KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE

Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria

I-MET-FLVVT-153

I-MET-FLVVT-153

KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE LEVENSMIDDELEN (SPECTROFOTOMETRIE)

Versie

03

Datum van toepassing

2014-05-09

Opgesteld door :

Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke

Nazicht door :

Sophie De Volder; QAM; 2014-04-28

Goedkeuring vrijgave door :

Mandy Lekens, Laboratoriummanager; 2014-05-05

Beheer & locatie geldende versie :

FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem

Bestemmelingen :

Medewerkers FLVVT

Trefwoorden :

Toevoegingsmiddelen

LAB 25 I-MET-FLVVT-153 – Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 1/9


Overzicht wijzigingen Herziening * door/datum M, Vanbrabant, 03/2013 J-P. De Lannoy, 01/2014 M. Vanbrabant, 04/2014

Reden van de herziening Opsteller van initiële versie Aanpassing naar aanleiding van interne audit 2013/04; B25 en B26 en update Verduidelijking aanmaak chromogeen reagens

Tekstdeel/draagwijdte van de herziening Volledige tekst Paragraaf 10 Paragraaf 8 en 12 Paragraaf 8

*

Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar

bedragen.

Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.

Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document.


KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE LEVENSMIDDELEN (SPECTROFOTOMETRIE) INHOUDSTABEL

1

DOEL .................................................................................................................................. 4

2

TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4

3

WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4

4

DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 4

5

PRINCIPE........................................................................................................................... 4

6

PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 4

7

VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5

8

REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 5 8.1

REAGENTIA..................................................................................................................... 5

8.2

HULPSTOFFEN ................................................................................................................ 6

8.2.1 9

Standaarden ........................................................................................................ 6

TOESTELLEN .................................................................................................................... 7 9.1

ALGEMEEN ..................................................................................................................... 7

9.2

SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE .............................................................................. 7

10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 7 10.1 10.1.1

EXTRACTIE ................................................................................................................. 7 Voedingssupplementen en zuigelingenmelk ....................................................... 7

10.2

STANDAARDCURVE ..................................................................................................... 7

10.3

ENZYMATISCHE REACTIE ............................................................................................. 8

10.3.1

Standaard ............................................................................................................ 8

10.3.2

Monster ................................................................................................................ 8

10.4

METING VAN DE ABSORBANTIES ................................................................................... 8

11 KWALITEITSCONTROLE ................................................................................................. 8 12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................... 8 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN .................................................................................................. 9



1 Doel Kwantitatieve bepaling van choline in specifieke levensmiddelen.

2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van choline in voedingssupplementen en zuigelingenmelk. De rapporteringsgrens bedraagt 200 mg/kg. Choline komt meestal voor onder vorm van choline chloride of cholinebitartraat en in mindere mate als cholinediwaterstofcitraat.

3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT.

4 Definities en afkortingen Term

Definitie

5 Principe Choline

wordt

uit

het

monster

geëxtraheerd

via

een

alkalische

hydrolyse

met

natriumhydroxide, vervolgens wordt een chromogeen reagens toegevoegd waardoor de resterende fractie gebonden choline wordt vrijgezet en er een kleurreactie plaatsvindt. Het choline-gehalte wordt geanalyseerd d.m.v. spectrofotometrie.

6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De

waarden

voor

de

reproduceerbaarheid

(RSDR%)

zijn

terug

te

vinden

in

M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx.



7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht, in afwezigheid van fluorescent licht en direct licht.

Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT.

8 Reagentia en hulpstoffen 8.1

Reagentia

Alle reagentia dienen van ‘pro analyse ‘-kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia

Labonr.

8.1.1

Water, HPLC-kwaliteit (H2O)

R1003

8.1.2

Zoutzuur, 37% (HCl)

R0304

8.1.3

Natriumhydroxide pellets (NaOH)

R0206

8.1.4

Norit, actieve kool, geactiveerd

R2019

8.1.5

Tris hydroxymethyl aminomethaan

R2020

8.1.6

Phospholipase D (poedervorm)

R2028

8.1.7

Phospholipase D (in oplossing)

R2032

8.1.8

Choline oxidase

R2022

8.1.9

Peroxidase, Type I

R2029

8.1.10 4-aminoantipyrine

R2026

8.1.11 Phenol

R2027

Zoutzuur (HCl) 5N: 8.1.12 Voeg 425 ml HCl (R0304) toe aan 500 ml water (R1003) in een maatkolf van

W0230

1000 ml. Leng aan tot de maatstreep en meng. Zoutzuur (HCl) 1N: 8.1.13 Voeg 85 ml HCl (R0304) toe aan 300 ml water (R1003) in een maatkolf van

W0009

1000 ml. Leng aan tot de maatstreep en meng. 8.1.14

Natriumhydroxide (NaOH) 1N: Los 40 g NaOH (R0206) op in 1000 ml water (R1003)

W0110


KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE LEVENSMIDDELEN (SPECTROFOTOMETRIE) Tris hydroxymethyl aminomethaan (Trizma) buffer 0,05M, pH 8,0: 8.1.15

Weeg 3,03 g tris hydroxymethyl aminomethaan (R2020) af in +/- 200 ml H2O. Breng op pH 8,0 met HCl 1 N (W0009) en leng verder aan met water tot 250 ml.

W0231

Bewaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C. Chromogeen reagens: Weeg achtereenvolgens af in een maatkolf van 100 ml: 

Choline oxidase: 100-120 units (R2022)



Phospholipase D: 1,3 à 1,5 mg (~ 75-100 units; 60 IU/mg) (R2028) of 1 à 1,3 µl (~ 75-100 units; 79000 IU/ml) (R2032)

8.1.16



Peroxidase: 1,7 à 5,6 mg (250-280 units; 50-150 IU/mg) (R2029)



4-aminoantipyrine: 15 mg (R2026)



Phenol: 50 mg (R2027)

W0232

Leng aan met Trizma buffer (W0231) en meng. Dit mengsel is 3 dagen houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4°C.

8.2

Hulpstoffen

8.2.1

Standaarden

Choline (bitartraat) standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S2165)

8.2.1.1

Choline standaard stockoplossing, 2500 μg/ml choline hydroxide (W0229)

Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, x mg choline bitartraat (S2165) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng zodat een uiteindelijke concentratie van 2500 μg/ml choline hydroxide bekomen wordt. Deze oplossing is 1 week houdbaar, bij een temperatuur van 4 ± 4°C.

8.2.1.2

Choline standaard werkoplossing 1 (W1), 250 μg/ml choline hydroxide

Pipetteer 10 ml van de standaard stockoplossing (W0229) in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse.

8.2.1.3

Choline standaard werkoplossing 2 (W2), 375 μg/ml choline hydroxide

Pipetteer 15 ml van de standaard stockoplossing (W0229) in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse.



9 Toestellen 9.1

Algemeen

Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT.

9.2

Specificaties voor deze methode 

UV/Vis spectrofotometer met λ = 505 nm



Glazen cuvetten met een optische weglengte van 10 mm

10 Werkwijze 10.1 Extractie

10.1.1 Voedingssupplementen en zuigelingenmelk Weeg, afhankelijk van het verwachte gehalte, 1 – 20 g monster af in een fles van 250 ml. Voor zuigelingenmelk wordt standaard 5 g monster afgewogen. Voeg 30 ml NaOH 1N (W0110) toe en schud. Plaats de fles gedurende 3 uur in een warmwaterbad op 70°C. Laat afkoelen en breng vervolgens op pH 3,5 à 4,0 met HCl 5N (W0230). Breng het extract kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml en leng aan met H 2O (R1003). Centrifugeer, indien nodig, filtreer (595 ½ Whatman plooifilter) en verwijder de eerste 5 à 10 ml filtraat. Controleer nogmaals of pH gelijk is aan 3,5 à 4,0 en pas aan indien nodig. Voeg 0,2 g Norit (R2019) toe, schud en filtreer opnieuw. Herhaal de filtratie met Norit tot het extract helder is.

10.2 Standaardcurve

Maak een standaardreeks in 15 ml Falcon tubes volgens onderstaand schema: [STD]

Verdunning

0

0 µg/ml

H2O

1

6,25 µg/ml

0,25 ml W1 / 10 ml H2O

2

25 µg/ml

1 ml W1 / 10 ml H2O

3

100 µg/ml

4 ml W1 / 10 ml H2O

4

200 µg/ml

8 ml W1 / 10 ml H2O

5

375 µg/ml

= W2


KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE LEVENSMIDDELEN (SPECTROFOTOMETRIE) 10.3 Enzymatische reactie

10.3.1 Standaard 

Voor meetpunt 0: Neem 100 µl H2O en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (Areag)



Voor meetpunt 1 tot 5: Neem van elk standaardniveau 100 µl en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (Astd)



Plaats in warmwaterbad op 37 ± 2°C gedurende 15 minuten

10.3.2 Monster 

Blanco: Neem van elk monster 100 µl extract en voeg 3 ml H2O (R1003) toe (Abl)



Neem voor elk monster 100 µl extract en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (Asmp)



Plaats in warmwaterbad op 37 ± 2°C gedurende 15 minuten

10.4 Meting van de absorbanties

Na toevoegen van het chromogeen reagens treedt er een kleurverandering op. Meet vervolgens binnen 15 minuten de absorbantie van de standaarden monsteroplossingen bij de maximale golflengte (λmax = 505 nm) met behulp van een UV/Vis spectrofotometer. 1. Start de spectrofotometer en wacht tot het toestel geïnitialiseerd is 2. Kies vervolgens: ‘Library / Cholnew / Load’ en bevestig telkens met ‘Enter’ 3. Plaats 2 glazen cuvetten met blanco-oplossing H2O in het toestel en stel de absorptie op nul met behulp van ‘Zero base’ 4. Meet de absorbantie van de oplossingen bij 505 nm in een glazen cuvet ten opzichte van de blanco-oplossing met behulp van ‘Run’ 5. Print de ruwe data af en vul alle gegevens in in ‘Berekening Choline.xls’ om de standaardcurve en geëxtrapoleerde resultaten te bekomen (Areag, de absorptie van het chromogeen reagens wordt in mindering gebracht bij elke absorbantie meetwaarde, zodat de standaardcurve het nulpunt bevat)

11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN

12 Berekening en rapportering


KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE LEVENSMIDDELEN (SPECTROFOTOMETRIE) Onderstaande berekening gebeurt met behulp van de Excel-file ‘Berekening Choline.xls’. Netto absorbantie monster A = Asmp – Abl – Areag

X mg/kg choline hydroxide

=

=

Met: 

A=



Areag = Absorbantie nulpunt standaard (absorbantie chromogeen reagens)



Abl =



Asmp = Absorbantie monster + chromogeen reagens



S=

Helling standaardcurve (a uit vergelijking standaardcurve y = ax)



V=

Volume hydrolysaat (ml)



W=

Afgewogen monster (g)



f=

Verdunningsfactor (g/ml)

Netto absorbantie monster

Absorbantie monster + H2O

13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 38

W ERKWIJZE CHOLINE

LAB 25-F 62

REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART

LAB 25-L 18

OVERZICHT WETGEVING FLVVT

LAB 25-L 21

APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT

LAB 25-L 22

OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT

LAB 25-P 04

RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN

LAB 25-P 07

VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT BEREKENING CHOLINE.XLS


KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE

Recommend Documents