UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie Departement voor Moleculair Biomedisch onderzoek (DMBR) Laboratorium Mouse Genetics in Inflammation (MGI) Academiejaar 2012 – 2013
STEELAND NANOBODIES Sophie EN MICRORNA IN THERAPIE
TEGEN TNF-GEÏNDUCEERDE INFLAMMATIE
Fien LUYCKX Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor
Prof. dr. Claude Libert Begeleiders
Leen Puimège Sophie Steeland Commissarissen
Prof. dr. apr. D. Deforce Dr. apr. K. Raemdonck
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie Departement voor Moleculair Biomedisch onderzoek (DMBR) Laboratorium Mouse Genetics in Inflammation (MGI) Academiejaar 2012 – 2013
STEELAND NANOBODIES Sophie EN MICRORNA IN THERAPIE
TEGEN TNF-GEÏNDUCEERDE INFLAMMATIE
Fien LUYCKX Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor
Prof. dr. Claude Libert Begeleiders
Leen Puimège Sophie Steeland Commissarissen
Prof. dr. apr. D. Deforce Dr. apr. K. Raemdonck
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
3 juni 2013
Promotor
Auteur
Prof. dr. Claude Libert
Fien Luyckx
SAMENVATTING Tumor Necrosis Factor (TNF) is een cytokine dat onder meer een prominente rol speelt bij infecties en de inflammatoire immuunrespons. Wegens zijn pro-inflammatoire rol bij onder andere reumatoïde artritis en de ziekte van Crohn, gebeurde de laatste jaren veel onderzoek naar TNF-inhibitoren ter behandeling van deze ziektes. TNF-inhibitoren hebben echter ook veel neveneffecten en dit is vooral te wijten aan de dualistische rol van TNF in het immuunsysteem. Naast het blokkeren van de negatieve effecten van TNF, zoals het beperken van de TNFR₁-afhankelijke inflammatoire schade, belemmeren TNF-inhibitoren ook de TNFR₂-afhankelijke weefselprotectieve en regulatoire functie van TNF. Verschillende studies wijzen uit dat TNFR₁ een veel interessantere target is om te inhiberen, omdat dit therapeutisch gezien minder nevenwerkingen veroorzaakt in vergelijking met volledige TNFinhibitie. In deze masterproef wordt ingegaan op de huidige ontwikkelingen in het MGI rond Nanobodies (Nb’s) als selectieve therapeutische TNFR₁-inhibitoren enerzijds en anderzijds microRNA’s (miR’s) als middel om het werkingsmechanisme van TNF verder te onderzoeken. Na herklonering, expressie en opzuivering van Nb’s tegen mTNFR₁, worden deze in vitro getest op bindingscapaciteit voor mTNFR₁. In tegenstelling tot wat werd verwacht, vertonen deze Nb’s geen affiniteit voor mTNFR₁, maar wel voor BSA, het carriëreiwit dat bij het coatingsantigen wordt gebruikt ter stabilisatie van mTNFR₁. Dit verklaart waarom in het verleden nooit inhiberende eigenschappen bij deze Nb’s werden gedetecteerd. Verder worden ook de bindings- en inhibitiecapaciteit van de Nb’s tegen hTNFR₁ in vitro getest. Hierin wordt bevestigd dat de extra aminozuren die toegevoegd werden aan de sequentie na overschakeling voor de productie van de hNb’s naar de gist Pichia pastoris, geen negatieve invloed hebben op de bindende en inhiberende capaciteit. In de toekomst zal het effect van deze Nb’s in vivo getest worden in muizenmodellen van inflammatoire aandoeningen. Op vlak van microRNA’s (miR’s) werd ontdekt dat het conA-model geschikt is voor het bestuderen van het beschermende effect van miR-511 bij auto-immune hepatitis. MiR-511 bindt namelijk op het mRNA dat codeert voor mTNFR₁ en zorgt bijgevolg voor verminderde expressie van deze receptor. Minder mTNFR₁ betekent minder invloed van de schadelijke inflammatoire respons en daardoor minder leverschade. Bovendien werd gevonden dat anti-miR-511 kan gebruikt worden ter blokkering van het effect van miR-511.
DANKWOORD
In de eerste plaats wil ik graag mijn promotor, Prof. dr. Claude Libert, bedanken om mij de kans te bieden in zijn labo mijn masterproef te volbrengen. Een speciaal woord van dank gaat ook uit naar mijn begeleidsters, Leen Puimège en Sophie Steeland. Ik dank hen voor hun uitleg en hulp bij de het uitvoeren van de experimenten, het nalezen en corrigeren van mijn masterproef en hun luisterend oor wanneer het eens wat moeilijker ging. Dankzij hen heb ik echt enorm veel bijgeleerd en zal ik deze ervaring nooit vergeten. Ook dank ik alle doctoraatsstudenten, postdoctoraatsstudenten en laboranten van het MGI voor hun dagelijkse bereidwilligheid om te helpen. Daarenboven bedank ik ook alle andere studenten in het MGI voor hun steun, de leuke middagpauze’s en vele ‘slappelachmomenten’. Als laatste gaat ook een speciaal woordje van dank uit naar Kelly Lemeire om mij te introduceren in de wereld van de immunohistochemische kleuringen. Verder wil ik ook zeker mijn familie en vrienden bedanken om te luisteren naar mijn ‘muizenverhalen’, mij te steunen wanneer het eens wat moeilijker ging en de mij de nodige ontspanning te geven tussendoor. Ook speciaal dank aan mijn ouders om mij de kans te geven om te studeren, zonder hen was deze masterproef er immers nooit geweest. Als laatste wil ik ook in het bijzonder mijn zus bedanken voor het nalezen en corrigeren van deze masterproef op taal- en spellingsfouten.
INHOUDSOPGAVE 1
INLEIDING .............................................................................................................1 1.1
TNF ................................................................................................................1
1.1.1 Ontdekking en identificatie ......................................................................1 1.1.2 TNF-receptoren ........................................................................................1 1.1.3 Signalisatiepathway .................................................................................2 1.2
ROL TNF IN INFLAMMATIE EN AUTO-IMMUUNZIEKTES ..................................3
1.2.1 Modulatie verschillende orgaansystemen ................................................3 1.2.2 Dualistische rol in het immuunsysteem ....................................................3 1.2.3 Anti-TNF-therapie ....................................................................................4 1.3
ALTERNATIEVE ANTI-TNF-THERAPIE ...............................................................5
1.3.1 Principe ....................................................................................................5 1.3.2 Bevestigend onderzoek ............................................................................6 1.3.3 Toekomstperspectieven ...........................................................................7 1.4
NANOBODIES .................................................................................................7
1.4.1 Achtergrond .............................................................................................7 1.4.2 Onderzoek in het MGI ............................................................................10 1.4.3 Toekomstperspectieven .........................................................................11 1.5
MICRORNA ..................................................................................................12
1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5 1.6
Achtergrond ...........................................................................................12 Anti-microRNA .......................................................................................12 Onderzoek in het MGI ............................................................................13 Toekomstperspectieven .........................................................................14 Therapeutische toepasbaarheid .............................................................14
PROEFDIEREN ..............................................................................................15
1.6.1 C57BL/6 .................................................................................................15 1.6.2 SPRET/Ei ................................................................................................15 2
3
OBJECTIEVEN ......................................................................................................16 2.1
NANOBODIES ...............................................................................................16
2.2
MICRORNA ..................................................................................................17
MATERIAAL EN METHODEN ................................................................................18
3.1
MATERIAAL ..................................................................................................18
3.2
PROEFDIEREN ..............................................................................................18
3.2.1 C57BL/6 .................................................................................................18 3.2.2 SPRET/Ei ................................................................................................18 3.3
NANOBODIES ...............................................................................................18
3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.4
Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c ..........18 Expressie en opzuivering ........................................................................20 Coomassie staining en Western blot ......................................................21 ELISA bindingstest ..................................................................................21 Inhibitietest ...........................................................................................22
MICRORNA ..................................................................................................23
3.4.1 ConA experiment ...................................................................................23 3.4.1.1 Bereiding ultrapuur DNA .................................................................23 3.4.1.2 AST/ALT-bepalingen ........................................................................24 3.4.1.3 Aanmaak coupes .............................................................................25 3.4.1.4 Hematoxyline-eosine kleuring .........................................................25 3.4.1.5 TUNEL staining ................................................................................25 3.4.1.6 Eiwitbereiding en -concentratiebepaling .........................................26 3.4.1.7 Mouse sTNFR₁ ELISA ........................................................................26 3.4.1.8 Mouse IFNγ ELISA ............................................................................26 3.4.2 Anti-miR-511 experiment .......................................................................26 3.4.3 Transgene miR-511-muizen....................................................................27 3.4.3.1 Restrictiedigest, gelelektroforese en opzuivering uit gel ..................27 3.4.3.2 Elektroporatie, selectie en transfectie .............................................27 3.5 4
STATISTIEK ...................................................................................................27
RESULTATEN .......................................................................................................28 4.1
mTNFR₁ NANOBODIES ..................................................................................28
4.1.1 Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c ..........28 4.1.2 Opsporing mutaties ...............................................................................30 4.1.3 Expressie en opzuivering ........................................................................30 4.1.4 Bindingsstudies ......................................................................................31 4.1.4.1 Bindingscapaciteit voor mTNFR₁ ......................................................31 4.1.4.2 Bindingscapaciteit voor BSA ............................................................32 4.1.4.3 Bindingscapaciteit voor CF mTNFR₁ .................................................33 4.2
hTNFR₁ NANOBODIES ...................................................................................33
4.2.1 Bindingscapaciteit voor hTNFR₁ ..............................................................33 4.2.2 Bindingscapaciteit trimere humane Nanobodies voor albumine ............34 4.2.3 Inhibitiecapaciteit ..................................................................................35 4.3
MICRORNA ..................................................................................................36
4.3.1 ConA experiment ...................................................................................36 4.3.1.1 Bereiding ultrapuur miR-511-DNA ...................................................36 4.3.1.2 Opvolging lichaamstemperatuur .....................................................37 4.3.1.3 AST/ALT-bepalingen ........................................................................37 4.3.1.4 Mouse sTNFR₁-ELISA ........................................................................38 4.3.1.5 Mouse IFNγ-ELISA ...........................................................................38 4.3.1.6 Immunohistochemie .......................................................................39 4.3.2 Anti-miR-511 experiment .......................................................................41 4.3.3 Transgene miR-511-muizen....................................................................41 5
DISCUSSIE ...........................................................................................................43 5.1
mTNFR₁ NANOBODIES ..................................................................................43
5.1.1 Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c ..........43 5.1.1.1 Gelanalyse.......................................................................................43 5.1.1.2 Sequentieanalyse mTNFR₁ Nanobodies in pHEN6c ..........................44 5.1.2 Opsporing mutaties: sequentieanalyse mTNFR₁ Nb’s in pHEN4-vector ...45 5.1.3 Expressie en opzuivering mTNFR₁ Nanobodies ......................................45 5.1.4 Bindingsstudies ......................................................................................46 5.2
hTNFR₁ Nanobodies .....................................................................................48
5.3
MICRORNA ..................................................................................................48
5.3.1 ConA experiment ...................................................................................48 5.3.2 Anti-miR-511 experiment .......................................................................49 5.3.3 Transgene miR-511-muizen....................................................................50 6
CONCLUSIES........................................................................................................51
7
LITERATUURLIJST ................................................................................................52
8
BIJLAGES ...............................................................................................................1 8.1
BIJLAGE 1: Materiaal ......................................................................................1
8.1.1 Producten ................................................................................................1 8.1.2 Instrumenten ...........................................................................................3
8.1.3 Benodigdheden ........................................................................................3 8.1.4 Kits...........................................................................................................4 8.2
BIJLAGE 2: Gebruikte primersequenties .........................................................4
8.3
BIJLAGE 3: Protocols ......................................................................................4
8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.4
DNA agarose gelektroforese ....................................................................4 15% Acrylamide gel ..................................................................................5 Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer ........................................................6 Shandon Citadel Tissue Processor (2000) .................................................7
8.4
BIJLAGE 4: pEZX-MR04-vector met miR-511 gensequentie.............................7
8.5
BIJLAGE 5: Sequentieanalyse Nanobodies in pHEN6c na herklonering ...........8
8.5.1 8.5.2 8.5.3 8.5.4 8.6
Nanobody 15 ...........................................................................................8 Nanobody 29 ...........................................................................................9 Nanobody 81 .........................................................................................10 Nanobody 62 .........................................................................................11
BIJLAGE 6: Sequentieanalyse Nanobodies in pHEN4: opsporing mutaties ....12
8.6.1 Nanobody 15 .........................................................................................12 8.6.2 Nanobody 29 .........................................................................................13 8.7
BIJLAGE 7: Nanobody gensequenties ...........................................................14
8.8
BIJLAGE 8: Gensequentie Nb 29 met restrictiesites voor Pstl .......................16
8.9
BIJLAGE 9: Internationalisation at home: Evening lectures ...........................17
8.9.1 Biedt het Kiwi-model een oplossing voor de financiële problemen van de sociale zekerheid? ..................................................................................17 8.9.2 Registration of new vaccines in the EU: not an easy task ........................17 8.9.3 Innovating for a Better and Sustainable Healthcare ...............................18 8.9.4 Hospital Admissions Related to Medication: a preventable health and economic burden? .................................................................................18 8.9.5 Current alternative methods to animal testing used in pharmaceutical, cosmetic and chemical industry .............................................................19
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AL
Antilichaam
Alb
Albumine
ALT
Alanine aminotransferase
Amp
Ampicilline
APS
Ammoniumpersulfaat
AST
Aspartaat aminotransferase
AZ
Aminozuren
(BxS)F₁
Hybride muizen van C57BL/6 en SPRET/Ei muizen
βMe
β-mercapto-ethanol
bp
Basenparen
BSA
Bovine serum albumin
conA
Concanavalin A
CDR
Complementarity determining region
CF
Carrier-free, carriërvrij
CRD
Cysteïnerijk domein
Ctr(l)
Controle
DD
Death domain
DMEM
Dulbecco's modified eagle medium
DNA
Deoxyribonucleic acid
EDTA
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
ES
Embryonale stamcellen
Gluc
Glucose
GFP
Groen fluorescent protein
hNb
Nanobody tegen hTNFR₁
hTNF
Humaan TNF
hTNFR
Humane TNF-receptor
IFNβ
Interferon β
IPTG
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
IC₅₀
Half maximaal inhiberende concentratie
IU
International Units
IV
Intraveneus
kb
Kilobasenparen
kDa
Kilodalton
KO
Knockout muizen
KT
Kamertemperatuur
LB
Luria Bertani
LD₁₀₀
Letale dosis
LNA
Locked nucleic acid
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
miR
MicroRNA
MGI
Laboratorium Mouse Genetics in Inflammation
mRNA
Messenger RNA
mNb
Nanobody tegen mTNFR₁
mTNF
Muis TNF
mTNFR
Muis TNF-receptor
Nb
Nanobody
NF-κB
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells
OD₆₀₀
Optische densiteit, gemeten bij een golflengte van 600 nm
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
RNA
Ribonucleic acid
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SEAP
Secreted embryonic alkaline phosphatase
SEM
Standard error of mean
SOC
Super optimal broth with catabolite repression
SODD
Silencer of death domains
sTNF
Soluble TNF
sTNFR
Soluble TNF receptor
TACE
TNF alpha-converting enzyme
TAE
Tris-acetaat-EDTA
TMB
Tetramethylbenzidine
tmTNF
Transmembranair TNF
tmTNFR
Transmembranaire TNF receptor
TB
Terrific broth
TBE
Tris-boorzuur-EDTA
TBS
Tris buffered saline
TEMED
Tetramethylethyleendiamine
TNF
Tumor necrosis factor
TNFR
TNF-receptor
TRADD
TNFR₁-associated death domain
TUNEL
Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
V
Volt
VHH
Variable heavy chain
WT
Wildtype muizen
1
INLEIDING
1.1 TNF 1.1.1 Ontdekking en identificatie Tumor Necrosis Factor (TNF) werd ontdekt door Dr. Lloyd J. Old van het Memorial Soan-Kettering Cancer Center in New York als een molecule met cytotoxische eigenschappen die geproduceerd wordt door macrofagen (Carswell, Old et al. 1975). Pas later werd ontdekt dat TNF als signaalmolecule ook een prominente rol speelt bij infecties en de inflammatoire immuunrespons (Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011). TNF wordt bovendien geassocieerd met een groot aantal ziektes, zoals de auto-immuunziektes reumatoïde artritis, inflammatoire darmziekte en multiple sclerose (Kollias 2005) en speelt ook een prominente rol bij kanker (Feng, Liu et al. 2012) en in insulineresistentie bij diabetes type ll (Swaroop, Rajarajeswari et al. 2012). Bij gezonde individuen is TNF gewoonlijk niet detecteerbaar, maar hoge levels kunnen gedetecteerd worden bij inflammatie, infectie en verwonding (Bradley 2008). TNF wordt geëxpresseerd in de transmembranaire homotrimere vorm (tmTNF), maar kan via het proteolytisch enzyme TNF alpha-converting enzyme (TACE) verknipt worden tot de oplosbare vorm (sTNF) (Robertshaw and Brennan 2005).
1.1.2 TNF-receptoren Om zijn effect uit te oefenen, kan TNF binden op twee transmembranaire receptoren, namelijk TNFR₁ (55 kDa) of TNFR₂ (75 kDa). Deze receptoren kunnen ook door TACE geknipt worden tot hun oplosbare vorm, respectievelijk sTNFR₁ en sTNFR₂, wat shedding wordt genoemd (Black, Rauch et al. 1997). Beide receptoren behoren tot de zogenaamde TNF-receptor superfamilie en zijn enkel werkzaam als homotrimeer (Idriss and Naismith 2000). Deze trimerisatie gebeurt via het PLAD (pre-ligand binding assembly domain), een geconserveerd domein in het extracellulaire gedeelte van de TNFR-familie. PLAD kan drie TNF-receptoren associëren bij zowel aan- als afwezigheid van ligand. Deze associatie is daarenboven ook receptorspecifiek: het PLAD van TNFR₁ kan niet trimeriseren met het PLAD van TNFR₂ (Cao, Meng et al. 2011).
Inleiding
1
TNFR₁ kan zowel door tmTNF als sTNF volledig gestimuleerd worden, terwijl TNFR₂-activatie vooral afhankelijk is van de lokale concentratie aan tmTNF. TNFR₁ is bovendien constitutief aanwezig op bijna alle celtypes, terwijl TNFR₂-expressie induceerbaar is en vooral voorkomt op cellen betrokken bij de immuunrespons (zoals lymfocyten, macrofagen en dendritische cellen), endotheliale en neuronale cellen (Grell, Douni et al. 1995). De extracellulaire domeinen van beide receptoren zijn analoog en bestaan uit vier cysteïnerijke domeinen. TNF bindt met twee van deze domeinen, namelijk CRD2 en CRD3. Hun intracellulaire domein is daarentegen wel verschillend, wat het verschil in signalisatiepathway verklaart (Idriss and Naismith 2000).
1.1.3 Signalisatiepathway TNF wordt geproduceerd door onder andere macrofagen, lymfocyten en mastcellen wanneer deze getriggerd worden door inflammatie, infectie en verwonding (Baud and Karin 2001). Wanneer TNF in zijn trimere vorm bindt met TNFR₁, ondergaat deze receptor een conformationele verandering waardoor hij kan trimeriseren. Hierdoor dissocieert SODD (silencer of death domains) en kan TRADD (TNFR₁-associated death domain) associëren (Chen and Goeddel 2002). Via TRADD worden diverse pathways geïnitieerd die uiteindelijk resulteren in activatie van verschillende caspases en de transcriptiefactoren NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) en AP-1 (Activator Protein). Deze transcriptiefactoren transloceren vervolgens naar de celkern en initiëren de transcriptie van proteïnen die betrokken zijn bij de regulatie van een breed spectrum aan biologische processen zoals celoverleving en -proliferatie, inflammatoire responsen en anti-apoptotische factoren (Tartaglia and Goeddel 1992). Soms induceert TNF ook apoptosis via TNFR₁, wanneer de anti-apoptotische signalen via NF-κB en AP-1 geïnhibeerd worden (Beg and Baltimore 1996). De signalisatiepathway van TNFR₂ verloopt verschillend, omdat deze receptor intracellulair geen DD bezit en bijgevolg TRADD niet kan associëren. TNFR₂-activatie kan echter wel zorgen voor NF-κB en AP-1 activatie, wat leidt tot opregulatie van talrijke proinflammatoire molecules (Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011). Bovendien kan stimulatie van TNFR₂ cellen ook aanzetten tot apoptose via competitie met TNFR₁. Deze complexe en soms tegenstrijdige pathways dienen bijgevolg streng gereguleerd te worden
Inleiding
2
via factoren die bepaalde stappen stimuleren en andere inhiberen. Op deze manier kunnen verschillende cellen met diverse functies samenwerken en zo adequaat reageren op de inflammatie (Cabal-Hierro and Lazo 2012).
1.2 ROL TNF IN INFLAMMATIE EN AUTO-IMMUUNZIEKTES 1.2.1 Modulatie verschillende orgaansystemen Het effect van TNF op de verschillende organen is niet uniform, maar afhankelijk van het bestudeerde weefsel. Allereerst is TNF een antitumorale molecule met een hoge specificiteit voor tumoren. Hierdoor lijkt TNF veelbelovend in de ontwikkeling van nieuwe antikankertherapeutica (Niitsu, Watanabe et al. 1987). Op de lever heeft TNF een dualistisch effect, waardoor de gevolgen niet altijd voorspelbaar zijn. Enerzijds is TNF noodzakelijk voor normale proliferatie van de hepatocyten gedurende de regeneratie van de lever, anderzijds kan het in hoge concentraties hepatotoxiciteit veroorzaken (Schwabe and Brenner 2006). Ook op de nier heeft TNF een inflammatoir effect: studies wijzen uit dat mastcellen acuut nierfalen kunnen veroorzaken door TNF-vrijstelling (Summers, Chan et al.). Op de hypothalamus
heeft
TNF
een
anorexigeen
effect,
zorgt
het
voor
verhoogde
lichaamstemperatuur en een verhoogd respiratoir quotiënt. Dit effect komt tot stand via modulatie van de insuline- en leptinesignalisatie en -activatie in de hypothalamus (Romanatto, Cesquini et al. 2007). TNF is daarenboven ook een belangrijke mediator bij insulineresistentie. Het blokkeert op verschillende belangrijke plaatsen in het lichaam de insulineactiviteit (Uysal, Wiesbrock et al. 1997).
1.2.2 Dualistische rol in het immuunsysteem Zoals hierboven al werd vermeld, is TNF geen molecule met louter positieve of negatieve effecten. TNF speelt namelijk zowel een pro-inflammatoire rol, waarbij het de typische kenmerken van infectie (rubor, calor, dolor en tumor) veroorzaakt, als een immunosuppressieve rol in onderdrukking van de inflammatoire immuunrespons. Zoals hierboven reeds werd aangehaald, situeert dit verschil in werking zich ter hoogte van de receptoren TNFR₁ en TNFR₂. Het pro-inflammatoire effect van TNF in chronisch inflammatoire pathologieën en de weefselschade die het daardoor veroorzaakt, wordt vooral gemedieerd door binding met TNFR₁, terwijl binding met TNFR₂ vooral instaat voor de Inleiding
3
regulatie van de inflammatoire celrespons via activatie van regulatoire T-cellen. TNFR₁ staat dus in voor de initiële immuunrespons, wat enerzijds gunstig is om de infectie te bestrijden, maar anderzijds ook erg belastend blijkt voor het lichaam. TNFR₂ daarentegen, zorgt voor de terminatie van deze immuunrespons en initieert de herstelmechanismen (Baud and Karin 2001; Kollias, Kontoyiannis et al. 2002). Uit studies blijkt inderdaad dat verhoging van de TNF-productie in gezonde muizen de ontwikkeling van TNFR₁-afhankelijke ziektes zoals reumatoïde artritis (Keffer, Probert et al. 1991), multiple sclerose (Akassoglou, Bauer et al. 1998) en inflammatoire darmziekte (Kontoyiannis, Pasparakis et al. 1999) bevordert. Verrassend genoeg werd daarnaast ook aangetoond dat diezelfde TNF-geïnduceerde inflammatie de ontwikkeling van spontane auto-immuniteit kan verhinderen (Kollias, Kontoyiannis et al. 2002). Dit laatste, immunosuppressieve effect wordt vooral gemedieerd door binding van TNF met TNFR₂. Andere studies in TNFR₁ knockout muizen (TNFR₁-/-, KO, zie ook 1.6) tonen aan dat TNF en TNFR₁ noodzakelijk zijn bij onder andere de ontwikkeling van secundaire lymfoïede organen en optimale antilichaamresponsen (Le Hir, Bluethmann et al. 1996). Bovendien speelt TNF een belangrijke rol bij inductie van de angiogenese bij infecties (Leibovich, Polverini et al. 1987) en bij de aanzet van cytotoxische T-cellen en macrofagen tot fagocytose van geïnfecteerde cellen (Wohlleber, Kashkar et al. 2012). Dit illustreert zijn essentiële rol in de regulatie van de immuunrespons tegen intracellulaire bacteriën en sommige virussen (Gardam, Keystone et al. 2003).
1.2.3 Anti-TNF-therapie Wegens de pro-inflammatoire rol van TNF in o.a. reumatoïde artritis en de ziekte van Crohn, gebeurde de laatste jaren veel onderzoek naar TNF-inhibitoren voor de behandeling van deze ziektes (Kontoyiannis, Pasparakis et al. 1999). De monoclonale antilichamen (AL) adalimimab (Humira®), etanercept (Enbrel®) en infliximab (Remicade®) behoren intussen tot de top tien van best verkopende geneesmiddelen ter wereld en nog steeds wordt onderzoek gedaan naar nieuwe mogelijke toepassingen voor deze geneesmiddelen. TNF-inhibitoren kennen echter ook veel neveneffecten. Naast het blokkeren van de negatieve effecten van TNF, zoals het beperken van de TNFR₁-afhankelijke inflammatoire schade, belemmeren ze ook de TNFR₂-afhankelijke weefselprotectieve functie van TNF. Dit kan leiden tot verhoogde
Inleiding
4
gevoeligheid voor infecties zoals tuberculose en listeriose. Het is dan ook aangewezen om patiënten die TNF-inhibitoren gebruiken, nauwgezet op te volgen, zeker indien er signalen zijn die in de richting van tuberculose wijzen (Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011). Verrassend genoeg, zien we dat TNF-inhibitoren, tegen hun werkingsmechanisme in, ook nieuwe TNFR₁-afhankelijke auto-immuunziektes kunnen veroorzaken, zoals systemische lupus erythematosus (Shakoor, Michalska et al. 2002), type l diabetes (Tack, Kleijwegt et al. 2009), vasculitis (Jarrett, Cunnane et al. 2003), multiple sclerose (Mohan, Edwards et al. 2001) en psoriasis (de Gannes, Ghoreishi et al. 2007). Dit houdt verband met het verhinderen van het TNFR₂-dependente immunosuppressieve effect dat hierboven al besproken werd. Daarnaast wordt ook vermoed dat inhibitie van TNF kan zorgen voor een licht verhoogde kans op de ontwikkeling van nieuwe tumoren (Bongartz, Sutton et al. 2006). Bovendien zijn TNF-inhibitoren erg duur en hebben ze bij een aanzienlijk deel van de patiënten op termijn geen effect meer doordat er neutraliserende AL geproduceerd worden. In de vakliteratuur wordt gesproken van ongeveer 20% non-responders (Malottki, Barton et al. 2011).
1.3 ALTERNATIEVE ANTI-TNF-THERAPIE 1.3.1 Principe Om de positieve en negatieve effecten van TNF te scheiden, probeert men nu selectievere TNF-inhibitoren te synthetiseren. Aangezien het effect van TNF op TNFR₁ sterk verschilt van zijn effect op TNFR₂ en TNF-inhibitoren op deze manier veel nevenwerkingen veroorzaken, lijkt het gunstiger om selectief TNFR₁ te blokkeren. Zo kan TNF wel nog binden met TNFR₂ en blijven de gunstige effecten die veroorzaakt worden door TNF intact, maar verdwijnen de ongunstige effecten ten gevolge van de binding met TNFR₁ (Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011). Een andere mogelijke manier om dit selectieve inhibitieprincipe te bewerkstelligen is om het proteolytische enzyme TACE te inhiberen zodat tmTNF niet kan omgezet worden in sTNF. TNFR₂ wordt immers zo goed als volledig geactiveerd door tmTNF, terwijl TNFR₁ ook gestimuleerd wordt door sTNF (Kollias, Kontoyiannis et al. 2002). Een nadeel van deze aanpak is wel dat door TACE-inhibitie er ook minder sTNFR₁ en sTNFR₂ zal zijn die in competitie kunnen gaan met tmTNFR₁ en tmTNFR₂
Inleiding
5
voor binding van TNF. Het netto-effect is echter wel positief: er zal globaal gezien minder sTNF zijn dat kan binden op TNFR₁. Een derde manier is om via AL specifiek sTNF te inhiberen zodat de tmTNF-TNFR₁ en tmTNF-TNFR₂ interacties intact blijven (Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011). Deze principes worden geïllustreerd in Figuur 1.1.
Celdood, celproliferatie of –overleving en cytokineproductie TNFR₁-gemedieerde signalisatie vaak pathogeen bv. artritis, multiple sclerose
TNFR₂-gemedieerde signalisatie vaak immunomodulerend bv. multiple sclerose, functie regulaitoire T-cellen Figuur 1.1: Signalisatiemechanismen van TNF (aangepast uit Van Hauwermeiren, Vandenbroucke et al. 2011).
1.3.2 Bevestigend onderzoek Vroegere studies in het MGI (Laboratorium Mouse Genetics in Inflammation) wezen uit dat TNFR₁ KO muizen, die geen TNFR₁ tot expressie brengen, erg resistent zijn tegen TNFgeïnduceerde inflammatie (deze proefdieren worden verder besproken onder 1.6). Verrassend genoeg, werd ook ontdekt dat TNFR₁ +/- muizen, dit zijn heterozygote F₁-muizen die 50% reductie van TNFR₁ vertonen en ontstaan zijn door kruising van TNFR₁ -/- en TNFR₁ +/+ muizen, even resistent zijn tegen TNF als de homozygote TNFR₁ -/- muizen. Deletie van één functioneel Tnfrsf1a allel leidt tot volledige bescherming tegen TNF tot een dosis van minstens 40 keer de LD100 (letale dosis: dosis waarbij 100% van de muizen sterft). Hieruit kunnen we concluderen dat er een niet-lineair genafhankelijk verband is tussen dosis TNF en hoeveelheid TNFR₁: een minimale reductie van TNFR₁ leidt tot buitengewone bescherming tegen TNF. Er werd ook gezien dat 50% reductie in TNFR₁ geen effect heeft op de positieve effecten van TNF zoals antibacteriële resistentie en de ontwikkeling en functie van de secundaire lymfoïede orgaanstructuren. Hieruit kunnen we afleiden dat TNFR₁ een belangrijke rol speelt in de schadelijke inflammatoire respons en dat door selectieve
Inleiding
6
blokkering van deze receptor de positieve effecten van TNF intact blijven. Deze veronderstelling werd bevestigd in een studie waarbij monoclonale AL tegen TNFR₁ werden getest: na injectie van deze AL waren de muizen beschermd tegen TNF-geïnduceerde letaliteit volgens een dosisafhankelijk verband (Van Hauwermeiren, Armaka et al. 2013). Selectieve blokkering van TNFR₁ heeft dus duidelijk de hoogste succesfactor en verder onderzoek zal zich dus vooral daarop moet toespitsen. De rol van TNFR₂ in de regulatie van de immuunrespons en de initiatie van de herstelmechanismen werd onder andere bevestigd in een studie van Kassiotis en Kollias. In een muizenmodel voor multiple sclerose werd bij TNF-deficiënte muizen een vertraagde T-celrespons en bijgevolg ernstigere vorm van multiple sclerose waargenomen (Kassiotis and Kollias 2001). Dit verklaart opnieuw dat niet-selectieve blokkering van TNF niet alleen de schadelijke pro-inflammatoire rol, maar ook de immunomodulerende rol van TNF blokkeert.
1.3.3 Toekomstperspectieven Uit wat hierboven werd beschreven, blijkt dat TNFR₁ een erg interessante target is om te inhiberen, omdat dit therapeutisch gezien erg veel voordelen biedt ten opzichte van volledige TNF-inhibitie. Op deze manier zullen namelijk de nevenwerkingen die opduiken bij TNF-inhibitoren, grotendeels teniet kunnen worden gedaan. In het MGI werden al eigen anti-TNFR₁ tools ontwikkeld die gebaseerd zijn op dit selectieve inhibitieprincipe. In de toekomst is het de bedoeling om deze tools verder te ontwikkelen en het werkingsmechanisme van TNF volledig te ontrafelen, alsook de voordelen van alternatieve anti-TNF therapie in de praktijk om te zetten. Deze scriptie behandelt de huidige ontwikkelingen in het MGI rond Nanobodies als selectieve therapeutische TNFR₁-inhibitoren en microRNA’s als middel om het werkingsmechanisme van TNF verder te onderzoeken.
1.4 NANOBODIES 1.4.1 Achtergrond Nanobodies, hierna afgekort als Nb’s, zijn een gesimplificeerde vorm van AL die toch de unieke structurele en functionele eigenschappen van deze moleculen bezitten (Vincke and Muyldermans 2012). De Nb-technologie is gebaseerd op de ontdekking dat Camelidae of
Inleiding
7
kameelachtigen naast gewone AL, ook AL bezitten die enkel bestaan uit een zware keten. Het bindende gedeelte van zo’n zware keten AL, het VHH-proteïne (variable heavy chain), werd door de firma Ablynx gekloneerd en ‘Nanobody’ genoemd (Figuur 1.2). Nb’s zijn dus slechts een onderdeel van de zware keten AL, maar bezitten nog altijd de specifieke antigenbindende eigenschappen van conventionele AL (Coppieters, Dreier et al. 2006). Nanobody® (Ablynx) Kleinste nog functionele fragment van een in de natuur voorkomend enkelvoudige keten antilichaam CONVENTIONEEL ANTILICHAAM
ZWARE KETEN ANTILICHAAM
Zware en lichte keten Beide ketens zijn noodzakelijk voor binding antigen en stabiliteit
Enkel zware keten Volledige antigenbindingscapaciteit en erg stabiel
Figuur 1.2: Structuur antilichamen en Nanobodies (aangepast uit Elsadek and Kratz 2012).
Om Nb’s te produceren worden kamelen of lama’s geïmmuniseerd met een specifiek antigen en worden vervolgens de lymfocyten geïsoleerd. Uit deze cellen wordt het mRNA geëxtraheerd, vermenigvuldigd via RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) en gekloneerd in geschikte plasmidevectoren. Deze plasmides worden ingebracht in bacteriofagen die dan op hun beurt het Nb op hun oppervlak tot expressie brengen. Nadien worden via panning de best bindende Nb’s geselecteerd: een microtiterplaat wordt gecoat met het antigen, vervolgens worden daarop de bacteriofagen, die de Nb’s tot expressie brengen, gebracht en na enkele wasstappen blijven enkel nog de sterkste binders over (Arbabi Ghahroudi, Desmyter et al. 1997). De best bindende bacteriofagen worden vervolgens van de plaat gewassen en bacteriën worden hiermee getransfecteerd. Na eiwitexpressie, identificatie en eventueel recombinante koppeling via een flexibele of rigide linkermolecule, zijn de Nb’s afgewerkt en kunnen ze gebruikt worden voor therapeutische doeleinden (Coppieters, Dreier et al. 2006). Dit proces wordt weergegeven in Figuur 1.3. Nb’s zijn slechts 15 kDa groot, waardoor ze kunnen binnendringen in receptorholtes waarin conventionele antilichamen niet kunnen doordringen, zoals enzymatische groeven. Hierdoor hebben ze vaak zelfs een hogere bindingscapaciteit dan de conventionele AL
Inleiding
8
(Harmsen and De Haard 2007). Nb’s zijn bovendien ook erg stabiel, flexibel, modificeerbaar, goed oplosbaar en ze kunnen dankzij hun kleine afmetingen erg goedkoop geproduceerd worden in verscheidene pro- en eukaryoten (Van Bockstaele, Holz et al. 2009). Een nadeel van de kleine afmetingen is dat Nb’s snel renaal geklaard worden en bijgevolg een korte halfwaardetijd hebben. Hierdoor wordt de effectiviteit van de Nb’s sterk gelimiteerd in vele parenterale toepassingen (Harmsen and De Haard 2007).
Bloedafname
Isolatie lymfocyten Extractie mRNA
Generatie multivalente, bispecifieke VHH constructs via recombinate koppeling
Immunisatie kameel/lama met gewenste antigen
OF Productie oplosbare antigenspecifieke VHH-proteïnen
Generatie bibliotheek van ~107 transformanten
Selectie specifieke VHH-proteïnen via panning
Figuur 1.3: Productie van antigen-specifieke VHH proteïnen (aangepast uit Coppieters, Dreier et al. 2006).
Een extra pluspunt van de uitzonderlijke oplosbaarheid en stabiliteit van de Nb’s is dat ze kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor de synthese van bi- en trivalente constructies (Els Conrath, Lauwereys et al. 2001). Koppeling van meerdere Nb’s verhoogt niet alleen de halfwaardetijd, maar maakt het ook mogelijk om het sterkst bindende eiwit te combineren met het sterkst inhiberende eiwit om zo het meest therapeutisch actieve Nb te genereren. Zo kunnen ze bijvoorbeeld gelinkt worden aan een anti-albumine Nb om de halfwaardetijd in het bloed te verhogen. Anti-albumine zal in het lichaam immers binden met albumine en aangezien dit eiwit in het menselijk lichaam zelf een halfwaardetijd van 19 dagen heeft, zal de farmacokinetiek van het gekoppelde Nb verlengd worden (Dennis, Zhang et al. 2002). Een bijkomend voordeel van de koppeling aan een anti-albumine Nb is dat albumine accumuleert in inflammatoire regio's waardoor het Nb meer targetspecifiek wordt (Wunder, Muller-Ladner et al. 2003). Al deze voordelen worden weergegeven in Tabel 1.1. Inleiding
9
Tabel 1.1: Voordelen Nanobodies
Voordelen Nanobodies Klein (15 kDa) Dringen gemakkelijk binnen in receptorholtes Hoge stabiliteit Hoge flexibiliteit Hoge wateroplosbaarheid Snelle en eenvoudige productie Modificeerbaar tot dimere en trimere constructs
Omdat lichaamsvreemde moleculen vaak een immuunrespons op gang brengen, worden AL zoveel mogelijk gehumaniseerd. Voor Nb’s vormt dit echter geen groot obstakel, aangezien deze al een relatief hoge sequentiehomologie (80-90%) vertonen met de zwareketen variabele domeinen bij de mens. Bovendien zijn Nb’s erg klein (15 kDa) ten opzichte van AL (150 kDa) en zullen ze dus niet snel een immuunreactie op gang brengen (CortezRetamozo, Lauwereys et al. 2002). Ondanks het lage risico op immunogeniciteit, worden sommige Nb’s, onder andere degene voor intraveneuze injectie, toch gehumaniseerd om 100% zeker te zijn dat ze veilig zijn.
1.4.2 Onderzoek in het MGI Ongepubliceerde in vitro bindings- en inhibitiestudies binnen het MGI wezen uit dat binnen de groep van de Nb’s tegen humane TNFR₁ (hTNFR₁), Nb 96 de beste binder is en Nb 70 de beste inhibitor. Om de farmacokinetiek en -dynamiek van deze humane Nb’s (hNb’s) te verbeteren, werd besloten om het bispecifieke Nb 70-96 te genereren. Dit Nb is in vitro een betere inhibitor dan de monovalente hNb’s. Aangezien TNF een trimere molecule is die bindt en interageert met de trimere receptor TNFR₁, was de overstap naar de synthese van trimere hNb’s om de bindingscapaciteit en het inhiberend vermogen te verbeteren een logische keuze. Een bijkomend voordeel van trimere hNb’s is dat, zoals hierboven al werd vermeld, hierdoor de farmacokinetiek verbetert en de halfwaardetijd wordt verlengd. Ook is het om dezelfde reden gunstig om dimere hNb’s te linken aan anti-albumine (ongepubliceerde data). Voor de productie van de trimere humane anti-albumine Nb’s werd overgestapt van de bacterie E. coli naar de gist Pichia pastoris. De reden voor deze aanpassing was dat E. coli de trimere hNb’s maar moeilijk tot expressie kon brengen; de opbrengst van de Inleiding
10
eiwitexpressie bleef immers telkens laag. P. pastoris wordt vaak gebruikt voor eiwitexpressie bij recombinante DNA technologie omdat deze gist zich erg snel vermenigvuldigt en in staat is om te groeien in eenvoudige, goedkope media (Liang, Wang et al. 2012). In het MGI werden ook al Nb’s gesynthetiseerd tegen muis TNFR₁ (mTNFR₁). Het voordeel van deze muis Nb’s (mNb’s) is enerzijds dat we op deze manier in het MGI zelf bindings- en inhibitietestudies kunnen uitvoeren in muizen om zo het werkingsmechanisme van de Nb’s beter te leren begrijpen. Anderzijds kunnen we hierdoor ook testen bij welke ziektebeelden deze nieuwe therapeutica een gunstig effect zouden kunnen hebben.
1.4.3 Toekomstperspectieven De hTNFR₁ Nb’s worden eerst in vitro getest op hun bindingscapaciteit en inhiberend vermogen en zullen vervolgens ook in een in vivo systeem onderzocht worden. Voor deze testen zullen transgene humane TNFR₁-knock-in muizen gebruikt worden, in samenwerking met Dr. G. Kollias (Vari, Griekenland). Dit zijn muizen waarin het muis tnfrsf1a-gen vervangen werd door het humane tnfrsf1a-gen. In deze muizensystemen zal dan het inhibitiemechanisme bestudeerd worden en een vergelijking worden gemaakt met commerciële AL. Op langere termijn zal vervolgens getest worden of reumatoïde artritis, de ziekte van Crohn en astma kunnen worden beschouwd als TNFR₁-afhankelijke ziektes. Bovendien zal ook onderzocht worden of TNFR₁ een beter target is voor anti-inflammatoire therapie dan TNF zelf. Als laatste zal ook onderzoek gebeuren naar het effect van de gesynthetiseerde Nb’s op muizenmodellen van astma, de ziekte van Crohn en reumatoïde artritis. De mTNFR₁ Nb’s zullen getest worden bij in vitro bindings- en inhibitietesten en in vivo muizenexperimenten. Indien we bij deze studies enkel goede binders vinden en geen effectieve inhibitoren, dan kunnen we deze Nb’s eventueel koppelen aan het enzyme TACE om ze alsnog actief te maken. Een groot nadeel van deze theorie is dat TACE veel meer substraten heeft dan TNFR₁ alleen en vaak ook pro-inflammatoire effecten teweegbrengt. Het risico op off-target effecten is dus erg groot. Daarom zullen de effecten van TACE eerst onderzocht worden bij Nb’s tegen mTNFR₁ vooraleer ze ook toe te passen bij de hNb’s.
Inleiding
11
1.5 MICRORNA 1.5.1 Achtergrond MicroRNA’s (miR’s) zijn kleine, niet-coderende RNA’s van 15-22 nucleotiden lang, die endogeen aanwezig zijn in planten en dieren. Ze reguleren de genexpressie op transcriptioneel en posttranscriptioneel niveau via binding aan het 3’UTR-uiteinde van mRNA-sequenties. Op deze manier regelen ze enkele kritische processen, zoals celproliferatie, -differentiatie en -overleving. Wanneer een miR bindt op mRNA, kan dit resulteren in twee verschillende processen. Enerzijds kan het mRNA worden afgebroken, waardoor translatie niet meer mogelijk wordt en anderzijds wordt het mRNA niet afgebroken, maar gedestabiliseerd wat resulteert in een structurele blokkering van de translatie. Meestal zijn de miR- en mRNA-sequenties grotendeels complementair, maar één miR kan wel honderden verschillende transcriptieproducten reguleren die een rol spelen in uiteenlopende pathways (Ambros 2004). MicroRNA’s worden overgeschreven uit het genoom als pri-miR’s en vervolgens door het nucleaire ribonuclease Drosha geknipt tot fragmenten van 70-100 nucleotiden lang. Deze fragmenten vormen een hairpinstructuur en worden pre-miR’s genoemd. Nadien worden ze uit de celkern getransloceerd en verder geknipt door het ribonuclease Dicer tot 17-25 bp-lange dubbelstrengige miR-fragmenten zodat ze daarna in het RISC (RNA-induced silencing complex) kunnen binnendringen. Dit complex zorgt voor scheiding van de dubbelstrengen en faciliteert de interactie met mRNA (Bader, Brown et al. 2010).
1.5.2 Anti-microRNA Anti-microRNA’s (anti-miR’s) zijn synthetische moleculen die bestaan uit sequenties complementair aan endogene miR’s. Op deze manier kunnen ze binden met deze miR’s en daardoor de binding van miR op mRNA verhinderen (Stenvang, Petri et al. 2012). Naast RNA-nucleotiden bevatten deze moleculen ook LNA™-nucleotiden (locked nucleic acid). LNA's zijn gemodificeerde RNA-nucleotiden waarbij er een extra methyleenbrug werd gevormd tussen 2’O en 4’C. Dit zorgt ervoor dat deze molecule minder flexibel wordt en bijgevolg langer en beter bindt op de miR die endogeen aanwezig is (Kloosterman, Wienholds et al. 2006). Wegens de hoge affiniteit van anti-miR voor miR, wordt het Inleiding
12
endogene miR geblokkeerd in een configuratie die niet kan worden opgenomen door het RISC of leidt het anderzijds tot degradatie van het endogene miR (Bader, Brown et al. 2010).
Figuur 1.4: Structuur LNA™ (aangepast uit Elmen, Zhang et al. 2004).
1.5.3 Onderzoek in het MGI Eerder, nog niet gepubliceerd, onderzoek in het MGI wees uit dat SPRET/Ei muizen minder TNFR₁-eiwit bezitten dan C57BL/6 muizen (deze proefdieren worden verder besproken onder 1.6); de mRNA-niveaus daarentegen zijn normaal. Het feit dat SPRET/Ei muizen minder TNFR₁-eiwit bezitten, zorgt ervoor dat deze muizen minder gevoelig zijn voor TNF-geïnduceerde letale shock dan C57BL/6 muizen. Verrassend genoeg werd ook opgemerkt dat (BxS)F₁ muizen, dit zijn muizen uit de kruising van SPRET/Ei muizen met C57BL/6 muizen, even resistent zijn tegen TNF als SPRET/Ei muizen. De verklaring hiervoor is dat de TNF-resistentie een dominant fenotype is. In het onderzoek van deze masterproef zal dan ook worden gewerkt met deze F₁-hybride muizen in plaats van SPRET/Ei muizen aangezien SPRET/Ei muizen erg moeilijk kweken en ook vrij duur zijn (ongepubliceerde data). De loci die mogelijks verantwoordelijk zijn voor zowel de lagere expressie van TNFR₁ als de TNF-resistentie liggen distaal op chromosoom 6 en proximaal op chromosoom 2 (Staelens, Wielockx et al. 2002; ongepubliceerde data). Het verband met chromosoom 6 is logisch, aangezien het TNFR₁-gen in deze locus gelegen is. Daarnaast werd ontdekt dat in de locus op chromosoom 2 een miR ligt die vermoedelijk in staat is om TNFR₁ te downreguleren via repressie van translatie, namelijk miR-511. Er wordt vermoed dat miR-511 bindt aan de 3'UTR-sequentie van het TNFR₁ mRNA. Hierdoor destabiliseert het mRNA waardoor de translatie en expressie van TNFR₁ wordt verhinderd. Verder onderzoek wees uit dat SPRET/Ei muizen wel degelijk meer miR-511 hebben dan C57BL/6 muizen (ongepubliceerde data).
Inleiding
13
Via injectie van miR-511 in C57BL/6 muizen werd onderzocht of miR-511 inderdaad het verhoopte effect had op TNFR₁. Op eiwitniveau werd gezien dat de TNFR₁-levels lager lagen na miR-511 injectie. Deze bevindingen lagen in de lijn van de verwachtingen. Ander onderzoek in het MGI wees uit dat bij toediening van TNF 24 uur na injectie van miR-511, miR-controle (dit is een miR-achtige sequentie die nergens op bindt) of PBS (oplosmiddel van miR-511 en miR-controle), de muizen voorbehandeld met miR-511 resistenter zijn tegen TNF zijn dan de controlemuizen. Hieruit kan worden geconcludeerd dat miR-511 TNF-resistentie genereert door downregulatie van TNFR₁ op eiwitniveau (ongepubliceerde data).
1.5.4 Toekomstperspectieven Bijkomende studies met miR-511 zullen helpen om het werkingsmechanisme van TNF verder te ontrafelen. Deze bevindingen kunnen dan toegepast worden in de ontwikkeling van tools tegen inflammatoire aandoeningen. Er zal ook grondig worden onderzocht of miR-511 zelf zou kunnen worden gebruikt als alternatief voor TNF-inhibitoren ter behandeling van inflammatoire ziektes zoals reumatoïde artritis en de ziekte van Crohn. Aangezien één miR echter honderden verschillende transcriptieproducten kan reguleren, is het enorm moeilijk om te voorspellen welke bijkomende (on)gunstige effecten miR-511 in het lichaam nog zal teweegbrengen. Het gebruik van miR-511 als therapeutisch middel is dus nog toekomstmuziek, er is nog veel bijkomend onderzoek vereist.
1.5.5 Therapeutische toepasbaarheid Via injectie van concanavalin A in muizen kan acute hepatitis geïnduceerd worden (Jarrett, Cunnane et al. 2003). ConA veroorzaakt snelle activatie van natural killer T-cellen die bijgevolg grote hoeveelheden inflammatoire cytokines, waaronder TNF, produceren. Deze cytokines induceren ernstige inflammatie in de lever, met leverschade tot gevolg (Fang, Wang et al. 2012). Gezien in artikels werd aangetoond dat acute hepatitis een TNFR₁-afhankelijke aandoening is (Wolf, Hallmann et al. 2001) en microRNA na hydrodynamische staartinjectie in de lever terechtkomt (Liu, Song et al. 1999), is dit model ideaal voor het bestuderen van de beschermende effecten veroorzaakt door miR-511 bij auto-immune hepatitis. We verwachten dat door downregulatie van TNFR₁ deze muizen beschermd zullen zijn tegen conA en dus minder leverschade zullen vertonen.
Inleiding
14
1.6 PROEFDIEREN 1.6.1 C57BL/6 In de transgenetica wordt vaak gebruik gemaakt van C57BL/6 muizen. Deze muizen zijn erg geschikt voor dit opzet, omdat ze de aangebrachte mutaties maximaal tot expressie brengen. C57BL/6 muizen worden erg gemakkelijk gekweekt, leven lang en zijn weinig tumorgevoelig (Sprott 1975). In deze masterproef wordt gebruik gemaakt van deze muizen om het effect van miR-511 op TNFR₁ in vivo te bestuderen. Ook worden deze muizen vaak gebruikt voor de productie van transgene knockin muizen. Dit zijn muizen waarbij extra genen in het genoom geïntegreerd worden (Osada, Toyoda et al. 2005). Daarnaast bestaan er ook knockout muizen waarbij in het genoom van de muis doelbewust een mutatie werd aangebracht om een specifiek gen disfunctioneel te maken (Rothe, Lesslauer et al. 1993). Voor de experimenten beschreven in deze inleiding werden enerzijds wild type muizen gebruikt (WT, TNFR₁ +/+), waarbij geen mutaties werden aangebracht en anderzijds TNFR₁-knockout muizen (KO, TNFR₁ -/-), waarbij het gen voor TNFR₁ werd uitgeschakeld. Ook wordt gebruik gemaakt van heterozygote F₁-hybride muizen (F₁, TNFR₁ +/-), dit zijn muizen die gekweekt worden door TNFR₁ -/- en TNFR₁ +/+ muizen te kruisen. Deze F₁-hybride muizen worden ook wel intercross muizen genoemd.
1.6.2 SPRET/Ei Naast C57BL/6 muizen wordt voor het bestuderen van bepaalde inflammatoire ziektes ook gebruik gemaakt van SPRET/Ei muizen. Deze muizen stammen af van Mus spretus, een stam die zich meer dan 2 miljoen jaar geleden afsplitste van de stam Mus musculus (Dejager, Libert et al. 2009). Hierdoor zijn deze muizen genetisch erg verschillend van de C57BL/6 muizen. Studies wezen uit dat SPRET/Ei muizen beduidend minder gevoelig zijn voor TNF-geïnduceerde inflammatoire shock dan C57BL/6 muizen (Staelens, Wielockx et al. 2002). In deze masterproef wordt gebruik gemaakt van F₁-hybride muizen, (C57BL/6 x SPRET/Ei)F₁ of (BxS)F₁, gekweekt door kruising van C57BL/6 muizen met SPRET/Ei muizen. Uit onderzoek bleek namelijk dat deze muizen even resistent zijn als gewone SPRET/Ei muizen (Staelens, Wielockx et al. 2002)
Inleiding
15
2
OBJECTIEVEN
2.1 NANOBODIES Uit wat in de inleiding werd beschreven, blijkt dat TNFR₁ een erg interessante target is om te inhiberen omdat dit therapeutisch erg veel voordelen biedt in vergelijking met volledige TNF-inhibitie. In het MGI werden al eigen anti-TNFR₁-tools ontwikkeld die gebaseerd zijn op dit selectieve inhibitieprincipe: synthetische Nb’s tegen mTNFR₁ en hTNFR₁. Een eerste doelstelling van dit thesisonderzoek is om de resterende mTNFR₁ Nb gensequenties in de vector pHEN4 te herkloneren naar de expressievector pHEN6c (Figuur 2.1) om ze vervolgens tot expressie te brengen en op te zuiveren. Uiteindelijk zal van deze Nb’s de bindingscapaciteit bestudeerd worden via ELISA. In eerdere studies in het MGI werd al opgemerkt dat opgezuiverde mTNFR₁ Nb’s een goede binding vertonen. Bij testen van de inhibitiecapaciteit met L929 NF-κB luc-cellen kon echter geen inhibitie worden gedetecteerd. Ter controle van de bindingscapaciteit van de mNb’s zal getest worden of de mNb’s binden op BSA, het carriëreiwit dat in het aangekochte coatingsantigen wordt gebruikt ter stabilisatie van mTNFR₁, in plaats van op mTNFR₁.
Figuur 2.1: Herklonering Nanobody gensequenties van vector pHEN4 naar vector pHEN6c (Figuur werd aangemaakt in het programma CLC).
In de inleiding werd ook vermeld dat voor de productie van de trimere hTNFR₁ Nb’s overgeschakeld werd naar de gist Pichia pastoris. Deze overschakeling bleek echter ook een nadeel in te houden: na herklonering van de Nb gensequenties van de vector pHEN6c naar pAOXZalfaHC bevatten de gensequenties 5 AZ (aminozuren) extra. Als tweede doelstelling zal in deze thesis onderzocht worden of deze extensie invloed heeft op de bindings- en inhibitiecapaciteit van de Nb’s. Extra AZ kunnen immers zorgen voor een alternatieve eiwitconfiguratie en bijgevolg een verschil in bindende en inhiberende eigenschappen. Objectieven
16
2.2 MICRORNA Naast onderzoek naar Nb’s, wordt in het MGI momenteel ook veel onderzoek gedaan naar miR-511. Zoals al in de inleiding werd vermeld, kan deze miR ervoor zorgen dat TNFR₁ minder tot expressie wordt gebracht. MiR-511 is dus een geschikte molecule om de rol van TNFR₁ in inflammatoire aandoeningen te bestuderen. Als derde doelstelling van deze thesis zal daarom onderzocht worden of het conA model (injectie van concanavalin A in muizen) een goed model is voor de bestudering van de beschermende effecten veroorzaakt door miR-511 bij auto-immune hepatitis. Gezien acute hepatitis een TNFR₁-afhankelijke aandoening is en microRNA na hydrodynamische staartinjectie in de lever terecht komt, lijkt bovenstaand model ideaal voor dit opzet. We verwachten dat door de downregulatie van TNFR₁ deze muizen beschermd zullen zijn tegen conA en dus minder leverschade zullen vertonen. Op de serumstalen van het conA-experiment zullen AST/ALT-bepalingen uitgevoerd worden en op de leverstalen IFNγ- en TNFR₁-ELISA. Om de leverschade histologisch te bestuderen zullen van de levers ook coupes gemaakt worden waarop immunohistochemische kleuringen zullen worden uitgevoerd. Naast miR’s, bestaan ook anti-miR’s die in staat zijn om de werking van microRNA te blokkeren. Om de werking van anti-miRs te bestuderen zullen we als vierde doelstelling in deze thesis een ELISA uitvoeren op leverstalen van muizen die anti-miR-511 toegediend kregen. Na analyse van de resultaten verwachten we een blokkering van de werking van miR-511 en dus een upregulatie van TNFR₁. Als vijfde en laatste doelstelling zullen we proberen om ES-cellen (embryonale stamcellen) te transfecteren met het miR-511 gen om zo transgene muizen te genereren die deze miR verhoogd tot expressie brengen. In de toekomst zullen hier dan ook experimenten mee worden uitgevoerd om de werking van miR-511 en meer algemeen ook de rol van TNF en de TNFR₁ in inflammatie nog beter te kunnen bestuderen.
Objectieven
17
3
MATERIAAL EN METHODEN
3.1 MATERIAAL In bijlage 1 wordt een lijst gegeven van de belangrijkste gebruikte producten, instrumenten, benodigdheden en kits met bijhorende firma.
3.2 PROEFDIEREN 3.2.1 C57BL/6 C57BL/6 WT muizen werden besteld bij Janvier-Europe en gekweekt in het Animal House van het DMBR (Department voor Moleculair Biomedisch onderzoek).
3.2.2 SPRET/Ei SPRET/Ei muizen werden besteld bij The Jackson Laboratory en gekweekt in het Animal House van het DMBR. F₁-hybride muizen, (BxS)F₁, werden gekweekt door kruising van vrouwelijke C57BL/6 muizen met mannelijke SPRET/Ei muizen.
3.3 NANOBODIES 3.3.1 Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c Een LB-plaat (10 g/l NaCl, 5 g/l yeast extract, 10 g/l tryptone, 15 g/l agar) met 100 µg/ml ampicilline (Amp) en 1% glucose (Gluc) wordt geïnoculeerd met E. Coli TG1 bacteriën die de vector pHEN4 met de gewenste Nb gensequentie bevatten (VIB Nanobody Service Facility, Brussel, België) en wordt overnacht bij 37°C geïncubeerd. Nadien wordt 25 ml vloeibaar LB medium (10 g/l NaCl, 5 g/l Yeast, 10 g/l Tryptone) met 100 µg/ml Amp en 1% Gluc geïnoculeerd met 1 zuivere kolonie en laten we deze cultuur overnacht schuddend incuberen bij 37°C. Vervolgens worden de plasmides opgezuiverd met de Qiagen® Midi Plasmid Purification kit volgens het bijgeleverde protocol en bepalen we de DNAconcentratie per staal met de Nanodrop 1000-spectrofotometer.
Materiaal en methoden
18
Daarna amplificeren we het DNA via de polymerase chain reaction (PCR). Hiertoe wordt aan 10 µl template DNA een PCR-mix (2,5 µl 10 x PCR buffer, 0,75 µl 50 mM MgCl₂, 0,1 µl 5U/µl Taq DNA polymerase, 0,5 µl 10 mM dXTPs, 0,5 µl 10 µM primer A6E, 0,5 µl 10 µM primer 38 en 10,15 µl nucleasevrij H₂O) toegevoegd (primersequenties: zie bijlage 2). Het PCR-toestel PTC-2000 wordt gebruikt om de PCR-reactie te laten doorgaan volgens het volgende temperatuursprogramma: 4 min 94°C, [30s 94°C, 30s 55°C, 30s 72°C] x 34, 7 min 72°C en tenslotte afkoelen tot 10°C. Vervolgens wordt het PCR-product geladen op een 2% agarosegel ter controle van de fragmentgrootte (protocol: zie bijlage 3). Het overige PCRproduct wordt opgezuiverd met de Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit volgens het bijgeleverde protocol. We bepalen achteraf opnieuw de DNA-concentratie per staal met de Nanodrop 1000-spectrofotometer. Nadien laten we het restrictie-enzyme Pstl gedurende 3 uur bij 37°C inwerken op zowel de opgezuiverde PCR-producten als de pHEN6c-vector volgens het bijgeleverde protocol. Het digest wordt daarna opnieuw opgezuiverd met de Nucleospin Gel & PCR Cleanup kit. Vervolgens knippen we zowel insert als vector met een tweede restrictie-enzyme BstEll gedurende 3 uur bij 60°C. Nadien worden alle geknipte fragmenten opgezuiverd met de Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit en geladen op een 1,5% agarosegel om de grootte van de fragmenten te controleren. Vervolgens wordt 30 ng van de geknipte Nb gen insert overnacht bij 4°C geligeerd in 100 ng van de pHEN6c-vector met T4 ligase volgens het bijgeleverde protocol. Na ligatie wordt 50 µl elektrocompetente WK6-cellen (VIB Nanobody Service Facility, Brussel, België) getransformeerd met 1 µl ligatieproduct via elektroporatie met de Gene Pulser ll (1 min equilibratie op ijs, shock van 4-5 volt en toevoeging 1 ml SOC (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glucose)) en wordt gedurende 1 uur bij 37°C schuddend geïncubeerd. Daarna wordt 250 µl bacterie-cultuur getransfereerd naar een LB/Amp/1% Gluc-plaat en overnacht geïncubeerd bij 37°C. Op de aanwezige kolonies wordt vervolgens kolonie PCR uitgevoerd met de primers Universal Forward en Universal Reverse (primersequenties zie bijlage 2) volgens het hotstart PCR-programma: 10 min 94°C, [30s 94°C, 30s 55°C, 30s 72°C] x 34, 7 min 72°C en tenslotte afkoelen tot 10°C. Nadien worden de PCR producten geladen op
Materiaal en methoden
19
een 2% agarosegel om de grootte van de fragmenten te controleren. De positieve kolonies worden vervolgens geïnoculeerd in 25 ml vloeibaar LB-medium met 100 µg/ml ampicilline en 1% glucose, opgezuiverd met de Qiagen® Midi Plasmid Purification Kit en opgestuurd naar de VIB Genetic Service Facility (Antwerpen) voor sequentiebepaling.
3.3.2 Expressie en opzuivering Een LB/Amp/1%Gluc plaat wordt geïnoculeerd met bacteriën die het Nb gen in hun gensequentie dragen en overnacht geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens inoculeren we 15 ml LB/Amp/1%Gluc met een single kolonie en incuberen overnacht schuddend bij 37°C. Van deze precultuur wordt vervolgens 4 ml toegevoegd aan 330 ml TB-medium (2,3 g/l KH₂PO₄, 16,4 gl/l K₂HPO₄.3H₂O, 12 g/l tryptone, 24 g/l yeast extract, 0,4% glycerol) met 100 µg/ml Amp, 2 mM MgCl₂ en 0,1% Gluc. Deze culturen worden gedurende 3u schuddend geïncubeerd bij 37°C tot een OD600 (optische densiteit bij 600 nm) van 0,6-0,7 wordt bereikt. Op dit moment wordt 1 mM IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) toegevoegd en wordt verder overnacht geïncubeerd bij 28°C tot een OD 600 van 25-30 bereikt wordt. Via toediening van IPTG wordt de repressor van het lacZ gen geblokkeerd waardoor het lac operon terug fuctioneel wordt en de transcriptie van het Nb kan doorgaan. De Nb’s worden in de periplasmatische ruimte gesecreteerd, waaruit ze zullen opgezuiverd worden. Hiervoor worden de culturen gecentrifugeerd (8000 rpm, 8 min, 4°C) in de Sorvall RC 5C Plus en wordt de pellet gehersuspendeerd in 12 ml TS (0,2 M Tris pH 8,0 + 0,5 M sucrose) en 1u op ijs geschud. Vervolgens wordt 18 ml TS/4 toegevoegd en verder overnacht schuddend geïncubeerd op ijs. Nadien wordt gecentrifugeerd (8000 rpm, 30 min, 4°C) en wordt het supernatans met periplasmatisch extract overgebracht in een 50 ml tube. De opzuivering gebeurt met de His GraviTrap Kit volgens het bijgeleverde protocol. Wanneer we het staal op kolom brengen, zullen de Nb’s, die een histidine-tag bezitten, geïmmobiliseerd worden wegens hun affiniteit voor de met nikkel beladen kolom, terwijl de andere storende bestanddelen van de kolom worden weggewassen. Hierna wordt het opgezuiverde extract overnacht gedialyseerd met de Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette in PBS volgens het bijgeleverde protocol. Deze stap wordt uitgevoerd om storende bestanddelen, zoals imidazol uit de elutiebuffer van de His GraviTrap kit, te elimineren.
Materiaal en methoden
20
3.3.3 Coomassie staining en Western blot Om te controleren of de Nb’s correct geëxpresseerd werden, worden alle geëxpresseerde eiwitten op basis van hun grootte elektroforetisch gescheiden op een polyacrylamide gel. Hiertoe worden eerst de eiwitconcentraties bepaald met de Bio-Rad DC Protein Assay Kit volgens het bijgeleverde protocol. Vervolgens wordt 50 µg staal, na toevoeging van 5x ladingsbuffer (10% SDS, 10 mM βMe, 20% glycerol, 0,2 M Tris-HCl pH 6.8, 0,05% broomfenolblauw) en 5 min koken bij 95°C, geladen op een 15% polyacrylamide gel (protocol: zie bijlage 3) samen met de Precision Plus Protein™ All Blue Standards ladder en een positieve controle (reeds opgezuiverd Nb). De gel loopt in 1x elektrodebuffer (5x: 30 g/l Tris, 144 g/l glycine, 5 g/l SDS) aan 80 V tot het blauwe migratiefront volledig doorheen de concentratiegel gemigreerd is en vervolgens aan 150 V tot op het einde van de gel. Voor coomassie wordt de gel na elektroforese overnacht gekleurd in 1x Coomassie Brilliant Blue (0,1% coomassie R250, 20% methanol, 10% azijnzuur) en daarna ontkleurd in destain (50% methanol, 10% azijnzuur). Nadien wordt de gel getransfereerd naar een cassette met cellofaan en overnacht gedroogd bij KT. Met deze techniek worden alle aanwezige eiwitten gekleurd en kunnen ze op basis van hun grootte geïdentificeerd worden. Voor Western blot worden de proteïnen na elektroforese uit de gel geblot op een Protran nitrocellulose transfer membraan (0,45 µm), dat langs weerszijden wordt bedekt met 3 filterpapieren. Dit gebeurt op basis van de Semi-Dry Western blotting methode met de Semi dry blotter bij 0,8 mA/cm² gel gedurende 2 uur. Het membraan wordt vervolgens overnacht geblokkeerd bij 4°C met 2% BSA in PBS. Daarna volgt een incubatiestap (1u, KT) met mouse anti-His tag AL (1/1000, Abdserotec, Kidlington, Engeland) in PBS, gevolgd door 3x wassen in PBS + 0,05% Tween 20 (PBST) en een tweede incubatiestap (1u, KT) met anti-mouse-IRDye 800 (1/10000, Westburg, Leusden, Nederland) in PBS. Nadien vinden 3 reeksen van 3 wasstappen plaats in PBST, PBS en gedestilleerd water. De visualisatie gebeurt bij een golflengte van 800 nm met het Odyssey Infrared Imaging System.
3.3.4 ELISA bindingstest Een Corning® 96 well Half Area Microplate wordt overnacht bij 4°C gecoat met 50 µl recombinant antigen (1 ng/µl in TBS, zie Tabel 3.1). Na 3 keer wassen met 125 µl TBST Materiaal en methoden
21
(50 mM TrisHCl pH 7,4 + 150 mM NaCl + 0,05% Tween 20), wordt gedurende 1 uur op KT geblokkeerd met 100 µl TBST+ 5% BSA. Na een nieuwe wasstap met TBST wordt 50 µl staal uit een 1/5 verdunningsreeks van de Nb’s in TBST + 2,5% BSA op de plaat gebracht en gedurende 1 uur geïncubeerd op KT. Vervolgens wordt opnieuw gewassen met TBST en gedurende 1 uur op KT geïncubeerd met 50 µl mouse anti-His tag AL (1/1000 in TBST + 1% BSA; Abdserotec, Kidlington, Engeland). Na nogmaals wassen met TBST, wordt 50 µl secundair AL anti-mouse-HRP (1/2000 in TBST + 0,5% BSA; GE Healthcare, Diegem, België) op de plaat gebracht en gedurende 1 uur in het donker geïncubeerd op KT. Na een laatste wasstap, wordt 25 µl substraatoplossing (1:1 mengsel van Color Reagent A (H₂O₂) en Color Reagent B (tetramethylbenzidine) uit de TMB Substrate Reagent set) toegevoegd, waarna een blauwe kleur ontstaat. Vervolgens wordt de enzymatische kleurreactie na 30 min gestopt met 25 µl 1M H₂SO₄. De OD₄₅₀ wordt gemeten met de iMark™ Microplate Absorbance Reader. De OD₅₉₅ wordt van de resultaten afgetrokken om te corrigeren voor de optische imperfecties in de microtiterplaat. Tabel 3.3: Specificaties ELISA bindingstesten (*: bij deze test wordt geblokkeerd met TBST + 5% melkpoeder en worden de Nb’s en AL telkens verdund in TBST zonder BSA).
Test Binding mNb’s op mTNFR₁ Binding mNb’s op BSA Binding mNb’s op CF mTNFR₁*
Coatingsantigen Recombinant Mouse sTNFRI/TNFRSF1A 5% BSA
Binding hNb’s op hTNFR₁
Recombinant Mouse sTNFRI/TNFRSF1A, CF sTNFR-R Type l Human Recombinant
Binding trimere hNb’s op albumine
Albumin from mouse serum
Firma R&D Systems, Minneapolis, VS Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België R&D Systems, Minneapolis, VS Tebu-bio NV, Boechout, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België
3.3.5 Inhibitietest Een glycerolstock aan HEK-2-Blue cellen (Invivogen, Toulouse, Frankrijk) wordt ontdooid en hieraan wordt 10 ml vers bereid Dulbecco's Modified Eagle Complete Medium (DMEM, 10% foetaal kalfserum, 1% L-glutamine, 0,2% penicilline/streptomycine, 0,1% natriumpyruvaat) toegevoegd. Na overnacht incuberen bij 37°C en 5% CO₂ in een 175 cm² fles wordt het medium afgezogen en worden de cellen losgemaakt met 10 ml trypsine-EDTA (0,032% EDTA, 0,05% trypsine). Na toevoeging van 10 ml DMEM Complete medium, worden de cellen getransfereerd naar een tube, gecentrifugeerd (1100 rpm, 5 min, KT) en wordt de
Materiaal en methoden
22
pellet gehersuspendeerd in 5 ml DMEM Complete medium. Hierna worden de cellen, verdund in trypaanblauw (1/10), geteld met behulp van de telkamer van Burker en wordt de concentratie verdund in HEK-Blue Detection medium tot 20 000 cellen/ml. Vervolgens wordt deze celsuspensie uitverdeeld in een 96-well plaat (170 µl per well). Na enkele uren incubatie bij 37°C en 5% CO₂ tot de cellen confluent zijn, wordt aan elke well 20 µl van een 1/5 verdunningsreeks (startconcentratie 5 µM) van Nb’s toegevoegd. Na 30 min wordt 10 µl 100 IU/ml recombinant hTNF (verkregen van de VIB Protein Service Facility) toegevoegd. Na 18 uur wordt de OD₆₅₅ gemeten met de iMark™ Microplate Absorbance Reader.
3.4 MICRORNA 3.4.1 ConA experiment Op tijdstip -24 uur worden plasmides met miR-511, miR-controle of PBS via hydrodynamische staartinjectie IV (intraveneus) geïnjecteerd in C57BL/6 muizen (10 mg/kg muis, opgelost in 2 ml PBS). Op tijdstip 0 uur wordt conA (360 mg/kg muis, opgelost in 200 µl PBS) IV in de staart geïnjecteerd. Daarna wordt op verschillende tijdstippen de lichaamstemperatuur rectaal gemeten om de gezondheidstoestand van de muizen op te volgen. Op tijdstip 0 uur en 8 uur worden, na verdoving met 200 µl ketamine/xylazine/PBS (1:1:8), bloedstalen genomen via cardiale punctie. Deze zullen gebruikt worden voor AST/ALT-bepalingen (verder besproken onder 3.4.1.2) Op diezelfde tijdstippen worden ook leverstalen geïsoleerd. De grootste linkerlob zal gebruikt worden voor het maken van coupes (verder besproken onder 3.4.1.3) en de mediale rechterlob voor eiwitbereiding (verder besproken onder 3.4.1.6).
3.4.1.1 Bereiding ultrapuur DNA Het verkregen plasmide DNA dat codeert voor miR-511 en miR-controle (Genecopoeia, Labomics S.A., Nivelles, België), moet eerst nog vermenigvuldigd en opgezuiverd worden om een ultrapure oplossing te bekomen die kan geïnjecteerd worden. Hiertoe wordt 7ml TB/Amp-medium geïnoculeerd met een zuivere kolonie en gedurende 6 uur schuddend geïncubeerd bij 37°C. Daarna inoculeren we 200 ml TB/Amp-medium met deze cultuur en laten overnacht schuddend incuberen bij 37°C. Na centrifugatie (5000 rpm, 10 min, 4°C) in de Sorvall RC 5C Plus wordt het medium verwijderd en de pellet terug Materiaal en methoden
23
opgelost in 10 ml oplossing 1 (50 mM dextrose, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA pH 8). Vervolgens wordt 20 ml vers bereide oplossing 2 (0,2 M NaOH, 1% SDS) toegevoegd, wordt het geheel op ijs geschud en 5 min geïncubeerd op KT. Na toevoeging van 10 ml ijskoude oplossing 3 (600 ml 5M kaliumacetaat, 115,2 ml azijnzuur, aanlengen tot 1 liter met steriel endotoxinevrij water), wordt het geheel 10 min op ijs gezet, gecentrifugeerd (8000 rpm, 15 min, 4°C) en over een filter getransfereerd naar een 50 ml tube. Hieraan wordt 25 ml isopropanol toegevoegd en het geheel wordt 10 min geïncubeerd op KT. De oplossing wordt daarna gecentrifugeerd (5000 rpm, 10 min, KT), het supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt opgelost in 3 ml gekoelde 10 mM Tris-HCl pH 8. Na toevoeging van 3 ml ijskoude 5 M LiCl oplossing wordt opnieuw gecentrifugeerd (8000 rpm, 10 min, RT) en wordt het supernatans getransfereerd naar een glazen centrifuge COREX buis. Verder, na toevoeging van 6 ml isopropanol, wordt nog eens gecentrifugeerd (5000 rpm, 10 min, RT) en het supernatans geaspireerd. Vervolgens wordt de pellet gedroogd, opgelost in 500 µl 10 mM Tris-HCl pH 8 en getransfereerd naar een microcentrifuge eppje. Na een digest met 10 µl RNase A gedurende 1 à 2 uur op 37°C en met een mengsel van 5 µl 20 mg/ml proteïnase K en 10 µl 10% SDS gedurende 1 uur op 56°C, wordt het DNA tweemaal met fenol en tweemaal met chloroform geëxtraheerd. Vervolgens wordt 3M natriumacetaat pH 5,2 toegevoegd om een 0,3 M finale concentratie te bekomen, 2 volumes ijskoude 100% ethanol toegevoegd, krachtig geschud en wordt de oplossing tenminste 1 uur geïncubeerd bij -20°C. De ijsgekoelde oplossing wordt daarna gecentrifugeerd in de microcentrifuge (13000 rpm, 10 min, RT), het supernatans afgezogen en de pellet tweemaal gewassen met 500 µl 70% ethanol. De uiteindelijke pellet wordt gedroogd, opgelost in 100 µl PBS en verdund tot de gewenste concentratie.
3.4.1.2 AST/ALT-bepalingen De bloedstalen afgenomen 0u en 8u na injectie van conA (zie 3.4.1), worden overnacht bij 4°C geïncubeerd om stolling te initiëren. Daarna wordt het supernatans gecentrifugeerd (13000 rpm, 5 min, KT) en overgebracht naar een nieuw eppje. Op deze serumstalen worden vervolgens AST/ALT-bepalingen uitgevoerd door het klinische labo van UZ Gent volgens een kinetische fotometrische bepaling. Bij leverbeschadiging komen de
Materiaal en methoden
24
leverenzymes AST (aspartaat aminotransferase) en ALT (alanine aminotransferase) vrij in het bloed en kunnen verhoogde serumconcentraties worden gedetecteerd.
3.4.1.3 Aanmaak coupes De leverstalen worden na isolatie (zie 3.4.1) gefixeerd met 4% paraformaldehydeoplossing, overnacht geïncubeerd bij KT en overgebracht in 70% ethanol. Om de leverstalen in te bedden, moeten ze eerst een run doorlopen in de Shandon Citadel 2000 Tissue Processor (programma: zie bijlage 3). De leverstalen worden vervolgens ingebed in paraffine met behulp van Histocenter 2. Hierna worden coupes van 4 µm gesneden met de Microm HM 360 Rotary Microtome en overnacht gedroogd op KT op Superfrost Plus draagglaasjes.
3.4.1.4 Hematoxyline-eosine kleuring Deze kleuring kan geautomatiseerd gebeuren in de Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer met programma 1 (zie bijlage 3). Hierin wordt eerst alle paraffine verwijderd door de stalen onder te dompelen in een bad met xyleen. Daarna gaan de stalen door verschillende oplossingen met een verminderd alcoholpercentage om uiteindelijk in gedestilleerd water terecht te komen. Er wordt nadien achtereenvolgens gekleurd met hematoxyline en eosine en dan wordt via verschillende oplossingen met stijgend alcoholpercentage terug overgegaan naar xyleen. De stalen worden vervolgens gemonteerd met Entellan® Rapid Embedding Agent for Microscopy. We bekijken de coupes onder de microscoop Olympus BX51 en nemen foto’s van de beelden met de PixeLINK Capture Camera.
3.4.1.5 TUNEL staining Vooreerst wordt de paraffine van de coupes verwijderd met programma 2 van de Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer (zie bijlage 3). Daarna brengen we de stalen in Dako REAL target retrieval solution (1/10 in PBS) in de 2100 Retriever (2,5u, 121°C). Deze stap is nodig om de proteïne crosslinks die gevormd werden bij de fixatie te breken en zo verborgen antigenen bereikbaar te maken voor het primair AL. Vervolgens worden de stalen 4 keer gewassen in TBS en gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd met 50 µl/coupe Enzyme Solution in Label Solution (1/10, Tunel TMR Red fluorescentiekit). Nadien wordt opnieuw 3 keer gewassen in TBS en wordt tegengekleurd met 70 µl/coupe Hoechst (1ng/µl in TBS)
Materiaal en methoden
25
gedurende 10 min bij KT in het donker. Na een laatste wasstap in TBS, worden de coupes gemonteerd met 1% N-propylgallaat in glycerol. Als positieve controle wordt een staal vooraf behandeld met 70 µl/coupe DNase l (3U/ml in PBS). Dit is een enzyme dat het DNA in de cellen vernietigt waardoor zeker celdood zichtbaar zal zijn. We bekijken de coupes onder de microscoop Olympus BX 61 en nemen foto’s met behulp van het CellM Imaging Station.
3.4.1.6 Eiwitbereiding en -concentratiebepaling De leverstalen voor eiwitbereiding, die geïsoleerd werden onder 3.4.1, moeten onmiddellijk overgebracht worden in vloeibare stikstof. Vervolgens worden ze gelyseerd met het detergent 0,5% Chaps in PBS en 1 tablet complete ULTRA (proteïnase inhibitor) en gedounced met de RZR 2020. Daarna laten we de stalen 30 min incuberen op ijs en wordt 30 min gecentrifugeerd (13000 rpm, 30 min, 4°C). Het supernatans, dat de te bestuderen eiwitten bevat, wordt daarna overgebracht in een nieuw eppje. Eiwitconcentraties worden bepaald met de Bio-Rad DC Protein Assay Kit volgens het bijgeleverde protocol. Nadien wordt de OD₆₅₅ bepaald met de iMark™ Microplate Absorbance Reader.
3.4.1.7 Mouse sTNFR₁ ELISA Via ELISA bepalen we de hoeveelheid msTNFR₁ die aanwezig is in 250 µg eiwit (bereid onder 3.4.1.6). Deze test wordt uitgevoerd met de R&D DuoSet ELISA Development System mouse sTNF Rl/TNFRSF1A kit volgens het bijgeleverde protocol.
3.4.1.8 Mouse IFNγ ELISA Op 250 µg eiwit (zie 3.4.1.6) wordt ook een mouse IFNγ ELISA uitgevoerd met de eBioscience Mouse IFN gamma ELISA Ready-Set-Go!® kit volgens het bijgeleverde protocol.
3.4.2 Anti-miR-511 experiment Op tijdstip 0 uur worden C57BL/6 muizen en (BxS)F₁ muizen onder hoge druk IV geïnjecteerd met 2 ml van een 100 µg/ml oplossing aan anti-miR-511, anti-miR-controle (Exiqon, Vedbaek, Denemarken) of zuiver PBS. Na 24 uur worden de muizen gedood via cervicale dislocatie, de levers geïsoleerd en op vloeibare stikstof gebracht. Vervolgens wordt
Materiaal en methoden
26
het eiwit bereid en de eiwitconcentratie bepaald zoals beschreven onder 3.4.1.6. Nadien bepalen we de hoeveelheid msTNFR₁ zoals eerder besproken onder 3.4.1.7.
3.4.3 Transgene miR-511-muizen 3.4.3.1 Restrictiedigest, gelelektroforese en opzuivering uit gel Het restrictie-enzyme Snol is een isoschizomeer van het restrictie-enzyme ApaLI en knipt bij de vector pEZX-MR04 (zie bijlage 4) in het Amp-resistentiegen en de pUC origin of replication, waardoor een lineair stuk DNA bekomen wordt met daarin de gewenste sequentie die codeert voor miR-511. Deze enzymatische knipreactie wordt uitgevoerd met de FastDigest ApaLI kit volgens het bijgeleverde protocol. Nadien wordt een deel van het digest geladen op een 1% agarosegel om te controleren of het restrictiedigest correct en volledig is verlopen. Vervolgens wordt het volledige digest geladen op een 1% agarosegel en laten we de gel lopen in 0,5% TBE bij 100 V op KT. Wanneer de fragmenten ver genoeg gemigreerd zijn, wordt de ladder samen met een deel van de gel gekleurd met ethidiumbromide om het geknipte fragment te kunnen lokaliseren met behulp van UV-licht. Hierna wordt het DNA opgezuiverd uit gel met de Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit.
3.4.3.2 Elektroporatie, selectie en transfectie Na opzuivering, zullen de fragmenten ingediend worden bij de Transgenic mice Core Facility in het DMBR waar elektroporatie, selectie en transfectie wordt uitgevoerd. ES cellen zullen worden geëlektroporeerd met 25 µg plasmide DNA en positieve klonen worden geselecteerd via puromycine resistentie en GFP-detectie (Groen fluorescent proteïne). De beste kloon zal dan gebruikt worden voor transfectie via 4n aggregatie of blast injectie.
3.5 STATISTIEK Alle data worden geanalyseerd in GraphPad met de ongepaarde t-test. De foutenbalken in de figuren duiden het gemiddelde ± SEM (Standard error of mean) aan. Statistische significantie wordt op de geïllustreerde grafieken aangeduid met
ns
(niet
significant), * (0.01 ≤ p-waarde < 0.05), ** (0.001 p-waarde < 0.01), *** (0.0001 ≤ p-waarde < 0.001) en **** (p-waarde < 0.0001).
Materiaal en methoden
27
4
RESULTATEN
4.1 mTNFR₁ NANOBODIES 4.1.1 Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c De gewenste Nb-sequenties (zie bijlage 7) worden aangekocht in de vector pHEN4, maar moeten eerst worden geherkloneerd naar de pHEN6c expressievector waardoor de Nb’s na expressie een His-tag zullen krijgen. Deze His-tag is een sequentie coderend voor 6 histidinemoleculen waarmee de Nb’s gemakkelijk opgezuiverd kunnen worden. Bovendien bevat de pHEN6c-vector vóór het Nb gen ook een Pel B signaalsequentie waardoor het Nb na expressie wordt gesecreteerd in de periplasmatische ruimte van de bacterie. In het MGI werden reeds verscheidene mNb’s geherkloneerd van pHEN4 naar pHEN6c, behalve Nb 15, 29, 81 en 62. Na PCR op de pHEN4-vector, worden de DNA-fragmenten geladen op een 2% agarosegel om te controleren of de juiste sequenties vermenigvuldigd werden. Op Figuur 4.1 en 4.2 is te zien dat de fragmenten die Nb 15, 29, 62 en 81 zouden moeten bevatten, de gewenste lengte van ongeveer 380 basenparen hebben.
Nb 15
Nb 29
Nb 81
400 bp 300 bp
400 bp
200 bp
200 bp
Figuur 4.1: DNA-gelelektroforese na opzuivering. In volgorde bevatten de laantjes respectievelijk: Nb 15 – small fragment ladder die verspringt per 100 bp – Nb 29 - gewone ladder die verspringt per 200 bp – Nb 81.
Nb 62 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
400 bp 200 bp
Figuur 4.2: DNA-gelektroforese na opzuivering. In volgorde bevatten de laantjes respectievelijk small fragment ladder die verspringt per 100 bp – 5x Nb 62 – gewone ladder die verspringt per 200 bp.
Nadien worden de Nb sequenties en de vector pHEN6c achtereenvolgens geknipt met de restrictie-enzymes Pstl en BstEll en ter controle geladen op een 1,5% agarosegel. Figuur 4.3 en 4.4 tonen aan dat het geknipte Nb 15, Nb 81 en Nb 62 allen ongeveer 320 bp lang zijn en de vector pHEN6c 3268 bp. Bij Nb 29 wordt ook een sequentie van ongeveer 320 bp verwacht, maar dit blijkt niet te kloppen. Uitleg hiervoor wordt gegeven in het hoofdstuk Discussie.
Resultaten
28
400 bp
400 bp
200 bp
200 bp
Figuur 4.3: DNA-gelelektroforese na knippen met restrictieenzymes. In volgorde bevatten de laantjes respectievelijk: Nb 15 – gewone ladder die verspringt per 200 bp – Nb 29 – gewone ladder die verspringt per 200 bp – Nb 81 – vector pHEN6c.
400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
Figuur 4.4: DNA-gelelektroforese na knippen met restrictieenzymes. In volgorde bevatten de laantjes respectievelijk: small fragment ladder die verspringt per 100 bp – 4x Nb 62.
Na ligatie in pHEN6c, elektroporatie van de plasmides in WK6-cellen en kolonie PCR op de gegroeide kolonies met universele pHEN6c primers, worden de geselecteerde klonen nog een laatste keer geladen op een 2% agarosegel om te controleren of de ligatie correct is verlopen. Figuur 4.5 toont aan dat alle WK6-cellen het 550 bp-lange plasmide met insert bevatten, behalve de cellen 15.1, 15.7, 29.4 en 62.1.1 (zie ook Discussie). Deze foutieve kolonies worden verder niet meer gebruikt. De positieve kolonies worden vervolgens opgestuurd naar VIB Genetic Service Facility voor sequentiebepaling.
15.1 15.2 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 29.1 29.2 29.3 29.4 600 bp 400 bp
300 bp 200 bp 100 bp
200 bp
81.1 81.2 81.3 81.4 81.5 81.6 81.7 81.8 29.5 29.6 29.7 29.8 300 bp 200 bp 100 bp
600 bp 400 bp 200 bp
600 bp 400 bp 200 bp
Figuur 4.5: DNA-gelelektroforese na kolonie PCR. In volgorde bevat de eerste gel respectievelijk: small fragment ladder die verspringt per 100 bp – Nb 15.1 – 15.2 – 15.3 – 15.4 – 15.5 – 15.6 – 15.7 – 15.8 – 29.1 – 29.2 – 29.3 – 29.4 – gewone ladder die verspringt per 200 bp. De tweede gel bevat respectievelijk: small fragment ladder die verspringt per 100 bp – Nb 81.1 – 81.2 – 81.3 – 81.4 81.5 – 81.6 – 81.8 – 29.5 – 29.6 – 29.7 – 29.8 – gewone ladder die verspringt per 200 bp. De derde gel bevat respectievelijk: gewone ladder die verspringt per 200 bp – Nb 62.1.1 – 62.1.2 – 62.2.1 – 62.2.2 – 62.3.1 – 62.3.2 – 62.4.1 – 62.4.2 – 62.5.1 – 62.5.2 – 62.6.1 – 62.6.2 – 62.7.1 – 62.7.2.
Resultaten
29
4.1.2 Opsporing mutaties Bij vergelijking van de sequenties geligeerd in pHEN6c met de oorspronkelijk verkregen sequenties (zie bijlage 5), werden bij Nb 15, 29 en 81 een groot aantal mutaties ontdekt. Aangezien meerdere van deze mutaties in andere AZ resulteren, kan dit een invloed hebben op de TNFR₁-binding. Hierdoor was het dus niet zinvol om deze Nb’s tot expressie te laten komen en op te zuiveren. Bij Nb 62 werd echter wel een correcte kloon gevonden. Deze sequentieanalyses worden verder besproken in het hoofdstuk Discussie. Om te achterhalen of de mutaties eventueel reeds in de startvector pHEN4 aanwezig waren, groeien we de bacteriën met de Nb’s in pHEN4 opnieuw op en zuiveren deze vector op met de Qiagen® Plasmid Purification Mini Kit. Hiervan laten we opnieuw de sequentie bepalen. Na alignering van de opgezuiverde sequenties met de theoretische sequenties van de Nb’s in de vector pHEN4 (zie bijlage 6), zien we dat Nb 29 geen mutaties bevat in de oorspronkelijke pHEN4-vector. Bij Nb 15 echter, zien we wel al mutaties in de opgezuiverde Nb gensequentie in pHEN4. De sequentiebepaling van Nb 81 was niet geslaagd en zal dus opnieuw moeten gebeuren. Deze resultaten worden verder besproken in het hoofdstuk Discussie.
4.1.3 Expressie en opzuivering Aangezien Nb 15, 29 en 81 te veel mutaties bevatten, wordt enkel Nb 62 tot expressie gebracht. Vermits in het verleden Nb 86 al correct werd geherkloneerd, maar nog niet tot expressie gebracht, zal dit Nb ook meegenomen worden voor expressie. Na opzuivering en dialyse van het periplasmatisch extract waarin de Nb’s tot expressie zijn gekomen, worden de eiwitconcentraties bepaald. Vervolgens wordt 50 µg per opgezuiverd Nb op een 15% acrylamide gel geladen en geanalyseerd via Western blot en coomassie gel. De resultaten worden weergegeven in Figuur 4.6 en 4.7 op de volgende bladzijde. Uit deze figuren blijkt dat Nb 62 de correcte grootte van ongeveer 12,98 kDa heeft, wat overeenstemt met de verwachtingen: Nb 62 is op zichzelf ongeveer 12,32 kDa lang en wanneer we ook de His-tag (6x AZ histidine) hierbij tellen, komen we aan 12,98 kDa. Op zowel coomassie gel als Western blot is bij Nb 86 echter geen duidelijk bandje zichtbaar op deze hoogte. We zien ook dat het controle Nb, Nb 19, een stuk hoger ligt. Wanneer we Resultaten
30
uitrekenen hoe groot dit controle Nb is, komen we, na toevoeging van de His-tag, aan 14,3 kDa. Op de figuren zien we echter dat dit Nb nog iets hoger lijkt te liggen. Deze resultaten worden verder besproken in het hoofdstuk Discussie. 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa
Nb 19
Ctrl Nb Nb 19
Ladder
Nb 86
Nb 62
50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa
b
15 kDa 10 kDa
Figuur 4.6: Coomassie gel. De laantjes bevatten respectievelijk Nb 62 – Nb 86 – Precision Plus protein ladder – controle Nb 19.
Figuur 4.7: Western blot. De laantjes bevatten respectievelijk controle Nb 19 – Precision Plus protein ladder – Nb 86 – Nb 62
Hierna wordt de expressie van Nb 62 en 86 nog eens opnieuw uitgevoerd. De bekomen pellets worden nu echter niet zelf opgezuiverd, maar ingediend bij de VIB Protein Service Facility zodat we Nb’s krijgen met een hogere zuiverheidsgraad. Op Figuur 4.6 zien we namelijk dat de Nb’s die we zelf opgezuiverd hebben nog veel contaminanten bevatten. Deze opzuivering gebeurt bovendien endotoxinevrij waardoor de Nb’s later kunnen worden gebruikt voor in vivo-studies.
4.1.4 Bindingsstudies 4.1.4.1 Bindingscapaciteit voor mTNFR₁ Met behulp van ELISA wordt de bindingscapaciteit van de geherkloneerde Nb’s voor mTNFR₁ bepaald. Zowel het nieuw opgezuiverde Nb 62, als de al eerder opgezuiverde Nb’s (Nb 1, 3, 7, 10, 25, 42, 64 en het dimere Nb 86-86) worden getest. We nemen ook een positieve controle (mTNFR₁ AL) en een negatieve controle (anti-β-galactosidase Nb, vanaf heden Ctrl Nb genoemd) mee. Bij de positieve controle verwachten we een zeer sterke binding en we hopen dat de bindingscapaciteit van de opgezuiverde Nb’s die van de positieve controle zal benaderen. Als negatieve controle wordt een Nb gekozen dat normaliter niet bindt op mTNFR₁, tenzij de Nb’s om een of andere reden van nature aspecifieke binding op deze receptor zouden vertonen. Figuur 4.8 toont aan dat Nb 86-86 de
Resultaten
31
hoogste affiniteit heeft voor de mTNFR₁, gevolgd door het pas opgezuiverde Nb 62. Nb 1, 3, 7, 10, 25, 42 en 64 hebben een lagere affiniteit. De negatieve controle vertoont nagenoeg geen affiniteit. Merkwaardig is dat het mTNFR AL niet goed bindt. Een verklaring hiervoor wordt gegeven in het hoofdstuk Discussie. 2 .5
Nb 1 Nb 3
O D 450 nm
2 .0
Nb 7 N b 10
1 .5
N b 25 N b 42
1 .0
N b 62 N b 64
0 .5
N b 8 6 -8 6 m TNFR 1 A L -0
-0
50%
E
E
2
4
,1
5
0
,0
C tr l N b
6
5
2
2 1 0
0 0 0
0
,0
,0
,0
0
1 5
5 2 0
,0
0
0
0
6
8
4
2 1
6
2 0
,0
,6
,3
1
4
8
0
0
0 0
0 2
0 1
5
0
0
0
0 .0
C o n c e n t r a t ie N b ( n M )
Figuur 4.8: Bindingscapaciteit muis Nanobodies voor mTNFR₁ geanalyseerd via ELISA. De 50% lijn geeft weer bij welke Nb-concentratie nog de helft van de mTNFR₁ bezet zijn.
4.1.4.2 Bindingscapaciteit voor BSA Uit eerdere studies in het MGI blijken de mNb’s wel bindende, maar geen inhiberende eigenschappen te vertonen. Ter controle van de bindingscapaciteit van de mNb’s wordt via ELISA getest of mNb’s binden op BSA in plaats van op mTNFR₁. BSA is een carriëreiwit dat aan het aangekochte coatingsantigen is toegevoegd ter stabilisatie van mTNFR₁. Het wordt bovendien ook, zoals o.a. in het vorige bindingsexperiment (zie 4.1.4.1), gebruikt om te blokkeren en ter verdunning van de detectieantilichamen. Uit Figuur 4.9 blijkt dat Nb 86-86 en 62 de beste affiniteit te hebben voor BSA, gevolgd door alle andere mNb’s. Deze opmerkelijke resultaten worden verder besproken in het hoofdstuk Discussie. 2 .5
Nb 1 Nb 3
O D 450 nm
2 .0
Nb 7 N b 25
1 .5
N b 42 1 .0
N b 62 N b 64
0 .5
N b 8 6 -8 6 50 % 2 0
2 1 ,0
0
0 0
0
,0
0
0
0
5
5 2
1 0
,0
,0 0
1
6
8 2
4 6
2 ,0 0
0
,3
,6 1
8
0 4
0 0 2
0 0 1
5
0
0
0
0
0 .0
C o n c e n t r a t ie N b ( n M )
Figuur 4.9: Bindingscapaciteit muis Nanobodies voor BSA geanalyseerd via ELISA. De 50% lijn geeft weer bij welke Nb-concentratie nog de helft van de BSA-moleculen bezet zijn.
Resultaten
32
4.1.4.3 Bindingscapaciteit voor CF mTNFR₁ Aangezien uit bovenstaande resultaten blijkt dat de affiniteit voor BSA ongeveer gelijk is aan de affiniteit voor mTNFR₁ verdund in BSA, rijst de vraag of de mNb’s ook zouden binden op mTNFR₁ wanneer geen BSA aanwezig is. Hiervoor wordt de bindings-ELISA nogmaals herhaald, maar nu met carriërvrij (CF) mTNFR₁. Als blokkerend eiwit wordt bovendien gebruik gemaakt van melkpoeder in plaats van BSA en alle verdere verdunningen gebeuren in TBST zonder BSA om alle interferentie met BSA te elimineren. De selectieve bindingseigenschappen voor mTNFR₁ worden onderzocht voor alle mNb’s met als positieve en negatieve controle respectievelijk mTNFR₁ AL en Ctrl Nb. Figuur 4.10 toont aan dat enkel mTNFR₁ AL en Nb 62 affiniteit vertonen voor mTNFR₁. Deze resultaten worden samen met de resultaten uit 4.1.4.2 besproken in het hoofdstuk Discussie. Nb 1
2 .0
Nb 3 Nb 7
O D 450 nm
1 .5
N b 10 N b 25
1 .0
N b 42 N b 62
0 .5
N b 64 0 .0
N b 8 6 -8 6 m TNFR 1 A L
2 1 00 4 2 .8 2 40 8 .5 6 5 8 .7 1 2 1 . 1 6 .1 0 4 .3 0 2 . 0 28 .0 0 64 . 0 05 .0 6 0 12 . 0 01 8 . 0 00 12 . 0 00 25 . 0 00 05 6 .0 0 1 0 00 10 2 ,0 0 2 0 2 4 0 0 0 4 2 8 0 4 8
4
0 0
1 7
0 1
5
0
0
0
- 0 .5
C tr l N b 50%
C o n c e n t r a t ie N b ( n M )
Figuur 4.10: Bindingscapaciteit muis Nanobodies voor CF mTNFR₁ geanalyseerd via ELISA. De 50% lijn geeft weer bij welke Nb-concentratie nog de helft van de CF mTNFR₁ bezet zijn.
4.2 hTNFR₁ NANOBODIES 4.2.1 Bindingscapaciteit voor hTNFR₁ Door overschakeling voor de productie van trimere humane Nb’s van E. coli naar Pichia pastoris bevatten de Nb gensequenties, na herklonering in de vector pAOXZalfaHC, vijf AZ extra. Er moet dus onderzocht worden of deze extensie invloed heeft op de affiniteit voor hTNFR₁. Extra AZ kunnen immers zorgen voor een alternatieve eiwitconfiguratie en bijgevolg verschil in bindende eigenschappen. De bindingscapaciteit van Nb Alb-70-96 en Nb Alb-70-70 wordt bepaald met behulp van een ELISA en ook de andere monomere en dimere hNb’s (Nb 70, Nb 96 en Nb 70-96) worden meegenomen ter vergelijking. Als positieve en negatieve controle worden respectievelijk anti-hTNFR₁ AL en Ctrl Nb gebruikt. Figuur 4.11 Resultaten
33
toont aan dat de dimere en trimere Nb’s de beste affiniteit hebben voor hTNFR₁ en deze affiniteit nagenoeg evenwaardig is aan die van hTNFR₁ AL. De monomere Nb’s vertonen ook relatief goede affiniteit en Ctrl Nb vertoont praktisch geen affiniteit voor hTNFR₁. We kunnen dus besluiten dat de affiniteit voor hTNFR₁ stijgt bij overschakeling van een monomere naar een dimere vorm. Aangezien de affiniteit van Nb 70-96 hoger is dan die van de trimere Nb’s, kunnen we stellen dat anti-albumine Nb, ondanks de positieve eigenschappen besproken in de inleiding, een licht negatieve invloed heeft op de affiniteit voor hTNFR₁. 2 .5
N b A lb - 7 0 - 9 6 N b A lb - 7 0 - 7 0
2 .0
O D 450 nm
N b 70 1 .5
N b 96 N b 7 0 -9 6
1 .0
C tr l N b hTNFR 1 A L
0 .5
50 %
E
1
-0
0
5
2
2
5
0 ,0
0 2
0
0
,0
,0
,0
0
0
0
2
5
5
1
6
8 1 0
0
0
,0
,0
0
1
2
4 6
2
1
,3
,6
8
0 4
2
0
0
0
0
0
0 .0
C o n c e n t r a t ie N b ( n M )
Figuur 4.11: Bindingscapaciteit humane Nanobodies voor hTNFR₁ geanalyseerd via ELISA. De 50% lijn geeft weer bij welke Nb-concentratie nog de helft van de mTNFR₁ bezet zijn.
4.2.2 Bindingscapaciteit trimere humane Nanobodies voor albumine Naast de invloed op de bindingscapaciteit voor hTNFR₁, moet ook gecontroleerd worden of de overschakeling naar Pichia pastoris bij de trimere hNb’s effect heeft op de affiniteit voor albumine. Deze kans is reëel, aangezien de extra AZ zich aan het N-terminale einde bevinden en dit is de kant waar het Nb start met anti-albumine. Via ELISA wordt de bindingscapaciteit van Nb Alb-70-70 en Nb Alb-70-96 onderzocht. Als positieve en negatieve controle worden respectievelijk anti-albumine Nb en Ctrl Nb gebruikt. 3
O D 450 nm
N b A lb - 7 0 - 9 6 N b A lb - 7 0 - 7 0
2
N b A lb C tr l N b 50 %
1
5 -0
0
E
1 ,0 2
0
,0
0
5
0
0 0
,0
0
0 ,0 0
2
2 5
5 2
1 ,0 0
1
6
8 2
4 0
,0
6
2 ,3
,6 1
8
0 4
0 0 2
0
1
0
0
0
0
C o n c e n t r a t ie N b ( n M )
Figuur 4.12: Bindingscapaciteit trimere humane Nanobodies voor albumine geanalyseerd via ELISA. De 50% lijn geeft weer bij welke Nb-concentratie nog de helft van de albuminemoleculen bezet zijn.
Resultaten
34
Figuur 4.12 toont aan dat de trimere hNb’s na overschakeling naar de gist Pichia pastoris nog steeds goede affiniteit voor albumine vertonen, vergelijkbaar met de affiniteit van een zuiver anti-albumine Nb. De negatieve controle (Ctrl Nb) vertoont, zoals verwacht, opnieuw geen affiniteit.
4.2.3 Inhibitiecapaciteit De overschakeling naar Pichia pastoris kan ook invloed hebben op de inhibitiecapaciteit van de trimere Nb’s. Met behulp van een in vitro celsysteem worden de inhiberende eigenschappen van Nb Alb-70-96 en Alb-70-70 onderzocht. Ook de andere humane monomere en dimere Nb’s (Nb 70, Nb 96 en Nb 70-96) worden meegenomen ter vergelijking. Als positieve en negatieve controle worden respectievelijk anti-hTNFR₁ AL en Ctrl Nb gebruikt. Om te kunnen vergelijken hoe sterk de Nb’s inhiberen, wordt ook een extra negatieve controle meegenomen: in een reeks van twaalf wells wordt daarom geen Nb gebracht, maar enkel hTNF. In dit experiment wordt gebruik gemaakt van HEK-2-Blue cellen, stabiel getransfecteerd met een plasmide met hierop de IFNβ (interferon β) minimale promotor, gevolgd door vijf NF-κB bindingssites en het SEAP gen (Secreted embryonic alkaline phosphatase). Deze cellen worden eerst 30 minuten met Nb’s geïncubeerd om vervolgens gedurende 18 uur met hTNF gestimuleerd te worden. Na toevoeging van hTNF ontstaat competitie tussen de Nb’s en hTNF voor binding op hTNFR₁. Wanneer Nb’s binden, kan hTNF de signalisatiepathway van hTNFR₁ niet meer activeren en wordt minder NF-κB overgeschreven. Minder NF-κB betekent minder inductie van de promotor en minder transcriptie van SEAP. Hierdoor wordt minder kleurloos SEAP substraat omgezet in blauw product en de intensiteit van deze blauwe kleur kan gemeten worden bij OD₆₅₅. Figuur 4.13 toont aan dat hTNFR₁ AL nog steeds de beste inhibitor is, gevolgd door de trimere Nb’s Nb Alb-70-96 en Nb Alb-70-70. Daarna volgt het dimere Nb 70-96 en het monomere Nb 70. Nb 96 inhibeert praktisch niet, wat ook al bleek uit eerdere studies in het MGI. Ook het Ctrl Nb en de negatieve controle vertonen geen inhibitie van hTNFR₁. Uit deze figuur blijkt dus dat de overschakeling voor productie van trimere hNb’s van de bacterie E. coli naar de gist Pichia pastoris geen invloed heeft op de inhibitiecapaciteit.
Resultaten
35
N b A lb -7 0 -9 6 N b A lb -7 0 -7 0 O D 655 nm
2
N b 70 N b 96 N b 7 0 -9 6 C trl N b
1
hTNFR 1 A L N e g . c o n tro le 50 %
E
E
-0
-0
7
7
6
1
,0
2
2 5
,1
6 2
,2 1
,5
8
E
-0 E
-0
5
4 0 0 ,0
0
0
,0
0
0
0
0
3
6
2
6 1
8 0
,0
,0 0
0
0
4 ,0
,2 0
1
3
,7
5
9
0
C o n c e n t r a t ie N b ( µ M )
Figuur 4.13: Inhibitiecapacitieit humane Nanobodies. De 50% lijn geeft de IC₅₀ (half maximaal inhiberende concentratie) weer, de Nb-concentratie waarbij 50% van de hoeveelheid hTNFR₁ geïnhibeerd wordt.
4.3 MICRORNA 4.3.1 ConA experiment Door concanavalin A (conA) in muizen te injecteren, wordt acute hepatitis geïnduceerd. Na voorbehandeling met miR-511, wordt verwacht dat deze miR zal binden op het mRNA van TNFR₁ en op die manier voor een downregulatie van TNFR₁ zal zorgen. Downregulatie van TNFR₁ betekent minder invloed van de schadelijke effecten geïnduceerd door conA en dus minder leverschade. Hieronder worden alle uitgevoerde proeven afzonderlijk besproken. Evaluatie van het conA experiment in zijn geheel en overkoepelende besluiten worden getrokken in het hoofdstuk Discussie.
4.3.1.1 Bereiding ultrapuur miR-511-DNA Het verkregen DNA dat codeert voor miR-511 en miR-controle moet eerst nog vermenigvuldigd en opgezuiverd worden om een ultrapure oplossing te bekomen die kan geïnjecteerd worden. Dat opgezuiverde DNA zal vervolgens na injectie door de muizen zelf omgezet worden in matuur en functioneel microRNA. De uiteindelijk bekomen concentraties na opzuivering worden weergegeven in Tabel 4.1. Uit deze tabel blijkt dat hoge concentraties worden bekomen na opzuivering. De 260/280 en 260/230 waarden blijken daarentegen niet optimaal. Een verklaring voor deze ongunstige waarden wordt gegeven in het hoofdstuk Discussie.
Resultaten
36
Tabel 4.1: DNA-concentraties bekomen met de Nanodrop 1000-spectrofotometer
STAAL
CONCENTRATIE (ng/µl)
VOLUME (µl)
260/280a
260/230b
miR-511
5755,24
100
1,04
1,39
miR-controle
5782,93
100
1,06
1,38
a De 260/280 ratio is een maat voor de eiwitcontaminatie en ligt preferentieel rond de 1,8. b De 260/230 ratio drukt de alcohol- en fenolcontaminatie uit en ligt bij voorkeur rond de 2-2,2.
4.3.1.2 Opvolging lichaamstemperatuur Om de gezondheidstoestand van de muizen te controleren, wordt de lichaamstemperatuur opgevolgd vanaf het moment dat conA IV wordt geïnjecteerd. Figuur 4.14 toont aan dat de muizen die voorbehandeld werden met PBS na toediening van conA de sterkste temperatuursdaling ondervinden, gevolgd door de muizen voorbehandeld met miR-controle. De muizen die een miR-511 voorbehandeling kregen, ondervinden minder schade van de conA-toediening en volgen ongeveer hetzelfde temperatuursverloop als
L ic h a a m s t e m p e r a t u u r ( ° C )
degene die geen conA toegediend kregen. 40
m iR - 5 1 1 ( n = 4 ) m iR - c t r l ( n = 4 )
38
P B S (n = 4 ) 36
m iR - 5 1 1 + c o n A ( n = 7 ) m iR - c t r l + c o n A ( n = 7 )
34
P B S + c o n A (n = 6 )
32
30 0
2
4
6
8
T ijd n a in je c t ie v a n c o n A ( u )
Figuur 4.14: Opvolging lichaamstemperatuur na IV injectie van conA. Muizen werden 24u voordien behandeld met miR-511, miR-controle of PBS (met n = aantal muizen).
4.3.1.3 AST/ALT-bepalingen AST en ALT zijn goede parameters ter bepaling van de leverschade. Uit de bloedstalen genomen 0 uur en 8 uur na injectie van conA, wordt serum bereid en nadien worden via kinetische fotometrische bepaling hierin de AST- en ALT-levels bepaald. Uit Figuur 4.15 blijkt dat 8 uur na toediening van conA de ALT-levels het sterkst verhoogd zijn in de groep muizen die voorbehandeld werden met PBS, gevolgd door deze voorbehandeld met miR-controle en miR-511. Deze verschillen zijn niet significant, maar er is wel een Resultaten
37
duidelijke trend waarneembaar. De verschillen in AST-levels zijn minder uitgesproken, maar ook hier constateren we na toediening van conA een geringere stijging in AST in de miR-511groep dan in de PBS-groep. ALT
AST
10000
8000
m iR - c tr l ( n = 4 / n = 6 ) P B S (n = 4 / n = 6 )
6000
4000
2000
0
m iR - 5 1 1 (n = 4 / n = 5 ) A S T S e r u m ( IU /L )
A L T s e r u m ( IU /L )
m iR - 5 1 1 (n = 4 / n = 5 ) 8000
m iR - c tr l ( n = 4 / n = 6 ) 6000
P B S (n = 4 / n = 6 )
4000
2000
0 0
8
T ijd (u )
0
8
T ijd (u )
Figuur 4.15: AST- en ALT bepaling in serum 0u en 8u na IV injectie van conA. Muizen werden 24u voordien behandeld met miR-511, miR-controle of PBS (met n = aantal muizen).
4.3.1.4 Mouse sTNFR₁-ELISA Na eiwitbereiding en concentratiebepaling op de leverstalen, geïsoleerd 0 uur en 8 uur na injectie van conA, wordt 250 µg levereiwit gebruikt voor de uitvoering van een msTNFR₁-ELISA. Deze test dient ter controle van het effect van miR-511 op de TNFR₁expressie. De resultaten worden weergegeven in Figuur 4.16. Uit deze figuur kunnen we geen eenduidige conclusies trekken aangezien gemerkt wordt dat de hoeveelheid TNFR₁ enerzijds verlaagd wordt door voorbehandeling met miR-511 maar anderzijds ook verhoogd wordt door de inflammatoire reactie veroorzaakt door conA. MsTNFR₁ blijkt in deze studieopzet dus niet de geschikte parameter om concrete conclusies uit te trekken.
4.3.1.5 Mouse IFNγ-ELISA Om het effect van miR-511 op de acute hepatitis veroorzaakt door conA te bestuderen, wordt op de leverstalen naast een msTNFR₁-ELISA ook een IFNγ-ELISA uitgevoerd. Hoge concentraties IFNγ worden immers geassocieerd met inflammatie en bepaalde auto-immuunziektes. Resultaten worden weergegeven in Figuur 4.16. Na injectie van conA zien we dat de IFNγ-expressie in elke groep significant is gestegen. Ook kunnen we vaststellen dat de hoeveelheid IFNγ in de groep muizen voorbehandeld met miR-511 significant lager ligt dan in de groep muizen die een PBS-voorbehandeling kregen.
Resultaten
38
IF N
sT N F R 1 2000
m iR - 5 1 1 (n = 4 / n = 7 ) m iR - c tr l ( n = 4 / n = 7 ) 400
P B S (n = 4 / n = 6 )
200
IF N le v e r ( p g /m l )
s T N F R 1 le v e r ( p g /m l )
600
*
m iR - 5 1 1 (n = 4 / n = 7 )
*
1500
m iR - c tr l ( n = 4 / n = 7 )
**
P B S (n = 4 / n = 6 )
1000
* 500
0
0 0
8
0
8
0
0
8
8
0
8
0
8
T ijd (u )
T ijd (u )
Figuur 4.16: sTNFR₁- en IFNγ bepaling in lever 0u en 8u na IV injectie van conA. Muizen werden 24u voordien behandeld met miR-511, miR-controle of PBS (met n = aantal muizen).
4.3.1.6 Immunohistochemie Via hematoxyline-eosine kleuring krijgen we een mooi beeld van de microanatomie van de lever. Bij deze kleuring worden de kernen blauwpaars gekleurd door de basische kleurstof hematoxyline en de cytoplasmatische celcomponenten helder roze door het in ethanol opgeloste, zure eosine. Op de coupes worden zo subtiele kleurverschillen zichtbaar die kunnen helpen bij detectie en interpretatie van morfologische veranderingen veroorzaakt door bepaalde ziektes. In ons geval, kan op de levercoupes ten gevolge van conA-injectie schade waargenomen worden, wat zich representeert in de aanwezigheid van necrotische zones. ConA-injectie leidt immers tot de ontwikkeling van acute hepatitis (Lafdil, Wang et al. 2009).
40 x
40 x
40 x
40 x
40 x
40 x
Figuur 4.17: Levercoupes gekleurd met hematoxyline en eosine 0u en 8u na injectie van conA. Muizen werden 24u voordien behandeld met miR-511 (n=4/ n=7), miR-controle (n=4/n=7) of PBS (n=4/n=7) (met n = aantal muizen). Necrotische zones worden met een zwarte lijn omrand en zijn beduidend lichter van kleur.
Resultaten
39
Figuur 4.17 toont een selectie van de resultaten van deze immunohistochemische kleuring. Wanneer alle coupes naast elkaar bekeken worden, wordt onderling vrij veel variatie geconstateerd, maar toch is een globale trend waarneembaar. De levers van muizen die behandeld werden met miR-511 zijn acht uur na toediening van conA relatief gezien in betere staat dan degene die behandeld werden met miR-controle of PBS. Ook wordt gezien dat injectie van vooral miR-511, maar ook miR-controle en PBS op zich al leverschade veroorzaakt wat bij onderlinge vergelijking van de 8 uur-stalen kan zorgen voor vertekening. Vervolgens wordt een TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) staining uitgevoerd, een techniek waarmee celapoptose zichtbaar wordt. Celapoptose veroorzaakt DNA-fragmentatie en de TUNEL TMR Red kit bevat het enzyme TdT dat de additie van fluorescent gelabelde dUTPs aan de vrije 3’OH uiteinden van de DNAstrengen katalyseert (Lafdil, Wang et al. 2009). Een selectie uit de resultaten van deze kleuring worden weergegeven in Figuur 4.18.
400 x
400 x
400 x
400 x
400 x
400 x
400 x
400 x
Figuur 4.18: Levercoupes gekleurd met Hoechst en TUNEL staining 0u en 8u na injectie van conA. Muizen
werden 24u voordien behandeld met miR-511 (n=4/ n=7), miR-controle (n=4/n=7) of PBS (n=4/n=7) (met n = aantal muizen). Alle celkernen worden gelabeld met een blauwe fluorescente dye, maar enkel de celkernen van dode cellen worden gelabeld met een rode fluorescente dye.
Door tegenkleuring met Hoechst worden alle celkernen blauw gekleurd. Rode fluorescentie is enkel zichtbaar in kernen van dode cellen en wordt veroorzaakt door een fluorescente kleuring met de kit. Wanneer alle coupes naast elkaar bekeken worden, is opnieuw vrij veel variatie waarneembaar, maar globaal gezien is zeker weer een trend te
Resultaten
40
zien. De levers van muizen die vooraf behandeld werden met miR-511 vertonen acht uur na toediening van conA relatief gezien immers minder rode fluorescentie dan die van muizen die vooraf behandeld werden met miR-controle of PBS.
4.3.2 Anti-miR-511 experiment Tien C57BL/6 muizen worden geïnjecteerd met anti-miR-511, tien andere met anti-miR-controle en nogmaals tien met PBS. Dit experiment wordt ook uitgevoerd met F₁-hybride muizen, (C57BL/6 x SPRET/Ei)F₁. Na lyse van de leverstalen worden de eiwitconcentraties gemeten en vervolgens wordt via ELISA de hoeveelheid msTNFR₁ bepaald in 250 µg levereiwit. De resultaten worden weergegeven in Figuur 4.19. Bij de C57BL/6 muizen zien we in de anti-miR-511 groep significant hogere msTNFR₁-levels ten opzichte van de PBS groep. Het verschil in msTNFR₁ tussen de PBS- en anti-miR-controle groep is ook significant. Bij de F₁-muizen zien we enkel een significant verschil tussen de anti-miR-controle en de anti-miR-511 groep. Merkwaardig genoeg wordt ook gezien dat de msTNFR₁-levels in de PBS groep hoger liggen dan deze in de anti-miR-controle groep Deze resultaten worden verder besproken in het hoofdstuk Discussie. C 5 7 B L /6
(B x S )F 1
200
150
150 ns ns
% T N F R 1 - e x p r e s s ie
% T N F R 1 - e x p r e s s ie
** *
100
50
0
**
ns
100
50
0 PBS
a n t i m iR - c t r l
a n t i- m iR - 5 1 1
PBS
a n t i m iR - c t r l
a n t i- m iR - 5 1 1
Figuur 4.19: Hoeveelheid msTNFR₁ in leverstalen C57BL/6 en (BxS)F₁ muizen relatief t.o.v. de PBS groep. Muizen werden 24u voordien IV geïnjecteerd met PBS, anti-miR-ctrl of anti-miR-511.
4.3.3 Transgene miR-511-muizen Voor het conA experiment werd het plasmide dat codeert voor miR-511 opgezuiverd om een ultrapure oplossing te bekomen die geïnjecteerd kan worden. Dit DNA trachten we te integreren in het muisgenoom om muizen te genereren die miR-511 verhoogd tot expressie brengen. Vooreerst moeten in de vector pEZX-MR04, de vector waarin het gen voor miR-511 vervat zit (zie bijlage 4), enkele stukken gensequentie verwijderd worden via Resultaten
41
restrictiedigest met het restrictie-enzyme SnoI. Dit enzyme knipt in het Amp-resistentiegen en de pUC origin of replication waardoor we een lineair stuk DNA bekomen met daarin de gewenste sequentie die codeert voor miR-511. In Figuur 4.20 worden de verschillende fragmenten na restrictiedigest met Snol weergegeven, geladen op een 1% agarosegel. Zowel het gewenste fragment van 3755 bp als de weggeknipte DNA sequentie van 1246 bp zijn aanwezig. Boven het fragment van 3755 bp zien we ook nog een licht bandje ter hoogte van 5001 bp wat het ongeknipte plasmide voorstelt.
mir-511 5000 bp 4000 bp 3000 bp 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp
Figuur 4.20: DNA gelelektroforese na restrictiedigest. In volgorde bevatten de laantjes respectievelijk: gewone smartladder die verspringt per 200 bp – miR-511 DNA.
Nadien wordt het volledige digest geladen op een 1% agarosegel om de DNA-fragmenten te scheiden en wordt het gewenste fragment van 3755 bp opgezuiverd uit gel. Na opzuivering van het geknipte DNA-fragment met de Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit, wordt echter maar een erg laag rendement bekomen. Aangezien voor transfectie 25 µg DNA nodig is, kan dus niet verdergegaan worden met het protocol. Om rendement na opzuivering te verhogen, wordt vervolgens overgeschakeld naar een 1% low melting agarosegel in combinatie met een opzuivering gelijkaardig aan degene die toegepast werd voor de bereiding van het ultrapure miR-511 DNA. Na analyse van de resultaten bekomen met de Nanodrop, blijkt de opbrengst echter opnieuw erg laag. Verdere bespreking hieromtrent gebeurt in het hoofdstuk Discussie.
Resultaten
42
5
DISCUSSIE
5.1 mTNFR₁ NANOBODIES 5.1.1 Herklonering Nanobody gensequenties van pHEN4 naar pHEN6c 5.1.1.1 Gelanalyse Op Figuur 4.3 (DNA-gelelektroforese na knippen met restrictie-enzymes) verwachten we bij Nb 29 een sequentie van ongeveer 320 bp, maar dit blijkt niet te kloppen. Een verklaring hiervoor kan liggen in het feit dat Nb 29 in zijn gensequentie een extra restrictiesite draagt voor het enzyme Pstl (zie bijlage 7 en 8). Hierdoor kan het zijn dat het restrictie-enzyme Pstl tweemaal knipt in de Nb gensequentie en er dus ook kortere fragmenten gegenereerd worden. In totaal zullen na restrictie met Pstl en BstEll drie fragmenten ontstaan: het gewenste fragment van ongeveer 320 bp met een Pstl en BstEll restrictiesite, een korter fragment met tweemaal een Pstl restrictiesite en een ander kort fragment met een Pstl en BstEll restrictiesite. Wanneer dit het geval zou zijn, verwachten we in de gel drie bandjes: een bandje van ongeveer 320 bp en twee kortere bandjes van ongeveer 230 en 90 bp. Het korte fragment met tweemaal een Pstl restrictiesite kan bovendien niet geligeerd worden in de pHEN6c-vector omdat deze opengeknipte vector een Pstl en een BstEll restrictiesite bezit. Op Figuur 4.3 zien we nochtans alleen het bandje van ongeveer 230 bp. Tijdens de herklonering werd hier echter geen acht op geslaan en werd bovendien bij verdere stappen geen hinder meer ondervonden van dit ‘foute’ bandje. In Figuur 4.5 (DNA-gelelektroforese na kolonie PCR) zien we namelijk dat de bandjes die Nb 29 representeren op dezelfde hoogte liggen als die van de andere Nb’s. Indien verder werd gewerkt met het ‘foute’, te kleine fragment van ongeveer 230 bp, zou hier een verschil van ongeveer 90 bp waarneembaar moeten zijn. Op Figuur 4.5 (DNA-gelelektroforese na kolonie PCR) zien we bij Nb 15 en Nb 29 enkele bandjes die een stuk lager liggen dan de andere. Dit valt te verklaren doordat de WK6-cellen een plasmide hebben opgenomen waarbij de gensequenties die uit de pHEN6cvector werden geknipt, gewoon opnieuw in de pHEN6c-vector zijn geligeerd in plaats van de gewenste insert. De lagere bandjes liggen ongeveer bij 250 bp, wat logisch is aangezien de
Discussie
43
pHEN6c-vector mét Nb een fragment van 550 bp geeft, het Nb zelf ongeveer 320 bp lang is en het weggeknipte fragment 20 bp lang is. WK6-cellen zijn ook in staat om te groeien met een plasmidevector zonder insert, maar omdat we knippen met twee verschillende restrictie-enzymes, kan de vector niet opnieuw sluiten vooraleer een fragement met complementaire restrictiesites is opgenomen.
5.1.1.2 Sequentieanalyse mTNFR₁ Nanobodies in pHEN6c Na sequentieanalyse van de opgezuiverde Nb’s, worden deze sequenties met de CLC Main Workbench gealigneerd met de sequenties van de Nb’s in de vector pHEN6c die idealiter zouden moeten bekomen zijn. In bijlage 5 kunnen we zien dat de opgezuiverde sequenties van Nb 15, 29 en 86 ten opzichte van de ware sequentie van de Nb’s in vector pHEN6c echter veel mutaties bevatten. Nb 62 daarentegen vertoont 100% alignering. Bij dit Nb zien we echter wel één klein verschil t.o.v. de theoretisch gewenste sequentie. Op plaats 113 vinden we bij de opgezuiverde sequentie van Nb 29, alsook bij alle andere Nb’s, namelijk een adenine (A) i.p.v een guanine (G). Dit valt echter te verklaren doordat de primer A6E hier gelegen is. Deze primer is functioneel wanneer op deze plaats een G staat, maar ook indien hier een A staat. De primer die wij hebben gebruikt voor PCR heeft op deze plaats een A, dus is het logisch dat na PCR-reactie de Nb’s op deze plaats steeds een A bezitten. Deze mutatie is echter niet ernstig omdat beide sequenties resulteren in hetzelfde AZ. Sommige puntmutaties bij Nb 15, 29 en 81 zijn niet ernstig, omdat ze resulteren in hetzelfde AZ. Helaas zien we ook grotere mutaties die resulteren in andere AZ. Na translatie bestaat het risico dat het geëxpresseerde Nb een andere conformatie zal hebben met bijgevolg andere bindings- en inhibitie-eigenschappen. Dit is vooral het geval wanneer de mutatie zich bevindt in de CDR-regio’s (Complementarity determining region, zie bijlage 7). Deze regio’s zijn immers belangrijk voor de antigenherkenning en moeten 100% complementair zijn met de theoretische sequentie van het Nb in pHEN6c. Buiten de CDR-regio’s willen we idealiter ook geen mutaties, want wanneer bijvoorbeeld een hydrofoob AZ verandert in een hydrofiel, kan de 3D-configuratie van het Nb-eiwit wijzigen en kan hierdoor ook de bindings- en inhibitiecapaciteit van het Nb verschillen.
Discussie
44
De reden dat bij herklonering zoveel mutaties in de sequenties ontstaan zijn, is vermoedelijk doordat bij de PCR-amplificatie gebruik werd gemaakt van het Taq polymerase. Dit enzyme werkt erg snel, maar heeft als nadeel dat het geen proofreading activiteit bezit en dus niet kan corrigeren voor mutaties die ontstaan bij de transcriptie (Shinde, Lai et al. 2003). Dit probleem kan opgelost worden door Taq polymerase te combineren met het enzyme Pfu. Dit enzyme bezit een 3´-5´exonuclease proofreading activiteit en kan dus corrigeren voor eventuele fout geïncorporeerde basenparen (Wunschel, Masselon et al. 2004). In de toekomst wordt dus beter geopteerd voor een combinatie van deze enzymen omdat op deze manier de snelheid van Taq polymerase en de juistheid van Pfu kunnen worden gecombineerd.
5.1.2 Opsporing mutaties: sequentieanalyse mTNFR₁ Nb’s in pHEN4-vector Na alignering van de opgezuiverde sequenties met de theoretische sequenties van de Nb’s in de vector pHEN4, zien we dat bij Nb 29 geen mutaties aanwezig waren in de oorspronkelijke pHEN4-vector. De mutaties zijn dus hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door het Taq polymerase dat geen proofreading activiteit bezit. Bij Nb 15 echter, zien we wel al mutaties in de opgezuiverde Nb gensequentie in de pHEN4-vector. Wanneer we deze sequentieanalyse van Nb 15 in pHEN4 (bijlage 6) vergelijken met die van Nb 15 in pHEN6c (bijlage 5), zien we dat het grootste deel van de mutaties die gezien werden in de pHEN6c-vector, al aanwezig waren in de pHEN4-vector nog voor de herklonering was gestart. Van Nb 15 zal dus een nieuwe kloon in de pHEN4-vector gebruikt moeten worden voor de herklonering. Voor de herklonering van Nb 29 en 81 (en eventueel ook voor Nb 15) zal het in de toekomst gunstiger zijn om gebruik te maken van het enzyme Pfu of een combinatie van dit enzyme en het voordien gebruikte Taq polymerase.
5.1.3 Expressie en opzuivering mTNFR₁ Nanobodies Controle Nb 19 ligt niet op de hoogte die we verwachten. Dit kan o.a. te wijten zijn aan het feit dat dit Nb geladen werd aan de rand van de gel. Op coomassie gel (Figuur 4.6) zien we immers dat de eiwitten aan de rand van de gel scheef gelopen zijn, waardoor het moeilijk is de exacte lengte van het eiwitfragment te achterhalen. Op de Western blot (Figuur 4.7) zien we dat de gel behoorlijk recht is gelopen, maar toch ligt controle Nb 19
Discussie
45
hoger dan we verwachten. Een verklaring hiervoor kan zijn dat door onregelmatigheden in de gel sommige eiwitten sneller migreren dan andere. Bij vorige eiwitanalyses in het MGI, bleek Nb 19 echter wel de correcte lengte hebben. Aangezien Nb 62 wel de correcte lengte lijkt te hebben, kunnen we de resultaten beschouwen als betrouwbaar. Vermits Nb 86 geen bandje vertoont op coomassie gel en Western blot, kan ervan uitgegaan worden dat dit Nb niet tot expressie is gekomen. Dit wordt ook gereflecteerd in de lage eiwitconcentratie die bekomen werd na opzuivering. Bovendien hadden de bacteriën met Nb 86 tijdens de expressie veel meer moeite om tot een OD van 25-30 te komen dan die met Nb 62. Een verklaring hiervoor kan zijn dat IPTG op het verkeerde tijdstip werd toegevoegd. Bacteriën worden namelijk het best gestimuleerd aan het begin van de exponentiële fase, omdat ze zich op dit moment maximaal aan het vermenigvuldigen zijn. Wanneer IPTG te vroeg wordt toegevoegd en de bacteriën zich nog in de lag fase bevinden, hebben ze zich nog onvoldoende kunnen vermenigvuldigen en zullen ze na stimulatie het Nb slechts in kleine hoeveelheden tot expressie brengen. Wanneer IPTG daarentegen te laat wordt toegevoegd, bevinden de bacteriën zich al in de stationaire fase of de afstervingsfase. In deze twee fasen wordt de groei gelimiteerd door depletie van nutriënten en opstapeling van inhiberende bacteriële producten. In de stationaire fase blijft het aantal bacteriën gelijk, omdat er evenveel sterven als er gegenereerd worden, terwijl in de afstervingsfase het aantal stervende bacteriën overheerst. Wanneer we op dit moment pas IPTG toevoegen, zal het Nb evenzeer niet goed tot expressie komen aangezien in dode bacteriën de genexpressie uitgeschakeld is. Omdat de bacteriën die Nb 86 in hun gensequentie droegen, tijdens het tweede deel van de expressie nooit de OD600 van 25 bereikt hebben, veronderstellen we dat IPTG niet op het correcte tijdstip werd toegevoegd (Zwietering, Jongenburger et al. 1990).
5.1.4 Bindingsstudies Bij Figuur 4.8 (bindingscapaciteit muis Nb’s voor mTNFR₁) zien we dat de curve van het mTNFR₁ AL beduidend lager ligt dan verwacht. In eerdere studies echter, was dit AL steeds de beste binder. Een verklaring voor deze contradictie kan zijn dat er bij het huidige experiment een fout heeft plaatsgevonden bij het verdunnen van de AL-concentratie.
Discussie
46
Uit Figuur 4.9 (bindingscapaciteit muis Nanbodies voor BSA) blijkt verrassend dat de mNb’s affiniteit hebben voor BSA. Dit verklaart mee het feit waarom bij deze Nb’s nooit inhiberende eigenschappen konden worden gedetecteerd. Tot hiertoe werd dit toegeschreven aan het feit dat Nb’s op verschillende plaatsen kunnen binden met mTNFR₁. Om te inhiberen echter, moeten ze specifiek binden op de TNF-bindingsplaats. Dit is ook de reden waarom bij de hNb’s enkel Nb 70 gevonden werd als inhibitor. Om te achterhalen of de mNb’s volstrekt geen affiniteit vertonen voor mTNFR₁, werd daarna de bindings-ELISA nogmaals herhaald, maar nu met CF mTNFR₁. Figuur 4.10 toont aan dat enkel mTNFR₁ AL en Nb 62 affiniteit vertonen voor CF mTNFR₁. Dit eerste is logisch, aangezien mTNFR₁ AL bij dit en andere experimenten wordt gebruikt als positieve controle. Aanvankelijk werd gedacht dat de affiniteit van Nb 62 waarschijnlijk te verklaren viel door aspecifieke binding, aangezien dit Nb immers nog niet werd opgezuiverd door de VIB Protein Service Facility en dus nog veel contaminanten bevatte. Bij herhaling van deze test na opzuivering van Nb 62 (Figuur 4.10), wordt echter gezien dat dit Nb nog steeds affiniteit voor CF mTNFR₁ vertoont. De reden dat we bij de bindings-ELISA van de mNb’s (Figuur 4.8) bindende eigenschappen kunnen waarnemen voor Nb 1, 3, 7, 10, 25, 42, 64 en 86-86, ligt dus louter aan het feit dat BSA bij dit experiment gebruikt wordt als carriëreiwit in het coatingsantigen mTNFR₁. De oorzaak hiervoor moeten we zoeken bij de procedure waarbij de mNb’s gegenereerd werden. Vooreerst werden hNb’s gegenereerd na immunisatie van alpaca’s met CF hTNFR₁. Verschillende ronden van panning resulteerden in de identificatie van acht verschillende hNb’s met selectieve affiniteit voor hTNFR₁. Geen van deze Nb’s vertoonde echter crossreactiviteit met mTNFR₁. Daarom werd de gegenereerde Nb-bibliotheek opnieuw gepanned, maar deze keer met mTNFR₁. Hieruit werden twaalf verschillende mNb’s geïdentificeerd met selectieve affiniteit voor mTNFR₁. Deze tweede panning gebeurde echter met mTNFR₁ verdund in BSA, waardoor het grootst deel van de geïdentificeerde mNb’s louter geselecteerd werden op basis van hun affiniteit voor BSA. Recombinante proteïnen worden meestal aangekocht als formulatie met BSA als carriëreiwit ter verhoging van de stabiliteit. In de toekomst zal dus een nieuwe panning moeten gebeuren met carriërvrij (CF) mTNFR₁. Hierbij kan nu ook de vraag rijzen hoe het mogelijk is dat de alpaca’s AL aangemaakt hebben tegen BSA, hoewel de immunisatie gebeurde met CF hTNFR₁. De alpaca’s die bij deze Discussie
47
immunisatie gebruikt werden, worden voor verschillende doeleinden aangewend en meerdere malen per jaar met diverse antigenen geïmmuniseerd. Indien bij één enkele immunisatie BSA aanwezig was in het antigen, zullen de alpaca’s AL hiertegen aangemaakt hebben. BSA is immers gekend als een eiwit waartegen gemakkelijk AL gegenereerd worden. Wanneer bij panning echter gebruik gemaakt wordt van een CF antigen, worden deze Nb’s niet gedetecteerd en veroorzaken ze bijgevolg ook geen hinder.
5.2 hTNFR₁ Nanobodies Algemeen kunnen we uit de bindings- en inhibitiestudies besluiten dat de overschakeling naar de gist Pichia pastoris voor de productie van de trimere hNb’s geen invloed heeft op de bindende en inhiberende capaciteit van de Nb’s. De beste inhibitor blijft nog steeds het trimere Nb Alb-70-96, gevolgd door Nb Alb-70-70, Nb 70-96 en Nb 70. De beste binder is daarentegen het dimere Nb 70-96, gevolgd door de trimere Nb’s Nb Alb-70-96, Nb Alb-70-70 en daarna de monomere Nb’s Nb 96 en Nb 70.
5.3 MICRORNA 5.3.1 ConA experiment Uit Tabel 4.1 blijkt dat de bekomen 260/280- en 260/230-waarden bij de bereiding van het ultrapure miR-511 DNA niet ideaal zijn. Wanneer we de DNA-concentraties echter verdunnen en opnieuw een concentratiebepaling uitvoeren, zien we deze waarden optimaliseren. Een verklaring hiervoor is dat de Nanodrop 1000-spectrofotometer bij te hoge concentraties niet meer accuraat kan meten. Een bijkomend argument hiervoor is dat na 1/1000 verdunning van deze concentraties, hogere concentraties worden gemeten dan de concentraties die we theoretisch zouden moeten bekomen, wat betekent dat de concentraties weergegeven in Tabel 4.1 vermoedelijk een onderschatting zijn. Bij opvolging van de lichaamstemperatuur (Figuur 4.14), wordt gezien dat muizen voorbehandeld met miR-511 duidelijk minder schade ondervinden na injectie van conA dan de muizen uit de PBS- en miR-controle-groep. Dit werd ook bevestigd via bepaling van de AST/ALT-levels in het serum (Figuur 4.15) en de IFNγ-expressie (Figuur 4.16). AST/ALT en IFNγ zijn goede parameters ter bepaling van de leverschade en leverinflammatie. In de
Discussie
48
miR-511-groep werden na injectie van conA zowel lagere AST/ALT- als IFNγ-levels gedetecteerd dan in de PBS- en miR-controle-groep. Gezien de beperkte omvang van de onderzochte groep, kunnen niet altijd harde conclusies getrokken worden. Desalniettemin kunnen zeker opmerkelijke trends waargenomen worden en zal statistische significantie vermoedelijk bereikt worden bij gebruik van grotere groepen. Het is niet eenvoudig om uit de uitgevoerde immunohistochemische kleuringen (Figuur 4.17 en 4.18) eenduidige conclusies te trekken. Zo zijn er eerst en vooral al interindividuele verschillen tussen de muizenlevers vóór toediening van miR en conA. Ook zien we bij sommige stalen dat hydrodynamische IV staartinjectie van vooral miR-511, maar ook miR-controle en PBS op zich al leverschade veroorzaakt. Isolatie van de levers acht uur na conA is vermoedelijk bovendien wat te vroeg om al duidelijke pathologische veranderingen te kunnen constateren, maar omwille van het stijgend sterftecijfer door injectie van een letale dosis conA, mag ook niet te lang gewacht worden. In het volgende experiment zullen grotere groepen onderzocht worden om ambiguïteit uit te sluiten. Algemeen, na totaalanalyse van het experiment, kan besloten worden dat het conA-model geschikt is voor het bestuderen van de effecten van miR-511 op TNFR₁. Wanneer miR-511 bindt op het mRNA dat codeert voor TNFR₁, wordt minder TNFR₁ tot expressie gebracht. Minder TNFR₁ betekent, na injectie van conA, minder activatie van T-cellen en macrofagen en bijgevolg minder inflammatie en leverschade.
5.3.2 Anti-miR-511 experiment Figuur 4.19 toont aan dat bij C57BL/6 muizen de hoeveelheid msTNFR₁ 24 uur na toediening van anti-miR-511 significant hoger is dan na toediening van PBS. Dit stemt overeen
met onze verwachtingen: anti-miR-511 bindt met het endogene miR-511 en
verhindert zo dat deze laatste kan binden met het mRNA voor mTNFR₁. Bijgevolg wordt translatie nu niet meer geïnhibeerd en wordt meer mTNFR₁ aangemaakt. De downregulatie van mTNFR₁ wordt teniet gedaan en upregulatie kan worden waargenomen. Idealiter, zou ook een significante stijging waarneembaar moeten zijn bij anti-miR-511 t.o.v. anti-miR-controle. Op de grafiek zien we een stijging van msTNFR₁, maar deze is statistisch is
Discussie
49
niet significant gezien de beperkte omvang van de onderzoeksgroep. Om harde conclusies te kunnen trekken, dient in de toekomst gebruik gemaakt te worden van een grotere cohort. In Figuur 4.19 zien we bij de F₁-muizen in de anti-miR-511 groep een significante stijging van msTNFR₁, ten opzichte van de anti-miR-controle groep. Dit stemt opnieuw overeen met het effect dat we verhoopt hadden. Vreemd genoeg kunnen in de groep muizen die PBS toegediend kreeg hogere concentraties aan msTNFR₁ waargenomen worden dan in de groep die anti-miR-controle kreeg. Het is erg moeilijk om hiervoor een verklaring te geven gezien diverse factoren de nauwkeurigheid van de resultaten negatief kunnen beïnvloeden: injectiefouten, foute eiwitconcentratiebepaling, fouten bij ELISA, uitschieters… In de toekomst zal dit experiment opnieuw uitgevoerd worden om ambiguïteit te vermijden.
5.3.3 Transgene miR-511-muizen Aangezien via beide opzuiveringsmethodes slechts een laag rendement werd bekomen, zal in de toekomst geopteerd moeten worden voor een andere methode vooraleer kan worden overgegaan tot transfectie. De reden voor deze lage opbrengst ligt aan het feit dat bij de opzuivering gebruik gemaakt wordt van kolommetjes, waaruit de elutie van grote DNA-fragmenten vaak moeilijk verloopt. In het bijgeleverde protocol staat als tip ter elutie van grotere fragmenten (> 1000 bp) om meerdere elutiestappen uit te voeren bij verhoogde temperatuur (70°C) en 5 min te laten incuberen. Ook is het nuttig om in plaats van TBE, TAE buffer (Tris-acetaat-EDTA) te gebruiken aangezien TAE niet interageert met het DNA, wat resulteert in een hoger rendement. Bovendien is het aangewezen om de gel zo kort mogelijk te laten lopen, bij een laag voltage. Als laatste moet de gel zo kort mogelijk blootgesteld worden aan UV-licht om de ontwikkeling van mutaties te voorkomen. Door laag rendement bij opzuivering met de Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit, werd overgeschakeld naar een low melting agarosegel, aangezien deze gel ideaal is voor opzuivering van DNA fragmenten groter dan 1000 bp en recuperatie na elektroforese. Low melting agarosegel smelt bij 65,5°C en dit ligt beneden het smeltpunt van de meeste nucleïnezuren. Via deze nieuwe opzuiveringsmethode werd echter tevens geen hoog rendement bekomen. In de toekomst zal er dus moeten gezocht worden naar een andere, meer rendabele opzuiveringstechniek vooraleer kan gestart worden met de transfectie.
Discussie
50
6 CONCLUSIES Na herklonering van de resterende mTNFR₁ Nb’s, werd gezien dat Nb 62 correct werd geherkloneerd, maar Nb 15, 29 en 81 na herklonering teveel mutaties bevatten, waardoor voor deze Nb’s niet overgegaan kon worden tot expressie en opzuivering. In de toekomst zal daarom bij PCR gebruik gemaakt worden van het enzyme Pfu dat proofreading activiteit bezit om de mutatiefrequentie te reduceren. In bindingsexperimenten werd merkwaardig genoeg ook gezien dat de meeste van de opgezuiverde mNb’s geen affiniteit voor CF mTNFR₁ bezitten. De reden dat deze mNb’s in vorige experimenten wel bindingsaffiniteit voor mTNFR₁ vertoonden, viel dus louter te wijten aan het feit dat bij deze experimenten in het coatingsantigen gebruik werd gemaakt van BSA als carriëreiwit ter stabilisatie van mTNFR₁. Na analyse van de uitgevoerde bindings- en inhibitietesten voor de opgezuiverde hTNFR₁ Nb’s, kan besloten worden dat overschakeling voor de expressie naar de gist Pichia pastoris geen invloed heeft op de bindende en inhiberende capaciteit van deze Nb’s. De beste inhibitor blijft nog steeds het trimere Nb Alb-70-96 gevolgd door Nb Alb-70-70, Nb 70-96 en Nb 70. De beste binder is daarentegen het dimere Nb 70-96 gevolgd door de trimere Nb’s Nb Alb-70-96, Nb Alb-70-70 en daarna de monomere Nb’s Nb 96 en Nb 70. Uit totaalanalyse van temperatuursverloop, AST/ALT-bepalingen, IFNγ-ELISA en immunohistochemische kleuringen, kan geconstateerd worden dat het conA-model geschikt is voor de bestudering van het beschermende effect van miR-511 bij auto-immune hepatitis. Mir-511 bindt op het mRNA dat codeert voor mTNFR₁ en zorgt bijgevolg voor verminderde expressie van deze receptor. Minder mTNFR₁ betekent minder invloed van de schadelijke inflammatoire respons en bijgevolg minder leverschade. MsTNFR₁-ELISA’s op C57BL/6 en F₁ leverstalen wezen uit dat anti-miR-511 kan gebruikt worden ter blokkering van het effect van miR-511. Deze anti-miR kan dus in de toekomst gebruikt worden om het werkingsmechanisme van miR-511 verder te bestuderen. Aangezien na restrictie en opzuivering van het DNA coderend voor miR-511 een erg laag rendement werd bekomen, zal in de toekomst moeten gezocht worden naar een betere opzuiveringstechniek vooraleer kan overgegaan worden tot transfectie van ES cellen.
Conclusies
51
7
LITERATUURLIJST
Akassoglou, K., J. Bauer, G. Kassiotis, M. Pasparakis, H. Lassmann, G. Kollias and L. Probert (1998). "Oligodendrocyte apoptosis and primary demyelination induced by local TNF/p55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: models for multiple sclerosis with primary oligodendrogliopathy." Am J Pathol 153(3): 801-813. Ambros, V. (2004). "The functions of animal microRNAs." Nature 431(7006): 350-355. Arbabi Ghahroudi, M., A. Desmyter, L. Wyns, R. Hamers and S. Muyldermans (1997). "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett 414(3): 521-526. Bader, A. G., D. Brown and M. Winkler (2010). "The Promise of MicroRNA Replacement Therapy." Cancer Research 70(18): 7027-7030. Baud, V. and M. Karin (2001). "Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives." Trends Cell Biol 11(9): 372-377. Beg, A. A. and D. Baltimore (1996). "An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alphainduced cell death." Science 274(5288): 782-784. Black, R. A., C. T. Rauch, C. J. Kozlosky, J. J. Peschon, J. L. Slack, M. F. Wolfson, B. J. Castner, K. L. Stocking, P. Reddy, S. Srinivasan, N. Nelson, N. Boiani, K. A. Schooley, M. Gerhart, R. Davis, J. N. Fitzner, R. S. Johnson, R. J. Paxton, C. J. March and D. P. Cerretti (1997). "A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells." Nature 385(6618): 729-733. Bongartz, T., A. J. Sutton, M. J. Sweeting, I. Buchan, E. L. Matteson and V. Montori (2006). "AntiTNF antibody therapy in rheumatoid arthritis and the risk of serious infections and malignancies: systematic review and meta-analysis of rare harmful effects in randomized controlled trials." JAMA 295(19): 2275-2285. Bradley, J. R. (2008). "TNF-mediated inflammatory disease." J Pathol 214(2): 149-160. Cabal-Hierro, L. and P. S. Lazo (2012). "Signal transduction by tumor necrosis factor receptors." Cell Signal 24(6): 1297-1305. Cao, J., F. Meng, X. Gao, H. Dong and W. Yao (2011). "Expression and purification of a natural Nterminal pre-ligand assembly domain of tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1 PLAD) and preliminary activity determination." Protein J 30(4): 281-289. Carswell, E. A., L. J. Old, R. L. Kassel, S. Green, N. Fiore and B. Williamson (1975). "An endotoxininduced serum factor that causes necrosis of tumors." Proc Natl Acad Sci U S A 72(9): 36663670. Chen, G. and D. V. Goeddel (2002). "TNF-R1 signaling: a beautiful pathway." Science 296(5573): 1634-1635. Coppieters, K., T. Dreier, K. Silence, H. de Haard, M. Lauwereys, P. Casteels, E. Beirnaert, H. Jonckheere, C. Van de Wiele, L. Staelens, J. Hostens, H. Revets, E. Remaut, D. Elewaut and P. Rottiers (2006). "Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis." Arthritis Rheum 54(6): 1856-1866. Cortez-Retamozo, V., M. Lauwereys, G. Hassanzadeh Gh, M. Gobert, K. Conrath, S. Muyldermans, P. De Baetselier and H. Revets (2002). "Efficient tumor targeting by singledomain antibody fragments of camels." Int J Cancer 98(3): 456-462. de Gannes, G. C., M. Ghoreishi, J. Pope, A. Russell, D. Bell, S. Adams, K. Shojania, M. Martinka and J. P. Dutz (2007). "Psoriasis and pustular dermatitis triggered by TNF-{alpha} inhibitors in patients with rheumatologic conditions." Arch Dermatol 143(2): 223-231. Literatuurlijst
52
Dejager, L., C. Libert and X. Montagutelli (2009). "Thirty years of Mus spretus: a promising future." Trends in Genetics 25(5): 234-241. Dennis, M. S., M. Zhang, Y. G. Meng, M. Kadkhodayan, D. Kirchhofer, D. Combs and L. A. Damico (2002). "Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins." J Biol Chem 277(38): 35035-35043. Elmen, J., H. Y. Zhang, B. Zuber, K. Ljungberg, B. Wahren, C. Wahlestedt and Z. Liang (2004). "Locked nucleic acid containing antisense oligonucleotides enhance inhibition of HIV-1 genome dimerization and inhibit virus replication." FEBS Lett 578(3): 285-290. Els Conrath, K., M. Lauwereys, L. Wyns and S. Muyldermans (2001). "Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs." J Biol Chem 276(10): 7346-7350. Elsadek, B. and F. Kratz (2012). "Impact of albumin on drug delivery--new applications on the horizon." J Control Release 157(1): 4-28. Fang, X., R. Wang, J. Ma, Y. Ding, W. Shang and Z. Sun (2012). "Ameliorated ConA-induced hepatitis in the absence of PKC-theta." PLoS One 7(2): e31174. Feng, R. N., G. Y. Liu, C. Wang, C. H. Sun and Y. Li (2012). "TNF polymorphisms and cancer." Asian Pac J Cancer Prev 13(6): 3007. Gardam, M. A., E. C. Keystone, R. Menzies, S. Manners, E. Skamene, R. Long and D. C. Vinh (2003). "Anti-tumour necrosis factor agents and tuberculosis risk: mechanisms of action and clinical management." Lancet Infect Dis 3(3): 148-155. Grell, M., E. Douni, H. Wajant, M. Lohden, M. Clauss, B. Maxeiner, S. Georgopoulos, W. Lesslauer, G. Kollias, K. Pfizenmaier and P. Scheurich (1995). "The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor." Cell 83(5): 793-802. Harmsen, M. M. and H. J. De Haard (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments." Appl Microbiol Biotechnol 77(1): 13-22. Idriss, H. T. and J. H. Naismith (2000). "TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structurefunction relationship(s)." Microsc Res Tech 50(3): 184-195. Jarrett, S. J., G. Cunnane, P. G. Conaghan, S. J. Bingham, M. H. Buch, M. A. Quinn and P. Emery (2003). "Anti-tumor necrosis factor-alpha therapy-induced vasculitis: case series." J Rheumatol 30(10): 2287-2291. Kassiotis, G. and G. Kollias (2001). "Uncoupling the proinflammatory from the immunosuppressive properties of tumor necrosis factor (TNF) at the p55 TNF receptor level: implications for pathogenesis and therapy of autoimmune demyelination." J Exp Med 193(4): 427-434. Keffer, J., L. Probert, H. Cazlaris, S. Georgopoulos, E. Kaslaris, D. Kioussis and G. Kollias (1991). "Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis." EMBO J 10(13): 4025-4031. Kloosterman, W. P., E. Wienholds, E. de Bruijn, S. Kauppinen and R. H. Plasterk (2006). "In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-modified oligonucleotide probes." Nat Methods 3(1): 27-29. Kollias, G. (2005). "TNF pathophysiology in murine models of chronic inflammation and autoimmunity." Semin Arthritis Rheum 34(5 Suppl1): 3-6. Kollias, G., D. Kontoyiannis, E. Douni and G. Kassiotis (2002). "The role of TNF/TNFR in organspecific and systemic autoimmunity: implications for the design of optimized 'anti-TNF' therapies." Curr Dir Autoimmun 5: 30-50.
Literatuurlijst
53
Kontoyiannis, D., M. Pasparakis, T. T. Pizarro, F. Cominelli and G. Kollias (1999). "Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies." Immunity 10(3): 387-398. Lafdil, F., H. Wang, O. Park, W. Zhang, Y. Moritoki, S. Yin, X. Y. Fu, M. E. Gershwin, Z. X. Lian and B. Gao (2009). "Myeloid STAT3 inhibits T cell-mediated hepatitis by regulating T helper 1 cytokine and interleukin-17 production." Gastroenterology 137(6): 2125-2135 e2121-2122. Le Hir, M., H. Bluethmann, M. H. Kosco-Vilbois, M. Muller, F. di Padova, M. Moore, B. Ryffel and H. P. Eugster (1996). "Differentiation of follicular dendritic cells and full antibody responses require tumor necrosis factor receptor-1 signaling." J Exp Med 183(5): 2367-2372. Leibovich, S. J., P. J. Polverini, H. M. Shepard, D. M. Wiseman, V. Shively and N. Nuseir (1987). "Macrophage-induced angiogenesis is mediated by tumour necrosis factor-alpha." Nature 329(6140): 630-632. Liang, S., B. Wang, L. Pan, Y. Ye, M. He, S. Han, S. Zheng, X. Wang and Y. Lin (2012). "Comprehensive structural annotation of Pichia pastoris transcriptome and the response to various carbon sources using deep paired-end RNA sequencing." BMC Genomics 13: 738. Liu, F., Y. Song and D. Liu (1999). "Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA." Gene Ther 6(7): 1258-1266. Malottki, K., P. Barton, A. Tsourapas, A. O. Uthman, Z. Liu, K. Routh, M. Connock, P. Jobanputra, D. Moore, A. Fry-Smith and Y. F. Chen (2011). "Adalimumab, etanercept, infliximab, rituximab and abatacept for the treatment of rheumatoid arthritis after the failure of a tumour necrosis factor inhibitor: a systematic review and economic evaluation." Health Technol Assess 15(14): 1-278. Mohan, N., E. T. Edwards, T. R. Cupps, P. J. Oliverio, G. Sandberg, H. Crayton, J. R. Richert and J. N. Siegel (2001). "Demyelination occurring during anti-tumor necrosis factor alpha therapy for inflammatory arthritides." Arthritis Rheum 44(12): 2862-2869. Niitsu, Y., N. Watanabe, H. Sone, H. Neda, N. Yamauchi, Y. Ohtsuka and H. Umeno (1987). "[Anti-tumor effect and mechanism of action of the tumor necrosis factor (TNF)]." Gan To Kagaku Ryoho 14(6 Pt 2): 2089-2097. Osada, T., A. Toyoda, S. Moisyadi, H. Akutsu, M. Hattori, Y. Sakaki and R. Yanagimachi (2005). "Production of inbred and hybrid transgenic mice carrying large (> 200 kb) foreign DNA fragments by intracytoplasmic sperm injection." Mol Reprod Dev 72(3): 329-335. Robertshaw, H. J. and F. M. Brennan (2005). "Release of tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) by TNF alpha cleaving enzyme (TACE) in response to septic stimuli in vitro." British Journal of Anaesthesia 94(2): 222-228. Romanatto, T., M. Cesquini, M. E. Amaral, E. A. Roman, J. C. Moraes, M. A. Torsoni, A. P. CruzNeto and L. A. Velloso (2007). "TNF-alpha acts in the hypothalamus inhibiting food intake and increasing the respiratory quotient--effects on leptin and insulin signaling pathways." Peptides 28(5): 1050-1058. Rothe, J., W. Lesslauer, H. Lotscher, Y. Lang, P. Koebel, F. Kontgen, A. Althage, R. Zinkernagel, M. Steinmetz and H. Bluethmann (1993). "Mice lacking the tumour necrosis factor receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes." Nature 364(6440): 798-802. Schwabe, R. F. and D. A. Brenner (2006). "Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways." Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290(4): G583-589. Shakoor, N., M. Michalska, C. A. Harris and J. A. Block (2002). "Drug-induced systemic lupus erythematosus associated with etanercept therapy." Lancet 359(9306): 579-580.
Literatuurlijst
54
Shinde, D., Y. Lai, F. Sun and N. Arnheim (2003). "Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis: (CA/GT)n and (A/T)n microsatellites." Nucleic Acids Res 31(3): 974-980. Sprott, R. L. (1975). "Behavioral characteristics of C57BL/6J. DBA/2J, and B6D2F1 mice which are potentially useful for gerontological research." Exp Aging Res 1(2): 313-323. Staelens, J., B. Wielockx, L. Puimege, F. Van Roy, J. L. Guenet and C. Libert (2002). "Hyporesponsiveness of SPRET/Ei mice to lethal shock induced by tumor necrosis factor and implications for a TNF-based antitumor therapy." Proc Natl Acad Sci U S A 99(14): 93409345. Stenvang, J., A. Petri, M. Lindow, S. Obad and S. Kauppinen (2012). "Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides." Silence 3(1): 1. Summers, S. A., J. Chan, P. Y. Gan, L. Dewage, Y. Nozaki, O. M. Steinmetz, D. J. Nikolic-Paterson, A. R. Kitching and S. R. Holdsworth (2011). "Mast cells mediate acute kidney injury through the production of TNF." J Am Soc Nephrol 22(12): 2226-2236. Swaroop, J. J., D. Rajarajeswari and J. N. Naidu (2012). "Association of TNF-alpha with insulin resistance in type 2 diabetes mellitus." Indian J Med Res 135: 127-130. Tack, C. J., F. S. Kleijwegt, P. L. Van Riel and B. O. Roep (2009). "Development of type 1 diabetes in a patient treated with anti-TNF-alpha therapy for active rheumatoid arthritis." Diabetologia 52(7): 1442-1444. Tartaglia, L. A. and D. V. Goeddel (1992). "Two TNF receptors." Immunol Today 13(5): 151-153. Uysal, K. T., S. M. Wiesbrock, M. W. Marino and G. S. Hotamisligil (1997). "Protection from obesity-induced insulin resistance in mice lacking TNF-alpha function." Nature 389(6651): 610-614. Van Bockstaele, F., J. B. Holz and H. Revets (2009). "The development of nanobodies for therapeutic applications." Curr Opin Investig Drugs 10(11): 1212-1224. Van Hauwermeiren, F., M. Armaka, N. Karagianni, K. Kranidioti, R. E. Vandenbroucke, S. Loges, M. Van Roy, J. Staelens, L. Puimege, A. Palagani, W. V. Berghe, P. Victoratos, P. Carmeliet, C. Libert and G. Kollias (2013). "Safe TNF-based antitumor therapy following p55TNFR reduction in intestinal epithelium." J Clin Invest. Van Hauwermeiren, F., R. E. Vandenbroucke and C. Libert (2011). "Treatment of TNF mediated diseases by selective inhibition of soluble TNF or TNFR1." Cytokine Growth Factor Rev 22(56): 311-319. Vincke, C. and S. Muyldermans (2012). "Introduction to heavy chain antibodies and derived Nanobodies." Methods Mol Biol 911: 15-26. Wohlleber, D., H. Kashkar, K. Gartner, M. K. Frings, M. Odenthal, S. Hegenbarth, C. Borner, B. Arnold, G. Hammerling, B. Nieswandt, N. van Rooijen, A. Limmer, K. Cederbrant, M. Heikenwalder, M. Pasparakis, U. Protzer, H. P. Dienes, C. Kurts, M. Kronke and P. A. Knolle (2012). "TNF-induced target cell killing by CTL activated through cross-presentation." Cell Rep 2(3): 478-487. Wolf, D., R. Hallmann, G. Sass, M. Sixt, S. Kusters, B. Fregien, C. Trautwein and G. Tiegs (2001). "TNF-alpha-induced expression of adhesion molecules in the liver is under the control of TNFR1--relevance for concanavalin A-induced hepatitis." J Immunol 166(2): 1300-1307. Wunder, A., U. Muller-Ladner, E. H. Stelzer, J. Funk, E. Neumann, G. Stehle, T. Pap, H. Sinn, S. Gay and C. Fiehn (2003). "Albumin-based drug delivery as novel therapeutic approach for rheumatoid arthritis." J Immunol 170(9): 4793-4801.
Literatuurlijst
55
Wunschel, D. S., C. Masselon, B. Feng and R. D. Smith (2004). "Proofreading activity of Pfu thermostable DNA polymerase on a 6-O-methylguanine-containing template monitored by ESI-FTICR mass spectrometry." Chembiochem 5(7): 1012-1015. Zwietering, M. H., I. Jongenburger, F. M. Rombouts and K. van 't Riet (1990). "Modeling of the bacterial growth curve." Appl Environ Microbiol 56(6): 1875-1881.
Literatuurlijst
56
8
BIJLAGES
8.1 BIJLAGE 1: Materiaal 8.1.1 Producten - 1% N-propylgallaat in glycerol - Acrylamide (40%) - Agarose - Ampicilline - APS - Azijnzuur - Bacto Agar - Bacto Yeast extract - Bacto Tryptone - βMe - Boorzuur - Broomfenolblauw - BSA - BstEll - Chaps - Chloroform - Concanavalin A - Complete ULTRA - Coomassie R250 - Dako REAL target retrieval solution - Dextrose - DMEM - DNase l - dXTPs - EDTA - Eosine - Entellan Rapid Embedding Agent - Ethanol - Ethidiumbromide - Fenol - Foetaal kalfsserum - Glucose - Glycerol
Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Biosolve, Valkenswaard, Nederland Invitrogen, Merelbeke, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België VWR, Leuven, België Invitrogen, Merelbeke, België Invitrogen, Merelbeke, België Invitrogen, Merelbeke, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België VWR, Leuven, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Promega, Leiden, Nederland Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Invitrogen, Merelbeke, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Roche diagnostics, Mannheim, Duitsland VWR, Leuven, België Dako Belgium, Heverlee, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Invitrogen, Merelbeke, België Invitrogen, Merelbeke, België Promega, Leiden, Nederland VWR, Leuven, België VWR, Leuven, België Merck, Darmstadt, Duitsland Merck, Darmstadt, Duitsland Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Invitrogen, Merelbeke, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Merck, Darmstadt, Duitsland Biosolve, Valkenswaard, Nederland
Bijlage
1
- Glycine Biosolve, Valkenswaard, Nederland - H₂SO₄ Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - HEK-Blue Detection Medium Invivogen, Toulouse, Frankrijk - Hematoxyline Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - Hoechst Invitrogen, Merelbeke, België - IPTG Invitrogen, Merelbeke, België - Isopropanol VWR, Leuven, België - Kaliumacetaat VWR, Leuven, België - KCl Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - Ketamine/xylazine/PBS De Pannemaeker NV, Gent, België - KH₂PO₄ VWR, Leuven, België - K₂HPO₄.3H₂O VWR, Leuven, België - LiCl Merck, Darmstadt, Duitsland - L-glutamine Invitrogen, Merelbeke, België - Melkpoeder Nestlé Belgilux NV, Brussel, België - Methanol Merck, Darmstadt, Duitsland - MgCl₂ VWR, Leuven, België - MgSO₄ Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - NaCl VWR, Leuven, België - NaOH VWR, Leuven, België - Natriumacetaat VWR, Leuven, België - Natriumpyruvaat Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - Nucleasevrij H₂O Invitrogen, Merelbeke, België - Penicilline/streptomycine Invitrogen, Merelbeke, België - Paraformaldehyde Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - Puromycine Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België - PBS Invitrogen, Merelbeke, België - Precision Plus Protein™ All Blue Standards Ladder Bio-rad Laboratories, Hercules, VS - Primer A6E en 38 Invitrogen, Merelbeke, België - Proteïnase K Invitrogen, Merelbeke, België - Pstl Promega, Leiden, Nederland - RNase A Qiagen, Hilden, Duitsland - SDS Biosolve, Valkenswaard, Nederland - Smartladder (Small Fragment en gewone) Eurogentec SA, Seraing, België - Sucrose VWR, Leuven, België - SYBR® safe Invitrogen, Merelbeke, België - T4 ligase Promega, Leiden, Nederland - Taq polymerase (+ buffer + MgCl₂) Invitrogen, Merelbeke, België - TEMED GE Healthcare, Diegem, België - TMB Substrate Reagent set BD, Le Pont de Claix, Frankrijk
Bijlage
2
- Tris - Trypaanblauw - Trypsine - Tween 20 - Universal Forward & Reverse primer - Xyleen - Xyleencyanol
Biosolve, Valkenswaard, Nederland Invitrogen, Merelbeke, België Invitrogen, Merelbeke, België Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België Invitrogen, Merelbeke, België VWR, Leuven, België Gurr’s, Londen, Engeland
8.1.2 Instrumenten - 2100 Retriever
ProteoGenix, Schiltigheim, Frankrijk
- CellM Imaging Station - Gene Pulser ll - Histocenter 2 - iMark Microplate Absorbance Reader - Microm HM 360 Rotary Microtome - Nanodrop 100 Spectrophotometer - Olympus BX51 - Olympus BX61 - Odyssey Infrared Imaging System - PixeLINK Capture Camera - PTC-2000 Thermo Cycler - RunOne Electrophoresis Unit - RZR 2020 - Semi dry blotter (10cm x 10cm) - Shandon Citadel 2000 Tissue Processor - Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer - Sorvall RC 5C Plus - ULTima 16-si Pro
Olympus Belgium NV, Aartselaar, België Bio-rad Laboratories, Hercules, VS Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland Bio-rad Laboratories, Hercules, VS Hyland Scientific, Stanwood, VS Isogen Life Science, De Meern, Nederland Olympus Belgium NV, Aarstselaar, België Olympus Belgium NV, Aartselaar, België Li-Cor Biosciences, Lincoln, VS PixeLINK, Ottawa, Canada MJ Research, Ramsey, VS Embi Tec, San Diego, VS Heidolph, Schwabach, Duitsland Biostep, Jahnsdorf, Duitsland Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland Isogen Life Science, De Meern, Nederland
8.1.3 Benodigdheden - Corning® 96 well Half Area Microplate
Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België
- Protran nitrocellulose transfer membraan (0,45 µm) - Superfrost+ draagglaasjes
Perkin Elmer, Boston, VS Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland
Bijlage
3
8.1.4 Kits - Bio-rad DC Protein Assay kit
Bio-Rad Laboratories, Hercules, VS
- DuoSet ELISA Development System mouse sTNF Rl/TNFRSF1A kit R&D Systems, Minneapolis, VS - FastDigest ApaLI Thermo Scientifi, Braunschweig, Duitsland - His GraviTrap kit GE Healthcare, Diegem, België - Mini en Midi Plasmid Purification kit Qiagen, Hilden, Duitsland - Mini-PROTEAN® Tetra Cell kit Bio-rad Laboratories, Hercules, VS - Mouse IFN gamma ELISA Ready-Set-Go!® kit eBioscience, San Diego, VS - Nucleospin Gel & PCR Clean-up kit Machenery-Nagel, Düren, Duitsland - Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 7K MWCO Thermo Scientific, Braunschweig, Duitsland - Tunel TMR Red kit Roche diagnostics, Mannheim, Duitsland
8.2 BIJLAGE 2: Gebruikte primersequenties Tabel 1.1 Gebruikte primersequenties
NAAM PRIMER
PRIMERSEQUENTIE
A6E
GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA GGA GG
38
GGA CTA GTG CGG CCG CTG GAG ACG GTG ACC TGG GT
UNIVERSAL FORWARD
CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
UNIVERSAL REVERSE
TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA
8.3 BIJLAGE 3: Protocols 8.3.1 DNA agarose gelektroforese Voor snelle scheiding en identificatie van kleine DNA-fragmenten (0,2-10 kb), wordt gebruik gemaakt van een 1-2% agarosegel. Deze gel wordt bereid met agarose in 0,5x TBE buffer (5x: 89 mM Tris base, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA). SYBR® safe (1:10000) wordt toegevoegd voor visualisatie. De gel wordt geladen met een mix van 2 µl staal, 2 µl 5x ladingsbuffer (20 g glycerol, 2 ml TrisHCl, 20 ml EDTA, 40 mg broomfenolblauw, 40 mg xyleencyanol, aangelengd tot 200 ml met gedestilleerd water) en 8 µl gedestilleerd water.
Bijlage
4
Op de gel wordt ook een Smartladder (Small Fragment of gewone ladder) geladen om de grootte van de fragmenten te kunnen aanduiden. Vervolgens laten we de gel lopen in de RunOne Electrophoresis Unit in 0,5x TBE buffer bij 100 volt. De visualisatie gebeurt met de ULTima 16-si Pro.
8.3.2 15% Acrylamide gel 1) Scheidingsgel Component
Hoeveelheid
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
15 ml
Acrylamide – 40%
22,5 ml
H₂O
21,5 ml
10% SDS
0,6 ml
Component
Hoeveelheid
0,5 M Tris-HCl pH 6,8
5 ml
Acrylamide – 40%
3 ml
H₂O
13 ml
10% SDS
0,2 ml
2) Concentratiegel
Vooreerst wordt de mix voor de scheidingsgel bereid volgens bovenstaande specificaties. Na toevoeging van 100 µl 10% ammoniumpersulfaat (APS) en 10 µl tetramethyleendiamine (TEMED) per 10 ml mix, wordt deze gel gegoten tussen twee eiwitvrije glaasjes die gemonteerd worden in een cassette uit de Mini-PROTEAN® Tetra Cell kit. Boven de scheidingsgel wordt vervolgens een laagje isopropanol gegoten om ervoor te zorgen dat geen lucht aan de gel kan en het bovenvlak van de gel mooi horizontaal blijft. Na stolling van de scheidingsgel, wordt het isopropanol afgegoten en wordt het geloppervlak 3 keer gespoeld met gedestilleerd water. Nadien wordt de resterende vloeistof verwijderd met een filterpapiertje en wordt boven de scheidingsgel de concentratiegel gegoten na toevoeging van 100 µl APS en 10 µl TEMED per 5 ml mix.
Bijlage
5
8.3.3 Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer PROGRAMMA 1
PROGRAMMA 2
1) Xyleen (5’)
1) Xyleen (5’)
2) Xyleen (5’)
2) Xyleen (5’)
3) Xyleen (3’)
3) Xyleen (2’)
4) EtOH (1’)
4) 100% EtOH (2’)
5) 100% EtOH (1’)
5) 100% EtOH (2’)
6) 90% EtOH (1’)
6) 90% EtOH (2’)
7) 90% EtOH (1’)
7) 90% EtOH (2’)
8) 70% EtOH (1’)
8) 70% EtOH (2’)
9) Gedestilleerd water (1’)
9) Gedestilleerd water (PASS)
10) Hematoxyline (4’)
10) Hematoxyline (PASS)
11) Hematoxyline (4’)
11) Hematoxyline (PASS)
12) Lopend kraantjeswater (1’)
12) Lopend kraantjeswater (2’)
13) H₂O + HCl (5’’)
13) END
14) Lopend kraantjeswater (3’30’’) 15) Eosine 1% in gedestilleerd water (3’) 16) Lopend kraantjeswater (10’’) 17) Gedestilleerd water (10’’) 18) 70% EtOH (50’’) 19) 90% EtOH (50’’) 20) 90% EtOH (50’’) 21) 100% EtOH (50’’) 22) 100% EtOH (50’’) 23) Xyleen (2’) 24) Xyleen (2’)
Bijlage
6
8.3.4 Shandon Citadel Tissue Processor (2000) 1) 70% EtOH (2u)
7) – (PASS)
2) Xyleen (1u)
8) 90% EtOH (2u)
3) Xyleen (1,5u)
9) 100% EtOH (1u)
4) Xyleen (1,5u)
10) 100% EtOH (2u)
5) Paraffine (2u)
11) 100% EtOH (2u)
6) Paraffine (3u)
12) – (PASS)
8.4 BIJLAGE 4: pEZX-MR04-vector met miR-511 gensequentie
Figuur 8.1: pEZX-MR04-vector met miR-511 gensequentie, aangemaakt in het computerprogramma CLC (met pUC ori = pUC origin of replication, CMV = Cytomegalovirus promoter, eGFP = enhanced Green Fluorescent Protein, MR04 forward = primer, miR-511 = miR-511 gen, MR04 reversed = primer, PURO = Puromycine resistentiegen, SV40 = Simian Virus 40 promoter, Amp = Ampiciline resistentiegen, Snol & Bful & Aagl = restrictie-enzymes).
Bijlage
7
8.5 BIJLAGE 5: Sequentieanalyse Nanobodies in pHEN6c na herklonering 8.5.1 Nanobody 15
Figuur 8.2: Sequentieanalyse Nb 15 in pHEN6c met Universal forward en Universal reverse primers na herklonering. Nb 15.5 en Nb 15.2 tonen de analyse van 2 positieve kolonies na sequenering en mTNFR1 Nb 15 toont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 15 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine).
Bijlage
8
8.5.2 Nanobody 29
Figuur 8.3: Sequentieanalyse Nb 29 in pHEN6c met Universal forward en Universal reverse primers na herklonering. Nb 29.5 en Nb 29.6 tonen de analyse van 2 positieve kolonies na sequenering en mTNFR1 Nb 29 toont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 29 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine).
Bijlage
9
8.5.3 Nanobody 81
Figuur 8.4: Sequentieanalyse Nb 81 in pHEN6c met Universal forward en Universal reverse primers na herklonering. Nb 81.2 en Nb 81.3 tonen de analyse van 2 positieve kolonies na sequenering en mTNFR1 Nb 81 toont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 81 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine).
Bijlage
10
8.5.4 Nanobody 62
Figuur 8.5: Sequentieanalyse Nb 62 in pHEN6c met Universal forward en Universal reverse primers na herklonering. Nb 62.2.2 toont de analyse van een positieve kolonie na sequenering en mTNFR1 Nb 62 toont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 62 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine).
Bijlage
11
8.6 BIJLAGE 6: Sequentieanalyse Nanobodies in pHEN4: opsporing mutaties 8.6.1 Nanobody 15
Figuur 8.6: Sequentieanalyse Nb 15 in pHEN4 met primers A6E en 38. Nb 15 A6E toont de analyse na sequenering en mTNFR1 Nb 15 toont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 15 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine)
Bijlage
12
8.6.2 Nanobody 29
Figuur 8.7: Sequentieanalyse Nb 29 in pHEN4 met primers A6E en 38. Nb 29 pHEN4 - A6E toont de analyse na sequenering en mTNFR1 Nb 29 vertoont de theoretisch correcte gensequentie van Nb 29 die gaat van CAGGT tot TCTCC (met A = adenine, G = guanine, C = cytosine, T = thymine)
Bijlage
13
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
* 80 * 60 * 40 * 20 * CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAACCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTAGTGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGATA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTTTGGACGCACCTTCAGTACGTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTTTGGACGCACCTTCAGTACGTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGTGGCGCCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCCGCCTCTGGACGCACCTTCTTTATCTA
* 180 * * 120 160 * * 100 140 TGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGCTGGTTGCAGCTATTACCTGGAGTGGAGGTAGTACATATTATACAGACTCCG TGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGCTGGTTGCAGCTATTACCTGGAGTGGAGGTAGTACATATTATACAGACTCCG TGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGCTGGTTGCAGCTATTACCTGGAGTGGAGGTAGTACATATTATACAGACTCCG TGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGCTGGTTGCAGCTATTACCTGGAGTGGAGGTAGTACATATTATACAGACTCCG TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGGCGGAGCGTGAGTTTGTTGCAGCTATCAGCAGGAGTGGTGGTGTCACATACTATGCAGACTCCG TTCTATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAAATTGTGGCAGCTATTAGTCGGAGAAGTAGCGCCGTATTCTATGCAAACTTCG TGCCACGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAAATTGTGGCAGCTATTATTCGGAGAAGTAGCACCGTATTCTATGCAAACTTCG TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTCGCAGCTATTAGCAGGAATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCG TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTCGCAGCTATTAGCAGGAATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCG TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTGGCCGGAGTGGTGGTAGTACATACTATGCAGACTCCG TGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTAGCTGGAGGGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCG
280 * 260 * 240 * 220 * 200 TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACTTCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTAC TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACTTCCTGAAACCTGAGGACACGGCCACATATTAC TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACGACCTGAAACCTGAAGACACGGCCGTCTATTAC TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTAC TGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATACCAAGAACACCATGTATCTACAAATGAGCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTATATTAC CGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGACAAGAACACGGTAATTCTGCAAATGGACAAACTGAAACCTGAGGATACGGCCATCTATTAT CGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCTCATGAGTAACCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC TGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC TGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGACACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCATATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC CGAAGGGGCGATTCTCCATCTCCCCAGACAACACCGAGAACACGGTATATCTTCACATGAGTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC TGCCGCGGGCTGGTTCCCCCCCGCTCCCCGGAAAGAGCGTGAGTTTGTATCACCTATTATCTGGAGGGGGGTGATCACATACTATGCGCACTCCG
: : : : : : : : : : : :
: : : : : : : : : : :
: : : : : : : : : : : : :
4MTNFR86 4MTNFR7 4MTNFR10 4MTNFR64 4MTNFR62 4MTNFR1 4MTNFR15 4MTNFR3 4MTNFR25 4MTNFR29 4MTNFR42 4MTNFR81
4MTNFR86 4MTNFR7 4MTNFR10 4MTNFR64 4MTNFR62 4MTNFR1 4MTNFR15 4MTNFR3 4MTNFR25 4MTNFR29 4MTNFR42
4MTNFR86 4MTNFR7 4MTNFR10 4MTNFR64 4MTNFR62 4MTNFR1 4MTNFR15 4MTNFR3 4MTNFR25 4MTNFR29 4MTNFR42 4MTNFR81 4MTNFR81
285 285 285 285 285 285 285 285 285 285 285 285 190
190 190 190 190 190 190 190 190 190 190 190
95 95 95 95 95 95 95 95 95 95 95 95
8.7 BIJLAGE 7: Nanobody gensequenties
Figuur 8.8: Gensequenties Nanobodies tegen mTNFR₁. Tusenruimtes werden geïntroduceerd om de sequenties te aligneren (met blauw: restrictiesite voor Pstl, rood: restrictiesite voor BstEll, groen: CDR-regio’s).
Bijlage
14
Figuur 8.8 (vervolg): Gensequenties Nanobodies tegen mTNFR₁. Tusenruimtes werden geïntroduceerd om de sequenties te aligneren (met blauw: restrictiesite voor Pstl, rood: restrictiesite voor BstEll, groen: CDR-regio’s).
Bijlage
15
384 384 384 405 384 384 411 396 396 396 396 396
420 * 400 * GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACTGTTCCGGGCCAGCATACACTGTTAAAAGCTGA GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGATCGTAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------AGACTACAGTTCCGGCCGAACATAG---------------
: : : : : : : : : : : :
4MTNFR86 4MTNFR7 4MTNFR10 4MTNFR64 4MTNFR62 4MTNFR1 4MTNFR15 4MTNFR3 4MTNFR25 4MTNFR29 4MTNFR42 4MTNFR81
: : : : : : : : : : : :
380 * 320 360 * * 300 340 * * TGTAATTACCGA----------------GACA-AT----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAC-GTAGA----------------TTCATAT----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAT-ATAGA----------------CTCATAC----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAATGGCGGAAGAGGTGGGAACCCGCCCTATATCATCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAACGTGAGG----------------GGTA-AC----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAC-GTAGAC--------------TCGAAT------TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAT-GCTAATAC--------CCCACCGAATGGGGCCTGGGGCCAGGGGACCCAAGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCGGTACGAAGTTCC TGTAAT-GCTAATAC--------CCAACCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAT-GCTAATAC--------CCAACCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAT-GCTAATAC--------CCAACCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTAAT-GCTAATAC--------CCAACCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC TGTGAT-GCTAATAC--------CCACCCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCCTGTCACCGTGTCCCCCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC
: : : : : : : : : : : :
4MTNFR86 4MTNFR7 4MTNFR10 4MTNFR64 4MTNFR62 4MTNFR1 4MTNFR15 4MTNFR3 4MTNFR25 4MTNFR29 4MTNFR42 4MTNFR81
: : : : : : : : : : : :
359 359 359 380 359 359 371 371 371 371 371 371
8.8 BIJLAGE 8: Gensequentie Nb 29 met restrictiesites voor Pstl
Figuur 8.9: Gensequentie Nb 29 met restrictiesites voor Pstl.
Bijlage
16
8.9 BIJLAGE 9: Internationalisation at home: Evening lectures 8.9.1 Biedt het Kiwi-model een oplossing voor de financiële problemen van de sociale zekerheid? Dirk Van Duppen, auteur van ‘De cholesteroloorlog’ (2004) vergastte ons op een boeiend betoog over hoe het geneesmiddelenbeleid goedkoper, beter en eerlijker kan georganiseerd worden. Hierbij baseerde hij zich op het zogenaamde Kiwi-model uit NieuwZeeland. In 2005 vertrok de ‘Kiwi-commisie’ daarheen om te overleggen met Anette King, de Nieuw-Zeelandse minister van Volksgezondheid. Het doel van het Kiwi-model is om de kostprijs voor geneesmiddelen spectaculair te laten dalen door vooraf op basis van objectieve wetenschappelijke criteria en bevindingen (EBM) per aandoening een geneesmiddelkeuze te maken. Zo kan de arts slechts uit een selecte groep van geneesmiddelen
kiezen
en
heeft
marketing
eigenlijk
geen
zin
meer
omdat
vertegenwoordigers van de farmaceutische firma’s geen invloed meer hebben op het voorschrijfgedrag van de artsen. Daardoor komt een aanzienlijk budget vrij, dat kan worden gebruikt voor onderzoek naar nieuwe, betere en goedkopere geneesmiddelen. Van Duppen ondernam ook al talrijke acties om politici in België te overtuigen. Resulaten zijn bijvoorbeeld het gratis maken van het HPV-vaccin voor tienermeisjes en het aankaarten van ‘geneesmiddelentoerisme’. Bij dit laatste zette hij een groep mensen met chronische pijn op de bus naar Nederland en liet hen daar grote hoeveelheden pijnstillers inkopen. In Nederland is de prijs van sommige geneesmiddelen immers beduidend lager dan in België. Zo evolueerde het Kiwi-model ook enigszins naar het ‘Kaas-model’. Dit model biedt mijns inziens een zeer interessante visie op geneesmiddelen. Als we maatregelen kunnen nemen om geneesmiddelen goedkoper, beter en eerlijker te maken, waarom zouden we dan nog langer twijfelen?
8.9.2 Registration of new vaccines in the EU: not an easy task Onze gastspreker, Prof. dr. Pieter Neels, werkt voor het CHMP, het Committee for Human Medicinal Products. Deze commissie bekijkt de kosten-batenverhouding van zowel nieuwe als heel oude producten en geeft advies aan de EU over welke geneesmiddelen een gunstige ratio opleveren. Eerst legde de spreker ons uit hoe de registratiecommissie in gans Europa georganiseerd is en vervolgens bracht hij zijn eigen persoonlijke visie over vaccins. Een ideaal vaccin is 100% effectief, veilig, stabiel gedurende lange tijd, goedkoop,
Bijlage
17
gemakkelijk toe te dienen in één enkel dosis en biedt een levenslange protectie. Vaccins zijn zeer verdienstelijke geneesmiddelen, dankzij hen is bijvoorbeeld sinds de tweede helft van de jaren zeventig het pokkenvirus compleet uitgeroeid. Ik volg Neels in het feit dat vaccins een zeer goede ontdekking zijn, maar dan is het belangrijk dat ze consequent toegediend worden. Op deze manier kunnen we een ‘herd immunity’ ontwikkelen en net zoals is gebeurd bij het pokkenvirus, ook andere virussen en bacteriën trachten uit te roeien.
8.9.3 Innovating for a Better and Sustainable Healthcare Rudi Pauwels heeft zijn plaats in de medische geschiedenisboeken al verdiend. Als oprichter en grote baas van het biotechnologiebedrijf Biocartis speelt hij een grote rol in de wetenschapswereld. Zijn betoog over gezondheidszorg werd dan ook erg boeiend en geloofwaardig gebracht. In 100 jaar tijd is de geschatte levensverwachting enorm toegenomen, onder andere door de ontdekking van penicilline, het uitvoeren van klinische studies, vaccins, CT-scans, stents en robotoperaties. De kosten voor de gezondheidszorg zullen in de toekomst echter blijven stijgen, doordat de vergrijzing de vraag naar geneesmiddelen doet stijgen en steeds duurdere innovatieve industriële technieken worden aangewend voor de ontwikkeling ervan. Bovendien moeten we ons steeds meer toespitsen op een meer geïndividualiseerde patiëntenbehandeling. Men is er al lang van overtuigd dat de hypothese ‘one size fits all’ niet opgaat en voor veel patiënten resulteert in een sterk verminderd effect of zelfs toxiciteit. Toediening van foute geneesmiddelen is niet alleen nefast voor de patiënt, maar kost daarenboven de maatschappij ook enorm veel geld. Daarom geloof ik zeker dat het belangrijk is om in het lichaam op zoek te gaan naar biomarkers die representatief zijn voor de ernst van de ziekte en om nieuwere en betere technieken voor medische beeldvorming en geautomatiseerde diagnosekits te ontwikkelen. Zo kunnen we elke patiënt een geïndividualiseerde en gerichte therapie geven. De gastspreker eindigde ook met een mooie quote die erg toepasselijk is op wetschappelijk onderzoek: Shoot for the moon. Even if you miss, you’ll land among the stars.
8.9.4 Hospital Admissions Related to Medication: a preventable health and economic burden? Dr. Patricia van den Bemt sprak over de twee manieren waarop geneesmiddelen het menselijk lichaam kunnen schaden: intrinsiek via de geneesmiddeleigenschappen en extrinsiek via het geneesmiddelgebruik. Het begrip ADR, Adverse Drug Reactions, wordt in de literatuur vaak verkeerdelijk gebruikt. Met ADR bedoelen we de intrinsieke neveneffecten
Bijlage
18
van het geneesmiddel. Die zijn onvoorspelbaar en kunnen dus maar moeilijk vermeden worden. Ook medicatiefouten kunnen leiden tot schade aan het lichaam. In tegenstelling tot het vorige begrip, kunnen deze fouten wel vermeden worden en zijn de effecten voorspelbaar vanuit het farmacologisch profiel. Deze voorspelbare en onvoorspelbare schade brengen we onder één gemeenschappelijke noemer, ADE of Adverse Drug Events. Dokter van den Bemt werkte ook mee aan verscheidene studies om de frequentie van deze schade in de praktijk te kwantificeren en een manier te vinden om ze te voorkomen. Dit werd onderzocht in de HARM, PHARM en High 5’s studie. Ik vind het zeker nuttig dat men een poging doet om schade aan het lichaam door geneesmiddelen te voorkomen, gezien de frequentie hiervan in bijvoorbeeld ziekenhuizen enorm hoog is. Fouten zoals in het specifieke voorbeeld van de HARM studie, waarbij een patiënt met pancreatitis, teweeggebracht door het geneesmiddel Simvastatine, na een ziekenhuisopname opnieuw behandeld wordt met het schadelijke geneesmiddel, mogen zeker niet meer gebeuren!
8.9.5 Current alternative methods to animal testing used in pharmaceutical, cosmetic and chemical industry Naar de lezing van Philippe Vanparys had ik het meest uitgekeken omdat deze het nauwst aansluit bij mijn scriptie. Hij vertelde dat o.a. de farmaceutische industrie de laatste jaren een enorme evolutie meemaakte mee van in vivo naar in vitro proeven. Deze evolutie was echter geen sinecure: tussen het menselijk lichaam en in vitro dierlijke celculturen is er namelijk een grote barrière van interspecies- en organisatieverschillen. Cellen in cultuur zijn immers geïsoleerd uit hun natuurlijke omgeving en kunnen niet communiceren met andere omliggende cellen. In de toekomst wil men zoveel mogelijk in vivo experimenten vermijden, maar we moeten hier ook realistisch in zijn. Indien er geen alternatieve in vitro techniek voorhanden is, moet het uitvoeren van in vivo experimenten nog steeds mogelijk blijven om tragische gebeurtenissen zoals het Softenonschandaal te vermijden. In het labo waar ik stage gelopen heb, proberen ze proeven op dieren zo veel als mogelijk te vermijden, maar een volledige afschaffing is echter nog toekomstmuziek. Het is namelijk onmogelijk om een geneesmiddel op de markt te brengen waarvan je niet zeker bent dat het veilig is. Steeds moet er rekening worden gehouden met de ethische beladenheid omtrent dierenproeven en moeten de pro’s en contra’s tegen elkaar afgewogen worden. Het is een goede zaak dat er veel onderzoek wordt gedaan naar in vitro alternatieven en misschien zal het in de toekomst ooit mogelijk worden om dierenproeven volledig te vermijden.
Bijlage
19
