nists as preferred treatment for patients with essential hypertension and known LVH, especially in diabetic patients.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
literatuur Neal B, MacMahon S, Chapman N. Effects of ACE inhibitors, calcium antagonists, and other blood-pressure-lowering drugs: results of prospectively designed overviews of randomised trials. Lancet 2000;356:1955-64. Walma EP, Grundmeijer HGLM, Thomas A, Prins A, Hoogen JPH van den, Laan JR van der. NHG-standaard Hypertensie. In: Geijer RMM, Burgers JS, Laan JR van der, Wiersma Tj, Rosmalen CFH, Thomas S, redacteuren. NHG-standaarden voor de huisarts. Deel 1. 2e dr. Maarssen: Elsevier/Bunge; 1999. p. 185-205. 1999 World Health Organization – International Society of Hypertension Guidelines for the management of hypertension. Guidelines subcommittee. J Hypertens 1999;17:151-83. The Norwegian Multicenter Study Group. Timolol-induced reduction in mortality and reinfarction in patients surviving acute myocardial infarction. N Engl J Med 1981;304:801-7. Levy D, Garrison RJ, Savage DD, Kannel WB, Castelli WP. Prognostic implications of echocardiographically determined left ventricular mass in the Framingham Heart Study. N Engl J Med 1990;322:1561-6. Brunner HR. Experimental and clinical evidence that angiotensin II is an independent risk factor for cardiovascular disease. Am J Cardiol 2001;87(Suppl 8A):3C-9C. Dählof B, Devereux RB, Kjeldsen SE, Julius S, Beevers G, de Faire U, et al. Cardiovascular morbidity and mortality in the Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a randomised trial against atenolol. Lancet 2002;359:995-1003. Lindholm LH, Ibsen H, Dählof B, Devereux RB, Beevers G, de Faire U, et al. Cardiovascular morbidity and mortality in patients with diabetes in the Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a randomised trial against atenolol. Lancet 2002;359:1004-10. Hansson L, Lindholm LH, Niskanen L, Lanke J, Hedner T, Niklason A, et al. Effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition compared with conventional therapy on cardiovascular morbidity and mortality in hypertension: the Captopril Prevention Project (CAPPP) randomised trial. Lancet 1999;353:611-6.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Hansson L, Lindholm LH, Ekbom T, Dählof B, Lanke J, Schersten B, et al. Randomised trial of old and new antihypertensive drugs in elderly patients: cardiovascular mortality and morbidity in the Swedish Trial in Old Patients with Hypertension-2 study. Lancet 1999;354:1751-6. UK Prospective Diabetes Study Group. Efficacy of atenolol and captopril in reducing risk of macrovascular and microvascular complications in type 2 diabetes: UKPDS 39. BMJ 1998;317:713-20. Benetos A, Gautier S, Lafleche A, Topouchian J, Frangin G, Girerd X, et al. Blockade of angiotensin II type 1 receptors: effect on carotid and radial artery structure and function in hypertensive humans. J Vasc Res 2000;37:8-15. Verdecchia P, Porcellati C, Reboldi G, Gattobigio R, Borgioni C, Pearson TA, et al. Left ventricular hypertrophy as an independent predictor of acute cerebrovascular events in essential hypertension. Circulation 2001;104:2039-44. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. Effects of ramipril on cardiovascular and microvascular outcomes in people with diabetes mellitus: results of the HOPE study and MICRO-HOPE substudy. Lancet 2000;355:253-9. Yusuf S, Sleight P, Pogue J, Bosch J, Davies R, Dagenais G. Effects of an angiotensin-converting-enzyme inhibitor, ramipril, on cardiovascular events in high-risk patients. N Engl J Med 2000;342: 145-53. Zanella MT, Kohlmann jr O, Ribeiro AB. Treatment of obesity hypertension and diabetes syndrome. Hypertension 2001;38(3 Pt 2): 705-8. Dählof B, Devereux R, de Faire U, Fyhrquist F, Hedner T, Ibsen H, et al. The Losartan Intervention For Endpoint reduction (LIFE) in hypertension study: rationale, design, and methods. Am J Hypertens 1997;10(7 Pt 1):705-13. Edwards RM, Trizna W, Stack EJ, Weinstock J. Interaction of nonpeptide angiotensin II receptor antagonists with the urate transporter in rat renal brush-border membranes. J Pharmacol Exp Ther 1996;276:125-9. Franse LV, Pahor M, Di Bari M, Shorr RI, Wan JY, Somes GW, et al. Serum uric acid, diuretic treatment and risk of cardiovascular events in the Systolic Hypertension in the Elderly Program (SHEP). J Hypertens 2000;18:1149-54. Aanvaard op 1 november 2002
Capita selecta
‘Proteomics’: het in kaart brengen van alle humane eiwitten p.h.reitsma en ch.g.de koster Het humane genoomproject is bijna klaar. Ongeveer 35.000 humane genen zijn geïdentificeerd en vele biomedische wetenschappers houden zich nu bezig met de vraag hoe deze schat aan informatie vertaald kan worden naar toepassingen die de gezondheid bevorderen. In het kielzog hiervan is een geheel nieuwe tak van wetenschap aan het ontstaan, die van het zogenaamde ‘omics’onderzoek.1 In een aantal opzichten wijkt ‘omics’-onAcademisch Medisch Centrum/Universiteit van Amsterdam, Laboratorium voor Experimentele Inwendige Geneeskunde, Meibergdreef 9, 1105 AZ Amsterdam. Prof.dr.P.H.Reitsma, moleculair bioloog. Universiteit van Amsterdam, Swammerdam Instituut voor Levenswetenschappen, Amsterdam. Prof.dr.Ch.G.de Koster, chemicus. Correspondentieadres: prof.dr.P.H.Reitsma (
[email protected]).
samenvatting – Het genoom van vele organismen, waaronder de mens, is nu grotendeels bekend. In het kielzog hiervan ontstaat de behoefte alle eiwitten die door genen gecodeerd worden te identificeren en meetbaar te maken (‘proteomics’). – Deze behoefte leidt tot stormachtige ontwikkelingen op het gebied van analysetechnieken, zoals tweedimensionale elektroforese, massaspectrometrie en eiwitchips. – De snelheid van de vooruitgang rechtvaardigt de verwachting dat het binnen 5-10 jaar inderdaad mogelijk wordt het proteoom van een organisme, of van onderdelen daarvan, zoals plasma, serum en weefsel, te bepalen. – In combinatie met informatie omtrent ontstaan en beloop van ziekte kan proteomics bijdragen aan het bevorderen van gezondheid en betere primaire en secundaire preventie.
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
99
derzoek af van meer traditioneel onderzoek in de biomedische wetenschappen. Zo is het vaak niet gebaseerd op een werkhypothese die tot doel heeft het bestuderen van een geïsoleerd biochemisch of moleculair-biologisch proces, maar het stelt zichzelf tot doel een biologisch systeem, bijvoorbeeld bloed, urine, ontlasting, de cel, een orgaan, het organisme, vanuit een bepaalde (technologische) invalshoek volledig in kaart te brengen. Termen die daarbij gebruikt worden zijn ‘genomics’ (kennis van genen), ‘transcriptomics’ (kennis van ‘messenger’RNA’s), ‘proteomics’ (kennis van eiwitten), ‘interactomics’ (kennis van netwerken van eiwitten), ‘metabolomics’ (kennis van metabolieten) en ‘glycomics’ (kennis van koolhydraten). In dit overzicht proberen wij een beeld te schetsen van de technologische vernieuwingen en benaderingen die nu actueel zijn. Het is goed ons hierbij te realiseren dat veel van de eiwittechnologie in principe al geruime tijd beschikbaar is. Er was echter weinig reden prioriteit te geven aan het verder ontwikkelen van de analysetechnieken, omdat de identiteit van eiwitten altijd moeilijk te achterhalen was. De vlekjes die al 25 jaar met tweedimensionale gelelektroforese zichtbaar gemaakt kunnen worden, krijgen tegenwoordig echter plotseling betekenis, nu wij steeds vaker, dankzij het humane genoomproject, weten welk eiwit ze vertegenwoordigen. proteomics en bio-informatica: ‘clinomics’ Proteomics is een van de veelbelovende onderzoeksvelden die in ontwikkeling is en aandacht trekt. Het doel van proteomics is om van een biologisch systeem zoals een organel, cel, weefsel, orgaan of zelfs van een organisme alle aanwezige eiwitten kwalitatief en kwantitatief in kaart te brengen. De complexiteit van het humane ‘proteoom’ wordt geschat op 80.000-100.000 eiwitten, maar dit aantal is wellicht nog groter.2 Zoveel eiwitten kunnen op dit moment bij lange na niet routinematig geanalyseerd worden, maar er worden wereldwijd nieuwe technieken ontwikkeld die dit wel mogelijk moeten maken. Wij zijn daarom niet bang de verwachting uit te spreken dat nieuwe proteomicstechnieken op middellange termijn een revolutie zullen veroorzaken in de laboratoriumanalyse van lichaamsmateriaal dat van patiënten afkomstig is. De ‘omics’-technologie, en proteomics vormt daarop geen uitzondering, kan enorme datastromen opleveren. Het is niet zinvol dat een arts in de toekomst per aangevraagde bepaling met duizenden datapunten geconfronteerd wordt. Daarom is het van het grootste belang om statistische en bio-informaticamethoden te ontwikkelen die de datastromen kanaliseren en vertalen naar direct bruikbare, op de patiënt toegesneden diagnostiek, prognostiek en behandeling, ook wel ‘clinomics’ genoemd, zonder dat de dokter zich hoeft af te vragen wat de precieze betekenis van elk datapunt is. Zonder deze vertaalslag blijft proteomics, en ‘omics’ in het algemeen, onbruikbaar voor de dagelijkse praktijk. Daarbij is het goed ons te realiseren dat de vertaalslag niet eenvoudig zal zijn en veel zal vragen van ons vermogen zorgvuldig, en vooral goed gedocumenteerd, lichaamsmateriaal van 100
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
patiënten te verzamelen, op te slaan en te analyseren. Koppeling van laboratoriumanalyse aan eveneens zorgvuldig verzamelde informatie met betrekking tot het ontstaan en het beloop van ziekte, levert pas het gewenste resultaat. Daarnaast kan ‘omics’-onderzoek nieuwe inzichten verschaffen in de pathogenese van complexe aandoeningen en nieuwe richtingen geven aan door hypothesen gestuurd onderzoek. eierstokkanker Een actueel toonbeeld van bovenstaande ontwikkelingen werd recent gepubliceerd.3 4 Eierstokkanker is goed te behandelen als deze in een vroeg stadium gediagnosticeerd wordt, maar late opsporing gaat gepaard met hoge morbiditeit en sterfte. Petricoin et al. beschrijven de ontdekking van een eiwitprofiel waarmee men goed onderscheid kan maken tussen individuen met kanker en zonder kanker.3 Interessant daarbij is dat niet gekeken is naar het kankerweefsel zelf, maar dat het eiwitprofiel aanwezig is in het bloed van de patiënten. Wat hebben de auteurs nu precies gedaan? Het onderzoek valt in twee onderdelen uiteen. Discriminerend eiwitprofiel. Allereerst werd in een cohort patiënten en een cohort controlepersonen een groot aantal eiwitten in het serum gemeten. Dit ging met behulp van een eiwit-‘chip’ die kleine hydrofobe eiwitten uit serum bindt (over eiwitchips volgt verderop meer). Gebonden eiwit werd vervolgens geanalyseerd met een zeer gevoelige massaspectrometer, hetgeen ongeveer 15.000 massametingen van eiwitten of fragmenten van eiwitten per monster genereerde. Vervolgens werd met behulp van clusteranalysen en genetische algoritmen gezocht naar een pakket van markereiwitten dat verschilde tussen de patiënten en de controlepersonen. Dit leverde een beperkte set van 5-20 eiwitten op die bruikbaar waren als voorspellers van kanker. De eiwitspectra uit deze eerste groep bepalingen werden daarmee als het ware gebruikt om een statistisch correct eiwitprofiel te ‘trainen’, dat wil zeggen een risicoprofiel te identificeren, zonder dat de vraag gesteld wordt hoe belangrijk elk eiwit afzonderlijk was in het discrimineren tussen ziek en gezond. Hierin wijkt deze methode enigszins af van de klassieke patiëntcontrole en oddsratiobenaderingen die de laatste jaren een grote vlucht genomen hebben in de analyse van risicofactoren voor ziekte. Voorspelling met behulp van het discriminerend eiwitprofiel. Daarna is met een tweede serie geblindeerde serummonsters gekeken hoe goed het model patronen kon interpreteren en hoe goed het kon voorspellen of serum afkomstig was van een patiënt met eierstokkanker of van een gezonde controlepersoon. Het bleek dat in deze testfase van het onderzoek alle kankers correct benoemd werden. Wel werden er van de 65 controlepersonen ‘slechts’ 63 correct gediagnosticeerd; bij 2 was de uitslag fout-positief. Deze laatste bevinding beperkt helaas de praktische toepassing van deze technologie voor screening op grote schaal, omdat eierstokkanker weinig voorkomt en fout-positieve uitslagen tot veel onnodige onrust en extra medisch handelen leiden. Toekomstig
onderzoek moet er dan ook op gericht zijn het aantal fout-positieve uitslagen drastisch te verminderen. Dit onderzoek illustreert fraai hoe proteomics van serum of plasma een bijdrage kan leveren aan de vroege opsporing van kanker en inderdaad gezondheid kan bevorderen. In dit geval is gekeken naar hydrofobe eiwitten, maar een andere aanpak geeft wellicht dezelfde of nog betere resultaten. Dezelfde benadering, dat wil zeggen eerst vaststellen van een risicoprofiel en vervolgens testen van de nauwkeurigheid van het model, leent zich voor erg veel klinische vraagstellingen.5-8 Behalve aan oncologische toepassingen moeten wij daarbij bijvoorbeeld denken aan voorspellingen van cardiovasculaire of neurologische problemen. proteomicstechnieken De volgende vraag is welke hindernissen nog genomen moeten worden om proteomics breed te kunnen toepassen, en welke technologische ontwikkelingen op dit moment actueel zijn. Laten wij weer als voorbeeld proteomics van serum en bloed nemen. Als wij proberen een goed beeld te krijgen van wat zich in dit compartiment afspeelt, worden wij gehinderd doordat slechts een klein aantal eiwitten (albumine, immunoglobulinen) meer dan 90% van de eiwitten vertegenwoordigt. Wij zijn meestal geïnteresseerd in eiwitten die in veel geringere concentraties voorkomen, maar een nauwkeurige analyse wordt gestoord door het vele albumine en de vele immunoglobulinen. Dikwijls is het dus nodig de veelvoor-
komende eiwitten te neutraliseren of anderszins onzichtbaar te maken. Dit kan onder andere met immunoprecipitatie van de veelvoorkomende plasma-eiwitten of door chromatografische scheiding op een kolom, bijvoorbeeld met proteïne A, waaraan de abundante immunoglobulinen selectief gebonden worden. Een probleem hierbij is dat de eiwitten waarin wij geïnteresseerd zijn aselectief adsorberen aan bijvoorbeeld albumine en daardoor gedeeltelijk ook in de kolom achterblijven, waardoor een vertekend beeld ontstaat van de kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling. tweedimensionale elektroforese en massaspectrometrie Welke technologie is nu het bruikbaarst? De klassieke proteomics gaat uit van een zogenaamde tweedimensionale analyse, gevolgd door identificatie van gescheiden eiwitten door middel van massaspectrometrie.9 Hierbij wordt het eiwit op een gel gebracht en allereerst gescheiden op lading, of anders geformuleerd, op iso-elektrisch punt. Vervolgens worden de eiwitten met een identiek iso-elektrisch punt gescheiden in een tweede dimensie op molecuulmassa. In de praktijk leidt dit tot een gel met een patroon van vlekken (figuur 1). Deze vlekken kunnen vervolgens door kleuring zichtbaar gemaakt en kwantitatief geanalyseerd worden met gelscanners. Vergelijking van gels geeft inzicht in welke eiwitten discrimineren tussen de pathologische en de gezonde toestand.
tau
a
b
figuur 1. Op zoek naar eiwitpatronen in de liquor cerebrospinalis om een diagnostische test ante mortem voor de ziekte van Alzheimer te ontwikkelen, werden eiwitten in liquor van personen met de ziekte van Alzheimer (a) en van controlepersonen zonder de ziekte (b) verkregen door precipitatie.10 De eiwitprecipitaten werden gescheiden door een tweedimensionale gelelektroforese, waarna de gels werden gekleurd met een ammoniakale zilveroplossing, waardoor de eiwitten zwart werden. De diagnose ‘ziekte van Alzheimer’ werd in een later stadium post mortem bevestigd. Vergelijking van de gels laat zien dat een aantal vlekjes (tau-eiwitten), aangegeven met pijlen, discrimineren tussen de gezonde en de pathologische toestand. Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
101
Vervolgens worden de interessante spotjes uit de gels gesneden. Het eiwit in een stukje gel wordt gedigereerd door een protease, zoals trypsine, dat knipt na een lysine- of een arginineresidu. Het resultaat is een mengsel van peptiden met een molmassa van 100-4000 g/mol. Door de lage molmassa’s kan van deze tryptische peptiden door middel van massaspectrometrie nauwkeurig de molmassa bepaald worden. Nu wordt de digestie herhaald met behulp van de computer voor alle eiwitten waarvan de primaire structuur of de DNA-sequentie in elektronische databases is opgeslagen. Dat betekent dat deze eiwitten in de computer theoretisch met trypsine worden gedigereerd tot peptiden, ook wel ‘in-silicodigestie’ genoemd, en dat de molecuulmassa’s van de resulterende peptidepatronen worden vergeleken met die van de experimenteel verkregen peptiden. Op grond hiervan wordt ieder onbekend eiwit geïdentificeerd. Een van de grootste successen op dit gebied is het in kaart brengen van het proteoom van Haemophilus influenzae.11 Met behulp van een aantal fractioneringen en voorscheidingen om eiwitten die slechts in een beperkt aantal kopieën in de cel voorkomen te scheiden van de meest voorkomende eiwitten, en het opwerken van membraangebonden eiwitten, was het mogelijk om 502 eiwitten te identificeren met massaspectrometrie van een proteoom dat geschat wordt op 1742 eiwitcoderende DNA-sequenties. Hoewel de tweedimensionale techniek al 25 jaar gebruikt wordt en in de farmaceutische industrie grote onderzoeksgroepen werken aan robotisering en optimalisatie, is de techniek dermate bewerkelijk, moeilijk te standaardiseren en te automatiseren dat het onwaarschijnlijk is dat ze een grote rol zal spelen in kwantitatieve grootschalige analyse van bloed of weefsel.12 Globaal zijn er twee alternatieve strategieën die naarstig uitgetest worden: toepassing van eiwitchips en kwantitatieve massaspectrometrie, al dan niet in combinatie met een voorscheiding, zoals tweedimensionale vloeistofchromatografie, of een combinatie van beide. Dit laatste was het geval in het voorbeeld van de analyse van eierstokkanker. eiwitchips Op basis van het succes van DNA- en RNA-microarrays wordt er gewerkt aan de ontwikkeling van eiwitchips.13-15 Aan een deel van het oppervlak van de chip wordt een organisch molecuul bevestigd, dat specifiek bindt aan een eiwit of subklasse van eiwitten. Voor de zoektocht naar biomarkers voor vroegtijdige diagnostiek bij eierstokkanker is een chip gebruikt met op het oppervlak lange alifatische koolwaterstofketens. Deze apolaire gebonden fase gaat hydrofobe interacties aan met peptiden die de aminozuren alanine, valine, leucine, isoleucine, fenylalanine en tyrosine bevatten. In waterige oplossing met een hoge zoutconcentratie binden hydrofobe domeinen van peptiden aan de spots op de chips. De overige eiwitten worden er vervolgens afgewassen. Daarna wordt de chip met behulp van een ‘surfaceenhanced laser desorption/ionization’(SELDI)-‘time102
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
of-flight’-massaspectrometer uitgelezen. Dit wil zeggen dat van de gebonden eiwitten nauwkeurig de molecuulmassa bepaald wordt. Het resultaat is een vingerafdruk van een deelverzameling, in dit geval de hydrofobe eiwitten, van het totale serumeiwitprofiel. De eiwitchipmethode is dus een vingerafdrukmethode waarbij de gebonden eiwitten niet afzonderlijk geïdentificeerd worden. Voor verdere identificatie is het nodig de peptiden te sequencen. Voor de komende jaren is het de opgave eiwitchips te ontwikkelen die selectief, bijvoorbeeld doordat een zeer uitgebreid panel van antilichamen als spots op de chip is gebracht (zogenaamde antilichaamchips), ieder gewenst eiwit kunnen binden dat door het humaan genoom tot expressie kan worden gebracht. Het streven is deze chips kwalitatief en kwantitatief uit te lezen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot een revolutie in de klinische diagnostiek. kwantitatieve massaspectrometrie Het proteomicsonderzoek naar markers voor eierstokkanker laat zien dat een aanpak gebaseerd op onderlinge vergelijking van eiwitprofielen in serum wellicht volstaat voor vroege opsporing van deze vorm van kanker. Recente ontwikkelingen laten zien dat methoden waarbij stabiele isotopen zoals deuterium gebruikt worden om eiwitten te markeren in combinatie met massaspectrometrie veelbelovend zijn voor relatieve vergelijking van de eiwitsamenstelling van twee cellulaire toestanden. De kwantitatieve samenstelling van het eiwitpatroon van de ene toestand wordt in deze experimentele benadering relatief uitgedrukt ten opzichte van die van de andere toestand door meting van piekratio’s van met isotoop gelabeld eiwit versus ongelabeld eiwit. Dit is erg nuttig bij de bepaling van de concentratie van eiwitten in bijvoorbeeld serum, waarbij gecorrigeerd kan worden voor binding aan albumine. Labeling. Dit gaat als volgt: een aanhangsel, een zogenaamde ‘isotope-coded affinity tag’ (ICAT), wordt door selectieve alkylering van cysteïneresiduen aan de eiwitketen gebonden.16 Van dit aanhangsel beschikken wij over 2 vormen: één met 8 gewone waterstofatomen (d0), en één met 8 deuteriumatomen (d8); het gewichtsverschil tussen beide aanhangsels is dus 8 Da. De d0ICAT’s binden wij aan het plasmamonster van de patiënt en de d8-ICAT’s aan het controlemonster (figuur 2a). Het d8-ICAT-eiwitmonster wordt vervolgens gemengd met het d0-ICAT-eiwitmonster. Vanaf dit punt in de analysegang wordt aangenomen dat verdere opwerking, zoals precipitatie van albumine en immunoglobuline om de complexheid van het monster te reduceren, de beide relatieve monsterhoeveelheden niet zal beïnvloeden. Na opwerking wordt het gehele eiwitmengsel gedigereerd met trypsine tot peptiden. Omdat het ICAT-label ook een biotineaanhangsel bevat, kunnen de ICAT-gelabelde peptiden met behulp van scheiding op een avidine-agarosekolom selectief geïsoleerd worden (biotine bindt namelijk aan avidine). Dit geeft weer een belangrijke reductie (met een factor 10 of daaromtrent) van de complexiteit van het mengsel. De volgende stap is vloeistofchromatografie (zie fi-
plasma van een patiënt
plasma van een controlepersoon
labeling door ICAT met gewone waterstof (d0)
labeling door ICAT met deuterium (d8)
samenvoegen, (pre)fractioneren en proteolytisch klieven
scheiding van ICAT-peptiden door affiniteitschromatografie
analyse van de fracties met micro-vloeistofchromatografie en massaspectrometrie
relatieve hoeveelheid
relatieve hoeveelheid
a
A
b
B
C
D
E
F
G
1000 retentietijd
c
1200
1400 d0 d8 B
M/z
figuur 2. Schematisch overzicht van de ‘proteomics’-strategie om differentiële eiwitexpressie in plasma van een patiënt en een controlepersoon te kwantificeren: (a) de plasma-eiwitten van de patiënt en de controlepersoon worden gelabeld met het ‘isotope-coded affinity tag’(ICAT)-reagens, met respectievelijk waterstofatomen (d0) en deuteriumatomen (d8); (b) na menging van beide monsters en opwerking en digestie met trypsine wordt het peptidemengsel chromatografisch gescheiden, waarbij 8 peptiden ontstaan (A-G); telkens geeft het linker balkje de relatieve hoeveelheid d0- en het rechter die van d8-gelabeld peptide weer; (c) als voorbeeld een tryptisch peptide (peptide B) uit humaan albumine met aminozuurvolgorde LCTVATLR, waarbij de verhouding d0- en d8-gelabeld peptide B is bepaald met een massaspectrometer. De d0-d8-verhouding is een maat voor de relatieve verhouding van patiënt- en controlealbumine in het plasmamengsel (LCTVATLR staat voor leucine-cysteïne-threonine-valinealanine-threonine-leucine-arginine).
guur 2b), gekoppeld aan massaspectrometrie, waarbij de massaspectrometer gebruikt wordt om de ratio van d0versus d8-gelabelde peptiden te meten (zie figuur 2c). Deze ratio is een maat voor de verhouding van de eiwitten in twee biologische toestanden of bij een pathologische toestand versus een gezonde controletoestand. De massaspectrometer wordt ook gebruikt om van het ICAT-gelabelde peptide de primaire sequentie te bepalen. Op deze sequentie worden vervolgens de bekende DNA- en eiwitdatabases afgezocht om het eiwit waaruit het peptide door digestie verkregen is te identificeren. Opgemerkt moet worden dat deze aanpak alleen kan worden toegepast voor eiwitten die cysteïne bevatten. Ontwikkeling van aanhangsels die kunnen binden aan andere residuen is gewenst. Belemmeringen voor ‘high throughput’-applicaties zijn de hoge kostprijs van ICAT-reagentia, de tijd die nodig is voor de scheiding van complexe mengsels van ICATgelabelde peptiden en hoge investeringen in massaspectrometrische expertise en apparatuur. Er wordt gezocht naar goedkopere alternatieven voor ICAT-reagentia.
conclusie Proteomics is een zich snel ontwikkelend wetenschapsveld dat met grote investeringen in mens en machine nieuwe mogelijkheden opent voor wetenschap en diagnostiek. De voortgang van de afgelopen jaren rechtvaardigt het beeld dat een revolutie gaande is die de komende 5-10 jaar zal doorsijpelen naar de klinisch-chemische routinepraktijk. Dit zal leiden tot krachtiger en betrouwbaarder diagnostisch en prognostisch onderzoek, dat niet alleen gericht is op verbetering van de gezondheid, maar ook op beter begrip van de pathogenese van aandoeningen. In combinatie met informatie omtrent ontstaan en beloop van ziekte kan proteomics bijdragen aan het bevorderen van gezondheid en betere primaire en secundaire preventie. In de nog verder liggende toekomst is het misschien zelfs mogelijk de glycosylering en vouwing van eiwitten op grote schaal te bepalen, wat de betekenis van proteomics nog verder zal doen toenemen. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
103
6
abstract Proteomics: the mapping of all human proteins – The genomes of many organisms, including humans, are now largely known. In the wake of this there is a need to identify and measure all proteins that are encoded by the genome (proteomics). – This need leads to turbulent developments in the area of analytical techniques, such as two-dimensional electrophoresis, mass spectrometry, and protein chips. – The rapidity of advancements justifies the expectation that in the next 5-10 years it will indeed become possible to determine the proteome of an organism or its components such as plasma, serum, or tissues. – In combination with information on initiation and progress of disease, proteomics will contribute to improving health and to better primary and secondary prevention.
7
8
9 10
11
12 1
2
3
4 5
literatuur Banks RE, Dunn MJ, Hochstrasser DF, Sanchez JC, Blackstock W, Pappin DJ, et al. Proteomics: new perspectives, new biomedical opportunities. Lancet 2000;356:1749-56. Harrison PM, Kumar A, Lang N, Snyder M, Gerstein M. A question of size: the eukaryotic proteome and the problems in defining it. Nucleic Acids Res 2002;30:1083-90. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002;359:572-7. Daly MB, Ozols RF. The search for predictive patterns in ovarian cancer: proteomics meets bioinformatics. Cancer Cell 2002;1:111-2. Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. Am J Pathol 2001;158:1491-502.
13
14 15
16
Paweletz CP, Gillespie JW, Ornstein DK, Simone NL, Brown MR, Cole KA, et al. Rapid protein display profiling of cancer progression from human tissue using a protein chip. Drug Dev Res 2000;49: 34-42. Wellmann A, Wollscheid V, Lu H, Ma ZL, Albers P, Schutze K, et al. Analysis of microdissected prostate tissue with ProteinChip arrays – a way to new insights into carcinogenesis and to diagnostic tools. Int J Mol Med 2002;9:341-7. Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res 2002;62:3609-14. Aebersold R, Goodlett DR. Mass spectrometry in proteomics. Chem Rev 2001;101:269-95. Choe LH, Dutt MJ, Relkin N, Lee KH. Studies of potential cerebrospinal fluid molecular markers for Alzheimer’s disease. Electrophoresis 2002;23:2247-51. Langen H, Takacs B, Evers S, Berndt P, Lahm HW, Wipf B, et al. Two-dimensional map of the proteome of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 2000;21:411-29. Ong SE, Pandey A. An evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics. Biomol Eng 2001;18:195-205. Weinberger SR, Dalmasso EA, Fung ET. Current achievements using ProteinChip Array technology. Curr Opin Chem Biol 2002; 6:86-91. Figeys D. Adapting arrays and lab-on-a-chip technology for proteomics. Proteomics 2002;2:373-82. Issaq HJ, Veenstra TD, Conrads TP, Felschow D. The SELDI-TOF MS approach to proteomics: protein profiling and biomarker identification. Biochem Biophys Res Commun 2002;292:587-92. Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotopecoded affinity tags. Nat Biotechnol 1999;17:994-9.
Aanvaard op 1 november 2002
Capita selecta
Chronische lymfatische leukemie: hoog tijd voor een op het risico afgestemd beleid a.p.kater en m.h.j.van oers Chronische lymfatische B-celleukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. De aandoening komt voornamelijk bij ouderen voor, met een incidentie oplopend tot 50 per 100.000 boven de 70 jaar.1 De laatste jaren lijkt de ziekte vaker op jongere leeftijd op te treden.2 Bij CLL is er een sterke accumulatie van rijpe lymfocyten die niet wordt veroorzaakt door toegenomen proliferatie, maar veel eerder door een verstoorde apoptose (geprogrammeerde celdood). De ziekte wordt gekenmerkt door lymfocytose, lymfadenopathie en hepatosplenomegalie.
Academisch Medisch Centrum/Universiteit van Amsterdam, afd. Hematologie, Postbus 22.660, 1100 AD Amsterdam. A.P.Kater, assistent-geneeskundige; prof.dr.M.H.J.van Oers, internisthematoloog. Correspondentieadres: A.P.Kater (
[email protected]).
104
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 18 januari;147(3)
Samenvatting: zie volgende bladzijde.
CLL wordt algemeen beschouwd als een indolente aandoening met een langdurig goedaardig beloop waarbij de patiënt vaak sterft aan een oorzaak die niet met de CLL samenhangt. Dit is apert onjuist omdat een dergelijk beloop slechts gezien wordt bij ten hoogste 30% van de patiënten. Sommige patiënten overlijden snel – binnen 2 tot 3 jaar na het stellen van de diagnose – aan CLLgerelateerde complicaties, met name infecties. Gezien het heterogene beloop bestaat grote behoefte aan prognostische factoren waarmee men een onderscheid kan maken tussen patiënten die in aanmerking komen voor intensieve behandeling en patiënten bij wie een expectatief beleid gerechtvaardigd is. De laatste jaren zijn belangrijke nieuwe moleculair-genetische en immunologische kenmerken gevonden, waardoor niet al-
