IMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum PADA MEMBRAN ZEOLIT/KAPPA-KARAGINAN UNTUK MENINGKATKAN STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
WAHYUNING LESTARI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Imobilisasi Sel Lactobacillus plantarum pada Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, April 2016 Wahyuning Lestari G451130211
RINGKASAN WAHYUNING LESTARI. Imobilisasi Sel Lactobacillus plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI, NOVIK NURHIDAYAT, dan ZAENAL ABIDIN.
Kadar asam urat di dalam tubuh perlu di ukur secara akurat dan cepat agar penyakit asam urat dapat dideteksi sejak dini sehingga tidak menimbulkan berbagai macam komplikasi penyakit. Pengukuran kadar asam urat secara klinis dilakukan dengan memeriksa sampel darah di laboratorium dengan metode spektrofotometri. Metode spektrofotometri memiliki kelemahan sehingga diperlukan suatu alat pendeteksi alternatif pengganti metode konvesional salah satunya adalah biosensor. Biosensor asam urat berbasis enzim urikase telah banyak dikembangkan akan tetapi, proses pemurnian enzim tergolong rumit serta mahal sehingga diperlukan sumber urikase lain diantaranya menggunakan sel Lactobacillus plantarum yang lebih mudah penanganannya dan murah. Masalah yang timbul pada biosensor adalah kestabilan, Kestabilan biosensor asam urat erat kaitannya dengan metode imobilisasi yang digunakan untuk menjaga kelangsungan hidup bioreseptor sehingga waktu hidup dan aktivitas bioreseptor tetap terjaga. Adsorpsi merupakan metode imobilisasi sel yang paling sederhana. Namun, interaksi yang terjadi antara mikroorganisme dengan material pengimobilisasi pada proses adsorpsi merupakan ikatan yang lemah sehingga dengan mudah mikroorganisme yang terimobilisasi akan lepas dan secara langsung berdampak pada stabilitas biosensor. Metode lain yang dapat digunakan untuk imobilisasi mikroorganisme adalah entrapment atau penjeratan. Metode mampu menjaga stabilitas bioreseptor dengan baik. Tujuan penelitian ini adalah meningkatkan stabilitas biosensor asam urat dengan mengimobilisasi L.plantarum pada membran zeolit/kappa-karaginan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nilai konstanta Michaeles-Menten (KM) dan Vmax pada penelitian ini berturut-turut 2.86 mM dan 0.0018 mA Linearitas pengukuran 2-2.6 mM dengan nilai r2 = 0.9959. Limit deteksi dan limit kuantitas berturut-turut 0.478 mM dan 1.598 mM. Stabilitas biosensor asam urat adalah 23 hari dengan aktivitas sebesar 80.43%. Imobilisasi sel L.plantarum pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan kinerja biosensor asam urat. Kata kunci: biosensor asam urat, Lactobacillus plantarum, zeolit, kappakaraginan
SUMMARY WAHYUNING LESTARI. Immobilization of Lactobacillus plantarum Cell on Zeolite/Kappa-Carrageenan Membrane to Increase Uric Acid Biosensor Stability. Supervised by DYAH ISWANTINI, NOVIK NURHIDAYAT, and ZAENAL ABIDIN. Levels of uric acid in the body need to be measured accurately and quickly to detect gout disease early. Measurement of uric acid levels is clinically done by examining a blood sample in a laboratory with spectrophotometric method. Spectrophotometric method has the disadvantage that needed alternative detector conventional methods one of which is a biosensor. Uric acid enzyme-based biosensors have been developed. However, the enzyme purification process is complex and expensive so we need other sources such uricase of Lactobacillus plantarum cells are easier to handle and inexpensive. Although this biosensor is known for its instability. The stability of uric acid biosensor is closely related to immobilization method used to maintain the viability of bioreseptor so bioreseptor life time and activity is maintained. Adsorption is a cell immobilization method is the simplest. However, interaction between microorganisms with immobilization material. The adsorption process is weak bonds so easily immobilized microorganisms will be loose and have a direct impact on the stability of the biosensor. Another method that can be used for the immobilization of microorganisms is entrapment. This methods can maintain stability of bioreseptor. The purpose of this research is to improve the stability of uric acid biosensor by immobilized L.plantarum on zeolite/ kappa-carrageenan membrane. The results of this study indicate that the Michaeles-Menten constant (KM) and Vmax in this study successively 2.86 mM and 0.0018 mA. Linearity measurements at 2-2.6 mM with R2 = 0.9959. Limit of detection and limit of quantity respectively 0,478 mM and 1.598 mM. The stability of uric acid biosensor is 23 days with the activity of 80.43%. L.plantarum cell immobilized on zeolite/ kappa-carrageenan membrane is able to improve the performance of the uric acid biosensor. Keywords:
uric acid biosensor, carrageenan.
Lactobacillus plantarum, zeolite, kappa-
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
IMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum PADA MEMBRAN ZEOLIT/KAPPA-KARAGINAN UNTUK MENINGKATKAN STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
WAHYUNING LESTARI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Akhiruddin Maddu, M.Si
Judul Penelitian :
Nama NRP
Imobilisasi Sel Lactobacillus Plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat : Wahyuning Lestari : G451130211
Disetujui oleh, Komisi Pembimbing
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc. Agr Ketua
Dr Novik Nurhidayat Anggota
Dr Zaenal Abidin Anggota
Diketahui oleh
Ketua program studi Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc. Agr
Dr Ir Dahrul Syah, MSc. Agr
Tanggal Ujian: 5 April 2016
Tanggal Lulus:
Judul Penelitian Nama NRP
Imobilisasi Sel Lactobacillus Plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat
• Wahyuning Lestari
Disetujui oleh, Komisi Pembimbing
Prof Dr Dvah Iswantini Pradono. MSc. Agr Ketua
Dr No ik Nu Ida at ggot
Dr Zaenal Abidin Anggota
Diketahui oleh
Ketua program studi Kimia
asarjana
4
Prof Dr Dyah Isw
Pradono, MSc. Agr
Tanggal Ujian: 5 April 2016
Dr Ir Dahrul Syah, MSc. Agr Tanggal Lulus:
25
APR 2016
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2014 sampai September 2015 ini ialah biosensor asam urat, dengan judul Imobilisasi Sel Lactobacillus plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Dyah Iswantini Pradono MSc. Agr, Bapak Dr Novik Nurhidayat dan Bapak Dr Zaenal Abidin selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Acun Samsuri dan Mbak Lusianawati dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah membantu saya untuk menumbuhkan bakteri. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, teman-teman S2 Kimia angkatan 2013 serta seluruh keluarga atas doa dan dukungannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas dana pendidikan yang telah diberikan kepada penulis melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN). Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, April 2016 Wahyuning Lestari
DAFTAR ISI DAFTAR ISI
viii
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Rumusan Masalah
3
Tujuan Penelitian
4
Hipotesis
4
Manfaat penelitian
4
2 METODE PENELITIAN
4
Waktu dan Tempat Penelitian
4
Bahan dan Alat
4
Lingkup Kerja
5
Aktivasi Zeolit
5
Prosedur Pengujian Nilai KTK Zeolit
5
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon
6
Pembuatan Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
6
Pembuatan Media GYP (Glucose Yeast Pepton)
6
Penumbuhan dan Pemanenan sel L. plantanum
6
Imobilisasi L. Plantanum Pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
7
Pengukuran Elektrokimia
7
Optimasi Aktivitas Sel L. Plantarum yang Diimobilisasi pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
7
Penentuan Parameter Analitik
9
Penentuan Stabilitas Biosensor Asam Urat
9
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivasi Zeolit
9 9
Pembuatan dan Pencirian Elektroda Pasta Karbon
11
Penumbuhan dan Pemanenan Sel L. plantanum
12
Imobilisasi Sel L.plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan dan Pengujian Aktivitas
12
Optimasi L. plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
14
Analisis Parameter Kinetika Enzim Urikase dari Sel L.plantarum
16
Pengukuran Parameter Analitik Biosensor Asam Urat
17
Stabilitas Biosensor Asam Urat
18
4 SIMPULAN DAN SARAN
19
Simpulan
19
Saran
19
RIWAYAT HIDUP
25
DAFTAR TABEL Tabel 1 Kombinasi berat zeolit, konsentrasi karaginan, dan konsentrasi asam urat untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum 8 Tabel 2 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah 9 Tabel 3 Puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai konsentrasi HCl 10 Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6], 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena 11 Tabel 5 Hasil analisa pengaruh variabel terhadap arus 15 Tabel 6 Perkembangan Biosensor Asam Urat 19
DAFTAR GAMBAR Gambar 1 Voltamogram aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran dengan variasi konsentrasi HCl Gambar 2 Voltamogram karakterisasi elektroda pasta karbon menggunakan larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M Gambar 3 Mekanisme pendeteksian biosensor asam urat Gambar 4 Voltamogram sel L.plantarum yang terimobilisasi Gambar 5 Kontur (a) pengaruh konsentrasi kappa-karaginan dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (b) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (c) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi kappa-karaginan terhadap arus Gambar 6 Grafik hubungan 1/[S] dengan 1/I Gambar 7 Linearitas biosensor asam urat Gambar 8 Stabilitas biosensor asam urat
10 11 13 14
15 16 17 18
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian Lampiran 2 Hasil kombinasi Response Surface Methods Lampiran 3 Stabilitas Biosensor Asam Urat
23 24 24
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Asam urat merupakan hasil akhir dari metabolisme purin pada sel tubuh. Asam urat berperan sebagai antioksidan apabila kadarnya di dalam darah tidak berlebih, namun apabila kadarnya berlebih asam urat akan berperan sebagai prooksidan. Kadar asam urat di dalam tubuh manusia dapat diketahui melalui pemeriksaan darah ataupun urin. Kadar asam urat normal pada laki-laki yaitu 3.68.2 mg/dL sedangkan pada perempuan yaitu 2.3-6.1 mg/dL. Kadar asam urat yang tidak normal akan berakibat munculnya berbagai macam penyakit antara lain hiperurisemia, gout, sindrom Lesch-Nyhan, dan gagal ginjal (Luo et al 2006). Kadar asam urat di dalam tubuh perlu di ukur secara akurat dan cepat agar penyakit asam urat dapat dideteksi sejak dini sehingga tidak menimbulkan berbagai macam komplikasi penyakit. Pengukuran kadar asam urat secara klinis dilakukan dengan memeriksa sampel darah di laboratorium dengan metode spektrofotometri (Mateo et al. 2007). Metode spektrofotometri memiliki kelemahan antara lain kurang spesifik, mahal, dan sangat peka terhadap cahaya untuk itu diperlukan suatu alat yang dapat mengatasi kelemahan tersebut. Biosensor merupakan alat pendeteksi alternatif pengganti metode konvensional karena memiliki banyak kelebihan yaitu sensitivitas tinggi, kecepatan waktu analisis, portabilitas dan efisiensi biaya. Biosensor asam urat berbasis enzim urikase telah banyak dikembangkan. Enzim urikase merupakan katalis oksidasi dari asam urat ketika berikatan dengan oksigen sebagai agen pengoksidasinya. Hasil inilah yang nantinya akan dideteksi oleh biosensor. Enzim urikase banyak ditemukan dari hewan vertebrata, namun enzim tersebut sulit diisolasi sehingga harga enzim urikase murni menjadi mahal, oleh sebab itu penggunaan mikroba yang dapat menghasilkan enzim tersebut digunakan sebagai solusi untuk menekan biaya (Attala et al. 2009). Mikroba penghasil enzim urikase salah satunya adalah Lactobacillus plantarum yang diketahui memiliki aktivitas yang baik terhadap asam urat, mudah diperoleh, memiliki ketahanan hidup yang tinggi, dan tidak sulit penanganannya (Rostini 2007). Pengukuran aktivitas urikase dari protein L. plantarum pada berbagai variasi suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat serta kestabilan telah dilakukan oleh Mardiah (2010) dengan metode spektrofotometri. Aktivitas dan kestabilan protein L. plantarum yang mengandung enzim urikase masih sangat rendah. Kestabilan enzim urikase dari protein L. plantarum hanya bertahan selama dua hari. Rendahnya aktivitas dan kestabilan tersebut dipengaruh oleh tidak adanya imobilisasi enzim. Enzim bebas bersifat tidak stabil untuk itu diperlukan suatu teknik imobilisasi enzim agar enzim mudah dikendalikan. Imobilisasi enzim merupakan suatu proses penahanan suatu enzim dalam suatu pori. Teknik yang digunakan untuk imobilisasi enzim bebas juga beragam antara lain entrapment, cross-linking, adsorpsi, enkapsulasi, ataupun penggabungan antara beberapa teknik tersebut. Teknik yang digunakan tersebut bergantung pada material yang digunakan sebagai media pengimobilisasi (Elnashar et al. 2014). Sedangkan material yang banyak digunakan sebagai media imobilisasi enzim
2
adalah zeolit, selulosa, agar, karaginan, kitosan, polimer sintetik seperti polianilin dan polistirena (Bhatia et al. 2000). Zeolit merupakan salah satu material yang dapat digunakan untuk media imobilisasi enzim. Zeolit memiliki struktur berpori yang dapat berfungsi sebagai adsorben ion maupun molekul. Molekul ataupun ion akan masuk ke dalam pori zeolit. Sifat inilah yang mendasari penggunaan zeolit sebagai media imobilisasi enzim (Xing et al. 2000). Terdapat dua jenis zeolit yaitu zeolit sintetik dan alam. Zeolit sintetik memiliki nilai KTK diatas 100 cmol/kg, namun zeolit ini harganya mahal. Sedangkan, zeolit alam kelimpahannya sangat banyak dan harga relatif murah (Arif 2011). Penelitian mengenai biosensor asam urat berbasis enzim dari sel L. plantarum yang diimobilisasi pada zeolit alam telah dilaporkan oleh Widyatmoko (2012) hasilnya stabilitas mampu bertahan selama 6 hari bila disimpan pada suhu 28ºC dan aktivitas urikase meningkat ketika enzim dari L. plantarum diimobilisasi pada zeolit. Penelitian lain yang memanfaatkan zeolit sebagai media pengimobilisasi telah dilakukan oleh Weniarti (2011) yang menggunakan zeolit sebagai media pengimobilisasi ekstrak enzim superoksida dismutase Deinococcus radiodurans yang digunakan untuk biosensor antioksidan dan penelitian Liyonawati (2013) yang memanfaatkan zeolit alam sebagai media imobilisasi ekstrak Escherichia coli untuk biosensor antioksidan. Zeolit sebagai media pengimobilisasi berinteraksi dengan bahan yang diimobilisasi melalui adsorpsi. Adsorpsi merupakan metode imobilisasi sel yang paling sederhana. Teknik ini didasarkan pada interaksi fisik antara mikroorganisme dengan permukaan material pengimobilisasi (Monsan et al. 1987, Krekeler et al. 1990). Interaksi yang terjadi antara mikroorganisme dengan material pengimobilisasi merupakan ikatan yang lemah seperti gaya van der Walls, ikatan ionik, ikatan hidrogen maupun interaksi hidrofobik sehingga dengan mudah mikroorganisme yang terimobilisasi akan lepas dan secara langsung berdampak pada stabilitas biosensor yang dibuat (Hsu et al. 2004; Gorecka & Jastrzebska 2011). Metode lain yang dapat digunakan untuk imobilisasi mikroorganisme adalah entrapment atau penjeratan. Mikroorganisme akan dijerat di dalam suatu matrik sehingga akan tercipta suatu penghalang di sekitar ruang gerak mikroorganisme. Kombinasi antara metode imobilisasi penjeratan dengan adsoprsi fisik diharapkan mampu meningkatkan stabilitas dari biosensor asam urat yang akan dibuat. Matrik yang digunakan untuk menjerat mikroorganisme merupakan matrik berpori salah satunya adalah karaginan (Lopez et al. 1997; Ramakrishna & Prakasham 1999). Karaginan adalah suatu hidrokoloid yang termasuk dalam senyawa polisakarida yang diekstrak dari alga merah. Terdapat berbagai jenis karaginan antara lain lambda, iota, dan kappa-karaginan. Kappa-karaginan merupakan jenis karaginan yang menghasilkan gel yang kuat. Struktur dari kappa-karaginan adalah D-galaktosa dan gugus 2-sulfat ester yang terdapat pada 3,6-anhidro-D-galaktosa. Kappa-karaginan akan berinteraksi dengan enzim melalui metode penjebakan (entrapment). Kemampuan kappa-karaginan dalam membentuk gel inilah yang dimanfaatkan untuk media imobilisasi. Kekuatan gel yang terbentuk dari kappakaraginan menyebabkan enzim yang terjebak di dalamnya akan sulit untuk lepas. Dengan demikian diharapkan stabilitasnya akan lebih meningkat. Penelitian mengenai kappa-karaginan yang dimanfaatkan sebagai media imobilisasi enzim telah banyak dilakukan antara lain oleh Takata et al (1977)
3
yang melakukan screening terhadap beberapa matrik untuk media imobilisasi mikrobakteri. Hasil penelitian menyebutkan bahwa kappa-karaginan mempunyai kekuatan gel yang lebih tinggi dan aktivitas enzim yang tinggi dibanding polisakarida lain seperti alginat. Penelitian tersebut dilanjutkan oleh Tosa et al (1979) yang melakukan imobilisasi enzim dan mikrobakteri pada matrik kappa-karaginan, hasilnya kappa-karaginan mampu meningkatkan aktivitas enzim sebesar 69% dengan stabilitas mencapai 686 hari. Pada tahun 1991 Moon et al melaporkan bahwa Bacillus firmus dapat diimobilisasi menggunakan kappakaraginan, Buyukgungor (1992) melaporkan bahwa Lactobacillus bulgaris yang diimobilisasi pada gel kappa-karaginan mempunyai stabilitas yang tinggi dibanding dengan Ca-alginat, Cordoves et al (1993) menggunakan karaginan untuk imobilisasi enzim horseradish peroksidase dan kolesterol oksidase yang diaplikasikan untuk biosensor kolesterol. Penelitian lain dilakukan oleh Campanella et al (1999) yang menggunakan kappa-karaginan untuk media imobilisasi enzim superoxidase dismutase yang diaplikasikan pada biosensor antioksidan, hasilnya stabilitas biosensor mampu bertahan selama 30 hari. Elnashar et al (2014) melaporkan imobilisasi β-galaktosidase menggunakan kappa-karaginan mampu meningkatkan aktivitas enzim sebesar 60% dan nilai KM yang dihasilkan 61.6 mM sedangkan enzim tanpa imobilisasi menghasilkan nilai KM sebesar 22.9 mM. Rodriquez et al (2014) telah mencoba memanfaatkan kappa-karaginan yang dikombinasikan dengan dadih untuk mengimobilisasi L. plantarum dengan hasil matriks yang dibentuk antara kappa-karaginan/dadih memiliki ketahanan yang tinggi dan mempunyai viskoelastis yang tinggi sehingga L. plantarum terjerat kuat pada matrik tersebut. Melihat keberhasilan kappa-karaginan sebagai media imobilisasi enzim maupun mikroorganisme, maka penelitian ini akan menggunakan kappa-karaginan yang akan dikombinasi dengan zeolit sebagai media imobilisasi L. plantarum dengan harapan stabilitas dapat meningkat.
Rumusan Masalah Dengan adanya latar belakang yang tersaji di atas dapat diambil suatu rumusan masalah yaitu stabilitas dan aktivitas biosensor asam urat berbasis mikroorganisme L. plantarum yang diimobilisasi dalam media zeolit alam masih relatif rendah jika dibandingkan dengan media pengimobilisasi lain seperti gel kappa karaginan, sehingga diperlukan suatu media pengimobilisasi lain dan teknik imobilisasi yang berbeda yang nantinya dapat dikombinasikan dengan media zeolit. Jadi, permasalahannya adalah apakah imobilisasi L. plantarum pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan stabilitas biosensor asam urat.
4
Tujuan Penelitian 1. 2.
Membuat zeolit-kappa karaginan sebagai media imobilisasi bakteri L. plantarum. Menentukan parameter kinetik urikase sel L. plantarum yang diimobilasi pada membran zeolit/kappa-karaginan, parameter analitik dan stabilitas biosensor asam urat.
Hipotesis Media imobilisasi membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan stabilitas dari L. plantarum.
Manfaat penelitian Memberikan informasi mengenai stabilitas, parameter analitik, dan parameter kinetik L. plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappakaraginan.
2 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan mulai bulan Oktober 2014 – September 2015 bertempat di Laboratorium Kimia Fisik dan Laboratorium Bersama Departemen Kimia FMIPA IPB, Laboratorium Ilmu Tanah Departemen Ilmu Tanah Fakultas Pertanian IPB, serta Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan Puslit Biologi LIPI Cibinong.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah bufer borat, sel L. plantarum Mar 8, NaCl 0,85 % (Himedia, India), grafit, minyak parafin, glukosa (Himedia, India), akuades, CH3COONa (Himedia, India), pepton (Himedia, India), larutan garam, tween 80 (Applichem, Jerman), beef extract (Difco, USA), yeast extract (Himedia, India), HCl 32% (Merck, Jerman), 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4benzokuinon/ Q0 (Sigma, Jerman), DMSO, urikase (Sigma, Jerman), asam urat
5
(Nacalaic tesque, Jepang), Kappa-karaginan, dan zeolit alam Bayah. Alat yang digunakan adalah eDAQ Potensiotat yang dilengkapi Echem v2.1.0 dengan sistem 3 elektroda, oven, tanur, inkubator, autoklaf (Hariyama), sentrifuga (Kokusann H1500F), pH meter, spektrofotometer UV-Vis, pipet mikro, serta alat gelas lainnya.
Lingkup Kerja Penelitian ini dimulai dengan aktivasi zeolit dan pengujian, pembuatan media GYP (Glucose Yeast Pepton) sebagai media penanaman bakteri L. plantarum, penumbuhan dan pemanenan bakteri L. plantarum, pembuatan elektroda pasta karbon, imobilisasi L. plantanum pada membran, pengukuran elektrokimia, optimasi, penentuan stabilitas biosensor, penetuan parameter analitik, dan penentuan kinetika enzim urikase dari bakteri L. plantarum.
Aktivasi Zeolit (Modifikasi Cordoves et al. 2008; Arif 2011) Zeolit bayah berukuran 400 mesh sebanyak 50 g ditambahkan 250 mL HCl dengan konsentrasi masing-masing 0, 0.5, 1, dan 3 M dan diaduk selama 1 jam, didekantasi dan dicuci dengan akuades sampai pH netral. Larutan tersebut diuji kandungan klorin dengan AgNO3 dan dicuci kembali sampai tidak mengandung klorin. Setelah pH netral dan bebas klorin dikeringkan pada suhu 300ºC selama 3 jam. Selanjunya zeolit ditentukan nilai KTK (Kapasitas Tukar Kation).
Prosedur Pengujian Nilai KTK Zeolit (SNI 13-3494-1994) Penentuan pengujian KTK diawali dengan pencucian pasir silika dengan larutan HCl 0,1 N panas, kemudian dicuci dengan air distilasi sampai netral. Kolom penukar ion diisi dengan glass wool pada bagian bawah setinggi 2 cm dan pasir silika pada bagian atas setinggi 0.2 cm. Larutan CH3COONH4 0.1 N diteteskan pada pasir silika dan glass wool sampai ketinggian 1 cm, kemudian serbuk zeolit sebanyak 0.2-0.3 g dimasukkan ke dalam kolom dan dinding kolom dibilas dengan larutan CH3COONH4 sampai ketinggian 5 cm. Kemudian Volume hasil titrasi contoh dan blanko dicatat. Nilai KTK zeolit ditentukan dengan rumus: (𝑉2 − 𝑉1 )𝑥 𝑁 𝐻𝐶𝑙 𝐾𝑇𝐾 (𝑚𝑒𝑘⁄100 𝑔) = 𝑥 100 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑧𝑒𝑜𝑙𝑖𝑡
Dimana: V1 = volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi sampel (mL) = volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi blanko (mL) V2 N HCl = normalitas HCl
6
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon (Ikeda et al. 1998; Huang 2005) Pembuatan pasta karbon diawali dengan pembuatan pasta karbon yang ditambahkan mediator didalamnya. Sebanyak 3 mg Q0 ditambahkan dengan 1 mL DMSO, kemudian ditambahkan grafit sebanyak 100 mg. Campuran tersebut didiamkan selama 2 jam, kemudian dioven selama 2 jam dan ditambahkan parafin sebanyak 50 μL. Pasta karbon yang terbentuk siap digunakan untuk membuat eletroda dengan cara memasukkan pasta karbon ke dalam gelas kaca yang telah diberi kawat tembaga, selanjutnya permukaan elektroda pasta karbon tersebut dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak. Elektroda yang telah siap dikarakterisasi menggunakan larutan KCl 0.1 M dan K3[Fe(CN)6] 0.01 M dalam larutan KCl 0.1 M.
Pembuatan Membran Zeolit/Kappa-Karaginan (Modifikasi Campanella et al. 1999) Zeolit ditimbang sesuai dengan berat kemudian di larutkan dalam 10 mL akuades dengan cara di ultrasonikasi selama 10 menit. Kemudian ditambahkan karaginan sesuai dengan berat yang diperlukan dan diultrasonikasi kembali pada suhu 50°C-60°C selama 5 menit. Campuran yang berbentuk koloid tersebut kemudian dicetak di atas cetakan dengan diameter 10 cm. Kemudian membran di diamkan selama 5 jam, selanjutnya membran dipotong ukuran 3 mm. Membran kemudian didiamkan kembali pada suhu 4 °C.
Pembuatan Media GYP (Glucose Yeast Pepton) (Triana et al 2006) Media GYP padat dibuat dengan mencampurkan 10 g glukosa, 10 g yeast extract, 2 g beef extract, 5 g pepton, 1.4 g CH3COONa, 5 mL larutan garam (0.1 g MgSO4.7H2O, 0.1 g MnSO4.4H2O, 0.1 g FeSO4.7H2O, 0.1 g NaCl, 50 mL akuades), 10 mL Tween 80, 20 g agar, dan 3.75 g CaCO3 dalam 1 liter akuades. Selanjutnya, media dipanaskan dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada 121ºC. Media dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah dingin digunakan untuk menumbuhkan sel bakteri. Sedangkan media GYP cair dibuat sama dengan cara di atas tetapi tanpa penambahan agar dan CaCO3.
Penumbuhan dan Pemanenan sel L. plantanum Inokulum digoreskan pada permukaan media GYP padat dalam cawan petri dengan jarum inokulasi. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari. Bakteri yang tumbuh ditanam pada 20 mL media GYP cair sebagai starter dan
7
diinkubasi semalam hingga mencapai nilai OD600=1. Sebanyak 500 μL starter diinokulasi kedalam 10 mL media GYP dan diinkubasi selama 3 jam. Sel bakteri tersebut dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan akuades dan ditambahkan buffer borat pH 8.
Imobilisasi L. Plantanum Pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan (Modifikasi Campanella et al. 1999) Membran direndam dalam 20 μL Lactobacillus plantarum yang diresuspensi dengan buffer borat pH 8 selama 3 jam. Membran yang telah direndam kemudian diletakkan pada permukaan elektroda, dilapisi dengan dengan membran dialisis, dan diikat dengan O-Ring rubber. Apabila elektroda tidak digunakan, elektroda direndam pada bufer borat pH 8 dan disimpan pada suhu 4°C.
Pengukuran Elektrokimia Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik menggunakan eDAQ potensiostat (Ecorder 410) yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0. Elektrode yang digunakan adalah elektrode Ag/AgCl, platina, dan pasta karbon yang berturut-turut sebagai elektrode pembanding, elektrode pembantu, dan elektrode kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut: Mode : Cyclic Initial : 0 mV Final : 0 mV Rate : 200 mV/s Step W : 20 ms Upper E : 1000 mV Lower : 0 mV Range :2V Larutan bufer borat dengan pH 8 sebanyak 2 mL ditambahkan ke dalam sel pengukuran, lalu puncak arus yang terbentuk diamati sebagai puncak blanko. Setelah itu, ditambahkan 2 mL asam urat dan diukur kembali perubahan puncak arus anoda yang terjadi.
Optimasi Aktivitas Sel L. Plantarum yang Diimobilisasi pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan Optimasi dilakukan untuk aktivitas urikase dari sel L.plantarum adalah variasi berat zeolit (10-50 mg), konsentrasi asam urat (0.1-3.0 mM), dan
8
konsentrasi kappa-karaginan (1-3 %, w/v). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman aktivitas urikase adalah Respon Surface Method. Metode ini mengkombinasikan variabel bebas yang nantinya kombinasi tersebut digunakan untuk mendapatkan nilai aktivitas yang optimum. Kombinasi variabel bebas untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Kombinasi berat zeolit, konsentrasi karaginan, dan konsentrasi asam urat untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum No
Berat zeolit (mg)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
30 30 50 10 10 50 10 50 30 50 30 30 30 30 10 30 30 30 10 50
Konsentrasi kappakaraginan (%) 2 2 3 1 1 2 3 3 2 1 2 3 2 2 2 1 2 2 3 1
Konsentrasi asam urat (mM) 1.55 3.00 0.10 0.10 3.00 1.55 3.00 3.00 1.55 0.10 1.55 1.55 1.55 0.10 1.55 1.55 1.55 1.55 0.10 3.00
Penentuan Parameter Kinetika Penentuan parameter kinetik enzim urikase yang berasal dari sel Lactobacillus plantarum yang diimobilisasi ditentukan dengan menggunakan persamaan Michealis-Menten, yaitu : 𝑎𝑝𝑝 𝐼𝑚 [𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑢𝑟𝑎𝑡] 𝐼= 𝐾𝑀 + [𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑢𝑟𝑎𝑡] 𝑎𝑝𝑝 dengan 𝐼𝑚 adalah respon arus maksimal yang terukur (apperent), 𝐾𝑀 adalah konstanta Michaelis-Menten dan [Asam urat] adalah konsentrasi asam urat. Persamaan yang diperoleh selanjutnya dibuat turunannya berupa plot LineweaverBurk.
9
Penentuan Parameter Analitik (Harmita 2004) Penentuan parameter yang dilakukan pada percobaan ini antara lain linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas. Liniearitas ditentukan dengan melihat nilai koefisien korelasi. Limit deteksi dan limit kuantitas ditentukan dengan rumus: 𝑘. 𝑠𝑏 𝑄= 𝑏 Keterangan: Q : LOD (Limit deteksi) atau LOQ (Limit Kuantitas) Sb : simpangan baku k : 3 (LOD), k=10 (LOQ) b : kemiringan atau slope.
Penentuan Stabilitas Biosensor Asam Urat Stabilitas diuji dengan melihat aktivitas relatifnya sampai terjadi penurunan stabilitas. Persen aktivitas urikase diukur dengan rumus: 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 =
𝐼 𝑠𝑎𝑎𝑡 ℎ𝑎𝑟𝑖 𝑘𝑒 − (𝜇𝐴) 𝑥 100% 𝐼 𝑠𝑎𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 (𝜇𝐴)
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivasi Zeolit Sampel yang diambil adalah zeolit alam dihaluskan hingga mencapai ukuran 400 mesh. Menurut Wennerstrum et al (2002), pengubahan ukuran sampel dimaksudkan untuk meningkatkan luas permukaan bidang kontak, menghasilkan ukuran partikel yang sesuai untuk kegunaannya. Serbuk zeolit kemudian di aktivasi menggunakan metode kimia dengan penambahan HCl dengan konsentrasi bervariasi antara 0.5 M, 1M, dan 3 M. Zeolit teraktivasi kemudian dilakukan pengujian nilai KTK. Hasil uji nilai KTK dari beberapa sampel zeolit disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah No 1 2 3 4
Konsentrasi HCl (M) 0 0.5 1 3
Nilai KTK (me/100g) 82.05 81.45 76.20 68.14
10
Pada penelitian ini digunakan zeolit dengan aktivasi HCl 0.5 M, hal ini dikarenakan zeolit tersebut memiliki nilai KTK tinggi meskipun nilai tersebut lebih rendah dibandingkan dengan nilai KTK zeolit tanpa aktivasi. Hal ini dikarenakan, perlakuan asam akan menurunkan nilai KTK namun disisi lain logam pengotor pada permukaan zeolit hilang sehingga kemurnian zeolit menjadi lebih tinggi. Zeolit yang teraktivasi dengan zeolit 0.5 M dipilih dibanding dengan zeolit teraktivasi lain karena nilai KTK yang lebih tinggi sehingga lebih bersifat hidrofilik dan daya adsorpsi lebih kuat sehingga cocok digunakan untuk media pengimobilisasi sel L.plantarum (Ozkan & Ulku, 2005). Berdasarkan puncak arus yang dihasilkan, zeolit yang diaktivasi menggunakan HCl 0.5 M menunjukkan arus yang lebih tinggi dibanding dengan aktivasi menggunakan HCl dengan konsentrasi lain. Arus yang lebih tinggi menunjukkan bahwa aktivitas dari sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan tinggi. Tabel 3 dan Gambar 1 menunjukkan puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai macam konsentrasi HCl yang digunakan untuk aktivasi zeolit. Tabel 3
Puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai konsentrasi HCl
No 1 2 3 4
Konsentrasi HCl (M) 0 0.5 1 3
I (mA) 0.0036 0.0126 0.0035 0.0061
HCl 0 M HCl 0,5 M HCl 1 M HCl 3 M
0,00004 0,00003
I (mA)
0,00002 0,00001 0,00000 -0,00001 -0,00002 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
Gambar 1 Voltamogram aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran dengan variasi konsentrasi HCl
11
Pembuatan dan Pencirian Elektroda Pasta Karbon Elektroda pasta karbon difabrikasi dari serbuk grafit, Q0 (2,3-dimetoksi-5metil-1,4-benzoquinon) sebagai mediator dan parafin sebagai agen pengikat dengan perbandingan antara grafit dan parafin adalah 2:1 (w/v). Q0 digunakan sebagai mediator dikarenakan respon arus oksidasi yang dihasilkan Q0 paling tinggi diantara mediator lain (Widyatmoko 2012). Mediator berperan dalam proses transfer elektron dari bioreseptor ke transduser sehingga arus yang dihasilkan menjadi lebih baik (Trivadila 2011). Hasil pengukuran respon arus oksidasi pada beberapa mediator ditunjukkan oleh Tabel 4. Elektroda pasta karbon kemudian dikarakterisasi menggunakan larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M dalam larutan KCl 0.1 M. Pengukuran dilakukan menggunakan metode voltametri siklik dengan rentang potensial 0-1000 mV sebanyak 5 siklik. Hasil karakterisasi ditunjukkan pada Gambar 2. Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6], 2,3-dimetoksi-5-metil1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena Mediator Q0 Ferosena K3[Fe(SCN)6] (Widyatmoko 2012)
Ipa (μA) 28,9267 5,3767 3,5700
I (mA)
KCl 0,1 M K3[Fe(CN)6] 0,01 M 1,0x10
-5
5,0x10
-6
0,0
-5,0x10
-6
-1,0x10
-5
-1,5x10
-5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
Gambar 2 Voltamogram karakterisasi elektroda pasta karbon menggunakan larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M
12
Voltamogram larutan blangko KCl 0.1 M tidak menunjukkan adanya puncak sedangkan voltamogram larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M menunjukkan adanya puncak arus anodik dan pada tegangan sekitar 0.500 V dan puncak arus katodik pada tegangan sekitar 0.300 V. Puncak arus anodik dan katodik mengindikasikan bahwa elektroda tersebut mampu mengalirkan elektron dengan baik sehingga reaksi redoks dapat berlangsung. Munculnya puncak anodik dan katodik terjadi karena di dalam sel elektrokimia terjadi reaksi redoks yang bersifat reversibel pada keadaan setimbang. Reaksi yang terjadi pada saat karakterisasi adalah: Reaksi reduksi
: [Fe(CN)6 ]3- + e →[Fe(CN)6 ]4-
Reaksi oksidasi
: [Fe(CN)6 ]4- →[Fe(CN)6 ]3- + e
Penumbuhan dan Pemanenan Sel L. plantanum Sel bakteri yang digunakan merupakan sel L.plantarum Mar 8 yang merupakan bakteri yang menghasilkan enzim urikase dengan aktivitas yang lebih besar dari bakteri penghasil enzim urikase lain seperti Bacillus. Penelitian mengenai bakteri penghasil enzim urikase telah dilakukan oleh Mardiah (2010) yang meneliti aktivitas urikase yang dihasilkan dari sel L.plantarum sedangkan Nurjayati (2010) meneliti aktivitas urikase dari sel Bacillus. Hasilnya sel L.plantarum memiliki aktivitas sebesar 0,0842-0,1073 U/mL sedangkan sel Bacillus memiliki aktivitas sebesar 0,0322-0,0570 U/mL sehingga untuk penelitian ini digunakan sel L.plantarum sebagai penghasil enzim urikase.
Imobilisasi Sel L.plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan dan Pengujian Aktivitas Suatu sel atau mikroorganisme lain umumnya memilki sifat yang kurang stabil sehingga dibutuhkan suatu media yang berfungsi untuk menjaga agar sel tetap terjaga ketika diaplikasikan sebagai bioreseptor pada biosensor. Proses imobilisasi dapat dilakukan dengan berbagai teknik salah satunya adsorbsi menggunakan zeolit. Zeolit yang digunakan adalah zeolit jenis klinoptilolit yang memiliki luas permukaan 6.35 m2 dan jari-jari 16.23 Å (Ginting et al. 2007). Jarijari pori yang sangat kecil tersebut menyebabkan sel L.plantarum tidak mampu masuk ke dalam pori, namun hanya teradsopsi pada permukaan zeolit. Cara lain yang dapat ditempuh agar sel L.plantarum mampu teradsorpsi adalah dengan proses aktivasi dan memperluas permukaan bidang sentuh dengan cara memperkecil ukuran zeolit. penambahan kappa-karaginan dalam membran juga diharapkan mampu menjadi media penjerat sel sehingga sel mampu bertahan lebih lama.
13
Mekanisme pendeteksian biosensor asam urat menggunakan sel L. plantarum yang telah diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan ditunjukkan pada Gambar 3. Puncak arus yang keluar pada voltamogram terjadi karena adanya reaksi antara bioreseptor dengan substrat. Mula-mula sel L. plantarum yang telah diimobilisasi pada membran zeolit/kapppa-karaginan akan mensekresikan enzim urikase. Apabila ke dalam sel pengukuran ditambahkan dengan substrat dalam penelitian ini asam urat maka akan terjadi reaksi pemecahan cincin purin pada struktur asam urat sehingga akan diperoleh produk allantoin dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida tersebut yang akan mengalami reaksi redoks sehingga terjadi transfer elektron. Proses percepatan transfer elektron dibantu oleh mediator Q0. Sinyal yang keluar dari hasil reaksi tersebut selanjutnya diubah oleh transduser menjadi sinyal yang bisa dibaca, dalam penelitian ini sinyal tersebut diubaah menjadi kuat arus yang terbaca pada puncak katoda maupun anoda. Berikut reaksi yang terjadi: OH N HO
O
H N
urikase
NH
O
OH + O2 + H2O N
N
O H2N
asam urat
N H
+ CO2 + H2O2
N H
alantoin +
H2O2 ↔ O2 + 2H + 2e Voltamogram aktivitas sel yang telah terjerat pada membran zeolit-kappa karaginan dapat dilihat pada Gambar 4. Keberhasilan imobilisasi sel pada membran tersebut dapat dilihat adanya puncak oksidasi yang dihasilkan akibat adanyan reaksi antara sel dengan asam urat sebagai analitnya pada tegangan 0,40,7 volt (Widyatmoko 2012).
Sel + zeolit/kppa-karaginan
Gambar 3 Mekanisme pendeteksian biosensor asam urat
14
I (mA)
Buffer borat pH 8 Buffer borat + asam urat 3 mM 1,4x10
-5
1,2x10
-5
1,0x10
-5
8,0x10
-6
6,0x10
-6
4,0x10
-6
2,0x10
-6
0,0 -2,0x10
-6
-4,0x10
-6
-6,0x10
-6
-8,0x10
-6
-1,0x10
-5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
Gambar 4 Voltamogram sel L.plantarum yang terimobilisasi Proses penjeratan dilakukan melalui proses penyerapan larutan sel L.plantarum oleh membran. Membran akan mengembang ketika ditetesi sel, hal ini dikarenakan adanya pori dan ketiadaan air pada membran. Membran yang mengembang mengindikasikan bahwa sel telah terjerat di dalamnya (Campanella et al. 1999). Kekuatan gel dari karaginan menentukan proses imobilisasi sel. Gel yang kuat mampu mempersempit pori-pori sehingga sel yang telah terjerat tidak akan mudah lepas. Hal ini diharapkan mampu meningkatkan aktivitas dari sel tersebut (Tosa et al. 1979). Pada penelitian ini, imobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan menghasilkan arus puncak sebesar 0.0148 mA. Hasil ini tiga kali lebih tinggi dari puncak arus yang dihasilkan oleh penelitian sebelumnya yang hanya menggunakan zeolit sebagai media imobilisasi sel L.plantarum yang berkisar antara 0.0042 mA (Widyatmoko 2012) dan 0.0051 mA (Kamal 2013) sehingga dapat dikatakan bahwa imobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan arus puncak yang dihasilkan.
Optimasi L. plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan Metode yang digunakan untuk optimasi adalah Respon Surface Method. Variabel yang diuji pengaruhnya antara lain berat zeolit, konsentrasi kappakaraginan (w/v), dan konsentrasi asam urat terhadap arus. Hasil optimasi menunjukkan konsentrasi asam urat berpengaruh secara signifikan terhadap arus yang dihasilkan, hal ini dilihat dari nilai P < 0.05. Hasil analisis pengaruh variabel terhadap arus dapat dilihat pada Tabel 5. Kontur antara berbagai variabel dengan arus ditunjukkan pada Gambar 5.
15
Tabel 5 Hasil analisa pengaruh variabel terhadap arus Faktor Konstanta Berat zeolit Konsentrasi karaginan Konsentrasi asam urat R-sq = 92.81 %
Koefisien 5.45 x 10-3 1.39 x 10-3 -0.36 x 10-3 2.19 x 10-3 R-sq (adj) = 82.02 %
3,0
2,0
Hold Values berat zeolit 50
1,5
1,0
0,5
1,0
Arus (mA) < 0,002 – 0,004 – 0,006 – 0,008 – 0,010 – 0,012 – 0,014 > 0,014
0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012
2,5 konsentrasi asam urat
konsentrasi asam urat
3,0
Arus (mA) < 0,004 0,004 – 0,006 0,006 – 0,008 0,008 – 0,010 0,010 – 0,012 0,012 – 0,014 > 0,014
2,5
P 0.000 0.064 0.582 0.008
2,0
Hold Values konsentrasi karaginan 2
1,5
1,0
0,5
1,5 2,0 2,5 konsentrasi karaginan
3,0
10
20
30 berat zeolit
40
(b)
(a)
3,0
konsentrasi karaginan
50
Arus (mA) < 0,002 – 0,004 – 0,006 – 0,008 – 0,010 – 0,012 – 0,014 > 0,014
0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012
2,5
Hold Values konsentrasi asam urat
2,0
3
1,5
(c) 1,0 10
20
30 berat zeolit
40
50
Gambar 5 Kontur (a) pengaruh konsentrasi kappa-karaginan dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (b) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (c) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi kappa-karaginan terhadap arus Warna pada kontur menunjukkan besarnya arus pengukuran. Kontur dengan warna hijau tua menunjukkan bahwa arus yang terukur merupakan arus maksimum. Gambar 5 menunjukkan bahwa sel L.plantarum memberikan respon arus optimum ketika diimobilisasi pada membran dengan komposisi zeolit 50 mg (Gambar 5b dan 5c) serta konsentrasi kappa karaginan 2% (Gambar 5a). Sedangkan konsentrasi asam urat optimum pada konsentrasi 3 mM (Gambar 5a dan 5b). Dengan menggunakan Response Optimizer pada software minitab diperoleh hasil bahwa kondisi optimum aktivitas sel L.plantarum pada konsentrasi
16
karaginan 2%, berat zeolit 50 mg, dan konsentrasi asam urat 3 mM. Pada proses optimasi digunakan pH 8 dan suhu 32.5°C ± 2.5 °C.
Analisis Parameter Kinetika Enzim Urikase dari Sel L.plantarum Pengukuran kinetika enzim urikase dilakukan untuk melihat kespesifikan suatu enzim. Pengukuran kinetika enzim yang dilakukan adalah pengukuran konstanta Michaelis-Menten nyata (KM) dan kecepatan reaksi nyata (Vmax) yang dianalogikan dengan arus maksimum nyata (Imaks) pada pengukuran ini. Metode yang digunakan adalah Lineweaver-Burk. Besarnya nilai KM dan Vmax dalam hal ini dianalogikan dengan Imax. Grafik hubungan antara 1/[asam urat] dengan 1/Ipa ditunjukkan pada Gambar 6. Besarnya nilai KM dan Vmax berturut-turut adalah 2.86 mM dan 1.8 µA. Besarnya nilai KM dan Vmax urikase dari sel L.plantarum yang digunakan berbeda dengan hasil yang diperoleh dari pengukuran parameter kinetik urikase murni yang bersumber dari Candida utilitis. Pada penelitian sebelumnya nilai KM dan Vmax yang diperoleh sebesar 3.1397 x 10-3 mM dan 7.4936 µA (Iswantini et al. 2013). Nilai KM mengindikasikan kuat lemahnya suatu enzim dalam mengikat substrat. Semakin besar nilai KM semakin lemah enzim mengikat substrat dan sebaliknya. Pada penelitian ini, nilai KM yang diperoleh besar yang artinya enzim kurang terikat kuat pada substrat. Hal ini dikarenakan bebrapa faktor antara lain perbedaan sumber enzim urikase yang digunakan. Enzim urikase yang digunakan pada penelitian ini merupakan urikase yang dihasilkan oleh sel L.plantarum tanpa pemurnian, sedangkan enzim yang digunakan pada penelitian sebelumnya adalah enzim urikase murni yang diisolasi dari Candida utilitis. Selain itu, tidak dilakukannya optimasi jumlah enzim urikase yang dihasilkan oleh sel L.plantarum pada penelitian ini juga dimungkinkan berpengaruh terhadap jumlah enzim yang dihasilkan oleh sel, semakin sedikit jumlah urikase yang dihasilkan akan mempengaruhi kuat lemahnya ikatan dengan substrat. 300,00
1/I (mA-1)
250,00 200,00 y = 157,22x + 54,782 R² = 0,9603
150,00 100,00 50,00 0,00 0,30
0,50
0,70
0,90
1,10
1,30
1/[S] (mM-1)
Gambar 6 Grafik hubungan 1/[S] dengan 1/I
1,50
17
Pengukuran Parameter Analitik Biosensor Asam Urat Parameter analitik yang diukur dari biosensor asam urat meliputi linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas. Rentang linearitas biosensor asam urat pada penelitian ini sebesar 2-2.6 mM dengan linearitas 99.59%. Grafik yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 7. Sedangkan, limit deteksi dan limit kuantitas berturut-turut 0.478 mM dan 1.598 mM. Limit deteksi menunjukkan konsentrasi jumlah terkecil analit yang dapat dideteksi dan memberikan respon secara signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita 2004). Pada penelitian ini limit deteksi yang diperoleh lebih baik dari penelitian sebelumnya yang dilakukan Hamzah et al (2013) yang memperoleh nilai limit deteksi sebesar 0,58 mM untuk biosensor asam urat dengan enzim urikase murni. Sedangkan limit kuantitas menunjukan jumlah terkecil analit yang masih memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita 2004). Dalam penelitian ini, limit kuantitas yang diperoleh sebesar 1.598 mM artinya pada pengukuran asam urat sebesar 1.598 mM memberikan respon yang cermat dan seksama. Sensitivitas biosensor asam urat dari besarnya persamaan regresi adalah 0.8 μA mM-1 artinya setiap perubahan konsentrasi substrat 1 mM biosensor asam urat mampu memberikan perubahan respon arus sebesar 0.8 μA. Hasil ini masih jauh lebih rendah dibanding dengan hasil Kamal (2013) yang memperoleh nilai sensitivitas 3,47 μA mM-1. Masih rendahnya nilai sensitivitas yang diperoleh pada penelitian ini dikarenakan teknik entrapment yang digunakan pada penelitian ini memiliki kekurangan yaitu adanya hambatan difusi pada membran sehingga hal ini mempengaruhi respon sensor terhadap substrat yang diukur. Untuk memperkecil hambatan difusi sehbaiknya membran dibuat dalam bentuk thick layer. y = 0,0008x - 0,0015 R² = 0,9959
8,E-04 7,E-04
ΔI (mA)
6,E-04 5,E-04 4,E-04 3,E-04 2,E-04 2
2,1
2,2
2,3
2,4 2,5 2,6 [asam urat] (mM)
2,7
Gambar 7 Linearitas biosensor asam urat
2,8
2,9
3
18
Stabilitas Biosensor Asam Urat Pengukuran stabilitas dilakukan dengan cara membandingkan arus pada setiap waktu dengan arus awal pengukuran. Hasil pengukuran stabilitas biosensor ditampilkan pada Gambar 8. Gambar 8 menunjukkan bahwa sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mempunyai stabilitas yang jauh lebih lama jika dibandingkan dengan tanpa proses imobilisasi. Sel yang diimobilisasi mampu bertahan hingga 23 hari dengan sisa aktivitas sebesar 80.43 %, sedangkan sel yang tidak diimobilisasi hanya mampu bertahan selama 7 hari dengan sisa aktivitas sebesar 54.17 %. Pada penelitian sebelumnya stabilitas biosensor asam urat mampu bertahan selama 22 hari dengan sisa aktivitas sebesar 45.26% (Widyatmoko 2012) dan 77.28% (Kamal 2013). Mulyasuryani dan Srihardiastutie (2011) melaporkan bahwa stabilitas biosensor asam urat menggunakan enzim urikase murni yang diimobilisasi pada membran nata de coco hanya bertahan selama 3 hari. Ali et al (2011) melaporkan bahwa biosensor asam urat yang menggunakan enzim urikase murni sebagai bioreseptor hanya bertahan selama 3 minggu dengan aktivitas sebesar 80%. Hal ini menunjukkan bahwa biosensor asam urat menggunakan sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan stabilitas biosensor asam urat dibandingkan dengan penelitian sebelumnya.
110
Aktivitas relatif (%)
100
sel tidak terimobilisasi
90
sel terimobilisasi
80 70 60 50 40 0
1
2
3
5
6 7 8 9 Waktu (Hari ke-)
12
14
16
Gambar 8 Stabilitas biosensor asam urat
23
19
Tabel 6 Perkembangan Biosensor Asam Urat Stabilitas Sisa aktivitas Rentang Linieritas Linearitas LOD LOQ %RSD Sensitivitas Pengimobilisasi
Widyatmoko 2012 22 hari 45.26% zeolit
Kamal 2013 22 hari 77.28% 0.4-4 mM 97% 3.47 μA mM-1 zeolit
Penelitian ini >23 hari 80.43% 2-2.6 mM 99% 0.478 mM 1.598 mM 3.44 % 0.80 μA mM-1 zeolit/κ-karaginan
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Imobilisasi urikase dari sel L.plantarum pada membran zeolit/kappakaraginan terbukti mampu meningkatkan aktivitas dan stabilitas dari biosensor asam urat. Pada penelitian ini nilai konstanta Michaeles-Menten (KM) dan Vmax pada penelitian ini berturut-turut 2.86 mM dan 0.0018 mA. Linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas berturut-turut 0.9959, 0.478 dan 1.598 mM. Stabilitas biosensor mampu bertahan selama 23 hari dengan sisa aktivitas sekitar 80%.
Saran Imobilisasi urikase dari sel L.plantarum pada membran zeolit/kappakaraginan dapat diaplikasikan sebagai bioreseptor dalam biosensor asam urat. Namun, untuk meningkatkan rentang analisis substrat perlu dilakukan optimasi konsentrasi bakteri yang digunakan. Penambhan nutrisi bakteri juga dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk meningkatkan masa hidup dari bakteri. Selain itu, perlu adanya peningkatan rentang liniaeritas dan sensitivitas dari biosensor tersebut.
20
DAFTAR PUSTAKA Ali SMU, Alvi NH, Ibupoto Z, Nur O, Willander M, Danielsson, B. 2011. Selective potentiometric determination of uric acid with uricase immobilized on ZnO nanowires. Sensors and Actuators B. 152: 241-247. doi:10.1016/j.snb.2010.12.015. Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen [Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Attala MM et al. 2009. Optimum conditions uricase enzyme production by Gliomastix gueg. J Microbiol. 5:45-50. Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chem Mater. 12: 2434-2441. doi: 10.1021/cm000260f CCC. Buyukgungor H. 1992. Stability of Lactobacillus bulgaricus Immobilized in rccarrageenan bels. J Chem Tech Biotechnol.53: 173-175. Campanella L, Favero G, Tomasetti M. 1999. Superoxide Dismutase biosensors for superoxide radical analysis. Analytical Letters. 32 (13): 2559-2581. doi: 10.1080/00032719908542988. Cordoves AIP, Valdes MG, Fernandes JCT, Luis GP, Garcia-Calzon JA, Garcia Crumbliss AL, Stonehuerner JG, Henkens RW. 1993. A carrageenan hydrogel stabilized colloidal gold multi-enzyme biosensor electrode utilizing immobilized horseradish peroxidase and cholesterol oxidaselcholesterol esterase to detect cholesterol in serum and whole blood. Biosensor&Bioelectronics. 331-337. Elnashar MM, Awad GE, Hassan ME, Eldin MSM, Haroun BM, El-Dinawy A. 2014. Optimal immobilization of 𝛽-galactosidase onto 𝜅-carrageenan gel beads using response surface methodology and its applications. The Scientific World Journal. 2014: 7. doi: 10.1155/2014/571682. Ginting AB, Anggraini D, Indaryati S, Kriswa R. 2007. Karakterisasi komposisi kimia, luas permukaan pori dan sifat termal dari zeolit Bayah, Tasikmalaya, dan Lampung. J Tek Bhn Nukl. 3(1): 1-48. Gorecka E, Jastrzębska M . 2011. Immobilization techniques and biopolymer carriers. Biotechnol. Food Sci. 75: 65-86 Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. I (3): 117 – 135. Hsu CH, Chu YF, Argin-Soysal S, Hahm TS, Lo YM. 2004. Effect of surface characteristics and xanthan polymers on the immobilization of Xanthomonas campestris to fibrous matrices. J. Food Sci. 69: 441-448. doi: 10.1111/j.1365-2621.2004.tb09928.x. Huang W. 2005. Voltammetric Determination of Bisphenol A Using a CarbonPaste Electrode Based on the Enhancement Effect of Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB). Bull. Korean Chem. Soc. 26(10): 1560-1564. Ikeda T, Hiroshige Matsubara, Kan Kato, Dyah Iswantini, Kenji Kano, Mamoru Yamada. 1998. Electrochemical monitoring of in vivo reconstitution of glucose dehydrogenase in Escherichia coli cells with externally added pyrroloquinoline quinone. J Electroanal Chem 449: 219 - 224
21
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila, Widiyatmoko O. 2013. Activity and stability of uricase from Lactobacillus plantarum immobilizated on natural zeolite for uric acid biosensor. Pakistan Journal of Biological Science. 17(2): 277-281. doi: 10.3923/pjbs.2013. Kamal F. 2014. penentuan kestabilan dan linearitas pada biosensor asam urat menggunakan urikase Lactobacillus plantarum termodifikasi zeolit secara elektrokimia. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Liyonawati. 2013. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari ekstrak Escherichia coli diimobilisasi pada zeolit alam sebagai biosensor antioksidan. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lopez A, Lazaro N, Marques AM. 1997. The interphase technique: a simple method of cell immobilization in gel-beads. J. Microbiol. Methods. 30:231-234. Luo YC, Do JS, Liu CC. 2006. An amperometric uric acid biosensor based on modified Ir–C electrode. Biosens Bioelectron. 22(4): 482-488. doi: 10.1016/j.bios.2006.07.013. Mardiah DE. 2010. Aktivitas urikase yang dihasilkan dari berbagai sel Lactobaciilus plantarum dan parameter kinetiknya [skripsi]. Bogor (ID) : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Mateo C, Palomo JM, Lorente GF, Guisan JM. 2007. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology. 40: 1451–1463.doi:10.1016/j.enzmictec.2007.01.018. Monsan P, Durand G, Navarro JM. 1987. Immobilization of microbial cells by adsorption to solid supports. Methods Enzymol. 135: 307-318. Moon SH, Parulekar SJ. 1991. Characterization of kappa-carrageenan gels used for immobilization of Bacillus firmus. Biotechnol. Prog. 7: 516-525. Mulyasuryani A, Srihardiastutie A. 2011. Conductimetric biosensor for the detection of uric acid by immobilization uricase on nata de coco membrane-Pt electrode. Analytical Chemistry Insights, 6:47-51. doi: 10.4137/ACI.S7346 Nurjayati A. 2010. Penentuan kinetika urikase dari sel Bacillus subtilis, B. megaterium, dan B. cereus. [Skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ozkan FC, Ulku S. 2005. The effect of HCl treatment on water vapor adsorption characteristics of clinoptilolite rich natural zeolite. Microporous and Mesoporous Materials. 77: 47-53. Ramakrishna SV, Prakasha RS. 1999. Microbial fermentations with immobilized cells. Curr Sci. 77:87-100. Rodriguez LH, Calleros CL, Gonzales DJP, Carter EJV. 2014. Lactobacillus plantarum protection by entrapment in whey protein isolate: κ-carrageenan complex coacervates. Food Hydrocolloids. 36: 181-188. Rostini I. 2007. Peranan bakteri asam laktat (Lactobacillus plantarum) terhadap masa simpan filet nila merah pada suhu rendah [tesis]. Jatinangor (ID) : Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjajaran. Takata I, Tosa T, Chibata I. 1977. Screening of matrix suitable for immobilization of microbial cells. Journal of Solid-Phase Biochemistry. 2(3): 225-236.
22
Tosa T, Sato T, Mori T, Yamamoto K, Tanaka I, Nishida Y, Chibata I. 1979. Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenan as matrix. Biotech and Bioenginerring. 21: 1697-1709. Triana E, Yulianto E, Nurhidayat N. 2006. Uji Viabilitas Lactobacillus sp. Mar 8 Terenkapsulasi. Biodiversitas. 7(2): 114-117. Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase Deinococus radiodurans diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam Indonesia. [tesis]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wennerstrum S, Kendrick T, Tomaka J, Cain J. 2002. Size reduction solutions for hard-to-reduce materials. Powderand Bulk Enggineering (1): 1-5. Widyatmoko O. 2012. Aktivitas dan stabilitas urikase Lactobacillus plantarum yang diimobilisasikan pada zeolit alam untuk biosensor asam urat. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Xing GW, Li XW, Tian GL, Ye YH. 2000. Enzymatic peptide synthesis in organic solvent with different zeolites as immobilization matrixes. Tetrahedron. 56: 3517-3522.
23
Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian
24
Lampiran 2 Hasil kombinasi Response Surface Methods berat zeolit (mg) 30 50 10 10 50 10 30 50 30 30 30 30 30 30 10 50
konsentrasi karaginan % (w/v) 2 3 1 1 2 3 2 1 2 3 2 2 2 2 3 1
konsentrasi asam urat (mM) 3 0,1 0,1 3 1,55 3 1,55 0,1 1,55 1,55 1,55 0,1 1,55 1,55 0,1 3
Arus (mA)
Lampiran 3 Stabilitas Biosensor Asam Urat Hari 0 1 2 3 5 6 7 8 9 12 14 16 23
Dengan Imobilisasi Arus Stabilitas (mA) (%) 0,0138 100 0,0138 100 0,0137 99,28 0,0137 99,28 0,0132 95,65 0,0137 99,28 0,0137 99,28 0,0137 99,28 0,0144 95,65 0,0145 94,93 0,0147 93,48 0,0148 92,75 0,0111 80,43
Tanpa Imobilisasi Arus Stabilitas (mA) (%) 0,00419 100,00 0,00423 98,92 0,00411 98,22 0,00411 98,21 0,00409 97,70 0,00611 54,12
0,0061 0,0022 0,0029 0,0048 0,013 0,0063 0,0041 0,0059 0,0049 0,0021 0,0082 0,0011 0,0055 0,0041 0,0052 0,0126
25
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 30 Januari 1990 dari Bapak Subardi dan Ibu Slamet Lestari. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Sebelas Maret Surakarta, lulus pada tahun 2013. Pada tahun 2013 penulis diterima di Program Studi Kimia pada Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN) DIKTI. Selama mengikuti program S-2, penulis menjadi anggota Ikatan Mahasiswa Pascasarjana (IMAPASKA) Kimia IPB.
