CONTROLE VAN DE NANOPARTIKELAGGREGATIE VOOR DE ACUTE TOXICITEITSBEPALING IN VITRO

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

VAKGROEP GENEESMIDDELENLEER LABORATORIUM VOOR ALGEMENE BIOCHEMIE EN FYSISCHE FARMACIE

CONTROLE VAN DE NANOPARTIKELAGGREGATIE VOOR DE ACUTE TOXICITEITSBEPALING IN VITRO Lise VANDEPUTTE 1ste Master Farmaceutische Zorg Academiejaar 2013-2014

Promotor: Prof. Dr. J. Demeester Commissarissen: Prof. Dr. C. Stove en Dr. K. Raemdonck

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

VAKGROEP GENEESMIDDELENLEER LABORATORIUM VOOR ALGEMENE BIOCHEMIE EN FYSISCHE FARMACIE

CONTROLE VAN DE NANOPARTIKELAGGREGATIE VOOR DE ACUTE TOXICITEITSBEPALING IN VITRO Lise VANDEPUTTE 1ste Master Farmaceutische Zorg Academiejaar 2013-2014

Promotor: Prof. Dr. J. Demeester Commissarissen: Prof. Dr. C. Stove en Dr. K. Raemdonck

AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

13 mei 2014

Promotor

Auteur

Prof. Dr. Jo Demeester

Lise Vandeputte

SAMENVATTING De snelle vooruitgang van de nanotechnologie heeft de unieke eigenschappen van NPs blootgelegd. Dit leidde al snel tot het gebruik van NPs in consumentenproducten. Wat de invloed van deze NPs op de gezondheid is, is echter nog onvoldoende geweten. Onderzoek naar de toxiciteit van NPs is zeer complex gezien de fysicochemische eigenschappen van NPs sterk wijzigen wanneer ze in celmedium worden gebracht in vergelijking met hun originele formulatie. NPs in celmedium zijn niet enkel onderhevig aan de Brownse bewegingen maar ook aan diffusie, sedimentatie en aggregatie. Het aggregeren van NPs in celmedium is een vaak voorkomend fenomeen dat opname en toxiciteit van NPs kan beïnvloeden maar niet altijd in rekening wordt gebracht tijdens nanotoxiciteitstudies. Tot op heden zijn er nog weinig inzichten gekend omtrent het verschil in toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke NPs en hun aggregaten. In deze masterproef werd een protocol ontwikkeld om citraatgecoatte AuNPs enerzijds als afzonderlijke AuNPs en anderzijds als aggregaten stabiel in dispersie te houden. Daarnaast werd ook een MTT-test uitgevoerd om het verschil in toxiciteit geïnduceerd door beide dispersies na te gaan. Uit het onderzoek bleek dat de vorming van de proteïnecorona een snellere kinetiek vertoonde dan de vorming van aggregaten. Door de toevoeging van PBSaan de AuNPs werd een dispersie met aggregaten verkregen. Voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs kon ddH2O toegevoegd worden. Beide dispersies werden gestabiliseerd door de vorming van een proteïnecorona na toevoeging van celmedium. Vervolgens werd dit protocol geoptimaliseerd zodat eenzelfde pH, gehalte aan nutriënten en isotonie verkregen werd als in celmedium. Hiervoor werd niet langer gebruik gemaakt van ddH2O, maar werd er aangelengd met PBS- en gebruik gemaakt van dubbelgeconcentreerd celmedium. Voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs werd aan de AuNPs dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS- toegevoegd, terwijl voor de dispersie met aggregaten, PBS- aan de AuNPs werd toegevoegd, gevolgd door dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS-. Uit DLS metingen en de UV/VIS-spectra van beide dispersies kon geconcludeerd worden dat via deze methode een dispersie met enkel afzonderlijke AuNPs en een dispersie met aggregaten verkregen werd. Een eerste toxiciteitsbepaling van beide dispersies met een MTT-test, leidde tot een gedaalde viabiliteit voor de cellen geïncubeerd met aggregaten tegenover afzonderlijke AuNPs. Toch bleek dit verschil niet significant te zijn. In volgende studies kunnen meerdere toxiciteitsmechanismen en de opname van beide dispersies verder onderzocht worden.

DANKWOORD Graag wil ik Prof. Dr. J. Demeester bedanken, die mij de kans gegeven heeft om deze masterproef te schrijven, door het ter beschikking stellen van het labo. Ik wens ook Freya Joris te bedanken die mij toeliet om mee te werken aan haar onderzoek. Daarnaast wil ik haar bedanken voor het advies en de vele hulp die ik gekregen heb tijdens het opstellen van deze masterproef. Dan wil ik ook nog familie en vrienden bedanken voor hun steun tijdens het schrijven en de tijd die ze namen om deze masterproef na te lezen. Tot slot wens ik alle medewerkers van het laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie te bedanken voor de goede sfeer en de hulp die ze aanboden.

INHOUDSTAFEL 1. INLEIDING ..................................................................................................................................................... 1 1.1 GOUDEN NANOPARTIKELS ............................................................................................................................ 2 1.1.1 Gelokaliseerde oppervlakte resonantie .......................................................................................... 2 1.1.2 Toepassingen.................................................................................................................................. 3 1.1.2.1 Niet-medische applicaties .............................................................................................................................. 3 1.1.2.2 Medische applicaties ...................................................................................................................................... 4

1.2 NANOPARTIKELINTRERACTIES MET CEL........................................................................................................ 5 1.2.1 Opname ......................................................................................................................................... 5 1.2.2 Toxiciteit ........................................................................................................................................ 6 1.2.2.1 Reactieve zuurstofmolecules .......................................................................................................................... 7 1.2.2.2 Andere toxiciteitsmechanismen ..................................................................................................................... 7

1.3 NANOPARTIKELS IN CELMEDIUM.................................................................................................................. 8 1.3.1 Proteïnecorona............................................................................................................................... 8 1.3.2 Nanopartikelaggregatie ................................................................................................................ 10 1.3.2.1 Inlvoedsfactoren die nanopartikelaggregatie beïnvloeden .......................................................................... 10 1.3.2.2 Particokinetiek .............................................................................................................................................. 12

1.3.3 Opname en toxiciteit .................................................................................................................... 14 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................................................. 16 3. MATERIALEN EN METHODE ........................................................................................................................ 18 3.1 KARAKTERISATIE 20 NM GOUDEN NANOPARTIKELS................................................................................... 18 3.1.1 UV/VIS-spectroscopie ................................................................................................................... 18 3.1.2 DLS ............................................................................................................................................... 19 3.2 CONTROLE NANOPARTIKELAGGREGATIE ................................................................................................... 21 3.2.1 Methode A: Sequentiële versus directe additie methode volgens Yang et al. ............................... 21 3.2.2 Methode B: Sequentiële additie ddH2O versus PBS- ..................................................................... 22 3.2.3 Methode C: Geoptimaliseerde sequentiële versus directe additie methode ................................ 23 3.3 STABILITEIT VAN NANOPARTIKELDISPERSIE OVER 24U .............................................................................. 24 3.4 BEVESTIGING VAN DE AGGREGATIEPROFIELEN VIA DLS ............................................................................. 24 3.4.1 Aanmaak serum vrije stalen voor DLS metingen ........................................................................... 24 3.4.2 DLS metingen ............................................................................................................................... 25 3.5 CELCULTUUR ............................................................................................................................................... 26 3.6 CELLEN UITPLATEN VOOR IN VITRO TESTEN ............................................................................................... 26 3.7 MTT-TEST .................................................................................................................................................... 26 3.7.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode B .................................... 27 3.7.2 Invloed van mediumdepletie ........................................................................................................ 28 3.7.3 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode C1 ................................... 28

4. RESULTATEN ............................................................................................................................................... 29 4.1 KARAKTERISATIE 20 NM GOUDEN NANOPARTIKELS................................................................................... 29 4.2 CONTROLE NANOPARTIKELAGGREGATIE ................................................................................................... 29 4.2.1 Methode A: Sequentiële versus directe additie methode volgens Yang et al. ............................... 30 4.2.2 Methode B: Sequentiële additie ddH2O versus PBS- ..................................................................... 31 4.2.3 Methode C: Geoptimaliseerde sequentiële versus directe additie methode ................................ 32 4.3 STABILITEIT VAN DE NANOPARTIKELDISPERSIE OVER 24U ......................................................................... 33 4.4 BEVESTIGING VAN DE AGGREGATIEPROFIELEN VIA DLS ............................................................................. 34 4.4.1 Aanmaak van serum vrije stalen voor DLS metingen .................................................................... 34 4.4.2 DLS metingen ............................................................................................................................... 35 4.5 MTT-TEST .................................................................................................................................................... 38 4.5.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode B .................................... 38 4.5.2 Invloed van mediumdepletie ........................................................................................................ 38 4.5.3 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode C1 ................................... 39 5. DISCUSSIE ................................................................................................................................................... 40 6. CONCLUSIE ................................................................................................................................................. 46 7. LITERATUURLIJST ........................................................................................................................................ 47 8.BIJLAGEN ........................................................................................................................................................ I 8.1 MATERIAAL EN METHODEN ........................................................................................................................... I 8.1.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode C1 ...................................... I 8.2 RESULTATEN .................................................................................................................................................. I 8.2.1 Aanmaak van serumvrije stalen voor DLS metingen ........................................................................ I 8.2.2 DLS metingen ................................................................................................................................. II 9. INTERNATIONALIZATION AT HOME: PROF. DR. DAAN J.A. CROMMELIN ...................................................... V 9.1 INAUGURAL LECTURE: IMPACT OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES OVER THE PAST 50 YEARS AND.. QUO VADIS? .................. V 9.2 BIOTECH TAKES OVER AND WE BETTER BE PREPARED. GENERIC PARADIGM REVISITED: BIOSIMILARS AND NON-BIOLOGICALCOMPLEX DRUGS ..................................................................................................................................................... V

9.3 SCENARIOS FOR THE FUTURE OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES AND IMPLICATIONS INNOVATION STRATEGIES AND PUBLICPRIVATE PARTNERSHIPS THE CHANGING ROLE OF THE PHARMACIST IN AN INTERNATIONAL PERSPECTIVE (FIP) ........................... VI

AFKORTINGEN AuNP

Gouden nanopartikel

BSA

Runderalbumine

ddH2O

Dubbel gedestilleerd water

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

FBS

Foetaal kalfserum

HS

Paardenserum

LSPR

Gelokaliseerde oppervlakte resonantie

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

NP

Nanopartikel

PBS-

Fosfaat gebufferde saline zonder CaCl2 en MgCl2

PDI

Polydispersiteitsindex

RME

Receptorgemedieerde endocytose

ROS

Reactieve zuurstofmolecules

SERS

Oppervlakte versterkte Ramanspectroscopie

1. INLEIDING Nanotechnologie kende zijn ontstaan in 1980. Sindsdien was er een sterke evolutie in het onderzoek naar nanomaterialen wat vanaf 1990 leidde tot de ontwikkeling van verschillende applicaties.[1] Een nanomateriaal wordt door de Europese commissie gedefinieerd als “een natuurlijk, incidenteel of geproduceerd materiaal dat uit deeltjes bestaat, in ongebonden toestand of als een aggregaat of agglomeraat en waarvan minstens 50% van de deeltjes in de gekwantificeerde grootteverdeling één of meer externe dimensies bezitten binnen het bereik van 1 nm tot 100 nm.”[2] De nanopartikels (NPs) worden geclassificeerd in twee verschillende groepen: de organische en anorganische NPs. Liposomen en NPs bestaande uit polymeren zijn voorbeelden van organische NPs die o.a. gebruikt kunnen worden voor gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen. De anorganische NPs omvatten zowel de metallische (goud, zilver en quantum dots) als de metaaloxide NPs (ijzeroxide, ceriumoxide) en kennen uiteenlopende toepassingen.[3-4] Daar in deze thesis met gouden nanopartikels (AuNPs) zal gewerkt worden, is het vervolg van deze inleiding meer toegespitst op anorganische NPs en meer specifiek op de AuNPs. Omwille van hun kleine dimensies, hebben NPs in vergelijking met hun bulk materiaal gewijzigde eigenschappen hetgeen kan verklaard worden door een combinatie van drie factoren. Ten eerste is gezien de grootte, de oppervlakte-energie zeer groot. Ten tweede vertaalt de kleine partikeldimensie zich in een stijging van de oppervlakte/volume-ratio, waardoor er een stijging is van het aantal atomen aan het oppervlak.[5-7] Ten derde wijzigt de elektronenconfiguratie aan het oppervlak, waardoor de chemische reactiviteit toeneemt.[8] De unieke eigenschappen van NPs openen deuren naar innovatieve applicaties in verschillende velden. Zo toont de biomedische wereld interesse en ziet ze mogelijke toepassingen in diagnostisering en specifieke en gecontroleerde geneesmiddelenafgifte.[910] Daarnaast heeft de nanotechnologie zijn weg gevonden naar consumentenproducten zoals cosmetica, een voorbeeld hiervan zijn zinkoxide NPs in zonnecrème.[11] Gezien de toename aan NPs bevattende consumentenproducten, wordt verwacht dat de blootstelling zal toenemen.[12-13] Dit gaat gepaard met een toegenomen bezorgdheid omtrent de effecten die NPs op onze gezondheid kunnen hebben.[14] Deze zijn voorlopig echter onvoldoende gekend bij gebrek aan algemene inzichten in hun toxiciteitsprofielen.[10] 1

In eerste instantie werd de toxiciteit van NPs geëvalueerd met methodes die origineel ontwikkeld werden voor de analyse van chemische componenten. Snel bleek echter dat deze methodes ongeschikt zijn voor de toxicologische analyse van NPs en dat nanotoxicologie als een afzonderlijk onderzoeksveld beschouwd dient te worden.[1] Voor in vitro testen is immers te zien dat NPs met assays kunnen interfereren, dat toxiciteit door verschillende mechanismen kan veroorzaakt worden en dat NPs zich in celmedium anders gedragen dan chemische componenten.[1,8,12,15] Het aggregeren van NPs in celmedium is een veelvoorkomend fenomeen dat niet steeds in rekening wordt gebracht in in vitro studies.[16] Dit ten onrechte, aangezien NP aggregatie kan resulteren in gewijzigde opname en toxiciteit.[17-18] Om na te kunnen gaan of verschillen in toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke NPs of hun aggregaten te wijten zijn aan verschillen in intracellulaire dosis of de manier waarop de cel beide ‘objecten’ verwerkt, zal in deze thesis een methode ontwikkeld worden om dispersies met enkel afzonderlijke NPs of aggregaten te creëren. Hierna zal de acute toxiciteit geïnduceerd door beide dispersies bepaald worden. Om dit onderzoek te kaderen, worden eerst de AuNPs besproken, gevolgd door een algemene inleiding over de toxiciteit geïnduceerd door NPs om tot slot te eindigen met het fenomeen van NP aggregatie.

1.1 GOUDEN NANOPARTIKELS De eerste aanmaak van colloïdaal goud dateert van voor 1900. De vooruitgang in chemie, fysica en microscopie in de 20ste eeuw maakte het mogelijk om de interactie van AuNPs met wit licht en de atomische structuur van AuNPs beter te begrijpen. Deze kennis en de brede toepasbaarheid van hun optische eigenschappen in uiteenlopende velden leidde tot de grote interesse in AuNPs en de ontwikkeling van verscheidene applicaties.[19] 1.1.1 Gelokaliseerde oppervlakte resonantie Goud als bulk materiaal heeft steeds dezelfde kenmerkende gouden kleur, terwijl de spectrale eigenschappen van AuNPs en dus de waargenomen kleur van de AuNP dispersie afhankelijk is van de dimensies en vorm van de AuNPs (Fig. 1.1).[9] De specifieke optische eigenschappen kunnen verklaard worden doordat de elektronen in de buitenste schil van de NPs interageren met het elektromagnetisch veld van het invallend licht. Wanneer de frequentie van de trilling van de elektronen op de buitenste schil overeenstemt met de 2

golflengte van het invallend licht, treedt er resonantie op. Dit gaat gepaard met zeer sterke absorbantie wat zich uit in de gelokaliseerde oppervlakte resonantie (LSPR)-piek in het UV/VIS-spectrum van de AuNPs.[3] Wanneer aggregaten gevormd zijn, verandert de elektronendistributie aan het oppervlak waardoor de golflengte waarbij resonantie optreedt zal wijzigen. De LSPR-piek van geaggregeerde NPs vertoont een bathochrome verschuiving in vergelijking met de afzonderlijke NPs.[20] Dit fenomeen is visueel waarneembaar als een kleurverandering van een rode naar een blauw-paarsachtige tint in de dispersie.[21]

Figuur 1.1: Dispersie (A) en spectra (B) met de karakteristieke LSPR-piek van citraatgecoatte AuNPs van verschillende groottes.[22]

1.1.2 Toepassingen De grote verscheidenheid aan mogelijke toepassingen is te wijten aan het feit dat gedurende de synthese, zowel de grootte als vorm nauwgezet gecontroleerd kunnen worden en bijgevolg NPs met de gewenste spectrale eigenschappen gecreëerd kunnen worden.[3] Bovendien kan het oppervlak gefunctionaliseerd worden via amine- en thiolgroepen.[6] Hierdoor bieden AuNPs potentieel voor zowel medische als niet-medische applicaties.[19] 1.1.2.1 Niet-medische applicaties AuNPs kunnen onder andere gebruikt worden als reagens in de bioanalyse en in oppervlakte versterkte Ramanspectroscopie (SERS). De toepassing in de bioanalyse kan gebaseerd zijn op het principe dat AuNPs omwille van hun oppervlaktelading in dispersie stabiel zijn. Wanneer deze NPs interageren met componenten aanwezig in het onbekende staal, wijzigt de oppervlaktepotentiaal waardoor aggregaten gevormd worden. Zoals in het vorige hoofdstuk besproken, heeft dit een bathochrome shift van de LSPR-piek tot gevolg. Vervolgens zal het verschil in absorbantie gemeten bij de golflengte voor de afzonderlijke NPs 3

een maat zijn voor de concentratie van het analyt in het staal. Zo kan bijvoorbeeld de concentratie van aminozuren in oplossing bepaald worden via HPLC.[23] Ramanspectroscopie is een zeer gevoelige techniek voor de detectie van analyten aanwezig in een lage concentratie. Bij Ramanspectroscopie wordt een Ramanmolecule met laserlicht bestraald. Hierdoor zullen fotonen geabsorbeerd worden. Waarbij het grootste aandeel fotonen met eenzelfde golflengte als het invallend licht terug wordt uitgezonden. Een klein aantal fotonen zal een lagere of hogere energie bezitten dan het invallend licht. Deze fotonen leveren de Raman of inelastische verstrooiing. Wanneer laserlicht gestraald wordt op het analyt en de AuNPs, zullen deze met elkaar interageren waardoor het Ramansignaal versterkt wordt, hetgeen SERS wordt genoemd.[24-26] 1.1.2.2 Medische applicaties Goud als bulkmateriaal is chemisch inert en veilig bevonden, waardoor het reeds wordt toegepast in de behandeling van rheumatoïde arthritis.[21] Recentelijk werden nanovarianten ontwikkeld voor het gebruik in medische toepassingen. Een belangrijk voordeel van AuNPs is dat ze zodanig ontworpen kunnen worden dat de LSPR-piek in de infrarood regio van het spectrum valt. Het weefsel is doorlaatbaar voor dit deel van het spectrum, wat o.a. beeldvorming met minimale weefselschade toelaat. De voornaamste medische toepassingen in ontwikkeling zijn: de fotothermale therapie, de specifieke geneesmiddelenaflevering, de foto-akoestische beeldvorming en de theranostica.[26] Ten eerste worden AuNPs ontwikkeld als contrastvloeistof voor foto-akoestische beeldvorming. Deze techniek is gebaseerd op het principe dat elektromagnetische golven door AuNPs kunnen geabsorbeerd worden, waarna de opgenomen energie kan worden omgezet in warmte. De temperatuurstijging zorgt op zijn beurt voor een thermo-elastische expansie van het omliggende weefsel en het ontstaan van een drukgolf. Deze drukgolf wordt met een ultrasonische transducer gedetecteerd en omgezet in een beeld. Wanneer AuNPs gefunctionaliseerd worden, zodanig dat specifiek tumorcellen herkend worden, kunnen ze mogelijks gebruikt worden als contrastvloeistof om het tumorweefsel in beeld te brengen.[2627] Daarnaast worden AuNPs ontwikkeld als agens voor fotothermale behandeling van kankers. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een infrarood lichtbron voor de bestraling. Het 4

ingezonden licht zal worden omgezet in warmte waardoor het oppervlak van de AuNPs zeer heet wordt. Deze hitte wordt overgebracht op het omliggende tumorweefsel waardoor de functie gewijzigd kan worden of zelfs celdood geïnduceerd wordt.[28-29] Ten derde kunnen AuNPs toegepast worden voor de gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen. Hiervoor kunnen AuNPs opgeladen worden met kleine molecules zoals peptiden, proteïnen, plasmide DNA en chemotherapeutica.[30] Deze constructen worden zodanig ontworpen dat ze na systemische toediening specifiek hun doelwit bereiken. Zo kan het oppervlak van AuNPs gefunctionaliseerd worden met antilichamen die specifiek met receptoren op cellen in een bepaald weefsel interageren en zo receptor-gemedieerde endocytose faciliteren. Eens de constructen hun doelwitweefsel bereikt hebben, kunnen de aan het oppervlak gebonden activa hun functie uitvoeren. Het grote voordeel van dit soort therapieën is dat de aspecifieke interactie van de actieve componenten met niet doelwitweefsel sterk gereduceerd wordt met als gevolg dat er minder systemische toxiciteit zal optreden. Bovendien zal het activum gerichter in het doelwitweefsel terecht komen waardoor lagere dosissen kunnen gebruikt worden, hetgeen het risico op systemische neveneffecten opnieuw vermindert.[26,31] Tot

slot zijn er nog de theranostatica, waarbij zowel het diagnostisch als het

therapeutisch aspect gekoppeld wordt. Zo is het bijvoorbeeld mogelijk om AuNPs te modificeren zodanig dat foto-akoestische beeldvorming kan toegepast worden voor de diagnostisering en fotothermale therapie om het therapeutische effect te bereiken.[26] 1.2 NANOPARTIKELINTRERACTIES MET CEL Recente studies hebben echter aangetoond dat het verwerken van goud tot AuNPs een negatieve invloed heeft op de biocompatibiliteit, hetgeen kan verklaard worden door de hoge oppervlakte/volume-ratio.[6] Als volgt zullen NP interacties met de cel, meer specifiek opname en toxiciteit besproken worden. 1.2.1 Opname NPs van enkele nanometers groot kunnen door middel van passieve diffusie de celmembraan passeren, waarna ze vrij in het cytosol voorkomen.[32-33] AuNPs worden echter slechts zelden vrij in het cytosol gevonden, maar bevinden zich meestal in vesikels na opname door middel van endocytose of fagocytose.[9] Endocytose is het voornaamste 5

opnamemechanisme voor AuNPs.[34] Hierbij stulpt de celmembraan in rond een AuNP dat erop geadheerd is. De celmembraan vormt een vesikel rond de NPs, gevolgd door internalisatie in endosomen in het cytosol. Bij ruptuur kunnen de NPs vrij in het cytosol diffunderen naar de verschillende organellen en mogelijks toxiciteit induceren.[32,35] Receptorgemedieerde endocytose (RME) is een vorm van endocytose, waarbij een ligand specifiek bindt met een receptor in de celmembraan van het weefsel. Na binding, zal zowel receptor als ligand geïnternaliseerd worden. Door het oppervlak van AuNPs te modificeren met eiwitten die specifiek binden met receptoren op het doelwitweefsel kan de opname en specificiteit hiervoor verhoogd worden.[34] In gespecialiseerde cellen zoals macrofagen en neutrofielen die kunnen fagocyteren, gebeurt de opname van NPs vaak door middel van fagocytose.[33] Bij fagocytose worden NPs net zoals bij endocytose opgenomen in vesikels of fagosomen. Waar voor endocytose de opname van NPs groter dan 100 nm niet efficiënt is, kunnen via fagocytose NPs opgenomen worden die groter zijn dan 500 nm. Dit wijst er op dat de opname van grote aggregaten via fagoctose efficiënter verloopt.[9,32] Hoe efficiënt een NP door de cel geëndocyteerd kan worden hangt af van verschillende factoren, zoals de NP grootte, lading en coating. Chithrani et al. toonden aan dat de hoogste concentratie in endosomen gemeten werd bij 50 nm AuNPs, wat dus wijst op de meest efficiënte opname van AuNPs bij deze grootte.[36] Door een sterkere interactie van positief geladen AuNPs met de negatief geladen celmembraan blijken deze een snellere opname te vertonen tegenover negatief geladen AuNPs.[19] Daarnaast bleken bij Cho et al. de polyethyleenglycolgecoatte AuNPs een lagere opname te vertonen in vergelijking met citraatgecoatte AuNPs van dezelfde grootte.[37] 1.2.2 Toxiciteit Na opname van de NPs kunnen ze toxiciteit veroorzaken via verschillende mechanismen. Stimulatie van de productie van reactieve zuurstofmolecules (ROS) wordt door Nel et al. naar voor geschoven als het belangrijkste mechanisme van nanotoxiciteit.[10] Als volgt komt een korte bespreking van ROS en andere mechanismen waaronder genotoxiciteit, beschadiging van de celmembraan en schade aan mitochondriën en cytoskelet.

6

1.2.2.1 Reactieve zuurstofmolecules ROS zijn reactieve signaalmolecules zoals bijvoorbeeld H2O2, OH∙ en O2∙.[38] Bij normale fysiologische condities worden ze in kleine hoeveelheden in de mitochondriën geproduceerd tijdens oxidatieprocessen. Hierna worden ze door antioxidanten en antioxiderende enzymen geneutraliseerd. Wanneer cellen aan externe stress onderhevig zijn, repliceren ze hierop door een stijging van ROS. Wanneer er een overmatige ROS productie is, kunnen de detoxificatiemechanismen verzadigd zijn met opstapeling van ROS als gevolg.[10,39] Wanneer het evenwicht verstoord is tussen de productie van ROS en de detoxificatie van deze molecules, ontstaat oxidatieve stress.[38] Partikels

in

de

grootteorde

van

nanometers

hebben

een

verstoorde

elektronenconfiguratie aan het oppervlak in vergelijking met hun bulk materiaal. Hierdoor zijn de oppervlaktegroepen reactief en kunnen ze fungeren als elektrondonor- of acceptorgroep. Daardoor is er elektronenuitwisseling mogelijk met O2 waaruit superoxide ontstaat met als gevolg een stijging van ROS.[10] Voor AuNPs werd een concentratie-afhankelijke inductie van ROS bij stijgende concentratie AuNPs in C17.2 cellen aangetoond door Soenen et al.[6] Indien de cel hier geen of onvoldoende anti-oxidatief antwoord op heeft kan dit leiden tot oxidatieve stress. Bovendien kan aanhoudende ROS-productie een reeks van secundaire effecten veroorzaken. ROS kan het DNA beschadigen door de crosslinking tussen de basenparen en de DNA-strengen te breken. Daarnaast kunnen signaalpathways geactiveerd worden, waardoor de celcyclus geïnhibeerd wordt en apoptose geïnduceerd wordt.[38] Tot slot bevordert ROS de lipidenperoxidatie wat leidt tot de productie van toxische aldehyden zoals acroleïne en malondialdehyde. Deze toxische stoffen beïnvloeden de posttranslationele modificatie van proteïnen en DNA, waardoor genotoxiciteit en cytotoxiciteit geïnduceerd wordt.[40] 1.2.2.2 Andere toxiciteitsmechanismen Naast stimulatie van ROS productie kunnen NPs de integriteit van de celmembraan verstoren. Enerzijds kan dit via een direct mechanisme waarbij een AuNP bijvoorbeeld een porie vormt in de membraan. Hierdoor kan er uitwisseling zijn van medium tussen extracellulaire vloeistof en cytosol wat acute toxische gevolgen kan hebben.[41] Daarnaast kan membraanschade ook indirect veroorzaakt worden door persistente ROS.[8] Ten tweede is er de genotoxiciteit, waar omtrent veel tegenstrijdigheden heersen.[42] In het algemeen wordt aangenomen dat gezien AuNPs zich in vesikels in het cytosol bevinden, 7

niet doorheen de kernmembraan kunnen penetreren.[9] Desondanks werd toch al genotoxiciteit vastgesteld bij NPs met een dimensie van 1,4 nm. Deze konden immers in de bindingsgroeves van het DNA binden.[43] De interactie van deze AuNPs met het DNA resulteert in een sterke cytotoxiciteit. In tegenstelling tot deze vaststelling werd aangetoond dat 3,7 nm AuNPs tot in de nucleus van Hela-cellen konden penetreren, maar waarbij geen cytotoxiciteit werd waargenomen.[44] Ten derde kunnen AuNPs leiden tot deformaties van het cytoskelet doordat ze de actine- en tubulinevezels kunnen aantasten. Coradeghini et al. zag dat na incubatie met AuNPs, de actinevezels gebroken waren. Aangezien het cytoskelet instaat voor de mobiliteit, vermenigvuldiging, intracellulair transport en de vorm van de cel is de deformatie van het cytoskelet een belangrijke parameter in het toxiciteitsprofiel van AuNPs. De deformatie van de actinevezels heeft dan ook gevolgen voor de actine-gemedieerde signaalpathways, wat zich kan uiten in defecten in de celhomeostase, celproliferatie, celmobiliteit etc.[6,45] Tot slot kunnen NPs ook interageren met de mitochondriën. Dit kan enerzijds de membraanpotentiaal verstoren waardoor de elektronentransportketen en de oxidatieve fosforylatie ontregeld worden. Anderzijds kan de accumulatie van AuNPs aan de mitochondriën leiden tot zwelling van de mitochondriën en de uitwendige membraan ervan beschadigen.[42] Tot slot zijn de mitochondriën de belangrijkste organellen voor de productie van ROS, zij zijn het meest gevoelig voor verhoogde concentraties ROS. Dit heeft als gevolg dat mitochondriaal DNA kan beschadigd zijn, wat de apoptose in de hand werkt.[46] 1.3 NANOPARTIKELS IN CELMEDIUM Wanneer NPs in celmedium gebracht worden kunnen ze verschillende processen ondergaan. Zo zal in serum bevattend medium een proteïnecorona ontstaan en kan aggregatie optreden. Beide fenomenen zullen hieronder besproken worden.[47] 1.3.1 Proteïnecorona Wanneer NPs in contact komen met eiwitten zoals serum aanwezig in celmedium kunnen ze deze adsorberen. Hierdoor worden de NPs omringd met een proteïnelaag ook wel de proteïnecorona genoemd (Fig. 1.2).[35] Deze proteïnecorona beïnvloedt de zètapotentiaal, dewelke zwak negatief zal worden voor NPs met origineel verschillende oppervlakteladingen.[47] 8

Lesniak et al. toonden aan dat de opnamemechanismen kunnen wijzigen, wanneer een proteïnecorona gevormd is. Wanneer de AuNPs in compleet celmedium met serum werden gebracht, werd een proteïnecorona gevormd. De NPs werden hier enkel door endocytose openomen. Terwijl NPs in serumvrij medium, zowel vrij als in vesikels in het cytosol voorkwamen. Dit wijst er op dat het opnamemechanisme voor deze NPs niet enkel endocytose was. Daarnaast werd aangetoond dat NPs in serumvrij medium sterker aan het celoppervlak adheerden. Dit fenomeen verklaart de lagere internalisatie van NPs met proteïnecorona.[48] Desondanks kunnen de serumproteïnen aan het oppervlak van AuNPs, toch ook de opname bevorderen, namelijk via RME. Hierdoor is het mogelijk dat zelfs NPs zonder doelwitligand toch door middel van RME worden opgenomen. Aangezien het serum mogelijks eiwitten bevat die optreden als liganden en met receptoren aan het oppervlak kunnen binden. Door de diversiteit van eiwitten in serum, kunnen de NPs via verschillende receptoren opgenomen worden, waardoor er toch een verhoogde opname mogelijk is in vergelijking met NPs die enkel met één doelwiteiwit gecoat zijn.[34,36] Tot slot kan de binding van eiwitten aan het oppervlak van de NPs, de conformatie van de proteïnen doen wijzigen, waardoor nieuwe epitopen kunnen ontstaan die door het immuunsysteem kunnen herkend worden en vervolgens een immuunreactie induceren.[49] Al deze elementen samen geven een verklaring voor het feit dat voor dezelfde AuNPs in verschillende media toch verschillen in opname en toxiciteit kunnen waargenomen worden.[9]

Figuur 1.2: De proteïnecorona gevormd door de adsorptie van proteïnen aan het oppervlak van de AuNP wanneer het NP in celmedium wordt gebracht. (http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12274-013-0400-0)

9

1.3.2 Nanopartikelaggregatie Spontane aggregatie van NPs in celmedium is een vaak voorkomend fenomeen.[16] Aggregatie is het verschijnsel waarbij NPs gaan samenklitten, wanneer de van der Waalskrachten tussen partikels groter zijn dan de elektrostatische afstotingskrachten. Dit is in overstemming met het feit dat een systeem steeds streeft naar een zo laag mogelijke vrije energie en dus het streven van NPs naar een zo laag mogelijke oppervlakte-energie.[21,50] Hier moet echter eerst een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen aggregatie en agglomeratie. Aggregaten zijn partikels die door sterke covalente bindingen verbonden zijn, terwijl agglomeraten gevormd worden door zwakke bindingen zoals waterstofbruggen, van der Waalskrachten en hydrofobe interacties.[1] Bij agglomeraten kunnen de bindingen bijgevolg opnieuw gebroken worden, waar dat voor aggregaten niet het geval is. Beide processen leiden tot een daling van de vrije oppervlakte-energie doordat de grootte stijgt maar de totale oppervlakte daalt.[50] Aangezien NP aggregatie een NP- en medium afhankelijk fenomeen is, is het een parameter die ongetwijfeld invloed zal hebben op toxiciteitsevaluaties. Toch wordt deze factor vaak over het hoofd gezien, hetgeen vergelijking tussen in vitro studies onderling en in vivo studies extra bemoeilijkt.[51-52] Om het fenomeen van NP aggregatie verder te duiden zullen naast de factoren die NP aggregatie beïnvloeden ook de invloed op NP opname en toxiciteit besproken worden. 1.3.2.1 Inlvoedsfactoren die nanopartikelaggregatie beïnvloeden De dispersietoestand van NPs in celmedium kan wijzigen als gevolg van verschillende medium- en NP-gerelateerde factoren.(16) De belangrijkste NP-gerelateerde invloedsfactoren zijn de vorm, concentratie, coating en hydrofobiciteit. Ten eerste zullen staven elkaar bijvoorbeeld sterker aantrekken dan sferen, waardoor grotere aggregaten worden gevormd in vergelijking met sferen. Dit omdat het oppervlak waartussen interactie is, groter is wanneer staven interageren in vergelijking met sferen.[53] Daarnaast is de aggregatie ook afhankelijk van de concentratie: bij hogere concentraties is het aantal interactiemogelijkheden tussen de NPs groter, waardoor er sneller aggregaten gevormd worden. Hiermee in overeenstemming zullen kleine partikels sneller aggregeren dan grote wanneer ze in éénzelfde massaverhouding aanwezig zijn. Dit is te wijten aan het hoger aantal van de kleinere partikels tegenover de grotere.[54] Afhankelijk van de coating van de NPs, kan het colloïdale systeem gestabiliseerd worden. Zo zullen 10

polymeergecoatte partikels met als voorbeeld polyethyleenglycol een beschermende laag vormen omheen de partikels, waardoor de stabiliteit van de dispersie gegarandeerd wordt. Aangezien deze coating zorgt voor de stabilisatie, zullen deze NPs minder aggregeren en sedimenteren.[55] Voor hydrofiele NPs zullen watermolecules aan het oppervlak van de NPs adheren, waardoor de waterlaag omheen de NPs verhindert dat partikels aan elkaar adheren. In tegenstelling tot hydrofiele NPs, zullen hydrofobe NPs onderling een sterkere aantrekkingskracht hebben dan tussen watermolecules en NPs, waaruit de vorming van aggregaten volgt.[35] Zouten, pH-wijzigingen en serumproteïnen aanwezig in het celmedium kunnen de oppervlaktepotentiaal van NPs wijzigen waardoor de vorming van aggregaten gestimuleerd wordt. Elk van deze parameters kan dus de oppervlaktelading van de NPs neutraliseren, waardoor de repulsie tussen de partikels afneemt en aggregaten ontstaan.[9] Ten eerste zal met stijgende zoutconcentraties, de oppervlaktelading steeds meer geneutraliseerd worden, waardoor de attractie tussen NPs toeneemt en aggregatie bevorderd wordt.[21,56] De invloed van de binding van eiwitten aan het oppervlak is nog niet volledig uitgeklaard, gezien dit enerzijds leidt tot de stabilisatie van gevormde aggregaten en anderzijds de vorming van aggregaten kan bevorderen.[16,18] Zo kunnen eiwitten uit het medium enerzijds aan het oppervlak binden, waardoor de destabilisatie die optreedt kan leiden tot aggregatie.[57] Sharma et al. toonden anderzijds aan dat de spontane aggregatie gestopt wordt wanneer serumproteïnen

worden

toegevoegd

door

de

vorming

van

een

stabiliserende

proteïnecorona.[16] Tot

slot

hebben

pH-wijzigingen

in

het

celmedium

tot

gevolg

dat

de

oppervlaktegroepen geprotoneerd of gedeprotoneerd kunnen worden, waardoor de vorming van aggregaten in de hand wordt gewerkt. Liu et al. nam bijvoorbeeld aggregaten waar onder een pH 3 van citraatgecoatte AuNPs. Dit was te wijten aan de neutralisatie van de carboxylgroepen door de hoge concentratie protonen. De pKa’s van citraat in water bedragen 3,13, 4,76 en 6,4, waardoor bij pH 7 de carboxylgroepen gedeprotoneerd zijn. De negatieve ladingen zorgen dus voor elektrostatische stabiliteit aangezien de repulsiekrachten overheersen, waardoor geen aggregatie optreedt.[56]

11

1.3.2.2 Particokinetiek Bij in vitro experimenten met oplosbare componenten wordt de concentratie waaraan de cellen worden blootgesteld accuraat weergegeven door de concentratie aanwezig in celmedium. Voor nanopartikels geldt dit echter niet, aangezien deze in dispersie kunnen diffunderen, aggregeren en sedimenteren. Bovendien zal de kinetiek van deze processen verschillen afhankelijk van het medium waarin de NPs gedispergeerd zijn. Dit maakt dat de NP dosis een dynamischer begrip is, wat de vergelijking van resultaten uit uiteenlopende studies extra bemoeilijkt. Hieruit ontstond het begrip ‘particokinetiek’, wat door Teeguarden et al. wordt beschouwd als de transportmechanismen van NPs in celmedium richting de cel.[58] Wanneer over dosis gesproken wordt, moet volgens hun een onderscheid gemaakt worden tussen de toegediende dosis, de afgeleverde dosis en de intracellulaire dosis.[59] De toegediende dosis is de concentratie aan NPs die via het celmedium wordt toegediend. De afgeleverde dosis is de dosis die het celoppervlak bereikt terwijl de intracellulaire dosis de concentratie is die effectief in de cel wordt opgenomen (Figuur 1.3).[58] Deze laatste hangt af van de mate waarin ze aan het oppervlak adsorberen en de snelheid waarmee ze worden opgenomen. De toegediende dosis is daarom niet in overeenstemming met de intracellulaire dosis.[12]

Figuur 1.3: Schematische weergave van de toegediende dosis (A), afgeleverde dosis (B)

en

de

intracellulaire dosis (C).[1]

Zoals eerder vermeld zijn er drie verschillende processen die NPs in celmedium kunnen ondergaan en zo de afgeleverde dosis kunnen beïnvloeden: diffusie, sedimentatie en aggregatie.[58] Diffusie wordt gedefinieerd door de Einstein-Stokes vergelijking (Formule 1.1).

12

Einstein-Stokes vergelijking: 𝐷 =

𝑘𝑇 3𝜋𝜂𝑑

(Formule 1.1)

𝐷 = Diffusiecoëfficiënt (m²/s) 𝑘 = Constante van Boltzmann (m².kg/(K.s²)) 𝑇 = Temperatuur (K) 𝜂 = Viscositeit (Pa.s) 𝑑 = Diameter van NP (m) Aangezien de diffusiecoëfficiënt omgekeerd evenredig is met de diameter van de partikels, zullen kleinere partikels sneller diffunderen dan grotere partikels.[12] Grotere partikels zullen voornamelijk sedimenteren onder invloed van de zwaartekracht door hun hogere massa/volumeverhouding.[58] Volgens de wet van Stokes (Formule 1.2) is deze sedimentatiesnelheid bovendien afhankelijk van de viscositeit van het medium, de massadichtheid en diameter van het NP.[12] Stokes: ν 𝑠𝑒𝑑 =

𝑔(δ𝑝 −δ𝑚 )𝑑2 18η

(Formule 1.2)

ν 𝑠𝑒𝑑 = Sedimentatiesnelheid (m/s) 𝑔 = Valversnelling (m/s²) δ𝑝 = Massadichtheid van de partikel (kg/m³) δ𝑚 = Massadichtheid van het medium (kg/m³) 𝑑 = Diameter partikel (m) 𝜂 = Viscositeit van het medium (Pa.s ) Deze beide formules tonen aan dat de transportsnelheid beïnvloed wordt door de diameter van de NPs. Zo zullen partikels kleiner dan 10 nm snel diffunderen en partikels groter dan 100 nm snel sedimenteren, waardoor een hoge transportsnelheid bereikt wordt. Partikels met een diameter gelegen tussen 10 en 100 nm zullen zowel sedimenteren als diffunderen

13

maar beide processen zullen minder efficiënt zijn, waardoor ze uiteindelijk een lage transportsnelheid zullen hebben. Hetgeen mooi geïllustreerd wordt in Figuur 1.4.[12]

Figuur 1.4: Weergave van de belangrijkste in vitro transportprocesen.[12]

Voor aggregaten is dit gegeven nog complexer, gezien het feit dat een aggregaat niet altijd dezelfde densiteit heeft als een NP met dezelfde grootte. Hierbij zal de densiteit bepaald worden door de pakkingsdensiteit van het aggregaat. Dit resulteert in een lagere densiteit in vergelijking met de initiële NPs of NPs uit hetzelfde materiaal met dezelfde grootte als het aggregaat. De sedimentatiesnelheid zal vervolgens hoger zijn dan van de initiële partikels, terwijl afzonderlijke partikels van dezelfde grootte als aggregaten toch sneller zullen sedimenteren.[58] Dit feit geeft de complexiteit van het gegeven ‘NP aggregatie en zijn gevolgen’ mooi weer. 1.3.3 Opname en toxiciteit Gezien aggregaten een grootte kunnen aannemen van enkele honderden nanometers, kan de biologische respons verschillen van deze op afzonderlijke NPs.[17] Er bestaat nog geen eenduidigheid omtrent de invloed van aggregatie op de opname en cytotoxiciteit. Daar verschillende studies verhoogde of verlaagde opname detecteren voor aggregaten, al dan niet gelinkt aan een gestegen of gedaalde toxiciteit.[1]

14

Cho et al. toonden aan dat de belangrijkste parameters voor opname van NPs de diffusie-en sedimentatiesnelheid zijn. Aangezien aggregaten een hogere massa hebben in vergelijking met hun afzonderlijke NPs, hebben ze een hogere sedimentatiesnelheid. Hierdoor zal de concentratie aan het celoppervlak hoger zijn. Gezien de opname rechtstreeks gecorreleerd is met de concentratie, kan er dus een verhoogde opname zijn van aggregaten.[37] Dit kan echter enkel indien de aggregaten voldoende klein zijn om door de cel te kunnen worden ogenomen. Zoals eerder besproken in hoofdstuk 1.2.1, is het belangrijkste opnamemechanisme voor AuNPs endocytose. Hierbij bedraagt de optimale grootte voor een efficiënte opname 40 à 60 nm.[60] Grotere aggregaten zullen dus minder efficiënt worden opgenomen dan kleinere. Zo zagen Wenjuan et al. dat de opname van aggregaten via endocytose gelimiteerd was waardoor grote aggregaten niet werden opgenomen en dus ook niet cytotoxisch bleken te zijn. De adsorptie van de aggregaten aan de cellen, werd door de cellen ondervonden als een stressfactor, waardoor de groei zelfs gestimuleerd werd.[57] Anderzijds namen Yang et al. een sterke stijging van de toxiciteit waar bij geaggregeerde AuNPs tegenover afzonderlijke AuNPs. Hierbij werd een grotere beschadiging van de actinevezels gezien bij de aggregaten, als gevolg van een verhoogde opname van de aggregaten.[47] De opname van NPs en aggregaten is niet eenvoudig te verklaren, gezien afzonderlijke NPs en hun aggregaten mogelijks door een verschillend opnamemechanisme worden opgenomen.[18] Een bijkomende factor die opname bepaalt is het celtype aangezien Albanese et al. zowel een verhoogde als verlaagde opname waarnam van geaggreerde AuNPs in verschillende cellijnen. Voor de aggregaten lag de opname 25% lager voor de aggregaten in de Hela en A549 cellijn. Terwijl de opname van 98 nm aggregaten in de MDA-MB-435 cellijn dubbel zo hoog lag als voor de afzonderlijke partikels.[21] Een laatste paramater die de toxiciteit kan beïnvloeden, is de conformatie van de aggregaten. Hierbij zullen aggregaten met een densere pakking een grotere interactie hebben met de celmembraan, waardoor ze een sterkere aantasting van de membraanintegriteit kunnen veroorzaken.[61] Daarnaast kunnen er afhankelijk van de conformatie meer of minder ligand-receptorinteracties plaats vinden, waardoor de opname van aggregaten via RME kan variëren.[21]

15

2. OBJECTIEVEN De nanotechnologie wordt gezien als een nieuwer onderzoeksveld dat snel vooruitgang boekt. Recente onderzoeken hebben de unieke optische, chemische en mechanische eigenschappen van NPs blootgelegd. Deze specifieke eigenschappen van NPs legden als snel de weg open voor het gebruik van NPs in consumentenproducten. Hierdoor is er zowel een stijging in de intentionele als niet-intentionele blootstelling van NPs. Wat de effecten hiervan op onze gezondheid zijn, is voorlopig nog onvoldoende gekend. Vandaar het belang om met in vitro toxiciteitstudies meer inzichten te verwerven in de toxiciteitsprofielen. Tijdens deze in vitro studies worden echter tegenstrijdige resultaten verkregen. Dit is te wijten aan de grote verscheidenheid van NPs met elk hun eigen fysicochemische eigenschappen en de verschillende toxiciteitsmechanismen die ze kunnen induceren. Gezien de toxiciteit beïnvloed wordt door de eigenschappen van de partikels, zal vooreest een karakterisatie van de citraatgecoatte AuNPs uitgevoerd worden. Daarnaast wijzigen de eigenschappen van NPs naar gelang het medium waarin ze worden blootgesteld. Aggregatie bijvoorbeeld is een fenomeen dat zich frequent voordoet, maar vaak over het hoofd wordt gezien in nanotoxiciteitstudies. Tot op heden is het onbekend of het verschil in toxiciteit veroorzaakt door aggregaten en afzonderlijke NPs te wijten is aan verschillen in intracellulaire dosis of de manier waarop de cel met beide omgaat. In het eerste luik van deze thesis wordt dan ook een protocol ontwikkeld, dat toelaat om AuNPs enerzijds als aggregaten en anderzijds als afzonderlijke partikels stabiel in dispersie te houden. Het UV/VIS-spectrum van deze dispersies met de weergave van de LSPR-pieken zal uitsluitsel geven over de efficiëntie van de gebruikte methodes. Om de stabiliteit van de dispersies gedurende de incubatietijd gebruikt voor de in vitro toxiciteitstesten na te gaan, zal een 24-uursmeting worden gedaan. Daarnaast zal via DLS een idee verkregen worden over de grootterange van de afzonderlijke AuNPs en aggregaten. Indien gunstige resultaten verkregen worden, moet dit protocol het mogelijk maken om het verschil in toxiciteit geïnduceerd door aggregaten en afzonderlijke partikels te kunnen bepalen.

16

Tot slot zal dan in het tweede luik aan de hand van een MTT-test de acute toxiciteit van deze twee dispersies onderzocht worden. Deze test laat een eerste screening toe waarbij het mogelijke verschil in toxiciteit tussen afzonderlijke AuNP en aggregaten kan worden waargenomen.

17

3. MATERIALEN EN METHODE 3.1 KARAKTERISATIE 20 NM GOUDEN NANOPARTIKELS 3.1.1 UV/VIS spectroscopie Spectroscopie is een techniek waarbij een spectrofotometer meet hoeveel licht een chemische component absorbeert door de lichtintensiteit te meten van een lichtstraal die door de dispersie wordt gestuurd. Wanneer licht invalt op de molecules kunnen de elektronen in het hoogst bezette molecuulorbitaal energie van het invallend licht opslaan. Hierdoor bezitten de elektronen een hogere energie en kunnen ze overgaan naar het laagste onbezette molecuulorbitaal. Hierbij gaan de elektronen dus over van de grondtoestand naar de geëxciteerde toestand (Figuur 3.1). De molecules zullen elektromagnetische straling absorberen waardoor de uittredende lichtstraal een lagere intensiteit heeft dan de intredende lichtstraal. Volgens de wet van Lambert-Beer, is de absorbantie dan vervolgens een maat voor het verschil in intensiteit tussen de in- en uittredende lichtstraal (Formule 3.1). Er dient nog te worden opgemerkt dat bij de meting van de absorbantie voor de AuNP dispersie moet gecorrigeerd worden voor de absorbantie van het medium of de oplossing. Dit aan de hand van een blancostaal dat dezelfde samenstelling heeft als de AuNPs dispersie waarbij het gehalte aan AuNPs vervangen wordt door ddH2O. Bij UV/VIS-spectroscopie wordt de absorbantie gemeten bij een golflengte van 200 nm tot 800 nm. Hierbij wordt een spectrum verkregen waarbij de absorbantie wordt uitgezet in functie van de golflengte van het invallend licht. Het spectrum van AuNPs vertoont een LSPR-piek bij verschillende golflengtes afhankelijk van hun grootte. Hierdoor zal een bathochrome verschuiving van de LSPR-piek te zien zijn bij aggregaten tegenover afzonderlijke AuNPs. Deze techniek laat dus toe om een dispersie met aggregaten

en

afzonderlijke

AuNPs

te

onderscheiden.[21]

(http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/uv-vis/spectrum.htm)

Figuur 3.1: Elektronentransitie van grondtoestand naar geëxciteerde toestand bij absorptie. (http://community.asdlib.org/imageandvideoexchangeforum/2013/07/26/absorbance-and-emissionspectroscopy/)

18

𝐼

Wet van Lambert-Beer: 𝐸 = − log( 1 ) 𝐼0

(Formule 3.1)

𝐸 = Extinctie 𝐼1 = Intensiteit van uittredende lichtstraal 𝐼0 = Intensiteit van intredende lichtstraal 80 µL van de originele AuNPs dispersie werd in een UV-cuvet (Brand, Wertheim, Duitsland) gebracht en met behulp van de Nanodrop 2000c spectrofotometer (Thermo scientific, Wilmington, USA) werd het spectrum opgemeten. Dit spectrum werd telkens opgenomen tussen een golflengte van 220 nm en 750 nm. In de grafieken weergegeven in het hoofdstuk resultaten, wordt slechts een deel van dit spectrum weergegeven, namelijk van 450 nm tot 750 nm. Dit deel van het spectrum omvat zowel de LSPR-piek van de afzonderlijke AuNPs als van de aggregaten. 3.1.2 DLS Dynamische lichtverstrooiing (DLS) is een techniek die toelaat om zowel de groottedistributie als de zèta-potentiaal van NPs in dispersie te bepalen. Beide metingen zijn gebaseerd op het feit dat NPs in dispersie willekeurige of Brownse bewegingen maken, te wijten aan botsingen tussen de partikels en solventmolecules. Met DLS zal de snelheid bepaald worden waarmee de NPs in dispersie bewegen. Hierbij wordt de suspensie bestraald met monochromatisch laserlicht. Op het grensvlak tussen de partikels en het medium waarin ze zich bevinden zal het licht verstrooid worden. De intensiteit van het verstrooid licht wijzigt afhankelijk van de snelheid van de bewegingen van de partikels. Een detector zal vervolgens de intensiteit van het verstrooid licht meten. Uit de fluctuaties van de gemeten intensiteit kan vervolgens de diffusiecoëfficiënt van de NPs berekend worden. Met behulp van de EinsteinStokes vergelijking (Formule 1.1) kan hieruit de hydrodynamische diameter bepaald worden. (http://www.horiba.com/scientific/products/particle-characterization/technology/dynamiclight-scattering/) Daarnaast kan met DLS ook de lading van de NPs bepaald worden aan de hand van de zèta-potentiaal. Een geladen partikel zal in dispersie omringd worden door sterk gebonden tegenionen, die de Sternlaag vormen. De buitenste diffusielaag, bevat minder sterk gebonden ionen die met het partikel kunnen meebewegen. De grens tussen de regio waar ionen mee 19

bewegen met het partikel en deze waar ze niet meer meebewegen, wordt het afschuifvlak genoemd. De elektrostatische potentiaal aan het afschuifvlak, wordt de zèta-potentiaal genoemd. Wanneer een elektrisch veld wordt aangelegd in de dispersie zullen de partikels aangetrokken worden tot de pool met tegengestelde lading. De migratiesnelheid van de NPs kan gevisualiseerd worden door de dispersie te bestralen met monochromatisch laserlicht. De intensiteit van het licht dat vervolgens gemeten wordt door de detector wijzigt afhankelijk van de migratiesnelheid van de NPs in het elektrisch veld. De frequentie van de fluctuaties in intensiteit staan in relatie tot de migratiesnelheid waaruit vervolgens de zèta-potentiaal kan berekend worden met behulp van de vergelijking van Henry (Formule 3.2). Henry’s vergelijking: 𝜁 =

3µ𝜂 2𝜀𝑓(𝐾𝑎)

Formule 3.2

𝜁 = Zèta-potentiaal (V) µ = Elektroforetische mobiliteit (m²/(V.s)) 𝜂 = Viscositeit van het medium (Pa.s) 𝜀 = Diëlektrische constante 𝑓(𝐾𝑎) = Functie van Henry DLS is een vaak gebruikte techniek om de aggregatietoestand in een dispersie te onderzoeken, alhoewel deze techniek echter enkele beperkingen heeft. Ten eerste wordt de assumptie gemaakt dat alle partikels sferisch zijn. Onafhankelijk van de vorm wordt de hydrodynamische diameter bepaald voor het sferisch partikel met dezelfde diffusiecoëfficiënt als het partikel. Dit leidt tot een minder goede schatting van de grootte van de aggregaten aangezien deze veelal niet langer sferisch zijn. Daarnaast vertonen grotere partikels een grotere lichtverstrooiing aangezien de lichtverstrooiing evenredig is aan d6 , waarbij d de diameter van de partikel weergeeft. Hierdoor zal de groottedistributie verkregen op basis van lichtintensiteit het aandeel aan aggregaten overschatten wanneer de dispersie polydispers is. De hogere scattering voor grotere partikels heeft ook gevolgen voor de gemiddelde hydrodynamische diameter in een polydispers systeem. Deze zal bijgevolg bij een hogere waarde gelegen zijn. De gemiddelde hydrodynamische diameter zal volgens de deeltjesdistributie lager zijn als voor de volumedistributie en de groottedistributie op basis van de intensiteit. In polydisperse suspensies is de omzetting van de groottedistributie op 20

basis van de intensiteit naar de volume- en deeltjesdistributie via de Mie theorie echter vaak misleidend. Er wordt namelijk verwacht dat alle partikels sferisch zijn en homogeen verdeeld zijn. Een correctere weergave van de groottedistributie zou kunnen verkregen worden met transmissieelektronenmicroscopie.[62] (http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wpcontent/uploads/2011/02/DLS_Terms_defined_Malve rn.pdf)

80 µL van de originele AuNPs dispersie werd in een UV-cuvet (Brand®, Wertheim, Duitsland) gebracht en met behulp van de Zetasizer nano® series (Malvern®, Worcestershire, VK) werd de groottedistributie bepaald. Voor de bepaling van de zèta-potentiaal werd 1mL originele dispersie in een DTS 1070 cel (Malvern®, Worcestershire, Engeland) gebracht. De metingen gebeurden telkens onder een hoek van 173°. Ook voor het vervolg van de testen werd deze methode gehanteerd. 3.2 CONTROLE NANOPARTIKELAGGREGATIE Vooreerst moest een protocol opgesteld worden dat toeliet om het aggregeren van de NPs te controleren. Een eerste indicatie van het al dan niet aggregeren werd verkregen op basis van het opmeten van de spectra. De verschillende protocols voor het verkrijgen van een dispersie met afzonderlijke AuNPs of aggregaten worden in de secties hieronder beschreven. 3.2.1 Methode A: Sequentiële versus directe additie methode volgens Yang et al. Het celmedium dat gebruikt werd voor de directe additie methode had dezelfde samenstelling als het celmedium gebruikt voor de celcultuur. Voor de aanmaak moest aan DMEM met 0,45 % glucose (InvitrogenTM, Merelbeke, België), 10% kalfserum (FBS) (Hyclone®, Cramlington, VK) en 5% paardenserum (HS) (Hyclone®, Cramlington, VK) toegevoegd worden. Vervolgens moest nog 1% van een 200 mM L-glutamineoplossing (InvitrogenTM, Merelbeke, België) toegevoegd worden en 2% penicilline/streptomycine-oplossing (InvitrogenTM, Merelbeke, België) tot een uiteindelijke concentratie van 100 IU/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine. Dit medium werd gefiltreerd doorheen een cellulose-acetaatmembraan met een MWCO van 0,22 µm gebruikmakende van een Corning® filtration/storage system (Corning, NY, VSA). Aangezien UV/VIS-spectroscopie werd gehanteerd werd DMEM zonder fenolrood (InvitrogenTM, Merelbeke, België) gebruikt. De stalen voor UV/VIS-spectroscopie bevatten 20 % AuNPs (Aaldrich® chemistry, Steinheim, Duitsland) dispersie en 80 % celmedium. 21

Voor de sequentiële additie methode werd de dubbelgeconcentreerde DMEM aangemaakt door 4 % penicilline-streptomycine, 2 % glutamine, 0,45 % glucose (Sigma, Steinheim, Duitsland) samen te voegen en aan te lengen met DMEM tot 100 %. Daarnaast werd de dubbelgeconcentreerde serumoplossing gemaakt door 20 % FBS, 10 % HS samen te voegen en aan te lengen met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot 100 %. Het staal werd aangemaakt door aan 20 % AuNPs, 40 % dubbelgeconcentreerde serumoplossing toe te voegen en vervolgens 40 % dubbelgeconcentreerde DMEM om tot een zelfde samenstelling te komen als via de directe additie methode (Figuur 3.2 en Tabel 3.1).

Figuur 3.2: De sequentiële en directe additie van celmedium aan AuNPs volgens Yang et al.[47] Tabel 3.1: Samenstelling van de verschillende media voor de aanmaak van de stalen via de directe en sequentiële additie methode volgens Yang et al.

Celmedium Penicillinestreptomycine (%) Glutamine (%) Glucose (%) HS (%) FBS (%) ddH2O (%) DMEM (%)

2

Dubbelgeconcentreerde DMEM 4

Dubbelgeconcentreerde serumoplossing /

1 0,45 5 10 / Tot 100

2 0,90 / / / Tot 100

/ / 10 20 Tot 100 /

3.2.2 Methode B: Sequentiële additie ddH2O versus PBSDe dispersie zonder aggregaten werd aangemaakt volgens het sequentiële principe door aan 20 % AuNPs, 20 % ddH2O toe te voegen, gevolgd door de toevoeging van 60 % celmedium zonder fenolrood. Voor de dispersie met de aggregaatvorming werd dezelfde

22

methode gehanteerd maar hierbij werd het aandeel ddH2O vervangen door fosfaat gebufferde saline zonder CaCl2 en MgCl2 (PBS-) (Gibco®, Paisley, UK) (Tabel 3.2). 3.2.3 Methode C: Geoptimaliseerde sequentiële versus directe additie methode Om dezelfde viabiliteit te verkrijgen bij de onbehandelde cellen dus gecultiveerd zoals beschreven onder methode B, maar waarbij het aandeel AuNPs in de stalen vervangen werd door PBS- als bij cellen gecultiveerd met celmedium, werden verschillende mogelijkheden getest om methode B te optimaliseren. Van elke methode werd het spectrum opgenomen zodat kon worden nagegaan of beide dispersies eveneens uit afzonderlijke AuNPs of aggregaten bestonden. De eerste methode (C1) hield in dat de geaggregeerde dispersie werd aangemaakt volgens de sequentiële additie methode door aan 20 % AuNPs, achtereenvolgens 20 % PBSen 60 % dubbelgeconcentreerd celmedium toe te voegen. De dispersie met afzonderlijke NPs werd aangemaakt via de directe additie methode. Hierbij werd eerst 60 % dubbelgeconcentreerd celmedium en 20% PBS- samengevoegd. Vervolgens werd deze oplossing aan 20 % AuNPs toegevoegd. Voor de aanmaak van dubbelgeconcentreerd celmedium, werd aan DMEM met 0,45 % glucose, 20% FBS, 10% HS, 0,45 % glucose, 2% van een 200 mM L-glutamineoplossing en 4% penicilline/streptomycine-oplossing toegevoegd. Dit medium werd opnieuw doorheen een cellulose-acetaatmembraan gefiltreerd. Het staal voor de tweede methode (C2) werd op dezelfde manier aangemaakt als in de eerste methode maar hier werd het aandeel dubbelgeconcentreerd celmedium vervangen door celmedium. Dit zowel bij de geaggregeerde als niet geaggregeerde dispersie. Tot slot werd voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs nog een staal gemaakt volgens methode B waarbij het compleet celmedium vervangen werd door dubbelgeconcentreerd celmedium (C3) (Tabel 3.2). Door vervolgens de verschillende mogelijkheden te testen met MTT werd het meest geschikte protocol gekozen.

23

Tabel 3.2: Aanmaak van de verschillende dispersies voor de optimalisatie van protocol B.

Niet geaggregeerd (Protocol B) Geaggregeerd (Protocol B) Niet geaggregeerd (Protocol C2)

Niet geaggregeerd (Protocol C1) Geaggregeerd (Protocol C1) Niet geaggregeerd (Protocol C3)

AuNPs (%) 20 20 20 AuNPs (%) 20 20 20

ddH2O (%) 20

PBS(%) 20

ddH2O (%)

PBS(%) 20

20

Celmedium (%) + PBS- (%) 60 + / 60 + / 60 + 20 Dubbelgeconcentreerd celmedium (%) + PBS- (%) 60 + 20 60 + / 60 + /

3.3 STABILITEIT VAN NANOPARTIKELDISPERSIE OVER 24U In 3.6.2 wordt beschreven hoe deze verschillende methodes getest werden op cellen. Daar hieruit werd besloten om met methode C1 verder te werken zullen volgende experimenten enkel van deze stalen weergegeven worden (Tabel 3.3). Het was belangrijk dat zowel de geaggregeerde als niet geaggregeerde dispersie stabiel bleef gedurende de incubatieperiode van 24u aangezien de dispersies tijden de in vitro toxiciteitstesten voor 24u geïncubeerd werden. Daarom werden spectra opgemeten na 1, 2, 4, 6, 8 en 24u na aanmaak van de dispersies. Gedurende dit experiment werden de stalen bewaard bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Tabel 3.3: Aanmaak van de verschillende dispersies om de stabiliteit na te gaan over 24u.

Niet geaggregeerd (Protocol C1) Geaggregeerd (Protocol C1)

AuNPs (%) 20 20

PBS(%) 20

Dubbelgeconcentreerd celmedium (%) + PBS- (%) 60 + 20 60 + /

3.4 BEVESTIGING VAN DE AGGREGATIEPROFIELEN VIA DLS 3.4.1 Aanmaak serum vrije stalen voor DLS metingen Net zoals aggregaten zullen serumproteïnen ook leiden tot lichtverstrooiing, waardoor de distributieprofielen verkregen van de serumproteïnen zouden overlappen met de distributieprofielen bekomen van de AuNPs. Dit maakte het onmogelijk om de grootte van de AuNPs in de dispersies te bepalen zonder bijkomende verdunning van de stalen. Hierdoor werd eerst gezocht naar stalen waarbij het aandeel dubbelgeconcentreerd celmedium vervangen werd zonder de aggregatieprofielen te wijzigen. Hiervoor moest worden nagegaan 24

of de spectra in serumvrije stalen overeenstemden met de spectra in dubbelgeconcentreerd celmedium, zodanig dat de groottedistributies in de serumvrije stalen konden geëxtrapoleerd worden naar de dispersies waarmee cellen werden geïncubeerd. Om

verschillende

mogelijkheden

te

testen

werd

het

aandeel

aan

dubbelgeconcenteerd celmedium vervangen door DMEM zonder fenolrood en vervolgens door ddH2O. Beide media werden vergeleken met stalen aangemaakt zoals in methode C1 waarmee de cellen in een latere fase van dit project geïncubeerd werden (Tabel 3.4). Tabel 3.4: Aanmaak van de verschillende stalen om de aggregatieprofielen na te gaan in serumvrije stalen.

Niet geaggregeerd dubbel geconcentreerd celmedium Geaggregeerd dubbel geconcentreerd celmedium Niet geaggregeerd DMEM

AuNPs ddH2O PBS(%) (%) (%) 20 / /

Celmedium (%) + PBS- (%) 60 + 20

ddH2O DMEM (%) (%) / /

20

/

20

60 + /

/

/

20

20

/

/

/

60

Geaggregeerd DMEM Niet geaggregeerd ddH2O

20 20

/ 20

20 /

/ /

/ 60

60 /

Geaggregeerd ddH2O

20

/

20

/

60

/

3.4.2 DLS metingen Om na te gaan of de dispersies gedurende 24u stabiel bleven alsook de groottedistributie, werden DLS metingen uitgevoerd op 1, 4 en 24u na aanmaak van de dispersies. De niet geaggregeerde dispersie werd aangemaakt door aan 20 % AuNPs, 80 % ddH2O toe te voegen. De dispersie met aggregaten door aan 20 % AuNPs, 20 % PBS- toe te voegen gevolgd door 60 % ddH2O. Gedurende dit experiment werden de stalen bewaard bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Elke conditie werd in duplicaat gemaakt zodat bij elke conditie één staal telkens werd gehersuspendeerd alvorens de groottedistributie te bepalen, terwijl het andere staal niet werd gehersuspendeerd. Indien de UV/VIS-spectra in serumvrije stalen overeenstemden met de spectra in dubbelgeconcentreerd celmedium, konden de groottedistributies in de serumvrije stalen geëxtrapoleerd worden naar de

25

dispersies in dubbelgeconcentreerd celmedium die gebruikt werden in latere in vitro experimenten. 3.5 CELCULTUUR De in vitro experimenten werden uitgevoerd op de C17.2-cellijn. Dit zijn geïmmortaliseerde neuronale progenitorcellen van een muis. De cellen werden in kweek gehouden in 75 cm2 cultuurflessen (SPL Lifesciences®, Sinji-Ri, Korea) en geïncubeerd in een incubator (Nu-5510 E, Nuare, Plymouth, VK) bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Om de twee dagen werd het medium ververst. Wanneer de cellen voor 80 % confluent waren, werden ze 1/20 gesplit. 3.6 CELLEN UITPLATEN VOOR IN VITRO TESTEN De C17.2 cellen werden uitgezaaid in een 24-well plaat (SPL Lifesciences®, Sinji-Ri, Korea) waarbij elke well 50 000 cellen bevatte in 500 µL celmedium. De cellen in de celsuspensie werden geteld met behulp van een Bürkertelkamer (Blau brand, Germany). 50 µL van de celsuspensie werd samengevoegd met 100 µL 0,4 % trypaanblauw oplossing (SigmaAldrich®, Bornem, België), hiervan werd twee maal 10 µL in de bürkerkamer gebracht. Trypaanblauw fungeert als kleurstof die de dode cellen gaat merken. In dode cellen met membraanschade zal trypaanblauw worden opgenomen, waardoor ze blauw kleuren. In levende cellen met een goede membraanintegriteit zal trypaanblauw niet worden opgenomen, waardoor ze ook niet gaan kleuren.[64] Door met behulp van een microscoop de levende cellen te tellen kon dan aan de hand van onderstaande formule de hoeveelheid cellen per mL celsuspensie berekend worden (Formule 3.2). 𝑎𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛

= 1 𝑚𝐿 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑠𝑖𝑒

𝑎𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 0,1 µ𝐿

× 10000 × 3

(Formule 3.2)

3.7 MTT-TEST Deze techniek liet toe om de enzymatische activiteit van de mitochondriën te meten aan

de

hand

van

diphenyltetrazolium

een

bromide

kleurreactie. is

een

MTT

of

wateroplosbaar

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5tetrazoliumzout.

Door

de

dehydrogenasen aanwezig in de mitochondriën werd het gereduceerd tot het paars, onoplosbare formazan zoals geïllustreerd in de redoxreactie in Figuur 3.3. Lysisbuffer (0,04 N HCl in isopropanol) werd gebruikt om het formazan op te lossen. Hierdoor werd een paarse oplossing verkregen waarvan de absorptie bepaald kon worden. De gemeten absorbantie was 26

een maat van de resterende celactiviteit en kon gebruikt worden om de viabiliteit te kwanitificeren aan de hand van formule 3.3.[9] (http://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/articles/biofiles/cell-viability-and-proliferation.html) 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 (%) =

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑡𝑖𝑒𝑏𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑡𝑖𝑒𝑜𝑛𝑏𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛

(Formule 3.3)

Figuur 3.3: Redoxreactie waarbij MTT gereduceerd wordt tot formazan door mitochondriale dehydrogenasen. (http://2010.igem.org/Team:Freiburg_Bioware/Project/Methods)

Gedurende 24u werden de cellen geïncubeerd in een incubator bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Na 24u incubatie werd het medium van de cellen gehaald en 1 mL van de aangemaakte dispersies werd toegevoegd. De cellen werden opnieuw 24u geïncubeerd bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Na de incubatie werd het medium verwijderd waarna 400 µL compleet celmedium en 100 µL MTT-oplossing (5 mg/ml in PBS-) (Sigmaaldrich®, Steinheim, Germany) werden toegevoegd. Na drie uur incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2, werd het medium van de cellen gehaald en 300 µL lysisbuffer (0,04 N HCl in isopropanol) toegevoegd. Gedurende één uur vond een menging plaats bij kamertemperatuur. Tot slot werd de absorbantie gemeten met de EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer®, Massachusetts, VSA) bij 590 nm en bij 690 nm. De meting bij de hoogste golflengte diende om het achtergrondsignaal te kunnen detecteren. Deze methode werd gehanteerd voor het nagaan van de invloed van mediumdepletie alsook voor de bepaling van de toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke AuNPs en hun aggregaten. 3.7.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode B In een eerste screeningsexperiment werd volgende concentratierange getest: 10, 25, 50, 150, 250, 350 pM AuNP. Volgens methode B werd aan de NPs ddH2O of PBS- toegevoegd in een 1/1-verhouding. Hieraan werd 41% celmedium toegevoegd, zodanig dat het aandeel celmedium gelijk zou zijn voor de verschillende concentratie. Het resterende volume om tot 1

27

mL in elke well te komen werd opgevuld met ddH2O. In analogie bestond het medium voor de onbehandelde cellen uit 41% celmedium aangelengd met ddH2O. 3.7.2 Invloed van mediumdepletie Aangezien er een verlaagde viabiliteit gezien werd tijdens MTT-testen wanneer de onbehandelde cellen werden geïncubeerd met bovenvermelde dispersie, werd er gezocht naar andere condities om eenzelfde viabiliteit te verkrijgen voor de onbehandelde cellen als cellen geïncubeerd met conventioneel celmedium. Hierbij werd gekeken of de vervanging van ddH2O in PBS- en het gebruik van dubbelgeconcentreerd celmedium in plaats van celmedium beter aansloot bij cellen die in conventioneel celmedium gecultiveerd werden. (Tabel 3.5). Tabel 3.5: Aanmaak van de verschillende oplossingen voor het nagaan van de invloed van mediumdepletie.

Celmedium (%) Celmedium 100 Celmedium/ddH2O 50 Celmedium/PBS 50 Dubbelgeconcentreerd / celmedium/ ddH2O Dubbelgeconcentreerd / Celmedium/ PBS

Dubbelgeconcentreerd ddH2O (%) celmedium (%) / / / 25 / / 50 25 50

PBS- (%)

/

/ 25 50 25 50

3.7.3 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode C1 Aangezien met dubbel geconcentreerd medium gewerkt werd, werd het aandeel van AuNPs en PBS- beperkt tot 50 %. Hierdoor werd dit maal met volgende concentratieranges gewerkt: 5, 10, 25, 50, 150 en 250 pM AuNPs. Volgens methode C1 werd aan de AuNPs PBStoegevoegd in een 1:1-verhouding om aggregatie te induceren. Hieraan werd 58,2 % dubbel geconcentreerd celmedium toegevoegd zodanig dat het aandeel celmedium gelijk zou zijn voor de verschillende condities. Het resterend volume om tot 1 mL te komen in elke well werd opgevuld met PBS-. Ook voor de afzonderlijke NPs werd het aandeel celmedium aangelengd met PBS- vooraleer het geheel aan de NPs werd toegevoegd (zie bijlage Tabel 8.1).

28

4. RESULTATEN 4.1 KARAKTERISATIE 20 NM GOUDEN NANOPARTIKELS Vermits toxiciteitsprofielen van NPs afhankelijk zijn van hun fysicochemische eigenschappen is het belangrijk om met een goed gekarakteriseerd systeem te werken. De karakterisatiedata werden verkregen door Sigma, ter controle van deze data werd de hydrodynamische diameter, zѐta-potentiaal en LSPR-piek bepaald. Uit de DLS metingen bleek dat de gemiddelde hydrodynamische diameter van de AuNPs 26 nm bedroeg, hierbij werd een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,185 verkregen. Hieruit bleek dat de dispersie voldoende monodispers was, daar de PDI lager was dan 0,2. Aangezien het citraatgecoatte AuNPs zijn, werd de zèta-potentiaal geacht negatief te zijn. De gemeten zèta-potentiaal bedroeg -31,8 mV. De LSPR-piek werd gemeten bij een golflengte van 519 tot 521 nm. Alle onderzochte parameters liggen binnen het vooropgestelde interval dat aangegeven wordt door Sigma (Tabel 4.1). Tabel 4.1: Karakterisatiedata van 20 nm AuNPs in de originele dispersie zoals verkregen van Sigma en experimenteel bepaald.

Karakterisatie Sigma Aldrich Hydrodynamische diameter 21 - 32nm (PDI < 0,2) Diameter 18 -22 nm λmax 518 - 522 nm Concentratie 7,9*1011 NP/ml ≈ 1,195 nM Zѐta-potentiaal /

Experimentele karakterisatie 26 nm (PDI = 0,185) / 519 - 521 nm / -31,8 mV

4.2 CONTROLE NANOPARTIKELAGGREGATIE Chemische stoffen lossen meestal op in celmedium waardoor ze door de Brownse bewegingen homogeen verdeeld zijn. De toegediende dosis is hier vaak in overeenstemming met de concentratie waaraan de cellen worden blootgesteld. NPs daarentegen blijken in celmedium onderhevig te zijn aan diffusie, sedimentatie en aggregatie. Aangezien aggregatie zowel sedimentatie en diffusie beïnvloedt, is dit een belangrijke parameter om in rekening te brengen tijdens toxiciteitstudies. Zo kan dit leiden tot een verhoogde concentratie van NPs aan het celoppervlak waardoor zowel de opname als toxiciteit kan wijzigen. Vandaar het belang om de invloed van aggregatie op de toxiciteit na te gaan. Hiervoor is het gewenst om een protocol te hanteren dat toelaat om enerzijds de aggregaatvorming van AuNPs te

29

induceren en anderzijds de AuNPs als afzonderlijke partikels stabiel in dispersie te houden, zodat cellen met beide dispersies kunnen geïncubeerd worden. 4.2.1 Methode A: Sequentiële versus directe additie methode volgens Yang et al. Initieel werd uitgegaan van de bevindingen van Yang et al. Om aggregaten te creëren werden de AuNPs direct in celmedium met 10 % FBS gebracht. Om de aggregaatvorming te vermijden moesten de AuNPs toegevoegd worden aan 20 % FBS in ddH2O, waaraan vervolgens dubbelgeconcentreerde DMEM werd toegevoegd in een 1/1-ratio zodat de totale concentratie FBS in de dispersie 10 % bedroeg. De idee achter het principe van Yang et al. is dat de vorming van een proteïnecorona verhindert dat AuNPs kunnen aggregeren.[47] Uit het spectrum (Figuur 4.1) bekomen met UV/VIS-spectroscopie, kon afgeleid worden dat de LSPRpiek zowel voor de sequentiële methode als voor de directe methode bij dezelfde golflengte lag. Het absorptiemaximum voor beide methoden bedroeg respectievelijk 524 nm en 522 nm. Dit stemt overeen met het absorptiemaximum van de originele NPs, waaruit kon geconcludeerd worden dat de dispersies bij zowel de sequentiële als directe methode uit afzonderlijke AuNPs bestonden. De absorbantie voor de originele dispersie bij 521 nm bedroeg 0,98, terwijl de waarde voor de andere stalen 0,21 bedroeg. Dit kan verklaard worden door de wet van Lambert-Beer (Formule 4.1) waar de evenredigheid tussen de concentratie en absorbantie aangetoond wordt. Aangezien de originele dispersie verdund werd tijdens de aanmaak van de stalen was de concentratie aan AuNPs hier lager, waardoor de absorbantie ook lager was. Wet van Lambert-Beer: 𝐸 = 𝜀𝑐𝑑

(Formule 4.1)

𝐸 = Extinctie 𝜀 = Molaire extinctiecoëfficiënt (L/(mol.cm)) 𝑐 = Concentratie (mol/L) 𝑑 = Weglengte cuvet (cm)

30

Absorbantie

1.2 Origineel Sequentieel Direct

0.8

λmax (nm) Origineel Sequentieel Direct

0.4

521 522 524

0 450

550

650

750

Golflengte (nm) Figuur 4.1: Spectra bekomen na toevoegen van celmedium aan de AuNPs volgens de directe en sequentiële methode van Yang et al. Zowel bij directe als sequentiële methode, trad geen verschuiving van de λmax op t.o.v. de originele dispersie, waaruit bleek dat beide dispersies uit afzonderlijke AuNPs bestonden.

4.2.2 Methode B: Sequentiële additie ddH2O versus PBSDaar de methode van Yang et al. niet het gewenste resultaat opleverde en bleek dat NPs in celmedium niet aggregeerden werd gezocht naar een nieuwe methode om aggregatie te induceren. De literatuur stelt dat de beïnvloeding van de oppervlaktelading leidt tot een vermindering van de elektrostatische repulsie waardoor de aantrekkingskrachten tussen partikels stijgen. Hierdoor werd beslist om PBS- aan de AuNPs toe te voegen, zodat de aggregatie geïnduceerd werd. Om het aandeel celmedium in de dispersie met afzonderlijke AuNPs en aggregaten gelijk te houden werd voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs ddH2O toegevoegd. Er werd gekozen voor ddH2O aangezien hier geen ionen in aanwezig zijn en de lading van de AuNPs niet zou beïnvloed worden waardoor de dispersie stabiel bleef. Er werd gebruik gemaakt van het principe van de sequentiële additie, door eerst enerzijds ddH2O toe te voegen en anderzijds PBS-, gevolgd door celmedium. De toevoeging van PBS- aan de AuNPs resulteerde in een kleurverandering van de oplossing van rood naar blauw (Figuur 4.2 B). In het spectrum was dit zichtbaar als een bathochrome verschuiving van het absorptiemaximum van 524 nm naar 685 nm (Figuur 4.2 A). Hetgeen de inductie van NP aggregatie aangeeft.

31

Absorbantie

1.2

A

B

origineel

0.8

Niet geaggregeerd Geaggregeerd

0.4 0 450

550

650

Origineel Niet geaggregeerd Geaggregeerd

λmax (nm) 521 521 685

750

Golflengte (nm) Figuur 4.2 : Spectrum van AuNPs na sequentiële additie van ddH2O en celmedium in vergelijking met het spectrum na sequentiële additie van PBS- en celmedium. Na toevoeging van PBS-, werden aggregaten gevormd, hierbij trad een verschuiving van de LSPR-piek op naar hogere golflengte. Na toevoeging van ddH2O, bleef de λmax gelijk aan deze van de originele dispersie (A). Kleurverandering van de dispersie van rood naar blauw wanneer aggregaten gevormd worden door toevoeging van PBS(rechts) ten opzicht van AuNPs in ddH2O (links) (B).

4.2.3 Methode C: Geoptimaliseerde sequentiële versus directe additie methode Om aan de daling in celviabiliteit tegemoet te komen werd het celmedium vervangen door dubbelgeconcentreerd celmedium en werd niet langer ddH2O gebruikt. Er werden verschillende methodes ontwikkeld waarbij deze condities gewijzigd werden. Bij methode C1 werd geen ddH2O gebuikt maar werd er aangelengd met PBS- en gebruik gemaakt van dubbelgeconcentreerd medium. Bij methode C2 werd opnieuw aangelengd met PBS- zonder gebruik te maken van ddH2O, maar deze dispersie werd aangemaakt in celmedium. Tot slot werd nog methode C3 getest. Deze methode omvatte hetzelfde principe als bij methode B voor de

afzonderlijke

AuNPs

maar

hierbij

werd

het

celmedium

vervangen

door

dubbelgeconcenreerd celmedium. Aan de hand van de spectra van deze verschillende dispersies werd gekeken of de LSPR-piek verkregen bij de nieuwe methodes gelijk was aan de LSPR-piek verkregen met methode B. Hierbij werd vastgesteld dat bij elke methode de LSPRpiek gelijk bleef in vergelijking met het overeenkomstige staal aangemaakt via methode B. Dit toont aan dat via deze methodes de aggregatieprofielen vermoedelijk gelijk bleven (Figuur 4.3 en 4.4). Na het testen welk protocol de minste invloed had op de viabiliteit kon het meest geschikte protocol gekozen worden.

32

Absorbantie

1.2 Origineel Methode B Methode C1 Methode C2 Methode C3

0.8 0.4 0 450

550

650

750

Origineel Methode B Methode C1 Methode C2 Methode C3

λmax (nm) 520 525 520 525 524

Golflengte (nm) Figuur 4.3: Vergelijking van de spectra voor de afzonderlijke AuNPs van de nieuw ontwikkelde methodes met methode B. Aangezien de LSPR-pieken via elke methode gelijk bleven, werd vermoed dat de aggregatieprofielen gelijk bleven ten opzichte van methode B.

Absorbantie

1.2 Origineel

0.8

Methode B 0.4

Methode C1

Origineel Methode B Methode C1

λmax (nm) 520 688 687

0 450

550

650

750

Golflengte (nm) Figuur 4.4: Vergelijking van de spectra verkregen via methode C1 en methode B. Aangezien er geen wijziging van λmax optrad, waren de verkregen aggregatieprofielen vermoedelijk gelijk.

4.3 STABILITEIT VAN DE NANOPARTIKELDISPERSIE OVER 24U Aangezien de cellen tijdens de in vitro testen voor 24u geïncubeerd werden, werd de stabiliteit van beide dispersies nagegaan over 24u. In de resultaten hier weergegeven, worden enkel de spectra volgens methode C1 getoond, omdat deze methode finaal gebruikt werd voor de toxiciteitsbepaling. Uit Figuur 4.5 kon worden afgeleid dat de dispersie met afzonderlijke AuNPs stabiel bleef gedurende 24u, gezien er geen wijziging van de LSPR-piek optrad. De LSPRpiek was gelegen bij een golflengte van 521 à 525 nm, wat in overeenstemming was met de originele AuNPs. Dit was ook het geval voor de aggregaten, waar de LSPR-piek steeds gelegen lag tussen 657 nm en 670 nm (Figuur 4.6). Origineel 1u 2u 4u 6u 8u 24u

Absorbantie

1.2 0.8 0.4 0 450

550

650

750

Origineel 1u 2u 4u 6u 8u 24u

λmax (nm) 520 522 525 521 521 522 521

Golflengte (nm) Figuur 4.5: Spectra van de afzonderlijke AuNPs in dubbelgeconcentreerd celmedium na 1, 2, 4, 6, 8 en 24u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax bleef gedurende 24u gelijk. Dit wees op de stabiliteit van de dispersie gedurende 24u aan.

33

Origineel 1u 2u 4u 6u 8u 24u

Absorbantie

1.2 0.8 0.4

Origineel 1u 2u 4u 6u 8u 24u

0 450

550

650

λmax (nm) 520 667 670 667 657 662 657

750

Golflengte (nm) Figuur 4.6: Spectra van de aggregaten in dubbelgeconcentreerd celmedium na 1, 2, 4, 6, 8 en 24u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5-%CO2. De λmax bleef gedurende 24u gelijk, wat wees op de stabiliteit van de dispersie gedurende 24u.

4.4 BEVESTIGING VAN DE AGGREGATIEPROFIELEN VIA DLS Ter controle van de aggregatieprofielen werd DLS uitgevoerd. Met DLS zou een verschuiving van de grootte moeten waaargenomen worden bij de aggregaten tegenover de afzonderlijke partikels. Daarnaast maakte deze techniek het mogelijk om een schatting van de groottedistributie van de partikels in dispersie te maken. 4.4.1 Aanmaak van serum vrije stalen voor DLS metingen Aangezien proteïnen aanwezig in het celmedium zouden interferen met de meting moest een medium gebruikt worden zonder serumproteïnen. Aanvankelijk werd gebruik gemaakt van DMEM zonder serum. Dit leidde echter tot de vorming van aggregaten in de dispersie met afzonderlijke AuNPs (zie bijlage Figuur 8.1). Hierdoor werd overgegaan naar ddH2O. De dispersie met afzonderlijke AuNPs werd aangemaakt door de AuNPs aan te lengen met ddH2O. Voor de dispersie met aggregaten werd aan de AuNPs in een 1/1-verhouding PBStoegevoegd, waarna aangelengd werd met ddH2O tot eenzelfde totaal volume als in de dispersie met afzonderlijke AuNPs. Er traden geen verschuivingen op van de LSPR-pieken voor de afzonderlijke NPs en aggregaten in ddH2O in vergelijking met dubbelgeconcentreerd celmedium. Hieruit kon worden geconcludeerd dat na de vorming van de aggregaten de toevoeging van ddH2O geen invloed meer had op de aggregatie (Figuur 4.7). Hierdoor konden de DLS data van serumvrije stalen een schatting opleveren van de grootterange van de AuNPs in serumhoudende dispersies waarmee geïncubeerd werd.

34

Origineel

1.2

Absorbantie

Niet geaggregeerd in ddH2O Niet geaggregeerd dubbelgeconcentreerd medium Geaggregeerd in ddH2O

0.8

Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium

0.4

0 450

550

650

750

Origineel Niet geaggregeerd in ddH2O Niet geaggregeerd in dubbel geconcentreerd celmedium Geaggregeerd in ddH2O Geaggregeerd in dubbel geconcentreerd celmedium

λmax (nm) 520 520 523

665 668

Golflengte (nm)

Figuur 4.7: Vergelijking van de spectra van geaggregeerde en niet-geaggregeerde AuNPs in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium. λmax bleef gelijk voor de dispersies in ddH2O in vergelijking met de dispersises in dubbelgeconcentreerd celmedium,

4.4.2 DLS metingen De spectra van de dispersie met afzonderlijke AuNPs en aggregaten werden zowel opgenomen in ddH2O als in dubbelgeconcentreerd celmedium. Hierbij werd nagegaan of de LSPR-pieken in beide dispersies gelijk bleven aan elkaar in functie van de tijd. Figuur 8.2 tot 8.7 in bijlage tonen aan dat de LSPR-pieken in ddH2O in overeenstemming waren met de LSPRpieken in dubbelgeconcentreerd medium waaruit kon geconcludeerd worden dat de AuNPs in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium zich in dezelfde grootterange bevonden en stabiel bleven in functie van de tijd. Hierdoor was het mogelijk om de groottedistributies verkregen via DLS in serumvrije stalen te extrapoleren naar stalen in dubbelgeconcentreerd celmedium. De aggregatieprofielen werden met DLS bevestigd. Als eerste werd de stabiliteit van de originele dispersie nagegaan. Er werd geen wijziging van het distributieprofiel vastgesteld gedurende de incubatie van 24u (Figuur 4.8). De waarden voor de hydrodynamische diameter waren steeds gelegen tussen 26 nm en 27 nm. Intensitet (%)

14 Origineel 1u 9

origineel 4u

4

Origineel 24u

-1

1

10

100

Hydrodynamische diameter (nm)

1000

Figuur 4.8: Groottedistributie op basis van de intensiteit van de originele dispersie na 1, 4 en 24u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. Er werd geen wijziging van de gemiddelde hydrodynamische diameter vastgesteld gedurende de incubatie, waaruit blijkt dat de dispersie stabiel bleef.

35

Voor de dispersies met de afzonderlijke AuNPs, was het opmerkelijk dat in het niet gehersuspendeerde staal een verschuiving van de gemiddelde hydrodynamische diameter was naar hogere waardes na 4u incubatie (Figuur 4.9). Waar voor de meting na 1u een waarde van 27 nm gemeten werd, bedroeg deze na 24u 45 nm. Dit werd echter niet gezien in het gehersuspendeerde staal, waar de gemiddelde diameter na 1u en 24u respectievelijk 29 nm en 32 nm bedroeg (Figuur 4.10). In tabel 4.2 is bovendien te zien dat de grootterange van de niet geheruspendeerde dispersie groter was en een hogere PDI-waarde bereikt werd voor dit staal. Daarnaast was in de dispersies met afzonderlijke AuNPs een tweede piek te zien bij een hydrodynamische diameter van minstens 220 nm. Aangezien in de deeltjesgroottedistributie geen tweede populatie werd vastgesteld, kon worden besloten dat slecht een klein percentage van de totale populatie uit aggregaten bestond. Aangezien hiermee de stabiliteit van de dispersies bevestigd werd, konden deze condities gebruikt worden om te incuberen.

Inensiteit (%)

14

Niet geaggregeerd 1u

9

Niet geaggregeerd 4u

4

Niet geaggregeerd 24u

-1

1

10

100

1000

Hydrodynamische diameter (nm) Figuur 4.9: Groottedistributie op basis van de intensiteit van de afzonderlijke AuNPs in het niet gehersuspendeerde staal na 1, 4 en 24u incubatie. Er is duidelijk te zien dat na een incubatietijd van 4u er een verschuiving van de deeltjesgrootte optrad.

Intensiteit (%)

14

Niet geaggregeerd 24u (Gehersuspendeerd)

9 Niet geaggregeerd 24u (niet gehersuspendeerd)

4 -1

1

10

100

1000

Hydrodynamische diameter (nm) Figuur 4.10: Groottedistributie op basis van de intensiteit van afzonderlijke AuNPs na 24u incubatie in het gehersuspendeerde en niet gehersuspendeerde staal. Het niet gehersuspendeerde staal vertoonde na 24u duidelijk een hogere gemiddelde hydrodynamische diameter dan het gehersuspendeerde staal.

36

Tabel 4.2: De groottedistributie van de afzonderlijke AuNPs. Hierbij was duidelijk te zien dat het niet gehersuspendeerde staal een hoger gemiddelde hydrodynamische diameter had en een bredere grootterange tegenover het gehersuspendeerde staal. Beide stalen vertoonden een tweede populatie bij hogere grootteranges.

T24

Gem. hydr. Diameter (nm) Grootterange 1 (nm) Grootterange 2 (nm) PDI

Niet gehersuspendeerd 45 14 - 142 225-1718 (9,7 %) 0,379

Gehersuspendeerd 32 12 - 79 396 -3570 (11,5%) 0,293

Voor de geaggregeerde dispersie, werd geen verschuiving van het profiel vastgesteld in functie van de tijd in vergelijking met de groottedistributie verkregen na 1u incubatie. Hierbij bedroeg de gemiddelde hydrodynamische diameter voor de niet gehersuspendeede dispersie 143 nm na 1u en 145 nm na 24u incubatie (Figuur 4.11). Voor de gehersuspendeerde

Intensiteit (%)

dispersie bedroegen deze respectievelijk 128 nm en 165 nm (zie bijlage Figuur 8.8). 14

Geaggregeerd 1u Geaggregeerd 4u Geaggregeerd 24u

9 4 -1

1

10

100

1000

Hydrodyamische diameter (nm) Figuur: 4.11: Groottedistributie op basis van de intensiteit van de aggregaten na 1, 4 en 24u incubatie, waarbij niet gehersuspendeerd werd.

Uit deze data kon een schatting gemaakt worden van de grootte van de afzonderlijke AuNPs en aggregaten. Aangezien het polydisperse systemen zijn, is

het beter om de

grootterange in acht te nemen dan de gemiddelde hydrodynamische diameter. Voor de originele dispersie werd een gemiddelde hydrodynamische diameter verkregen tussen 26 nm en 27 nm. Deze sluit dicht aan bij de hydrodynamische diameter voor de afzonderlijke AuNPs. Na 1u incubatie bedroeg deze 27 nm, terwijl deze na 24u incubatie door de vorming van agglomeraten 45 nm bedroeg. Ze bevonden zich steeds in een grootterange van 12 nm tot 142 nm. Voor de aggregaten bedroeg de hydrodynamische diameter 145 nm en bevonden ze zich in een grootterange van 51 nm tot 459 nm (Tabel 4.3). Aangezien de laagste waarde voor deze grootterange 51 nm bedroeg, wat hoger was dan de hydrodynamische diameter voor de afzonderlijke AuNPs, werd aangetoond dat een zwart-wit situatie gecreëerd werd van afzonderlijke AuNPs en aggregaten. 37

Tabel 4.3: Resultaten van de DLS meting waarbij de groottedistributies worden weergegeven van de verschillende dispersies, waarbij niet gehersuspendeerd werd na 1, 4 en 24u incubatie.

T1

T4

T24

Origineel Gem. hydr. Diameter(nm) 26 Grootterange (nm) 12 - 68 PDI 0,185 Gem. hydr. Diameter 1 (nm) 26 Grootterange 1 (nm) 12 - 79 Gem. hydr. Diameter 2 (nm) / Grootterange 2 (nm) / PDI 0,188 Gem. hydr. Diameter (nm) 27 Grootterange 1 (nm) 12 - 79 Gem. hydr. Diameter 2 (nm) / Grootterange 2 (nm) / PDI 0,232

Afzonderlijk NP 27 12 -79 0,203 32 12 - 91 2331 295 - 3091 (9,7 %) 0,290 45 14 - 142 650 225-1718 (11,3 %) 0,397

Aggregaten 143 59 - 459 0,187 138 51 - 459 / / 0,181 145 59 - 459 / / 0,188

4.5 MTT-TEST 4.5.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode B De disperies werden aangemaakt zoals vermeld onder 3.7.1. Wanneer cellen werden geïncubeerd met deze dispersies werden lage absorbantiewaarden verkregen voor de onbehandelde cellen. Hetgeen wijst op een lage viabiliteit van de onbehandelde cellen. Door dit lage signaal was het onmogelijk nauwkeurig verschillen vast te stellen in toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke NPs of hun aggregaten (Resultaten niet weergegeven). 4.5.2 Invloed van mediumdepletie Om de verlaagde viabiliteit in de onbehandelde cellen weg te werken werd het aggregatieprotocol geoptimaliseerd zoals eerder vermeld onder 4.2.3. Hier werd nagegaan of het gebruik van dubbelgeconcentreerd celmedium tegemoet kwam aan het verlies aan de fractie aan celmedium door het gehalte aan AuNPs en ddH2O in de dispersies. Bovendien werd bepaald of het opportuun was om ddH2O te gebruiken en of er al dan niet een hogere viabiliteit werd verkregen door gebruik te maken van PBS-. Deze test toonde aan dat de absorbantie voor oplossingen met ddH2O lager was dan wanneer deze fractie door PBS- werd vervangen. Het beste alternatief werd verkregen door dubbelgeconcentreerd medium in combinatie met PBS- te gebruiken zoals in methode C1. Hierbij werd de hoogste viabiliteit verkregen dewelke vergelijkbaar was met de viabiliteit van cellen gecultiveerd in conventioneel celmedium (Figuur 4.12). 38

0.7 0.6

Absorbantie

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 celmedium

celmedium/ddH2O

celmedium/PBS-

2x geconc. celmedium/ddH2O

2x geconc. celmedium/PBS-

Figuur 4.12: Absorbantie verkregen bij de verschillende condities om de invloed van mediumdepletie na te gaan.

4.5.3 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikels volgens methode C1 Na de optimalisatie van het protocol werd er geopteerd om met protocol C1 verder te werken om de acute toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke AuNPs en de aggregaten na te gaan. Voor de niet geaggregeerde AuNPs bedroeg de viabiliteit ongeveer 90 % voor de laagste concentraties tot en met 50 pM. De concentraties 150 en 250 pM leidden allebei tot een sterke daling in viabiliteit tot circa 59 %. De aggregaten daarentegen vertoonden een sterkere toxiciteit. Bij de laagste concentraties bedroeg de viabiliteit 84 %, terwijl bij 150 en 250 pM, een viabiliteit van 49 % werd opgemeten. Op het eerste zicht bleken aggregaten dus meer toxisch te zijn in vergelijking met hun afzonderlijke AuNPs in dezelfde concentratie. Toch kan op het 5 %- significantieniveau geen significante daling van de viabiliteit worden vastgesteld van aggregaten tegenover afzonderlijke AuNPs (Figuur 4.13) Niet geaggregeerde AuNP

Viabiliteti (%)

100%

Geaggregeerde AuNP

80% 60% 40% 20% 0% 5 pM

10 pM

25 pM

50 pM

150 pM

250 pM

Concentratie AuNP (pM) Figuur 4.15: Viabiliteit voor afzonderlijke AuNPs tegenover hun aggregaten. Zowel voor de aggregaten als de afzonderlijke NPs is er een sterke daling van de viabiliteit bij een concentratie vanaf 150 pM. Aggregaten bleken een hogere toxiciteit te vertonen in vergelijking met afzonderlijke AuNPs, toch kon dit niet worden bevestigd op het 5 %-significantieniveau (n=3).

39

5. DISCUSSIE In deze masterproef werd een protocol ontwikkeld dat toeliet om een stabiele dispersie te verkrijgen met afzonderlijke AuNPs en een dispersie met aggregaten. Dit om vervolgens het verschil in acute toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke AuNPs en aggregaten te kunnen onderzoeken. Vooreerst werd de originele AuNPs dispersie gekarakteriseerd om met zekerheid te kunnen aannemen dat de dispersie aan de karakterisatiedata van Sigma voldeed. Uit deze data werd verkregen dat de gemiddelde hydrodynamische diameter voor de AuNPs in de originele dispersie 26 nm bedroeg. Hierbij hadden ze een zèta-potentiaal van -31,8 mV en was de LSPR-piek gelegen tussen 519 en 521 nm. Deze resultaten voldeden aan de vooropgestelde waarden verkregen van Sigma. Vervolgens werd een protocol ontwikkeld zodat een dispersie met aggregaten en een dispersie met afzonderlijke AuNPs verkregen werd. Aanvankelijk werd gedacht dat AuNPs in celmedium zouden aggregeren terwijl de dispersie stabiel zou blijven wanneer DMEM sequentieel aan de dispersie van AuNPs met serumoplossing zou worden toegevoegd. Figuur 4.1 laat zien dat de sequentiële en directe additie van celmedium volgens Yang et al. niet toeliet om een zwart-wit situatie te creëren van enerzijds een dispersie met onafhankelijke AuNPs en anderzijds een dispersie met aggregaten. Beide dispersies bekomen via deze methode hadden immers een LSPR-piek bij 522 en 524 nm respectievelijk, waaruit bleek dat geen aggregaten gevormd werden. De hypothese van Yang et al. was gebaseerd op het principe dat de aggregatiekinetiek sneller verliep dan de vorming van een proteïnecorona.[47] In de resultaten hier verkregen werd dus het tegendeel bewezen. De vorming van de proteïnecorona had een snellere kinetiek dan de vorming van aggregaten. In de literatuur worden drie mechanismen naar voor geschoven om de interactie van serumeiwitten met de citraatgecoatte AuNPs te verklaren. Ten eerste kunnen omwille van elektrostatische attractie de positief geladen groepen van aminozuren zoals lysine interageren met de negatieve citraatcoating van de AuNPs. Ten tweede kunnen aminozuren zoals cysteïne door middel van een thiolbinding aan het oppervlak van goud adheren.[65] Tot slot kunnen serumcomponenten door middel van hydrofobe interacties een proteïnecorona vormen omheen de AuNPs. Deze laatste hypothese wordt door DominguezMedina et al. naar voor geschoven als zijnde het belangrijkste mechanisme om de stabilisatie van afzonderlijke AuNPs in serum te verklaren. Er werd vermoed dat wanneer serum via 40

elektrostatische interacties aan de citraationen zou binden, de bindingsaffiniteit zou dalen ten gevolge van de binding van zouten aan de citraationen wanneer deze in een oplossing met hoge ionensterkte aan de AuNPs zou worden toegevoegd. Dit doordat minder citraatgroepen vrij zouden zijn om een binding met serumeiwitten aan te gaan. Toch bleek echter dat de bindingsaffiniteit van runderalbumine (BSA) voor de AuNPs steeg bij een hoge ionensterkte. Daarnaast werd ook aangetoond dat na modificering van de thiolgroepen van BSA zodat geen thiolbindingen meer konden gevormd worden met de AuNPs, de dispersie van afzonderlijke AuNPs toch stabiel bleef. Uit deze vaststellingen werd vermoed dat hoofdzakelijk hydrofobe interacties leidden tot de stabilisatie van de afzonderlijke NPs.[66] Zoals eerder aangetoond, trad na toevoeging van een oplossing met hoge ionensterkte zoals PBS- wel aggregatie op.[67] Kationen konden binden aan de negatief geladen carboxylgroepen van de citraatcoating, waardoor de oppervlaktelading geneutraliseerd werd. De elektrostatische repulsie was daardoor niet langer sterker dan de van der Waalskrachten, waardoor de AuNPs aggregeerden.[21] In de dispersie was dit waar te nemen als een kleurverandering van een rode naar blauwe tint. Aangezien in ddH2O geen ionen aanwezig zijn die de oppervlaktepotentiaal kunnen wijzigen en de vorming van aggregaten induceren, bleef de dispersie stabiel in ddH2O. Het is dan ook van zelfsprekend dat na toevoeging van ddH2O, geen kleurverandering van de dispersie optrad. Aangezien volgens de methode van Yang et al. bleek dat de serumproteïnen de vorming van aggregaten verhinderden, werd besloten om het sequentieel principe te behouden onder gewijzigde vorm. Zo werd aan de AuNPs, ddH2O of PBS- toegevoegd, gevolgd door de toevoeging van celmedium, zodanig dat de vorming van de proteïnecorona omheen de aggregaten en afzonderlijke AuNPs de dispersies stabiliseerden. Nadat cellen met deze dispersies geïncubeerd werden, werd met een MTT-test de viabiliteit van de cellen bepaald. Hieruit bleek echter dat zelfs de viabiliteit van de onbehandelde cellen verlaagd was in vergelijking met cellen geïncubeerd met celmedium. Dit betekende dus dat de cellen reeds aan stress onderhevig waren, onafhankelijk van de blootstelling aan AuNPs. Uit deze bevindingen werd besloten om het protocol te optimaliseren. Met een MTT-test werd eerst de viabiliteit van verschillende oplossingen vergeleken. Zo werd een oplossing met ddH2O, PBS- en celmedium vergeleken met een oplossing van enkel celmedium en PBS-. Daarnaast werd in deze beide stalen het celmedium 41

ook vervangen door dubbelgeconcentreerd celmedium. Het was opmerkelijk dat alle stalen zonder ddH2O een hogere viabiliteit vertoonden in vergelijking met stalen waarin ddH2O aanwezig was. Dit is te verklaren doordat de dispersies niet langer isotoon, maar hypotoon waren wanneer aangelengd werd met ddH2O en ten gevolgde van de gewijzigde pH. Daarnaast vertoonden stalen met dubbelgeconcentreerd medium een betere viabiliteit in vergelijking met dezelfde stalen met celmedium. Door het gehalte aan nutriënten te verhogen steeg dus ook de viabiliteit. Het staal met enkel dubbelgeconcentreerd celmedium en PBS- vertoonde eenzelfde viabiliteit als het controlestaal met celmedium, waaruit bleek dat dit staal de beste benadering was voor de onbehandelde cellen. Uit de spectra in Figuur 4.3 en 4.4 werd aangetoond dat de sequentiële toevoeging van dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS- niet tot een wijziging van de eerder verkregen spectra leidde. Voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs kon dus via de directe additie methode dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS- worden toegevoegd en voor de aggregaten kon de oplossing van dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS-, sequentieel worden toegevoegd aan de dispersie met AuNPs en PBS-. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de resultaten van Dominguez-Medina et al. In deze studie werd opgemerkt dat er geen bathochrome verschuiving was van de spectra wanneer BSA in een oplossing met hoge ionensterkte werd toegevoegd in vergelijking met BSA op zich. Dit is nogmaals de bevestiging voor de snellere vorming van de proteïnecorona tegenover de aggregatiesnelheid

waardoor

afzonderlijke

AuNPs

gestabiliseerd

worden

in

een

serumoplossing. In de studie van Dominguez-Medina et al. deed de sequentiële toevoeging van BSA aan de dispersie van AuNPs en NaCl de aggregatievorming direct stoppen, waardoor een dispersie werd verkregen met zowel aggregaten als afzonderlijke AuNPs. Dit is in tegenstelling met de resultaten die hier verkregen werden, aangezien in de dispersie met aggregaten vermoedelijk geen afzonderlijke AuNPs meer in aanwezig waren.[66] Dit werd gezien in Figuur 4.4, waar één LSPR-piek vastgesteld werd bij een golflengte van 687 nm, wat betekende dat de dispersie enkel uit aggregaten bestond. Vervolgens werd er nagegaan of de dispersies stabiel bleven gedurende 24u. Dit om met zekerheid te kunnen aannemen dat de zwart-wit situatie van de dispersies aangehouden werd wanneer ze voor 24u werden geïncubeerd bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%CO2 tijdens de in vitro testen. Zoals aangetoond in Figuur 4.5 en 4.6 werd geen verschuiving 42

van de LSPR-piek vastgesteld na 24u incubatie. Dit toont aan dat zowel de dispersies met afzonderlijke AuNPs als met aggregaten stabiel bleven. Om de stabiliteit van de dispersies over 24u te bevestigen werden DLS metingen uitgevoerd, waarmee de grootte van de AuNPs bovendien geschat kon worden. Aangezien serumcomponenten zich in de grootterange van de AuNPs bevinden zouden de groottedistributies overlappen met de profielen verkregen voor de AuNPs. Hiervoor was het nodig om dispersies met dezelfde grootterange van AuNPs te creëren in een medium vrij van serum. Vooreerst werd uitgegaan van DMEM als vervangend medium voor het celmedium. Toch bleek echter dat door de hoge ionensterkte van DMEM en door de afwezigheid van serum in dit medium de dispersie niet gestabiliseerd werd. Dit uitte zich in een verschuiving van de LSPR-piek naar hogere golflengte, waaruit bleek dat de dispersie dus aggregaten bevatte (Figuur 8.1). Dit is in overeenstemming met de resultaten verkregen door Casals et al. waarbij DMEM (met 1000 mg/L glucose, NaHCO3, C3H3NaO3 en fenolrood) zonder serum leidde tot de vorming van aggregaten. In de originele dispersie werden de citraatgecoatte AuNPs gestabiliseerd door de elektrostatische repulsie tussen de negatieve ladingen van de carboxylgroepen van de coating, terwijl deze geneutraliseerd worden in een medium met hoge ionensterkte zoals DMEM waardoor de aggregatie geïnduceerd wordt.[68] Gezien het belang van de ionensterkte van het medium om de vorming van aggregaten te vermijden zou ddH2O dus een goed alternatief bieden, aangezien hier geen ionen in aanwezig zijn. Dit werd dan ook bevestigd in de spectra in Figuur 4.7. Daarnaast moesten de spectra van de AuNPs in celmedium overlappen met de spectra van de AuNPs in ddH2O, zodat er met zekerheid kon worden aangetoond dat volgens beide methodes aggregaten en afzonderlijke AuNPs met dezelfde grootte gevormd werden. Aangezien deze data overeenstemden konden de data van de DLS metingen geëxtrapoleerd worden naar de dispersies waarmee geïncubeerd werd. Met DLS metingen werd echter vastgesteld dat na 24u incubatie er in de dispersie met afzonderlijke NPs een verschuiving was van de groottedistributie op basis van intensiteit naar een hogere gemiddelde hydrodynamische diameter. Zo bedroeg deze na 1u 27 nm, terwijl deze na 24u 45 nm bedroeg. Vermits deze verschuiving enkel zichtbaar was in het staal dat niet gehersuspendeerd was, wijst dit op de vorming van agglomeraten. In het gehersuspendeerde staal werkte tijdens het hersuspenderen een externe mechanische kracht 43

op de agglomeraten in, waardoor de zwakke bindingen tussen de verschillende AuNPs in de agglomeraten gebroken werden. In dit staal bedroeg de hydrodynamische diameter na 1 en 24u respectievelijk 29 en 32 nm, wat in overeenstemming is met de grootte van de NPs in de originele dispersie. Daarnaast werd in de niet-geaggregeerde stalen nog een tweede populatie gezien bij een grootte van minstens 220 nm, dit zijn aggregaten. Aangezien deze populatie niet gezien werd in de deeltjesdistributie, is het aandeel aggregaten verwaarloosbaar waardoor deze conditie kon gebruikt worden ter vervanging van het celmedium. Voor de dispersie met aggregaten, bleef de dispersie gedurende 24u stabiel en bedroeg de gemiddelde hydrodynamische diameter van de dispersie 145 nm in een grootterange van 51 nm tot 459 nm. Deze waarde van 51 nm toont aan dat er geen NPs aanwezig waren met een kleinere diameter, wat er op wees dat er geen afzonderlijke AuNPs in de dispersie aanwezig zijn, aangezien deze een hydrodynamische diameter van circa 26 nm hadden. Hierdoor kon met zekerheid gezegd worden dat een zwart-wit situatie werd verkregen van een dispersie met aggregaten en een dispersie met afzonderlijke AuNPs. Gezien de stabiliteit van de dispersies bewezen in de spectra en tijdens de DLS metingen, werden cellen met beide dispersies geïncubeerd. Hier dient opgemerkt te worden, dat de grootterange bepaald werd aan de hand van DLS metingen. Aangezien DLS minder geschikt is voor polydisperse systemen, een hogere scattering vertoont voor grotere partikels en elk deeltje als sferisch beschouwd wordt, zijn deze grootteranges slechts een schatting van de effectieve waardes. Een correctere weergave van

de

groottedistributie

zou

kunnen

verkregen

worden

met

transmissie-

elektronenmicroscopie.[62] Na incubatie van beide dispersies in een concentratierange van 5 pM tot 250 pM kon met behulp van MTT-testen, het verschil in toxiciteit geïnduceerd door deze dispersies nagegaan worden. Terwijl voor de concentratierange van 5 pM tot 50 pM 90 % viabiliteit werd waargenomen voor de incubatie met afzonderlijke AuNPs, bedroeg deze voor de aggregaten 84 %. Een grotere daling van de viabiliteit werd gezien bij concentraties van 150 en 250 pM. Hierbij bedroeg de viabiliteit voor de afzonderlijke AuNPs 59 % tegenover 49 % voor de aggregaten. Toch bleek echter dat er geen significante verschillen in toxiciteit optraden tussen afzonderlijke AuNPs en hun aggregaten op het 5 %- significantieniveau. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de bevindingen van Albanese et al. waarbij geen wijziging in de 44

celviabiliteit werd waargenomen na incubatie met afzonderlijke AuNPs en aggregaten. De viabiliteit werd in deze studie bepaald aan de hand van een XTT-screeningstest.[21] Zowel bij een MTT-test als XTT-test wordt de viabiliteit bepaald aan de hand van de mitochondriale activiteit. Deze MTT-test is slechts een eerste screening op het verschil in toxiciteit geïnduceerd door afzonderlijke AuNPs en hun aggregaten. Hierdoor is het belangrijk om in volgende experimenten verschillende toxiciteitsmechanismen te onderzoeken om zo een beter inzicht te krijgen in het toxiciteitsprofiel. Daarnaast dient de opname van beide dispersies ook nog onderzocht te worden aangezien in de literatuur zowel een gedaalde als een gestegen opname voor aggregaten tegenover afzonderlijke AuNPs wordt gemeld.[37,57]

45

6. CONCLUSIE Alvorens de aggregatieprofielen van AuNPs in celmedium te controleren werd de originele AuNPs dispersie gekarakteriseerd. Hiermee werden de karakterisatiedata van Sigma voor de AuNP dispersie bevestigd. In een eerste test om een dispersie met aggregaten en een dispersie met afzonderlijke AuNPs te verkrijgen werd vastgesteld dat de toevoeging van celmedium aan de AuNPs, de dispersie stabiliseerde. Ook na sequentiële toevoeging van DMEM aan de dispersie met AuNPs in serumoplossing, bleef de dispersie stabiel. Dit toont aan dat de vorming van een proteïnecorona omheen de AuNPs een snellere kinetiek heeft dan de aggregatiesnelheid. Vervolgens werd aangetoond dat door wijziging van de zèta-potentiaal door toevoeging van zouten onder vermelding van PBS-, aggregatie kon geïnduceerd worden. Zo was het mogelijk om PBS- aan de dispersie toe te voegen, gevolgd door de toevoeging van celmedium, waarbij een stabiele dispersie van aggregaten verkregen werd. Voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs kon ddH2O gebruikt worden in plaats van PBS-, aangezien hier geen ionen in aanwezig zijn die de zèta-potentiaal beïnvloedden en de aggregatie induceerden. Vervolgens werd dit protocol geoptimaliseerd zodat eenzelfde pH, gehalte aan nutriënten en isotoon milieu verkregen werd als in celmedium. Hiervoor werd niet langer gebruik gemaakt van ddH2O maar werd er aangelengd met PBS- en gebruik gemaakt van dubbelgeconcentreerd medium. Voor de dispersie met afzonderlijke AuNPs werd aan de AuNPs volgens de directe additie methode dubbelgeconcentreerd medium met PBS- toegevoegd, terwijl voor de dispersie met aggregaten PBS- aan de AuNPs werd toegevoegd, gevolgd door dubbelgeconcentreerd celmedium met PBS-. Na een eerste toxiciteitsbepaling met een MTT-test, bleken aggregaten meer toxisch te zijn dan afzonderlijke AuNPs. Toch bleken geen significante verschillen op te treden tussen beide dispersies. Voor een concentratie van 5 tot 50 pM bedroeg de viabiliteit voor de afzonderlijke AuNPs 90 % tegenover 84 % voor de aggregaten. Bij de concentraties van 150 en 250 pM werd een grotere daling van de viabiliteit waargenomen. Voor de afzonderlijke AuNPs bedroeg deze 59 % en voor de aggregaten 49%. Om een beter inzicht te krijgen in de toxiciteitsprofielen van beide dispersies dienen meerdere toxiciteitsmechanismen en het opnamemechanisme verder onderzocht te worden.

46

7. LITERATUURLIJST 1.

Joris F, Manshian BB, Peynshaert K, De Smedt SC, Braeckmans K, Soenen SJ. Assessing nanoparticle toxicity in cell-based assays: influence of cell culture parameters and optimized models for bridging the in vitro-in vivo gap. Chem Soc Rev. 2013 Nov 7;42(21):8339–59.

2.

EU, ed. European Commission, Official Journal of the European Union, Brussels, 2011, vol. 2011/696/EU.

3.

Fadeel B, Garcia-Bennett AE. Better safe than sorry: Understanding the toxicological properties of inorganic nanoparticles manufactured for biomedical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2010 Mar 8;62(3):362–74.

4.

Chuto G, Chaumet-Riffaud P. Les nanoparticules. Médecine Nucléaire. 2010 Jun;34(6):370–6.

5.

Buzea C, Pacheco II, Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity. Biointerphases. 2007 Dec;2(4):MR17-71.

6.

Soenen SJ, Manshian B, Montenegro JM, Amin F, Meermann B, Thiron T,Cornelissen M, Vanhaecke F, Doak S, Parak WJ, De Smedt S, Braeckmans K. Cytotoxic effects of gold nanoparticles: a multiparametric study. ACS Nano. 2012 Jul 24;6(7):5767-83.

7.

Neouze M-A. Nanoparticle assemblies: main synthesis pathways and brief overview on some important applications. J Mater Sci. 2013 Jul 4;48(21):7321–49.

8.

Elsaesser A, Howard CV. Toxicology of nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev. 2012 Feb;64(2):129–37.

9.

Alkilany AM, Murphy CJ. Toxicity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we have learned so far? J Nanopart Res. 2010 Sep;12(7):2313–33.

10.

Nel A, Xia T, Mädler L, Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 2006 Feb 3;311(5761):622–7.

11.

Nohynek GJ, Lademann J, Ribaud C, Roberts MS. Grey goo on the skin? Nanotechnology, cosmetic and sunscreen safety. Crit Rev Toxicol. 2007 Mar;37(3):251–77.

12.

Hinderliter PM, Minard KR, Orr G, Chrisler WB, Thrall BD, Pounds JG, Teeguarden JG. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Part Fibre Toxicol. 2010 Nov 30;7(1):36.

13.

Choi SY, Jeong S, Jang SH, Park J, Park JH, Ock KS, Lee SY, Joo SW. In vitro toxicity of serum protein-adsorbed citrate-reduced gold nanoparticles in human lung adenocarcinoma cells. Toxicol In Vitro. 2012 Mar;26(2):229-37.

14.

Donaldson K. Resolving the nanoparticles paradox. Nanomedicine (Lond). 2006 Aug;1(2):229–34.

15.

Kroll A, Pillukat MH, Hahn D, Schnekenburger J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch Toxicol. 2012 Jul;86(7):1123–36.

16.

Sharma G, Kodali V, Gaffrey M, Wang W, Minard KR, Karin NJ, Teeguarden JG, Thrall BD. Iron oxide nanoparticle agglomeration influences dose rates and modulates oxidative stress-mediated dose-response profiles in vitro. Nanotoxicology. 2014 Sep;8(6):66375.

17.

Magdolenova Z, Bilaničová D, Pojana G, Fjellsbø LM, Hudecova A, Hasplova K, Marcomini A, Dusinska M. Impact of agglomeration and different dispersions of titanium dioxide nanoparticles on the human related in vitro cytotoxicity and genotoxicity. J Environ Monit. 2012 Feb;14(2):455-64.

18.

Drescher D, Orts-Gil G, Laube G, Natte K, Veh RW, Österle W, Kneipp J. Toxicity of amorphous silica nanoparticles on eukaryotic cell model is determined by particle agglomeration and serum protein adsorption effects. Anal Bioanal Chem. 2011 May;400(5):136773.

19.

Alkilany AM, Lohse SE, Murphy CJ. The gold standard: gold nanoparticle libraries to understand the nano-bio interface. Acc Chem Res. 2013 Mar 19;46(3):650–61.

47

20.

He S, Liu D, Wang Z, Cai K, Jiang X. Utilization of unmodified gold nanoparticles in colorimetric detection. Sci China Physics, Mech Astron. 2011 Sep 5;54(10):1757–65.

21.

Albanese A, Chan WC. Effect of gold nanoparticle aggregation on cell uptake and toxicity. ACS Nano. 2011 Jul 26;5(7):5478-89.

22.

Maiorano G, Sabella S, Sorce B, Brunetti V, Malvindi MA, Cingolani R, Pompa PP. Effects of cell culture media on the dynamic formation of protein-nanoparticle complexes and influence on the cellular response. ACS Nano. 2010 Dec 28;4(12):7481-91.

23.

Zu Y. Molecular and nanoparticle postcolumn reagents for assay of low-molecular-mass biothiols using high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009 Oct 15;877(28):3358–65.

24.

Sharma B, Frontiera RR, Henry A-I, Ringe E, Van Duyne RP. SERS: Materials, applications, and the future. Mater Today. 2012 Jan;15(1-2):16–25.

25.

Anker JN, Hall WP, Lyandres O, Shah NC, Zhao J, Van Duyne RP. Biosensing with plasmonic nanosensors. Nat Mater. 2008 Jun;7(6):442–53.

26.

Webb J a, Bardhan R. Emerging advances in nanomedicine with engineered gold nanostructures. Nanoscale. 2014 Mar 7;6(5):2502– 30.

27.

De Montigny E. Photoacoustic Tomography : Principles and applications. 2010;35(2007).

28.

Huang X, El-Sayed M a. Plasmonic photo-thermal therapy (PPTT). Alexandria J Med. Alexandria University Faculty of Medicine; 2011 Mar;47(1):1–9.

29.

Shao J, Griffin RJ, Galanzha EI, Kim JW, Koonce N, Webber J, Mustafa T, Biris AS, Nedosekin DA, Zharov VP. Photothermal nanodrugs: potential of TNF-gold nanospheres for cancer theranostics. Sci Rep. 2013;3:1293.

30.

Jeong EH, Jung G, Hong CA, Lee H. Gold nanoparticle (AuNP)-based drug delivery and molecular imaging for biomedical applications. Arch Pharm Res. 2014 Jan;37(1):53–9.

31.

Nazir S, Hussain T, Ayub A, Rashid U, MacRobert AJ. Nanomaterials in combating cancer: therapeutic applications and developments. Nanomedicine. 2014 Jan;10(1):19–34.

32.

Zhu M, Nie G, Meng H, Xia T, Nel A, Zhao Y. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Acc Chem Res. 2013 Mar 19;46(3):622–31.

33.

Kettler K, Veltman K, van de Meent D, van Wezel A, Hendriks AJ. Cellular uptake of nanoparticles as determined by particle properties, experimental conditions, and cell type. Environ Toxicol Chem. 2014 Mar;33(3):481-92.

34.

Chithrani DB. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Mol Membr Biol. 2010 Oct;27(7):299–311.

35.

Nel AE, Mädler L, Velegol D, Xia T, Hoek EM, Somasundaran P, Klaessig F, Castranova V, Thompson M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nat Mater. 2009 Jul;8(7):543-57.

36.

Chithrani BD, Ghazani A a, Chan WCW. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 2006 Apr;6(4):662–8.

37.

Cho EC, Zhang Q, Xia Y. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nat Nanotechnol. 2011 Jun;6(6):385–91.

38.

Manke A, Wang L, Rojanasakul Y. Mechanisms of nanoparticle-induced oxidative stress and toxicity. Biomed Res Int. 2013 Jan;2013:942916.

39.

Bartłomiejczyk T, Lankoff A, Kruszewski M, Szumiel I. Silver nanoparticles -- allies or adversaries? Ann Agric Environ Med. 2013 Jan;20(1):48–54.

48

40.

Yadav UCS, Ramana K V. Regulation of NF-κB-induced inflammatory signaling by lipid peroxidation-derived aldehydes. Oxid Med Cell Longev. 2013 Jan;2013:690545.

41.

Lin J, Zhang H, Chen Z, Zheng Y. Penetration of lipid membranes by gold nanoparticles: insights into cellular uptake, cytotoxicity, and their relationship. ACS Nano. 2010 Sep 28;4(9):5421-9.

42.

Soenen SJ, Rivera-Gil P, Montenegro J-M, Parak WJ, De Smedt SC, Braeckmans K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 2011 Oct;6(5):446–65.

43.

Rivera Gil P, Hühn D, del Mercato LL, Sasse D, Parak WJ. Nanopharmacy: Inorganic nanoscale devices as vectors and active compounds. Pharmacol Res. 2010 Aug;62(2):115–25.

44.

Gu Y-J, Cheng J, Lin C-C, Lam YW, Cheng SH, Wong W-T. Nuclear penetration of surface functionalized gold nanoparticles. Toxicol Appl Pharmacol. 2009 Jun 1;237(2):196–204.

45.

Coradeghini R, Gioria S, García CP, Nativo P, Franchini F, Gilliland D, Ponti J, Rossi F. Size-dependent toxicity and cell interaction mechanisms of gold nanoparticles on mouse fibroblasts. Toxicol Lett. 2013 Mar 13;217(3):205-16.

46.

Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. Oxidative stress: the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis. Arch Toxicol. 2013 Jul;87(7):1157–80.

47.

Yang JA, Lohse SE, Murphy CJ. Tuning Cellular Response to Nanoparticles via Surface Chemistry and Aggregation. Small. 2013 Dec 9;1–10.

48.

Lesniak A, Fenaroli F, Monopoli MP, Åberg C, Dawson KA, Salvati A. Effects of the presence or absence of a protein corona on silica nanoparticle uptake and impact on cells. ACS Nano. 2012 Jul 24;6(7):5845-57.

49.

Saptarshi SR, Duschl A, Lopata AL. Interaction of nanoparticles with proteins: relation to bio-reactivity of the nanoparticle. J Nanobiotechnology. 2013 Jul 19;11:26.

50.

Gosens I, Post JA, de la Fonteyne LJ, Jansen EH, Geus JW, Cassee FR, de Jong WH. Impact of agglomeration state of nano- and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 2010 Dec 2;7(1):37.

51.

Wang Y-XJ. Superparamagnetic iron oxide based MRI contrast agents: Current status of clinical application. Quant Imaging Med Surg. 2011 Dec;1(1):35–40.

52.

Murdock RC, Braydich-Stolle L, Schrand AM, Schlager JJ, Hussain SM. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to in vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicol Sci. 2008 Feb;101(2):239–53.

53.

Brown SC, Kamal M, Nasreen N, Baumuratov A, Sharma P, Antony VB, et al. Influence of shape, adhesion and simulated lung mechanics on amorphous silica nanoparticle toxicity. Adv Powder Technol. 2007 Jan 1;18(1):69–79.

54.

Limbach LK, Li Y, Grass RN, Brunner TJ, Hintermann MA, Muller M, Gunther D, Stark WJ. Oxide nanoparticle uptake in human lung fibroblasts: effects of particle size, agglomeration, and diffusion at low concentrations. Environ Sci Technol. 2005 Dec 1;39(23):9370-6.

55.

Safi M, Sarrouj H, Sandre O, Mignet N, Berret J-F. Interactions between sub-10-nm iron and cerium oxide nanoparticles and 3T3 fibroblasts: the role of the coating and aggregation state. Nanotechnology. 2010 Apr 9;21(14):145103.

56.

Liu J, Legros S, Ma G, Veinot JGC, von der Kammer F, Hofmann T. Influence of surface functionalization and particle size on the aggregation kinetics of engineered nanoparticles. Chemosphere. 2012 May;87(8):918–24.

57.

Cui W, Li J, Zhang Y, Rong H, Lu W, Jiang L. Effects of aggregation and the surface properties of gold nanoparticles on cytotoxicity and cell growth. Nanomedicine. 2012 Jan;8(1):46–53.

58.

Teeguarden JG, Hinderliter PM, Orr G, Thrall BD, Pounds JG. Particokinetics In Vitro: Dosimetry Considerations for In Vitro Nanoparticle Toxicology Assessments. Toxicol Sci. 2007 Jan 18;97(2):614–614.

49

59.

Ahmad Khanbeigi R, Kumar A, Sadouki F, Lorenz C, Forbes B, Dailey LA, Collins H. The delivered dose: Applying particokinetics to in vitro investigations of nanoparticle internalization by macrophages. J Control Release. 2012 Sep 10;162(2):259-66.

60.

Wang S-H, Lee C-W, Chiou A, Wei P-K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. J Nanobiotechnology. 2010 Jan;8(1):33.

61.

Thomassen LC, Rabolli V, Masschaele K, Alberto G, Tomatis M, Ghiazza M, Turci F, Breynaert E, Martra G, Kirschhock CE, Martens JA, Lison D, Fubini B. Model system to study the influence of aggregation on the hemolytic potential of silica nanoparticles. Chem Res Toxicol. 2011 Nov 21;24(11):1869-75.

62.

Hinterwirth H, Wiedmer SK, Moilanen M, Lehner A, Allmaier G, Waitz T, Lindner W, Lämmerhofer M. Comparative method evaluation for size and size-distribution analysis of gold nanoparticles. J Sep Sci. 2013 Sep;36(17):2952-61.

63.

Wallace R, Brown a P, Brydson R, Milne SJ, Hondow N, Wang P. Characterisation of ZnO nanoparticle suspensions for toxicological applications. J Phys Conf Ser. 2012 Jul 2;371:012080.

64.

Tran S-L, Puhar A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan blue dye enters viable cells incubated with the pore-forming toxin HlyII of Bacillus cereus. PLoS One. 2011 Jan;6(9):e22876.

65.

Brewer SH, Glomm WR, Johnson MC, Knag MK, Franzen S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 2005 Sep 27;21(20):9303–7.

66.

Dominguez-Medina S, Blankenburg J, Olson J, Landes CF, Link S. Adsorption of a Protein Monolayer via Hydrophobic Interactions Prevents Nanoparticle Aggregation under Harsh Environmental Conditions. ACS Sustain Chem Eng. 2013 Jul 1;1(7):833–42.

67.

Du S, Kendall K, Toloueinia P, Mehrabadi Y, Gupta G, Newton J. Aggregation and adhesion of gold nanoparticles in phosphate buffered saline. J Nanoparticle Res. 2012 Feb 14;14(3):758.

68.

Casals E, Pfaller T, Duschl A, Oostingh GJ, Puntes V. Time evolution of the nanoparticle protein corona. ACS Nano. 2010 Jul 27;4(7):3623–32.

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12274-013-0400-0 (20-03-2014) http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/uv-vis/spectrum.htm (10-03-2014) http://community.asdlib.org/imageandvideoexchangeforum/2013/07/26/absorbance-and-emission-spectroscopy/ (20-03-2014) http://www.horiba.com/scientific/products/particle-characterization/technology/dynamic-light-scattering/ (6-05-2014) http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wpcontent/uploads/2011/02/DLS_Terms_defined_Malvern.pdf ( 6-05-2014) http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/cell-viability-and-proliferation.html (8-03-2014) http://2010.igem.org/Team:Freiburg_Bioware/Project/Methods (12-05-2014)

50

8.BIJLAGEN 8.1 MATERIAAL EN METHODEN 8.1.1 Incubatie aggregaten en afzonderlijke nanopartikelss volgens methode C1 Tabel 8.1: Aanmaak van de verschillende dispersies voor de incubatie van aggregaten en afzonderlijke AuNPs in een concentratierange van 5 pM tot 250 pM volgens methode C 1.

AuNPs (%) / 0,4 0,8 2,1 4,2 12,6 20,9 0,4 0,8 2,1 4,2 12,6 20,9

Onbehandeld 5 pM 10 pM 25 pM 50 pM 150 pM 250 pM 5 pM 10 pM 25 pM 50 pM 150 pM 250 pM

PBS (%) / 0,4 0,8 2,1 4,2 12,6 20,9 / / / / / /

Celmedium (%) + PBS (%) 58,2 + 41,8 58,2 + 41,0 58,2 + 40,2 58,2 + 37,8 58,2 + 33,4 58,2 + 16,6 58,2 + / 58,2 + 41,4 58,2 + 41,0 58,2 + 39,7 58,2 + 37,6 58,2 + 29,2 58,2 + 20,9

8.2 RESULTATEN 8.2.1 Aanmaak van serumvrije stalen voor DLS metingen 1.2

Absorbantie

Origineel 0.8 Dispersie met afzonderlijke AuNPs in DMEM

0.4

Origineel Dispersie met afzonderlijke AuNPs in DMEM

λmax (nm) 520 641

0 450

550

650

750

Golflengte (nm) Figuur 8.1: Spectrum van de dispersie met afzonderlijke AuNPs in DMEM. Er trad een duidelijke verschuiving van de LSPR-piek op naar 641 nm in vergelijking met de originele dispersie. Hieruit kon geconcludeerd worden dat de dispersie uit aggregaten bestond.

I

8.2.2 DLS-metingen

Absorbantie

1.2

Origineel

0.8

Niet geaggregeerd in ddH2O 1u

0.4

Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 1u

0 450

550

650

Origineel Niet geaggregeerd in ddH2O 1u Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 1u

λmax (nm) 520 519 522

750

Golflengte (nm) Figuur 8.2: Spectra van de afzonderlijke AuNPs in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 1u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax voor beide stalen was gelijk.

1.2 Origineel Niet geaggregeerd in ddH2O 4u

0.4

Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 4u

Absorbantie

0.8

Origineel Niet geaggregeerd in ddH2O 4u Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 4u

λmax (nm) 520 521 521

0 450

550

Golflengte (nm)

650

750

Figuur 8.3: Spectra van de afzonderlijke AuNPs in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 4u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax voor beide stalen was gelijk. Origineel

Absorbantie

1.2

Niet geaggregeerd in ddH2O 24u

0.8

Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 24u

0.4

Origineel Niet geaggregeerd in ddH2O 24u Niet geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 24u

λmax (nm) 520 520 521

0 450

550

650

750

Golflengte (nm)

Figuur 8.4: Spectra van de afzonderlijke AuNPs in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 24u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax bleef constant voor stalen waar het aandeel dubbelgeconcentreerd celmedium is vervangen door ddH 2O gedurende 24u incubatie. Hierdoor konden de groottedistributies van serumvrije stalen geëxtrapoleerd worden naar stalen waarmee geïncubeerd werd.

II

Absorbantie

1.2

Origineel Geaggregeerd in ddH2O 1u

0.8 Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 1u 0.4

Origineel Geaggregeerd in ddH2O 1u Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 1u

λmax (nm) 520 665 667

0 450

550

650

750

Golflengte (nm) Figuur 8.5: Spectra van de aggregaten in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 1u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax voor beide stalen was gelijk.

Absorbantie

1.2

Origineel Geaggregeerd in ddH2O 4u

0.8

Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 4u

0.4 0 450

550

Golflengte (nm)

650

Origineel Geaggregeerd in ddH2O 4u Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 4u

λmax (nm) 520 672 667

750

Figuur 8.6: Spectra van de aggregaten in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 4u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De stalen werden niet gehersuspendeerd voor de metingen. De λmax voor beide stalen was gelijk. Origineel

1.2

Absorbantie

Geaggregeerd in ddH2O 24u 0.8

Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 24u

0.4 0 450

550

Golflengte (nm)

650

750

Origineel Geaggregeerd in ddH2O 24u Geaggregeerd in dubbelgeconcentreerd celmedium 24u

λmax (nm) 520 663 657

Figuur 8.7: Spectrum van de dispersie met aggregaten in ddH2O en dubbelgeconcentreerd celmedium na 24u incubatie bij 37°C in een vochtige atmosfeer met 5%-CO2. De λmax bleef constant voor stalen waar het aandeel dubbelgeconcentreerd celmedium is vervangen door ddH2O gedurende 24u incubatie. Hierdoor konden de groottedistributies van serumvrije stalen geëxtrapoleerd worden naar stalen waarmee geïncubeerd werd.

III

14 12 10 8 6 4 2 0

Geaggregeerd 1u

Intensiteit

Geaggregeerd 4u Geaggregeerd 24u

1

10

100

1000

Hydrodynamische diameter (nm) Figuur 8.8: Groottedistributie op basis van de intensiteit van de aggregaten na 1, 4 en 24u incubatie waarbij voor elke meting gehersuspendeerd werd.

IV

9. INTERNATIONALIZATION AT HOME: PROF. DR. DAAN J.A. CROMMELIN 9.1 INAUGURAL LECTURE: IMPACT OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES OVER THE PAST 50 YEARS AND.. QUO VADIS? Tijdens de eerste lezing kwam vooral de evolutie van de farmaceutische sector aan bod. Voor 1964 was er geen effectieve behandeling voor hypertensie, maag- en darmzweren moesten nog chirurgisch behandeld worden en er waren nog geen geneesmiddelen voorhanden om parasitaire en virale infecties te behandelen. Dit toont aan dat de lijst met actieve bestanddelen reeds sterk gewijzigd en uitgebreid is. Naast de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen hebben de formulaties ook een sterke evolutie doorgemaakt. Zo werden inhalatiesystemen en formulaties met gecontroleerde geneesmiddelenafgifte ontwikkeld. Nog steeds is dit een belangrijke tak in onderzoek en wordt er op zoek gegaan naar betere technieken om de patiënt maximaal comfort te bieden. Daarnaast

veranderde

ook

de

gedachtegang

omtrent

de

veiligheid

van

geneesmiddelen. Tegenwoordig wordt veel sceptischer gekeken naar de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Wanneer niet met volle zekerheid de veiligheid van een geneesmiddel kan gegarandeerd worden, zal dit geneesmiddel niet op de markt gebracht worden. Als voorbeeld kan hier aspirine beschouwd worden. Wanneer dit nu pas zou ontdekt worden, zou het niet op de markt komen. Toch heeft aspirine reeds zijn functionaliteit bewezen. Hierbij kan dan ook de vraag gesteld worden of er geen belangrijke en efficiënte therapieën verloren gaan door deze voorzichtige houding aan te nemen. Tot slot leidt deze houding ook tot een belemmering van de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. 9.2

BIOTECH

TAKES

OVER

AND

WE

BETTER

BE

PREPARED.

GENERIC PARADIGM REVISITED: BIOSIMILARS AND NON-BIOLOGICAL-COMPLEX DRUGS Deze lezing handelde voornamelijk over biologicals en biosimilars. Biologicals zijn proteïnen zoals monoklonale antilichamen en hormonen die biotechnologisch worden aangemaakt en gebruikt worden in therapeutische behandelingen. Het belang van biotechnologische geneesmiddelen wordt steeds groter. 7 van de 10 meest verkochte geneesmiddelen zijn biologicals. Deze geneesmiddelen verschillen sterk van de klassieke therapeutica omwille van hun structuur, moleculair gewicht en stabiliteit. De eiwitten kunnen wel een bepaalde tertiaire of quaternaire structuur aannemen maar het is moeilijker om deze structuur gedurende jaren te behouden. Een complete karakterisatie is onmogelijk, het is dan V

ook belangrijk dat het productieproces nauwlettend in het oog wordt gehouden. Er zal nooit één product gevormd worden, maar het zal een familie van molecules zijn. De molecules zijn gelijkaardig maar niet identiek. Tot slot zijn deze molecules species specifiek waardoor ze maar werkzaam zijn in één mechanisme en geen in vivo experimenten met dieren mogelijk zijn. Deze probleemstellingen omtrent de productie en complexiteit van biologicals resulteren dan ook in een hoge kostprijs voor deze geneesmiddelen. Naast de hoge kostprijs van deze therapieën kunnen ze ook immunogeen zijn voor de patiënt en moeten ze met behulp van injecties toegediend worden. Hierdoor kunnen irritaties optreden ter hoogte van de injectieplaats en is er mogelijks een lagere therapietrouw. Biosimilars worden beschouwd als de generische vorm van de biologicals en hebben als voordeel dat ze minder duur zijn. Deze geneesmiddelen lijken sterk op de biologicals maar zijn niet identiek. De EMA houdt een goede controle over het op de markt komen van biosimilars. In andere werelddelen is er een minder goede controle op de veiligheid van biosimilars. Hierbij wordt van bioquestionable gesproken. Dit is de generische vorm van een therapeutisch eiwit waarbij er een beperkt onderzoek werd gevoerd naar kwaliteit en veiligheid. 9.3 SCENARIOS FOR THE FUTURE OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES AND IMPLICATIONS INNOVATION

STRATEGIES

AND

PUBLIC-PRIVATE

PARTNERSHIPS

THE CHANGING ROLE OF THE PHARMACIST IN AN INTERNATIONAL PERSPECTIVE (FIP) In deze lezing werd stilgestaan bij de perspectieven van de farmaceutische sector en hoe deze in de toekomst zal evolueren. Om een scenario analyse te maken moeten mensen open staan voor vernieuwingen. De wereld is zeer conservatief en wil altijd het lineaire model volgen. Voor apothekers betekent dit dat in de toekomst de farmaceutische zorg steeds belangrijker zal zijn en dat door het elektronisch patiëntendossier een betere opvolging van de patiënt mogelijk zal zijn. Wanneer op wereldschaal wordt gekeken naar industrie, is te zien dat Israël en Zweden grote investeerders zijn in de industrie en dat dit leidt tot innovatie. België daarentegen doet het niet goed op gebied van innovatie. De discovery in ons land doet het goed maar we zijn niet in staat om dit om te zetten in innovatie. Hierbij wordt de innovatie tegengehouden door het idee dat alles veilig moet zijn. De samenwerking van academici met de industrie zou de innovatie mogelijks ten goede komen

VI