FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2013 - 2014
IN VITRO MICRO-CT STUDIE VAN DE INVLOED VAN BIOMECHANISCHE STRESS OP BOTNIEUWVORMING IN MUISMODELLEN VOOR ARTRITIS
Elin PAUWELS
Promotor: Dr. P. Jacques
Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Voorwoord
Bij deze neem ik graag de gelegenheid om een aantal mensen die mij gedurende mijn studies en het voltooien van deze masterproef gesteund hebben. In de eerste plaats wil ik mijn promotor, Dr. P. Jacques, bedanken om mij de kans te geven aan een onderwerp te werken waarbij ik een mooie integratie kon doen van geneeskunde en mijn onderzoek als doctoraatstudent bij het UGCT. Ik wil haar ook bedanken om steeds tijd vrij te maken om mijn vragen te beantwoorden en mij anderzijds ook veel vrijheid te geven in het uitwerken van dit onderzoek. Verder wil ik ook Prof. Dr. L. Van Hoorebeke, promotor van mijn doctoraatsonderzoek, bedanken om gebruik te kunnen maken van de infrastructuur van het UGCT voor deze masterproef en voor het nalezen van de methodologie over micro-CT. Ook wil ik mijn fantastische collega’s bedanken voor het scoren van de CT-beelden en de hulp bij de theoretische achtergrond van de porositeitbepaling en de statistische analyses. Uiteraard wil ik ook Louis bedanken om mij de weg te wijzen naar de reumatologie en ervoor te zorgen dat ik daar de mogelijkheid heb gekregen om aan een onderwerp te werken waarvoor ik mijn fysica nog kon gebruiken. Tot slot wil ik uiteraard mijn ouders bedanken. Zij stonden steeds achter mij en hebben mij ten volle gesteund toen ik besloten heb aan een tweede studie te beginnen. Zonder hen zou ik nooit zover geraakt zijn en ik ben hen daar dan ook enorm dankbaar voor.
Elin Pauwels
9 april 2014
Inhoudsopgave Abstract
1
1. Inleiding
2
1.1 Het SpA concept ....................................................................................................
2
1.2 De rol van biomechanische stress in de pathofysiologie van SpA ...........................
2
1.3 Botnieuwvorming in SpA .......................................................................................
5
1.4 Muismodellen voor artritis .....................................................................................
6
1.4.1 Het TNFΔARE muismodel ...............................................................................
6
1.4.2 Collagen Antibody-Induced Arthritis ............................................................
8
1.5 Doelstelling van dit onderzoek ...............................................................................
8
2. Methodologie 2.1 Muizen ...................................................................................................................
9 9
2.2 Micro-CT acquisities .............................................................................................. 10 2.2.1 Hoge resolutie X-stralentomografie: enkele algemene principes .................... 10 2.2.2 Technische gegevens voor de micro-CT-scans .............................................. 12 2.2.3 Contrastering van de muizenpoten................................................................. 13 2.2.4 Analyse van de CT-beelden........................................................................... 15
Anatomie ................................................................................................ 15
Kwalitatieve botnieuwvormingscore........................................................ 16
Kwantitatieve volumebepaling osteofyten ............................................... 16
Porositeitbepaling osteofyten ................................................................... 16
2.2.5 Micro-CT-scans uitgevoerd bij Infinity ......................................................... 18 2.3 Histologie .............................................................................................................. 19
2.4 Statistiek ................................................................................................................ 19 3. Resultaten
20
3.1 Anatomie ............................................................................................................... 20 3.2 Botnieuwvorming .................................................................................................. 22 3.2.1 Kwalitatieve evaluatie van de graad van botnieuwvorming met micro-CT..... 22
Klinische artritis en botnieuwvorming ..................................................... 23
Vergelijking aantasting links en rechts .................................................... 25
Biomechanische stress en botnieuwvorming ............................................ 25
3.2.2 Kwantitatieve evaluatie van de graad van botnieuwvorming met micro-CT ... 27
Verband tussen beide opgemeten osteofytgroottes ................................... 29
Klinische artritis en osteofytgrootte ......................................................... 30
Biomechanische stress en osteofytgrootte ................................................ 32
Porositeit van de osteofyten ..................................................................... 36
3.3 Enthesen ................................................................................................................ 39 3.3.1 Uitwerking contrasteringsprotocol................................................................. 39 3.3.2 Enthesen en botnieuwvorming ...................................................................... 40 3.4 Histologie .............................................................................................................. 42 4. Discussie
43
5. Referentielijst
48
Abstract Het spondyloartritis (SpA) concept omvat een groep chronische inflammatoire aandoeningen die gekarakteriseerd worden door perifere artritis en/of axiale inflammatie. Daarnaast zijn er vaak extra-articulaire manifestaties aanwezig. Er zijn twee typische kenmerken van SpA, namelijk enthesitis, met een voorkeurslokalisatie ter hoogte van de Achillespees en de fascia plantaris, en botnieuwvorming, wat uiteindelijk kan leiden tot ankylose. In tegenstelling tot reumatoïde artritis (RA) waar de inflammatie primair ontstaat ter hoogte van de synoviale membraan, is er voor SpA steeds meer evidentie dat enthesitis en niet synovitis aan de basis ligt. Binnen het enthesitis-gebaseerd model voor de pathogenese van SpA wordt aangenomen dat zowel biomechanische stressfactoren als inflammatoire factoren een rol spelen. Enthesen zijn in bijzondere mate onderhevig aan biomechanische stress. In deze studie wordt de invloed van biomechanische stress op botnieuwvorming onderzocht met behulp van hoge resolutie X-stralentomografie (micro computed tomography of microCT) en histologie aan de hand van een muismodel voor destructieve polyartritis met reparatie, het Collagen Antibody-Induced Arthritis (CAIA) model. 10 dagen na inductie van de artritis, werd de helft van de groep muizen (n = 20) ontlast ter hoogte van de achterpoten gedurende 28 dagen zodat deze niet meer onderhevig waren aan biomechanische stress. Met behulp van micro-CT werd nadien de botnieuwvorming gevisualiseerd en verschillende parameters ter karakterisatie van de botnieuwvorming werden bepaald, waaronder een kwalitatieve score voor botnieuwvorming, osteofytgrootte en porositeit van de osteofyten. Tot slot werden de pootjes gecontrasteerd om de enthesen te kunnen visualiseren met behulp van micro-CT. Er bleek vooral een belangrijk lineair verband tussen klinische artritis en botnieuwvorming. Hoe hoger de graad van voorafgaande inflammatie, hoe meer osteofyten zichtbaar waren. De invloed van biomechanische stress op botnieuwvorming was minder duidelijk. Er kon geen significant verschil aangetoond worden tussen de ontlaste groep muizen en de controlegroep voor de verschillende parameters van botnieuwvorming. De gegevens leken er echter globaal wel op te wijzen dat biomechanische stress aanleiding zal geven tot meer botnieuwvorming en grotere osteofyten, maar door een combinatie van de beperkte steekproefgrootte enerzijds en een niet optimale randomisatie, kon significantie niet bereikt worden. Tot slot toonden de micro-CT-beelden aan dat botnieuwvorming voornamelijk optreedt ter hoogte van enthesen, wat plaatsen van verhoogde biomechanische stress zijn.
1
1. Inleiding 1.1 Het SpA concept Het spondyloartritis (SpA) concept omvat een groep chronische inflammatoire aandoeningen waaronder spondylitis ankylosans (AS), reactieve artritis (ReA), artritis/spondylitis geassocieerd
aan
inflammatoir
darmlijden
(IBD),
psoriasis
artritis
(PsA)
en
ongedifferentieerde SpA. Deze ziekten worden gekarakteriseerd door perifere artritis en/of axiale inflammatie, namelijk spondylitis en sacroiliïtis. Daarnaast zijn er vaak extra-articulaire manifestaties aanwezig zoals uveïtis, IBD en psoriasis. De perifere artritis is doorgaans asymmetrisch en oligoarticulair en treft voornamelijk de onderste ledematen. Een typisch kenmerk
is dactylitis.
Dit
ontstaat
ten gevolge
van een inflammatie van de
metacarpofalangeale en interfalangeale gewrichten in combinatie met een tenosynovitis van de flexorpezen en treedt voornamelijk op bij PsA en ReA. Ook enthesitis is een belangrijk kenmerk van SpA. Dit is een inflammatie van de insertie van ligamenten en pezen aan het bot met voorkeurslokalisatie ter hoogte van de Achillespees en de fascia plantaris. Bij SpA treedt, in tegenstelling tot bij reumatoïde artritis (RA), ook botnieuwvorming op die uiteindelijk kan leiden
tot
ankylose.(1-4)
Volgens
de
recente
classificatiecriteria
worden
spondylarthropathieën ingedeeld in axiale en perifere SpA, afhankelijk van de initiële presentatie.(2) De verschillende aandoeningen binnen het SpA concept vertonen een tendens tot familiale aggregatie en een significante associatie met het HLA-B27 antigeen. Deze associatie kan echter duidelijk variëren naargelang de aandoening en tussen verschillende etnische groepen.(4) Binnen de Europese, Caucasische populatie wordt de prevalentie van SpA geschat tussen 0,5 en 1,9%.(1, 5) SpA begint typisch in de vroege volwassenheid, en voor de leeftijd van 45 jaar. De diagnose wordt gesteld op basis van klinische criteria en radiologische bevindingen, zowel klassieke radiografieën als magnetische resonantie imaging (MRI).(2) Er zijn geen specifieke labotesten voorhanden.
1.2 De rol van biomechanische stress in de pathofysiologie van SpA Bij RA ontstaat de inflammatie van de gewrichten primair ter hoogte van de synoviale membraan. Voor SpA echter is er steeds meer evidentie dat enthesitis en niet synovitis aan de 2
basis ligt. Bij de introductie van deze hypothese werd initieel vooropgesteld dat de aanwezige synovitis secundair was aan de lokale vrijlating van pro-inflammatoire mediatoren ten gevolge van enthesitis. Synovitis treedt gewoonlijk op in respons op vele stimuli zoals kristalneerslag, infectie, trauma en kraakbeendegradatie en bovendien is experimenteel gebleken dat het synovium bijzonder gevoelig is aan pro-inflammatoire cytokines. Illustratief voor deze hypothese is het gebrek aan boterosies bij sacroiliïtis in het bovenste derde van het gewricht grenzend aan het interosseus ligament, waar geen synovium voorkomt.(6) Ondertussen is gebleken dat de link tussen enthesitis en synovitis meer ingewikkeld is, wat geleid heeft tot de introductie van het concept “synovio-entheseaal complex” (SEC).(7) (zie verder) Op basis van structuur en lokalisatie worden twee types enthesen onderscheiden, namelijk de fibreuze en de fibrocartilagineuze. De fibreuze zijn karakteristiek voor pezen en ligamenten die aanhechten op de metafyse en diafyse van lange beenderen. De fibrocartilagineuze enthesen bevinden zich ter hoogte van de apofyse en epifyse van lange beenderen, de korte beenderen in handen en voeten en de ligamenten van de wervelzuil. Enthesitis van dit laatste type is een hoofdkenmerk van SpA.(8) Enthesen zijn onderhevig aan repetitieve biomechanische stress tengevolge van de normale krachten uitgeoefend door spieren, ligamenten en pezen. In antwoord op dergelijke stress kunnen enthesen en nabijgelegen zones van het kapsel, pezen en ligamenten toenemen in massa. Ook het aangrenzend bot kan hierop reageren door middel van botnieuwvorming waarbij enthesofyten worden gevormd.(8, 9) In 2001 stelden McGonagle et al. (9) een enthesitis-gebaseerd model op voor de pathogenese van SpA waarbij de interactie tussen biomechanische stressfactoren en het antwoord van het aangeboren immuun systeem op bacteriële producten een centrale rol spelen. Hiermee wordt eveneens de lokalisatie van de inflammatoire respons bij SpA verklaard. Het model steunt op de volgende bevindingen; (a) Repetitieve biomechanische stress heeft een effect op proinflammatoire genexpressie waarbij een aantal molecules en transcriptiefactoren die ook een prominente rol spelen in de inflammatoire cascade opgereguleerd worden. (b) Bovendien is een belangrijk gevolg van aangehouden mechanische stress in de verschillende gewrichtsstructuren het ontstaan van microtraumata met een daaraan geassocieerde inflammatoire respons en genezing. (c) Hierdoor ontstaat ook een toegenomen vascularisatie die in de gewrichten kan leiden tot een preferentiële depositie van bacteriële moleculen op deze plaatsen.(9)
3
Zoals reeds aangehaald is er een functionele relatie tussen het ontstaan van enthesitis en synovitis wat geleid heeft tot de introductie van het “synovio-entheseaal complex” (SEC), bestaande uit de enthesis en het nabijgelegen synovium. (zie figuur 1-1) Synoviaal membraan is rijk gevasculariseerd, pro-inflammatoir, bevat een grote hoeveelheid macrofagen en bestaat uit vet of losmazig bindweefsel waardoor dit een zwakke structuur is. Gezonde enthesen daarentegen zijn avasculair, intrinsiek anti-inflammatoir, bevatten geen macrofagen en zijn opgebouwd uit dens regulair bindweefsel om het fysiek sterk te maken. Het SEC bestaat dus enerzijds uit een component die zeer gevoelig is aan microtraumata (de enthesis) en anderzijds uit een component die juist zeer gevoelig is aan inflammatie (het synovium). Wanneer een enthesis beschadigd raakt ten gevolge van biomechanische stress kan bijgevolg verwacht worden dat er een geassocieerde inflammatoire respons zal ontstaan in het aangrenzende synovium.(7, 10)
Figuur 1-1. Het synovio-entheseaal complex (SEC) van de Achillespees. Het synoviaal membraan (SM) omlijnt het grootste deel van de retrocalcaneaire bursa (B), behalve waar het sesamoid fibrocartilago (SF) drukt tegen het periostaal fibocartilago (PF) en staat zo in nabij contact met de enthesis (E). Macrofagen (M) als onderdeel van het synovium kunnen bijdragen tot de inflammatoire respons met degeneratieve veranderingen (DC) als gevolg. Bloedvat invasie (VI), wat vaak gezien wordt bij ouderen, is afkomstig uit onderliggend bot op plaatsen van focale afwezigheid van de subchondrale botplaat (FAB) of door rechtstreekse invasie vanuit het synovium. [overgenomen uit (7)]
Enthesitis is dus meer dan een focale pathologie van de eigenlijke aanhechting van pezen en ligamenten en omvat vaak ook de omliggende weefsels. Dit heeft geleid tot de introductie van het concept “enthesis orgaan” en omvat naast de enthesis zelf ook nabijgelegen bursae, fibrocartilago, vetweefsel, onmiddellijk aangrenzende trabeculaire beennetwerken en in sommige gevallen ook de diepe fascia. Het SEC is bijgevolg tevens een onderdeel van het enthesis orgaan.(8, 10) 4
Naast de eigenlijke insertie van pezen en ligamenten aan het bot zijn er ook zones waar deze weefsels in onmiddellijk contact staan zonder aan elkaar vastgehecht te zijn. Deze regio’s bevinden zich typisch waar een pees/ligament van richting verandert door rond een bot te draaien. Ook proximaal van een enthesis kan een pees rechtstreeks tegen het bot aandrukken. Deze zones worden door Benjamin et al. (8) beschreven als functionele enthesen. Deze zijn bijvoorbeeld terug te vinden ter hoogte van de pezen die rond de laterale en mediale malleoli draaien in hun overgang naar de voet. Het begrip “functionele enthesen” refereert naar de anatomische, biomechanische en pathologische gelijkenissen die ze vertonen met klassieke enthesen. Ze zijn namelijk eveneens onderhevig aan hoge compressie- en trekkrachten leidend tot differentiatie van fibrocartilago en blijken ook ziektelocaties te zijn in SpA (cfr. tenosynovitis is frequent aanwezig bij SpA). Dit suggereert een gemeenschappelijke biomechanische basis voor ziektemanifestatie. Bovendien blijkt de aanwezigheid van fibrocartilago als indicator voor compressie- of trekkrachten, een belangrijke link tussen veel ziektelocaties in SpA.(8, 10) Ook bij de extraskeletale ziektemanifestaties kan biomechanische stress een belangrijke rol spelen. Zo worden de extensorzijden van de huid, voornamelijk ter hoogte van de ellebogen en knieën, typisch aangetast bij psoriasis. Ook het corpus ciliaris van het oog ondervindt repetitieve biomechanische stress, wat van belang kan zijn bij anterieure uveïtis.(9)
1.3 Botnieuwvorming in SpA In tegenstelling tot bij RA waar inflammatie enkel leidt tot boterosies, treedt bij SpA ook botnieuwvorming of ankylose op. Deze botnieuwvorming gebeurt doorgaans ter hoogte van enthesen. Zo ontstaat een hielspoor ter hoogte van de fascia plantaris, ontwikkelt een spinale syndesmofyt zich langs het ligamentum intervertebrale anterius en worden ook ter hoogte van de Achillespees beensporen gevormd. De relatie tussen enthesitis, botnieuwvorming en boterosie is echter nog niet volledig opgehelderd. In een studie van McGonagle et al. (11) werd aangetoond dat erosie en botnieuwvorming op duidelijk anatomisch onderscheiden locaties plaatsgrijpen ter hoogte van de Achillespees. Waar bot onmiddellijk onderhevig is aan compressie wordt het geresorbeerd en neemt de kraakbeenvorming toe. Beensporen komen echter meer voor ter hoogte van de enthesen waar de trekkrachten groter zijn. Verder werd er gesuggereerd dat intermittente compressie van de pees tegen de tuberositas van het calcaneum botnieuwvorming inhibeert. Vandaar dat de vorming van sporen eerder ter hoogte
5
van het distale dan het proximale deel van de enthesis voorkomt, waar de graad van inhibitie lager is.(11) Dat de relatie tussen erosie en botnieuwvorming nog niet volledig begrepen is, wordt ook geïllustreerd door de bevindingen bij therapie met tumor necrosis factor (TNF) blokkers. Het pro-inflammatoire cytokine TNF is in belangrijke mate geassocieerd met inflammatie en erosie, en heeft een centrale rol in de pathogenese van SpA. Hoewel TNF antagonisten de ziekte-activiteit in belangrijke mate doen afnemen en de degeneratieve botprocessen kunnen inhiberen, blijken ze een minder duidelijk effect te hebben op botnieuwvorming zowel in muismodellen als bij patiënten. Verschillende studies hebben aangetoond dat SpA patiënten onder anti-TNF therapie radiografische progressie blijven vertonen, doch in mindere mate.(11-17) Langdurige en/of vroegtijdige behandeling zou in staat zijn de radiografische progressie af te remmen.(18) Anderzijds toonden Wanders et al. aan dat een continue behandeling met niet-steroïdale anti-inflammatoire medicatie (NSAIDs) de radiografische progressie bij patiënten met symptomatische AS kon verminderen.(19) Deze bevindingen illustreren dus dat inzicht in de moleculaire mechanismen van ankylose en de relatie tussen inflammatie en botnieuwvorming bij SpA essentieel is.(20) Het blijft momenteel echter nog onvoldoende duidelijk of inflammatie en botnieuwvorming bij SpA ontkoppeld of juist sterk geassocieerd zijn en waarom deze processen beiden plaatsvinden ter hoogte van de enthesen.(21) De typische presentatie met voornamelijk inflammatoire symptomen in de vroege fase en ankylose in de latere fase, kan een chronologische koppeling suggereren, maar hier is nog geen specifieke evidentie voor.(20) Aangezien ankylose een traag proces is dat niet bij alle patiënten optreedt en menselijke weefselstalen niet eenvoudig te verkrijgen zijn, wordt het huidig onderzoek naar de pathofysiologie
van
botnieuwvorming
bij
SpA
voornamelijk
uitgevoerd
op
muismodellen.(20)
1.4 Muismodellen voor artritis 1.4.1 Het TNF∆ARE muismodel Dit muismodel vertoont een deletie van de adenosine-uracil (AU) rijke elementen (ARE) uit de regulatorische sequenties van het TNF genoom. Hierdoor ontstaat een stabilisatie van het TNF messenger RNA, wat leidt tot een spontane, chronische en gedereguleerde TNF productie. Deze overproductie van TNF veroorzaakt een chronische inflammatoire polyartritis en een inflammatoire ileïtis gelijkend op IBD.(22) Daarnaast ontwikkelen deze muizen ook 6
sacroiliïtis en enthesitis waardoor ze als een echt translationeel model voor SpA kunnen worden aanzien.(23) Een groot nadeel is echter dat in muizen met een TNF overexpressie, zoals het TNF ∆ARE model, geen botnieuwvorming optreedt. TNF bevordert daarentegen botdestructie door recrutering van osteoclasten en vermindering van het aantal osteoblasten.(24, 25) Verschillende signalisatie pathways spelen een rol bij botvorming en zijn van belang bij kraakbeen en botpathologie, zoals de signalisatie via wingless-type (Wnt) en bone morphogenetic protein (BMP).(20) De eiwitten afkomstig van de Wnt genen zijn belangrijke mediatoren van de osteoblastogenese. Wnt signalisatie wordt onder andere geïnhibeerd door Dickkopf-1 (DKK-1), die op zijn beurt geïnduceerd wordt door TNF. Diarra et al. toonden aan dat blokkade van DKK-1 in een humaan TNF transgeen (hTNFtg) muismodel resulteerde in het ontstaan van osteofyten.(24) BMPs zijn eiwitten die de endochondrale botvorming kunnen induceren. Ze worden onder andere gestimuleerd via Wnt signalisatie. Ook TNF kan BMP stimuleren, maar werkt anderzijds inhiberend op Wnt in via DKK-1 zoals eerder vermeld. Het onderlinge evenwicht tussen deze verschillende signalisatie routes zal dus het ontstaan en de progressie van de botnieuwvorming reguleren. (zie figuur 1-2) Dit verklaart eveneens waarom in TNF overexpressie muismodellen geen osteofytvorming optreedt.(20)
Figuur 1-2. Rol van BMP, Wnt en TNF op botnieuwvorming. Endochondrale botvorming wordt gestimuleerd door BMP (bone morphogenetic proteins) waarbij Wnt (wingless-type) een ondersteunende rol speelt, hoewel sommige Wnts een negatief effect hebben op de vroege chondrocyt differentiatie. TNF (tumor necrosis factor) stimuleert BMP, maar induceert tevens DKK1 (dickkopf-1), een inhibitor van Wnt. [overgenomen uit (20)]
7
1.4.2 Collagen Antibody-Induced Arthritis (CAIA) Bij het collagen antibody-induced arthritis (CAIA) muismodel wordt artritis geïnduceerd door toediening van een cocktail van 4 monoclonale antilichamen – ontwikkeld
door
Nandakumar et al. (26) – gericht tegen specifieke epitopen verspreid over het volledige collageen type II (CII), een belangrijke component van het articulair kraakbeen. Hierdoor worden collageen-IgG immuuncomplexen gevormd die neerslaan in de gewrichtsruimten en zo inflammatie triggeren. Op deze manier ontstaat een inflammatoire polyartritis, onder andere bestaande uit synovitis met infiltratie van polymorfonucleaire en mononucleaire cellen,
pannusvorming,
kraakbeendegradatie
en
boterosies.
Extra
toediening
van
lipopolysaccharide (LPS) zorgt voor een secundaire immuunstimulus waardoor er een lagere hoeveelheid monoclonale antilichamen nodig is voor de inductie van artritis. Deze LPS boost is echter niet strikt noodzakelijk. (26-28) Het CAIA model biedt een aantal belangrijke voordelen. Zo ontstaat de artritis reeds na een aantal dagen, wat de volledige studieduur sterk kan reduceren. Bovendien is in dit model de generatie van auto-antilichamen door de gastheer niet noodzakelijk waardoor CAIA bij een breed spectrum aan muisstammen mogelijk is. De ziekte incidentie bedraagt bij CAIA ongeveer 100% en synchronisatie voor verschillende cohortes binnen een studie is op een eenvoudige manier mogelijk.(28) Na resolutie van de inflammatoire fase starten reparatiefenomenen met vorming van osteofyten als gevolg.(21) Het CAIA model kan dus gebruikt worden voor onderzoek naar botnieuwvorming. Er bestaan uiteraard nog andere muismodellen voor artritis, maar deze worden hier niet verder besproken.
1.5 Doelstelling van dit onderzoek In dit onderzoek wordt de rol van biomechanische stress bij botnieuwvorming in het kader van SpA onderzocht aan de hand van hoge resolutie X-stralentomografie en histologie. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van het CAIA muismodel voor destructieve polyartritis met reparatie.
8
2. Methodologie 2.1 Muizen Zoals reeds aangehaald, werd voor dit onderzoek het CAIA muismodel gekozen. De muizen werden
gekweekt
en
gehuisvest
onder
specifieke
pathogeenvrije
condities
in
overeenstemming met de algemene aanbevelingen van het Ethisch Comité voor Dierenwelzijn. Artritis werd geïnduceerd met de ArthritomabTM Antilichaam Cocktail van MD Biosciences. Om de invloed van biomechanische stress tengevolge van normale fysieke activiteiten op enthesitis en botnieuwvorming na te gaan, werden de achterpoten van de studiegroep muizen ontlast. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een ontlastingmodel dat oorspronkelijk ontwikkeld werd bij ratten om de condities van gewichtloosheid tijdens een ruimtevlucht na te bootsen ter hoogte van de achterpoten en de hierop volgende skeletale veranderingen te bestuderen. De muizen worden via de staart gefixeerd aan een rail waarbij de achterpoten worden opgetild, zodanig dat geen of slechts minimaal contact met de grond mogelijk is. Het ophangsysteem is zodanig ontwikkeld dat de dieren in staat zijn om vrij rond te bewegen in hun kooi.(29, 30) De antilichamen werden ingespoten bij DBA/1 muizen (N = 20). Tevens werd een LPS boost toegediend. Ongeveer 7 dagen na immunisatie ontwikkelen de muizen een enthesitis die nadien progressief overgaat in een destructieve artritis.(31) Botnieuwvorming treedt pas op ten gevolge van reparatiefenomenen na resolutie van het inflammatoir beeld. Op dag 10 na immunisatie, wanneer een duidelijke klinische artritis bereikt was, werd de helft van de muizen ontlast gedurende 28 dagen om mechanische krachten ter hoogte van de achterpoten te verhinderen, de tail suspended (TS) groep. De overige muizen, de non-tail suspended (NTS) groep of controlegroep, werd onder normale omstandigheden gehouden zodat de biomechanische stress die zij ondervinden enkel te wijten is aan gewone fysieke activiteiten. Een overzicht van het tijdschema van dit protocol met een voorbeeld van de evolutie van de klinische artritis in functie van de tijd is te zien in figuur 2-1. De klinische tekenen van artritis werden op regelmatige basis geëvalueerd door twee personen en aan iedere muis werd op die manier een klinische score toegekend per poot, gaande van 0 tot 3 (0 = geen zwelling, 0,5 = zwelling van vinger of teen, 1 = minimale zwelling van enkel of pols, 2 = zwelling van carpus of tarsus, 3 = volledige poot gezwollen). De totale klinische score voor een muis is de som van de klinische scores van de vier poten. De muizen werden gerandomiseerd in de TS en NTS groep op basis van deze totale klinische score. 9
Figuur 2-1. Klinische artritis in functie van de tijd bij CAIA & aanduiding tijdschema protocol. De grafiek toont de totale klinische artritis score uitgedrukt in een ordinale schaal in functie van de tijd in dagen. Het tijdstip van immunisatie, LPS boost en start en einde van de ontlasting bij de tail suspended groep is eveneens aangeduid.
2.2 Micro-CT acquisities 2.2.1 Hoge resolutie X-stralentomografie: enkele algemene principes X-stralentomografie is een driedimensionale beeldvormingtechniek die, gebruik makende van X-stralen of Röntgenstralen, toelaat om op een niet-destructieve manier het inwendige van het gescande object te visualiseren. De medische Computed Tomography (CT)-scanner is hiervan een van de best gekende toepassingen. Ook voor wetenschappelijke en industriële doeleinden wordt X-stralentomografie veelvuldig gebruikt. Dit heeft onder andere geleid tot de ontwikkeling van hoge resolutie CT-scanners. Bij micro-CT scanners wordt, in tegenstelling tot bij de klassieke medische scanner, meestal het object zelf geroteerd terwijl X-stralenbuis en detector vaststaan. Een schematische voorstelling van een dergelijke opstelling wordt weergegeven in figuur 2-2. Vanuit de bron wordt een conische, polychromatische X-stralenbundel uitgestuurd naar de detector. Het te scannen object bevindt zich in de bundel en wordt met behulp van een rotatiemotor stapsgewijze rond zijn as gedraaid. Bij iedere rotatiestap wordt een projectie of radiografie gemaakt. Door het combineren van de informatie uit al deze projecties aan de hand van een reconstructiealgoritme, kan uiteindelijk de interne structuur gereconstrueerd worden.(32, 33)
10
Figuur 2-2. Schematische opbouw van een standaard micro/nano-CT-scanner. [overgenomen uit (32)]
Een CT-scan geeft uiteindelijk aanleiding tot een virtuele 3D representatie van het gescande object opgebouwd uit voxels. Dit zijn kleine volume-elementen met een welbepaalde grootte, vergelijkbaar met pixels in een tweedimensionaal beeld. Voor elke voxel wordt tijdens de reconstructie een grijswaarde berekend die staat voor de lineaire attenuatiecoëfficiënt μ van het materiaal aanwezig in die voxel. μ is het product van de lokale dichtheid ρ en de massaattenuatiecoëfficiënt μ/ρ. Deze laatste is sterk afhankelijk van het atoomgetal Z van het materiaal en hangt daarnaast ook af van de energie van de invallende fotonen. Op deze manier zal naargelang de dichtheid en de aard van het aanwezige materiaal een verschillende grijswaarde bekomen worden en kan dus visueel een onderscheid gemaakt worden. In medische CT-scanners worden de grijswaarden gewoonlijk omgezet naar Hounsfield Units (HU) aan de hand van de volgende formule:
Hierin staat μx voor de lineaire attenuatiecoëfficiënt in een voxel x en μwater voor de lineaire attenuatiecoëfficiënt van water die onder dezelfde scanomstandigheden, met name dezelfde fotonenergie, wordt verkregen. Omwille van het polychromatisch karakter van de Xstralenbundel wordt de gemeten (of gereconstrueerde) μ in een bepaald punt van het object ook bepaald door het omliggende materiaal. Immers, naarmate de bundel doorheen een object propageert worden voornamelijk de laag-energetische fotonen geattenueerd waardoor het Xstralenspectrum naar hogere energieën opschuift. Dit proces noemt men beam hardening en zorgt er dus voor dat een voxel afhankelijk van zijn positie in het object en het omliggende materiaal gezien wordt met een welbepaalde “gemiddelde” fotonenergie die meteen ook μx zal bepalen. Aangezien in medische scanners steeds “objecten” met min of meer dezelfde vorm
11
en samenstelling worden gevisualiseerd, is het mogelijk om hier een kalibratie door te voeren en de grijswaarden om te zetten naar HU. Dit is echter niet routinematig mogelijk in situaties waar sterk verschillende objecten worden gescand. De resolutie van het beeld is gelijk aan het scheidend vermogen, namelijk de kleinste afstand tussen twee punten die nog als afzonderlijk kunnen waargenomen worden. Naarmate een object dichter bij de bron – en verder van de detector – geplaatst wordt, zal de beeldvergroting toenemen waardoor kleinere details kunnen worden waargenomen en de resolutie verbetert. Een mogelijke beperkende factor is de eindige spotgrootte van de X-stralenbron, maar zolang deze voldoende kleiner blijft dan de voxelgrootte, mag de bron als een puntbron beschouwd worden en zal deze geen aanleiding geven tot wazige beeldranden. Voor alle scans uitgevoerd in dit onderzoek geldt deze benadering. De voxelgrootte van het gereconstrueerde volume is dus een maat voor de uiteindelijke resolutie (ongeveer 3 keer de voxelgrootte). De minimale voxelgrootte die bereikt kan worden, wordt bepaald door de grootte van het object en bedraagt ongeveer 1/1000 van de diameter van het object. Dus hoe kleiner het object, hoe hoger de resolutie die kan behaald worden, gesteld dat de spotgrootte voldoende klein is.(32)
2.2.2 Technische gegevens voor de micro-CT-scans Voor dit onderzoek werden de rechter achterpoten van de muizen gescand aan het Centrum voor X-stralentomografie van de Universiteit Gent, het UGCT, gespecialiseerd in zeer hoge resolutie X-stralentomografie.(34, 35) Het UGCT beschikt
momenteel over
vier
zelfgebouwde scanners. Kenmerkend is de modulaire opbouw, zodat voor ieder object de meest geschikte X-stralenbuis en detector gekozen kan worden om optimale scancondities te creëren. Een afbeelding van één van de scanners is te zien in figuur 2-3. Naast de eigenlijke ontwikkeling en bouw van scanners, wordt aan het UGCT ook onderzoek verricht naar de ontwikkeling van algoritmes en software, onder andere voor CT-reconstructie, 3D-analyse en CT-simulaties, en naar het gebruik en de toepassingen van X-stralentomografie.
12
Figuur 2-3. Afbeelding van de meest recente micro-CT-scanner gebouwd aan het UGCT
Omwille van praktische overwegingen werden de muizenpoten in twee reeksen gescand. Daarnaast werd ook beslist om twee muizen die geen klinische artritis vertoonden ter hoogte van de achterpoten niet te scannen. In het totaal waren er namelijk vier muizen die een klinische score van 0 hadden voor beide achterpoten. Omwille van de lange duur en kostprijs van de micro-CT-scans werd ervoor gekozen om hiervan één muis uit de TS groep en één uit de NTS groep te scannen en de overige buiten beschouwing te laten. Voor de eerste reeks werden de transmissiekop van een tweekoppige X-stralenbuis van Feinfocus (FXE 160.51) en een Varian 2520V Paxscan a-Si flat panel detector gebruikt. De buis werd ingesteld op een spanning van 120kV en een bundelfiltratie van 1mm aluminium werd toegepast. Voor elke scan werden 1801 projecties genomen over 360° met een belichtingstijd van 1s per projectie. De resulterende voxelgrootte bedroeg tussen 6.5 en 10µm. Voor de tweede reeks werd een directionele X-stralenbuis van X-RAY WorX en een PerkinElmer XRD 1620 CN3 CS a-Si flat panel detector gebruikt. De buisspanning werd ingesteld op 130kV en ook hier werd een filtratie van 1mm aluminium toegepast. Per scan werden 2401 projecties genomen over 360° met een belichtingstijd van 1s per projectie. De voxelgrootte bedroeg 5µm voor alle pootjes van deze reeks. Voor reconstructie van de ruwe projectiedata werd gebruik gemaakt van Octopus, een softwarepakket voor reconstructie ontwikkeld aan het UGCT.(36)
2.2.3 Contrastering van de muizenpoten Beeldcontrast wordt bereikt wanneer twee aangrenzende weefseltypes aanleiding geven tot een verschillende X-stralen attenuatie. Zoals eerder aangehaald hangt dit in belangrijke mate af van de atoommassa en densiteit van het materiaal. De verschillende zachte weefsel 13
structuren, zoals spieren, ligamenten en pezen, hebben echter nagenoeg dezelfde samenstelling en dichtheid en zijn dan ook niet steeds eenvoudig te onderscheiden met CT. Eén van de manieren om het contrast te verhogen is door de weefsels te drogen. Hierbij kunnen echter vervormingen ontstaan en fijne structuren kunnen zelfs ineenklappen. Met behulp van kritisch-punt-drogen kan dit vermeden worden, maar de procedure is niet eenvoudig en vereist speciale apparatuur. Een veel eenvoudiger alternatief om contrast te verhogen is gebruik te maken van contraststoffen. Voor CT toepassingen zijn dit meestal stoffen die elementen met een hoog atoomgetal bevatten en die op een verschillende manier in verscheidene weefseltypes gaan doordringen om zo aanleiding te geven tot een duidelijk verschil in attenuatie. Een voorbeeld van een dergelijke contraststof is kwikchloride (HgCl2). Hiermee kunnen onder andere de verschillende spierbundels, pezen, ligamenten en grote bloedvaten gevisualiseerd worden. Figuur 2-4 toont een CT-doorsnede van een muizenpoot met en zonder contrastering met HgCl2.(37)
Figuur 2-4. Effect van contrastering van zachte weefsels met HgCl 2. Links: Vergelijkende CT-doorsnede van een muizenpoot zonder (A) en met contrast (B). Rechts: 3D-rendering van de gecontrasteerde muizenpoot. Spierbundels, pezen en ligamenten zijn duidelijk zichtbaar. [overgenomen uit (37)]
Voor dit onderzoek is het onder andere de bedoeling de enthesen in de voet te visualiseren om na te gaan of de botnieuwvorming voornamelijk op deze plaatsen van verhoogde biomechanische stress optreedt. De pootjes uit de eerste reeks werden dan ook, na een initiële scan zonder contrast, nog een tweede maal gescand na contrastering. Als contraststof werd een waterige oplossing van HgCl2 met een concentratie van 4% gekozen waarin de pootjes werden ondergedompeld. Aangezien de huid een belangrijke barrière vormt voor het doordringen van de contraststof, werd die zoveel mogelijk verwijderd. 14
Echter ter hoogte van de voet zelf was dit niet mogelijk. Bovendien zijn pezen en ligamenten dense structuren, wat ook het doordringen van de contraststof kan bemoeilijken. Daarom werden eerst een aantal testen uitgevoerd op pootjes van wild-type muizen om de ideale contrasteringsduur te bepalen. Ook werd nagegaan of het rechtstreeks injecteren van contraststof in de poot verbetering geeft. Concreet werden pootjes die gedurende 2, 3 en 4 dagen ondergedompeld waren in contraststof vergeleken. Verder werden ook bij 2 pootjes rechtstreeks contrastinjecties gegeven in de poot waarna ze gedurende 3 dagen in de contrastvloeistof werden gelegd. De pootjes werden nadien per 3 gescand, inclusief een niet gecontrasteerde referentiepoot, met dezelfde scanparameters als diegene gebruikt voor de eerste reeks CAIA muizen. Door de toegenomen objectgrootte bedroeg de voxelgrootte in dit geval 24µm. Uit vergelijking van de resultaten werd het ideale contrasteringsprotocol bepaald dat vervolgens werd toegepast op de CAIA muizen.
2.2.4 Analyse van de CT-beelden Analyse van de beelden gebeurde met behulp van VGStudio MAX. Dit is een programma voor visualisatie en analyse van CT-data en laat ook toe 3D-renderings uit te voeren. Anatomie In eerste instantie werd de beenderige anatomie van de muizenpoten bestudeerd. Er zijn slechts een beperkt aantal afbeeldingen van de skeletstructuur van muizen terug te vinden. Vandaar dat eerst de anatomie van de middenvoetsbeentjes in kaart gebracht werd op de CT-beelden van een wild-type referentiepoot. Hiervoor werd in VGStudio een threshold ingesteld op het grijswaardenhistogram, zodat het zacht weefsel onzichtbaar werd gemaakt en enkel het bot overbleef. Vervolgens werden de verschillende botten afzonderlijk gesegmenteerd met behulp van een region growing operatie. Hierbij wordt een initiële voxel in het beeld gekozen, ook wel seed genoemd, en wordt er een bepaalde tolerantie ingesteld door de gebruiker. Vanuit deze initiële voxel wordt dan naar de aangrenzende voxels gekeken en indien deze een grijswaarde hebben die gelijk is aan of binnen de tolerantiegrenzen valt van de grijswaarde van de initiële voxel, worden ze opgenomen in de regio. Van hieruit wordt dan opnieuw naar de aangrenzende voxels gekeken. Op deze manier wordt een region of interest (ROI) verkregen die gegroeid is vanuit een initiële voxel. Het resultaat van deze segmentatie werd vergeleken met de voorhanden zijnde afbeeldingen (38) om de verschillende botten te identificeren. 15
Kwalitatieve botnieuwvormingscore Vervolgens werden de verschillende datasets door twee personen onafhankelijk en blind, dit wil zeggen zonder te weten over welke muis het gaat, doorgenomen en werd door beide een score toegekend voor de graad van botnieuwvorming, gaande van 0 (geen botnieuwvorming) tot 3. Waar de scores niet in onderlinge overeenstemming waren, werden de pootjes geherevalueerd om tot een consensus te komen. Kwantitatieve volumebepaling osteofyten Er werden twee locaties uitgekozen waarop bij de meeste muizen botnieuwvorming te zien was. Vervolgens werd voor iedere poot op deze twee plaatsen de grootte van de osteofyten gemeten. Hiervoor werd met VG Studio zorgvuldig een ROI getekend zodat de osteofyt als een apart volume geëxtraheerd kon worden. Het aantal voxels vermenigvuldigd met de voxelgrootte geeft dan uiteindelijk het volume van de osteofyt. De fout op deze volumemeting werd bepaald door bij één van de osteofyten de meting 5 maal te herhalen en klassieke foutberekening toe te passen. Dit leverde een onzekerheid op voor het volume van 0,004 mm³. Tot slot werden de volumes ook omgezet naar een volume score, eveneens gaande van 0 tot 3. De afkapwaarden werden zodanig gekozen dat de intervallen tussen de scores een gelijke grootte hadden en de volumes dus gelijkmatig verdeeld konden worden. Porositeitbepaling osteofyten De porositeit van een osteofyt wordt bepaald door de verhouding te nemen van het aantal beenmergbevattende voxels tot het totaal aantal voxels (zowel beenmerg als bot). Figuur 25 toont een typisch voorbeeld van een grijswaardenhistogram van een osteofyt. Hierin zijn duidelijk twee pieken te zien; de ene afkomstig van beenmerg en de andere van bot. Aan beide pieken kan een Gaussische verdeling worden gefit waardoor het zeer duidelijk wordt dat er zich tussen beide een zone van overlap bevindt met voxels die niet eenduidig als beenmerg of bot geclassificeerd kunnen worden. Een threshold plaatsen op het histogram om de voxels met beenmerg van die met bot te scheiden, is dus niet zo eenvoudig. De oorzaak van deze overlap is te wijten aan het partial volume effect. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2-6. Voxels die zich op de scheidingslijn tussen twee verschillende materialen bevinden, zullen fracties van beide materialen bevatten waardoor de uiteindelijke grijswaarde in die voxels zal resulteren uit een combinatie van de lineaireattenuatiecoëfficiënten van die materialen. Hierdoor ontstaat een continuüm tussen de
16
pieken van de twee materialen in het histogram. Hoe hoger de resolutie van de CT-beelden, hoe minder dit partial volume effect een rol zal spelen.(32)
Figuur 2-5. Histogram van een osteofyt met Gauss-curves gefit aan de beenmerg- en de botpiek. Het histogram toont het aantal voxels, genormaliseerd op het totaal aantal voxels, in functie van de grijswaarde, uitgedrukt in arbitraire eenheden (a.e.). Aan de beenmerg- en botpiek werd een Gaussische verdeling gefit met standaarddeviaties aangegeven op de grafiek. De grijze zone is het gevolg van het partial volume effect.
Figuur 2-6. Schematische voorstelling van het partial volume effect. Voxels die enkel beenmerg bevatten zijn in deze figuur zwart, voxels die enkel bot bevatten wit. Voxels die beide materialen bevatten zullen echter een grijstint krijgen en zijn daardoor niet eenduidig te classificeren als beenmerg of bot.
Om nu een schatting te maken van de porositeit, wordt eerst de hoogte van de beenmergpiek en de botpiek, genormaliseerd op het totaal aantal voxels, bepaald. Aangezien de Gaussische verdelingen gefit aan deze pieken nagenoeg dezelfde standaarddeviatie hebben (zie figuur 2-5), mag aangenomen worden dat de piekhoogte van een materiaal rechtevenredig zal zijn met het percentage voxels dat dit materiaal bevat in het geval er geen partial volume effect is. Hieruit volgt dat de verhouding van de 17
genormaliseerde piekhoogte voor beenmerg tot de som van de piekhoogte voor beenmerg met deze voor bot een goede benadering zal vormen voor de porositeit.
2.2.5 Micro-CT-scans uitgevoerd bij Infinity Voorafgaand aan dit onderzoek waren de linker achterpoten reeds gescand aan het Infinity (INnovative Flemish IN-vivo Imaging TechnologY) lab, een preklinische onderzoeksfaciliteit van de Universiteit Gent, die naast CT ook andere beeldvormingmodaliteiten ter beschikking heeft zoals MRI, positron emissie tomografie (PET) en single photon emission CT (SPECT). Een belangrijk verschil met het UGCT op het vlak van CT is dat hier gewerkt wordt met commercieel beschikbare small animal scanners bedoeld voor in vivo beeldvorming. Dit laatste legt uiteraard belangrijke restricties op aan het dosistempo en de scanduur. Mede hierdoor is de beeldkwaliteit beter voor de scans uitgevoerd aan het UGCT. Een vergelijking wordt getoond in figuur 2-7. Anderzijds zijn dergelijke commerciële small animal scanners wel gekalibreerd, zodat de grijswaarden hier toch in HU worden uitgedrukt. De pootjes werden gescand met een GE Healthcare eXplore Locus SP micro-CT scanner (GE Medical Systems, London, Ontario). De buisspanning werd ingesteld op 80kV bij een buisstroom van 80µA. 500 projecties werden genomen over 200° met een totale belichtingstijd van 3s. De voxelgrootte bedroeg 8µm. Op basis van deze CT-beelden werd eveneens een kwalitatieve score voor botnieuwvorming toegekend aan de pootjes op dezelfde manier als beschreven in 2.2.4. De beeldkwaliteit van deze CT-scans was echter niet steeds optimaal wat de evaluatie van osteofytvorming bemoeilijkte. De scores van de beelden van het UGCT zijn dan ook meer betrouwbaar.
Figuur 2-7. Vergelijking van CT-beelden van scans uitgevoerd bij Infinity en bij het UGCT. Links: CT-doorsnede verkregen met een GE Healthcare eXplore Locus SP micro-CT scanner bij Infinity (voxelgrootte 8µm; 80kV; 0,24mAs). Rechts: CT-doorsnede verkregen met een zelfgebouwde scanner van het UGCT (voxelgrootte 6,5µm; 120kV; 334mAs)
18
2.3 Histologie Histologie werd uitgevoerd op de linker achterpoten die voordien gescand waren aan het Infinity lab. Voor de rechter achterpoten was dit namelijk niet meer mogelijk omwille van de contrastering met HgCl2. De pootjes werden gefixeerd in 4% formaldehyde en gedecalcifieerd in 0.5M ethyleendiaminetetra-azijnzuur. Vervolgens werden paraffinecoupes met een dikte van 7µm gemaakt waarop een haematoxyline-eosine(H&E)-kleuring werd toegepast om inflammatie, boterosies en osteofytvorming aan te tonen, en een safranine-haematoxylinekleuring waarmee kraakbeen kan geëvalueerd worden.
2.4 Statistiek Voor de statistische gegevensverwerking werd enerzijds gebruik gemaakt van het softwarepakket IBM SPSS Statistics 20. De niet-parametrische Mann-Whitney U-test werd toegepast om verschillen na te gaan tussen de TS en de NTS groep voor verschillende variabelen. De nulhypothese dat beide groepen gelijk zijn, wordt verworpen indien de tweezijdige P-waarde kleiner is dan 0,05. Om verbanden na te gaan tussen verschillende variabelen werd de niet-parametrische Spearman correlatiecoëfficiënt bepaald. Indien deze een significante positieve correlatie aantoonde – namelijk wanneer de tweezijdige P-waarde kleiner was dan 0,05 – werd vervolgens een lineaire regressieanalyse uitgevoerd. Hierbij werd de determinatiecoëfficiënt R² bepaald die, vermenigvuldigd met 100, aangeeft hoeveel procent van de totale variantie van de afhankelijke variabele verklaard kan worden door de onafhankelijke variabele. De P-waarde die bij de regressieanalyses wordt vermeld, geeft aan of het lineaire regressiemodel zinvol is. Dit is opnieuw het geval bij een P-waarde kleiner dan 0,05. Tot slot wordt de berekende richtingscoëfficiënt β meegegeven met bijhorende standaardafwijking en 95% confidentie-interval (CI). De P-waarde die hierbij wordt vermeld is het resultaat van de statistische test met nulhypothese dat β gelijk is aan nul. Dit is in feite dezelfde hypothese als deze die getest wordt bij het nagaan van de zinvolheid van het model. De P-waarden horende bij R² en bij β zullen dus gelijk zijn. Anderzijds werd voor de weergave van de verschillende grafieken, het fitten van data aan Gauss-curven en de grafische weergave van de lineaire regressieanalyses gebruik gemaakt van scripts geschreven met de programmeertaal Python.
19
3. Resultaten 3.1 Anatomie Figuur 3-1 toont enkele van de weinige afbeeldingen die terug te vinden zijn van de skeletstructuur van een muizenpoot (38), samen met een afbeelding van een humane voet ter vergelijking. Wat hier meteen opvalt is dat de fibula en tibia voor een gedeelte met elkaar vergroeid zijn over hun verloop. Verder blijkt dat de tarsalia van de muis grotendeels gelijklopend zijn met de humane anatomie. Voor de duidelijkheid – en in navolging met de meeste wetenschappelijke artikels – wordt hier gekozen om niet de benamingen van figuur 31, maar de gebruikelijke naamgeving uit de humane anatomie toe te passen. Het os fibulare, intermedium en centrale worden dan respectievelijk calcaneus, talus en os naviculare. De distale tarsalen 1 tot 3 komen overeen met het os cuneiforme 1 (mediale), 2 (intermedium) en 3 (laterale). De distale tarsalen 4 en 5 zijn gefusioneerd (39) en zijn het equivalent van het os cuboideum. Het os tibiale tenslotte is een extra bot dat bij de meeste mensen niet voorkomt. Het komt echter wel overeen met het os naviculare accessorium, een van de meest voorkomende accessoire voetwortelbeentjes (4-21%), ook gekend als het os tibiale externum of os naviculare secundarium.(40)
Figuur 3-1. Vergelijking skeletstructuur van een humane voet en een muizenpoot. Links: Dorsaal zicht op een humane rechtervoet. De rode stip duidt de meeste frequente locatie aan van het os naviculare accessorium. [overgenomen en aangepast uit http://www.oxford174.com/foot-anatomy-bones] Midden: Dorsaal zicht op een rechterpoot van een muis. Rechts: Zicht op de flexorzijde van de rechter tibia en fibula van een muizenpoot. [overgenomen uit (38)]
Figuur 3-2 toont het resultaat van de segmentatieoperaties van de verschillende botstructuren op de micro-CT-beelden van de wild-type referentiepoot. Hierop zijn alle voorgenoemde botstructuren terug te vinden. Echter het os naviculare en het os cuneiforme 3 blijken vergroeid. Om na te gaan of dit ook bij andere muizenpoten het geval is en of er mogelijks 20
nog andere fusies optreden, werd een gelijkaardige segmentatie uitgevoerd op een CT-scan van een CAIA muis met beperkte aantasting (zie figuur 3-3). Hier zijn het os naviculare en os cuneiforme 3 duidelijk aparte entiteiten. Bij verdere evaluatie van de overige CT-beelden, bleek uiteindelijk een dergelijke fusie aanwezig bij 9 van de 18 gescande rechterpoten en 8 van de 18 linkerpoten. Deze was slechts in 5 gevallen bilateraal. In een artikel van Davis et al. werd deze fusie tussen het os naviculare en os cuneiforme 3 reeds beschreven als zijnde regelmatig voorkomend bij wild-type muizen.(41) In figuur 3-3 wordt tot slot ook de vergroeiing tussen tibia en fibula geïllustreerd.
Figuur 3-2. 3D-rendering van de segementatie van de wild-type referentiepoot. (dorsaal zicht) Merk op dat het os naviculare en os cuneiforme 3 gefusioneerd zijn.
Figuur 3-3. 3D-rendering van de segmentatie van een CAIA poot met beperkte aantasting. Links: Dorsaal zicht waaruit blijkt dat er geen fusie is tussen het os naviculare en het os cuneiforme 3. Rechts: Fronto-lateraal zicht ter illustratie van de gedeeltelijke vergroeiing tussen tibia en fibula.
21
3.2 Botnieuwvorming 3.2.1 Kwalitatieve evaluatie van de graad van botnieuwvorming met micro-CT De botnieuwvorming kan duidelijk gevisualiseerd worden met behulp van micro-CT, zoals geïllustreerd in figuur 3-4.
Figuur 3-4. Visualisatie van botnieuwvorming met behulp van micro-CT. Links: 3D-rendering van een poot met duidelijke botersosies en –nieuwvorming. Rechts: Sagittale doorsnede door dezelfde poot met osteofyten zichtbaar ter hoogte van metatarsaal 5 en cuneiforme 3 (zie pijlen).
In tabel 3-1 worden de klinische scores en de kwalitatieve scores voor botnieuwvorming weergegeven. De totale klinische score is de som van de individuele klinische scores, elk gaande van 0 (geen artritis) tot 3, van de 4 poten van iedere muis. De klinische score van de achterpoten worden ook afzonderlijk meegegeven om deze te correleren aan de kwalitatieve botnieuwvormingscores bepaald aan de hand van de micro-CT-beelden. Zoals in paragraaf 2.2.5 vermeld, zijn de scores van de rechter achterpoot, geëvalueerd op basis van de scans uitgevoerd aan het UGCT, betrouwbaarder omwille van de hogere beeldkwaliteit. Merk op dat muis 5 geen artritis vertoonde, ook niet ter hoogte van de voorpoten. Eveneens opmerkelijk is dat op de CT-beelden van de rechter achterpoot van muis 13 zware erosieve destructie zichtbaar was (zie figuur 3-5), mogelijks ook (sub)luxaties zoals blijkt uit het zijaanzicht, hoewel klinisch de artritis als afwezig werd gescoord. Geen enkele van de andere poten vertoonde dergelijke uitgesproken boterosies. De linkerpoot vertoonde wel duidelijke aantasting, maar met een veel minder erosief karakter (beelden hier niet getoond).
22
Tabel 3-1. Overzicht van de totale klinische score, de individuele klinische scores voor de achterpoten en de scores voor botnieuwvorming bepaald aan de hand van de micro-CT-beelden voor de verschillende muizen.
Muis
TS/NTS*
Totale klinische score
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 15 16 17 18 19 20
TS TS TS TS TS TS TS TS NTS NTS NTS NTS NTS NTS TS TS NTS NTS
10 12 10 9 0 11 9 12 10 9 9 9 8 12 12 8 6 9
Klinische score rechter achterpoot 3 3 1 1 0 3 1 3 3 0 2 0 1 3 3 1 0 2
Klinische score linker achterpoot 1 3 3 2 0 2 2 3 1 3 1 3 1 3 3 1 0 1
Score botnieuwvorming rechts 2 3 0 0 0 2 0 2 3 0 1 2 0 3 2 0 0 3
Score botnieuwvorming links 0 1 1 1 0 1 0 1 0 2 0 2 2 1 2 0 0 0
* TS = tail suspended; NTS = non-tail suspended
Figuur 3-5. 3D-renderings van de rechterpoot van muis 13. Links: Dorsaal zicht waarop de erosieve destructie duidelijk zichtbaar is. Rechts: Lateraal zicht waarop, naast de prominente erosies, ook luxaties aanwezig lijken.
In wat volgt worden een aantal statistische analyses uitgevoerd op de data uit tabel 3-1. Klinische artritis en botnieuwvorming Met uitzondering van de rechterpoot van muis 13, werd bij alle poten waarvoor artritis als afwezig werd gescoord, ook geen botnieuwvorming waargenomen. Daarnaast lijken poten met een hogere artritis score meer botnieuwvorming te vertonen. Om na te gaan of er weldegelijk een correlatie is tussen beide, werd de Spearman correlatiecoëfficiënt bepaald. 23
Deze bedroeg 0,737 met een P-waarde kleiner dan 0,001 voor de rechter achterpoot en 0,726 met een P-waarde van 0,001 voor de linker achterpoot. Er is dus een sterk significante positieve correlatie tussen klinische artritis en botnieuwvorming. Het resultaat van de lineaire regressieanalyse wordt getoond in figuur 3-6 voor de rechter achterpoot en figuur 3-7 voor de linker achterpoot. Een overzicht van alle belangrijke parameters is weergegeven in tabel 3-2.
Figuur 3-6. Correlatie van botnieuwvorming met klinische artritis voor de rechter achterpoot. Het resultaat van de lineaire regressieanalyse is aangegeven op het scatterdiagram. R² = 0,57, p < 0,001
Figuur 3-7. Correlatie van botnieuwvorming met klinische artritis voor de linker achterpoot. Het resultaat van de lineaire regressieanalyse is aangegeven op het scatterdiagram. R² = 0,47, p = 0,002
24
Tabel 3-2. Overzicht resultaten lineaire regressieanalyse van de score voor botnieuwvorming in functie van klinische artritis voor de rechter en linker achterpoot. Poot
R²
P-waarde
Rechts Links
0,57 0,47
< 0,001 0,002
β 0,74 0,50
Richtingscoëfficiënt Standaardfout 95% CI 0,16 [0,40 – 1,08] 0,13 [0,22 – 0,79]
P-waarde < 0,001 0,002
Er is dus een duidelijk lineair verband tussen de graad van botnieuwvorming en de voorafgaande inflammatie. Vergelijking aantasting links en rechts In eerste instantie zou men verwachten dat zowel op vlak van inflammatie als botnieuwvorming de aantasting bilateraal gelijk is, aangezien artritis geïnduceerd wordt door systemische toediening van de ArthritomabTM Cocktail. Dit wordt hier nagegaan. De Spearman correlatiecoëfficiënt ter vergelijking van de artritis score tussen de linker- en de rechterpoot bedroeg 0,252 met een P-waarde van 0,313. Vergelijking van de botnieuwvormingscores leverde een correlatiecoëfficiënt op van -0,006 met een P-waarde van 0,981. Zowel wat betreft artritis als botnieuwvorming zijn de achterpoten dus significant verschillend. Een lineaire regressieanalyse heeft hier dan ook duidelijk geen zin. Dit impliceert tevens dat meetresultaten die slechts op één van beide poten werden uitgevoerd, niet mogen geëxtrapoleerd worden naar de andere poot. Biomechanische stress en botnieuwvorming Om de invloed van biomechanische stress te evalueren, wordt er nagegaan of er een verschil is in botnieuwvorming tussen de groep tail suspended (TS) muizen en de non-tail suspended (NTS) controlegroep. Aangezien botnieuwvorming in lineair verband staat met artritis, is het van belang eerst te controleren of de TS en NTS groep gelijk zijn wat betreft hun artritis score. De muizen werden namelijk gerandomiseerd op basis van de totale klinische score en niet die van de achterpoten afzonderlijk. In figuur 3-8 worden de box-and-whisker plots getoond van de artritis score voor de TS en NTS groep en dit voor beide achterpoten. Hieruit blijkt dat vooral voor de rechterpoot, maar in mindere mate ook voor de linkerpoot, in de TS groep hogere artritis scores voorkomen. Om na te gaan of de groepen significant verschilden werd de niet-parametrische Mann-Whitney U-test toegepast. Dit leverde voor de rechterpoot een P-waarde van 0,328 en voor de linkerpoot een P-waarde van 0,483 op. De TS en NTS groep zijn dus niet significant verschillend, maar zeker omwille van de 25
beperkte steekproefgrootte dient er toch rekening mee gehouden te worden dat de artritis score globaal hoger ligt bij de TS groep. Voor de rechterpoot kan dit omzeild worden door de artritis scores te groeperen in mineure artritis (score 0-1) en majeure artritis (score 2-3). In dit geval zijn de TS en NTS groep gelijk verdeeld wat betreft inflammatie. Voor de linkerpoot gaat dit niet op.
Figuur 3-8. Box-and-whisker plots van de klinische artritis score voor de NTS en TS groep. Links: linkerpoot. Rechts: rechterpoot.
In figuur 3-9 worden de box-and-whisker plots weergegeven van de botnieuwvormingscore voor de TS en NTS groep voor beide achterpoten. Botnieuwvorming lijkt iets beperkter bij de TS groep in vergelijking met de NTS, maar dit is niet significant. De Mann-Whitney Utest leverde P-waarden van 0,342 en 0,775 op voor de rechter en linker achterpoot respectievelijk.
Figuur 3-9. Box-and-whisker plots van de score voor botnieuwvorming voor de NTS en TS groep. Links: rechterpoot. Rechts: linkerpoot.
26
Zoals hierboven aangehaald, kan het interessant zijn om voor de rechterpoot een onderverdeling te maken naar mineure en majeure klinische artritis. Dit wordt getoond in figuur 3-10. Merk op dat voor de TS groep de scores voor de pootjes samenvallen binnen deze onderverdeling. Muizen uit de TS groep met mineure artritis, vertoonden geen botnieuwvorming. Toepassing van de Mann-Whitney U-test binnen de mineure en majeure artritis groepen resulteerde in P-waarden van 0,264 en 0,171 respectievelijk. Deze resultaten zijn dus nog steeds niet significant. Er dient echter wel opgemerkt te worden dat omwille van de verdere onderverdeling de aantallen binnen de groepen klein worden (4 à 5 pootjes per groep) en significantie dus moeilijker bereikt kan worden.
Figuur 3-10. Box-and-whisker plot van de score voor botnieuwvorming voor de NTS en TS groep, ingedeeld naargelang mineure (score 0-1) en majeure (score 2-3) klinische artritis. Merk op dat de scores binnen de TS groepen samenvallen waardoor de boxplot reduceert tot een lijn.
3.2.2 Kwantitatieve evaluatie van de graad van botnieuwvorming met micro-CT Zoals beschreven in de methodologie werden twee locaties uitgekozen waar het volume van de gevormde osteofyten werd gemeten. Er werd gekozen voor de dorsale zijde van het os cuneiforme 3 (zie figuur 3-11) en de plantaire zijde van het os naviculare (zie figuur 3-12).
Figuur 3-11. Osteofyt op de dorsale zijde van het os cuneiforme 3. Links: Sagittaal doorgesneden 3Drendering. Rechts: Sagittale CT-doorsnede waarop de ROI die de osteofyt omvat paars gekleurd werd.
27
Figuur 3-12. Osteofyt op de plantaire zijde van het os naviculare. Links: Sagittaal doorgesneden 3Drendering. Rechts: Sagittale CT-doorsnede waarop de ROI die de osteofyt omvat geel gekleurd werd.
De volumes werden enkel opgemeten aan de hand van de scans uitgevoerd aan het UGCT aangezien de kwaliteit van de andere beelden ontoereikend was om ROI’s rond de osteofyten uit de tekenen. In tabel 3-3 worden deze voor beide osteofyten weergegeven samen met een herhaling van de klinische score en botnieuwvormingscore van de rechter achterpoot. Daarnaast werden de volumes omgezet naar een volume score waarvan de verdeling onderaan de tabel is meegegeven. De onzekerheid op de volumes bedraagt 0,004 mm³. Tabel 3-3. Volumes en volumescore voor de naviculare en cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt van de rechterpoot van de verschillende muizen, inclusief een herhaling van de klinische score en kwantitatieve botnieuwvormingscore. Muis
TS/NTS*
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 15 16 17 18 19 20
TS TS TS TS TS TS TS TS NTS NTS NTS NTS NTS NTS TS TS NTS NTS
Klinische score achterpoot 3 3 1 1 0 3 1 3 3 0 2 0 1 3 3 1 0 2
Score botnieuwvorming 2 3 0 0 0 2 0 2 3 0 1 2 0 3 2 0 0 3
Volume naviculare osteofyt (mm³) 0,041 0,038 0,019 0,023 0,022 0,039 0,022 0,037 0,061 0,028 0,039 0,031 0,024 0,042 0,027 0,026 0,023 0,064
* TS = tail suspended; NTS = non-tail suspended *** scores naviculare osteofyt: 0 < 0,025 mm³ 1 0,025 mm³ < x < 0,040 mm³ 2 0,040 mm³ < x < 0,055 mm³ 3 > 0,055 mm3
** ****
28
Volume CF 3 osteofyt (mm³) 0,083 0,071 - ** 0,069 0,064 0,167 0,046 0,032 0,101 0,053 0,135
Volume score naviculare osteofyt *** 2 1 0 0 0 1 0 1 3 1 1 1 0 2 1 1 0 3
geen osteofyt waargenomen scores cuneiforme 3 osteofyt: 0 < 0,030 mm³ 1 0,030 mm³ < x < 0,070 mm³ 2 0,070 mm³ < x < 0,110 mm³ 3 > 0,110 mm³
Volume score CF 3 osteofyt **** 2 2 0 0 0 1 0 1 3 0 1 1 0 2 1 0 0 3
Merk op dat er ter hoogte van de dorsale zijde van het os cuneiforme 3 bij veel muizen met beperkte aantasting geen osteofyt werd waargenomen. Ook op de data uit tabel 3-3 werden een aantal statistische analyses uitgevoerd. Verband tussen beide opgemeten osteofytgroottes In eerste instantie werd nagegaan of er weldegelijk een correlatie is tussen de osteofytvolumes op beide meetplaatsen. De Spearman correlatiecoëfficiënt voor het verband tussen de volumes bedroeg 0,911 met een P-waarde kleiner dan 0,001. Voor de volume scores werd een correlatiecoëfficiënt van 0,883 bekomen opnieuw met een Pwaarde kleiner dan 0,001. Er is dus een zeer sterk significante positieve correlatie tussen de osteofytgrootte op het os naviculare en dat op het os cuneiforme 3 (CF 3). In figuur 3-13 wordt het resultaat van de lineaire regressieanalyse voor de volumes weergegeven. De parameters zijn samengevat in tabel 3-4 samen met de parameters van de regressieanalyse voor de volume scores (grafiek hier niet getoond).
Figuur 3-13. Correlatie van het volume van de osteofyt op het os naviculare met het volume van de osteofyt op het os cuneiforme 3 (CF 3). Het resultaat van de lineaire regressieanalyse is aangegeven op het scatterdiagram. R² = 0,91, p < 0,001; foutenvlag = 0,004 mm³ Tabel 3-4. Overzicht resultaten lineaire regressieanalyse van het volume en de volume score van de naviculare osteofyt in functie van het volume en de volume score van de CF 3 osteofyt.
Volumes Volume scores
R²
P-waarde
0,91 0,84
< 0,001 < 0,001
β 0,24 0,84
29
Richtingscoëfficiënt Standaardfout 95% CI 0,019 [0,202 – 0,282] 0,091 [0,653 – 1,037]
P-waarde < 0,001 < 0,001
Zoals verwacht is er dus een sterk significant lineair verband tussen de volumes van de osteofyten op verschillende locaties. Klinische artritis en osteofytgrootte Om na te gaan of er een verband is tussen de graad van inflammatie en het volume van de osteofyten werd de Spearman correlatiecoëfficiënt bepaald. Deze bedroeg 0,657 met een Pwaarde van 0,003 voor de osteofyt op het os naviculare en 0,810 met een P-waarde kleiner dan 0,001 voor de osteofyt op het os cuneiforme 3. Er is dus een sterk significante positieve correlatie tussen de grootte van de osteofyten en klinische artritis. De resultaten van de lineaire regressieanalyse voor beide osteofyten worden getoond in figuur 3-14 en figuur 3-15, met een overzicht van de parameters in tabel 3-5.
Figuur 3-14. Correlatie van het volume van de osteofyt op het os naviculare met klinische artritis. Het resultaat van de lineaire regressieanalyse is aangegeven. R² = 0,37, p = 0,008; foutenvlag = 0,004 mm³
Figuur 3-15. Correlatie van het volume van de osteofyt op het os cuneiforme 3 (CF 3) met klinische artritis. Het resultaat van de lineaire regressieanalyse is aangegeven. R² = 0,56, p = < 0,001; foutenvlag = 0,004 mm³
30
Tabel 3-5. Overzicht resultaten lineaire regressieanalyse van het osteofytvolume in functie van klinische artritis. Osteofyt
R²
P-waarde
Naviculare Cuneiforme 3
0,37 0,56
0,008 < 0,001
β 0,006 0,031
Richtingscoëfficiënt Standaardfout 95% CI 0,002 [0,002 – 0,011] 0,007 [0,016 – 0,045]
P-waarde 0,008 < 0,001
Er is dus een significant lineair verband tussen het volume van de gevormde osteofyten en de graad van voorafgaande inflammatie. Volledig analoog werd de correlatie onderzocht tussen de graad van inflammatie en de volume score. De Spearman correlatiecoëfficiënt bedroeg 0,621 met een P-waarde van 0,006 voor de naviculare osteofyt en 0,749 met een P-waarde kleiner dan 0,001 voor de CF 3 osteofyt, dus zoals verwacht opnieuw een significante positieve correlatie. De resultaten van de lineaire regressieanalyse zijn weergegeven in figuur 3-16 en tabel 3-6.
Figuur 3-16. Correlatie van de volume score van de osteofyten met klinische artritis. Links: Lineaire regressie voor de naviculare osteofyt. R² = 0,35, p = 0,01. Rechts: Lineaire regressie voor de cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt. R² = 0,50, p = 0,001.
Tabel 3-6. Overzicht resultaten lineaire regressieanalyse van volume score voor de osteofyten in functie van klinische artritis voor de rechter en linker achterpoot. Osteofyt
R²
P-waarde
Naviculare Cuneiforme 3
0,35 0,50
0,01 0,001
β 0,46 0,60
31
Richtingscoëfficiënt Standaardfout 95% CI 0,16 [0,13 – 0,80] 0,15 [0,28 – 0,92]
P-waarde 0,01 0,001
Biomechanische stress en osteofytgrootte Figuur 3-17 geeft de box-and-whisker plots weer van de volumes van de osteofyten voor de NTS en TS groep. De volumes van de naviculare osteofyt lijken globaal lager te liggen in de TS groep. Voor de CF 3 osteofyt is dat minder duidelijk.
Figuur 3-17. Box-and-whisker plots van de volumes van de osteofyten voor de NTS en TS groep. Links: naviculare osteofyt. Rechts: cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt.
De nulhypothese dat beide groepen uit dezelfde populatie afkomstig zijn moet getest worden. De volumes van de naviculare osteofyt waren min of meer Gaussisch verdeeld. Voor de volumes van de CF 3 osteofyt was dat echter niet het geval. (grafieken hier niet getoond) Bovendien leverde de Levene’s test, waarmee wordt nagegaan of beide steekproefvarianties gelijkwaardig zijn, een P-waarde van 0,103 voor de naviculare osteofyt en 0,078 voor de CF 3 osteofyt. Er kan dus maar nipt aangetoond worden dat er geen significant verschil is tussen beide varianties. Aangezien de voorwaarden voor de parametrische Student’s t-test slechts beperkt vervuld zijn, werd gekozen voor de nietparametrische Mann-Whitney U-test als hypothesetest. Voor het volume van de naviculare osteofyt leverde dat een P-waarde op van 0,091. De nulhypothese kan dus net niet verworpen worden. Verwacht wordt dat bij een toename van de steekproefgrootte significantie wel bereikt kan worden. Voor het volume van de CF 3 osteofyt bedroeg de Pwaarde echter 0,486 en is er dus geen significant verschil tussen de TS en NTS groep, wat reeds uit de box plot kon afgeleid worden. Dat dit gedrag anders is dan voor de volumes van de naviculare osteofyt, ondanks de sterke correlatie tussen beide, heeft wellicht te maken met het feit dat bij 8 van de 18 muizen geen CF 3 osteofyt waarneembaar was. Figuur 3-18 toont de box-and-whisker plots van de volume scores voor beide osteofyten voor de TS en NTS groep. Toepassing van de Mann-Whitney U-test leverde voor de naviculare osteofyt een P-waarde van 0,217 en voor de CF 3 osteofyt een P-waarde van 32
0,370. Ook in dit geval is er dus geen significant verschil tussen de TS en de NTS groep wat betreft osteofytvolume.
Figuur 3-18. Box-and-whisker plots van de volume scores van de osteofyten voor de NTS en TS groep. Links: naviculare osteofyt. Rechts: cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt.
Aangezien tot nog toe geen significantie bereikt werd, werden de groepen verder opgesplitst volgens mineure en majeure klinische artritis om de verschillen in klinische score tussen beide groepen min of meer weg te werken. In figuur 3-19 en 3-20 worden de box-and-whisker plots van de volumes en de volume scores getoond volgens deze onderverdeling. Op het eerste zicht lijken de TS en NTS groep hier wel verschillend. Toepassing van de Mann-Whitney U-test, waarvan de P-waarden zijn opgenomen in tabel 3-7, leert echter dat enkel het volume van de naviculare osteofyt binnen de majeure klinische artritis groep significant verschillend is tussen de TS en NTS groep. De kleine aantallen binnen de verschillende groepen spelen hierin een belangrijke rol.
Figuur 3-19. Box-and-whisker plot van de volumes van de osteofyten voor de NTS en TS groep, ingedeeld naargelang mineure (score 0-1) en majeure (score 2-3) klinische artritis. Links: naviculare osteofyt. Rechts: Cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt.
33
Figuur 3-20. Box-and-whisker plot van de volume scores van de osteofyten voor de NTS en TS groep, ingedeeld naargelang mineure (score 0-1) en majeure (score 2-3) klinische artritis. Links: naviculare osteofyt. Rechts: Cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt. Bemerk dat veel scores binnen de TS groep samenvallen waardoor de boxplot tot een lijn reduceert.
Tabel 3-7. Overzicht van de P-waarden bekomen na toepassing van de Mann-Whitney U-test op verschillende testvariabelen binnen de mineure en de majeure artritis subgroep. Testvariabele Volume naviculare osteofyt Volume CF 3 osteofyt Volume score naviculare osteofyt Volume score CF 3 osteofyt
P-waarde mineure artritis subgroep 0,050 0,264 0,371 0,264
P-waarde majeure artritis subgroep 0,027* 0,221 0,078 0,150
* significant, want P < 0,05
Zowel wat betreft de kwalitatieve als de kwantitatieve graad van botnieuwvorming is er tot hiertoe dus nog nauwelijks een significant verschil aangetoond tussen de TS en de NTS groep. Dit is wellicht te wijten aan een combinatie van enerzijds de beperkte steekproefgroottes en anderzijds het feit dat de groepen niet volledig gelijk verdeeld zijn volgens hun artritis score. De TS groep heeft ietwat hogere artritis scores, en hoewel dit niet significant is, kan dit wel een rol gaan spelen bij dergelijke kleine groepen. Gezien het lineair verband tussen artritis en botnieuwvorming, wordt er in deze groep meer osteofytvorming verwacht. Anderzijds is het doel van dit onderzoek na te gaan of biomechanische stress aanleiding geeft tot meer botnieuwvorming. De TS en NTS groep zullen in dit geval globaal naar elkaar toe bewegen waardoor het niet eenvoudig is een significant verschil tussen beide aan te tonen. Om het gedrag ten gevolge van de artritis los te koppelen, werd een differentiële score ingevoerd, waarbij de klinische score wordt afgetrokken van de volume score. Omwille 34
van de sterke positieve correlatie tussen artritis en botnieuwvorming (Spearman correlatiecoëfficiënt tussen 0,7 en 0,8) wordt hierdoor het effect van de artritis geëlimineerd. Aangezien de artritis score een kwalitatieve maat is die een rangorde toekent aan de pootjes, is het hiervoor wel van belang de volumes om te zetten in een gelijkaardige rangorde, waarbij de aantallen horende bij de verschillende graden gelijk zijn. Er werd daarom een aangepaste volume score geïntroduceerd, waarbij op basis van de opgemeten volumes scores werden toegekend, zodat er net als bij de klinische score 7 pootjes score 3, 2 pootjes score 2, 5 pootjes score 1 en 4 pootjes score 0 kregen. Dit alles is opgenomen in tabel 3-8. Tabel 3-8. Overzicht van de klinische score, volumes, aangepaste volume scores en differentiële scores voor de naviculare en cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt van de rechterpoot van de verschillende muizen.
Muis
TS/ NTS*
Klinische score achterpoot
Volume naviculare osteofyt (mm³)
Volume CF 3 osteofyt (mm³)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 15 16 17 18 19 20
TS TS TS TS TS TS TS TS NTS NTS NTS NTS NTS NTS TS TS NTS NTS
3 3 1 1 0 3 1 3 3 0 2 0 1 3 3 1 0 2
0,041 0,038 0,019 0,023 0,022 0,039 0,022 0,037 0,061 0,028 0,039 0,031 0,024 0,042 0,027 0,026 0,023 0,064
0,083 0,071 0,069 0,064 0,167 0,046 0,032 0,101 0,053 0,135
Aangepaste volume score naviculare osteofyt 3 3 0 0 0 3 0 2 3 1 3 2 1 3 1 1 1 3
Aangepaste volume score CF 3 osteofyt
Differentiële score naviculare osteofyt
Differentiële score CF 3 osteofyt
3 3 0 0 0 3 0 3 3 1 2 1 1 3 2 1 1 3
0 0 -1 -1 0 0 -1 -1 0 1 1 2 0 0 -2 0 1 1
0 0 -1 -1 0 0 -1 0 0 1 0 1 0 0 -1 0 1 1
* TS = tail suspended; NTS = non-tail suspended
De differentiële score is voor alle muizen uit de TS groep negatief of gelijk aan nul, terwijl bij de NTS groep enkel scores groter of gelijk aan nul terug te vinden zijn en dit voor beide osteofyten. Dit wordt grafisch weergegeven met behulp van box-and-whisker plots in figuur 3-21. Toepassing van de Mann-Whitney U-test leverde een P-waarde van 0,002 voor de naviculare osteofyt en een P-waarde van 0,006 voor de CF 3 osteofyt. De TS en NTS groep zijn in dit geval dus significant verschillend, waarbij de TS groep een overwegend negatieve en de NTS groep een overwegend positieve tendens vertoont. 35
Figuur 3-21. Box-and-whisker plots van de differentiële scores van de osteofyten voor de NTS en TS groep. Links: naviculare osteofyt. Rechts: cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt.
Op basis van deze differentiële score kan met enige voorzichtigheid besloten worden dat de TS groep minder botnieuwvorming vertoont dan de NTS groep na loskoppelen van de invloed van de klinische artritis. Het lijkt er dus op dat biomechanische stress inderdaad aanleiding zal geven tot grotere osteofyten. Porositeit van de osteofyten Naast het volume is de porositeit van het nieuwgevormde bot een tweede parameter die van belang kan zijn voor de beschrijving van het botnieuwvormingsproces. De porositeit is een maat voor de hoeveelheid poriën aanwezig in het bot en is gelijk aan de fractie van het volume van het beenmerg op het totale volume. Hoe hoger de porositeit van een osteofyt, hoe minder bot erin vervat zit. Het volume alleen is dus onvoldoende als beschrijvende parameter voor de osteofytvorming. Hier zal worden nagegaan of de porositeit in verband gebracht kan worden met de graad van inflammatie, botnieuwvorming en biomechanische stress. De porositeit van de osteofyten wordt bepaald aan de hand van micro-CT door de verhouding te nemen van de genormaliseerde piekhoogte van de beenmergvoxels in het histogram tot de som van de genormaliseerde piekhoogtes van de beenmerg- en botvoxels. Deze genormaliseerde piekhoogtes en de overeenkomstige porositeit zijn opgenomen in tabel 3-9 voor beide osteofyten. Merk op dat poot 13 een sterke uitschieter is op vlak van porositeit. Dit heeft wellicht te maken met het sterk erosieve karakter van de botaantasting waardoor er in verhouding veel minder botbevattende voxels aanwezig zijn.
36
Tabel 3-9. Overzicht van de genormaliseerde piekhoogtes uit het histogram van de beenmerg- en botbevattende voxels en de hieruit berekende porositeit voor de naviculare en cuneiforme 3 (CF 3) osteofyt van de rechterpoot van de verschillende muizen. Muis
TS/NTS*
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 15 16 17 18 19 20
TS TS TS TS TS TS TS TS NTS NTS NTS NTS NTS NTS TS TS NTS NTS
Piekhoogte BM naviculare osteofyt 0,0112 0,00574 0,00848 0,0109 0,00985 0,0203 0,0145 0,0268 0,0305 0,00878 0,0368 0,0246 0,00531 0,0163 0,00895 0,0113 0,0102 0,0176
Piekhoogte bot naviculare osteofyt 0,0700 0,0227 0,0280 0,0280 0,0291 0,0680 0,0798 0,0505 0,0591 0,0271 0,0570 0,0130 0,0233 0,0607 0,0251 0,0286 0,0267 0,0670
Porositeit naviculare osteofyt 0,138 0,202 0,232 0,280 0,253 0,230 0,154 0,347 0,340 0,245 0,392 0,654 0,186 0,212 0,263 0,283 0,276 0,208
Piekhoogte BM CF 3 osteofyt 0,0193 0,00658 0,0217 0,0309 0,0210 0,0304 0,0244 0,0166 0,00959 0,0234
Piekhoogte bot CF 3 osteofyt 0,0646 0,0192 0,0599 0,0499 0,0665 0,0819 0,0107 0,0628 0,0220 0,0574
Porositeit CF 3 osteofyt 0,230 0,255 0,266 0,382 0,240 0,271 0,695 0,209 0,304 0,290
* TS = tail suspended; NTS = non-tail suspended
De correlatie tussen de porositeit en de klinische score, de kwalitatieve score voor botnieuwvorming, het volume en de volume score werd onderzocht voor de naviculare osteofyt. De CF 3 osteofyt werd buiten beschouwing gelaten aangezien die bij veel muizen afwezig was. Figuren 3-22 en 3-23 geven voor al deze situaties het scatterdiagram weer. In tabel 3-10 werden de verschillende Spearman correlatiecoëfficiënten en hun bijhorende Pwaarde opgenomen.
Figuur 3-22. Scatterdiagram van de porositeit van de naviculare osteofyt in functie van de klinische artritis score (rechts) en de kwalitatieve score voor botnieuwvorming (links).
37
Figuur 3-23. Scatterdiagram van de porositeit van de naviculare osteofyt in functie van het volume (rechts) en de volume score van deze osteofyt (links). Tabel 3-10. Overzicht van de Spearman correlatiecoëfficiënten met bijhorende P-waarden voor de correlatie van de porositeit van de naviculare osteofyt met 4 andere parameters. Correlatie van de porositeit van de naviculare osteofyt met Klinische score Score botnieuwvorming Volume naviculare osteofyt Volume score naviculare osteofyt
Spearman correlatiecoëfficiënt
P-waarde
-0,197 0,006 -0,009 0,022
0,434 0,983 0,971 0,931
Tot slot wordt nog de invloed van biomechanische stress op de porositeit nagegaan. Figuur 3-24 toont de box-and-whisker plots van de porositeit van beide osteofyten voor de TS en NTS groep. Hierop lijkt er geen duidelijk verschil tussen beide groepen. Dit wordt bevestigd door toepassing van de Mann-Whitney U-test die een P-waarde van 0,424 voor de naviculare osteofyt en een P-waarde van 0,676 voor de CF 3 osteofyt opleverde.
Figuur 3-24. Box-and-whisker plots van de porositeit voor de NTS en TS groep. Links: naviculare osteofyt. Rechts: CF 3 osteofyt.
38
Het is duidelijk dat de porositeit niet afhankelijk is van de graad van inflammatie, de hoeveelheid botnieuwvorming, de osteofytgrootte en de graad van biomechanische stress. Het is dus gerechtvaardigd om in dit onderzoek de botnieuwvorming enkel aan de hand van de volumes van de osteofyten te beschrijven en de porositeit buiten beschouwing te laten.
3.3 Enthesen 3.3.1 Uitwerking contrasteringsprotocol In eerste instantie wordt hier nagegaan hoe lang de pootjes ondergedompeld moeten worden in de contrastvloeistof om een optimale visualisatie van pezen en ligamenten, en bijgevolg de enthesen toe te laten. Figuur 3-25 toont de resultaten na 2, 3 en 4 dagen onderdompeling in een waterige HgCl2-oplossing met een concentratie van 4%, samen met een niet gecontrasteerde referentiepoot ter vergelijking. Het is meteen duidelijk dat contrastering noodzakelijk is om de verschillende zachte weefsel structuren te kunnen visualiseren. Het effect van een verschillende contrasteringsduur is iets minder duidelijk. Het lijkt er wel op dat de structuren in de voet zelf na 3 dagen (figuur 3-25C) iets beter zichtbaar zijn dan na 2 dagen (figuur 3-25B). Verder lijkt er na 4 dagen (figuur 3-25D) wat meer precipitatie van de contraststof te zijn. Er werd dan ook geopteerd voor een contrasteringsduur van 3 dagen, hoewel de verschillen minimaal zijn.
Figuur 3-25. CT-doorsneden ter vergelijking van de invloed van verschillende contrasteringstijden met een waterige HgCl2-oplossing met een concentratie van 4%. A: niet gecontrasteerde referentiepoot. B: 2 dagen contrastering. C: 3 dagen contrastering. D: 4 dagen contrastering.
39
Daarnaast werd nagegaan of directe injectie van de contrastvloeistof in de poot nog tot verbetering kon leiden. Met een fijne naald werd op twee plaatsen in de voetzool enkele milliliter contraststof ingespoten. Nadien werden de pootjes nog gedurende 3 dagen ondergedompeld in de vloeistof. De resultaten worden getoond in figuur 3-26. Hieruit blijkt er geen duidelijke invloed zichtbaar van de injectie met contraststof. Als optimaal contrasteringsprotocol werd dus gekozen voor een contrasteringsduur van 3 dagen zonder rechtstreekse injectie van contraststof. Merk tot slot op dat de aanwezige witte stippen op de CT-beelden een gevolg zijn van neerslag van contraststof.
Figuur 3-26. CT-doorsneden ter vergelijking van de invloed van directe injectie van contrastvloeistof (een waterige HgCl2-oplossing met een concentratie van 4%) in de voet. A: referentiepoot met 3 dagen contrastering zonder injectie van contraststof. B en C: 2 pootjes met injectie van contraststof en nadien 3 dagen contrastering.
3.3.2 Enthesen en botnieuwvorming Door het toepassen van contraststoffen is het mogelijk de pezen en ligamenten te visualiseren en zo de (functionele) enthesen min of meer te lokaliseren met micro-CT. Uit de CT-beelden van de verschillende pootjes blijkt dat de osteofyten inderdaad hoofdzakelijk gevormd worden ter hoogte van deze plaatsen van verhoogde biomechanische stress. Figuur 3-27 toont een coupe doorheen een 3D-rendering van een sterk aangetaste muis (zowel op vlak van artritis als op vlak van botnieuwvorming) uit de TS groep waarbij de naviculare en CF 3 osteofyt zijn aangeduid met de omgevende peesstructuren die daar lijken aan te hechten en zo een enthesis vormen, of daar toch in elk geval in onmiddellijk contact staan met het bot en in dit laatste geval een functionele enthesis vormen. Figuur 3-28 toont een detailbeeld hiervan op 40
een gewone CT-doorsnede. Figuur 3-29 toont een gelijkaardig detailbeeld van een sterk aangetaste muis (opnieuw zowel wat betreft artritis als botnieuwvorming) uit de NTS groep.
Figuur 3-27. Coupe doorheen een 3D-rendering van een sterk aangetaste TS muis na contrastering met aanduiding van de osteofyten en de bijhorende enthesen. Rechts: naviculare osteofyt. Links: CF 3 osteofyt.
Figuur 3-28. Sagittale CT-doorsnede van een sterk aangetaste TS muis na contrastering met aanduiding van de osteofyten en de bijhorende enthesen. Rechts: naviculare osteofyt. Links: cuneiforme 3 osteofyt.
Figuur 3-29. Sagittale CT-doorsnede van een sterk aangetaste NTS muis na contrastering met aanduiding van de osteofyten en de bijhorende enthesen. Rechts: naviculare osteofyt. Links: cuneiforme 3 osteofyt.
41
3.4 Histologie De kwaliteit van de histologische coupes was ondermaats en zeker onvoldoende om betrouwbare scores toe te kennen voor botnieuwvorming en inflammatie. Dit is te wijten aan de voorafgaande beeldvorming, waarbij de weefsels ondanks preservatietechnieken en constante bevochtiging toch wat uitdrogen gedurende de CT-scan. Hierdoor gaat de kwaliteit sterk achteruit en worden de weefsels brozer, wat nefast is voor de volgende stappen van decalcificatie, paraffinering, snijden en kleuren. Er werd daarom gekozen om hier enkel ter illustratie enkele van de betere beelden te tonen (zie figuur 3-30), maar verder werden de histologische gegevens niet gebruikt voor analyse en besluitvorming.
Figuur 3-30. Histologische coupes na haematoxyline-safranine-kleuring waarbij de overgang getoond wordt tussen twee middenvoetsbeentjes. A: controle muis. B: NTS muis. C: TS muis. De pijlen duiden de osteofytvorming aan.
42
4. Discussie In tegenstelling tot RA dat zijn oorsprong vindt ter hoogte van de synoviale membraan, zijn er voor SpA steeds meer argumenten dat de ziekte primair ontstaat ter hoogte van de enthesen, waarbij er wel een belangrijke functionele relatie bestaat met het synovium (cfr. het concept SEC). Binnen het enthesitis-gebaseerd model voor de pathogenese van SpA wordt aangenomen dat zowel biomechanische stressfactoren als inflammatoire factoren een rol spelen.(9) Enthesen zijn bijzonder onderhevig aan biomechanische stress en indien er hierdoor schade ontstaat, zal dit aanleiding kunnen geven tot een geassocieerde inflammatoire respons in het aangrenzende synovium.(7, 10) In een studie toegepast op TNF∆ARE muizen werd aangetoond dat indien de achterpoten van de muizen werden ontlast door middel van tail suspension, het ontstaan van enthesitis ter hoogte van de Achillespees kon verhinderd worden. Hierbij werd gesuggereerd dat biomechanische stress eerder fungeert als een aan/uit knop zonder dat er een lineaire relatie hoeft te zijn tussen de hoeveelheid biomechanische stress en de graad van inflammatie. Botnieuwvorming kon hier niet bestudeerd worden aangezien het TNF∆ARE muismodel gebruikt werd.(21) In het huidig onderzoek werd gebruik gemaakt van het CAIA muismodel zodat botnieuwvorming wel onderzocht kon worden. Een belangrijk verschil is dat de muizen pas ontlast werden nadat een duidelijke klinische artritis werd bereikt. Op deze manier wordt enkel de invloed van biomechanische stress op botnieuwvorming onderzocht en wordt de invloed op het ontstaan van inflammatie buiten beschouwing gelaten.
Zowel wat de graad van inflammatie als de botnieuwvorming betreft, bleek er geen significante correlatie tussen de linker en rechter achterpoot. Het is dus verkeerd te veronderstellen dat de aantasting bilateraal gelijk is, ondanks het feit dat artritis geïnduceerd werd door systemische toediening van de ArthritomabTM Antilichaam Cocktail. Dit betekent ook dat verbanden tussen de verschillende meetresultaten en scores enkel kunnen nagegaan worden indien die bepaald werden voor eenzelfde poot. Extrapolatie van meetgegevens naar de andere poot is niet mogelijk. Dit heeft belangrijke implicaties voor de randomisatie van de muizen in de NTS en TS groep. Voor dit onderzoek gebeurde die op basis van de totale klinische score, wat achteraf geen ideale keuze bleek te zijn. Voornamelijk voor de rechter achterpoot vertoonde de TS groep namelijk ietwat hogere scores voor artritis dan de NTS groep. Omwille van de beperkte 43
steekproefgrootte was dit verschil nog niet significant. Indien echter, puur illustratief, de aantallen binnen de groepen verdrievoudigd worden volgens deze verdeling blijkt binnen de TS groep de artritis score wel significant hoger. Dit is een belangrijk aspect waarmee rekening dient gehouden te worden bij interpretatie van de resultaten. Een volledig correcte randomisatie van de muizen kan dus enkel gebeuren voor één achterpoot afzonderlijk, waarbij de andere buiten beschouwing wordt gelaten.
Er blijkt een belangrijke correlatie te zijn tussen de graad van inflammatie en de botnieuwvorming. Zowel de kwalitatieve score voor botnieuwvorming als de opgemeten osteofytvolumes vertoonden een significant lineair verband met de klinische artritis score (R² variërend tussen 0,4 en 0,6). Naarmate de inflammatie meer uitgesproken was, trad er meer botnieuwvorming op met vorming van grotere osteofyten. Een dergelijke associatie tussen inflammatie en ankylose werd reeds gesuggereerd door Maksymowych et al.. Zij observeerden dat syndesmofyten zich vaker vormden op plaatsen waar voordien op basis van MRI inflammatie werd vastgesteld.(42) Dit werd ook in andere studies waargenomen, hoewel syndesmofyten zich ook vaak ontwikkelden op locaties waar bij aanvang geen inflammatie werd gezien op MRI. De relatie tussen inflammatie en ankylose is dus niet zo eenduidig en nog onvoldoende begrepen.(43, 44) Anderzijds zou men op basis van deze correlatie tussen artritis en botnieuwvorming kunnen suggereren dat preventie van inflammatie het proces van ankylose zou kunnen vertragen. Dit strookt met de bevinding dat een continue behandeling met NSAIDs de radiografische progressie bij patiënten met AS kon verminderen.(19, 45, 46) Ook langdurige en/of vroegtijdige behandeling met anti-TNF therapie zou in staat zijn radiografische progressie af te remmen.(17, 18) Ondanks een duidelijke vermindering van de ziekte-activiteit, blijkt het effect van anti-TNF behandeling op botnieuwvorming minder duidelijk. Zo bleek er geen invloed van TNF antagonisten op radiografische progressie in studies met een duur van 2 jaar.(14-16) Dit kan te wijten zijn aan het feit dat TNF via DKK-1 als een rem kan werken op botnieuwvorming, zodat anti-TNF behandeling deze inhiberende invloed wegneemt. Anderzijds verhindert anti-TNF therapie de ontwikkeling van nieuwe inflammatoire laesies, waardoor op lange termijn radiografische progressie wel onderdrukt kan worden.(42) Een andere implicatie van deze belangrijke correlatie is dat botnieuwvorming wellicht niet of slechts minimaal zal optreden indien de muizen al van bij aanvang ontlast worden. Er werd immers aangetoond dat het ontstaan van enthesitis kon verhinderd worden door
44
ontlasting.(21) Op deze manier speelt biomechanische stress alvast onrechtstreeks een rol in het proces van botnieuwvorming.
In dit onderzoek werd de rol van biomechanische stress op botnieuwvorming onderzocht door een aantal parameters voor botnieuwvorming te vergelijken tussen de TS en NTS groep. Er werd echter geen significant verschil waargenomen tussen beide groepen en dit zowel wat betreft de kwalitatieve botnieuwvorming (p = 0,342 voor de rechterpoot) als de eigenlijke opgemeten osteofytgroottes (p = 0,091 voor de naviculare osteofyt en p = 0,486 voor de CF 3 osteofyt). Voor het volume van de naviculare osteofyt wordt significantie echter bijna bereikt wat gezien de beperkte steekproefgrootte mogelijk toch kan wijzen op een effect van ontlasting. Dat dit niet geldt voor de CF 3 osteofyt, ondanks het sterke lineaire verband (R² = 0,91) tussen beide osteofytgroottes, heeft te maken met het feit dat de CF 3 osteofyt slechts zichtbaar was bij 10 van de 18 muizen. Deze osteofyt treedt dus pas op bij een hogere graad van aantasting in tegenstelling tot de naviculare osteofyt die reeds bij beperkte aantasting aanwezig is. Aangezien de klinische scores in de TS groep globaal (doch net niet significant) iets hoger liggen dan in de NTS groep, wordt in deze groep omwille van het lineair verband tussen artritis en botnieuwvorming, meer botnieuwvorming verwacht. Anderzijds is het de bedoeling na te gaan of biomechanische stress aanleiding zal geven tot meer botnieuwvorming. De TS en de NTS groep zullen in dat geval netto ongeveer hetzelfde resultaat geven op vlak van botnieuwvorming en verschillen tussen beide groepen zullen moeilijk aantoonbaar zijn. Om de invloed van de verschillen in klinische score tussen de TS en de NTS groep enigszins weg te werken werden de groepen verder onderverdeeld in mineure (klinische score 0-1) en majeure (klinische score 2-3) artritis. De P-waarden lagen in dit geval een stuk lager, vooral binnen de subgroep majeure artritis, maar significantie werd enkel bereikt voor het volume van de naviculare osteofyt (p = 0,027 voor majeure artritis, p = 0,050 voor mineure artritis). Dat significantie in dit geval nog steeds niet bereikt wordt, heeft vooral te maken met de beperkte groottes van de verschillende groepen. Een andere manier om rekening te houden met de verschillen in klinische artritis tussen de TS en de NTS groep, zonder de groepen verder op te delen, is door het invoeren van een differentiële score, waarbij de klinische score wordt afgetrokken van de aangepaste volume score. Op deze manier wordt de invloed van de klinische artritis losgekoppeld van de botnieuwvorming. Dit leverde wel significante verschillen op tussen de TS en de NTS groep (p = 0,002 voor de naviculare osteofyt, p = 0,006 voor de CF 3 osteofyt). Met enige 45
voorzichtigheid kan hieruit besloten worden dat biomechanische stress aanleiding zal geven tot grotere osteofyten en dus meer botnieuwvorming.
Naast de osteofytgrootte werd ook de porositeit van de osteofyten onderzocht als parameter voor de beschrijving van het botnieuwvormingsproces. Hoe hoger de porositeit van een osteofyt, hoe minder bot erin vervat zit. Het is dus de combinatie van het volume en de porositeit die de eigenlijke hoeveelheid botnieuwvorming zal beschrijven. Anderzijds zal tail suspension gedurende 28 dagen ook aanleiding geven tot osteopenie met afname van de botmassa en -densiteit.(29, 47) Dit kan dus ook een weerslag hebben op de porositeit. Er werd in dit onderzoek echter geen verband aangetoond tussen de porositeit en de graad van inflammatie, de kwalitatieve score voor botnieuwvorming en de osteofytgrootte. Er waren ook geen significante verschillen in porositeit van de osteofyten tussen de TS en NTS groep, dus biomechanische stress lijkt geen rol te spelen. Het is dan ook gerechtvaardigd om hier de botnieuwvorming enkel aan de hand van de volumes van de osteofyten te beschrijven en de porositeit buiten beschouwing te laten.
Verder was het voor dit onderzoek ook de bedoeling de enthesen te visualiseren op de microCT-beelden om na te gaan of botnieuwvorming voornamelijk op deze plaatsen van verhoogde biomechanische stress optreedt. Hiervoor was het noodzakelijk de pootjes te contrasteren. Er werd gebruik gemaakt van een waterige HgCl2-oplossing met een concentratie van 4%.(37) Er werden nog enkele testen uitgevoerd op pootjes van wild-type muizen om het optimale contrasteringsprotocol uit te werken. Een contrasteringsduur van 3 dagen bleek optimaal en directe injectie van contrastvloeistof in de pootjes bracht geen duidelijke verbetering met zich mee. Uit de CT-beelden van de verschillende pootjes bleek dat de osteofyten inderdaad hoofdzakelijk gevormd worden ter hoogte van de enthesen. Aangezien enthesen in bijzondere mate onderhevig zijn aan repetitieve biomechanische stress, kan deze bevinding gezien worden als een extra illustratie van de invloed van biomechanische factoren op botnieuwvorming.
Samengevat blijkt er dus vooral een belangrijke significante correlatie tussen klinische artritis en botnieuwvorming. Aangezien biomechanische stress een rol speelt in het ontstaan van inflammatie, heeft het zo alvast onrechtstreeks een invloed op de graad van botnieuwvorming.
46
Een rechtstreekse invloed van biomechanische stress door vergelijking van verschillende variabelen tussen de TS en NTS groep, kon hier echter niet worden aangetoond. De gegevens lijken er echter globaal wel op te wijzen dat biomechanische stress aanleiding zal geven tot meer botnieuwvorming en grotere osteofyten, maar enerzijds omwille van de beperkte steekproefgrootte en anderzijds omwille van de minder goede randomisatie kon significantie niet bereikt worden. Voor toekomstige studies is het dan ook aan te raden om de steekproef te vergroten en het onderzoek en de randomisatie te beperken tot één poot. Tot slot toonden de micro-CT-beelden aan dat botnieuwvorming voornamelijk optreedt ter hoogte van enthesen en dus plaatsen van verhoogde biomechanische stress, wat eveneens suggereert dat er een rol is voor biomechanische stress in het ontstaan van botnieuwvorming.
47
5. Referentielijst 1. 2.
3. 4. 5.
6. 7.
8. 9.
10. 11.
12.
13. 14.
15.
16.
17.
18.
19.
20. 21.
22.
Sieper J, Rudwaleit M, Khan MA, Braun J. Concepts and epidemiology of spondyloarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2006 Jun;20(3):401-17. Sieper J, Rudwaleit M, Baraliakos X, Brandt J, Braun J, Burgos-Vargas R, et al. The Assessment of SpondyloArthritis international Society (ASAS) handbook: a guide to assess spondyloarthritis. Ann Rheum Dis. 2009 Jun;68 (Suppl II):ii1-44. Baraliakos X, Braun J. Spondyloarthritides. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2011 Dec;25(6):825-42. Ehrenfeld M. Spondyloarthropathies. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2012 Feb;26(1):135-45. Braun J, Bollow M, Remlinger G, Eggens U, Rudwaleit M, Distler A, et al. Prevalence of spondylarthropathies in HLA-B27 positive and negative blood donors. Arthritis Rheum. 1998 Jan;41(1):5867. McGonagle D, Gibbon W, Emery P. Classification of inflammatory arthritis by enthesitis. Lancet. 1998 Oct 3;352(9134):1137-40. McGonagle D, Lories RJ, Tan AL, Benjamin M. The concept of a "synovio-entheseal complex" and its implications for understanding joint inflammation and damage in psoriatic arthritis and beyond. Arthritis Rheum. 2007 Aug;56(8):2482-91. Benjamin M, McGonagle D. The anatomical basis for disease localisation in seronegative spondyloarthropathy at entheses and related sites. J Anat. 2001 Nov;199:503-26. McGonagle D, Stockwin L, Isaacs J, Emery P. An enthesitis based model for the pathogenesis of spondyloarthropathy. additive effects of microbial adjuvant and biomechanical factors at disease sites. J Rheumatol. 2001 Oct;28(10):2155-9. Benjamin M, McGonagle D. The enthesis organ concept and its relevance to the spondyloarthropathies. Adv Exp Med Biol. 2009;649:57-70. McGonagle D, Wakefield RJ, Tan AL, D'Agostino MA, Toumi H, Hayashi K, et al. Distinct topography of erosion and new bone formation in achilles tendon enthesitis: implications for understanding the link between inflammation and bone formation in spondylarthritis. Arthritis Rheum. 2008 Sep;58(9):2694-9. Baraliakos X, Listing J, Brandt J, Haibel H, Rudwaleit M, Sieper J, et al. Radiographic progression in patients with ankylosing spondylitis after 4 yrs of treatment with the anti-TNF-alpha antibody infliximab. Rheumatology. 2007 Sep;46(9):1450-3. Lories RJ, Derese I, De Bari C, Luyten FP. Evidence for uncoupling of inflammation and joint remodeling in a mouse model of spondylarthritis. Arthritis Rheum. 2007 Feb;56(2):489-97. van der Heijde D, Landewe R, Baraliakos X, Houben H, van Tubergen A, Williamson P, et al. Radiographic findings following two years of infliximab therapy in patients with ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2008 Oct;58(10):3063-70. van der Heijde D, Landewe R, Einstein S, Ory P, Vosse D, Ni L, et al. Radiographic progression of ankylosing spondylitis after up to two years of treatment with etanercept. Arthritis Rheum. 2008 May;58(5):1324-31. van der Heijde D, Salonen D, Weissman BN, Landewe R, Maksymowych WP, Kupper H, et al. Assessment of radiographic progression in the spines of patients with ankylosing spondylitis treated with adalimumab for up to 2 years. Arthritis Res Ther. 2009;11(4):R127. Baraliakos X, Haibel H, Listing J, Sieper J, Braun J. Continuous long-term anti-TNF therapy does not lead to an increase in the rate of new bone formation over 8 years in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2014 Apr 1;73(4):710-5. Haroon N, Inman RD, Learch TJ, Weisman MH, Lee M, Rahbar MH, et al. The impact of tumor necrosis factor alpha inhibitors on radiographic progression in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2013 Oct;65(10):2645-54. Wanders A, Heijde D, Landewe R, Behier JM, Calin A, Olivieri I, et al. Nonsteroidal antiinflammatory drugs reduce radiographic progression in patients with ankylosing spondylitis: a randomized clinical trial. Arthritis Rheum. 2005 Jun;52(6):1756-65. Lories RJ, Luyten FP, de Vlam K. Progress in spondylarthritis. Mechanisms of new bone formation in spondyloarthritis. Arthritis Res Ther. 2009;11(2):221. Jacques P, Lambrecht S, Verheugen E, Pauwels E, Kollias G, Armaka M, et al. Proof of concept: enthesitis and new bone formation in spondyloarthritis are driven by mechanical strain and stromal cells. Ann Rheum Dis. 2014 Feb 1;73(2):437-45. Kontoyiannis D, Pasparakis M, Pizarro TT, Cominelli F, Kollias G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 1999 Mar;10(3):387-98.
48
23. Armaka M, Apostolaki M, Jacques P, Kontoyiannis DL, Elewaut D, Kollias G. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J Exp Med. 2008 Feb 18;205(2):331-7. 24. Diarra D, Stolina M, Polzer K, Zwerina J, Ominsky MS, Dwyer D, et al. Dickkopf-1 is a master regulator of joint remodeling. Nat Med. 2007 Feb;13(2):156-63. 25. Lam J, Takeshita S, Barker JE, Kanagawa O, Ross FP, Teitelbaum SL. TNF-alpha induces osteoclastogenesis by direct stimulation of macrophages exposed to permissive levels of RANK ligand. J Clin Invest. 2000 Dec;106(12):1481-8. 26. Nandakumar KS, Holmdahl R. Efficient promotion of collagen antibody induced arthritis (CAIA) using four monoclonal antibodies specific for the major epitopes recognized in both collagen induced arthritis and rheumatoid arthritis. J Immunol Methods. 2005 Sep;304(1-2):126-36. 27. Nandakumar KS, Andren M, Martinsson P, Bajtner E, Hellstrom S, Holmdahl R, et al. Induction of arthritis by single monoclonal IgG anti-collagen type II antibodies and enhancement of arthritis in mice lacking inhibitory FcgammaRIIB. Eur J Immunol. 2003 Aug;33(8):2269-77. 28. Khachigian LM. Collagen antibody-induced arthritis. Nat Protoc. 2006;1(5):2512-6. 29. Morey-Holton ER, Globus RK. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 1998 May;22(5 Suppl):83S-8S. 30. Morey-Holton ER, Globus RK. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 2002 Apr;92(4):1367-77. 31. Sherlock JP, Joyce-Shaikh B, Turner SP, Chao CC, Sathe M, Grein J, et al. IL-23 induces spondyloarthropathy by acting on ROR-gammat+ CD3+CD4-CD8- entheseal resident T cells. Nat Med. 2012 Jul;18(7):1069-76. 32. Vlassenbroeck J. Advances in laboratory-based X-ray microtomography [PhD Thesis]: Ghent University; 2009. 33. Pauwels E. Optimalisatie van gebruik en detectie van contraststoffen in hoge resolutie X-stralentomografie op basis van de energieafhankelijkheid van hun attenuatie [Master's thesis]: Ghent University; 2010. 34. Masschaele B, Cnudde V, Dierick M, Jacobs P, Van Hoorebeke L, Vlassenbroeck J. UGCT: new x-ray radiography and tomography facility. Nucl Instrum Methods Phys Res, Sect A. 2007 Sep 21;580(1):266-9. 35. Dierick M, Van Loo D, Masschaele B, Boone MN, Van Hoorebeke L. A LabVIEW (R) based generic CT scanner control software platform. J X-ray Sci Technol. 2010;18(4):451-61. 36. Vlassenbroeck J, Dierick M, Masschaele B, Cnudde V, Van Hoorebeke L, Jacobs P. Software tools for quantification of X-ray microtomography at the UGCT. Nucl Instrum Methods Phys Res, Sect A. 2007 Sep 21;580(1):442-5. 37. Pauwels E, Van Loo D, Cornillie P, Brabant L, Van Hoorebeke L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. J Microsc. 2013 Apr;250(1):21-31. 38. Cook MJ. The anatomy of the laboratory mouse: Academic Press; 1965. 39. Chiba K, Rahman ME, Ishikawa H, Endo A. The timing of appearance of ossification centers of carpal and tarsal bones in mouse newborns. Congenit Anom. 1995;35(2):189-97. 40. Keles Coskun N, Arican RY, Utuk A, Ozcanli H, Sindel T. The incidence of accessory navicular bone types in Turkish subjects. Surg Radiol Anat. 2009 Nov;31(9):675-9. 41. Davis AP, Capecchi MR. Axial homeosis and appendicular skeleton defects in mice with a targeted disruption of hoxd-11. Development. 1994 Aug;120(8):2187-98. 42. Maksymowych WP, Chiowchanwisawakit P, Clare T, Pedersen SJ, Ostergaard M, Lambert RG. Inflammatory lesions of the spine on magnetic resonance imaging predict the development of new syndesmophytes in ankylosing spondylitis: evidence of a relationship between inflammation and new bone formation. Arthritis Rheum. 2009 Jan;60(1):93-102. 43. Baraliakos X, Listing J, Rudwaleit M, Sieper J, Braun J. The relationship between inflammation and new bone formation in patients with ankylosing spondylitis. Arthritis Res Ther. 2008;10(5):R104. 44. van der Heijde D, Machado P, Braun J, Hermann KG, Baraliakos X, Hsu B, et al. MRI inflammation at the vertebral unit only marginally predicts new syndesmophyte formation: a multilevel analysis in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2012 Mar;71(3):369-73. 45. Poddubnyy D, Rudwaleit M, Haibel H, Listing J, Marker-Hermann E, Zeidler H, et al. Effect of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on radiographic spinal progression in patients with axial spondyloarthritis: results from the German Spondyloarthritis Inception Cohort. Ann Rheum Dis. 2012 Oct;71(10):1616-22. 46. Kroon F, Landewe R, Dougados M, van der Heijde D. Continuous NSAID use reverts the effects of inflammation on radiographic progression in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2012 Oct;71(10):1623-9.
49
47. Falcai MJ, Louzada MJ, de Paula FJ, Okubo R, Volpon JB. A modified technique of rat tail suspension for longer periods of observation. Aviat Space Environ Med. 2012 Dec;83(12):1176-80.
50
