MIKROSKOPIE MICROSCOPY OF TIME VARIABLE BIOLOGIC OBJECTS

´ UCEN ˇ Í TECHNICKE ´ V BRNE ˇ VYSOKE BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

ˇ YRSTV ´ Í FAKULTA STROJNÍHO INZEN ´ ´ ÍHO INZEN ˇ YRSTV ´ Í USTAV FYZIKALN FACULTY OF MECHANICAL ENGINEERING INSTITUTE OF PHYSICAL ENGINEERING

ˇ ˇ PROMENN ˇ YCH ´ ´ ˚ MIKROSKOPIE CASOV E BIOLOGICKYCH OBJEKTU MICROSCOPY OF TIME VARIABLE BIOLOGIC OBJECTS

ˇ Í PRACE ´ DIZERTACN DOCTORAL THESIS

´ AUTOR PRACE

ˇ A ´ Ing. HANA UHLÍROV

AUTHOR

´ VEDOUCÍ PRACE

doc. RNDr. RADIM CHMELÍK, Ph.D.

SUPERVISOR

ˇ SKOLITEL SPECIALISTA

´ CSc. MUDr. PAVEL VESELY,

CO-SUPERVISOR

´ ˇ Ustav molekulárn´ı genetiky AV CR Institute of Molecular Genetics, AS CR

BRNO 2010

Abstrakt Pˇredmˇetem disertaˇcn´ı práce je vyuˇzit´ı transmisn´ıho digit´ aln´ıho holografického mikroskopu (DHM) ´ VUT v Brnˇe pro v´ navrˇzeného a zkonstruovaného v Laboratoˇri optické mikroskopie na UFI yzkum dynamiky ˇziv´ ych bunˇek. Prvn´ı ˇcást práce se zab´ yvá teoretick´ ym popisem vlastnost´ı zobrazen´ı mikroskopu v závislosti na koherenci osvˇetlen´ı doplnˇen´ ym experimenty s modelov´ ym a re´ aln´ ym biologick´ ym vzorkem. V dalˇs´ı ˇcásti jsou popsány konstrukˇcn´ı zmˇeny a inovace mikroskopu a jeho vybaven´ı, které umoˇznily vyuˇz´ıván´ı mikroskopu pro pozorov´ an´ı ˇziv´ ych bunˇek. V experimentáln´ı ˇcásti byla vypracov´ ana metodika pˇr´ıpravy a pozorov´ an´ı ˇziv´ ych bunˇek pro DHM, která byla ovˇeˇrena pˇri zobrazen´ı dynamiky bunˇeˇcné apopt´ ozy indukované cytostatikem cis-platinou. Byla zkoumána také dynamika ˇziv´ ych bunˇek pˇri standardn´ıch podm´ınkách a za p˚ usoben´ı deprivaˇcn´ıho stimulu. Pro vyhodnocen´ı kvantitativn´ıch zmˇen rozm´ıstˇen´ı bunˇeˇcné hmoty bˇehem experiment˚ u byla vytvoˇrena metoda zpracov´ an´ı holograficky rekonstruované fáze nazvaná dynamické fázové diference“. Touto metodou byly odhaleny r˚ uzné vzorce chov´ an´ı ra” kovinov´ ych bunˇek bˇehem specifické reakce v z´ avislosti na typu bunˇek, stupni jejich malignity a hustotˇe porostu. Pro kvantitativn´ı anal´ yzu fázového zobrazen´ı z DHM byla navrˇzena vhodn´ a statistick´ a charakteristika a zp˚ usob interpretace namˇeˇren´ ych dat, které byly u ´spˇeˇsnˇe aplikov´ any pˇri porovn´ an´ı vnitrobunˇeˇcného pohybu dvou typ˚ u rakovinov´ ych bunˇek rodiˇcovské a dceˇriné linie. Na z´ akladˇe uvedeného zpracován´ı pozorován´ı byly stanoveny hypotézy o mechanismu reakce n´ adorov´ ych bunˇek na nepˇr´ıznivé ˇzivotn´ı podm´ınky. V závˇeru práce jsou shrnuty poznatky a doporuˇcen´ı pro konstrukci a aplikace nové generace transmisn´ıho DHM. Abstract The subject of the PhD thesis is the application of a transmission digital holographic microscope (DHM) which was designed and constructed in the Laboratory of optical microscopy at the IPE BUT for the research of live cells dynamics. First part of the work is concerned with theoretical description of the microscope imaging properties dependent on the coherence of illumination. It is supplemented with experiments of imaging of a model and a real biological specimen. The following part describes construction modifications and innovations of the microscope and its equipment that enabled the utilization of the microscope for live cells observations. In the experimental part the methodology of live cells preparation and DHM imaging was worked out. The methodology was verified by the observation of cell dynamics during an apoptosis induced by the cytostaticum cis-platinum. Further experiments examined the dynamics of live cells in standard conditions and during a deprivation stimulus. A novel method of holographically reconstructed phase, named “dynamic phase differences”, was set up to evaluate quantitative changes of cell mass distribution during the experiments. Depending on the degree of malignancy and density of cell outgrowth, various schemes of cancer cells behaviour during a specific reaction were revealed using this method. For the quantitative analysis of the DHM phase imaging, a suitable statistical characteristic and an interpretation of the measured data were proposed. Both of them were successfully applied for the comparison of cell motility of two cell types: parental and progeny cell lines. On the basis of the proposed processing, hypotheses describing the reaction mechanism of tumour cells to stress life conditions were established. In the conclusions we summarize our findings and suggestions for the construction and the applications of a new generation of the transmission DHM.

Kl´ıˇ cov´ a slova Digitáln´ı holografická mikroskopie, n´ızk´ a koherence, zobrazov´ an´ı ˇziv´ ych bunˇek, such´ a hmota buˇ nky, dynamické fázové diference, apopt´ oza. Keywords Digital holographic microscopy, low coherence, live cell imaging, cell dry mass, dynamic phase differences, apoptosis.

ˇ ´ H. Mikroskopie ˇcasovˇe promˇenných biologických objekt˚ UHLÍROV A u. Brno, 2010. 72 s. Dizertaˇcn´ı práce. Vysoké uˇcen´ı technické v Brnˇe, Fakulta strojn´ıho inˇzen´ yrstv´ı, Vedouc´ı dizertaˇcn´ı práce doc. RNDr. Radim Chmel´ık, Ph.D.

Prohlaˇsuji, ˇze jsem pˇredloˇzenou práci vypracovala v celém rozsahu samostatnˇe pod veden´ım doc. RNDr. Radima Chmel´ıka, Ph.D. a MUDr. Pavla Veselého, CSc., a ˇze veˇskeré podklady, ze kter´ ych jsem ˇcerpala, jsou uvedeny v seznamu literatury. Ing. Hana Uhl´ıˇrov´ a

Na tomto m´ıstˇe dˇekuji doc. RNDr. Radimu Chmel´ıkovi, Ph.D za veden´ı dizertaˇcn´ı práce, ´ nesˇcetné konzultace a pomoc pˇri ˇreˇsen´ı u ´kol˚ u. D´ ale dˇekuji MUDr. Pavlu Veselému, CSc. (Ustav ˇ molekulárn´ı genetiky AV CR, Praha) za veden´ı biologické ˇc´ asti pr´ ace, neust´ alou motivaci a pracovn´ı nasazen´ı. Dˇekuji také RNDr. Janu Br´ abkovi,Ph.D. a RNDr. Danielu R¨ oselovi, Ph.D. (oba Katedra bunˇeˇcné a molekulárn´ı biologie, Pˇr. f. UK, Praha), Ing. Martinu Antoˇsovi, Ph.D, Ing. Pavlu Kolmanovi, Ing. Lukáˇsi Kvasnicovi a Ing. Tom´ aˇsi Zikmundovi za spolupr´ aci. V neposledn´ı ˇradˇe dˇekuji svému manˇzelovi Vojtovi za jeho trpˇelivost, laskavost, pomoc a pochopen´ı a rodiˇc˚ um za stálou podporu. Ing. Hana Uhl´ıˇrov´ a

Obsah ´ 1 Uvod 1.1 Historick´ y pˇrehled transmisn´ı interferenˇcn´ı mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Souˇcasn´ y stav . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3 Motivace a c´ıle práce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9 9 10 11

2 Transmisn´ı DHM 2.1 Schéma transmisn´ıho DHM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Justáˇz transmisn´ıho DHM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Nastaven´ı mikroskopu pro pozorov´ an´ı . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

12 12 13 15

3 Konstrukˇ cn´ı u ´ pravy mikroskopu 3.1 Vytápˇen´ı mikroskopu a komora . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Osov´ y posuv v referenˇcn´ı vˇetvi . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Stolek a posuv objektu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Dorazy stolku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Systém regulace ˇcasové a prostorové koherence osvˇetlen´ı 3.6 Stacionárn´ı pozorovac´ı kom˚ urky . . . . . . . . . . . . . . 3.7 Pr˚ utokové pozorovac´ı kom˚ urky . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . .

16 . . . . . 16 . . . . . 16 . . . . . 17 . . . . . 17 . . . . . 17 . . . . . 18 . . . . . 18

. . . .

. . . .

20 20 21 24 25

5 Experimenty se zmˇ enou koherence svˇ etla 5.1 Modelov´ y experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Zobrazen´ı bunˇek v rozptyluj´ıc´ım médiu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Pozorován´ı bunˇek v opalescentn´ım médiu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31 31 34 36

4 Teoretick´ y rozbor vlivu koherence osvˇ etlen´ı 4.1 Vliv koherence osvˇetlen´ı na vlastnosti zobrazen´ı . . . . . ˇ 4.2 Casov´ a koherence osvˇetlen´ı . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Prostorová koherence osvˇetlen´ı . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Vliv velikosti zdroje na kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . . . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

6 V´ yznam kvantitativn´ıho f´ azov´ eho kontrastu buˇ nky 38 6.1 Vztah indexu lomu a hustoty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 6.2 V´ yznam kvantitativn´ı fáze buˇ nky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 7 Zpracov´ an´ı a vyhodnocen´ı obrazu 7.1 Základn´ı u ´pravy kvantitativn´ı f´ aze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 Dynamické fázové diference . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

43 43 44

7

OBSAH 7.3 7.4

Statistické vyhodnocen´ı DPD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rozliˇsen´ı DHM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8 Experimenty s buˇ nkami 8.1 Standardn´ı pˇr´ıprava vybaven´ı pro pozorov´ an´ı . . . 8.2 Reakce nádorov´ ych bunˇek G3S2 na cisPt . . . . . . 8.3 Reakce bunˇek na energetickou a nutriˇcn´ı deprivaci 8.3.1 Zobrazen´ı v Zernikovˇe f´ azovém kontrastu . 8.3.2 Zobrazen´ı v DHM . . . . . . . . . . . . . . 8.3.3 Závˇer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4 Porovnán´ı motility cytoskeletonu dvou typ˚ u bunˇek 8.4.1 Motilita za standardn´ıch podm´ınek . . . . . 8.4.2 Motilita pˇri extern´ım stimulu . . . . . . . . 8.4.3 Závˇer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5 Testován´ı pr˚ utokov´ ych kom˚ urek . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

45 46

47 . . . . . . . 47 . . . . . . . 48 . . . . . . . 51 . . . . . . . 51 . . . . . . . 53 . . . . . . . 56 . . . . . . . 57 . . . . . . . 57 . . . . . . . 58 . . . . . . . 60 . . . . . . . 60

9 Z´ avˇ er

61

Dodatek: Biologick´ e pracoviˇ stˇ e

64

Seznam pouˇ zit´ ych symbol˚ u

64

Literatura

68

8

Kapitola 1

´ Uvod 1.1. Historick´ y pˇ rehled transmisn´ı interferenˇ cn´ı mikroskopie Snaha o aplikaci interferenˇcn´ı mikroskopie v biologii nebo medic´ınˇe byla jistˇe inspirována moˇznost´ı zobrazit transparentn´ı prepar´ aty. Skuteˇcnost, ˇze nˇekteré objekty jsou okem ˇci mikroskopem dobˇre patrné, zat´ımco jiné velmi tˇeˇzko, vedla k rozdˇelen´ı objekt˚ u z optického hlediska na amplitudové a fázové. Zat´ımco amplitudové objekty mˇen´ı amplitudu proch´ azej´ıc´ıho svˇetla, fázové objekty mˇen´ı jeho fázi. Jak´ ykoliv detektor (oko, kamera, fotografick´ a deska) je citliv´ y v˚ uˇci zmˇenám intenzity (tedy kvadrátu modulu amplitudy), coˇz zp˚ usob´ı, ˇze amplitudové objekty maj´ı pˇrirozen´ y kontrast, zat´ımco fázové nikoliv. V polovinˇe 17. stolet´ı si poprvé Robert Hook vˇsimnul barevn´ ych prouˇzk˚ u [1], které byly pozdˇeji identifikov´ any jako interference – jev, kter´ y potvrzuje vlnovou podstatu svˇetla a je ovlivnˇen f´ az´ı svˇetla. Od té doby uplynulo pˇres 200 let, neˇz byl vyuˇzit potenciál transmisn´ıch interferenˇcn´ıch mikroskop˚ u pro zviditelnˇen´ı f´ azov´ ych objekt˚ u. Transmisn´ı interferenˇcn´ı mikroskopie mohla b´ yt jiˇz od roku 1907, kdy byly vyvinuty tk´ an ˇové kultury, pouˇz´ıvána pro studium bunˇek. V této dobˇe ale pˇrevl´ adly jiné zobrazovac´ı techniky, jako je metoda svˇetlého a temného pole, v kombinaci s fixov´ an´ım a barven´ım bunˇek. Podle [2] byla interferenˇcn´ı mikroskopie poprvé aplikov´ ana na ˇzivé buˇ nky aˇz po roce 1935. Mezi t´ım Zernike vyvinul fázov´ y kontrast a tato metoda zviditelˇ nov´ an´ı f´ azov´ ych diferenc´ı ovlivnˇen´ım fáze ˇcásti svˇetla difraktovaného vzorkem se stala aˇz do dneˇsn´ı doby nejbˇeˇznˇeji pouˇz´ıvanou metodou pro pozorován´ı nebarven´ ych bunˇek. Byla také vyvinuta metoda diferenci´ aln´ıho interferenˇcn´ıho kontrastu. Tyto dvˇe techniky tvoˇrily dominantn´ı n´ astroj pro v´ yzkum transparentn´ıch objekt˚ u, zat´ımco interferenˇcn´ı mikroskopie se uplatˇ novala sp´ıˇse pro mikro-interferometrii v reflexn´ı verzi. Je nutno poznamenat, ˇze jedna verze reflexn´ıho mikroskopu dos´ ahla také ˇsirokého uplatnˇen´ı v bunˇeˇcné biologii, a to interferenˇcn´ı mikroskop vyvinut´ y roku 1964 Curtisem [3] pro studium kontakt˚ u bunˇek se substrátem [4], [5]. Do poloviny 20. stolet´ı nebyla v bunˇeˇcné biologii transmisn´ı interferenˇcn´ı mikroskopie vyuˇz´ıvána jako metoda interferometrick´ a. Skuteˇcnost, ˇze jako jedin´ a umoˇzn ˇovala nejen zobrazit, ale také zmˇeˇrit rozd´ıl optické dráhy (OPD) indukovan´ y vzorkem, nebyla docenˇena, protoˇze nebyla známa vhodná interpretace této mˇeˇritelné veliˇciny. V roce 1952 pˇriˇsel Barer [6] s v´ ykladem buˇ nkou indukovan´ ym OPD. Jeho práce zv´ yˇsily popularitu transmisn´ı interferenˇcn´ı mikroskopie, coˇz mˇelo za následek nˇekteré d˚ uleˇzité objevy v 50. a 60 letech v bunˇeˇcné biologii [7], [8]. Nicménˇe po této aplikaci nastal dalˇs´ı u ´padek pˇripisovan´ y komplikovanosti zaˇr´ızen´ı a jejich vysoké poˇrizovac´ı cenˇe [2]. Transmisn´ı interferenˇcn´ı mikroskopy se pˇrestaly vyr´ abˇet. Obnoven´ y zájem o tento typ mikroskop˚ u se objevuje na pˇrelomu stolet´ı pˇri p´ atr´ an´ı po nekon-

9

ˇ ´ STAV 1.2. SOUCASN Y venˇcn´ıch zobrazovac´ıch technikách. Mikroskopy jsou zav´ adˇeny pod n´ azvem digit´ aln´ı holografické mikroskopy (DHM), protoˇze jejich zobrazen´ı umoˇzn ˇuje rekonstrukci jak f´ aze, tak i intenzity. Práci s tˇemito mikroskopy znaˇcnˇe usnadnil pˇredevˇs´ım rozvoj poˇc´ıtaˇcové a digit´ aln´ı techniky. Dokonce se znovu objevuje jejich komerˇcn´ı produkce (firma Lyncée tec). V dneˇsn´ı dobˇe existuj´ı transmisn´ı DHM pro r˚ uzné biologické aplikace, ale z˚ ust´ avaj´ı v nˇekolika v´ yzkumn´ ych laboratoˇr´ıch a v bˇeˇzné biomedic´ıncké praxi se stále nevyuˇz´ıvaj´ı.

1.2. Souˇ casn´ y stav V souˇcasné dobˇe maj´ı transmisn´ı digit´ aln´ı holografické mikroskopy obvykle optické schéma odpov´ıdaj´ıc´ı Machovu-Zehnderovu interferometru. Nˇekteré holografické systémy vyuˇz´ıvaj´ı osové holografie, a vyˇzaduj´ı tedy z´ aznam v´ıce interferogram˚ u pro jedinou rekonstrukci [1], [9]. Tyto techniky, oznaˇcované jako phase – shifting ˇci phase – stepping, nejsou vhodné pro zobrazov´ an´ı rychle se mˇen´ıc´ıch objekt˚ u a nejsou pˇr´ıliˇs odolné v˚ uˇci zmˇenám teploty a vibrac´ım. Ostatn´ı holografické systémy pouˇz´ıvaj´ı tak zvanou mimoosovou holografii, která umoˇzn ˇuje rekonstrukci obrazové vlny z jediného hologramu [10], [11]. Tyto techniky, aˇc nároˇcnˇejˇs´ı na rozliˇsen´ı detekˇcn´ıho zaˇr´ızen´ı, jsou bˇeˇznˇejˇs´ı d´ıky své rychlosti a obecnˇe menˇs´ı citlivosti na zmˇeny zobrazovac´ıch podm´ınek v ˇcase. Stávaj´ıc´ı DHM se liˇs´ı také charakterem pouˇzitého osvˇetlen´ı. Koherentn´ı zdroje svˇetla jsou ˇcasto nahrazovány n´ızkokoheretn´ımi, a to ze dvou hlavn´ıch d˚ uvod˚ u: 1) jsou potlaˇceny neˇz´ adouc´ı interference v systému, takˇze v´ ysledn´ y obraz nen´ı znehodnocen koherenˇcn´ım ˇsumem [12], a 2) zobrazen´ı má konfokáln´ı charakter, vytv´ aˇr´ı se optické ˇrezy. To znamen´ a, ˇze v´ıcen´ asobnˇe rozpt´ ylené svˇetlo se nepod´ıl´ı na vzniku obrazu [13], [14], [15], [16]. Na druhé stranˇe koherenˇcn´ı délka vymezuje oblast numerického pˇreostˇrov´ an´ı [12], tj. oblast, ve které lze vypoˇc´ıtat zobrazen´ı ˇs´ıˇren´ım vlny zaznamenané v jiné rovinˇe. Doposud se v mimoosov´ ych systémech pouˇz´ıvalo vˇetˇsinou koherentn´ıho osvˇetlen´ı [17], [18], [19], zat´ımco n´ızkokoherentn´ıho svˇetla se pouˇz´ıvlo pˇredevˇs´ım v osov´ ych systémech [13], [14], [15], [16]. Existuj´ı i mikroskopy s mimoosov´ ym uspoˇr´ ad´ an´ım a n´ızkokoherentn´ım osvˇetlen´ım [20], zde vˇsak je oblast interference omezena ˇcasovou koherenc´ı zdroje [21], kterou tud´ıˇz nelze pˇr´ıliˇs omezovat. Prvn´ım systematick´ ym zkoumán´ım bunˇek interferenˇcn´ım mikroskopem byla práce G. A. Dunna, A. F. Browna a D. Zichy, kteˇr´ı nejen buˇ nky zobrazili, ale vyuˇzili i kvantitativn´ıho fázového kontrastu k dalˇs´ımu zpracov´ an´ı a vyhodnocen´ı pohybu a tvaru bunˇek [22], [23], [24]. Digitáln´ı holografická mikroskopie je v souˇcasnosti vyuˇz´ıv´ ana v biologii bunˇek nejˇcastˇeji pro tyto typy experiment˚ u: • zjiˇstˇen´ı integráln´ıho indexu lomu bunˇek, napˇr. [25], [26], • moˇznost rekonstrukce 3D oblasti z jednoho hologramu at’ jiˇz pro doostˇren´ı prepar´ atu bˇehem pozorován´ı [17] nebo pro automatickou objemovou identifikaci objekt˚ u [27], [28], [16], [29], • porovnán´ı zmˇeny kvantitativn´ı f´ aze bunˇek pˇri aplikaci extern´ıho stimulu, jako napˇr. efekt trypsinu [30], hypertonického nebo hypotonického prostˇred´ı [15], toxinu Latrunculinu [19] nebo laserov´ ych n˚ uˇzek [31].

10

´ 1.3. MOTIVACE A CÍLE PRACE Digitáln´ı holografická mikroskopie byla pouˇzita také napˇr´ıklad pro optickou tomografii [32], pro v´ yzkum fluktuace membrány erytrocyt˚ u [33], urˇcov´ an´ı poˇctu bunˇek [34], rozpozn´ av´ an´ı kmenov´ ych bunˇek [35] nebo vizualizaci krevn´ıch bunˇek pulce in vivo [36].

1.3. Motivace a c´ıle pr´ ace V Laboratoˇri optické mikroskopie na FSI VUT v Brnˇe byl vyvinut transmisn´ı DHM, kter´ y se v poˇcáteˇcn´ıch aplikac´ıch ukázal b´ yt vhodn´ ym n´ astrojem pro zobrazov´ an´ı bunˇek. Mikroskop umoˇzn ˇuje kvantitativn´ı zobrazen´ı fázového rozd´ılu mezi referenˇcn´ı a pˇredmˇetovou vlnou (d´ ale jen kvantitativn´ı fáze), které oproti metodˇe klasického Zernikova f´ azového kontrastu nebo diferenciáln´ıho interferenˇcn´ıho kontrastu vypov´ıd´ a o skuteˇcném rozm´ıstˇen´ı suché hmoty buˇ nky [37]. Fázi v tomto DHM lze zaznamenávat s vysokou vzorkovac´ı frekvenc´ı (12 Hz), a monitorovat tak dynamické dˇeje v buˇ nce. Proto bylo uplatnˇen´ı mikroskopu smˇeˇrov´ ano pˇredevˇs´ım k ˇcasosbˇern´ ym záznam˚ um reakc´ı ˇziv´ ych bunˇek na vnˇejˇs´ı podnˇety. Nav´ıc je tento mikroskop navrˇzen tak, ˇze v mimoosovém uspoˇrádán´ı umoˇzn ˇuje pouˇz´ıt svˇetlo mnohem niˇzˇs´ı koherence neˇz u ostatn´ıch v aplikac´ıch znám´ ych a pouˇz´ıvan´ ych systém˚ u, coˇz d´ av´ a pˇredpoklad pro zobrazov´ an´ı prepar´ at˚ u v silnˇe rozptyluj´ıc´ıch prostˇred´ıch. Intenzita osvˇetlen´ı ˇziv´ ych prepar´ at˚ u pˇri pouˇzit´ı n´ızkokoherentn´ıho svˇetla m˚ uˇze b´ yt velmi n´ızká, a metoda se st´ av´ a neinvazivn´ı, coˇz je v´ yhoda oproti pouˇz´ıvané technice fluorescenˇcn´ıho barven´ı bunˇek. C´ılem doktorské práce bylo vyuˇzit´ı techniky zobrazov´ an´ı digit´ aln´ım holografick´ ym mikroskopem pˇri pozorován´ı dynamiky ˇziv´ ych bunˇek. Jednalo se tedy o vyuˇzit´ı pˇredevˇs´ım kvantitativn´ı fáze zobrazeného preparátu a vyuˇzit´ı vlastnost´ı zobrazen´ı s n´ızkokoherentn´ım osvˇetlen´ım. Experimentáln´ı ˇcinnost mˇela vést k v´ yvoji metodiky just´ aˇze mikroskopu, pˇr´ıpravy vzork˚ u a pozorován´ı mikroskopem. Na základˇe proveden´ ych experiment˚ u mˇela b´ yt také vyvinuta metodika zpracován´ı obrazu a anal´ yza v´ yznamu kvantitativn´ı f´ aze ˇziv´ ych bunˇek. Dalˇs´ım c´ılem bylo zkoumán´ı teoretick´ ych i experimentáln´ıch aspekt˚ u holografického zobrazen´ı v z´ avislosti na koherenˇcn´ıch vlastnostech pouˇzitého osvˇetlen´ı. V r´ amci doktorské pr´ ace se pˇredpokl´ adaly zmˇeny a inovace mikroskopu a jeho vybaven´ı a d´ ale pˇrizp˚ usoben´ı pˇr´ıstroje pro biomedic´ınsk´ y v´ yzkum a pozdˇeji praxi. Byly nutné také u ´pravy a v´ yvoj softwaru pro zpracov´ an´ı dat z DHM.

11

Kapitola 2

Transmisn´ı DHM 2.1. Sch´ ema transmisn´ıho DHM

Obrázek 2.1: Schéma DHM, kter´ y je pˇredmˇetem pr´ ace. Symboly Z1 – Z5 oznaˇcuj´ı zrcátka, IF interferenˇcn´ı filtr, O osvˇetlovac´ı objektiv, K1 , K2 kondenzory a O1 , O2 objektivy. Jedná se o achromatick´ y interferometr Machova-Zehnderova typu [38], [39], obr. 2.1. Optické 12

´Z ˇ TRANSMISNÍHO DHM 2.2. JUSTA schéma mikroskopu je odvozeno od reflexn´ı verze digit´ aln´ıho holografického mikroskopu publikovaného pod názvem Parallel-mode confocal microscope“ [40]. Zdrojem svˇetla je halogenov´ a ” lampa. Osvˇetlovac´ı soustava byla navrˇzena na principu K¨ ohlerova osvˇetlen´ı, takˇze osvˇetlovac´ı 1 u K1 a K2 , které slouˇz´ı jako kondenˇcoˇcka (O) zobraz´ı zdroj do pˇredn´ı ohniskové roviny objektiv˚ zory, a t´ım je zajiˇstˇeno rovnomˇerné osvˇetlen´ı pˇredmˇetu a referenˇcn´ıho objektu. Dˇeliˇcem svazku svˇetla je lineárn´ı fázová difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzka, na n´ıˇz svazek difraktuje a zrc´ atky se vyb´ır´ a +1. a −1. difrakˇcn´ı ˇrád tvoˇr´ıc´ı svazky referenˇcn´ı a pˇredmˇetové vˇetve. Prostorov´ a frekvence difrakˇcn´ı −1 mˇr´ıˇzky f = 70 mm byla zvolena tak, aby difrakˇcn´ı a interferenˇcn´ı u ´hly svazk˚ u byly malé. Nen´ı tedy potˇreba pouˇz´ıt spojovac´ıho ˇclenu a interferenˇcn´ı obrazec je lokalizovan´ y ve v´ ystupn´ı rovinˇe mikroskopu (dále jen v´ ystupn´ı rovina). Z´ aroveˇ n ale mus´ı b´ yt splnˇena holografick´ a podm´ınka, která ˇr´ıká, ˇze prostorová frekvence interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u mus´ı b´ yt alespoˇ n 3× vetˇs´ı neˇz maximáln´ı prostorová frekvence, kterou pˇrenesou objektivy ([41], str. 23). Svazek pˇredmˇetové vˇetve je z difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky zrcátky smˇerován do kondenzoru K2 . Pak proch´ az´ı pˇredmˇetem, na kter´ y je zaostˇren objektiv O2 . Tento objektiv zobraz´ı pˇredmˇet do v´ ystupn´ı roviny, kde se prot´ınaj´ı svazky z obou vˇetv´ı a interferuj´ı. Referenˇcn´ı vˇetev m´ a stejnou konstrukci aˇz na to, ˇze mezi kondenzorem K1 a objektivem O1 nen´ı pˇredmˇet, ale pouze referenˇcn´ı objekt. V naˇsem pˇr´ıpadˇe je pˇredmˇetem kom˚ urka s buˇ nkami naplnˇená médiem a v referenˇcn´ı vˇetvi je pouze kom˚ urka s médiem. Rozd´ıl optick´ ych drah svazk˚ u je tedy v ideáln´ım pˇr´ıpadˇe zp˚ usoben pouze pr˚ uchodem svˇetla buˇ nkami. Za v´ ystupn´ı rovinou je um´ıstˇen v´ ystupn´ı objektiv, kter´ y zobrazuje hologram na ˇcip CCD kamery. Jeho funkc´ı je zvˇetˇsit interferenˇcn´ı obrazec, aby bylo splnˇeno kritérium prostorové vzorkovac´ı frekvence kamery. V tomto achromatickém mikroskopu je u ´hel mezi osou svazku +1. a −1. difrakˇcn´ıho ˇr´ adu stejn´ y jako u ´hel, pod kter´ ym tyto svazky interferuj´ı, a to pro kaˇzdou vlnovou délku (´ uhly α0 pro vˇetˇs´ı vlnovou délku a u ´hly α pro menˇs´ı vlnovou délku v obr´ azku 2.1). Ve v´ ystupn´ı rovinˇe tedy tvoˇr´ı svˇetlo vˇsech vlnov´ ych délek hologramy se stejnou prostorovou frekvenc´ı interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u. V tomto smyslu tedy velikost oblasti interference nen´ı omezena ˇcasovou koherenc´ı osvˇetlen´ı.

2.2. Just´ aˇ z transmisn´ıho DHM Justáˇz mikroskopu provád´ıme s laserovou diodou vyzaˇruj´ıc´ı na centr´ aln´ı vlnové délce2 λ0 = 650 nm. Nastaven´ı osvˇetlen´ı prob´ıhá nejdˇr´ıve bez osvˇetlovac´ı ˇcoˇcky O. Orientace optick´ ych prvk˚ u a osy mikroskopu v osvˇetlovac´ı ˇcásti odpov´ıd´ a schématu na obr´ azku 2.1. Diodu um´ıst´ıme tak, aby stopa svazku procházela vodorovnˇe stˇredem otvoru pro uchycen´ı osvˇetlen´ı a po odrazu na zrcátku Z1 smˇeˇrovala doprostˇred difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky. Spr´ avn´ y smˇer svazku kontrolujeme podle stopy nultého difrakˇcn´ıho ˇrádu odraˇzeného od mˇr´ıˇzky, kter´ a mus´ı po odrazu na zrc´ atku Z1 v rovinˇe otvoru pro uchycen´ı osvˇetlen´ı splynout se stopou paprsku vych´ azej´ıc´ıho z diody. Dále je nutné nastavit zrcátka Z2 a Z3 v obou vˇetv´ıch tak, aby svazky, které proch´ azej´ı d´ırami pro kondenzory, procházely stˇredem dˇer a z´ aroveˇ n kolmo na rovinu dosed˚ u objektiv˚ u O1 a O2 . Poloˇz´ıme rovinné zrcadlo na dosedovou plochu tˇechto objektiv˚ u a obˇe d´ıry pro kondenzory K1 a K2 zaclon´ıme clonkou s kruhov´ ym otvorem uprostˇred d´ıry pro kondenzor. Otvor ve clonce slouˇz´ı ˇ ap´ıme zrc´ atka Z2 a Z3 tak, aby svazek v obou k centrován´ı svazku. Srouby S1 – S4 (obr. 2.2) nakl´ vˇetv´ıch procházel právˇe otvory v clonkách. Kontrolou kolmosti svazku v˚ uˇci dosedov´ ym ploch´ am 1 2

Pˇredn´ı je m´ınˇeno ve smˇeru chodu paprsk˚ u. Jako centr´ aln´ı budeme nad´ ale vˇzdy oznaˇcovat tuto vlnovou délku.

13

´Z ˇ TRANSMISNÍHO DHM 2.2. JUSTA

Obrázek 2.2: DHM s vyznaˇcen´ım justáˇzn´ıch prvk˚ u. Tento mikroskop je k dispozici v Laboratoˇri ´ VUT v Brnˇe. optické mikroskopie na UFI objektiv˚ u je stopa svˇetla odraˇzeného zrcadlem poloˇzen´ ym na dosedac´ı plochu objektiv˚ u, kter´ a mus´ı proj´ıt zpˇet otvory ve clonkách. Poté naˇsroubujeme objektivy O1 a O2 a zkontrolujeme, zda stopa svˇetla dopadá do jejich stˇredu. Objektivy opˇet odˇsroubujeme. Poté je potˇreba nastavit pomoc´ı ˇsroub˚ u S5 – S8 zrc´ atka Z4 a Z5 tak, aby se paprsky z obou vˇetv´ı setkávaly v ose mikroskopu ve v´ ystupn´ı rovinˇe. Tato kontrola probˇehne ztotoˇznˇen´ım stopy svˇetla se zámˇern´ ym kˇr´ıˇzem matnice vloˇzené do v´ ystupn´ı roviny, jej´ıˇz poloha vzhledem ke konstrukˇcn´ım prvk˚ um mikroskopu je zakreslena na obr´ azku 2.3. Pˇri nastavov´ an´ı polohy zrc´ atek alenost´ı od v´ ystupn´ı roviny Z4 a Z5 je potˇreba dbát na to, aby se stopy svˇetla s rostouc´ı vzd´ rozb´ıhaly vodorovnˇe a symetricky v˚ uˇci ose mikroskopu. Poté naˇsroubujeme kondenzory K1 a K2 a pokud se stopa svˇetla na matnici odch´ yl´ı z centra zámˇerného kˇr´ıˇze, dolad´ıme jej´ı polohu ˇsrouby S9 – S12 , které posouvaj´ı s cel´ ymi kondenzory. Následuje opˇet kontrola symetrie rozb´ıhavosti paprsk˚ u za v´ ystupn´ı rovinou. Naˇsroubujeme objektivy O1 , O2 a zkontrolujeme pr˚ uchod paprsk˚ u jejich stˇredy. Poté vloˇz´ıme osvˇetlovac´ı ˇcoˇcku, ’ která zajiˇst uje Köhlerovo osvˇetlen´ı, do vzd´ alenosti asi 116 mm od roviny clonek osvˇetlen´ı. Do pˇr´ısluˇsné roviny vloˇz´ıme clonky osvˇetlen´ı a jemn´ ymi posuvy vystˇred´ıme clonku s vybran´ ym pr˚ umˇerem tak, aby stˇred osvˇetlovac´ıho paprsku proch´ azel clonkou. Za v´ ystupn´ı rovinu naˇsroubujeme v´ ystupn´ı objektiv, aby vzd´ alenost jeho dosedac´ı plochy od v´ ystupn´ı roviny mikroskopu byla 53 mm. Naˇsroubujeme také kameru dosedac´ı plochou do vzd´ alenosti 197 mm od v´ ystupn´ı roviny. T´ımto je dokonˇceno základn´ı nastaven´ı mikroskopu a d´ ale pˇri bˇeˇzném pouˇz´ıv´ an´ı 14

´ Í 2.3. NASTAVENÍ MIKROSKOPU PRO POZOROVAN

Obrázek 2.3: Poloha osy mikroskopu ve v´ ystupn´ı rovinˇe, kde se prot´ınaj´ı svazky svˇetla z obou vˇetv´ı, vzhledem ke konstrukˇcn´ım prvk˚ um mikroskopu. Na obr´ azku vpravo je pohled smˇerem od kamery. Rozmˇery jsou uvedeny v milimetrech. mikroskopu jiˇz nepouˇz´ıváme ˇsrouby S1 – S4 a S9 – S12 .

2.3. Nastaven´ı mikroskopu pro pozorov´ an´ı Pˇred zapoˇcet´ım série pozorován´ı je vhodné provést n´ asleduj´ıc´ı nastaven´ı mikroskopu s kryc´ımi skly. Do obou vˇetv´ı vloˇz´ıme na stolek prepar´ atu kryc´ı skl´ıˇcko, protoˇze pouˇz´ıvané objektivy jsou korigované právˇe na kryc´ı skl´ıˇcko. Spust´ıme program ide2, kter´ y slouˇz´ı k vyˇc´ıt´ an´ı obrazu z kamery a zobrazován´ı holografick´ ych rekonstrukc´ı. Zakryjeme pˇredmˇetovou vˇetev vsunut´ım clonky do otvoru pˇred kondenzor K2 a posuvem P1 (obr. 2.2), kter´ y posouv´ a obˇema kondenzory v ose z (osa mikroskopu), zaostˇr´ıme v rovinˇe ˇcipu kamery difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzku. Rovina difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky, rovina preparátu, v´ ystupn´ı rovina mikroskopu a rovina ˇcipu kamery jsou opticky sdruˇzené roviny. Po zaostˇren´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky v referenˇcn´ı vˇetvi odkryjeme pˇredmˇetovou vˇetev a posuvem P2 , kter´ y pohybuje jen objektivem v pˇredmˇetové vˇetvi, doostˇr´ıme difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzku i v této vˇetvi. Poté ˇsrouby S5 – S8 sesad´ıme obrazy mˇr´ıˇzek na sebe. Je vhodné nastavit tˇemito ˇsrouby stˇred zobrazen´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky do stˇredu zorného pole. D´ ale ovl´ ad´ ame délku pˇredmˇetové vˇetve ˇsroubem S13 a pˇri jeho otáˇcen´ı zároveˇ n korigujeme vz´ ajemnou polohu obraz˚ u mˇr´ıˇzek v obou vˇetv´ıch (S7 a S8 ) tak dlouho, aˇz nastav´ıme kontrastn´ı interferenˇcn´ı prouˇzky v celém zorném poli. Oblast nejvˇetˇs´ıho kontrastu interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u kontrolujeme podle nejsvˇetlejˇs´ı oblasti v online holografické rekonstrukci intenzity. Po tomto základn´ım nastaven´ı vymˇen´ıme kryc´ı skl´ıˇcko za prepar´ at v pˇredmˇetové vˇetvi a referenˇcn´ı kom˚ urku v referenˇcn´ı vˇetvi. Je potˇreba opˇet doostˇrit mˇr´ıˇzku v obou vˇetv´ıch a sesadit jej´ı obrazy na sebe. Pˇri pouˇzit´ı objektiv˚ u 20×, které maj´ı pracovn´ı vzd´ alenost 1 mm je vˇetˇsinou nutné v závislosti na v´ yˇsce pouˇzité kom˚ urky rozostˇrit nejdˇr´ıve prepar´ at pohybem stolku k objektiv˚ um a pak teprve doostˇrit mˇr´ıˇzku, aby nedoˇslo ke kontaktu front´ aln´ıch ˇcoˇcek kondenzor˚ u s preparátem. Je potˇreba doladit také délku pˇredmˇetové vˇetve v˚ uˇci referenˇcn´ı (S13 ), neˇz je nalezena oblast nejvˇetˇs´ıho kontrastu interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u. Jelikoˇz jsou na difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzce defekty v podobˇe vryp˚ u a prachu, je nutné obraz mˇr´ıˇzky na kameˇre rozostˇrit, coˇz mikroskop dovoluje spoleˇcn´ ym posuvem obou kondenzor˚ u (P1 ). Je vhodné rozostˇrit pohybem kondenzor˚ u smˇerem od roviny preparátu pro zvˇetˇsen´ı pˇredmˇetového prostoru v ose z. Po tomto rozostˇren´ı je opˇet nutné at doladit interferenci pomoc´ı S7 a S8 podle rekonstruované intenzity. Poté doostˇr´ıme prepar´ posuvem stolku P3 . Tento postup opakujeme po kaˇzdé v´ ymˇenˇe pozorovaného prepar´ atu. 15

Kapitola 3

Konstrukˇ cn´ı u ´ pravy mikroskopu 3.1. Vyt´ apˇ en´ı mikroskopu a komora Z poˇzadavk˚ u dlouhodobého mikroskopického pozorov´ an´ı ˇziv´ ych bunˇek savc˚ u a stability zaostˇren´ı mikroskopu vypl´ yvaj´ı vysoké nároky na stabilizaci teploty v oblasti vzorku na 37, 0 ◦ C. Proto jsme navrhli dvoj´ı systém vytápˇen´ı. 1. Cel´ y prostor okolo mikroskopu je vyt´ apˇen na teplotu pˇribliˇznˇe 35 ◦ C. Pro tepelnou izolaci vytápˇeného prostoru jsme zkonstruovali komoru z izolaˇcn´ıho kom˚ urkového plexiskla. Topen´ı je realizováno um´ıstˇen´ım série rezistor˚ u do dr´ aˇzek vyvrtan´ ych do spodn´ı stˇeny betonového kv´ adru 3 ´pravou. Jsou pouˇzity paralelnˇe o rozmˇerech 500 × 500 × 80 mm s mramorovou povrchovou u tˇri sekce po ˇsesti rezistorech v sérii. Kaˇzd´ y odpor v sérii m´ a hodnotu 120 Ω. V´ ykon topen´ı celkem ˇcin´ı 222 W. Kvádr je um´ıstˇen do komory, a na nˇej je postaven mikroskop. Vyt´ apˇen´ı je regulováno digitáln´ım termostatem Dixell XR10C (s ON/OFF regulac´ı). Do obvodu je také pˇripojena pojistka s nastavitelnou maxim´ aln´ı teplotou. Vyt´ apˇen´ı celého prostoru je nutné pro temperaci vˇsech mikroskopov´ ych komponent, pˇredevˇs´ım objektiv˚ u. Vyt´ apˇen´ a komora slouˇzila také pro nˇekolikadenn´ı pˇrechováván´ı ˇziv´ ych bunˇek. ˇ ast stolku, na které leˇz´ı vzorek, je vyt´ 2. C´ apˇena na teplotu 37, 0 ◦ C. Pro tento u ´ˇcel byla navrˇzena a zkonstruována duralová topn´ a vloˇzka ve tvaru mezikruˇz´ı, kter´ a byla v koneˇcné fázi vloˇzena do stolku a zaaretována ˇsrouby. Pˇrenos tepla je realizov´ an odporov´ ym vodiˇcem opˇreden´ ym izolac´ı (mˇern´ y odpor 6 Ω/m, délka 2,4 m, pr˚ umˇer 0,3 mm), kter´ y je navinut na vybrán´ı ve vloˇzce. Proud procházej´ıc´ı vodiˇcem je regulov´ an PID regul´ atorem Technologic TLK 38, kter´ y umoˇzn ˇuje pˇresnˇejˇs´ı stabilizaci teploty na z´ akladˇe automatického v´ ypoˇctu parametr˚ u pˇri PID regulaci. Do vloˇzky je provrt´ an otvor, do nˇehoˇz je aˇz k povrchu stolku zavedeno polovodiˇcové NTC ˇcidlo. Systém regulace je schopen udrˇzovat teplotu v m´ıstˇe vzorku s pˇresnost´ı na desetinu ◦ C, coˇz je plnˇe vyhovuj´ıc´ı.

3.2. Osov´ y posuv v referenˇ cn´ı vˇ etvi Pozorován´ım preparátu ve vˇetˇs´ı hloubce média pˇri pouˇzit´ı neimerzn´ıch objektiv˚ u se projev´ı otvorová vada. Pokud je v obou vˇetv´ıch zaostˇreno do stejné hloubky, malé otvorové vady kondenzor˚ u se pˇri rekonstrukci hologramu eliminuj´ı. Jestliˇze pozorovan´ y objekt pˇr´ıliˇs nerozptyluje svˇetlo, ˇcásteˇcnˇe se eliminuj´ı také otvorové vady objektiv˚ u. Proto bylo tˇreba zkonstruovat separátn´ı posuv v osovém smˇeru pouze v jedné z vˇetv´ı. Dalˇs´ım d˚ uvodem byla snaha o zajiˇstˇen´ı maximáln´ı moˇzné optické ekvivalence obou vˇetv´ı. Tyto poˇzadavky byly realizov´ any duralovou

16

3.3. STOLEK A POSUV OBJEKTU vloˇzkou tvaru mezikruˇz´ı (obr. 3.1) s jemn´ ym vnˇejˇs´ım z´ avitem a protikusem, jeˇz byly vsazeny ˇ do stolku v referenˇcn´ı ˇcásti mikroskopu, a protikus byl zaaretov´ an ˇsrouby. Sroubov´ an´ım vloˇzky je moˇzné lokálnˇe zv´ yˇsit nebo sn´ıˇzit rovinu stolku v referenˇcn´ı vˇetvi tak, aby byla vzd´ alena od frontáln´ı ˇcoˇcky objektivu na jednotky mikrometr˚ u stejnˇe, jako je vzd´ alena rovina stolku od frontáln´ı ˇcoˇcky pˇr´ısluˇsného objektivu v objektové vˇetvi. V takovém pˇr´ıpadˇe lze pˇredpokl´ adat dobrou eliminaci otvorové vady a optickou ekvivalenci vˇetv´ı.

Obrázek 3.1: Stolek s posuvem, drˇzákem vzorku, vloˇzkou pro osov´ y posuv a s topnou vloˇzkou.

3.3. Stolek a posuv objektu Z d˚ uvod˚ u um´ıstˇen´ı posuvné a topné vloˇzky bylo tˇreba zkonstruovat nov´ y stolek pro prepar´ at. Pohyb preparátu v osách x, y b´ yvá realizov´ an tˇremi zp˚ usoby: 1. stolek má posuv v jedné ose (napˇr. x) a vzorkem je posouv´ ano v druhé ose (napˇr. y), 2. stolek má posuvy v obou osách (x a y) a vzorkem nen´ı posouv´ ano, 3. stolek je bez posuvu a vzorkem je posouv´ ano v obou os´ ach x a y. DHM je pro biologická pozorován´ı pouˇz´ıv´ an v invertované verzi, takˇze objektivy proch´ azej´ı stolkem, frontáln´ı ˇcoˇckou aˇz do u ´rovnˇe roviny stolku. T´ım znemoˇzn ˇuj´ı vˇetˇs´ı posuvy stolku. Proto pro návrh stolku byla zvolena tˇret´ı varianta, stolek pevn´ y. Posuv vzorku byl realizov´ an tak, ˇze ke stolku byl pˇripevnˇen mikrometrick´ y posuv firmy Thorlabs s pohyblivost´ı v obou os´ ach. Byl zkonstruován drˇzák vzorku s pruˇzn´ ym raménkem a pˇripevnˇen k tomuto posuvu. Vzorek tedy leˇz´ı na topné vloˇzce a je posouván drˇzákem (obr. 3.1).

3.4. Dorazy stolku Pro vymezen´ı prostoru pˇri ostˇren´ı vertik´ aln´ımi posuvy stolku byly zkonstruov´ any dorazy pro horn´ı a spodn´ı polohu, které zabraˇ nuj´ı kontaktu vzorku s front´ aln´ımi ˇcoˇckami objektiv˚ u a kondenzor˚ u.

3.5. Syst´ em regulace ˇ casov´ e a prostorov´ e koherence osvˇ etlen´ı Pro experimenty vyuˇz´ıvaj´ıc´ı r˚ uzné ˇcasové a prostorové koherence svˇetla byl vyvinut systém reguˇ lace koherence. Casová koherence osvˇetlen´ı byla omezov´ ana vsunut´ım barevn´ ych filtr˚ u s r˚ uznou 17

´ Í POZOROVACÍ KOMURKY ˚ 3.6. STACIONARN poloˇs´ıˇrkou spektráln´ı propustnosti (od 10 nm aˇz po b´ılé svˇetlo). Pro regulaci prostorové koherence osvˇetlen´ı byly vytvoˇreny kruhové clonky o pr˚ umˇerech od (0,3 – 4,0) mm a jejich drˇz´ ak s hrub´ ym posuvem pro v´ ymˇenu clonek a jemn´ ym posuvem pro jejich vystˇredˇen´ı.

3.6. Stacion´ arn´ı pozorovac´ı kom˚ urky Pozorovac´ı kom˚ urky slouˇz´ı pro um´ıstˇen´ı prepar´ atu. Byly navrˇzeny tak, aby imitovaly ˇzivotn´ı podm´ınky bunˇek v Petriho miskách a z´ aroveˇ n vyhovovaly podm´ınk´ am zobrazen´ı objektivy. Maximáln´ı velikost kom˚ urek je omezena geometri´ı mikroskopu: later´ alnˇe rozchodem referenˇcn´ı a objektové vˇetve a axiálnˇe pracovn´ı vzdálenost´ı objektiv˚ u (pro objektivy 10×/0, 25 jsme pouˇz´ıvali kom˚ urky vysoké 0,8 mm, pro objektivy 20×/0, 40 kom˚ urky vysoké maxim´ alnˇe 0,5 mm). Pevnou ˇcást kom˚ urky tvoˇr´ı kryc´ı skl´ıˇcko (pr˚ umˇer 22 mm) pˇripevnˇené silikonem k nerezovému mezikruˇz´ı (vnˇejˇs´ı pr˚ umˇer 22 mm, vnitˇrn´ı pr˚ umˇer 15 mm), které vymezuje buˇ nk´ am ˇzivotn´ı prostor. Silikon vyhovuje podm´ınkám netoxiˇcnosti a je odoln´ y v˚ uˇci alkoholu a vyˇzivovac´ımu médiu bunˇek. V této ˇcásti kom˚ urky jsou po jeho sterilizaci kultivov´ any buˇ nky. Pro pozorov´ an´ı je kom˚ urka uzavˇrena dalˇs´ım kryc´ım skl´ıˇckem o stejn´ ych rozmˇerech a spoj je utˇesnˇen vakuovou vazel´ınou.

3.7. Pr˚ utokov´ e pozorovac´ı kom˚ urky Existuj´ı dva hlavn´ı d˚ uvody pro pˇrechod od stacion´ arn´ıch k pr˚ utokov´ ym pozorovac´ım kom˚ urkám: 1. moˇznost okamˇzitého sn´ımán´ı reakce po aplikaci vnˇejˇs´ıho stimulu v podobˇe u ´ˇcinné l´ atky, popˇr´ıpadˇe záznam uˇz bˇehem pod´ av´ an´ı l´ atky, 2. moˇznost sn´ımán´ı stejného zorného pole pˇred a po reakci, které zaruˇc´ı pˇresnost urˇcen´ı u ´ˇcink˚ u látky vzhledem k p˚ uvodn´ımu stavu pozorovan´ ych bunˇek.

Obrázek 3.2: Pr˚ utokov´ a kom˚ urka. Pr˚ utokové kom˚ urky byly konstruov´ any pro pozorov´ an´ı s objektivy 10×/0, 25, které poskytly dostateˇcn´ y prostor mezi preparátem a kondenzorem. Pozdˇeji byly zakoupeny objektivy 20×/0, 40 LWD, které byly pouˇzity jako kondenzory v kombinaci s objektivy 20×/0, 40. Tato kombinace umoˇznila pouˇzit´ı pr˚ utokov´ ych kom˚ urek pˇri zobrazen´ı s vˇetˇs´ım zvˇetˇsen´ım. Stávaj´ıc´ı pr˚ utokovou kom˚ urku tvoˇr´ı v´ alec o vnˇejˇs´ım pr˚ umˇeru 25 mm, a v´ yˇsce 4 mm. Do nˇej byl vyvrtán otvor ve tvaru kosoˇctverce s hlavn´ımi osami o délce 18,5 mm a 13,5 mm s delˇs´ı osou ve smˇeru proudˇen´ı. Tento tvar napomáhá lamin´ arn´ımu pr˚ utoku kapaliny kom˚ urkou. K podstavám válce jsou z obou stran nalepena silikonem kryc´ı skl´ıˇcka o tlouˇst’ce 0,17 mm a pr˚ umˇeru 25 mm. Do vrchol˚ u kosoˇctverce ve smˇeru delˇs´ı poloosy byly vytvoˇreny dva otvory o pr˚ umˇeru 1,5 mm pro 18

˚ ´ POZOROVACÍ KOMURKY ˚ 3.7. PRUTOKOV E zaveden´ı jehly, z nichˇz jeden byl vyvrtán ve v´ yˇsce 2 mm a druh´ y byl vybrouˇsen na povrchu v´ alce. Tento otvor je odtokov´ y a je um´ıstˇen na povrchu kom˚ urky, aby j´ım odch´ azely vzduchové bubliny a také aby bylo moˇzné uchytit kom˚ urku st´ avaj´ıc´ım posuvn´ ym systémem (viz odstavec 3.3). Do otvor˚ u jsou zasunuty jehly o vnˇejˇs´ım pr˚ umˇeru 1,3 mm a vnitˇrn´ım 1,2 mm s obrouˇsen´ ym hrotem a jsou v d´ırách utˇesnˇeny silikonem. Na jehly jsou navleˇceny tˇesn´ıc´ı teflonové hadiˇcky a na nˇe silikonové hadiˇcky o vnitˇrn´ım pr˚ umˇeru 1,5 mm. Na pˇr´ıvodn´ı hadiˇcku je napojen´ a jehla o stejn´ ych rozmˇerech a na ni injekˇcn´ı stˇr´ıkaˇcka, kterou je realizov´ ana v´ ymˇena kapaliny v kom˚ urce. Odvodn´ı hadiˇcka vede do odpadn´ı nádoby. Odvod je realizov´ an pouze vytlaˇcen´ım pˇr´ıchoz´ı tekutinou. Pˇred jehlu pˇr´ıvodn´ı hadiˇcky je zapojen uz´ avˇer, kter´ y br´ an´ı pohybu kapaliny v pˇr´ıvodn´ı hadiˇcce a vzniku bublin. Do horn´ı stˇeny kosoˇctverce byly vybrouˇseny z´ aˇrezy slouˇz´ıc´ı jako pasti pro vzduchové bubliny, které se tak drˇz´ı na kraji zorného pole.

19

Kapitola 4

Teoretick´ y rozbor vlivu koherence osvˇ etlen´ı 4.1. Vliv koherence osvˇ etlen´ı na vlastnosti zobrazen´ı Redukc´ı prostorové koherence osvˇetlen´ı se holografické zobrazen´ı pˇribliˇzuje zobrazen´ı konfokáln´ımu [40], [42]. Zobrazen´ı obecnˇe je za pˇredpokladu line´ arn´ıho a prostorovˇe invariantn´ıho systému [43] charakterizováno impulsovou odezvou h zobrazovac´ıho systému. Impulsov´ a odezva konfokáln´ıho mikroskopu je souˇcinem dvou impulsov´ ych odezev h = h1 h2 , z nichˇz jedna pˇr´ısluˇs´ı a zobrazen´ı bodu v objektu na detektor (h2 ) zobrazen´ı bodového zdroje na objekt (h1 ) a druh´ [42]. Hlavn´ımi znaky konfokáln´ıho zobrazen´ı jsou [42]: a) Vyˇsˇs´ı rozliˇsen´ı: jelikoˇz impulsová odezva je souˇcinem dvou impulzov´ ych odezev (h1 h2 ), poloˇs´ıˇrka funkce, která ji popisuje, je menˇs´ı, neˇz by byla poloˇs´ıˇrka funkce h1 nebo h2 odpov´ıdaj´ıc´ı klasickému mikroskopu a rozliˇsen´ı konfok´ aln´ıho mikroskopu je tak vˇetˇs´ı. b) Potlaˇcen´ı rozpt´ yleného svˇetla: rozptyluj´ıc´ı materi´ al um´ıstˇen´ y do dr´ ahy zobrazovac´ıch paprsk˚ u, kter´ y rozˇs´ıˇr´ı pouze jednu z impulsov´ ych odezev, nezp˚ usob´ı rozˇs´ıˇren´ı h oproti zaostˇrenému obrazu klasick´ ym mikroskopem – rozliˇsen´ı je stejné jako rozliˇsen´ı dané uˇzˇs´ı impulsovou odezvou. Tato vlastnost umoˇzn ˇuje zobrazen´ı pod rozptyluj´ıc´ı vrstvou. c) Hloubková diskriminace: signál rozostˇreného objektu velmi rychle kles´ a k nule s rostouc´ım rozostˇren´ım. Potlaˇcen´ı rozpt´ yleného svˇetla a hloubkov´ a diskriminace maj´ı za n´ asledek vytv´ aˇren´ı optick´ ych ˇrez˚ u objektem. Impulsová odezva holografického zobrazen´ı pˇri osvˇetlen´ı ploˇsn´ ym tedy prostorovˇe nekoherentn´ım zdrojem je popsána také souˇcinem dvou impulsov´ ych odezev h1 h∗2 , kde h1 pˇr´ısluˇs´ı optické soustavˇe v objektové vˇetvi, h2 optické soustavˇe ve vˇetvi referenˇcn´ı a ∗ znaˇc´ı komplexn´ı sdruˇzen´ı [39]. Skuteˇcnost, ˇze holografické zobrazen´ı charakterizuje souˇcin dvou impulsov´ ych odezev má stejné d˚ usledky na zobrazen´ı (a – c) jako u zobrazen´ı konfok´ aln´ıho. Plné vyuˇzit´ı prostorovˇe nebo ˇcasovˇe nekoherentn´ıho svˇetla v holografickém zobrazen´ı vyˇzaduje pouˇzit´ı tzv. achromatického interferometru. Tuto podm´ınku vˇetˇsinou splˇ nuj´ı mˇr´ıˇzkové interferometry [38], [39]. Vlivem disperze svˇetla na difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzce je ˇcasovˇe nekoherentn´ı zdroj

20

ˇ ´ KOHERENCE OSVETLEN ˇ Í 4.2. CASOV A z pohledu objektu prostorovˇe rozloˇzen na zdroje monochromatické. Redukovan´ a ˇcasov´ a koherence je tedy mˇr´ıˇzkou pˇrevedena na redukovanou prostorovou koherenci s d˚ usledky a – c na zobrazen´ı. Redukce ˇcasové a zároveˇ n prostorové koherence osvˇetlen´ı m´ a za n´ asledek dalˇs´ı zjemnˇen´ı optick´ ych ˇrez˚ u, které mohou b´ yt tenˇc´ı neˇz v mikroskopu konfok´ aln´ım. Ukazuje se dokonce, ˇze osové rozliˇsen´ı holografického zobrazen´ı dané omezen´ım ˇcasové a z´ aroveˇ n prostorové koherence svˇetla je vˇetˇs´ı, neˇz rozliˇsen´ı dané superpozic´ı vlivu pouze ˇcasové a pouze prostorové koherence [44]. Proto je v´ yhodné m´ıt DHM s ˇcasovˇe i prostorovˇe nekoherentn´ım svˇetlem. Jelikoˇz charakter zobrazen´ı u ´zce souvis´ı s koherenˇcn´ımi vlastnostmi osvˇetlen´ı, v n´ asleduj´ıc´ıch dvou odstavc´ıch odhadneme charakteristiky ˇcasové a prostorové koherence, koherenˇcn´ı délku Lk a koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrku Dk , které budou plnˇe popisovat charakter osvˇetlen´ı z hlediska koherenˇcn´ıch vlastnost´ı.

ˇ 4.2. Casov´ a koherence osvˇ etlen´ı DHM p˚ usob´ı vzhledem k disperzi svˇetla na mˇr´ıˇzce jako spektr´ aln´ı filtr, jelikoˇz pupily kondenzor˚ u vymezuj´ı spektráln´ı pásmo svˇetla, které kondenzory projde. Spektr´ aln´ı hustota intenzity svˇetla proˇslého mikroskopem je tedy obecnˇe jin´ a neˇz spektr´ aln´ı hustota intenzity zdroje. Nav´ıc vzhledem k prostorové nekoherenci zdroje se spektr´ aln´ı hustota intenzity interferuj´ıc´ıho svˇetla, tedy svˇetla vytváˇrej´ıc´ıho obraz, liˇs´ı od spektr´ aln´ı hustoty intenzity svˇetla proˇslého mikroskopem. V tomto odstavci je odvozeno, jak z´ avis´ı spektr´ aln´ı hustota intenzity interferuj´ıc´ıho svˇetla na velikosti zdroje, tedy potaˇzmo na jeho prostorové koherenci.

Obrázek 4.1: Schéma pr˚ uchodu svˇetla pupilami kondenzor˚ u (PK) pro centr´ aln´ı vlnovou délku λ0 a a – obecnou vlnovou délku λ1 , b – obecnou vlnovou délku λ2 , pˇriˇcemˇz λ0 > λ1 > λ2 . D´ıky tomu, ˇze je mikroskop achromatick´ y, je moˇzné pro zobrazen´ı pouˇz´ıt svˇetlo libovolné 21

ˇ ´ KOHERENCE OSVETLEN ˇ Í 4.2. CASOV A koherenˇcn´ı délky, které projde mikroskopem a interferuje ve v´ ystupn´ı rovinˇe. Pro zkoumán´ı vlivu koherence osvˇetlen´ı na zobrazen´ı byl vytvoˇren systém regulace jak ˇcasové, tak i prostorové koherence. ˇ Casovou koherenci osvˇetlen´ı lze regulovat vsouv´ an´ım r˚ uzn´ ych interferenˇcn´ıch filtr˚ u s danou poloˇs´ıˇrkou spektráln´ı propustnosti za zdroj svˇetla. Pro regulaci prostorové koherence byly vyrobeny kruhové clonky o pr˚ umˇerech od 0, 3 do 3 mm a jejich drˇz´ ak s jemn´ ymi posuvy pro vystˇredˇen´ı clonky a s hrub´ ym posuvem pro v´ ymˇenu clonek. Osvˇetlovac´ı soustava je tedy sloˇzena z halogenové lampy, matnice, clonky o zvoleném pr˚ umˇeru a popˇr´ıpadˇe z filtru s danou poloˇs´ıˇrkou spektráln´ı propustnosti. Halogenovou lampu m˚ uˇzeme povaˇzovat za ˇcasovˇe i prostorovˇe nekoherentn´ı zdroj. Ukazuje se, ˇze koherenˇcn´ı délka prostorovˇe nekoherentn´ıho svˇetla pod´ılej´ıc´ıho se na zobrazen´ı je v DHM urˇcena spektráln´ım sloˇzen´ım svˇetla zdroje, prostorovou frekvenc´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky a velikost´ı pupily kondenzoru, popˇr´ıpadˇe velikost´ı zdroje. Pˇredstavme si, ˇze ploˇsn´ y zdroj b´ılého svˇetla spektr´ alnˇe rozloˇz´ıme na zdroje vyzaˇruj´ıc´ı na jednotliv´ ych vlnov´ ych délkách. Zdroje vˇsak nad´ ale z˚ ust´ avaj´ı ploˇsné a m˚ uˇzeme je povaˇzovat za ’ prostorovˇe nekoherentn´ı, nebot velikost koherenˇcn´ıch ploˇsek zobrazen´ ych do pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin kondenzor˚ u je menˇs´ı, neˇz je pˇr´ıˇcn´ a rozliˇsovac´ı schopnost kondenzor˚ u ([45], str. 14). Pˇredpokládáme, ˇze pupily kondenzor˚ u (PK v obr. 4.1) jsou um´ıstˇeny v jejich pˇredn´ı ohniskové rovinˇe. Zdroj, vyzaˇruj´ıc´ı na centráln´ı vlnové délce λ0 , se zobraz´ı po difrakci na mˇr´ıˇzce do pupil y se stˇredem pupil S (obr. 4.1). kondenzor˚ u tak, ˇze stˇred zobrazeného zdroje S0 je totoˇzn´ Zdroj vyzaˇruj´ıc´ı na menˇs´ı vlnové délce λ1 < λ0 (obr. 4.1a) se zobraz´ı do roviny pupil kondeny smˇerem k ose mikroskopu o vzd´ alenost danou prostorovou zor˚ u tak, ˇze jeho stˇred S1 je posunut´ frekvenc´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky a rozd´ılem vlnov´ ych délek λ0 − λ1 . Pupilou tedy proch´ az´ı pouze ˇcást a ˇc´ ast. Jelikoˇz se jedn´ a o prostozobrazen´ı zdroje vlnové délky λ1 , a to v kaˇzdé z vˇetv´ı jin´ rovˇe nekoherentn´ı zdroj, ve v´ ystupn´ı rovinˇe interferuje svˇetlo z obou vˇetv´ı poch´ azej´ıc´ı pouze ze stejného bodu zdroje. Body zdroje pˇrisp´ıvaj´ıc´ı k interferenci jsou omezeny pupilami v obou ˇ ım je vˇetˇs´ı rozd´ıl vˇetv´ıch a tvoˇr´ı efektivn´ı plochu zdroje (pr˚ unik ˇsrafovan´ ych ploch v obr. 4.1a). C´ |λ0 −λ1 |, t´ım menˇs´ı je efektivn´ı plocha. Svˇetlo vlnové délky, pro kterou se stˇred zdroje zobraz´ı na okraj pupily (obr. 4.1b), se jiˇz nepod´ıl´ı na interferenci, i kdyˇz mikroskopem proch´ az´ı. Efektivn´ı plocha zdroje je tedy dána prostorovou frekvenc´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky, velikost´ı pupil kondenzor˚ u a vlnovou délkou. Na obrázku 4.2 je spektrofotometrem namˇeˇren´ a spektr´ aln´ı hustota intenzity svˇetla halogenové ˇzárovky, zat´ımco na obrázku 4.3 je namˇeˇren´ a spektr´ aln´ı hustota intenzity svˇetla proˇslého mikroskopem, ve které se uplatn´ı efekt spektr´ aln´ı filtrace svˇetla difraktovaného na mˇr´ıˇzce a omezeného pupilami kondenzor˚ u. Obrázek 4.4 ukazuje vypoˇctenou závislost relativn´ı efektivn´ı plochy zdroje na vlnové délce pro r˚ uzné pr˚ umˇery zobrazen´ı zdroje omezeného clonkou v pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin´ ach kondenzor˚ u. Zdroj se zobraz´ı do pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin kondenzor˚ u 2× zvˇetˇsen´ y. Z obr´ azku je vidˇet, jak je spektráln´ı ˇs´ıˇrka interferuj´ıc´ıho svˇetla ovlivˇ nov´ ana velikost´ı zdroje. Spektr´ aln´ı hustotu intenzity zdroje v tomto pˇr´ıpadˇe mus´ı nahradit korigovan´ a spektr´ aln´ı hustota intenzity pro danou velikost zdroje, která je souˇcinem spektr´ aln´ı hustoty intenzity svˇetla zdroje na obrázku 4.2 a relativn´ı efektivn´ı plochy na obrázku 4.4. Z této funkce (obr. 4.5) m˚ uˇzeme odhadnout efektivn´ı koherenˇcn´ı délku interferuj´ıc´ıho svˇetla podle obvyklého vztahu Lk =

¯2 λ , ∆λ

22

(4.1)

ˇ ´ KOHERENCE OSVETLEN ˇ Í 4.2. CASOV A ¯ je stˇredn´ı vlnová délka a ∆λ je poloˇs´ıˇrka korigované spektr´ kde λ aln´ı hustoty intenzity svˇetla.

Obrázek 4.2: Spektráln´ı hustota intenzity svˇetla halogenové lampy namˇeˇren´ a spektrofotometrem.

Obrázek 4.3: Namˇeˇrená spektráln´ı hustota intenzity svˇetla halogenové lampy proˇslého mikroskopem.

23

´ KOHERENCE OSVETLEN ˇ Í 4.3. PROSTOROVA

Obrázek 4.4: Závislost relativn´ı efektivn´ı plochy zdroje na vlnové délce pro dané pr˚ umˇery zobrazen´ı zdroje v pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin´ ach kondenzor˚ u.

Obrázek 4.5: Korigovaná spektráln´ı hustota intenzity svˇetla pro dané pr˚ umˇery zobrazen´ı zdroje v pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovinách kondenzor˚ u.

4.3. Prostorov´ a koherence osvˇ etlen´ı ¯ a polomˇer Rc Koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrku Dk svˇetla v pˇredmˇetové rovinˇe pro stˇredn´ı vlnovou délku λ zobrazen´ı zdroje v pˇredn´ı ohniskové rovinˇe kondenzoru odhadneme podle vztah˚ u odvozen´ ych 24

ˇ ÍCH PROUZK ˇ U ˚ 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENCN pro Köhlerovo osvˇetlen´ı a kvazimonochromatické svˇetlo ([46], str. 526) µ(P1 , P2 ) =

2J1 (u12 ) , u12

(4.2)

2π q (4.3) u12 = ¯ (x1 − x2 )2 + (y1 − y2 )2 nc sin θc . λ Odhad provád´ıme pro spektrálnˇe u ´zké, kvazimonochromatické svˇetlo, tud´ıˇz komplexn´ı stupeˇ n koherence je |γ(P 1, P 2, τ˜)| ∼ |µ(P 1, P 2)|, kde τ˜ vyjadˇruje ˇcasové posunut´ı ([46], str. 508). Body oznaˇcené P1 , P2 se nacházej´ı v pˇredmˇetové rovinˇe o souˇradnic´ıch x, y, J1 je Besselova ¯ je stˇredn´ı vlnov´ funkce prvn´ıho druhu ˇrádu 1, λ a délka a nc je index lomu prostˇred´ı mezi a θc oznaˇcuje u ´hel mezi optickou kondenzorem a pˇredmˇetem. V naˇsem pˇr´ıpadˇe nc = 1. Promˇenn´ osou a paprskem vycházej´ıc´ım z krajn´ıho bodu zobrazen´ı zdroje smˇeˇrovan´ ym kondenzorem do ohniska. Z pr˚ ubˇehu funkce µ vypl´ yvá, ˇze pro u12 = 1, 22π je µ = 0 (napˇr. [46], str. 397). Dosad´ımeuˇzeme odhadnout vzd´ alenost dvou bod˚ u Dk = li hodnotu u12 = 1, 22π do rovnice (4.3), m˚ p 2 2 (x1 − x2 ) + (y1 − y2 ) , kter´ ymi proch´ az´ı jiˇz vz´ ajemnˇe nekoherentn´ı svˇetlo. Tato vzd´ alenost urˇcuje pr˚ umˇer oblasti, ve které je svˇetlo jeˇstˇe prostorovˇe koherentn´ı a povaˇzujeme ji za koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrku osvˇetlen´ı v pˇredmˇetové rovinˇe. Plat´ı tedy 2π u12 = 1, 22 = ¯ Dk sin θc . λ

(4.4)

Ze sinové podm´ınky (napˇr. [46], str.168) vypl´ yv´ a, ˇze sin θc =

Rp sin θp , Rc

(4.5)

´hel mezi optickou osou a paprskem proch´ azej´ıc´ım kde Rp je polomˇer pupily kondenzoru a θp je u krajn´ım bodem pupily smˇeˇrovan´ ym kondenzorem do ohniska. Dosad´ıme-li (4.5) do (4.4), dostaneme po u ´pravˇe v´ ysledn´ y vztah pro odhad koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrky svˇetla v pˇredmˇetové rovinˇe DHM Dk =

¯ Rp 0, 61λ . sin θp Rc

(4.6)

4.4. Vliv velikosti zdroje na kontrast interferenˇ cn´ıch prouˇ zk˚ u ´ Uvahy a v´ ypoˇcty v následuj´ıc´ım odstavci se t´ ykaj´ı velikosti zorného pole u DHM, které je mimo jiné omezeno velikost´ı oblasti kontrastn´ıch interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u. Odstavec se zamˇeˇruje na jeden z faktor˚ u ovlivˇ nuj´ıc´ıch kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u, a t´ım je velikost ploˇsného, prostorovˇe nekoherentn´ıho zdroje. Je zde pops´ ano, jak se mˇen´ı interferenˇcn´ı struktura v závislosti na poloze sv´ıt´ıc´ıho bodu v ploˇsném zdroji ve dvou na sebe kolm´ ych os´ ach. Interferenˇcn´ı struktura ve v´ ystupn´ı rovinˇe mikroskopu je za podm´ınky prostorovˇe nekoherentn´ıho osvˇetlen´ı rovna souˇctu intenzit interferenˇcn´ıch obrazc˚ u od jednotliv´ ych bod˚ u efektivn´ı plochy zdroje. Tento obrazec je vlastnˇe ˇrezem interferenˇcn´ıch ploch v´ ystupn´ı rovinou. Interferenˇcn´ımi plochami jsou rotaˇcn´ı hyperboloidy s osou rotace proch´ azej´ıc´ı zobrazen´ımi bodu zdroje v pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovinách objektiv˚ u pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vˇetve. Rovina zdroje je sdruˇzenou rovinou k pˇredn´ım ohniskov´ ym rovin´ am objektiv˚ u, ve kter´ ych pˇredpokl´ adáme, ˇze jsou um´ıstˇeny pupily objektiv˚ u. Zdroj je tedy zobrazen do pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin objektiv˚ u pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vˇetve a jeho zobrazen´ı je omezeno velikost´ı pupil nebo clonkou zdroje. 25

ˇ ÍCH PROUZK ˇ U ˚ 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENCN

Obrázek 4.6: Prostor od pˇredn´ıch ohniskov´ ych rovin objektiv˚ u pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vˇetve po v´ ystupn´ı rovinu mikroskopu. Zab´ yvejme se interferenˇcn´ı strukturou v z´ avislosti na poloze bodu zobrazen´ı zdroje v pupilách objektiv˚ u. Na obrázku 4.6 je znázornˇen prostor od pupil objektiv˚ u aˇz k v´ ystupn´ı rovinˇe mikroskopu. Uvaˇzujme monochromatick´ y, ploˇsn´ y, tedy prostorovˇe nekoherentn´ı zdroj, vyzaˇruj´ıc´ı na centráln´ı vlnové délce. Souˇradnicov´ y systém um´ıst´ıme tak, ˇze poˇc´ atek 0 je v pr˚ useˇc´ıku spojnice zobrazen´ı stˇredov´ ych bod˚ u tohoto zdroje (do stˇred˚ u pupil) v obou vˇetv´ıch a osy mikroskopu. Tato osa je zároveˇ n souˇradnicovou osou z. Zavedeme také dalˇs´ı dva souˇradnicové systémy pˇr´ısluˇsné atek ohniskov´ ym rovinám objektiv˚ u v pˇredmˇetové (x1 , y1 ) a referenˇcn´ı (x2 , y2 ) vˇetvi, jejichˇz poˇc´ je ve stˇredu pupil. Osa z1 , resp. z2 je totoˇzn´ a s optickou osou pˇredmˇetové, resp. referenˇcn´ı vˇetve y jako α0 = arcsin(λ0 f ), kde f je prostorov´ a a sv´ırá s osou mikroskopu u ´hel α0 resp. −α0 dan´ frekvence difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky. Porovnejme odchylky mezi interferenˇcn´ımi obrazci, které jsou vytvoˇreny r˚ uzn´ ymi body zob26


Obrázek 4.7: Pr˚ ubˇeh interferenˇcn´ıch maxim v okol´ı v´ ystupn´ı roviny v ˇrezu rovinou x = 0. razen´ı zdroje. Uvaˇzujme nejprve zmˇenu interferenˇcn´ı struktury pˇri zmˇenˇe polohy bodu zobrazen´ı v pupile v ose y1 resp. y2 . Názornˇeji tuto situaci nahlédneme na obr. 4.7, kter´ y je ˇrezem prostoru v obr. 4.6 rovinou x = 0. Nahrad’me ˇrezy ohniskov´ ych rovin oblouky jedné kruˇznice κ se stˇredem S, kter´ y tvoˇr´ı pr˚ useˇc´ık osy z s v´ ystupn´ı rovinou a polomˇer kruˇznice je l, l = |SA1 | = |SA2 |. Ohniskové roviny tvoˇr´ı v ˇrezu teˇcny k této kruˇznici. Interferenˇcn´ı maxima pro stˇredov´ y bod zdroje zobrazen´ y do stˇred˚ u pupil jako A1 a A2 vytvoˇr´ı hyperboly s ohnisky v tˇechto bodech. Pr˚ useˇc´ıky hyperbol s v´ ystupn´ı rovinou lokalizuj´ı interferenˇcn´ı maxima hologramu. Uvaˇzujme dále body B1 , B2 , které jsou zobrazen´ımi obecného bodu zdroje a leˇz´ı v naˇs´ı aproximaci na kruˇznici κ. Interference svˇetla z tˇechto dvou bod˚ u opˇet vytvoˇr´ı maxima v m´ıstech pr˚ ubˇehu hyperbol (ˇcárkované v obr. 4.7), které budou ovˇsem otoˇceny okolo stˇredu S o u ´hel τ odpov´ıdaj´ıc´ı usledkem je rozd´ıl polohy interferenˇcn´ıch maxim u ´hlové vzdálenosti bod˚ u A1 , B1 , resp. A2 , B2 . D˚ ve v´ ystupn´ı rovinˇe ve smˇeru osy y a následn´ a ztr´ ata kontrastu interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u s rostouc´ı vzdálenost´ı od osy z. Zmˇenu polohy interferenˇcn´ıch maxim ve v´ ystupn´ı rovinˇe ud´ avaj´ı pr˚ useˇc´ıky r˚ uznˇe natoˇcen´ ych hyperbol o u ´hel pˇr´ısluˇsn´ yu ´hlové vzd´ alenosti daného bodu od stˇredu pupily. Interferenˇcn´ı struktura je souˇctem d´ılˇc´ıch interferenˇcn´ıch obrazc˚ u natoˇcen´ ych o u ´hel τ v rozsahu od −τmax po τmax , kde τmax je u ´hlová vzd´ alenost odpov´ıdaj´ıc´ı polomˇeru pupily Rp : τmax ≃

Rp . l

(4.7)

Dále zkoumejme pr˚ ubˇeh interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u pˇri zmˇenˇe polohy bodu v pupile v ose x1 , resp. x2 v obrázku 4.6. Tentokrát situaci nahlédneme v ˇrezu prostoru v´ ystupn´ı rovinou (tedy u v´ ystupn´ı z = zG = l cos α0 v obr. 4.6). Interferenˇcn´ı prouˇzky jsou opˇet ˇrezem hyperboloid˚ rovinou a tvoˇr´ı hyperboly symetrické podél osy rovnobˇeˇzné s osou y o r˚ uzn´ ych souˇradnic´ıch x (obr. 4.8). Stˇredové body pupil vytvoˇr´ı hyperboly symetrické podle osy y (ˇcernˇe v obr. 4.8). Body posunuté od stˇredu o ∆x vytvoˇr´ı hyperboly posunuté v˚ uˇci stˇredov´ ym také o ∆x (ˇc´ arkované 27

ˇ ÍCH PROUZK ˇ U ˚ 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENCN hyperboly). V´ ysledn´ y interferenˇcn´ı obrazec v zorném poli v´ ystupn´ı roviny je souˇctem r˚ uznˇe posunut´ ych hyperbol pro ∆x od −Rp do Rp , kde Rp je polomˇer pupily nebo zobrazen´ı clonky, pokud je jeho polomˇer menˇs´ı neˇz polomˇer pupily. Na obr´ azku 4.8 jsou zn´ azornˇeny tˇri sady interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u pro stˇredov´ y bod a body posunuté o ∆x a −∆x. Z obr´ azku je vidˇet, ˇze kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u je tedy omezen i ve smˇeru osy x, a to v d˚ usledku skl´ ad´ an´ı v˚ uˇci sobˇe posunut´ ych hyperbol.

Obrázek 4.8: Interferenˇcn´ı maxima v ˇrezu v´ ystupn´ı rovinou. Pro v´ ypoˇcet interferenˇcn´ı struktury ve v´ ystupn´ı rovinˇe pˇrejdeme k vlnové optice. Uvaˇzujme obecn´ y bod zdroje A, kter´ y se zobraz´ı do jedné z vˇetv´ı mikroskopu jako A1 a do druhé jako A2 (obr. 4.6). Z tˇechto dvou bod˚ u vycházej´ı divergentn´ı kulové vlny popsané vztahy exp (ikr1 ) exp (−iωt), r1 exp (ikr2 ) u2 = exp (−iωt), r2 u1 =

(4.8)

kde i oznaˇcuje imaginárn´ı jednotku, k vlnové ˇc´ıslo (k = 2π/λ ) a r1 , resp. r2 jsou vzd´ alenosti ad´ ame, ˇze amobecného bodu G ve v´ ystupn´ı rovinˇe od bodu A1 , resp. A2 (obr. 4.6). Pˇredpokl´ ˇ plituda obou vln v bodech A1 a A2 je stejn´ a a poloˇz´ıme ji rovnu 1. Casovou z´ avislost vlny charakterizuje fázor exp(−iωt), kde ω je u ´hlov´ a frekvence vlny. Pˇri interferenci vlnˇen´ı nedoch´ az´ı ke zmˇenám frekvence, takˇze tento fázor nebudeme nad´ ale ps´ at. Intenzita svˇetla vlny v bodˇe G je dána vztahem

I = |u1 + u2 |2 = u1 u∗1 + u2 u∗2 + u1 u∗2 + u∗1 u2 = Vzdálenosti r1 a r2 urˇc´ıme z obrázku 4.6 jako 28

1 1 2 + 2+ cos [k(r1 − r2 )]. 2 r 1 r2 r1 r2

(4.9)


r1 = r2 =

q

(xG − xA1 )2 + (yG − yA1 )2 + (zG − zA1 )2 ,

q

(xG − xA2 )2 + (yG − yA2 )2 + (zG − zA2 )2 ,

(4.10)

kde xA1 , yA1 , zA1 , xA2 , yA2 a zA2 jsou souˇradnice v systému x, y, z. Polohu bodu A1 , resp. A2 vyjádˇr´ıme polárn´ımi souˇradnicemi ξ a ϕ ve v´ ystupn´ıch pupil´ ach. Pˇredpokl´ ad´ ame, ˇze oba body leˇz´ı ve stejném m´ıstˇe pupily a popisujeme je tedy stejn´ ymi veliˇcinami ξ a ϕ. Pro bod A1 plat´ı: xA1 = x1A1 = ξ cos ϕ, d d yA1 = + y1A1 cos α0 = + ξ sin ϕ cos α0 , 2 2 zA1 = y1A1 sin α0 = ξ sin ϕ sin α0 .

(4.11)

xA2 = x2A2 = ξ cos ϕ, d d yA2 = − + y2A2 cos α0 = − + ξ sin ϕ cos α0 , 2 2 zA2 = −y2A2 sin α0 = −ξ sin ϕ sin α0 .

(4.12)

Pro bod A2 plat´ı:

Po dosazen´ı rovnic (4.11) a (4.12) do rovnic (4.10) dost´ av´ ame:

r1 =

s

d (xG − ξ cos ϕ)2 + (yG − ξ sin ϕ cos α0 − )2 + (zG − ξ sin ϕ sin α0 )2 , 2

r2 =

s

d (xG − ξ cos ϕ)2 + (yG − ξ sin ϕ cos α0 + )2 + (zG + ξ sin ϕ sin α0 )2 . 2

(4.13)

V´ yslednou intenzitu ve v´ ystupn´ı rovinˇe z´ısk´ ame dosazen´ım rovnic (4.13) do (4.9) a integrac´ı pˇres ξ a ϕ:

I=

ZRpZ2π

ξ

0 0

1 1 2 + 2+ cos [k(r1 − r2 )] dϕ dξ. 2 r1 r 2 r1 r2

(4.14)

Kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u je d´ an vztahem ([46], str. 267) Imax − Imin , (4.15) Imax + Imin kde Imax je lokáln´ı maximum intenzity interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u v rozmez´ı jedné periody a Imin je lokáln´ı minimum. Pokud V ≥ 0, 75, jedn´ a se o v´ yborn´ y kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u. Tento u ´daj budeme brát jako kritérium pro urˇcen´ı maxim´ aln´ı velikosti zorného pole. V =

Parametry v´ ypoˇctu: prostorová frekvence difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky f = 70 mm−1 vlnov´ a délka λ = λ0 = 650 · 10−6 mm polomˇer pupil Rp = 4 mm vzd´ alenost pˇredn´ı ohniskové roviny od roviny v´ ystupn´ı l = 150 mm 29

ˇ ÍCH PROUZK ˇ U ˚ 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENCN Numerick´ ym v´ ypoˇctem podle vztah˚ u (4.14) a (4.15) jsme zjistili, ˇze pro dané parametry poklesne kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u ve v´ ystupn´ı rovinˇe pro x = 0 na V = 0, 75 ve vzd´ alenosti y = 3, 0 mm. Pokud bychom vycházeli z této hodnoty a zvolili velikost pole 6, 0 × 6, 0 mm2 na okraji zorného pole, tedy pro x = 3, 0 mm a y = 3, 0 mm, by poklesl kontrast na V = 0, 57. Hodnoty pro V > 0, 50 povaˇzujeme jeˇstˇe za dobr´ y kontrast. Pokud bychom vyˇzadovali v´ yborn´ y kontrast pˇres celé zorné pole, jeho velikost by musela b´ yt maxim´ alnˇe 5, 1 × 5, 1 mm2 , pokud uvaˇzujeme pˇr´ıpad ˇctvercového pole. Pouˇzijeme-li v achromatickém interferometru ˇsirokospektr´ aln´ı zdroj svˇetla, kaˇzd´ a vlnov´ a délka vytvoˇr´ı pˇr´ısluˇsnou interferenˇcn´ı strukturu stejnou, jako vytvoˇr´ı centr´ aln´ı vlnov´ a délka (nebereme-li v u ´vahu amplitudy vln). Pro obecnou vlnovou délku je ovˇsem efektivn´ı plocha zdroje menˇs´ı, tud´ıˇz pokles kontrastu interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u smˇerem ke kraj˚ um pole bude také pozvolnˇejˇs´ı, a to t´ım v´ıc, ˇc´ım vzdálenˇejˇs´ı je dan´ a vlnov´ a délka od centr´ aln´ı aˇz po mezn´ı vlnovou délku, která bude interferovat (viz obr. 4.5). D´ a se tedy pˇredpokl´ adat, ˇze pˇri pouˇzit´ı zdroje svˇetla o nenulové spektráln´ı ˇs´ıˇrce bude zorné pole s kontrastn´ımi interferenˇcn´ımi prouˇzky jeˇstˇe vˇetˇs´ı. Z v´ ypoˇct˚ u vypl´ yvá, ˇze interferenˇcn´ı pole ve v´ ystupn´ı rovinˇe je v pˇr´ıpadˇe ide´ aln´ıho nastaven´ı 2 mikroskopu omezeno pouze velikost´ı difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky, kter´ a je 3 × 3 mm . Tyto v´ ypoˇcty lze také pouˇz´ıt pˇri návrhu dalˇs´ı generace DHM.

30

Kapitola 5

Experimenty se zmˇ enou koherence svˇ etla 5.1. Modelov´ y experiment Na základˇe závˇer˚ u uveden´ ych v odstavci 4.1 jsme testovali pˇredpokl´ adané vlastnosti zobrazen´ı na modelovém vzorku kryc´ıho skl´ıˇcka CELLocate (Eppendorf) s povrchov´ ym profilem. Objekt jsme zobrazili bez difuzoru a s difuzorem koherentn´ım a n´ızkokoherentn´ım svˇetlem. Zdrojem ¯ = 632, 8 nm, koherenˇcn´ı délkou koherentn´ıho svˇetla byl He-Ne laser se stˇredn´ı vlnovou délkou λ Lk > 10 cm, prostorovˇe koherentn´ı. Zdrojem n´ızkokoherentn´ıho svˇetla byla halogenov´ a lampa, za ¯ niˇz byl zaˇrazen interferenˇcn´ı filtr se stˇredn´ı vlnovou délkou λ = 650 nm a s poloˇs´ıˇrkou spektr´ aln´ı propustnosti ∆λ = 10 nm. Koherenˇcn´ı délka takto vzniklého osvˇetlen´ı byla Lk = 42 µm a koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrka Dk = 991 nm. Difuzor tvoˇrila 2 µm siln´ a f´ olie. C´ılem pozorov´ an´ı bylo porovnat, jak koherence svˇetla a pˇr´ıtomnost difuzn´ıho materi´ alu ovlivn´ı zobrazen´ı ve svˇetlém poli a holografické zobrazen´ı. Zobrazen´ı ve svˇetlém poli bylo vytvoˇrené zaclonˇen´ım referenˇcn´ı vˇetve v DHM. V kaˇzdé sérii obrázk˚ u 5.1–5.4 je zobrazen objekt ve svˇetlém poli, jeho hologram a d´ ale intenzita a kvantitativn´ı fáze, obˇe numericky rekonstruované z hologramu. Nejdˇr´ıve jsme pozorovali objekt bez difuzoru s n´ızkokoherentn´ım osvˇetlen´ım. Objekt byl patrn´ y ve vˇsech sn´ımc´ıch (obr. 5.1). Poté jsme pˇrikryli vzorek difuzorem. Aˇckoli ve svˇetlém poli ani v hologramu nen´ı objekt patrn´ y, intenzitn´ı a f´ azov´ a rekonstrukce z hologramu je difuzorem témˇeˇr nezmˇenˇena (obr. 5.2). Následnˇe jsme zamˇenili zdroj za koherentn´ı, difuzor st´ ale pˇrikr´ yval vzorek. Vˇsechny sn´ımky jsou znehodnoceny koherenˇcn´ı zrnitost´ı (obr. 5.3), kter´ a je d˚ usledkem interference koherentn´ıho svˇetla rozpt´ yleného v difuzoru a na neˇcistot´ ach v optickém systému. V posledn´ım kroku jsme odkryli vzorek (obr. 5.4). Aˇckoli je na obr´ azku zˇreteln´ a Fresnelova difrakce na objektu v d˚ usledku m´ırného rozostˇren´ı, ve vˇsech sn´ımc´ıch jsou obrysy objektu rozeznatelné. Kvantitativn´ı pr˚ ubˇeh fáze pozorovan´ y se svˇetlem n´ızké koherence se pˇri vloˇzen´ı difuzoru také pˇr´ıliˇs nemˇen´ı, jak je patrné z ˇrez˚ u proveden´ ych pˇribliˇznˇe ve stejném m´ıstˇe vzorku (obr. 5.5). Fáze φ je zde pˇrepoˇc´ıtaná na v´ yˇsku v podle vztahu 2πv φ = ¯ ∆n, λ

(5.1)

¯ je pˇr´ısluˇsná stˇredn´ı vlnová délka a ∆n = 0, 5 je rozd´ıl index˚ kde λ u lomu vzduchu a skla. Pˇribliˇznˇe jsme urˇcili v´ yˇsku namˇeˇrenou jednotliv´ ymi zp˚ usoby. V n´ızkokoherentn´ım svˇetle (obr. 5.5 a,b) vid´ıme tvarovou i v´ yˇskovou shodu profilu v pˇr´ıpadˇe pozorov´ an´ı s difuzorem a bez difuzoru, 31

´ EXPERIMENT 5.1. MODELOVY v koherentn´ım svˇetle nikoli (obr. 5.5 c,d).

Obrázek 5.1: Zobrazen´ı skl´ıˇcka CELLocate bez difuzoru svˇetlem n´ızké koherence v r˚ uzn´ ych ¯ = 650 nm, Lk = 42 µm, Dk = 991 nm. Objektivy 20×/0, 40. módech. Parametry osvˇetlen´ı: λ

Obrázek 5.2: Zobrazen´ı skl´ıˇcka CELLocate s difuzorem svˇetlem n´ızké koherence v r˚ uzn´ ych ¯ = 650 nm, Lk = 42 µm, Dk = 991 nm. Objektivy 20×/0, 40. módech. Parametry osvˇetlen´ı: λ

32

´ EXPERIMENT 5.1. MODELOVY

Obrázek 5.3: Zobrazen´ı skl´ıˇcka CELLocate s difuzorem koherentn´ım svˇetlem v r˚ uzn´ ych m´ odech. ¯ = 632, 8 nm, Lk > 10 cm, prostorovˇe koherentn´ı. Objektivy 20×/0, 40. Parametry osvˇetlen´ı: λ

Obrázek 5.4: Zobrazen´ı skl´ıˇcka CELLocate bez difuzoru koherentn´ım svˇetlem v r˚ uzn´ ych m´ odech. ¯ = 632, 8 nm, Lk > 10 cm, prostorovˇe koherentn´ı. Objektivy 20×/0, 40. Parametry osvˇetlen´ı: λ 33

ˇ V ROZPTYLUJÍCÍM MEDIU ´ 5.2. ZOBRAZENÍ BUNEK

ˇ Obrázek 5.5: Rezy fázov´ ym zobrazen´ım skl´ıˇcka CELLocate: a – svˇetlo n´ızké koherence bez difuzoru; b – svˇetlo n´ızké koherence s difuzorem; c – koherentn´ı svˇetlo bez difuzoru; d – koherentn´ı svˇetlo s difuzorem. Tento experiment potvrdil, ˇze sn´ıˇzen´ı prostorové a ˇcasové koherence m´ a za n´ asledek vyˇsˇs´ı potlaˇcen´ı koherenˇcn´ı zrnitosti a svˇetla rozpt´ yleného v optickém systému mimo rovinu zaostˇren´ı.

5.2. Zobrazen´ı bunˇ ek v rozptyluj´ıc´ım m´ ediu V biologii a medic´ınˇe se ˇcasto vyskytuj´ı prepar´ aty, ze kter´ ych nen´ı moˇzné vytvoˇrit tenk´ y ˇrez, nebo jsou souˇcást´ı tkán´ı. Takové vzorky pak silnˇe rozptyluj´ı svˇetlo a to znesnadˇ nuje jejich pozorován´ı. V odstavci 5.1 bylo ukázáno, jak ovlivˇ nuje redukce koherence osvˇetlen´ı v DHM tvorbu obrazu v rozptyluj´ıc´ım prostˇred´ı. Proto bylo pˇredmˇetem dalˇs´ıch experiment˚ u sledov´ an´ı vlivu zmˇeny ˇcasové i prostorové koherence osvˇetlen´ı na v´ ysledné zobrazen´ı bunˇek pod silnˇe rozptyluj´ıc´ı vrstvou simuluj´ıc´ı tkán ˇ. Zobrazili jsme fixované nádorové buˇ nky v rozptyluj´ıc´ım médiu v DHM svˇetlem o tˇrech 34

ˇ V ROZPTYLUJÍCÍM MEDIU ´ 5.2. ZOBRAZENÍ BUNEK r˚ uzn´ ych koherenˇcn´ıch délkách a ˇs´ıˇrkách. Médium bylo tvoˇrené polystyrénov´ ymi kuliˇckami o pr˚ umˇeru 356 nm rozpt´ ylen´ ymi v minim´ aln´ım mnoˇzstv´ı vody. Nejvyˇsˇs´ı moˇzn´ a hustota rozptyluj´ıc´ıho média je omezena nutnost´ı sjednotit optické délky pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vˇetve pˇri justáˇzi mikroskopu, která vyˇzaduje moˇznost zaostˇrit v obou vˇetv´ıch na totoˇzné m´ısto difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky. Toto je v praxi realizováno zaostˇren´ım na vryp nebo prachovou ˇc´ astici na povrchu aktivn´ı vrstvy mˇr´ıˇzky. Pokud je médium natolik husté, ˇze tato m´ısta v pˇredmˇetové vˇetvi nezobraz´ıme, nelze reprodukovatelnˇe doc´ılit interference pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vlny ve v´ ystupn´ı rovinˇe.

Obrázek 5.6: Zobrazen´ı bunˇek pod rozptyluj´ıc´ı vrstvou polystyrénov´ ych kuliˇcek rozpt´ ylen´ ych ¯ = 650 nm o koherenˇcn´ı délce a ˇs´ıˇrce a – Lk = 3 µm, Dk = 2, 6 µm; b – v médiu svˇetlem s λ adku jsou zobrazeny Lk = 8 µm, Dk = 7, 9 µm; c – Lk = 42 µm, Dk = 21, 1 µm;. V prvn´ım ˇr´ rekonstruované amplitudy, v druhém rekonstruované f´ aze s naznaˇcen´ım ˇrezu proch´ azej´ıc´ıho pˇres zobrazen´ı bunˇek a ve tˇret´ım ˇrádku jsou vykresleny tyto ˇrezy. Objektivy 10×/0, 25.

35

´ Í BUNEK ˇ V OPALESCENTNÍM MEDIU ´ 5.3. POZOROVAN Buˇ nky byly pozorovány pˇres rozptyluj´ıc´ı vrstvu média, které vyplnilo kom˚ urku o tlouˇst’ce 0,8 mm. Na obrázc´ıch 5.6 jsou v prvn´ım ˇr´ adku zobrazeny rekonstruované amplitudy, v druhém rekonstruované kvantitativn´ı fáze s naznaˇcen´ım ˇrezu proch´ azej´ıc´ıho pˇres buˇ nky a ve tˇret´ım ˇr´ adku jsou tyto ˇrezy vykresleny. V prvn´ım pˇr´ıpadˇe (obr. 5.6a) byl zdroj b´ılého svˇetla omezen clonkou o pr˚ umˇeru 2,4 mm a za ni byl um´ıstˇen neutráln´ı filtr. Tak bylo vytvoˇreno osvˇetlen´ı s koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrkou Dk = 2, 6 µm. ¯ 2 /∆λ byla 3 µm. Hodnota ∆λ byla poloˇs´ıˇrka Koherenˇcn´ı délka osvˇetlen´ı spoˇctená jako Lk = λ ¯ = maxima korigované spektráln´ı hustoty intenzity dle obr´ azku 4.5 a stˇredn´ı vlnov´ a délka λ 650 nm. V druhém pˇr´ıpadˇe (obr. 5.6b) byl stejn´ y zdroj omezen clonkou o pr˚ umˇeru 0,8 mm a za ni byl um´ıstˇen neutráln´ı filtr. Tak bylo vytvoˇreno osvˇetlen´ı s koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrkou Dk = 7, 9 µm. Koherenˇcn´ı délka tohoto osvˇetlen´ı byla Lk = 8 µm. V posledn´ım pˇr´ıpadˇe (obr. 5.6c) byl stejn´ y zdroj omezen clonkou o pr˚ umˇeru 0,3 mm a za ¯ = 650 nm a poloˇs´ıˇrkou spektr´ clonku byl zaˇrazen interferenˇcn´ı filtr s λ aln´ı propustnosti ∆λ = 10 nm. Tak bylo dosaˇzeno koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrky Dk = 21, 1 µm a koherenˇcn´ı délky osvˇetlen´ı Lk = 42 µm. Je zˇrejmé, ˇze v amplitudov´ ych zobrazen´ıch jsou buˇ nky jen tˇeˇzko postˇrehnutelné a kvalita obrazu se rapidnˇe zhorˇsuje pˇri pˇrechodu ke svˇetlu vyˇsˇs´ı koherence. Ve f´ azov´ ych zobrazen´ıch jsou buˇ nky pomˇernˇe dobˇre patrné. V ˇrezech proveden´ ych rekonstruovanou kvantitativn´ı f´ az´ı je zjevn´ y efekt zvyˇsován´ı koherence na zobrazen´ı. Svˇetlo s vˇetˇs´ı koherenˇcn´ı délkou a ˇs´ıˇrkou rozpt´ ylené na kuliˇckách interferuje a vytv´ aˇr´ı strukturu koherenˇcn´ı zrnitosti, kter´ a znehodnocuje jak amplitudové, tak fázové zobrazen´ı. V ˇrezech se projev´ı jako aditivn´ı ˇsum. V pˇr´ıpadech niˇzˇs´ı koherence se interference svˇetla r˚ uzn´ ych vlnov´ ych délek a z r˚ uzn´ ych bod˚ u zdroje navz´ ajem eliminuj´ı a vliv rozpt´ yleného svˇetla je potlaˇcen.

5.3. Pozorov´ an´ı bunˇ ek v opalescentn´ım m´ ediu Zv´ yˇsené schopnosti zobrazit objekty v rozptyluj´ıc´ıch prostˇred´ıch m˚ uˇze b´ yt vyuˇzito napˇr´ıklad pˇri pozorován´ı bunˇek v opalescentn´ım prostˇred´ı. Porovnali jsme zobrazen´ı bunˇek ve smˇesi Ovosanu (smˇes média a lipid˚ u) v DHM a klasickém Zernikovˇe f´ azovém kontrastu. Porovn´ an´ım jsme zjistili, ˇze rozptylem svˇetla v prostˇred´ı mimo prepar´ at je chod paprsk˚ u svˇetla natolik naruˇsen´ y, ˇze zobrazen´ı metodou klasického Zernikova f´ azového kontrastu je velmi bl´ızké obyˇcejnému zobrazen´ı ve svˇetlém poli, které je pro zobrazen´ı bunˇek nevhodné. Jiˇz pˇri koncentraci lipid˚ u v médiu 0,3% byly v klasickém fázovém kontrastu buˇ nky nepozorovatelné. Pˇri zobrazen´ı v DHM byly patrné nejen buˇ nky, ale i jejich detaily (viz obr. 5.7). Parametry osvˇetlen´ı v DHM, Dk = 21, 1 µm a Lk = 42 µm, byly kompromisem mezi pouˇzitelnost´ı mikroskopu ve smyslu naladˇen´ı interference a schopnost´ı zobrazit preparát v rozptyluj´ıc´ım prostˇred´ı potlaˇcen´ım rozpt´ yleného svˇetla. Na obrázku 5.7 jsou zobrazeny v horn´ım ˇr´ adku rekonstruované amplitudy a ve spodn´ım ˇrádku rekonstruované fáze bunˇek v Ovosanu o koncentraci 0,3% a – na zaˇc´ atku pozorov´ an´ı a b – po 14,5 hodinách. Z obrázk˚ u je dobˇre patrn´ a zmˇena tvaru a morfologie bunˇek zp˚ usobena pobytem v tomto médiu. Pˇri pozorován´ı v opalescentn´ıch médi´ıch se obecnˇe vyskytuje problém, kter´ y znemoˇzn ˇuje navázán´ı fáze. Na okraj´ıch drobn´ ych rozptyluj´ıc´ıch ˇc´ astic v kom˚ urce prepar´ atu doch´ az´ı k silnému lomu ˇci odrazu svˇetla, kter´ y následnˇe vede k potlaˇcen´ı interferenˇcn´ıho jevu v daném m´ıstˇe. D˚ usledkem je nulová intenzita zobrazen´ı v tˇechto m´ıstech a nedefinovan´ a f´ aze, takˇze je nutné

36

´ Í BUNEK ˇ V OPALESCENTNÍM MEDIU ´ 5.3. POZOROVAN

Obrázek 5.7: Buˇ nky v opalescentn´ım médiu zobrazené v DHM pˇri osvˇetlen´ı s parametry adku je rekonstruovan´ a amplituda a v doln´ım ˇr´ adku Dk = 21, 1 µm, Lk = 42 µm. V horn´ım ˇr´ rekonstruovaná fáze bunˇek v Ovosanu o koncentraci 0, 3% a – na poˇc´ atku pozorov´ an´ı a b – po 14,5 hodinách. Objektivy 20×/0, 40. tyto oblasti vyˇradit z rekonstrukce nebo je vhodnˇe nahradit. Touto ˇc´ ast´ı zpracov´ an´ı obrazu jsem se ve své pr´ aci nezab´ yvala.

37

Kapitola 6

V´ yznam kvantitativn´ıho f´ azov´ eho kontrastu buˇ nky C´ılem následuj´ıc´ı kapitoly je shrnout poznatky, které pˇrisoud´ı f´ azovému zobrazen´ı buˇ nky z holografického mikroskopu v´ yznam zobrazen´ı rozloˇzen´ı jej´ı suché hmoty a vysvˇetluje, co pojem suchá hmota buˇ nky zahrnuje. K tomuto u ´ˇcelu nejdˇr´ıve odvod´ıme, jak souvis´ı index lomu buˇ nky s koncentrac´ı jej´ı suché hmoty (odstavec 6.1) a na základˇe této souvislosti odvod´ıme, ˇze ploˇsn´ a hustota suché hmoty je pˇr´ımo u ´mˇerná kvantitativn´ı fázi z DHM (odstavec 6.2).

6.1. Vztah indexu lomu a hustoty Rozd´ıl optické dráhy δ vlny zp˚ usoben´ y pr˚ uchodem l´ atkou v˚ uˇci vlnˇe proch´ azej´ıc´ı vzduchem z´ avis´ı na jej´ım indexu lomu n látky. Index lomu l´ atky je funkc´ı jej´ı hustoty ρ, coˇz vyjadˇruje Lorentz˚ uvLorenz˚ uv vztah, ze kterého plyne ([46], str. 88) n2 − 1 M = R, n2 + 2 ρ

(6.1)

kde

4π Nm p, (6.2) 3 Nm je Avogadrova konstanta, p je stˇredn´ı polarizovatelnost molekuly a M je hmotnost molekuly. Vztah (6.1) m˚ uˇzeme pˇrepsat do tvaru R=

n+1 M (n − 1) = R. 2 ρ n +2

(6.3)

V rozsahu index˚ u lomu vˇetˇsiny znám´ ych tekutin n = (1, 3; 1, 6) se prvn´ı zlomek rovnice (6.3) mˇen´ı pouze v rozsahu hodnot (0, 6233; 0, 5702). Pro tekutiny tedy m˚ uˇzeme vztah (6.3) nahradit v´ yrazem n−1 = η, (6.4) ρ kde η je konstanta závisej´ıc´ı na R a M [37]. Experiment´ alnˇe byl tento vztah ovˇeˇren v [47]. Ukázalo se, ˇze R a tedy i n u ´zce souvis´ı s objemem atom˚ u a také s meziatomov´ ymi vazbami v molekule. Vˇsechny organické l´ atky jsou pˇrev´ aˇznˇe tvoˇreny atomy uhl´ıku, vod´ıku, dus´ıku a kysl´ıku a typy vazeb v r˚ uzn´ ych organick´ ych l´ atk´ ach jsou tedy pˇrev´ aˇznˇe stejné. Za tˇechto podm´ınek m˚ uˇzeme pˇredpokládat malé rozd´ıly v jejich refraktivn´ıch vlastnostech. 38

6.1. VZTAH INDEXU LOMU A HUSTOTY V pˇr´ıpadˇe extrémnˇe velk´ ych molekul, jako jsou proteiny, dokonce pomˇernˇe znaˇcné variace v jejich sloˇzen´ı neovlivn´ı v´ yraznˇe jejich index lomu. V´ yjimkou jsou pigmentové proteiny, ve kter´ ych se vyskytuj´ı v´ıcenásobné vazby, které sice zvyˇsuj´ı hodnotu R, ale to se projev´ı pˇredevˇs´ım v ultrafialovém svˇetle. Lze tedy ˇr´ıci, ˇze ve viditelné oblasti svˇetelného spektra je moˇzné pˇredpokl´ adat stejný index lomu pro vˇsechny proteiny [37]. Buˇ nku lze povaˇzovat za roztok protein˚ u, jehoˇz hustota line´ arnˇe z´ avis´ı na koncentraci protein˚ u, coˇz je dokázáno napˇr. v [48], [49], [50]. Vyjádˇr´ıme tedy hustotu buˇ nky ̺B obecnˇe jako ̺B = a + bC,

(6.5)

kde a a b jsou konstanty a C je koncentrace protein˚ u v buˇ nce. Dosazen´ım (6.5) do v´ yrazu (6.4) a jeho u ´pravou dostaneme nB = 1 + ηa + ηb C, | {z } |{z} αs K

(6.6)

nB = K + αs C.

(6.7)

nky. Pro zjednoduˇsen´ı vztahu 6.6 zavedeme konstanty K a αs , takˇze kde nB je index lomu buˇ

Pokud C = 0, nahlédneme, ˇze K vyjadˇruje index lomu tekutiny, ve které jsou proteiny rozpuˇstˇeny, tedy index lomu rozpouˇstˇedla, nR . M˚ uˇzeme tedy ps´ at nB − nR = αs C.

(6.8)

Koncentrace C roztoku je obvykle mˇeˇrena v jednotk´ ach g/100 ml = g/100 cm3 a konstanta αs , uvádˇená vˇetˇsinou v jednotkách 100ml/g = 100cm3 /g, je zn´ ama jako specifický refraktivn´ı pˇr´ır˚ ustek. Hodnoty αs byly zkoumány pro r˚ uzné proteiny rozpustné ve vodˇe (napˇr. [5], [37])1 . Bylo zjiˇstˇeno, ˇze se pˇr´ıliˇs neliˇs´ı a pohybuj´ı se v rozsahu (0, 00179 − 0, 00192) 100ml/g [37]. Faktory ovlivˇ nuj´ıc´ı hodnotu αs Zab´ yvejme se zmˇenami hodnot αs v z´ avislosti na zmˇenˇe experiment´ aln´ıch podm´ınek. 1. pH roztoku Hodnoty αs nejsou v´ yraznˇe ovlivnˇeny zmˇenou pH roztoku ani koncentrac´ı sol´ı v roztoku [37]. 2. Teplota yv´ a ˇcl´ anek [50]. Bylo zjiˇstˇeno, ˇze pˇri poklesu teploty Vlivem zmˇeny teploty na αs se zab´ ◦ ◦ z 25 C na 5 C hodnota αs pro zkouman´ y protein, kter´ ym byl lidsk´ y albumin, vzrostla z 0,001854 100ml/g na 0,001887 100ml/g, coˇz nen´ı pˇr´ıliˇs v´ yrazn´ a zmˇena. Jiné publikace zmˇenu αs vlivem teploty nepotvrdily. 1

V publikac´ıch b´ yv´ a specifick´ y refraktivn´ı pˇr´ır˚ ustek oznaˇcov´ an jako α.

39

´ ´ ˇ 6.2. VYZNAM KVANTITATIVNÍ FAZE BUNKY 3. Vlnová délka an v maxim´ aln´ım rozsahu od 366 nm do 656 nm a m˚ uˇze Vliv vlnové délky na αs byl zkoum´ b´ yt ve viditelné ˇcásti spektra vyj´ adˇren vztahem [50] αs,Λ = αs,578

2 · 104 0, 940 + Λ2

!

,

(6.9)

kde Λ je bezrozmˇerná hodnota vlnové délky v nanometrech a αs,578 je hodnota specifického refraktivn´ıho pˇr´ır˚ ustku pro vlnovou délku 578 nm, pro kterou bylo provedeno velké mnoˇzstv´ı mˇeˇren´ı [50]. Hodnoty αs jsou vˇetˇsinou uv´ adˇeny pro zelené nebo ˇzluté svˇetlo. 4. Index lomu rozpouˇstˇedla uzn´ ych indexech lomu. Jelikoˇz rozpouˇstˇedla Parametr αs se jistˇe mˇen´ı pro rozpouˇstˇedla o r˚ v buˇ nkách maj´ı velmi podobn´ y index lomu, nehraje tento fakt roli, pokud se nejedn´ a o komponenty rozpustné v nevodnat´ ych médi´ıch nebo ve velmi koncentrovan´ ych roztoc´ıch soli. 5. Látky neproteinové povahy v buˇ nce Co se t´ yˇce lipid˚ u a sacharid˚ u pˇr´ıtomn´ ych v buˇ nce, jsou vˇetˇsinou v´ az´ any na proteiny do komplex˚ u – tzv. lipoprotein˚ u a glykoprotein˚ u, jejichˇz αs je velmi bl´ızké samotn´ ym protein˚ um. Specifick´ y refraktivn´ı pˇr´ır˚ ustek nukleov´ ych kyselin, aminokyselin a ostatn´ıch komponent buˇ nky neproteinové povahy je také velmi bl´ızk´ y protein˚ um. u je pˇribliˇznˇe konZ uveden´ ych v´ yzkum˚ u vypl´ yvá, ˇze hodnota αs pro vodné roztoky protein˚ stantou nehledˇe na typ proteinu a na vliv faktor˚ u 1 − 5. C´ılem u ´vah je urˇcit hodnotu αs pro protoplazmu2 ˇzivé buˇ nky, coˇz je komplexn´ı slouˇcenina protein˚ u, cukr˚ u, tuk˚ u a v´ yˇse zm´ınˇen´ ych komponent neproteinové povahy rozpuˇstˇen´ ych ve vodˇe. Nen´ı sice moˇzné pˇresnˇe urˇcit hodnotu αs protoplazmy jiˇz z toho d˚ uvodu, ˇze se bude zˇrejmˇe pro r˚ uzné typy bunˇek do jisté m´ıry liˇsit. U témˇeˇr vˇsech typ˚ u bunˇek jsou ale hlavn´ı pevnou organickou sloˇzkou protoplazmy proteiny a alespoˇ n ˇc´ ast sacharid˚ u a tuk˚ u je pˇr´ıtomna ve formˇe komplex˚ u s proteiny. Obecnˇe se tedy uvaˇzuje stˇredn´ı hodnota αs pro protoplazmu 0,00180 100ml/g [37]. To je o nˇeco niˇzˇs´ı stˇredn´ı hodnota neˇz pro vˇetˇsinu roztok˚ u protein˚ u, protoˇze bere v u ´vahu vliv lipid˚ u a sacharid˚ u. Podle [37] nen´ı pravdˇepodobné, ˇze by se tento odhad liˇsil od skuteˇcné hodnoty o v´ıce neˇz 5%, ale je tˇreba brát v u ´vahu pˇredpoklady, které byly pro tuto teorii stanoveny.

6.2. V´ yznam kvantitativn´ı f´ aze buˇ nky Rozd´ıl optick´ ych drah δ indukovan´ y buˇ nkou, kter´ y namˇeˇr´ıme interferenˇcn´ım mikroskopem je v pˇr´ıpadˇe ideáln´ıho zobrazen´ı definován vztahem δ(x, y) =

Z

[nB (x, y, z) − nM ] dz,

(6.10)

kde x, y oznaˇcuj´ı souˇradnice kolmé na optickou osu objektivu pˇredmˇetové vˇetve, z je souˇradnice ve smˇeru optické osy a nB , nM jsou pˇr´ısluˇsné indexy lomu buˇ nky a média. Médium je oznaˇcen´ı pro okoln´ı prostˇred´ı buˇ nky. Dále pˇredpokl´ ad´ ame, ˇze v pˇredmˇetové vˇetvi DHM je buˇ nka v médiu a v referenˇcn´ı vˇetvi je opticky totoˇzn´ y pˇredmˇet, ale bez buˇ nky. 2

Protoplazma je metabolicky aktivn´ı ˇziv´ a hmota vyplˇ nuj´ıc´ı vnitˇrn´ı ˇc´ ast buˇ nky.

40

´ ´ ˇ 6.2. VYZNAM KVANTITATIVNÍ FAZE BUNKY Jestliˇze C ve vztahu (6.8) je uvedeno v jednotk´ ach g/100 ml, zavedeme C ′ tak, ˇze [C ′ ] =g/ml. Potom (6.8) lze pˇrepsat do tvaru nB (x, y, z) = nR + 100αs C ′ (x, y, z).

(6.11)

Jelikoˇz médium je velmi pˇr´ıbuzné rozpouˇstˇedlu v buˇ nce, m˚ uˇzeme mu pˇrisoudit stejn´ y index lomu, tedy n M = nR . (6.12) Vezmeme-li v u ´vahu tento fakt a dosad´ıme-li rovnici (6.11) do rovnice (6.10), dostaneme Z

δ(x, y) = 100αs C ′ (x, y, z) dz.

(6.13)

nky v gramech na mililitr, pak celJestliˇze C ′ udává koncentraci, tj. mnoˇzstv´ı suché hmoty buˇ kovou suchou hmotu buˇ nky W v gramech ud´ av´ a integr´ al pˇres objem buˇ nky V. W =

ZZZ

C ′ (x, y, z) dx dy dz.

(6.14)

V

Integrujeme-li (6.13) pˇres plochu pr˚ umˇetu buˇ nky S do roviny x, y, obdrˇz´ıme ZZ

S

ZZZ

δ(x, y) dx dy = 100αs

C ′ (x, y, z) dx dy dz,

(6.15)

V

kde integrál na pravé stranˇe je roven W . Po dosazen´ı (6.14) do (6.15) vyj´ adˇr´ıme suchou hmotu buˇ nky jako W =

1 100αs

ZZ

δ(x, y) dx dy.

(6.16)

S

Rozd´ıl fáze pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vlny φ(x, y) z´ıskan´ y rekonstrukc´ı hologramu definujeme jako 2π φ(x, y) = kδ(x, y) = δ(x, y), (6.17) λ kde k je vlnové ˇc´ıslo. Vztah mezi pozorovanou fáz´ı a suchou hmotou buˇ nky m˚ uˇzeme pomoc´ı vztahu (6.17) vyj´ adˇrit jako ZZ λ W = φ(x, y) dx dy. (6.18) 200παs S Ze vztahu (6.18) je zˇrejmé, ˇze pozorovan´ a f´ aze buˇ nky v DHM je u ´mˇern´ a ploˇsné hustotˇe jej´ı suché hmoty. Pˇri pˇrechodu na diskrétn´ı rozloˇzen´ı f´ aze zp˚ usobené digitalizac´ı obrazu m˚ uˇzeme ps´ at W (i, j) =

λ 200παs

ZZ

φ(i, j) dx dy,

(6.19)

Si,j

kde i a j urˇcuj´ı polohu pixelu ve fázovém zobrazen´ı, W (i, j) oznaˇcuje suchou hmotu odpov´ıdaj´ıc´ı ploˇse buˇ nky zobrazené na obrazov´ y pixel i, j a Si,j oznaˇcuje plochu daného pixelu, pˇres kterou integrujeme. V digit´ aln´ım zobrazen´ı je fáze φ(i, j) povaˇzov´ ana za konstantn´ı na ploˇse pixelu fázového zobrazen´ı. Protoˇze kaˇzdému pixelu zobrazen´ı odpov´ıd´ a stejn´ a plocha pr˚ umˇetu prepar´ atu do

41

´ ´ ˇ 6.2. VYZNAM KVANTITATIVNÍ FAZE BUNKY roviny x, y, kterou oznaˇc´ıme ∆S, fáze φ(i, j) buˇ nky na ploˇse odpov´ıdaj´ıc´ı ploˇse pr˚ umˇetu do jednoho pixelu je pˇr´ımo u ´mˇerná suché hmotˇe buˇ nky W (i, j), tedy W (i, j) =

λ∆S φ(i, j). 200παs

(6.20)

Suchou hmotu tvoˇr´ı látky jako proteiny, cukry, tuky a jejich slouˇceniny, nukleové kyseliny a aminokyseliny, které jsou nositelem ˇzivotn´ıch proces˚ u v buˇ nce. Zmˇeny suché hmoty odhaluj´ı dynamiku tˇechto proces˚ u a vypov´ıdaj´ı o dˇej´ıch odehr´ avaj´ıc´ıch se jak na povrchu tak i uvnitˇr buˇ nky. Právˇe tyto pochody sledujeme, pozorujeme-li obrazovou f´ azi z DHM a jej´ı dynamiku.

42

Kapitola 7

Zpracov´ an´ı a vyhodnocen´ı obrazu Z holografického zobrazen´ı lze numericky rekonstruovat celou pˇredmˇetovou vlnu, tedy jej´ı intenzitu i fázi. Rekonstrukce je provádˇena pomoc´ı fourierovsk´ ych metod a je pops´ ana v [41], str. 20 – 25.

7.1. Z´ akladn´ı u ´ pravy kvantitativn´ı f´ aze V holografickém zobrazen´ı fáze je oproti jin´ ym f´ azov´ ym zobrazen´ım (klasick´ y Zernik˚ uv f´ azov´ y kontrast, DIC) u ´roveˇ n ˇsedé v obrazu line´ arnˇe u ´mˇern´ a f´ azi, proto holografické zobrazen´ı fáze m˚ uˇzeme oznaˇcit jako kvantitativn´ı fázov´ y kontrast. Jak bylo uk´ az´ ano v odstavci 6.2, kvantitativn´ı fáze buˇ nky je pˇr´ımo u ´mˇerná ploˇsné hustotˇe jej´ı suché hmoty. Proto jsme se zab´ yvali v anal´ yze experimentáln´ıch dat pˇredevˇs´ım kvantitativn´ı f´ az´ı. Prvn´ı u ´pravou fáze v pˇr´ıpadˇe, ˇze rozsah hodnot f´ aze je vˇetˇs´ı neˇz 2π, je jej´ı nav´ az´ an´ı ([41], str. 25). Odstran´ıme fázové skoky a rozˇs´ıˇr´ıme obor hodnot f´ aze z intervalu h0, 2π) na h0, mi, kde kladné ˇc´ıslo m > 2π reprezentuje maxim´ aln´ı hodnotu f´ aze pˇredmˇetové vlny. Po této u ´pravˇe z´ıskáme obraz fáze pˇredmˇetové vlny, kter´ y je souˇctem f´ azového posuvu v prepar´ atu a fázov´ ych aberac´ı vznikl´ ych pr˚ uchodem vlny mikroskopem, popˇr´ıpadˇe nepˇresnost´ı pˇri automatickém urˇcován´ı nosné frekvence interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u pˇri rekonstrukci obrazu. Tyto aberace se projevuj´ı modulac´ı, popˇr´ıpadˇe naklonˇen´ım f´ azového zobrazen´ı prepar´ atu. Pro jejich eliminaci rekonstruujeme zobrazen´ı fáze pouze aberac´ı bez prepar´ atu a to odeˇc´ıt´ ame od zobrazen´ı fáze s preparátem. V naˇsem pˇr´ıpadˇe je fázov´ ym zobrazen´ım prepar´ atu rekonstruovan´ a f´ aze kom˚ urky s buˇ nkami a médiem a zobrazen´ım aberac´ı je rekonstruovan´ a f´ aze kom˚ urky s médiem bez bunˇek, tzv. pozad´ı. Ukázalo se, ˇze pozad´ı se bˇehem experiment˚ u mˇen´ı. To m˚ uˇze b´ yt zp˚ usobeno napˇr´ıklad nestabilitou justáˇzn´ıch prvk˚ u, vyrovnáván´ım teploty prepar´ atu s okol´ım nebo lok´ aln´ımi zmˇenami indexu lomu média v d˚ usledku metabolizmu bunˇek. Jelikoˇz posuv preparátu nen´ı automatizovan´ y, nelze prov´ adˇet referenˇcn´ı sn´ımky pozad´ı bˇehem pozorován´ı. Po ukonˇcen´ı pozorov´ an´ı jsou proto oper´ atorem v kaˇzdém obr´ azku f´ aze oznaˇceny obdéln´ıkové oblasti, ve kter´ ych se nevyskytuj´ı buˇ nky a tˇemi je proloˇzena plocha, která aproximuje pozad´ı. Tato plocha je od daného f´ azového sn´ımku odeˇctena. Bylo otestov´ ano (Ing. Tomáˇs Zikmund), ˇze pro nejlepˇs´ı eliminaci aberac´ı pozad´ı je vhodn´ a polynomi´ aln´ı plocha ’ 3. stupnˇe. Koeficienty polynom˚ u jsou poˇc´ıt´ any pro kaˇzd´ y obr´ azek zvl´ aˇst . Tato operace klade nároky na vzhled prepar´ atu v tom smyslu, ˇze v zorném poli se mus´ı vyskytovat oblasti bez bunˇek umoˇzn ˇuj´ıc´ı jednoznaˇcné proloˇzen´ı aberaˇcn´ı plochy. Nelze tedy

43

´ FAZOV ´ ´ DIFERENCE 7.2. DYNAMICKE E provádˇet korekci pro souvislou vrstvu bunˇek. Pˇri popsané korekci obrazu f´ aze prob´ıh´ a lokalizace oblast´ı pozad´ı pouze v prvn´ım ze sn´ımk˚ u ˇcasosbˇerné série pozorov´ an´ı, v ostatn´ıch sn´ımc´ıch je poloha a velikost vybran´ ych oblast´ı stejn´ a. Automatick´ a kontrola oblast´ı v˚ uˇci pˇr´ıtomnosti buˇ nky nen´ı zajiˇstˇena. Nesprávná korekce se projev´ı pˇri vizu´ aln´ı kontrole korigovan´ ych sn´ımk˚ u a v´ ybˇer oblast´ı je nutné opakovat. Rozsah hodnot fáze je v d˚ usledku ˇsumu a navazov´ an´ı f´ aze v kaˇzdém sn´ımku jin´ y. V d˚ usledku toho má pr˚ umˇerná hodnota fáze pozad´ı v kaˇzdém sn´ımku jinou hodnotu. Pro prohl´ıˇzen´ı ˇcasosbˇerné série po sobˇe následuj´ıc´ıch sn´ımk˚ u je nutné hladinˇe pozad´ı pˇriˇradit stejnou hodnotu fáze ve vˇsech sn´ımc´ıch. K tomuto u ´ˇcelu se urˇc´ı pr˚ umˇern´ a hodnota v´ yˇrezu pozad´ı φ¯p, q v oblasti bez bunˇek ve stejném m´ıstˇe kaˇzdého sn´ımku q a ta je odeˇctena od f´ aze kaˇzdého pixelu aze pozad´ı vyrovn´ ana na stejnou φq (i, j), kde i, j udávaj´ı polohu pixelu v obraze. T´ım je hladina f´ hodnotu. Poté se odeˇcte absolutn´ı minimum hodnot f´ aze vˇsech sn´ımk˚ u φq, min (i, j) < 0, ˇc´ımˇz je dosaˇzeno rozsahu oboru hodnot upravené f´ aze Φq ∈ h0, ma i, kde ma je absolutn´ı maximum hodnot fáze vˇsech sn´ımk˚ u. Φq (i, j) = [φq (i, j) − φ¯p, q ] − φq, min (i, j).

(7.1)

Tˇemito u ´pravami je zajiˇstˇeno maximáln´ı osové rozliˇsen´ı zmˇen f´ aze prepar´ atu v ˇcase. V upraveném zobrazen´ı fáze Φ je moˇzné provést prahov´ an´ı bunˇek a pozad´ı. Z obdéln´ıkového ¯ p, q v kaˇzdém v´ yˇrezu um´ıstˇeného do pozad´ı obrazu fáze s buˇ nkami se urˇc´ı pr˚ umˇern´ a hodnota Φ ze sn´ımk˚ u. Prahován´ı prob´ıhá následovnˇe: ¯ p, q , pokud Φq (i, j) ≤ Φ ¯ p, q , pokud Φq (i, j) > Φ

pak

Φq (i, j) = 0,

(7.2)

pak

¯ p, q . Φq (i, j) = Φq (i, j) − Φ

(7.3)

7.2. Dynamick´ e f´ azov´ e diference Pro vyuˇzit´ı kvantitativn´ı informace, kterou poskytuje f´ azov´ a rekonstrukce z DHM, m´ a v´ yznam jak jej´ı hodnota v˚ uˇci nulové fázi definované v m´ıstech, kde f´ aze pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vlny maj´ı stejnou hodnotu, tak také relativn´ı hodnota f´ aze v˚ uˇci f´ azi v jin´ ych ˇcasov´ ych okamˇzic´ıch bˇehem pozorován´ı. Aˇckoli jsme se v kapitole 6 zab´ yvali v´ yznamem hodnoty f´ aze buˇ nky teoreticky, experimentálnˇe jsme se zamˇeˇrili pouze na v´ yznam relativn´ıch hodnot, tedy zmˇen f´ aze v ˇcase. Pro zviditelnˇen´ı zmˇen rozloˇzen´ı suché hmoty buˇ nky bˇehem pozorov´ an´ı byla vyvinuta metoda dynamických f´ azových diferenc´ı (DPD). Tato metoda je zaloˇzena na odliˇsném zobrazen´ı kladn´ ych a z´ aporn´ ych rozd´ıl˚ u kvantitativn´ı fáze dvou sn´ımk˚ u ΦD poˇr´ızen´ ych v r˚ uzn´ ych ˇcasech pozorov´ an´ı. Pokud ΦD > 0, jedná se o pˇr´ır˚ ustek suché hmoty buˇ nky a je zn´ azornˇen v obr´ azku DPD ˇcervenou barvou tak, ˇze jas barvy odpov´ıdá hodnotˇe ΦD . Hodnoty ΦD < 0 vyjadˇruj´ı u ´bytek suché hmoty, jsou oznaˇceny ve stejném obrázku DPD zelenou barvou a jas barvy odpov´ıd´ a hodnotˇe −ΦD . Pro ΦD = 0 je jas barvy nulov´ y (ˇcerná). DPD m˚ uˇzeme vypoˇc´ıtat jako rozd´ıl po sobˇe n´ asleduj´ıc´ıch sn´ımk˚ u f´ aze, coˇz nazveme jako postupné DPD ΦD1, q (i, j) = Φq+1 (i, j) − Φq (i, j), q = 1, 2, ..., w − 1, (7.4) kde w je poˇcet sn´ımk˚ u. DPD m˚ uˇzeme ale spoˇc´ıtat i jako rozd´ıl pˇr´ısluˇsného a poˇc´ ateˇcn´ıho sn´ımku, coˇz nazveme DPD vzhledem k poˇca ´tku ΦD2, q (i, j) = Φq (i, j) − Φ1 (i, j), 44

q = 1, 2, ..., w.

(7.5)

´ VYHODNOCENÍ DPD 7.3. STATISTICKE Odeˇcten´ı dvou obraz˚ u kvantitativn´ı f´ aze a odliˇsné oznaˇcen´ı kladn´ ych a z´ aporn´ ych diferenc´ı bylo navrˇzeno jiˇz G. A. Dunnem v [22]. Inovace této metody spoˇc´ıv´ a pˇredevˇs´ım ve vyˇsˇs´ım ˇcasovém rozliˇsen´ı metody, které je vyuˇzito pˇri prom´ıtnut´ı po sobˇe n´ asleduj´ıc´ıch ΦD, q . T´ımto zp˚ usobem lze vizuálnˇe i elektronicky vyhodnotit okamˇzité zmˇeny rozm´ıstˇen´ı suché hmoty buˇ nky bˇehem reakce (postupné DPD) nebo v´ yvoj reakce (DPD vzhledem k poˇc´ atku). Vizualizace dynamick´ ych fázov´ ych diferenc´ı a jejich barevné oznaˇcen´ı umoˇzn ˇuje zv´ yraznit pohyby drobn´ ych ˇcást´ı buˇ nky, které jsou pouh´ ym pozorov´ an´ım kvantitativn´ı f´ aze velmi tˇeˇzko postˇrehnutelné. Tato skuteˇcnost je demonstrov´ ana na obr´ azku 7.1. Zat´ımco rozd´ıl rozloˇzen´ı hmoty mezi obrázky 7.1a a 7.1b v ˇcasech t a t+25 s je tˇeˇzko postˇrehnuteln´ y, DPD na obr´ azku 7.1c dává jasnou pˇredstavu o tom, k jak´ ym zmˇen´ am v ˇcasovém intervalu 25 sekund doˇslo.

Obrázek 7.1: Kvantitativn´ı fáze buˇ nky v ˇcasech t na obr´ azku a, t + 25 s na obr´ azku b a DPD mezi tˇemito sn´ımky na obrázku c. Je zˇrejmé, ˇze DPD zv´ yrazn´ı zmˇeny rozloˇzen´ı suché hmoty buˇ nky. Dalˇs´ı moˇznost´ı zobrazen´ı je kombinace f´ azov´ ych diferenc´ı s intenzitou (modr´ a barva). To se ale neukazuje pˇr´ıliˇs v´ yhodné, protoˇze intenzita je mnohem v´ıce poznamen´ ana ˇsumem neˇz f´ aze.

7.3. Statistick´ e vyhodnocen´ı DPD Obrázek DPD ukazuje suchou hmotu buˇ nky, kter´ a se pˇrem´ıstila ve zvoleném ˇcasovém intervalu. Této informace lze vyuˇz´ıt pˇri posuzován´ı m´ıry pohyblivosti buˇ nky, a to jak pˇri pˇresouv´ an´ı z m´ısta na m´ısto – migraci, tak i pˇri vnitrobunˇeˇcném pohybu, kter´ y m´ a vyˇsˇs´ı frekvenci. Zamˇeˇrili jsme se na statistické vyhodnocen´ı vnitrobunˇeˇcného pohybu. K tomu bylo navrˇzeno následuj´ıc´ı zpracován´ı kvantitativn´ı fáze. azku V kaˇzdém sn´ımku q byla nejdˇr´ıve spoˇctena suma kladn´ ych DPD Aq v celém obr´ Aq =

N X M X

i=1 j=1

ΦD1, q (i, j) =

N X M X

[Φq+1 (i, j) − Φq (i, j)]

pro

ΦD1, q (i, j) > 0,

(7.6)

i=1 j=1

kde N a M jsou rozmˇery obrázku v pixelech. Hodnota Aq je celkov´ a kladn´ a zmˇena f´ aze v obr´ azku a se pˇrem´ıstila q za dan´ y ˇcasov´ y interval. Tato hodnota je u ´mˇern´ a celkové hmotˇe AW, q , kter´ v daném ˇcasovém intervalu: AW, q =

N X M λ∆S X ΦD1, q (i, j), 100α2π i=1 j=1

45

(7.7)

ˇ Í DHM 7.4. ROZLISEN kde ∆S je plocha preparátu pˇripadaj´ıc´ıho na pixel zobrazen´ı. Sledovaná veliˇcina mus´ı b´ yt nezávisl´ a na poˇctu bunˇek v zorném poli nebo na jejich velikosti. Proto zavedeme normován´ım Aq veliˇcinu Bq

100α2π AW, q = = Bq = N M N X M λ∆S X XX Φq+1 (i, j) Φq+1 (i, j) Aq

i=1 j=1

i=1 j=1

M N X X

[Φq+1 (i, j) i=1 j=1 N X M X

− Φq (i, j)] ,

(7.8)

Φq+1 (i, j)

i=1 j=1

coˇz vyjadˇruje normované mnoˇzstv´ı suché hmoty, kter´ a se pˇrem´ıstila v daném ˇcasovém intervalu. Tato charakteristika nebere v u ´vahu fakt, ˇze nˇekteré ˇc´ asti bunˇek se pohybuj´ı v´ıce neˇz jiné ˇcásti. Vyjadˇruje celkov´ y pˇresun suché hmoty vztaˇzen´ y na jednotku suché hmoty.

7.4. Rozliˇ sen´ı DHM Pˇ r´ıˇ cn´ e rozliˇ sen´ı Pˇr´ıˇcné rozliˇsen´ı DHM je stejnˇe jako u konvenˇcn´ıho mikroskopu omezeno difrakc´ı svˇetla na apertuˇre objektivu. Rozliˇsen´ı ∆ závis´ı na numerické apertuˇre NA pouˇzit´ ych objektiv˚ u a vlnové délce: 0, 61λ ∆= . (7.9) NA Pro objektivy 10×/0, 25 a vlnovou délku 650 nm je ∆ = 1, 59 µm, pro objektivy 20×/0, 40 a tutéˇz vlnovou délku je ∆ = 0, 99 µm. Pod´ eln´ e rozliˇ sen´ı Osové rozliˇsen´ı kvantitativn´ı fáze v holografickém mikroskopu (tj. rozliˇsen´ı pˇri mˇeˇren´ı rozd´ılu optick´ ych drah) je dáno rozptylem hodnot kvantitativn´ı f´ aze vlivem ˇsumu. Z ([51], str. 63) plyne, ˇze hodnoty fáze pozorované za t´ ychˇz experiment´ aln´ıch podm´ınek v jednom pixelu v r˚ uzn´ ych sn´ımc´ıch nebo ve vybran´ ych pixelech v jednom sn´ımku v oblasti s konstantn´ım f´ azov´ ym posunem podléhaj´ı normáln´ımu rozdˇelen´ı. Provedli jsme mˇeˇren´ı hodnot f´ aze ve vybraném pixelu ve 100 sn´ımc´ıch z ˇcasového intervalu 8,3 minut. Rozptyl tˇechto hodnot byl pr˚ umˇernˇe 4, 77 · 10−5 rad, coˇz odpov´ıdá rozd´ılu optick´ ych drah 0, 005 nm.

46

Kapitola 8

Experimenty s buˇ nkami Po u ´pravách mikroskopu popsan´ ych v kapitole 3 a po vybudov´ an´ı biologického pracoviˇstˇe popsaného v dodatku jsme pˇristoupili k experiment˚ um s ˇziv´ ymi buˇ nkami. Odstavec 8.3 popisuje experiment reakce bunˇek na toxickou l´ atku cis-platinu. V odstavci 8.2 je uvedeno pozorován´ı odezvy r˚ uzn´ ych typ˚ u rakovinov´ ych bunˇek r˚ uznˇe hustého porostu na energetickou a nutriˇcn´ı deprivaci. Odstavec 8.4 popisuje experiment porovn´ an´ı motility dvou typ˚ u pˇr´ıbuzn´ ych bunˇek za standardn´ıch podm´ınek a za p˚ usoben´ı extern´ıho stimulu. Pˇ rehled bunˇ ek pouˇ zit´ ych v experimentech LF K2 A3

RsK4 EM-G3 G3S2 HaCaT

lidské normáln´ı podkoˇzn´ı fibroblasty, pln´ ym oznaˇcen´ım LW13K2; krys´ı n´ adorové embryon´ aln´ı fibroblasty, pln´ ym oznaˇcen´ım A337/311RP; krys´ı n´ adorové buˇ nky, které byly in vivo selektovány z L13K2 na metastatick´ y potenci´ al do plic [52] projevuj´ıc´ı se vysok´ ym v´ yskytem metast´ az (90 − 100 %)[53], krys´ı nádorové buˇ nky odvozené ze spont´ annˇe in vitro neoplasticky transformovan´ ych K2 supertransformac´ı virem Rousova sarkomu [54], lidské nádorové buˇ nky z prsn´ıho karcinomu [55], lidské nádorové buˇ nky odvozené z bunˇek EM-G3 neoplastickou progres´ı, lidské keratinocyty spont´ annˇe transformované in vitro.

¯ = 650 nm, Lk = 42 µm, Dk = 21, 1 µm. Parametry pouˇ zit´ eho osvˇ etlen´ı: λ

8.1. Standardn´ı pˇ r´ıprava vybaven´ı pro pozorov´ an´ı Pro pˇr´ıpravu vzork˚ u byl zaveden následuj´ıc´ı postup. Sterilizace kryc´ıch skl´ıˇ cek Kruhová kryc´ı skl´ıˇcka byla odmaˇstˇena vodou s detergentem, opl´ achnuta ˇcistou a poté deionizovanou vodou. Následnˇe byla ostˇr´ıknuta ethylalkoholem (96%) a ponoˇrena do misky s ethylalkoholem alespoˇ n na 15 minut. Po vyjmut´ı byla um´ıstˇena jeˇstˇe alespoˇ n na dalˇs´ıch 10 minut do misky s nov´ ym ethylalkoholem (96%). Poté byla ve flow-boxu op´ alena z jedné strany nad plamenem.

47

´ ´ ˇ G3S2 NA CISPT 8.2. REAKCE NADOROV YCH BUNEK Pˇ r´ıprava stacion´ arn´ıch kom˚ urek pro pozorov´ an´ı Nerezová mezikruˇz´ı byla odmaˇstˇena vodou s detergentem, opl´ achnuta ˇcistou vodou a ponoˇrena na 10 minut do ethylalkoholu. Poté bylo k mezikruˇz´ı silikonem (Loctite 5366) pˇrilepeno steriln´ı kryc´ı skl´ıˇcko a ponecháno 24 hodin pro vytvrzen´ı silikonu. Pˇred aplikac´ı bunˇek byly takto pˇripravené kom˚ urky opláchnuty vodou s detergentem, ˇcistou vodou, vodou pro tk´ an ˇové kultury a ethylalkoholem. Pˇri opˇetovném pouˇzit´ı kom˚ urek byly zbytky bunˇek odstranˇeny kart´ aˇckem a vodou s detergentem a cel´ y proces sterilizace alkoholem bez op´ alen´ı byl opakován. Takto pˇripravené polotovary kom˚ urek byly um´ıstˇeny do Petriho misek a na nˇe byly nasazeny buˇ nky. Pˇred pozorován´ım bylo z Petriho misek ods´ ato médium, kom˚ urky byly naplnˇeny nov´ ym médiem a uzavˇreny steriln´ım kryc´ım skl´ıˇckem s utˇesnˇen´ım vakuovou vazel´ınou. Pˇ r´ıprava pr˚ utokov´ ych kom˚ urek pro pozorov´ an´ı Nerezová mezikruˇz´ı byla oˇciˇstˇena jako v pˇr´ıpadˇe stacion´ arn´ıch kom˚ urek a z obou stran byla silikonem pˇrilepena steriln´ı kryc´ı skl´ıˇcka. Pˇr´ıvodn´ı a odvodn´ı jehly byly vysterilizov´ any v ethanolu a silikonem pˇrilepeny do otvor˚ u v mezikruˇz´ı. Kom˚ urky byly pˇred aplikac´ı bunˇek propláchnuty chemikáliemi v následuj´ıc´ım poˇrad´ı: • trypsin – 1. stupeˇ n oddˇelen´ı zbytk˚ u bunˇek od kultivaˇcn´ıho povrchu, • EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) – 2. stupeˇ n poruˇsen´ı kontakt˚ u bunˇek s neˇziv´ ym okol´ım, • steriln´ı H2 O pro tkán ˇové kultury – v´ yplach bunˇek a jejich zbytk˚ u, • ethylalkohol (minimáln´ı koncentrace 70%) – sterilizace prostˇred´ı, • steriln´ı H2 O pro tkán ˇové kultury – opl´ achnut´ı alkoholu, • PBS (phosphate buffered saline) – pˇr´ıprava prostˇred´ı pro nasazen´ı bunˇek. Kaˇzd´ y v´ yplach je potˇreba provádˇet objemem tekutiny rovn´ ym ˇsestin´ asobku objemu kom˚ urky. Po tˇechto procedurách byla do kom˚ urek vstˇr´ıknuta suspenze bunˇek v médiu.

8.2. Reakce n´ adorov´ ych bunˇ ek G3S2 na cisPt Jedn´ım z prvn´ıch experiment˚ u s ˇziv´ ymi buˇ nkami, kter´ ym byl analyzov´ an potenci´ al kvantitativn´ıho fázového kontrastu byl ˇcasosbˇern´ y z´ aznam reakce n´ adorov´ ych bunˇek G3S2 na cytostatikum cis-platinu (cisPt). Reakce se projevuje postupn´ ym n´ astupem programové bunˇeˇcné smrti, apoptózy, která je charakteristická prudk´ ymi zmˇenami distribuce hmoty. Proto jsme zvolili pr´ avˇe tento bunˇeˇcn´ y proces pro porovnán´ı zobrazen´ı v DHM se zobrazen´ım v klasickém Zernikovˇe fázovém kontrastu. V tomto experimentu jsme mimo jiné testovali vlastnosti mikroskopu a jeho pˇr´ısluˇsenstv´ı pˇri dlouhodobém pozorov´ an´ı. Celkov´ a doba sn´ım´ an´ı byla tˇri dny. Pˇ r´ıprava bunˇ ek ˇ Cerstvˇ e pˇripravené suspenze bunˇek byly nasazeny do Petriho misek (o pr˚ umˇeru 35 mm) s 15 ml ◦ yˇsené vlhkosti po dobu standardn´ıho kultivaˇcn´ıho média a inkubov´ any za teploty 37 C a zv´ 48

´ ´ ˇ G3S2 NA CISPT 8.2. REAKCE NADOROV YCH BUNEK dvou dn˚ u. Pro experimenty v DHM byly do Petriho misek pˇrid´ any spodn´ı ˇc´ asti stacion´ arn´ıch kom˚ urek. Pˇred pozorován´ım bylo médium ods´ ato a buˇ nky byly 1× opl´ achnuty médiem bez ˇ K buˇ ˇ s minim´ fenolové ˇcervenˇe (FC). nkám bylo pro pozorov´ an´ı pˇrid´ ano médium bez FC aln´ım terapeutick´ ym mnoˇzstv´ım cisPt. Pro referenˇcn´ı pozorov´ an´ı v klasickém f´ azovém kontrastu byly buˇ nky ponechány pˇr´ımo v Petriho misk´ ach a pro DHM byly buˇ nky uzavˇreny do stacion´ arn´ıch pozorovac´ıch kom˚ urek. Pozorov´ an´ı Nejdˇr´ıve byl nˇekolikrát proveden experiment v klasickém Zernikovˇe f´ azovém kontrastu (obr. 8.1), kter´ y ukázal indukci apoptózy pˇribliˇznˇe s frekvenc´ı mitotické aktivity. Pˇri pouˇzit´ı minimáln´ı toxické dávky doˇslo totiˇz k tomu, ˇze buˇ nky, které neproch´ azely bunˇeˇcn´ ym cyklem dˇelen´ı, na cisPt nereagovaly, zat´ım co u tˇech, které proch´ azely bunˇeˇcn´ ym cyklem nam´ısto rozdˇelen´ı buˇ nky, nastala apoptóza. Poté bylo provedeno pozorován´ı v DHM. Byla zachycena apopt´ oza (obr. 8.2) a jej´ı zobrazen´ı v kvantitativn´ım fázovém kontrastu bylo porovn´ ano se zobrazen´ım v klasickém fázovém kontrastu. I kdyˇz zábˇery z klasického f´ azového kontrastu p˚ usob´ı dojmem, ˇze maj´ı vyˇsˇs´ı pˇr´ıˇcné rozliˇsen´ı a vˇetˇs´ı kontrast, ve skuteˇcnosti obsahuj´ı artefakty, které nevypov´ıdaj´ı o skuteˇcném rozloˇzen´ı hmoty. Je to pˇredevˇs´ım d´ıky halo“ efekt˚ um, které vznikaj´ı v m´ıstech velk´ ych zmˇen ” optické tlouˇst’ky preparátu. Po apoptóze se dokonce vytv´ aˇrej´ı shluky s takov´ ym gradientem optické tlouˇst’ky, ˇze se v zobrazen´ı klasick´ ym f´ azov´ ym kontrastem objevuj´ı skoky f´ aze. Naproti tomu kvantitativn´ı fázov´ y kontrast po naváz´ an´ı ˇz´ adné skoky f´ aze neobsahuje a stupnˇe ˇsedi fázového zobrazen´ı jsou u ´mˇerné rozd´ılu optick´ ych drah indukovan´ ych buˇ nkami.

Obrázek 8.1: Apoptotická smrt buˇ nky indukovan´ a cisPt v klasickém Zernikovˇe f´ azovém kontrastu. Objektivy 10×/0, 25. Pr˚ ubˇeh apoptózy se vyznaˇcuje nˇekolika stadii. Poˇc´ ateˇcn´ı stadium je velice rychlé staˇzen´ı buˇ nky, následuje rozprsknut´ı okrajov´ ych ˇc´ ast´ı. V této f´ azi buˇ nka nˇejakou dobu setrv´ a. Posledn´ım stadiem apoptózy je nafouknut´ı okrajov´ ych ˇc´ ast´ı buˇ nky – vytvoˇr´ı se jeden nebo v´ıce puch´ yˇr˚ u, které za urˇcit´ y ˇcas splasknou. Nab´ız´ı se ot´ azka, jak´ ym mechanismem dojde k jejich splasknut´ı. Uchová si buˇ nka sv˚ uj obsah nebo praskne a vyvrhne jej? Pokud se bunˇeˇcn´ y obsah dostane opravdu mimo buˇ nku, jaké je jeho sloˇzen´ı? Toto mohou b´ yt signifikantn´ı ukazatele pro indukci apoptózy ˇci jiné bunˇeˇcné smrti. 49

´ ´ ˇ G3S2 NA CISPT 8.2. REAKCE NADOROV YCH BUNEK

Obrázek 8.2: Kvantitativn´ı fáze apoptotické buˇ nky v DHM. Objektivy 10×/0, 25.

Obrázek 8.3: 3D vizualizace kvantitativn´ı f´ aze apoptotické buˇ nky v DHM. Objektivy 10×/0, 25.

Obrázek 8.4: Zobrazen´ı posledn´ıho stadia apopt´ ozy v m´ odu DPD vzhledem k poˇc´ atku. Obr´ azky a – e jsou pˇr´ısluˇsné obrázk˚ um 8.3. Objektivy 10×/0, 25.

50

ˇ NA ENERGETICKOU A NUTRICN ˇ Í DEPRIVACI 8.3. REAKCE BUNEK V odpovˇed´ıch na tyto otázky je pˇr´ınosem m´ od dynamick´ ych f´ azov´ ych diferenc´ı. Na obrázku 8.3 je série sn´ımk˚ u demonstruj´ıc´ıch pr˚ ubˇeh kvantitativn´ı f´ aze posledn´ıho stadia apoptózy. V buˇ nce tedy probˇehlo rychlé staˇzen´ı a rozprsknut´ı a nyn´ı je zobrazen proces nafouknut´ı puch´ yˇr˚ u a následného splasknut´ı v pohledu z vhodného u ´hlu. Na obr´ azku 8.4 je v´ yˇrez stejné scény zaznamenán pomoc´ı dynamick´ ych f´ azov´ ych diferenc´ı vzhledem k poˇc´ atku. Do obr´ azk˚ u jsou pˇridány kontury, které spojuj´ı m´ısta se stejnou hodnotou f´ aze. Vnˇejˇs´ı kontura kaˇzdé buˇ nky oznaˇcuje pˇribliˇznˇe jej´ı hranice. Vizuáln´ı anal´ yza zobrazen´ı ukazuje, ˇze buˇ nka zˇrejmˇe sv˚ uj obsah opravdu vyvrhne, na coˇz se dá usoudit z pˇrechodu pevného, konturou obepnutého kulatého tvaru puch´ yˇrku (obr. 8.4d) pomˇernˇe rychle na nejednoznaˇcn´ y, ˇsirˇs´ı u ´tvar (obr. 8.4e). Pˇr´ır˚ ustky suché hmoty reprezentované ˇcervenou barvou se objev´ı mimo buˇ nku ohraniˇcenou konturou, tud´ıˇz puch´ yˇr zˇrejmˇe praskl a buˇ nka vyvrhla sv˚ uj obsah ven. N´ ar˚ ust suché hmoty mimo buˇ nku ukazuje na to, ˇze vyvrˇzená hmota buˇ nky je hustˇs´ı neˇz samotné médium obklopuj´ıc´ı buˇ nku. Potvrzen´ı této hypotézy je moˇzné pomoc´ı v´ ypoˇct˚ u celkové suché hmoty uvnitˇr buˇ nky bˇehem experimentu.

8.3. Reakce bunˇ ek na energetickou a nutriˇ cn´ı deprivaci Motivace experiment˚ u akutn´ı nutriˇcn´ı a energetické deprivace vych´ azela z klinické praxe. Pacient vyléˇcen´ y z rakovinového onemocnˇen´ı u ´spˇeˇsnˇe prodˇelanou operac´ı, ozaˇrov´ an´ım nebo chemoterapi´ı se jev´ı jako zdrav´ y. Tento stav m˚ uˇze b´ yt v budoucnu poruˇsen extern´ım stimulem, napˇr´ıklad silnˇe stresovou situac´ı, pˇri které se rakovinové bujen´ı opˇet projev´ı. Vyvst´ av´ a tedy ot´ azka, jestli rakovinové buˇ nky maj´ı nˇejaké mechanismy umoˇzn ˇuj´ıc´ı jejich pˇreˇzit´ı v silnˇe nepˇr´ızniv´ ych podm´ınkách a jejich následné znovuobnoven´ı. Proto jsme se zamˇeˇrili na experiment modeluj´ıc´ı tyto podm´ınky in vitro. Vytvoˇrili jsme energeticky a nutriˇcnˇe deprivaˇcn´ı prostˇred´ı pouˇzit´ım PBS (phosphate buffered saline) nam´ısto standardn´ıho média. Stanovili jsme soubor bunˇek s reprezentanty od normáln´ıch (zdrav´ ych) bunˇek (LF), pˇres n´ adorové nemetastazuj´ıc´ı (K2, RsK4, G3) aˇz po vysoce metastazuj´ıc´ı buˇ nky (A3, G3S2) pro typ bunˇek mesenchym´ aln´ı (fibroblasty) a epiteliáln´ı (prsn´ı). Chován´ı bunˇek bylo také zkoum´ ano v z´ avislosti na hustotˇe porostu ve dvou typech: ˇr´ıdk´ y a polohust´ y. Základn´ı rámec experiment˚ u tvoˇril test pˇreˇzit´ı bunˇek v deprivaˇcn´ım médiu, jehoˇz kritériem byla alespoˇ n jedna pˇreˇzivˇs´ı buˇ nka schopn´ a dˇelen´ı. Toto mˇeˇren´ı bylo provedeno na spolupracuj´ıc´ım pracoviˇsti v laboratoˇri Bunˇeˇcné biologie a kultivace k˚ uˇze, FNKV v Praze ˇcasosbˇern´ ym z´ aznamem technikou klasického Zernikova fázového kontrastu.

8.3.1. Zobrazen´ı v Zernikovˇ e f´ azov´ em kontrastu Pˇ r´ıprava bunˇ ek ˇ Cerstvˇ e pˇripravené suspenze bunˇek byly nasazeny do Petriho misek o pr˚ umˇeru 35 mm. Byly y a 104 bunˇek/cm2 pouˇzity dvˇe hustoty nasazen´ı bunˇek: pˇribliˇznˇe 25 · 103 bunˇek/cm2 pro ˇr´ıdk´ pro polohust´ y porost kultivaˇcn´ıho povrchu. Po dvou dnech ve standardn´ım kultivaˇcn´ım médiu bylo médium odstranˇeno a buˇ nky byly 2× opl´ achnuty PBS. Poté bylo pˇrid´ ano 5 ml PBS a buˇ nky byly inkubovány za teploty 37◦ C a zv´ yˇsené vlhkosti. Buˇ nky byly pozorov´ any v kultivaˇcn´ıch lahviˇckách s prodyˇsn´ ym uzávˇerem s filtrac´ı.

51

ˇ NA ENERGETICKOU A NUTRICN ˇ Í DEPRIVACI 8.3. REAKCE BUNEK

Obrázek 8.5: Registrace reakce bunˇek od poˇc´ atku p˚ usoben´ı PBS po bunˇeˇcnou smrt. Klasick´ y fázov´ y kontrast, objektiv 10×/0, 25 Ph. A: Lidské podkoˇzn´ı fibroblasty LF. V obr´ azc´ıch jsou uvedeny doby p˚ usoben´ı PBS. Obrázek d ukazuje nekrotickou smrt buˇ nky po 18 hodin´ ach. B: Krys´ı nádorové buˇ nky A3. Obrázek d ukazuje onkotickou smrt po 24 hodin´ ach.

52

ˇ NA ENERGETICKOU A NUTRICN ˇ Í DEPRIVACI 8.3. REAKCE BUNEK Hustota bunˇek ˇ ıdké R´ Doba p˚ usoben´ı PBS [h] Buˇ nky RsK4 A3 K2 G3S2 EM-G3

Polohusté

4

24

36

60

24

36

60

77

+ + + NT NT

+ + − + +

− + − + +

− − − − −

+ + + NT +

− − − + +

− − − + −

− − − − −

Tabulka 8.1: Test pˇreˇzit´ı bunˇek. V´ yznam symbol˚ u: + pˇreˇzit´ı bunˇek a dˇelen´ı; − destrukce bunˇek; NT nebylo testováno. Pozorov´ an´ı Pro vˇsechna pozorován´ı klasick´ ym fázov´ ym kontrastem byl pouˇzit mikroskop Nikon Diaphot 300, digitáln´ı kamera a software UniBrain. Obrázek 8.5 demonstruje reakci dvou typ˚ u bunˇek v klasickém f´ azovém kontrastu. V ˇcásti A je vidˇet mechanismus poruˇsen´ı kontakt˚ u bunˇek norm´ aln´ıch lidsk´ ych fibroblast˚ u s kultivaˇcn´ım povrchem, po kterém následuje rychlé staˇzen´ı bunˇek ke skupinˇe s vyˇsˇs´ı hustotou a – c. Na obr´ azku d je vidˇet jejich nekrotická smrt po 18 hodin´ ach v PBS. Nekr´ oza se projevuje typick´ ym rozpadem bunˇek. V ˇcásti B jsou zobrazeny buˇ nky A3 v rychlé reakci na m´ıstˇe a – c. Obr´ azek d registruje onkotickou smrt po 24 hodinách v PBS. Onk´ oza je proces podobn´ y nekr´ oze, ale pˇredch´ az´ı j´ı obrana buˇ nky ve formˇe puch´ yˇr˚ u, buˇ nka déle odol´ av´ a. V tabulce 8.1 je zaznamenána doba ˇzivota vˇsech n´ adorov´ ych typ˚ u bunˇek ve dvou koncentrac´ıch. Jako nejodolnˇejˇs´ı se projevily silnˇe invazivn´ı buˇ nky G3S2 jak v ˇr´ıdkém, tak v polohustém porostu. V polohustém porostu pˇreˇzily dokonce 60 hodin. Odolnost bunˇek klesala s klesaj´ıc´ı invazivitou bunˇek od G3S2 pˇres EM-G3, A3, RsK4 po K2.

8.3.2. Zobrazen´ı v DHM Pˇ r´ıprava bunˇ ek Buˇ nky byly pˇestovány stejnˇe jako pro pozorov´ an´ı v klasickém f´ azovém kontrastu na spolupra´ cuj´ıc´ım pracoviˇsti. Pˇred jejich transportem do Laboratoˇre optické mikroskopie na UFI bylo ˇ Po pˇrevozu standardn´ı médium nahrazeno totoˇzn´ ym médiem, ale bez fenolové ˇcervenˇe (FC). byly buˇ nky ihned um´ıstˇeny do vyhˇr´ıvaného boxu a ponech´ any alespoˇ n hodinu pro stabilizaci ˇ a pak uzavˇreny pˇred pozorován´ım. Buˇ nky byly 1× opl´ achnuty standardn´ım médiem bez FC do kom˚ urky s totoˇzn´ ym médiem. Bylo provedeno referenˇcn´ı pozorov´ an´ı alespoˇ n 20 minut ve standardn´ıch podm´ınkách. Poté byly kom˚ urky otevˇreny, buˇ nky opl´ achnuty 2× v PBS a opˇet uzavˇreny avˇsak s PBS. Byla pozorována jejich reakce na nutriˇcn´ı ˇsok alespoˇ n 45 minut. Poté ˇ a nakonec byly opˇet kom˚ urky otevˇreny, buˇ nky 1× opl´ achnuty standardn´ım médiem bez FC ˇ Byla pozorov´ uzavˇreny se standardn´ım médiem bez FC. ana jejich rekonvalescenˇcn´ı schopnost.

53

ˇ NA ENERGETICKOU A NUTRICN ˇ Í DEPRIVACI 8.3. REAKCE BUNEK Pozorov´ an´ı Na obrázc´ıch 8.6 – 8.9 jsou zobrazeny 4 typy bunˇek. Obr´ azky a – c zobrazuj´ı vˇzdy poˇc´ ateˇcn´ı stav, tedy situaci asi po pˇeti minutách po prvn´ı aplikaci PBS. Jedn´ a se o amplitudu, f´ azi a 3D vizualizaci fáze, jej´ımˇz hodnotám (v radiánech) je pro lepˇs´ı prostorovou orientaci pˇriˇrazena barevn´ a ˇskála. Dalˇs´ı dva ˇrádky d – h charakterizuj´ı prepar´ at v urˇcitém stadiu bˇehem reakce. Obr´ azky postupnˇe znázorˇ nuj´ı d – rekonstruovanou intenzitu, e – rekonstruovanou f´ azi a f – dynamické f´ azové diference. Jak do obrázku fáze (e), tak DPD (f) byly pro lepˇs´ı orientaci pˇrid´ any vrstevnicové kontury spojuj´ıc´ı hodnoty stejné fáze. Na obr´ azku g jsou separ´ atnˇe zobrazeny u ´bytky suché hmoty buˇ nky a na obrázku h pˇr´ır˚ ustky. Hodnot´ am je pˇriˇrazena barevn´ a ˇsk´ ala pro lepˇs´ı kvantitativn´ı pˇredstavu. Obrázek 8.6 demonstruje normáln´ı ˇr´ıdké fibroblasty v p´ até (a – c) a v tˇrin´ acté (d – h) minutˇe reakce na PBS. Buˇ nky LF vykazuj´ı ztr´ atu kontakt˚ u s kultivaˇcn´ım povrchem zaˇc´ınaj´ıc´ı v nejdelˇs´ıch lamelách a v okrajov´ ych ˇc´ astech celého tˇela. To je patrné v obr´ azku 8.6f ze zeleného zabarven´ı u kraj˚ u buˇ nky. Reakce se projevuje masivn´ı rozdrobenou vnitrobunˇeˇcnou aktivitou, kterou jasnˇe zobrazuj´ı ˇcerveno-zelené body uvnitˇr bunˇek. Na obrázku 8.7 jsou husté buˇ nky K2 v p´ até (a – c) a v osmé (d – h) minutˇe reakce. Jejich oddˇelován´ı od kultivaˇcn´ıho povrchu je ve velké m´ıˇre rovnomˇerné (rovnomˇernost zelené a ˇcervené barvy v obrázku 8.7f) a polarizované (jedna ˇc´ ast buˇ nky je pˇrichycen´ a a druh´ a se oddˇeluje), ale s malou aktivitou v centru buˇ nky.

ˇ ıdké LF buˇ Obrázek 8.6: R´ nky zobrazené v DHM v 5. minutˇe: a – intenzita, b – f´ aze, c – 3D vizualizace fáze; a 13. minutˇe: d – intenzita, e – f´ aze, f – DPD, g – u ´bytky suché hmoty buˇ nky a h – pˇr´ır˚ ustky suché hmoty buˇ nky. Objektivy 10×/0, 25.

54


Obrázek 8.7: Husté K2 buˇ nky zobrazené v DHM v 5. minutˇe: a – intenzita, b – f´ aze, c – 3D vizualizace fáze; a 8. minutˇe: d – intenzita, e – f´ aze, f – DPD, g – u ´bytky suché hmoty buˇ nky a h – pˇr´ır˚ ustky suché hmoty buˇ nky. Objektivy 10×/0, 25.

ˇ ıdké A3 buˇ Obrázek 8.8: R´ nky zobrazené v DHM v 5. minutˇe: a – intenzita, b – f´ aze, c – 3D vizualizace fáze; a 22. minutˇe: d – intenzita, e – f´ aze, f – DPD, g – u ´bytky suché hmoty buˇ nky a h – pˇr´ır˚ ustky suché hmoty buˇ nky. Objektivy 10×/0, 25. 55


Obrázek 8.9: Husté G3S2 buˇ nky zobrazené v DHM v 5. minutˇe: a – intenzita, b – f´ aze, c – 3D vizualizace fáze; a 10. minutˇe: d – intenzita, e – f´ aze, f – DPD, g – u ´bytky suché hmoty buˇ nky a h – pˇr´ır˚ ustky suché hmoty buˇ nky. Objektivy 10×/0, 25. Obrázek 8.8 zachycuje stadium reakce ˇr´ıdk´ ych bunˇek A3 v p´ até (a – c) a dvac´ até druhé (d – h) minutˇe. Oddˇelován´ı bunˇek je silnˇe polarizované a pohyb vnitrobunˇeˇcné hmoty kompaktn´ı aˇz do zakulaceného tvaru, ve kterém buˇ nky odol´ avaj´ı nepˇr´ızniv´ ym podm´ınk´ am velmi dlouho. Vytváˇrej´ı tenké v´ ybˇeˇzky, které jsou zapojeny do jejich rychlého nahodilého pohybu. Reakce hust´ ych bunˇek G3S2 je zachycena na obr´ azku 8.9. Obr´ azky a – c ukazuj´ı buˇ nky v páté minutˇe a obrázky d – h v desáté minutˇe. Prvn´ım jevem je plynulé rozpojen´ı mezibunˇeˇcn´ ych kontakt˚ u. Stahován´ı bunˇek je nepolarizované, rovnomˇernˇe po celém okraji buˇ nky. Objevuje se i jistá nerovnomˇerná aktivita v centru buˇ nky (obr. 8.8h – nevyv´ aˇzenost pohybu hmoty centra).

8.3.3. Z´ avˇ er Popsan´ y experiment ukázal, ˇze odolnost bunˇek v˚ uˇci stresov´ ym podm´ınk´ am je podm´ınˇena jak vnitˇrn´ımi faktory, do kter´ ych patˇr´ı typ buˇ nky (epiteli´ aln´ı vs. mesenchym´ aln´ı), stupeˇ n malignity a hustota porostu bunˇek. Samostatné buˇ nky jsou citlivˇejˇs´ı a reaguj´ı rychleji neˇz buˇ nky s vˇetˇs´ım mnoˇzstv´ım mezibunˇeˇcn´ ych kontakt˚ u. U nejcitlivˇejˇs´ıch bunˇek (norm´ aln´ı fibroblasty) se projevila nekróza, zat´ımco u odolnˇejˇs´ıch bunˇek A3 onk´ oza. Programov´ a bunˇeˇcn´ a smrt, apopt´ oza, nebyla pozorována. Mód fázov´ ych diferenc´ı v DHM zv´ yraznil nˇekteré bunˇeˇcné reakce, které by byly pˇri zkoumán´ı jednotliv´ ych sn´ımk˚ u velmi tˇeˇzko postˇrehnutelné. Byly odhaleny rozd´ıly ve vnitrobunˇeˇcné motilitˇe nádorov´ ych bunˇek r˚ uzné malignity bˇehem reakce na PBS od norm´ aln´ıch fibroblast˚ u (LF, obr. 8.6), pˇres nádorové nemetastazuj´ıc´ı fibroblasty (K2, obr. 8.7) k silnˇe metastazuj´ıc´ım fibroblast˚ um (A3, obr. 8.8). Normáln´ı fibroblasty se projevovaly rozdroben´ ym pohybem suché hmoty ve stˇredn´ı oblasti buˇ nky, nemetastazuj´ıc´ı fibroblasty vykazovaly pˇrev´ aˇznˇe polarizovan´ y, 56

´ Í MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPU ˚ BUNEK ˇ 8.4. POROVNAN tedy smˇerov´ y pohyb a metastazuj´ıc´ı fibroblasty se projevovaly kompaktn´ım pˇresunem bunˇeˇcné hmoty. Vzorce chován´ı G3S2, které jsou nejodolnˇejˇs´ı v˚ uˇci dan´ ym stresov´ ym podm´ınk´ am, se podobaly reakc´ım bunˇek A3 s mal´ ymi lokalizovan´ ymi zmˇenami v rozloˇzen´ı hmoty v buˇ nce. Zdá se také, ˇze je obecn´ ym pravidlem, ˇze polarizované buˇ nky (mesenchym´ aln´ı, s jednou osou delˇs´ı neˇz druhou) vykazuj´ı polarizovanou aktivitu pˇri stahov´ an´ı, zat´ımco nepolarizované buˇ nky (epiteliáln´ı) projevuj´ı nepolarizovanou aktivitu. Takˇze typ reakce odpov´ıd´ a morfotypu buˇ nky. Podobnost v kompaktnosti motility vnitˇrn´ı bunˇeˇcné hmoty mezi G3S2 a A3 buˇ nkami odkrytá v DHM se jev´ı ve shodˇe s patologickou klasifikac´ı epitelio-mesenchym´ aln´ı pˇremˇeny bunˇek pokroˇcilého karcinomu na sarkomov´ y morfotyp. Tyto v´ ysledky jsou publikovány v [56].

8.4. Porovn´ an´ı motility cytoskeletonu dvou typ˚ u bunˇ ek U nádorov´ ych bunˇek je zásadn´ım faktorem pro tvorbu metast´ az invazivita bunˇek. Anal´ yza invazivn´ıho módu daného typu bunˇek je urˇcuj´ıc´ı pro stanoven´ı efektivn´ı léˇcby. V publikaci [57] byl zkoumán invazivn´ı mechanismus dvou typ˚ u pˇr´ıbuzn´ ych bunˇek: nemetastazuj´ıc´ıch bunˇek typu fibroblast˚ u K2 a vysoce metastazuj´ıc´ıch bunˇek A3, které byly odvozeny od K2. Jedn´ a se o mateˇcnou a dceˇrinou linii, tedy buˇ nky bl´ızce pˇr´ıbuzné, ale s velmi odliˇsnou schopnost´ı indukce metast´ az. Proto je tento model atraktivn´ı pro in vitro studium metastatické transformace. Jeden z detekovan´ ych rozd´ıl˚ u ve vlastnostech tˇechto dvou typ˚ u bunˇek byl v dynamice cytoskeletonu. Dynamika cytoskeletonu byla kvantifikována pomoc´ı kuliˇcek nav´ azan´ ych na cytoskeleton (nanoscale particle tracking [58]) jako kvadrát zmˇeny polohy kuliˇcky za jednu sekundu. Tato promˇenn´ a D∗ byla experimentálnˇe stanovena ∼ 2, 5× vˇetˇs´ı pro buˇ nky A3 v porovn´ an´ı s K2.

8.4.1. Motilita za standardn´ıch podm´ınek ˇ Casosbˇ ern´ y záznam kvantitativn´ı fáze v DHM a pˇredevˇs´ım dynamické f´ azové diference zobrazuj´ı dynamiku suché hmoty buˇ nky, tedy mimo jiné jej´ıho cytoskeletonu. Pokusili jsme se tedy porovnat pohyblivost cytoskeletonu stejného sarkomového modelu bunˇek pr´ avˇe touto metodou. Pouˇzili jsme statistické zpracován´ı namˇeˇren´ ych dat popsané v odstavci 7.3. Dynamika cytoskeletonu popsaná pomoc´ı D∗ v [57] byla urˇcena z velkého poˇctu kuliˇcek (547 pro K2 a 748 pro A3), pˇriˇcemˇz hustota kuliˇcek byla asi 1 kuliˇcka na 1,5 buˇ nky. Z toho vypl´ yv´ a, ˇze statistika byla provedena z pˇribliˇznˇe 360 bunˇek K2 a 500 bunˇek A3. Doba trv´ an´ı experimentu byla krátká, pouze 5 minut, pro omezen´ı vlivu pˇrem´ıstˇen´ı kuliˇcek v d˚ usledku migrace bunˇek. Charakteristika D∗ tedy vyjadˇruje pˇredevˇs´ım m´ıru vnitˇrn´ıho pˇrem´ıst’ov´ an´ı hmoty cytoskeletonu. Jelikoˇz v podm´ınkách naˇs´ı laboratoˇre je prov´ adˇen´ı experiment˚ u s velk´ ym mnoˇzstv´ım bunˇek komplikované a nen´ı moˇzné zaruˇcit stejné podm´ınky pro buˇ nky v r´ amci r˚ uzn´ ych transport˚ u nakultivovan´ ych bunˇek, vyhodnocovali jsme delˇs´ı série pozorov´ an´ı menˇs´ıho poˇctu bunˇek. Omezen´ı vlivu migrace jsme zajistili pouze vizu´ aln´ım v´ ybˇerem. Buˇ nky byly kultivov´ any stejnˇe jako v odstavci 8.3 a pozorovány ve standardn´ım médiu bez fenolové ˇcervenˇe s oznaˇcen´ım F10. Ze séri´ı fázov´ ych rekonstrukc´ı pohybuj´ıc´ıch se bunˇek byly vizu´ alnˇe vybr´ any ˇc´ asti, ve kter´ ych ’ se buˇ nka nepˇrem´ıst ovala. Délka pozorov´ an´ı se pohybovala od 17 minut aˇz po hodinu s intervalem sn´ımkován´ı 5 sekund. a Pro kaˇzdou sérii pozorován´ı byly spoˇcteny hodnoty Bq definované jako normovaná such´ hmota buˇ nky, která se pˇresune v daném intervalu pˇr´ısluˇsném sn´ımk˚ um q a q+1 (viz odstavec 7.3). 57

´ Í MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPU ˚ BUNEK ˇ 8.4. POROVNAN

Obrázek 8.10: Rozloˇzen´ı Bq s vyznaˇcen´ ym medi´ anem Me v jedné sérii pozorov´ an´ı. u s intervalem mezi sn´ımky 5 sekund je na obr´ azku 8.10. Je Pˇr´ıklad rozloˇzen´ı Bq v sérii sn´ımk˚ vidˇet, ˇze hodnoty kol´ısaj´ı okolo stˇredn´ı hodnoty, kter´ a pˇredstavuje pr˚ umˇerné mnoˇzstv´ı pohybuj´ıc´ı se suché hmoty pro dané pozorován´ı. Tato statistika je zat´ıˇzena jak aditivn´ım, tak impulzn´ım ˇsumem. Impulzn´ı ˇsum v tomto pˇr´ıpadˇe pˇredstavuje nespr´ avné hodnoty Bq zp˚ usobené pˇredevˇs´ım nestejnou hladinou pozad´ı fáze a vede pˇri dalˇs´ım zpracov´ an´ı statistiky k z´ avaˇzn´ ym chyb´ am 2. druhu. Provedli jsme proto jeho filtraci, ve které jsme nahradili hodnoty leˇz´ıc´ı mimo interval hMe − ǫ, Me + ǫi, hodnotou Me, pˇriˇcemˇz Me je medi´ an a ǫ je experiment´ alnˇe stanoven´ a hodnota. Aditivn´ı ˇsum bychom odstranili pr˚ umˇerov´ an´ım, avˇsak vzhledem k malému poˇctu namˇeˇren´ ych dat jsme aditivn´ı ˇsum nefiltrovali. Takto z´ıskané hodnoty z r˚ uzn´ ych pozorov´ an´ı daného typu buˇ nky tvoˇr´ı soubor realizac´ı náhodné promˇenné Bq . Pro porovnán´ı rozloˇzen´ı Bq byl sestaven histogram (obr. 8.11) z 1309 hodnot zaznamenávaj´ıc´ı pohyb 3 bunˇek K2 a 2 bunˇek A3. Z histogramu na obrázku 8.11 je patrné, ˇze rozloˇzen´ı mnoˇzstv´ı pohybuj´ıc´ı se hmoty u A3 je nerovnomˇerné, ménˇe se podobá normáln´ımu rozloˇzen´ı a zasahuje do vyˇsˇs´ıch hodnot neˇz u K2.

8.4.2. Motilita pˇ ri extern´ım stimulu Vzhledem k experimentáln´ım v´ ysledk˚ um popsan´ ym v odstavci 8.3 jsme provedli anal´ yzu mnoˇzstv´ı pohybuj´ıc´ı se suché hmoty bunˇek K2 a A3 pˇri slabˇe deprivaˇcn´ım stimulu médiem F0 ochuzen´ ym o ˇziviny a pˇri následné rekonvalescenci opˇet v plnohodnotném standardn´ım médiu F10. Nejdˇr´ıve bylo provedeno referenˇcn´ı pozorov´ an´ı bunˇek ve standardn´ım médiu po dobu 30 minut. Poté byly kom˚ urky otevˇreny, buˇ nky 2× opl´ achnuty médiem F0 a uzavˇreny s F0. Reakce na slabˇe deprivaˇcn´ı médium byla filmov´ ana po 15 minut´ ach, které byly stanoveny jako ˇcas odpov´ıdaj´ıc´ı spotˇrebován´ı zásobn´ıch ˇzivin a energie bunˇek. V tomto stavu byly buˇ nky pozorovány 58

´ Í MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPU ˚ BUNEK ˇ 8.4. POROVNAN dalˇs´ıch 30 minut. Histogram rozloˇzen´ı pohybuj´ıc´ı se hmoty vytvoˇren´ y ze 777 realizac´ı n´ ahodné promˇenné B reprezentuj´ıc´ı pohyb 2 bunˇek K2 a 2 bunˇek A3 je na obr´ azku 8.12. Poté byly kom˚ urky opˇet otevˇreny a médium bylo vymˇenˇeno za standardn´ı. Po stabilizaˇcn´ım intervalu 15 minut byly buˇ nky filmovány dalˇs´ı p˚ ul hodiny. Histogram rozloˇzen´ı pohybuj´ıc´ı se suché hmoty v rekonvalescenˇcn´ı fázi tvoˇren´ y 824 realizacemi n´ ahodné promˇenné B zahrnuj´ıc´ı pohyb 3 bunˇek K2 a 2 bunˇek A3 je na obr´ azku 8.13.

Obrázek 8.11: Histogram normovaného mnoˇzstv´ı pohyblivé suché hmoty pro buˇ nky K2 a A3 v médiu F10.

Obrázek 8.12: Histogram normovaného mnoˇzstv´ı pohyblivé suché hmoty pro buˇ nky K2 a A3 ve slabˇe deprivaˇcn´ım médiu F0.

Obrázek 8.13: Histogram normovaného mnoˇzstv´ı pohyblivé suché hmoty pro buˇ nky K2 a A3 pˇri rekonvalescenci v médiu F10. Z obrázk˚ u 8.11 – 8.13 je patrné, ˇze pˇri deprivaˇcn´ı reakci invazivn´ı buˇ nky A3 reagovaly pomˇernˇe velk´ ym sn´ıˇzen´ım pohyblivosti, zat´ımco jedna z bunˇek K2 byla vybuzena k pohyblivosti 59

´ Í PRUTOKOV ˚ ´ ˚ 8.5. TESTOVAN YCH KOMUREK vˇetˇs´ı ve srovnán´ı s p˚ uvodn´ım stavem ve standardn´ım médiu. V rekonvalescenˇcn´ı f´ azi pˇri doplnˇen´ı ˇzivin naopak obˇe invazivn´ı buˇ nky A3 prok´ azaly n´ ar˚ ust pohyblivosti, zat´ımco u bunˇek K2 z˚ ustala pohyblivost pˇribliˇznˇe na stejné u ´rovni jako v deprivaˇcn´ım stadiu, tedy m´ırnˇe zv´ yˇsená oproti p˚ uvodn´ımu stavu ve standardn´ım médiu.

8.4.3. Z´ avˇ er Porovnán´ı rozloˇzen´ı pohyblivosti suché hmoty ve tˇrech po sobˇe n´ asleduj´ıc´ıch situac´ıch znázornˇen´ ych v histogramech 8.11 – 8.13 lze analyzovat tak, ˇze invazivn´ı buˇ nky A3 vykazuj´ı silnou reakci na stresovou situaci, ve které omez´ı svou pohybovou ˇcinnost. Tato hypotéza koresponduje dobˇre se sledovan´ ym v´ yvojem silnˇejˇs´ı deprivaˇcn´ı reakce popsan´ ym v odstavci 8.3, bˇehem n´ıˇz se buˇ nky A3 rychle stáhly do kulatého tvaru, ve kterém dlouho odol´ avaly nepˇr´ızniv´ ym podm´ınkám. Pˇri návratu do plnohodnotného média obˇe testované buˇ nky A3 zv´ yˇsily svou pohybovou ˇcinnost (obr. 8.13), dokonce i v˚ uˇci standardn´ımu stavu (obr. 8.11). Tyto hypotézy mohou ukazovat princip pˇreˇzit´ı silnˇe invazivn´ıch bunˇek za nepˇr´ızniv´ ych podm´ınek, jako je léˇcba a chemoterapie, a následné obnoven´ı jejich invazivity za standardn´ıch podm´ınek. Pozorované neinvazivn´ı buˇ nky K2 prok´ azaly m´ırn´ y n´ ar˚ ust pohyblivosti pˇri stresov´ ych podm´ınkách (obr. 8.12) v˚ uˇci p˚ uvodn´ımu stavu (obr. 8.11), kter´ y setrval i pˇri rekonvalescenci ve standardn´ıch podm´ınkách (obr. 8.13). Tento poznatek m˚ uˇze demonstrovat, ˇze neinvazivn´ı buˇ nky nemaj´ı ochrann´ y mechanismus v˚ uˇci stresov´ ym podm´ınk´ am, a tud´ıˇz rychleji podléhaj´ı destrukci, jak bylo ukázáno v odstavci 8.3. Aˇckoli tyto závˇery jsou pouze hypotézami princip˚ u invazivn´ıho mechanismu bunˇek, které by bylo potˇreba ovˇeˇrit na statisticky v´ yznamn´ ych souborech bunˇek, v odstavci 8.4 je demonstrov´ an zp˚ usob moˇzné interpretace popsaného zpracov´ an´ı, prezentace holografick´ ych dat a v´ yznam DPD.

8.5. Testov´ an´ı pr˚ utokov´ ych kom˚ urek Testován´ı pr˚ utokov´ ych pozorovac´ıch kom˚ urek sestaven´ ych podle popisu v odstavci 3.7 a pˇripraven´ ych dle popisu v odstavci 8.1 probˇehlo z ˇcasov´ ych d˚ uvod˚ u pouze z hlediska kompatibility s ˇziv´ ymi buˇ nkami. Zjiˇst’ovali jsme, jak dlouho pˇreˇzij´ı ˇzivé buˇ nky v prostˇred´ı pr˚ utokové kom˚ urky a jak ˇcasto je nutná v´ ymˇena média v objemu kom˚ urky. K tomuto u ´ˇcelu jsme vyuˇzili mikroskop s klasick´ ym Zernikov´ ym fázov´ ym kontrastem na spolupracuj´ıc´ım pracoviˇsti. Do kom˚ urky byla vstˇr´ıknuta suspenze bunˇek HaCaT ve standardn´ım médiu bez fenolové ˇcervenˇe. Buˇ nky z˚ ustaly po 7 dn˚ u aktivn´ı, to znamená, ˇze st´ ale prob´ıhalo jejich dˇelen´ı. Pro dan´ y objem kom˚ urky a semikonfluentn´ı porost kultivaˇcn´ıho povrchu byla optim´ aln´ı frekvence v´ ymˇeny média stanovena na jeden den. Tyto kom˚ urky vyhovuj´ı tedy z hlediska ˇzivotn´ıch podm´ınek pro kr´ atkodobé experimenty v rozsahu nˇekolika hodin i pro dlouhodobé experimenty v rozsahu nˇekolika dn˚ u.

60

Kapitola 9

Z´ avˇ er V dizertaˇcn´ı práci jsem se zab´ yvala ovˇeˇren´ım moˇznosti pouˇzit´ı transmisn´ıho digit´ aln´ıho holografického mikroskopu pro v´ yzkumu ˇziv´ ych bunˇek, v´ yvojem a standardizac´ı metodiky pozorován´ı, v´ yvojem nov´ ych zobrazovac´ıch mód˚ u a jejich pouˇzit´ım. D´ ale jsem se zab´ yvala zpracov´ an´ım a interpretac´ı namˇeˇren´ ych dat pˇri v´ yzkumu dynamiky ˇziv´ ych bunˇek. Zab´ yvala jsem se také vlastnostmi zobrazen´ı mikroskopu v závislosti na koherenci pouˇzitého osvˇetlen´ı. Byly navrˇzeny a realizovány konstrukˇcn´ı zmˇeny jak mikroskopu, tak jeho vybaven´ı pro snazˇs´ı manipulaci s mikroskopem (dorazy stolku, drˇz´ ak a posuvy prepar´ atu) a pro operaci s ˇziv´ ymi buˇ nkami (vytápˇen´ı, pozorovac´ı kom˚ urky). Byla také zkonstruov´ ana vloˇzka koriguj´ıc´ı rovinu zaostˇren´ı v referenˇcn´ı vˇetvi pro dosaˇzen´ı optické ekvivalence obou vˇetv´ı mikroskopu a drˇz´ ak clonek s posuvy pro regulaci prostorové koherence zdroje. Proveden´ım tˇechto u ´prav byl mikroskop pˇripraven pro systematická pozorován´ı. Dále byl teoreticky popsán kontrast interferenˇcn´ıho obrazce ve v´ ystupn´ı rovinˇe transmisn´ıho DHM v závislosti na poloze bodu zdroje a byla urˇcena velikost interferenˇcn´ıho pole s vysok´ ym kontrastem interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u tohoto mikroskopu. Na z´ akladˇe v´ ypoˇctu efektivn´ı plochy zdroje byla urˇcena korigovaná spektr´ aln´ı hustota intenzity zdroje, ze které lze odhadnout koherenˇcn´ı délku svˇetla v závislosti na velikosti pouˇzitého zdroje. Byl také odvozen vztah pro odhad koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrky osvˇetlen´ı, takˇze pouˇzité svˇetlo bylo plnˇe charakterizov´ ano z hlediska koherenˇcn´ıch vlastnost´ı. V DHM byly provedeny experimenty s modelov´ ym vzorkem a rozptyluj´ıc´ı vrstvou s koherentn´ım a n´ızkokoherentn´ım osvˇetlen´ım. Tyto experimenty potvrdily efekt optick´ ych ˇrez˚ u pˇri redukci koherence svˇetla. Dále byly zobrazeny v DHM buˇ nky v rozptyluj´ıc´ım médiu svˇetlem se tˇremi r˚ uzn´ ymi koherenˇcn´ımi délkami a ˇs´ıˇrkami. Bylo prok´ az´ ano, ˇze m´ a smysl sniˇzovat koherenci osvˇetlen´ı pro silnˇejˇs´ı potlaˇcen´ı rozpt´ yleného svˇetla. Schopnost zobrazen´ı DHM v rozptyluj´ıc´ım médiu jiˇz byla vyuˇzita pˇri pozorován´ı bunˇek v opalescentn´ım médiu. Byla vyvinuta metoda zpracován´ı kvantitativn´ı f´ aze z DHM a jej´ı vizualizace nazvan´ a dynamické fázové diference (DPD). Tato metoda byla u ´spˇeˇsnˇe pouˇzita pro zpracov´ an´ı pozorován´ı ˇziv´ ych bunˇek. Bylo navrˇzeno statistické zpracov´ an´ı dat vyuˇz´ıvaj´ıc´ı m´ od dynamick´ ych f´ azov´ ych diferenc´ı ke kvantifikaci a interpretaci experimentu. V prvn´ım experimentu s ˇziv´ ymi buˇ nkami jsme zkoumali potenci´ al DHM porovn´ an´ım zobrazen´ı reakce bunˇek na toxickou látku cisPt, projevuj´ıc´ı se apopt´ ozou, pomoc´ı kvantitativn´ıho fázového kontrastu z DHM a klasického Zernikova f´ azového kontrastu. Pro anal´ yzu z´ avˇereˇcného stadia apoptózy byla u ´spˇeˇsnˇe pouˇzita navrˇzen´ a metoda DPD. Tento experiment také potvrdil stabilitu mikroskopu pˇri pozorován´ı po dobu tˇr´ı dn˚ u.

61

Dalˇs´ım experimentem byly reakce r˚ uzn´ ych typ˚ u n´ adorov´ ych bunˇek dvou hustot bunˇeˇcného porostu na energetickou a nutriˇcn´ı deprivaci. Pomoc´ı m´ odu DPD jsme odhalili r˚ uzné vzorce chován´ı bunˇek pˇri reakci na PBS v závislosti na nˇekolika faktorech: typu bunˇek, stupni malignity a hustotˇe porostu. Jiná pozorován´ı byla zamˇeˇrena na porovn´ an´ı motility dvou pˇr´ıbuzn´ ych lini´ı bunˇek s odliˇsn´ ym metastatick´ ym potenciálem za standardn´ıch podm´ınek pˇri slabém deprivaˇcn´ım stimulu a pˇri následné rekonvalescenci. Byl navrˇzen zp˚ usob anal´ yzy a zobrazen´ı kvantitativn´ı f´ aze pomoc´ı histogram˚ u normované pohyblivé hmoty bunˇek. Na z´ akladˇe navrˇzeného postupu byly stanoveny hypotézy mechanism˚ u chován´ı dan´ ych typ˚ u bunˇek pˇri stresov´ ych podm´ınk´ ach, které jsou moˇzn´ ym pˇr´ıkladem interpretace mikroskopického pozorov´ an´ı v DHM. V´ ysledky z´ıskané v této práci ukazuj´ı velk´ y potenci´ al kombinace zobrazen´ı v DHM a metody DPD s následn´ ym zpracován´ım, nebot’ odhaluj´ı experiment´ aln´ı fakta nedostupn´ a jin´ ymi metodami. Na základˇe experimentáln´ıch zkuˇsenost´ı se st´ avaj´ıc´ım transmisn´ım DHM byly stanoveny následuj´ıc´ı poˇzadavky na dalˇs´ı generaci mikroskopu, kter´ a je jiˇz ve v´ yvoji: a) konstrukce mikroskopu umoˇzn ˇuj´ıc´ı snadnou zmˇenu osy mikroskopu vytv´ aˇrej´ıc´ı polohu invertovaného a neinvertovaného systému, popˇr´ıpadˇe polohu s vodorovnou osou mikroskopu pro variabilitu pˇri specifick´ ych biologick´ ych pozorov´ an´ıch, b) kompletace DHM s dalˇs´ımi pozorovac´ımi metodami, pˇredevˇs´ım s fluorescenˇcn´ı technikou pro strukturáln´ı anal´ yzu a jej´ı souvislost s kvantitativn´ı f´ az´ı, c) dokonˇcen´ı softwaru pro online rekonstrukci obrazu, poˇc´ıtaˇcové ˇr´ızen´ı experimentu a dalˇs´ı zpracován´ı obrazu, d) zvˇetˇsen´ı vzdálenosti mezi kondenzory a objektivy pro um´ıstˇen´ı a manipulaci s kom˚ urkami, zvˇetˇsen´ı zorného pole a jednoduˇsˇs´ı v´ ymˇena objektiv˚ u pouˇzit´ım standardn´ıch kondenzor˚ u, e) jednoduˇsˇs´ı a stabilnˇejˇs´ı justáˇz mikroskopu s just´ aˇzn´ımi prvky, které budou souˇc´ astmi mikroskopu pro u ´ˇcely poloautomatické ˇci automatické just´ aˇze. Bylo také vybudováno doˇcasné biologické pracoviˇstˇe, které umoˇznilo pˇr´ıpravu bunˇek pro pozorován´ı a manipulaci s buˇ nkami. Na tomto pracoviˇsti byly provedeny kr´ atkodobé i nˇekolikadenn´ı biologické experimenty. Byla navrˇzena stabiln´ı Laboratoˇr experiment´ aln´ı biofotoniky s biologick´ ym zázem´ım experiment˚ u pro pˇr´ımou aplikaci mikroskopie a optick´ ych pˇr´ıstroj˚ u v biologii a medic´ınˇe. Tato laboratoˇr je v souˇcasnosti realizov´ ana. Hlavn´ım pˇr´ınosem práce je vypracov´ an´ı metodiky pozorov´ an´ı, zpracov´ an´ı, vyhodnocen´ı a interpretace biologick´ ych dat namˇeˇren´ ych pomoc´ı digit´ aln´ıho holografického mikroskopu. Byl demonstrován pˇr´ınos zobrazen´ı v DHM pro v´ yzkum ˇzivé buˇ nky. Dalˇs´ı v´ yzkum v této oblasti je moˇzno vést ovˇeˇrován´ım navrˇzen´ ych hypotéz. Práce pˇrispˇela k propojen´ı v´ yvojové a konstrukˇcn´ı oblasti v´ yzkumu v Laboratoˇri optické ´ ˇ ast v´ mikroskopie na UFI s aplikaˇcn´ı ˇcinnost´ı v oblasti biomedic´ınského v´ yzkumu. C´ ysledk˚ u práce byla jiˇz publikována v impaktovaném zahraniˇcn´ım ˇcasopise [56], v dom´ ac´ım ˇcasopise [59] a prezentována na vˇedeck´ ych konferenc´ıch (5 mezin´ arodn´ıch, 3 dom´ ac´ı).

62

Pˇ rehled publikac´ı autorky Janeˇcková H., Vesel´ y P., Chmel´ık R.: Proving tumour cells by acute nutritional/energy deprivation as a survival threat: a task for microscopy. Anticancer Research 29, 2339-2346 (2009). ´ Kolman P., Janeˇcková H., Chmel´ık R.: Digit´ aln´ı holografick´ a mikroskopie na UFI, VUT v Brnˇe. Jemná mechanika a optika 7-8, 206-208 (2009). Janeˇcková H., Vesel´ y P., Chmel´ık R.: Aplikace digit´ aln´ıho transmisn´ıho holografického mikroskopu. In: Aplikovaná optika a mikroskopie 2008, s. 35-44, 2008 (ISBN: 978-80-01-041017). Janeˇcková H., Kolman P., Vesel´ y P., Chmel´ık R.: Digital holographic microscope with low spatial and temporal coherence of illumination. In: Optical and digital image processing, Proc. SPIE 7000, ˇc. 700002E, s. 1-8, 2008 (ISSN: 0277-786X, ISBN: 978-0-8194-7198-7). Janeˇcková H.: Mikroskopie ˇcasovˇe promˇenn´ ych biologick´ ych objekt˚ u. In: FSI Junior konference Brno 2007, s. 8-16, 2008 (ISBN: 978-80-214-3565-0). Kolman P., Janeˇcková H., Chmel´ık R., Vesel´ y P., Lovicar L., Foret Z.: In vitro dynamic observations in a low-coherence holographic microscope. In: 15th Czech-Polish-Slovak Conference on Wave and Quantum Aspects of Contemporary Optics. Proc. SPIE 6609, ˇc. M6090, s. 1, 2007 (ISSN: 0277-786X, ISBN: 978-0-8194-6748-5). Janeˇcková H., Kolman P., Vesel´ y P., Chmel´ık R., Lovicar L., Foret Z.: Low-coherence holographic microscopic imaging: characteristics and time lapse recording. In: Cytokinematics 2006. infocus Magazine 42, Royal Microscopical Society, 2007 (ISSN: 1750-4740).

63

Dodatek:

Biologick´ e pracoviˇ stˇ e Z ˇcásti laboratoˇre Optické mikroskopie bylo vytvoˇreno prozat´ımn´ı biologické pracoviˇstˇe. Pracoviˇstˇe obsahuje laminárn´ı flow-box MSC Advantage pro pˇr´ıpravy a manipulaci s buˇ nkami ve steriln´ım prostˇred´ı, mikroskop Meopta s f´ azov´ ym kontrastem pro kontrolu stavu bunˇek, polystyrénov´ y box um´ıstˇen´ y ve vyhˇr´ıvané komoˇre, kter´ y slouˇzil jako term´ aln´ı box pro uchov´ aván´ı bunˇek do ˇctyˇr dn˚ u a pokusné kultivace, DHM ve vyhˇr´ıvané komoˇre, poˇc´ıtaˇcovou jednotku a veˇskeré drobné manipulaˇcn´ı zaˇr´ızen´ı pro pˇr´ıpravu bunˇek. Tato ˇc´ ast laboratoˇre byla oddˇelena pro zatemnˇen´ı prostoru. Na tomto pracoviˇsti byly provedeny experimenty uvedené v disertaˇcn´ı práci. Buˇ nky byly pˇestovány ve spolupracuj´ıc´ı laboratoˇri Bunˇeˇcné biologie a kultivac´ı v Praze ´ byly um´ıstˇeny do term´ (FNKV). Po jejich pˇrevozu do Brna na UFI aln´ıho boxu. Teplota uvnitˇr ◦ boxu byla udrˇzována na (35 – 36) C a zv´ yˇsen´ a vlhkost byla zajiˇstˇena odpaˇrov´ an´ım vody z vloˇzené ano speci´ aln´ım nádobky. Zv´ yˇsené mnoˇzstv´ı CO2 nebylo tˇreba zajiˇst’ovat, protoˇze pH bylo udrˇzov´ 1 pufrem . Pro c´ılené biomedic´ınské aplikace optick´ ych pˇr´ıstroj˚ u vyvinut´ ych v Laboratoˇri optické mi´ kroskopie je budována na UFI stabiln´ı Laboratoˇr experiment´ aln´ı biofotoniky (obr. 9.1), kter´ a bude zahrnovat mikroskopická pracoviˇstˇe spoleˇcnˇe s m´ıstnost´ı pro kultivaci bunˇek.

1

Pufr je konjugovan´ y p´ ar kyseliny a nebo z´ asady, kter´ y je schopn´ y udrˇzovat v jistém rozmez´ı stabiln´ı pH.

64

Obrázek 9.1: Laboratoˇr experimentáln´ı biofotoniky obsahuje ˇsatnu a sklad (×.01), chodbu su ´loˇzn´ ymi prostory a pracovn´ım stolem pro jeden menˇs´ı mikroskop (×.02), m´ıstnost pro kultivaci bunˇek (×.03), tˇri mikroskopická pracoviˇstˇe (×.04) a chemickou laboratoˇr (×.05).

65

Seznam pouˇ zit´ ych symbol˚ u Symbol

V´ yznam

Jednotky

f α0

prostorová frekvence difrakˇcn´ı mˇr´ıˇzky difrakˇcn´ı a interferenˇcn´ı u ´hel pˇr´ısluˇsn´ y centr´ aln´ı vlnové délce centráln´ı vlnová délka impulzové odezvy obecné vlnové délky stˇredn´ı vlnová délka difrakˇcn´ı u ´hly pˇr´ısluˇsné obecn´ ym vlnov´ ym délkám komplexn´ı stupeˇ n koherence ˇcasové posunut´ı komplexn´ı stupeˇ n koherence kvazimonochromatického osvˇetlen´ı vzdálenost stˇredu v´ ystupn´ı roviny a stˇredu pupily objektivu vzdálenost stˇred˚ u pupil objektiv˚ u polomˇer pupily vlnové funkce kulov´ ych vln imaginárn´ı jednotka vlnov´ y vektor u ´hlová frekvence vlny ˇcas kontrast interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u lokáln´ı maximum a minimum intenzity interferenˇcn´ıch prouˇzk˚ u v rozmez´ı jedné periody kvantitativn´ı fáze, respektive f´ azov´ y rozd´ıl mezi vlnou z pˇredmˇetové a referenˇcn´ı vˇetve kvantitativn´ı fáze po numerick´ ych u ´prav´ ach index lomu v´ yˇska pˇredmˇetu koherenˇcn´ı délka svˇetla koherenˇcn´ı ˇs´ıˇrka svˇetla

m−1

λ0 h, h1 , h2 λ, λ1 , λ2 ¯ λ α, α1 , α2 γ(P 1, P 2˜ τ) τ˜ µ(P 1, P 2) l d Rp u1 , u 2 i k ω t V Imax , Imin φ Φ n v Lk Dk

◦

m m m ◦

s

m m m m−1 rad m−1 rad s−1 s J s−1 m−2 rad rad m m m

66

Symbol

V´ yznam

Jednotky

∆λ

poloˇs´ıˇrka maxima intenzity spektr´ aln´ı propustnosti nebo poloˇs´ıˇrka maxima korigované spektráln´ı intenzity rozd´ıl optické dráhy hustota hmotnost molekuly Avogadrova konstanta stˇredn´ı polarizovatelnost molekuly specifick´ y refraktivn´ı pˇr´ır˚ ustek koncentrace roztoku suchá hmota dynamická fázová diference postupná dynamická f´ azov´ a diference dynamická fázová diference vzhledem k poˇc´ atku pˇr´ıˇcné rozliˇsen´ı mikroskopu normovaná pohyblivá such´ a hmota buˇ nky medián veliˇciny B

m

δ ̺ M Nm p αs C W ΦD ΦD1 ΦD2 ∆ B Me

67

m kg m−3 kg m3 m3 /kg kg/m3 kg rad rad rad m

Literatura [1] Dunn G. A.: Transmitted-light interference microscopy: a technique born before its time. Proceedings of the Royal Microscopical Society 33, 189-196 (1998). [2] Ross K. F. A.: Phase contrast and interference microscopy for cell biologists. Edward Arnold Ltd., London (1967). [3] Curtis A. S. G.: The mechanism of adhesion of cells to glass. A study by interference reflection microscopy. J. Cell Biology 20, 199-215 (1964). [4] Verschueren H.: Interference reflection microscopy in cell biology: methodology and applications. J. Cell. Sci. 75, 279-301 (1985). [5] Bereiter-Hahn J., Fox C. H., Thorell B.: Quantitative reflection contrast microscopy of living cells. J. Cell Biology 82, 767-779 (1979). [6] Barer R.: Interference microscopy and mass determination. Nature 169, 366-367 (1952). [7] Huxley A. F., Niedergerke R.: Structural changes in muscle during contraction. Nature 173, 971-973 (1954). [8] Huxley A. F., Niedergerke R.: Measurement of the striations of isolated muscle fibres with the interference microscope. J. Physiol. 144, 403-425 (1958). [9] Zhang T., Yamaguchi I.: Three-dimensional microscopy with phase-shifting digital holography. Opt. Lett. 23, 1221-1223 (1998). [10] Ikeda T., Popescu G., Dasari R. R., Feld M. S.: Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005). [11] Cuche E., Bevilacqua F., Depeursinge C.: Digital holography for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 24, 291-293 (1999). [12] Dubois F., Joannes L., Legros J.-C.: Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Opt. 38, 7085-7094 (1999). [13] Izzat J. A., Hee M. R., Owen G. M., Swanson E. A., Fujimoto J. G.: Optical coherence microscopy in scattering media. Opt. Lett. 19, 590-592 (1994). [14] Indebetouw G., Klysubun P.: Imaging through scattering media with depth resolution by use of low-coherence gating in spatiotemporal digital holography. Opt. Lett. 25, 212-214 (2000). 68

LITERATURA [15] Yang C., Wax A., Hahn M. S., Badizadegan K., Dasari R. R., Feld M. S.: Phase-referenced interferometer with subwavelength and subhertz sensitivity applied to the study of cells membrane dynamics. Opt. Lett. 26, 1271-1273 (2001). [16] Dubois F., Yourassowsky C., Monnom O., Legros J.-C., Debeir O., Ham P. V., Kiss R., Decaestecker C.: Digital holographic microscopy for the three-dimensional dynamic analysis of in vitro cancer cell migration. Journal of Biomedical Optics 11 (5), 054032 (2006). [17] Mann Ch. J., Yu L., Kim M. K.: Movies of cellular and sub-cellular motion by digital holographic microscopy. BioMedical Engineering OnLine2006 5:21 (2006). [18] Marquet P., Rappaz B., Magistretti P. J., Cuche E., Emery Y., Colomb T., Depeursinge C.: Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt. Lett. 30, 468-470 (2005). [19] Kemper B., Carl D., Schnekenburger J., Bredebusch I., Sch¨ afer M., Domschke W., Bally G. von: Investigation of living pancreas tumor cells by digital holographic microscopy. Journal of Biomedical Optics 11, 0340051-0340058 (2006). [20] Massatsch P., Charriere F., Cuche E., Marquet P., Depeursinge C. D.: Time-domain optical coherence tomography with digital holographic microscopy. Appl. Opt. 44, 1806-1812 (2005). [21] Kemper B., St¨ urwald S., Remmersmann Ch., Langehanenberg P., Bally G. von: Characterization of light emitting diodes (LEDs) for application in digital holographic microscopy for inspection of micro and nanostructured surfaces. Optics and Lasers in Engineering 46, 499-507 (2008). [22] Dunn G. A., Brown A. F.: A unified approach to analysing cell motility. J. Cell. Sci. Suppl. 8, 81-102 (1987). [23] Brown A. F., Dugina V., Dunn G. A., Vasiliev J. M.: A quantitative analysis of alterations in the shape of cultured fibrablasts induced by tumour-promoting phorbol ester. Cell Biology, International Reports 13 (4), 357-366 (1989). [24] Brown A. F., Dunn G. A.: Microinterferometry of the movement of dry matter in fibroblasts. Journal of Cell Science 92, 379-389 (1989). [25] Rappaz B., Marquet P., Cuche E., Emery Y., Depeursinge Ch., Magistretti P. J.: Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy. Optics Express 13 (23), 9361-9373 (2005). [26] Kemper B., Kodmeier S., Langehanenberg P., Bally G. von, Bredebusch I., Domschke W., Schnekenburger J.: Integral refractive index determination of living suspesion cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. Journal of Biomedical Optics 12 (5), 054009 (2007). [27] Yeom S., Javidi B.: Automatic identification of biological microorganisms using threedimensional complex morphology. Journal of Biomedical Optics 11 (2), 024017 (2006). 69

LITERATURA [28] Moon I., Javidi B.: Volumetric three-dimensional recognition of biological microorganisms using multivariate statistical method and digital holography. Journal of Biomedical Optics 11 (6), 064004 (2006). [29] Sheng J., Malkiel E., Katz J.: Digital holographic microscope for measuring threedimensional particle distributions and motions. Appl. Opt. 45 (16), 3893-3901 (2006). [30] Kemmler M., Fratz M., Giel D., Saum N., Brandenburg A., Hoffmann Ch.: Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. Journal of Biomedical Optics 12 (6), 064002 (2007). [31] Yu L., Mohnty S., Zhang J., Genc S., Kim M. K., Berns M. W., Chen Z.: Digital holographic microscopy for quantitative dynamic evaluation during laser microsurgery. Opttics Express 17 (14), 1231-1238 (2009). [32] Charriere F., Pavillon N., Colomb T., Depeursinge Ch.: Living specimen tomography by digital holographic microscopy: morphometry of testate emoeba. Optics Express 14 (26), 7005-7013 (2006). [33] Rappaz B., Barbul A., Hoffmann A., Boss D., Korenstein R., Depeursinge Ch., Magistretti P. J., Marquet P.: Spatial analysis of erythrocyte membrane fluctuations by digital holographic microscopy. Blood Cells Mol. Dis. (2009), doi:10.1016/j.bcmd.2009.01.018 [34] Mölder A., Sebesta M., Gustafsson M., Gisselson L., Wingren A. G., Alm K.: Non-invasive label-free cell counting and quantitative analysis of adherent cells using digital holography. Journal of Microscopy 232, 240-247 (2008). [35] Moon I., Javidi B.: Three-dimensional identification of stem cells by computational holographic imaging. J. R. Soc. Interface 4, 305-313 (2006). [36] Sun H., Song B., Dong H., Reid B., Player M. A., Watson J., Zhao M.: Visualization of fast-moving cells in vivo using digital holographic video microscopy. Journal of Biomedical Optics 13 (1), 014007 (2008). [37] Barer R., Joseph S.: Refractometry of living cells. Part I. Basic Principles. Quarterly Journal of Microscopical Science 95, 399-423 (1954). [38] Chang B. J., Alferness R., Leith E. N.: Space-invariant achromatic grating interferometers: theory. Appl. Opt. 14, 1592-1600 (1975). [39] Leith E. N., Swanson G. J.: Achromatic interferometers for white light optical processing and holography. Appl. Opt. 19, 638-644 (1980). [40] Chmel´ık R., Harna Z.: Parallel-mode confocal microscope. Opt. Eng. 38, 1635-1639 (1999). ´ [41] Janeˇcková H.: Interferenˇcn´ı mikroskopie biologick´ ych vzork˚ u. Diplomov´ a pr´ ace, Ustav fyzikáln´ıho inˇzen´ yrstv´ı FSI VUT v Brnˇe (2006). [42] Sun P.-C., Leith E. N.: Broad-source image plane holography as a confocal imaging process. Appl. Opt. 33, 597-602 (1994).

70

LITERATURA [43] Komrska J.: Vlnová optika, Difrakce svˇetla, 1. vyd´ an´ı, Akademické nakladatelstv´ı CERM, Brno (2004), p. 157. [44] Leith E. N., Chien W.-C., Mills K. D., Athey B. D., Dilworth D. S.: Optical sectioning by holographic coherence imaging: a generalized analysis. J. Opt. Soc. Am. A 20, 380-387 (2003). [45] Henzlová M.: Numerické pˇreostˇrov´ an´ı v digit´ aln´ım holografickém mikroskopu s ˇc´ asteˇcnˇe ´ koherentn´ım svˇetlem. Bakaláˇrská pr´ ace, Ustav fyzik´ aln´ıho inˇzen´ yrstv´ı FSI VUT v Brnˇe (2008). [46] Born M., Wolf E.: Principles of optics, 6th edition, Cambridge university press, Cambridge (1980). [47] Dale T. P., Gladstone J, H.: On the influence of temperature on the refraction of light. Phil. Trans. 148, 887-894 (1858). [48] Barer R., Tkaczyk S.: Refractive Index of Concentrated Protein Solutions. Nature 173, 821-822 (1954). [49] Adair G. S., Robinson M. E.: The specific refraction increments of serum-albumin and serum-globulin. Biochem. J. 24, 993-1011 (1930). [50] Perlmann G. E., Longswotrh L. G.,: The specific refractive increment of some purified proteins. J. Amer. Chem. Soc. 70, 2719-2724 (1948). [51] Chmel´ık R.: Korelaˇcn´ı mikroskopie, alternativn´ı metoda v´ıcekan´ alového konfok´ aln´ıho zob´ razen´ı. Habilitaˇcn´ı práce. Ustav fyzik´ aln´ıho inˇzen´ yrstv´ı FSI VUT v Brnˇe (2001). [52] Vesel´ y P., Chaloupková A., Urbanec P., Urbancov´ a H., Boh´ aˇc L., Krchˇ n´ akov´ a E., Franc F., ˇ Sprincl L., Vousden K., Moss R. et al.: Patterns of in vitro behaviour characterizing cells of spontaneously metastasizing K2M rat sarcoma. Folia Biol. (Praha) 33, 307-324 (1987). [53] Cavanna T., Pokorná E., Vesel´ y P., Gray C., Zicha D: Evidence for protein 4.1B acting as a metastasis suppressor. Journal of Cell Science 120, 606-616 (2007). [54] Vesel´ y P., Donner L., Cinátl J., Sovov´ a V.: Interaction of Rous sarcoma virus with rat embryo fibroblasts of inbred Lewis strain in vitro. Folia Biol. (Praha) 14, 457-465 (1968). ˇ c´ık J., Scholzov´ [55] Broˇzov´ a M., Kleibl Z., Net´ıkova I., Sevˇ a E., Bˇrezinov´ a J., Chaloupkov´ a A., Vesel´ y P., Dundr P., Zadinová M., Kr´ asn´ a L., Matouˇskov´ a E.: Establishment, growth and in vivo differentiation of a new clonal human cell line, EM-G3, derived from breast cancer progenitors. Breast Cancer Res. Treat. 103, 247-257 (2007). [56] Janeˇcková H., Vesel´ y P., Chmel´ık R.: Proving tumour cells by acute nutritional/energy deprivation as a survival threat: a task for microscopy. Anticancer Research 29, 2339-2346 (2009). [57] Rösel D., Brábek J., Tolde O., Mierke C. T., Zitterbart D. P., Raupach C., Bicanov´ a K., Kollmannsberger P., Paˇ nková D., Vesel´ y P., Folk P., Fabry B.: Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Molecular Cancer Research 6 (9), 1410-1420 (2008). 71

LITERATURA [58] Raupach C., Zitterbart D. P., Mierke C. T. Metzner C., M¨ uller F. A., Fabry B.: Stress fluctuation and motion of cytoskeletal-bond markers. Phys. Rev. E 76, 011018 (2007). ´ [59] Kolman P., Janeˇcková H., Chmel´ık R.: Digit´ aln´ı holografick´ a mikroskopie na UFI, VUT v Brnˇe. Jemná mechanika a optika 7-8, 206-208 (2009).

72

MIKROSKOPIE MICROSCOPY OF TIME VARIABLE BIOLOGIC OBJECTS

Recommend Documents