HODNOCENÍ TOXICITY VYBRANÝCH NANOČÁSTIC NA BIOLOGICKÉ ČINITELE EVALUATION OF THE TOXICITY OF SELECTED NANOPARTICLES ON BIOLOGICAL AGENTS Petra Škodová1), Lucie Křiklavová1), Tomáš Lederer1), Totka Bakalova2) Oddělení nanomateriálů v přírodních vědách, Ústav pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace, Technická univerzita v Liberci, Studentská 1402/2, 461 17 Liberec 1, e-mail:
[email protected] 1) Department of nanomaterials in natural science, Institute for Nanomaterials, Advanced Technologies and Innovations, Technical University of Liberec, Studentská 1402/2, 461 17 Liberec 1, Czech Republic, e-mail:
[email protected] 2) Oddělení přípravy a analýzy nanostruktur, Ústav pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace, Technická univerzita v Liberci, Studentská 1402/2, 461 17 Liberec 1 2) Department of the preparation and analysis of nanostructures, Institute for Nanomaterials, Advanced Technologies and Innovations, Technical University of Liberec, Studentská 1402/2, 461 17 Liberec 1 1)
Abstrakt: Tento příspěvek se zabývá hodnocením vlivu vybraných nanočástic na bakteriální populace Escherichia coli, a to především pomocí respirometrického měření a mikroskopické fluorescenční analýzy, která umožňuje pozorování a porovnání živých a mrtvých buněk ve zkoumaném vzorku. Tyto dvě metody byly doplněny o stanovení kultivovatelnosti bakterií. Nanočástice byly používány v koncentraci 1 g/l. Výsledky experimentu ukázaly jako nejvíce toxické nanočástice praseodymu. Pro hodnocení vlivu nanočástic na biologické činitele je velmi důležitá jejich čistota. Pravděpodobně v důsledku ne zcela čistých nanočástic nebyl pozorován významný toxický efekt. Právě nečistoty obsažené ve vzorku nanočástic mohou vést k vyšší aktivitě bakterií. Kromě toxicity nanočástic na bakteriální populace byl hodnocen také jejich vliv na klíčivost semen hořčice bílé - Sinapis alba v médiu obsahujícím nanočástice opět v koncentraci 1 g/l. Výsledky testu klíčivosti neukázaly žádný toxický vliv na klíčení semen Sinapis alba. Abstract: This paper deals with the evaluation of influence of selected nanoparticles on bacterial population of Escherichia coli. Especially respirometry measurement and microscopic fluorescent analysis are used for the evaluation of the toxicity. Fluorescent analysis enables observation and comparison live and dead cells in the sample. These two methods were completed by determining of CFU/ml of bacteria. Nanoparticles were used at a concentration of 1 g/l. The results of the experiment showed that nanoparticles of praseodymium are the most toxic. Purity of the nanoparticles is very important for evaluation of their impact on biological agents. Significant toxic effect was not observed due to insufficiently pure nanoparticles. Just impurities contained in a sample of nanoparticles may lead to higher activity of the bacteria. The influence of solutions containing nanoparticles was evaluated on germination of seeds of Sinapis alba. The concentration of nanoparticles in medium was also 1 g/l. The results test of germination did not show any toxic effect on seed germination of Sinapis alba. Klíčová slova: Toxicita nanočástic, bakteriální populace, respirometrie, fluorescenční mikroskopie Keywords: Toxicity of nanoparticles, bacterial population, respirometry, fluorescence microscopy Úvod Nanotechnologie mají široké uplatnění v různých složkách lidského působení. Použití nanočástic v komerčních produktech a průmyslových aplikacích se v posledních letech výrazně zvýšilo, ačkoli porozumění interakčnímu mechanismu na molekulární úrovni mezi nanočásticemi a biologickými systémy do značné míry chybí. Nanočástice se tak mohou stát novým environmentálním hazardem (Barrena a kol. 2009). Nanočástice se uvolňují do vzduchu, vody a půdy, proto se předpokládá, že
mohou mít určitý dopad na lidské zdraví. Ačkoli vliv běžných kovů a materiálů na lidské zdraví a životní prostředí je velmi dobře známý, jakmile jsou tyto kovy a materiály ve velikosti nanometrů, je třeba jejich vliv ještě řádně prostudovat (Brar a kol. 2010). Podle dostupných výsledků je patrné, že testování toxických účinků velmi záleží na použitém modelovém organismu, proto je třeba provádět testy na široké škále organismů (Barrena a kol. 2009). Nebezpečí nanočástic spočívá zejména v jejich velikosti a tvaru (Brar a kol. 2010). K první interakci biologického materiálu s nanočásticemi dochází mezi buněčnou membránou a danými nanočásticemi. Právě tato interakce je velmi závislá na fyzikálně chemických vlastnostech nanočástic. Malá změna v jejich velikosti, tvaru, náboji nebo chemickém složení může vést k radikálně odlišným interakcím s živými systémy (Mahmoudi a kol. 2014; Zhang a kol. 2012). V případě malé velikosti nanočástic, která je ~5 nm, tedy menší než tloušťka lipidové dvojvrstvy, může docházet k zabudování nanočástice právě do lipidové dvojvrstvy, což může vést k narušení membrány, případně k zanesení pórů prostupujících cytoplazmatickou membránou. Zatímco velikost nanočástic je kritická pro udržení buněčné membrány v původním stavu, tvar použitých nanočástic může hrát významnou roli jako definovaný kontaktní povrch mezi nanočásticemi a cytoplazmatickou membránou (Mahmoudi a kol. 2014). Toxicita nanomateriálů může být způsobena různými důvody. U nanostruktur bylo prokázáno, že mají elektronické, optické a magnetické vlastnosti, které se vztahují k jejich fyzickým rozměrům, rozpad těchto nanostruktur by mohl vést k jedinečnému toxickému efektu, který je těžké předpovídat (Borm a kol. 2006; Fischer, Chan 2007). Povrchy nanostruktur jsou zapojeny v mnoha katalytických a oxidačních reakcích, jestliže tyto reakce indukují cytotoxicitu, může být výsledná toxicita větší než u podobného sypkého materiálu, protože poměr povrch-objem je pro materiály s nanoměřítkem mnohem větší (Fischer, Chan 2007). Dosud neexistují žádné standardizované metody, které by bylo možné použít pro testování toxicity nanočástic uvolněných do různých složek životního prostředí. V předkládaném článku se řeší toxicita vybraných nanočástic na bakteriální populaci E. coli a semena Sinapis alba, v obou případech byl zatím experiment proveden v kultivačních médiích pro získání důležitých informací a sestavení metodiky. Nejvhodnější metodou pro měření vlivu nanočástic na modelový organismus E. coli byla respirometrie. Tento experiment je teprve začátkem pro získání a pozdější ucelení informací o vybraných nanočásticích a jejich interakci s biologickými činiteli. Metodika Pro hodnocení toxicity vybraných nanočástic byly vybrány dvě stěžejní metody, a to měření respirace buněk E. coli za přítomnosti nanočástic v médiu a fluorescenční analýza živých a mrtvých buněk. Respirační aktivita bakterií byla měřena na přístroji Micro-Oxymax Respirometer - Columbus Instruments International podle ČSN EN ISO 9408, místo organických látek však byly použity anorganické nanočástice. Uspořádání experimentu pro respirometrii: 18 ml média, 2 ml fyziologického roztoku s E. coli o počáteční absorbanci ~ 0,9 při 600 nm, 1 g/l nanočástic Respirace vzorků byla měřena vždy po dobu 5 dnů. Z výsledků získaných měřením respirace je také možné stanovit růstovou křivku bakterií v daném prostředí. Respirace byla měřena jak u vzorků obsahujících nanočástice v koncentraci 1 g/l, tak v kontrolních médiích, které neobsahovaly žádné nanočástice. Mikroskopické hodnocení vzorků bylo provedeno na fluorescenčním mikroskopu ZEISS Axio Imager.M2 s kamerou AxioCamICc1 s fluorescenční lampou Colibri.2. Nastavení odpovídalo filtru 62HE B/G/HR, tj. vlnovým délkám 365 nm, 470 nm a 590 nm. Pro hodnocení životaschopnosti buněk E. coli byl použit LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit, díky němuž se buňky s porušenou membránou, tedy mrtvé nebo umírající zbarví červeně, zatímco buňky s neporušenou membránou se zbarví zeleně. Mikroskopická analýza bakteriální populace E. coli byla provedena vždy první a pátý
den experimentu, kdy bylo odebráno 5 µl vzorku na podložní sklíčko a k němu následně přidány 3 µl fluorescenčního barviva. Vzorek byl překryt krycím sklíčkem a 15 minut inkubován ve tmě. Z takto získaných výsledků bylo možné porovnat, jak se změnilo zastoupení živých a mrtvých buněk ve vzorcích 5. den, oproti 1. dni experimentu. Tyto metody byly doplněny o měření růstové křivky E. coli ve vzorcích s nanočásticemi měřením absorbance při 600 nm, dále byly výsledky doplněny o stanovení kultivovatelnosti bakterií, tzv. KTJ/ml (kolonie tvořící jednotka) podle ČSN EN ISO 6222. Ačkoli stanovení KTJ/ml patří mezi běžně používané metody, její výsledky jsou pouze orientační. Velká nepřesnost metody spočívá ve faktu, že pouze 2 % bakterií jsou kultivovatelná. Při nasazení experimentu stejně tak jako po jeho ukončení byl odebrán vzorek pro stanovení (KTJ/ml). V těchto dnech byla také měřena absorbance při 600 nm, která ukázala nárůst bakteriální populace ve vzorcích. Pro hodnocení toxicity na E. coli byly vybrány následující nanočástice: diamanty (ND), TiO2, SiO2 a nanočástice Pr, Pb, Ce a Bi. V průběhu experimentu byla používána dvě média, BSM médium s různou koncentrací glukosy (C6H12O6, bezvodá, p.a., Lach-ner), testovaná koncentrace byla 0,5 g/l, 5 g/l a 25 g/l, dále byl používán sójový vývar (Tryptone Soya Broth, Himedia). Ve všech případech bylo měření prováděno s koncentrací nanočástic 1 g/l. Toxicita nanočástic byla testována také na semenech Sinapis alba. Pro tento test bylo připraveno kultivační médium (KM) podle požadavků ČSN EN ISO 746-2 a ČSN EN ISO 6341 o výsledném pH 7,9. Na Petriho misku o průměru 96 mm bylo rozmístěno 15 semen hořčice bílé. Kontrolní vzorek byl zvlhčen čistým kultivačním médiem, ostatní vzorky obsahovaly 1 g/l nanočástic diamantů, TiO2 a SiO2. Semena byla inkubována ve tmě při 20±2 °C po dobu 72 h. Následně byla změřena délka kořene vyklíčených semen ve všech vzorcích, ze které lze spočítat IC50.
Spotřeba O2 kumulativní (mg)
Výsledky Vliv jednotlivých nanočástic Bi, Ce, Pb a Pr, pro které bylo použito BSM médium s glukosou jako kultivační médium, ukazuje obr. 1. Tento graf znázorňuje kumulativní spotřebu kyslíku vzorků, které obsahovaly E. coli a uvedené nanočástice. V grafu je zřetelný jednoznačný vliv testovaných nanočástic na respirační aktivitu bakterií. Přítomnost nanočástic ve všech případech snižuje respirační aktivitu bakterií oproti kontrole. Z použitých nanočástic jsou nejméně toxické nanočástice bismutu, zatímco jako nejvíce toxické se projevily nanočástice praseodymu.
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
20
40
60
80
100
Čas (hod) Bi
Ce
Pb
Pr
Kontrola BSM
Obr. 1: Kumulativní spotřeba kyslíku vzorků obsahujících E. coli a uvedené nanočástice: Bi, Ce, Pb a Pr
Druhou stěžejní metodou byla mikroskopická fluorescenční analýza živých a mrtvých buněk. Obr. 2 ukazuje porovnání fluorescenční analýzy provedené první den experimentu s pátým dnem experimentu u vzorků s nanočásticemi bismutu a SiO2. Zatímco z obrázku 2a je patrná převaha živých buněk (zelené buňky, 54 %), vzorek 2b ukazuje důsledek působení nanočástic bismutu na E. coli pátý den experimentu, převaha mrtvých buněk (červené buňky, 75 %). V případě testování nanočástic SiO2 je vývoj experimentu odlišný, z fluorescenční mikroskopie vyplývá, že nanočástice SiO2 nejsou pro buňky E. coli příliš toxické, buňky jsou v jejich přítomnosti schopné dělení. a
b
d
c
Obr. 2: Snímky z fluorescenčního mikroskopu vzorku obsahujícího E. coli a nanočástice Bi a SiO2 a) Bi - 1. den, b) Bi 5. den, c) SiO2 - 1. den, d) SiO2 - 5. den Toxicita nanočástic byla testována také na klíčivosti semen Sinapis alba. Test byl proveden v kvadruplikátech s koncentrací nanočástic v kultivačním médiu 1 g/l. Po 72 h inkubace ve tmě byly změřeny délky všech kořenů a pro každý vzorek byla následně spočítána průměrná délka kořene. Z vypočítaných hodnot bylo patrné, že v přítomnosti nanočástic došlo ve všech případech ke stimulaci růstu kořene ve srovnání s kontrolou, jak ukazuje tabulka 1, proto se výpočet IC50 neprováděl. Tab. 1: Výsledná klíčivost a průměrné délky kořenů Sinapis alba po 72 h inkubaci klíčivost (%)
průměrná délka kořene (mm)
KM
98,3
26,5
KM + ND
100
44,4
KM + TiO2
100
42,9
KM + SiO2
98,3
34,5
vzorek
Diskuse Z experimentálních dat je patrná prokazatelná toxicita nanočástic Bi, Ce, Pb a Pr pro buňky E. coli. Toxicita dalších testovaných nanočástic – TiO2, SiO2 a diamantů, nebyla tak výrazná. Toxicita nanodiamantů je zatím sporná, výsledky respirační aktivity ukázaly nepatrný nárůst oproti kontrolním vzorkům, to naznačuje, že nanodiamanty obsahovaly kromě diamantové struktury také uhlík v podobě, kterou jsou bakterie schopné využít jako C-zdroj. Jedním z důležitých kritérií testovaných nanočástic je tedy právě jejich čistota. Nečistoty mohou obsahovat například volně dostupný uhlík (vhodná energie pro bakterie). V tuto chvíli není ani z odborné literatury, ani podle našich výsledků zatím jasné, čím je toxicita způsobena, zda je to jen díky velikosti či tvaru částic, nebo má vliv i jiný faktor (míra agregace, oxidovatelnost či reaktivita částic, morfologie povrchu aj.). Zřetelný vliv nanočástic byl pozorován u testu klíčivosti semen hořčice bílé. Zatímco bylo předpokládáno, že přítomnost nanočástic povede buď k inhibici růstu kořene, nebo nebude mít žádný vliv na klíčivost semen, výsledky experimentu ukázaly, že ve všech případech měly testované nanočástice stimulační efekt na růst kořene oproti kontrolním vzorkům bez nanočástic. Testované nanočástice se tedy pravděpodobně nedostanou do buněk hořčice bílé, kde by mohly inhibovat důležité pochody pro růst a přežití buněk, naopak hořčice zřejmě dokáže využít nanočástice ke svému růstu. Testované nanočástice tedy zjevně nejsou toxické pro semena Sinapis alba. Závěr Z výsledků experimentu vyplývá, že nanočástice Bi, Ce, Pb a Pr mají určitý toxický vliv na bakteriální populaci E. coli. Výsledky respirometrického měření ukázaly, že nejvíce toxické byly pro E. coli nanočástice Pr, čemuž odpovídá také mikroskopická fluorescenční analýza, zatímco nejmenší toxicitu z uvedených 4 druhů vykazují nanočástice Bi. Další testované nanočástice SiO2, TiO2 a diamantů tak významnou toxicitu jako výše zmíněné nanočástice nevykazovaly. Ve vzorcích, které obsahovaly nanodiamanty v koncentraci 1 g/l, se buňky E. coli množily rychleji než v kontrolním médiu bez nanočástic. Přítomnost nanočástic v kultivačním médiu pro klíčení semen Sinapis alba měla výrazný vliv na klíčivost použitých semen. Naměřené údaje ukazují na stimulaci růstu kořene za přítomnosti nanočástic v médiu oproti kontrole, která nanočástice neobsahovala. Poděkování Práce byla podpořena z projektu OP VaVpI „Inovativní výrobky a environmentální technologie“, registrační číslo CZ.1.05/3.1.00/14.0306. Výsledky tohoto projektu LO1201 byly získány za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy v rámci účelové podpory „Národní program pro udržitelný rozvoj I“ a projektu OP Výzkum a vývoj pro inovace „Centrum pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace“, registrační číslo CZ.1.05/2.1.00/01.0005. Literatura Barrena R., Casals E., Colón J., Font X., Sánchez A., Puntes V. 2009. Evaluation of the ecotoxicity of model nanoparticles. Chemosphere. 75, pp. 850-857 Borm P., Klaessig F. C., Landry T. D., Moudgil B., Pauluhn J., Thomas K., Trottier R., Wood S. 2006. Research Strategies for Safety Evaluation of Nanomaterials, Part V: Role of Dissolution in Biological Fate and Effects of Nanoscale Particles. Toxicol. Sci. 90, pp. 23-32 Brar S. K., Verma M., Tyagi R. D., Surampalli R. Y. 2010. Engineered nanoparticles in wastewater and wastewater sludge – Evidence and impacts. Waste Management. 30, pp. 504-520 Fischer H. C., Chan W. C. W. 2007. Nanotoxicity: the growing need for in vivo study. Current Opinion in Biotechnology. 18, pp. 565-571 Mahmoudi M., Meng J., Xue X., Liang X. J., Rahman M., Pfeiffer Ch., Hartman R., Gil P. R., Pelaz B., Parak W. J., del Pino P., Carregal-Romero S., Kanaras A. G., Selvan S. T. 2014. Interaction of stable colloidal nanoparticles with cellular membranes. Biotechnology Advances. 32, pp. 679-692
Zhang X.-Q., Xu X., Bertrand N., Pridgen E., Swami A., Farokhzad O. C. 2012. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, pp. 1363-1384
