Kezdetek
1
2
• J. J. Thomson, 1910, 1912 – Kisülési csőbe különböző gázokat vezetett – 20Ne/22Ne Izotópok létezésének bizonyítéka
Tömegspektrometria Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont (
[email protected])
Az MS felé felépítése
3
• F. W. Aston, 1919 – Első spektrográf – Ne, Cl, Hg, N izotópok
4
Mintabevitel
Detektor
Adatgyűjtő rendszer Ionforrás
Kezdetek
Analizátor
Vákuumrendszer
Interface
Ionforrá Ionforrás
Elektron ionizá ionizáció ció
5
Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: • elektron ionizáció (EI) • kémiai ionizáció (CI) • gyors atom bombázás (FAB) • lézerdeszorpció (LDI, MALDI) • ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) légköri nyomású photoionozáció (APPI) deszorpciós electrospray (DESI)
6
repeller mágnes
mágnes
filament (fűtőszál)
Filament (fűtőszál): W, Re Tfil= 2000 °C
trap
M+• Kamra: p= 10-5 Torr T= 100-200 °C Repeller: U= néhány V
1
Elektronionizá lektronionizáció ció
7
Az elektronenergia hatá hatása
8
Kémiai ionizá ionizáció ció
10
• Vizsgálhatóság feltétele: illékonyság • Tömeghatár: 1000 Dalton (Da) • Kationok, gyökkationok képződnek • Fragmentáció: gyakori és jellegzetes (spektrumkönyvtár) • Sok esetben nincs molekulaion • Az elektron energiának a szerepe
Kémiai ionizá ionizáció ció
9
• CI forrás: az EI forrásnál zártabb
Ion-molekula reakciók:
• Reagens gáz: metán, izobután, ammónia
Metán:
• Nyomás: ≈ 0.1 Torr (EI ≈10-6 Torr) • Minta parciális nyomása: ≈10-4 Torr
CH5+ + M → CH4 + [M+H]+ C2H5+ + M → [M+C2H5]+
• Lágy ionizáció Izobután:
• Fragmentáció: elhanyagolható • Kvázi-molekulaion
CI reagens gá gázok Metán:
• szerves vegyületekre általánosan jó • [M+H]+ [M+C2H5]+ ionokat ad • az adduktok intenzitása kicsi
Izobután:
• enyhe fragmentáció figyelhető meg • [M+H]+ [M+C4H9]+ ionokat ad • az adduktok intenzitása nagy • nem olyan univerzális, mint a metán
CH4 + e- → CH 4+• + 2 eCH4 + CH4+• → CH 3• + CH5+ CH3+ + CH4 → C2H 5+ + H2
(CH3)3CH+• → C3H7+ + CH 3• C3H7+ + C4H10 → C4H9+ + C3H 8
C4H9+ + M → [M+H]+ + C4H8 C4H9+ + M → [M+ C4H9]+
11
Tipikus EI spektrum [M-OH]+
12
M+•
Ammónia: • fragmentáció nincs • bázikus molekuláknál [M+H]+ iont ad • poláris vegyületeknél [M+NH4]+ iont ad • egyéb vegyületekre nem jó
2
Tipikus CI spektrum [M+H]+
Gyors atom bombá bombázás
13
14
• Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét
[2M+H]+
• Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe • Mátrix: glicerin, NOBA • Tömeghatár: ≅ néhány ezer Da • Fragmentáció: kismértékű • Gyors atom/ion: Xe, Cs+ • Kvázi-molekulaion: [M+H]+, [M+Na]+,
Gyors atom bombá bombázás
Lézerdeszorpció zerdeszorpció
15
16
Matrix Assisted Laser Desorption IonizationonizationTime of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok:
4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA)
2,5-dihidroxi benzoesav (DHB)
Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA)
Mintatartó Mintatartó
MALDI ionké ionképző pződés
17
18
Laser
Mintatartó
1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra.
hn
2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba.
AH+
3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. Rács
+20 kV
Rács
4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás.
3
A MALDI elő előnyei
l
l
l
l
l
Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kDa) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors
20
Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = 149089.4, 3562]
[M+H]+ 100
149131
3562.3
[M+2H]2+
90
1 pmol lineáris mód + 25 kV gyors. fesz
74667 80 70
% Intensity
l
60 50 40
[M+3H]3+
30 20
24607
49813
[2M+3H]3+
0 20000
[2M+H] +
99694
10
298434 80000
140000
200000
260000
0 320000
Mass (m/z)
Ionizá Ionizáció ció légkö gköri nyomá nyomáson
21
Poláros
ESI
APPI Apoláros 102
103
10 104
105
Móltömeg
IonSprayTM Áramlási tartomány: 2 – 200 µ L/min
22
Ionforrások koncentrációtartományai: – TurboV (2µL/min—3mL/min) – Turbo-IonSpray (2µL/min—1mL/min) – IonSpray (2 to 200µL/min) – Micro-IonSpray (50 to 1000 nL/min) – NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 20-50 nL/min) Kis áramlás → nagyobb érzékenység!
APCI
101
Electrospray ionizá ionizáció ció IonSpray: Pneumatikusan segített electrospray Nagyfeszültség (5-6 kV) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!).
Polaritás
l
Tipikus MALDI spektrum
19
23
TurboIonSprayTM
24
Áramlási tartomány: 2 – 1000 µ L/min
4
Turbo VTM
25
Áramlási tartomány: 2 – 3000 µL/min
Nanospray
Mic Microelectrospray
26
Áramlási tartomány: 50 – 1000 nL/min
27
Nanospray
28
29
Sprayké Sprayképző pződés
30
Áramlási tartomány: 20 – 50 nL/min
Microtechniká Microtechnikák máské sként
vákuum
légköri nyomás 1. 1. töltött töltött cseppek cseppek képződése képződése
3. Coulomb robbanás
2. oldószereltávolítás
5
Többszö bbszörösen tö töltö ltött ionok
31
Móltö ltömegszá megszámítás
32
minden egyes csúcsra igaz: Lysozyme MW = 14,305.14
m/z = (MW + nH+) n
m/z = tömeg/töltés értékek a spektrumban MW = a fehérje móltömege n = töltésszám (egész) H+ = a hidrogén ion tömege (1.008 Da)
Móltö ltömegszá megszámítás
33
A töltés és a móltömeg is ismeretlenek Két szomszédos csúcs töltöttségi foka közti különbség:1
Rekonstruá Rekonstruált tö tömegspektrum
34
14305.7
1431.6 = (MW + nH+) 1301.4 = (MW + [n+1]H+) [n+1] n 2 ismeretlen két egyenlet – először n-re oldjuk meg n = 1300.4/130.2 = 10 majd behelyettesítve a móltömeg: MW = 14316 - (10x1.008) = 14305.9
Eluensmó Eluensmódosí dosítók
14402.8 14,305.14
35
Sóhatá hatás
36
• Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp3 N- tartalmú) protonálódását. • Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. • 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. • Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mM koncentrációban. • Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!!
6
APCI • • • • • •
37
Az APCI nagy áramlást is (0.1-2.0 mL/min.) tolerál Poláros, termikusan stabil vegyületek vizsgálatára Molekulatömeg MW < 1000 Da Intenzív fűtés hatására az oldószer elpárolog Porlasztó- és segédgáz alkalmazása szükséges Korona kisülés hatására következik be az ionizáció
APCI ionké ionképző pződés
Ionké Ionképzé pzés mechanizmusa primer folyamat:
38
N2 + e- → N2+• + 2e-
szekunder folyamat:N2+• + H2O → H2O+• + N2 H2O+• + H2O → H3O+ + OH• adduktképződés:
H3O+ + M → [M+H]+ + H2O
Kombiná Kombinált forrá forrás
39
40
vákuum vákuum vákuum
légköri nyomás nyomás légköri oldószermolekulák 1.1.oldószermolekulák ionizációja ionizációja
Forrásház ESI probe
2. adduktképződés, klaszterképződés
APCI probe
Légkö gköri nyomá nyomású fotoionizá fotoionizáció ció
41
Photospray forrá forrás
42
• Eluens áramlási sebessége:100µL-2mL/min • Fordított fázis • MeOH/víz előnyös • ACN csökkenti az érzékenységet • Normál fázis • Izooktán/Izopropanol/Diklórmetán • Dopant: Toluol (HPLC grade) 5-15% külön pumpával • Hőmérséklet: 300-450 °C (APCI)
7
PSI alkalmazá alkalmazás XI C of +M RM ( 4 pair s) : 28 9. 3/ 97. 2 am u f r om S am p le 3 ( SM 4 100- 1 0p g/ uL 10 uL i nj N P A P CI ) of SM 4 Q 1. . .
43
Deszorpció Deszorpciós Electrospray
44
45
Oldó Oldószereltá szereltávolí volítás
46
M ax. 2. 0e4 cp s.
1. 00e 5
9. 50e 4
Testosterone
9. 00e 4
8. 50e 4
PhotoSpray Source
8. 00e 4
7. 50e 4
7. 00e 4
OH CH3
6. 50e 4 I nt ensit y, cps
6. 00e 4
5. 50e 4
5. 00e 4
4. 50e 4
CH3
4. 00e 4
H
3. 50e 4
3. 00e 4
APCI
2. 50e 4
2. 00e 4
H
H
1. 50e 4
1. 00e 4
O
500 0. 00
0. 00 0. 0
0. 5
1. 0
1. 5
2. 0
2. 5
3. 0
3. 5
4. 0
4. 5
5. 0
5. 5
6. 0
6. 5
7. 0
7. 5
Tim e, m in
XI C of +M RM ( 4 pair s) : 27 9. 5/ 133. 0 am u f r om Sam p le 1 ( SM 4 10 0- 10 pg/ uL 1 0u L in j N P PI ) of SM 4 Q 1 M . . .
M ax. 2. 0e4 cp s.
2. 0e4 1. 9e4
1. 8e4
Ethynyl Estradiol
1. 7e4
1. 6e4
OH CH3
PhotoSpray Source
1. 5e4
1. 4e4
CH
H
1. 3e4
1. 2e4
1. 0e4
H
800 0. 0
H
700 0. 0
HO
600 0. 0
500 0. 0
400 0. 0
300 0. 0
APCI
200 0. 0
100 0. 0
0. 0 1
2
3
4
5
6
7
8
Tim e, m in
DESI alkalmazá alkalmazások
Nitrogén gázfüggöny
Gázfü zfüggö ggöny interface
Robusztussá Robusztusság
47
1.80E+05
légköri nyomás
CUR
DP
vákuum
SK
1.60E+05
Q0
48
Methomyl 3.1% Carbaryl 3.3% Aldicarbsulfone 3.6% Aldicarb 3.6%
2.00E+05
+
+
+
+
+
+
Response
+
1.20E+05
1.00E+05
8.00E+04
+
+
+
+ +
+
+
FP
+
+
+
+ +
+ +
+
1.40E+05
+
I nt ensit y, cps
1. 1e4
900 0. 0
6.00E+04
4.00E+04
N2
2.00E+04
0.00E+00
0
200
400
600
800
1000
1200
Injection Number
Szpájkolt talajminta (50ng/mL); 1200 injektálás (3.5nap)
8
Karbantartá Karbantartás
49
Oldó Oldószereltá szereltávolí volítás
50
Fűtött kapilláris HPLC eluens Spray
Párologtató gáz
Fűtőegység
Szárítógáz
Fűtött kapilláris
Analizá Analizátorok
51
Cél: Töltött részecskék szétválasztása
52
Lorentz erő: 1. ½ mv2 = eU
Analizátor típusok: • mágnes (B) • elektrosztatikus (ESA) • kvadrupol (Q) • ioncsapda (trap) • repülési idő (TOF) • lineáris ioncsapda (LIT) • Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia MS (FT-ICR) • Orbitrap
Mágneses analizá analizátor
Mágneses analizá analizátor
2. veB = mv2/R ⇒ v= eRB/m 1. + 2. ⇒
m B2 R2 e = 2U
Tömeg megspektrometria alapegyenlete Pásztázás (scan) : • mágnesáram • gyorsító feszültség
53
Elektrosztatikus analizá analizátor
54
Szektormező +
1. ½ mv2 = eU 2. mv2/R = eE 1. + 2. ⇒
ϕ
-
R = 2U / E Független a tö tömegtő megtől!!!
9
ESA
Kettő Kettős fó fókuszá kuszálás
55
56
Cél: a mágnes és az ESA kölcsönös hiányosságainak kiküszöbölése
Kettő Kettős fó fókuszá kuszálás
•
A forrásból kilépő ionok sebesség- és irányszoródást szenvednek
•
Mágnes: impulzus szerint szeparál. Azonos tömeg, különböző energia ⇒ kiszélesedik a csúcs
•
Rések: érzékenység csökken
•
Nagyfelbontás!!
Felbontá Felbontás
57
m ∆m
Felbontás: R = Z-rés
mágnes
ESA
Full Width at Half Mass
10 % völgy
∆m (50% magasságnál)
m forrásrés
58
kollektorrés detektor 10 %
ionforrás ∆m
Kvadrupol analizá analizátor
59
m
Kvadrupol analizá analizátor
60
+ –
–+
+
+
• Felbontás: egységnyi • A rendszer méréshatára: néhány ezer
+
+
–
–
+
+
+
+ +
+
–+
• DC = 0 - ± 500 V • RF = 6000 V
–
+
+
–
–+
1. Ion enters the quadrupole system 2. 3. Electrical 4. 5. 6. Egy Movement RF-voltage Movement ... adott ACrepulsion of /changes of DC the the érték ion ion and polarity into into esetében attraction, direction direction andcsak electrical respectively, ofofthe egy the nearest repulsion ionbetween nearest and quadrupole számára attraction, quadrupole quadrupole stabil rod respectively, az with ionpálya. rod rods thewith opposite and between the ion opposite charge quadrupole charge rods and ion
10
Kvadrupol analizá analizátor
Ioncsapda analizá analizátor
61
62
belépő ionok belépő elektróda
gyűrűelektróda
kilépő elektróda
kilépő ionok
Előny: érzékenység, kis méret, MSn
Ioncsapda analizá analizátor
RF pásztázás…
63
Lineá Lineáris ioncsapda: Q TRAP
…kilépő potenciálgát EXB változtatása 64
Radiális csapdázás
• Ionok mozgása: az elektródákra kapcsolt egyenilletve váltófeszültség hatására
Axiális csapdázás
• Az összes ion egyszerre tartózkodik a csapdában
Axiális csapdázás
• Kis méret, könnyű kezelhetőség Q2
• MSn funkció (n=10, elméletileg!)
Segéd RF pásztázás….
Konstans potenciál (U)
m1, m2
D
65
m1 m2
Idő (ns)
Repü Repülési idő idő analizá analizátor ½ mv2 = eU m1 → v1 v = (2eU/m)1/2 m2 → v2 t = D/v = (D2m/2eU)1/2 ⇒
Detektor
Repü Repülési idő idő analizá analizátor
Radiális csapdázás
Kilépő oldali háló
66
2U m= D2 t2
Az ionok energiaszórása miatt a felbontás kicsi
m1>m2 azonos töltés esetén
Megoldás: • iontükör (reflektor) • késleltetett ionkieresztés (delayed extraction)
11
A felbontá felbontást befolyá befolyásoló soló tényező nyezők 67 Forrás
Felbontá Felbontást nö növelő velő megoldá megoldások
68
Detektor
Eltérő helyen képződő ionok
• Az ionképződés helyének szórása – Iontükör (Reflectron)
R= m/∆m=t/2∆t
∆t
• Sebességeloszlás (energiaszórás)
t
– Delayed extraction (MALDI) – orthogonal TOF
Sebességszórás
∆t
Iontü Iontükör
69
Iontü Iontükör a való valóságban
70
71
A DE hatá hatása a felbontá felbontásra
72
Iontükör
detektor
Ugyorsító
deflektor
U=0
Utükör
forrás
Delayed Extraction (DE) +20 kV
Linear mode
+ +
Reflector mode
+ delayed extraction R=11,000
continuous extraction R=125
delayed extraction R=1,100
continuous extraction R=650
A potenciálgradiens a lassabb ionokat jobban gyorsítja
+20 kV
+ + + 10600
10800
11000
m/z
A detektorig a lassabb ion utóléri a gyorsabbat
Minta: DNS 36-mer
11200
11400
6130
6140
6150
6160
6170
m/z
Minta: DNS 20-mer
12
Felbontá Felbontás Felbontás: R =
Felbontá Felbontás
73
m ∆m
Minimálisan szükséges felbontás
Full W idth at Half Mass
10 % völgy ∆m
74
Ar 39.96239 C3H4 40.03130 N2 28.00615 C2H4 28.03130 CO 27.99491 N2 28.00615 13CC H 92.05813 6 7 C7H8 92.06260
∆m (50% magasságnál)
10 %
m
m
FTFT-ICR MS
75
580 1100 2490 20600
Ionpá Ionpályá lyák az orbitrapban
76
Teljesí Teljesítőképessé pesség
78
A cellába bejuttatott és a nagy mágneses térerő hatására körpályára kényszerített ionok által indukált áramot méri. • óriási felbontás • tág időskála (nem destruktív detektálás)
Speciá Speciális Orbitrap
77
Instrument performance for Bovine Insulin
+5
m/∆m = 70,000
+3 m/∆m = 40,000 1,147
1,148
1,149
+4 m/∆m = 45,000
+5
1,911
1,912
1,913
1,914
+3 1,434
1,435
1,436
+4 1,200
1,400
1,600
1,800
m/z
13
Analizá Analizátorok felbontá felbontása
Az FTFT-ICR felbontá felbontása
79
80
11+
R=1,040,000 !!!
779.6097
• • • • • •
szektor (E,B) kvadrupol (Q) ioncsapda (trap) repülési idő (TOF) lineáris ioncsapda (LIT) orbitrap FT-ICR
nagy >10,000 egységnyi (kivétel!) nagy (de: tömegpontosság?) nagy >10,000 közepes <10,000 nagy > 200,000 nagy!!! >1,000,000
779.5187
779.7009
779.7924 779.4282 779.3482 779.8840 779.9759
A felbontá felbontás szerepe az azonosí azonosításokban XIC ± 100mDa
XIC ± 9.6mDa
S/N = 5.3
S/N = 15.5
XIC ± 4.8mDa
Elegendő Elegendő-e egy egyszerű egyszerű LC/MS?
81
XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1
82
2000
frequency of occurrence
•
Több száz vegyület rendelkezik 250 körüli móltömeggel. 1500 1000
500
S/N = 41.0
200
Szerkezeti informá információ ció nyeré nyerése Benzocaine
83
400 600 molecular weight
800
1000
MSMS spektrumok
84
Ethenzamide O
O O
NH2
CH3
H2 N
O
•Egyező összegképlet : C9H11NO2
CH3
Eltérő fragmensek
•Egyező tömeg : 165.19 dalton •Egyező számú kettős kötés : 4
14
Tandem tö tömegspektrometria
Triple quadrupol felé felépítése
85
Célok: • szerkezeti információ nyerése
Q1
Q0
q2
• érzékenység növelése • szelektivitás növelése
86
CEM
Q3
DF
Ütközési cella
Megvalósítás: • szektor: kombináció (EBE, BEB) • kvadrupol: QqQ • ioncsapda: MSn • TOF: Post Source Decay (PSD), TOF/TOF • hibrid: BEqQ, Q-Trap, Q-TOF,
Lehetsé Lehetséges scanfunkció scanfunkciók Product Ion Scan
MS pásztá sztázási mó módok
87
Precursor Ion Scan
Q1 full scan
pásztáz: anyaion kiválaszt: fragmension
kiválaszt: anyaion pásztáz: fragmension
Neutral Loss Scan
pásztáz: Q1 és Q3 a semleges tömegével eltolva
Minden iont figyel
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Selected Ion Monitoring (SIM)
Csak a kiválasztott ionokat figyeli
kiválaszt: anyaion kiválaszt: fragmension
Q1 Full scan mód
Q1 SIM mó mód
89
2nd scan
1st scan
1st experiment
90
2nd experiment
m/z 3
m/z arány m/z 3 m/z 2 m/z 1
m/z 3 m/z 2
Idő
m/z 3
Last m/z
m/z értékek
Last m/z
88
• Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken • Jobb jel/zaj viszony m/z 2
m/z 2
m/z 1
m/z 1
Time
15
Single Quad Full Scan 10.2
1.5e8
1ng/ml peszticid
1.5e5
1.0e8
1.4e5
11.2
0.6 6.5 6.8
92
1.6e5
10ng/ml peszticid
5.0e7
Single Quad SIM
91
12.4
7.6 8.2 9.2 9.4 9.9
1.3e5
13.3 14.0
1.2e5 1.1e5 1.0e5
0.0
1
2
3
4
5
6
7 8 Time, min
9
10
11
12
13
14
9.0e4
15
8.0e4
253
1.15e5
7.0e4
1.00e5
11.1
6.0e4 7.1
8.00e4 6.00e4
88
171
102
5.0e4
202
4.0e4
4.00e4
3.0e4
2.00e4
2.0e4
0.00 80
9.6 0.6
1.0e4
90
100
110
120
130
140
150
160
170 180 190 m/z, amu
200
210 220
230
240
250
260
MRM mó mód
0.0
1
2
3
4
5
6
7 8 Time, min
9
10
11
12
13
14
Triple Quad MRM
93
94
6. 9
Első scan
6500
Második scan
6000
1ng/ml peszticid
5500
MRM3
MRM3
5000
Q1/Q3 értékek
4500 4000 3500 3000 2500
MRM2
MRM2 2000 1500 1000
MRM1
MRM1
500 0
1
2
3
4
5
6
7 8 Time, min
9
10
11
12
13
14
Idő
Szelektivitá Szelektivitás: Atrazin 100μ 100μg/L
95
Érzé rzékenysé kenység: Chlortoluron 10μ 10μg/L
MRM
MRM
SIM
SIM
96
16
Linearitá Linearitás: Linuron
Q-Trap
97
98
3D Trap Érzékenység a teljes tömegtartományban
MRM
Q TRAPTM
MS3 (vagy több)
Érzékenység a teljes tartományban
QqQ MRM lehetőség
SIM
MS3
Semlegesvesztés
MRM lehetőség
Precursor Scan
Semlegesvesztés Precursor Scan
Ha akarom: há hármas kvadrupol... kvadrupol...
...ha akarom ioncsapda
99
100
Új pásztázási módokkal : Megtartva minden hagyományos funkciót : - Enhanced single MS scan (EMS) • Single MS scans (Q1 and Q3 scans)
- Enhanced Resolution scan (ER)
• Product Ion Scan (MS2)
- Enhanced Product Ion scan (EPI)
• Precursor Ion Scan (Prec)
- Enhanced Multiply Charged scan (EMC)
• Neutral Loss Scan (NL)
- Time Delayed Fragmentation scan (TDF)
• Multiple Reaction Monitoring scan (MRM)
- MS/MS/MS scan (MS3)
Lineá Lineáris ioncsapda: Q TRAP
Q-Trap
101
102
Exit lens Ion accumulation
Q0
Q1
Q2
Q3
30% 3D Ion Trap
Anyaion kiválasztás
Fragmentáció
N2 CAD Gas
linear ion trap 3x10-5 Torr
Q TRAP System
1. Anyaion kiválasztása. 2. Intenzív fragmentáció a LINAC-ban. 3. Fragmensionok csapdázása Q3-ban 4. Mass scan.
17
MS1 (3D trap)
EMS (QTrap (QTrap))
103
104
+EMS: 4.521 to 5.003 min from Sample 56 (797-47/5 EMS ujbol) of CPF.wiff (Turbo Spray), subtracted (3.346 to 4.231 min)
Max. 1.0e7 cps.
538.5 547.4
1.00e7 9.50e6 9.00e6 8.50e6 8.00e6 7.50e6 7.00e6 6.50e6 6.00e6 5.50e6 5.00e6 4.50e6 4.00e6 3.50e6 3.00e6 2.50e6 2.00e6
1093.4 1.50e6 529.6
1.00e6
508.6 520.7
1033.4
684.3
540.4 566.3
5.00e5
649.4
666.2
0.00 500
550
600
650
700
750
800
1115.5 1131.4
945.5
815.5 850 m/z, Da
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250
MS2 547
105
MS3 547/538
106
MS4 547/538/529
107
MS5 547/538/529/392
108
18
EPI 547
EPI 547
109
+EPI (547.38) Charge (+2) CE (35) CES (15) FT (250): Exp3, 4.871 to4.945 min from Sample 2 (090217 797-47/5 IDA) of CPF.wiff (TurboSpray)
Max. 1.2e5 cps.
+EPI (547.50) CE (50): 0.867 to 0.914 min from Sample 22 (090219 108 EPI 547) of CPF.wiff (Turbo Spray)
1.15e5
3.4e6
1.10e5
3.2e6
1.05e5
185.2
CE:35eV
1.00e5
417.3
3.0e6
9.50e4
2.8e6
9.00e4
8.00e4
2.4e6
7.50e4
2.2e6
7.00e4
CE:50eV
435.3 392.4
167.2 287.3
2.6e6
305.2
8.50e4
666.4
2.0e6 154.2
6.50e4
238.4 1.8e6
6.00e4 5.50e4
215.3 500.3 536.4
1.6e6 392.4
5.00e4
518.3
271.3
1.4e6
547.2
4.50e4
261.2
287.4 1.0e6
417.4 529.4
3.00e4
630.4
271.2 305.3
2.50e4
435.4
256.6 232.2
5000.00 0.00 200
500.2 277.3
389.3 322.2
262.7
362.3 334.4
209.3
6.0e5 666.1
213.4 209.5
226.2 194.3
8.0e5
684.2
261.4
2.00e4
547.4
244.1
3.50e4
520.4
399.2 455.4 490.3 508.8
684.3
256.4
1.2e6
4.00e4
1.00e4
Max. 1.3e7 cps.
538.3
1.20e5
1.50e4
110
565.2
171.2 203.3
1033.3
630.1
4.0e5 945.5
583.2
420.2
777.5
594.4
795.5
815.5
927.6
252.2
175.1 233.3
2.0e5
1015.4
867.8
147.2
288.1 232.3
565.4
299.3
406.3
277.4
362.4 381.1
309.1
529.4
400.2
282.3 322.4
351.5
384.4 423.2
339.3
648.5
482.3 474.4 456.4
548.3
514.3
583.4
612.4 641.4 655.3
575.6
795.4 741.4
777.3 849.5
867.4 928.7 945.7 1016.6
1034.3
0.0 250
300
350
400
450
500
550
600
650 700 m/z, Da
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
150
“Enhanced“ Enhanced“ pásztá sztázási módok
111
200
250
300
350
400
450
500
550
600 650 m/z, Da
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
Megnö Megnövelt felbontá felbontás
112
Scan @ 4000 amu/sec Enhanced MS Scan
<0.7 amu 4000amu/s 1000amu/s 250amu/s
Scan @ 1000 amu/sec 0.3 amu
Enhanced Resolution Scan 250amu/s
Scan @ 250 amu/sec 0.15 amu
Megnö Megnövelt felbontá felbontás +ER: 4.424 to 4.532 min from Sample 6 (AI 19-45 1/1000_3f...
Max. 7.8e5 cps.
653.73
7.8e5
+ER: 5.306 to 5.337 min from Sample 7 (PPB 1-21 1/1000_2f...
849.96
2.8e6
Max. 2.8e6 cps.
850.40
2+
2.7e6
3+
7.5e5
113
2.6e6
7.0e5
Megnö Megnövelt leá leányion pá pásztá sztázás
114
Product Ion Scan
2.5e6 2.4e6
6.5e5
2.3e6
653.43
2.2e6
6.0e5
2.1e6 2.0e6
5.5e5
1.9e6
654.04
1.8e6
5.0e5
1.7e6 4.5e5
1.6e6 Intensity, cps
Intensity, cps
4.0e5
850.86
1.5e6 1.4e6
Enhanced Product Ion Scan
1.3e6
3.5e5 1.2e6 1.1e6
3.0e5
1.0e6 2.5e5
9.0e5
654.35
8.0e5 2.0e5
7.0e5 6.0e5
1.5e5
5.0e5
851.33
4.0e5
1.0e5
3.0e5
654.67
2.0e5
5.0e4
851.83
1.0e5 0.0
652.0
652.5
653.0
653.5
654.0 654.5 m/z, amu
655.0
655.5
656.0
656.5
848
849
850
851 m/z, amu
852
853
854
19
Érzé rzékenysé kenységnö gnövekedé vekedés
115
EPI
Ismeretlen komponensek keresése (G.U.S.) • EMS pásztázáson alapuló IDA mérés, mint Survey Scan, amit információfüggő EPI scan követ (Auto Fragment módban dinamikus háttérkivonással DBS)
> 550x
Ütkö tközési cellá cellák
“Cross talk” talk” effektus
117
• A hagyományos ütközési cellák egy RF-only kvadrupolok, melyben az ütközőgáz nyomása relatíve nagy (fókuszálás)
Ütközösi cella
• Felmerülő problémák – Érzékenység csökkenése (kis dwell time-ok esetén) – Cross Talk (együtt eluálódó, egyező fragmenstömegű komponensek)
Egy csú csúcs jellemzé jellemzése
300
200
119
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
400
200 m/z
• Az ionok áthaladási ideje a cellán: 50-80 msec. Azonos Q3 tömegek esetében az egyes átmenetek zavarhatják egymást.
Egy csú csúcs jellemzé jellemzése • A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul • S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével • A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20
0.25
118
Ütközösi cella
m/z
4500
0 0.2
116
Célmolekulák keresése (M.T.S): • 300 MRM (2MRM/komponens): 150 vegyület • 300 MRM-en alapuló IDA mérés, mint Survey Scan amit 3 információfüggő EPI scan követ (3 különböző ütközési energián): 300 vegyület • És ha több komponens van?
Hagyományos product ion scan
• A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul • S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével • A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20
Screening módszerek
0.6
120
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
20
Egy csú csúcs jellemzé jellemzése • A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul • S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével • A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20
MRM hatá határai
121
122
• Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során ~ 20 sec – Minimálisan szükséges adatpontok száma ~10 – Minimális dwell time / ion ~ 5msec – Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec • MRM átmenetek maximális száma: = 20 sec/csúcs ÷ 10pont/csúcs ÷ 7 msec/pont = 285
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
Ajá Ajánlá nlás mennyisé mennyiségi meghatá meghatározá rozásokhoz
0.6
123
Célmolekulá lmolekulák MRM átmenetei XIC of -MRM (3 pairs): 321.0/152.0 amu from Sample 3 (Std. 0.5ng/ml) of Data Quantitation Chl...
• Ajánlás 2002/657/EG
124
Max. 385.8 cps.
4.99 380
Quantifier tömeg
360 340
• SIM és MRM (4 azonosítási pont) • MS anyaion 1.0 2 MRMs = 4 • MS2 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) • Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) • Nagyfelbontású MS (>10 000)
320 300 280 260 240 220
Qualifier tömeg(ek)
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
Metolachlor Poz Pozití itív talá találat
125
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5 Time, min
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Metobromuron Negatí Negatív talá találat
Oldószer
Oldószer
0.1µg/L Standard
0.1µg/L Standard
Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.90
Felszíni víz 0.01µg/L
Felszíni víz 0.008µg/L
Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.39
126
21
QTrap kínálta screening lehető lehetőség
127
300 komponens egyidejű egyidejű mérése 128 XIC of +MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray)
Survey scan: 300 MRM IDA kritérium (küszöb…) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 60 sec
Max. 1.1e6 cps.
11.79 1.05e6
300 Peszticid 100ng/mL
1.00e6
MRM Survey Scan
9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5
IDA Criteria
Dynamic Exclusion
6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5
Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra
2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e4 0.00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 Time, min
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
MultiMulti-target screening
129
MultiMulti-target screening
130
Spektrumkö Spektrumkönyvtá nyvtár
131
A QTRAP nyú nyújtotta lehető lehetőségek
132
Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben • mért koncentráció 0.29 mg/kg
Standard 5.84
• maximálisan megengedett érték = 0.05 mg/kg
1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5
• átlag MRM arány a standard esetében = 0.850 (RSD=8%, n=7)
1.0e5 1.0e5
• MRM arány a mintában = 0.909
P
• a standard Rt értéktartománya 5.84 - 5.87 perc (SD=0.01 perc, n=7) • minta Rt = 5.78 perc
Gyömbér minta 5.78 5.78
1.2e5 1.2e5 Intensity, cps Intensity, cps
• • • •
8.0e4 8.0e4 6.0e4 6.0e4 4.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e4 0.0 0.0
6
2
2
4 4 Time, min Time, min
6
6
Ð
További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő!
22
A QTRAP nyú nyújtotta lehető lehetőségek
Tová További lehető lehetőségek
133
134
Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben
• Tovább növelni az egy injektálásból vizsgálható célmolekulák számát (1000-körüli értékig): Scheduled-MRM
• Enhanced Product Ion spektrumok az m/z=334 (M+H+) ionokon (API 4000 Qtrap) Qua ntifier
Qualifier
Tebufenpyrad standard oldata
Gyömbér minta
Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható!
Tipikus Screening kromatogram
• 300 MRM • Ciklusidő 2.1 sec – Dwell Time: 5msec – Pause time 2msec
11.79 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5
Egy tipikus screening mérés
135
136
• MRM csatornák alakulása az LC mérés során: Csúcsszélesség 10sec, egyszerre vizsgált MRM cstaornák átlaga : 7 Pesticide Mix (253 MRM) - From 6.68-Min to Last MRM (out of 302) Average MRM/Sec = 7 (for Peak Width of 16sec)
Numb. MRM
Gradient
25
90 80
6.50e5
20
70
5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5
60 15 50 40 10 30
2.50e5
20
5
2.00e5
%A (aqueous)
Number MRM at Time
6.00e5
1.50e5
10
1.00e5
0
5.00e4
0 0
0.00 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 Time, min
13
14
15
16
17
18
19
ScheduledScheduled-MRM
20
21
22
100
200
300
400
500
600
700
800
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
LC Time (sec)
23
137
• Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható • Minden MRM csatorna esetén meg kell adni – Egy várt Rt. – Rt. ablak – Minimum dwell time • A program automatikusan felépíti a metódot – Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket – A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul
ScheduledScheduled-MRM: MRM: a koncepció koncepció Nagy számú vizsgált MRM átmenet
138
Kis számú vizsgált MRM átmenet
MRM átmenetek
23
High throughput vizsgá vizsgálat sMRM módszerrel 9 .50e 4 9 .00e 4 8 .50e 4 8 .00e 4 7 .50e 4 7 .00e 4 6 .50e 4
140
• Screening módszerek
1 .05e 5 1 .00e 5
Alkalmazá Alkalmazások
139
• 10 perces LC futás • 1000 MRM módszer • 35 vegyület spike-olt vizelet
– – – –
6 .00e 4 5 .50e 4 5 .00e 4
Klinikai alkalmazás Doppinganalitika Igazságügy Élelmiszer/környezetvédelem
4 .50e 4 4 .00e 4 3 .50e 4 3 .00e 4 2 .50e 4 2 .00e 4 1 .50e 4 1 .00e 4 5 000.00 0 .00
1
2
3
4
5 Time , m in
6
7
8
Terá Terápiá piában haszná használt gyó gyógyszerek – – – – – – –
Analeptikumok Antiarrhythmikumok Antibiotikumok Antidepresszánsok Antiepileptikumok Antikoagulánsok Antimycotikunok
– – – – – –
10
Élelmiszerek minő minőségbiztosí gbiztosítása
141
Antiretrovirális szerek Analgetikumok Bronchustágítók Immunszupresszánsok Narkotikumok Cytosztatikumok
Mi is az a Cliquid • Az első élelmiszervizsgálatokra készült szoftver • Egyszerű felhasználói felület • Agilent 1100,1200 HPLC, Shimadzu Prominence HPLC illetve bármely AB Triple Quad vagy QTrap MS rendszerekkel használható • A legfontosabb célvegyületekre előregyártott metódok • Beépített riportkészítő egység • A szoftver mellé a szükséges oszlopok is rendelkezésre állnak
9
143
• • • • • • • • • • • • • •
142
Klóramfenikol (mézből, tejből, kagylóból, tojásból) Szulfonamidok (mézből, húsból) Tetraciklinek (mézből, húsból) Benzimidazolok (húsból) Béta agonisták (állatorvosi eseteknél) Nitrofurán (mézből, húsból, kagylóból, tojásból) Akrilamid (sültkrumpliból) Chlormequat és Mepiquat mérése Ochratoxin A and Zearalenon (sütőipari termékek) Aflatoxinok Isoproturon és Glifozát (csapvízből és talajból) Karbamátok (gyümölcsből) Triazinok és fenilurea peszticidek (vízből) Multi pesticide screening (gyümölcsből, zöldségből)
Beé Beépített mó módszerek
144
• Peszticidek: karbamátok, szerves foszfonátok, fenilurea, triazinok • Nitrofurán és metabolitjaik • Klóramfenikol • Azofestékek (pozitív és negatív módban) • Malachite zöld ……kiegészítve egy 421 vegyületből álló MRM • Akrilamid könyvtárral, amiből saját metódot állíthatunk • Mikotoxinok össze, illetve amikből a már meglévő • Szteroidok módszereket ki tudjuk egészíteni
24
Nyitó Nyitólap: navigá navigál
145
Egyszerű Egyszerű metó metódkivá dkiválasztá lasztás
146
Mérendő rendő mintá minták listá listája
147
Riportké Riportkészí szítési lehető lehetőség
148
149
Áttekinté ttekintés, ekvilibrá ekvilibrálás
150
Egyszerűen szerkeszthető, vagy importálható
Riportkü Riportküldé ldés mó módja
25
Automatikus mé mérés
151
Real time kromatogramfigyelé kromatogramfigyelés
152
A készülék állapotának grafikus megjelenítése
26
