IMOBILISASI URIKASE DARI Lactobacillus plantarum PADA KARBOKSIMETILSELULOSE-GELATIN-ZEOLIT UNTUK MENINGKATKAN STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
NOVITA ROSE DIANA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Imobilisasi Urikase dari Lactobacillus plantarum pada Karboksimetilselulose-Gelatin-Zeolit untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Maret 2016 Novita Rose Diana NIM G451130201
4
RINGKASAN NOVITA ROSE DIANA. Imobilisasi Urikase dari Lactobacillus plantarum pada Karboksimetilselulose-Gelatin-Zeolit untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat. Dibimbing oleh KOMAR SUTRIAH, DYAH ISWANTINI dan NOVIK NURHIDAYAT. Konsentrasi asam urat yang tinggi dalam darah mengindikasikan adanya penyakit. Ada banyak metode yang umum digunakan untuk mengukur kadar asam urat dalam darah, salah satunya adalah biosensor. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan stabilitas biosensor asam urat dengan cara mengimobilisasi bakteri Lactobacillus plantarum (bioreseptor) pada matriks yang dibuat dari karboksimetilselulosa-gelatin-zeolit. Biosensor asam urat digunakan sebagai alat deteksi awal pasien yang menderita berbagai macam penyakit yang disebabkan oleh tingginya kadar asam urat dalam darah seperti gout, penyakit kardiovaskular, hipertensi, dan lain-lain. Penggunaan sensor ini dalam jangka panjang akan mengurangi performa stabilitasnya, sehingga diperlukan metode untuk meningkatkan stabilitas sensor. Urikase dan matriks didepositkan pada elektroda pasta karbon dan dikarakterisasi menggunakan KCl dan K3Fe(CN)6. Elektroda yang layak digunakan selanjutnya diukur menggunakan voltametrik siklik untuk mengetahui arus yang dihasilkan. Kondisi optimum pengukuran diperoleh dengan memvariasikan konsentrasi asam urat, massa zeolit, dan konsentrasi glutaraldehida. Dari proses optimasi diketahui bahwa kinerja elektroda terbaik adalah pada konsentrasi gltaraldehida 0 mM, massa zeolit 5 gram, dan konsentrasi asam urat 2,3 mM. Parameter kinetik menghasilkan nilai KM dan Vmax berturutturut adalah 478,9 µM dan 9,7266 A. Stabilitas biosensor mencapai 23 hari. Kata kunci: biosensor, imobilisasi, zeolit, Lactobacillus plantarum, asam urat, urikase, voltametrik siklik
SUMMARY NOVITA ROSE DIANA. Immobilization of Uricase from Lactobacillus plantarum on carboximethylcellulose-gelatin-Zeolit matrix to Increase the Stability of Uric Acid Biosensor. Supervised by KOMAR SUTRIAH, DYAH ISWANTINI and NOVIK NURHIDAYAT. The high concentration of uric acid in blood indicates several diseases. There are many methods to measure this concentration, one of them is biosensor. This study aimed to improve the stability of uric acid biosensor by immobilizing the Lactobacillus plantarum cells (bioreceptor) on a matrix which is synthesized by mixing carboximethylcellulose, gelatin, and zeolite. Uric acid biosesor functioned as an initial sensor for patient who suffers from any diseases caused by the high concentration of uric acid in blood such as gout, cardiovascular diseases, hypertension, and many others. The using of this sensor will cause the degradation of its performance from day to day, therefore it is needed to improve its stability. The uricase and the matrix was deposited on the carbon paste electrode and was characterized by using KCl and K3Fe(CN)6. The proper electrodes then was measured by using cyclic voltametric to observe the current yielded. The optimum performance of electrodes was observed by varying the uric acid concentration, zeolite mass, and glutaraldehyde concentration. The optimization resulted the optimum performance of electrodes attained at 0 mM of glutaraldehyde concentration, 5 mg of zeolite mass, and uric acid concentration at 2,3 mM. The kinetics parameters resulted KM and Vmax in the amounts of 478,9 µM and 9,7266 A respectively. The stability of the biosensor achieved 23 days. Keywords: biosensor, immobilization, zeolite, Lactobacillus plantarum, uric acid, uricase, cyclic voltametric
6
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
IMOBILISASI URIKASE DARI Lactobacillus plantarum PADA KARBOKSIMETILSELULOSE-GELATIN-ZEOLIT UNTUK MENINGKATKAN STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
NOVITA ROSE DIANA
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
8
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr Akhirudin Maddu, MSi
Judul Tesis • Imobilisasi Urikase dari Lactobacillus plantarum pada Karboksimetilselulose-Gelatin-Zeolit untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat Nama • Novita Rose Diana • (5451130201
Disetujui Oleh Komisi Pembimbing
Dr Komar Sutriah MS Ketua
Dr No ik Nurhi a at
ProfDr Dy Iswantini. MSCAgr
ggota
Anggota
Diketahui Oleh
OLOG/
ascasarjana
Ketua Program Studi Kimia
40CA
Prof Dr Dy
yah, MSC Agr
Iswantini, MSCAgr
Tanggal Ujian: 29 Maret 2016
Tanggal Lulus:
20
2016
Judul Tesis : Imobilisasi Urikase dari Lactobacillus plantarum pada Karboksimetilselulose-Gelatin-Zeolit untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat Nama : Novita Rose Diana NIM : G451130201
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Komar Sutriah, MS Ketua
Prof Dr Dyah Iswantini, MSc Agr Anggota
Dr Novik Nurhidayat Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Dyah Iswantini, MSc Agr
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 29 Maret 2016
Tanggal Lulus:
10
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2014 ini ialah biosensor, dengan judul Imobilisasi Sel Lactobacillus plantarum pada Karboksimetilselulose-Gelatin-Zeolit untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Komar Sutriah, MS, Prof Dr Dyah Iswantini, MSc Agr, dan Dr Novik Nurhidayat selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada bapak Acun Syamsuri dan ibu Lusianawati dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium mikrobiologi. Kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI), penulis sampaikan terimakasih atas dana pendidikan yang telah diberikan melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN). Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2016 Novita Rose Diana
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Hipotesis
1 1 2 2 2
2 TINJAUAN PUSTAKA Asam urat Bakteri Lactobacillus plantarum Enzim urikase Biosensor asam urat Zeolit Gelatin
2 2 3 4 5 5 6
3 METODE Waktu dan tempat Bahan dan alat Prosedur penelitian Aktivasi zeolit Preparasi zeolit Pembuatan elektroda pasta karbon Karakterisasi elektroda pasta karbon Pembuatan media penumbuhan Lactobacillus plantarum Penumbuhan dan pemanenan Lactobacillus plantarum Pembuatan matriks CMC-gelatin-zeolit dan imobilisasi Pengukuran Elektrokimia Optimasi kinerja elektroda Penentuan stabilitas biosensor Penentuan kinetika urikase Lactobacillus plantarum
6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 10 10
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi zeolit Nilai KTK zeolit Pembuatan dan karakterisasi elektroda pasta karbon Penumbuhan dan pemanenan Lactobacillus plantarum Matriks CMC-gelatin-zeolit dan imobilisasi Optimasi kinerja elektroda Stabilitas biosensor Kinetika urikase Lactobacillus plantarum Kelinearan, Limit Deteksi, dan Limit Kuantifikasi Biosensor
11 11 12 12 14 15 16 17 18 19
5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
21 21
12
Saran
21
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL 1 Kombinasi konsentrasi asam urat, massa zeolit, dan konsentrasi glutaraldehida untuk pengoptimuman kinerja elektroda 2 Hasil uji PSA : Sebaran ukuran zeolit 3 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6], 2,3-dimetoksi-5metil-1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena 5 Perbandingan stabilitas
10 11 12 12 18
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6
7 8 9
10 11 12
Struktur asam urat Mekanisme reaksi asam urat dengan enzim urikase Mekanisme kerja biosensor urikase Sebaran ukuran zeolit berdasarkan intensitas Voltamogram karakterisasi elektroda pasta karbon Proses penanaman bakteri ke media padat (a) Bakteri yang telah tumbuh di media padat (b) Suspensi bakteri dalam buffer borat pH 8 (c) Reaksi taut silang dengan glutaraldehida yang terjadi dalam campuran gelatin-CMC (Asma 2014) Voltamogram elektroda optimum Pengaruh massa zeolit dan konsentrasi asam urat (a); pengaruh konsentrasi glutaraldehida dan massa zeolit (b); pengaruh konsentrasi glutaraldehida dan konsentrasi asam urat (c) terhadap perubahan puncak arus Diagram stabilitas biosensor Grafik Hubungan 1/[asam urat] dengan 1/Ipa Grafik kelinearan biosensor
3 4 5 11 13
14 15 16
17 17 19 20
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5
Diagram alir penelitian Data optimasi elektroda pasta karbon Data hasil pengukuran stabilitas elektroda Penghitungan kinetika urikase L. plantarum Penghitungan Kelinearan, LOD, dan LOQ
25 25 27 28 28
14
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Asam urat (2, 6, 8-trihidroksipurin) merupakan suatu hasil akhir dari metabolisme purin dalam tubuh manusia. Kecepatan ekskresi asam urat (kecepatan perubahan purinnukleotida dari asam nukleat menjadi produk ekskresi) orang dewasa yang sehat adalah 0,6 g/24 jam (Devi & Pundir, 2013). Kadar asam urat normal dalam serum adalah antara 0,13 dan 0,46 mM (2,18-7,7 mg.dl-1. Apabila kadar asam urat normal dalam tubuh telah diketahui, maka adanya suatu ketidaknormalan atau penyakit yang berhubungan dengan kelainan metabolisme purin dapat ditentukan. Kadar asam urat yang tinggi dalam darah (hyperuricemia) dapat mengindikasikan berbagai macam penyakit, seperti rematik, radang sendi, penyakit kardiovaskular, penyakit saraf, resistansi insulin, hipertensi, dan penyakit ginjal. Telah banyak teknik yang dikembangkan untuk mengukur kadar asam urat dalam tubuh manusia, misalnya spektrofotometrik, kolorimetrik, HPLC (Lorentz & Berndt 1967), kemiluminesens (Chaudari et al. 2012), dan fluoresens (Bloch & Lata 1970). Namun, teknik-teknik ini memiliki banyak kelemahan, seperti kolorimetrik yang membutuhkan banyak waktu, dan kolorimetrik enzimatik yang sangat mahal serta rentan terhadap interferensi. Saat ini telah dikembangkan teknik biosensor untuk deteksi asam urat. Teknik ini memiliki banyak keuntungan dari segi kemudahan, kecepatan, sensitivitas, dan biaya analisis. Komponen terpenting dalam penerapan biosensor asam urat adalah enzim. Salah satu enzim yang berperan mengkatalisis reaksi oksidasi asam urat adalah urikase. Enzim urikase pada umumnya diperoleh dari hewan vertebrata, namun karena teknik isolasi yang rumit, ketersediaan bahan atau sumber enzim yang minim, dan biaya yang besar mendorong penggunaan sumber alternatif lain seperti kapang, khamir, dan bakteri (Atalla et al. 2009). Salah satu bakteri penghasil protein enzim urikase adalah Lactobacillus plantarum yang telah diketahui memiliki aktivitas yang baik terhadap asam urat. Bakteri ini dipilih karena mudah diperoleh, ketahanan hidupnya relatif tinggi, dan tidak sulit penanganannya (Rostini 2007). Bakteri seringkali sangat sensitif terhadap kondisi lingkungan, seperti udara, kelembaban, dan suhu yang menyebabkan aktivitas dan kestabilannya sangat rendah selama masa penyimpanan dan pemrosesan. Oleh karena itu, untuk menjaga bakteri-bakteri tetap hidup dan aktif, diperlukan metode penanganan khusus, misalnya imobilisasi. Penelitian ini menggunakan matriks karboksimetilselulosa (CMC)-gelatin-zeolit sebagai media pengimobilisasi. Dari pencampuran ketiga material ini diharapkan akan menghasilkan suatu matriks pengimobilisasi yang lebih stabil dan kompak sehingga aktivitas urikase juga lebih terjaga. Pada kombinasi CMC dan gelatin, gelatin akan menghilangkan sifat kristal yang disebabkan oleh adanya interaksi elektostatik yang kuat antara rantai makromolekul yang menyebabkan aglomerasi (Prasad & Kalyanasundaram 1995). Pencampuran CMC dengan gelatin akan menghasilkan suatu fase padat yang kuat.
2
Berdasarkan penelitian oleh Iswantini et al (2013) dan Wijayanti (2014), imobilisasi enzim pada zeolit dapat meningkatkan respon arus yang dihasilkan. Ukuran zeolit dibuat dalam skala nano agar interaksi antara pengisi dan matriks meningkat (Kohls & Beaucage 2002). Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas dan kestabilan protein enzim urikase L. plantarum yang diimobilisasi pada CMC-gelatin-zeolit dengan metode elektrokimia, sehingga diperoleh teknik imobilisasi protein enzim yang terbaik.
Perumusan Masalah
Imobilisasi sel bakteri Lactobacillus plantarum pada matriks CMC-gelatinzeolit mampu meningkatkan stabilitas biosensor.
Tujuan Penelitian
1. 2.
Membuat CMC-gelatin-zeolit sebagai media imobilisasi bakteri L. plantarum. Meningkatkan kestabilan urikase dari bakteri L. plantarum yang diimobilasi pada CMC-gelatin-zeolit.
Hipotesis
CMC-gelatin-zeolit mampu meningkatkan kestabilan urikase dari bakteri L. plantarum.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Asam Urat
Metabolisme purin dalam tubuh manusia memproduksi suatu zat yang disebut asam urat (2,6,8-trihidroksipurin). Asam urat dapat berfungsi sebagai parameter diagnosis, karena konsentrasi asam urat yang tinggi dalam darah (hiperurisemia) dapat menandakan adanya berbagai macam penyakit seperti encok, radang sendi, penyakit jantung, penyakit saraf, resistensi insulin, hipertensi, dan gagal ginjal, pneumonia, dan leukimia (Arora et al. 2007).
3
Gambar 1 Struktur asam urat (Ringertz 1966) Kecepatan ekskresi asam urat dalam tubuh orang dewasa adalah 0,6 g/hari dan jumlah asam urat yang dikeluarkan setara dengan perubahan purinnukleotida dari asam urat (Devi & Pundir 2013). Kadar asam urat normal dalam serum adalah antara 240-520 µM, sedangkan dalam urin 1,4-4,4 µM (Kannan & John 2008). Akibatnya, penentuan kadar asam urat menjadi hal yang sangat penting dalam diagnosis dan manajemen medis penyakit yang disebabkan oleh kelainan metabolisme purin. Banyak metode yang dapat digunakan untuk penentuan kadar asam urat. Pendekatan yang dapat digunakan antara lain metode chemiluminescence, fluroscence, voltammetric-coulometric, dan biosensor (Arora et al. 2007).
Bakteri Lactobacillus plantarum
Bakteri L. plantarum merupakan jenis bakteri asam laktat homofermentatif yang berasal dari kingdom Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacili, ordo Lactobacillus, famili Lactobacillaceae, dan genus Lactobacillus. L. plantarum memiliki efek fisiologis yang tinggi pada fungsi usus, sehingga sangat mempengaruhi kesehatan manusia dan hewan. Apabila tidak terenkapsulasi, bakteri ini bersifat sangat sensitif terhadap kondisi lingkungan, seperti udara, kelembapan, suhu, pH lambung, dan larutan garam empedu (Trabelsi et al. 2013). Salah satu sifat bakteri L. plantarum yang utama adalah aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogenik. Aktivitas antibakteri dapat ditunjukkan oleh produksi zat-zat seperti asam organik, hidrogen peroksida, atau bakteriosin oleh bakteri tersebut. Bakteri L. plantarum dapat menghasilkan beberapa protein enzim yang dapat dimanfaatkan sebagai komponen pengenal hayati biosensor. Protein enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut adalah piruvat oksidase (POX) yang digunakan pada biosensor fosfat (a & Chaniotakis 2001), laktat oksidase (LOX) yang digunakan pada biosensor asam laktat (Gamella et al. 2010), dan urikase oksidase yang dapat digunakan untuk biosensor asam urat (Iswantini et al. 2009).
4
OH -
N
N OH
OH
HO
OH N
N H
Asam urat
OH
Urikase
N N
HO
N
N H
-
N
N
+ O2 + H2O
OH HO
N
+ CO2 +H2O2
N H
Alantoin
Gambar 2 Mekanisme reaksi asam urat dengan enzim urikase
Enzim Urikase
Enzim urikase, atau sering disebut urat oksidase merupakan enzim yang berperan dalam jalur peluruhan purin, mengkatalisis oksidasi asam urat menjadi alantoin dan hidrogen peroksida dengan bantuan oksigen. Katalisis ini dilakukan dengan cara membuka cincin purin pada asam urat dengan keberadaan oksigen sebagai oksidator untuk menghasilkan alantoin dan karbon dioksida. Sementara oksigen tereduksi menjadi hidrogen peroksida. Reaksi oksidasi asam urat adalah sebagai berikut: Keberadaan urikase yang berlebih (terakumulasi) dalam tubuh manusia dapat menyebabkan penyakit encok atau radang sendi (Devi & Pundir 2013). Urikase memiliki spesifitas yang tinggi terhadap asam urat, sehingga dapat dimanfaatkan untuk diagnosis penyakit dan keperluan medis lainnya. Urikase berperan penting dalam metabolisme nitrogen dan dapat digunakan untuk keperluan medis sebagai reagen pendiagnosis. Enzim ini biasanya dibutuhkan dalam jumlah yang banyak untuk analisis serum atau urin manusia sehingga jumlah asam urat dapat diketahui, dengan begitu risiko akumulasi urat dapat dikurangi. Urikase sering dijumpai dalam hati hewan atau dalam mikroorganisme, terutama dalam Bacillus pasteurii, Proteus mirabilis, Eschericia coli (Aly et al. 2013), dan Lactobacilus plantarum ( Iswantini et al. 2013). Untuk memperoleh enzim urikase dapat dilakukan dengan menumbuhkan bakteri penghasil urikase dalam medium cair yang berisi asam urat yang berfungsi sebagai sumber nitrogen. Dari studi literatur, diketahui bahwa asam urat merupakan media dan sumber nitrogen terbaik produksi urikase (Atalla et al. 2009). Urikase yang dihasilkan berupa supernatan koloni bakteri tersebut dan juga cairan di dalam sel. Pertumbuhan bakteri dan produksi urikase bervariasi berdasarkan induktor yang ditambahkan, medium yang digunakan, pH awal, dan kecepatan pengguncangan (Aly 2013).
5
Biosensor Asam Urat
Biosensor merupakan komponen analitik yang bekerja dengan mengkonversi respon biologis menjadi sinyal elektrik. Saat ini telah banyak sekali dikembangkan biosensor yang berbasis enzim karena enzim memiliki kemampuan untuk mengenali molekul target secara cepat dan akurat dalam sistem yang kompleks. Telah banyak literatur mengenai bahan dan metode imobilisasi enzim semenjak elektroda enzim ditemukan pertama kali oleh Clark dan Lyones pada tahun 1962 (Pan et al. 2005). Salah satu biosensor berbasis enzim yang mulai dikembangkan adalah biosensor asam urat atau biosensor urikase. Urikase memiliki spesifitas yang tinggi terhadap asam urat, sehingga dapat dimanfaatkan untuk diagnosis penyakitpenyakit yang ditimbulkan oleh kelebihan kadar asam urat dalam tubuh seperti encok, radang sendi, penyakit jantung, penyakit saraf, resistensi insulin, hipertensi, gagal ginjal, pneumonia, dan leukimia (Arora et al. 2007) dan keperluan medis lainnya. Urikase berperan penting dalam metabolisme nitrogen dan dapat digunakan untuk keperluan medis sebagai reagen pendiagnosis. Mekanisme kerja instrumen biosensor dimulai dari katalisis oksidasi asam urat oleh enzim urikase sehingga membentuk alantoin, karbondioksida, dan hidrogen peroksida. Katalisis ini dilakukan dengan cara membuka cincin purin pada asam urat yang dibantu dengan keberadaan oksigen sebagai oksidator untuk menghasilkan alantoin dan CO2. Sementara oksigen tereduksi menjadi hidrogen peroksida. Reaksi redoks ini akan menghasilkan elektron yang akan berinteraksi dengan elektroda. Kemudian elektroda akan mengirim sinyal menuju transduser. Oleh transduser, sinyal ini akan diubah menjadi gelombang elektromagnetik yang dapat dibaca dan terekam oleh recorder. Jumlah elektron yang berinteraksi dengan elektroda setara dengan kadar asam urat dalam darah.
Zeolit
Zeolit merupakan material berpori mikro yang memiliki peran penting dalam beberapa kajian teknologi, terutama karena spesifitas, kemampuan mengabsorpsi, dan keberadaan pusat asam aktifnya. Akhir-akhir ini, zeolit banyak
Gambar 3 Mekanisme kerja alat biosensor urikase (Martin 2011)
6
digunakan sebagai agen penyangga dalam imobilisasi enzim karena keefektifan dan kemudahannya dalam proses imobilisasi dan dapat digunakan untuk support material dalam sistem enzimatik lebih lanjut karena bersifat inert. Zeolit umumnya berupa aluminosilikat kristalin dengan struktur kombinasi tridimensional tetrahedron TO4 (T = Si, Al) yang dihubungkan oleh atom oksigen (Calgaroto et al. 2011). Secara umum, terdapat dua macam zeolit, yaitu zeolit alami dan zeolit sintetik. Zeolit alami terdiri dari sekitar 50 tipe (klinoptilolit, kabasit, mordenit, dan lain-lain), sedangkan beberapa tipe zeolit sintetik yang banyak digunakan untuk support material imobilisasi enzim adalah zeolit A, X, dan Y. Zeolit-zeolit tersebut memiliki muatan negatif struktur aluminosilikat kristalin dengan rumus kimia Nax(AlO2)x(SiO2)y]·zH2O (Chang & Chu 2007).
Gelatin
Gelatin merupakan suatu polipeptida dengan berat molekul tinggi. Gelatin dapat diperoleh dari kolagen yang mengalami denaturasi termal. Gelatin banyak dimanfaatkan dalam industri makanan dan obat-obatan. Menurut Gelatin Manufactures of Europe, gelatin komersil paling banyak dihasilkan dari jaringan babi dan sapi (Cho et al. 2005). Gelatin dapat digunakan sebagai pelapis pada imobilisasi enzim. Penambahan gelatin ini dapat meningkatkan stabilitas material support imobilisasi (Trabelsi et al. 2013). Dalam penelitian yang dilakukan oleh Emregul et al pada tahun 2012, penggunaan gelatin sebagai material support dalam imobilisasi enzim superoksida dismutase menghasilkan produk imobilasasi yang stabil. Selain itu, gelatin juga dapat berinteraksi dengan glutaradehida membentuk agen ikat silang (crosslinking) untuk mengikat enzim dengan kuat (Emregul et al. 2012).
3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2014-September 2015 bertempat di Laboratorium Kimia Fisika, Laboratorium Bersama Departemen Kimia FMIPA IPB, dan Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan, Puslit Biologi LIPI Cibinong.
7
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah bufer borat, sel L. plantarum Mar8, NaCl 0,85% (Himedia, India), akuades, grafit, minyak parafin, glukosa (Himedia, India), pepton (Himedia, India), natrium asetat (Himedia, India), tween 80 (Applichem, Jerman), beef extract (Difco, USA), yeast extract (Himedia, India, HCl 3 M (Merck, Jerman), 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzokuinon (QO) (Sigma, Jerman), asam urat (Nacalaic tesque, Japan), karboksimetilselulosa, glutaraldehida, zeolit alami Bayah tipe mordenit dan klinoptiloit, dan gelatin. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah oven, tanur, inkubator (Sanyo), autoklaf (Hariyama), sentrifus (Kokusan H-1500 F), seperangkat alat voltameter siklik (E-Daq potensiostat E-Corder 410), gelas piala, labu takar, gelas pengaduk, termometer, pipet mikrometer (Gilson), pinset, pipet mohr/volumetrik, pH meter (TOA DK HM-250), Particle Size Analyzer (PSA) dan elektroda.
Prosedur Penelitian
Prosedur kerja pada penelitian ini, seperti disebutkan pada Lampiran 1, meliputi aktivasi zeolit dan preparasi zeolit, pembuatan dan karakterisasi elektroda pasta karbon, penumbuhan dan pemanenan bakteri L. plantarum, pembuatan matriks CMC-gelatin-zeolit dan imobilisasi, pengukuran elektrokimia, optimasi kinerja elektroda, penentuan stabilitas biosensor, dan penentuan parameter kinetik biosensor.
Aktivasi Zeolit (modifikasi Cordoves et al. 2008, Arif 2011) Sebanyak 50 gram zeolit halus dicuci dengan akuades sampai pH netral, disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105o C. Zeolit yang telah dikeringkan diaktivasi dengan menambah 250 ml HCl 3 M dalam gelas piala dan diaduk selama 1 jam. Zeolit yang telah diaktivasi disaring, kemudian dicuci dengan akuades sampai pHnya netral. Larutan hasil saringan diuji kandungan klorin dengan AgNO3 dan dicuci kembali dengan akuades sampai tidak mengandung klorin. Setelah pHnya netral dan bebas klorin zeolit dikeringkan pada suhu 300o C selama 3 jam. Zeolit yang telah diaktivasi kemudian dihaluskan dan diayak dengan ayakan 100 mesh.
Preparasi Zeolit (Wahyudi et al. 2010) Zeolit yang telah diaktivasi kemudian digerus dengan alat planetary ball mill (PBM) dan diultrasonikasi. Ukuran partikel nano dikonfirmasi dengan PSA.
8
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon (Ikeda et al. 1998, Huang 2005) Pasta karbon dibuat dengan cara melarutkan Q0 ke dalam DMSO, kemudian dicampur dengan grafit dan minyak parafin (2:1), lalu digerus dengan mortar hingga terbentuk pasta. Setelah itu, pasta karbon dimasukkan ke dalam badan elektroda. Permukaan elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak. Elektroda didiamkan selama 2 hari sebelum digunakan.
Karakterisasi Elektroda Pasta Karbon Elektroda-elektroda yang telah dibuat selanjutnya dikarakterisasi dengan tujuan untuk memperoleh sifat yang sama dan meminimalisasi pengaruh elektroda terhadap hasil pengukuran. Karakterisasi elektroda meliputi karakterisasi dengan larutan KCl 0.1 M dan larutan K3Fe(CN)6 0.01 M dalam KCl 0.1 M. Karakterisasi dilakukan dengan menggunakan alat voltametri siklik yang telah dilengkapi dengan perangkat lunak E-chem. Hasil karakterisasi ditentukan dengan melihat terbentuknya puncak anodik dan katodik dari reaksi redoks yang terjadi di dalam kedua larutan tersebut.
Pembuatan Media Penumbuhan L. plantarum (Triana et al 2006) Dalam proses penumbuhan L. plantarum diperlukan dua jenis media, yaitu media Glucose Yeast Peptone (GYP) padat dan GYP cair. Media GYP padat dibuat dengan melarutkan 3,75 gram kalsium karbonat, 20 gram agar, 10 gram glukosa, 5 gram pepton, 1,4 gram natrium asetat, 5 ml larutan garam, 10 ml tween 80, 2 gram beef extract, dan 10 gram yeast extract ke dalam 1000 ml akuades, kemudian diaduk hingga larut. Setelah itu, larutan dipanaskan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC . Selanjutnya media dituang ke cawan petri dan dibiarkan dingin dan memadat sehingga siap digunakan. Media GYP cair dibuat dengan cara yang sama namun tanpa penambahan agar dan kalsium karbonat. Penumbuhan dan Pemanenan L. plantarum Inokulum digoreskan pada permukaan media GYP dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi) kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 hari. Bakteri yang tumbuh selanjutnya ditanam ke dalam 10 mL media GYP cair sebagai strarter dan diinkubasi hingga mencapai nilai OD600=1. Sebanyak 500 µl starter dimasukkan ke dalam 10 ml media GYP cair dan diinkubasi selama 3 jam dalam suhu 37˚C. Sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm (8000× g) selama 15 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan, lalu dicuci dengan air distilata dan diresuspensi dengan buffer borat pH 8.
9
Pembuatan Matriks CMC-Gelatin-Zeolit dan Imobilisasi (Modifikasi Emregul et al. 2012) Disiapkan campuran polimer (CMC-gelatin) dengan konsentrasi (0,1 w/w), kemudian campuran diambil sebanyak 0,75 gram. Selanjutnya campuran matriks ini dilarutkan dalam 10 ml buffer borat pH 8 dengan bantuan sonikator selama 20 menit pada suhu 50˚C. Larutan ini kemudian diambil sebanyak 1 ml untuk dicampur dengan zeolit sebanyak 5; 7,5; dan 10 mg. Matriks yang telah siap digunakan selanjutnya diambil sebanyak 30 µl dan ditambah dengan glutaraldehida dengan konsentrasi 0; 0,005; dan 0,001 mM sebanyak 10 µl, dan 80 µl bakteri. 10 µl dari campuran ini lalu diteteskan pada permukaan elektroda pasta karbon dan didiamkan hingga pelarutnya menguap. Selanjutnya permukaan elektroda dilapisi dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm. Elektroda dapat langsung digunakan untuk pengukuran aktivitas bakteri L. plantarum dengan metode voltametri siklik. Elektroda direndam dalam bufer borat pH 8 pada suhu 4 ºC ketika tidak digunakan untuk memberikan keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya.
Pengukuran Elektrokimia Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik menggunakan eDAQ potensiostat (Ecorder 410) yang dilengkapi perangkat lunak Echem v 2.1.0. Elektroda yang digunakan adalah elektroda Ag/AgCl, platina, dan pasta karbon yang berturut-turut sebagai elektroda pembanding, elektroda pembantu (counter), dan elektroda kerja. Parameter pengukuran dibuat mode cyclic, initial 0 mV, final 0 mV, rate 200 mV/s, step W 10 ms, upper E 1000mV, lower E 0 mV, range 5 V, dan arus 100 μA. Sebanyak 2 ml larutan bufer borat ditambahkan ke dalam sel pengukuran, lalu puncak arus yang terbentuk diamati sebagai puncak blanko. Setelah itu, pengukuran dilanjutkan dengan asam urat konsentrasi 0,3; 1,3; dan 2,3 lalu diamati puncak yang terbentuk.
Optimasi Kinerja Elektroda Optimasi yang dilakukan meliputi konsentrasi asam urat (0,3; 1,3; dan 2,3 mM), massa zeolit (5; 7,5; dan 10 mg), dan konsentrasi glutaraldehida (0; 0,005; dan 0,01 mM). Metode yang digunakan untuk optimasi adalah Respon Surface Method. Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak statistik minitab. Setelah itu, percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi yang dihasilkan untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya. Tabel 1 menampilkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas untuk pengoptimuman kinerja elektroda.
10
Tabel 1 Kombinasi konsentrasi asam urat, massa zeolit, dan konsentrasi glutaraldehida untuk pengoptimuman kinerja elektroda Asam urat (mM) 0,3 2,3 1,3 1,3 0,3 1,3 2,3 0,3 1,3 0,3 1,3 1,3 1,3 0,3 1,3 1,3 1,3 2,3 2,3 2,3
Zeolit (mg) 5 5 7,5 5 7,5 7,5 10 10 7,5 10 7,5 7,5 7,5 5 7,5 10 7,5 7,5 5 10
Glutaraldehida (mM) 0 0 0 0,005 0,005 0,005 0,01 0 0,005 0,01 0,005 0,005 0,005 0,01 0,01 0,005 0,005 0,005 0,01 0
Penentuan Stabilitas Biosensor Stabilitas diuji dengan melihat aktivitas relatif sampai terjadi penurunan. Persen stabilitas biosensor diukur dengan persamaan: Stabilitas = (* + )
Penentuan Kinetika Urikase L. plantarum Penentuan kinetika didasarkan pada besar arus yang dihasilkan oleh pengukuran elektroda dengan variasi konsentrasi asam urat. Dari data tersebut kemudian ditentukan besar KM dan Vmax dengan metode Lineweaver-Burk seperti pada persamaan berikut:
Keterangan: V = laju reaksi Vmax = laju reaksi maksimum
11
KM = konstanta Mechaelis-Menten [S] = konsentrasi substrat
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi Zeolit
Zeolit yang telah diaktivasi kemudian digerus dengan alat planetary ball mill (PBM) dan dihomogenasi dengan teknik ultrasonikasi. Selanjutnya, ukuran zeolit dikonfirmasi dengan PSA untuk mengetahui apakah partikel terbentuk dalam skala nano atau mikro. Tabel 2 dan Gambar 4 merupakan data hasil uji PSA yang memberikan informasi sebaran ukuran zeolit setelah diberi perlakuan planetary ball mill. Tabel 2 Hasil uji PSA : Sebaran ukuran zeolit Size (nm) 223,93 245,54 309,11 338,93 354,91 389,15 407,49 426,69 489,91 562,49 1,778,75 4,678,59 8,914,87
Intensity 1,00 1,00 1,00 1,00 0,51 1,00 0,56 1,00 0,69 1,00 0,49 0,44 0,31
Number 0,22 0,24 0,16 0,10 0,04 0,07 0,04 0,08 0,03 0,02 0,00 0,00 0,00
Gambar 4 Sebaran ukuran zeolit berdasarkan intensitas
Volume 0,02 0,03 0,05 0,04 0,02 0,04 0,03 0,06 0,03 0,04 0,03 0,15 0,46
12
Tabel 3 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah No Konsentrasi HCl (M) 1 0,5 2 1 3 3
Nilai KTK (me/100g) 81,45 76,20 68,14
Ukuran zeolit yang dihasilkan rata-rata sebesar 386,66 nm. Dari hasil tersebut diketahui bahwa dalam penelitian ini, zeolit dalam ukuran nanometer belum terbentuk. Suatu material dapat dikatakan berukuran nano apabila besar partikelnya berada pada kisaran 1-100 nm, sehingga disimpulkan zeolit masih dalam skala ukuran mikrometer. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh material zeolit yang menggumpal kembali (beraglomerasi) setelah digerus karena sifat dari zeolit itu sendiri. Aglomerasi ini mengakibatkan ukuran partikel kembali meningkat dikarenakan adanya interaksi Van der Wasls antar partikel (Wahyudi et al. 2011).
Nilai KTK Zeolit
Selanjutnya, nilai KTK zeolit diuji untuk mengetahui kondisi zeolit sebagai matriks pengimobilisasi. Hasil nilai KTK yang diperoleh disajikan dalam Tabel 3. Hasil pengujian KTK memperlihatkan bahwa konsentrasi HCl dalam proses aktivasi zeolit mempengaruhi nilai KTK. Semakin tinggi konsentrasi HCl yang digunakan, semakin kecil nilai KTK. Nilai KTK yang rendah menunjukkan kadar Al yang rendah, sehingga interaksi Al dengan gugus NH3+ yang dimiliki oleh gelatin dapat dihindari. Hal ini bertujuan agar gugus amina gelatin dapat berikatan dengan aldehida dari glutaraldehida secara optimal.
Pembuatan dan Karakterisasi Elektroda Pasta Karbon
Pasta karbon dibuat dengan cara melarutkan Q0 ke dalam DMSO, kemudian dicampur dengan grafit dan minyak parafin (2:1), lalu digerus dengan mortar hingga terbentuk pasta. Setelah itu, pasta karbon dimasukkan ke dalam badan elektroda. Permukaan elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak. Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6], 2,3-dimetoksi-5-metil1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena Mediator Ipa (μA) Q0 28,9267 Ferosena 5,3767 K3[Fe(SCN)6] 3,5700 (Iswantini, 2013)
13
Elektroda didiamkan selama 2 hari sebelum digunakan (Ikeda et al. 1998, Huang 2005). Q0 berfungsi sebagai mediator yang dapat mempercepat tejadinya proses transfer elektron dari bioreseptor ke transduser. Dalam Tabel 4, diketahui bahwa mediator Q0 menampilkan profil penghasil arus tertinggi. Elektrodaelektroda yang telah dibuat selanjutnya dikarakterisasi dengan tujuan untuk memperoleh sifat yang sama dan meminimalisasi pengaruh elektroda terhadap hasil pengukuran asam urat. Karakterisasi elektroda meliputi karakterisasi dengan larutan KCl 0.1 M dan larutan K3Fe(CN)6 0,01 M dalam KCl 0.1 M. KCl dan K3Fe(CN)6 merupakan larutan elektrolit pendukung yang akan mengalami reaksi redoks pada permukaan elektroda. Reaksi redoks yang terjadi pada larutan K3Fe(CN)6 menyebabkan pembentukan puncak yang teramati pada voltamogram. Reaksi redoks yang terjadi dalam larutan elektrolit K3Fe(CN)6 pada polarisasi katodik (reduksi) dan anodik (oksidasi) adalah sebagai berikut: K3[Fe(CN)6] 3K+ + [Fe(CN)6]3[Fe(CN)6]3- + e [Fe(CN)6]4[Fe(CN)6]4- [Fe(CN)6]3- +e
(reduksi) (oksidasi)
Karakterisasi dilakukan dengan menggunakan alat voltametri siklik yang telah dilengkapi dengan perangkat lunak E-chem. Pembentukan voltamogram dimulai dari potensial tertentu hingga reaksi berjalan dan membentuk puncak oksidasi, selanjutnya voltamogram berjalan dengan arah sebaliknya hingga membentuk puncak reduksi pada potensial yang hampir sama dengan potensial pada reaksi oksidasi. Kedua reaksi ini berlangsung pada permukaan elektroda yang sama namun dalam waktu yang berbeda. Kinerja elektroda ditentukan dengan melihat terbentuknya puncak anodik dan katodik dari reaksi redoks yang terjadi di dalam kedua larutan tersebut. Gambar 5 menunjukkan hasil karakterisasi elektroda di dalam kedua larutan. Terbentuknya puncak pada voltamogram menunjukkan kemampuan elektroda untuk melakukan transfer elektron dengan baik sehingga reaksi redoks dapat belangsung. Selain itu, terbentukya kedua puncak tersebut juga mengindikasikan bahwa reaksi berlangsung reversibel. Dalam karakterisasi elektroda menggunakan teknik voltametrik siklik, digunakan tiga buah elektroda, yaitu elektroda kerja berupa elektroda pastakarbon, elektroda pembanding dan elektroda pembantu. Elektroda pembanding yang digu-
KCl 0.1 M K3Fe(CN)6 0.05 M
0,000015
0,000010
I (A)
0,000005
0,000000
-0,000005
-0,000010
-0,000015 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
Gambar 5 Voltamogram karakterisasi elektroda pasta karbon
14
nakan adalah Ag/AgCl. Elektroda pembanding berfungsi untuk membandingkan besarnya potensial yang terjadi selama proses reaksi berlangsung, sehingga besarnya potensial dalam elektroda ini harus tetap. Apabila ada arus yang mengalir pada elektroda Ag/AgCl, maka konsentrasi Cl- dan harga potensial akan berubah, sehingga diperlukan suatu elektroda bantu yang memiliki hambatan lebih kecil daripada elektroda Ag/AgCl. Dengan begitu, arus yang mengalir menuju elektroda pembanding menjadi sangat kecil dan dianggap nol. Elektroda bantu yang digunakan adalah platina (Pt). Kelebihan dari elektroda Pt yaitu dapat digunakan daerah potensial yang luas.
Penumbuhan dan Pemanenan L. Plantarum
Mula-mula satu ose koloni bakteri dipindahkan ke media padat dengan bantuan jarum pindah. Selanjutnya bakteri diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37°C. Bakteri L.plantarum yang telah berkembang pada media padat kemudian ditumbuhkan dalam media GYP cair dan diinkubasi selama 24 jam untuk dijadikan starter. Sebanyak 500 µl starter ditumbuhkan kembali di dalam 10 ml media GYP cair selama 3 jam dalam suhu 37°C. Setelah OD600 mencapai 0,5-1 bakteri siap dipanen untuk memproduksi enzim urikase. Dalam penelitian ini digunakan sel utuh bakteri (tanpa pemecahan) karena enzim urikase yang dihasilkan akan dikeluarkan oleh bakteri. Pemanenan bakteri L.plantarum dilakukan dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm (8000× g) selama 15 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan, lalu dicuci dengan air distilata dan diresuspensi dengan buffer borat pH 8. Pelet berwarna putih, sehingga ketika diresuspensi akan menghasilkan cairan keruh berwarna putih
(a)
(b)
(c)
Gambar 6 Proses penanaman bakteri ke media padat (a) Bakteri yang telah tumbuh di media padat (b) Suspensi bakteri dalam buffer borat pH 8 (c)
15
Matriks CMC-Gelatin-Zeolit dan Imobilisasi
Gelatin merupakan polimer alam yang memiliki sifat sangat hidrofil dan kemampuan mekanisnya relatif rendah sehingga membatasi aplikasi potensialnya. Karena itu, penambahan bahan lain seperti CMC menjadi salah satu langkah untuk meningkatkan sifat gelatin tersebut. CMC merupakan polisakarida endogen yang berperan penting dalam pertumbuhan bakteri, diferensiasi, dan sebagai buffer dalam perubahan tekanan. Karena sifat biologisnya yang baik, CMC sering digunakan dalam bidang medis. CMC dan gelatin menghasilkan campuran poliionik yang reversibel, sedangkan penambahan glutaraldehida sebagai agen taut silang akan membentuk jaringan kimia yang permanen dan resistensi mekanisnya telah terbukti menjanjikan untuk perkembangan biomaterial yang dapat diperbarui (Asma et al 2014). Dalam interaksinya dengan CMC, gelatin berfungsi untuk menghilangkan sifat mengkristal CMC yang disebabkan oleh interaksi elektrostatik yang kuat antar rantai makromolekul yang menyebabkan CMC teraglomerasi (Prasad & Kalyanasundaram 1995). Yao et al (2007) menyatakan bahwa teknik dan bahan yang digunakan dalam imobilisasi akan mempengaruhi selektivitas dan stabilitas enzim yang diimobilisasi. Oleh sebab itu, pemilihan bahan dan teknik imobilisasi yang sesuai menjadi sangat penting. Dalam penelitian ini, matriks dibuat dengan cara mencampur CMC, gelatin, dan zeolit. Prasad dan Kalyanasundaram (1993) membuktikan bahwa gelatin meningkatkan stabilitas matriks ketika ditambahkan pada CMC dengan metode taut silang. Dalam penelitiannya, Prasad dan Kalyanasundaram menemukan bahwa matriks CMC yang tertaut silang mengalami erosi homogen, sedangkan matriks yang mengandung gelatin mengalami erosi heterogen sampai matriks habis bersamaan dengan release exhaustion. Karena itu, penambahan gelatin dalam CMC dengan metode taut silang akan meningkatkan integritas matriks. NaCMC bersifat kompatibel dengan polimer bermuatan positif, gelatin, di bawah titik isoeletriknya sehingga membentuk jaringan polimer yang interaktif (Prasad & Kalyanasundaram 1993).
Gambar 7 Reaksi taut silang dengan glutaraldehida yang terjadi dalam campuran gelatin-CMC (Asma et al. 2014)
16
Asma et al (2014) meneliti bahwa penambahan CMC dalam gelatin dapat meningkatkan fleksibilitas, sedangkan glutaraldehida sebagai agen taut silang meningkatkan stabilitas matriks. Matriks CMC-gelatin sangat berpori, sehingga zeolit ditambahkan untuk mendapatkan matriks yang stabil dan kompak. Iswantini et al (2013) meneliti dan membuktikan bahwa enzim yang diimobilisasi dengan zeolit akan mengalami peningkatan aktivitas. Selain itu, kation-kation yang terkandung dalam zeolit berperan dalam pertumbuhan bakteri, sehingga produktivitas urikase dari bakteri dapat terjaga.
Optimasi Kinerja Elektroda
Proses optimasi diawali dengan pembuatan variasi pada variabel bebas yang meliputi konsentrasi asam urat, konsentrasi glutaraldehida, dan massa zeolit yang digunakan dengan metode Response Surface Method. Variasi yang diperoleh selanjutnya diaplikasikan pada pembuatan elektroda, kemudian diukur menggunakan potensiostat untuk mengetahui besarnya arus puncak yang terbentuk. Gambar 8 memperlihatkan kontur hubungan antar dua variabel yang berpengaruh terhadap besarnya arus. Daerah optimum kinerja elektroda ditunjukkan oleh warna kontur yang semakin gelap dan arus yang tinggi. Kinerja elektroda terbaik adalah pada konsentrasi glutaraldehida 0 mM, massa zeolit 5 mg, massa CMC 0,1 g, dan massa gelatin 1 g, yaitu menghasilkan arus sebesar 0,0340 mA pada konsentrasi asam urat sebesar 2,3 mM. Besarnya respon arus yang dihasilkan dari tiap elektroda dapat dilihat pada Lampiran 2. Kondisi optimum elektroda ini kemungkinan disebabkan karena adanya glutaraldehida dapat menghambat aktivitas urikase dan juga mempengaruhi masa hidup sel. Selain itu tingginya konsentrasi asam urat yang menyebabkan arus yang terbentuk semakin tinggi. Massa zeolit optimum adalah massa zeolit yang paling rendah, sehingga menyebabkan bakteri yang diteteskan pada badan elektroda semakin baKarakterisasi K3[Fe(CN)6] Blanko (Buffer pH 8) Blanko+asam urat 0,3 mM Blanko+asam urat 1,3 mM Blanko+asam urat 2,3 mM
0,08 0,06 0,04
I (mA)
0,02 0,00 -0,02 -0,04 -0,06 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
Gambar 8 Voltamogram elektroda optimum
17
nyak sehingga mampu mengikat lebih banyak asam urat, akibatnya arus yang terukur juga semakin tinggi.
Hold Values konsentrasi glutaraldehida (mM)
8
0
7
6
5
0,008
0,006
Hold Values konsentrasi asam urat (mM)
2,3
0,004
0,002
0,000
0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 konsentrasi asam urat (mM)
0,010
delta I (mA) < 0,0050 – 0,0075 – 0,0100 – 0,0125 – 0,0150 – 0,0175 – 0,0200 > 0,0200
0,0050 0,0075 0,0100 0,0125 0,0150 0,0175
5
6
7 8 massa zeolit (mg)
9
konsentrasi glutaraldehida (mM)
9 massa zeolit (mg)
0,010
delta I (mA) < 0,005 0,005 – 0,010 0,010 – 0,015 0,015 – 0,020 > 0,020
konsentrasi glutaraldehida (mM)
10
0,008
0,006
Hold Values massa zeolit (mg)
5
0,004
0,002
0,000
10
delta I (mA) < 0,0050 – 0,0075 – 0,0100 – 0,0125 – 0,0150 – 0,0175 – 0,0200 > 0,0200
0,0050 0,0075 0,0100 0,0125 0,0150 0,0175
0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 konsentrasi asam urat (mM)
Gambar 9 Pengaruh massa zeolit dan konsentrasi asam urat (a); pengaruh konsentrasi glutaraldehida dan massa zeolit (b); pengaruh konsentrasi glutaraldehida dan konsentrasi asam urat (c) terhadap perubahan puncak arus
Stabilitas Biosensor
waktu
Gambar 10 Diagram stabilitas biosensor
hari-23
hari-16
hari-14
hari-12
hari-9
hari-8
hari-7
hari-6
hari-5
3 jam
hari-2
2 jam
1 jam
120 100 80 60 40 20 0 0 jam
% stabilitas
Stabilitas elektroda ditentukan dengan pengukuran performa elektroda dari waktu ke waktu. Elektroda yang digunakan adalah elektroda dengan kemampuan pengukuran yang optimum. Selama proses pengukuran, elektroda disimpan dalam buffer brat pH 8 dengan suhu 4°C ketika sedang tidak dipakai. Hal ini bertujuan untuk memberi lingkungan yang sesuai untuk bakteri. Dalam penelitian ini, stabilitas elektroda mencapai 23 hari. Sampai hari ke 23, presentase stabilitas elektroda adalah 71,57 %. Perhitungan stabilitas selengkapnya disajikan dalam Lampiran 3. Perbandingan stabilitas elektroda dengan penelitian sebelumnya dapat dilihat dalam Tabel 5.
18
Tabel 5 Perbandingan stabilitas biosensor asam urat Penelitian Stabilitas (hari) Sumber urikase Pan et al (2005) Jiang et al (2007) Liu et al (2012) Iswantini (2013) Kamal (2013) Penelitian ini Tanpa imobilisasi
50 157 70 18 22 23 6
Hati babi (murni) Aspergillus niger (murni) Urikase murni L. plantarum (sel utuh) L. plantarum (sel utuh) L. plantarum (sel utuh) L. plantarum (sel utuh)
Persentase Stabilitas 81,00 % 82,00 % 92,00 % 96,40 % 77,28 % 71,57 % 98,12 %
Stabilitas ini menyatakan masa atau lamanya suatu biosensor dapat bekerja secara relevan. Performa kerja biosensor akan semakin menurun seiring lamanya waktu biosensor tersebut digunakan. Data stabilitas ini juga memberikan tambahan informasi bahwa bakteri L. plantarum memproduksi urikase secara terus-menerus. Hal ini dapat dilihat dari adanya aktivitas urikase pada setiap pengukuran sehingga menghasilkan data stabilitas tertentu.
Kinetika Urikase L. plantarum
Pengukuran kinetika enzim urikase dilakukan untuk melihat kespesifikan suatu enzim. Pengukuran kinetika enzim yang dilakukan adalah pengukuran konstanta Michaelis-Menten nyata (KM) dan kecepatan reaksi nyata (Vmax) yang dianalogikan dengan arus maksimum nyata (Imaks) pada pengukuran ini. Metode yang digunakan adalah Lineweaver-Burk, Dixon, dan Eadie-Hofstee. Besarnya nilai Vmax dalam hal ini dianalogikan dengan Imax. Grafik pengukuran kinetika urikase L. plantarum ditunjukkan pada Gambar 11. Dari ketiga metode, metode Lineweaver-Burk menghasilkan kelinearan atau nilai R2 terbesar yaitu 0,9937, dengan perhitungan seperti disajikan dalam Lampiran 4, sehingga disimpulkan bahwa kinetika urikase L. plantarum mengikuti kinetika Lineweaver-Burk. Besarnya nilai KM dan Vmax berturut-turut adalah 0,4789 mM dan 9,7266 A, sedangkan nilai KM dan Vmax urikase murni berturut-turut sebesar 3,1397 10-3 mM dan 7,4936 A (Iswantini et al. 2013). Perbedaan nilai parameter kinetik ini kemungkinan disebabkan karena sumber urikase yang berbeda. Selain itu tingkat kemurnian urikase yang berbeda juga dapat menjadi penyebab perbedaan afinitas enzim terhadap substrat dan perbedaan kecepatan susbtrat mengisi sisi aktif enzim hingga jenuh. Semakin tinggi nilai KM mengindikasikan bahwa jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menjenuhkan substrat semakin banyak, artinya afinitas enzim terhadap substrat semakin rendah. Sedangkan Vmax menyatakan kecepatan enzim mengkatalisis reaksi.
300 250 200 150 100 50 0
400 [S]/V (mMmA-1)
I max (mA-1)
19
y = 49,239x + 102,81 R² = 0,9937
300 200 y = 97,17x + 55,422 R² = 0,9916
100 0
0
1
2 1/[S]
3
4
0
1
(mM-1)
2
3
4
[S] (mM)
0,01 V (mA)
0,008 0,006 0,004 0,002
y = -0,4973x + 0,0099 R² = 0,9687
0 0
0,005
0,01
V/[S]
(mAmM-1)
0,015
Gambar 11 Grafik Hubungan 1/[asam urat] dengan 1/Ipa Nilai KM urikase dari L plantarum 150 kali lebih besar daripada nilai KM urikase murni. Artinya, untuk menghasilkan afinitas terhadap substrat yang mirip dengan urikase murni, L. plantarum membutuhkan konsentrasi setidaknya 150 kali lebih besar daripada konsentrasi enzim murni. Hal ini kemungkinanan disebabkan karena lingkungan dari urikase murni adalah dirinya sendiri, sehingga gangguan atau hambatan dalam interaksi enzim-substrat lebih minimal daripada urikase dari bakteri. Dari analisis RPD (Relative Percent Difference), diperoleh perbedaan relatif antara nilai Vmax urikase murni dengan nilai Vmax L. plantarum sebesar 2%.
Kelinearan, Limit Deteksi, dan Limit Kuantifikasi Biosensor Hubungan yang linear antara respon biosensor (arus) dan konsentrasi asam urat terjadi pada rentang pengukuran 0,2 sampai 2,5 mM dalam buffer asam borat pH 8 seperti disajikan pada Gambar 12. Kelinearan ditunjukkan oleh nilai R2 yaitu sebesar 0,995, artinya kelinearan hasil yang diperoleh dari pengukuran biosensor pada rentang tersebut adalah sebesar 99,50%.
20
Dalam penelitian ini juga ditentukan besarnya limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ). LOD merupakan konsentrasi asam urat terendah yang dapat terdeteksi secara reliabel oleh biosensor namun belum terkuantifikasi besar atau nilainya. Sedangkan LOQ adalah konsentrasi terendah dari asam urat yang dapat ditentukan kuantitasnya secara presisi dan akurat. LOD dan LOQ dapat ditentukan salah satunya dengan menggunaan garis regresi, dan dihitung menurut persamaan sebagai berikut:
Q = LOD atau LOQ k = nilai k berlaku 3 untuk LOD dan 10 untuk LOQ sb = simpangan baku b = kemiringan kurva (slope) (Harmita 2004) Dari perhitungan diperoleh besarnya LOD dan LOQ biosensor, yaitu berturut-turut sebesar 0,23 dan 0,75 mM. Sehingga dinyatakan bahwa kemampuan biosensor untuk mulai mendeteksi adanya substrat yaitu pada konsentrasi substrat 0,23 mM, dan mulai dapat mengkuantifikasi substrat secara baik pada konsentrasi substrat 0,75 mM. Konsentrasi asam urat normal dalam serum adalah sebesar 0,13-0,46 mM, yang mana konsentrasi tersebut berada dalam wilayah kerja biosensor asam urat yang dihasilkan. Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa biosensor asam urat dari penelitian ini dapat digunakan untuk deteksi dini adanya indikasi suatu penyakit tertentu yang disebabkan oleh kelebihan kadar asam urat dalam darah. Perhitungan kelinearan, LOD, dan LOQ disajikan dalam Lampiran 5.
0,01
Imax (mA)
0,008 0,006 y = 0,0016x + 0,0039 R² = 0,995
0,004 0,002 0 0
1
2
3
[S] (mM)
Gambar 12 Grafik kelinearan biosensor
21
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Peningkatkan stabilitas biosensor dapat dilakukan salah satunya dengan metode imobilisasi enzim. Dalam penelitian ini, imobilisasi urikase dari sel Lactobacillus plantarum pada matriks karboksimetilselulosa-gelatin-zeolit terbukti dapat meningkatkan stabilitas biosensor. Glutaraldehida menghambat pertumbuhan bakteri, sehingga tidak sesuai digunakan sebagai agen taut silang sel utuh bakteri L. plantarum karena sangat berpengaruh pada masa hidup sel. Dari perhitungan, diperoleh nilai KM dan Vmax berturut-turut 478,9 µM dan 9,7266 A, kestabilan biosensor pada hari ke-23 masih berkisar 71,57 %, kelinearan biosensor berada pada rentang konsentrasi asam urat 0,2-2,5 mM, dengan nilai LOD dan LOQ berturut-turut 0,23 mM dan 0,75 mM, sehingga dari hasil tersebut biosensor yang dihasilkan mampu mendeteksi adanya indikasi suatu penyakit yang disebabkan oleh kelebihan kadar asam urat dalam darah.
Saran
Limit deteksi yang diperoleh melalui penelitian ini cukup baik yaitu 0,23 mM sehingga masih berada dalam range kadar asam urat normal, sedangkan limit kuantifikasi masih tinggi, yaitu 0,75 mM. Peningkatan kinerja biosensor mungkin dapat dilakukan dengan menambah jumlah bakteri yang digunakan dalam matriks. Masih diperlukan banyak pengembangan hingga diperoleh informasi serta data yang lebih lengkap. Dalam penelitian ini, karakter nanomaterial untuk zeolit belum terbentuk, sehingga diperlukan metode kimiawi untuk membentuk nanomaterial zeolit. Dalam penumbuhan dan pemanenan bakteri perlu dilakukan penghitungan dan optimasi konsentrasi bakteri, serta uji kontaminan terhadap bakteri. Penanganan yang baik terhadap bakteri seperti penambahan nutrisi dapat meningkatkan aktivitasnya, sehingga stabilitas biosensor juga akan meningkat.
DAFTAR PUSTAKA Aly M, Tork S, Al-Garni S, Allam R. 2013. Production and characterization of uricase from Streptomyces exfoliatus UR10 isolated from farm wastes. Turkish Journal of Biology. 37: 520-529. Arif, Zulhan. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media pendeteksi studi kasus : kromium heksavalen [tesis]. Bogor (ID) :
22
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Arora K, Sumana G, Saxena V, Gupta SK, Yakhmi JV, Pandey MK, Chand S, Malhotra BD. 2007. Improved performance of polyaniline-uricae biosensor. Analytica Chimica Acta. 594: 17-23. doi: 10.1016/j.aca.2007.04.068. Asma C, Meriem E, Mahmoud B, Djafeer B. 2014. Physicochemical characterization og gelatin-CMC composite edibles film from polyioncomplex hydrogels. Journal of Chilean Chemical Society. 59(1): 1-11. doi: 10.4067/S0717-97072014000100008 Atalla MM, MM Farag, RH Eman, MS Abs-El-Lataif, EA Nehad. 2009. Optimum condition for uricase enzyme production by Gliomastix gueg. Malaysian Journal of Microbiology. 5(1): 45-50. Bloch PL, Lata GF. 1970. Fluorescence assay for picomole quantities of uric acid: A new enzyme-Coupled approach. Analytical Biochemistry. 38(1): 1-19. doi: 10.1016/0003-2697(70)90160-8. Calgaroto C , Scherera RP, Calgarotob S, Oliveiraa JV, de Oliveiraa D, Pergherc SBC. 2011. Immobilization of porcine pancreatic lipase in zeolite MCM 22 with different Si/Al ratios. Applied Catalysis A: General. 394: 101104. Chang YK, Chu L. 2007. A simple method cell disruption by immobilization of lysozyme on the extrudate-shaped NaY zeolite. Biochemical Engineering Journal. 35: 37-45. Chaudari RD, Joshi AB, Srivastava R. 2012. Uric acid biosensor based on chemiluminescence detection using a nano-micro hybrid matrix. Sensors and Actuators B: Chemical. 173: 882-889. doi: 10.1016/j.snb.2012.08.001. Cho SM, Gu YS, Kim SB. 2005. Extracting optimization and physical of yellowfin tuna (Thunnus albacares) skin gelatin compared to mammalian gelatins. Food Hydrocolloids. 19: 221-229. Cordoves AIP, Valdes MG, Fernandes JCT, Luis GP, Garcia-Calzon JA, Garcia MED. 2008. Characterization of the binding site affinity distribution of a surfactant-modified clinoptililote. Micropor Mesopor Mater. 109:38-48.doi:10.1016/j.micromeso.2007.04.029 Devi R, Pundir CS. 2013. Construction and application of an amperometric uric acid biosensorbased on covalent immobilization of uricase on iron oxidenanoparticles/chitosan-g-polyaniline composite film electrodepositedon Pt electrode. Sensors and Actuators B. 193: 608– 615. doi: 10.1016/j.snb.2013.12.010. Emregul E, Kocabay O, Derkus B, Yumak T, Emregul KC, Sinag A, Polat K. 2012. A novel carboxymethylcellulose-gelatin-titanium dioxidesuperoxide dismutase biosensor; electrochemical properities of carboxymethylcellulose-gelatin-titanium dioxide-superoxide dismutase. Bioelectrochemistry. 90: 8-17. doi: 10.1016/j.bioelechem.2012.09.002. Gamella M, Campuzano S, Conzuelo F, Curiel JA, Muñoz R, Reviejo AJ, Pingarrón JM. 2010. Integrated multienzyme electrochemical biosensors for monitoring malolactic fermentation in wines. Talanta. 81(3): 925933.
23
Gavalas
VG, Chaniotakis NA. 2001. Phosphate biosensor based on polyelectrolyte-stabilized pyruvate oxidase. Analytica Chimica Acta. 427(2): 271-277. doi: 10.1016/S0003-2670(00)01204-6. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. I (3): 117-135. Huang W. 2005. Voltammetric Determination of Bisphenol A Using a CarbonPaste Electrode Based on the Enhancement Effect of Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB). Bull. Korean Chem. Soc. 26(10): 1560-1564. Ikeda T, Hiroshige Matsubara, Kan Kato, Dyah Iswantini, Kenji Kano, Mamoru Yamada. 1998. Electrochemical monitoring of in vivo reconstitution of glucose dehydrogenase in Escherichia coli cells with externally added pyrroloquinoline quinone. J Electroanal Chem 449: 219 - 224 Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila, Mardiah E. 2009. Aktivitas urikase yang dihasilkan dari berbagai sel Lactobacillus p/antarum dan parameter kinetikanya. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 14(3): 163-169. Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila, Widyatmoko O. 2013. Activity and stability of uricase from Lactobacillus plantarum immobilizated on natural zeolite for uric acid biosensor. Pakistan Journal of Biological Science. 1-5. Doi: 10.3923/pjbs.2013. Jiang Y, Wang A, Kan J. 2007. Selective uricase biosensor based on polyaniline synthesized in ionic liquid. Sensors and Actuators B. 124 (2007) 529– 534. doi: 0.1016/j.snb.2007.01.016 Kannan P, John SA. 2008. Determination of nanomolar uric and ascorbic acid using enlarged gold nanoparticles modified electrode. Analytical Biochemistry. 386: 65-72. doi: 10.1016/j.ab.2008.11.043. Kohls DJ, Beaucage G. 2002. Rational design of reinforced rubber. Solid state and materials science. 6: 183-194. Liu Y, Yuan M, Liu L, Guo R. 2012. A facile electrochemical uricase biosensor designed from gold/amino acid nanocomposites. Sensors and Actuators B. 176 (2013) 592– 597. doi:10.1016/j.snb.2012.08.058 Lorentz K, Berndt W. 1967. Enzymic determination of uric acid by colorimetric method. Analytical Biochemistry. 18(1):58-63. Martin C. 2011. Prinsip Biosensor. http://www.newsmedical.net/health/BiosensorPrinciple- (Indonesia).aspx [20 Januari 2012] Pan X, Zhou S, Chen C, Kan J. 2005. Preparation and properties of anuricase biosensor based on copolymer of o-aminophenol-aniline. Sensors and Actuators B. 113: 329-334. doi: 10.1016/j.snb.2005.3.086. Prasad MP, Kalyananasundaram M. 1993. Effect of incorporation of gelatin, an interactive polymer on the matrix stability and release of fenthion from crosslinked matrices of carboxymethylcellulose. Journal of controlled release. 27: 219-225. Prasad MP, Kalyananasundaram M. 1995. Scanning electron microscopic analysis and swelling behaviour of ionotropically crosslinked carboxymethylcellulose and carboxymethylcellulose-gelatin matrices. Carbohydrate polymers. 26: 35-41. Ringertz H. 1966. Molecular and Crystal Structure of Uric Acid. Acta Cryst. 20, 397.
24
Rostini I. 2007. Peranan Bakteri asam laktat (Lactobacillus plantarum) terhadap masa simpan filet nila merah pada suhu rendah [tesis]. Jatinangor (ID) : Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjajaran. Trabelsi I, Ayadi D, Bejar W, Bejar S, Chouayekh H, Salah RB. 2013. Effects of Lactobacillus plantarum immobilization in alginate coated with chitosan and gelatin on antibacterial activity. International Journal of Biological Macromolecules. 64: 84-89. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2013.11.031. Triana E, Yulianto E, Nurhidayat N. 2006. Uji Viabilitas Lactobacillus sp. Mar 8 Terenkapsulasi. Biodiversitas. 7(2): 114-117. Wahyudi A, Amalia D, Sariman, Rochani S. 2010. Sintesis nanopartikel zeolit secara top down mnggunakan planetary ball mill dan ultrasonikator. M & E. 8:1. Wahyudi A, Rochani S, Ardha IGN, Purnomo H, Sariman, Saleh N, Amalia D, Maryono, Sutanto A, Sulistiani L et al. 2011. Penyiapan nano partikel silika dari mineral silikat secara mekanis. [Laporan] Jakarta (ID): Kementerian ESDM. Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase Deinoccocus radiodurans diimobilisasi pada komposit zeolit alam Indonesia [tesis]. Bogor (ID) : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wijayanti. 2014. Biosensor antioksidan menggunakan enzim superoksida dismutase dari bakteri deinococcus radiodurans terimobilisasi nanopartikel zeolit. [Tesis] Bogor: Institut Pertanian Bogor. Yao H, Y Sun, X Lin, Y Tang and L Huang. 2007. Electrochemical characterization of poly (eriochrome black T) modified glassy electrode and its application to stimultaneous determination of dopamine, ascorbic acid and uric acid. Electrochim Acta, 52: 6165-6171.
25
26
27
Lampiran 2 Data optimasi elektroda pasta karbon konsentrasi asam urat (mM) 1,3 0,3 2,3 0,3 2,3 2,3 1,3 1,3 2,3 0,3 1,3 1,3 0,3 1,3 1,3 1,3 1,3 0,3 2,3 1,3
massa zeolit (mg) 7,5 5 5 5 10 7,5 7,5 7,5 5 10 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 5 7,5 10 10 10
konsentrasi glutaraldehida (mM) 0,005 0,01 0,01 0 0 0,005 0,005 0,005 0 0 0 0,005 0,005 0,01 0,005 0,005 0,005 0,01 0,01 0,005
delta I (µA) 4,5 5,4 3,1 8,2 4,8 10,8 2,8 2,8 24,3 6,7 4,1 1,1 6,3 11,5 2,5 6,8 4,8 5,3 6 2,3
Lampiran 3 Data hasil pengukuran stabilitas elektroda Waktu 0 jam 1 jam 2 jam 3 jam hari-2 hari-5 hari-6 hari-7 hari-8 hari-9 hari-12 hari-14 hari-16 hari-23
Arus (µA) 20,4 20,4 20,2 20,5 20,2 20,2 19,8 20,9 20,3 21,3 20,3 20,2 15,3 14,6
Contoh perhitungan: hari ke-2
Stabilitas (%) 100 100 99,02 99,51 99,02 99,02 97,05 97,55 99,51 95,58 99,51 99,02 75 71,57
28
(*
Stabilitas =
+
)
(*
= 100%
+
)
= 99,02 % Lampiran 4 Penghitungan kinetika urikase L. plantarum [Asam urat] 0,3 0,4 0,5 1 1,5 2 2,5 3
V0 0,0038 0,0044 0,0049 0,0064 0,0070 0,0077 0,0081 0,0091
1/[Asam urat] 3,3333 2,5 2 1 0,6667 0,5 0,4 0,3333
1/V0 263,1579 227,2727 204,0816 156,2500 136,9863 129,8701 123,4568 109,8901
Persamaan yang diperoleh : y = 49,239 x + 102,81
R2 = 99,37 %
dari persamaan tersebut jika dimasukkan ke persamaan
Sehingga diperoleh : Vmaks = 9.7266 A KM =0.4789 mM
Lampiran 5 Penghitungan Kelinearan, LOD, dan LOQ [Asam urat] (mM) 0,2 0,2 0,4 0,5 1 1,5 2 2,5
Arus (Y) 0,0043 0,0044 0,0044 0,0047 0,0055 0,0063 0,0071 0,0079
Yi 0,00422 0,00438 0,00454 0,00470 0,00550 0,00630 0,00710 0,00790
Yi-Y -8.10-5 -2.10-5 0,00014 0 0 -0,0001 0,0001 0,0002
(Yi-Y)2 6,4.10-9 4.10-10 1,96.10-8 0 0 1.10-8 1.10-8 4.10-8
29
Σ σ2 σ LOD LOQ Kelinearan
8,64.10-8 1,44.10-8 1,2.10-4 0,225 0,75 0,995
30
Riwayat Hidup Penulis dilahirkan di Ponorogo pada tanggal 9 November 1989 dari ayah Budi Sanyoto dan ibu Siti Rowiyah. Penulis adalah anak ke empat dari empat bersaudara. Program sarjana ditempuh di Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Sebelas Maret Surakarta, dan lulus ada tahun 2012. Pada tahun 2013 penulis diterima di Program Studi Kimia pada Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh melalui (BPPDN)
