Kezdetek. Tömegspektrometria. Elektron. ionizáci. ció. Ionforrás. Cél: Töltött részecskék előállítása

Kezdetek

1

2

• J. J. Thomson, 1910, 1912 – Kisülési csőbe különböző gázokat vezetett – 20Ne/22Ne Izotópok létezésének bizonyítéka

Tömegspektrometria Szabó Pál MTA Természettudományi Kutatóközpont ([email protected])

Az MS felé felépítése

3

• F. W. Aston, 1919 – Első spektrográf – Ne, Cl, Hg, N izotópok

4

Mintabevitel

Detektor

Adatgyűjtő rendszer Ionforrás

Kezdetek

Analizátor

Vákuumrendszer

Interface

Ionforrá Ionforrás

Elektron ionizá ionizáció ció

5

Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: • elektron ionizáció (EI) • kémiai ionizáció (CI) • gyors atom bombázás (FAB) • lézerdeszorpció (LDI, MALDI) • ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) légköri nyomású photoionozáció (APPI) deszorpciós electrospray (DESI)

6

repeller mágnes

mágnes

filament (fűtőszál)

Filament (fűtőszál): W, Re Tfil= 2000 °C

trap

M+• Kamra: p= 10-5 Torr T= 100-200 °C Repeller: U= néhány V

1

Elektronionizá lektronionizáció ció

7

Az elektronenergia hatá hatása

8

Kémiai ionizá ionizáció ció

10

• Vizsgálhatóság feltétele: illékonyság • Tömeghatár: 1000 Dalton (Da) • Kationok, gyökkationok képződnek • Fragmentáció: gyakori és jellegzetes (spektrumkönyvtár) • Sok esetben nincs molekulaion • Az elektron energiának a szerepe

Kémiai ionizá ionizáció ció

9

• CI forrás: az EI forrásnál zártabb

Ion-molekula reakciók:

• Reagens gáz: metán, izobután, ammónia

Metán:

• Nyomás: ≈ 0.1 Torr (EI ≈10-6 Torr) • Minta parciális nyomása: ≈10-4 Torr

CH5+ + M → CH4 + [M+H]+ C2H5+ + M → [M+C2H5]+

• Lágy ionizáció Izobután:

• Fragmentáció: elhanyagolható • Kvázi-molekulaion

CI reagens gá gázok Metán:

• szerves vegyületekre általánosan jó • [M+H]+ [M+C2H5]+ ionokat ad • az adduktok intenzitása kicsi

Izobután:

• enyhe fragmentáció figyelhető meg • [M+H]+ [M+C4H9]+ ionokat ad • az adduktok intenzitása nagy • nem olyan univerzális, mint a metán

CH4 + e- → CH 4+• + 2 eCH4 + CH4+• → CH 3• + CH5+ CH3+ + CH4 → C2H 5+ + H2

(CH3)3CH+• → C3H7+ + CH 3• C3H7+ + C4H10 → C4H9+ + C3H 8

C4H9+ + M → [M+H]+ + C4H8 C4H9+ + M → [M+ C4H9]+

11

Tipikus EI spektrum [M-OH]+

12

M+•

Ammónia: • fragmentáció nincs • bázikus molekuláknál [M+H]+ iont ad • poláris vegyületeknél [M+NH4]+ iont ad • egyéb vegyületekre nem jó

2

Tipikus CI spektrum [M+H]+

Gyors atom bombá bombázás

13

14

• Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét

[2M+H]+

• Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe • Mátrix: glicerin, NOBA • Tömeghatár: ≅ néhány ezer Da • Fragmentáció: kismértékű • Gyors atom/ion: Xe, Cs+ • Kvázi-molekulaion: [M+H]+, [M+Na]+,

Gyors atom bombá bombázás

Lézerdeszorpció zerdeszorpció

15

16

Matrix Assisted Laser Desorption IonizationonizationTime of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok:

4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA)

2,5-dihidroxi benzoesav (DHB)

Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA)

Mintatartó Mintatartó

MALDI ionké ionképző pződés

17

18

Laser

Mintatartó

1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra.

hn

2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba.

AH+

3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. Rács

+20 kV

Rács

4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás.

3

A MALDI elő előnyei

l

l

l

l

l

Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kDa) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors

20

Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = 149089.4, 3562]

[M+H]+ 100

149131

3562.3

[M+2H]2+

90

1 pmol lineáris mód + 25 kV gyors. fesz

74667 80 70

% Intensity

l

60 50 40

[M+3H]3+

30 20

24607

49813

[2M+3H]3+

0 20000

[2M+H] +

99694

10

298434 80000

140000

200000

260000

0 320000

Mass (m/z)

Ionizá Ionizáció ció légkö gköri nyomá nyomáson

21

Poláros

ESI

APPI Apoláros 102

103

10 104

105

Móltömeg

IonSprayTM Áramlási tartomány: 2 – 200 µ L/min

22

Ionforrások koncentrációtartományai: – TurboV (2µL/min—3mL/min) – Turbo-IonSpray (2µL/min—1mL/min) – IonSpray (2 to 200µL/min) – Micro-IonSpray (50 to 1000 nL/min) – NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 20-50 nL/min) Kis áramlás → nagyobb érzékenység!

APCI

101

Electrospray ionizá ionizáció ció IonSpray: Pneumatikusan segített electrospray Nagyfeszültség (5-6 kV) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!).

Polaritás

l

Tipikus MALDI spektrum

19

23

TurboIonSprayTM

24

Áramlási tartomány: 2 – 1000 µ L/min

4

Turbo VTM

25

Áramlási tartomány: 2 – 3000 µL/min

Nanospray

Mic Microelectrospray

26

Áramlási tartomány: 50 – 1000 nL/min

27

Nanospray

28

29

Sprayké Sprayképző pződés

30

Áramlási tartomány: 20 – 50 nL/min

Microtechniká Microtechnikák máské sként

vákuum

légköri nyomás 1. 1. töltött töltött cseppek cseppek képződése képződése

3. Coulomb robbanás

2. oldószereltávolítás

5

Többszö bbszörösen tö töltö ltött ionok

31

Móltö ltömegszá megszámítás

32

minden egyes csúcsra igaz: Lysozyme MW = 14,305.14

m/z = (MW + nH+) n

m/z = tömeg/töltés értékek a spektrumban MW = a fehérje móltömege n = töltésszám (egész) H+ = a hidrogén ion tömege (1.008 Da)

Móltö ltömegszá megszámítás

33

A töltés és a móltömeg is ismeretlenek Két szomszédos csúcs töltöttségi foka közti különbség:1

Rekonstruá Rekonstruált tö tömegspektrum

34

14305.7

1431.6 = (MW + nH+) 1301.4 = (MW + [n+1]H+) [n+1] n 2 ismeretlen két egyenlet – először n-re oldjuk meg n = 1300.4/130.2 = 10 majd behelyettesítve a móltömeg: MW = 14316 - (10x1.008) = 14305.9

Eluensmó Eluensmódosí dosítók

14402.8 14,305.14

35

Sóhatá hatás

36

• Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp3 N- tartalmú) protonálódását. • Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. • 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. • Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mM koncentrációban. • Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!!

6

APCI • • • • • •

37

Az APCI nagy áramlást is (0.1-2.0 mL/min.) tolerál Poláros, termikusan stabil vegyületek vizsgálatára Molekulatömeg MW < 1000 Da Intenzív fűtés hatására az oldószer elpárolog Porlasztó- és segédgáz alkalmazása szükséges Korona kisülés hatására következik be az ionizáció

APCI ionké ionképző pződés

Ionké Ionképzé pzés mechanizmusa primer folyamat:

38

N2 + e- → N2+• + 2e-

szekunder folyamat:N2+• + H2O → H2O+• + N2 H2O+• + H2O → H3O+ + OH• adduktképződés:

H3O+ + M → [M+H]+ + H2O

Kombiná Kombinált forrá forrás

39

40

vákuum vákuum vákuum

légköri nyomás nyomás légköri oldószermolekulák 1.1.oldószermolekulák ionizációja ionizációja

Forrásház ESI probe

2. adduktképződés, klaszterképződés

APCI probe

Légkö gköri nyomá nyomású fotoionizá fotoionizáció ció

41

Photospray forrá forrás

42

• Eluens áramlási sebessége:100µL-2mL/min • Fordított fázis • MeOH/víz előnyös • ACN csökkenti az érzékenységet • Normál fázis • Izooktán/Izopropanol/Diklórmetán • Dopant: Toluol (HPLC grade) 5-15% külön pumpával • Hőmérséklet: 300-450 °C (APCI)

7

PSI alkalmazá alkalmazás XI C of +M RM ( 4 pair s) : 28 9. 3/ 97. 2 am u f r om S am p le 3 ( SM 4 100- 1 0p g/ uL 10 uL i nj N P A P CI ) of SM 4 Q 1. . .

43

Deszorpció Deszorpciós Electrospray

44

45

Oldó Oldószereltá szereltávolí volítás

46

M ax. 2. 0e4 cp s.

1. 00e 5

9. 50e 4

Testosterone

9. 00e 4

8. 50e 4

PhotoSpray Source

8. 00e 4

7. 50e 4

7. 00e 4

OH CH3

6. 50e 4 I nt ensit y, cps

6. 00e 4

5. 50e 4

5. 00e 4

4. 50e 4

CH3

4. 00e 4

H

3. 50e 4

3. 00e 4

APCI

2. 50e 4

2. 00e 4

H

H

1. 50e 4

1. 00e 4

O

500 0. 00

0. 00 0. 0

0. 5

1. 0

1. 5

2. 0

2. 5

3. 0

3. 5

4. 0

4. 5

5. 0

5. 5

6. 0

6. 5

7. 0

7. 5

Tim e, m in

XI C of +M RM ( 4 pair s) : 27 9. 5/ 133. 0 am u f r om Sam p le 1 ( SM 4 10 0- 10 pg/ uL 1 0u L in j N P PI ) of SM 4 Q 1 M . . .

M ax. 2. 0e4 cp s.

2. 0e4 1. 9e4

1. 8e4

Ethynyl Estradiol

1. 7e4

1. 6e4

OH CH3

PhotoSpray Source

1. 5e4

1. 4e4

CH

H

1. 3e4

1. 2e4

1. 0e4

H

800 0. 0

H

700 0. 0

HO

600 0. 0

500 0. 0

400 0. 0

300 0. 0

APCI

200 0. 0

100 0. 0

0. 0 1

2

3

4

5

6

7

8

Tim e, m in

DESI alkalmazá alkalmazások

Nitrogén gázfüggöny

Gázfü zfüggö ggöny interface

Robusztussá Robusztusság

47

1.80E+05

légköri nyomás

CUR

DP

vákuum

SK

1.60E+05

Q0

48

Methomyl 3.1% Carbaryl 3.3% Aldicarbsulfone 3.6% Aldicarb 3.6%

2.00E+05

+

+

+

+

+

+

Response

+

1.20E+05

1.00E+05

8.00E+04

+

+

+

+ +

+

+

FP

+

+

+

+ +

+ +

+

1.40E+05

+

I nt ensit y, cps

1. 1e4

900 0. 0

6.00E+04

4.00E+04

N2

2.00E+04

0.00E+00

0

200

400

600

800

1000

1200

Injection Number

Szpájkolt talajminta (50ng/mL); 1200 injektálás (3.5nap)

8

Karbantartá Karbantartás

49

Oldó Oldószereltá szereltávolí volítás

50

Fűtött kapilláris HPLC eluens Spray

Párologtató gáz

Fűtőegység

Szárítógáz

Fűtött kapilláris

Analizá Analizátorok

51

Cél: Töltött részecskék szétválasztása

52

Lorentz erő: 1. ½ mv2 = eU

Analizátor típusok: • mágnes (B) • elektrosztatikus (ESA) • kvadrupol (Q) • ioncsapda (trap) • repülési idő (TOF) • lineáris ioncsapda (LIT) • Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia MS (FT-ICR) • Orbitrap

Mágneses analizá analizátor

Mágneses analizá analizátor

2. veB = mv2/R ⇒ v= eRB/m 1. + 2. ⇒

m B2 R2 e = 2U

Tömeg megspektrometria alapegyenlete Pásztázás (scan) : • mágnesáram • gyorsító feszültség

53

Elektrosztatikus analizá analizátor

54

Szektormező +

1. ½ mv2 = eU 2. mv2/R = eE 1. + 2. ⇒

ϕ

-

R = 2U / E Független a tö tömegtő megtől!!!

9

ESA

Kettő Kettős fó fókuszá kuszálás

55

Z-rés

mágnes

56

ESA

forrásrés

kollektorrés detektor

ionforrás

Kettő Kettős fó fókuszá kuszálás Cél: a mágnes és az ESA kölcsönös hiányosságainak kiküszöbölése

•

Mágnes: impulzus szerint szeparál. Azonos tömeg, különböző energia ⇒ kiszélesedik a csúcs

•

Rések: érzékenység csökken

•

Nagyfelbontás!!

m ∆m

Felbontás: R =

Full Width at Half Mass

10 % völgy

A forrásból kilépő ionok sebesség- és irányszoródást szenvednek

58

∆m (50% magasságnál)

m

10 %

∆m

Kvadrupol analizá analizátor

59

m


60

+ –

–+

+

+

• Felbontás: egységnyi • A rendszer méréshatára: néhány ezer

+

+

–

–

+

+

+

+ +

+

• DC = 0 - ± 500 V • RF = 6000 V

–

+

+

–

–+

•

Felbontá Felbontás

57

–+

1. Ion enters the quadrupole system 2. 3. Electrical 4. 5. 6. Egy Movement RF-voltage Movement ... adott ACrepulsion of /changes of DC the the érték ion ion and polarity into into esetében attraction, direction direction andcsak electrical respectively, ofofthe egy the nearest repulsion ionbetween nearest and quadrupole számára attraction, quadrupole quadrupole stabil rod respectively, az with ionpálya. rod rods thewith opposite and between the ion opposite charge quadrupole charge rods and ion

10


Ioncsapda analizá analizátor

61

62

belépő ionok belépő elektróda

gyűrűelektróda

kilépő elektróda

kilépő ionok

Előny: érzékenység, kis méret, MSn

Ioncsapda analizá analizátor

RF pásztázás…

63

…kilépő potenciálgát EXB változtatása 64

Q TRAP

Radiális csapdázás

• Ionok mozgása: az elektródákra kapcsolt egyenilletve váltófeszültség hatására

Axiális csapdázás

• Az összes ion egyszerre tartózkodik a csapdában

Axiális csapdázás

• Kis méret, könnyű kezelhetőség Q2

• MSn funkció (n=10, elméletileg!)

Segéd RF pásztázás….

Konstans potenciál (U)

m1, m2

D

65

m1 m2

Idő (ns)

Repü Repülési idő idő analizá analizátor ½ mv2 = eU m1 → v1 v = (2eU/m)1/2 m2 → v2 t = D/v = (D2m/2eU)1/2 ⇒

Detektor

Repü Repülési idő idő analizá analizátor

Radiális csapdázás

Kilépő oldali háló

66

2U m= D2 t2

Az ionok energiaszórása miatt a felbontás kicsi

m1>m2 azonos töltés esetén

Megoldás: • iontükör (reflektor) • késleltetett ionkieresztés (delayed extraction)

11

A felbontá felbontást befolyá befolyásoló soló tényező nyezők 67 Forrás

Felbontá Felbontást nö növelő velő megoldá megoldások

68

Detektor

Eltérő helyen képződő ionok

• Az ionképződés helyének szórása – Iontükör (Reflectron)

R= m/∆m=t/2∆t

∆t

• Sebességeloszlás (energiaszórás)

t

– Delayed extraction (MALDI) – orthogonal TOF

Sebességszórás

∆t

Iontü Iontükör

69

Iontü Iontükör a való valóságban

70

71

A DE hatá hatása a felbontá felbontásra

72

Iontükör

detektor

Ugyorsító

deflektor

U=0

Utükör

forrás

Delayed Extraction (DE) +20 kV

Linear mode

+ +

Reflector mode

+ delayed extraction R=11,000

continuous extraction R=125

delayed extraction R=1,100

continuous extraction R=650

A potenciálgradiens a lassabb ionokat jobban gyorsítja

+20 kV

+ + + 10600

10800

11000

m/z

A detektorig a lassabb ion utóléri a gyorsabbat

Minta: DNS 36-mer

11200

11400

6130

6140

6150

6160

6170

m/z

Minta: DNS 20-mer

12

Felbontá Felbontás

74

A cellába bejuttatott és a nagy mágneses térerő hatására körpályára kényszerített ionok által indukált áramot méri.

Minimálisan szükséges felbontás Ar 39.96239 C3H4 40.03130 N2 28.00615 C2H4 28.03130 CO 27.99491 N2 28.00615 13CC H 92.05813 6 7 C7H8 92.06260

FTFT-ICR MS

73

• óriási felbontás

580

• tág időskála (nem destruktív detektálás)

1100 2490 20600

Ionpá Ionpályá lyák az orbitrapban

75

Speciá Speciális Orbitrap

76

Teljesí Teljesítőképessé pesség

77

Analizá Analizátorok felbontá felbontása

78

Instrument performance for Bovine Insulin

+5

m/∆m = 70,000

• +3 m/∆m = 40,000

1,147

1,148

1,149

+4 m/∆m = 45,000

+5

1,911

1,912

1,913

+3 1,434

1,435

1,914

• • • • • •

szektor (E,B) kvadrupol (Q) ioncsapda (trap) repülési idő (TOF) lineáris ioncsapda (LIT) orbitrap FT-ICR

nagy >10,000 egységnyi (kivétel!) nagy (de: tömegpontosság?) nagy >10,000 közepes <10,000 nagy > 200,000 nagy!!! >1,000,000

1,436

+4 1,200

1,400

1,600

1,800

m/z

13

Az FTFT-ICR felbontá felbontása

Elegendő Elegendő-e egy egyszerű egyszerű LC/MS?

79

80

11+

R=1,040,000 !!!

779.5187

2000

frequency of occurrence

779.6097

779.7009

779.7924 779.4282

Több száz vegyület rendelkezik 250 körüli móltömeggel. 1500 1000

500

779.3482 779.8840 779.9759

Szerkezeti informá információ ció nyeré nyerése Benzocaine

81

200

400 600 molecular weight

800

1000

MSMS spektrumok

82

Ethenzamide O

O O

NH2

CH3

H2 N

O

CH3

Eltérő fragmensek

•Egyező összegképlet : C9H11NO2 •Egyező tömeg : 165.19 dalton •Egyező számú kettős kötés : 4

Tandem tö tömegspektrometria Célok: • szerkezeti információ nyerése • •

érzékenység növelése szelektivitás növelése

83

Triple quadrupol felé felépítése Q0

Q1

q2

Q3

84

CEM DF

Ütközési cella

Megvalósítás: • • • • •

szektor: kombináció (EBE, BEB) kvadrupol: QqQ ioncsapda: MSn TOF: Post Source Decay (PSD), TOF/TOF hibrid: BEqQ, Q-Trap, Q-TOF,

14

Lehetsé Lehetséges scanfunkció scanfunkciók Product Ion Scan

Q-Trap

85

Precursor Ion Scan

86

3D Trap Érzékenység a teljes tömegtartományban

Q TRAPTM

MS3 (vagy több) kiválaszt: anyaion pásztáz: fragmension

Neutral Loss Scan

pásztáz: anyaion kiválaszt: fragmension

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Érzékenység a teljes tartományban

QqQ MRM lehetőség

MS3

Semlegesvesztés

MRM lehetőség

Precursor Scan pásztáz: Q1 és Q3 a semleges tömegével eltolva

Semlegesvesztés

kiválaszt: anyaion kiválaszt: fragmension

Ha akarom: há hármas kvadrupol...

Precursor Scan

87

...ha akarom ioncsapda

88

Új pásztázási módokkal : Megtartva minden hagyományos funkciót : - Enhanced single MS scan (EMS) • Single MS scans (Q1 and Q3 scans)

- Enhanced Resolution scan (ER)

• Product Ion Scan (MS2)

- Enhanced Product Ion scan (EPI)

• Precursor Ion Scan (Prec)

- Enhanced Multiply Charged scan (EMC)

• Neutral Loss Scan (NL)

- Time Delayed Fragmentation scan (TDF)

• Multiple Reaction Monitoring scan (MRM)

Megnö Megnövelt leá leányion pá pásztá sztázás Product Ion Scan

- MS/MS/MS scan (MS3)

EPI

89

90

Exit lens Ion accumulation

Q0

Q1

Anyaion kiválasztás

Q2

Fragmentáció

N2 CAD Gas

Enhanced Product Ion Scan

Q3

linear ion trap 3x10-5 Torr

1. Anyaion kiválasztása. 2. Intenzív fragmentáció a LINAC-ban. 3. Fragmensionok csapdázása Q3-ban 4. Mass scan.

15

Érzé rzékenysé kenységnö gnövekedé vekedés

Q-Trap

91

Hagyományos product ion scan

92

30% 3D Ion Trap

EPI

Q TRAP System

> 550x

MS1 (3D trap)

EMS (QTrap (QTrap))

93

94

+EMS: 4.521 to 5.003 min from Sample 56 (797-47/5 EMS ujbol) of CPF.wiff (Turbo Spray), subtracted (3.346 to 4.231 min)

Max. 1.0e7 cps.

538.5 547.4

1.00e7 9.50e6 9.00e6 8.50e6 8.00e6 7.50e6 7.00e6 6.50e6 6.00e6 5.50e6 5.00e6 4.50e6 4.00e6 3.50e6 3.00e6 2.50e6 2.00e6

1093.4 1.50e6 529.6

1.00e6

508.6 520.7

1033.4

684.3

540.4 566.3

5.00e5

649.4

666.2

0.00 500

MS2 547

95

550

600

650

700

750

800

1115.5 1131.4

945.5

815.5 850 m/z, Da

900

950

1000

1050

MS3 547/538

1100

1150

1200

1250

96

16

MS4 547/538/529

MS5 547/538/529/392

97

EPI 547

EPI 547

99

+EPI (547.38) Charge (+2) CE (35) CES (15) FT (250): Exp3, 4.871 to4.945 min from Sample 2 (090217 797-47/5 IDA) of CPF.wiff (TurboSpray)

Max. 1.2e5 cps.

1.15e5

Max. 1.3e7 cps.

3.4e6

1.10e5

3.2e6

1.05e5

185.2

CE:35eV

1.00e5

417.3

3.0e6

9.50e4

287.3

2.6e6

305.2

8.50e4 8.00e4

2.4e6

7.50e4

2.2e6

7.00e4

CE:50eV

435.3 392.4

167.2

2.8e6

9.00e4

666.4

2.0e6 154.2

6.50e4

238.4 1.8e6

6.00e4 5.50e4

215.3 500.3 536.4

1.6e6 392.4

5.00e4

518.3

271.3

1.4e6

547.2

4.50e4

261.2

287.4 226.2

1.0e6

417.4

194.3

529.4

3.00e4

630.4

271.2 305.3

2.50e4

435.4

6.0e5 666.1

213.4

256.6

209.5

232.2 262.7

0.00 200

500.2 520.4

389.3 322.2

399.2 362.3

334.4

455.4 490.3 508.8

420.2

565.2

171.2 203.3

1033.3

630.1

4.0e5 945.5

583.2

777.5

594.4

795.5

815.5 867.8

927.6

147.2

288.1 299.3 232.3

252.2

175.1 233.3

2.0e5

1015.4

565.4 406.3

277.4

362.4 381.1

309.1

529.4

400.2

282.3 322.4

351.5

384.4 423.2

339.3

648.5

482.3 474.4 456.4

548.3

514.3

583.4

612.4 641.4 655.3

575.6

795.4 741.4

777.3 849.5

867.4 928.7 945.7 1016.6

1034.3

0.0 250

300

350

400

450

500

550

600

650 700 m/z, Da

750

800

850

900

950

1000

Csatolt techniká technikák A mintabevitel speciális módja, amikor folyamatosan jut be a minta a készülékbe. • GC-MS

1050

1100

150

• CE-MS

250

300

350

400

450

500

nagy

kicsi

• HPLC-MS

200

550

600 650 m/z, Da

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

GC vs. HPLC (MS)

101

102

GC: gáz/gőz minta, hőterhelés

Móltömeg

5000.00

277.3

209.3

8.0e5

684.2

261.4

2.00e4

547.4

244.1

3.50e4

684.3

256.4

1.2e6

4.00e4

1.00e4

100

+EPI (547.50) CE (50): 0.867 to 0.914 min from Sample 22 (090219 108 EPI 547) of CPF.wiff (Turbo Spray)

538.3

1.20e5

1.50e4

98

HPLC

HPLC: folyadék/oldat minta

GC

apoláros

Polaritás

poláros

LC/MS széleskörű alkalmazás, móltömeg információ

Chemical Abstracts entry compounds Total ; 9,000,000 GC applicable 130,000 (1.4%) target compounds for HPLC 8,870,000 (98.6%)

17

Az LCLC-MS/MS rendszerek érzé rzékenysé kenysége 21

GC-ECD GC-ECD 40

GC-EI-MSD GC-EI-MSD (SIM-mód) (SIM-mód)

4000

3

4

3500

GCGC-MS

103

3

104

3000

1

2500

2 ng/mL 20

Illékony minták jöhetnek szóba: EI/CI ionizáció

2

2000

= 0.8 ppb*

4

2 ng/mL

1500

= 0.8 ppb*

1000

10 0 12

14

1 2 3 4

16

18

20

22

Fipronil Fipronil-sulfide Fipronil-sulfone Fipronil-desulfinyl

24

26

10.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.00

min

Háttér: az egyre szigorodó EU normák következtében a bébiételekben 28 peszticid szermaradvány maximális értéke 10 ppb alá került (pl: fipronil és metabolitja 4 ppb)

A b u nd a nce

LC-ESI-MS/MS LC-ESI-MS/MS LC-ESI-MS/MS LC-ESI-MS/MS (negative MRM (negative MRM MRM mode) mode) (negatív mód)

TIC :V G L -1 .D 2 80 0 2 70 0

4

GC-NCI-MSD GC-NCI-MSD (SIM-mód) (SIM-mód)

2 60 0 2 50 0 2 40 0 2 30 0 2 20 0

2

2+4 33 2+4

3820 3500

1.4e5 1.2e5

3000

Fib ro n il u ndM e ta b o lit enje2ng /m l

2 10 0

1 90 0

2 ng/mL

1 80 0 1 70 0 1 60 0 1 50 0 1 40 0 1 30 0 1 20 0

1

3

= 0.8 ppb*

1 10 0 1 00 0 90 0 80 0 70 0 60 0 50 0

* 50g mintatömegre vonatkoztatva

40 0

In te n s it y, cp s

2 00 0

1.0e5 2500

11

0.2 5 pg/mL ng/mL

8.0e4 2000

500 2.0e4 0.00

Tim e->

4.6 4.6

4.8 4.8

5.0 5.0

5.2 5.4 5.4 5.2 Time,min min Time,

5.6 5.6

5.8 5.8

GCGC-MS szepará szeparátorok Membránszeparátor

• töltött kolonna: nagy gázáram ⇒ szeparátor • kapilláris kolonna: kis gázáram ⇒ direktbe A kapott spektrumok könyvtárból jól kereshetők

= 2 ng/kg !!

4.0e4 1000

1 1. 0012 .0 01 3. 0 0 14 .0 01 5 .0 01 6. 00 1 7 .0 01 8. 00 1 9 .0 02 0. 0 0 21 .0 02 2 .0 0 23 .0 02 4 .0 0

A vivőgáz és a vákuumrendszer egymással ellentétes

==0.08 2 ppt* ppb*

6.0e4 1500

30 0

Az analizátor sebességének szerepe • szektor: lassú • trap és quad közepes • TOF gyors

6.0 6.0

GCGC-MS taná tanácsok

105

Jetszeparátor

106

• Fokozottan ügyeljünk a vivőgáz tisztaságára • A kolonna kellően beérjen az ionforrásba • A GC és az MS közti átmenet “transfer line” fűtött legyen

membrán

• Lassú a válasz vákuumszivattyú

• A komponensek kis része jut be a készülékbe • A membrán szelektivitása függ a polaritástól és a móltömegtől

• Megbízható

HPLCHPLC-MS

Egyre kisebb a megkötés a vizsgálhatóság szempontjából Az eluens és a vákuumrendszer méginkább ellenségei egymásnak A mai ionforrások (API) egyben az interface szerepét is betöltik

Az első interface egyike: moving belt

HPLC

107

108

Különböző oszlopátmérőkhöz tartozó áramlás elnevezés

ID

áramlás

Ionforrás

Hagyományos

4.6 mm 3.2 mm

1-2 mL/min

mikro

1 mm 800 µm

100 µL/min 20 µL/min

Ionspray

kapilláris

500 µm 300 µm 180 µm

10 µL/min 4 µL/min 2 µL/min

Microelectrospray

nano

100 µm

300 nL/min

75 µm 50 µm

180 nL/min 80 nL/min

TurboIonspray

Nanospray

A forrásoknak széles áramlási tartományban kell dolgozni

18

Kolonnaá Kolonnaátmé tmérő vs. érzé rzékenysé kenység ckapilláris= cnormál

mAU

( dd

109

CE rendszer

110

111

CECE-MS illeszté illesztés

112

2

normál kapilláris

)

1.0 mm id

20 10 0

2 pmol mioglobin emésztmény

mAU

0.8 mm id

20

Absorption 206 nm

10 0

0.3 mm id

mAU 20 10 0

0.18 mm id

mAU 20 10 0 10

20

30

40

50

Time (min)

60

70

Kapillá Kapilláris elektroforé elektroforézis

80

Előnyök: • Gyors (10-30 perc) • Kis mintamennyiség (1-50 nL) • Nagy tányérszám • Számos mód a szelektivitás fokozására • Vizes/nemvizes közeg egyaránt • Egyszerű

Nehézségek: • Elektromos kapcsolat megvalósítása egy pufferedénnyel • A stabil spray-hez szükséges folyadékáram biztosítása • Megfelelő puffer kiválasztása, mely nem növeli az ionáramot (0.2 % hangyasav, 15 mM ammóniumacetát) • Megfelelő mennyiségű minta injektálása • Az MS és az elválasztás sebességének összehangolása

CECE-MS interface

113

114

ICPICP-MS

19

ICPICP-MS Felé Felépítés • • • • •

115

Ionforrás: ICP plazma Ionoptika Reakciócella Analizátor: Q, szektor Detektor

PE NexION 300 ICPICP-MS Detektor

ICP sugá sugárforrá rforrás Tekercs Minta aeroszol

117

Plazma

Kvarc cső Segédplazma gázok

• Kis kvadrupol • 90 fokos eltérítés töltött részecskék esetén • A semlegesek a vákuumtérbe kerülnek

Univerzális Q deflektor cella

Triple cone interface

118

• Lépcsőzetes nyomásesés • Kisebb szóródás • Kevesebb kondenzálódás • Nagyvákuumtéren kívül van, tisztításkor nem kell fellevegőztetni

Mágneses tér

Quadrupole ion deflector

Kvadrupol

116

119

Interferencia csö csökkenté kkentése

120

• ütközési cella (nem reaktív gáz) – kinetikus energia és szórásának csökkentése, valamint ütközési disszociáció • reakciócella (reaktív gáz) – Elektron- vagy protontranszfer, oxidáció – Ar+ + NH3 =>Ar + NH3+ • dinamikus reakciócella (reaktív és nem reaktív) – nagy sávszélességű kvadrupol csak adott m/z tartományú molekulák vesznek részt a reakcióban

20

Univerzá Univerzális cella technoló technológia 1.

2. 3.

Standard mód: ha nem áll fenn interferencia veszélye, ez biztosítja a legnagyobb érzékenységet. Ütközéses mód: Kinetikus Energia Diszkrimináció elvén. Reakciós mód pásztázó kvadrupollal: reagens gázok segítségével a nemkívánatos interferenciákat megszűnteti.

Analizá Analizátor II.

Analizá Analizátor I.

121

122

• Pásztázó kvadrupol 5000 amu/sec pásztázási sebességgel „peak hopping” módban páratlan gyorsaság.

LR vs HR ICP MS

123

124

• Nagyfelbontású szektorok.

56Fe:

Környezeti mintákban kis koncentrációban előfordul. A 56Fe és az ArO (40Ar+16O) azonos tömegű Quadrupole készülék =INTERFERENCIA!

Detektor

125

HR-ICPMS mérések = megkülönböztethető a 56Fe az ArO-tól FONTOS!: az elemek többsége egyszerű kvadrupollal is megkülönböztethető

Kimutatá Kimutatási hatá határok

126

• Szimultán analóg-digitális detektornak köszönhetően 9 nagyságrend dinamikus tartomány is elérhető.

21

Speciá Speciáció ciós vizsgá vizsgálatok

127

128

• GC-vel, HPLC-vel összekapcsolva módosulatanalitikai vizsgálatok elvégzése lehetséges.

Stabil izotó zotópará parány mérése Szén-12

Szén-13

Izotó Izotópará parányny-mérés

129

A perió periódusos rendszer 1H

Szén-14

2H

12C

13C

14N

130

15N 32S 33S

(6P + 6N)

(6P + 7N)

34S

(6P + 8N)

36S

Stabil izotópok

Radioaktív izotópok

Elő Előfordulá fordulások Element

Isotopes

Abundance

Hydrogen

1H, 2H

1H 2H

12C, 13C

12C

Nitrogen

14N, 15N

14N

Oxygen

16O, 17O, 18O

16O

13C

15N

17O 18O 32S, 33S, 34S, 36S

SIRMS

132

= 99.985% = 0.015%

Carbon

Sulfur

131

= 98.89% = 1.11% = 99.633% = 0.366% = 99.759% = 0.037% = 0.204%

32S

= 95.00% = 0.76% = 4.22% 36S = 0.014% 33S 34S

22

Izotó Izotópará parány mé mérése • • •

IRMS alkalmazá alkalmazások

133

• • • •

13C/12C

= 0.011225 = 0.011071 13C/12C = 0.010918 13C/12C

134

Kormeghatározás Eredetvizsgálat (borok, kábítószerek stb) Helicobacter Doppinganalitika

• Az eredményeket átszámolják delta (d) értékké: δ13Csample =

13C/12C sample

- 13C/12Cstandard

x 1000

13C/12C standard

135

C1

136

• A: csak egy izotópja van – F, P, I • A+1: két izotópja van, mindkettő intenzitása számottevő, tömegkülönbség 1 – H, C, N • A+2: két izotópja van, mindkettő intenzitása számottevő, tömegkülönbség 2 – Cl, Br, S, O

Mérési techniká technikák

Móltö ltömeg megadá megadása

Izotó Izotópok fajtá fajtái

137


138

C60

23



139

monoizotópos tömeg 556.277 nominál tömeg 556

C100

140

átlagos (kémiai) tömeg 556.64

Leu-enkefalin C28H38N5O7 felbontás

Móltö ltömeg megadá megadása átlagos (kémiai) tömeg 8681.83

250 1000

141

142

Protonált proinzulin C381H586N107O114S6

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása

monoizotópos tömeg 8676.167 nominál tömeg 8672

1000 felbontás 8000

Ionadduktok M+Na+

• • • •

12 25 .3

4.0e 5 3.8e 5

M+NH4+

3.6e 5

12 26 .2

1 22 0.5

3.4e 5

122 1.5

3.2e 5 3.0e 5 2.8e 5

5

2.6e 5 2.4e 5

Ionadduktok, Ionadduktok, tö tömegkü megkülönbsé nbségek

143

144

APCI pos: +H APCI neg: -H ESI pos: H, NH4, Na, K (1, 18, 23, 39) ESI neg: -H, Cl, formiát, acetát, trifluoracetát (-1, 35, 45, 59, 113)

16

2.2e 5 12 27 .1

2.0e 5

M+K+

38

1.8e 5

• Leggyakoribb tömegkülönbségek: 38, 22, 17, 5, 2

12 41 .3

1.6e 5 1.4e 5

22

1.2e 5 1.0e 5

M+H+

8.0e 4 6.0e 4

17

122 8.2

12 44 .2 1 22 9.3

2.0e 4 0.0

1 243 .1

120 3.4 1 20 4.4

4.0e 4

11 95

12 00

12 05

12 10

12 15

12 20

12 25 m/z, amu

1 23 0.2

12 30

12 35

12 40

124 5

12 50

24

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozás I +Q1: 0.20 min (8 scans) f rom MZ-91 ujbol

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása I

145

+Q1: 0.29 min (6 scans) f rom MZ-91 ujra HMR

1.35e5 cps

ACN-ból

58.9 1.3e5

1.26e7 cps x15

96.0 1.2e7

Ciklo(Gly-Gly-εLys)-(Gly)4-Choc M=596.3

1.2e5

1.1e5

DMF-ből

1.1e7

318+Na+

1.0e7

318+H+

1.0e5

146

341.1

319.0

9.0e6

9.0e4

201.9 8.0e6

105.1

7.0e4

Intensity, cps

Intensity, cps

8.0e4

2x318+H+

6.0e4

636.7

7.0e6

6.0e6

5.0e6

5.0e4

2x318+Na+

4.0e6

4.0e4

659.4 1018.5

596+ Na+

3.0e6

3.0e4 180.1

2.0e6

2.0e4

?

391.3 263.2

1.0e4

447.1 520.3

100

200

300

400

709.9

500 m/z, amu

600

700

776.4

906.4

800

900

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása II

200

400

600

1000

1200

1400

+Q1: 1.72 min (21 scans) from S.225 ESI pos/1, subtracted (scans 12 to 19)

148

3.78e6 cps

297.1

?

Normál MS HMR

3.5e6

337.3

337 .3 3.0e6

2.5e6

2.5e6

Intensity, cps

3.0e6

2.0e6

1.5e6

2.0e6

!

1.5e6

611.5 32 5.3

325 .3

1.0e6

1.0e6

571 .6 6 51.7

224.2 5.0e5

55.0

!

224.2 5.0e5

403.3

269.2

173.2

87.1

403.3

55.0

379.3

885.7 925 .6 96 5.8

173.2

119.2

8 45.5 465.4 8 8.8

50

100

150

200

250 m/z, amu

300

350

400

450

100

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása II +Product (611): 0.44 min (7 scans) from S.1.57 ESI pos 611=>

274+Na+

13000

149

337.2

200

300

400

500 m/z, amu

600

700

800

900

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása II

1.45e4 cps 297.2


3.78e6 cps

274+Na+

3.5e6

150

Normál MS HMR

297.1

MSMS

14000

314+Na+

314+Na+

337 .3

12000 3.0e6 11000 10000 2.5e6 9000

2.0e6

6000

274+314+Na+

1.5e6 5000

611.5 325 .3

4000

2x274+Na+

1.0e6

571 .6

2x314+Na+ 6 51.7

3000 224.2 2000

5.0e5

403.3

55.0

3x314+Na+

7000

3x274+Na+ 2x274+314+Na+ 274+2x314+Na+

611=274+314+Na+

8000

Intensity, cps

Intensity, cps

Intensity, cps

800 m/z, amu

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozás II

147

3.78e6 cps 297.1

Normál MS LMR

3.5e6

93 7 .5 1372.5

781.9


1215.9

8 46 .6

520.5

1.0e6

2x596+Na+

885.7 925 .6 96 5.8

173.2

8 45.5

1000 463.2

211.2 100

200

300

400 m/z, amu

610.4 500

600

8 8.8 100

200

300

400

500 m/z, amu

600

700

800

900

25

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása III +Q1: 0.53 min (7 scans) f rom Bat22/I/f o, subtracted (scans 2 to 4)

+Product (608): 0.02 min (2 scans) f rom Bat22/I/f o/607=>

3.69e6 cps

+ 296+Na 319.3

2.5e6

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása III

151

608=>

24000

310+H+

1.5e6

22000

311.2

20000

1.0e6

+ 296+H 297.1

5.0e5

18000

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

16000

341.2

330

Intensity, cps

Intensity, cps

2.75e4 cps 253.2

26000

2.0e6

340

m/z, amu

?

+Q1: 0.53 min (7 scans) f rom Bat22/I/f o, subtracted (scans 2 to 4)

3.69e6 cps

637.6

3.5e6

14000

12000

310+H+

10000

3.0e6

+ 296+310+Na 629.5

2.5e6 Intensity, cps

152

2.0e6

1.0e6 5.0e5

2000

615.4

607.6

651.4

643.3 610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

296+Na+

100

650


200

300

400

500

600

m/z, amu


153

+ 296+Na 319.2


3.69e6 cps

319.3

2.5e6

29 6 .8

4000

601.3 605

296+H+

6000 110.0

+ 2x310+H 621.4 296+310+H+ 2x296+Na+

1.5e6

311.2

8000

154

3.64e4 cps

35000

615=>

Intensity, cps

2.0e6

310+H+

1.5e6

30000

311.2

1.0e6 25000

+ 296+H 297.1

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

341.2

330

Intensity, cps

5.0e5

340

m/z, amu

?


3.69e6 cps

637.6

3.5e6

20000

15000

296+310+Na+

3.0e6

629.5 Intensity, cps

2.5e6

10000

2.0e6 1.5e6

+ 2x310+H 621.4

√

1.0e6

5000

610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

296+Na+

100

650


491.6

651.4

643.3

601.3 605

286.4 399.2

+ 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

5.0e5

200

400

500

600

m/z, amu


155

3.69e6 cps


156

6.46e4 cps 253.2

319.3

2.5e6

300

621=>

60000

Intensity, cps

2.0e6

310+H+ 1.5e6

55000

311.2 50000

1.0e6 45000

+ 296+H 297.1

40000

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

341.2

330

340

m/z, amu

?


3.69e6 cps

637.6

3.5e6

Intensity, cps

5.0e5

35000

+ 310+H 3 10 .8

30000

25000 3.0e6

296+310+Na+ 629.5

20000

Intensity, cps

2.5e6 2.0e6

15000

1.5e6

√

√

1.0e6

2x310+H+

10000

621.4

+ 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

5.0e5

5000 643.3

601.3 605

610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

545.6

651.4 650

100

200

300

400

500

600

m/z, amu

26

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása III 296+Na+



157

3.69e6 cps

5.52e5 cps

629=>

5.0e5

2.0e6

310+H+

1.5e6

4.5e5

311.2

1.0e6

4.0e5

+ 296+H 297.1

5.0e5

3.5e5

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

341.2

330

Intensity, cps

Intensity, cps

+ 296+Na 319.2


319.3

2.5e6

158

340

m/z, amu

?


3.69e6 cps

637.6

3.5e6 3.0e6

3.0e5

2.5e5

2.0e5

+ 296+310+Na 629.5

Intensity, cps

2.5e6 2.0e6 1.5e6

√

√

1.0e6

√ 2x310+H+

1.5e5

1.0e5

621.4

+ 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

5.0e5

5.0e4 651.4

643.3

601.3 605

610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

47.6

645

650

276.8

178.4 200

296+Na+

561.2

400

500

629.2 600


159

3.69e6 cps

+ 296+Na 319.2


319.3

2.5e6

431.2 300 m/z, amu


115.2 100

160

7.03e5 cps

638=>

6.5e5

310+H+

1.5e6

6.0e5

311.2

5.5e5

1.0e6

5.0e5

+ 296+H 297.1

5.0e5

4.5e5

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

341.2

330


Intensity, cps

2.0e6

340

m/z, amu

?


3.69e6 cps

637.6

3.5e6

?

3.0e6

+ 296+310+Na 629.5

Intensity, cps

1.5e6

√

√

1.0e6

296+310+H+

5.0e5

607.6

2.0e5

√

1.5e5

+ 2x310+H 621.4

1.0e5

2x296+Na+

5.0e4

615.4

651.4

643.3

601.3 605

610

615

3.0e5 2.5e5

2.5e6 2.0e6

3.5e5

620

625 m/z, amu

630

635

640

650

100

296+Na+

3.69e6 cps

500

600

1.8e6

310+H+

Li ionok hozzáadása!

2.72e6 c ps

Li+

311.2

310

1.7e6

311.2

162

Li+

2.0e6 1.9e6

Intensity, cps

637.2

400

+Q1: 0.73 m in (2 s c ans ) f rom Bat22/I/f o/+LiI, s ubtrac ted (s c ans 6 to 10)

2.0e6

1.5e6

414.8 300


161

319.3

2.5e6

200

m/z, amu


276.8

217.6

645

319.3

1.6e6

318

3 17 .2

1.5e6

1.0e6

1.4e6

+ 296+H 297.1

1.3e6

283.3

333.1

325.3 290

300

310

320

1.2e6

341.2

330

340

m/z, amu

??


3.69e6 cps

637.6

3.5e6

?

3.0e6

Intensity, cps

√

√

1.0e6

615

325.3

Li+

4.0e5

621.4

297.1

3.0e5 300.1 2.0e5

643.3 610

296

5.0e5

2x310+H+

601.3 605

9.0e5

6.0e5

√

+ 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

5.0e5

!!

1.0e6

7.0e5

629.5

2.5e6

1.5e6

1.1e6

8.0e5

296+310+Na+

2.0e6

Intensity, cps

5.0e5

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

651.4 650

303.1

1.0e5 294.4 295

307.9 300

305

310

315

320

325

330

m /z, am u

27

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása III 296+Na+ 319.3 318+H+

+Q1: 0.53 min (7 scans) f rom Bat22/I/f o, subtracted (scans 2 to 4) 2.5e6

√

3.69e6 cps

2.5e6

311.2

√

1.0e6

+ 296+H 297.1

5.0e5

333.1

325.3 300

310

320

341.2

330

√

1.0e6

+ 296+H 297.1

283.3 290

300

310

320

341.2

330

340

m/z, amu +Q1: 0.53 min (7 scans) f rom Bat22/I/f o, subtracted (scans 2 to 4)

637.6

3.69e6 cps 637.6

3.5e6

296+310+Na+

3.0e6

+ 296+310+Na 629.5

629.5 2.5e6 Intensity, cps


333.1

325.3

340 3.69e6 cps

3.5e6

2.0e6 1.5e6

2x310+H+

√

1.0e6

621.4

2x310+H+ √ +318+296+H+621.4 + 296+310+H 2x296+Na 615.4 607.6

1.5e6

5.0e5 651.4

643.3

601.3 605

2.0e6

1.0e6

+ 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

5.0e5

610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

318+H+ + 296+Na 319.2


605

610

615

620

625 m/z, amu

635

640

645

296+Na+ 319.3 318+H+


615=>

√


30000

630

650


165

3.64e4 cps

35000

651.4

643.3

601.3

650


166

3.69e6 cps

310+H+ 1.5e6

311.2

√

1.0e6

25000

+ 296+H 297.1

5.0e5 283.3 Intensity, cps

3.69e6 cps

311.2


3.0e6

164

310+H+ 1.5e6

5.0e5

283.3 290

√

2.0e6

310+H+ 1.5e6

296+Na+ 319.3 318+H+


Intensity, cps

Intensity, cps

2.0e6


163

333.1

325.3

20000

290

300

310

320

341.2

330

340


3.69e6 cps 637.6

3.5e6

15000

3.0e6

+ 296+310+Na 629.5


10000

5000

286.4

1.5e6

5.0e5 491.6 100

200

300

400

√

2.0e6

1.0e6

399.2

2x310+H+ 318+296+H+ 621.4 + + 296+310+H 2x296+Na 615.4 607.6

√

600

605



√

610

615

620

625 m/z, amu

3.69e6 cps


650

168

5.52e5 cps

629=>

3.5e5

283.3

333.1

325.3 290

645

4.0e5

+ 296+H 297.1

5.0e5

640

4.5e5

311.2

√

1.0e6

635

318+H+ + 296+Na 319.2

5.0e5

310+H+ 1.5e6

630


167

300

310

320

341.2

330

340


3.69e6 cps

318+310+H+ + 296+310+Na 629.5

3.5e6 3.0e6

637.6

Intensity, cps

Intensity, cps

2.0e6

651.4

643.3

601.3

500

m/z, amu

3.0e5

2.5e5

2.0e5

Intensity, cps

2.5e6

√

2.0e6

1.5e5

+ 2x310+H + 621.4 √ 318+296+H + 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

1.5e6 1.0e6 5.0e5

1.0e5

5.0e4 643.3

601.3 605

610

615

620

625 m/z, amu

630

635

640

645

651.4 47.6 650

115.2 100

276.8

178.4 200

431.2 300

400

561.2 500

629.2 600

m/z, amu

28



√

2.0e6


169

318+H+

3.69e6 cps

Intensity, cps

6.0e5

311.2

5.5e5 5.0e5

+ 296+H 297.1

5.0e5 283.3

300

310

4.5e5

333.1

325.3 290

320

341.2

330

340

4.0e5

2x318+H+ 637.6 318+310+H+ + 296+310+Na 629.5

+Q1: 0.53 min (7 scans) f rom Bat22/I/f o, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6 3.0e6

Intensity, cps

2.5e6

Intensity, cps

m/z, amu 3.69e6 cps

5.0e5

1.5e5 1.0e5 651.4

643.3

601.3 605

610

615

620

3.0e5

2.0e5

2x310+H+ + 621.4 √ 318+296+H + 2x296+Na+ 296+310+H 615.4 607.6

1.0e6

3.5e5

2.5e5

√

2.0e6 1.5e6

7.03e5 cps

638=>

6.5e5

√

1.0e6

+ 296+Na 319.2


310+H+ 1.5e6

170

625 m/z, amu

630

635

640

645

5.0e4 276.8

217.6

650 100

200

414.8 300

637.2

400

500

600

m/z, amu

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása IV

Móltö ltömeg meghatá meghatározá rozása IV

171

40 8.40 0

7.3e 5

(A+2H+2Na)2- A: Tetra 2COO + 4OSO3

5.4e 4

7.0e 5

A: Tetra 2COO + 4OSO3

4-

6.5e 5

5.0e 4

6.0e 5

172

83 9.50 0

4.5e 4

(A+H+2Na+NH4)2-

5.5e 5 4.0e 4

(A+H+3Na)2-

5.0e 5 3.5e 4

4.5e 5 49 6.40 0

2 87 .900 4.0e 5

3.0e 4 850 .50 0

3.5e 5

(A+2H+Na+NH4)2(A+3H+Na)2-

2.5e 4 3.0e 5 41 4.00 0

2.5e 5

2.0e 4 43 5.30 0

2.0e 5 1.5e 5

5 52 .1 00 5 57 .6 00

4 17 .9 00 3 55 .2 00 283 .30 0

3 00

39 1.10 0

51 8.10 0

4 26 .5 00

448 .10 0 530 .70 0

33 7.00 0

31 9.6 00 25 0

82 8.60 0

35 0

40 0

4 50

50 0

54 5.10 0

59 8.40 0

55 0

61 0.50 0 6 00 65 0 m /z , am u

697 .60 0 70 0

1.0e 4

83 9.50 0

500 0.0

82 9.10 0

7 24 .2 00 7 50

2-

80 0

8 50

85 8.50 0 830 .00 0

86 1.60 0 9 00

Mennyisé Mennyiségi meghatá meghatározá rozások • Egyszeres kvadrupol

(A+3Na+NH4)2(A+4Na)2-

8 51 .5 00

1.5e 4 37 9.00 0 3 50 .9 00

1.0e 5 5.0e 4

3-

84 8.00 0

8 61 .6 00

9 58 .200 95 0

173

1 00 0

79 0

8 00

8 10

8 20

830

84 0

85 0 86 0 m /z , a m u

87 0

8 80

8 90

MS pásztá sztázási mó módok

900

91 0

92 0

174

Q1 full scan

– Full scan mód – Selected Ion Monitoring (SIM)

• Hármas kvadrupol

Minden iont figyel

– Reakciócsatornák figyelése (MRM)

• Nagyfelbontású MS

Selected Ion Monitoring (SIM)

Csak a kiválasztott ionokat figyeli

29

Q1 Full scan mód

Q1 SIM mó mód

175

2nd scan

1st scan

1st experiment

176

2nd experiment

m/z 3

m/z arány m/z 3 m/z 2 m/z 1

• Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken • Jobb jel/zaj viszony m/z 2

m/z 2

m/z 1

m/z 3 m/z 2

m/z 1

Idő

Time

Single Quad Full Scan

1ng/ml peszticid

1.5e5

1.0e8

1.4e5

11.2

0.6 6.5 6.8

178

1.6e5

10ng/ml peszticid

5.0e7

Single Quad SIM

177

10.2

1.5e8

m/z 3

Last m/z

m/z értékek

Last m/z

12.4

7.6 8.2 9.2 9.4 9.9

1.3e5

13.3 14.0

1.2e5 1.1e5 1.0e5

0.0

1

2

3

4

5

6

7 8 Time, min

9

10

11

12

13

14

9.0e4

15

8.0e4

253

1.15e5

7.0e4

1.00e5

11.1

6.0e4 7.1

8.00e4 6.00e4

88

171

102

5.0e4

202

4.0e4

4.00e4

3.0e4

2.00e4

2.0e4

0.00 80

9.6 0.6

1.0e4

90

100

110

120

130

140

150

160

170 180 190 m/z, amu

200

210 220

230

240

250

260

MRM mó mód

0.0

1

2

3

4

5

6

7 8 Time, min

9

10

11

12

13

14

Triple Quad MRM

179

180

6. 9

Első scan

Második scan

6500 6000

MRM3

MRM3

1ng/ml peszticid

5500 5000

Q1/Q3 értékek

4500 4000 3500 3000 2500

MRM2

MRM2 2000 1500

MRM1

MRM1

1000 500 0

1

2

3

4

5

6

7 8 Time, min

9

10

11

12

13

14

Idő

30

Szelektivitá Szelektivitás: Atrazin 100μ 100μg/L

181

MRM

MRM

SIM

SIM

Nagyfelbontá Nagyfelbontás

183

XIC ± 100mDa

XIC ± 9.6mDa

S/N = 5.3

S/N = 15.5

XIC ± 4.8mDa

XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1

S/N = 41.0

Egy csú csúcs jellemzé jellemzése • A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul • S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével • A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20

185

Screening módszerek

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

182

184

Célmolekulák keresése (M.T.S): • 300 MRM (2MRM/komponens): 150 vegyület • 300 MRM-en alapuló IDA mérés, mint Survey Scan amit 3 információfüggő EPI scan követ (3 különböző ütközési energián): 300 vegyület • És ha több komponens van? Ismeretlen komponensek keresése (G.U.S.) • EMS pásztázáson alapuló IDA mérés, mint Survey Scan, amit információfüggő EPI scan követ (Auto Fragment módban dinamikus háttérkivonással DBS)


4500

0 0.2

Érzé rzékenysé kenység: Chlortoluron 10μ 10μg/L

186

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

31


MRM hatá határai

187

188

• Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során ~ 21 sec – Minimálisan szükséges adatpontok száma ~10 – Minimális dwell time / ion ~ 5msec – Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec • MRM átmenetek maximális száma: = 21 sec/csúcs ÷ 10pont/csúcs ÷ 7 msec/pont = 300

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

Ajá Ajánlá nlás mennyisé mennyiségi meghatá meghatározá rozásokhoz

0.6

189

Célmolekulá lmolekulák MRM átmenetei XIC of -MRM (3 pairs): 321.0/152.0 amu from Sample 3 (Std. 0.5ng/ml) of Data Quantitation Chl...

• Ajánlás 2002/657/EG

190

Max. 385.8 cps.

4.99 380

Quantifier tömeg

360 340

• SIM és MRM (4 azonosítási pont) • MS anyaion 1.0 2 MRMs = 4 • MS2 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) • Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) • Nagyfelbontású MS (>10 000)

320 300 280 260 240 220

Qualifier tömeg(ek)

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Metolachlor Poz Pozití itív talá találat

191

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5 Time, min

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

Metobromuron Negatí Negatív talá találat

Oldószer

Oldószer

0.1µg/L Standard

0.1µg/L Standard

Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.90

Felszíni víz 0.01µg/L

Felszíni víz 0.008µg/L

Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.39

192

32

QTrap kínálta screening lehető lehetőség

193

300 komponens egyidejű egyidejű mérése 194 XIC of +MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray)

Survey scan: 300 MRM IDA kritérium (küszöb…) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 60 sec

Max. 1.1e6 cps.

11.79 1.05e6

300 Peszticid 100ng/mL

1.00e6

MRM Survey Scan

9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5

IDA Criteria

Dynamic Exclusion

6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5

Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra

2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e4 0.00

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12 Time, min

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

MultiMulti-target screening

195

MultiMulti-target screening

196

Spektrumkö Spektrumkönyvtá nyvtár

197

A QTRAP nyú nyújtotta lehető lehetőségek

198

Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben • mért koncentráció 0.29 mg/kg

Standard 5.84

• maximálisan megengedett érték = 0.05 mg/kg

1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5

• átlag MRM arány a standard esetében = 0.850 (RSD=8%, n=7)

1.0e5 1.0e5

• MRM arány a mintában = 0.909

P

• a standard Rt értéktartománya 5.84 - 5.87 perc (SD=0.01 perc, n=7) • minta Rt = 5.78 perc

Gyömbér minta 5.78 5.78

1.2e5 1.2e5 Intensity, cps Intensity, cps

• • • •

8.0e4 8.0e4 6.0e4 6.0e4 4.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e4 0.0 0.0

6

2

2

4 4 Time, min Time, min

6

6

Ð

További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő!

33

A QTRAP nyú nyújtotta lehető lehetőségek

Tová További lehető lehetőségek

199

200

Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben

• Tovább növelni az egy injektálásból vizsgálható célmolekulák számát (1000-körüli értékig): Scheduled-MRM

• Enhanced Product Ion spektrumok az m/z=334 (M+H+) ionokon (API 4000 Qtrap) Qua ntifier

Qualifier

Tebufenpyrad standard oldata

Gyömbér minta

Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható!

Tipikus Screening kromatogram

• 300 MRM • Ciklusidő 2.1 sec – Dwell Time: 5msec – Pause time 2msec

11.79 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5

Egy tipikus screening mérés

201

202

• MRM csatornák alakulása az LC mérés során: Csúcsszélesség 10sec, egyszerre vizsgált MRM cstaornák átlaga : 7 Pesticide Mix (253 MRM) - From 6.68-Min to Last MRM (out of 302) Average MRM/Sec = 7 (for Peak Width of 16sec)

Numb. MRM

Gradient

25

90 80

6.50e5

20

70

5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5

60 15 50 40 10 30

2.50e5

20

5

2.00e5

%A (aqueous)

Number MRM at Time

6.00e5

1.50e5

10

1.00e5

0

5.00e4

0 0

0.00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12 Time, min

13

14

15

16

17

18

19

ScheduledScheduled-MRM

20

21

22

100

200

300

400

500

600

700

800

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

LC Time (sec)

23

203

• Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható • Minden MRM csatorna esetén meg kell adni – Egy várt Rt. – Rt. ablak – Minimum dwell time • A program automatikusan felépíti a metódot – Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket – A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul

ScheduledScheduled-MRM: MRM: a koncepció koncepció Nagy számú vizsgált MRM átmenet

204

Kis számú vizsgált MRM átmenet

MRM átmenetek

34

High throughput vizsgá vizsgálat sMRM módszerrel

Nontargeted screening: screening: SWATH™ SWATH™

205

• „Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical mass spectra” lehetővé teszi MS/MS felvételek készítését általános és átfogó módon

1 .05e 5 1 .00e 5

• 10 perces LC futás • 1000 MRM módszer • 35 vegyület spike-olt vizelet

9 .50e 4 9 .00e 4 8 .50e 4 8 .00e 4 7 .50e 4 7 .00e 4 6 .50e 4

206

– A Q1 kvadrupólt szélesre nyitjuk és léptetjük a teljes tömegtartományban – Data Independent Acquisition (DIA), információtól független mérés – MS/MSALL

6 .00e 4 5 .50e 4 5 .00e 4 4 .50e 4 4 .00e 4 3 .50e 4 3 .00e 4 2 .50e 4

Regular MS/MS

2 .00e 4

SWATH MS/MS

1 .50e 4 1 .00e 4 5 000.00 0 .00

1

2

3

4

5 Time , m in

6

7

8

9

Q1 filter [0.7]

10

SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete

TOF analyzer

CID TOF analyzer

SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete

m/z

1200

m/z

207

208 1100

Aebersold and coworkers, ETH Zurich

1100

1000

900

800

700

600

500

400

1000

900

Aebersold and coworkers, ETH Zurich

1200

Q1 filter [25Da]

CID

m/z tömegtartomány = [400-1200] Ÿ 25Da swath ablak ó 32 swath-ra van szükség Ÿ 100ms egy ablak ó 3.2s ciklusidő

800

swath = A kromatográfiás futás során egy adott tömegablakkal kiválasztott anyaionok fragmenseinek összessége

700

600

Ciklusidő: azonos tömegablakhoz való visszatéréshez szükséges idő 500

400 min 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

min 0

110

SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: adatgyűjtés és értékelés

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: Adatgyűjtés és értékelés MS2/swath map [swath 600-625 m/z]

TIC

209

210

TIC

MS1 map

209

MS1 map

855.5395 742.4556 671.4180 600.3368

Ae Ae ber ber so so ld ld aa nd nd co co wor wor ker ker s, s, E E TH TH Zurich Zurich

Ae ber so ld a nd co wor ker s, E TH Zurich

Keresett peptid

327.1295

Kiválasztott ionkromatogramok: 855.5395 742.4556 671.4180 600.3368 327.1295

210

35

SWATH elő előnyei

211

• általános és nem célzott • nincs módszerfejlesztés! • Az adatok utólagosan visszanyerhetők (mind MS, MS/MS és XIC) • A mérési idő nem növekszik a mérendő komponensek számával • A szelektivitása hasonló MRMHR -hez (a háttér általában magasabb)

Terá Terápiá piában haszná használt gyó gyógyszerek – – – – – – –

– – – – – –

Analeptikumok Antiarrhythmikumok Antibiotikumok Antidepresszánsok Antiepileptikumok Antikoagulánsok Antimycotikunok

Mennyisé Mennyiségi meghatá meghatározá rozások Komp/inj Q SIM

150

QTrap MS3

<100

QTrap MRM/EPI

300

QTrap sMRM

1000

TOF MS

Korlátlan

TOF MSMS

<1000

TOF MSMS SWATH

Korlátlan

Immunoszupp Immunoszuppresszá resszánsok

+ ++ + + + + +

Nem

+ ++ ++ + + ++ ++

Nem Nem Nem Nem Igen Nem Igen

Immunszuppresszá Immunszuppresszánsok

213

Antiretrovirális szerek Analgetikumok Bronchustágítók Immunszuppresszánsok Narkotikumok Cytosztatikumok

Érzékenység Szelektivitás Retrospektív

<100

QqQ MRM

212

214

• Ciklosporin A • Rapamycin (Sirolimus) • Tacrolimus • Everolimus

Ciklosporin iklosporin toxicitá toxicitás

215

216

H3 C

160 0

HO CH3

H3 C

O

O H N

N N O

(H 3C)2CHCH2

O CH 3

N

CH(CH3 )2 CH3

O

N

O

N

N CH3

CH3

H N

N H O

R

CH2 CH(CH3 )2 O

O H N

H3 C

CH3

N

O

Cyclosporin A Mol. Wt. 1202.624 Exact Wt. 1201.841

CH2 CH(CH3 )2

CH3

O CH(CH3 )2

Cyclosporin vérszint (ng/ml)

(CH3) 2CHCH2

150 ng/ml < C0 < 300 ng/ml

140 0

CH3

120 0

Nefrotoxicitás, hypertensio Hepatotoxicitás: Bi, máj enzimek

100 0 80 0 60 0 40 0 20 0 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

Id õ (ó ra )

36

CSA vérszint meghatá meghatározá rozás

FPIA vs. vs. LCMS

• Immunoassay -FPIA: fluorescence polarization immunoassay -EMIT: enzyme multiplied immunoassay technique • HPLC-MS/MS

CYA koncentráció FPIA módszerrel (ng/ml)

217

218

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

y=1.56151*x+63.0442 r=0.90742

200 0 0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

CYA koncentráció LC-MS módszerrel (ng/ml)

EMIT vs. vs. LCMS

219

Ciklosporin iklosporin metabolizmusa: CYP3A4

220

CYA koncentráció EMIT módszerrel (ng/ml)

OH 1200 1000

N 11

800

OH

O

HO N

N 10 O

600

2

O

N 1

N O

3 O

400

9

y=1.29705*x+27.88061 r=0.92766

200

100

200

300

400

500

600

700

800

O

N

0 0

O

8 N O

900

N

O

7 N

4

5 N 6 N O

O

CYA koncentráció LC-MS m ódszerrel (ng/m l)

CSA metabolitjai MRM

2D LCMS

221

XIC of +MRM ( 7 pairs): 1202.8/224.4 amu from Sample 10 (29) of 061206MRM.wiff (T urbo Spr ay), Smoothed

Poros R1/20 (2.1x30mm)

Max. 2593.7 cps. 5.49

2594

222

CSA

2500

3200 QTrap

2400

Luna Phenyl-Hexyl (2x50mm)

2300 2200 2100

60ºC

2000 1900 1800 1700 1600 1500

OH-CSA

1400 1300

Autosampler

1200 1100 1000

Pumpa A

900 800 700

diOH-CSA

600

ISTD

500

Pumpa B

400 4.55

300

Metanol 97%, 0.1% AcOH, 10mM NH4FA

200 100 0 0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 T ime, min

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

Metanol 50%

37

2D LC/MS/ MS LC/MS/MS

Metabolizmus következmé vetkezménye

223

X IC of +M RM (10 pa ir s) : 821.4 /576.0 am u from S am ple 10 ( 22) of 071001.w if f (T urb o S pray ) , S m oothed, Sm oothed

224

M ax . 14.7 cp s.

CSA

6202 6000

• Immunszuppresszív hatás csökken

5500

5000

4500

OH-CSA

• Metabolitok toxicitása hozzájárulhat az anyavegyület toxicitásához

4000

In te ns it y , c ps

3500

3000

2500

2000

diOH-CSA

1500

1000

500

0 1 .0

1.2

1.4 1 .6 T im e, m in

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

800

200

600

150

Bilirubin (µmol/l)

γ GT (U/l)

diOHdiOH-ciklosporin vs GGT /se Bi

400

200

0

5

10

15

20

25

30

35

40

400

100

50

r=0,88723 0

45

10

20

diOH-CSA (ng/ml)

30

40

50

60

diOH-CSA (ng/ml)

n=110

!

70

!

diOH-CYA GGT

60 300 50 40

200

30 20

100

10 0 0

10

20

30

150

200

250

0 300

idõ (nap)

DihidroxiDihidroxi-ciklosporin iklosporin vérszint II. FNGy 2007.09.05 52 éves férfi HBV

diOH-CYA GGT

600

30

500 400

20 300 200

10

100 0

0 0

2

4

6

8

idõ (nap)

10

12

14

16

70

!

diOH-CYA Bilirubin

60

120 100

50 80 40 60 30 40

20

20

10 0 0

10

20

30

150

200

250

0 300

idõ (nap)

227

228

Donor: 52 éves nő CYP3A4 aktivitás magas!!

Egyé Egyéni terá terápia megvaló megvalósítása

Tacrolimus

Cyclosporin

90 40 !

diOH-CYA Bilirubin

80 70

30

60 50

20

40 30

10

20 10

0

Bilirubin koncentráció (µmol/l)

Tacrolimus 700

!

G GT (U/l)

Dihidroxi-CYA koncen tráció (ng/ml)

Cyclosporin 40

Dihidroxi-CYA koncentrációja (ng/ml)

Recipiens:

226

Recipiens: KI 2007.01.03 45 éves férfi HCV

0

r=0,82787

0

DihidroxiDihidroxi-ciklosporin iklosporin vérszint I.

225

Bilirubin koncentráció (µmol/l)

0.8

Dihidroxi-cyclosporin koncentráció (ng/ml)

0.6

GGT koncentrációja (U/l)

0 .4

Dihidroxi-cyclosporin koncentráció (ng/ml)

0.2

• Genotipizálás • Fenotipizálás

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

idõ (nap)

38

Valproá Valproát metabolizmusa

229

Genetikai Genetikai polimorfizmusa polimorfizmusa

230

CYP allél

Mutáció

Enzim aktivitás

CYP2C9*2

430C>T

csökkent

CYP2C9*3

1075A>C

csökkent

COOH

CYP2C9

Valproát

CYP2C9 COOH

OH COOH

CYP2C9

COOH

COOH HO

5-hidroxi-valproát

4-én-valproát

OH

3-hidroxi-valproát

Esetismerteté Esetismertetés

231

• • • •

1,5 hónapos koraszülött csecsemő (S.H.) epilepsia focalis à valproát kezelés toxikus tünetek: leállították a valproát kezelést CYP status: CYP2C9*3/*3 valproát kezelés tilos!! • még 5 nappal a valproát kezelés beszüntetése után is magas valproát vérszint • karbamazepinre váltottak: a beteg állapota normalizálódott

Valproá Valproát kezelé kezelés a CYP2C9CYP2C9stá státus ismereté ismeretében

Valproá Valproát vérszintek alakulá alakulása a CYP2C9CYP2C9-stá státus fü függvé ggvényé nyében

232

CYP2C9 fenotípus 0,5

PM

IM Valproát vérszint / dózis (ug/ml)/mg

4-hidroxi- valproát

*1/*2

0,4

0,3

0,2

*1/*3 0,1

0,0

PN B B MPMaA BM FZs

z M M B A J D A N B B B D N T S J K S R B Z Mé G Zs S M L Á

Betegek

233

• CYP2C9 genotípus és fenotípus együttes figyelembe vétele: – CYP2C9 homozigóta mutáns: *2/*2 vagy *3/*3

nem javasolt a valproát alkalmazása – CYP2C9 heterozigóta: *1/*2 vagy *1/*3

alacsony dózis javasolt még CYP2C9 IM esetén is – CYP2C9 homozigóta vad: *1/*1

a CYP2C9 fenotípus irányadó:

CYP2C9 PM: alacsony dózis javasolt CYP2C9 IM: normál dózis alkalmazható

39

Kezdetek. Tömegspektrometria. Elektron. ionizáci. ció. Ionforrás. Cél: Töltött részecskék előállítása

Recommend Documents