Laboratorní diagnostika březosti u skotu MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava
Seminář FVL VFU Brno a ČBS, 14. listopadu 2015
OBSAH 1) Princip laboratorní diagnostiky březosti 2) Sensitivita a specifita ELISA testů k detekci březosti 3) IDEXX Bovine Pregnancy Test 4) Praktické informace 5) Výhody lab. diagnostiky březosti
2
Laboratorní diagnostika březosti u skotu PRINCIP Identifikace březosti krav stanovením specifického proteinu produkovaného placentou metodou ELISA v krevním séru. ü PAGs = pregnancy-associated glycoproteins - specifické proteiny produkované placentou, které jsou využity jako markery březosti ü stanovením přítomnosti těchto proteinů v krevním séru lze s vysokou přesností identifikovat březí krávy - přesnost testů ověřená experimentálně je 95 – 99% ü spolehlivá identifikace od 28. - 30. dne březosti
3
PAGs = pregnancy-associated glycoproteins https://commons.wikimedia.org
•
tyto specifické glykoproteiny jsou produkovány specializovanými buňkami v placentě přežvýkavců (trofoblastické velké mnohojaderné buňky) a uvolňovány do krevního oběhu matky
• proteiny, které spadají do široké skupiny aspartových peptidáz AP (AP = např. žaludeční enzymy jako pepsin a chymosin, lysozomální enzymy jako katepsin D, enzym renin apod.), ale jako enzymy se nechovají
• proteiny PAGs u skotu = velmi široká skupina - již 22 různých PAGs cDNA v Genbank • proteiny PAGs nejsou vylučovány všechny souběžně a rovnoměrně během březosti – některé jsou produkovány dříve jiné později • specifické protilátky vyrobené proti vybraným purifikovaným proteinům PAGs nám umožňují detekovat přítomnost těchto proteinů v krevním séru/plazmě
4
PAGs = pregnancy-associated glycoproteins •
jako první byl popsán tzv. PSPB = pregnancy specific protein B = protein B specifický pro březost – Butler et al. 1982
• první test na diagnostiku březosti ze séra – Sasser et al. 1986
Komerčně dostupné ELISA testy k detekci PAGs IDEXX Bovine Pregnancy Test
• výrobce: IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA • detekuje rané proteiny PAGs • test určen pro: skot, ovce, kozy, bizon
IDEXX Milk Pregnancy Test • test určen pro: skot a kozy
BioPRYN
• výrobce: BioTracking Inc., Moscow, Idaho, USA (Dr. R. Garth Sasser vyvinul test BioPRYN s využitím licencované technologie z University of Idaho)
• detekuje protein PSPB • test určen pro: všechny přežvýkavce (skot, ovce, kozy, jelen, bizon, wapiti, los atd.)
DG29™ Bovine Pregnancy Test
• výrobce: Conception Laboratories, Beaumont, QC, Kanada • detekuje „specific pregnancy protein“ • test určen pro: skot, ovce, kozy, jelen, bizon, wapiti
Senzitivita a specifita testů detekce březosti
porovnání ELISA testů: 1) na detekci raných proteinů PAGs (bPAG-1) 2) na detekci PSPB (pregnancy specific protein B) 3) stanovení hladiny progesteronu 4) manuální palpace (120 den po AI) 5) transrektální ultrasonografické vyšetření (jako „zlatý standard“) Výsledek: ELISA testy na detekci PSPB a raných PAG, mají shodnou sensitivitu (98.0 a 97.8%), specifitu (97.1 a 91.2%), pozitivní prediktivní hodnotu (99.3 a 97.8%), negativní prediktivní hodnotu (91.9 a 91.2%) a přesnost (97.8 a 96.4%) = jsou shodně efektivní a vysoce přesné (v porovnání
se sonografickým vyšetřením)
7
Senzitivita a specifita testů detekce březosti SENZITIVITA procento březích zvířat, která jsou testem detekovaná správně (pozitivně) NEBO: pravděpodobnost, že test bude pozitivní u březích zvířat senzitivita < 100% je příčinou nesprávně (falešně) negativních výsledků SPECIFITA procento nezabřezlých/jalových zvířat s negativním výsledkem testu NEBO: pravděpodobnost, že test je negativní u nezabřezlých zvířat specifita < 100% je důvodem nesprávně (falešně) pozitivních výsledků
Se 99% = v ELISA testu je výskyt 1% „falešně jalových“ zvířat Sp 95% = v ELISA testu je výskyt 5% „falešně březích“ zvířat Rozdíl 4% je způsoben hlavně embryonální odúmrtí.
(v testu ELISA částečně řešeno opakovaným odběrem – „pregnant-recheck“ – viz dále)
ALE žádný test není 100% - např. ultrasonografické vyšetření v terénních podmínkách má 88-98% přesnost/správnost (Pieterse et al. 1990)
8
IDEXX Bovine Pregnancy Test • detekuje rané proteiny PAGs • ze séra (skot, ovce, kozy) či z EDTA plazmy (skot, bizon) • dosahuje přesnosti ultrasonografického vyšetření • spolehlivá detekce PAG od 28. dne březosti (nejdříve 60 dní po otelení)
• výsledek do 2,5 hodin po doručení vzorku do lab.
druh
vzorek
od dne
sensitivita
specifita
kráva
sérum/plazma
28
99,3%/99,1%
93,8%/95,1%
ovce
sérum
35
98%
100%
koza
sérum
28
100%
100%
bizon
plazma
30
100%
91,4%
(po AI
Detekce hladiny raných PAG v IDEXX ELISA Telení
Hodnoty OD (S-N)
Zabřeznutí
Dny po zabřeznutí / otelení
IDEXX Bovine Pregnancy Test
Interpretace výsledků • • •
CUT-OFF = 0,300 pozitivní (březí) = S-N ≥ 0,300 negativní (jalová) = S-N < 0,300
Doporučený opakovaný odběr („pregnant-recheck“): • raná embryonální odúmrť = proteiny PAGs mohou u jalovice/krávy cirkulovat v určitém množství po určitý čas • pokud je hodnota S-N ≥ 0,300 ale < 1,000 je doporučován opakovaný odběr a test % Graf: Procenta vzorků (z celkového počtu vyšetření v SVÚ Jihlava) doporučených k opakovanému odběru v letech 2010 – 2015.
In-house PSPB ELISA
PAG IDEXX ELISA
11
Milk pregnancy test (IDEXX)
• Se = 98,8% a Sp = 97,4% (4% „recheck“) • shoda s testem z krve = 98,4% • použitelnost rovněž od 28. dne březosti a 60 dní po otelení Pokles PAG v mléku po otelení
Hodnoty OD (S-N)
Hodnoty OD (S-N)
Hladiny PAG v mléku během březosti
Cutoff pro recheck Cutoff testu
Dny březosti
Dny po otelení
Y
● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
YY Y ▲
jalová
▲
březí
▄
● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Y
IDEXX Bovine Pregnancy Test: princip
1) specifická anti-PAG protilátka 2) proteiny PAG (ve vzorku) 3) specifická detekční protilátka 4) konjugát (značený enzymem HRPO) 5) substrát-chromogen (TMB)
ELISA - nepřímá sendvičová metoda • • • •
v soupravě dodány destičky s navázanou protilátkou proti PAG proteiny PAG ze vzorku jsou vyvázány protilátkou vázanou na dno jamky konjugát jako sekundární protilátka konjugát = anti-species immunoglobulin, který se specificky váže na Fc region první (detekční) protilátky
13
Y
YY Y ▲
jalová
▲
březí
▄
Y
IDEXX Bovine Pregnancy Test: princip
1) specifická anti-PAG protilátka 2) proteiny PAG (ve vzorku) 3) specifická detekční protilátka 4) konjugát (značený enzymem HRPO) 5) substrát-chromogen (TMB)
ELISA - nepřímá sendvičová metoda • • • •
v soupravě dodány destičky s navázanou protilátkou proti PAG proteiny PAG ze vzorku jsou vyvázány protilátkou vázanou na dno jamky konjugát jako sekundární protilátka konjugát = anti-species immunoglobulin, který se specificky váže na Fc region první (detekční) protilátky
počty vyšetření
Počty vyšetření PSPB ELISA / PAG ELISA v laboratoři SVÚ Jihlava 2010-2015
15
Praktické informace Vzorek k vyšetření - krev odebraná standardním způsobem do odběrovek typu HEMOS nebo do zkumavek s EDTA Cena vyšetření = 60,- Kč / 1 vzorek Pokud požadujete výsledek v den doručení, je nutné doručit vzorek do cca 11:00 dopoledne. Výsledek vyšetření - standardní způsob sdělování výsledků je zkušební protokol, ale běžně zasíláme výsledky expresním způsobem e-mailem nebo faxem. Vzorek krve/séra lze použít pro jakákoliv jiná sérologická vyšetření (např. IBR, Ptb apod.) i některá virologická vyšetření (např. detekce viru BVD).
Pozitiva laboratorní diagnostiky březosti ü ü ü ü ü ü ü ü ü ü
spolehlivá a přesná raná diagnostika březosti identifikace od 28. dne březosti přesnost testu = 95 – 99% (srovnatelná s ultrasonografickým vyšetřením) rychlost vyšetření (cca 2,5hod) odběr krve z podocasní žíly je jednodušší z hlediska fixace zvířat, usnadní manipulaci se zvířaty (welfare) snížení rizika odumření plodu v důsledku mechanické iritace při manuální palpaci efektivní využití zejména u masného skotu (nižší náklady, jednodušší) vhodné např. na podzim při zahánění stáda z pastvy (roztřídění stáda – výběr březích do porodny) + méně náročná příprava odběru (palpace = ohrady, personál a čas = vyšší náklady) jeden odběr = stejné vzorky i pro účely kontroly zdraví zvířat uplatnění nachází i u konfirmace březosti jalovic k exportu – prodeji
Závěrem: „Bovine pregnancy testing: friend of foe?“
(Megan Pierce, Bovine Vet Online)
ü palpace popř. sono je denním chlebem pro mnohé veterináře, ALE… ü …je to i o změně filozofie a třeba se jednoho dne zeptám sám sebe: jsem palpační dělník, nebo jsem praktikující veterinář?... ü …používání laboratorní diagnostiky březosti, může být součástí změny role veterináře na farmě, který je více placen za poradenství, více času věnuje monitoringu, analýze informací, prací v managementu farmy apod…. ü …veterinářovo rámě je stále zlatým standardem v určení březosti a je nejlevnější, ALE hodnota, kterou může veterinář nabídnou zákazníkovi v podobě konzultačního servisu dalece převáží např. čas věnovaný palpaci… ü role laboratorní diagnostiky březosti v praxi se ještě bude vyvíjet, ale již nyní nabývá na významu a zdá se, že dále bude ü laboratorní diagnostika březosti je zajisté dobrá pomůcka pro veterináře ü otázky, zda je test funkční a zda je dobře funkční dobře, již byly mnohokrát zodpovězeny ü každý test, ať již laboratorní či stájový, má své přednosti a slabé stránky ü porozumění, jak test funguje, pomůže implementovat test do praxe
Informace – kontakty Státní veterinární ústav Jihlava Rantířovská 93 586 05 Jihlava Kontakt: MVDr. Pavel BARTÁK, Ph.D., vedoucí oddělení virologie Tel./Mobil: +420 567 143 232 / +420 602 790 988 E-mail:
[email protected] MVDr. Petr VÁCLAVEK, Ph.D. Tel./Mobil: +420 567 143 297 / +420 724 332 627 E-mail:
[email protected] MVDr. Marcela KOSTKOVÁ Tel./Mobil: +420 567 143 265 / +420 602 727 009 E-mail:
[email protected]
Děkuji za pozornost
Jste opravdu tak zaneprázdněný, doktore?
20
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie
