Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky
ANTIGEN (Ag) – specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab – antibody) – molekula bílkoviny vážící specificky daný antigen EPITOP – specifická část molekuly antigenu reagující a vážící se na protilátku HAPTEN – většinou nízkomolekulární látka schopna vyvolat imunitní reakci tj. vazby na protilátku ale pouze po vazbě na větší molekulu (většinou protein) AGLUTINACE – srážení antigenu specifickou protilátkou
Antigeny • částice – jiné buňky, baktérie, viry • molekuly – individuální bílkoviny, směsi bílkovin (např. krevního séra), části bílkovin – peptidy
• kusy tkání, orgánů, membrán Ne všechny protilátky mohou reagovat se svým antigenem
Protilátky • bílkoviny • základní tvar molekuly - Y • dva těžké a dva lehké řetězce
• disulfidické můstky • variabilní část • imunoglobulíny – pět tříd: IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM
Vazba antigenu a protilátky • Nevazebné interakce - vodíkové můstky - iontové interakce - van der Waalsovy síly - dipol-dipol • Interakce mezi antigenem a protilátkou závisí na pH, iontové síle a přítomnosti dalších látek např. detergentů, chaotropních činidel …
• Více protilátek reagujících s jednou částicí
• Precipitace
Vizualizace • Precipitace protilátky s antigenem • Značená primární protilátka (reaguje s antigenem) • Značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) • Značený antigen
Značení protilátek (antigemnů) • • • •
enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení
Aglutinace - precipitace
• Přímé značení – značená primární protilátka • Nepřímé značení – primární protilátka neznačena, značku nese sekundární protilátka - druhově specifická vůči primární protilátce
Značená primární protilátka Značená sekundární protilátka
Příprava protilátek Imunizace, očkování – odezva imunitního systému na přítomnost antigenu Hostitel - myši, králíci, kozy, prasata, koně Adjuvantní látky
Jedna nebo více dávek antigenu
maximum IgM asi po týdnu, IgG asi po třech týdnech
Krevní sérum s protilátkou odběr krve • z ucha – malé množství, malé zvíře • ze žíly – větší zvířata (více antiséra) • vykrvení – zabití a získání veškeré krve • sražení krve • centrifugace – získání krevního séra • izolace protilátek a jejich přečištění (srážení, chromatografie
Imunodetekce detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky • Sérologické metody
• Imunoprecipitace • ELISA • Imunoblotování
Imunodetekce Volně v roztoku - sérologické metody • Detekce protilátek - pomocí precipitace s příslušným antigenem (Salmonela, Listerie, ...)
• Detekce mikroorganismů pomocí předem připravených protilátek (Salmonela, Streptokoky, Stafylokoky, ...) • Detekce antigenů vylučovaných mikroorganismy pomocí předem připravených protilátek (Streptokoky – zápal plic, Haemophillus influenzae – meningitida, ...) • Krevní skupiny – průkaz krevních skupin reakcí protilátek s antigeny na červených krvinkách
Krevní skupiny Na povrchu erytrocytů - červených krvinek se vyskytují aglutinogeny – speciální antigeny určující krevní skupiny Na jejich základě určujeme čtyři základní krevní skupiny: A, B, AB a 0 V krvi se také vyskytují protilátky proti cizím krevním skupinám (aglutinogenům)
Antigeny na povrchu erytrocytů - aglutinogeny A a B (aglutinogen –aglutinace krve) Skupina A – tvoří aglutinogen A Skupina B – tvoří aglutinogen B Skupina AB – tvoří oba aglutinogeny Skupina 0 – netvoří ani jeden z aglutinogenů A a B (tvoří typ H, prekurzor A a B)
Protilátky tvořené v krvi – aglutiny anti-A a anti-B Skupina A – tvoří aglutinin anti-B Skupina B – tvoří aglutinin anti-A Skupina AB – netvoří žádný aglutinin Skupina 0 – tvoří oba aglutininy anti-A i anti-B
Aglutinace – zjišťování krevní skupiny
Imunodetekce Imunoprecipitace v gelech
• V agarózovém gelu • Možnost použít více protilátek v jednom experimentu • Možnost detekce více antigenů v jednom experimentu • Kombinace s elektroforézou • Kvantifikace
Reakce králičích protilátek proti lidskému séru s různými séry z:
člověka (Ho), krávy (Bo), koně (Eq), kočky (Fe), kozy (Cap), ovce (Ov), mýši (Mu), psa (Ca), králíka (Ra), prasete (Su)
Kvantifikace antigenu Kalibrační křivka Protilátka je přítomna v agarózovém gelu, do jamek je přidáno známé množství antigenu.
Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.
Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.
Rocket imunoelectroforéza Kvantitativní metoda Agarózový gel s příslušnou protilátkou, pH přibližně 8.6 – protilátky se nepohybují Elektroforéza proteinů (antigenů) o známé koncentraci a neznámých vzorků
Imunodetekce Metody ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Barevná reakce protilátky a antigenu
Využívá vlastnosti biologických makromolekul pevně se vázat na některé polymery (polystyrén ...)
ELISA metody lze dělit podle řady kritérií • Stanovení antigenu (Přímá ELISA) • Stanovení specifických protilátek (Nepřímá ELISA)
• Normální – vazba přímo na povrch jamky • Sendvičová – vazba přes zprostředkovatele
Pevná fáze s navázaným antigenem
Pevná fáze s navázanou protilátkou
Vizualizace • značená primární protilátka (reaguje s antigenem) • značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) • značený antigen
Značení • • • •
enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení
Western blotting Imunologická detekce bílkovin separovaných pomocí ELFO
Přenos proteinů na membránu
• elektroforetický přenos • pasivní přenos difuzí
Výběr membrány: PVDF, nitrocelulosa, radioaktivní a neradioaktivní detekce, glykoproteiny, druhá detekce, screening exprese
Vizualizace proteinů • Přenesení proteinů • Blokace volných vazebných míst na membráně • Navázání primární specifické protilátky • Navázání značené protilátky specifické proti primární protilátce
Vizualizace sekundární protilátkou
• Barevná reakce
• Chemiluminiscence • Fluorescence
• Radioaktivní detekce
Imunoafinitní preparace • Využití specifické vazby antigenu a protilátky při jejich izolaci a přečištění • Izolace přímo z roztoku precipitací • Izolace z roztoku pomocí antigenu nebo protilátky navázané na specifické částice nebo molekuly (protein A, magnetická separace) • Imunoafinitní chromatografie
Směsný vzorek před čištěním
Aplikace specifických Oddělení protilátek s protilátek navázaným antigenem
Využití vazby protilátky (nebo antigenu) na částice se specifickým vazebným místem
Příklad využití částic při magnetické separaci Magnetická částice s navázanou protilátkou
Reakce protilátek s antigenem
Separace částic pomocí magnetu
