Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2010-2011
Microbieel vetmetabolisme in het humane colon en het effect van vetten op de humane colonmicrobiota
Laureys David Promotor: Prof. Dr. ir. Tom Van de Wiele Copromotor: Dr. ir. Bruno Vlaeminck Tutor: ir. Rosemarie De Weirdt
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Levensmiddelenwetenschappen en Voeding
Copyright De auteur en de promotor geven de toelating dit eindwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopi¨eren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit eindwerk.
The author and the promotor authorize consultation and partial reproduction of this thesis for personal use. Any other reproduction or use is subject to copyright protection, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.
Gent, juni 2011
Promotor, Prof. Dr. ir. Tom Van de Wiele
Auteur, David Laureys
I
Voorwoord Graag wil ik iedereen bedanken die meegeholpen heeft om dit eindwerk tot stand te brengen. Op het Laboratorium voor Microbi¨ele Ecologie en Technologie (LabMET), onder de enthousiaste leiding van Prof. Dr. ir. Willy Verstraete, kreeg ik de kans om op een redelijk vrije manier mijn onderzoek uit te voeren. Prof. Dr. ir. Tom Van de Wiele, mijn promotor, wil ik in het bijzonder bedanken voor de deskundige aanwijzingen bij het opduiken van problemen. Ook An Verhelst, Ellen Verbeke, Greet Van de Velde, Eng. Mike Taghon, Siska Maertens en Tim Lacoere waren steeds bereid om mij te begeleiden waar nodig, net zoals alle doctoraatstudenten. Op het Laboratorium voor Diervoeding en Kwaliteit van Dierlijke Producten van de vakgroep Dierlijke Productie in Melle werd ik vakkundig bijgestaan voor de analyses door Dr. ir. Bruno Vlaeminck en Sjarai Deschildere. Meest van al wil ik ir. Rosemarie de Weirdt bedanken. Zij stond altijd paraat om mij met raad en daad bij te staan. Zelfs vanuit het verre Amerika (met 9 uur tijdsverschil) leidde zij steeds alles in goede banen. Een welgemeende dankuwel voor al je inzet en je geduld met mij!
David Laureys, Gent, juni 2011
II
Inhoudsopgave
Copyright
I
Voorwoord
II
Inhoudsopgave
VI
Lijst van figuren
VII
Lijst van tabellen
X
Woordenlijst
XII
Samenvatting
XVI
Abstract
XVIII
1 Inleiding
1
1.1
Situering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2
Structuur en eigenschappen van vetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2.1
Vetzuren
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2.2
Triglyceriden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Fysiologische functies van vet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3.1
Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3.2
De novo lipogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.3.3
Vetweefsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Vetten in de voeding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.4.1
7
1.3
1.4
Verzadigde vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III
Inhoudsopgave
1.5
1.6
1.7
1.4.2
Onverzadigde vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.4.3
Geconjugeerde en trans-vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
Vertering van vetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.5.1
Het spijsverteringskanaal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.5.2
Vertering en opname van vet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
1.5.3
Doorstroom van vet naar het colon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
De microbiota van de dikke darm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.6.1
Korteketen vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
1.6.2
Ammoniak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
1.6.3
Waterstofsulfide en methaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
1.6.4
Interactie tussen darmmicrobiota en de gastheer . . . . . . . . . . . . . .
18
Vet in het colon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.7.1
Oorsprong van vet in het colon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.7.2
Metabolisme van vet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.7.3
Invloed van vet op de colonmicrobiota . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
2 Doelstellingen
23
3 Materiaal en methoden
24
3.1
3.2
3.3
Buffers en media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.1
Fosfaatbuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.2
SHIME-medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.3
MCB-medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.4
MRS-medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.5
Galoplossing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
Uitvoering experimenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.2.1
Fecale slurry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.2.2
Penicillineflesjes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
3.2.3
Flushen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
Protocols van de experimenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
IV
Inhoudsopgave
3.4
3.5
3.6
3.3.1
Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol . . . . . . . . . .
26
3.3.2
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum . . . .
27
3.3.3
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota . . . . . . .
28
3.3.4
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri
. . . . . . . . .
29
3.3.5
Aanrijking van de colonmicrobiota 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
3.3.6
Aanrijking van de colonmicrobiota 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
3.3.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Chemische analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.4.1
pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.4.2
Gasanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.4.3
Gasdruk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
3.4.4
Ammonium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
3.4.5
Korteketen vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
3.4.6
Langeketen vetzuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Microbi¨ele analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
3.5.1
Flowcytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
3.5.2
Specifieke cultivatie van bacteri¨ele groepen . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
3.5.3
DNA-extractie en opzuivering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
3.5.4
Nanodrop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
3.5.5
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
3.5.6
Agarosegel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
3.5.7
DGGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
3.5.8
Verwerking DGGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
Dataverwerking en statistische analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
4 Resultaten
48
4.1
Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol . . . . . . . . . . . . . .
48
4.2
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum . . . . . . . .
49
4.3
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota . . . . . . . . . . .
54
4.4
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillis reuteri . . . . . . . . . . . . . .
56
V
Inhoudsopgave 4.5
Aanrijking van de colonmicrobiota 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
4.6
Aanrijking van de colonmicrobiota 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
4.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
5 Discussie
69
5.1
Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
5.2
Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol . . . . . . . . . . . . . .
70
5.3
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum . . . . . . . .
72
5.4
Hypotheses over de biohydrogenatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
5.5
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota . . . . . . . . . . .
77
5.6
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri . . . . . . . . . . . . . .
78
5.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
5.7.1
Conclusies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
Aanrijking van de colonmicrobiota 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
5.8.1
Conclusies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
Aanrijking van de colonmicrobiota 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
5.9.1
84
5.8
5.9
Conclusies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 Opportuniteiten voor verder onderzoek
86
A Structuurformules en triviale namen van de langeketen vetzuren
87
B Transvetzuren in levensmiddelen
88
Bibliografie
89
VI
Lijst van figuren
1.1
a) De cis-vorm van een dubbele binding. b) De trans-vorm van een dubbele binding. c) Een niet-geconjugeerd systeem van 2 dubbele bindingen. d) Een geconjugeerd systeem van 2 dubbele bindingen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.2
De nummering van koolstofatomen in vetzuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.3
De moleculaire structuur van glycerol (a), propionzuur (b), boterzuur (c), een algemeen vetzuur (d) en van een algemeen triglyceride (e). . . . . . . . . . . . . .
4
Links: De algemene structuur van een fosfolipide. Rechts: Het effect van onverzadigde bindingen in de fosfolipide dubbellaag [Wikipedia ]. . . . . . . . . .
5
Links: Een illustratie van vetweefsel. Rechts: De obesitas prevalentie in een aantal landen bij de populatie ouder dan 15 jaar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Wijziging van de consumptie van vetten van plantaardige en dierlijke oorsprong gedurende de afgelopen tientallen jaren. De gegevens zijn afkomstig uit de online databank van Faostat [FAO ]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.7
Een overzicht van het spijsverteringsstelsel [Van De Graaff, 2001]. . . . . . . . .
11
1.8
De hydrolyse van een 2-monoglyceride in aanwezigheid van water tot vrij glycerol en het vrije vetzuur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
De verschillende regio’s in het menselijke colon en de corresponderende activiteiten en fysiologische parameters [Cummings en Macfarlane, 1991]. . . . . . . . . . . .
14
1.10 Een overzicht van de meest voorkomende darmbacteri¨en en hun situering in de taxonomie [The Taxonomicon ]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
1.11 Sulfaatreductie (boven), methanogenese (midden) en acetogenese. . . . . . . . . .
17
1.12 Belangrijkste pathways van LA-biohydrogenatie door darmbacteri¨en. . . . . . . .
20
3.1
Bovenaanzicht van het toestel om een gel met een gradi¨ent aan te maken. . . . .
45
4.1
De concentratie waterstofgas en methaan in de headspace na 24 uur incubatie met niet-methanogeen en methanogeen inoculum (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . .
49
1.4
1.5
1.6
1.9
VII
Lijst van figuren 4.2
De concentraties totaal C18 en cis-9 18:1 vetzuur (boven) en de concentraties linolzuur en stearinezuur (midden) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). De relatieve concentraties van de vetzuren betrokken in het biohydrogenatieproces zijn weergegeven als % van totaal 18:0, trans 18:1, trans 18:2 en n-6 18:2 (onder). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
De concentraties trans 18:1 en trans 18:2 vetzuren (boven) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). Het cis en trans 18:1 is weergegeven als % van totaal 18:1 (midden). Het trans 18:2 is verder opgesplitst in de relatieve concentraties van de verschillende isomeren (onder). . . . . . . . . . . . . . . . .
51
De pH en concentratie totaal ammonium stikstof in mmol/L (boven) en de SCFA in mmol/L (onder) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). De groep vertakte vetzuren is de som van isobutyraat en isovaleraat. . . . . . . . . . . . . .
53
De pH en concentratie totaal ammonium stikstof in mmol/L (boven), de SCFA in mmol/L (midden) en de ratios totaal SCFA/TAN na 24 uur incubatie bij 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g vet/L (M±SD). De groep vertakte vetzuren is de som van isobutyraat en isovaleraat. De aangeduide significantieniveau’s zijn op basis van totaal SCFA (acetaat, propionaat, butyraat, valeraat, isobutyraat en valeraat), en werden aangeduid met een ∗ (p<0.05) of een o (p<0.001). De totale SCFA/TAN ratios worden ook weergegeven (onder) (M±SD). Links staan de resultaten voor zonnebloemolie, rechts voor kokosolie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
De dode en totale getelde Lactobacillis reuteri cellen op verschillende tijdstippen bij incubatie in SHIME-medium (M±SD). Deze celconcentraties werden gemeten met een flowcytometer na LIVE/DEAD-kleuring (protocol 3.5.1). . . . . . . . . .
56
De dode en totale getelde Lactobacillis reuteri cellen op verschillende tijdstippen bij incubatie in MRS-medium (M±SD). Deze celconcentraties werden gemeten met een flowcytometer na LIVE/DEAD-kleuring (protocol 3.5.1). . . . . . . . . .
57
De DGGE-profielen van het 16S PCR-product op het DNA-extract van de stalen na 0 uur (start experiment) en na 6 dagen incubatie (na 5 overentingen). De DGGE-profielen werd verwerkt met Bionumerics, en voor de clusteringsanalyse werd gebruik gemaakt van het clusteralgorithme van Ward en de Pearson correlatie co¨efficienten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
De SCFA en TAN-productie na 1 en 6 dagen incubatie bij de controle en de behandeling met 0.5 g zonnebloemolie/L (M±SD). De groep vertakte SCFA is de som van isobutyraat en isovaleraat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
4.10 Resultaten van de uitplatingen op selectieve cultuurmedia van de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie) na 15 dagen incubatie in SHIME-medium (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
VIII
Lijst van figuren 4.11 Resultaten van de SCFA- en TAN-analyses van de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie) na 1, 10 en 15 dagen incubatie in SHIME-medium (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
4.12 Resultaten van de uitplatingen op selectieve cultuurmedia van de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 11 dagen incubatie voor de incubaties in SHIME-medium en na 13 dagen voor de incubaties in MCB-medium (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
4.13 Resultaten van de SCFA- en TAN-analyses van de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 1, 7 en 12 dagen incubatie in SHIME-medium (boven) en in MCB-medium (onder) (M±SD). . . . . . . . .
64
4.14 De LCFA-analyses van de vetten gebruikt in de behandelingen (reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) en van de incubatiemedia van de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 12 dagen incubatie in SHIME- en MCB-medium (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
4.15 De DGGE-profielen van de incubaties in SHIME-medium (boven) en MCB-medium (onder). De S en M zijn de stalen op tijdstip 0 (3 herhalingen). C = Controle, R = Reuzel, O = Olijfolie, Z = Zonnebloemolie en L = Lijnzaadolie na 12 dagen incubatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
68
5.1
De verschillende biohydrogenatiepathways van linolzuur [Chilliard et al., 2007]. 72
A.1 Structuurformules en triviale namen van de langeketen vetzuren . . . . . . . . . .
IX
87
Lijst van tabellen
1.1
De pKa (maat voor de zuurtegraad) en de log Kow (maat voor de lipofiliciteit) van enkele verschillende vetzuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.2
Nomenclatuur van vetzuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3
Vetzuursamenstelling van enkele vetten, gerangschikt volgens dalend PUFA gehalte (g/100g vet) [Bodnermontville et al., 2006] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Aanbevolen dagelijkse consumptie van de verschillende vetten. De percentages hebben betrekking op het aandeel in de aanbevolen dagelijkse energieconsumptie [Ness, 2004]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
Verblijftijden in de verschillende delen van de darm op basis van gegevens die beschikbaar waren in de literatuur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Links: de samenstelling van de fosfaatbuffer. Rechts: de samenstelling van de ana¨erobe fosfaatbuffer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Links: de samenstelling van het SHIME-medium [Molly et al., 1993]. Rechts: de samenstelling van het MCB-medium [Van der Meulen et al., 2006]. . . . . .
25
De samenstelling van de haverzemelen (Haverzemelen; Ekoland, Harderwijk, Nederland). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
3.4
De samenstelling van ana¨erobe BHI-agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
3.5
De samenstelling van de oplossingen A, B en C voor RB-agar . . . . . . . . . . .
39
3.6
De samenstelling van de oplossingen A, B en C voor LAMVAB-agar . . . . . . .
40
3.7
De samenstelling van de PCR Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
3.8
Het PCR tijd/temperatuur-programma voor de gebruikte primers . . . . . . . . .
42
3.9
De samenstelling van de denaturatieoplossingen voor DGGE . . . . . . . . . . . .
44
4.1
De LCFA-concentraties (g/L) en de pH in de 3 reeksen (M±SD), de tijd is weergegeven in uur. Na 4 en 24 uur werden de twee behandelingen vergeleken met de controle via een Student’s T-test. Statistisch significante verschillen werden aangeduid met een o (p<0.001) of een ∗ (p<0.05). . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
1.4
1.5
3.1
3.2
3.3
X
Lijst van tabellen 4.2
De vetbelasting van de bacteri¨en in incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (mg toegevoegd linolzuur/g inoculum nat gewicht). . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
4.3
De druk (kPa) in de flesjes na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). 53
4.4
De vetbelasting van de bacteri¨en in de incubaties met 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g vet/L (het inoculum wordt uitgedrukt in nat gewicht). . . . . . . . . . . . . . . .
54
De acetaat-concentraties (mmol/L) na 100.5, 148.5 en 196.5 uur incubatie van Lactobacillus reuteri in SHIME-medium met 0, 20, 50, 200 en 500 mg linolzuur/L (M±SD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
4.5
4.6
De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1 en 6 dagen incubatie in SHIME-medium bij de controle en de behandeling met 0.5 g zonnebloemolie/L. 59
4.7
De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1, 6, 10 en 15 dagen incubatie in SHIME-medium bij de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie). . . . . . . . . . . . .
62
De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1, 7 en 12 dagen incubatie in SHIME- en MCB-medium bij de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie). . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
De vetconcentraties in de incubatiemedia na 12 dagen incubatie van de controle en de behandelingen in SHIME- en MCB-medium (M±SD). . . . . . . . . . . . .
66
De eigenschappen van SHIME-medium en het MCB-medium voor de incubatie van de colonmicrobiota in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
85
B.1 Concentratie van cis-9, trans-11 18:2 CLA in dierlijke producten . . . . . . . . .
88
4.8
4.9
5.1
XI
Verklarende Woordenlijst ANOVA Analysis Of Variance. APS Ammonium Persulfate. BAT Brown Adipose Tissue. BHI Brain Heart Infusion. BMI Body Mass Index. CLA Conjugated Linoleic Acid. CTAB Hexadecyltrimethylammonium Bromide. DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophorosis. DHA Docosohexaenoic Acid. DMSO Dimethylsulfoxide. DNA Deoxyribonucleic Acid. DS Denaturing Solution. EA Enterococcus Agar. EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid. EFA Essential Fatty Acid. EHC Entero Hepatic Circulation. EMA European Medicine Agency. EPA Eicosapentaenoic Acid. EPA-EE Eicosapentaenoic Acid-Ethylester. FDA Food and Drug Administration. FFA Free Fatty Acid.
XII
Woordenlijst G-C Guanine-Cytosine. GC Gas Chromatograph. HDL-C High Density Lipoprotein Cholesterol. LA Linoleic Acid. LAB Liquid-Associated Bacteria. LAMVAB Lactobacillus Anaerobic MRS with Vancomycin and Bromocresol green. LCFA Long Chain Fatty Acid. LDL-C Low Density Lipoprotein Cholesterol. M Mean. MC MacConkey. MCB Medium for Colon Bacteria. MCFA Medium Chain Fatty Acid. MRS de Man, Rogosa and Sharpe. OTU Operational Taxonomic Unit. PCR Polymerase Chain Reaction. PI Propidium Iodide. PUFA Poly Unsaturated Fatty Acid. QI Quetelet Index. RA Rumenic Acid. RB Raffinose Bifidobacterium. RDI Recommended Daily intake. RNA Ribonucleic Acid. SAB Solid-Adherent Bacteria. SCFA Short Chain Fatty Acid. SD Standard Deviation. SHIME Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem.
XIII
Woordenlijst SRB Sulphate Reducing Bacteria. TAE Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane), Acetic acid and EDTA. TAN Total Ammonia Nitrogen. TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylenediamine. Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane. TSC Tryptose Sulfiet Cycloserine. UV Ultraviolet. VA Vaccenic Acid. VLCFA Very Long Chain Fatty Acid. WAT White Adipose Tissue. WHO World Health Organisation.
XIV
Samenvatting Vetten maken een belangrijk deel uit van de menselijke voeding. Het grootste deel van dit vet wordt zeer effici¨ent geabsorbeerd in de dunne darm, maar toch komt er altijd nog vet in het colon terecht. Bij bepaalde condities (abnormaal korte of slecht werkende dunne darm, mucoviscidose, gebruik van Orlistat ...) is deze hoeveelheid echter hoger dan in normale omstandigheden. Het vet dat in het colon terechtkomt kan op 2 manieren interageren met de colonmicrobiota die daar aanwezig is. Enerzijds kan de colonmicrobiota de vetten metaboliseren via het biohydrogenatieproces. Hierbij worden onverzadigde vetten ge¨ısomeriseerd en gehydrogeneerd tot meer verzadigde vetzuren. Anderzijds kunnen deze vetten ook een invloed hebben op de samenstelling van de colonmicrobiota. Beide aspecten zijn echter nog onvoldoende onderzocht, en werden in dit eindwerk verder bestudeerd. In het eerste deel van dit eindwerk werd succesvol een protocol opgesteld om de biohydrogenatieprocessen die uitgevoerd worden door de colonmicrobiota in vitro te bestuderen. Aan de hand van dit protocol werd de invloed van de waterstofdruk op op de biohydrogenatieprocessen bestudeerd. Hieruit kwamen enkele opmerkelijke resultaten naar voor die een aantal conclusies in vraag stellen die teruggevonden worden in de literatuur. Uit dit onderzoek blijkt namelijk dat zowel het inoculumtype als de vetbelasting van de colonmicrobiota een invloed heeft op de verhouding van de verschillende CLA-isomeren die gevormd worden tijdens het biohydrogenatieproces. De vorming van deze verschillende CLA-isomeren in het humane colon is belangrijk omdat verschillende isomeren een andere invloed hebben op de gezondheid van de gastheer. Een methanogeen inoculum leverde een hoge (gewenste) verhouding van cis-9, trans-11/trans-10, cis-12 CLAisomeren op, terwijl deze verhouding lager lag (ongewenst) bij niet-methanogeen inoculum. De waterstofdruk leek in dit onderzoek een invloed uit te oefenen op de absolute concentraties CLA die gevormd werden, maar om dit te kunnen concluderen is nog verder onderzoek nodig. In het tweede deel van dit eindwerk bleek de aanwezigheid van zonnebloemolie in het fermentatiemedium een ongunstig effect te hebben op de fermentatieproducten (totale SCFA/TAN) van humane fecale microbiota in vitro. Hoe groter de concentratie zonnebloemolie, hoe minder gunstig de fermentatieproducten waren voor de gastheer (lagere ratio totale SCFA/TAN). De aanwezigheid van kokosolie had daarentegen een geringer effect. Mensen bij wie er om ´e´en of andere reden relatief meer vet in het colon terechtkomt, kiezen dus beter voor gebruik van kokoslie dan zonnebloemolie. In dit tweede deel bleek ook dat de aanwezigheid van linolzuur in het groeimedium van Lactobacillus reuteri, de membraanpermeabiliteit van deze bacterie doet toenemen. Echter had deze permeabiliteitsstijging geen effect op de fermentatieproducten die gevormd werden XV
Samenvatting door deze bacterie. Er zijn eveneens geen aanwijzingen dat de groei van deze bacterie negatief be¨ınvloed werd door de aanwezigheid van linolzuur. Tenslotte kwam ook naar voor dat de aanwezigheid van verschillende vetten in het groeimedium van humane fecale microbiota geen drastische gevolgen had voor de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap en de gevormde fermentatieproducten. Desalniettemin konden op beide niveau’s toch effecten waargenomen worden. Deze effecten waren echter afhankelijk van de samenstelling van het medium waarin de colonmicrobiota groeiden Dit zorgde ervoor dat het moeilijk was om algemene conclusies te trekken uit de resultaten. De groepen bacteri¨en die een invloed ondervonden van de vetten waren de Lactobacilli, Clostridia en de Bifidobacteria.
XVI
Abstract Fats are an important component in human nutrition. In healthy humans the fat digestion and absorption in the small intestine is a very efficient process. However, a residual amount of fat escapes this process and enters the colon. In some conditions (abnormal short or dysfunctional small intestine, mucoviscidosis, use of Orlistat ...) this amount is much higher than in normal circumstances. The fat that enters the colon can interact with the colon microbiota in two ways. On the one hand, the colon microbiota can metabolise the unsaturated fats in the biohydrogenation process. In this process there occurs an isomerisation and hydrogenation of unsaturated fatty acids with the production of more saturated fatty acids. On the other hand is it possible that these fats haven an influence on the composition of the human colon microbiota. Both aspects are not sufficiently studied, and it was the aim of this master dissertation to research these aspects in further detail. In the first part a protocol for biohydrogenation by the human colon microbiota in vitro was successfully conceived. With this protocol the influence of the hydrogen pressure on the biohydrogenation processes were studied in more detail. The results invalidate some conclusions that are found in the literature. From this research we can conclude that the inoculum type and the fat load of the colon microbiota both have en influence on the proportion of CLA-isomers that are produced. The distinction between these different isomers is important because different isomers have also a different influence on the health of the host. A methanogenic inoculum produced CLA with a high (desirable) cis-9, trans-11/trans-10 cis-12 ratio, while this ratio was lower for non-methanogenic inoculum. The hydrogen pressure seemed to have an influence on the absolute concentrations of the produced CLA, but further research is necessary to prove this. In the second part of this master dissertation, it was found that the addition of sunflower oil to the growth medium had an undesirable effect on the fermentation products (total SCFA/TAN) of the human fecal microbiota in vitro. The higher the concentration of sunflower oil, the less desirable the fermentation products were (lower SCFA/TAN). The presence of coconut oil had showed no distinct trend in the SCFA/TAN. So people that have a larger amount of fat entering the colon can better choose for coconut oil instead of sunflower oil. In this second part, it was also seen that the addition of linoleic acid to the growth medium of Lactobacillus reuteri increased the membrane permeability of this bacterium. Surprisingly this increase in membrane permeability had no influence on both the fermentation and the growth characteristics of this bacterium. Finally it was shown that the addition of different fats to the growth medium of human fecal XVII
Abstract microbiota had no drastic effects on the composition of the microbial community and the fermentation products. Nevertheless on both levels it was possible to detect differences, but these differences were dependent on the medium that was used. This made it difficult to form general conclusions about the results. The bacteria that were influenced by the fats were the Lactobacilli, Clostridia and Bifidobacteria.
XVIII
Hoofdstuk 1
Inleiding 1.1
Situering
De afgelopen decennia is het dieet van de Westerse bevolking aan sterke veranderingen onderhevig geweest. E´en van de meest uitgesproken veranderingen is de toename in de consumptie van plantaardige oli¨en in het Westerse voedingspatroon. Vetten in de voeding worden in normale omstandigheden zeer effici¨ent geabsorbeerd in de dunne darm van de mens, desalniettemin komt er per dag toch 6 tot 8 g vet in het colon terecht. Onverzadigde vetzuren die in het colon terechtkomen kunnen door de colonmicrobiota worden omgezet tot meer verzadigde vetzuren in het biohydrogenatieproces zoals reeds in enkele studies werd aangetoond. Niet alleen hebben de colonmicrobiota een effect op de vetzuren, maar vetzuren die in het colon terechtkomen kunnen op hun beurt ook de daar aanwezig zijnde microbiota be¨ınvloeden. Het is reeds aangetoond dat verscheidene verzadigde en onverzadigde vetzuren toxisch zijn voor sommige bacteri¨en. In deze masterproef zullen beide aspecten van de vetten in het colon worden bestudeerd aan de hand van in vitro proeven.
1.2
Structuur en eigenschappen van vetten
1.2.1
Vetzuren
Vetzuren bestaan volledig uit de elementen koolstof, zuurstof en waterstof. Het zijn carboxylzuren van alifatische koolstofwaterstofketens, waarbij de meeste vetzuren die voorkomen in de natuur een even aantal koolstofatomen bevatten [Shorland, 1954]. De lengte van deze acylketen (vetzuur) zal een belangrijke invloed hebben op de eigenschappen van het vetzuur. Naargelang het aantal koolstofatomen worden de vetzuren opgedeeld in 4 groepen:
de de de de
korteketen of vluchtige vetzuren (SCFA): minder dan 6 C-atomen middenketen vetzuren (MCFA): tussen 6 en 12 C-atomen langeketen vetzuren (LCFA): tussen 12 en 22 C-atomen zeer langeketen vetzuren (VLCFA): meer dan 22 C-atomen.
Naarmate de vetzuren langer zijn, nemen de Van der Waals krachten tussen deze moleculen toe waardoor het smeltpunt zal stijgen en de vluchtigheid zal afnemen. De SCFA worden ook wel
1
INLEIDING: Structuur en eigenschappen van vetten
1.2
vluchtige vetzuren genoemd omdat deze min of meer vluchtig zijn. Niet alleen zullen de Van der Waals krachten toenemen bij stijgende ketenlengte, ook zullen de watermoleculen prefereren om niet te interageren met deze hydrofobe ketens waardoor de wateroplosbaarheid van deze vetzuren daalt (tabel 1.1). Er treedt een preferenti¨ele exclusie van de vetzuren op waardoor ze naar elkaar toe gedreven worden en een afgescheiden fase vormen in een waterig milieu. Daar de dichtheid van vetzuren rond 0.9 g/cm3 ligt, zal deze afgescheiden fase bovendrijven in een waterig milieu. Vetzuren zijn amfipatische moleculen, ze bezitten een polaire carboxylgroep en een apolaire alifatische koolwaterstofketen. De carboxylgroep is doorgaans min of meer ge¨ıoniseerd in waterige oplossing afhankelijk van de pKa van het vetzuur in kwestie en de pH van het waterig milieu. Voor boterzuur is de pKa gelijk aan 4.83 wat betekent dat bij een pH = 4.83 de helft van de boterzuurmoleculen aanwezig zijn in ge¨ıoniseerde vorm (butyraat). In neutraal milieu bij pH=7 zal het gros van de boterzuurmoleculen dus aanwezig zijn als butyraat. Door het ioniseren van de carboxylgroep zal deze meer polair worden wat de wateroplosbaarheid bevordert. Dit is de reden dat de Na+ - en K+ -zouten van bijvoorbeeld laurinezuur kunnen gebruikt worden als wateroplosbare zepen terwijl het laurinezuur (12:0) op zich niet wateroplosbaar is. De pKa van de verschillende vetzuren is redelijk gelijkaardig en ligt steeds rond 5 (tabel 1.1). Verder zijn de bindingen tussen de C-atomen zeer belangrijk, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen onverzadigde en verzadigde vetzuren. De term verzadigd slaat op de verzadiging van de koolstofatomen met waterstof. Bij een dubbele binding zijn de koolstofatomen niet verzadigd met waterstof en kan er nog wel extra waterstof binden aan de koolstofatomen. Bij enkelvoudige bindingen in een vetzuur kan er geen extra waterstof meer binden, waardoor dit vetzuur verzadigd is. De onverzadigde vetzuren kunnen verder worden opgesplitst in mono-onverzadigde vetzuren met ´e´en dubbele binding en poly-onverzadigde vetzuren met meer dan ´e´en dubbele binding. Koolstofatomen die een dubbele binding vormen met elkaar kunnen niet vrij roteren ten opzichte van elkaar. Bij een dubbele binding in de vetzuurketen kunnen er bijgevolg twee isomeren voorkomen, de cis-vorm en de trans-vorm (figuur 1.1). De cis- en trans-vorm kan ook aangeduid worden als de Z- en E-vorm respectievelijk (Zusammen en Entgegen) op basis van toegekende prioriteiten (Cahn-Ingold-Prelog prioriteitsregels). De E- en Z-vorm is een meer ´e´enduidige methode en tevens de methode aangeraden door IUPAC [IUPAC ], maar voor vetzuren wordt meestal nog de cis- en trans-vorm gebruikt. Voor de eenvoud zal in het verdere verloop van deze masterproef steeds gewerkt worden met de cis- en trans-benaming. Tabel 1.1: De pKa (maat voor de zuurtegraad) en de log Kow (maat voor de lipofiliciteit) van enkele verschillende vetzuren. Vetzuur Azijnzuur Propionzuur Boterzuur Laurinezuur Stearinezuur
C:D 2:0 3:0 4:0 12:0 18:0
pKa [Serjeant en Dempsey, 1979] 4.76 4.86 4.83 ±5.3 ±5
2
log Kow [LOGKOW ] -0.17 0.33 0.79 4.60 8.23
INLEIDING: Structuur en eigenschappen van vetten a) R1
R2
H
H
b) R1
H
H
R2
1.2
c) R1
R2
d) R1
R2
Figuur 1.1: a) De cis-vorm van een dubbele binding. b) De trans-vorm van een dubbele binding. c) Een niet-geconjugeerd systeem van 2 dubbele bindingen. d) Een geconjugeerd systeem van 2 dubbele bindingen.
Bij poly-onverzadigde vetzuren kunnen 2 of meer dubbele bindingen geconjugeerd zijn, zoals bijvoorbeeld in RA (bijlage A). Dit betekent dat er slechts ´e´en enkelvoudige binding tussen twee opeenvolgende dubbele bindingen staat waardoor de opeenvolgende C-atomen allen een sp2-configuratie bezitten en een geconjugeerde systeem vormen (figuur 1.1). Om de vetzuren ´e´enduidig te benoemen, zal er verder gebruik worden gemaakt van de triviale namen of de triglyceridegetallen. De triviale namen zijn niet-systematische historische namen die veel gebruikt worden (alle gebruikte triviale namen met hun afkortingen zijn opgenomen in bijlage A). De triglyceridegetallen bestaan uit 2 getallen in de C:D vorm. Hierin stelt C het aantal koolstofatomen voor in het vetzuur, en D stelt het aantal dubbele bindingen voor. Vaak zal deze basisvorm nog worden aangevuld met de plaats en de stereo-isomerie van de dubbele binding(en). Om aan te duiden tussen welke koolstofatomen de dubbele binding(en) zich bevind(t)(en) kunnen de koolstofatomen in de vetzuurketens op 2 manieren genummerd worden. De eerste methode, de nummering volgens IUPAC [IUPAC ], duidt het carboxyl-koolstofatoom aan als het eerste C-atoom (C1); het eerstvolgende C-atoom (C2) wordt ook wel het α-C-atoom (Cα) genoemd. De plaats van een dubbele binding wordt vervolgens aangegeven door de positie van het eerste koolstofatoom van de dubbele binding (Cx), te tellen vanaf het carboxyl-koolstofatoom (C1), en wordt genoteerd als ∆x. Bij de tweede methode is het laatste koolstofatoom van de acylketen (dit van de terminale methylgroep) aangeduid als het Cn-1 atoom. De plaats van de dubbele binding wordt vervolgens aangegeven door de positie van het eerste koolstofatoom van een dubbele binding (Cn-x), te tellen vanaf Cn-1. De plaats van dit koolstofatoom wordt genoteerd als n-x. Soms wordt de n vervangen door ω met gelijkvormige notatie ω-x. Beide nummeringen worden grafisch voorgesteld in figuur 1.2. De nomenclatuur volgens de verschillende besproken methodes wordt ge¨ıllustreerd in tabel 1.2. Cα
HO C1
Cn-1 C9
Cn-6
O Figuur 1.2: De nummering van koolstofatomen in vetzuren.
3
INLEIDING: Fysiologische functies van vet
1.3
Tabel 1.2: Nomenclatuur van vetzuren. Triviale naam Laurinezuur Stearinezuur Linolzuur Rumenzuur α-linoleenzuur
1.2.2
C:D 12:0 18:0 18:2 18:2 18:3
∆x cis,cis-∆9 ,∆12 cis,trans-∆9 ,∆11 cis,cis,cis-∆9 ,∆12 ,∆15
n-x n-6 n-7 n-3
Triglyceriden
Vetzuren zullen van nature meestal voorkomen in de vorm van triglyceriden, zoals het geval is in oli¨en en vetten. De basisstructuur van triglyceriden bestaat uit ´e´en glycerolmolecule die veresterd is met 3 vrije vetzuren (FFA) (figuur 1.3). De vetzuren die voorkomen in een triglyceride zullen bijgevolg de eigenschappen bepalen van het resulterende triglyceride. Triglyceriden zijn net zoals de langeketen vetzuren onoplosbaar in water en hebben een kleinere dichtheid (rond 0.9 g/cm3) dan water waardoor ze een afgescheiden bovendrijvende fase vormen in waterig milieu. b) HO a) 1
c) HO 2
O
2
O
3
O
R1
O
O
R2
OH d) HO
3
e) 1
OH
O
R
O
R3
OH O
O
Figuur 1.3: De moleculaire structuur van glycerol (a), propionzuur (b), boterzuur (c), een algemeen vetzuur (d) en van een algemeen triglyceride (e).
Dubbele binding(en) in de vetzuren zorgen voor een knik in de vetzuurmolecule waardoor de stapeling van onverzadigde vetten moeilijker is dan bij verzadigde vetten. Hierdoor kristalliseren vetten met veel onverzadigde vetzuren niet zo gemakkelijk uit en zijn ze vloeibaar bij kamertemperatuur, dit verschil zorgt ervoor dat er bij plantaardige vetten gesproken wordt van oli¨en en bij dierlijke vetten van vet. Vetten van dierlijke oorsprong bevatten namelijk doorgaans meer verzadigde vetzuren dan vetten afkomstig van plantaardige bronnen. Echter niet alle plantaardige vetten bestaan voor een groot deel uit onverzadigde vetten, zoals wordt aangetoond in tabel 1.3.
1.3 1.3.1
Fysiologische functies van vet Membranen
Vetten zijn zeer belangrijke moleculen in alle levende organismen, zowel structureel als functioneel. Fosfolipiden (figuur 1.4) sluiten alle levende cellen af van de buitenwereld onder de vorm van een fosfolipide dubbellaag. Verstoring van deze dubbellaag, bijvoorbeeld door detergenten, brengt de 4
INLEIDING: Fysiologische functies van vet
1.3
Tabel 1.3: Vetzuursamenstelling van enkele vetten, gerangschikt volgens dalend PUFA gehalte (g/100g vet) [Bodnermontville et al., 2006] Vet
.
4:0
Lijnzaadolie Zonnebloemolie Sojaolie Koolzaad Olijfolie Kokosolie Moedermelk Koemelk Visolie (zalm) Kippenvet Varkensvet Rundvet
12:0
3.7
2.3
44.6 5.8 2.4
0.2 0.9
14:0
0.1 0.1 16.8 7.3 9.1 3.3 0.9 1.3 3.7
16:0 5.3 5.9 10.4 6.2 11.3 8.2 20.9 25.5 9.8 21.6 23.8 24.9
18:0 4.1 4.5 4.0 2.3 2.0 2.8 6.7 11.2 4.2 6.0 13.5 18.9
18:1 20.2 19.5 21.5 59.8 71.3 5.8 33.5 25.0 17.0 37.3 41.2 36.0
18:2 12.7 65.7 51.3 18.8 9.8 1.8 8.5 3.7 1.5 19.5 10.2 3.1
18:3 53.3 6.9 7.6 0.8 1.2 2.3 1.1 1.0 1.0 0.6
verz. 9.4 10.3 15.3 7.8 13.8 86.5 45.4 57.4 19.9 29.8 39.2 49.8
Totaal PUFA n-6 66.0 12.7 65.7 65.7 58.2 51.3 26.4 18.8 10.5 9.8 1.8 1.8 11.1 8.5 6.0 3.7 40.3 1.5 20.9 19.5 11.2 10.2 4.0 3.1
n-3 53.3 6.9 7.6 0.8 1.2 2.3 35.3 1.0 1.0 0.6
levensvatbaarheid van cellen in gevaar. Een membraan met een bepaalde samenstelling heeft een specifiek smeltpunt (temperatuur waarbij de overgang van gel naar vloeistof plaatsvindt). Een optimale vloeibaarheid van dit membraan is noodzakelijk voor optimale celfunctie. De vloeibaarheid van deze dubbellaag wordt bepaald door de samenstelling van de fosfolipiden in deze dubbellaag, waarbij enerzijds de lengte van de vetzuren en anderzijds de graad van onverzadigdheid van de vetzuren in de fosfolipiden van belang is (inleiding 1.2).
O− X
P
O
O O
R1 O
O
R2 O
Figuur 1.4: Links: De algemene structuur van een fosfolipide. Rechts: Het effect van onverzadigde bindingen in de fosfolipide dubbellaag [Wikipedia ].
Door een knik in de structuur van de onverzadigde vetzuren, is de stapeling van de fosfolipiden met onverzadigde vetzuren in het membraan minder dicht, en wordt het membraan aanzienlijk meer permeabel voor water en andere kleine moleculen (figuur 1.4) [Desbois en Smith, 2010].
5
INLEIDING: Fysiologische functies van vet
1.3.2
1.3
De novo lipogenese
Bij dieren wordt overtollige energie eerst onder de vorm van glycogeen opgeslagen (vooral in de spieren en de lever) en daarna in de vorm van vetweefsel (vooral onderhuids, rond de organen, in beenmerg en in borstweefsel). Dieren kunnen zelf vetten aanmaken via het lipogenese proces (vooral in de lever). Hierbij wordt gebruik gemaakt van acetyl-CoA dat afkomstig is uit het metabolisme van enkelvoudige suikers zoals glucose en fructose, maar mogelijks ook van de fermentatieprocessen in het colon. Bij deze fermentatieprocessen wordt acetaat gevormd dat doorheen de colonocyten kan opgenomen worden in het bloed dat vervolgens via de poortader naar de lever stroomt [Bergman, 1990].
1.3.3
Vetweefsel
Dierlijk vetweefsel (adiposeweefsel) bestaat uit vetcellen (adipocyten) die twee vormen kunnen aannemen, de witte (WAT) en de bruine adipocyten (BAT). De witte adipocyten (figuur 1.5) bevatten 1 grote vetdruppel (figuur 1.5). Vetweefsel vormt bij mannen 20% en bij vrouwen 25% van het lichaamsgewicht. Het bestaat uit ongeveer 80% vet in de vorm van triglyceriden, waarvan de samenstelling varieert naargelang het organisme maar ook naargelang de plaats in het organisme.
% obese (≥15) % van de totale populatie
40 35 30 25
USA UK Finland France Japan
20 15 10 5 0 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010
Jaar
Figuur 1.5: Links: Een illustratie van vetweefsel [Van De Graaff, 2001]. Rechts: De obesitas prevalentie in een aantal landen bij de populatie ouder dan 15 jaar [OECD, 2010].
Overmatige accumulatie van vet in het vetweefsel kan leiden tot overgewicht (of obesitas), een veelgebruikte maat voor zwaarlijvigheid is de BMI (Body Mass Index), of ook wel de QI genoemd (Quetelet Index):
6
INLEIDING: Vetten in de voeding
BM I =
1.4
lichaamsmassa (kg) [lichaamslengte (m)]2
(1.1)
Op basis van deze maat worden personen geclassificeerd als ondergewicht (BMI < 18.5), normaal (18.5 < BMI < 25), overgewicht (25 < BMI < 30) en obese of ernstig overgewicht (BMI > 30). De prevalentie van obesitas is de afgelopen tientallen jaren sterk gestegen (figuur 1.5).
1.4
Vetten in de voeding
Vetten hebben een energiedichtheid van 9 kCal/g of 37.8 kJ/g, dit is meer dan twee keer de energiedichtheid van koolhydraten of prote¨ınen (ongeveer 4 kCal/g). Vetten zijn dus een belangrijke bron van energie voor mensen. Anno 2004 was de gemiddelde vetconsumptie over de hele wereld gelijk aan 78 g/dag, dit varieert wereldwijd van ongeveer 50 g/dag (Azi¨e) tot 150 g/dag (Europa en Noord-Amerika) [FAOstat, 2009]. Voor Europa en Noord-Amerika is dit een stuk hoger dan de aanbevolen dagelijkse inname opgesteld door de WHO (tabel 1.4) Tabel 1.4: Aanbevolen dagelijkse consumptie van de verschillende vetten. De percentages hebben betrekking op het aandeel in de aanbevolen dagelijkse energieconsumptie [Ness, 2004]. Component Aanbevolen dagelijkse energie-inname Vetten totaal Verzadigde vetten Mono-onverzadigde vetten Poly-onverzadigde vetten totaal Poly-onverzadigde n-6 vetten Poly-onverzadigde n-3 vetten Trans vetzuren
1.4.1
RDI (%) 15-30 <10 9-10 6-10 5-8 1-2 <1
RDIMan (g) 2500 kCal 40-80 <28 25-28 16-28 14-22 2.8-5.6 <2.8
RDIVrouw (g) 2000 kCal 33-66 <22 20-22 13-22 11-18 2.2-4.4 <2.2
Verzadigde vetzuren
Verzadigde vetzuren worden vooral geassocieerd met dierlijke vetten (stearinezuur, 18:0), maar sommige vetten van plantaardige oorsprong zijn ook zeer rijk aan verzadigde vetzuren (tabel 1.3). Verschillende vetzuren hebben naast hun intrinsieke eigenschappen (inleiding 1.2) ook een verschillend effect op de menselijke fysiologie bij consumptie hiervan (lipide-hypothese [Thompson, 1999]). De trend in consumptie van vetten wordt weergegeven in figuur 1.6. Verzadigde vetten worden dikwijls aangewezen als oorzaak van de hart- en vaatziekten in de Westerse wereld [Danaei et al., 2009; Mozaffarian en Clarke, 2009; Skeaff en Miller, 2009]. De redenering hierachter is dat verzadigde vetten het totale cholesterol en het LDL-C (Low Density Lipoprotein-Cholesterol) niveau in het bloed doen stijgen, en dit zou ertoe leiden dat bloedlipiden (cholesterol en verzadigde vetten) worden afgezet op de wanden van de aders zodat deze geleidelijk dichtslibben (lipide hypothese voor atherosclerose) [Steinberg, 2006]. Het
7
INLEIDING: Vetten in de voeding
1.4
verband tussen verzadigde vetten en hart- en vaatziekten wordt echter door meerdere studies en meta-analyses in vraag getrokken, telkens bleek er geen reden om verzadigde vetten aan te duiden als oorzaak van hart- en vaatziekten [Mente et al., 2009; Ravnskov, 1998; Siri-Tarino et al., 2010].
1.4.2
Onverzadigde vetzuren
De afgelopen tientallen jaren is de consumptie van onverzadigde vetzuren zeer sterk gestegen in de Westerse wereld. Dit komt door de stijging in de consumptie van plantaardige oli¨en (figuur 1.6). In 1909 bestond 2.3% van de ingenomen calori¨en uit linolzuur, en dit is gestegen tot 7.2% in 2009 [Blasbalg et al., 2011]. De meest geconsumeerde oli¨en zijn zonnebloem-, soja- en koolzaadolie, en deze oli¨en zijn zeer rijk aan linolzuur (tabel 1.3). Een gevolg van deze stijging in de consumptie van linolzuur is onder andere een stijging van linolzuur in lichaamsweefsels en moedermelk [Ailhaud et al., 2006]. Dit laatste kan vervolgens een invloed hebben op ontwikkelende babies.
Dierlijke vetten
Plantaardige oli¨ en
35
35 Finland UK France USA Japan
25
30
kg/capita/day
kg/capita/dag
30
20 15 10 5 0 1960
25
USA UK France Japan Finland
20 15 10 5
1970
1980
1990
2000
0 1960
2010
Jaar
1970
1980
1990
2000
2010
Jaar
Figuur 1.6: Wijziging van de consumptie van vetten van plantaardige en dierlijke oorsprong gedurende de afgelopen tientallen jaren. De gegevens zijn afkomstig uit de online databank van Faostat [FAO ].
Het belangrijkste mono-onverzadigde vetzuur is oliezuur (18:1) en dit komt in grote hoeveelheden voor in olijfolie (tabel 1.3). De poly-onverzadigde vetzuren omvatten linolzuur (n-6 18:2) en α-linoleenzuur (n-3 18:3). Dit zijn vetzuren die het menselijke lichaam nodig heeft, maar die door het lichaam niet kunnen worden geproduceerd uit andere voedselcomponenten. Dit is het gevolg van het feit dat het menselijk lichaam geen ∆12- en ∆15-denaturase enzymes aanmaakt. Om deze reden worden ze ook wel essenti¨ele vetzuren genoemd (EFA’s). Deze n-6 en n-3 C18 LCFA kunnen nog worden omgezet tot langere keten n-6 en n-3 vetzuren 8
INLEIDING: Vetten in de voeding
1.4
(DHA en EPA) [Sprecher, 1981], de effici¨entie van dit proces is slechts rond de 5% [Plourde en Cunnane, 2007]. Het zouden vooral deze langere keten n-6 en n-3 vetzuren zijn die een positief effect hebben op de gezondheid [Anderson en Ma, 2009; Ramsden et al., 2010; Wang et al., 2006]. Tekort aan deze essenti¨ ele vetzuren leidt tot allerlei defici¨entiesymptomen. Plantaardige bronnen van deze EFA’s zijn lijnzaad, zonnebloemzaden, walnoten, algen ... Dierlijke bronnen van deze vetzuren zijn vis, visolie, vlees ... Vetten van plantaardige oorsprong bevatten enkel de C18 n-6 en n-3 vetzuren, vetten van dierlijke oorsprong bevatten wel de langere keten n-6 en n-3 vetzuren (DHA en EPA). Er zijn aanwijzingen dat overmatige consumptie van poly-onverzadigde vetzuren (vooral dan linolzuur, een n-6 vetzuur) ook nadelige effecten heeft. Ze kunnen de ontwikkeling van borstkanker [Sonestedt et al., 2008] en prostaatkanker [Berquin et al., 2007] bevorderen en maken het bloed viskeuzer [A. Simopoulos, 1999]. De consumptie van linolzuur blijkt ook gecorreleerd met het aantal moorden in een land [Hibbeln et al., 2004]. Deze n-6 vetzuren zouden over het algemeen een eerder pro-inflammatoire werking hebben, in tegenstelling tot n-3 vetzuren, die eerder anti-inflammatoir zouden zijn [Gonz´alez-P´eriz en Cl`aria, 2010]. Een goede onderlinge verhouding van deze 2 essenti¨ele vetzuren (n-6/n-3) is noodzakelijk voor een optimale gezondheid, deze verhouding moet ongeveer 4/1 zijn [A. Simopoulos, 2002]. Door de opkomst van de plantaardige oli¨en is deze ratio in Westerse voeding gestegen van 5.4/1 in 1909 tot 9.6/1 in 2009 [Blasbalg et al., 2011]. Sommige auteurs leggen deze laatste waarde nog hoger tot 16/1 [A. Simopoulos, 2008]. Deze ongunstige ratio n-6/n-3 zou een rol kunnen spelen in de ontwikkeling van welvaartsziekten zoals obesitas. Zo neemt de vetmassa van muizen toe over 4 generaties door het toedienen van een dieet met een ratio n-6/n-3 vetzuren van 28/1 [Massiera et al., 2010]. Hoewel de voedselopname niet steeg, nam de vetmassa toch toe. Een gelijkaardig resultaat werd bekomen in een andere studie waarbij de adipogenese in muizen significant steeg door het linoleenzuur (n-3) in het dieet te vervangen door linolzuur (n-6) waardoor de verhouding n-6/n-3 groter werd [Hanbauer et al., 2009]. Ook zijn muizenjongen na 1 week 40% zwaarder als ze zogen bij muizenmoeders die voeder krijgen met een n-6/n-3 ratio van 59/1 ten opzichte van een dieet met n-6/n-3 ratio van 2/1 [Ailhaud et al., 2007]. De gestegen consumptie van plantaardige oli¨en kan dus een rol spelen in de stijging van de obesitas prevalentie in de Westerse wereld.
1.4.3
Geconjugeerde en trans-vetzuren
Het voorkomen van een dubbele binding in de trans-configuratie in onverzadigde vetzuren blijkt sterk gerelateerd te zijn aan negatieve gezondheidseffecten zoals een daling van de verhouding HDL-C/LDL-C [Ascherio en Willett, 1997; Idris en Sundram, 2002; Mensink et al., 1994], een stijging van het risico op hart- en vaatziekten [Clifton et al., 2004; Stender en Dyerberg, 2000], abnormale functie van het endotheel [Lopez-Garcia et al., 2005] en depressie [S´anchez-Villegas et al., 2011]. Sommige transvetzuren zouden ook bijdragen aan de ontwikkeling van obesitas, insulineresistentie en type 2 diabetes, en kunnen dus de ontwikkeling van metabool syndroom promoten [Kochan et al., 2010]. Het is vooral ela¨ıdinezuur (trans-9 9
INLEIDING: Vetten in de voeding
1.5
18:1) dat deze negatieve effecten veroorzaakt. Niet alle transvetzuren hebben echter een negatief effect. In vlees en melk van herkauwers (koe, schaap, geit...) zijn ook transvetzuren aanwezig. Dit komt omdat de rumenbacteri¨en onverzadigde vetzuren in het voeder omzetten tot andere vetzuren via isomerisatie en hydrogenatie van de dubbele bindingen. De belangrijkste van deze geproduceerde vetzuren zijn geconjugeerd linolzuur (CLA: 18:2), vacceenzuur (VA: trans-11 18:1) en stearinezuur (SA: 18:0). Het CLA is een mengsel van geconjugeerde 18:2 vetzuren die al dan niet een trans-dubbele binding bevatten, het meest voorkomende vetzuur in deze groep is rumenzuur (RA: cis-9, trans-11 18:2), ook wel bovinezuur genoemd. Het voeder dat de dieren krijgen heeft een grote invloed op de concentratie van dit CLA in weefsels en melk. Vlees en melk van dieren gevoederd met gras bevatten een hogere CLA concentratie dan vlees en melk van dieren die graan als voeder kregen, (bijlage B.1). De belangstelling voor deze transvetzuren (VA en CLA) is de laatste 15 jaar sterk toegenomen omdat ze een gunstig effect zouden hebben op de gezondheid [Tardy et al., 2011]. Onder meer zouden deze vetzuren de ontwikkeling van kanker kunnen tegengaan [Bauman en Lock, 2006] en kunnen ze de vetmassa in het lichaam doen dalen. Al is dit laatste effect in muizen veel duidelijker dan in mensen [Steck et al., 2007; Terpstra, 2004]. Dit zijn de meest onderzochte effecten, er worden echter nog andere positieve effecten aan deze geconjugeerde transvetzuren toegeschreven [Pariza, 2004]. Er is interesse om deze geconjugeerde linolzuren als supplementen aan te bieden aan de consument. Een dagelijkse supplementatie van 6.4 g/dag CLA (50% cis-9, trans-11 en 50% trans-10, cis12 18:2 isomeren) zorgde echter wel voor milde ongewenste gastrointestinale symptomen in alle behandelde groepen. Tevens bleken de merkers voor ontstekingsreacties (serum alkaline phosphatase, C-reactive protein, IL-6 en witte bloedcellen) gestegen te zijn [Steck et al., 2007]. De veiligheid van dergelijke supplementen moet dus nog verder onderzocht worden. Een andere weg om de RA concentratie in het lichaam te verhogen zou kunnen zijn door de natuurlijke biohydrogenatieprocessen in het colon te onderzoeken en na te gaan welke factoren deze processen be¨ınvloeden om met die kennis de processen in vivo bij te sturen. Het CLA dat in het colon wordt gevormd door de colonmicrobiota kan geabsorbeerd worden en zou kunnen bijdragen aan de systemische RA concentratie (nog niet aangetoond). Zelfs indien dit niet het geval is kan het RA toch voordelen bieden voor de gastheer door antiontstekings eigenschappen via endoplasmatische en nucleaire mechanismen [Bassaganya-Riera en Hontecillas, 2006; Bassaganya-Riera et al., 2002]. Hierdoor is CLA mogelijks nuttig bij het behandelen van ulceratieve colitis en de ziekte van Crohn. Er zijn ook aanwijzingen dat CLA anticarcinogene eigenschappen heeft in het colon van ratten [Nichenametla et al., 2004] en mensen [Beppu et al., 2006; Kemp et al., 2003; Lampen et al., 2005]. Het CLA bestaat echter uit meerdere isomeren welke verschillende biologische effecten hebben. Het cis-9, trans-11 18:2 isomeer heeft een positieve invloed terwijl het trans-10, cis-12 18:2 isomeren eerder nadelige effecten heeft [Bauman et al., 2005; Pariza, 2004].
10
INLEIDING: Vertering van vetten
1.5 1.5.1
1.5
Vertering van vetten Het spijsverteringskanaal
Een algemeen overzicht van het spijsverteringsstelsel wordt gegeven in figuur 1.7. Voedsel wordt opgenomen, fijngemalen en vermengd met speeksel in de mond, en wordt daarna naar de maag getransporteerd via de slokdarm. Het is door de inwerking van verteringssappen (maagzuur, pepsine ...) en de knedingsactie in de maag dat de voedselbolus wordt omgezet tot chyme (voedselbrei), een proces dat tussen 40 minuten en een paar uur duurt. Deze chyme verlaat vervolgens de maag en komt in het duodenum (twaalfvingerige darm) terecht waar er pancreassap en gal wordt toegevoegd. Hierna volgen het jejunum (nuchtere darm) en het ileum (kronkeldarm). In dit deel van het spijsverteringsstelsel vindt het gros van de absorptie plaats (suikers, eiwitten, vetten) [Wilson, 1962]. Na de dunne darm komt de chyme in het colon (dikke darm) terecht die kan opgedeeld worden in 4 delen: het colon ascendens, colon transversum, colon descendens en het colon sigmoideum. Hierin treedt de resorptie van water en mineralen op om vast fecaal materiaal te vormen en komen de fermentatieprocessen voor. Daarna wordt het fecaal materiaal tijdelijk in het rectum (endeldarm) gestockeerd waarna het wordt ge¨excreteerd via de anus. Figuur 1.7: Een
overzicht spijsverteringsstelsel Graaff, 2001].
van het [Van De
De verblijftijden in de verschillende delen van het spijsverteringskanaal worden weergegeven in tabel 1.5. Mannen hebben een significant kortere colonverblijftijd (24u) dan vrouwen (55u) [Degen en Phillips, 1996; Meier et al., 1995]. Daarnaast zijn er nog vele andere factoren die de colonische verblijftijd be¨ınvloeden, zoals hormonale status (tijdstip in de menstruele cyclus bij de vrouw), rookgewoonten... [Meier et al., 1995]. De dagelijkse hoeveelheid stoelgang in de Westerse wereld bedraagt ongeveer 106 g [Cummings et al., 1992], maar wordt gekenmerkt door een grote interindividuele variabiliteit [Eastwood et al., 1984] omdat deze sterk afhankelijk is van de hoeveelheid vezels in het dieet [Kelsay et al., 1978; Spiller et al., 1986].
11
INLEIDING: Vertering van vetten
1.5
Tabel 1.5: Verblijftijden in de verschillende delen van de darm op basis van gegevens die beschikbaar waren a [Degen en Phillips, 1996], b [Metcalf et al., 1987], c [Zaslavsky et al., 1998], d [Arhan et al., 1981], e [Cummings en Wiggins, 1976] en f [Alvisi et al., 1982]. Deel van het spijsverteringskanaal 50% lediging van de maag 10% lediging van de dunne darm Verblijftijd in het colon Rechter colon Linker colon Rectosigmoid deel
1.5.2
Verblijftijd (uur) 2.5 - 3.3 a 3a 20 - 80 a,b,c,e,f 5-14 b,c,d 7-15 b,c,d 11-16 b,c,d
Vertering en opname van vet
Vooraleer de vetten kunnen worden geabsorbeerd moeten ze worden gehydrolyseerd. Het hydrolyseproces splitst een triglyceride opnieuw in zijn afzonderlijke componenten (glycerol en vetzuren), (figuur 1.8). De hydrolyse kan zowel enzymatisch als chemisch doorgaan. De enzymatische hydrolyse gebeurt door lipasen, dit zijn enzymen met lipolytische werking. Lipasen zijn goed wateroplosbaar en lossen niet op in een hydrofobe fase, maar hun substraat bevindt zich wel in de hydrofobe fase zodanig dat het enzym zich moet positioneren op het interfase oppervlak. De snelheid waarmee hydrolyse van triglyceriden doorgaat in aanwezigheid van lipasen zal bijgevolg deels bepaald worden door de grootte van dit interfase-oppervlak. Vele van deze lipasen zijn regiospecifiek (kunnen een onderscheid maken tussen hydroxylgroepen op verschillende plaatsen in een molecule). Deze eigenschap zorgt ervoor dat veel lipasen hydrolyse uitvoeren op de 1,3-plaats ´ of op de 2-plaats in glycerol (figuur 1.3). 1
OH
2
O
R1 + H
H
1
OH
2
OH + HO
3
OH
R1
O 3
O OH
O
Figuur 1.8: De hydrolyse van een 2-monoglyceride in aanwezigheid van water tot vrij glycerol en het vrije vetzuur.
In het spijsverteringskanaal zijn er drie belangrijke endogene lipasen aanwezig: het linguaal(tong), gastric- (maag) en pancreaslipase (dunne darm). Daarnaast kunnen er ook nog lipasen aanwezig zijn afkomstig uit het voedsel. In de mond en de maag worden zure lipasen geproduceerd (tong- en maaglipase), deze hebben geen nood aan galzouten en werken optimaal onder zure omstandigheden (pHopt = 3-6) [Tiruppathi en Balasubramania, 1982]. Bij zuigelingen zijn de zure lipasen (linguaal en gastric) de belangrijkste enzymen om vetten te verteren daar hun pancreas nog niet volledig ontwikkeld
12
INLEIDING: Vertering van vetten
1.5
is [Hernell et al., 1989]. Vetten in moedermelk komen namelijk voor 98% voor in de vorm van triglyceriden [Schmeits et al., 1999], en triglyceriden kunnen als dusdanig niet worden geabsorbeerd doorheen de darmwand. In de dunne darm wordt pancreassap (pancreaslipase) en gal (galzouten) gesecreteerd door de pancreas en galblaas. Galzouten zijn ge¨ıoniseerde galzuren die geneutraliseerd worden door een kation, doorgaans Na+ . Ze emulgeren het aanwezige vet tot een emulsie waardoor het oppervlak van de vetdruppeltjes sterk vergroot wordt, hierdoor zal de lipolysesnelheid sterk verhoogd worden. Naarmate er meer triglyceriden gehydrolyseerd zijn tot glycerol en vetzuren gaat het pancreaslipase minder goed aanhechten aan de vetdruppeltjes in de emulsie en tenslotte desorberen om over te gaan naar andere micellen waar nog veel triglyceriden aanwezig zijn, zo zullen nooit alle triglyceriden gehydrolyseerd worden. Als de triglyceriden in de micellen gehydrolyseerd zijn, kunnen de micellen na contact met de brush border van de dunne darm opgenomen worden. Dit hele absorptieproces is zeer effici¨ent: 96 tot 99% van het vet dat de dunne darm binnenkomt wordt geabsorbeerd [Hill, 1995]. Galzouten worden in de dunne darm niet mee geabsorbeerd met de micellen waardoor de concentratie in het darmlumen hoog blijft. In het ileum worden ze uiteindelijk wel zeer effici¨ent geabsorbeerd via actief transport. Er is 2 tot 5 g galzuur aanwezig in het lichaam, en dit is meer dan voldoende om de 100 tot 150 g vet/dag in het voedsel te emulgeren. Per maaltijd zouden de galzouten twee tot driemaal gerecirculeerd worden (afhankelijk van de hoeveelheid vet in het voedsel), waarbij 96 tot 99% van de galzouten gereabsorbeerd worden in elke enterohepatische cyclus (EHC) [Hill, 1995]. De hoeveelheid galzouten die terecht komen in het colon bedraagt 0.12 tot 2.0 g galzout per dag. De snelheid waarmee triglyderiden gehydrolyseerd worden door lipasen hangt ook af van de samenstelling en de positie van de vetzuren in het triglyceride [Ikeda et al., 1991; Jandacek et al., 1987; Lien et al., 1997]. Het blijkt dat LCFA op de 1- of 3-plaats in het triglyceride zorgen voor minder goede hydrolyse en absorptie [Bach en Babayan, 1982; Bracco, 1994]. Mensen waarbij dit systeem (galzouten en lipasen) onvoldoende werkt zijn bijgevolg gebaat met het vervangen van LCFA in het dieet door MCFA omdat deze beter gehydrolyseerd en geabsorbeerd worden in de dunne darm [Greenberger et al., 1966].
1.5.3
Doorstroom van vet naar het colon
Dagelijks komt er 6 tot 8 g vet in het colon terecht [Hill, 1995; Vonk et al., 1997], en zou er 2 tot 4 g vet ge¨excreteerd worden via de feces. Dit vet in de feces komt voor onder de vorm van vrije vetzuren en bacteri¨ele vetten, waarbij meer dan 5 g vet per dag in de feces de diagnose is voor steatorrhoea (vetmalabsorptie) [Hill, 1995]. Indien er toch nog min of meer vetrijke chyme doorheen het ileum zou stromen dan treedt er een ileal brake in actie [Van Citters en Lin, 1999]. Dit is een mechanisme dat de verblijftijd van de chyme in het jejunum sterk verhoogd door de motiliteit van het jejunum te doen dalen [Spiller et al., 1984]. Hierdoor is het minder waarschijnlijk dat vetrijke chyme in het colon terecht komt. Toch zijn er een aantal omstandigheden waarbij er meer vet in het colon terecht komt. Dit
13
INLEIDING: De microbiota van de dikke darm
1.6
is bijvoorbeeld het geval bij pati¨enten met een abnormaal korte dunne darm. Een studie bij dergelijke pati¨enten toont aan dat in het colon toch mogelijkheid is voor vetabsorptie [Nordgaard et al., 1996]. De FDA en EMA-goedgekeurde anti-obesiteit medicatie Orlistat ook wel bekend als Xenical (Roche) of Alli (GlaxoSmithKline) inhibeert het maag- en pancreaslipase waardoor de hydrolysestap ge¨ınhibeerd wordt en het vet niet geabsorbeerd kan worden in de dunne darm zodat het in het colon terechtkomt [Heck et al., 2000]. In pati¨enten met coeliakie komt er ook dikwijls vet malabsorptie en steatorrhoea voor na inname van gluten [Pyle et al., 2005]. Mucoviscidose geeft ook aanleiding tot verminderde absorptie van vetten in de dunne darm.
1.6
De microbiota van de dikke darm
Van het volledige intestinale kanaal is in normale omstandigheden enkel het caecum, het colon en het rectum sterk gekoloniseerd door micro-organismen. De kolonisatiegraad varieert van 101 CFU/mL in de maag tot 107 CFU/mL in het ileum. In het colon is de kolonisatie dan veel sterker uitgesproken met een bacteri¨ele concentratie van 1010 tot 1014 CFU/mL. In vergelijking met de andere delen van het spijsverteringskanaal is de verblijftijd in het colon veel groter (tabel 1.5). Een overzicht van de karakteristieken in de verschillende regio’s van het menselijke colon wordt weergegeven in figuur 1.9.
Figuur 1.9: De verschillende regio’s in het menselijke colon en de corresponderende activiteiten en fysiologische parameters [Cummings en Macfarlane, 1991].
14
Archaea
Bacteria
Domein
Methanobacteriales
Fusobacteriales
Bacteroidales
Actinomycineae
Methanobacteriaceae
Fusobacteriaceae
Methanosphaera
Methanobrevibacter
Fusobacterium
Prevotella
Bacteroides
Bacteroidaceae Prevotellaceae
Helicobacter
Desulfovibrio
Enterobacter
Citrobacter
Escherichia
Actinomyces
Propionibacterium
Helicobacteraceae
Desulfovibrionaceae
Enterobacteriaceae
Actinomycetaceae
Propionibacteriaceae
Figuur 1.10: Een overzicht van de meest voorkomende darmbacteri¨en en hun situering in de taxonomie [The Taxonomicon ].
Methanobacteria
Fusobacteria
Euryarchaeota
Enterobacteriales
Actinomycetales
Bifidobacterium
Staphylococcus
Enterococcus
Streptococcus
Streptococcaceae Enterococcaceae
Lactobacillus
Acetobacterium Lactobacillaceae
Bifidobacteriaceae
Campylobacterales
Fusobacteria
Roseburia
Lachnospiraceae
Bifidobacteriales
Epsilonproteobacteria
Bacteroidia
Veillonella
Veillonellaceae
Eubacterium
Peptococcus
Peptococcaceae
Eubacteriaceae
Ruminococcus
Peptostreptococcus
Clostridium
Genus
Ruminococcaceae
Clostridiaceae
Familie
Staphylococcaceae
Propionibacterineae
Suborde
Bacillales
Lactobacillales
Clostridiales
Orde
Desulfovibrionales
Actinobacteridae
Subklasse
Deltaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Actinobacteria
Bacilli
Clostridia
Klasse
Bacteroidetes
Proteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
Phylum
INLEIDING: De microbiota van de dikke darm
1.6
Een overzicht van de meest voorkomende colonbacteri¨en en hun situering in de taxonomie wordt weergegeven in figuur 1.10. De phyla Firmicutes en Bacteroidetes zijn het meest prominent aanwezig (samen meer dan 90% van alle leden) en daarnaast komen er nog 8 andere phyla voor in het colon [Eckburg et al., 2005]. Deze darmmicrobiota (het darmmicrobioom) kunnen beschouwd worden als het microbi¨ele orgaan in de mens vanwege hun enorm metabolische potentieel. Er wordt geschat dat het collectieve genoom van alle darmbacteri¨en (het microbioom) meer dan 100 keer meer genen bevat dan het menselijke genoom [Xu et al., 2007]. Deze darmbacteri¨en zullen ervoor zorgen dat nog een deel van de energie in onverteerbare voedingsvezels toch benut kan worden, ze zullen ook instaan voor stimulatie van het immuunsysteem, verhinderen de kolonisatie door pathogenen en produceren enkele vitamines [Backhed et al., 2005; Conly en Stein, 1992; Dethlefsen et al., 2006; Hopkins en Macfarlane, 2003; Neish, 2009; Round en Mazmanian, 2009; Salminen et al., 1998].
Deze bacteri¨en groeien op de niet-geabsorbeerde voedselresten die het colon binnenkomen. Het gaat vooral om onverteerbare koolhydraten (cellulose, pectine, xylaan...), ook wel voedingsvezel genoemd, en onverteerde eiwitten. Deze polymeren worden door de micro-organismen gehydrolyseerd tot monomeren die gedeeltelijk geabsorbeerd kunnen worden door de colonocyten. De rest wordt gefermenteerd door de colonmicrobiota. Fermentatie is het proces waarbij een substraat geoxideerd wordt door gebruik te maken van een endogene elektroneneacceptor in plaats van een exogene elektronenacceptor zoals O2 . Koolhydraten zullen in het colon vooral worden gefermenteerd tot SCFA, en bij de fermentatie van nucle¨ınezuren, ureum en vooral eiwitten in het colon komt naast SCFA ook ammoniak vrij. Tijdens deze fermentatieprocessen worden er ook nog gassen zoals CO2 en H2 vrijgesteld. Deze gassen kunnen in sommige gevallen nog verder worden verbruikt door de colonmicrobiota voor de productie van H2 S (sulfaatreductie), CH4 (methanogenese) of acetaat (home-acetogenese).
1.6.1
Korteketen vetzuren
Deze fermentatieproducten (acetaat, propionaat en butyraat) komen vooral vrij bij de fermentatie van koolhydraten in het colon. De verhouding acetaat:propionaat:butyraat ligt normaal tussen 75:15:10 en 40:40:20 [Bergman, 1990]. Er wordt geschat dat 10% van de calorische behoefte wordt voldaan door deze korteketen vetzuren. Een groot deel van deze SCFA wordt gebruikt door de colonocyten, de rest wordt opgenomen in het bloed en komt zo in de lever terecht. In de lever kan het acetaat gebruikt worden als substraat voor de lipogenese pathway en het propionaat kan hier worden omgezet tot glucose [Bergman, 1990]. Butyraat wordt vooral in de colonocyten omgezet tot ketonlichamen (aceton, acetoacetaat, β-hydroxybutyraat...) en CO2 .
1.6.2
Ammoniak
De fermentatie van eiwitten, ureum en nucle¨ınezuren leidt tot de vorming van ammoniak, vertakte SCFA, fenolen, indolen en amines, een aantal van deze componenten zouden een rol kunnen spelen in de ontwikkeling van colonkanker [Hughes et al., 2000].
16
INLEIDING: De microbiota van de dikke darm
1.6
Er wordt aangenomen dat ammoniak de levensduur van de colonocyten verkort, de groei van mucosa in het colon versnelt en de DNA-synthese wijzigt. Tevens zou ammoniak de ontwikkeling van colonkanker kunnen promoten [Ichikawa en Sakata, 1998].
1.6.3
Waterstofsulfide en methaan
De aanwezigheid van H2 in het colon is ongewenst omdat dit de fermentatieprocessen kan tegenwerken. Sommige colonmicrobiota kunnen dit waterstofgas verwijderen via methanogenese (figuur 1.11). De organismen die deze reactie uitvoeren behoren tot de archaea, meer bepaald betreft het hier vooral Methanobrevibacter smithii en Methanosphaera stadtmanae (figuur 1.10). In de Westerse wereld zou tussen 30 en 50% van de bevolking een methanogene colonmicrobiota bezitten (concentratie methanogenen >107 CFU/g drooggewicht). Bij de 50 tot 70% van de niet-methanogene populatie kunnen er grote hoeveelheden (>108 CFU/g drooggewicht) sulfaatreducerende bacteri¨en voorkomen [Gibson et al., 1993]. Deze organismen reduceren SO4– -ionen met H2 tot H2 S. Het sulfaat kan afkomstig zijn uit de voeding, maar kan ook afkomstig zijn van het mucus dat gesecreteerd wordt door de darmwand, want dit bevat ook zeer veel sulfaat. De organismen die betrokken zijn bij de sulfaatreductie (figuur 1.11) behoren vooral tot de Deltaproteobacteria en de Gram-positieve sulfaat reducerende bacteria (SRB) binnen de klasse van de Clostridia (Desulfomaculum, Desulfosporosinus en Desulfosporomusa) [Nakamura et al., 2010]. In een sulfaatrijke omgeving lijken de SRB een voordeel te hebben ten opzichte van de methanogenen, wat ook af te leiden is uit de Ks-waarden voor H2 . Er wordt meestal aangenomen dat H2 S toxisch is voor de colonocyten [Fite et al., 2004; Levine et al., 1998], maar dit wordt weerlegd door andere studies [Wallace et al., 2009]. Een laatste manier om waterstofgas in het colon te verwijderen is acetogenese, maar dit treedt slechts in beperkte mate op, en is tevens energetisch minder gunstig voor de micro-organismen (figuur 1.11). De organismen betrokken bij deze acetogenese zouden vooral behoren tot de genera Acetobacterium en Clostridium [Nakamura et al., 2010]. SO2− + 4H2 + 2H+ 4 CO2 + 4H2 2CO2 + 4H2
H2 S + 4H2 O CH4 + 2H2 O CH3 COOH + 2H2 O
0
(∆G0 = -152 kJ/mol; Ks = 1 µmol/L) 0 (∆G0 = -131 kJ/mol; Ks = 6 µmol/L) 0 (∆G0 = -95 kJ/mol)
Figuur 1.11: Sulfaatreductie (boven), methanogenese (midden) en acetogenese (onder) met Ks -waarden (H2 ) voor Desulfovibrio vulgaris en Methanobrevibacter smithii respectievelijk [Gibson et al., 1993; Kristjansson et al., 1982; Thauer et al., 1977].
De pH heeft een belangrijk effect op de microbi¨ele gemeenschap, en dus ook het fermentatiepatroon. Een meer neutrale pH is optimaal voor de groei van deze methanogenen. Een licht alkalische pH zou eerder optimaal zijn voor de sulfaatreducerende bacteri¨en en een zure pH is optimaal voor acetaatproductie [Gibson et al., 1990]
17
INLEIDING: De microbiota van de dikke darm
1.6.4
1.7
Interactie tussen darmmicrobiota en de gastheer
Er zijn verschillende manieren waarop de colonmicrobiota de gezondheid van de gastheer kan be¨ınvloeden. Deze kunnen worden opgesplitst in rechtstreekse en onrechtstreekse interacties met de gastheer. Onrechtstreeks Het kan hier gaan over gewone fermentatieproducten zoals SCFA, ammoniak ... Zo blijkt de microbi¨ele gemeenschap in het colon van mensen en dieren met overgewicht en obesitas beter in staat te zijn om energie vrij te stellen uit de onverteerbare resten van het voedsel in het colon dan de colonmicrobiota van normale individuen. Deze eigenschap blijkt zelfs overdraagbaar door de colonmicrobiota te transplanteren van obese dieren naar axenische dieren [Tsai en Coyle, 2009]. Het kan echter ook gaan om metabolieten gevormd uit xenobiotica, stoffen die normaal niet voorkomen in, of aangemaakt worden door het organisme, maar die door de colonmicrobiota geactiveerd kunnen worden tot bio-actieve moleculen. Na opname zullen deze stoffen een effect hebben op de gezondheid van de gastheer. Een voorbeeld hiervan is de activatie van isoxanthohumol tot biologisch actief 8-prenylnaringenine [Possemiers et al., 2005]. Dat de darm microbiota een uitgesproken effect heeft op de aanwezigheid van metabolieten in het bloed wordt duidelijk aangetoond in een studie die via MS-technieken de samenstelling van het bloed van kiemvrije muizen vergelijkt met dat van conventionele muizen. Hieruit blijkt het grootste deel van de stoffen die aanwezig zijn bij conventionele muizen niet aanwezig te zijn bij axenische muizen [Wikoff et al., 2009]. Er is ook een wisselwerking tussen de darmmicrobiota en de mentale gezondheid van de gastheer [Oleskin, 2009]. Onder andere bij autisme, schizofrenie, concentratiestoornissen... zou de darmmicrobiota een rol kunnen spelen, onder andere via de productie van bacteri¨ele metabolieten [Heijtz et al., 2011; Sandler et al., 2000; Wakefield, 2002]. Rechtstreeks Colonocyten zijn in staat om signaalmoleculen (cytokines, groeifactoren, hormonen...) te produceren die een autocrine, paracrine of endocrine functie hebben. Meer en meer blijkt dat de colonmicrobiota in staat zijn om de productie van deze signaalmoleculen te be¨ınvloeden. Zo blijkt de productie van FIAF (Fasting Induced Adipose Factor) gedeeltelijk onder de controle te staan van de colonmicrobiota [Cani et al., 2008]. De FIAF productie vindt normaal plaats in de lever, de spieren en de darmwand. FIAF-moleculen onderdrukken de werking van LPL (Lipoproteine Lipase) in het bloed. Dit LPL hydrolyseert triglyceriden in het bloed tot vrije vetzuren en monoglyceriden die vervolgens kunnen worden geabsorbeerd in vetweefsel waar ze worden opgeslagen als triglyceriden. Het onderdrukken van FIAF-productie in de darmwand door colonmicrobiota leidt dus tot minder FIAF in het bloed waardoor minder LPL ge¨ınhibeerd wordt zodat meer triglyceriden in het bloed gehydrolyseerd worden en dus gestockeerd worden in adiposeweefsel [Reinhardt et al., 2009].
18
INLEIDING: Vet in het colon
1.7 1.7.1
1.7
Vet in het colon Oorsprong van vet in het colon
De belangrijkste bron van vetten in het colon is de voeding, en de samenstelling van de vetten in de voeding zal bijgevolg de samenstelling van de vetten in het colon sterk be¨ınvloeden. Er komen vooral LCFA en VLCFA in het colon terecht (± 6-8 g per dag) omdat deze minder goed gehydrolyseerd worden door de lipasen [Apgar et al., 1987; Chen et al., 1989; Chen et al., 1994]. Er werd eerder al aangehaald dat niet alle triglyceriden even goed gehydrolyseerd worden. Zo blijkt het dat visolie, rijk aan zeer lange meervoudig onverzadigde vetzuren (EPA en DHA), slecht gehydrolyseerd wordt door de lipases [Chen et al., 1994]. Dit heeft tot gevolg dat ze ook minder goed geabsorbeerd worden in de dunne darm zodat een grotere fractie ervan in het colon terechtkomt. Hiernaast kan er ook nog endogeen vet in het colon terecht komen, dit is vooral afkomstig uit gal en uit de gedesquameerde epitheelcellen. De aanwezigheid van bacteri¨en in het colon van ratten zorgt ervoor dat de excretie van vetten via de feces 30% hoger is dan bij axenische ratten [Demarne et al., 1979]. Een groot deel van de vetten die ge¨excreteerd worden zijn van bacteri¨ele afkomst [Chen et al., 1998]. Bacteri¨en slaan doorgaans geen vetten op, zodat deze bacteri¨ele vetten afkomstig zijn uit de bacteri¨ele membranen (fosfolipiden) en celwanden (lipopolysacchariden). Bacteri¨ele vetten bevatten doorgaans een relatief grote proportie aan trans-vetzuren, wat het gevolg is van het bacterieel metabolisme van de vetzuren.
1.7.2
Metabolisme van vet
Het vet dat in het colon terecht komt zal vooral aanwezig zijn als vrije vetzuren en monoglyceriden omdat de lipasen in de spijsvertering (linguaal, gastric en pacreas lipase) reeds hebben kunnen inwerken. De vetzuren kunnen door de micro-organismen niet worden gebruikt voor vrijstelling van energie, dit kan enkel door deze ketens te oxideren in aanwezigheid van zuurstof als terminale elektroneneacceptor. Hydrolyse Het vet dat in het colon terecht komt onder de vorm van glyceriden of fosfolipiden zal snel worden gehydrolyseerd tot glycerol en vrije vetzuren door de aanwezige microbiota. Vele bacteri¨en produceren namelijk lipasen (Bacteroides, Fusarobacterium, Eubacterium, Propionibacterium en Clostridia), fosfolipasen of sfingomyelinasen [Hill, 1995; Jaeger et al., 1994; Juste, 2005]. De hoeveelheid vrijgekomen glycerol zal worden gemetaboliseerd door darmmicrobiota [De Weirdt et al., 2010]. Biohydrogenatie Onverzadigde vetzuren kunnen worden omgezet tot andere vetzuren, dit gebeurt tijdens het biohydrogenatieproces [Devillard et al., 2007; Devillard et al., 2009; Howard en Henderson, 1999; McIntosh et al., 2009]. Het best bestudeerde biohydrogenatieproces is dat van linolzuur (n-6 18:2). Dit proces kan worden opgesplitst in een isomerisatie- en een hydrogenatiestap. De eerste stap in dit proces voor linolzuur is een isomerisatie tot CLA (hoofdzakelijk RA). Daarna 19
INLEIDING: Vet in het colon
1.7
Figuur 1.12: Belangrijkste pathways van LA-biohydrogenatie door darmbacteri¨en. Open pijlen: Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium en sommige Clostridium species. Volle pijlen: Clostridium cluster XIVa en de gestippelde pijlen: ongekende organismen [Devillard et al., 2007].
volgt een hydrogenatie van RA tot VA, en dit VA wordt dan nogmaals gehydrogeneerd tot het eindproduct van het biohydrogenatieproces, stearinezuur (18:0) (figuur 1.12). Lactaat inhibeert de hydrogenatie van CLA, maar niet de hydrogenatie van VA door Clostridium proteoclasticum, zodat wordt aangenomen dat de twee hydrogenatiestappen uitgevoerd worden door verschillende enzymen [Maia et al., 2007b]. In het rumen van herkauwers is de microbi¨ele gemeenschap uitvoerig bestudeerd, de meeste bacteri¨en die betrokken zijn in het biohydrogenatieproces in het rumen zijn butyraatproducenten (zoals Butyrivibrio). Hierdoor werd de hypothese naar voor geschoven dat er een metabolisch verband zou zijn tussen butyraat metabolisme en vetzuur biohydrogenatie [Maia et al., 2007b]. De reden dat bacteri¨en deze biohydrogenatie uitvoeren komt mogelijks doordat meer verzadigde vetzuren minder toxisch zijn voor hen [Jenkins et al., 2008; Maia et al., 2007b]. Het zijn namelijk vooral bacteri¨ en die gevoelig zijn voor de toxische effecten van PUFA’s welke betrokken zijn in het biohydrogenatieproces [Maia et al., 2007b].
20
INLEIDING: Vet in het colon
1.7.3
1.7
Invloed van vet op de colonmicrobiota
Het is bekend dat bepaalde verzadigde en onverzadigde vetzuren een antimicrobi¨ele werking bezitten [Desbois en Smith, 2010]. Zo kunnen laurinezuur, myristinezuur en palmitinezuur een aantal enteropathogenen (E. coli O157, Yersinia enterocolitica en Salmonella species) inhiberen [Altieri et al., 2009]. Onverzadigde vetzuren hebben over het algemeen een sterker antimicrobieel effect dan de verzadigde vrije vetzuren [Desbois en Smith, 2010], ook naarmate dat de vetzuren langer zijn zou de toxiciteit stijgen [Nieman, 1954]. Deze regels zijn echter niet algemeen geldig. De gevoeligheid van verschillende bacteri¨ele species voor linolzuur werd getest door de lagfase te meten in aanwezigheid van linolzuur ten opzichte van de controle. Hieruit bleek dat een aantal darmbacteri¨en een lagfase vertoonden van 12-72 uur in aanwezigheid van linolzuur [Devillard et al., 2007]. In sommige omstandigheden blijkt de aanwezigheid van (lage) concentraties vetzuren de groei van bacteri¨en (zoals Lactobacilli en Bifidobacteria) zelfs te bevorderen [Nieman, 1954]. Dit betekent dat de vetzuren die in het colon terechtkomen daar een bepaald effect zullen hebben op deze gemengde microbi¨ele gemeenschap. De samenstelling van de vetzuren in het bacteri¨ele membraan is onder andere afhankelijk van de vetzuren die aanwezig zijn in het milieu waarin ze groeien [Bauchart et al., 1990]. Een verandering in membraansamenstelling kan zowel structurele als functionele veranderingen teweeg brengen, en deze veranderingen zouden de toxiciteit van vetzuren verklaren. Vooral de permeabiliteit van het membraan en de membraangebonden enzymen (belangrijk in het energiemetabolisme van bacteri¨en) zouden een nadelige invloed ondervinden [De Pablo en De Cienfuegos, 2000]. Langeketen vetzuren verhogen ook de zuurstofopname door Gram positieve bacteri¨en en inhiberen de aminozuuropname bij sub-bactericidale concentraties [Galbraith en Miller, 1973]. Gram-positieve bacteri¨ en zijn over het algemeen gevoeliger voor poly-overzadigde vetzuren dan de gram-negatieve bacteri¨en [Juste, 2005]. Dit zou verklaard kunnen worden doordat Gram-negatieve bacteri¨en een lipopolysaccharide-rijk membraan bezitten dat de bacteri¨en beschermt tegen surfactantia [Sheu en Freese, 1973]. High-fat dieten Muizen op een high-fat dieet hebben lagere aantallen Bacteroidetes en hogere aantallen Firmicutes en Proteobacteria in de feces [Dewulf et al., 2010; Hildebrandt et al., 2009]. Een studie met conventionele muizen en kiemvrije muizen die elk in een high-fat en een low-fat dieet groep werden opgedeeld laat zien dan de conventionele muizen op het high-fat dieet een grotere graad van intestinale ontsteking vertoonden (gemeten aan de hand van TNF-α mRNA en activatie van het NF-κBEGFP reporter gen) dan de kiemvrije muizen op het high-fat dieet. Deze stijging was sterk positief gecorreleerd met dieet ge¨ınduceerde gewichtstoename, plasma glucose en insuline niveaus. Dit toont aan dat er zeer waarschijnlijk interacties plaatsvinden tussen darmbacteri¨en en een high-fat dieet die de intestinale ontstekingsreacties promoten die op hun beurt gewichtstoename en insulineresistentie promoten [Ding et al., 2010]. Intestinale bacteri¨en zijn dus noodzakelijk om de stijging voor deze merkers van de ontstekingsreacties te induceren bij een high-fat dieet. Er werd geobserveerd dat mensen die een vetrijk dieet consumeren een typische colonmicrobiota bezitten rijk aan niet-sporulerende ana¨erobe bacteri¨en [Hill, 1995]. Het is echter wel zo dat meer vet in de voeding leidt tot grotere hoeveelheden vet in het colon, en met dit vet komt er ook meer galzout in het colon terecht dat vervolgens via de feces wordt ge¨excreteerd [Cummings 21
INLEIDING: Vet in het colon
1.7
et al., 1978]. Omdat galzouten een sterk antimicrobieel effect hebben (vooral dan de secundaire
galzouten) is het voorbarig om vetten in het dieet direct aan te wijzen als oorzaak van een gewijzigde colonmicrobiota. Daarenboven heeft het soort vet in het dieet ook een invloed op de concentraties vetzuren en galzuren in de feces [Awad et al., 1989], wat het verband nog ingewikkelder maakt. Obesitas Zowel bij muizen als mensen met overgewicht (obesitas) ligt de ratio Firmicutes/Bacteroidetes hoger dan bij hun normale tegenhangers [DiBaise et al., 2008; Ley, 2010]. Een gelijkaardige wijziging werd waargenomen voor muizen op een high-fat dieet (zie eerder). Meer specifiek vertoont Eubacterium dolichum van de mollicutes klasse binnen de firmicutes een stijging bij dieet-ge¨ınduceerde-obesitas bij muizen (prototypisch Westers dieet met hoge n-6/n-3 ratio) [Turnbaugh et al., 2008]. Effect van PUFA’s Bij een experiment met muizen bleek dat de aantallen fecale Bacteroidaceae lager, en de aantallen fecale Bifidobacteria hoger werden bij een dieet met visolie ten opzichte van een dieet met rundsvet. Daarnaast waren de concentraties oplosbare sacchariden en prote¨ınen in het caecum hoger in de groep die visolie toegediend kreeg [Kuda et al., 2000]. Ook bij muizen met experimentele colitis verhogen PUFA’s in het dieet de fecale Bifidobacteria [Hekmatdoost et al., 2009]. In vissen werd er vastgesteld dat visolie of lijnzaadolie de fecale melkzuurbacteri¨en doen stijgen terwijl dit effect niet waarneembaar was bij kokosolie [Ringø et al., 1998]. Bij mensen zorgt supplementatie van babyvoeding met visolie ervoor dat er verschuivingen optreden in de microbi¨ele gemeenschap [Nielsen et al., 2007]. Toedienen van 18g/dag eicosapentaeenzuurethylester (EPA-EE) aan gezonde proefpersonen voor 7 dagen doet de concentratie H2 in de adem dalen. Dit H2 in de adem is afkomstig van de microbi¨ele fermentatie in het colon. In de studie werd verondersteld dat dit H2 werd gebruikt om de 5 dubbele bindingen in EPA te hydrogeneren [Thompson en Spiller, 1995]. EPA blijkt in vivo een inhiberend effect te hebben op Bacteroides thetaiotaomicron [Thompson en Spiller, 1995]. Naast een antibacterieel effect heeft EPA in het colon ook nog een laxerend effect [Hawthorne et al., 1990], en dit zou natuurlijk ook kunnen bijdragen aan het totaaleffect van EPA op de colonmicrobiota. Aanhechting van micro-organismen aan de darmwand Een ander fenomeen dat optreedt in het colon is de adhesie van micro-organismen aan de mucosa van de darmwand. Hiermee verhinderen bacteri¨en dat ze worden verwijderd door hydrodynamische krachten die worden veroorzaakt door de beweging van de darminhoud in de darmen. Als er vetzuren worden toegediend aan het groeimedium van bacteri¨en zullen de gesupplementeerde vetzuren en de metabolieten hiervan (inleiding 1.7.2) ingebouwd worden in het celmembraan. Dit heeft gevolgen voor de eigenschappen van dit membraan. Hierdoor kan de aanwezigheid van bepaalde vetzuren mogelijks de adhesie van cellen aan de mucosa be¨ınvloeden, dit is onder andere aangetoond voor Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus en Lactobacillus casei Shirota, allen bacteri¨en die gebruikt worden bij de fermentatie van melk [Kankaanpaa et al., 2004].
22
Hoofdstuk 2
Doelstellingen In deze masterproef zal worden getracht om meer inzicht te verwerven in de rol van vetten in het colon. Een eerste deel zal gaan over het metabolisme van onverzadigde vetten in het menselijke colon (id est: wat doen de colonmicrobiota met deze vetten). Er zijn reeds enkele onderzoeken gepubliceerd die aantonen dat er biohydrogenatie van onverzadigde vetzuren optreedt in het menselijke colon. Op LabMET in het verleden al pogingen gedaan om dit proces te laten doorgaan in vitro, maar tot zover zonder succes. In dit eerste onderdeel zal getracht worden om tot een werkend protocol te komen om de biohydrogenatie in vitro te kunnen bestuderen. Aan de hand van dit protocol zal dan de invloed van de waterstofdruk op het biohydrogenatieproces bestudeerd worden. Het tweede deel zal gaan over de invloed die verschillende vetten hebben op de colonmicrobiota (id est: wat doen deze vetten met de colonmicrobiota). In de literatuur zijn er reeds verscheidene studies die aantonen dat de vetconsumptie een invloed heeft op de samenstelling van de colonmicrobiota in vivo en in vitro. Echter is het nog niet volledig duidelijk welke veranderingen er optreden en hoe deze veranderingen tot stand komen. Er zal getracht worden om na te gaan of de aanwezigheid van verschillende vetten een invloed kan hebben op het metabolisme en de samenstelling van de colonmicrobiota in een in vitro model.
23
Hoofdstuk 3
Materiaal en methoden 3.1
Buffers en media
3.1.1
Fosfaatbuffers
Voor incubaties met mengculturen werd er steeds gewerkt in een gebufferde oplossing. Hiervoor werd een 0.1 M fosfaatbuffer gebruikt bij pH = 7 (tabel 3.1). Tabel 3.1: Links: de samenstelling van de fosfaatbuffer. Rechts: de samenstelling van de ana¨erobe fosfaatbuffer.
. Component KH2 PO4 K2 HPO4
3.1.2
Concentratie (g/L) 6.8 8.8
Component KH2 PO4 K2 HPO4 Natriumthioglycolaat
Concentratie (g/L) 6.8 8.8 1.0
SHIME-medium
Dit medium werd gebruikt als voedingsbodem voor de incubaties (tabel 3.2). Alle componenten werden vooraf gemengd tot een droog mengsel, er werd dan telkens 15.9 g/L van dit droog SHIME-medium opgelost in 0.1 M fosfaatbuffer. Het medium werd vervolgens geautoclaveerd (tenzij anders vermeld).
3.1.3
MCB-medium
Dit medium werd gebruikt als voedingsbodem voor de groei van humane colonbacteri¨en [Van der Meulen et al., 2006]. De verschillende componenten (tabel 3.2) werden afgewogen en aangelengd met gedestilleerd water. Daarna werd het medium met een ultra-turrax (IKA-Werke; Staufen, Duitsland) gehomogeniseerd. Het medium werd vervolgens geautoclaveerd.
3.1.4
MRS-medium
Dit medium werd gebruikt om pure culturen in op te kweken. Hiervoor werd 55 g MRS-medium poeder opgelost in gedestilleerd water.
24
MATERIAAL EN METHODEN: Uitvoering experimenten
3.2
Tabel 3.2: Links: de samenstelling van het SHIME-medium [Molly et al., 1993]. Rechts: de samenstelling van het MCB-medium [Van der Meulen et al., 2006].
. Component arabinogalactaan gistextract glucose L-Cyste¨ıne-HCl·H2 O mucine pectine pepton xylaan zetmeel Totaal
3.1.5
Concentratie (g/L) 1.0 3.0 0.4 0.5 4.0 2.0 1.0 1.0 3.0 15.9
Component Bacteriologisch pepton Soya pepton Gist extract Trypton NaCl KCl MgSO4 ·7H2 O CaCl2 ·2H2 O L-Cyste¨ıne-HCl·H2 O NaHCO3 MnCl·4H2 O FeSO4 ·7H2 O ZnSO4 ·7H2 O Hemine Menadion KH2 PO4 K2 HPO4 Tween-80
Hoeveelheid per L 6.50 g 5.00 g 3.00 g 2.50 g 4.50 g 2.00 g 0.50 g 0.45 g 0.40 g 0.20 g 0.20 g 0.005 g 0.005 g 0.005 g 0.005 g 3.40 g 4.40 g 2 mL
Galoplossing
De galoplossing werd bereid door 10 g galpoeder (Oxgall, Fresh dehydrated bile; Becton, Dickinson and Company, Le Pont de Claix, Frankrijk) aan te lengen met gedestilleerd water tot 100 mL (10% w/v oplossing).
3.2 3.2.1
Uitvoering experimenten Fecale slurry
Het aanmaken van de fecale slurry gebeurde op basis van de methode beschreven in de literatuur [Molly et al., 1993]. Er werd 20 g fecaal materiaal aangelengd met 80 mL voorverwarmde (37) ana¨erobe fosfaatbuffer (tabel 3.1) om een 20% w/v fecale slurry te bekomen (200 g/L). Dit mengsel werd gedurende 10 minuten onderworpen aan homogenisatie in een stomacher (Lab-Blender 400; L.E.D. Techno, Hechtel-Eksel, Belgi¨e) waarna het gezeefd werd doorheen een metalen zeef (tenzij anders vermeld in het protocol) (Theezeef; Delhaize, Brussel, Belgi¨e). Hierdoor blijven de fijnste deeltjes aanwezig in de slurry, maar worden de grove deeltjes, die obstructies veroorzaken in pipetten en spuiten, toch verwijderd.
25
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.2.2
3.3
Penicillineflesjes
Er werd steeds gewerkt in amberkleurige penicillineflesjes van 60 mL. Deze flesjes konden luchtdicht worden afgesloten met een butylrubber stop en een metalen deksel. De butylrubber stop liet toe om via een spuit met naald inoculum in te brengen, of een staal te nemen uit het flesje, zonder dat er zuurstof werd in gebracht.
3.2.3
Flushen
Alle incubaties werden in ana¨erobe condities uitgevoerd. Hiervoor werd het zuurstofgas aanwezig in de headspace en de vloeistof in de penicillineflesjes verwijderd met een flushtoestel. Dit flushtoestel doorliep cycli van 2 minuten: 60 seconden onderdrukfase met een vacu¨ umpomp: 0.15 bar 60 seconden overdrukfase met N2 -gas (Stikstof N28; Air Liquide, Luik, Belgi¨e): 1.6 bar
Na 20 a´ 30 cycli werden de flesjes op atmosfeerdruk gebacht door de vacu¨ umpomp af te zetten in de overdrukfase van de cyclus. Bij overgang van de overdrukfase naar de onderdrukfase stroomde de overdruk in de flesjes weg via de vacu¨ umpomp zonder het risico dat er lucht instroomde.
3.3 3.3.1
Protocols van de experimenten Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol
Er werden 3 reeksen getest: een controlereeks, een reeks met linolzuur (Linoleic acid ≥ 99%; Sigma-Aldrich, St. Louis, Verenigde Staten) en een reeks met linolzuur en glycerol (87% Glycerol; Applichem, Darmstadt, Duitsland). Een controlereeks werd stopgezet na 0, 4 en 24 uur. De twee andere reeksen werden telkens stopgezet na 4 en 24 uur incubatie. Elke reeks werd in triplicaat uitgevoerd. Het fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 25 jaar. Oplossingen: Vetzuuroplossing: los 0.2 g linolzuur op per mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) Fecale slurry (volgens deel 3.2.1, maar de fecale slurry werd niet gezeefd)
Protocol: Weeg 0.2 g haverzamelen (Haverzemelen; Ekoland, Harderwijk, Nederland) (tabel 3.3) af in de penicillineflesjes Voeg 0.5 mL vetzuuroplossing toe en verdamp de ethanol onder een N2 -gasstroom (Stikstof N28; Air Liquide, Luik, Belgi¨e) Voeg 9 µL glycerol (87%) toe in de reeks met glycerol
26
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.3
Bereidt de fecale slurry en voeg 20 mL toe in elk flesje Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel Flush de headspace met stikstofgas (Stikstof N28; Air Liquide, Luik, Belgi¨e) en plaats in de incubator (37, 140 rpm) (Certomatr; Sartorius, Vilvoorde, Belgi¨e)
De concentraties in de incubatieoplossingen waren dus 10 g/L haverzemelen, 5 g/L linolzuur, 0.4 g/L glycerol en 200 g/L fecaal materiaal. Tabel 3.3: De samenstelling van de haverzemelen (Haverzemelen; Ekoland, Harderwijk, Nederland). Component Energie Eiwitrijk Koolhydraten Waarvan suikers Vet Voedingsvezel Oplosbaar Onoplosbaar Natrium
3.3.2
Per 100 g 345 kCal 15 g 50 g 2.1 g 9.7 g 15 g 7.1 g 7.9 g 0.05 g
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
Er werden 5 reeksen getest met oplopende concentratie inoculum (2, 5, 10, 15 en 20% w/v fecaal materaal). Elke reeks werd uitgevoerd in aan- ´en afwezigheid van waterslotjes, met twee herhalingen elk. De waterslotjes werden aangebracht om na te gaan of de H2 -druk in de flesjes de fermentatie- en biohydrogenatieprocessen be¨ınvloeden. Het volledige experiment werd uitgevoerd met methanogeen en niet-methanogeen inoculum. Het niet-methanogeen fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 25 jaar. Het methanogeen inoculum was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) vrouwelijke vrijwilliger van 30 jaar. Oplossingen: Vetzuuroplossing: los 0.1 g linolzuur (Linoleic acid ≥ 99%; Sigma-Aldrich, St. Louis, Verenigde Staten) op per mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenaysous-Bois, Frankrijk) SHIME-medium (deel 3.1.2) Fosfaatbuffer (deel 3.1.1) Fecale slurry (deel 3.2.1)
Protocol: Breng 100 µL vetzuuroplossing in de flesjes en verdamp het ethanol onder een N2 -gasstroom Voeg aan alle flesjes 5 mL SHIME-medium toe, behalve bij de hoogste inoculumconcentratie waar 80 mg droog SHIME-medium wordt toegevoegd
27
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.3
Leng aan met 13, 10, 5 , 0 en 0 mL fosfaatbuffer voor de reeksen met 2, 5, 10, 15 en 20% w/v fecaal materiaal Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel Flush de headspace Bereidt de fecale slurry Voeg via een spuit met naald (1.2 mm diameter) 2, 5, 10, 15 en 20 mL fecale slurry toe in de reeksen met 2, 5, 10, 15 en 20% w/v inoculum respectievelijk Flush de headspace Installeer de waterslotjes door ze te doorblazen met N2 waarna de naald onmiddellijk door de butylrubber stop wordt gestoken, het andere uiteinde wordt in een erlenmeyer met water geleid Incubeer gedurende 24 uur (37, 140 rpm)
De flesjes bevatten allen 4 g/L SHIME-medium en 0.5 g/L linolzuur in een 0.1 M fosfaatbuffer. De inoculumconcentraties waren 20, 50, 100, 150 en 200 g/L fecaal materaal (afkomstig van een methanogene of niet-methanogene donor).
3.3.3
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
Er werden 6 reeksen opgenomen in dit experiment: 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g/L vet. Het experiment werd uitgevoerd met zonnebloemolie (Zonnebloemolie; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e) en met kokosolie (Pure coconut oil; KTC Edibles Ltd, Wednesbury, Verenigd Koninkrijk). Alle reeksen werden in triplicaat uitgevoerd. Het fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 25 jaar. Oplossingen: Vetoplossing-1: los 0.1 g vet op per mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk), warm op tot 37 om het vet volledig op te lossen Vetoplossing-2: verdun 0.2 mL vetoplossing-1 met 1.8 mL ethanol SHIME-medium (deel 3.1.2) Fecale slurry (deel 3.2.1)
Protocol: Voeg 100 en 200 µL vetoplossing-2 toe aan de reeksen met 0.05 en 0.1 g/L vet respectievelijk; voeg 100, 400 en 1000 µL vetoplossing-1 toe aan de reeksen met 0.5, 2 en 5 g/L vet Verdamp de ethanol onder een N2 -gasstroom Voeg aan alle flesjes 10 mL SHIME-medium toe Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel Flush de headspace Bereidt de fecale slurry Voeg via een spuit met naald (1.2 mm diameter) 10 mL slurry toe Incubeer gedurende 24 uur (37, 140 rpm)
De flesjes bevatten allen 8 g/L SHIME-medium en 100 g/L fecaal materiaal in een 0.1 M 28
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.3
fosfaatbuffer. De vetconcentraties waren 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g/L. Het inoculum voor de beide experimenten was afkomstig van dezelfde donor, maar het inoculum werd bekomen op 2 verschillende dagen.
3.3.4
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri
Er werd gewerkt met Lactobacillus reuteri ATCC 53608, dit is een stam die ge¨ısoleerd werd uit het menselijke intestinaal kanaal. Er werden 5 reeksen opgenomen in dit experiment: 0, 20, 50, 200, en 500 mg/L linolzuur (Linoleic acid ≥ 99%; Sigma-Aldrich, St. Louis, Verenigde Staten). Elke reeks werd in triplicaat uitgevoerd. Het experiment werd eerst uitgevoerd in SHIME-medium en daarna in MRS-medium als incubatiemedium. Oplossingen: Vetzuuroplossing: los 0.025 g linolzuur op per mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) MRS-medium (deel 3.1.4, nog niet geautoclaveerd) SHIME-medium (deel 3.1.2, nog niet geautoclaveerd)
Protocol: Breng 0, 24, 60, 240 en 600 µL vetzuuroplossing in de flesjes voor 0, 20, 50, 200 en 500 mg/L vetzuur respectievelijk Verdamp de ethanol onder een N2 -gasstroom Voeg 20 mL SHIME-medium (of MRS-medium) toe Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel Flush de headspace Autoclaveer Opkweken pure cultuur: – Breng 20 mL MRS-medium in drie penicillineflesjes – Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel – Flush de headspace – Autoclaveer de flesjes – Inoculeer in steriele omstandigheden (zelfde procedure als eerder) 1. Was de butylrubber stop met ethanol 2. Flambeer de stop in de vlam 3. Breng via een steriele spuit (1 mL) met steriele naald 0.1 mL inoculum in de flesjes – Laat de cultuur 24 uur groeien (37) Inoculeer de flesjes met de opgekweekte cultuur in steriele omstandigheden (onder de laminaire flow) Incubeer (37, 140 rpm) Neem in steriele omstandigheden (zelfde procedure als eerder) via een steriele spuit met naald, 1 mL staal uit het flesje Maak de geschikte verdunningsreeks aan Analyseer met de flowcytometer (deel 3.5.1)
29
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.3
Alle omstandigheden behalve de vetzuurconcentratie waren identiek in alle reeksen (15.9 g/L SHIME-medium o´f 55 g/L MRS-medium). De concentratie linolzuur van de verschillende reeksen bedroeg 0, 20, 50, 200 en 500 mg/L.
3.3.5
Aanrijking van de colonmicrobiota 1
Dit experiment werd uitgevoerd om na te gaan of de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap van het colon in vitro be¨ınvloed wordt door de aanwezigheid van zonnebloemolie. Hiervoor werd de controle vergeleken met een behandeling waaraan 0.5 g/L zonnebloemolie (Zonnebloemolie; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e) werd toegevoegd. Elke reeks werd in duplicaat uitgevoerd. Het fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 26 jaar. Oplossingen: Vetoplossing: los 0.025 g vet op per mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) SHIME-medium (deel 3.1.2, nog niet geautoclaveerd) Fecale slurry (deel 3.2.1)
Protocol: Breng 400 µL vetoplossing in de flesjes voor de eerste stap (inoculatie) en 200 µL in de flesjes voor de daaropvolgende overentingsstappen Verdamp de ethanol onder een N2 -gasstroom Voeg 18 mL SHIME-medium toe aan de flesjes voor de eerste inoculatiestap en 10 mL aan de flesjes voor de daaropvolgende overentingsstappen Sluit de flesjes met een butylrubber stop en metalen deksel Flush de headspace Autoclaveer de flesjes Bereidt de fecale slurry Voeg via een spuit met naald (1.2 mm diameter) 2 mL slurry toe Incubeer (37, 140 rpm) Neem na 24 uur incubatie, via een spuit met naald, 10 mL staal uit de ge¨ıncubeerde suspensie, en breng deze over in een nieuw flesje van dezelfde reeks (dit flesje bevat reeds 10 mL SHIME-medium en het vet)
De toegevoegde vetconcentratie bedroeg 0.5 g/L op alle tijdstippen (in de veronderstelling dat 50% van het toegevoegde vet overgebracht werd naar het volgende penicillineflesje bij het overenten). De flesjes bevatten 14.4 g/L SHIME-medium en 2% w/v fecaal materiaal in de inoculatiestap, en 8 g/L vers SHIME-medium tijdens de daaropvolgende overentingsstappen. Er werd 5 keer overge¨ent.
30
MATERIAAL EN METHODEN: Protocols van de experimenten
3.3.6
3.3
Aanrijking van de colonmicrobiota 2
Dit is een vervolg op experiment 3.3.5. Het werd uitgevoerd om na te gaan of de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap van het colon in vitro be¨ınvloed wordt door de aanwezigheid van verschillende vetten. Er werden een controle en 6 behandelingen opgenomen in dit experiment. Aan de behandelingen werd 1 g/L kokosolie (Pure coconut oil; KTC Edibles Ltd, Wednesbury, Verenigd Koninkrijk), varkensvet (Reuzel geraffineerd; Olma, Fl´emalle, Belgi¨e), boter (Boter; Carrefour Discount, Evere, Belgi¨e), olijfolie (Extra olijfolie van eerste persing; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e), zonnebloemolie (Zonnebloemolie; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e) of visolie (EPA omega 3; Biover, Brugge, Belgi¨e) toegevoegd. Elke reeks werd in triplicaat uitgevoerd. Het fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 26 jaar. Oplossingen: Idem als in deel 3.3.5 De boter- en kokosolieoplossingen werden voor het overbrengen opgewarmd tot 37 om het vet volledig op te lossen De reuzeloplossing werd voor het overbrengen opgewarmd tot 60 om het vet volledig op te lossen
Protocol: Breng 800 µL vetoplossing in de flesjes voor de eerste inoculatiestap en 400 µL in de flesjes voor de daaropvolgende overentingsstappen Verdamp de ethanol onder een N2 -gasstroom De rest is identiek aan het protocol in deel 3.3.5
De vetconcentratie bedroeg 1 g/L op alle tijdstippen (in de veronderstelling dat 50% van het toegevoegde vet overgebracht werd naar het volgende penicillineflesje bij het overenten). De flesjes bevatten 14.4 g/L SHIME-medium en 2% w/v fecaal materiaal in de inoculatiestap, en 8 g/L vers SHIME-medium tijdens de daaropvolgende overentingsstappen. Er werd 14 keer overge¨ent.
3.3.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 3
Dit experiment werd uitgevoerd als uitbreiding op experiment 3.3.6. Naast de controle werden er 4 behandelingen opgenomen in dit experiment waarbij er 1 g/L varkensvet (Reuzel geraffineerd; Olma, Fl´emalle, Belgi¨e), olijfolie (Extra olijfolie van eerste persing; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e), zonnebloemolie (Zonnebloemolie; Bio Delhaize, Brussel, Belgi¨e) of lijnzaadolie (Lijnzaadolie van ´ eerste koude persing; Emile No¨el, Pont Saint Esprit, Frankrijk) werd toegevoegd. Elke reeks werd in triplicaat uitgevoerd. Het volledige experiment werd parallel uitgevoerd in SHIME-medium en MCB-medium als cultuurmedium (zelfde inoculum). Het fecaal materiaal was afkomstig van een gezonde (geen antibiotica en gastro-intestinale ziekten gedurende 6 maanden voor de experimenten) mannelijke vrijwilliger van 26 jaar. Oplossingen: 31
MATERIAAL EN METHODEN: Chemische analyses
3.4
SHIME-medium (deel 3.1.2) Fecale slurry (deel 3.2.1) Gal-oplossing (deel 3.1.5) MCB-medium (deel 3.1.3)
Protocol: Weeg 20 mg vet af in de flesjes voor de eerste inoculatiestap en 10 mg aan de flesjes voor de daaropvolgende overentingsstappen (warm reuzel op tot 60 zodat het vloeibaar genoeg is om te pippetteren) Voeg 10 mL gal-oplossing bij 500 mL geautoclaveerde SHIME-medium Voeg 18 mL cultuurmedium (SHIME-medium of MCB-medium) toe aan de flesjes voor de eerste inoculatiestap en 10 mL aan de flesjes voor de daaropvolgende overentingsstappen De rest is identiek aan het protocol in deel 3.3.5
De vetconcentratie bedroeg 1 g/L op alle tijdstippen (in de veronderstelling dat 50% van het toegevoegde vet overge¨ent werd). De concentratie gal in het incubatiemedium met SHIMEmedium was 2 g/L. Er werd 14 keer overge¨ent.
3.4 3.4.1
Chemische analyses pH
De pH werd gemeten met een pH-elektrode toestel (C535 multi-parameter analyser; Consort, Turnhout, Belgi¨e). De pH-elektrode (SP10B) werd voor gebruik gecalibreerd met een buffer bij pH = 4 en bij pH = 7 (Chem-Lab, Zedelgem, Belgi¨e).
3.4.2
Gasanalyse
Om de gasfase in de headspace van de ana¨erobe incubaties te analyseren werd er met behulp van een 3 mL spuit (voorzien van een kraantje) een staal uit de gasfase van de flesjes genomen. Het volume gas in de spuit werd bij atmosfeerdruk op 2 mL gebracht waarna het werd ge¨ınjecteerd in de gaschromatograaf (Compact-GCTM; Global Analyzer Solutions, Breda, Nederland). Deze GC was uitgerust met 2 kolommen met elk een Thermal Conductivity Detector (TCD). Om H2 -gas te meten werd gebruik gemaakt van de voorkolom Molsieve 5A (7 m x 0.32 mm), kolom Porabond Q (2 m x 0.32 mm) en detector TCD-B. Het draaggas voor deze meting was He. Om CO2 , O2 en CH4 te meten werd gebruik gemaakt van de voorkolom R1-QS-bond (28 m x 0.32 mm) en kolom R1-QS-bond (2 m x 0.32 mm); het draaggas voor deze metingen was N2 . De gebruikte software was CGCeditor (CGCeditor; Global Analyzer Solutions, Breda, Nederland) en EZChrom Elite (EZChrom Elite; VWR International, Leuven, Belgi¨e).
32
MATERIAAL EN METHODEN: Chemische analyses
3.4.3
3.4
Gasdruk
Om de gasdruk op te meten werd er gebruik gemaakt van een digitale drukmeter (Digital pressure gauge CPH 6200-S1; WIKA Alexander Wiegand SE & Co. KG, Klingenberg, Duitsland).
3.4.4
Ammonium
Om de totale hoeveelheid ammonium (NH+ 4 ) en ammoniak (NH3 ) in een staal te bepalen werd gebruik gemaakt van een destillatiemethode gevolgd door een titrimetrische bepaling. De destillatie gebeurde via een automatisch destillatietoestel (1026 Kjeltec Auto Distillation; FOSS Benelux, Amersfoort, Nederland). Het programma voor TAN (total ammonia nitrogen) werd zo ingesteld dat er gedurende 4 minuten met stoom werd gedestilleerd. Oplossingen: Boorzuuroplossing: 0.30 M – Gemengde indicator aanmaken: * 200 mg methylrood/100 mL ethanol (Methyleenrood; Vel, Leuven, Belgi¨e) * 100 mg methylblauw/50 mL ethanol (Methyleenblauw; Vel, Leuven, Belgi¨e) * Beide oplossingen mengen – 40 g Boorzuur (VWR International, Leuven, Belgi¨e) oplossen in 900 mL gedestilleerd water, opwarmen tot 60 om op te lossen en terug afkoelen tot kamertemperatuur – 20 mL gemengde indicator toevoegen – Aanlengen tot 2 L – pH aanpassen tot 5.3 met behulp van 1 N HCl of 1 N NaOH Zoutzuuroplossing: 0.02 M (Chem-Lab, Zedelgem, Belgi¨e)
Protocol: Breng een recipi¨ent met 10 mL boorzuuroplossing in het destillatietoestel Breng 1.0 mL staal in een Kjeldahl-proefbuis en voeg een overmaat MgO toe (1 lepel = ±1.5 g) Plaats de Kjeldahl-proefbuis onmiddellijk in het destillatietoestel Voltooi de destillatiecyclus van het apparaat voor ammoniumbepaling (TAN) Breng met een automatisch titratietoestel de pH van de boorzuuroplossing opnieuw tot 5.3 en noteer het volume 0.02 M HCl dat hiervoor nodig was
Het MgO zorgt ervoor dat de pH stijgt waardoor het aanwezige ammonium NH+ 4 wordt vrijgesteld als gasvormig ammoniak (NH3 ). Dit ammoniak wordt door middel van stoom overgedestilleerd naar een recipi¨ent die 10 mL boorzuurindicator bevat (0.30 M, pH 5.3). Het ammoniak reageert als base met het boorzuur waardoor het ammoniak als ammonium oplost in de boorzuuroplossing. Hierdoor zal de pH van de boorzuuroplossing stijgen naarmate er meer ammonium wordt overgedestilleerd. Deze boorzuuroplossing in het recipi¨ent wordt na afloop van het programma van het destillatietoestel met HCl (0.02 M) terug getitreerd tot pH 5.3. Uit het volume toegevoegd HCl kan dan de hoeveelheid overgedestilleerd ammoniak berekend worden, en kan de concentratie ammonium 33
MATERIAAL EN METHODEN: Chemische analyses
3.4
in het oorspronkelijke staal berekend worden. N H4+ − N (mg/L) =
(A − B) · 0.02 mol/L · 14.01 g/mol · 1000 mg/g ·f V
(3.1)
In deze formule is: A = volume HCl getitreerd voor het staal (mL) B = volume HCl getitreerd voor de blanco (mL) V = volume van het staal (mL) f = verdunning van het staal
3.4.5
Korteketen vetzuren
Om de concentratie acetaat, propionaat, butyraat en valeraat (SCFA) in de stalen te bepalen werden deze SCFA eerst met een etherextractie ge¨extraheerd. Dit extract werd vervolgens ge¨ınjecteerd in een gaschromatograaf waar de verschillende SCFA gescheiden en gedetecteerd werden. Oplossingen: Interne standaard
– Breng 1.5 mL 2-methyl hexaanzuur (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) over in een maatkolf van 100 mL, en leng aan met 0.1 M NaOH – Schud en breng over in een Schott fles – Spoel de maatkolf door opnieuw 100 mL 0.1 M NaOH toe te voegen en breng dit opnieuw over in de Schott fles H2 SO4 -oplossing 1/1 v/v: verdun ´e´en volume zwavelzuur met ´e´en volume gedestilleerd water
Procedure: Breng 2 mL staal over in een plastic proefbuisje Voeg achtereenvolgens 0.5 mL H2 SO4 (1/1), 0.4 g NaCl, 400 µL interne standaard en 2 mL diethylether toe Sluit het buisje en laat 2 minuten roteren (om een goede menging te bekomen) Centrifugeer het staal 3 minuten bij 1500 g Breng met een pasteurpipet de bovenstaande etherlaag uit het buisje over in een vial Bewaar de vial in een frigo (5-7) tot GC-analyse
Dit etherextract werd geanalyseerd met een gaschromatograaf (GC-2014; Shimadzu, ‘s-Hertogenbosch, Nederland) voorzien van een capillaire vetzuurvrije EC-1000 Econo-Cap kolom (dimensies: 25 mm x 0.53 mm; filmdikte: 1.2 µm) (Alltech, Laarne, Belgi¨e), een vlamionisatiedetector en een split injector. Het injectievolume was 1 µL en het temperatuursprofiel was ingesteld van 110 tot 160 met een temperatuursstijging van 6 min-1. Het draaggas was stikstofgas en de temperatuur van dit gas en de injector waren ingesteld op 100 en 220 respectievelijk [De Weirdt et al., 2010]. Om de concentratie lactaat (melkzuur) in een sample te bepalen werd dit staal eerst afgecentrifugeerd (10 minuten bij 5000g). Het supernatans werd verder gebruikt om de analyse op uit 34
MATERIAAL EN METHODEN: Chemische analyses
3.4
te voeren met behulp van de analyseoplossingen (D-Lactic/L-Lactic; R-Biopharm, Darmstadt, Duitsland). Het principe is gebaseerd op enzymen die D- en L-melkzuur van elkaar kunnen onderscheiden, de kwantificatie gebeurde via UV-absorptie met een spectrofotometer (Uvikon 933; Kontron Instruments, Watford, Verenigd Koninkrijk).
3.4.6
Langeketen vetzuren
De langeketen vetzuuranalyse werd uitgevoerd in het Laboratorium voor Diervoeding en Kwaliteit van Dierlijke Producten van de vakgroep Dierlijke Productie in Melle. Deze vakgroep is verbonden aan de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen van de Universiteit Gent. De analyse omvat een hydrolyse, esterificatie, hexaanextractie en een wasstap van het hexaanextract [Sukhija en Palmquist, 1988]. Oplossingen en materialen: Methanolisch NaOH: 0.5 M NaOH in methanol Methanolisch HCl: voeg voorzichtig 10 mL acetylchloride bij 50 mL ijskoud methanol (al roerend) Interne standaard: los 1 mg/mL C13:0 (Tridecanoic acid; Sigma, Bornem, Belgi¨e) op in tolueen (noteer de exacte massa) Verzadigde NaHCO3 -oplossing: voeg NaHCO3 toe aan gedestilleerd water tot er verzadiging optreedt Kolom: breng een kleine hoeveelheid glaswol, 200 mg silica gel en een kleine hoeveelheid actieve kool actereenvolgens in een plastic pipettip (10 mL)
Procedure: 1. Staalvoorbereiding Breng 10 mL staal in een glazen extractiebuis en vries dit in bij -20 Breng de extractiebuis met het ingevroren staal over in de vriesdroger en droog het staal 2. Interne standaard Voeg 2.00 mL interne standaard toe (nauwkeurig!) Sluit de extractiebuis en vortex voorzichtig zodat het staal volledig bevochtigd wordt 3. Methylatie van de gebonden vetzuren Voeg 2.00 mL methanolisch NaOH toe Sluit de extractiebuis en vortex voorzichtig zodat het staal volledig gemengd wordt Plaats de buis in een warmwaterbad bij 70 voor 60 minuten Laat de buis afkoelen bij kamertemperatuur of in een koudwaterbad 4. Methylatie van de vrije vetzuren Voeg 3.00 methanolisch HCl toe Sluit de extractiebuis en vortex voorzichtig zodat het staal volledig gemengd wordt Plaats de extractiebuis in een oven bij 50 voor 30 minuten Laat de buis afkoelen bij kamertemperatuur of in een koudwaterbad 5. Extractie Voeg 3 mL hexaan toe 35
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Voeg voorzichtig 2 keer 2 mL verzadigde NaHCO3 -oplossing toe (vermijdt overmatige schuimvorming) Sluit de extractiebuis en vortex voorzichtig zodat het staal volledig gemengd wordt Centrifugeer het staal 5 minuten bij 3000g 6. Opzuivering Was een kolom met 2 mL hexaan Breng met een pasteurpipet de bovenstaande hexaanlaag uit de extractiebuis over op de kolom en vang het effluent op Breng een staal van dit effluent over in een vial 7. Bewaring Bewaar de vial bij -18 tot GC-analyse
Het hexaanextract in deze vials werd vervolgens geanalyseerd met een gaschromatograaf. Voor het experiment in deel 3.3.2 werd van volgende opstelling gebruik gemaakt: – Gas chromatograaf (GC 6890; Hewlett-Packard, Brussel, Belgi¨e) met een Solgelwax kolom (30m x 0.25mm x 0.25 µm; SGE Analytical Science, Victoria, Australia). Het temperatuursprogramma startte bij 150 voor 2 min, daarna begon een temperatuursstijging met 3/min tot 250. De injector- en detectortemperatuur waren 250 en 280. Voor het experiment in deel 3.3.7 werd van volgende opstelling gebruik gemaakt: – Gas chromatograaf (HP 7890A; Agilent Technologies, Diegem, Belgi¨e) met capillaire kolom 75-m SP-2560TM (i.d. 0.18 mm, filmdikte 0.14 µm; Supelco Analytical, Bellefonte, PA, Verenigde Staten) en een vlamionisatiedetector. Op het tijdstip van injectie was de kolomtemperatuur 70 en deze steeg met 50/min tot 175, bleef vervolgens 13 min op deze temperatuur, gevolgd door een tweede stijging van 5/min tot 215, waarna de kolom voor 10 min bij deze temperatuur bleef. De injector- en detectortemperaturen waren 250 en 255 respectievelijk. De split-ratio was 100:1. De stroomsnelheid van het H2 -gas was 1 mL/min.
3.5 3.5.1
Microbi¨ ele analyses Flowcytometrie
De flow cytometer werd gebruikt om een idee te krijgen van de concentratie dode en levende bacteri¨en in de stalen. Hiervoor werd er een LIVE/DEAD kleuring uitgevoerd op verdunningen van het staal. Er werd een verdunningsreeks aangemaakt van de stalen tot de gewenste verdunning ´ bereikt was. Deze verdunningsreeks wordt aangemaakt in mineraalwater (Evian, Evian-les-bains, Frankrijk) dat gefilterd werd doorheen een 0.22 µm filter. Oplossingen: De 500 mM Na2 -EDTA-oplossing: – Breng 9.3 g Na2 -EDTA in een falcon buis – Leng aan met gedestilleerd water tot ±40 mL
36
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
– Voeg NaOH-oplossing toe tot pH = 8 – Leng verder aan tot 50 mL, en filtersteriliseer de oplossing over een 0.22 µm filter – Bewaar bij 4 De kleuringsoplossing: – 970 µL filtergesteriliseerde DMSO (0.22 µm) – 10 µL SYBR Green (Sybr green 10 000x concentraat in DMSO; Invitrogen, Eugene, Oregon, Verenigde Staten) – 20 µL Propidium Iodide (2 mM in DMSO; Invitrogen, Eugene, Oregon, Verenigde Staten) – Bewaar bij 4(korte termijn) of 20(lange termijn)
®
Procedure: Breng achtereenvolgens in de gewenste verdunning (1 mL): 10 µL bead-oplossing (Cytocount; DakoTM, Glostrup, Denemarken), 10 µL 500 mM Na2 -EDTA-oplossing en 10 µL kleuringsoplossing Vortex zodat alles goed gemengd is Laat 15 minuten inwerken op een donkere plaats Vortex nogmaals vlak voor analyse met de flowcytometer
De beads-oplossing bestaat uit een suspensie van een gekende concentratie fluorescerende pareltjes. De concentratie aan pareltjes in het verdunde staal kan berekend worden. Door het aantal getelde pareltjes te vergelijken met het aantal getelde bacteri¨en kan de concentratie cellen in de verdunde stalen berekend worden. Rekening houdende met de gebruikte verdunning kan dan ook de concentratie bacteri¨en (dood of levend) in het oorspronkelijke staal worden berekend. De kleurstof bestaat uit 2 DNA-bindende fluorescente kleurstoffen. Het principe is gebaseerd op het verschil in membraanpermeabiliteit tussen levende en dode cellen voor deze 2 kleurstoffen. Het SYBR-green zal alle cellen groen kleuren, terwijl het propidium iodide (PI) enkel dode cellen rood zal kleuren. Dit komt omdat transport van PI door het membraan wordt tegengehouden bij levende cellen. Het SYBR-green daarentegen migreert zowel door het membraan van levende als dode cellen. Levende cellen zullen dus enkel met SYBR-green gekleurd worden, terwijl dode cellen zowel met SYBR-green als met propidium iodide gekleurd worden. Dit verschil in kleuring kan door de flowcytometer gedetecteerd worden. De Na2 -EDTA-oplossing (dinatrium-ethylenediaminetetraacetic acid) wordt toegevoegd om de membraanpermeabiliteit van de gram negatieve bacteri¨en te vergroten. Het EDTA zal de lipopolysaccharidelaag aantasten die zich rond de cel bevindt waardoor transport van de kleurstoffen doorheen de membranen vergemakkelijkt wordt. De voorbereide stalen werden vervolgens geanalyseerd met de flowcytometer (CyAnADP; DakoCytomation, Glostrup, Denemarken), de gebruikte software was Summit (Dako Colorado, Fort Collins, Verenigde Staten). Goede resultaten met het toestel werden bekomen rond 30 000 cellen/1000 beads. Er werd gewerkt met een analysesnelheid rond 1000 eps (events per second), en er werd 1 minuut gemeten bij deze snelheid. De concentratie aan cellen in het oorspronkelijke
37
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
staal werd met volgende formule berekend: Ccellen =
Ncellen · Cbeads · f Nbeads
(3.2)
In deze formule is: C cellen = concentratie cellen in het oorspronkelijke staal (mL-1) N cellen = aantal getelde cellen N beads = aantal getelde beads C beads = concentratie beads in het verdunde staal (mL-1) f = verdunning van het oorspronkelijke staal
3.5.2
Specifieke cultivatie van bacteri¨ ele groepen
Ana¨ erobe incubaties Voor alle ana¨erobe incubaties werd gebruik gemaakt van gietplaten. Hierbij wordt 1 mL van een bepaalde verdunning in een plastic petriplaat gebracht waarna het nog vloeibare cultuurmedium (40-45) toegevoegd en met het staal gemengd werd door met de plaat te bewegen. De incubaties werden uitgevoerd in een ana¨erobe jar waarin een zuurstof scavenger (Anaerogen; Oxoid, Hampshire, Verenigd Koninkrijk) werd gebracht. 1. BHI-agar (Brain Heart Infusion): Ana¨eroob kiemgetal Maak het medium aan in gedestilleerd water (tabel 3.4) Autoclaveer, laat afkoelen tot 40-45, en maak een gietplaat Incubeer 48 uur onder ana¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen Tabel 3.4: De samenstelling van ana¨erobe BHI-agar
.
Component BHI broth Agar L-Cyste¨ıne-HCl·H2 O
Concentratie (g/L) 37 16 0.5
2. RB-agar (Raffinose-Bifidobacterium): Bifidobacteria
Maak oplossing A, B en C aan in gedestilleerd water (tabel 3.5) Voeg 15 mL oplossing B en 40 mL oplossing C toe aan 900 mL oplossing A Leng het geheel aan tot 1L Breng de pH op 6.7±0.1 met 1M HCl of NaOH Autoclaveer, laat afkoelen tot 40-45 en maak een gietplaat Incubeer 72 uur onder ana¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
3. TSC-agar (Tryptose Sulfiet Cycloserine): Clostridia 38
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Tabel 3.5: De samenstelling van de oplossingen A, B en C voor RB-agar
.
900 mL oplossing A Component (g) D-(+)raffinose·5H2 O 8.8 Natrium case¨ınaat 5.0 Gistextract 5.0 3.0 LiCl Natrium propionaat 15.0 L-Cyste¨ıne-HCl·H2 O 0.5 Na-thioglycolaat 0.5 Agar 18.0
200 mL oplossing B Component (g) Bromocresol purper 2.0
500 mL oplossing C Component (g) MgSO4 ·7H2 O 0.21 CaCl2 ·2H2 O 0.20 K2 HPO4 0.50 KH2 PO4 0.50 NaHCO3 5.00 NaCl 1.00
Los 39 g TSC-agar poeder op in 1 L gedestilleerd water Autoclaveer en laat afkoelen tot 40-45 Voeg 3 mL gedestilleerd water bij een potje cycloserine (0.4 g) en voeg het met een spuit toe doorheen een filter (0.22 µm), voeg zo in totaal 0.8 g/L cycloserine toe Maak een gietplaat Incubeer 24h onder ana¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
A¨ erobe incubaties Alle a¨erobe incubaties werden uitgevoerd door 0.1 mL van een verdunningsreeks op de plaat aan te brengen en dit uniform open te strijken over de volledige plaat met een steriele spatel. 1. BHI-agar (Brain Heart Infusion): A¨eroob kiemgetal
Los 37 g/L BHI broth en 16 g/L agar op in gedestilleerd water Autoclaveer, laat afkoelen tot 40-45 en maak de platen Breng 0.1 mL staal op de platen en strijk het open Incubeer 48 uur onder a¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
2. LAMVAB-agar (Lactobacillus Anaerobic MRS with Vancomycin and Bromocresol green): Lactobacilli
Maak oplossing A, B en C aan in gedestilleerd water (tabel 3.6) Pas de pH van oplossing A aan tot pH 5.0±0.1 met 1M HCl of NaOH Autoclaveer oplossing A en B en laat afkoelen tot 40-45 Filtersteriliseer oplossing C over een 0.22 µm filter Voeg 400 mL oplossing B en 8 mL van oplossing C toe aan oplossing A, schud en maak de platen Breng 0.1 mL staal op de platen en strijk het open Incubeer 72 uur onder a¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
3. MC-agar (MacConkey): Coliformen Los 50 g/L MacConkey-agar en 1.5 g/L agar op in gedestilleerd water
39
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Tabel 3.6: De samenstelling van de oplossingen A, B en C voor LAMVAB-agar
.
400 mL oplossing A (1 L fles) Component (g) MRS-broth 41.76 L-cyste¨ıne-HCl 0.50 Bromocresol green 0.02
400 mL oplossing B Component (g) Agar 16.0
200 mL oplossing C Component (g) Vancomycine HCl 0.40
Autoclaveer, laat afkoelen tot 40-45 en maak de platen Breng 0.1 mL staal op de platen en strijk het open Incubeer 24 uur onder a¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
4. EA (Enterococcus Agar): Enterococcen
3.5.3
Los 42 g/L EA en 5 g/L agar op in gedestilleerd water Kook 1 minuut, laat afkoelen tot 40-45 en maak de platen Breng 0.1 mL staal op de platen en strijk het open Incubeer 48 uur onder a¨erobe condities bij 37 en tel het aantal kolonies op de platen
DNA-extractie en opzuivering
Voor analyses op het aanwezige DNA in samples werd er eerst een DNA-extractie en opzuivering uitgevoerd volgens de CTAB-methode [Griffiths et al., 2000; Kowalchuk et al., 1998]. Oplossingen: CTAB buffer: – Voeg aan 200 mL water 4.2 g K2 HPO4 en 4.09 g NaCl toe – Pas de pH aan tot 8.0 met 10 N NaOH – Voeg een roervlo toe en autoclaveer – Voeg 10 g CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) toe en verwarm tot 60 zodat het volledig opgelost wordt. PEG-6000 precipitatie-oplossing: – Maak 300 g/L PEG-6000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Verenigde Staten) aan in water – Voeg 93.5 g/L NaCl toe – Voeg een roervlo toe en autoclaveer Fenol:chloroform:isoamylalcohol mengsel (25:24:1), pH 7.7-8.3 (Sigma, Steinheim, Duitsland) Chloroform:isoamylalcohol mengsel (24:1) (Merck Eurolab, Leuven, Belgi¨e) Ethanol 70% v/v – Leng 70 mL ethanol (Ethanol absolute; VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) aan tot 100 mL met gedestilleerd water – Bewaar bij -20
Procedure: 1. Staalvoorbereiding 40
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Breng 1 mL staal in een steriel epje en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5000g Verwijder de bovenstaande vloeistof en bewaar de pellet bij -20 Ontdooi de pellet voor de procedure van DNA-extractie 2. DNA-extractie voeg bij de pellet 0.5 g glasparels (Sartorius, Goettingen, Duitsland), 0.5 mL CTAB buffer en 0.5 mL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) Meng het geheel intens met een vortex Schud met de Beadbeater (Cell Homogenizer MSK; B. Braun Biotech, Melsungen, Duitsland) 3 keer 30 s met telkens 10 s tussenpauze om oververhitting te vermijden Centrifugeer 5 min bij 3000g en breng 300 µL supernatans over in een steriel epje Voeg opnieuw 0.5 mL CTAB buffer toe in het oorpronkelijke epje en homogeniseer opnieuw met de Beadbeater (3 keer voor 30 s met 10 s tussenpauze) Centrifugeer 5 min bij 3000g en breng 300 µL supernatans over in het epje dat reeds 300 µL bevatte Verwijder de fenol door menging met een gelijk volume (600 µL) chloroform:isoamylalcohol (24:1), keer om en centrifugeer voor 10 s (chloroform scheidt zeer snel van water) Breng de bovenstaande waterfase over in een steriel epje en precipiteer gedurende 2 uur de nucle¨ınezuren met 1.2 mL PEG-6000 precipitatie-oplossing bij kamertemperatuur centrifugeer 20 min bij 5000g Verwijder het supernatans en was de pellet met 1 mL ijskoude ethanol (70%) Centrifugeer 20 min bij 5000g Droog de pellet (DNA-SpeedVac DNA 10; Savant, Thermo Fisher Scientific) Suspendeer de pellet in 100 µL PCR water (Sigma-Aldrich, Ayrshire, Verenigd Koninkrijk) en bewaar het staal bij -20.
3.5.4
Nanodrop
®
Het Nanodrop toestel (Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer; Isogen Lifescience, Ijsselstein, Nederland) werd gebruikt om de concentratie en de zuiverheid van DNA in een DNA-extract te meten. Dit toestel berekent de concentratie DNA in ng/L op basis van de gemeten absorbantie bij 260 nm. De contaminatie van het DNA door RNA wordt berekend door de piek bij 260 nm (maximale absorbantie DNA) te delen door de piek bij 280 (maximale absorbantie RNA). Goede waarden zijn groter dan 1.8. Door de verhouding van de piek bij 260 nm (maximal absorbantie DNA) en 230 nm (maximale absorbantie eiwit) te berekenen kan een idee worden verkregen van de contaminatie van het DNA-extract met eiwit. Deze verhouding ligt best tussen 1.8 en 2.0.
3.5.5
PCR
Een PCR werd uitgevoerd om de concentratie van bepaalde DNA-fragmenten in een DNA-extract sterk te amplificeren. Hiervoor wordt er gebruik gemaakt van primers die specifiek zijn voor deze DNA-sequentie. Oplossingen:
41
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Master Mix (tabel 3.7) DNA-extract (deel 3.5.3)
Procedure: Breng 24 (of 48) µL Master Mix in steriele epjes en voorzie een negatieve controle in het begin en op het einde van de reeks Breng vervolgens 1 (of 2) µL DNA-extract in het tweede tot het voorlaatste epje en sluit de epjes Plaats de epjes in het PCR-toestel (Gene AMp PCR System 2700; Applied Biosystems, Foster City, Verenigde Staten) Stel het juiste tijd/temperatuur programma in (tabel 3.8) en de correcte hoeveelheid vloeistof in de epjes (25 of 50 µL) Tabel 3.7: De samenstelling van 100 µL Master Mix; a (Fermentas, York, Verenigd Koninkrijk), b (SigmaAldrich, Ayrshire, Verenigd Koninkrijk) Component PCR-water (nuclease-vrij)b TAQ Buffer+KCl-MgCl2 a MgCl2 a dNTP (10 mM)a Forward primer (10 µM) Reverse primer (10 µM) Bovine serum albumine (BSA)a TAQ-polymerasea
Volume (µL) 77.25 10.00 6.00 2.00 2.00 2.00 0.25 0.50
Dit bekomen PCR-product werd samen met een DNA-ladder op een agarosegel gezet om te controleren of het juiste stuk DNA geamplificeerd is, of het voldoende is geamplificeerd en of de negatieve controles geen DNA bevatten. Indien dit het geval was werd het PCR-product op een DGGE-gel gebracht voor scheiding van het geamplificeerde DNA (deel 3.5.7). Het PCR-product werd bewaard bij -20. Tabel 3.8: Het PCR tijd/temperatuur-programma voor de gebruikte primers Specificiteit Universeel (16S rDNA)
3.5.6
Primers P338fGC P518r
Tijd/temperatuur programma a) 50 94 b) 10 95 / 10 53 / 20 72 (x30) c) 100 72
Agarosegel
In neutraal tot licht alkalisch milieu zal DNA negatief geladen zijn door de ionisatie van de fosfaatgroepen in het DNA. Hierdoor zal het DNA naar de positieve pool in een elektrisch veld migreren. Hoe langer de ketens, hoe trager ze in een gel kunnen bewegen. Hierdoor wordt het aanwezige DNA gescheiden volgens lengte. Om het DNA te visualiseren werd gebruik gemaakt 42
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
van ethidiumbromide (Bio-Rad, Hercules CA, Verenigde Staten). Dit nestelt zich tussen de DNA-strengen en geeft een absorbantiepiek bij 296 nm. Oplossingen: 0.5x TAE-buffer (Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane), Acetic acid and EDTA) – Verdun 50x TAE (Applichem, Darmstadt, Duitsland) in gedestilleerd water
Procedure: Los 1.2 g agarose (UltraPureTM Agarose; Invitrogen, Eugene, Oregon, Verenigde Staten) op in 100 mL TAE-buffer (0.5x) door op te warmen in een microgolf Laat afkoelen tot handwarm en voeg 2 µL EtBr (10 mg/mL; Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten) toe per 100 mL oplossing Giet de gel in de gelhouder met een geschikte kam en laat 20 minuten stollen Verwijder de kam uit de gelhouder, en breng gel met houder in het elektroforesetoestel gevuld met 0.5x TAE-buffer Meng 5 µL van het PCR-product met 1 µL ladingsbuffer (6x DNA Loading Dye; Fermentas, St. Leon-Rot, Duitsland) en breng het mengsel in een uitsparing in de gel die gecre¨eerd werd door de kam Breng een DNA ladder (MassRulerTM DNA Ladder Mix; Fermentas, St. Leon-Rot, Duitsland) aan in het eerste en het laatste slot Leg gedurende 20 minuten een spanning van 100 V aan zodat het DNA naar de anode (+) kan migreren Visualiseer het patroon door belichting van de gel met UV
Door belichting van de gel met UV licht in een belichtingsbak (Vilber Lourmat, Marne-laVal´ee, Frankrijk) wordt het DNA zichtbaar en kan het patroon worden afgeprint (P90E printer; Mitsubishi, Japan).
3.5.7
DGGE
De DNA-fragmenten die via een PCR werden geamplificeerd, zijn ongeveer even groot, zodat ze niet gescheiden kunnen worden op basis van lengte. Een denaturerende gradi¨ent gel elektroforese wordt uitgevoerd om deze geamplificeerde DNA fragmenten te scheiden op basis van het gehalte guanine-cytosine (G-C) basenparen in het DNA. Hiervoor wordt een polyacrylamidegel aangemaakt waarin een concentratiegradi¨ent van denaturerende stoffen (ureum/formamide) aanwezig is. Aangezien het gehalte aan guanine (G) en cytosine (C) bepaalt hoe goed het dubbelstrenging DNA bestand is tegen denaturatie zullen DNA-fragmenten met een hoger G-C-gehalte later denatureren bij het doorlopen van de gel. In de primers is een G-C-klem aangebracht zodat deze ook ingebouwd worden in het PCRproduct, dit is een sequentie die zeer rijk is aan guanine en cytosine. Bij denaturatie (overgang dubbelstreng naar enkelstreng) van het DNA zal het DNA enkel nog samen worden gehouden door deze G-C-klem waardoor de mobiliteit van het gedenatureerde DNA zeer sterk daalt. De drijvende kracht achter de migratie van DNA-fragmenten is opnieuw de aantrekking van het
43
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
negatief geladen DNA naar de anode (+) in een elektrisch veld. Oplossingen: APS-oplossing: los 0.10 g APS (ammoniumpersulfaat, Bio Rad; Hercules, Verenigde Staten) op in 1 mL gedestilleerd water TEMED (tetramethylethyleendiamine) De 0% denaturatie-oplossing (tabel 3.9) De 60% denaturatie -oplossing (tabel 3.9) 1x TAE-buffer – Verdun 50x TAE (Applichem, Darmstadt, Duitsland) in gedestilleerd water Tabel 3.9: De samenstelling van de denaturatieoplossingen (DS) voor een 8% polyacrylamidegel; a (Bio-Rad, Hercules, VSA), b (Aldrich, Steinheim, Duitsland) en c (Applichem, Darmstadt, Duitsland) Component Acrylamide (40%)a Bisacrilamide (2%)a Ureab Formamidec TAE (50x)c Milli-Q
60% DS 10.0 mL 2.5 mL 12.5 g 12 mL 1 mL aanlengen tot 50 mL
0% DS 10.0 mL 2.5 mL 0.0 g 1 mL aanlengen tot 50 mL
Protocol: 1. Gelhouder Reinig een grote glasplaat, een kleine glasplaat en 2 spacers met water en ethanol en wrijf af met stofvrije doekjes Plaats de 2 spacers op de zijkanten van de grote glasplaat, en breng hierop de kleine glasplaat aan, breng vervolgens de klemmen aan om de glasplaten op de spacers gedrukt te houden Sluit de bodem af met tape en plaats de klemmen met glasplaten in een statief
2. Bodem gel Bereid de bodem gel: voeg aan 2 mL van de 60% denaturatieoplossing 40 µL APS en 2 µL TEMED toe Breng 1 mL van deze oplossing tussen de glasplaten door het langs een spacer naar beneden te laten lopen Laat de bodem gel 15 minuten polymeriseren, controleer de stolling van de resterende oplossing in het buisje
3. Gel Meng 10 mL van de hoogste denaturatieoplossing met 75 µL APS en 10 µL TEMED, en breng dit in compartiment 1 van het toestel dat de gradi¨ent aanmaakt (figuur 3.1) Ontlucht de scheiding tussen de twee compartimenten door het kraantje snel open en terug dicht te draaien
44
MATERIAAL EN METHODEN: Microbi¨ele analyses
3.5
Breng de oplossing die tijdens vorige stap in het tweede compartiment is gelopen terug in het eerste compartiment met behulp van een pipet Meng 10 mL van de laagste denaturatieoplossing met 75 µL APS en 10 µL TEMED, en breng dit in compartiment 2 van het toestel dat de gradi¨ent aanmaakt (figuur 3.1) Open gelijktijdig het kraantje tussen beide compartimenten en leg de pomp aan De pomp zal hierdoor eerst 100% vloeistof uit het eerste compartiment (60% DS) zuigen waarna dit percentage geleidelijk daalt naar 0% tegen het einde. Het percentage aan vloeistof uit het tweede compartiment (45% DS) is 0% in het begin, maar stijgt naar 100% tegen het einde. Hierdoor daalt de denaturatieconcentratie (% DS) van de uitstromende vloeistof van de maximale denaturatieconcentratie (60% DS) tot de minimale denaturatieconcentratie (45% DS) waardoor een denaturatiegradi¨ent wordt gecre¨erd in de gel (figuur 3.1) Als de vloeistof tussen de glasplaten voldoende hoog staat (gelijk aan de lijntjes op de klemmen) wordt de resterende oplossing in een buisje gepompt Laat de gel 2 uur polymeriseren, controleer de stolling in de resterende oplossing in het buisje
Figuur 3.1: Bovenaanzicht van het toestel om een gel met een gradi¨ent aan te maken.
4. Stacking gel Reinig een kam met ethanol en stofvrije doekjes Breng de kam tussen de glasplaten aan tot deze 1 mm hoger staat dan de gel Bereid de stacking gel: voeg aan 2 mL van de 0% denaturatieoplossing 40 µL APS en 2 µL TEMED (Applichem, Darmstadt, Duitsland) toe Breng de vloeistof met een pipet tussen de glasplaten aan tot de vloeistof het hoogste niveau bereikt (hoogte van de kleinste glasplaat) Laat de stacking gel 15 minuten polymeriseren, controleer de stolling in de resterende oplossing in het buisje, en verwijder voorzichtig de kam
5. Laden van de gel Haal de klemmen uit het statief en verwijder de tape van de bodem Breng de klemmen met de glasplaten in de apparaathouder, en reinig de uitsparingen in de stacking gel via een spuit met 1x TAE oplossing Breng voldoende 1x TAE oplossing in het bovenste compartiment zodat de uitsparingen in de gel onder het vloeistofniveau zitten Meng 8 µL PCR-product met 2 µL ladingsbuffer op een parafilm en breng dit vervolgens in een uitsparing van de gel met behulp van een pipet
6. Lopen van de gel 45
MATERIAAL EN METHODEN: Dataverwerking en statistische analyse
3.6
Breng de apparaathouder in het apparaat (Biorad) dat vooraf gedurende 2 uur opgewarmd werd (60) Controleer het vloeistofniveau en pas indien nodig aan met 1x TAE Breng gedurende 16 uren een spanning van 38 volt aan over de twee polen zodat het negatief geladen DNA doorheen de gel naar de anode (+) kan migreren
7. Ontwikkeling van de gel Breng 200 mL 1x TAE in een plastic bak Verwijder de klemmen met de glasplaten uit de apparaathouder en verwijder de klemmen van de glasplaten Breng de gel tussen de glasplaten voorzichtig over in de 1x TAE buffer Voeg 16-17 µL Sybr green (Sybr green 10 000x concentraat in DMSO; Invitrogen, Eugene, Oregon, Verenigde Staten) toe aan de buffer met de gel en meng zachtjes door de plastic bak te bewegen Laat het Sybr green gedurende 20 minuten inwerken op de gel Breng de gel over in een UV-transilluminator (OptiGo-650; Isogen Life Science, De Meern, Nederland) om een foto te maken van de UV fluorescentie van het Sybr green dat op het DNA is gebonden
®
3.5.8
Verwerking DGGE
Elke band op een DGGE kan beschouwd worden als een OTU (Operational Taxonomic Unit). De intensiteit van een band kan beschouwd worden als een maat van de concentratie van de bacteri¨en die aanwezig zijn in de microbi¨ele gemeenschap. De relatieve bandintensiteit zal dan overeenkomen met de fractie werk verricht door een species [Mertens et al., 2005]. Met behulp van de Bionumerics software 2.0 (Applied Maths, Kortijk, Belgi¨e) werden het aantal en de intensiteit van de verschillende banden bepaald in het DGGE-profiel. Hierbij worden densitometrische curven van de profielen bekomen. Tussen deze verschillende densitometrische curven werden de Pearson product-moment correlatieco¨effici¨enten berekend en uitgezet in een vergelijkbare matrix. Om de densitometrische curven volgens similariteit te rangschikken in een dendrogram werd het clusteralgoritme van Ward gebruikt [Ward Jr, 1963]. De percentages geven de similariteit weer tussen twee profielen. Op basis van de Pearsoncorrelatieco¨effici¨enten werden de banden geordend in een dendrogram. Hiervoor werd het clusteralgoritme van Ward gebruikt [Ward Jr, 1963].
3.6
Dataverwerking en statistische analyse
De Levene’s test werd gebruikt om de homogeniteit van de varianties na te gaan. In de meeste gevallen bleken deze niet gelijk te zijn, waardoor er steeds gewerkt werd met ongelijke varianties. Voor het vergelijken van behandelingen met de controle werd gebruik gemaakt van de Student’s T-test. Deze werden telkens tweestaartig uitgevoerd, en werd er verondersteld dat de varianties
46
MATERIAAL EN METHODEN: Dataverwerking en statistische analyse
3.6
niet gelijk waren. Het significantieniveau werd vooraf vastgelegd op p=0.05. Een ANOVA werd uitgevoerd om de controle en de behandelingen onderling te vergelijken met elkaar. Hiervoor werd de data ingegeven in SPSS 16. Als de nulhypothese werd verworpen werd gebruik gemaakt van de Tukey test om de verschillen te detecteren als de data gelijke varianties had. Als de varianties ongelijk bleken te zijn werd gebruik gemaakt van de Dunnet’s T3 test. Allen uitgevoerd bij een significantieniveau van 0.05.
47
Hoofdstuk 4
Resultaten 4.1
Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol
Zoals reeds eerder beschreven in de literatuur kunnen onverzadigde vetzuren die het colon binnenkomen, biohydrogenatie ondergaan door de colonmicrobiota die daar aanwezig zijn (inleiding 1.7.2). Dit experiment (protocol 3.3.1) werd uitgevoerd als eerste test om tot een goede proefopzet te komen om het biohydrogenatieproces door colonbacteri¨en in vitro te bestuderen. Tevens werd geprobeerd om na te gaan of glycerol een effect had op het biohydrogenatieproces. Uit de analyses van de LCFA kan men zien dat het initi¨ele LCFA-profiel (0 uur incubatie) bij de controle niet echt veranderde naarmate er langer werd ge¨ıncubeerd (figuur 4.1). De enige waarneembare trend was dat de concentratie CLA daalde in de tijd: na 24 uur was deze concentratie significant lager dan na 0 uur (p=0.015). De vetbelasting van het inoculum bedroeg 250 mg vetzuur/g inoculum in de twee behandelingen (vetzuur en vetzuur+glycerol). De concentratie linolzuur daalde in beide behandelingen met de tijd. Deze daling was statistisch significant in de reeks met vetzuur (p=0.010), maar niet in de reeks met vetzuur+glycerol (p=0.222). De concentratie stearinezuur steeg met de incubatietijd, maar de verschillen binnen de reeksen tussen 4 en 24 uur waren niet significant. Het CLA was steeds aanwezig in de laagste concentraties en daalde met de incubatietijd voor de drie reeksen. De concentraties CLA waren wel significant hoger in de reeksen met linolzuur dan in de controlereeks (tabel 4.1). Tabel 4.1: De LCFA-concentraties (g/L) en de pH in de 3 reeksen (M±SD), de tijd is weergegeven in uur. Na 4 en 24 uur werden de twee behandelingen vergeleken met de controle via een Student’s T-test. Statistisch significante verschillen werden aangeduid met een o (p<0.001) of een ∗ (p<0.05). Reeks Controle Controle Vetzuur Vetzuur+glycerol Controle Vetzuur Vetzuur+glycerol
Tijd 0 4 4 4 24 24 24
n-6 18:2 0.647±0.057 0.647±0.052 6.104±0.264o 5.339±0.465∗ 0.668±0.109 4.840±0.076o 4.782±0.478∗
Totaal CLA 0.038±0.002 0.032±0.007 0.140±0.007o 0.155±0.026∗ 0.025±0.004 0.141±0.004o 0.126±0.009o
Totaal 18:1 2.629±0.361 2.274±0.190 2.283±0.122 2.412±0.032 2.412±0.456 2.254±0.290 2.274±0.065
18:0 0.533±0.044 0.803±0.208 0.586±0.018 0.567±0.027 0.626±0.135 0.734±0.206 0.672±0.173
pH 6.19±0.07 5.05±0.13 5.16±0.12 5.28±0.02
Op tijdstip 0 en 24 uur werd de pH opgemeten ter controle, de pH was na 24 uur al tot rond pH 5 gedaald (tabel 4.1). De druk was na 4 en 24 uur incubatie rond 50 kPa en rond 80 kPa respectievelijk, er konden geen verschillen worden vastgesteld tussen de controle, de reeks met 48
RESULTATEN: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
4.2
vetzuur en de reeks met vetzuur+glycerol. Ook de korteketen vetzuren (SCFA) en ammonium (TAN) werden geanalyseerd, maar dit leverde zeer variabele resultaten op. Om een idee te krijgen of het linolzuur een effect had op de levensvatbaarheid van de colonmicrobiota, werd er na 4 en 24 uur incubatie een LIVE/DEAD kleuring uitgevoerd op een verdunningsreeks waarna de cellen geteld werden in de flowcytometer. De concentratie dode cellen was (niet significant) hoger wanneer er linolzuur werd toegevoegd (3.68E12±5.69E11) dan bij de controle (2.67E12±5.83E11) na 24 uur incubatie (M±SD).
4.2
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
In dit experiment werd getracht om de invloed van de waterstofdruk op het biohydrogenatieproces te bestuderen. Dit werd bewerkstelligd door te werken met 1) de aan- of afwezigheid van waterslotjes (om headspace ana¨eroob onder atmosfeerdruk te houden), 2) verschillende concentraties inoculum, en 3) door twee types inocula te gebruiken: methanogeen en een niet-methanogeen inoculum (protocol 1.6.3). De weergegeven resultaten zijn telkens de waarden voor de reeksen zonder waterslotjes.
Methanogeen 6
0.8
Waterstofgas Methaan
0.7 0.6
6
0.8
5
Waterstofgas Methaan
0.7 0.6
4
0.5
5 4
0.5
0.4
3
0.4
3
0.3
2
0.3
2
0.2
0.2 1
0.1 0
0 2
5
10
15
1
0.1 0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
% Methaan (v/v)
% Waterstofgas (v/v)
Niet-methanogeen
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
Figuur 4.1: De concentratie waterstofgas en methaan in de headspace na 24 uur incubatie met nietmethanogeen en methanogeen inoculum (M±SD).
De waterslotjes hadden geen noemenswaardig effect op de waterstofdruk. Ook de inoculumconcentratie had slechts een beperkte invloed op de waterstofdruk in de flesjes. De waterstofdruk was echter opvallend lager voor het methanogeen inoculum (figuur 4.1). Het methanogeen inoculum zorgde namelijk voor een H2 -druk van slechts 0.022±0.002% v/v bij de reeksen met 5, 10, 15 en 20% w/v inoculum.
49
RESULTATEN: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
Niet-methanogeen
Methanogeen 0.6
0.6 0.5
3 0.4
2
0.4
0.3
2
0.3
0.2
0.2
1
1 0.1
0
0.1
0 5
10
15
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
g/L n-6 18:2
n-6 18:2 18:0
0.4
15
20
2.5
0.6
2.5
2
0.5
2
0.4 1.5
1.5
0.3
0.3 1
1
0.2
0.2 0.5
0.1 0 5
10
15
0.5
0.1
0 2
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
100
% van totaal (18:0, t 18:1, t 18:2 en LA)
10
% Inoculum (w/v)
0.6 0.5
5
100
100
90
90
80
80
70
70
70
70
60
60
60
60
50
50
50
50
40
40
40
40
30
30
30
30
20
20
20
20
10
10
10
10
18:0 Trans 18:1 Trans 18:2 LA
90 80
0
0 2
5
10
15
g/L 18:0
2
g/L Cis-9 18:1
0.5
Totaal C18 Cis-9 18:1
3
4
100
18:0 Trans 18:1 Trans 18:2 LA
90 80
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
% van totaal (18:0, t 18:1, t 18:2 en LA)
g/L totaal C18
4
4.2
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
Figuur 4.2: De concentraties totaal C18 en cis-9 18:1 vetzuur (boven) en de concentraties linolzuur en stearinezuur (midden) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). De relatieve concentraties van de vetzuren betrokken in het biohydrogenatieproces zijn weergegeven als % van totaal 18:0, trans 18:1, trans 18:2 en n-6 18:2 (onder).
50
RESULTATEN: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
0.7
0.14
0.12
0.6
0.12
0.1
0.5
0.1
0.4
0.08
0.4
0.08
Trans 18:1 Trans 18:2
0.3
0.06
0.3
0.06
0.2
0.04
0.2
0.04
0.1
0.02
0.1
0.02
0
0 2
5
10
15
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
% van totaal 18:1
10
15
20
% Inoculum (w/v)
100
100
100
100
80
80
80
60
60
60
60
40
40
40
40
20
20
20
20
80
Trans Cis
0
0 2
5
10
15
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
% van totaal trans 18:2
5
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
100
100
100
100
90
90
90
90
80
80
80
80
70
70
70
70
60
60
60
60
50
50
50
50
40
40
40
40
30
30
30
30
20
20
20
10
10
10
c9, t11 t11, c15 t, t t10, c12
20 10 0
0 2
5
10
15
% van totaal 18:1
0.5
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
% van totaal trans 18:2
0.6
g/L Trans 18:1
Methanogeen 0.14
g/L Trans 18:2
Niet-methanogeen 0.7
4.2
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
Figuur 4.3: De concentraties trans 18:1 en trans 18:2 vetzuren (boven) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). Het cis en trans 18:1 is weergegeven als % van totaal 18:1 (midden). Het trans 18:2 is verder opgesplitst in de relatieve concentraties van de verschillende isomeren (onder).
51
RESULTATEN: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
4.2
De concentratie linolzuur daalde naarmate de inoculumconcentratie hoger was terwijl de concentratie stearinezuur steeg (figuur 4.2). Het inoculum bevatte op zichzelf ook C18 vetzuren, zodat de totale concentratie C18 steeg met de inoculumconcentratie. Het methanogene inoculum bevatte een hogere concentratie C18 vetzuren dan het niet-methanogene inoculum (figuur 4.2). Om deze reden werden de relatieve percentages uitgezet in een grafiek om een idee te krijgen over de biohydrogenatieprofielen (figuur 4.2). Het vetzuurprofiel uitgezet in relatieve concentraties liet een trend zien die zeer gelijkaardig was tussen de incubaties met het niet-methanogene en het methanogene inoculum. Bij het niet-methanogene inoculum trad er minder accumulatie op van CLA en trans-11 18:1, tussenproducten van het biohydrogenatieproces (figuur 4.3). De concentratie trans-11 18:1 streefde naar een bepaalde evenwichtswaarde bij niet-methanogeen inoculum, terwijl dit in het methanogene inoculum niet merkbaar was. Ook de verhoudingen van de verschillende isomeren lagen anders in het methanogene inoculum ten opzichte van het niet-methanogene inoculum. Bij de 18:1 isomeren lag deze verhouding in het voordeel van het trans-11 isomeer bij het niet-methanogeen inoculum, terwijl deze verhouding meer naar een evenredige verdeling neigde wanneer er ge¨ıncubeerd werd met methanogeen inoculum. De verhouding niet-geconjugeerde vetzuren (trans, trans in figuur 4.3, voornamelijk trans-9, trans-12 18:2) lag hoger bij niet-methanogeen inoculum ten opzichte van methanogeen inoculum. Omdat er overal evenveel linolzuur werd toegediend, terwijl de inoculumconcentratie verschillend was, werd de vetbelasting van de bacteri¨en be¨ınvloed. Deze is hier uitgerekend op basis van fecaal nat gewicht (= inoculum) (tabel 4.2). Tabel 4.2: De vetbelasting van de bacteri¨en in incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (mg toegevoegd linolzuur/g inoculum nat gewicht). Inoculumconcentratie (%) Vetbelasting (mg LA/g inoculum)
2 25.0
5 10.0
10 5.0
15 3.3
20 2.5
In dit experiment was de pH-verandering opmerkelijk: de pH daalde sterker bij niet-methanogeen inoculum dan bij methanogeen inoculum, maar deze daling kon niet verklaard worden door de SCFA. De productie van SCFA was namelijk hoger in het methanogeen inoculum (figuur 4.4). Er werden ook analyses uitgevoerd om na te gaan of lactaat aan de basis van de pH daling lag, maar deze resultaten (niet weergegeven) gaven hetzelfde profiel als de SCFA: een stijging met de inoculumconcentratie en hogere waarden voor het methanogene inoculum. De verhouding D-lactaat/L-lactaat was gelijkaardig voor beide inocula (1.25±0.05 en 1.50±0.40 voor het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum respectievelijk). Tenslotte kon nog worden opgemerkt dat het gebruik van waterslotjes om de druk in de headspace op atmosfeerdruk te houden geen invloed hadden op het algemeen metabolisme (pH, SCFA, TAN, lactaat) van de bacteri¨en en op de biohydrogenatieprocessen. De totale drukopbouw in de reeksen zonder waterslot was zo goed als identiek bij beide inocula (tabel 4.3). 52
RESULTATEN: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
4.2
Tabel 4.3: De druk (kPa) in de flesjes na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). Inoculum type 2 18.2±0.0 19.4±0.1
Niet-methanogeen Methanogeen
Inoculumconcentratie (%) 5 10 15 22.0±0.5 30.3±0.0 39.8±0.1 25.6±0.4 33.1±0.1 39.5±0.1
Niet-methanogeen
20 45.2±1.6 47.8±0.2
Methanogeen 7 40
pH TAN
40
pH TAN
6.8 30
30 6.6
pH
6.6 20
6.4
10
6.2 6 5
10
15
10
6.2
0 2
20
6.4
6
20
0 2
% Inoculum (w/v) 120
10
15
20
% Inoculum (w/v) 120
120
100
100
80
80
60
60
60
60
40
40
40
40
20
20
20
20
100
mmol/L
5
80
Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
0
0 2
5
10
15
120
Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
100 80
0
20
0 2
% Inoculum (w/v)
mmol/L
6.8
TAN (mmol/L)
7
5
10
15
20
% Inoculum (w/v)
Figuur 4.4: De pH en concentratie totaal ammonium stikstof in mmol/L (boven) en de SCFA in mmol/L (onder) na 24 uur incubatie met het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum bij de incubaties met 2, 5, 10, 15 en 20% inoculum (M±SD). De groep vertakte vetzuren is de som van isobutyraat en isovaleraat.
53
RESULTATEN: Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
4.3
4.3
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
Om na te gaan of vetten een invloed hebben op het algemeen metabolisme van de colonmicrobiota in vitro werden twee experimenten uitgevoerd waarbij de vetconcentratie werd gevarieerd (protocol 3.3.3). Beide experimenten werden uitgevoerd met een ander inoculum (zelfde donor, andere staalname). In het eerste experiment werd zonnebloemolie toegevoegd, een zeer onverzadigd vet. In het tweede experiment werd kokosolie toegevoegd, een zeer verzadigd vet. Het vet werd toegevoegd in concentraties 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g/L, dit werd nog eens omgezet naar de vetbelastingswaarden van de bacteri¨en in mg vet/g inoculum nat gewicht (tabel 4.4). Tabel 4.4: De vetbelasting van de bacteri¨en in de incubaties met 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g vet/L (het inoculum wordt uitgedrukt in nat gewicht). Vetconcentratie (g/L) vetbelasting (mg vet/g inoculum)
0.00 0
0.05 1
0.10 2
0.50 10
2 50
5.00
Wanneer zonnebloemolie werd toegediend, daalden de korteketen vetzuren naarmate de concentratie vet hoger was (figuur 4.5). Het verschil in totale SCFA (acetaat, propionaat, butyraat, valeraat, isobutyraat en isovaleraat) tussen de controle en de behandelingen was statistisch significant wanneer er voldoende zonnebloemolie (≥0.5 g/L) werd toegediend (figuur 4.5). Bij het toedienen van kokosolie konden daarentegen geen significante verschillen worden vastgesteld. Ook de productie van TAN was bij sommige reeksen significant verschillend van de controle, maar ook hier was dit enkel het geval wanneer zonnebloemolie werd toegediend. De resultaten van de TAN analyses lieten een zwakke stijgende trend zien naarmate er meer zonnebloemolie werd toegevoegd (figuur 4.5). Om deze twee trends beter in beeld te brengen werd de ratio van de totale SCFA ten opzichte van TAN berekend (figuur 4.5). Bij het toevoegen van zonnebloemolie daalde deze ratio SCFA/TAN naarmate er meer vet werd toegediend. Bij het toedienen van 0.5 en 5 g/L zonnebloemolie was deze ratio significant verschillend ten opzichte van de controlereeks. Bij het toevoegen van kokosolie was er daarentegen geen trend merkbaar. De hoge concentratie van acetaat bij het toevoegen van 5 g/L kokosolie was geen outlier. Het experiment werd in triplicaat uitgevoerd, en de drie herhalingen vertoonden allen een hoge acetaatproductie. Deze hoge acetaatproductie weerspiegelde zich ook in een uitgesproken pHdaling. De pH van het incubatiemedium daalde tijdens de incubatie van 6.70±0.01 (controlereeks bij 0 uur) tot ongeveer 6.16 (24 uur) (figuur 4.5). De pH-daling was groter naarmate er meer vet werd toegediend, en deze daling ten opzichte van de controle was zowel bij het toevoegen van kokosals zonnebloemolie significant (figuur 4.5).
54
RESULTATEN: Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
Zonnebloemolie
Kokosolie 50
*
40
40
6.5
6.5 30
*
pH
50
*
30
o*
*
*
*
*
*
20 6
pH TAN
pH TAN
10
5.5
0 0
0.05
0.1
0.5
2
0 0
0.05
0.1
0.5
2
5
Concentratie vet (g/L) 120
120
120
110
110
110
100
100
100
100
90
90
90
90
80
80
80
80
70
70
70
70
60
60
60
60
50
50
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
o* *
110
mmol/L
10
5.5
5
Concentratie vet (g/L) 120
20
o
6
40
*
o
Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
30 20 10 0
0 0
0.05
0.1
0.5
2
40
Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
30 20 10
0
5
mmol/L
*
7
TAN (mmol/L)
7
*
4.3
0 0
Concentratie vet (g/L)
0.05
0.1
0.5
2
5
Concentratie vet (g/L)
4
4
4
4
Totaal SCFA/TAN
Totaal SCFA/TAN
3.5
3.5
3.5
3.5
o* 3
3
o
3
2.5
2.5
2
2.5
2 0
0.05
0.1
0.5
3
*
2
2.5
2
5
2 0
Concentratie vet (g/L)
0.05
0.1
0.5
2
5
Concentratie vet (g/L)
Figuur 4.5: De pH en concentratie totaal ammonium stikstof in mmol/L (boven), de SCFA in mmol/L (midden) en de ratios totaal SCFA/TAN na 24 uur incubatie bij 0, 0.05, 0.1, 0.5, 2 en 5 g vet/L (M±SD). De groep vertakte vetzuren is de som van isobutyraat en isovaleraat. De aangeduide significantieniveau’s zijn op basis van totaal SCFA (acetaat, propionaat, butyraat, valeraat, isobutyraat en valeraat), en werden aangeduid met een ∗ (p<0.05) of een o (p<0.001). De totale SCFA/TAN ratios worden ook weergegeven (onder) (M±SD). Links staan de resultaten voor zonnebloemolie, rechts voor kokosolie.
55
RESULTATEN: Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillis reuteri
4.4
De gasdruk werd ook opgemeten, deze bedroeg voor de reeksen met zonnebloemolie ongeveer 60 kPa, en voor de reeksen met kokosolie ongeveer 50 kPa. Er dient te worden opgemerkt dat beide experimenten met een ander inoculum werden uitgevoerd (zie eerder). Gasanalyses werden uitgevoerd om eventuele veranderingen in H2 -druk te detecteren, maar er werden geen verschillen waargenomen door het toevoegen van zonnebloemolie of kokosolie.
4.4
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillis reuteri
De experimenten met Lactobacillus reuteri (protocol 3.3.4) werden uitgevoerd om na te gaan of linolzuur (18:2) een invloed had op de groeicurve (lagfase, groeisnelheid) van deze bacterie. Het eerste experiment werd uitgevoerd in SHIME-medium. De concentratie levende en dode bacteri¨en werd opgemeten met de flowcytometer (procedure 3.5.1). Er was te zien dat de celmembranen duidelijk meer doorlaatbaar werden voor propidium iodide naarmate de concentratie linolzuur groter was. Er werden significant meer dode cellen geteld na 124.5 uur incubatie bij de behandelingen met 200 en 500 mg linolzuur/L (p=0.001 en p=0.002 respectievelijk), terwijl de totale getelde cellen ongeveer gelijk bleven. De zeer lange lagfase (± 100 uur) was opvallend in dit experiment (figuur 4.6). Linolzuur heeft geen merkbaar effect op de groei (lagfase, groeisnelheid) van deze bacteri¨en.
Dood
Totaal
6e+08
0 mg/L 20 mg/L 50 mg/L 200 mg/L 500 mg/L
Cellen/mL
5e+08 4e+08
0 mg/L 20 mg/L 50 mg/L 200 mg/L 500 mg/L
3e+08 2e+08 1e+08 0 0
50
100
150
200
Incubatietijd (uur)
0
50
100
150
200
Incubatietijd (uur)
Figuur 4.6: De dode en totale getelde Lactobacillis reuteri cellen op verschillende tijdstippen bij incubatie in SHIME-medium (M±SD). Deze celconcentraties werden gemeten met een flowcytometer na LIVE/DEAD-kleuring (protocol 3.5.1).
Na 100.5 uur (start exponenti¨ele groeifase), 148.5 uur (vlak na het einde van de exponenti¨ele groei) en na 196.5 uur incubatie werden de SCFA geanalyseerd. Er was enkel acetaat aanwezig in de stalen. Hogere linolzuurconcentraties gaven geen aanleiding tot significante verschillen in acetaatproductie (tabel 4.5). 56
RESULTATEN: Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillis reuteri
4.4
Tabel 4.5: De acetaat-concentraties (mmol/L) na 100.5, 148.5 en 196.5 uur incubatie van Lactobacillus reuteri in SHIME-medium met 0, 20, 50, 200 en 500 mg linolzuur/L (M±SD). Linolzuur (mg/L) 0 20 50 200 500
Acetaat-concentratie (mmol/L) 100.5 uur 148.5 uur 196.5 uur 0 54.8±1.0 53.6±0.8 0 56.2±0.7 50.0±4.4 0 54.5±0.5 53.4±1.1 0 54.0±1.9 52.0±0.8 0 53.4±1.8 52.3±0.4
Hetzelfde experiment werd uitgevoerd in MRS-medium als incubatiemedium (figuur 4.7). Dezelfde trend werd waargenomen: een grotere getelde concentratie dode cellen naarmate er meer linolzuur wordt toegevoegd (p=0.016 en p=0.003 voor 200 en 500 mg linolzuur/L respectievelijk). Deze trend is vooral uitgesproken in de beginfase. De totale concentratie cellen lag in de eerste helft van de incubatie (0 tot 45 uur) zelfs hoger bij de hoogste concentratie linolzuur (500 mg linolzuur/L) dan bij de controle (p=0.01).
Dood
Totaal
1.4e+10
0 mg/L 20 mg/L 50 mg/L 200 mg/L 500 mg/L
1.2e+10
Cellen/mL
1e+10 8e+09 6e+09 4e+09 2e+09 0 0
20
40
60
80
100
Incubatietijd (uur)
0
20
40
60
80
100
Incubatietijd (uur)
Figuur 4.7: De dode en totale getelde Lactobacillis reuteri cellen op verschillende tijdstippen bij incubatie in MRS-medium (M±SD). Deze celconcentraties werden gemeten met een flowcytometer na LIVE/DEAD-kleuring (protocol 3.5.1).
57
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 1
4.5
4.5
Aanrijking van de colonmicrobiota 1
Een controle en een behandeling met 0.5 g zonnebloemolie/L met elk 2 herhalingen werden gedurende 6 dagen aangerijkt in penicillineflesjes (protocol 3.3.5). Het doel was om na te gaan of de samenstelling van de darmmicrobiota in vitro be¨ınvloed wordt door de aanwezigheid van zonnebloemolie. Na DNA-extractie van de stalen v´oo´r incubatie (dag 0) en na afloop van het experiment (dag 6) werd er een algemene 16S PCR uitgevoerd op het onverdunde DNA-extract. Dit PCR-product werd vervolgens op een DGGE gezet die verder verwerkt werd met Bionumerics (figuur 4.8). Na 5 keer overenten bleef er nog 3% van de initi¨ele ge¨ıncubeerde suspensie (de suspensie waaraan het inoculum werd toegevoegd) aanwezig. De inoculumconcentratie van deze initi¨ele ge¨ıncubeerde suspensie bedroeg 2%, waardoor de inoculum op dag 6 slechts 0.062% van het incubatiemedium uitmaakte. Er kon met de software geen verschil worden gevonden tussen de DGGE-profielen van de controlestalen en de stalen met zonnebloemolie, dit zowel op dag 0 en na 6 dagen overenting. De twee controlestalen en de twee behandelde stalen (met zonnebloemolie) zijn 96% identiek op dag 0, en 94% identiek na 6 dagen incubatie (figuur 4.8). De similariteit tussen de stalen op dag 0 en dag 6 was 53%.
Figuur 4.8: De DGGE-profielen van het 16S PCR-product op het DNA-extract van de stalen na 0 uur (start experiment) en na 6 dagen incubatie (na 5 overentingen). De DGGE-profielen werd verwerkt met Bionumerics, en voor de clusteringsanalyse werd gebruik gemaakt van het clusteralgorithme van Ward en de Pearson correlatie co¨efficienten.
Na 1 en 6 dagen (5 overentingen) werden de SCFA en de TAN-analyses uitgevoerd (figuur 4.9). De totale SCFA lag hoger als er zonnebloemolie werd toegevoegd, maar dit verschil was niet statistisch significant (p=0.100 na 1 dag en p=0.100 na 6 dagen). Opmerkelijk is de hoge butyraatproductie na 6 dagen incubatie (tabel 4.6). Ook de pH werd opgemeten op dag 6: deze bedroeg 6.00±0.04 en 5.92±0.04 (M±SD) bij de controle en de zonnebloemoliebehandeling respectievelijk. 58
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 2
Dag 1
4.6
Dag 6
Dag 1
Dag 6
120 30 100
mmol/L
mmol/L
80 60 Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
40 20 0
le
ro nt Co
10
TAN
nn
Zo
0
le
m
e lo eb
20
C
o tr on
n
n Zo
e
l ro nt o C
em lo eb
lo
b ne
n
Zo
em
le
ro nt Co
n
Zo
b ne
lo
em
Figuur 4.9: De SCFA en TAN-productie na 1 en 6 dagen incubatie bij de controle en de behandeling met 0.5 g zonnebloemolie/L (M±SD). De groep vertakte SCFA is de som van isobutyraat en isovaleraat.
Tabel 4.6: De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1 en 6 dagen incubatie in SHIMEmedium bij de controle en de behandeling met 0.5 g zonnebloemolie/L.
Reeks Controle Zonnebloemolie
4.6
Dag 1 60:14:26 59:15:26
Dag 6 45:15:40 47:14:39
Aanrijking van de colonmicrobiota 2
De vetconcentratie werd verdubbeld tot 1 g/L, en de aanrijkingstijd werd verlengd tot 15 dagen. Deze twee aanpassingen werden doorgevoerd in navolging van de resultaten van experiment 4.5. Er werden in dit experiment ook meerdere vetten getest (protocol 3.3.6). Op dag 15 (14 maal overge¨ent) werden verdunningsreeksen aangemaakt van de verschillende reeksen, vervolgens werden deze uitgeplaat op selectieve cultuurmedia en ge¨ıncubeerd onder specifieke omstandigheden. De toevoeging van 1 g/L vet zorgde voor een daling in Lactobacilli en Clostridia (figuur 4.10). Deze daling was het meest uitgesproken bij het toevoegen van zonnebloemolie. Desalniettemin bleven de verschillen niet statistisch significant. Voor de totale ana¨eroben, Bifidobacteria, Enterococcen en Coliformen werden geen verschillen waargenomen.
59
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 2
4.6
Ana¨ eroob kiemgetal
Bifidobacteria 1e+09
CFU/mL
CFU/mL
1e+09
1e+08
1e+07
1e+08
1e+07
le el ie ie er m olie ol ro uz Bot ijfol oe s t e is o n bl l R V k o e o O n C n K Zo
Enterococcen
Coliformen 1e+09
CFU/mL
CFU/mL
1e+09
1e+08
1e+07
1e+08
1e+07
l e e lie uze oter olie ol em soli so tr lo jf e i B i o n b l R V k e O Co Ko nn Zo
l e e lie uze oter olie ol em soli so tr lo jf e i B i o n b l R V k e O Co Ko nn Zo
Clostridia 1e+06
1e+05
1e+05
CFU/mL
CFU/mL
Lactobacilli 1e+06
1e+04
1000
le el ie ie er m olie ol ro uz Bot ijfol oe s t e is o n bl l R V k o e o O n C n K Zo
1e+04
1000
l e lie uze oter olie em soli so t lo jf e i B i o n b l R V k e O Co Ko nn Zo e
l ro
l e e lie uze oter olie ol em soli so tr lo jf e i B i o n b l R V k e O Co Ko nn Zo
Figuur 4.10: Resultaten van de uitplatingen op selectieve cultuurmedia van de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie) na 15 dagen incubatie in SHIME-medium (M±SD).
60
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 2
4.6
De concentratie TAN en SCFA werd op verschillende tijdstippen geanalyseerd (figuur 4.11). Op dag 0 werd het inoculum toegevoegd en de incubatie bij 37 gestart. Op dag 1 (na 24 uur incubatie) werd voor de eerste maal overge¨ent, en voor de eerste maal stalen genomen voor analyse.
Dag 1
Dag 10
Dag 15
120 100
mmol/L
80 60 40 20
Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
0
mmol/L
30 20 10
TAN 0
r ie m lie le ie el e o ro ol z te ol nt kos Reu Bo lijf eblo Vis o O nn C Ko Zo
r ie m lie le ie el e o ro ol z te ol nt kos Reu Bo lijf eblo Vis o O nn C Ko Zo
r ie m lie le ie el e o ro ol z te ol nt kos Reu Bo lijf eblo Vis o O nn C Ko Zo
Figuur 4.11: Resultaten van de SCFA- en TAN-analyses van de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie) na 1, 10 en 15 dagen incubatie in SHIME-medium (M±SD).
Acetaat en butyraat vertoonden globaal een dalende trend in de tijd. Als er zonnebloemolie werd toegediend steeg de acetaat- en propionaatproductie ten opzichte van de andere vetten en de controle na 15 dagen incubatie. Deze stijging ging vooral ten koste van butyraat. De butyraatproductie daalde minder in de tijd dan de controle en de andere behandelingen als er visolie werd toegediend (tabel 4.7). De butyraat- en TAN-profielen waren zeer gelijkaardig. Bij het eerste aanrijkingsexperiment (experiment 4.5) werd op dag 6 een hoge butyraatproductie waargenomen, dit bleek ook het geval te zijn in de controle van het tweede aanrijkingsexperiment. De verhoudingen van de belangrijkste vetzuren werden ook voor dit experiment berekend (tabel 4.7). Na dag 1 waren er nog geen verschillen waar te nemen tussen de verschillende reeksen, na 15 dagen waren er wel verschillen waar te nemen wanneer zonnebloem- of visolie werd toegediend. Visolie zorgde voor een stijging in de butyraatproducte ten koste van acetaat. Bij zonnebloemolie daarentegen stegen acetaat en propionaat ten koste van butyraat.
61
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
Een ANOVA op dag 1 en dag 10 leverde geen significante verschillen op. Uit de ANOVA op dag 15 kwam naar voor dat zowel propionaat, butyraat als valeraat verschillen vertoonden. De varianties waren hier ongelijk (p<0.05 in Levene’s test) zodat met Dunnet’s T3 test verder gewerkt werd. Met deze test konden de verschillen echter niet worden opgespoord (p>0.05). Tabel 4.7: De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1, 6, 10 en 15 dagen incubatie in SHIME-medium bij de controle en de behandelingen (1 g/L kokosolie, reuzel, boter, olijfolie, zonnebloemolie en visolie).
Reeks Controle Kokosolie Reuzel Boter Olijfolie Zonnebloem Visolie
Dag 1 60:14:26 59:14:27 59:14:27 59:14:27 59:14:27 59:14:27 59:14:27
Dag 6 44:15:41 -
Dag 10 56:24:20 56:23:20 56:23:20 56:24:20 57:24:20 57:23:20 54:22:24
Dag 15 51:24:25 52:27:21 50:26:24 51:25:24 52:25:23 55:28:17 46:24:30
De pH werd ook opgemeten: er waren geen verschillen merkbaar tussen de pH van de verschillende reeksen. De pH bedroeg 5.80±0.06 (21) op dag 1 en 5.61±0.16 (21) op dag 15. Gasanalyses werden uitgevoerd op dag 10, de waterstofgasdruk was voor alle reeksen ongeveer gelijk aan de controle (4.60±0.19), enkel olijfolie had een significant lagere waterstofgasdruk (3.57±0.38) dan de controlereeks (p=0.026).
4.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 3
Een derde aanrijkingsexperiment werd parallel uitgevoerd (zelfde inoculum) in twee verschillende cultuurmedia: SHIME-medium en MCB-medium (protocol 3.3.7). Na 11 dagen incubatie voor de reeksen in SHIME-medium, en na 13 dagen incubatie voor de reeksen in MCB-medium werden verdunningsreeksen aangemaakt van de verschillende stalen. Deze werden vervolgens uitgeplaat op selectieve cultuurmedia. De aantallen Bifidobacteria stegen licht als er zonnebloemolie of lijnzaadolie werd toegevoegd aan SHIME-medium als incubatiemedium (figuur 4.12). Het omgekeerde effect was waar te nemen als er in MCB-medium ge¨ıncubeerd werd met deze twee vetten. De Coliformen volgden deze trends in beide media, maar de trends waren minder uitgesproken. Enterococcen konden niet geteld worden wanneer er ge¨ıncubeerd werd in SHIME-medium. Het toevoegen van vetten had een licht positief effect op Enterococcen in MCB-medium. De platen om Clostridia te tellen gaven geen goede resultaten, en werden niet geteld. Lactobacilli waren niet aanwezig, er werden geen kolonies waargenomen bij de laagste verdunning (10-1). Een verschil dat zeer uitgesproken was tussen deze twee cultuurmedia was de waterstofdruk. Deze was beneden de detectielimiet voor het MCB-medium op dagen 1 en 7, maar steeg tot 62
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
0.47±0.18% v/v na 12 dagen incubatie (M±SD). Bij de incubaties in SHIME-medium lag de waterstofdruk een heel stuk hoger: 3.84±0.15% v/v na 1 dag incubatie, en steeg nog in de tijd tot 4.57±0.66% v/v na 12 dagen incubatie (M±SD).
Ana¨ eroob kiemgetal
Bifidobacteria
1e+10
1e+09
SHIME MCB
CFU/mL
CFU/mL
SHIME MCB 1e+09
1e+08
o nc la
B
el
z eu R
1e+07
lie jfo
li
m oe
bl
ne on
O
1e+08
L
ie ol ijn
o
nc
a Bl
l
eu R
ze
lie
fo
lij
O
ie
jn Li
ol
Coliformen
1e+08
1e+09
SHIME MCB
CFU/mL
MCB
CFU/mL
em
n
Zo
Z
Enterococcen
lo
b ne
1e+07
1e+06 co an
Bl
el
R
1e+07
ie
z eu
ie
m
ol ijf
l
O
1e+08
Zo
nn
e lo eb
L
l
o
c an Bl
ol ijn
ze
R
lie
fo
eu
O
lij
Zo
lo
n
b ne
em
jn Li
ie ol
Figuur 4.12: Resultaten van de uitplatingen op selectieve cultuurmedia van de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 11 dagen incubatie voor de incubaties in SHIME-medium en na 13 dagen voor de incubaties in MCB-medium (M±SD).
Het verschil in de SCFA- en TAN-productie tussen de cultuurmedia was opmerkelijk. In het MCB-medium zijn de waarden voor SCFA en TAN veel hoger dan in SHIME-medium. De SCFAen TAN-waarden bij de incubaties in SHIME-medium wijkten ook sterk af van deze bekomen in de vorige experimenten met SHIME-medium (experiment 4.5 en 4.6). De verschillende vetten bleken kleine veranderingen te induceren in de SCFA-productie (figuur 4.13). De algemene trend was een stijging van de SCFA in SHIME-medium naarmate er een meer onverzadigd vet werd toegediend. Tevens daalde de totale SCFA in de tijd. In MCB-medium ware deze twee trends net omgekeerd.
63
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
Dag 1 (SHIME)
Dag 7 (SHIME)
4.7
Dag 12 (SHIME)
80
mmol/L
60
40 Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
20
0
mmol/L
30 20 10
TAN 0
l e e lie ol uze em oli tr d jfo blo e n i a l R O a e Co nn ijnz L Zo
Dag 1 (MCB)
l e e lie ol uze em oli tr d jfo blo e n i a l R O a e Co nn ijnz L Zo
Dag 7 (MCB)
l e e lie ol uze em oli tr d jfo blo e n i a l R O a e Co nn ijnz L Zo
Dag 12 (MCB)
140 120
mmol/L
100 80 60 Vertakt Valeraat Butyraat Propionaat Acetaat
40 20 0
mmol/L
80 60 40 20
TAN
0
e ol
C
tr on
l e lie ze em oli d eu lijfo blo a R O a e nn ijnz L Zo
l e m lie lie ol uze fo bloe ado tr j e n i R Ol a e Co nn ijnz L Zo
l e m lie lie ol uze fo bloe ado tr j e n i R Ol a e Co nn ijnz L Zo
Figuur 4.13: Resultaten van de SCFA- en TAN-analyses van de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 1, 7 en 12 dagen incubatie in SHIMEmedium (boven) en in MCB-medium (onder) (M±SD).
64
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
De TAN was sterk verschillend tussen de twee gebruikte cultuurmedia, maar veranderde niet als er verschillende vetten worden toegevoegd. Ook in de tijd bleef de productie van TAN zeer stabiel zowel in SHIME- als in MCB-medium (figuur 4.13). Ook hier werden de verhoudingen van de belangrijkste vetzuren berekend (tabel 4.8). Er bleek zo goed als geen verandering op te treden in deze verhoudingen als er vet werd toegevoegd aan het incubatiemedium. Na 13 dagen incubatie werd eveneens de pH opgemeten zowel voor de reeksen in SHIME- als in MCB-medium. De pH van de controlereeks in het MCB-medium lag duidelijk hoger (6.56±0.06) dan de pH van de controlereeks in het SHIME-medium (6.06±0.03), dit verschil in pH tussen de twee controlereeksen was significant (p<0.001). Tabel 4.8: De verhoudingen van de drie belangrijkste vetzuren acetaat:propionaat:butyraat (berekend op mmol/L-basis en afgerond tot gehele getallen) na 1, 7 en 12 dagen incubatie in SHIMEen MCB-medium bij de controle en de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie).
Medium SHIME
MCB
Reeks Controle Reuzel Olijfolie Zonnebloemolie Lijnzaadolie Controle Reuzel Olijfolie Zonnebloemolie Lijnzaadolie
Dag 1 49:25:27 50:25:26 52:24:24 53:24:23 53:24:24 58:14:28 58:14:28 58:14:28 58:14:28 58:14:28
Dag 7 51:34:15 50:35:15 50:35:16 49:35:15 50:34:16 62:11:27 63:12:25 63:12:25 64:12:24 64:12:25
Dag 12 51:35:14 51:34:15 51:35:15 51:35:15 51:35:14 66:12:22 64:14:22 65:13:21 64:14:22 65:13:22
De ANOVA op van de SHIME-incubaties na 1 dat incubatie gaf aan dat er voor acetaat, propionaat, isovaleraat en valeraat statistisch significante verschillen te detecteren waren. De eerste 2 reeksen (controle en reuzelbehandeling) vertoonden statistisch significante verschillen met de 3 laatste reeksen (olijfolie-, zonnebloem-, en lijnoliebehandeling). Binnen deze twee groepen was er geen verschil. Voor de incubaties met MCB-medium na 1 dag incubatie bleken alle SCFA verschillen te vertonen tussen de reeksen (p≥0.02). Met Tuckey’s test kwam naar voor dat de SCFA in de eerste 3 reeksen (controle, reuzel en olijfolie) significante verschillen te vertonen ten opzichte van de 2 laatste reeksen (zonnebloemolie en lijnzaadolie). Binnen deze 2 groepen was er opnieuw geen statistisch significant verschil detecteerbaar. Na 12 dagen incubatie in SHIME-medium werden er via een ANOVA statistisch significante verschillen gevonden voor acetaat, butyraat en totale SCFA. Volgens Tuckey’s test vertoonden de 3 eerste behandelingen (controle, reuzel en olijfolie) statistisch significante verschillen met de 2 laatste behandelingen (zonnebloemolie en lijnzaadolie). Binnen deze 2 groepen was er geen statistisch significant verschil detecteerbaar. Voor de incubaties met MCB-medium na 12 dagen 65
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
konden er met een ANOVA geen verschillen worden gedetecteerd tussen de reeksen. Na 12 dagen werden de LCFA geanalyseerd. Aangezien er telkens werd overge¨ent, werd er ook een deel van het vet in het incubatiemedium mee overgebracht. Hierdoor was de exacte hoeveelheid toegevoegd vet in een flesje moeilijk te weten. Ook bevatten de media zelf nog een hoeveelheid vet (tabel 4.9). Er werd verondersteld dat het vet dat aanwezig was in de controlereeksen, ook sowieso aanwezig was in de behandelingen. Daarom werd voor beide media verder gewerkt met de relatieve vetzuurconcentraties na vermindering van de absolute waarden met de absolute waarden van de controles. Dit was noodzakelijk omdat toch een redelijk groot deel van de aanwezige vetzuren afkomstig waren van het medium zelf (14.81±3.05% en 36.09±6.05% w/w voor het SHIME- en het MCB-medium respectievelijk). Tabel 4.9: De vetconcentraties in de incubatiemedia na 12 dagen incubatie van de controle en de behandelingen in SHIME- en MCB-medium (M±SD). Medium SHIME MCB
Vetconcentratie (mg vet/mL) Controles Behandelingen 0.109±0.001 0.739±0.152 0.396±0.037 1.097±0.152
De LCFA-profielen van de stalen die ge¨ıncubeerd werden met een bepaald vet waren zo goed als identiek aan het profiel van het vetzuur dat werd toegevoegd (figuur 4.14). In het SHIME-medium kon zelfs totaal geen CLA worden gedetecteerd, en de concentratie CLA in het MCB-medium was volledig afkomstig van het MCB-medium zelf.
66
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
% van totaal C18 (18:0, 18:1, 18:2 en 18:3) 20
40
60
80
100
SHIME
MCB
Reuzel Olijfolie
SHIME
Zonnebloem
Vet SHIME
SHIME
Lijnzaadolie
Controles
0
SHIME
MCB
Vet
MCB
Vet
18:0 Cis-9 18:1 Andere 18:1 n-6 18:2 CLA n-3 18:3
MCB
Vet
MCB 0
20
40
60
80
100
% van totaal C18 (18:0, 18:1, 18:2 en 18:3) Figuur 4.14: De LCFA-analyses van de vetten gebruikt in de behandelingen (reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) en van de incubatiemedia van de behandelingen (1 g/L reuzel, olijfolie, zonnebloemolie en lijnzaadolie) na 12 dagen incubatie in SHIME- en MCBmedium (M±SD).
Na 12 dagen incubatie werd het DNA ge¨extraheerd, waarna een algemene 16S-PCR werd uitgevoerd op 100 keer verdund DNA-extract. De DGGE-profielen die bekomen werden (figuur 4.15) bleken geen verschillen te geven tussen de verschillende behandelingen en de controle waardoor de verwerking via Bionumerics niet werd uitgevoerd.
67
RESULTATEN: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
4.7
S1 S2 S3 C1 C2 C3 R1 R2 R3 O1 O2 O3 Z1 Z2 Z3 L1 L2 L3
M1 M2 M3
C1 C2 C3
R1 R2 R3
O1 O2 O3
Z1 Z2 Z3
L1 L2 L3
Figuur 4.15: De DGGE-profielen van de incubaties in SHIME-medium (boven) en MCB-medium (onder). De S en M zijn de stalen op tijdstip 0 (3 herhalingen). C = Controle, R = Reuzel, O = Olijfolie, Z = Zonnebloemolie en L = Lijnzaadolie na 12 dagen incubatie.
68
Hoofdstuk 5
Discussie 5.1
Inleiding
Biohydrogenatie is het proces waarbij bacteri¨en onverzadigde vetzuren omzetten tot hun meer verzadigde homologen (inleiding 1.7.2). Dit proces is reeds uitvoerig onderzocht in rumenbacteri¨en van schapen en koeien [Jenkins et al., 2008; Polan et al., 1964]. Recent werd aangetoond dat deze biohydrogenatieprocessen ook wordt uitgevoerd door humane colonmicrobiota (inleiding 1.7.2). De biohydrogenatie van linolzuur start meestal met de isomerisatie van een cis- naar een transisomeer van een dubbele binding. De productie van het trans-10, cis-12 CLA-isomeer lijkt te verlopen via een typisch isomerase-enzyme zonder proton-uitwisseling met water [Liavonchanka et al., 2006; McIntosh et al., 2009; Wallace et al., 2007]. De vorming van het cis-9, trans11 CLA-isomeer uit LA is tot op heden niet opgehelderd, maar dit mechanisme zou wel verlopen via proton-uitwisseling met water [McIntosh et al., 2009; Wallace et al., 2007]. De biohydrogenatie kan ook starten met de omzetting van LA naar 10-OH 18:1 (Roseburia spp.), wat vervolgens door andere micro-organismen kan omgezet worden tot cis-9, trans-11 CLA-isomeer (figuur 1.12). Het type CLA-isomeer dat gevormd wordt is belangrijk voor de gezondheid van de gastheer. De vorming van cis-9, trans-11 CLA uit LA in het colon is voordelig voor de gastheer (inleiding 1.4.3), terwijl de vorming van trans-10, cis-12-isomeer eerder schadelijk zou zijn [Kritchevsky, 2000; Pariza, 2004; Ris´ erus et al., 2002a; Ris´ erus et al., 2002b]. Een vraag die hier kan gesteld worden is of het misschien mogelijk is dat isomerisatie van linolzuur tot het “slechte” trans-10, cis-12 een rol speelt bij de ontwikkeling van darmaandoeningen zoals ulceratieve colitis. Het blijkt namelijk zo te zijn dat een hogere inname van linolzuur via de voeding geassocieerd is met een grotere kans op ontwikkeling van ulceratieve colitis (95% CI=1.04 tot 1.66, p=0.02 voor de trend) [Tjonneland et al., 2009]. Na de isomerisatie volgt de hydrogenatie (de reductie) van de dubbele binding in het vetzuur door een stereospecifiek reductase-enzym. Het benodigde waterstof voor deze reactie bestaat uit een proton en een hydride-ion dat aangebracht wordt door een carrier [Rosenfeld en Tove, 1971]. Deze carrier kan NADH of een andere endogene elektronendonor zijn [Hunter et al., 1976]. De meeste informatie over deze processen werd verkregen door onderzoek naar de biohydrogenatie van linolzuur door rumenbacteri¨en. Er werd vastgesteld dat voornamelijk bacteri¨en behorende tot het genus Butyrivibrio betrokken zijn bij de biohydrogenatie van LA [Fujimoto et al., 1993]. 69
DISCUSSIE: Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol
5.2
Deze organismen metaboliseren LA tot CLA en VA, maar zetten het VA niet verder om tot SA [Devillard et al., 2007]. Butyrivibrio fibrisolvens werd gedetecteerd in de colonmicrobiota van de mens [Montgomery, 1988; Rumney et al., 1995], waardoor het waarschijnlijk is dat dit organisme ook in het humane colon betrokken is bij de biohydrogenatieprocessen. Een stam van Butyrivibrio fibrisolvens die ge¨ısoleerd werd uit menselijk fecaal materiaal bleek een zeer hoge activiteit te bezitten voor omzetting van linolzuur tot CLA. Hierbij werd zo goed als 100% van het toegevoegde linolzuur (0.05 g/L) omgezet, het belangrijkste product was trans-11 18:1 [Devillard et al., 2007]. Opgemerkt moet worden dat de lagfase wel 24 uur bedroeg bij het toevoegen van linolzuur ten opzichte van de controle. Volgens Devillard et al., 2007 worden ook nog andere species aangetroffen in het humane colon die LA kunnen metaboliseren. Deze zijn onder andere Propionibacterium freudenreichii (Actinobacteria), Bifidobacterium breve (Actinobacteria), Roseburia inulinovorans (Clostridium cluster XIVa) en Roseburia hominis (Clostridium cluster XIVa). Geen van deze bacteri¨en produceert echter stearinezuur. De zoektocht naar micro-organismen die stearinezuur produceren verloopt erg moeizaam. Dit komt omdat deze bacteri¨en veel gevoeliger zouden zijn aan de toxische effecten van de onverzadigde vetzuren [John Wallace et al., 2006; Maia et al., 2007a]. In de humane colonmicrobiota zijn er nog geen bacteri¨en ge¨ıdentificeerd die stearinezuur produceren uit linolzuur, terwijl dit toch wordt geproduceerd bij incubatie van linolzuur met humane fecale microbiota [Devillard et al., 2007; Howard en Henderson, 1999].
5.2
Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol
In dit eerste experiment werd een controle, een behandeling met vetzuur en een behandeling met vetzuur+glycerol opgenomen. Dit was een eerste experiment om na te gaan of biohydrogenatie in deze omstandigheden doorging. De behandeling met vetzuur+glycerol werd opgenomen om na te gaan of glycerol een effect heeft op de biohydrogenatie van de vrije vetzuren. Vetzuren die in het colon toekomen, kunnen nog aanwezig zijn als glyceriden, en de colonmicrobiota zal deze glyceriden splitsen in glycerol en vrij vetzuur. Het is bekend dat sommige darmbacteri¨en (bijvoorbeeld Lactobacillus reuteri ) glycerol kunnen omzetten tot antibacteri¨ele stoffen (zoals reuterine) [Talarico et al., 1988] die toxisch zijn voor bepaalde bacteri¨en. Er kon worden waargenomen dat er een beperkte isomerisatie van LA tot CLA optrad (tabel 4.1). Deze isomerisatie vond enkel plaats in de behandelingen, en niet in de controle. Er was geen verschil waarneembaar tussen de CLA-concentraties van de behandeling met vetzuur en de behandeling met vetzuur+glycerol na 4 en 24 uur. De isomerisatie ging slechts door tot een concentratie van 0.141 g/L. Mogelijks zorgde de accumulatie van CLA voor productinhibitie van de isomerisatiestap. Het hydrogenatieproces van CLA tot meer verzadigde vetzuren gaat hier echter niet door, mogelijks omdat bacteri¨en die deze reacties uitvoerden afgedood of ge¨ınhibeerd werden door de hoge concentratie linolzuur. De concentratie CLA in dit experiment was namelijk een stuk hoger dan de evenwichtsconcentratie van CLA bij de incubaties met niet-methanogeen inoculum in experiment 4.2 (zelfe donor, andere staalname) (±0.035 g/L). Bovendien was de vetbelasting 250 mg linolzuur/g inoculum, wat al een stuk hoger is dan de vetbelastingen in andere studies. De productie van CLA is echter onvoldoende om de verdwijning van linolzuur
70
DISCUSSIE: Biohydrogenatie van linolzuur en de invloed van glycerol
5.3
te verklaren. Mogelijks werd een deel van het linolzuur omgezet tot vetzuren die niet werden gedetecteerd met de gebruikte analysemethode (procedure 3.4.6). In het humane colon werden namelijk al heel wat ana¨erobe en facultatief ana¨erobe organismen ge¨ıdentificeerd die linolzuur konden omzetten tot 10-hydroxy 18:1, maar die geen biohydrogenatie uitvoerden [Devillard et al., 2007; Fujimoto et al., 1993; Pearson en Jones, 1973]. In de controlereeks veranderde het vetzuurprofiel niet in de tijd, dit kan er op wijzen dat alle vetzuren ge¨ıncorporeerd waren in celmembranen waardoor ze niet toegankelijk waren voor de biohydrogenatie-enzymen. Dit werd ook eerder geobserveerd [Demeyer et al., 1978; Howard en Henderson, 1999]. Dit experiment werd uitgevoerd in aanwezigheid van 10 g/L haverzemelen (Ekoland, Harderwijk, Nederland). De keuze voor haverzemelen werd gemaakt omdat dit een zeer vezelrijk product is, en dit is wat er typisch in het colon binnenkomt. Bij nader inzien bleek deze keuze toch niet zo bijzonder geschikt. Een eerste probleem was dat deze haverzemelen nog zeer veel vetten bevatten (tabel 3.3). Hierdoor werd het moeilijker om de behandelingen (toevoegen van vetzuur of vetzuur+glycerol) te vergelijken met de controle omdat ook in de controle onverzadigd vet werd toegevoegd. Een tweede probleem was de hardheid van de zemelen, hierdoor was het moeilijk om kleine hoeveelheden haverzemelen kwantitatief af te wegen. Waarschijnlijk was deze hardheid ook niet optimaal voor de beschikbaarheid van de haverzemelen voor gebruik door de microbiota. Een derde probleem dat ondervonden werd tijdens het experiment was dat de waarden voor de TAN- en SCFA-analyses te variabel waren wat wellicht te maken had met partikelige aard van de zemelen waardoor eerder vermelde problemen aanleiding gaven tot grote variatie tussen de stalen. Om deze redenen werd voor volgende experimenten gekozen voor een andere voedingsbron (SHIME-medium). Het biohydrogenatieproces gaat echter ook door als er geen extra voedingsbron aanwezig is [Devillard et al., 2009]. Dit kan de interpretatie en vergelijking tussen verschillende experimenten gemakkelijker maken. Er werd toch geopteerd om verder te werken met een voedingsmedium, omdat bacteri¨en in stationaire fase veel minder actief blijken te zijn in het biohydrogenatieproces dan groeiende cellen [Chaudhary et al., 2004].
Conclusies: 1. De eerste stap van het biohydrogenatieproces, de isomerisatie is doorgegaan tot een bepaalde waarde werd bereikt. De verdere hydrogenatie is in dit experiment niet merkbaar doorgegaan. Wellicht was dit te wijten aan een te hoge vetbelasting van de bacteri¨en. 2. Als er al hydrogenatie tot 18:1 of 18:0 was opgetreden, dan was dit niet op te maken uit de resultaten omdat de variabiliteit van de resultaten te groot was. De oorzaak van deze grote variabiliteit lag waarschijnlijk bij de haverzemelen, dit is geen geschikte voedingsbron voor verdere biohydrogenatie-experimenten.
71
DISCUSSIE: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
5.3
5.3
Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
In het biohydrogenatieproces zijn er vele verschillende pathways mogelijk die elkaar niet uitsluiten (figuur 5.1) [Chilliard et al., 2007; McIntosh et al., 2009]. In dit eindwerk werd nagegaan of de waterstofdruk een invloed heeft op deze biohydrogenatieprocessen. Dit werd bewerkstelligd door te werken met 1) de aan- of afwezigheid van waterslotjes (om headspace ana¨eroob onder atmosfeerdruk te houden), 2) verschillende concentraties inoculum, en 3) door twee types inocula te gebruiken: methanogeen en een niet-methanogeen inoculum (protocol 1.6.3).
Figuur 5.1: De verschillende biohydrogenatiepathways van linolzuur [Chilliard et al., 2007].
Isomerisatie van linolzuur In dit experiment was een hoge waterstofdruk gekoppeld aan een lagere relatieve productie van cis-9, trans-11 CLA-isomeer, en omgekeerd. Dit wijst erop dat de waterstofdruk geen beperkende factor is bij de isomerisatie van LA tot cis-9, trans-11 CLA-isomeer. Er was waarschijnlijk wel een verband tussen de waterstofdruk en de absolute concentraties trans 18:1 en trans 18:2 die gevormd werden (beiden tussenproducten van de biohydrogenatie). Een hogere waterstofdruk leidde tot lagere concentraties trans 18:1 en vooral veel lagere concentraties trans 18:2 (merk op dat de relatieve concentraties wel gelijkaardig bleven tussen beide inocula, figuur 4.2). Wellicht is dit een effect van het principe van Le Chˆatelier. Dit principe stelt dat als er in een chemisch systeem een evenwichtsverandering optreedt, dat het evenwicht zich zal verschuiven zodanig dat die verandering tenietgedaan wordt. Uiteindelijk evolueert het systeem dan naar een nieuw evenwicht. In McIntosh et al., 2009 werd gesteld dat het trans-10, cis-12-CLA isomeer slechts in kleine hoeveelheden wordt geproduceerd tijdens het biohydrogenatieproces. In dit experiment is echter te zien dat de geproduceerde hoeveelheid van dit isomeer afhankelijk is van het inoculumtype, en 72
DISCUSSIE: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
5.3
van de vetbelasting van de bacteri¨en (figuur 4.3). Vooral bij een hoge vetbelasting (25 mg LA/g inoculum) werd er proportioneel veel van dit vetzuur geproduceerd. In McIntosh et al., 2009 werd ook gesteld dat het cis-9, trans-11 CLA de belangrijkste component zou zijn van het totale CLA, maar ook dit strookt niet met de resultaten van dit experiment. Het aandeel cis-9, trans-11 CLA is opnieuw afhankelijk van het inoculumtype en van de vetbelasting. Bij 10% inoculum was de relatieve concentratie van het trans-10, cis 12 CLA-isomeer in beide inocula groter dan de relatieve concentratie cis-9, trans-11 CLA-isomeer (figuur 4.3).
Het evenwicht van het biohydrogenatieproces Naarmate de inoculumconcentratie steeg was de vetbelasting van de bacteri¨en lager (tabel 4.2), en ging de biohydrogenatiereactie completer door. Dit was af te leiden uit de verhoudingen van de verschillende biohydrogenatiesubstraten en -producten (LA/trans 18:2/trans 18:1/SA) die naar evenwichtswaarden streefden. Deze werden bereikt bij 15 en 20% inoculum (figuur 4.2). Voor methanogeen inoculum lag deze verhouding LA/trans 18:2/trans 18:1/SA op 10/3/29/59, en voor niet-methanogeen lag deze op 9/4/19/68. De evenwichtsverhouding voor stearinezuur lag hoger in het methanogeen inoculum, en dit ging vooral ten koste van vacceenzuur. De biohydrogenatiereactie gaat dus meer compleet door bij het methanogene inoculum. Naarmate de inoculumconcentratie hoger was daalden de absolute en relatieve concentraties linolzuur na 24 uur incubatie, vanaf 20% inoculum leek er echter terug een stijging van de concentratie linolzuur plaats te vinden (zowel in absolute als relatieve concentraties) (figuur 4.2). De hypothese die werd voorgesteld om dit fenomeen te verklaren stelde dat de biohydrogenerende micro-organismen pas enzymen voor biohydrogenatie zullen aanmaken wanneer de verhouding van linolzuur/totaal C18 voldoende hoog is. Omdat de langeketen vetzuren wateronoplosbaar zijn (tabel 1.1), zijn ze niet homogeen verdeeld in de suspensie, maar komen ze eerder voor als een lipidelaagje rond partikels in het incubatiemedium, rond de bacteri¨en en zelfs als vetdruppeltjes in bacteri¨ele cellen [Bauchart et al., 1990]. Vooral een grote proportie van het linolzuur zou voorkomen in het cytoplasma van bacteri¨en die geassocieerd zijn met partikelig materiaal [Bauchart et al., 1990]. Kortom hoe groter de concentratie inoculum, hoe groter de concentratie andere vetten (uit het inoculum), en hoe lager de verhouding linolzuur/totaal C18. Naarmate deze verhouding linolzuur/totaal C18 daalde, waren de bacteri¨en vermoedelijk minder geneigd om biohydrogenatie-enzymen aan te maken (dit kost immers ook energie). Hierdoor trad er al terug iets minder biohydrogenatie op, met een iets hogere eindconcentratie linolzuur tot gevolg.
Effect van de pH op de isomerisatie Bij biohydrogenatie van onverzadigde vetten door rumenbacteri¨en blijken de concentraties van de verschillende CLA-isomeren afhankelijk te zijn van de pH waarbij werd ge¨ıncubeerd [Choi et al., 2005]. Meer bepaald gaat een lage pH de vorming van trans-10, cis-12 CLA bevorderen, en gaat een hogere pH de vorming van cis-9, trans-11 CLA bevoordeligen. Vermoed werd dat dit komt omdat de micro-organismen die de isomerisatie van LA tot trans-10, cis-12 uitvoeren meer zuurtolerant zijn dan de micro-organismen die de isomerisatie van LA tot cis-9, trans-11 CLA 73
DISCUSSIE: Biohydrogenatie door methanogeen en niet-methanogeen inoculum
5.3
uitvoeren [Choi et al., 2005]. Vele bacteri¨en produceren namelijk vooral ´e´en CLA-isomeer, zo produceert Lactobacillus plantarum en gerelateerde species vooral cis-9, trans-11 CLA [Ogawa et al., 2001], Propionibacterium acnes produceert dan weer enkel trans-10, cis-12 CLA uit LA [Liavonchanka et al., 2006]. De productie van cis-9, trans-11 CLA is dus positief gecorreleerd met de pH, en de productie van trans-10, cis-11 CLA is negatief gecorreleerd met de pH. In dit experiment bleef de pH niet constant, maar daalde deze lichtjes gedurende de incubatie. Deze pH-daling was echter sterker bij het niet-methanogeen inoculum (figuur 4.4). De pH-waarden waren 6.28±0.03 en 6.44±0.02 voor het niet-methanogeen en het methanogeen inoculum respectievelijk. Dit verschil was significant met p=0.039 bij 20% inoculum. De lagere pH bij het niet-methanogeen inoculum (20%) komt in dit experiment inderdaad overeen met een grotere relatieve productie van het trans-10, cis-12 isomeer en een kleinere relatieve productie van het cis-9, trans-11 CLA-isomeer dan bij het methanogeen inoculum. Dit verschil in pH was een interessante observatie. Hoewel een licht dalende trend te verwachten was bij toenemende inoculumconcentratie (vanwege de SCFA en de extra C-bronnen die nog in het inoculum aanwezig waren), daalde de pH sterker bij niet-methanogeen inoculum dan bij methanogeen inoculum. Dit is wel enigzins logisch omdat methanogenese optimaal blijkt door te gaan bij neutrale pH (inleiding 1.6.3) waardoor dit geen sterk zuurvormend inoculum zal zijn. Anderszijds kan deze pH-daling niet verklaard worden met de SCFA-, TAN- en de lactaatproductie. Er treedt dus waarschijnlijk nog productie op van andere zuren die dit pH-effect veroorzaken. Een mogelijkheid is succinaat, maar dit werd niet verder onderzocht.
Oliezuur Met het cis-9 18:1 gebeurt er zo goed als niets, de concentratie van dit vetzuur bij 20% inoculum is dubbel zo hoog als de concentratie bij 10% inoculum, dit geldt zowel voor het methanogeen als het niet-methanogeen inoculum (figuur 4.2). Dit cis-9 18:1 zou door rumenbacteri¨en echter toch direct [Kellens et al., 1986] of via trans 18:1-isomeren [AbuGhazaleh et al., 2005; Mosley et al., 2002; Proell et al., 2002] kunnen worden omgezet tot stearinezuur, maar geen van deze reacties lijkt hier door te gaan.
Conclusies 1. Er werd in dit eindwerk succesvol een protocol opgesteld om de biohydrogenatie van linolzuur door de colonmicrobiota in vitro te bestuderen. 2. Bij een vetbelasting van 2.5 tot 3.3 mg LA/g inoculum lijkt de biohydrogenatiereactie een evenwicht te bereiken na 24 uur incubatie. De colonmicrobiota streven dus naar een bepaald evenwichtsprofiel van de vetzuren bij de biohydrogenatie. Het is niet zo dat de biohydrogenatie blijft doorgaan tot er enkel nog stearinezuur overblijft. 3. De waterstofdruk lijkt slechts een beperkt effect te hebben op de ligging van dit evenwicht.
74
DISCUSSIE: Hypotheses over de biohydrogenatie
5.4
4. Dit evenwichtsprofiel van de verschillende vetzuren is zeer gelijkaardig tussen methanogeen en niet-methanogeen inoculum, maar er zijn wel verschillen tussen de verschillende gevormde isomeren. 5. Het inoculumtype (methanogeen versus niet-methanogeen) en de vetbelasting (mg linolzuur/g inoculum) hebben een effect heeft op de verhouding van de gevormde CLA-isomeren. 6. Het cis-9 18:1 speelt geen rol in het biohydrogenatieproces.
5.4
Hypotheses over de biohydrogenatie
De vraag blijft natuurlijk waarom bacteri¨en onverzadigde vetten gaan biohydrogeneren. Er zijn twee gangbare theori¨en om dit te verklaren. Een eerste theorie stelt dat de bacteri¨en dit uitvoeren om van een overmaat reducerende equivalenten (H2 ) af te zijn [Lennarz, 1966]. Deze reducerende equivalenten, die vrijkomen bij fermentatieprocessen, hinderen bij accumulatie namelijk de verdere fermentatie. Vooral in een competitief ecosysteem kan zelfs een zeer kleine voorsprong op de concurrentie (in dit geval een betere neutralisatie van reducerende equivalenten) een belangrijk verschil maken voor een organisme. Een probleem met deze theorie is dat er per massa vet slechts een beperkte hoeveelheid reducerende equivalenten kan worden verwijderd (0.357 mol H2 per 100 g linolzuur). Een ander probleem is dat bij Butyrivibrio fibrisolvens 0.5% van het totale prote¨ıne in de cel bestaat uit reductase dat CLA omzet tot VA, en dit is toch al een behoorlijke energiekost voor de cel. Dus de vraag hier is of de kosten voor een biohydrogenatiepathway het wel waard zijn voor de cel. De tweede hypothese stelt dat onverzadigde vetzuren toxisch zijn voor bacteri¨en [Kemp en Lander, 1984; Kemp et al., 1984], en dat bacteri¨en de biohydrogenatie uitvoeren als een detoxificatiemechanisme. Om deze toxiciteit te verklaren werden reeds een aantal mechanismen voorgesteld die besproken werden in Desbois en Smith, 2010. Een vaststelling die deze hypothese kracht bij zet is dat verschillende organismen slechts het biohydrogenatieproces uitvoeren tot het bekomen vetzuur niet meer toxisch is voor hen. Butyrivibrio fibrisolvens is gevoelig voor CLA, maar niet voor trans-11 18:1, en zal slechts tot trans-11 18:1 hydrogeneren. Clostridium proteoclasticum is gevoelig voor CLA en voor trans-11 18:1, en zal hydrogeneren tot 18:0 [Wallace et al., 2006]. Tot nu toe is het niet uitgemaakt welke van beide hypotheses de juiste is, maar over het algemeen blijkt de toxiciteitstheorie de voorkeur te genieten. Een alternatieve hypothese die de auteur in dit eindwerk wil voorstellen, is de membraanoptimalisatiehypothese. De goede werking van het bacteri¨ele celmembraan zal namelijk afhangen van de vloeibaarheid van dit membraan, en deze vloeibaarheid zal voor een belangrijk deel afhangen van de vetzuursamenstelling van het membraan (inleiding 1.3.1). Het zal ongunstig zijn voor de groei van de bacteri¨en die het biohydrogenatieproces uitvoeren om in alle omstandigheden de volledige biohydrogenatiepathway uit te voeren op alle beschikbare onverzadigde vetzuren. Zo zou er na verloop van tijd enkel nog stearinezuur in het milieu aanwezig zijn, en dit strookt niet met de observaties. De aanwezigheid van onverzadigde vetzuren is noodzakelijk om een goede vloeibaarheid en selectieve permeabiliteit van een bacterieel celmembraan in stand te houden [Cronan en Gelmann, 1973]. Het is bekend dat micro-organismen in staat zijn om de vetzuursamenstelling van hun 75
DISCUSSIE: Hypotheses over de biohydrogenatie
5.5
celmembraan aan te passen als ze groeien bij andere temperaturen of andere omstandigheden [Mansilla en de Mendoza, 2005]. Dit komt omdat bacteri¨ en hun biosynthesepathways voor de verschillende types vetzuur kunnen regelen zodat ze de membraanlipidesamenstelling precies kunnen aanpassen [Chintalapati et al., 2004; Tasaka et al., 1996; Zhang en Rock, 2008]. Dit proces is ook bekend als homeovisceuze adaptatie [Sinensky, 1974]. Onder andere gebruiken bacteri¨en hiervoor desaturase-enzymen om de endogeen gesynthetiseerde verzadigde vetzuren te dehydrogeneren tot meer onverzadigde vetzuren [Cybulski et al., 2002; Weber et al., 2001]. Bacteri¨en bevatten dus niet enkel de hydrogenatie-enzymen (zoals gebruikt in het biohydrogenatieproces), maar bezitten ook dehydrogenatie-enzymen. Biohydrogenatie van onverzadigde vetzuren kan dus misschien eerder verklaard worden door de strategie die gevolgd wordt door de bacteri¨ele cel om zijn membraanfunctionaliteit optimaal te houden. Bij aanwezigheid van hoge concentraties onverzadigde vetten in het milieu kunnen bacteri¨en hun membraan voldoende verzadigd houden door zelf extra verzadigde vetzuren te produceren (wat natuurlijk energie kost), of door de aanwezige onverzadigde vetzuren te hydrogeneren (wat minder energie kost). Dus bacteri¨en kunnen zelf vetzuren aanmaken of gebruik maken van vetzuren uit de omgeving voor de aanmaak van nieuwe celmembranen. Gebruik van vetzuren uit de omgeving geeft natuurlijk het voordeel dat er geen energie moet gestoken worden in productie van vetzuren, maar is ook een nadeel omdat de aanwezige vetzuren niet altijd geschikt zullen zijn om een optimaal celmembraan uit te maken. Bacteri¨en die gebruik maken van vetzuren uit de omgeving moeten deze dus kunnen aanpassen tot de samenstelling van hun membraan optimaal is. Deze membraanoptimalisatiehypothese kan ook verklaren waarom er een evenwicht optreedt in de verhoudingen van de verschillende vetzuren tijdens het biohydrogenatieproces. Ook kan deze hypothese een betere verklaring geven voor de vaststelling dat het vetzuurprofiel van de controlereeks bij biohydrogenatie-experimenten niet verandert in de tijd [Howard en Henderson, 1999]: het vetzuurprofiel is al optimaal voor de bacteri¨ en zodat het niet meer aangepast moet worden. Eerder werd dit verklaard door te veronderstellen dat alle vetzuren in deze omstandigheden aanwezig zijn in membranen, waardoor ze niet beschikbaar zouden zijn voor de biohydrogenatie-enzymen. Echter komen deze vetzuren vroeg of laat vrij. Tevens is het zo dat groeiende bacteri¨en actiever zijn in het biohydrogenatieproces dan bacteri¨en in stationaire fase [Chaudhary et al., 2004], wat met deze theorie ook kan verklaard worden. Er zijn namelijk heel wat vetzuren nodig voor de vorming van nieuwe membranen bij groei van de micro-organismen. Om deze membraanoptimalisatiehypothese te testen kan een bacterie die het biohydrogenatieproces uitvoert (bijvoorbeeld Butyrivibrio fibrisolvens) worden ge¨ıncubeerd in aanwezigheid van een bepaalde concentratie linolzuur, maar bij verschillende temperaturen. Indien deze membraanoptimalisatiehypothese correct is zal de biohydrogenatie meer doorgaan bij hogere temperaturen. Hetzelfde kan gedaan worden met een fecale slurry of een rumensuspensie.
76
DISCUSSIE: Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
5.5
5.5
Effect van vetten op het metabolisme van de colonmicrobiota
In normale omstandigheden gaat de vetabsorptie in de dunne darm zeer effici¨ent door, waardoor de hoeveelheden vet die in het colon terecht komen beperkt zijn. Er zijn echter een aantal condities waarbij de hoeveelheid vet die het colon bereikt toch veel groter is dan normaal (inleiding 1.5.3). Er werd reeds enkele keren aangehaald dat vetzuren (en in het bijzonder onverzadigde vetzuren) toxisch kunnen zijn voor bacteri¨en [Desbois en Smith, 2010]. De toxiciteit van vetzuren voor bacteri¨en verschilt van bacterie tot bacterie. Zo zijn stammen Butyrivibrio fibrisolvens die butyraat produceren via butyraatkinase gevoeliger voor de toxiciteit van linolzuur dan de stammen die butyraat produceren via het acyltransferase mechanisme [Paillard et al., 2007]. De aanwezigheid van hoge vetconcentraties in het colon kan dus significante gevolgen hebben voor het microbieel metabolisme en de gezondheid van de gastheer. Om na te gaan wat het accuut effect is van verschillende concentraties vet op de colonmicrobiota in vitro, werden er twee experimenten uitgevoerd waarbij de vetbelasting van de bacteri¨en gevarieerd werd van 0 (controle) tot 50 mg vet/g inoculum. In het eerste experiment werd gebruik gemaakt van zonnebloemolie, een vet dat zeer rijk is aan linolzuur (59% n-6 18:2). Het tweede experiment werd uitgevoerd met kokosolie een zeer verzadigd vet. Dit vet werd niet geanalyseerd, maar de samenstelling kan worden afgeleid uit de beschikbare gegevens in de literatuur (tabel 1.3). Kokosolie bevat 46% laurinezuur (12:0), 17% myristinezuur (14:0). Dit vet is voor 86% verzadigd. In eerste instantie zullen de triglyceriden gehydrolyseerd moeten worden tot vrije vetzuren en glycerol vooraleer de vetzuren beschikbaar zijn om hun effect uit te oefenen. Eens de vetzuren in vrije vorm voorkomen zullen ze zich in de oplossing gedragen als zwakke zuren met een pKa=±5. In de gebufferde oplossing (pH=±6.3) zullen de vrije vetzuren bijgevolg voorkomen in gedeprotoneerde toestand waarbij ze de pH van de oplossing doen dalen. In dit experiment kan dit bevestigd worden door de daling van de pH tussen de controle en de behandelingen. Deze daling was significant vanaf 2 g vet/L bij zonnebloemolie, en was significant voor alle behandelingen met kokosolie (figuur 4.5). Een bemerking die moet gemaakt worden bij het gebruik van vetten is dat de samenstelling niet volledig gekend is. Zo bevat zonnebloemolie een mengsel van verschillende soorten vetzuren waarvan linolzuur wel het belangrijkste is. De zonnebloemolie die in dit experiment gebruikt werd heeft een n-6/n-3 ratio van 262 (de samenstelling van deze olie werd geanalyseerd in experiment 4.7). Daarnaast bevat zonnebloemolie ook zeer veel vitamine E (50 mg/100 g olie). Hierdoor is het mogelijk dat waargenomen effecten veroorzaakt werden door minorcomponenten in het vet. Globaal gezien treedt er een stijging van de TAN- en een daling van de SCFA-waarden op bij het toevoegen van hogere concentraties zonnebloemolie (figuur 4.5). Uit de ratio totale SCFA/TAN komt naar voor dat het toedienen van zonnebloemolie aan colonbacteria in vitro een verschuiving induceert in het metabolisme van SCFA naar TAN, mogelijks een weerspiegeling van een verschuiving van koolhydraatfermentatie naar eiwitfermentatie. Deze beide veranderingen zijn ongunstig voor de gastheer (inleiding 1.6).
77
DISCUSSIE: Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri
5.6
Voor het experiment met kokosolie was er zowel voor de TAN- als de SCFA-waarden geen trend waarneembaar. De ratio van totale SCFA/TAN vertoonde bijgevolg ook geen trend. Opmerkelijk was de hoge acetaatproductie bij 5 g/L kokosolie. Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is misschien te zoeken in het glycerol dat aanwezig was in het vet (in de vorm van triglyceriden). Na hydrolyse van het vet wordt dit glycerol beschikbaar voor verdere fermentatie. In De Weirdt et al., 2010 wordt aangetoond dat glycerol door fermentatie omgezet kan worden tot pyruvaat en uiteindelijk tot acetaat. De 5 g/L kokosolie die wordt toegevoegd bevat echter slechts 8 mM glycerol (6 mM bij 5 g/L zonnebloemolie), en dit is te weinig om de stijging van acetaat te verklaren door fermentatie van het glycerol tot acetaat.
Conclusies 1. Zonnebloemolie (een onverzadigd vet met zeer hoge n-6/n-3 ratio) heeft een ongewenst effect op het algemeen metabolisme van de colonmicrobiota in vitro. Het effect van zonnebloemolie is bovendien concentratie-afhankelijk. 2. Bij toevoegen van 5 g/L kokosolie (50 mg vet/g inoculum) werd er een stijging van de acetaatconcentratie waargenomen, maar bij lagere concentraties ondervonden de microbiota niet echt een waarneembare invloed. 3. Kortom, de colonmicrobiota zijn redelijk goed bestand tegen een acuut hoge dosis vet, en kunnen kokosolie beter tolereren dan zonnebloemolie. Waarschijnlijk komt dit door de hogere toxiciteit van de onverzadigde vetzuren in zonnebloemolie [Desbois en Smith, 2010]. 4. Mensen bij wie er abnormaal grote hoeveelheden vetten in het colon terechtkomen zou men dus kunnen aangeraden om eerder kokosolie te gebruiken dan zonnebloemolie. Uiteraard is bevestiging van deze resultaten noodzakelijk.
5.6
Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri is een Gram-positieve bacterie die van nature voorkomt in het maagdarmkanaal van mensen. Het is een melkzuurbacterie die positieve effecten heeft op de gastheer waarin ze aanwezig is. Lactobacillus reuteri wordt daarom ook aangewend als een probioticum [Shornikova et al., 1997; Valeur et al., 2004]. Om na te gaan of een dergelijke probiotische bacterie een invloed ondervindt van linolzuur in het groeimedium werd deze bacterie opgekweekt bij verschillende concentraties linolzuur en in twee verschillende cultuurmedia. Eerst werd de bacterie opgekweekt in SHIME-medium en daarna werd het experiment herhaald in MRS-medium (experiment 4.4). Tijdens de exponenti¨ele groeifase was de concentratie getelde dode bacteri¨en telkens hoger naarmate er een hogere concentratie linolzuur werd toegevoegd. De totale getelde aantallen bacteri¨en bleven echter ongeveer gelijk. In werkelijkheid zijn er dus niet meer dode cellen, maar heeft dit te maken met het feit dat linolzuur het celmembraan meer permeabel maakt voor kleine moleculen 78
DISCUSSIE: Effect van linolzuur op de groei van Lactobacillus reuteri
5.6
(inleiding 1.3.1). Hierdoor kan propidium iodide toch door het celmembraan van de levende cellen. Propidium iodide wordt in normale omstandigheden namelijk buiten de cel gehouden door levende cellen [Sasaki et al., 1987], maar linolzuur kan het membraan voldoende permeabel maken zodat propidium iodide er toch doorheen kan. Dit werd ook aangetoond in Maia et al., 2010. Naar het einde van de fermentatie bleek dit effect verdwenen te zijn, en werden er zowel in de controle als in de behandelingen ongeveer evenveel dode en levende cellen geteld. Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn dat deze bacteri¨en het linolzuur omzetten tot een ander vetzuur waardoor het linolzuur niet meer kan interfereren met de membraanintegriteit van de cellen. In Devillard et al., 2007 werd inderdaad vastgesteld dat Lactobacillus reuteri linolzuur omzet tot 10-OH 18:2 (HFA). Deze wijziging in membraanpermeabiliteit heeft echter geen merkbaar effect op de productie van de SCFA. Er werd enkel acetaat geproduceerd, en bij alle behandelingen in dezelfde concentraties als in de controle (tabel 4.5). Wanneer het experiment in MRS-broth werd uitgevoerd, werd opgemerkt dat wanneer er meer dode celen geteld werden, er ook meer totale cellen geteld werden. Het lijkt wel alsof de toename van de membraanpermeabiliteit door linolzuur een voordeel is voor de groei van de bacteri¨en. Op het moment dat er geen verschil meer te detecteren is tussen de dode cellen in de controle en de behandelingen, valt dit verschil in totale cellen ook weg. Vermoed wordt dat dit moment net als bij het experiment in SHIME-medium samenvalt met het bereiken van het eindpunt van de hydoxylatie van het LA tot HFA. Deze observatie pleit niet in het voordeel van de toxiciteitshypothese voor de biohydrogenatie van onverzadige vetten. De Lactobacillus reuteri ondervindt geen waarneembare negatieve effecten van de aanwezigheid van linolzuur, maar toch wordt het linolzuur omgezet tot andere vetzuren. Het lijkt ongeveer 50 ´ a 70 uur te duren om het aanwezige linolzuur om te zetten tot HFA. In het SHIME-medium heeft deze bacterie een lange tijd nodig om zich aan te passen aan het nieuwe groeimedium, de lagfase bedroeg ongeveer 100 uur. Dit impliceert dat als deze bacterie ingenomen wordt als probioticum, ze in het colon ook een lange tijd nodig zal hebben om zich aan te passen aan de daar heersende omstandigheden. Waarschijnlijk zelfs langer dan de gemiddelde verblijftijd van de voedselresten in het colon. De verblijftijd in het colon bedraagt namelijk tussen 20 en 80 uur (tabel 1.5). De effectiviteit van de probiotische werking van een dergelijke bacterie zal vermoedelijk sterk kunnen worden verhoogd door bacteri¨en toe te dienen die opgekweekt werden in een medium dat min of meer lijkt op de omstandigheden in het colon. Hierdoor zullen de bacteri¨en al aangepast zijn aan deze omstandigheden waardoor ze in het colon sneller kunnen coloniseren. Dit zou getest kunnen worden in een Twin-shime opstelling waarbij de ene SHIME gesupplementeerd wordt met Lactobacillus reuteri opgekweekt in MRS, en de andere SHIME gesupplementeerd wordt met Lactobacillus reuteri opgekweekt in SHIME-medium. De kolonisatie van de SHIME door Lactobacillus reuteri zal vermoedelijk veel sneller gebeuren als de toegevoegde bacterie in SHIME-medium werd opgekweekt.
79
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 1
5.7
Conclusies: Linolzuur maakt het celmembraan van Lactobacillus reuteri meer permeabel. Deze wijziging heeft echter geen invloed op de groeikarakteristieken en de fermentatiekaraktereistieken van de bacterie. Lactobacillus reuteri blijkt dus goed bestand te zijn tegen de toxische effecten van linolzuur, en kan dit vetzuur waarschijnlijk omzetten tot een ander vetzuur dat niet meer interfereert met de membraanintegriteit van deze bacterie (HFA) [Devillard et al., 2007].
5.7
Aanrijking van de colonmicrobiota 1
Dit was het eerste experiment in een reeks van 3 experimenten om te onderzoeken of de aanwezigheid van verschillende types vetten een effect hebben op de samenstelling van de colonmicrobiota wanneer deze in vivo opgekweekt worden. Hierbij werd de ge¨ıncubeerde suspensie 5 keer overge¨ent in vers groeimedium (protocol 3.3.5). Na 6 dagen incubatie werd de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap vergeleken met de samenstelling v´o´or incubatie. Uit de resultaten van de DGGE op een 16S PCR-product van het DNA-extract komt naar voor dat het toevoegen van zonnebloemolie (0.5 g/L) aan het incubatiemedium geen grote wijzigingen induceerde in de microbi¨ele gemeenschap. De DGGE-profielen clusterden volledig samen volgens de incubatietijd (0 en 6 dagen). Er werd hierbij verondersteld dat deze 5 overentingen ervoor zorgden dat het DNA van in het inoculum voldoende verdund was zodat het geen belangrijke invloed meer had op het DGGE-profiel van de ge¨ıncubeerde suspensie na 5 overentingen. Er werden tevens ook SCFA en TAN geanalyseerd. Bij de SCFA was er een lichte (niet-significante) stijging waar te nemen na dag 1 en na dag 6 van de incubatie. De productie van TAN daarentegen leek iets onderdrukt te worden door het toevoegen van zonnebloemolie (zeer rijk aan linolzuur). Dit was een merkwaardig resultaat omdat deze trend volledig tegengesteld was aan de trend die werd waargenomen in experiment 4.3. Nochtans lag de vetbelasting van het inoculum bij dit experiment eveneens behoorlijk hoog (25 mg vet/g inoculum). De proefopzet verschilde wel van experiment 4.3 omdat er 5 keer minder inoculum werd toegevoegd, en dubbel zoveel SHIME-medium (protocol 3.3.3). Zo kan het zijn dat de bacteri¨en initieel een negatieve invloed ondervinden van de toegevoegde zonnebloemolie, maar dat deze negatieve invloed verdwijnt naarmate de bacteri¨en zich hebben aangepast. Bacteri¨en kunnen in dit experiment namelijk langer doorgroeien dan in experiment 4.3 omdat er meer voeding aanwezig was per g inoculum. Dit strookt met de vaststelling in Devillard et al., 2007 dat heel wat bacteri¨en een lagfase ondervinden door het toedienen van linolzuur aan hun medium, waardoor de bacteri¨en pas na een zekere aanpassingstijd goed beginnen groeien. Een ander groot verschil was de concentratie partikels: door de lagere inoculumconcentratie in dit experiment werd er ook veel minder partikelig materiaal toegevoegd. Hierdoor was de verhouding SAB (solidadhering bacteria) ten opzichte van de LAB (Liquid-associated bacteria) verschillend tussen beide experimenten. Het blijkt dat er wel degelijk verschillen zijn in de respons van de SAB en de LAB op de aanwezigheid van linolzuur. De SAB nemen verhoudingsgewijs veel linolzuur op als vrij vetzuur in hun cytoplasma [Bauchart et al., 1990]. Dit komt overeen met ander 80
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 2
5.8
onderzoek dat aantoont dat de SAB 1.6 tot 2.8 keer meer vet bevatten (op droge stof basis) dan de LAB [Vlaeminck et al., 2006]. Bovendien zijn het net deze SAB die aangehecht zitten aan de voedingsbron (het partikelig materiaal), dat uiteindelijk gefermenteerd werd. Het zou dus kunnen zijn dat enkel de SAB een negatief effect ondervinden van de toegevoegde zonnebloemolie terwijl de LAB eerder een positief effect ondervinden. Dit zou de trends in beide experimenten kunnen verklaren. Naarmate er langer wordt overge¨ent wordt het partikelig materiaal verdund, en wordt het verschil tussen het positieve effect van zonnebloemolie in dit experiment en het negatieve effect van zonnebloemolie in experiment 4.3 groter. Een mogelijk vervolg op experiment 4.3 zou zijn om dit experiment te herhalen, maar waarbij het inoculum wordt opgesplitst in de SAB en de LAB fractie. De ratios van de verschillende vetzuren zijn sterk gewijzigd na 6 dagen incubatie. Vooral butyraat was verhoudingsgewijs zeer sterk gestegen ten koste van acetaat. Tussen de behandeling en de controle was het verschil echter beperkt (niet-significant).
5.7.1
Conclusies
1. Zes dagen overenten blijkt onvoldoende om significante verschillen waar te nemen in de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap of in het metabolisme van de microbi¨ele gemeenschap tussen de controle en een behandeling met 0.5 g/L zonnebloemolie. 2. Opmerkelijk is de goede herhaalbaarheid van het experiment. Een dergelijke proefopzet kan dus aangewend worden om de effecten van meerdere componenten te testen ten opzichte van elkaar, en ten opzichte van een controle. Hierbij wordt er informatie verkregen over de microbi¨ele gemeenschap (DNA- of RNA-extractie), en over het algemeen metabolisme (SCFA, TAN, pH) van de microbi¨ele gemeenschap.
5.8
Aanrijking van de colonmicrobiota 2
Omdat de effecten van zonnebloemolie beperkt waren in experiment 4.5, werd het experiment overgedaan met een hogere concentratie vet, werden er verschillende vetten getest en werd er gedurende 15 dagen overge¨ent. De gekozen vetten liepen van zeer verzadigde tot zeer onverzadigde vetten (protocol 3.3.6). Om de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap in te schatten werd in dit experiment na 15 dagen incubatie uitgeplaat op selectieve cultuurmedia. Als er vet werd toegediend aan de flesjes is er een daling in Lactobacilli en Clostridia waar te nemen. Deze daling was het sterkst wanneer zonnebloemolie werd toegediend, maar trad op zodra er vet werd toegediend. Sommige Lactobacilli blijken gestimuleerd te worden door bepaalde vetzuren (bijvoorbeeld ole¨ınezuur), terwijl andere dan weer eerder ge¨ınhibeerd worden. In [Devillard et al., 2007] wordt aangetoond dat sommige Lactobacillus species een lag-fase vertonen als ze ge¨ıncubeerd worden met linolzuur. Voor sommige Lactobacilli is er dan weer een optimale range van vetzuurconcentraties waarbij ze optimaal groeien. Dit is bijvoorbeeld het geval voor Lactobacillus
81
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
5.9
helveticus die gestimuleerd wordt bij 0.2-2 ppm, en ge¨ınhibeerd wordt vanaf 10 ppm linolzuur [Nieman, 1954]. De daling van Lactobacilli kan gezien worden als een negatieve verandering omdat dit genus toch veel bacteri¨en bevat die belangrijke voordelen bieden aan de gastheer. Er treedt namelijk een wisselwerking op tussen de gastheer en de Lactobacilli waaruit beide partners een voordeel halen. We kunnen hier dan ook spreken van een symbiotische samenwerking. Binnen de groep van de Lactobacilli kan er echter een verschuiving plaatsvinden van de verschillende species die met deze methode niet kan worden gedetecteerd. Wat de Clostridia betreft zijn de gevolgen voor de gastheer minder ´e´enduidig omdat het genus Clostridium zowel bacteri¨en bevat die een positief effect hebben voor de gastheer (butyraatproductie), alsook een aantal pathogene bacteri¨en (Clostridium perfringens, C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. butyricum [Fenicia et al., 1999]). Afhankelijk van welke species gereduceerd werden door het toedienen van vet kan dit een positieve of een negatieve verandering zijn. Met de gebruikte methoden kon dit echter niet beoordeeld worden. Hiervoor is een DNA-extractie nodig gevolgd door een specifieke PCR-DGGE of een Q-PCR. Uit de analyses van de SCFA kon worden opgemaakt dat de verschillende vetten niet echt een groot effect hadden op het algemeen metabolisme van de microbi¨ele gemeenschap. Bij het toevoegen van zonnebloemolie steeg de acetaatproductie, vooral ten koste van butyraat, valeraat en de vertakte vetzuren. Een omgekeerde trend was waarneembaar bij het toedienen van visolie: hier steeg de butyraatproductie ten koste van de acetaatproductie. In experiment 4.5 werd een hoge butyraatproductie vastgesteld op dag 6, en ook hier blijkt dit het geval te zijn (tabel 4.7). Na 6 dagen is het systeem dus nog niet in evenwicht.
5.8.1
Conclusies
1. De samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap wijzigde licht bij het toevoegen van vetten aan het cultuurmedium, maar deze wijziging was onafhankelijk van het soort vet dat werd toegediend. Meer bepaald werden de aantallen Lactobacilli en Clostridia gereduceerd in de behandelingen. 2. Het algemeen metabolisme van de colonmicrobiota (SCFA en TAN) onderging geen grote wijzigingen door het toevoegen van verschillende vetten. Zonnebloemolie gaf een lichte stijging van acetaat ten koste van butyraat, en visolie liet het omgekeerde effect zien.
5.9
Aanrijking van de colonmicrobiota 3
In dit experiment werden twee verschillende cultuurmedia parallel naast elkaar gebruikt (inoculatie met hetzelfde inoculum). Aan het SHIME-medium werd ditmaal ook galoplossing toegevoegd. De galzouten zullen het toegevoegde vet emulgeren, waardoor het meer homogeen in de suspensie aanwezig zal zijn. Vermoed werd dat hierdoor het contact tussen de bacteri¨en en het vet intensiever zou worden, waardoor ook het effect van de toegevoegde vetten meer naar voor zou komen. In MCB-medium was Tween-80 aanwezig als emulgator (tabel 3.2). 82
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
5.9
Vanwege practische beperkingen werden de incubaties in SHIME-medium na 11 dagen, en de incubaties in MCB-medium na 13 dagen incubatie uitgeplaat. De sterkst waarneembare trend was te merken in de Bifidobacteria. Deze organismen zijn in hogere concenraties aanwezig als er een sterk onverzadigd vet (zonnebloemolie of lijnzaadolie) werd toegevoegd aan de incubaties met SHIME-medium. De trend was omgekeerd wanneer de incubatie gebeurde in MCB-medium. Bifidobacteria vervullen tal van functies die een voordeel opleveren voor de gastheer (inleiding 1.6). Meer Bifidobacteria kan dus ge¨ınterpreteerd worden als een gewenst effect. Dezelfde trend werd ook waargenomen voor het ana¨eroob kiemgetal en voor de Coliformen. Merk op dat het verschil tussen de Bifidobacteria in SHIME- en MCB-medium meer dan 1 log10-eenheid bedroeg bij het toevoegen van 1 g/L onverzadigd vet, en bij deze hoge aantallen is dit toch een behoorlijk verschil. De Lactobacilli konden niet geteld waren omdat ze zo goed als afwezig bleken te zijn. De platen voor Clostridia gaven slechte resultaten. Hierdoor konden de observaties die werden gedaan in experiment 4.6 niet worden gestaafd. Voor de incubaties in SHIME-medium volgden de SCFA ongeveer dezelfde trend als de Bifidobacteria. Het toevoegen van onverzadigde vetten (zonnebloemolie en lijnzaadolie) had een positief effect op de fermentatie tot SCFA in SHIME-medium. In MCB-medium had het toevoegen van onverzadigde vetten eerder een negatief effect op de fermentatie tot SCFA. Deze SCFA, en in het bijzonder butyraat, hebben positieve effecten voor de gezondheid van de gastheer [Scheppach en Weiler, 2004], waardoor een stijging van de SCFA algemeen wordt aanzien als gunstig voor de gastheer. De verschilen tussen waarden van de TAN-analyses waren minimaal tussen de reeksen met een bepaald medium. In het MCB-medium werd er echter veel meer SCFA en TAN geproduceerd dan in het SHIMEmedium. Dit leek tegenstrijdig met de waarden voor het ana¨erobe kiemgetal, wat lager was in het ge¨ıncubeerde MCB-medium dan in het ge¨ıncubeerde SHIME-medium. Mogelijks kan dit verklaard worden doordat het SHIME-medium een koolhydraatrijk medium is, terwijl de biomassa in MCB-medium voor het grootste deel uit peptiden bestaat. Het is namelijk de concentratie koolhydraten die de groei van bacteri¨en limiteert. De samenstelling van het medium weerspiegelde zich ook in de fermentatieproducten die gevormd werden. Bij SHIME-medium was de ratio totale SCFA/TAN ongeveer 4.0, terwijl deze ratio gedaald was tot 1.5 bij MCB-medium. Niet alleen was de TAN-productie lager, maar ook de SCFA-productie was in dit experiment een stuk lager dan bij eerdere incubaties met SHIME-medium. In eerdere incubaties met SHIMEmedium was deze ratio echter ook lager (rond 3.0). Mogelijks had dit te maken met de galzouten die werden toegevoegd, deze hebben namelijk een antimicrobieel effect [Hill, 1995]. Een andere mogelijke verklaring is de variatie van het inoculum dat gebruikt werd voor de incubaties (zelfde donor, andere staalname). In het MCB-medium was de (statistisch significante) trend die zichtbaar was op dag 1 niet meer waarneembaar na dag 12. Dit zou er kunnen op wijzen dat de organismen die gevoelig zijn voor onverzadigde vetten ofwel uit het ecosysteem verdwenen zijn en vervangen zijn door andere organismen die hun functie overnemen. Een andere mogelijkheid is dat deze bacteri¨en zich aangepast hebben aan de aanwezigheid van onverzadigde vetten. In Desbois en Smith, 2010 wordt echter gesteld dat resistentie tegen vetzuren moeilijk optreedt, waardoor dit laatste weinig 83
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
5.9
waarschijnlijk is. De pH van de ge¨ıncubeerde suspensie met SHIME-medium was rond 6.1, terwijl de pH van de ge¨ıncubeerde suspensie in MCB-medium rond 6.6 lag. Er werd reeds in de literatuur gesteld dat de pH van een dergelijk systeem vooral afhankelijk is van de SCFA en de TAN [Paul en Beauchamp, 1989]. De SCFA hebben een pKa kleiner dan 5 terwijl ammoniak een pKa heeft van 9.3. Hierdoor zal het ammoniak een gedeelte van de SCFA neutraliseren bij de pH van de ge¨ıncubeerde vloeistof. Ook al werd er bij MCB-medium veel meer SCFA geproduceerd, dit werd voor een groot deel geneutraliseerd door de hoge ammonium/ammoniak productie. In een microbieel ecosysteem treedt er een zogenaamde functional redundancy op, dit betekend dat verschillende functies in de gemeenschap kunnen uitgevoerd worden door meerdere organismen. Als er dan een organisme wegvalt, dan wordt zijn functie overgenomen door ´e´en of meerdere andere micro-organismen. Hierdoor konden er verschuivingen zijn opgetreden die niet gedetecteerd konden worden via uitplatingen op selectieve cultuurmedia of analyse van fermentatieproducten. Daarom werd ook nog eens een 16S-PCR uitgevoerd op de DNA-extracten van de ge¨ıncubeerde suspensies. Dit werd op DGGE gezet om een beeld te krijgen over de samenstelling van de microbi¨ele gemeenschap. De DGGE-profielen vertoonden echter geen waarneembare verschillen. Een andere opmerkelijke bevinding in dit experiment was de waterstofdruk. Deze was rond 3.8% v/v wanneer SHIME-medium werd gebruikt, en was beneden de detectielimiet wanneer MCB-medium werd gebruikt. In beide incubatiemedia steeg de waterstofdruk wel in de tijd. Merk ook op dat de waterstofdruk toch nog 4 keer hoger was dan de waterstofdruk die geobserveerd werd bij dezelfde inoculumconcentratie (2%) in experiment 4.2 (0.78% v/v H2 ). In dit experiment werd echter 14.4 g/L SHIME-medium toegevoegd versus 4 g/L in experiment 4.2, waardoor het erop lijkt dat de waterstofdruk die zich ontwikkeld evenredig is met de hoeveelheid toegevoegd SHIME-medium. Naast het testen van verschillende inoculumtypes (methanogeen versus nietmethanogeen) kan het misschien ook interessant zijn om de waterstofdruk te manipuleren door met verschillende media te werken om het effect van de waterstofdruk op de biohydrogenatieprocessen te bestuderen. Uit dit experiment komt naar voor dat het SHIME- en het MCB-medium geschikte kandidaten zijn voor een dergelijk experiment. Uit de analyses van de LCFA is het duidelijk dat er totaal geen biohydrogenatie heeft plaatsgevonden. Dit zou mogelijks te maken kunnen hebben met de afwezigheid van partikels in deze 2 media. Hierdoor kunnen er zich geen biofilms vormen, en worden enkel de LAB gecultiveerd (en niet de SAB). Er moet hier ook bij vermeld worden dat de LAB en SAB niet noodzakelijk verschillende bacteri¨en zijn, maar doordat ze in een andere omgeving aanwezig zijn (in vloeistof versus in een biofilm) ze een ander fenotype zullen vertonen. En gepaard met dit ander fenotype worden ook andere genen tot expressie gebracht.
5.9.1
Conclusies
1. Het effect dat onverzadigde vetten (zonnebloemolie of lijnzaadolie) hebben op de colonmicrobiota in vitro is afhankelijk van het medium waarin ze worden opgekweekt. In het koolhydraatrijke SHIME-medium wordt een gewenst effect effect waargenomen. Dit hield een stijging van de Bifidobacteria in en een stijging in SCFA-productie. In MCB-medium 84
DISCUSSIE: Aanrijking van de colonmicrobiota 3
5.9
werd een ongewenst effect waargenomen door het toevoegen van de onverzadigde vetten: een daling van de Bifidobacteria en een daling van de SCFA-productie. 2. De twee media zijn zeer verschillend in hun eigenschappen (tabel 5.1). Door deze verschillen is het mogelijk om de beide cultuurmedia te gebruiken voor verschillende doeleinden. Het SHIME-medium vertoont namelijk karakteristieken die eerder overeen komen met de condities in het proximale deel van het colon, terwijl het MCB-medium karakteristieken vertoont die dichter aanleunen bij de condities in het distale deel van het colon (figuur 1.9) [Cummings en Macfarlane, 1991]. 3. Er treedt geen biohydrogenatie op, een mogelijk verklaring kan de afwezigheid zijn van partikels. Tabel 5.1: De eigenschappen van SHIME-medium en het MCB-medium voor de incubatie van de colonmicrobiota in vitro.
SHIME-voeding Koolhydraatrijk → koolhydraatfermentatie Lage pH Hoge waterstofdruk
85
MCB-medium Eiwitrijk → eiwitfermentatie Hoge pH Lage waterstofdruk
Hoofdstuk 6
Opportuniteiten voor verder onderzoek Om de invloed van de waterstofdruk op het biohydrogenatieproces verder te onderzoeken kunnen er in een volgend experiment verschillende humane fecale inocula getest worden in verschillende media. Dit waren namelijk de twee factoren die een grote invloed hadden op de waterstofdruk. Naast de verschillende inocula kan ook de vetconcentratie gevarieerd worden, deze twee factoren bepaalden immers de ratio van isomeren die gevormd werden. De inocula kunnen eventueel nog eens verder opgesplitst worden in de SAB- en de LAB-fractie om na te gaan welke fractie van de bacteri¨en het meest betrokken is bij de biohydrogenatie. Om de acuute toxiciteit van verschillende vetten op de humane colonmicrobiota verder te onderzoeken kan het uitgevoerde experiment herhaald worden. Hierbij zouden er tevens nog andere vetten kunnen opgenomen worden. Ook hier kan het zinvol zijn om het inoculum op te splitsen in de SAB- en de LAB-fractie om na te gaan welke fractie van de bacteri¨en het meest gevoelig is voor de toxiciteit van verschillende vetten/vetzuren. Als uitbreiding zou er ook gewerkt kunnen worden met verschillende humane fecale inocula en verschillende media (SHIMEen MCB-medium). De biohydrogenatiecapaciteit van de suspensies gaat dus volledig verloren tijdens de aanrijkingsexperimenten. Interessant zou het zijn om uit te zoeken wat de oorzaak hiervan is. Mogelijks is dit door de afwezigheid van partikels. Dit kan verder getest worden door een gelijkaardig experiment als in experiment 3.3.7 uit te voeren, maar fijne partikels te incorporeren in de flesjes (fijn genoeg zodat ze mee kunnen worden overge¨ent). Bijvoorbeeld kan er gedacht worden aan het toevoegen van steriel gemaakte fecale slurry. Dit is de natuurlijke matrix van de bacteri¨en waardoor dit de grootste kans heeft om gekoloniseerd te worden door de SAB. Hierdoor is het misschien mogelijk om de SAB-fractie ook in stand te houden tijdens de incubatie, en misschien hiermee ook de biohydrogenatiecapaciteit. Ook zouden er op dit soort experimenten adhesie-testen kunnen gedaan worden. Bacteri¨en interageren immers met de buitenwereld via hun membraan, en mogelijks be¨ınvloed de vetzuursamenstelling in het groeimedium de adhesie van de bacteri¨en aan mucus door hun membraansamenstelling te wijzigen (inleiding 1.7.3). De resultaten van de aanrijkingsexperimenten laten zien dat er met een proefopzet zoals in experiment 4.7, een zeer goede herhaalbaarheid kan bekomen worden binnen de reeksen. Dit laat toe om een reeks gerelateerde substanties (bijvoorbeeld eiwitten, koolhydraten, prebiotica... ) parallel (met hetzelfde inoculum) te vergelijken met elkaar en met de controle gedurende korte tot middellange termijn.
86
Bijlage A
Lijst met vetzuren
α
a) HO 1
ω1 9
ω6
O b) HO O c) HO O d) HO O e) HO O f) HO O g) HO O h) HO O i) HO O j) HO O k) HO O l) HO O
Figuur A.1: a) Illustratie van de nomenclatuur van vetzuren b) Laurinezuur (12:0) c) Myristinezuur (14:0) d) Palmitinezuur (16:0) e) Stearinezuur (SA: 18:0) f) Oleinezuur (cis-∆9 18:1) g) Vacceenzuur (VA: trans-∆11 18:1) h) Linolzuur (LA: cis-∆9 , cis-∆12 18:2) i) Rumenzuur (bovinezuur) (RA: cis-∆9 , trans-∆11 18:2) j) Linoleenzuur (cis-∆9 , cis-∆12 , cis-∆15 18:3) k) Eicosapentaeenzuur (EPA: cis-∆5 , cis-∆8 , cis-∆11 , cis-∆14 , cis-∆17 20:5) l) Docosahexaeenzuur (DHA: cis-∆4 , cis-∆7 , cis-∆10 , cis-∆13 , cis-∆16 , cis-∆19 22:6)
87
Bijlage B
Transvetzuren in levensmiddelen Tabel B.1: Concentratie van cis-9, trans-11 18:2 CLA in dierlijke producten a [S´ eb´ edio en Christie, b 1998] en [Raes et al., 2004]. Dierlijk product Rundvlees
Totaal CLA (mg/g vet)a 4.3
Melk Lamsvlees
5.5 5.6
Varkensvlees Kippenvlees Eierdooier Zalm
0.6 0.9 0.6 0.3
Voeder graan gras
Cis-9, trans-11 18:2 (% van totale vetzuren)b 0.35 1.04
graan gras
0.40 1.40
88
Bibliografie AbuGhazaleh, A., M. Riley, E. Thies en T. Jenkins (2005). Dilution rate and pH effects on the ” conversion of oleic acid to trans C18: 1 positional isomers in continuous culture”. In: Journal of dairy science 88.12, pagina’s 4334-4341. Ailhaud, G., F. Massiera, P. Weill, P. Legrand, J. Alessandri en P. Guesnet (2006). Temporal ” changes in dietary fats: role of n-6 polyunsaturated fatty acids in excessive adipose tissue development and relationship to obesity”. In: Progress in Lipid Research 45.3, pagina’s 203236. Ailhaud, G., F. Massiera, J. Alessandri en P. Guesnet (2007). Fatty acid composition as an ” early determinant of childhood obesity”. In: Genes & Nutrition 2.1, pagina’s 39-40. Altieri, C., A. Bevilacqua, D. Cardillo en M. Sinigaglia (2009). Effectiveness of fatty acids and ” their monoglycerides against gram-negative pathogens”. In: International Journal of Food Science & Technology 44.2, pagina’s 359-366. Alvisi, V., F. Pavani, M. Ruina, A. Loponte, M. Tralli, O. Solera en B. Bagni (1982). Study of ” intestinal transit using a radioisotope method”. In: Minerva medica 73.25, pagina 1765. Anderson, B. en D. Ma (2009). Are all n-3 polyunsaturated fatty acids created equal”. In: ” Lipids Health Dis 8.1, pagina 33. Apgar, J., C. Shively en S. Tarka (1987). Digestibility of cocoa butter and corn oil and their ” influence on fatty acid distribution in rats”. In: The Journal of nutrition 117.4, pagina 660. Arhan, P., G. Devroede, B. Jehannin, M. Lanza, C. Faverdin, C. Dornic, B. Persoz, L. T´etreault, B. Perey en D. Pellerin (1981). Segmental colonic transit time”. In: Diseases of the Colon ” & Rectum 24.8, pagina’s 625-629. Ascherio, A. en W. Willett (1997). Health effects of trans fatty acids”. In: American Journal ” of Clinical Nutrition 66.4, 1006S. Awad, A., J. Chattopadhyay en M. Danahy (1989). Effect of dietary fat composition on rat ” colon plasma membranes and fecal lipids”. In: Journal of Nutrition 119.10, pagina 1376. Bach, A. en V. Babayan (1982). Medium-chain triglycerides: an update”. In: American Journal ” of Clinical Nutrition 36.5, pagina 950. Backhed, F., R. E. Ley, J. L. Sonnenburg, D. A. Peterson en J. I. Gordon (maart 2005). Host” bacterial mutualism in the human intestine.” In: Science 307.5717, pagina’s 1915-20. 89
Bibliografie Bassaganya-Riera, J. en R. Hontecillas (2006). CLA and n-3 PUFA differentially modulate ” clinical activity and colonic PPAR-responsive gene expression in a pig model of experimental IBD”. In: Clinical Nutrition 25.3, pagina’s 454-465. Bassaganya-Riera, J., R. Hontecillas en D. Beitz (2002). Colonic anti-inflammatory mechanisms ” of conjugated linoleic acid”. In: Clinical nutrition 21.6, pagina’s 451-459. Bauchart, D., F. Legay-Carmier, M. Doreau en B. Gaillard (1990). Lipid metabolism of ” liquid-associated and solid-adherent bacteria gin rumen contents of dairy cows offered lipidsupplemented diets”. In: British Journal of Nutrition 63.03, pagina’s 563-578. Bauman, D. en A. Lock (2006). Conjugated linoleic acid: biosynthesis and nutritional ” significance”. In: Advanced Dairy Chemistry Volume 2 Lipids, pagina’s 93-136. Bauman, D., A. Lock, B. Corl, C. Ip, A. Salter en P. Parodi (2005). Milk fatty acids and ” human health: potential role of conjugated linoleic acid and trans fatty acids”. In: Ruminant Physiology: Digestion, Metabolism and Impact of Nutrition on Gene Expression, Immunology and Stress, pagina’s 529-561. Beppu, F., M. Hosokawa, L. Tanaka, H. Kohno, T. Tanaka en K. Miyashita (2006). Potent ” inhibitory effect of trans9, trans11 isomer of conjugated linoleic acid on the growth of human colon cancer cells”. In: The Journal of nutritional biochemistry 17.12, pagina’s 830-836. Bergman, E. (1990). Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract ” in various species”. In: Physiological reviews 70.2, pagina 567. Berquin, I., Y. Min, R. Wu, J. Wu, D. Perry, J. Cline, M. Thomas, T. Thornburg, G. Kulik, A. Smith et al. (2007). Modulation of prostate cancer genetic risk by omega-3 and omega-6 ” fatty acids”. In: Journal of Clinical Investigation 117.7, pagina’s 1866-1875. Blasbalg, T., J. Hibbeln, C. Ramsden, S. Majchrzak en R. Rawlings (2011). Changes in ” consumption of omega-3 and omega-6 fatty acids in the United States during the 20th century”. In: The American Journal of Clinical Nutrition. Bodnermontville, J., J. Ahuja, L. Ingwersen, E. Haggerty, C. Enns en B. Perloff (2006). USDA ” Food and Nutrient Database for Dietary Studies: Released on the web”. In: Journal of Food Composition and Analysis 19, S100-S107. Bracco, U. (1994). Effect of triglyceride structure on fat absorption”. In: American Journal of ” Clinical Nutrition 60.6, 1002S. Brands, S. The Taxonomicon. Universal Taxonomic Services, Zwaag, Nederland. url: http: //taxonomicon.taxonomy.nl/. Cani, P., N. Delzenne, J. Amar en R. Burcelin (2008). Role of gut microflora in the development ” of obesity and insulin resistance following high-fat diet feeding”. In: Pathologie Biologie 56.5, pagina’s 305-309.
90
Bibliografie Chaudhary, L., N. McKain, A. Richardson, M. Barbier, J. Charbonnier en R. Wallace (2004). Screening for Fusocillus: factors that affect the detection of ruminal bacteria which form ” stearic acid from linoleic acid”. In: Reprod Nutr Dev 44.Suppl 1, S65. Chen, H., V. Haack, C. Janecky, N. Vollendorf en J. Marlett (1998). Mechanisms by which ” wheat bran and oat bran increase stool weight in humans”. In: The American journal of clinical nutrition 68.3, pagina 711. Chen, I., S. Subramaniam, G. Vahouny, M. Cassidy, I. Ikeda en D. Kritchevsky (1989). A ” comparison of the digestion and absorption of cocoa butter and palm kernel oil and their effects on cholesterol absorption in rats”. In: The Journal of nutrition 119.11, pagina 1569. Chen, Q., L. Bl¨ ackberg, A. Nilsson, B. Sternby en O. Hernell (1994). Digestion of triacylglycerols ” containing long-chain polyenoic fatty acids in vitro by colipase-dependent pancreatic lipase and human milk bile salt-stimulated lipase”. In: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism 1210.2, pagina’s 239-243. Chilliard, Y., F. Glasser, A. Ferlay, L. Bernard, J. Rouel en M. Doreau (2007). Diet, rumen ” biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat”. In: European Journal of Lipid Science and Technology 109.8, pagina’s 828-855. Chintalapati, S., M. Kiran en S. Shivaji (2004). Role of membrane lipid fatty acids in cold ” adaptation.” In: Cellular and molecular biology (Noisy-le-Grand, France) 50.5, pagina 631. Choi, N., J. Imm, S. Oh, B. Kim, H. Hwang en Y. Kim (2005). Effect of pH and oxygen on ” conjugated linoleic acid (CLA) production by mixed rumen bacteria from cows fed high concentrate and high forage diets”. In: Animal feed science and technology 123, pagina’s 643653. Clifton, P., J. Keogh en M. Noakes (2004). Trans fatty acids in adipose tissue and the food ” supply are associated with myocardial infarction”. In: Journal of Nutrition 134.4, pagina 874. Conly, J. en K. Stein (1992). Quantitative and qualitative measurements of K vitamins in ” human intestinal contents.” In: The American journal of gastroenterology 87.3, pagina 311. Cronan, J. en E. Gelmann (1973). An estimate of the minimum amount of unsaturated fatty ” acid required for growth of Escherichia coli”. In: Journal of Biological Chemistry 248.4, pagina 1188. Cummings, J. H. en G. T. Macfarlane (juni 1991). The control and consequences of bacterial ” fermentation in the human colon.” In: J Appl Bacteriol 70.6, pagina’s 443-59. Cummings, J. H., S. A. Bingham, K. W. Heaton en M. A. Eastwood (december 1992). Fecal ” weight, colon cancer risk, and dietary intake of nonstarch polysaccharides (dietary fiber)”. In: Gastroenterology 103.6, pagina’s 1783-9. Cummings, J. en H. Wiggins (1976). Transit through the gut measured by analysis of a single ” stool.” In: British Medical Journal 17.3, pagina 219.
91
Bibliografie Cummings, J., H. Wiggins, D. Jenkins, H. Houston, T. Jivraj, B. Drasar en M. Hill (1978). Influence of diets high and low in animal fat on bowel habit, gastrointestinal transit time, ” fecal microflora, bile acid, and fat excretion.” In: Journal of Clinical Investigation 61.4, pagina 953. Cybulski, L., D. Albanesi, M. Mansilla, S. Altabe, P. Aguilar en D. De Mendoza (2002). Mechanism of membrane fluidity optimization: isothermal control of the Bacillus subtilis ” acyl-lipid desaturase”. In: Molecular microbiology 45.5, pagina’s 1379-1388. Danaei, G., E. L. Ding, D. Mozaffarian, B. Taylor, J. Rehm, C. J. L. Murray en M. Ezzati (april 2009). The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment ” of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors.” In: PLoS Med 6.4, e1000058. De Pablo, M. en G. De Cienfuegos (2000). Modulatory effects of dietary lipids on immune ” system functions”. In: Immunology and Cell Biology 78.1, pagina’s 31-39. De Weirdt, R., S. Possemiers, G. Vermeulen, T. C. W. Moerdijk-Poortvliet, H. T. S. Boschker, W. Verstraete en T. Van de Wiele (december 2010). Human faecal microbiota display variable ” patterns of glycerol metabolism.” In: FEMS Microbiol Ecol 74.3, pagina’s 601-11. Degen, L. en S. Phillips (1996). Variability of gastrointestinal transit in healthy women and ” men.” In: Gut 39.2, pagina 299. Demarne, Y., E. Sacquet, M. Lecourtier en J. Flanzy (1979). Comparative study of endogenous ” fecal fatty acids in germ-free and conventional rats”. In: The American Journal of Clinical Nutrition 32.10, pagina 2027. Demeyer, D., C. Henderson en R. Prins (1978). Relative significance of exogenous and de novo ” synthesized fatty acids in the formation of rumen microbial lipids in vitro”. In: Applied and Environmental Microbiology 35.1, pagina 24. Desbois, A. en V. Smith (2010). Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of ” action and biotechnological potential”. In: Applied microbiology and biotechnology 85.6, pagina’s 1629-1642. Dethlefsen, L., P. Eckburg, E. Bik en D. Relman (2006). Assembly of the human intestinal ” microbiota”. In: Trends in Ecology & Evolution 21.9, pagina’s 517-523. Devillard, E., F. McIntosh, S. Duncan en R. Wallace (2007). Metabolism of linoleic acid by ” human gut bacteria: different routes for biosynthesis of conjugated linoleic acid”. In: Journal of bacteriology 189.6, pagina 2566. Devillard, E., F. M. McIntosh, D. Paillard, N. A. Thomas, K. J. Shingfield en R. J. Wallace (2009). Differences between human subjects in the composition of the faecal bacterial ” community and faecal metabolism of linoleic acid”. In: Microbiology 155.2, pagina’s 513520. Dewulf, E., P. Cani, A. Neyrinck, S. Possemiers, A. Holle, G. Muccioli, L. Deldicque, L. Bindels, B. Pachikian, F. Sohet et al. (2010). Inulin-type fructans with prebiotic properties ”
92
Bibliografie counteract GPR43 overexpression and PPAR [gamma]-related adipogenesis in the white adipose tissue of high-fat diet-fed mice”. In: The Journal of Nutritional Biochemistry. DiBaise, J., H. Zhang, M. Crowell, R. Krajmalnik-Brown, G. Decker en B. Rittmann (2008). Gut microbiota and its possible relationship with obesity”. In: Mayo Clinic Proceedings. ” Deel 83. 4. Mayo Clinic, pagina 460. Ding, S., M. Chi, B. Scull, R. Rigby, N. Schwerbrock, S. Magness, C. Jobin, P. Lund en S. Gaetani (2010). High-fat diet: bacteria interactions promote intestinal inflammation which ” precedes and correlates with obesity and insulin resistance in mouse”. In: PloS one 5.8, pagina’s 1210-1229. Eastwood, M., W. Brydon, J. Baird, R. Elton, S. Helliwell, J. Smith en J. Pritchard (1984). Fecal weight and composition, serum lipids, and diet among subjects aged 18 to 80 years ” not seeking health care”. In: American Journal of Clinical Nutrition 40.3, pagina 628. Eckburg, P., E. Bik, C. Bernstein, E. Purdom, L. Dethlefsen, M. Sargent, S. Gill, K. Nelson en D. Relman (2005). Diversity of the human intestinal microbial flora”. In: Science 308.5728, ” pagina 1635. FAO. Food and Agricultural Organization of the United Nations. United Nations. url: http: //faostat.fao.org/. FAOstat (2009). FAO statistical yearbook; dietary fat consumption. Fenicia, L., G. Franciosa, M. Pourshaban en P. Aureli (1999). Intestinal toxemia botulism in ” two young people, caused by Clostridium butyricum type E”. In: Clinical infectious diseases 29.6, pagina 1381. Fite, A., G. Macfarlane, J. Cummings, M. Hopkins, S. Kong, E. Furrie en S. Macfarlane (2004). Identification and quantitation of mucosal and faecal desulfovibrios using real time ” polymerase chain reaction”. In: Gut 53.4, pagina 523. Fujimoto, K., H. Kimoto, M. Shishikura, Y. Endo en K. Ogimoto (1993). Biohydrogenation of ” linoleic acid by anaerobic bacteria isolated from rumen”. In: Bioscience, biotechnology, and biochemistry 57.6, pagina’s 1026-1027. Galbraith, H. en T. Miller (1973). Effect of long chain fatty acids on bacterial respiration and ” amino acid uptake”. In: Journal of Applied Microbiology 36.4, pagina’s 659-675. Gibson, G., J. Cummings, G. Macfarlane, C. Allison, I. Segal, H. Vorster en A. Walker (1990). Alternative pathways for hydrogen disposal during fermentation in the human colon.” In: ” Gut 31.6, pagina 679. Gibson, G., G. Macfarlane en J. Cummings (1993). Sulphate reducing bacteria and hydrogen ” metabolism in the human large intestine.” In: Gut 34.4, pagina 437. Gonz´alez-P´eriz, A. en J. Cl` aria (2010). Resolution of adipose tissue inflammation.” In: ” ScientificWorldJournal 10, pagina’s 832-56.
93
Bibliografie Greenberger, N., J. Rodgers en K. Isselbacher (1966). Absorption of medium and long chain ” triglycerides: factors influencing their hydrolysis and transport.” In: Journal of Clinical Investigation 45.2, pagina 217. Griffiths, R., A. Whiteley, A. ODonnell en M. Bailey (2000). Rapid method form coextraction ” of DNA and RNA form natural environments for analysis of ribosomal DNA and RNA based microbial community composition”. In: Applied and Environmental Microbiology 66, pagina’s 5488-5491. Hanbauer, I., I. Rivero-Covelo, E. Maloku, A. Baca, Q. Hu, J. R. Hibbeln en J. M. Davis (2009). The decrease of n-3 fatty acid energy percentage in an equicaloric diet fed to b6c3fe mice ” for three generations elicits obesity.” In: Cardiovasc Psychiatry Neurol 2009, pagina 867041. Hawthorne, A., B. Filipowicz, T. Edwards en C. Hawkey (1990). High dose eicosapentaenoic ” acid ethyl ester: effects on lipids and neutrophil leukotriene production in normal volunteers.” In: British Journal of Clinical Pharmacology 30.2, pagina 187. Heck, A., J. Yanovski en K. Calis (2000). Orlistat, a new lipase inhibitor for the management ” of obesity”. In: Pharmacotherapy 20.3, pagina’s 270-279. Heijtz, R., S. Wang, F. Anuar, Y. Qian, B. Bj¨orkholm, A. Samuelsson, M. Hibberd, H. Forssberg en S. Pettersson (2011). Normal gut microbiota modulates brain development ” and behavior”. In: Proceedings of the National Academy of Sciences 108.7, pagina 3047. Hekmatdoost, A., M. Feizabadi, A. Djazayery, A. Mirshafiey, M. Eshraghian, S. Yeganeh, R. Sedaghat en K. Jacobson (2009). The effect of dietary oils on cecal microflora in ” experimental colitis in mice”. In: Indian Journal of Gastroenterology 27.5, pagina 186. Hernell, O., L. Bl¨ ackberg en S. Bernb¨ ack (1989). Digestion of human milk fat in early infancy”. ” In: Acta Pædiatrica 78.s351, pagina’s 57-62. Hibbeln, J., L. Nieminen en W. Lands (2004). Increasing homicide rates and linoleic acid ” consumption among five Western countries, 1961-2000”. In: Lipids 39.12, pagina’s 1207-1213. Hildebrandt, M., C. Hoffmann, S. Sherrill-Mix, S. Keilbaugh, M. Hamady, Y. Chen, R. Knight, R. Ahima, F. Bushman en G. Wu (2009). High-fat diet determines the composition of the ” murine gut microbiome independently of obesity”. In: Gastroenterology 137.5, pagina’s 17161724. Hill, M. J. (1995). Bacteria and fat digestion”. In: Role of gut bacteria in human toxicology and ” pharmacology, pagina’s 131-142. Hopkins, M. en G. Macfarlane (2003). Nondigestible oligosaccharides enhance bacterial ” colonization resistance against Clostridium difficile in vitro”. In: Applied and environmental microbiology 69.4, pagina 1920. Howard, F. en C. Henderson (1999). Hydrogenation of polyunsaturated fatty acids by human ” colonic bacteria”. In: Letters in applied microbiology 29.3, pagina’s 193-196.
94
Bibliografie Hughes, R., E. Magee en S. Bingham (2000). Protein degradation in the large intestine: ” relevance to colorectal cancer”. In: Current Issues in Intestinal Microbiology 1.2, pagina’s 5158. Hunter, W., F. Baker, I. Rosenfeld, J. Keyser en S. Tove (1976). Biohydrogenation of ” unsaturated fatty acids. Hydrogenation by cell-free preparations of Butyrivibrio fibrisolvens.” In: Journal of Biological Chemistry 251.8, pagina 2241. Ichikawa, H. en T. Sakata (1998). Stimulation of epithelial cell proliferation of isolated distal ” colon of rats by continuous colonic infusion of ammonia or short-chain fatty acids is nonadditive”. In: The Journal of nutrition 128.5, pagina 843. Idris, C. en K. Sundram (2002). Effect of dietary cholesterol, trans and saturated fatty acids ” on serum lipoproteins in non-human primates”. In: Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 11, S408-S415. Ikeda, I., Y. Tomari, M. Sugano, S. Watanabe en J. Nagata (1991). Lymphatic absorption ” of structured glycerolipids containing medium-chain fatty acids and linoleic acid, and their effect on cholesterol absorption in rats”. In: Lipids 26.5, pagina’s 369-373. IUPAC. International Union of Pure and Applied Chemistry. url: http://www.iupac.org/. Jaeger, K., S. Ransac, B. Dijkstra, C. Colson, M. van Heuvel en O. Misset (1994). Bacterial ” lipases”. In: FEMS Microbiology Reviews 15.1, pagina’s 29-63. Jandacek, R., J. Whiteside, B. Holcombe, R. Volpenhein en J. Taulbee (1987). The rapid ” hydrolysis and efficient absorption of triglycerides with octanoic acid in the 1 and 3 positions and long-chain fatty acid in the 2 position”. In: American Journal of Clinical Nutrition 45.5, pagina 940. Jenkins, T., R. Wallace, P. Moate en E. Mosley (2008). Board-invited review: Recent advances ” in biohydrogenation of unsaturated fatty acids within the rumen microbial ecosystem”. In: Journal of Animal Science 86.2, pagina 397. John Wallace, R, L. C. Chaudhary, N. McKain, N. R. McEwan, A. J. Richardson, P. E. Vercoe, N. D. Walker en D. Paillard (december 2006). Clostridium proteoclasticum: A ruminal ” bacterium that forms stearic acid from linoleic acid.” In: FEMS Microbiol Lett 265.2, pagina’s 195-201. Juste, C. (2005). Dietary fatty acids, intestinal microbiota and cancer”. In: Bull Cancer 92.7, ” pagina’s 708-721. Kankaanpaa, P., B. Yang, H. Kallio, E. Isolauri en S. Salminen (2004). Effects of polyunsa” turated fatty acids in growth medium on lipid composition and on physicochemical surface properties of lactobacilli”. In: Applied and environmental microbiology 70.1, pagina 129. Kellens, M., H. Goderis en P. Tobback (1986). Biohydrogenation of unsaturated fatty acids ” by a mixed culture of rumen microorganisms”. In: Biotechnology and bioengineering 28.8, pagina’s 1268-1276.
95
Bibliografie Kelsay, J., K. Behall en E. Prather (1978). Effect of fiber from fruits and vegetables on metabolic ” responses of human subjects. Bowel transit time, number of defecations, fecal weight, urinary excretions of energy and nitrogen and apparent digestibilities of energy, nitrogen, and fat”. In: American Journal of Clinical Nutrition 31.7, pagina 1149. Kemp, M., B. Jeffy en D. Romagnolo (2003). Conjugated linoleic acid inhibits cell proliferation ” through a p53-dependent mechanism: effects on the expression of G1-restriction points in breast and colon cancer cells”. In: The Journal of nutrition 133.11, pagina 3670. Kemp, P. en D. Lander (1984). Hydrogenation in vitro of {alpha}-linolenic acid to stearic acid ” by mixed cultures of pure strains of rumen bacteria”. In: Microbiology 130.3, pagina 527. Kemp, P., D. Lander en F. Gunstone (1984). The hydrogenation of some cis-and trans” octadecenoic acids to stearic acid by a rumen Fusocillus sp.” In: The British journal of nutrition 52.1, pagina 165. ˆ Kochan, Z., J. Karbowska en E. Babicz-Zieli˚ AAska (2010). [Dietary trans-fatty acids and ” metabolic syndrome].” In: Postepy Hig Med Dosw (Online) 64, pagina’s 650-8. Kowalchuk, G., P. Bodelier, G. Heilig, J. Stephen en H. Laanbroek (1998). Community ” analysis of ammonia-oxidising bacteria, in relation to oxygen availability in soils and rootoxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridisation”. In: FEMS Microbiology Ecology 27.4, pagina’s 339-350. Kristjansson, J., P. Sch¨ onheit en R. Thauer (1982). Different K values for hydrogen of ” methanogenic bacteria and sulfate reducing bacteria: an explanation for the apparent inhibition of methanogenesis by sulfate”. In: Archives of microbiology 131.3, pagina’s 278-282. Kritchevsky, D (mei 2000). Antimutagenic and some other effects of conjugated linoleic acid.” ” In: Br J Nutr 83.5, pagina’s 459-65. Kuda, T., T. Enomoto, T. Yano en T. Fujii (2000). Cecal environment and TBARS level in ” mice fed corn oil, beef tallow and menhaden fish oil”. In: Journal of nutritional science and vitaminology 46.2, pagina’s 65-70. Lampen, A., M. Leifheit, J. Voss en H. Nau (2005). Molecular and cellular effects of cis-9, ” trans-11-conjugated linoleic acid in enterocytes: effects on proliferation, differentiation, and gene expression”. In: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1735.1, pagina’s 30-40. Lennarz, W. (1966). Lipid metabolism in the bacteria.” In: Advances in lipid research 4, ” pagina 175. Levine, J., C. Ellis, J. Furne, J. Springfield en M. Levitt (1998). Fecal hydrogen sulfide ” production in ulcerative colitis”. In: The American journal of gastroenterology 93.1, pagina’s 83-87. Ley, R. (2010). Obesity and the human microbiome”. In: Current opinion in gastroenterology ” 26.1, pagina 5.
96
Bibliografie Liavonchanka, A., E. Hornung, I. Feussner en M. Rudolph (2006). Structure and mechanism of ” the Propionibacterium acnes polyunsaturated fatty acid isomerase”. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103.8, pagina 2576. Lien, E., F. Boyle, R. Yuhas, R. Tomarelli en P. Quinlan (1997). The effect of triglyceride posi” tional distribution on fatty acid absorption in rats”. In: Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 25.2, pagina 167. LOGKOW. A databank of evaluated octanol-water partition coefficients. Sangster Research Laboratories. url: http://logkow.cisti.nrc.ca/logkow/index.jsp. Lopez-Garcia, E., M. Schulze, J. Meigs, J. Manson, N. Rifai, M. Stampfer, W. Willett en F. Hu (2005). Consumption of trans fatty acids is related to plasma biomarkers of inflammation ” and endothelial dysfunction”. In: Journal of Nutrition 135.3, pagina 562. issn: 0022-3166. Maia, M. R. G., L. C. Chaudhary, L. Figueres en R. J. Wallace (mei 2007a). Metabolism of ” polyunsaturated fatty acids and their toxicity to the microflora of the rumen.” In: Antonie Van Leeuwenhoek 91.4, pagina’s 303-14. Maia, M., L. Chaudhary, L. Figueres en R. Wallace (2007b). Metabolism of polyunsaturated ” fatty acids and their toxicity to the microflora of the rumen”. In: Antonie Van Leeuwenhoek 91.4, pagina’s 303-314. Maia, M., L. Chaudhary, C. Bestwick, A. Richardson, N. McKain, T. Larson, I. Graham en R. Wallace (2010). Toxicity of unsaturated fatty acids to the biohydrogenating ruminal ” bacterium, Butyrivibrio fibrisolvens”. In: BMC microbiology 10.1, pagina 52. Mansilla, M. en D. de Mendoza (2005). The Bacillus subtilis desaturase: a model to understand ” phospholipid modification and temperature sensing”. In: Archives of microbiology 183.4, pagina’s 229-235. Massiera, F., P. Barbry, P. Guesnet, A. Joly, S. Luquet, C. Moreilhon-Brest, T. Mohsen-Kanson, E.-Z. Amri en G. Ailhaud (augustus 2010). A Western-like fat diet is sufficient to induce a ” gradual enhancement in fat mass over generations.” In: J Lipid Res 51.8, pagina’s 2352-61. McIntosh, F. M., K. J. Shingfield, E. Devillard, W. R. Russell en R. J. Wallace (2009). Mechanism of conjugated linoleic acid and vaccenic acid formation in human faecal ” suspensions and pure cultures of intestinal bacteria.” In: Microbiology 155.Pt 1, pagina’s 28594. Meier, R., C. Beglinger, J. Dederding, B. Meyer-Wyss, M. Fumagalli, A. Rowedder, Y. Turberg en R. Brignoli (1995). Influence of age, gender, hormonal status and smoking habits on ” colonic transit time.” In: Neurogastroenterology and motility: the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society 7.4, pagina 235. Mensink, R., E. Temme en G. Hornstra (1994). Dietary saturated and trans fatty acids and ” lipoprotein metabolism”. In: Annals of medicine 26.6, pagina’s 461-464.
97
Bibliografie Mente, A., L. de Koning, H. Shannon en S. Anand (2009). A systematic review of the evidence ” supporting a causal link between dietary factors and coronary heart disease”. In: Archives of internal medicine 169.7, pagina 659. Mertens, B., N. Boon en W. Verstraete (2005). Stereospecific effect of hexachlorocyclohexane on ” activity and structure of soil methanotrophic communities”. In: Environmental microbiology 7.5, pagina’s 660-669. Metcalf, A., S. Phillips, A. Zinsmeister, R. MacCarty, R. Beart en B. Wolff (1987). Simplified ” assessment of segmental colonic transit.” In: Gastroenterology 92.1, pagina 40. Molly, K., M. Woestyne en W. Verstraete (1993). Development of a 5-step multi-chamber ” reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem”. In: Applied Microbiology and Biotechnology 39.2, pagina’s 254-258. Montgomery, L. (1988). Isolation of human colonic fibrolytic bacteria”. In: Letters in applied ” microbiology 6.3, pagina’s 55-57. Mosley, E., G. Powell, M. Riley en T. Jenkins (2002). Microbial biohydrogenation of oleic acid ” to trans isomers in vitro”. In: Journal of Lipid Research 43.2, pagina 290. Mozaffarian, D en R Clarke (mei 2009). Quantitative effects on cardiovascular risk factors and ” coronary heart disease risk of replacing partially hydrogenated vegetable oils with other fats and oils.” In: Eur J Clin Nutr 63 Suppl 2, S22-33. Nakamura, N., H. Lin, C. McSweeney, R. Mackie en H. Gaskins (2010). Mechanisms of microbial ” hydrogen disposal in the human colon and implications for health and disease”. In: Food Science and Technology 1. Neish, A. (2009). Microbes in gastrointestinal health and disease”. In: Gastroenterology 136.1, ” pagina’s 65-80. Ness, A. (2004). Diet, Nutrition and the Prevention of Chronic Diseases. WHO Technical Report ” Series 916. Report of a Joint WHO/FSA Expert Consultation.” In: International Journal of Epidemiology 33.4, pagina’s 914-915. Nichenametla, S., E. South en J. Exon (2004). Interaction of conjugated linoleic acid, ” sphingomyelin, and butyrate on formation of colonic aberrant crypt foci and immune functions in rats”. In: Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A 67.6, pagina’s 469-481. Nielsen, S., D. Nielsen, L. Lauritzen, M. Jakobsen en K. Michaelsen (2007). Impact of diet on ” the intestinal microbiota in 10-month-old infants”. In: Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 44.5, pagina 613. Nieman, C. (1954). Influence of trace amounts of fatty acids on the growth of microorganisms”. ” In: Microbiology and Molecular Biology Reviews 18.2, pagina 147.
98
Bibliografie Nordgaard, I., B. Hansen en P. Mortensen (1996). Importance of colonic support for energy ” absorption as small-bowel failure proceeds”. In: American Journal of Clinical Nutrition 64.2, pagina 222. OECD (2010). OECD factbook 2010: economic, environmental and social statistics. Ogawa, J., K. Matsumura, S. Kishino, Y. Omura en S. Shimizu (2001). Conjugated linoleic acid ” accumulation via 10-hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus”. In: Applied and environmental microbiology 67.3, pagina 1246. Oleskin, A. (2009). Neurochemistry and symbiotic microflora of humans: Biopolitical aspects”. ” In: Herald of the Russian Academy of Sciences 79.3, pagina’s 274-280. Paillard, D., N. McKain, L. Chaudhary, N. Walker, F. Pizette, I. Koppova, N. McEwan, J. Kope˘cn´ y, P. Vercoe, P. Louis et al. (2007). Relation between phylogenetic position, lipid ” metabolism and butyrate production by different Butyrivibrio-like bacteria from the rumen”. In: Antonie Van Leeuwenhoek 91.4, pagina’s 417-422. Pariza, M. (2004). Perspective on the safety and effectiveness of conjugated linoleic acid”. In: ” The American journal of clinical nutrition 79.6, 1132S. Paul, J. en E. Beauchamp (1989). Relationship between volatile fatty acids, total ammonia, ” and pH in manure slurries”. In: Biological Wastes 29.4, pagina’s 313-318. Pearson, J. R. en F. A. Jones (mei 1973). Alteration of dietary fatty acid by human intestinal ” bacteria.” In: Proc Nutr Soc 32.1, 8A-9A. Plourde, M. en S. Cunnane (2007). Extremely limited synthesis of long chain polyunsaturates ” in adults: implications for their dietary essentiality and use as supplements”. In: Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism 32.4, pagina’s 619-634. Polan, C., J. McNeill en S. Tove (1964). Biohydrogenation of unsaturated fatty acids by rumen ” bacteria”. In: Journal of Bacteriology 88.4, pagina 1056. Possemiers, S., A. Heyerick, V. Robbens, D. De Keukeleire en W. Verstraete (2005). Activation ” of proestrogens from hops (Humulus lupulus L.) by intestinal microbiota; conversion of isoxanthohumol into 8-prenylnaringenin”. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry 53.16, pagina’s 6281-6288. Proell, J., E. Mosley, G. Powell en T. Jenkins (2002). Isomerization of stable isotopically labeled ” elaidic acid to cis and trans monoenes by ruminal microbes”. In: Journal of lipid research 43.12, pagina 2072. Pyle, G., B. Paaso, B. Anderson, D. Allen, T. Marti, C. Khosla en G. Gray (2005). Low” dose gluten challenge in celiac sprue: malabsorptive and antibody responses.” In: Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 3.7, pagina 679.
99
Bibliografie Raes, K., S. De Smet en D. Demeyer (2004). Effect of dietary fatty acids on incorporation of ” long chain polyunsaturated fatty acids and conjugated linoleic acid in lamb, beef and pork meat: a review”. In: Animal Feed Science and Technology 113.1-4, pagina’s 199-221. Ramsden, C. E., J. R. Hibbeln, S. F. Majchrzak en J. M. Davis (december 2010). n-6 fatty acid” specific and mixed polyunsaturate dietary interventions have different effects on CHD risk: a meta-analysis of randomised controlled trials.” In: Br J Nutr 104.11, pagina’s 1586-600. Ravnskov, U. (1998). The questionable role of saturated and polyunsaturated fatty acids in ” cardiovascular disease”. In: Journal of clinical epidemiology 51, pagina’s 443-460. Reinhardt, C., C. Reigstad en F. B¨ ackhed (2009). Intestinal microbiota during infancy and ” its implications for obesity”. In: Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 48.3, pagina 249. Ringø, E., H. R. Bendiksen, S. J. Gausen, A. Sundsfjord en R. E. Olsen (1998). The effect of ” dietary fatty acids on lactic acid bacteria associated with the epithelial mucosa and from faecalia of Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.)” In: Journal of Applied Microbiology 85.5, pagina’s 855-864. Ris´erus, U., S. Basu, S. Jovinge, G. N. Fredrikson, J. Arnl¨ov en B. Vessby (oktober 2002a). Supplementation with conjugated linoleic acid causes isomer-dependent oxidative stress ” and elevated C-reactive protein: a potential link to fatty acid-induced insulin resistance.” In: Circulation 106.15, pagina’s 1925-9. Ris´erus, U., P. Arner, K. Brismar en B. Vessby (september 2002b). Treatment with dietary ” trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid causes isomer-specific insulin resistance in obese men with the metabolic syndrome.” In: Diabetes Care 25.9, pagina’s 1516-21. Rosenfeld, I. en S. Tove (1971). Biohydrogenation of unsaturated fatty acids”. In: Journal of ” Biological Chemistry 246.16, pagina 5025. Round, J. L. en S. K. Mazmanian (mei 2009). The gut microbiota shapes intestinal immune ” responses during health and disease.” In: Nat Rev Immunol 9.5, pagina’s 313-23. Rumney, C., S. Duncan, C. Henderson en C. Stewart (1995). Isolation and characteristics of a ” wheatbran-degrading Butyrivibrio from human faeces”. In: Letters in applied microbiology 20.4, pagina’s 232-236. Salminen, S., C. Bouley, M. Boutron, J. Cummings, A. Franck, G. Gibson, E. Isolauri, M. Moreau, M. Roberfroid en I. Rowland (1998). Functional food science and gastrointestinal ” physiology and function”. In: British Journal of Nutrition 80.S1, S147-S171. ˆ S´anchez-Villegas, A., L. Verberne, J. De Irala, M. RuiAz-Canela, E. Toledo, L. Serra-Majem en ˆ M. A. MartiAnez-Gonz´ alez (2011). Dietary fat intake and the risk of depression: the SUN ” project.” In: PLoS One 6.1, e16268. Sandler, R., S. Finegold, E. Bolte, C. Buchanan, A. Maxwell, M. V¨ais¨anen, M. Nelson en H. Wexler (2000). Short-term benefit from oral vancomycin treatment of regressive-onset ” autism”. In: Journal of child neurology 15.7, pagina 429. 100
Bibliografie Sasaki, D., S. Dumas en E. Engleman (1987). Discrimination of viable and non-viable cells using ” propidium iodide in two color immunofluorescence”. In: Cytometry 8.4, pagina’s 413-420. Scheppach, W. en F. Weiler (2004). The butyrate story: old wine in new bottles?” In: Current ” Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care 7.5, pagina 563. Schmeits, B. L., J. A. Cook, D. J. VanderJagt, M. A. Magnussen, S. K. Bhatt, E. G. Bobik, Y.-S. Huang en R. H. Glew (1999). Fatty acid composition of the milk lipids of women in ” Nepal”. In: Nutrition Research 19.9, pagina’s 1339-1348. S´eb´edio, J. en W. Christie (1998). Trans fatty acids in human nutrition. first edition. The oily press. Serjeant, E. en B. Dempsey (1979). Ionisation constants of organic acids in aqueous solution. Pergamon, Oxford. Sheu, C. en E. Freese (1973). Lipopolysaccharide layer protection of gram-negative bacteria ” against inhibition by long-chain fatty acids”. In: Journal of Bacteriology 115.3, pagina 869. Shorland, F. (1954). Occurrence of Fatty Acids with Uneven-numbered Carbon Atoms in ” Natural Fats”. In: Shornikova, A., I. Casas, H. mykk¨ anen, E. Salo en T. Vesikari (1997). Bacteriotherapy with ” Lactobacillus reuteri in rotavirus gastroenteritis”. In: The Pediatric infectious disease journal 16.12, pagina 1103. Simopoulos, A. (1999). Essential fatty acids in health and chronic disease”. In: American Journal ” of Clinical Nutrition 70.3, 560S. Simopoulos, A. (2002). The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids”. ” In: Biomedecine & Pharmacotherapy 56.8, pagina’s 365-379. Simopoulos, A. (2008). The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in cardio” vascular disease and other chronic diseases”. In: Experimental Biology and Medicine 233.6, pagina 674. Sinensky, M. (1974). Homeoviscous adaptation —a homeostatic process that regulates the ” viscosity of membrane lipids in Escherichia coli”. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71.2, pagina 522. Siri-Tarino, P., Q. Sun, F. Hu en R. Krauss (2010). Meta-analysis of prospective cohort studies ” evaluating the association of saturated fat with cardiovascular disease”. In: American Journal of Clinical Nutrition. Skeaff, C. M. en J. Miller (2009). Dietary fat and coronary heart disease: summary of evidence ” from prospective cohort and randomised controlled trials.” In: Ann Nutr Metab 55.1-3, pagina’s 173-201. Sonestedt, E., U. Ericson, B. Gullberg, K. Skog, H. Olsson en E. Wirf¨alt (2008). Do both ” heterocyclic amines and omega-6 polyunsaturated fatty acids contribute to the incidence
101
Bibliografie of breast cancer in postmenopausal women of the Malm¨o diet and cancer cohort?” In: International Journal of Cancer 123.7, pagina’s 1637-1643. issn: 1097-0215. Spiller, G., J. Story, L. Wong, J. Nunes, M. Alton, M. Petro, E. Furumoto, J. Whittam en J. Scala (1986). Effect of increasing levels of hard wheat fiber on fecal weight, minerals and ” steroids and gastrointestinal transit time in healthy young women”. In: Journal of Nutrition 116.5, pagina 778. Spiller, R., I. Trotman, B. Higgins, M. Ghatei, G. Grimble, Y. Lee, S. Bloom, J. Misiewicz en D. Silk (1984). The ileal brake–inhibition of jejunal motility after ileal fat perfusion in man.” ” In: British Medical Journal 25.4, pagina 365. Sprecher, H. (1981). Biochemistry of essential fatty acids.” In: Progress in lipid research 20, ” pagina 13. Steck, S., A. Chalecki, P. Miller, J. Conway, G. Austin, J. Hardin, C. Albright en P. Thuillier (2007). Conjugated linoleic acid supplementation for twelve weeks increases lean body mass ” in obese humans”. In: Journal of Nutrition 137.5, pagina 1188. Steinberg, D. (2006). Thematic review series: the pathogenesis of atherosclerosis. An ” interpretive history of the cholesterol controversy, part V: the discovery of the statins and the end of the controversy”. In: Journal of Lipid Research 47.7, pagina 1339. Stender, S. en J. Dyerberg (2000). Influence of trans fatty acids on health”. In: Annals of ” Nutrition and Metabolism 48.2, pagina’s 61-66. issn: 0250-6807. Sukhija, P. en D. Palmquist (1988). Rapid method for determination of total fatty acid content ” and composition of feedstuffs and feces”. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry 36.6, pagina’s 1202-1206. Talarico, T., I. Casas, T. Chung en W. Dobrogosz (1988). Production and isolation of ” reuterin, a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri.” In: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32.12, pagina 1854. Tardy, A.-L., B. Morio, J.-M. Chardigny en C. Malpuech-Brug`ere (februari 2011). Ruminant ” and industrial sources of trans-fat and cardiovascular and diabetic diseases.” In: Nutr Res Rev, pagina’s 1-7. Tasaka, Y., Z. Gombos, Y. Nishiyama, P. Mohanty, T. Ohba, K. Ohki en N. Murata (1996). Targeted mutagenesis of acyl-lipid desaturases in Synechocystis: evidence for the important ” roles of polyunsaturated membrane lipids in growth, respiration and photosynthesis.” In: The EMBO Journal 15.23, pagina 6416. Terpstra, A. (2004). Effect of conjugated linoleic acid on body composition and plasma lipids ” in humans: an overview of the literature”. In: American Journal of Clinical Nutrition 79.3, pagina 352. Thauer, R., K. Jungermann en K. Decker (1977). Energy conservation in chemotrophic ” anaerobic bacteria.” In: Microbiology and Molecular Biology Reviews 41.1, pagina 100.
102
Bibliografie Thompson, G. (1999). The proving of the lipid hypothesis”. In: Current opinion in lipidology ” 10.3, pagina 201. Thompson, L. en R. Spiller (1995). Impact of polyunsaturated fatty acids on human colonic ” bacterial metabolism: an in vitro and in vivo study”. In: British Journal of Nutrition 74.05, pagina’s 733-741. Tiruppathi, C. en K. Balasubramania (1982). Purification and properties of an acid lipase from ” human gastric juice”. In: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism 712.3, pagina’s 692-697. Tjonneland, A., K. Overvad, M. Bergmann, G. Nagel, J. Linseisen, G. Hallmans, R. Palmqvist, H. Sjodin, G. Hagglund, G. Berglund et al. (2009). Linoleic acid, a dietary ” n-6 polyunsaturated fatty acid, and the aetiology of ulcerative colitis: a nested case-control study within a European prospective cohort study”. In: Gut 58.12. Tsai, F. en W. Coyle (2009). The microbiome and obesity: Is obesity linked to our gut flora?” ” In: Current gastroenterology reports 11.4, pagina’s 307-313. Turnbaugh, P., F. B¨ ackhed, L. Fulton en J. Gordon (2008). Diet-induced obesity is linked ” to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome”. In: Cell Host & Microbe 3.4, pagina’s 213-223. Valeur, N., P. Engel, N. Carbajal, E. Connolly en K. Ladefoged (2004). Colonization and ” immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract”. In: Applied and environmental microbiology 70.2, pagina 1176. Van Citters, G. en H. Lin (1999). The ileal brake: a fifteen-year progress report”. In: Current ” Gastroenterology Reports 1.5, pagina’s 404-409. Van De Graaff, K. (2001). Van De Graaff: Human anatomy. Sixth edition. McGraw-Hill. Van der Meulen, R., L. Makras, K. Verbrugghe, T. Adriany en L. De Vuyst (2006). In ” vitro kinetic analysis of oligofructose consumption by Bacteroides and Bifidobacterium spp. indicates different degradation mechanisms”. In: Applied and environmental microbiology 72.2, pagina 1006. Vlaeminck, B., V. Fievez, D. Demeyer en R. Dewhurst (2006). Effect of forage: concentrate ratio ” on fatty acid composition of rumen bacteria isolated from ruminal and duodenal digesta”. In: Journal of dairy science 89.7, pagina’s 2668-2678. Vonk, R., M. Kalivianakis, D. Minich, C. Bijleveld en H. Verkade (1997). The metabolic ” importance of unabsorbed dietary lipids in the colon.” In: Scandinavian journal of gastroenterology. Supplement 222, pagina 65. Wakefield, A. (2002). The gut-brain axis in childhood developmental disorders”. In: Journal of ” pediatric gastroenterology and nutrition 34, S14.
103
Bibliografie Wallace, J., L. Vong, W. McKnight, M. Dicay en G. Martin (2009). Endogenous and ” exogenous hydrogen sulfide promotes resolution of colitis in rats”. In: Gastroenterology 137.2, pagina’s 569-578. Wallace, R., L. Chaudhary, N. McKain, N. McEwan, A. Richardson, P. Vercoe, N. Walker en D. Paillard (2006). Clostridium proteoclasticum: a ruminal bacterium that forms stearic ” acid from linoleic acid”. In: FEMS microbiology letters 265.2, pagina’s 195-201. Wallace, R., N. McKain, K. Shingfield en E. Devillard (2007). Isomers of conjugated linoleic ” acids are synthesized via different mechanisms in ruminal digesta and bacteria”. In: Journal of lipid research 48.10, pagina 2247. Wang, C., W. Harris, M. Chung, A. Lichtenstein, E. Balk, B. Kupelnick, H. Jordan en J. Lau (2006). n-3 Fatty acids from fish or fish-oil supplements, but not {alpha}-linolenic ” acid, benefit cardiovascular disease outcomes in primary-and secondary-prevention studies: a systematic review”. In: American Journal of Clinical Nutrition 84.1, pagina 5. Ward Jr, J. (1963). Hierarchical grouping to optimize an objective function”. In: Journal of the ” American statistical association 58.301, pagina’s 236-244. Weber, M., W. Klein, L. M¨ uller, U. Niess en M. Marahiel (2001). Role of the Bacillus subtilis ” fatty acid desaturase in membrane adaptation during cold shock”. In: Molecular Microbiology 39.5, pagina’s 1321-1329. Wikipedia. Wikipedia foundation inc. url: http://www.wikipedia.org/. Wikoff, W., A. Anfora, J. Liu, P. Schultz, S. Lesley, E. Peters en G. Siuzdak (2009). Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood ” metabolites”. In: Proceedings of the National Academy of Sciences 106.10, pagina 3698. Wilson, T. (1962). Intestinal absorption.” In: Intestinal absorption. ” Xu, J., M. Mahowald, R. Ley, C. Lozupone, M. Hamady, E. Martens, B. Henrissat, P. Coutinho, P. Minx, P. Latreille et al. (2007). Evolution of symbiotic bacteria in the distal human ” intestine”. In: PLoS Biol 5.7, e156. Zaslavsky, C., T. Reverbel da Silveira en I. Maguilnik (1998). Total and segmental colonic ” transit time with radio-opaque markers in adolescents with functional constipation”. In: Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 27.2, pagina 138. Zhang, Y. en C. Rock (2008). Membrane lipid homeostasis in bacteria”. In: Nature Reviews ” Microbiology 6.3, pagina’s 222-233.
104
