatását etiolált borsó hajtástenyészetekben vizsgáltuk. Mindkét esetben, irodalmi előzmények alapján alapvető változásokra számítottunk a pklid komplexek arányait és ezzel párhuzamosan a PLT-ek megjelenését illetően. A zöldülés folyamatának megértéséhez fontos kérdés a PLT struktúra kialakulásának szabályozása.

PLT-ek

nemcsak

etioplasztiszokban,

hanem

fiatal

fejlődő

levelek

kloroplasztiszaiban természetes fény-sötét perióduson is kialakulnak éjszaka (Rebeiz and Rebeiz 1986, Schoefs and Franck 2008, Whately 1974), és eddig még részleteiben tisztázatlan szerepük van a kloroplasztiszok fejlődésében (Blomqvist et al. 2008). 6.6.a A szervtenyészetben fejlődött etiolált borsó szárak és az etiolált epikotil összehasonlítása Az 1mg/l BAP-nal kiegészített táptalajon („teljes MS”), etiolált szervtenyészetekben fejlődött hajtások szárának 77 K fluoreszcencia emissziós sajátságai eltérőek voltak a szár különböző szakaszaiban (E36. ábra). A szár felső régiójának spektruma (E36. ábra, A spektrum) hasonlított leginkább az etiolált epikotiléhoz. Az egyes növények spektrumai között voltak eltérések, de a 655 nm-es pklid komplexnek megfelelő sáv minden növényke esetén a szár középső régiójában volt a legnagyobb intenzitású (E36. ábra, B spektrum). Az alsó szárrégiókban megjelenő kl sávok (E36. ábra, C spektrum) a táptalajokra helyezett, eredetileg zöld hajtásrészletekből származhattak, melyek oldalhajtásaiként alakultak ki az etiolált hajtások (E33. ábra). Sötétzöld magokból csírázó etiolált növények esetében írtak le hasonló jelenséget (Böddi et al. 1999). Ennek megfelelően a BAP és nitrogén mennyiségi hatásainak vizsgálatához az etiolált borsó szár plasztiszainak fejlődésére és pklid komplexeinek arányaira, a középső szárrégiókból vettünk mintát, mivel az arányában nagyobb mennyiségű P655 lehetővé tette a spektrális változások könnyebb nyomon követését. A borsó csíranövény epikotiljának (E15. ábra, A kép) és a teljes MS táptalajon fejlődött növénykék szárának középső régiójában (E35. ábra, B kép) kialakult etioplasztiszok 109

mérete hasonló volt. Az elektronmikroszkópos felvételek összehasonlítása alapján, a bennük található PLT-ek átlagos méretében szintén nem volt jelentős eltérés, viszont a szervtenyészetekben fejlődött etiolált szárak etioplasztiszaiban feltűnően kevesebb PT membránt lehetett megfigyelni. Figyelembe véve a különböző pklid komplexek feltételezett lokalizációját (Ryberg and Sundqvist 1982), ez jól összeegyeztethető azzal, hogy ezekben a szárakban nagyobb volt a P655 aránya a rövidebb hullámhossznál emittáló pklid komplexekhez képest, mint az epikotilokban. 6.6.b Az exogén citokinin hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira Irodalmi adatok alapján a citokinin eltérő módon hat a különböző fajú etiolált csíranövények POR enzim szintjére (összefoglaló: Masuda and Takamiya 2004), plasztisz fejlődésére és pklid tartalmára, de az egyféle POR génnel rendelkező fajoknál (mint a borsó) egyértelműen kimutatható ennek citokinin-függő aktivációja (Fusada et al. 2005). Összehasonlítva a teljes MS táptalajon, illetve az ehhez képest harmad mennyiségű BAP-ot tartalmazó közegen fejlődött etiolált szárakat, egyértelműen látható, hogy a citokininanalóg mennyiségének növelésével párhuzamosan nőtt a P655 mennyisége (E34. ábra, A és B spektrum). Az E34. ábra B spektruma, sávarányait tekintve, hasonlít egy etiolált borsó csíranövény levelének spektrumára (I6. ábra), azonban a szervtenyészetben, a szárral azonos hajtásról vett levélminta spektrumával összehasonlítva (E34. ábra, C spektrum), arányában kisebb a 655 nm-es sávjának amplitúdója. Az etioplasztiszok ultrastruktúrájában sokkal szembetűnőbb a különbség a kétféle BAP mennyiségű táptalajon nevelt szárak között (E 35. ábra, A és B kép). Rendezett szerkezetű PLT-ek csak a nagyobb BAP koncentráció mellett alakultak ki. Több közlemény is beszámol arról, hogy citokininekkel sötétben is indukálható, az egyébként fény hatására felhalmozodó, galaktolipidek bioszintézise (Chory et al. 1994, Yamaryo et al. 2003). Tekintve, hogy az etioplasztisz belső membránjait döntő többségükben galaktolipidek alkotják (Ryberg

et al. 1983), a citokininek serkentő hatása a PLT-ek

kialakulására ezeknek a lipideknek a bioszintézisén keresztül valósulhatott meg. Seyedi és mtsai (2001) borsó lip1 mutánsok etioplasztiszain vizsgálták a citokinin hatását a PLT fejlődésére, mivel a mutánsban kezelés nélkül nem alakulnak ki PLT-ek. A citokinin hatására

110

azonban létrejöttek, és ezzel párhuzamosan nőtt a P655 mennyisége is. Mi is hasonló eredményeket kaptunk az etiolált borsó szervtenyészetekben, melyek alátámasztják, hogy a PLT kialakulás és a P655 mennyisége között korreláció van (Böddi et al. 1989). Sötétben tartott etiolált uborka sziklevelekben benziladenin kezelés hatására fokozódik a pklid akkumuláció (Yamaryo et al. 2003). Etiolált vörös tölgy epikotilját és szárát összehasonlítva, utóbbiban a nagyobb pigmenttartalom együtt jár a 655 nm-es sáv nagyobb relatív amplitúdójával a 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumokban (Skribanek and Böddi 2001). Ezek alapján a teljes MS táptalajon nevelt borsó szár középső szegmensének etioplasztiszaiban az epikotilhoz képest nagyobb mennyiségű P655 kialakulása (ld. előző pont) magyarázható a citokinin hatására kialakuló nagyobb mennyiségű pigment felhalmozódással. 6.6.c A nitrogén hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira

A nitrogén, a kl molekulának és előanyagainak, valamint a struktúr- és enzimfehérjéknek az alkotóelemeként, nélkülözhetetlen a növények fejlődéséhez, még sötétben is. Kísérleteinkben, a táptalaj nitrogénmennyiségével párhuzamosan nőtt az etiolált szárak 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban a 655 nm-es sáv relatív aránya (E37. ábra, E2. táblázat), és a pklid mennyisége (E2. táblázat). Ez alátámasztja azt a korábbi megállapítást, hogy a nagyobb pklid tartalom több P655 kialakulásához vezet. A teljes MS táptalajon nőtt szár pklid mennyisége nagyon hasonló a vörös tölgy etiolált szárában kapott adathoz (Skribanek and Böddi 2001). Az etioplasztiszok ultrastruktúrája is párhuzamosan változott a táptalaj nitrogén tartalmával (E38. ábra). A teljes MS táptalajon kívül minden etioplasztisz sztrómájában plasztoglobulusok halmozódtak fel. A plasztoglobulusok minden plasztisz típusban előforduló lipoprotein partikulumok, melyek alakja és mérete változik a kialakulásuk vagy a plasztisz differenciációja közben, illetve különféle stresszorok hatására (összefoglaló: Bréhélin et al. 2007). Az etioplasztiszokban is megtalálhatóak, öregedéskor a számuk és méretük is jellemzően megnő (összefoglaló: Hopkins et al. 2007). Összehasonlították rizs etioplasztiszok

111

plasztoglobulusaiból és a PLT-ekből izolált fehérjéit, és megállapították, hogy különböző fehérjéket tartalmaznak (Grennan 2008). A nitrogént egyáltalán nem, vagy a teljes MS tápközeghez képest csak egyharmad mennyiségben tartalmazó közegeken kialakult szárakban a plasztiszok inkább proplasztisz, mint etioplasztisz jellegűek voltak, egyszerű belső membránokkal (E38. ábra, a és b kép). Ennek ellenére a fluoreszcencia emissziós spektrumokban volt 655 nm-es sáv, ami megvilágítás hatására eltűnt és hosszú hullámhosszú klid sáv jelent meg helyette. Az eredmények értékelésénél mindenképpen figyelembe kell venni, hogy mindkét esetben nagyon kis mennyiségű pigmentről van szó, a teljes MS táptalajon nőtt szárak pklid tartalmának mindössze 4%-a alakul ki ilyen mértékben csökkent nitrogén elérhetőség mellett (E3. táblázat). Fiatal, néhány napos etiolált levelek plasztiszai általában inkább proplasztisz jellegűek, mint etioplasztiszok (El Amrani et al. 1994). Schoefs és Franck (1993) 2 napos, etiolált bab levelek nagy intenzitású felvillanásos megvilágításakor, a fluoreszcencia emissziós spektrumokban 690 nm-es klid maximumot kaptak. Ez a megfigyelés egyértelműen P655 átalakulásra utal, annak ellenére, hogy a plasztiszokban nem voltak PLT-ek. Érdekes megfigyelés, hogy nitrogénmentes táptalajon, sötétben is kialakultak etiolált borsóhajtások. Ráadásul a leveleik etioplasztiszaiban rendezett szerkezetű PLT-eket lehetett megfigyelni, fluoreszcencia emissziós spektrumaikban pedig a fő sáv a 655 nm-es volt (E39. ábra). Felmerül a lehetőség, hogy a fokozatosan lebomló zöld hajtás, aminek oldalhajtásaként kialakultak az etiolált hajtások (E33. ábra), nitrogénforrásként működhetett. Bár a táptalaj magas citokinin tartalma akadályozhatta a nitrogén remobilizációját az idősebb szövetekből a fiatalabbakba (Jordi et al. 2000, Criado et al. 2009), de a citokinin általánosan ismert öregedést késleltető hatásai segíthették a PLT szerkezetének, a POR fehérjének és a pklid-eknek a megmaradását.

Az eredményeink összegzésére összeállított reakciósémák a pklid komplexek in vitro és in vivo átalakulási lehetőségeiről a Következtetések után találhatóak.

112

7. Következtetések

I. Kimutattuk, hogy etiolált borsó epikotilokban, a fluoreszcencia emissziós sávok statisztikai összehasonlítása alapján, a P636 relatív mennyisége a legváltozékonyabb az epikotilok középső szegmensében. A variabilitás korfüggését is sikerült jellemezni: 6 napos csíranövényekben nagyobb volt a variabilitás, mint 9 vagy 13 napos növények esetén.

II. Kísérleteinkkel igazoltuk, hogy az etiolált borsó epikotilban található, 636 nm-nél emittáló pklid komplexek egy részében a monomer pklid flash megvilágítás hatására, közvetlenül 676 nm körül emittáló klid-dé redukálódik. A P636 komplexek flashfotoaktivitása egyértelműen bizonyítja, hogy a P636 egy része a POR enzim, pklid és NADPH hármas egysége, tehát ez a legkisebb flash-fotoaktív forma. Ez az eredmény cáfolja azt az irodalomban általánosan elterjedt hipotézist, miszerint csak az aggregált (a 644 nm-nél és a 655-657 nm-nél emittáló) komplexek lehetnek flash-fotoaktívak, és a rövidebb hullámhossznál emittáló monomer komplexek csak közvetett módon, azokon keresztül alakulhatnak klid komplexekké. III. Az a kísérleti eredmény, hogy borsó epikotilok 632.8 nm-es lézerrel történő megvilágításakor ugyanaz a foton-mennyiség, ami rövid idő alatt a rövid hullámhosszú pklid komplexek fotoredukcióját okozta, hosszú idő alatt abszorbeálódva a hosszú hullámhosszú komplexek átalakulását váltotta ki, azt bizonyítja, hogy nemcsak P644-P655, hanem P636-P644 és P636-P655 dinamikus átalakulások is végbemennek in vivo. Az az eredmény, hogy a mintákat – 15 °C –ra hűtve is (amikor a membránmozgások gátoltak) végbement a hosszú hullámhosszú pklid formák fotoredukciója, azt bizonyítja, hogy az energiamigrációnak is jelentős szerepe van abban, hogy a pklid formák párhuzamosan alakulnak át.

IV. Sikerült mesterséges közegben a borsó epikotil 636 nm-nél emittáló monomer komplexeit aggregáltatva flash-fotoaktív, 655 nm-nél emittáló komplexet kapni. Ez az eredmény alátámasztja azt a következtetésünket, hogy a 636 nm-es forma egy része olyan

113

monomer pklid-et tartalmaz, amely a POR enzim aktív centrumában kötött és flash-fotoaktív. A mesterséges közegben a fagyasztás-felmelegítés után is épek maradtak a PLT-ek. Az aggregáció

hatékonyabbá

tette

a

fototranszformációt

etiolált

epikotilban.

Ez

jól

összeegyeztethető azzal az irodalomból ismert elképzeléssel, hogy a levelek szárakénál hatékonyabb fototranszformációját és kisebb fényérzékenységét az aggregált formák túlsúlya, nem pedig a POR enzimek különbözősége okozza. Az aggregációt kiváltó közegben nem kaptunk 655 nm-nél hosszabb hullámhosszú pklid komplexeket, alátámasztva azt az általános nézetet, hogy az etiolált növények spektrumaiban a 670 nm feletti emissziós sávok valójában vibrációs szatellit sávok. A fagyasztás-felmelegítés után elhomogenizált epikotilban a monomer P636 és dimer P644 komplexek re-aggregációjával újra kialakítható volt a flash-fotoaktív P655. A munka eredményei is bizonyítják, hogy a flash-fotoaktív monomer pklid komplexekből összeálló, hosszú hullámhossznál emittáló flash-fotoaktív pklid komplexek oligomerek. V. Etiolált búza levelekben csak 676 nm környékén emittáló klid termékeket kaptunk, ha a megvilágításhoz 632.8 nm-es lézerfényt vagy kis intenzitású és/vagy rövid idejű 654 nm-es fényt alkalmaztunk. Mindkét esetben csak a PLT-ek felületén található komplexek (főleg P644) alakulnak át, amikből ezután könnyen kiesik a C676. Ez megerősíti a korábbi szakirodalmi feltételezéseket. A két lézer együttes alkalmazása azonos PFD értékek mellett az izolált etioplasztisz belső membránok esetén, a felhalmozott klid mennyiség tekintetében, kevésbé volt hatékony, mint külön-külön a kétféle hullámhosszúságú lézer, tehát nem volt erősítési effektus. Eredményeink alapján nincs bizonyíték a P633 közvetlen átalakulására búza levélben, a felhalmozodó C676 inkább a hosszú hullámhosszú pklid komplexek fototranszformációjával kialakuló oligomerekből való kieséssel jöhet létre.

VI. Sikerült specifikus festésekkel kimutatni a szuperoxid anion gyök és a hidrogénperoxid jelenlétét a görbülést kiváltó intenzitású fénnyel megvilágított etiolált borsó epikotilokban. A középső epikotil régióban keletkeztek ROS molekulák nagy mennyiségben,

114

ami megmagyarázza, hogy miért a középső régióban történik a görbülés, ahol tehát a II. típusú mellett az I. típusú fotokémiai reakcióban szereplő ROS molekulák is termelődnek VII. Erős fehér fénnyel, egy órán át megvilágított epikotilokban a pigmentek szinte teljesen lebomlottak, majd ezt követően sötétben 4 óra alatt, de novo pigment bioszintézissel, az elsőként regenerálódó pklid komplex érdekes módon a P655 volt. Ennek lehetséges magyarázata, hogy a bleaching alatt az oligomer komplexekben a pigmentek molekuláris fehérje és lipid környezete megmaradt, ahova be tudtak kötni az újonnan szintetizálódott pklid-ek. Tehát a borsó etioplasztiszokban a POR-fehérje egységek pigment nélkül is stabilak maradnak, sőt a fehérjék natív elrendeződése is megmarad. VIII. Kísérleteink során a P629 közvetlen fototranszformációját még rövid hullámhosszú lézer megvilágítással sem sikerült kimutatni, azonban a több órás, kis intenzitású fény hatására történő lassú átalakulását és az erős fény által kiváltott kifehéredését igen. Száz etiolált borsó epikotil átlagspektrumában a P629-nek megfelelő Gauss komponens intenzitásához képest, az átlagtól való átlagos abszolút eltérése ennek a komplexnek volt a legkisebb. Fagyasztás-felmelegítés és fehérje aggregációt kiváltó közegben történt elhomogenizálás hatására mennyisége nem változott jelentősen. Mindezek a megfigyelések alátámasztják, hogy etiolált borsó epikotilban a 629 nm-nél emittáló komplexben tárolt, nem a POR enzim aktív centrumában kötött monomer pklid-ek, és regenerálni tudják a fotoaktív formák hármas komplexeit olyan módon, hogy a megvilágításra fotoredukálódott pklid-eket pótolják. IX. Etiolált borsó szárában sikerült exogén citokinin kezeléssel megnövelni a 655 nm-es pklid komplex mennyiségét vagy arányát, és ezzel párhuzamosan rendezett szerkezetű PLT-eket tartalmazó etioplasztiszok fejlődését előidézni. Ez alátámasztja azt a hipotézist, hogy a fotoaktív, hosszú hullámhosszú pklid komplex mennyisége összefüggést mutat a PLT-ek mennyiségével és méretével.

X. A nitrogénhiányos körülmények között nevelt etiolált borsó szervtenyészetek vizsgálata azt mutatta, hogy a nitrogén hiánya jelentősen gátolja az etioplasztiszok

115

fejlődését, bennük a PLT membránok kialakulását. A nitrogént egyáltalán nem, vagy a teljes MS tápközeghez képest csak egyharmad mennyiségben tartalmazó közegeken kialakult szárakban a plasztiszok inkább proplasztisz, mint etioplasztisz jellegűek voltak, egyszerű belső membránokkal. A táptalaj nitrogénmennyiségével párhuzamosan nőtt az etiolált szárak 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumaiban a 655 nm-es sáv relatív aránya és a pklid mennyisége. Ez alátámasztja azt a korábbi megállapítást, hogy a nagyobb pklid tartalom több P655 kialakulásához vezet.

A következő sémák a legfontosabb következtetéseket foglalják össze a pklid komplexek lehetséges átalakulásairól a feltételezett szerkezeti modelljeik ábrázolásával. A római számok az adott átalakulásra magyarázatot adó következtetés számát jelölik az ábrákon: A protoklorofillid komplexek in vitro egymásba alakulásának lehetőségei:

B

A P644

IV

P655 P654.5

= POR

= protoklorofillid

= NADPH

116

A protoklorofillid komplexek in vivo egymásba alakulásának lehetőségei és foto-aktivitása:

VIII.

P628-629 ROS

ismeretlen molekula

VI.

P633-636

II.

POR III.

P644

C676

protoklorofillid

NADPH

ms

P655

V.

klorofillid C676

NADP+ VII. de novo bioszintézis

117

8.A Összefoglalás Sötétben nevelt borsó epikotilokban található 628, 636, 644 és 655 nm-nél emittáló protoklorofillid (pklid) formák (P628, P636, P644 és P655) és búza levelekben megjelenő P633, P644 és P655 előfordulását, spektrális és fotokémiai tulajdonságait, egymásba történő átalakulásának lehetőségeit tanulmányoztuk. A pklid formák arányait befolyásoló élettani tényezők vizsgálatához borsó embriókból szervkultúrákat hoztunk létre. A P636 a borsó epikotil középső szegmensében volt jelen a legnagyobb arányban, de mennyisége nagy biológiai variabilitást mutatott. 632.8 nm-es lézer flash hatására ez a forma közvetlenül 676 nm-nél emittáló klorofillid (C676) formává alakult, 40 % glicerint és 40 % szacharózt tartalmazó homogenátumokban pedig flash-fotoaktív P644 és P655 formává aggregálódott. Az aggregációt elősegítette a -14 °C-os sötét inkubáció és/vagy fagyasztás-felmelegítés kezelések vagy ATP hozzáadása. Ezek az eredmények azt bizonyították, hogy a P636 a NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz (POR) enzim monomer egysége. A búza levelekben található P633 forma nem volt flash-fotoaktív. Ha a leveleket 632.8 nm-es vagy 654 nm-es kis PFD értékű felvillanásokkal világítottuk meg, a P644 és P655 formák alakultak át C676-tá. Arra következtettünk, hogy alacsony fényintenzitásnál a prolamelláris testek (PLT) felületén található komplexek alakulnak át. Az újonnan keletkezett klorofillid molekulák könnyen ki tudtak esni a POR aggregátumaiból és monomer állapotúak. A P628 sem alakult át klorofilliddé.

Borsó

epikotilokban

fotooxidációs/fotodegradációs

folyamatok

szenzibilizátorának bizonyult, ebben a munkában az I. típusú fotokémiai reakciót írtuk le. A reakció a legnagyobb intenzitással az epikotil középső szegmensében folyt. Folytonos, kis PFD értékű fénnyel való megvilágításkor azonban ez a forma is klorofilliddé alakult úgy, hogy beléphetett a hosszú hullámhosszú flash-fotoaktív komplexek pklid molekulái helyére. A P644 és P655 oligomer szerkezete stabil maradt még akkor is, ha a pigmenteket kifehérítettük borsó epikotilokban. 4 órás sötét-inkubáció után a P655 jelent meg; a rövidebb hullámhosszú formák regenerációjához mintegy 18 óra kellett. A P644 és P655 felhalmozódását fokozni lehetett citokininnel, ha ezt a hormont a borsó szervtenyészetek tápközegéhez adtuk. A növekvő nitrogénforrásnak is hasonló stimuláló szerepét mutattuk ki. Párhuzamosan mindkét esetben a PLT-k kialakulása is serkentődött. A fenti reakciók összegzésére komplex reakciósémát állítottunk össze.

118

8.B Summary The occurrence, the spectral and photochemical properties and the possibilities of interconversions of the 628, 636, 644 and 655 nm emitting protochlorophyllide (Pchlide) forms (P628, P636, P644 and P655, respectively) of dark-grown pea epicotyls and the P633, P644 and P655 nm emitting Pchlide forms of dark-grown wheat leaves were studied. To learn physiological effects influencing the ratio of the Pchlide forms, organ cultures were grown from pea embryos. The P636 was the most abundant in the middle section of pea epicotyls, however, its relative amount had great biological variability. The direct phototransformation of this form into a 676 nm emitting chlorophyllide (C676) form was observed at 632.8 nm light flashes. Its aggregation into the flash-photoactive P644 and P655 forms was found in 40 % glycerol and 40 % sucrose containing phosphate buffer. The aggregation was stimulated by incubation at -14 ºC and/or by freezing-thawing periods or by ATP. These experiments proved that P636 is a monomer unit of the NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase enzyme (POR). The P633 form was not flash-photoactive in wheat leaves. When the leaves were illuminated with 632.8 nm or 654 nm flashes of low PFD values, the phototransformation of P644 and P655 forms took place and C676 form was produced. We concluded that at low light intensities, the Pchlide complexes localized on the surface of prolamellar bodies (PLB). The newly formed C676 molecules could easily leave the POR aggregates and are in monomer state. The P628 form did not transform directly into chlorophyllide either; it proved to be sensibiliser of photo-oxidation/photodegradation processes in pea epicotyls. In this work, we detected type I. photochemical reaction. It was the strongest in the middle segment of pea epicotyls. At continuous illumination of low PFD value, however, this form transformed into chlorophyllide indirectly, via replacing the Pchlide molecules of the longer wavelength and flash-photoactive forms. The structure of the P644 and P655 oligomer was stabile even if the pigments were bleached in pea epicotyls: after 4 hours of dark-incubation, the P655 appeared; the regeneration of the shorter wavelength forms took place only after 18 hours. The accumulation of the P644 and P655 form could be stimulated by cytokinin when this hormone was added to the medium of the pea organ culture. The increasing nitrogen source had similar stimulating effect on these forms. In both cases, the formation of PLBs was stimulated. A reaction scheme summarizes the above describe reactions.

119

9. Irodalomjegyzék

Abdelkader AF, Aronsson H, Solymosi K, Böddi B and Sundqvist C (2007) High salt stress induces swollen prothylakoids in dark-grown wheat and alters both prolamellar body transformation and reformation after irradiation. J Ex Bot 58:2553-2564 Adamska I (1997) ELIPs: light-induced stress proteins. Physiol Plant 100: 794-805 Adeishvili K (2001) Glycerol-induced aggregation of the oligomeric L-asparaginase II from E. coli monitored with ATR-FTIR. Int J Mol Sci 2: 109-120 Amirjani M, Sundqvist K, Sundqvist C (2006) Protochlorophyllide and POR development in dark-grown plants with different proportions of short-wavelength and long-wavelength protochlorophyllide spectral forms. Physiol Plant 128:751–762 Appenroth K-J, Keresztes Á, Sárvári É, Jaglarz A, Fischer W (2003) Multiple effects of chromate on Spirodela polyrhiza : Electron microscopy and biochemical investigations. Plant Biol. 5: 315-323 Armstrong GA (1998) Greening in the dark: light-independent chlorophyll biosynthesis from anoxygenic photosynthetic bacteria to gymnosperms. J Photochem Photobiol B 43: 87-100 Armstrong GA, Apel K and Rüdiger W (2000) Does a light-harvesting protochlorophyllide a/b-binding protein complex exist? Plant Science 5: 40-44 Armstrong GA, Runge S, Frick G, Sperling U and Apel K (1995) Identification of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductases A and B: a branched pathway for lightdependent chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 108: 1505-1517

120

Aronsson H, Sundqvist C, Timko MP and Dahlin C (2001) The importance of the Cterminal region and Cys residues for the membrane association of the NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase in pea. FEBS Lett 502: 11-15 Artus NN, Ryberg M, Lindsten A, Ryberg H and Sundqvist C (1992) The Shibata-shift and the transformation of etioplasts to chloroplasts in wheat with clomazone (FMC 57020) and amiprophos-methyl (Tokunol M). Plant Physiol 98: 253-263 Avarmaa R, Renge I and Mauring K (1984) Sharp-line structure in the fluorescence and excitation spectra of greening etiolated leaves. FEBS Lett 167: 186-190 Belyaeva OB, Griffiths WT, Kovalev JV, Timofeev KN and Litvin FF (2001) Participation of free radicals in photoreduction of protochlorophyllide to chlorophyllide in an artificial pigment-protein complex. Biochemistry (Mosc) 66: 173-177 Belyaeva OB and Litvin FF (1981) Primary reactions of protochlorophyllide into chlorophyllide phototransformation at 77K. Photosynthetica 15: 210-215 Belyaeva OB and Litvin FF (2009) Pathways of formation of pigment forms at the terminal photobiochemical stage of chlorophyll biosynthesis. Biochem (Mosc) 74: 1535-1544 Benková E, Witters E, Van Dongen W, Kolář J, Motyka V, Brzobohatý, Van Onckelen HA and Macháčková I (1999) Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurence and changes due to light/ dark treatment. Plant Physiol 121: 245-251 Beyer WF, Fridovich I (1987) Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions. Anal Biochem 161: 559-566 Bi YM, Wang RL, Zhu T, Rothstein SJ (2007) Global transcription profiling reveals differential responses to chronic nitrogen stress and putative nitrogen regulatory components in Arabidopsis. BMC Genomics 8: 281

121

Birve SJ, Selstam E and Johansson LB (1996) Secondary structure of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase examined by circular dichroism and prediction methods. Biochem J 317: 549-555 Biswal, UC and Biswal B (1988) Ultrastructural modification and biochemical changes during senescence of chloroplasts. Int Rev Cytol 113: 271-321 Blomqvist LA, Ryberg M, Sundqvist C (2008) Proteomic analysis of highly purified prolamellar bodies reveals their significance in chloroplast developement. Photosynth Res 96: 37-50 Böddi

B

(1994)

Spectral,

biochemical

and

structural

changes

connected

to

protochlorophyllide photoreduction in chlorophyll biosynthesis. Human and Environmental Sciences 3: 39-55 Böddi B (2005) Tissue- and organ specific plastid differentiation in various plant species. Acta Biol Szeg 49: 185-186 Böddi B, Bóka K and Sundqvist C (2004) Tissue specific protochlorophyll(ide) forms in dark-forced shoots of grapevine (Vitis vinifera L.) Photosynth Res 82: 141-150 Böddi B, Evertsson I, Ryberg M, Sundqvist C (1996) Protochlorophyllide transformations and chlorophyll accumulation in epicotyls of pea (Pisum sativum). Physiol Plant 96: 706-713 Böddi B and Franck F (1997) Room temperature fluorescence spectra of protochlorophyllide and chlorophyllide forms in etiolated bean leaves. J Photochem Photobiol B: Biol 41: 73-82 Böddi B, Keresztes Á, Csapó B, Kovács J, Páldi E and Láng F (1997) Differences in the etioplast ultrastructure and chlorophyll biosynthesis time course of cold tolerant and cold sensitive maize lines under cold treatment. Maydica 42, 305-311

122

Böddi B, Kis-Petik K, Kaposi AD, Fidy J, Sundqvist C (1998) The two short wavelength protochlorophyllide forms in pea epicotyls are both monomeric. Biochim Biophys Acta 1365: 531-540 Böddi B, Lindsten A, Ryberg M, Sundqvist C (1989) On the aggregational states of protochlorophyllide and its protein complexes in wheat etioplasts. Physiol Plant 76: 135-143 Böddi B, Lindsten A, Ryberg M and Sundqvist C (1990) Phototransformation of aggregated forms of protochlorophyllide in isolated etioplast inner membranes. Photochem Photobiol 52: 83-87 Böddi B, Lindstein A, Sundqvist C (1999) Chlorophylls in dark-grown epicotyl and stipula of pea. J Photochem Photobiol B 48: 11-16. Böddi B, Loudeche R and Franck F (2005) Delayed chlorophyll accumulation and pigment photodestruction in the epicotyls of dark - grown pea (Pisum sativum). Physiol Plant125: 365372 Böddi B, Mc Ewen B, Ryberg M, Sundqvist C (1994) Protochlorophyllide forms in nongreening epicotyls of dark-grown pea (Pisum sativum). Physiol Plant 92: 160-170 Böddi B, Oravecz AR and Lehoczki E (1995) Effect of cadmium on organization and photoreduction of protochlorophyllide in dark-grown leaves and etioplast inner membrane preparations of wheat. Photosynthetica 31, 411-420 Böddi B, Popovic R and Franck F (2003) Early reactions of light-induced protochlorophyllide and chlorophyllide transformations analyzed in vivo at room temperature with a diode array spectrofluorometer. J Photochem Photobiol B: Biol 69: 31-39

123

Böddi B, Rákász É and Láng F (1983) The effect of water on the aggregation of protochlorophyll in solid films. Photobiochem Photobiophys 5: 27-33 Böddi B, Ryberg M, Sundqvist C (1991) The formation of a short-wavelength chlorophyllide form at partial phototransformation of protochlorophyllide in etioplast inner membranes. Photochem Photobiol 53: 667-673 Böddi B, Ryberg M, Sundqvist C (1992) Identification of four universal protochlorophyllide forms in dark-grown leaves by analyses of the 77 K fluorescence emission spectra. J Photochem Photobiol B: Biol 12: 389-401 Böddi B, Ryberg M and Sundqvist C (1993) Analysis of the 77 K fluorescence emission and excitation spectra of isolated etioplast inner membranes. J Photochem Photobiol B Biol 21: 125-133 Böddi B, Soós J and Láng F (1980) Protochlorophyll forms with different molecular arrangements. Biochim Biophys Acta 593: 158-165 Böddi B, Szakács É and Láng F (1986) A protochlorophyll650 nm form without CD signals. Photobiochem Photobiopys 12: 115-117 Bréhélin C, Kessler F, van Wijk KJ (2007. ) Plastoglobules: versatile lipoprotein particles in plastids. Trends Plant Sci 12 260–266 Brouers M (1972) Optical properties of in vitro aggregates of protochlorophyllide in nonpolar solvents. I. Visible absorption and fluorescence spectra. Photosynthetica 6: 415-423 Brouers M (1979) Spectral properties of in vitro aggregates of protochlorophyllide in nonpolar solvents. III. Infra-red spectra, visible absorption and fluorescence of fractions obtained by differential centrifugation. Photosynthetica 13: 9-14

124

Brouers M and Michel-Wolwertz MR (1983) Estimation of protochlorophyll(ide) contents in plant extracts; re-evaluation of the molar absorption coefficient of protochlorophyll(ide). Photosynth Res 4: 265-270 Brown SB, Houghton JD and Hendry GAF (1991) Chlorophyll breakdown. In Chlophylls (ed H Sheer) CRC Press, Boca Raton, FL, pp 465-489 Buhr F, El Bakkouri M, Valdez O, Pollmann S, Lebedev N, Reinbothe S and Reinbothe C (2008) Photoprotective role of NADPH: Protochlorophyllide oxidoreductase A. Proc Natl Acad Sci USA 105:12629–12634 Butler WL and Briggs WR (1966) The relation between structure and pigments during the first stages of proplastid greening. Biochim Biophys Acta 112: 45-53 Caliskan G, Kisliuk A, Tsai AN, Soles CL and Sokolov AP (2003) Protein dynamics in viscous solvents. J Chem Phys 118: 4230-4236 Carmak I, Hengeler C and Marchner H. (1994) Partitioning of shoot and root dry matter and carbohydrates in bean plants suffering from phosphorus, potassium and magnesium deficiency. J Exp Bot 45: 1245-1250 Chory J, Reinecke D, Sim S, Washburn T and Brenner M (1994) A role of cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis. Plant Physiol 104: 339-347 Cohen CE and Rebeiz CA (1981) Chloroplast biogenesis 34. Spectrofluorometric characterization in situ of the protochlorophyll species in etiolated tissues of higher plants. Plant Physiol 67: 98-103 Cottone G, Ciccotti G, Cordone L (2002) Protein-trehalose-water structures in trehalose coated carboxy-myoglobin. J Chem Phys 117: 9862-9866

125

Criado MV, Caputo C, Roberts IN, Castro MA, Barneix AJ (2009) Cytokinin-induced changes of nitrogen remobilization and chloroplast ultrastructure in wheat (Triticum aestivum). J Plant Physiol 166: 1775-1785 Dehexh K,

Apel K (1983) The function of proteases during the light-dependent

transformation of etioplasts to chloroplasts in barley. Planta 157: 381-383 Diaz U, Saliba-Colombani V, Loudet O, Belluomo P, Moreau L, Daniel-Vedele F, MorotGaudry JF, Maselaux-Daubresse U (2006) Leaf yellowing and anthocyanin accumulation are two genetically independent strategies in response to nitrogen limitation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 47: 74-83 Domanskii V, Rassadina V, Gus-Mayer S, Wanner G, Schoch S, Rüdiger W (2003) Characterization of two phases of chlorophyll formation during greening of etiolated barley leaves. Planta 216: 475-483 Domanski VP and Rüdiger W (2001) On the nature of the two pathways in chlorophyll formation from protochlorophyllide. Photosynth Res 68: 131-139 Doncheva S, Vassileva V, Ignatov G and Pandev S (2001) Influence of nitrogen deficiency on photosynthesis and chloroplast ultrastructure of pepper plants. Agr Food Sci Finland 10: 59-64 Dujardin E and Sironval C (1970) The reduction of protochlorophyllide to chlorophyllide III. The phototrasformability of the protochlorophyllide-lipoprotein complex found in darkness. Photosynthetica 4: 129-138 Durin G, Delaunay A, Darnault C, Heyes DJ, Royant A, Vernede X, Hunter CN, Weik M, Bourgeois D (2009) Simultaneous measurements of solvent dynamics and functional kinetics in a light-activated enzyme. Biophys J 96:1902-1910

126

El Amrani A, Couée I, Carde JP, Gaudillére JP and Raymond P (1994) Modifications of etioplasts in cotyledons during prolonged dark growth of sugar beat seedlings. Plant Physiol 106: 1555-1565 El Hamouri B (1984) Protochlorophyllide and chlorophyllide-protein complexes during greening. In: Protochlorophyllide Reduction and Greening, eds. Sironval C and Brouers M Martinus Nijhoff/ Dr. W. Junk Publ., The Hague-Boston-Lancester, pp 129-138 Engdahl S, Aronsson H, Sundqvist C, Timko MP and Dahlin C (2001) Association of the NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase (POR) with isolated etioplast inner membranes from wheat. The Plant Journal 27: 297-304 Erdei N, Barta Cs, Hideg É and Böddi B (2005) Light-induced wilting and its molecular mechanism in epycotils of dark-germinated pea (Pisum sativum L.) seedlings. Plant Cell Physiol 46: 185-191 Fletcher RA and McCullagh D (1971) Benzyladenine as a regulator of chlorophyll synthesis in cucumber cotyledons. Can J Bot 49: 2197-2201 Foote CS (1991) Definition of type I and type II photosensitized oxidation. Photochem Photobiol 54: 659 Forreiter C, van Cleve B, Schmidt A and Apel K (1990) Evidence for a general lightdependent negative control of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase in angiosperms. Planta 183: 126-132 Franck F, Barthélemy X, Strzalka K (1993) Spectroscopic characterization of protochlorophyllide photoreduction in the greening leaf. Photosynthetica 29: 185-194

127

Franck

F,

Bereza

B

and

Böddi

B

(1999)

Protochlorophyllide-NADP+

and

protochlorophyllide-NADPH complexes and their regeneration after flash illumination in leaves and etioplast membranes of dark-grown wheat. Photosynth Res 59: 53-61 Franck F and Mathis P (1980) A short-lived intermediate in the photoenzymatic reduction of protochlorophyll(ide) into chlorophyll(ide) at a physiological temperature. Photochem Photobiol 32: 799–803 Franck F, Sperling U, Frick G, Pochert B, Van Cleve B, Apel K, Armstrong GA (2000) Regulation of etioplast pigment-protein complexes, inner membrane architecture, and protochlorophyllide a chemical heterogeneity by light-dependent NADPH:protochlorophyllide oxidoreductases A and B. Plant Physiol 124: 1678-1396. Fujita Y (1996) Protochlorophyllide reduction: a key step in the greening of plants. Plant Cell Physiol 37: 411-421 Fusada N, Masuda T, Kuroda H, Shiraishi T, Shimada H, Ohta H and Takamiya K (2000) NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase in cucumber is encoded by a single gene and its expression is transcriptionally enhanced by illumination. Photosynth Res 64: 147-154 Fusada N, Masuda T, Kuroda H, Shimada H, Ohta H and Takamiya K (2005) Identification of a novel cis-element exhibiting cytokinin-dependent protein binding in vitro in the 5'-region of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase gene in cucumber. Plant Mol Biol 59: 631-645 Gekko K and Timasheff SN (1981) Mechanism of protein stabilization by glycerol: Preferencial hydration in glycerol-water mixtures. Biochem 1981: 4667-4676 Grennan AK (2008) Plastoglobule Proteome. Plant Physiol 147: 443-445

128

Grevby C, Engdahl S, Ryberg C and Sundqvist C (1989) Binding properties of protochlorophyllide oxidoreductase to isolated immobilized prolamellar bodies of Avena sativa. Physiol Plant 77: 493-503 Griffiths WT (1975) Characterization of the terminal stages of chlorophyll(ide) synthesis in etioplast membrane preparations. Biochem J 152: 623-63 Griffiths WT (1978) Reconstitution of chlorophyllide formation by isolated etioplast membranes. Biochem J 174: 681-692 Griffiths WT, McHugh T and Blankenship RE (1996) The light intensity dependence of protochlorophyllide photoconversion and its significance to the catalytic mechanism of protochlorophyllide reductase. FEBS Lett 398: 235-238 Haase P, Pugnaire FI, Clark SC and Incoll LD (1999) Diurnal and seasonal changes in cladode photosynthetic rate in relation to canopy age structure in the leguminous shrub Retama sphaerocarpa. Functional Ecology 13: 640-649 Harsányi A, Böddi B, Bóka K, Almási A and Gáborjányi R (2002) Abnormal etioplast development in barley seedlings infected with BSMV by seed transmission. Physiologia Plantarum 114, 147-154 Heidarvand L and Amiri LM (2010) What happens in plant molecular responses to cold stress? Acta Physiol Plant 32:419-431. Helfrich M, Schoch S, Schäfer W, Ryberg M and Rüdiger W (1996) Absolute configuration

of

protochlorophyllide

a

and

substrate

specificity

of

NADPH-

protochlorophyllide oxidoreductase. J Am Chem Soc 118: 2606-2611 Hendrich W and Bereza B (1993) Spectroscopic characterization of protochlorophyllide and its transformation. Photosynthetica 28: 1-16

129

Henningsen KW (1970) Macromolecular physiology of plastids VI. Changes in membrane structure associated with shifts in the absorption maxima of the chlorophyllous pigments. J Cell Sci 7: 587-621

Heyes DJ and Hunter CN (2004) Identification and characterization of the product release steps within the catalytic cycle of protochlorophyllide oxidoreductase. Biochemistry 43: 82658271

Heyes DJ and Hunter CN (2005) Making light work of enzyme catalysis: protochlorophyllide oxidoreductase. Trends Biochem Sci 30: 642-6 Heyes DJ, Hunter CN, Van Stokkum IH, Van Grondelle R and Groot ML (2003) Ultrafast enzymatic reaction dynamics in protochlorophyllide oxidoreductase. Nat Struct Biol 10: 491-492 Heyes DJ, Heathcote P, Rigby SE, Palacios MA, van Grondelle R, Hunter CN (2006) The first catalytic step of the light-driven enzyme protochlorophyllide oxidoreductase proceeds via a charge transfer complex. J Biol Chem. 28: 26847-26853 Heyes DJ, Menon BRK, Sakuma M, Scrutton NS (2008) Conformational events during ternary enzyme-substrate complex formation are rate limiting in the catalytic cycle of the light-driven enzyme protochlorophyllide oxidoreductase (POR). Biochem 47: 10991-10998 Holtorf H, Reinbothe S, Reinbothe C, Bereza B and Apel K (1995) Two routes of chlorophyllide synthesis that are differentially regulated by light in barley (Hordeum vulgare L.). Proc Natl Acad Sci USA 92: 3254-3258 Hopkins M, Taylor C, Liu Z, Ma F, McNamara L, Wang T, Thompson JE (2007. ) Regulation and execution of molecular disassembly and catabolism during senescence. New Phytol 175 201–214 130

Horton P and Leech RM (1972) The effect of ATP on photoconversion of protochlorophyllide into chlorophyllide in isolated ethioplasts. Febs Letters 26: 277-280 Horton P and Leech RM (1975) The effect of ATP on the photoconversion of protochlorophyllide in isolated etioplasts of Zea mays. Plant Physiol 56: 113–120 Houssier C and Sauer K (1969) Optical properties of the protochlorophyll pigments II. Electronic absorption, fluorescence and circular dichroism spectra. Biochim Biophys Acta 172: 492-502 Ignatov NV and Litvin1 FF 2002 Biosynthesis of Chlorophyll from Protochlorophyll(ide) in Green Plant Leaves. Biochemistry 67: 949-955 Iwai J, Ikeuchi M, Inoue Y and Kobajashi T (1984) Early processes of protochlorophyllide photoreduction as measured by nanosecond and picosecond spectrophotometry. In: Sironval C and Brouers M (eds) Protochlorophyllide Reduction and Greening, pp 165–178. Nijhoff and Junk Publishers, The Hague

Jordy W, Schapendonk A, Davelaar E, Stoopen GM, Pot CS, de Visser R, van Rhijn JA, Gan S, Amasino RM (2000) Increased cytokinin levels in transgenic PSAG12-IPT tobacco plants have large direct and indirect effects on leaf senescence, photosynthesis and N partitioning. Plant Cell Environ 23: 279-289

Kahn A, Boardman NK, Thorne SW (1970) Energy transfer between protochlorophyllide molecules: Evidence for multiple chromophores in the photoactive protochlorophyllideprotein complex in vivo and in vitro. J Mol Biol 48: 85-101 Kahn A, Nielsen O (1974) Photoconvertible protochlorophyll(ide)633/650 in vivo: a single species or two species in dynamic equilibrium? Biochim Biophys Acta 333: 409-414

131

Kay

SA

and

Griffiths

W.T.

(1983).

Light-induced

breakdown

of.

NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase in vitro. Plant Physiol 72: 229-236

Kirsch M and de Groot H (2001) NAD(P)H, a directly operating antioxidant? FASEB J 15: 1569-1574

Kis-Petik K, Böddi B, Kaposi AD, Fidy J (1999) Protochlorophyllide forms and energy transfer in dark-grown wheat leaves. Studies by conventional and laser excited fluorescence spectroscopy between 10 K and 100 K. Photosynth Res 60: 87-98 Klein, S and Schiff JA (1972) The correlated appearance of prolamellar bodies, protochlorophyll(ide) species, and the Shibata shift during development of bean etioplasts in the dark. Plant Physiol. 49:619-626 Klement H, Helfrich M, Oster U, Schoch S and Rüdiger W (1999) Pigment-free NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase from Avena sativa L. Purification and substrate specificity. Eur J Biochem 265: 862-874 Klement H, Oster U and Rüdiger W (2000) The influence of glycerol and chloroplast lipids on the spectral shifts of pigments associated with NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase from Avena sativa L. FEBS Lett 480: 306-310 Kovacevic D, Dewez D, Popovic R (2007) Protochlorophyllide photo-transformation and chlorophyll(ide) formation in barley etioplast fractions. Photosynthetica 45: 340-347 Kovacheva S, Ryberg M and Sundqvist C (2000) ADP/ATP and protein phosphorylation dependence of phototransformable protochlorophyllide in isolated etioplast membranes. Photosynth Res 64: 127-136

132

Kuroda H, Masuda T, Ohta H, Shioi Y and Takamiya K (1995) Light-enhanced gene expression of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase in cucumber. Biochem Biophys Res Common 210: 310-316 Kuroda H, Masuda T, Ohta H, Shioi Y and Takamiya K (1996) Effects of light, developmental age and phytohormones on the expression of the gene encoding NADPHprotochlorophyllide oxidoreductase in Cucumis sativus. Plant Physiol Biochem 34: 17-22 Kuroda H, Masuda T, Fusada N, Ohta H and Takamiya K (2000) Expression of NADPHprotochlorophyllide oxidoreductase gene in fully green leaves of cucumber. Plant Cell Physiol 41: 226-229 Kuroda H, Masuda T, Fusada N, Ohta H and Takamiya K (2001) Cytokinin-induced transcriptional activation of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase gene in cucumber. J Plant Res 114: 1-7 Kusnetov V, Herrmann RG, Kulaeva ON and Oelmüller R (1998) Cytokinin stimulates and abscisic acid inhibits greening of etiolated Lupinus luteus cotyledons by affecting the expression of the light-sensitive protochlorophyllide oxidoreductase. Mol Gen Genet 259: 2128 Kutik J, Cincerova A and Dvorak M (1993) Chloroplats ultrastructural development durind the ontogeny of the second leaf of wheat under nitrogen deficiency. Photosynthetica 28: 447453 Lawlor DW, Boyle FA, Young AT, Kendall AC, Keys AJ (1987) Nitrate nutrition and temperature effects on wheat: Soluble components of leaves and carbon fluxes to amino acids and sucrose. J Experimental Botany 38: 1091-2103

133

Lebedev N, Karginova O, Melvor W and Timko MP (2001) Tyr275 and Lys279 stabilize NADPH within the catalytic site of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase and are involved in the formation of the enzyme photoactive state. Biochem 40: 12562-12574 Lebedev N and Timko MP (1998) Protochlorophyllide photoreduction. Photosynth Res 58: 5-23 Lebedev N and Timko MP (1999) Protochlorophyllide oxidoreductase B-catalyzed protochlorophyllide photoreduction in vitro: insight into the mechanism of chlorophyll formation in light-adapted plants. Proc Natl Acad Sci USA 96: 9954-9959 Lebedev N, van Cleve B, Armstrong G and Apel K (1995) Chlorophyll synthesis in a deetiolated (det340) mutant of Arabidopsis without NADPH–protochlorophyllide (PChlide) oxidoreductase (POR) A and photoactive PChlide–F655. Plant Cell 7: 2081-2090 Lee JC and Timasheff SN (1981) The stabilization of proteins by sucrose. J Biol Chem 256: 7193-7201 Lenti K, Fodor F and Böddi B (2002) Mercury inhibits the activity of the NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase (POR). Photosynthetica 40, 145-151 Lillford PJ and Holt CB (2002) In vitro uses of biological cryoprotectants. Philos Trans. R. Soc. Lond. B 357: 945–951 Lindsten A, Ryberg M and Sundqvist C (1988) The polypeptide composition of highly purified prolamellar bodies and prothylakoids from wheat (Triticum aestivum) as revealed by silver staining. Physiol Plant 72: 167-176 Malmgren L, Olsson Y (1977) A sensitive histochemical method for light-and electronmicroscopic demonstration of horseradish peroxidase. J Histochem Cytochem 25: 1280-1283

134

Martin G E M, Timko M P, Wilks (1997) Purification and kinetic analysis of pea (Pisum sativum L.) NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase expressed as fusion with maltosebinding protein in Escherichia coli. Biochem J 325: 139-145 Masuda T, Takamiya K (2004) Novel insights into the enzymology, regulation and physiological

functions

of

light-dependent

protochlorophyllide

oxidoreductase

in

angiosperms. Photosynth Res 81: 1-29 Mathis P and Sauer K (1972) Circular dichroism studies on the structure and photochemistry of protochlorophyllide and chlorophyllide holochrome. Biochim Biophys Acta 267: 498-511 Mathis P and Sauer K (1973) Chlorophyll Formation in Greening Bean Leaves during the Early Stages. Plant Physiol. 51, 115−119 Matile P. (1992) Chloroplast senescence. In: Baker N and Thomas H (eds). Crop Photosynthesis: Spatial and Temporal Determinants. Elsevier, Amsterdam. pp. 413-440 Mc Ewen B, Seyyedi M, Younis S and Sundqvist C. (1996) Formation of short-wavelength chlorophyll(ide)

after

brief

irradiation

is

correlated

with

the

occurrence

of

protochlorophyll(ide)636-642 in dark-grown epi- and hypocotyls of bean (Phaseolus vulgaris). Physiol Plant 96: 51-58 Mc Ewen B, Sundqvist C and Younis S (1994) Protochlorophyll(ide) forms in hypocotyls of dark-grown bean (Phaseolus vulgaris). Physiol Plant 90: 396-407 Meyer G, Bliedung H and Kloppstech K (1983) NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase: reciprocal regulation in mono- and dicotyledonean plants. Plant Cell Rep 2: 26-29 Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 155: 473-497

135

Myśliwa-Kurdziel B, Amirjani MR, Strzalka K, Sundqvist C (2003) Fluorescence lifetime protochlorophyllide

in

plants

with

different

proportions

of

short-wavelenght

protochlorophyllide spectral forms. Photochem Photobiol 78: 205-212 Myśliwa-Kurdziel B, Franck F, Strzatka K (1999) Analysis of fluorescence lifetime of protochlorophyllide and chlorophyllide in isolated etioplast membranes measured from multifrequency cross-correlation phase fluorometry. Photochem Photobiol 70: 616 - 623 Myśliwa-Kurdziel B, Solymosi K, Kruk J, Böddi B and Strzałka K (2007) Protochlorophyll complexes with similar steady-state fluorescence characteristics can differ in fluorescence lifetimes. A model study in Triton X-100. J Photochem Photobiol B: Biol 86: 262-271 Nilsen ET, Meinzer FC and Rundel PW (1989) Stem photosynthesis in Psorothamnus spinosus (smoke tree) in the Sonoran desert of California. Oecologica 79: 193-197 Nyitrai P, Mayer M, Óvári M, Keresztes Á (2007) Involvement of the phosphoinositide signaling pathway in the anti-senescence effect of low-concentration stressors on detached barley leaves. Plant Biol. 9, 420-426 Oliver RP and Griffiths T (1982) Pigment-protein complexes of illuminated etiolated leaves. Plant Physiol 70: 1019-1025 Ouellet F (2007) Cold acclimation and freezing tolerance in plants. Encycl Life Sci. doi:10.1002/9780470015902.a0020093 Oosawa N, Masuda T, Awai K, Fusada N, Shimada H, Ohta H and Takamiya K (2000) Identification and light-induced expression of a novel gene of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase isoform in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett 474: 133-136

136

op den Camp RG, Przybyla D, Ochsenbein C, Laloi C, Kim C, Danon A, Wagner D, Hideg É, Göbel C, Feussner I, Nater M and Apel K (2003) Rapid induction of distinct stress responses after the release of singlet oxygen in Arabidopsis. Plant Cell 15: 2320-2332 Ouazzani Chahdi A M, Schoefs B, Franck F (1998) Isolation and characterization of photoactive complexes of NADPH protochlorophyllide oxidoreductase. Planta 206: 673-680 Paddock T, Mason M, Lima D and Armstrong G (2010) Arabidopsis protochlorophyllide oxidoreductase A (PORA) restores bulk chlorophyll synthesis and normal development to a porB porC double mutant. Plant Mol Bio 72: 445-457 Parsegian VA, Rand RP, Rau DC (2000) Osmotic stress, crowding, preferential hydration, and binding: a comparison of perspectives, PNAS 97: 3987-3992 Priev A, Almagor A, Yedgar S and Gavish B (1996) Glycerol decreases the volume and compressibility of protein interior. Biochemistry 35: 2061-2066 Rassadina V, Domanskii V, Averina NG, Schoch S and Rüdiger W (2004) Correlation between

chlorophyllide

esterification,

Shibata

shift

and

regeneration

of

protochlorophyllide650 in flash-irradiated etiolated barley leaves. Physiol Plant 121: 556-567 Rebeiz CC, and Rebeiz CA (1986). Chloroplast Biogenesis 53: Ultrastructural study of chloroplast development during photoperiodic greening. In: Regulation of Chloroplast Differentiation. Akoyunoglou, G., and Senger, H. (eds.) pp: 389-396. Alan Liss, New York. Reinbothe C, Apel K and Reinbothe S (1995) A light-induced protease from barley plastids degrades NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase complexed with chlorophyllide. Mol Cell Biol 15: 6206-6212 Reinbothe C, Lebedev N and Reinbothe S (1999) A protochlorophyllide light-harvesting complex involved in de-etiolation of higher plants. Nature 397: 80-84

137

Reinbothe C, Lepinat A, Deckers M, Beck E and Reinbothe S (2003) The extra loop distinguishing POR from the structurally related short-chain alcohol dehydrogenases is dispensable for pigment binding but needed for the assembly of light-harvesting PORprotochlorophyllide complex. J Biol Chem 278: 816-822 Reinbothe S, Reinbothe C, Apel K and Lebedev N (1996) Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell 86: 703-705 Ruan K, Xu C, Li T, Li J, Lange R and Balny C (2003) The thermodynamic analysis of protein stabilization by sucrose and glycerol against pressure-induced unfolding. Eur J Biochem 270: 1654-1661 Rüdiger

W,

Böhm

S,

Helfrich

M,

Schulz

S

and

Schoch

S

(2005)

Enzymes of the last steps of chlorophyll biosynthesis: modification of the substrate structure helps

to

understand

the

topology

of

the

active

centers.

Biochem 44:10864-10872 Ryberg

M

and

Dehesh

K

(1986)

Localization

of

NADPH-protochlorophyllide

oxidoreductase in dark-grown wheat (Triticum aestivum) by immuno-electron microscopy before and after transformation of the prolamellar bodies. Physiol Plant 66: 616-624 Ryberg M, Sandelius AS and Selstam E (1983) Lipid composition of prolamellar bodies and prothylakoids of wheat etioplasts. Physiol Plant 57: 555-560 Ryberg M and Sundqvist C (1982) Spectral forms of protochlorophyllide in prolamellar bodies and prothylakoids fractioned from wheat etioplasts. Physiol Plant 56: 133-138 Ryberg M and Sundqvist C (1988) The regular ultrastructure of isolated prolamellar bodies depends on the presence of membrane-bound NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase. Physiol Plant 73: 218-226.

138

Schiff JA, Epstein HT The relative aspect of chloroplast continuity in Euglena, in: T.W. Goodwon (Ed.), Biochemistry of Chloroplasts, vol.1, Academic Press, London and New York, 1966, pp. 341-353 Schoch S, Helfrich M, Wiktorsson B, Sundqvist C, Rüdiger W and Ryberg M (1995) Photoreduction

of

zinc

protopheophorbide

b

with

NADPH-protochlorophyllide

oxidoreductase from etiolated wheat (Triticum aestivum L.). Eur J Biochem 229: 291-298 Schoefs B (2001) The protochlorophyllide-chlorophyllide cycle. Photosynth Res 70: 257-271 Schoefs B, Bertrand M, Franck F (2000a) Spectroscopic properties of protochlorophyllide analyzed in situ in the course of etiolation and in illuminated leaves. Photochem Photobiol 72: 85-93 Schoefs B, Bertrand M and Funk C (2000b) Photoactive protochlorophyllide regeneration in cotyledons and leaves from higher plants. Photochem Photobiol 72: 660-668 Schoefs B and Franck F (1993) Photoreduction of protochlorophyllide to chlorophyllide in 2day old dark-grown bean leaves. Comparison with 10-day old leaves. J Exp Botany 44: 10531057 Schoefs B and Franck F (2003) Protochlorophyllide reduction: mechanisms and evolution. Photochem Photobiol 78:543-557 Schoefs B and Franck F (2008) Pathways of chlorophyll formation from protochlorophyllide in bean leaves during the first days of photoperiodic growth. Photosynth Res 96: 15-26 Schoefs B, Garnir HP, Bertrand M (1994) Comparison of the photoreduction of protochlorophyllide to chlorophyllide in leaves and cotyledons from dark-grown bean as a function of age. Photosynth Res 41: 405-417

139

Seliskar CJ and Ke B (1968) Protochlorophyllide aggregation in solution and associated spectral changes. Biochim Biophys Acta 153: 658-691 Selstam E Developement of thylakoid membranes with respect to lipids, in: Siegenthaler PA, Murata N (Eds.), Lipids in Photosynthesis: Structure, Function and Genetics, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1998, pp. 209-224 Selstam E, Schelin J, Williams WP, Brain APR (2007) Structural organisation of prolamellar bodies (PLB) isolated from Zea mays. Parallel TEM, SAXS and absorption spectra measurements on samples subjected to freeze-thaw, reduced pH and high-salt perturbation. Biochim Biophys Acta 1768: 2235-2245 Seyedi M, Timko MP and Sundqvist C (1999) Protochlorophyllide, POR and chlorophyll formation in the lip1 mutant of pea. Physiol Plant 106: 345–354 Seyedi M, Selstam E, Timko MP and Sundqvist C (2001) The cytokinin 2isopentenyladenine causes partial reversion to skotomorphogenesis and induces formation of prolamellar bodies and protochlorophyllide657 in the lip1 mutant of pea. Physiol Plant 112: 261-272 Shibata K (1957) Spectroscopic studies on chlorophyll formation in intact leaves. J Biochem 44: 147-173

Šiffel P, Lebedev NN, Krasnovskiї

AA (1987) Detection of shortwavelength chlorophyll a

emission in green leaves. Photosynthetica 21: 23-28 Sironval C, Brouers M (1970) The reduction of protochlorophyllide into chlorophyllide. II. The

temperature

dependence

of

the

P657-647→P688-676

phototransformation.

Photosynthetica 4: 38-47

140

Sironval C, Brouers M (1980) The reduction of protochlorophyllide. VIII. The theory of transfer units. Photosynthetica 14: 213-221 Skribanek A, Apatini D, Inaoka M, Böddi B (2000) Protochlorophyllide and chlorophyll forms in dark-grown stems and stem-related organs. J Photochem Photobiol B: Biol 55: 172177 Skribanek A and Böddi B (2000) A klorofill-szintézis befejező lépéseinek sajátosságai szár eredetű szervekben. Bot Közlem 86-87. kötet 1-2. füzet 1999-2000 Skribanek A and Böddi B (2001) Light- and cold-stress effects on the greening process of epicotyls and young stems of red oak (Quercus rubra L.) seedlings. Tree Physiol 21: 549-554 Skribanek A, Solymosi K, Hideg É and Böddi B (2008) Light and temperature regulation of greening in dark-grown ginkgo (Ginkgo biloba). Physiol plant 134: 649-659 Smeller L, Solymosi K, Fidy J and Böddi B (2003) Activation parameters of the blue shift (Shibata shift) subsequent to protochlorophyllide phototransformation. Biochim Biophys Acta 1651: 130-138 Smith JHC and Benitez A (1954) The effect of temperature on the conversion of protochlorophyll to chlorophyll a in etiolated barley leaves. Plant Physiol 29: 135-143 Solymosi K, Smeller L, Ryberg M, Sundqvist C, Fidy J and Böddi B (2007) Molecular rearrangement in POR macrodomains as a reason for the blue shift of chlorophyllide fluorescence observed after phototransformation. Biochim Biophys Acta 1768: 1650-1658 Solymosi K, Myísliva-Kurdziel B, Bóka K, Strzalka K and Böddi B (2006) Disintegration of the prolamellar body structure at high concentrations of Hg2+ Plant Biology 8, 627-635

141

Spano AJ, He Z, Michel H, Hunt DF and Timko MP (1992) Molecular cloning, nuclear gene structure, and developmental expression of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase in pea (Pisum sativum L.). Plant Mol Biol 18: 967-972 Sperling U, Franck F, van Cleve B, Frick G, Apel K and Armstrong GA (1998) Etioplast differentiation in Arabidopsis: both PORA and PORB restore the prolamellar body and photoactive protochlorophyllide-F655 to the cop1 photomorphogenic mutant. Plant Cell 10: 283-296 Sperling U, van Cleve B, Frick G, Apel K and Armstrong GA (1997) Overexpression of light-dependent PORA or PORB in plants depleted of endogenous POR by far-red light enhances seedling survival in white light and protects against photooxidative damage. Plant J 12: 649-658 Stadnichuk IN, Amirjani MR, Sundqvist C (2005) Identification of spectral forms of protochlorophyllide in the region 670-730 nm. Photochem Photobiol Sci 4: 230-238 Steinmüller D and Tevini M (1985) Composition and function of plastoglobuli. I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplats. Planta 163: 201-207 Stenbaek A, Jensen PE (2010) Redox regulation of chlorophyll biosynthesis. Phytochem 71: 853-859 Sundqvist C (1969) Transformation of protochlorophyllide formed from exogenous ∂aminolevulinic acid in continuous light and in flashlight. Physiol Plant 22: 147-156 Sundqvist C, Bjorn LO and Virgin HI (1980) Factors in chloroplast differentiation. In: Reinert J (ed) Results in cell differentiation. Vol. 10. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag. pp. 202-224

142

Sundqvist C and Dahlin C (1997) With chlorophyll from prolamellar bodies to lightharvesting complexes. Physiol Plant 100: 748-759 Sytina OA, Heyes DJ, Hunter CN and Groot ML (2009) Ultrafast catalytic processes and conformational changes in the light-driven enzyme protochlorophyllide oxidoreductase (POR) Biochem Soc Trans 37: 387–391 Szujkó-Lacza J, Rakován JN, Horváth G, Fekete G and Faludi-Dániel Á (1971) Anatomical, ultrastructural and physiological studies on one-year old Eonymus europeus bark displaying photosynthesis activity. Acta Agr Acad Sci Hung 20: 247-260 Teakle GR and Griffiths WT (1993) Cloning, characterization and import studies on protochlorophyllide reductase from wheat (Triticum aestivum). Biochem J 296: 225-230 Thordal-Christensen H, Zhang Z, Wei YD, Collinge DB (1977) Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barleypowdery mildew interaction. Plant J 11:1187-1194 Townley HE, Sessions RB, Clarke AR, Dafforn TR and Griffiths WT (2001) Protochlorophyllide oxidoreductase: a homology model examined by site-directed mutagenesis. Proteins 44: 329-335 Valladares F, Hernandez LG, Dobarro I, Garcia-Perez C, Sanz R, Puguaire FI (2003) The ratio of leaf to total photosynthetic area influences shade survival and plastic response to light of green-stemmed leguminous shrub seedlings. Ann Bot 91: 577-584 Westh P (2003) Unilamellar DMPC vesicles in aqueous glycerol: preferential interactions and thermochemistry. Biophys J 84: 341-349 Whatley JM (1971) Ultrastructural changes in chloroplasts of Phaseolus vulgaris during development under conditions of nutrient deficiency. New Phytol 70: 725-742

143

Whatley JM (1974) Chloroplast development in primary leaves of Phaseolus vulgaris. New Phytol 73: 1097–1110 Wiktorsson B, Engdahl S, Zhong LB, Böddi B, Ryberg M, Sundqvist C (1993) The effect of cross-linking of the subunits of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase on the aggregational state of protochlorophyllide. Photosynthetica 29: 205-218 Wiktorsson B, Ryberg M, Sundqvist C (1996) Aggregation of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase-pigment complexes is favoured by protein phosphorilation. Plant Physiol Biochem 34: 23-34 Wilks HM and Timko MP (1995) A light-dependent complementation system for analysis of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase: Identification and mutagenesis of two conserved residues that are essential for enzyme activity. Proc Natl Acad Sci USA 92: 724728 Wright WW, Guffanti GT and Vanderkooi JM (2003) Protein in sugar films and in glycerol/water as examined by infrared spectroscopy and by the fluorescence and phosphorescence of tryptophan. Biophys J 85: 1980-1995 Yamaryo Y, Kanai D, Awai K, Shimojima M, Masuda T, Shimada H, Takamiya K and Ohta H (2003) Light and cytokinin play a co-operative role in MGDG synthesis in greening cucumber cotyledons. Plant Cell Physiol 44: 844-855 Zavaleta-Mancera HA, Thomas BJ, Thomas H and Scott IM (1999a) Regreening of senescent Nicotiana leaves I. Reappearance of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase and light-harvesting chlorophyll a/ b-binding protein. J Exp Bot 50: 1677-1682 Zavaleta-Mancera HA, Thomas BJ, Thomas H and Scott IM (1999b) Regreening of senescent Nicotiana leaves II. Redifferentiation of plastids. J Exp Bot 50: 1683-1689

144

Zavaleta-Mancera HA, Lopez-Delgado H, Loza-Tavera H, Mora-Herrera M, TrevillaGarcia C, Vargas-Suarez M and Ougham H (2007) Cytokinin promotes catalase and ascorbate peroxidase activities and preserves the chloroplast integrity during dark-senescence. J Plant Physiol 164: 1572–1582 Zhao D, Reddy KR, Kakani VG and Reddy VR (2005) Nitrogen deficiency effects on plant growth, leaf photosynthesis, and hyperspectral reflectance properties of sorgum. Europ J Agronomy 22: 391-403 Zhong D (2007) Ultrafast catalytic processes in enzymes. Curr Opin Chem Biol 11: 174-181 Zhong LB, Wiktorsson B, Ryberg M, Sundqvist C (1996) The Shibata shift; effects of in vitro conditions on the spectral blue-shift of chlorophyllide in irradiated isolated prolamellar bodies. J Photochem Photobiol B Biol 36: 263-270

10. Köszönetnyilvánítás

145

Hálás vagyok témavezetőmnek, Dr. Böddi Béla egyetemi tanárnak, az MTA doktorának a szakmai irányításért, nélkülözhetetlen útmutató tanácsaiért és segítőkész támogatásáért. Megköszönöm az ELTE Növényszervezettani Tanszék oktatóinak és dolgozóinak, hogy munkájukkal és hasznos javaslataikkal hozzájárultak a doktori munkám sikeres elvégzéséhez. Külön köszönöm Dr. Preininger Éva egyetemi adjunktusnak, Dr. Solymosi Katalin egyetemi adjunktusnak, Dr. Bóka Károly egyetemi docensnek, Vitányi Beáta PhD hallgatónak, Jónás Csilla és Kálmán Ágnes technikusoknak a segítséget. Köszönetet mondok az ELTE Növényélettani Tanszék oktatóinak és dolgozóinak, hogy segítették a munkámat, különösen Dr. Sárvári Éva egyetemi docensnek. Köszönettel tartozom Dr. Hideg Éva tudományos tanácsadó, az MTA doktorának (SZBK Növénybiológiai Intézet). Hálás

vagyok

Szenzenstein

Andrea

tudományos

Egyetem

Biofizikai

segédmunkatársnak

(MTA

és

Intézet

Mezőgazdasági Kutatóintézet). Köszönöm

a

Semmelweis

Sugárbiológiai

munkatársainak, hogy a méréseinkhez szükséges lézert a rendelkezésünkre bocsátotta. Köszönöm a Göteborgi Tudományegyetem Növényélettani Tanszékének, hogy kísérleteinkhez az izolált etioplasztisz belső membrán preparátumokat biztosította.

11. Függelék

146

Az értekezés alapját adó, impakt faktoros folyóiratban megjelent közlemények listája 1., A. Kósa, Zs. Márton and B. Böddi (2005) Fast phototransformation of the 636 nm emitting protochlorophyllide form in epicotyls of dark-grown pea (Pisum sativum L.) Physiologia Plantarum 124: 132-142 2., A. Kósa, Zs. Márton, K. Solymosi, K. Bóka and B. Böddi (2006) Aggregation of the 636 nm emitting monomeric protochlorophyllide form into flash-photoactive, oligomeric 644 and 655 nm emitting forms in vitro Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics 1757: 811–820 3., A. Szenzenstein, A. Kósa and B. Böddi (2008) Biological variability in the ratios of protochlorophyllide forms in leaves and epicotyls of dark-grown pea (Pisum sativum L.) seedlings (A statistical method to resolve complex spectra) Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 90: 88-94 4., A. Szenzenstein, A. Kósa, K. Solymosi, É. Sárvári and B. Böddi (2010) Preferential regeneration of the NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase oligomer complexes in pea epicotyls after bleaching Physiologia Plantarum 138: 102-112 5., É. Hideg, B Vitányi, A. Kósa, K. Solymosi, K. Bóka, S. Won, Y. Inoue, R.W. Ridge and B. Böddi (2010) Reactive oxygen species from type-I photosensitized reactions contribute to the light-induced wilting of dark-grown pea (Pisum sativum) epicotyls Physiologia Plantarum 138: 485-492

147