ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů katedra ochrany rostlin
Interakce mezi Cydia pomonella granulovirus (CpGV) a jeho hostitelem obalečem jablečným disertační práce
Autor:
Ing. Tereza Zichová
Školitel:
Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.
Konzultant:
Ing. Jiban Kumar Kundu, Ph.D., VÚRV, v.v.i. Ing. Jitka Stará, Ph.D., VÚRV, v.v.i.
Praha 2 0 1 1
Prohlašuji, ţe jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškerou literaturu a ostatní prameny, z nich jsem při přípravě práce čerpala, řádně cituji a uvádím v seznamu pouţité literatury.
Datum a podpis
1
Poděkování Děkuji vedoucímu disertační práce doc. Ing. Pavlu Ryšánkovi, CSc. a konzultantům Ing. Jibanu Kumar Kundu, Ph.D. a Ing. Jitce Staré, Ph.D. za vedení práce a podnětné připomínky. Dále bych chtěla poděkovat dr. Johannesovi A. Jehle za laskavé poskytnutí izolátů CpGV, cenné rady, vlídné zacházení a celému jeho týmu, jmenovitě dr. Sabine Asser-Kaiser, Stefanie Schulze-Bopp, dr. Karolin A. Eberle a Britta Wahl-Ermels za seznámení s metodikou biologických testů a dále kolegům z JKI institutu v Darmstadtu jmenovitě dr. Jürg Huber, dr. Annegret Schmitt, dr. Eva Fritsch a dr. Karin Undorf-Spahn za cenné rady k problematice odchovu přírodní populace obaleče jablečného. Za poskytnutí dvou nových preparátů na bázi CpGV bych chtěla poděkovat také švýcarské firmě Andermatt biocontrol. Za pomoc při sběru vzorků a udrţování chovu obaleče jablečného bych chtěla poděkovat především Ireně Kubečkové a Lence Slámové a děkuji také všem kolegům z VÚRV za vytvoření příjemných podmínek pro práci. Poděkování patří také mé rodině a partnerovi za bezmeznou podporu. Práce byla řešena za finanční podpory grantů Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. v Praze Ruzyni: výzkumný záměr MZe ČR 0002700603 - Systémy ochrany rostlin a skladovaných produktů před škodlivými organismy zajišťující zdravotní nezávadnost a kvalitu rostlinných produktů a neohroţující ţivotní prostředí; NAZV 1G58081 - Inovace ochrany jádrovin vůči škůdcům v systému integrované produkce a v organickém zemědělství; a za finanční podpory grantů České zemědělské univerzity v Praze: MSM 6046070901 Setrvalé zemědělství, kvalita zemědělské produkce, krajinné a přírodní zdroje; GA FAPPZ 21180/1312/3125 - Citlivost populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k biopreparátům na bázi Cydia pomonella granulovirus; GA FAPPZ 21180/1312/3129 - Citlivost přírodních populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k Cydia pomonella granulovirus (izolát CpGV-M); a FRVŠ G42548 - Molekulární diagnostika bakuloviru Cydia pomonella granulovirus a vyuţití bakulovirů v biologické ochraně proti hmyzím škůdcům.
2
Obsah Obsah .......................................................................................................................................... 3 Seznam zkratek a symbolů ......................................................................................................... 6 1
Úvod ................................................................................................................................... 8
2
Literární přehled ............................................................................................................... 10 2.1
Entomopatogenní viry vyuţitelné v ochraně proti hmyzím škůdcům ...................... 10
2.2
Bakuloviry ................................................................................................................ 10
2.2.1 2.2.2 2.2.3
Historie bakulovirů ............................................................................................. 10 Morfologie bakulovirů ........................................................................................ 12 Systém bakulovirů .............................................................................................. 12
2.2.4 Exprese časných a pozdních genů a geny významné pro manipulace viru s hostitelem ....................................................................................................................... 14 2.2.5 Metody detekce bakulovirů ................................................................................ 15 2.2.6 Hostitelský okruh bakulovirů a jejich názvosloví .............................................. 16 2.2.7 Přípravky na bázi bakulovirů.............................................................................. 17 2.2.8 Rekombinantní bakuloviry ................................................................................. 18 2.2.9 Masová produkce bakulovirů pro přípravu biopreparátů ................................... 20 2.2.10 Formulace a aplikace bakulovirů........................................................................ 20 2.3 Cydia pomonella granulovirus – původce granulózy obaleče jablečného ............... 22 2.3.1 Charakteristika CpGV ........................................................................................ 22 2.3.2 Infekční cyklus CpGV ........................................................................................ 23 2.3.3 Hostitelský okruh CpGV .................................................................................... 24 2.4 Obaleč jablečný – nejvýznamnější hostitel CpGV ................................................... 25 2.4.1 Popis obaleče jablečného .................................................................................... 26 2.4.2 Ţivotní cyklus obaleče jablečného ..................................................................... 27 2.4.3 Škodlivost obaleče jablečného a moţnosti biologické ochrany ......................... 28 2.5 Interakce mezi CpGV a jeho hostitelem obalečem jablečným ................................. 29 2.5.1 2.5.2
Přenos CpGV ...................................................................................................... 29 Transpozony v CpGV ......................................................................................... 30
3
2.5.3 Citlivost obaleče jablečného k CpGV - laboratorní hodnocení .......................... 31 2.5.4 Rezistence obaleče jablečného k CpGV ............................................................. 32 Cíle práce .......................................................................................................................... 35
4
Cíl I: Porovnání vlivu pouţité diety a metody aplikace na účinnost CpGV .................... 36 4.1
Metodika ................................................................................................................... 36
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5
Zdroj obaleče jablečného .................................................................................... 36 Zdroj CpGV ........................................................................................................ 36 Kvantifikace CpGV pro biologické testy ........................................................... 36 Příprava umělých diet obsahujících CpGV ........................................................ 37 Příprava umělých diet s povrchovou aplikací CpGV ......................................... 37 3
4.1.6
Testování vlivu sloţení diety a metody aplikace CpGV na mortalitu
v biologickém testu........................................................................................................... 38 4.1.7 Testování vlivu sloţení diety na vývoj obaleče jablečného ............................... 38 4.1.8 Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek ..................................... 39 4.2 Výsledky ................................................................................................................... 39 4.2.1 Mortalita na dietách obsahujících CpGV ........................................................... 39 4.2.2 Mortalita na dietách povrchově ošetřených CpGV ............................................ 41 4.2.3 Vývoj obaleče jablečného na různých dietách ................................................... 43 4.2.4 Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek ..................................... 45 4.3 Diskuze ..................................................................................................................... 46 5
Cíl II: Biologické testy citlivosti obaleče jablečného k CpGV ........................................ 51 5.1
Metodika ................................................................................................................... 51
5.1.1 Zdroje obaleče jablečného .................................................................................. 51 5.1.2 Zdroj CpGV ........................................................................................................ 52 5.1.3 Testování citlivosti obaleče jablečného k CpGV ............................................... 53 5.1.4 Statistické vyhodnocení ...................................................................................... 53 5.1.5 Původ populací testovaných v roce 2008 ........................................................... 55 5.1.6 Původ populací testovaných v roce 2009-2010 .................................................. 56 5.2 Výsledky ................................................................................................................... 56 5.2.1
Citlivost laboratorního kmene CpKrym k CpGV ............................................... 56
5.2.2 Citlivost polních populací obaleče jablečného k CpGV ..................................... 58 5.2.3 Statistické porovnání mortality VBII a kříţenců VBII♂xCpKrym♀ ................. 63 5.3 Diskuze ..................................................................................................................... 65 6
Cíl III: Účinnost nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného ... 69 6.1
Metodika ................................................................................................................... 69
6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4
Zaloţení rezistentního kmene obaleče jablečného ............................................. 69 Ověření zaloţení rezistence CpR-CZ k CpGV-M .............................................. 69 Zdroj obaleče jablečného .................................................................................... 69 Zdroj CpGV ........................................................................................................ 69
6.1.5 Biologický test účinnosti nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného ............................................................................................................ 70 6.2 Výsledky ................................................................................................................... 71 6.2.1 Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného ............................................... 71 6.2.2 Ověření zaloţení rezistence u CpR-CZ .............................................................. 71 6.2.3 Purifikované izoláty............................................................................................ 72 6.2.4 Formulované přípravky ...................................................................................... 74 6.3 Diskuze ..................................................................................................................... 76 7
Cíl IV: Detekce CpGV ..................................................................................................... 78 7.1
Metodika ................................................................................................................... 78 4
7.1.1
Metody izolace nukleové kyseliny pro detekci CpGV v hostiteli ...................... 78
7.1.2 Detekce CpGV .................................................................................................... 81 7.2 Výsledky ................................................................................................................... 84 7.2.1 Izolace NK .......................................................................................................... 84 7.2.2 PCR a RT-PCR detekce CpGV .......................................................................... 84 7.3 Diskuze ..................................................................................................................... 89 8
Závěr ................................................................................................................................. 91
9
Literatura .......................................................................................................................... 94
10
Publikační aktivita autorky ............................................................................................. 101
10.1
Seznam publikací souvisejících s disertační prací .................................................. 101
10.2
Seznam ostatních publikací .................................................................................... 102
Přílohy .........................................................................................................................................I A
B
C
D
Semisyntetické diety pro vývoj obaleče jablečného ............................................................I A.1
Umělá dieta pro laboratorní chov obaleče jablečného v České republice ...................I
A.2
Umělá dieta podle Ivaldi-Sender (1974) pro laboratorní chov v Německu ................I
A.3
Umělá dieta podle Guennelon a kol. (1981) .............................................................. II
Pufry a chemikálie pro molekulární biologii ..................................................................... II B.1
0,5 M EDTA (pH 8,0) ............................................................................................... II
B.2
50x TAE pufr (zásobní roztok).................................................................................. II
B.3
10x ficoll nanášecí pufr ............................................................................................ III
B.4
Pouţívané komerční kity a chemikálie ..................................................................... III
Biologické testy ................................................................................................................ IV C.1
Tabulka pro kvantifikaci purifikovaného izolátu viru před biologickým testem ..... IV
C.2
Tabulka pro hodnocení biologického testu v různých termínech .............................. V
Rozměrné tabulky, obrázky a schémata ........................................................................... VI D.1
Přehled virů bezobratlých ......................................................................................... VI
D.2
Seznam preparátů na bázi bakulovirů pouţitelných v ochraně rostlin ................... VII
D.3
Genom CpGV (Luque a kol., 2001) ....................................................................... XII
D.4
Fotografie okluzních tělísek (OB) z rastrovacího mokroskopu (J. T. Wennmann,
JKI Darmstadt) .................................................................................................................. XIII
5
Seznam zkratek a symbolů obecné zkratky pouţité v textu BV
sekundární forma částice (budded virus)
bdH2O
dvakrát destilovaná voda
bp
pár bází (base pair)
cDNA
komplementární deoxyribonukleová kyselina
COI
cytochromoxidáza podjednotka 1
DEPC
diethyl pyrokarbonát
DNA
deoxyribonukleová kyselina
EDTA
kyselina ethylendiamintetraoctová
ELISA
imunosorpční enzymové stanovení (enzyme-linked immunosorbent assay)
F1
první filiální generace = první generace potomků
GMO
geneticky modifikovaný organismus
GV
granulovirus
h
hodina
ha
hektar
kbp
kilopár bází (kilo base pair)
l
litr
LC50
střední letální koncentrace (median lethal concentration)
LD50
střední letální dávka (median lethal dose)
min
minuta
MNPV
multiple nucleopolyhedrovirus
mRNA
mediátorová ribonukleová kyselina
mtDNA
mitochondriální deoxyribonukleová kyselina
NPV
nucleopolyhedrovirus
OB
okluzní tělísko (occlusion body)
ODV
primární forma částice (occlusion derived virus)
ORF
otevřený čtecí rámec (open reading frame)
PCR
polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
RFLP
polymorfismus délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism)
RIA
imunochemické stanovení vyuţívající značení antigenu či protilátky radionuklidem (radioimmunoassay)
RT-PCR
PCR s reverzní transkripcí
RNA
ribonukleová kyselina 6
SD
výběrová směrodatná odchylka (standard deviation)
SNPV
single nucleoplyhedrovirus
SNP
jednonukleotidový polymorfismus (Single Nucleotide Polymorphism)
ST50
střední letální čas (median lethal time)
TAE
Tris-acetát-EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová
Zkratky organizací DLR Rheinpfalz
Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz
ICTV
Mezinárodní komise pro klasifikaci virů (International Committee of Taxonomy of Viruses)
JKI
Julius Kühn-Institut
SISPO
Svaz pro integrované systémy pěstování ovoce
SRS
Státní rostlinolékařská zpráva
zkratky názvů bakulovirů pouţitých v textu AcMNPV
Autographa californica MNPV
AdorGV
Adoxophyes orana GV
AgMNPV
Anticarsia gemmatalis MNPV
AgseNPV
Agrotis segetum NPV
BmNPV
Bombyx mori NPV
CrleGV
Cryptophlebia leucotreta GV
CpGV
Cydia pomonella GV
CuniNPV
Culex nigripalpus NPV
GmNPV
Galleria mellonella NPV
HaSNPV
Helicoverpa armigera SNPV
HzSNPV
Helicoverpa zea SNPV
MabrNPV
Mamestra brassicae NPV
OpMNPV
Orgyia peudotsugata MNPV
PiGV
Plodia interpunctella GV
PlxyNPV
Plutella xylostella NPV
RoNPV
Rachiplusia ou NPV
SeMNPV
Spodoptera exigua MNPV
7
1
Úvod V současné době stoupá ve vyspělých zemích zájem veřejnosti o původ a kvalitu
potravin. Přestoţe je pro spotřebitele významným kritériem cena potravin, lidé se stále více ptají také na jejich původ, bezpečnost a nezávadnost. Produkce ovoce v ČR se od 90. let 20. století postupně odklání od konvenční, intenzivní produkce, která je zaloţena na pouţívání chemických prostředků na ochranu rostlin a umělých hnojiv. Spolu s tímto systémem produkce se zvyšuje znečištění ţivotního prostředí, sniţuje se diverzita uţitečných organismů v sadech, opakované pouţívání stejných účinných látek pesticidů vede k selekci rezistentních populací škodlivých organismů a také se ve sklízených plodech mohou vyskytovat rezidua pesticidních látek. Novými směry pro pěstování ovoce se staly systémy integrované a organické (ekologické) produkce ovoce, u kterých je kladen důraz na ochranu ţivotního prostředí a zdraví spotřebitele. Oba systémy produkce ovoce vyuţívají k ochraně před škodlivými organismy účinných biopreparátů, které nezanechávají rezidua v plodech, jsou selektivní a šetrné k ţivotnímu prostředí. Virus granulózy obaleče jablečného (Cydia pomonella granulovirus - CpGV) je základním bioagens vyuţitelným v ochraně proti obaleči jablečnému (Cydia pomonella, L. 1758). Zatímco ve světě je tento preparát vyuţíván desítky let, v ČR probíhaly po mnoho let registrační pokusy, které byly v roce 2010 zakončeny zařazením dvou preparátů na bázi CpGV: Madex (Andermatt Biocontrol, Švýcarsko) a Carpovirusine (Arysta Lifescience, Francie) do registru přípravků na ochranu rostlin vydávaného Státní rostlinolékařskou správou (SRS). Tím došlo k rozšíření spektra účinných látek pouţívaných v sadech se systémem integrované produkce ovoce a produkce určené pro zpracování na dětskou výţivu, která má velmi přísné limity pro obsah reziduí pesticidů. Pro ekologické pěstitele je CpGV základním přípravkem, který mohou proti obaleči jablečnému vyuţít. Cílem disertační práce bylo studovat v laboratorních podmínkách vzájemné vztahy mezi virem a hostitelem na úrovni biologických testů, ve kterých byly porovnány dvě metody aplikace viru pro testování účinnosti různých izolátů CpGV, vliv pouţité diety na tyto pokusy a také porovnání citlivosti přírodních populací škůdce k CpGV. Vztahy zkoumané na molekulární úrovni představují různé přístupy detekce CpGV. Disertační práce pojednává také o současné problematice související s výskytem lokálních populací obaleče jablečného rezistentních k CpGV a předkládá výsledky monitoringu citlivosti vybraných populací obaleče jablečného k CpGV s vyuţitím metod, které byly převzaty z renomovaných zahraničních pracovišť v Německu (DLR Rheinpfalz, Neustadt a. d. W; JKI, Darmstadt). 8
Výsledky práce zabývající se monitoringem rezistence k CpGV přispějí k výběru vhodné antirezistentní strategie při dlouhodobém pouţívání biopreparátů na bázi CpGV. V roce 2009 byly první informace o potenciální selekci rezistentních populací škůdce k CpGV zpracovány do metodiky pro praxi a předány členům Svazu pro integrované systémy pěstování ovoce (SISPO) a pěstitelům v reţimu organické produkce. Práce navazuje na výzkum, který byl zaměřen na vyuţití viru granulózy obaleče jablečného v ochraně sadů proti obaleči jablečnému, metody pro hodnocení kvality biopreparátů na bázi CpGV a určení optimálních termínů jejich aplikace (Stará, 2002).
9
2 2.1
Literární přehled Entomopatogenní viry vyuţitelné v ochraně proti hmyzím škůdcům Doposud bylo izolováno více neţ 700 druhů entomopatogenních virů. Tyto viry lze
charakterizovat jako obligátní intracelulární infekční agens, které nenapadají buňky obratlovců ani rostlin (Khachatourians, 2009). Viry napadající hmyz patří do skupiny DNA i RNA virů (příloha D.1). Některé čeledi těchto virů napadají výhradně bezobratlé, zatímco jiné čeledi zahrnují i rody patogenní pro obratlovce či rostliny (Hunter-Fujita, 1998). Pro ochranu rostlin před hmyzími škůdci jsou v současné době vhodné pouze DNA viry z čeledi Baculoviridae - bakuloviry (Miller, 1997; Moscardi, 1999).
2.2 Bakuloviry Zástupci této čeledi jsou patogenní pro tři řády hmyzu, především pro motýly (Lepidoptera), ale také pro blanokřídlé (Hymenoptera) a dvoukřídlé (Diptera). Dříve byly do bakulovirů řazeny i viry napadající zástupce dalších skupin členovců (korýši, brouci, chrostíci, rovnokřídlí), ale tyto viry byly později zařazeny do jiných skupin (Jehle a kol., 2006a; Rohrmann, 2008). Do dnešní doby bylo popsáno více neţ 600 druhů bakulovirů (Szewczyk a kol., 2006) a více neţ 90 % z nich infikuje zástupce 34 čeledí motýlů (Lange a kol., 2004). Viry představují vhodnou alternativu chemickým insekticidům, které mají nepříznivý vliv na ţivotní prostředí a mohou zanechávat v produkci škodlivá rezidua. Povětšinou jsou bakuloviry vysoce selektivní a lze je také vyuţít při antirezistentních strategiích tam, kde se selektovaly populace škůdce rezistentní k chemickým insekticidům. Bakuloviry jsou poměrně rozmanitou skupinou virů hmyzu, jejichţ genom je tvořen dvouřetězcovou kruhovou DNA sbalenou do kapsidy tyčinkovitého tvaru (Miller, 1997; Theilmann a kol., 2005; Rohrmann, 2008). Jsou hostitelsky specifické, nemají škodlivý vliv na ţivotní prostředí a nepředstavují ţádné riziko pro člověka ani necílové druhy ţivočichů (Black a kol., 1997; Szewczyk a kol., 2006). Další výhodou této skupiny virů je stabilita částic chráněných okluzním tělískem, která umoţňuje aplikovat virové preparáty běţnými postřikovači (Bulach a kol., 1999). 2.2.1 Historie bakulovirů První záznamy o bakulovirech pochází z dob, kdy se v Číně začalo produkovat hedvábí, tedy před více neţ 5000 lety. Tehdy vznikly i první popisy onemocnění bource morušového (Bombyx mori) bakulovirem Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV). Popis zahrnoval paralýzu housenek a pozdější rozpad těla housenky umoţňující další šíření 10
onemocnění (Kalmakoff a Ward, 2003; Rohrmann, 2008). Pro toto onemocnění bource morušového se ve dvacátých letech 19. století pouţíval název „grasserie― (Jehle, 2009), dnes je pouţíván obecnější název polyedrie (Kalmakoff a Ward, 2003). V roce 1925 popsal francouzský entomopatolog André Paillot virové onemocnění u housenek běláska zelného (Pieris brassicae), které připomínalo polyedrii bource morušového, avšak v infikovaných tkáních se vyskytovaly neznámé granule. Paillot toto onemocnění nazval „pseudo-grasserie― (Jehle, 2009). V roce 1947 popsal Steinhaus podobné onemocnění u Peridroma margaritosa (nyní Peridroma saucia). Granule o velikosti 0,4 - 0,6 μm, které nalezl v tukovém tělesu a dalších tkáních, připomínaly granule popsané Paillotem (Steinhaus, 1947). V roce 1949 nazval onemocnění granulózou a tuto skupinu virů pojmenoval granuloviry (Jehle, 2009). V této době byly také prvně popsány tyčinkovité viriony uzavřené do sekundárního proteinového obalu (okluzního tělíska). Tvar virionů dal později vzniknout názevu čeledi Baculoviridae [baculum = tyčinka] (Rohrmann, 2008). Protoţe jsou okluzní tělíska (polyedra/granule) stabilní i bez přítomnosti hostitele, začalo se uvaţovat o moţnostech vyuţití bakulovirů v ochraně rostlin proti hmyzím škůdcům s technikou aplikace jako u konvenčních insekticidů (Bulach a kol., 1999). V roce 1975 byl registrován první bakulovirový preparát Elcar na bázi Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus (HzSNPV). Tento preparát se v roce 1984 přestal vyrábět, protoţe se infekce rozvíjela pomalu a také byly k dispozici nové chemické přípravky na bázi syntetických pyretroidů. Ovšem v průběhu 90. let vzrostla poptávka po organicky pěstovaných plodinách a také došlo k selekci rezistentních populací šedavky kukuřičné (Helicoverpa zea) k mnoha insekticidům včetně pyretroidů, a tak se začal preparát znovu vyrábět, tentokrát pod obchodním názvem GemStar (Moscardi, 1999; Szewczyk a kol., 2006). V roce 1976 se podařilo registrovat další biopreparát TM BioControl-1 na bázi Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) proti bekyni Orgyia pseudotsugata (Szewczyk a kol., 2006). Tento úspěch vedl k dalšímu podrobnému studiu bakulovirů a k vývoji nových biopesticidů na bázi bakulovirů. V současné době jsou bakuloviry vyuţívány také v biomedicíně jako vhodný expresní vektor cizorodých eukaryotních genů (Kalmakoff a Ward, 2003) a studují se moţnosti genetických modifikací bakulovirů pro zvýšení jejich pesticidního účinku (Inceoglu a kol., 2001).
11
2.2.2 Morfologie bakulovirů Genom bakulovirů (příloha D.3) je sloţen z 80-180 Kbp a kóduje 90 aţ 180 genů (Jehle a kol., 2006a, Rohrmann, 2008). Konce mnoha genů bakulovirů se překrývají a kódují v obou směrech, coţ je umoţněno otevřenými čtecími rámci (open reading frame - ORF) (Kalmakoff a Ward, 2003). Genom je sbalen do nukleokapsidy tyčinkovitého tvaru o velikosti 30-60 nm x 250-300 nm (Jehle a kol, 2006a). Bakuloviry mají obvykle dva typy částic, které mají různou funkci v infekčním cyklu (Jehle a kol., 2006a). První typ částice „occlusion derived virus― (ODV) slouţí jako infekční virion, který vyvolá primární infekci hostitele v buňkách středního střeva a druhý typ, „budded virus― (BV) pučí z napadených buněk a šíří infekci do dalšch buněk hostitele (obrázek 2.1) (Miller, 1997). Částice typu ODV jsou uzavřeny do proteinové matrice (obrázek 2.1 A) tzv. okluzního tělíska - „occlusion body― (OB), které zajištuje stabilitu částice v době, kdy se vyskytuje ve vnějším prostředí (Mayer a Cory, 2003). Sekundární pučící forma částice BV nemá obal virového původu jako ODV (obrázek 2.1 B). Částice získá obal aţ při pučení z buňky, u které modifikuje cytoplasmatickou membránu pomocí svého obalového fúzního proteinu (Jehle a kol., 2006a).
Obrázek 2.1: A) Rozdíl v utváření okluzních tělísek – granulí virů granulózy (GV) a okluzních tělísek – polyheder virů polyedrózy (SNPV, MNPV). V okluzním tělísku jsou uzavřeny částice prvního typu (ODV) vyvolávající infekci hostitele. B) Odlišnosti v morfologii částic typu pučící virion (budded virus-BV) a infekčního virionu (occlusion derived virus-ODV). Obrázek zpracován podle Steineke (2004) a Kalmakoff a Ward (2003).
2.2.3 Systém bakulovirů Na základě morfologie OB byly bakuloviry donedávna děleny na dva rody: Granulovirus (GV) a Nucleopolyhedrovirus (NPV) (Kalmakoff a Ward, 2003; Theilmann a kol., 2005). Zástupci GV mají částice typu ODV uzavřeny jednotlivě do vejčitých okluzních tělísek tzv. granulí o rozměrech 0,13 µm x 0,5 µm, zatímco NPV mají okluzní tělíska tvaru mnohostěnu (polyedru), jsou přibliţně 0,15-15 µm velká a obsahují jeden či více částic typu 12
ODV (obrázek 2.1). Z fotografií okluzních tělísek zástupců GV a NPV z rastrovacího elektronového mikroskopu je dobře patrný velikostní rozdíl OB těchto dvou skupin (příloha D.4). Okluzní tělíska všech bakulovirů jsou natolik velká, ţe je moţné je pozorovat i světelným mikroskopem (Kalmakoff a Ward, 2003). Základní bílkovinou okluzního tělíska GV je granulin a většina NPV má bílkovinnou matrici z bílkoviny polyhedrin (Jehle a kol., 2006b). Geneticky jsou si tyto dvě krystalické bílkoviny velmi blízké a patří mezi nekonzervovanější bílkoviny bakulovirů (Rohrmann 2008). Někteří zástupci NPV (obrázek 2.1 A) mají v OB uzavřené viriony s jednou nukleokapsidou (single nucleopolyhedrovirus SNPV), u ostatních virion obsahuje více nukleokapsid (multiple nucleopolyhedrovirus MNPV) (Williams a Faulkner, 1997; Theilmann a kol., 2005). S rozvojem technik molekulární biologie byla pozornost věnována talé příbuznosti bakulovirů (Bulach a kol., 1999, Herniou a kol., 2001, Herniou a kol., 2003, Lange a kol., 2004; Jehle a kol., 2006a,b). Na základě fylogenetických studií vycházejících z kompletně osekvenovaných třinácti bakulovirů izolovaných z řádů motýli (12) a dvoukřídlí (1) bylo navrţeno rozdělení rodu NPV do třech skupin: I NPV a II NPV, které jsou specifické pro motýly a skupiny NPV specifické pro dvoukřídlé, která byla navrţena podle sekvence viru komára Culex nigripalpus nucleopolyhedrovirus (CuniNPV). U rodu GV nedošlo k ţádným změnám (Herniou a kol., 2003). CuniNPV byl zařazen do samostatné skupiny, protoţe se výrazně geneticky lišil od NPV specifických pro motýly (Herniou a kol., 2003) a také OB tohoto viru je tvořeno bílkovinou odlišnou od granulinu i polyhedrinu (Rohrmann 2008). Zástupci skupin I NPV a II NPV se významně liší v genech, především pak v typu obalového fuzního proteinu, který napomáhá částicím druhého typu (BV) modifikovat membránu hostitelské buňky a vyuţít ji jako obal nukleokapsidy. Skupina I NPV pouţívá pro fúzi výlučně protein Gp64, přestoţe většina z nich obsahuje také F protein. Skupina II NPV a také GV vyuţívají analogy proteinu F (Pearson a Rohrmann, 2002; Rohrmann, 2008). Toto navrhované rozdělení bylo předzvěstí vzniku nového systému bakulovirů, který byl vytvořen v roce 2006 na základě porovnání příbuznosti vysoce konzervativních genů late expression factor 8 (lef-8), late expression factor 9 (lef-9) a polyhedrin/granulin (polh/gran) u 117 bakulovirů vyvolávajících onemocnění
u motýlů
(114),
blanokřídlých
(2)
a dvoukřídlých (1) (Jehle a kol., 2006b) a řady genů pocházejících z 29 celých genomů bakulovirů izolovaných z řádů motýli (26), blanokřídlí (2) a dvoukřídlí (1) (Jehle a kol., 2006a). Mezinárodní komise pro klasifikaci virů (ICTV) uvedla v platnost toto rozdělení v roce 2008 (zdroj ICTV - Virus Taxonomy list 2008). Čeleď Baculoviridae je nyní rozdělena 13
do čtyř rodů: Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Gammabaculovirus a Deltabaculovirus (obrázek 2.2; tabulka 2.1). Nové rozdělení respektuje nejen příbuznost jednotlivých zástupců čeledi, ale také lépe vystihuje jejich hostitelskou specifitu (Jehle a kol., 2006a). V současné době je v GenBank databázi dostupných více neţ 50 kompletních genomových sekvencí (databáze online NCBI GenBank, 22. 7. 09), které umoţňují dále studovat a porovnávavat geny bakulovirů (Jiang a kol., 2009). Rod Alphabaculovirus Betabaculovirus Gammabaculovirus Deltabaculovirus
Původní rod NPV GV NPV NPV
Hostitelská specifita Lepidoptera Lepidoptera Hymenoptera Diptera
Tabulka 2.1: Nové rozdělení bakulovirů platné od roku 2007 (zdroj ICTV - Virus Taxonomy list 2008)
Obrázek 2.2: Nový systém bakulovirů zaloţený na příbuznosti 29 druhů bakulovirů (Jehle a kol., 2006a)
2.2.4 Exprese časných a pozdních genů a geny významné pro manipulace viru s hostitelem Genová exprese je u bakulovirů rozdělena do čtyř časových období: okamţitá časná (immediate early), zpoţděná časná (delayed early), pozdní (late) a velmi pozdní (very late) (Guarino a Summers, 1987). Geny časné fáze infekce jsou přepisovány před replikací viru za pomoci hostitelské RNA polymerázy II, zatímco pozdní geny jsou přepisovány aţ po začátku replikace virové DNA a jsou kódovány virovu RNA polymerázou, rezistentní 14
k α-amanitinu. Alfa amanitin inhibuje hostitelskou RNA polymerázu II (Rohrmann, 2008). Velmi pozdní geny přepisují například geny významné pro tvorbu strukturálních proteinů okluzních tělísek (granulin/polyhedrin) (Funk a kol., 1997). Schéma na obrázku 2.3 popisuje děj v jednotlivých fázích infekce.
Obrázek 2.3: Schéma exprese genů bakulovirů v průběhu infekčního cyklu. Časné geny jsou přepisovány pomocí hostitelské RNA polymerázy II. Pozdní a velmi pozdní geny mají promotory odlišné od těch, které rozpoznává hostitelská RNA polymeráza II, a jsou přepisovány virovou RNA polymerázou. V pozdní fázi infekčního cyklu se vytvářejí pučící viriony (BV) šířící infekci v těle hostitele. Ve velmi pozdní fázi infekce se začínají produkovat nové částice (ODV), které se uzavírají do okluzních tělísek (OB) a slouţí k infekci nového hostitele.
Bakuloviry mají celou řadu genů, které jim pomáhají ovládat hostitele. Vysoce propracované systémy například brání jiţ od časné fáze infekce apoptóze tedy programované smrti buněk, která se spustí, aby zastavila šíření viru z napadených buněk hostitele. Hlavní roli zde hrají geny p35 a skupina inhibitorů apoptózy aip (Clem, 1997; Rohrmann 2008). Prikhod’ko a Miller (1996) uvádí, ţe časný virový tansaktivátor IE-1 produkt genu ie-1 také souvisí s apoptózou. Gen egt kóduje enzym ekdysteriod UDP-glukosyltransferázu, která blokuje funkci svlékacího hormonu ekdysonu, čímţ dochází k prodlouţení fáze, kdy larva přijímá potravu a virus se tak můţe déle mnoţit. Koncem infekčního cyklu jsou produkovány enzymy katepsin a chitináza, které desintegrují buňky hostitele a okluzní tělíska se snáze rozšíří do prostředí (Funk a kol., 1997; Rohrmann, 2008). 2.2.5 Metody detekce bakulovirů První detekční metodou, která umoţnila potvrdit přítomnost bakuloviru byla světelná a elektronová mikroskopie (Hunter-Fujita a kol., 1998). Později byla optimalizována řada metod vyuţívajících pro detekci značených protilátek (Wo, 2001). Mezi nejvýznamnější z těchto metod patřily různé varianty imunosorpčního enzymového stanovení (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay) (Crook a Payne, 1980) a imunochemické stanovení vyuţívající značení protilátky radionuklidem RIA (radioimmunoassay) (Smith a Summers, 15
1981). Vyuţití těchto technik však bylo omezené, protoţe byly buďto zdlouhavé a nespolehlivé nebo vyuţívaly radioaktivních materiálů (Wo, 2001). Nový rozměr detekce bakulovirů byl dosaţen s rozvojem velmi citlivé metody polymerázové řetězové reakce (PCR-polymerase chain reaction) zaloţené na opakovaném zmnoţení (amplifikaci) známého úseku DNA za pomoci termostabilní DNA polymerázy. Tento úsek je ohraničen dvěma specifickými primery, tedy krátkými úseky komplementární DNA, které jsou navrţeny do vysoce konzervativních oblastí genomu bakulovirů, např. genů polh/gran (Wo, 2001; Kundu a kol., 2003). Novou a ještě citlivější variantou PCR je kvantitativní PCR v reálném čase (Real-Time PCR či qPCR), která je zaloţena na sledování průběhu PCR přímo během reakce pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují mnoţství PCR produktu zvýšením své fluorescenční aktivity. Této vysoce citlivé metody lze vyuţít například pro kvantitativní porovnání replikace viru v různých tkáních hmyzu (Asser-Kaiser, 2010). 2.2.6 Hostitelský okruh bakulovirů a jejich názvosloví Různé bakuloviry mají odlišný počet hostitelských druhů, které mohou usmrtit (Cory a Mayers, 2003). Například alfabakuloviry, které infikují bekyňovité (Lymantriidae), jsou hostitelsky vysoce specifické, na druhou stranu Mamestra brassicae NPV (MabrNPV), který byl pojmenován po svém hostiteli můře zelné (Mamestra brassicae), infikuje druhy čtyř řádů motýlů a Autographa californica MNPV (AcMNPV) má dokonce hostitele nejméně v 15 řádech motýlů. Ostatní bakuloviry včetně betabakulovirů však bývají hostitelsky specifické a mají jen jednoho hostitele či několik hostitelů z úzce příbuzných druhů či rodů (Cory a Mayers, 2003). Díky těmto vlastnostem lze bakuloviry pouţít jako vysoce selektivní agens pro regulaci cílového škůdce bez negativních dopadů na necílové organismy. Nomenklatura bakulovirů je ustanovena ICTV a nebyla s novým systémem změněna. Druhové jméno viru je tvořeno z celého latinského názvu hostitele, ze kterého byl virus prvně izolován a rodové jméno tvoří název rodu bakuloviru podle starého systému (NPV popř. SNPV, MNPV nebo GV) (Rohrmann, 2008). Jak jiţ bylo naznačeno, hostitelský okruh některých bakulovirů je široký. Pokud virus napadá i další hostitele, zůstává název viru podle původního hostitele. V některých případech byl ovšem virus izolován z různých hostitelů a pojmenován několika jmény, ačkoliv rozdíl v aminokyselinách byl mezi těmito viry jen 1,5 – 4 %, coţ naznačuje, ţe se jedná jen o různé izoláty jednoho viru. Příkladem toho jsou viry Galleria mellonella NPV (GmNPV), Rachiplusia ou NPV (RoNPV) a Plutella xylostella NPV (PlxyNPV), které jsou blízce příbuzné s Autographa californica MNPV (AcMNPV) (Rohrmann, 2008).
16
2.2.7 Přípravky na bázi bakulovirů Komerčně vyráběné biopreparáty na bázi bakulovirů představují vhodnou alternativu k insekticidům v lesních porostech, sadech, sklenících, ale i v polních plodinách. Jejich předností je selektivní účinek a zdravotní nezávadnost, která tyto produkty předurčuje pro pouţití v systémech organické a integrované produkce plodin (Szewczyk a kol., 2009). Insekticidní účinek bakulovirů je niţší a mnohdy pomalejší neţ v případě syntetických insekticidů, avšak při dlouhodobějším vyuţívání bakulovirů v systémech ochrany se významně sniţuje populační hustota škůdce v dalších letech (Lacey a Unruh, 2005). Podobný účinek mají také preparáty na bázi grampozitivní bakterie Bacillus thuringiensis (Bt), kterou proti bakulovirům zvýhodňuje snadnější produkce preparátu a širší hostitelský okruh (Rohrmann, 2008). V některých případech však účinnost bakulovirů účinek Bt významně převyšuje. Například v jabloňových sadech se proti obaleči jablečnému (Cydia pomonella) osvědčil bakulovirus Cydia pomonella GV (CpGV) a preparáty na bázi Bt nejsou v praktické ochraně proti obaleči jablečnému příliš účinné, protoţe se housenky tohoto škůdce velmi brzy zavrtávají do jablka a obvykle tak nepřijmou letální dávku Bt toxinu (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). CpGV navíc patří mezi tři neúspěšnější bakulovirové preparáty a je pouţíván po celém Světě (Rohrman, 2008). Dašími dvěma významnými bakuloviry jsou Anticarsia gemmatalis MNPV (AgMNPV), který je vyuţíván v ochraně sóji proti můře Anticarsia gemmatalis v Brazílii a Helicoverpa armigera SNPV (HaSNPV), který se Číně pouţívá k ochraně bavlny proti polyfágní černopásce bavlníkové (Helicoverpa armigera) (Rohrman, 2008). Seznam preparátů na bázi těchto a dalších druhů bakulovirů je uveden v příloze D.2. Nejširší spektrum bioinsekticidů bylo do dnešní doby formulováno z CpGV, který byl prvně izolován v roce 1963 z infikovaných housenek pocházejících ze severu Mexika (Tanada, 1964 cit. podle Asser-Kaiser, 2010). Biopreparáty na bázi mexického izolátu (CpGV-M) začala později produkovat a nabízet pod různými obchodními názvy řada světových firem. První preparát SAN 406 vytvořila v USA firma Sandoz v roce 1980. V Evropě byl v roce 1988 prvně uveden na trh přípravek Madex švýcarské firmy Andermatt Biocontrol. Dalšími registrovanými preparáty, které jsou v Evropě pouţívány i dnes, jsou Granupom (Hoechst, Německo, registrace: 1991) a Carpovirusine (Calliope, Francie, registrace: 1993) (Rohrmann, 2008). V USA a Kanadě byly později registrovány preparáty Cyd-X (Thermo Trilogy nyní Certis, USA, registrace: 1995) a VirosoftCP4 (Biotepp, Kanada, registrace: 2000). VirosoftCP4 ovšem na rozdíl od ostatních preparátů neobsahuje CpGV-M, ale izolát pocházející z Quebeku (Kanada) (Vincent a kol., 2007; Rohrmann, 2008). Eberle 17
(2010) označila izolát pocházející z preparátu Virosoft CpGV-S. Vývoj preparátů probíhal také v dalších zemích, například v Rusku to byl preparát Virin-CyAP (Moscardi, 1999; Rohrmann, 2008) či v České republice byl testován preparát firmy Biola Chelčice (Stará a Kocourek, 2003), u kterého však vzhledem k vysoké konkurenci zahraničních výrobků nebyl dokončen proces registrace. Přípravek
Producent
Izolát viru
Registrováno
Carpovirusine
Calliope, nyní Arysta LifeScience
Mexický
Kanada, USA
Carpovirus Plus
INTA, Agro Roca
Mexický
Argentina
Cyd-X
Thermo Trilogy, nyní Certis
Mexický
Kanada, USA
Granupom
Biobest
Mexický
Pouze Belgie
Granupom neu
OMYA
Mexický
Švýcarsko
Granupom
Hoechst AgrEvo, nyní Probis
Mexický
Německo
Madex
Andermatt Biocontrol
Mexický
Západní Evropa, Nový Zéland, JAR, Kypr aj.
Madex Max
Andermatt Biocontrol
neuveden
Německo
Madex Plus
Andermatt Biocontrol
Mexický selektovaný
Švýcarsko
VirosoftCP4
BioTEPP
Kanadský
Kanada, USA
Tabulka 2.2: Přehled komerčně dostupných biopreparátů na bázi CpGV.
Další vlna produkce nových preparátů na bázi CpGV započala v roce 2007, kdy byl registrován první izolát CpGV účinný proti populacím obaleče jablečného rezistentních k CpGV-M (viz podkapitola 2.5.4). Současné spektrum produktů na bázi CpGV uvádí tabulka 2.2. Přípravky na bázi CpGV jsou pouţívány v mnoha evropských zemích, Severní a Jiţní Americe, na Novém Zélandu, či v Jihoafrické republice (Jehle a Schmitt, 2009). V České republice byly první preparáty na bázi CpGV (Madex, Carpovirusine) registrovány aţ v roce 2010. 2.2.8 Rekombinantní bakuloviry Oproti chemickým insekticidům je pesticidní účinek bakulovirů pomalý (Inceoglu a kol., 2001; Szewczyk a kol., 2006; Szewczyk a kol., 2009). Bakuloviry usmrtí larvu hostitele obvykle za 5 dní (většina NPV), ale také aţ za 7-14 dní (většina GV), coţ vede mnohdy k citelným ztrátám produkce (Inceoglu a kol., 2001). Příkladem „pomalého― bakuloviru vyuţitelného do jabloňových sadů je Adoxophyes orana GV (AdorGV), který zabíjí housenky svého hostitele obaleče zimolezového (Adoxophyes orana) aţ v posledním larválním instaru bez ohledu na to, kdy byla housenka infikována a jakou dávku viru přijala (Wormleaton a 18
kol., 2003). Naproti tomu CpGV, který patří mezi „rychlé― bakuloviry, usmrcuje housenky obaleče jablečného do 5-10 dnů po infekci a infikované housenky navíc rostou pomaleji a také příjmají méně potravy (Luque a kol., 2001; Jehle a kol., 2006c). Přesto stihnou housenky obaleče jablečného před úhynem vytvořit povrchové závrtky na plodech (Cross a kol., 1999, Lacey a Unruh, 2005). Vzájemné vztahy systému virus-hostitel jsou stále studovány a hledají se moţnosti, jak zvýšit účinnost jednotlivých bakulovirů. Existují tři základní způsoby rekombinace bakulovirů, kterými lze zvýšit jejich účinnost. První moţností je vloţit do genomu bakuloviru gen kódující vybrané hormony hmyzu, například diuretický hormon či esterázu juvenilního hormonu (Inceoglu a kol., 2001). Druhou moţností je odebrat gen pro ekdysteroid UDP- glukosyltransferázu (egt), jejíţ produkt zabraňuje svlékání larvy a tím prodluţuje dobu, kdy housenka přijímá potravu a virus se můţe v hostiteli déle mnoţit. Tato manipulace, která zrychluje účinek viru, byla také úspěšně provedena u CpGV (Cross a kol., 1999), a to i přesto, ţe se manipulace u GV provádějí obtíţněji (Inceoglu a kol., 2001). Třetím typem modifikace bakulovirů je vloţení nových genů kódujících toxiny specifické pro hmyz (např. gen cry toxin z Bacillus thuringiensis, gen pro toxiny roztočů, pavouků či škorpionů) (Black a kol., 1997; Hughes a kol, 1997; Moscardi, 1999, Szewczyk a kol., 2006). Například Sun a kol. (2002) vyuţili pro urychlení infekce vyvolané Helicoverpa armigera SNPV (HaSNPV) dva různé typy rekombinace. U prvního typu (HaCXW1) byl odebrán egt a u druhého typu (HaCXW2) byl tento gen nahrazen neurotoxinem AaIT ze škorpiona Androctonus australis. Výše popsané rekombinace byly zkoušeny při vývoji komerčního biopreparátu, který by rychleji a účinněji reguloval škůdce černopásku bavlníkovou (Helicoverpa armigera) v Číně. V polním pokusu zaloţeném v bavlníku ošetřeném rekombinantními HaCXW1 nebo HaCXW2 byly housenky černopásky zabíjeny rychleji neţ housenky, které byly ošetřeny původním izolátem HaSNPV. Zasaţené housenky byly sbírány a chovány na umělé dietě. Střední letální čas (ST50) se proti pouţití původního izolátu zkrátil o 15,3 % (HaCXW1) a 26,3 % (HaCXW2). Také úbytek listové plochy hodnocený 108 hodin po ošetření se sníţil přibliţně o 50 % HaCXW1 a o 63 % u HaCXW2 proti původnímu přírodnímu izolátu HaSNPV. Tyto výsledky naznačují, ţe rekombinantní typy bakulovirů by mohly úspěšněji a efektivněji chránit pěstované plodiny, především jedná-li se o „pomalé― bakuloviry. Avšak vzhledem k všeobecné nedůvěře k GMO nebyl dosud registrován ţádný preparát na bázi rekombinovaného bakuloviru (van Beek a Davis, 2007; Szewczyk a kol., 2009).
19
2.2.9 Masová produkce bakulovirů pro přípravu biopreparátů Produkce bakulovirů můţe probíhat v in vivo nebo in vitro podmínkách, ovšem vzhledem k finanční a také materiálové náročnosti in vitro technik, je masová produkce pro výrobu biopreparátů zaloţena na propagaci viru v hostiteli (Khachatourians, 2009). Pro propagaci viru in vivo je vybrán hostitel, kterého lze snadno chovat (krátký vývoj, vysoká reprodukční schopnost, nevyskytuje se kanibalismus larev, moţnost chovu na umělé dietě apod.) a je vysoce citlivý k vybranému bakuloviru. Ovšem při pouţití alternativního hostitele je nutné sledovat účinnost pasáţovaného viru proti cílenému škůdci, protoţe se virulence můţe produkcí v jiném hostiteli sníţit (Hunter-Fujita a kol., 1998). Hmyz bývá chován na umělé potravě (dietě), popřípadě na přirozené potravě a je infikován v pozdějším vývojovém stádiu, aby housenky uhynuly aţ těsně před kuklením, kdy vyprodukují nejvíce viru. Sběr infikovaných housenek bývá prováděn obvykle krátce před úhynem (Khachatourians, 2009). Chov hostitele a příprava diety by měly být odděleny od vlastní produkce viru, aby nedošlo ke kontaminaci chovu virem. Ideální je mít tyto procesy v různých budovách (Hunter-Fujita a kol., 1998). Výroba preparátů vyţaduje mnoho pracovních sil (odchov hostitele, propagace viru, sběr infikovaných jedinců) a také je třeba udrţovat vysokou hygienu chovu, coţ zvyšuje cenu produktu. I přesto se v současné době stále jedná o jedinou ekonomicky dostupnou metodu produkce (Grzywacz a kol., 1997; Cadogan a kol., 2003). Druhá metoda produkce bakulovirů in vitro je zaloţena na propagaci viru v hmyzích buňkách udrţovaných v buněčných kulturách (Khachatourians, 2009). Tato metoda bývá vyuţívána zejména při produkci rekombinantních bakulovirů (Inlow a kol., 1989) a pro různé laboratorní experimenty (Kariuki a kol., 2000). Výhodou proti metodě in vivo je produkce čistého virového preparátu bez příměsi mikroorganismů, které se mohou vyskytovat při produkci in vivo, a proto musí být v chovu hmyzu dodrţována vyjímečná hygienická opatření (Hunter-Fujita a kol., 1998). Nevýhodou je kromě vysoké ceny také riziko sniţující se účinnosti neustálým pasáţováním (Kariuki a kol., 2000). 2.2.10 Formulace a aplikace bakulovirů Základem biopreparátů jsou okluzní tělíska, která se vytváří na konci infekčního cyklu viru v hostiteli. Aby mohl být preparát úspěšně pouţíván, je nutné zajistit, aby se při dlouhodobém skladování nesniţovala aktivita částic a prezistence přípravku po aplikaci byla co nejdelší (Hunter-Fujita a kol., 1998).
20
Kvalitu přípravků na bázi bakulovirů je moţné zachovat skladováním ve zmraţeném stavu při -20 °C. Takto se bakuloviry dlouhodobě skladují v laboratoři, ovšem to není v praxi běţné, a proto je nutné formulovat přípravky tak, aby je bylo moţné skladovat po dobu alespoň 18 měsíců za vyšších teplot a přitom nedošlo ke sníţení kvality rozvojem bakterií a hub (Hunter-Fujita a kol., 1998). Přípravky na bázi bakulovirů jsou formulovány nejčastěji jako suspenzní koncentráty (SC) nebo smáčitelné prášky (WP) (Khachatourians, 2009). U smáčitelných prášků je rozvoji mikroorganismů zabráněno nízkou vlhkostí (do 5 %) a hermetickým uzavřením jednotlivých balení preparátů, u suspenzních koncentrátů je růstu většiny mikroorganismů zabráněno zajištěním nízkého pH (≤ 4) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Aplikované preparáty na bázi mikroorganismů jsou nejvíce degradovány vlivem ultrafialového záření (UV), a to jak UV-A (320-400 nm), tak i UV-B (280-320 nm) (Burges a Jones, 1998; Hunter-Fujita a kol., 1998). Perzistenci biopreparátů po aplikaci zvyšuje celá řada chemických UV protektantů, které absorbují, reflektují nebo blokují UV záření (Burges a Jones, 1998). Hunter-Fujita a kol. (1998) uvádí látky, kterými lze zvýšit odolnost proti UV záření. Mezi významné řadí optické zjasňovače, které však současně působí nepříznivě na fotosyntézu a opylování zjasňovači pokrytých rostlin (Salamouny a kol., 2009). Je však známa také řada přírodních absorbantů UV záření. Salamouny a kol.(2009) testovali v laboratorních podmínkách účinnost ligninu (Reax85A) a černého čaje na prodlouţení účinnosti
SeMNPV
proti
blýskavce
červivcové
(Spodoptera
exigua).
SeMnNPV
o koncentraci 2x105 OB/ml byl před biologickým testem vystaven zdroji UV-A a UV-B záření po dobu aţ 5 hodin. Mortalita housenek vlivem SeMNPV v biologickém testu bez ochrany ligninu nebo černého čaje dosáhla jiţ po dvouhodinovém záření 100 %, zatímco při ochraně těmito přírodními látkami zůstala 100 % účinnost zachována i po 5 hodinách záření. Dalšími významnými adjutanty preparátů na bázi viru jsou látky zvyšující adhezi či látky zabraňující odpařování vody a tím úletu malých kapek při postřiku (anti-drift) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Také je třeba zmínit látky zvyšující chuťovou atraktivnost preparátu (např. melasa), která zvýší příjem potravy s virem dříve, neţ začne degradovat např. vlivem UV záření (Lacey a Unruh, 2005). Aplikace biopreparátů je obdobná jako u chemických insekticidů. Je moţné pouţít běţné postřikovače (Hunter-Fujita a kol., 1998), či při ochraně lesů aplikovat preparáty letecky (Švestka a Pultar, 2002). Bakuloviry jsou aplikovány ve vysokých koncentracích metodou inundace (zaplavení, zamoření), kdy je cílem decimovat škůdce, kteří se v určitém čase vyskytují na určitém místě a neočekává se dlouhodobá regulace pomocí tohoto bioagens 21
(Holuša a Weiser, 2005). Například proti obaleči jablečnému jsou aplikovány dávky 1012-1013 OB/ha, aby okamţitě došlo k potlačení škůdce (Lacey a Unruh, 2005). Preparáty je moţné aplikovat v tankmixu, avšak ne s příliš kyselými či zásaditými látkami (optimální pH pro aplikaci se pohybuje od 4 do 9) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Postřiky jsou prováděny několikrát za sezónu, v závislosti na hustotě výskytu škůdce a průběhu počasí, ovšem vzhledem k prvním zprávám o výskytu k viru rezistentních populací škůdce (Jehle a kol., 2006c), by měly být prováděny v kombinaci s odlišně působícími přípravky (Jehle, 2008b; Stará a kol., 2009). Bakuloviry mají pouze poţerový účinek, a proto je nutné zacílit aplikaci proti nejvnímavějšímu stádiu škůdce, tedy čerstvě vylíhnutým housenkám v případě hostitelů se skrytým způsobem ţíru a prvních několika instarů škůdců s povrchovým ţírem (Lacey a Unruh, 2005). Perzistence okluzních tělísek je po aplikaci niţší neţ u chemických insekticidů a sniţuje se, zejména jak jiţ bylo uvedeno zvyšující se intenzitou UV záření (Hunter-Fujita a kol., 1998). Při silném slunečním záření musí být aplikace opakována přibliţně po 3-8 dnech (Lacey a Unruh, 2005).
2.3 Cydia pomonella granulovirus – původce granulózy obaleče jablečného Cydia pomonella granulovirus (CpGV) patří mezi zástupce rodu Betabaculovirus (dříve Granulovirus) a je zároveň typovým druhem tohoto rodu (Theilmann a kol., 2005). Podobně jako ostatní bakuloviry vyniká CpGV šetrností k ţivotnímu prostředí a necílovým organizmům a zaujímá tak významné místo v ochraně sadů se systémem integrované produkce ovoce a je nepostradatelnou součástí organického zemědělství (Jehle a kol., 2006c). 2.3.1 Charakteristika CpGV Genom CpGV je tvořen cirkulární dvouřetězcovou DNA (123,5 kb) sbalenou do kapsidy tyčinkovitého tvaru. Genom obsahuje 143 orf (otevřených čtecích rámců). Velikost genomu a počet orf byl zjištěn v roce 2001 osekvenováním in vivo klonovanéno M1 genotypu mexického izolátu CpGV-M (Luque a kol., 2001). Sekvence tohoto izolátu (NC_002816) je volně přístupná v GenBank databázi National Center for Biotechnology Information (NCBI). Schéma genomu CpGV je uvedeno v příloze D.3. Restrikční profil CpGV-M a dalších dvou izolátů původem z Ruska (CpGV-R) a Anglie (CpGV-E) byl znám jiţ od 80. let 20. století (Crook a kol., 1985). K mapování pouţili Crook a kol. 1985 restrikční endonukleázy EcoRI, BamHI, SmaI, HindIII a ApaI. Další důkladné mapování genomu CpGV-M bylo publikováno v roce 1996 (Crook a kol., 1996). Přestoţe byly známy různé izoláty viru, komerční biopreparáty pouţívané v Evropě obsahovaly jen částice nejlépe 22
popsaného izolátu CpGV-M (Crook a kol., 1985; Crook a kol., 1997; Luque a kol., 2001). Protoţe byly v roce 2003 zaznamenány potíţe s účinností CpGV-M (Fritsch a kol., 2005; Jehle a kol., 2006c; Zingg a Kessler, 2007; Asser-Kaiser a kol., 2007), znovu započalo hledání izolátů viru, a to takových, které by dokázaly regulovat i nově selektované rezistentní populace obaleče jablečného (více k rezistenci v podkapitole 2.5.4). V roce 2008 byly popsány nové izoláty pocházející z Íránu (Rezapanah a kol., 2008). V různých oblastech Íránu byly nalezeny desítky izolátů. Jedenáct z nich (CpGV-I01, I07, I08, I15, I22, I28, I30, I66, I67, I68, I70) vykazovalo genetické i biologické odlišnosti. Genetické rozdíly byly nalezeny pomocí restrikce virové DNA endonukleázami EcoRI, PstI a XhoI a biologické vlastnosti byly hodnoceny biologickým testem (bioassay). Další práce Eberle a kol. (2009) představuje restrikční profil a biologické vlastnosti šesti izolátů viru z Íránu (CpGV- I01, I07, I08, I12, I66, I68), dvou z Gruzie (CpGV-G01, G02) a jednoho z Anglie (CpGV-E2), který prvně popsal Crook a kol. (1985). Ve své disertační práci uvádí Eberle (2010) restrikční profily celkem 14 CpGV izolátů hodnocených restrikční analýzou s následujícími restrikčními endonukleázami SalI, EcoRI, BamHI, XhoI, PstI, KpnI, SacI, SmaI, ApaI a HindIII. 2.3.2 Infekční cyklus CpGV Infekční cyklus CpGV (obrázek 2.4) začíná přijetím granule (okluzní tělísko, OB) housenkou vnímavého hostitele. Housenka přijme OB spolu s potravou. Kdyţ se OB dostanou do středního střeva hostitele, dochází vlivem alkalického pH k rozpuštění granulinu a uvolněné částice prvního typu (ODV) procházejí peritrofickou membránou a pronikají aţ do buněčných jader střevního epitelu, kde dochází k primární infekci. Sekundární infekci vyvolávají částice druhého typu (BV), které pučí z napadených buněk. Při pučení modifikují BV svým obalovým fúzním proteinem F (u CpGV transkript genu Cp31) cytoplasmatickou membránu buňky hostitele a vyuţívají ji jako obal (obrázek 2.1 B). Poté se infekce za pomoci BV rozšiřuje do dalších tkání hostitele. Zatímco BV se vytvářejí v pozdní fázi infekce, ve velmi pozdní fázi dochází opět k vytváření částic typu ODV, produkci proteinové matrix (granulin) a vzniku nových OB. Virové proteinázy: chitináza (u CpGV transkript genu Cp10) a katepsin (u CpGV transkript genu Cp11) se podílejí na degradaci chitinu exoskeletu a rozloţení těla hostitele (obrázek 2.5 C), při kterém se nově vytvořené OB uvolní do prostředí (Funk a kol., 1997; Luque a kol., 2001; Kalmakoff a Ward, 2003; Jehle a kol., 2006c). Obrázek 2.5 A B ukazuje rozdíl mezi zdravou a infikovanou housenku. Typickým příznakem posledního stádia granulózy je zduření tělních segmentů housenky, mléčné zabarvení a sníţení její pohyblivosti.
23
Obrázek 2.4: Infekční cyklus CpGV. Infekce začíná příjmem a následným rozpuštěním okluzních tělísek (OB) ve středním střevu housenky. Uvolněné infekční viriony (ODV) prochází peritrofickou membránou a fúzují s membránou buněk střevního epitelu. Nukleokapsidy vstupují do jádra a začnou se replikovat. Nově vytvořené nucleokapsidy pučí z buněčné membrány a vznikají tak částice druhého typu (BV), které vyvolávají sekundární infekci v nově napadených buňkách hostitele. Do dalších buněk se BV dostávají za pomoci fúze s buněčnou membránou. V pozdní fázi infekce se formují znovu ODV, které se obalují a vytváří se OB. V konečné fázi infekce dochází k uvolnění OB do prostředí. (obrázek podle Arends, 2004).
Obrázek 2.5: Infekce housenek L1 obaleče jablečného nízkou dávkou (300 OB/ml) vede k úhynu posledních instarů. A) Zdravá housenka L5; B) Infikovaná housenka L5 v posledním stádiu infekce; C) Housenka s prasklou kutikulou.
2.3.3 Hostitelský okruh CpGV Nejdůleţitějším a také nejvnímavějším hostitelem CpGV je celosvětově rozšířený škůdce jádrovin a dalších dřevin, obaleč jablečný Cydia pomonella (biologie škůdce v podkapitole 2.4). Pouze několik částic viru (3-17) pozřených housenkou prvního instaru 24
(L1) stačí k tomu, aby započala infekce končící smrtí hostitele (Cossentine a kol., 2005). Dalším citlivým hostitelem CpGV je Cryptophlebia leucotreta, (anglicky „false codling moth― – „falešný obaleč jablečný―). C. leucotreta je významným škůdcem citrusů, bavlníku, kukuřice a dalších ekonomicky významných plodin tropické a subtropické Afriky (Reiser a kol., 1993; Lange a Jehle, 2003). Velkochov tohoto škůdce je snazší neţ u obaleče jablečného, proto je moţné pouţít housenky posledních instarů (L4-L5) pro masovou produkci CpGV (Reiser a kol., 1993). C. leucotreta je také hostitelem C. leucotreta granulovirus (CrleGV), který však obaleče jablečného nenapadá (Jehle a kol., 1992). Oba viry CrleGV a CpGV mají k sobě z fylogenetického hlediska blízko (Lange a Jehle, 2003). Eastwell a kol. (1999) uvádí, ţe CpGV dokáţe v laboratorních podmínkách infikovat i další blízké druhy obalečů, avšak jen při několikanásobně vyšších dávkách viru. Mezi tyto hostitele uvádí obaleče východního (Grapholita molesta), obaleče prýtového (Rhyacionia buoliana), obaleče Rhyacionia frustrana a obaleče hrachového (Cydia nigricana). Pro obaleče východního infikovaného v L1 instaru CpGV uvádí Lacey a kol. (2005) hodnoty střední letální koncentrace (LC50) 35,1 okluzních tělísek na milimetr čtvereční (OB/mm2), coţ je 557 krát vyšší hodnota, neţ udává pro obaleče jablečného (LC50 0,063 OB/mm2). Peyne (1981) porovnával citlivost L1 housenek obaleče hrachového a obaleče jablečného k šesti různým koncentracím CpGV. Na virem kontaminované dietě byly housenky po dobu 24 hodin. Poté byly přeneseny na dietu bez viru a po 6 dnech byla stanovena LC50, která byla u obaleče jablečného (1,54x104 OB/ml) a u obaleče hrachového (1,90x105 OB/ml). LC50 obaleče jablečného byla jen 12,3 krát niţší neţ obaleče hrachového, ovšem kdyţ se housenky L1 vyvíjely na dietě obsahující různé koncentrace CpGV po dobu 14 dní, u obaleče jablečného došlo i v nejniţší testované koncentraci (1,56x103 OB/ml) k 100 % mortalitě, zatímco housenky obaleče hrachového uhynuly jen při nejvyšší koncentraci (1,56x106 OB/ml). V nejniţší koncentraci 1,56x103 OB/ml jejich mortalita po 14 dnech nepřesáhla 10 %. Nově popsaným hostitelem CpGV se stal obaleč švestkový (Cydia funebrana) (Reineke a kol., 2010). Autoři testovali 10 různých izolátů CpGV a nalezli dva izoláty CpGV-V15 a CpGVV18, které při povrchové aplikaci na švestky v koncentraci 107 OB/ml způsobovaly mortalitu housenek obaleče švestkového 58 % (CpGV-V15) a 63 % (CpGV-V18).
2.4 Obaleč jablečný – nejvýznamnější hostitel CpGV Obaleč jablečný, Cydia pomonella (Linnaeus, 1758) patří do třídy hmyz (Insecta), řádu motýli (Lepidoptera) a čeledi obalečovití (Tortricidae). Housenky obaleče jablečného poškozují především plody jádrovin, ale mohou příleţitostně napadat i plody dalších ovocných dřevin, například ořešáků, meruněk, broskvoní a vzácně také plody třešní, slivoní, 25
mandloní či jedlých kaštanů (Sorauer, 1953). Přestoţe obaleč jablečný pochází z jihovýchodní Evropy (Shel‘Deshova, 1967), je rozšířen téměř po celém světě a patří mezi hospodářsky nejvýznamnější škůdce jabloňových sadů (Thaler a kol., 2008). 2.4.1 Popis obaleče jablečného Vajíčka jsou zploštělá, čočkovitého tvaru a bývají 1,3 x l,0 mm velká. Po nakladení mají mléčně stříbřitou (opalescentní) barvu, ale v průběhu vývoje je moţné přes průhledný chorion pozorovat ve vajíčku vývojové změny. Nejsnáze jsou pozorovatelné dvě embryonální fáze vajíčka, které slouţí pro orientační stanovení termínu ošetření larvicidy (Hluchý a kol., 1997). První fází je tzv. „červený prstenec―, kdy se druhý aţ třetí den po nakladení vytváří po obvodu vajíčka úzký červený krouţek. Druhou fází je „černá hlavička―, kterou lze ve vajíčku pozorovat přibliţně jeden aţ dva dny před líhnutím. Vývoj housenky obaleče jablečného prochází pěti instary (L1-L5). Tělo prvních čtyř instarů je bělavé s tmavě hnědou aţ černou hlavou. Poslední pátý instar má růţové zbarvení, hlava s hrudním štítem jsou světleji hnědé a lesklé. Housenky L5 jsou 14-18 mm dlouhé. Hrudní články nesou po jednom páru panoţek, anální článek je s pošinkami. U housenek obaleče jablečného není vytvořen anální hřeben. Od pozdějšího instaru L4 lze u housenek rozlišit pohlaví, protoţe samcům při pohledu na dorzální stranu těla prosvítají skrz pokoţku pátého abdominálního segmentu dvě oddělené červenofialové gonády (Howell, 1991; Fuková a kol., 2008). Na obrázku 2.6 A je samičí a samčí housenka L5.
Obrázek 2.6: Rozdíl mezi samcem a samicí ve stádiu housenky L5 a kukly. A) Samčí housenky L5 lze od samičích rozlišit podle prosvítajících gonád skrz pokoţku pátého abdominálního segmentu. B) Rozdíl mezi samčí a samičí kuklou je dán počtem abdominálních segmentů. U samice jsou viditelné tři, zatímco u samce čtyři.
Kukla motýlů je nekousací mumiová (pupa adectica obtecta). Obaleč jablečný má kuklu 9 aţ 10 mm dlouhou, nejprve světle hnědé barvy, která do líhnutí ztmavne. Kukla samic 26
bývá větší a těţší, ale toto kritérium není vhodné pouţít pro rozlišení pohlaví. Pohlaví lze snadno odlišit při pohledu na ventrální stranu kukly (obrázek 2.6 B). Samice má tři volně spojené abdominální segmenty a terminální segment je vytvořen fúzí několika segmentů, zatímco kukla samce má vytvořené čtyři volně spojené abdominální segmenty (Howell, 1991). Motýli, kteří vylétnou z kukel, mají rozpětí křídel 14-18 mm. Samice bývají větší a těţší (16-42 mg) a nelétají příliš daleko. Samci jsou díky niţší váze (12-21 mg) pohyblivější (Howell, 1991). Přední křídla jsou popelavě šedá s tmavými příčkami. Blízko jejich hrotu je červenavě tmavohnědá skvrna, tzv. zrcátko, které je světle leskle orámované. Zadní křídla jsou šedohnědá. Hlava a hruď jsou popelavě hnědé, zadeček šedohnědý (Miller, 1956). Pohlavní dimorfismus není výrazný. Samec má na spodní straně předních křídel hranatou černou skvrnu a proti samičce má uţší zadeček. Lépe lze pohlaví rozlišit při kaudálním pohledu na vnější genitálie. U samice je na konci zadečku viditelný kruhový otvor (obrázek 2.7 A), zatímco vnější pohlavní orgány samce jsou tvořeny párem valvae (obrázek 2.7 B) (Howell, 1991).
Obrázek 2.7: Rozlišení pohlaví u dospělců obaleče jablečného. A) samice, B) samec
2.4.2 Ţivotní cyklus obaleče jablečného Ţivotní cyklus obaleče jablečného popisuje obrázek 2.8. Tento škůdce přezimuje ve stádiu housenky posledního larválního instaru (L5). Housenky si upředou pevný zámotek, ve kterém přezimují v prasklinách kůry stromů či v půdě. Na jaře se housenky v zámotku kuklí a v závislosti na teplotě zhruba od poloviny května vylétávají první motýli. Dříve se líhnou samci (Lacey a Unruh, 2005). Motýli se obvykle páří při soumraku, kdy intenzita světla klesá pod 150 lux. Při vysoké oblačnosti se páří i dříve (Howell, 1991). Samičky kladou vajíčka jednotlivě nebo v malých skupinách po 2-3 na listy a plody. Z vajíček se po 3-7 dnech líhnou housenky, které okamţitě začnou hledat vhodné místo pro vytvoření závrtku. Jsou li vajíčka nakladena na listech a doba neţ naleznou plod, je dlouhá, mohou se krátce ţivit i listem, ovšem po nalezení plodu vytváří závrek. Nejprve den či dva vytvářejí poţerek těsně pod slupkou plodu a pak se ve stádiu druhého instaru zaţírají dovnitř plodu 27
(Lacey a Unruh, 2005). Pronikají nejčastěji aţ do jádřince, kde mohou vyţírat i semena. Vstupní otvor i chodbička jsou vyplněny trusem. Vývoj housenek trvá v závislosti na teplotě 18-40 dní (Lacey a Unruh, 2005). Potom housenky L5 opouštějí plody a vyhledávají úkryty vhodné pro přezimování (kůra stromu, půda, tráva). V teplejších oblastech nevstupují všechny housenky první generace do diapauzy, ale většina se brzy zakuklí a dá vzniknout 2. generaci. V závislosti na klimatických podmínkách můţe mít obaleč jablečný aţ čtyři generace (Asser-Kaiser, 2010). V našich podmínkách škodí housenky druhé generace na dozrávajících plodech především v teplejších oblastech, např. na Jiţní Moravě, v chladnějších oblastech je druhá generace jen částečná nebo zcela chybí.
L5
Obrázek 2.8: Ţivotní cyklus obaleče jablečného. Z vajíček se vylíhnou housenky prvního instaru (L1), které se zavrtají do plodu a další vývoj aţ do L5 probíhá skrytě. Housenky L5 se buďto kuklí a vylétnou motýli 2. generace, kteří nakladou další vajíčka, nebo vstupují do diapauzy a přezimují v zámotku pod kůrou stromů či v půdě. Na jaře se housenky zakuklí a vylétnou motýli první generace., kteří nakladou vajíčka. Autorem obrázku je V. Falta; publikováno Stará a kol. (2009).
2.4.3 Škodlivost obaleče jablečného a moţnosti biologické ochrany První generace škůdce způsobuje předčasný opad mladých plodů. Později napadené plody zůstávají na stromě, časněji se vybarvují a jsou náchylnější k napadení houbovými chorobami, především moniliovou hnilobou jádrovin (Monilinia fructigena). Holb (2004) uvádí ve své studii ze sadu v organickém reţimu pěstování, ţe 70-80 % plodů napadených M. fructigena bylo poškozeno od obaleče jablečného. 28
V důsledku intenzivní chemické ochrany v jabloňových sadech došlo v průběhu 90. let minulého století k selektování mnoha populací obaleče jablečného rezistentních k insekticidům s různými typy účinných látek. V České republice byl zaznamenán výskyt populací tohoto škůdce rezistentních k organofosfátům a inhibitorům růstu v oblastech s intenzivním pěstováním jabloní, především na Jiţní Moravě (Stará a Kocourek, 2007). Vzhledem ke snaze eliminovat rezidua pesticidů v plodech a také zabránit rozvoji rezistence k pouţívaným insekticidům, je vhodné obohatit spektrum pouţívaných preparátů proti obaleči jablečnému o mikrobiální pesticidy. V ČR byl donedávna povolen pouze Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki formulovaný v přípravku Biobit XL (Valent BioSciences Corporation), který je ovšem účinný spíše proti škůdcům, kteří se nevyvíjí skrytě (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). Od roku 2010 je moţné pouţít také preparáty na bázi CpGV, ovšem vzhledem k moţné selekci rezistence škůdce (více podkapitola 2.5.4) by bylo vhodné rozšířit seznam povolených bioagens o další preparáty. Mnoho experimentů je v poslední době prováděno s entomopatogenními hlísticemi Steinernema carpocapsae a S. feltiae, které lze pouţít na podzim proti přezimujícím housenkám obaleče jablečného (Lacey a Unruh, 2005; Kienzle a kol., 2008; Brown 2010). Ve světě byla provedena také řada experimentů s entomopatogenními houbami (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). U druhů Beauveria bassiana a Peacilomyces farinosus byla zjištěna nejlepší účinnost, ovšem v ochraně proti obaleči jablečnému se běţně nepouţívají (Lacey a Unruh, 2005).
2.5 Interakce mezi CpGV a jeho hostitelem obalečem jablečným 2.5.1 Přenos CpGV Udrţování viru v populaci hostitele je v přírodě zajišťováno kombinací horizontálního a vertikálního přenosu (Kukan, 1999; Cory a Mayers, 2003). 2.5.1.1 Horizontální přenos Horizontální přenos je nejběţnějším způsobem přenosu bakulovirů. Je závislý na interakcích mezi infikovanými a zdravými housenkami a populační hustotě škůdce. Přenos probíhá v rámci jedné generace, kdy obecně platí, ţe s vyšší hustotou škůdce se zvyšuje šance pro přenos viru (Kukan, 1999; Cory a Mayers, 2003). Zdrojem OB v přírodě mohou být usmrcené larvy, exkrementy infekčních larev a výkaly jejich predátorů (Szewczyk a kol., 2006). Horizontální přenos viru se snadno uskutečňuje u škůdců, kteří poškozují listovou plochu povrchovým ţírem, protoţe se infikované larvy mohou potkávat se zdravými ve všech vývojových stádiích. Obaleč jablečný ale poškozuje plody vnitřním ţírem a proto je u něj tento typ horizontálního přenosu viru méně častý (Steineke, 2004). Období, ve kterém se 29
housenka obaleče můţe setkat s virovou partikulí, je omezeno jen na první (L1), maximálně časný druhý (L2) instar. Housenka v té době hledá vhodné místo na plodu, kde začne poţerek a protoţe vajíčka bývají nakladena i na listech, je pravděpodobné, ţe se cestou k plodu potká s OB kontaminujícími prostředí. Poté, co se housenka prokouše slupkou plodu, probíhá celý vývoj do L5 skrytě a navíc v jednom jablku se obvykle vyvíjí jen jedna housenka obaleče jablečného. 2.5.1.2 Vertikální přenos Druhým typem přenosu je přenos vertikální, kterým virus přechází z rodičů na potomstvo, a proto není závislý na populační hustotě škůdce (Steineke, 2004). Aby mohl být virus přenesen do další generace, musí být larva infikována subletální dávkou viru obvykle aţ ve vyšším instaru, kdy se významně sniţuje vnímavost housenek k viru (Burden a kol., 2002; Il'inykh a Ul'yanova, 2004). Doposud byl vertikální přenos potvrzen jen u několika druhů bakulovirů, především ze skupiny alfabakulovirů (Kukan, 1999; Burden a kol., 2003; Cory a Mayers, 2003). Ve skupině betabakulovirů byl molekulárně potvrzen vertikální přenos Plodia interpunctella GV (PiGV) subletálně infikovanými housenkami zavíječe paprikového Plodia interpunctella (Burden a kol., 2002). Vertikální přenos byl také studován u CpGV, avšak výsledky prací nebyly vţdy zcela jasné. Například výsledky experimentů Steineke (2004) byly znehodnoceny CpGV kontaminací negativní kontroly. Podobně nejasné kontaminace housenek negativních kontrol uvádí ve své diplomové práci i Perchat (1998). To můţe znamenat, ţe housenky v kontrolní skupině neošetřené virem měly v sobě přítomen virus v latentní či perzistentní formě. Latence je charakterizována expresí jen několika či dokonce jen jednoho genu, zatímco při perzistenci probíhá exprese všech genů, ale na velmi nízké úrovni (Burden a kol., 2003). Latentní infekci v laboratorním chovu obaleče jablečného v Britské Kolumbii (Kanada) popisují Cossentine a kol. (2005) a domnívají se, ţe přenos na potomstvo je zajištěn transovariálně (ve vajíčku). Je tedy zřejmé, ţe vertikální přenos bude hrát roli také v přenosu CpGV, ovšem do dnešní doby nebyl jednoznačně potvrzen. 2.5.2 Transpozony v CpGV V roce 1995 byli identifikováni mutanti viru CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5, kteří obsahovali transponovatelný element (transpozon) pocházející z hostitele. Tyto transpozony se do CpGV dostaly horizontálně v průběhu infekce obaleče jablečného a obaleče Cryptophlebia leucotreta. Mutant CpGV-MCp4 obsahoval transpozon TCp3.2, coţ je 3,2 Kbp dlouhý úsek DNA začleněný původně do genomu obaleče jablečného (Jehle a kol., 1997). 30
V pozdější studii Arends a Jehle (2002) zjistili, ţe v průběhu klonování CpGV-MCp4 in vivo došlo k inverznímu vloţení TCp3.2. Tento mutant byl nazván CpGV-MCp4inv. Druhý mutant CpGV-MCp5 získal transpozon TCl4.7 z genomu obaleče C. leucotreta. Tento transpozon je 4,7 Kbp dlouhý (Jehle a kol., 1997). Arends (2004) stanovil u CpGV-M a mutantů CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5 střední letální dávku (LD50) pro pátý instar (L5) housenek obaleče jablečného a nenalezl rozdíly ve virulenci, avšak stanovení středního letálního času (ST50) u L5 housenek obaleče jablečného ukázalo, ţe ST50 je u CpGV-M signifikantně kratší neţ u mutantů CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5. V letech 1999-2002 sledovali Kundu a kol. (2003) přítomnost TCp3.2 v housenkách čtyř přírodních populací obaleče jablečného v ČR. Četnost výskytu transponovatelného elementu TCp3.2 se lišila mezi populacemi a lety sběru housenek. Nebyla nalezena souvislost mezi ošetřením housenek obaleče jablečného CpGV preparáty a četností výskytu TCp3.2. 2.5.3 Citlivost obaleče jablečného k CpGV - laboratorní hodnocení Je všeobecně známo, ţe vnímavost larev k bakulovirové infekci klesá s jejich vývojem, a to nejen mezi instary, ale i v průběhu růstu jednotlivých instarů (Cory a Mayers, 2003). Také u housenek obaleče jablečného je k CpGV nejvnímavější první instar (L1), který je navíc jako jediný z instarů snadno zasaţitelný přípravkem na bázi CpGV, protoţe jinak se obaleč jablečný vyvíjí skrytě (Steineke, 2004). Údaje o citlivosti L1 housenek infikovaných CpGV v laboratorních podmínkách uvádí celá řada autorů (Lacey a kol., 2002; Lacey a kol., 2005; Asser-Kaiser a kol., 2007; Eberle a kol., 2008, Berling a kol., 2009). Nejběţnější metodou pro hodnocení citlivosti obaleče k CpGV nebo porovnání virulence různých izolátů CpGV je biologický test na umělé dietě kontaminované virem. Existují dva základní postupy pro přípravu virem kontaminované umělé diety. Buď je virus míchán přímo do diety, nebo je aplikována suspenze viru na povrch diety (Hunter-Fujita a kol., 1998). V obou případech je vytvořena koncentrační řada viru a u housenek je v různé době po infekci hodnocena mortalita statisticky probitovou analýzou, kterou prvně formuloval Chester Ittner Bliss v roce 1934 (Bliss, 1935; Bliss, 1938). Finney (1971) vytvořil model probitové analýzy, která je pouţívána dodnes. Nejčastěji je probitovou analýzou zjišťována střední letální koncentrace (LC50) popřípadě střední letální dávka (LD50), coţ je vypočítaná koncentrace/dávka OB CpGV, při které je usmrcena polovina jedinců. V případě, ţe je virus míchán do diety, je LC50 uváděna OB/ml, při aplikaci na povrch bývají jednotky OB/mm2 (Hunter-Fujita a kol., 1998). S povrchovou aplikací CpGV se setkáme například v pracích Lacey a kol. (2002), Lacey a kol. (2005) a Berling a kol. (2009). Metodě aplikace viru do diety dali přednost Fritsch a kol. (2005), Asser-Kaiser a kol. (2007) či Eberle a kol. (2008). Metody aplikace viru jsou dvě, ale 31
termínů pro hodnocení mortality je celá řada. Jehle a kol. (2006c) uvádí, ţe housenky obaleče jablečného nakaţené krátce po vylíhnutí podléhají infekci za 5-7 dnů, proto autoři vyuţívají k hodnocení 6. den (Fritsch a kol., 2005), 7. den (Lacey a kol., 2005; Asser-Kaiser a kol., 2007; Eberle a kol., 2008, Berling a kol., 2009) či 10. den (Lacey a kol., 2002). Z důvodu selekce k CpGV rezistentních populací obaleče byl zaveden také termín hodnocení po 14 dnech, kdy jsou kontrolní housenky při standardní teplotě 25-26 °C v posledním 5. instaru (Fritsch a kol., 2005), popřípadě aţ po 21 dnech, kdy je většina housenek v kontrole zakuklena (Asser-Kaiser a kol., 2007). 2.5.4 Rezistence obaleče jablečného k CpGV První případy sníţené účinnosti biopreparátů na bázi CpGV proti obaleče jablečnému byly zaznamenány v roce 2002 ekologickým pěstitelem v jiţním Bádensku (Německo). CpGV zde byl aplikován od roku 1996 (Fritsch a kol., 2005). Další populace se sníţenou náchylností k CpGV byly objeveny v několika sadech nejen v Německu, ale i ve Francii a později také ve Švýcarsku, Itáli, Holandsku a Rakousku (Fritsch a kol., 2005; Sauphanor a kol., 2006; Jehle a kol., 2006c; Zingg a Kessler, 2007; Asser-Kaiser a kol., 2007, Jehle a Schmitt, 2009). Ve všech v Evropě dostupných CpGV biopreparátech je pouţit mexický izolát CpGV-M, který nedokáţe housenky rezistentní populace obaleče jablečného usmrtit (Jehle, 2008a). Účinnost CpGV-M byla hodnocena v průběhu třech let (2003-06) biologickými testy u housenek (L1) pocházejících ze 13 ze sadů na jihu Německa, kde byla pozorována sníţená účinnost biopreparátů a u několika populací citlivých L1 housenek z přírody resp. laboratorního chovu. Biologický test byl hodnocen po 14 dnech probitovou analýzou a byly stanoveny střední letální koncentrace (LC50). Housenky jedenácti sledovaných přírodních populací byly 1000 krát a ve dvou případech dokonce 10 000 krát méně citlivé neţ k viru senzitivní housenky z přírody a laboratorního chovu a bylo prokázáno, ţe se jedná o dědičnou rezistenci obaleče jablečného k CpGV-M (Asser-Kaiser a kol., 2007). Původní hypotéza, ţe je rezistence k CpGV zaloţena autozomálně s neúplnou dominancí (Eberle a Jehle, 2006), byla o rok později vyvrácena Asser-Kaiser a kol. (2007). Eberle a Jehle (2006) kříţili citlivé (CpS) a rezistentní (CpR) obaleče ve skupinách (cca 30♂ x 30♀) (Jehle 2008a), zatímco Asser-Kaiser a kol. (2007) kříţili jednotlivé páry. Při kříţení zjistili, ţe CpR stále obsahuje citlivé jedince, proto pod dalším selekčním tlakem (CpGV-M v diskriminační koncentraci 5,8x104 OB/ml) získali čistě rezistentní kmen CpRR1. Poté kříţili jednotlivé páry CpS♂ x CpRR1♀ a CpS♀ x CpRR1♀ a jejich hybridní potomstvo zpětně kříţili s CpRR1 nebo CpS. Podle výsledků testů potvrdili hypotézu, ţe rezistence k CpGV-M je zaloţena dominantně na pohlavním chromozomu Z. U většiny motýlů a také u 32
obalečovitých je u samic pohlaví zaloţeno heterogameticky ZW, zatímco samci mají dva stejné chromozomy ZZ (Traut a Marec, 1997). Toto dominantní zaloţení rezistence na pohlavním chromozomu Z vede při selekčním tlaku biopreparáty na bázi CpGV-M k rychlejšímu rozšíření rezistentních jedinců neţ kdyby byla rezistence zaloţena autozomálně (Asser-Kaiser a kol., 2007). Ovšem dominantně se rezistence dědí jen při dávkách viru do koncentrace ~ 1x104 OB/ml. Při vysokých dávkách přeţívají samičky ZRW a samci ZRZR, ale heterozygotní samci ZSZR hynou v posledním instaru housenky (obrázek 2.9). Dominance je tedy závislá na koncentraci viru, kdy je faktor rezistence u heterozygotních samců ZSZR 1000 a u samic ZRW a samců ZRZR dosahuje faktor rezistence dokonce 100 000. Faktor rezistence byl stanoven jako podíl LC50 laboratorního kmene CpRR1 a LC50 referenčního citlivého kmene CpS (Jehle a Schmitt, 2009). Další práce na téma zaloţení rezistence u heterogenní populace (CpR) z přírody byla vydána v roce 2010 (Asser-Kaiser a kol., 2010). V této práci byly kříţeny různé páry CpR populace (CpR♂xCpR♀), hybridní páry CpR (CpS♂xCpR♀ či CpR♂xCpS♀) a také bylo provedeno zpětné kříţení potomstva hybridního kříţení. Následné biologické testy při diskriminační koncentraci 5,8x104 OB/ml prokázaly, ţe je i zde dědičnost rezistence zaloţena pouze dominantně na pohlavním chromozomu Z, a ţe při diskriminační koncentraci platí dědičnost tak, jak je uvedeno na obrázku 2.9 ve sloupci běţná dávka (Asser-Kaiser a kol., 2010; Stará a kol., 2009). Ze závěrů Asser-Kaiser (2010) vyplývá, ţe rezistence k CpGV, na rozdíl od jiných pozorovaných rezistencí, nesniţuje jedinům jejich fitness. Tyto informace jsou podloţeny třemi lety, kdy byl chov kmene CpR udrţován bez selekce virem a nedošlo u něho ke změně poměru citlivých a rezistentních jedinů. Lze předpokládat, ţe i v sadech, kde se selektují rezistentní jedinci, nedojde po odstranění selekčního tlaku k zpětnému nastolení převahy citlivých jedinců. Kromě dědičnosti rezistence byl studován také mechanismus rezistence k CpGV (Asser-Kaiser a Jehle, 2009; Asser-Kaiser, 2010). Byly provedeny tři různé experimenty, které měly vysvětlit mechanismus rezistence. Zjistilo se, ţe rezistentní housenky nelze infikovat OB (obsahují typ částic ODV) přijatými potravou ani druhým typem částic (BV) injektovaným do hemocoelu housenek L4. Hemolymfa infikovaných rezistentních housenek vstříknutá do citlivých housenek nevyvolala infekci, protoţe neobsahovala BV. Vstřikováním BV do hemocoelu rezistentních housenek nedošlo ke vzniku infekce, zatímco citlivé housenky hynuly do 7 dnů. Závěrem těchto pokusů bylo, ţe infekce není blokována ve středním střevě, ale je blokována sekundární infekce ve všech typech buněk. 33
Obrázek 2.9: Schématické zobrazení dědičnosti rezistence k CpGV podle výsledků Asser-Kaiser a kol. (2007). Rezistence je děděna přes pohlavní chromozóm Z. R=rezistentní alela, S=citlivá alela. Autorem obrázku je V. Falta; publikováno Stará a kol. (2009).
Poté, co byla prokázána rezistence k izolátu CpGV-M, započalo hledání nových účinnějších izolátů viru. V laboratořích Andermatt Biocontrol AG pasáţovali izolát CpGV-M přes rezistentní housenky a selektovali tak nový účinný izolát (Zingg a Kessler, 2007; Jehle a Schmitt, 2009). Jeho účinnost byla hodnocena roku 2006 nejen laboratorně biologickými testy, ale i polními pokusy v pěti vybraných sadech. Účinnost přípravku byla vysoká na rezistentní i citlivé populace obaleče jablečného (Zingg a Kessler, 2007). Obchodní název nového biopreparátu je Madex Plus a v roce 2008 byl registrován ve Švýcarsku (Jehle a Schmitt, 2009). V současné době jsou studovány další izoláty CpGV, které se od CpGV-M liší geneticky i biologickou aktivitou a mohou být významné v antirezistentní strategii (Rezapanah a kol., 2008; Jehle a Schmitt, 2009; Eberle, 2010).
34
3
Cíle práce Cílem práce bylo vyhodnotit v laboratorních podmínkách vztahy mezi CpGV a jeho
hostitelem obalečem jablečným. Podle dílčích cílů byla práce rozdělena na čtyři části. Dílčími cíli bylo: Porovnat dvě základní metody aplikace viru a vyhodnotit vliv pouţité diety
1)
na účinnost viru (4 Cíl I). Byly testovány následující hypotézy:
Pouţívání různých diet pro biologické testy nemá vliv na mortalitu housenek obaleče jablečného při zamíchání CpGV do diety.
Pouţívání různých diet pro biologické testy má vliv na mortalitu housenek obaleče jablečného při povrchové aplikaci CpGV.
Vývoj housenek se na odlišných dietách neliší. Vyhodnotit v letech 2008-2010 citlivost laboratorního kmene (CpKrym) a různých
2)
českých populací škůdce k izolátu CpGV-M, který je běţně pouţíván v komerčně dostupných biopreparátech (5 Cíl II). Byly testovány následující hypotézy:
Housenky laboratorního kmene obaleče jablečného CpKrym jsou k CpGV-M vysoce citlivé.
Citlivost
populací
obaleče
jablečného
pocházejících
z různých
míst ČR
je
k CpGV-M vysoká. V případě, ţe bude zjištěna rezistence polních populací obaleče jablečného k CpGV,
3)
stabilizovat rezistentní kmen (CpR-CZ), ověřit zaloţení rezistence a otestovat nové izoláty viru (6 Cíl III). Byly testovány následující hypotézy:
Rezistence CpR-CZ je zaloţena na pohlavním chromozomu Z.
Citlivost homogenně rezistentního kmene CpR-CZ k novým izolátům CpGV je vysoká.
4)
Optimalizovat metody rutinní detekce CpGV v hostiteli za pomoci polymerázové
řetězové reakce (PCR). Mimo jednoduché PCR detekce CpGV optimalizovat také duplex PCR pro detekci viru s vnitřní kontrolou (hostitelskou DNA) v jedné reakci. Připravit metody izolace a detekce virové mRNA genu pro granulin pro studium vertikálního přenosu CpGV (7 Cíl IV).
35
4
Cíl I: Porovnání vlivu pouţité diety a metody aplikace na účinnost CpGV
4.1 Metodika 4.1.1 Zdroj obaleče jablečného Chov citlivého kmene obaleče jablečného (CpS) byl zaloţen v JKI (dříve BBA) v Darmstadtu (Německo). Experimenty byly prováděny v DLR Rheinpfalz, Neustadt a. d. Weinstrasse (Německo), kde byly housenky obaleče chovány individuálně na semi syntetické dietě připravené podle Ivaldi-Sender (1964) viz příloha A.2. Po 14 dnech byly housenky vyndány z diety a ponechány v páscích z vlnité lepenky ke kuklení. Za týden byly z pásků vyndány kukly, které byly po skupinách přeneseny do chovných klícek vyloţených polyethylenovým sáčkem, na který samice kladly vajíčka. Podmínky pro chov a experimenty byly: 26° C, 60% relativní vlhkost a 16L:8D h fotoperioda. 4.1.2 Zdroj CpGV Pro hodnocení citlivosti populací obaleče jablečného k viru slouţil purifikovaný izolát CpGV-M (EU standard). 4.1.3 Kvantifikace CpGV pro biologické testy Před pouţitím izolátu viru byla provedena kvantifikace částic v zásobní suspenzi. Výchozí koncentrace okluzních tělísek (OB) purifikovaného izolátu CpGV byla stanovena počítáním OB v ředěné suspenzi viru v počítací komůrce (Petroff - Hausser couting chamber, hloubka: 0,02 mm, Hausser Scientific, PA, USA) obrázek 4.1.
Obrázek 4.1: Počítací komůrka Petroff-Hausser (hloubka 0,02 mm) pro kvantifikaci izolátů CpGV. A) Celá počítací komůrka. B) Detail centrální části komůrky. Počítání okluzních tělísek bylo provedeno v úhlopříčce pěti velkých čtverců, které jsou rozděleny na 16 menších čtverců.
Suspenze byla připravena postupným ředěním redestilovanou vodou (1:10) s výsledným poměrem 1: 10 000 (suspenze:voda). Optickým mikroskopem Olympus CX 41 36
RF, Olympus Optical Co., Ltd. či Leica (DMBRE) s temným polem při celkovém zvětšení 400 x byly částice počítány úhlopříčně v pěti velkých čtvercích obrázek 4.1 B dvakrát po sobě z jednoho ředění viru a poté z druhého nezávislého ředění viru. Pro výpočet byla pouţita tabulka uvedená v příloze C.1. Postup kvantifikace byl převzat na stáţi v DLR Rheinpfalz. 4.1.4 Příprava umělých diet obsahujících CpGV Diety podle Ivaldi-Sender (1975), dále jen „Iv-S― a podle Guennelon a kol. (1981), dále jen „Guenn― byly připraveny podle předpisu v příloze A.2 a A.3 jen s tím rozdílem, ţe pro přípravu Iv-S bylo pouţito jen 5 g agaru pro snazší zamíchání viru do diety. Pro biologický test bylo pouţito 45 ml diety o teplotě 40 °C, která byla skleněnou tyčinkou dobře promíchána s 5 ml vodní virové suspenze za vzniku koncentrační řady s jednotkou uvádějící počet okluzních tělísek v mililitru diety (OB/ml). Do kontrolní diety (45 ml) bylo přidáno 5 ml vody. Komerčně dostupná instantní dieta Manduca Premix-Heliothis premix (Stonefly Industries, Inc., Bryan, TX, USA) dále jen „Premix―, byla připravena za studena z práškového premixu a vodné suspenze viru v poměru 1:3 (12,5 g premixu, 37,5 ml suspenze viru) za vzniku koncentrační řady. Do kontrolní diety byla přidána čistá voda. Výsledný objem diety byl 50 ml. Testovací boxy (odkládací box na zkumavky, Neolab) byly plněny dietami od kontroly bez viru aţ po nejvyšší koncentraci viru, aby se zamezilo kontaminaci kontrol virem. Bylo testováno šest koncentrací viru: 3x102; 103; 3x103; 104; 3x104; 105 OB/ml. 4.1.5 Příprava umělých diet s povrchovou aplikací CpGV V tomto experimentu byly porovnány jen dvě diety Iv-S a Premix. Diety byly připraveny v objemu 50 ml bez obsahu viru podle přílohy A.2 a A.3. Druhý den po přípravě bylo na povrch diety v kaţdé komůrce aplikováno za pomoci dávkovací pipety (Multipette Plus, Eppendorf) 30 μl vody (kontrola) nebo vodné suspenze viru o různých koncentracích za vzniku koncentrační řady s jednotkou uvádějící počet okluzních tělísek na milimetru čtverečním diety (OB/mm2). Rozsah aplikovaných koncentrací se mezi dietami lišil. Na povrch diety Iv-S bylo aplikováno šest různých koncentrací: 0,0208; 0,0625; 0,208; 0,625; 2,08; 6,25 OB/mm2, zatímco na Premix bylo aplikováno sedm koncentrací: 0,0625; 0,208; 0,625; 2,08; 6,25; 20,8; 62,5 OB/mm2. Povrch diety Iv-S byl po aplikaci suspenze vysušen v digestoři.
37
4.1.6 Testování vlivu sloţení diety a metody aplikace CpGV na mortalitu v biologickém testu Čerstvě vylíhlé housenky byly za pomoci štětečku umístěny do jednotlivých komůrek naplněných dietou. Tento den se do hodnocení biologického testu nezapočítával a byl označen jako den 0. První den po přípravě testu byla vyhodnocena mortalita způsobená manipulací s housenkami. Mrtvé housenky ze dne 1 nebyly do pokusu započítány. Sedmý a čtrnáctý den byla hodnocena mortalita v kontrole a ve virem kontaminovaných boxech. Statisticky byla mortalita vyhodnocena probitovou analýzou za pomoci statistického software XLSTAT 2010 (Addinsoft, USA). Mortalita v kontrolách byla při vyhodnocování testů přepočtena dle Abbotta (1925). Biologický test byl s kaţdou dietou a metodou aplikace proveden ve třech nezávislých opakováních. Pro jedno opakování (všechny druhy diet) byl vţdy virus nově kvantifikován. Výsledkem probitové analýzy bylo stanovení středních letálních koncentrací (LC50) s 95% konfidenčními limity (pásy spolehlivosti) pro jednotlivé diety a metody aplikace viru ze všech opakování. Rozdíly mezi LC50 a sklony křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV byly pro jednotlivé diety vyhodnoceny porovnáním 95% konfidenčních intervalů. Rozdíly v hodnotách LC50 sklonů křivek byly povaţovány za statisticky významné v případě, ţe se nepřekrývaly jejich 95% konfidenční intervaly (Tabashnik a kol., 1987). 4.1.7 Testování vlivu sloţení diety na vývoj obaleče jablečného Vývoj obaleče jablečného byl hodnocen na třech dietách Guenn, Iv-S a Premix třikrát ve stádiu housenky (po 1, 7 a 14 dnech) a ve stádiu kukly (po 21 dnech) ve viruprostých kontrolách biologického testu. První a druhé hodnocení bylo zaměřeno na porovnání přirozené mortality housenek na jednotlivých dietách. Den po umístění housenek na dietu byla vyhodnocena mortalita, která však byla ovlivněna fitness housenek a manipulací při přenosu housenek na povrch diety. Z tohoto důvodu byla mortalita housenek hodnocena ještě po 7 dnech a vztaţena k počtu housenek, které přeţily den po umístění na dietu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal-Wallisovým testem (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA). Další dvě hodnocení byla zaloţena na porovnání hmotnosti obaleče jablečného v různých fázích vývoje. Po 14 dnech byly všechny housenky, které dosáhly posledního instaru (L5), rozděleny podle pohlaví, zváţeny a ponechány v páscích z vlnité lepenky na zakuklení. Kukly byly 21. den vyndány z lepenky a zváţeny (opět samice a samci zvlášť). Pomocí neparametrického testu Mann-Whitney (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA) byl nejprve hodnocen rozdíl mezi hmotností housenek resp. kukel samců a samic, který by se měl lišit (Howell, 1991). Poté byla testována hypotéza, zda se hmotnost housenek resp. kukel mezi 38
dietami neliší u samic a samců zvlášť pomocí neparametrického testu Kruskal-Wallis (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA). Pokus byl proveden ve třech nezávislých opakováních. Pro kaţdé opakování byly pouţity dva boxy s dietou. V jednom opakování bylo hodnoceno 60-70 housenek resp. kukel. 4.1.8 Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Do diet Guenn a Iv-S je během přípravy přidáván absolutní etanol, ve kterém jsou rozpuštěny látky omezující rozvoj mikroskopických hub a kvasinek, zatímco dieta Premix etanol neobsahuje. Součástí experimentu bylo připravit diety Guenn a Iv-S standardním postupem, avšak jeden box s připravenou dietou Guenn a Iv-S uzavřít víkem jiţ po zchladnutí za 1,5 h. Pro potřeby biologických testů byly boxy s dietou ponechány nezakryté do druhého dne (minimálně 16 h). Druhý den byly na diety připravené standardně i se zkrácenou dobou větrání umístěny čerstvě vylíhlé housenky. Jako kontrola slouţila dieta Premix neobsahující etanol. Experiment byl vyhodnocen po 10 dnech, kdy se většina housenek chovných za stálé teploty 26 °C nachází v L4 nebo L5 (Steineke a kol., 2002).
4.2 Výsledky 4.2.1 Mortalita na dietách obsahujících CpGV Závislost mortality housenek na koncentraci CpGV v různých dietách 7 a 14 dní po umístění housenek na dietu byla graficky znázorněna (obrázek 4.2). Ve všech dietách se výrazně projevil trend zvyšující se mortality s koncentrací CpGV v dietě a s počtem dnů od umístění housenek na dietu. Porovnáním LC50 stanovených po 7 a 14 dnech bylo zjištěno, ţe se LC50 sníţila u jednotlivých diet: 5,8 krát (Guenn), 4 krát (Iv-S) a 5,6 krát (Premix). Variabilita mortality mezi jednotlivými opakováními byla nejniţší u diety Premix (graf na obrázku 4.2 C) a nejvyšší na dietě Iv-S (graf na obrázku 4.2 B). Mortalita v kontrolách byla u všech sledovaných diet nízká do 2,5 % po sedmi dnech a do 3,5 % po čtrnácti dnech. Střední letální koncentrace CpGV a jejich 95% konfidenční limity na různých dietách po sedmi a čtrnácti dnech uvádí tabulka 4.1. Na základě porovnání 95% konfidenčních limitů bylo zjištěno, ţe se mortalita housenek na dietě Premix po sedmi i čtrnácti dnech statisticky významně lišila od mortality na dietách Guenn a Iv-S. Diety Guenn a Iv-S se nelišily. LC50 na dietě Premix byla po sedmi dnech 2,6 krát vyšší v případě porovnání s Iv-S a 1,8 krát vyšší při porovnání s Guenn. Po čtrnácti dnech se rozdíl sníţil a LC50 byla 1,9 krát vyšší
39
při porovnání s Guenn i Iv-S. Sklon křivek se po 7 a 14 dnech biologického testu statisticky významně nelišil.
Obrázek 4.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV zamíchaného do diety A) Guenn, B) Iv-S a C) Premix. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech nezávislých opakování testu.
40
7 dní druh diety
počet housenek v testu (n)
Guenn Iv-S Premix
599 606 605
LC50 95% konf. limity (OB/ml x103) (OB/ml x103) 1,807 1,248 3,236
1,487 – 2,174 a 1,013 – 1,512 a 2,685 – 3,892 b
χ2
sklon
95% konf. limity
167,62 156,38 220,50
1,85 1,77 1,69
1,57 – 2,13 a 1,50 – 2,05 a 1,46 – 1,91 a
69,89 73,77 109,49
1,83 1,64 1,86
1,40 – 2,26 a 1,27 – 2,02 a 1,51 – 2,20 a
14 dní Guenn Iv-S Premix
599 606 605
0,311 0,310 0,581
0,219 – 0,401 a 0,211 – 0, 411 a 0,455 – 0,714 b
Tabulka 4.1: Střední letální koncentrace CpGV na různých dietách při míchání viru do diety. Hodnoceno po 7 a 14 dnech, tři nezávislá opakování. Konfidenční limity s rozdílnými symboly indikují statisticky významný rozdíl mezi dietami v LC50 resp. sklonu křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV.
4.2.2 Mortalita na dietách povrchově ošetřených CpGV Závislost mortality housenek na koncentraci CpGV na dietách Iv-S a Premix povrchově ošetřených CpGV je graficky znázorněna na obrázku 4.3. U obou diet se projevil trend rostoucí mortality se zvyšující se koncentrací CpGV. U diety Iv-S se výrazně neprojevil trend zvyšující se mortality s počtem dnů od umístění housenek na virem ošetřenou dietu. LC50 stanovená po 7 dnech na dietě Iv-S byla jen 1,6 krát vyšší neţ po 14 dnech. LC50 zjištěná po 7 dnech na dietě Premix byla naproti tomu téměř 2,9 krát vyšší neţ po 14 dnech. V porovnání s metodou aplikace viru do diety byl rozdíl mezi LC50 stanovenými v rozmezí sedmi dnů niţší. Výsledky jednotlivých opakování se méně lišily u diety Iv-S obrázek 4.3 A. Mortalita v kontrolách byla u obou diet nízká do 1 % po sedmi dnech a do 3,5 % po čtrnácti dnech. Mortalita housenek na dietě Premix se po sedmi i čtrnácti dnech statisticky významně lišila od mortality na dietě Iv-S (tabulka 4.2). Zatímco v testu, kde byl virus míchán do diety, byly 95% konfidenční limity různých diet blízko u sebe (tabulka 4.1), při povrchové aplikaci nedošlo k přiblíţení křivek resp. jejich 95% konfidenčních limitů (tabulka 4.2). Rozpětí aplikovaných koncentrací muselo být z tohoto důvodu odlišné. Na dietu Iv-S byl virus aplikován v koncentracích 0,0208 - 6,25 OB/mm2, zatímco na premix byly aplikovány vyšší koncentrace 0,0625 - 62,5 OB/mm2. Střední letální koncentrace stanovená pro dietu Premix byla 15,1 krát (7. den) a 8,6 krát (14. den) vyšší neţ u diety Iv-S. Rozdíl mezi dietami se s délkou testu podobně jako u aplikace viru do diety sníţil, ovšem stále byl statisticky významně odlišný. Sklon křivek se po 7 a 14 dnech biologického testu statisticky významně nelišil. 41
Obrázek 4.3: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV aplikovaného na povrch diety A) Iv-S a B) Premix. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech nezávislých opakování testu.
7 dní druh diety
počet housenek v testu (n)
LC50 (OB/mm2)
95% konf. limity (OB/mm2)
χ2
sklon
95% konf. limity
Iv-S Premix
561 708
0,257 3,885
0,207 – 0,315 a 3,202 – 4,740 b
191,44 263,03
1,53 1,52
1,32 – 1,75 a 1,34 – 1,70 a
170,83 127,39
1,57 1,61
1,33 – 1,80 a 1,33 – 1,89 a
14 dní Iv-S Premix
561 708
0,157 1,351
0,126 – 0,193 a 1,070 – 1,663 b
Tabulka 4.2: Střední letální koncentrace CpGV na různých dietách při povrchové aplikaci viru na dietu. Hodnoceno po 7 a 14 dnech, tři nezávislá opakování. Konfidenční limity s rozdílnými symboly indikují statisticky významný rozdíl mezi dietami v LC 50 resp. sklonu křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV.
42
4.2.3 Vývoj obaleče jablečného na různých dietách První den po umístění housenek na povrch diety byla průměrná mortalita ze třech opakování testu na dietě Genn 2,38 % (SD=2,15), Iv-S 1,90 % (SD=2,95) a Premix 3,33 % (SD=4,58). Pomocí Kruskal-Wallisova testu na hladině významnosti α=0,05 (p=0,831) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se přirozená mortalita na různých dietách nelišila. Po sedmi dnech od umístění housenek na dietu byla mortalita vztaţena k prvnímu dni, kdy uţ mortalita nebyla ovlivněna manipulací a ţivotaschopností housenek. Na dietě Genn uhynulo v průměru 1,96 % (SD=3,56), Iv-S 0,95 % (SD=1,48) a Premix 1,46 % (SD=2,41). Přirozená mortalita se proti prvnímu hodnocení sníţila a pomocí Kruskal-Wallisova testu na hladině významnosti α=0,05 (p=0,901) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se přirozená mortalita na různých dietách nelišila. Po 14 dnech bylo provedeno zhodnocení hmotnosti housenek na jednotlivých dietách. Nejprve byla stanovena průměrná hmotnost a SD ze všech 272 samců (61,51 mg; SD=11,71) a 263 samic (80,30 mg; SD=15,40) obrázek 4.4 A. Pomocí Mann-Whitney testu na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) bylo potvrzeno, ţe se hmotnost housenek samců a samic statisticky významně liší.
Obrázek 4.4: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti samců a samic A) housenek L5 B) kukel ze všech diet. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
Poté byly housenky samců resp. samic ze všech třech opakování experimentu sloučeny. Celkem byla hodnocena hmotnost 94 samců a 90 samic pocházejících z diety Guenn, 105 samců a 93 samic z diety Iv-S a 80 samců a 73 samic z diety Premix. Porovnání průměrné hmotnosti samců a samic z jednotlivých diet je graficky znázorněno v krabicovém grafu na obrázku 4.5. Průměrná hmotnost samců a výběrová směrodatná odchylka (SD) byla u Guenn 62,64 mg (SD=11,24), Iv-S 64,03 mg (SD=10,45) a Premix 56,43 mg (SD=12,60). Průměrná hmotnost samic byla vyšší: Guenn 78,82 mg (SD=14,16), Iv-S 81,83 mg 43
(SD=14,66), Premix 80,18 mg (SD=17,49). Rozdíl mezi hmotností housenek samců resp. samic byl vyhodnocen Kruskal-Wallisovým testem. Na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) byla zamítnuta hypotéza, ţe se hmotnost samců z různých diet neliší. Hmotnost housenek samců z diety Premix se statisticky významně lišila. V případě hodnocení housenek samic byla při α=0,05 (p=0,316) potvrzena nulová hypotéza, ţe hmotnost housenek samic se v různých dietách neliší.
Obrázek 4.5: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti A) housenek samců aB) housenek samic na třech odlišných dietách. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
Po 21 dnech byla hodnocena hmotnost kukel na jednotlivých dietách. Nejprve byla stanovena průměrná hmotnost a výběrová směrodatná odchylka (SD) ze všech 252 samců (36,85 mg, SD=5,61) a 243 samic (45,10 mg; SD=5,61), u kterých došlo k úspěšnému zakuklení obrázek 4.4 B. Pomocí Mann-Whitney testu bylo na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) potvrzeno, ţe se hmotnost kukel samců a samic statisticky významně liší. Pro statistické hodnocení rozdílu mezi dietami byly sloučeny kukly samců resp. samic ze všech třech opakování experimentu dohromady. Celkem byla hodnocena hmotnost 87 samců a 82 samic pocházejících z diety Guenn, 98 samců a 90 samic z diety Iv-S a 67 samců 71 samic z diety Premix. Porovnání průměrné hmotnosti samců a samic z jednotlivých diet je graficky znázorněno v krabicovém grafu na obrázku 4.6. Průměrná hmotnost kukel samců a výběrová směrodatná odchylka (SD) byla u Guenn 37,64 mg (SD=5,29), Iv-S 37,95 mg (SD=7,39), Premix 34,23 mg (SD=6,43). Průměrná hmotnost kukel samic byla vyšší: Guenn 46,18 mg (SD=14,16), Iv-S 45,90 mg (SD=14,66), Premix 42,79 mg (SD=17,49). Rozdíl mezi hmotností kukel samců resp. samic byl vyhodnocen KruskalWallisovým testem. Na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) byla zamítnuta hypotéza, ţe se hmotnost kukel samců z různých diet neliší. Hmotnost kukel samců z diety Premix byla statisticky významně niţší. V případě hodnocení kukel samic byla při α=0,05 (p=0,001) 44
zamítnuta hypotéza, ţe hmotnost kukel samic se v různých dietách neliší. Také zde byla hmotnost samičích kukel z diety Premix niţší.
Obrázek 4.6: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti A) kukel samců a B) kukel samic na třech odlišných dietách. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
4.2.4 Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Výsledky pokusu hodnotícího vliv reziduálního etanolu na vývoj housenek obaleče jablečného ukazují grafy na obrázku 4.7. V boxech s dietou Guenn i Iv-S, které byly uzavřeny jiţ po 1,5 h převládal instar L4 nad L5. Podíl L4 a L5 v dietách Guenn a Iv-S standardně připravených se příliš nelišil od referenční diety Premix (L4 41,8 %; L5 53,7 %). Na dietě Guenn byl vývoj pomalejší (o 13,4 % L5 méně) a na dietě Iv-S rychlejší (o 8,5 % L5 více) v porovnání s dietou Premix. Zastoupení L4 a L5 housenek na dietě Guenn s reziduálním etanolem se významně lišilo od zastoupení v standardně připravené dietě (obrázek 4.7 A). Podíl L4 housenek činil 93,9 % a L5 byly zastoupeny jen 6,1 %, zatímco v standardně připravené dietě Guenn bylo 52,2 % L4 a 40,3 % L5. Rozdíl v zastoupení instarů L4 a L5 byl odlišný také na dietě Iv-S s reziduálním etanolem a standardní přípravou (obrázek 4.7 B), ovšem nebyl tak výrazný jako v případě diety Guenn. Na dietě Iv-S s reziduálním etanolem činilo zastoupení housenek L4 53,1 % a L5 37,5 %. V standardně připravené dietě Iv-S převaţoval počet L5 nad L4 (L4 33,3 %; L5 62,3 %). Podíl housenek niţších instarů (L2, L3) nebyl významný ani na dietách připravovaných standardně, ani s reziduálním etanolem a pohyboval se od 0 do 7 %.
45
Obrázek 4.7: Zastoupení jednotlivých instarů po 10 dnech vývoje na dietách Guenn a Iv-S při dodrţení standardní přípravy diety a při nedostatečném odpaření etanolu z uvařené diety. A) porovnání rychlosti vývoje na dietě Guenn, Premix-referenční dieta.; B) porovnání rychlosti vývoje na dietě Iv-S, Premixreferenční dieta.
4.3 Diskuze Cílem tohoto experimentu bylo porovnat vliv diety na mortalitu housenek při pouţití dvou zákadních metod aplikace viru (Hunter-Fujita a kol., 1998) a vybrat vhodnou metodu aplikace CpGV a sloţení diety pro testování citlivosti přírodních populací obaleče jablečného k CpGV (5 Cíl II). V prvním biologickém testu byl CpGV zamíchán do diety a byl porovnáván vliv třech diet na mortalitu housenek. Stanovené LC50 ani sklon křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV se na dietách Guenn a Iv-S statisticky významně nelišily v ţádném z termínů hodnocení. Mezi dietami Guenn resp. Iv-S a Premix byly nalezeny statisticky průkazné rozdíly LC50 v obou termínech hodnocení, sklon křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV se statisticky nelišil. Horní mez 95% konfidenčního limitu LC50 stanovená pro dietu Premix se nacházela v těsné blízkosti dolních mezí 95% konfidenčních 46
limitů diety Guenn po 7 dnech hodnocení a obou diet po 14 dnech hodnocení (tabulka 4.1). Při aplikaci viru do diety bylo moţné porovnat výsledky všech třech diet, přestoţe mortalita housenek na dietě Premix byla niţší. Diety Guenn a Iv-S se připravují vařením a osahují směs pšeničných klíčků, kukuřičné polenty a kvasnic v odlišném poměru. Součástí diet je také agar, který dietám dává pevnou konzistenci. Housenky se na těchto dietách zaţírají aţ po několika dnech a obvykle začínají ţír v rozích komůrek. Proti tomu je dieta Premix připravovaná za studena a bez agaru měkká, nemá hladký rovný povrch a housenky se obvykle do druhého dne zaţírají dovnitř diety v různých místech komůrky (obrázek 4.8). Dietu Premix je moţné rychle připravit a okamţitě pouţít, coţ je velmi příznivá vlastnost při práci s polními populacemi obaleče jablečného.
Obrázek 4.8: Konzistence diety Premix (vlevo) a Iv-S (vpravo) se liší. Povrch diety Premix umoţňuje okamţité vsáknutí vody, zatímco povrch Iv-S diety je hladký, pevný a voda se musí z povrchu odpařit. Housenky se na dietě premix vţírají do druhého dne na různých místech (výřez vlevo), zatímco housenky na dietě Iv-S zůstávají několik dní na povrchu a obvykle začínají ţír v rozích a u stěn komůrek.
Metodu aplikace viru do diety pouţívali také Fritsch a kol. (2005), Asser-Kaiser a kol. (2007) či Eberle a kol. (2008). Při stejných termínech hodnocení stanovili Eberle a kol. (2008) střední letální koncentraci k CpGV-M na dietě Iv-S pro housenky laboratorního kmene CpS 1,9x103 OB/ml (7 dní) a 0,145x103 OB/ml (14 dní), Asser-Kaiser (2010) uvádí ve své disertační práci LC50 1,425x103 OB/ml (7 dní) a 0,501x103 OB/ml (14 dní). Tyto výsledky korespondují s našimi výsledky zjištěnými pro dietu Guenn a Iv-S. LC50 stanovená AsserKaiser (2010) po 14 dnech dokonce koresponduje i s údaji zjištěnými pro dietu Premix (LC50=0,581x103 OB/ml). 47
Biologické testy druhého experimentu porovnávaly mortalitu housenek při aplikaci CpGV na povrch diety. Dieta Iv-S byla vybrána jako zástupce diety s agarem, pruhou testovanou dietou byl Premix. Předpokládali jsme, ţe odlišné vlastnosti diet (obrázek 4.8) povedou k rozdílnějším LC50 neţ u rovnoměrného zamíchání viru do diety. Suspenze CpGV aplikovaná na povrch diety Iv-S zůstávala pouze na povrchu, zatímco při aplikaci na povrch diety Premix se suspenze okamţitě vsákla a tak částice mohly proniknout i hlouběji do diety. Naše výsledky potvrdily hypotézu, ţe má při této metodě pouţitá dieta vliv na mortalitu housenek. Střední letální koncentrace stanovená pro dietu Premix byla 15,1 krát (7. den) a 8,6 krát (14. den) vyšší neţ u diety Iv-S a 95% konfidenční limity LC50 na těchto dietách byly od sebe vzdáleny (tabulka 4.2). Sklon křivek mortality se na dietách Iv-S a Premix nelišil v ţádném z termínů hodnocení, a přestoţe byl niţší neţ při aplikaci viru do diety, nebyly mezi sklony křivek mortality stanovenými pro obě metody nalezeny průkazné rozdíly. Porovnatelnost LC50 při pouţití těchto dvou diet a metody aplikace CpGV na povrch diety nebyla moţná. Povrchovou aplikaci CpGV pouţívali v biologických testech například Berling a kol. (2009), Lacey a kol. (2005) a Lacey a kol (2008). Všichni hodnotili mortalitu sedmý den, ovšem pouţívali různé diety a uváděli odlišné hodnoty LC50. Lacey a kol. (2005) ve své práci nezmiňují druh diety, který pouţili, ale dietu popsali tak, ţe měla pevný povrch, který byl před aplikací housenek vysušen. V pozdější práci Lacey a kol. (2008) uvádí, ţe v pokusu pouţili umělou dietu vyrobenou firmou Southland Products Incorporated (Lake Village, AR), která se prodává jiţ připravená a před pokusem se pouze rozvaří. Tato dieta stejně jako Iv-S obsahuje agar. Berling a kol. (2009) pouţili dietu od firmy Stonefly Industries, TX, tedy dietu „Premix―. Mortalita v pokusech Lacey a kol. (2005) po 7 dnech (LC50=0,06 OB/mm2) je 4,3 krát niţší neţ mortalita v našich pokusech na dietě Iv-S, avšak pozdější práce Lacey a kol. (2008) uvádí LC50 po 7 dnech 0,236 OB/mm2, coţ plně koresponduje s našimi výsledky stanovenými pro dietu Iv-S (LC50=0,257 OB/mm2). Lacey a kol. nepouţívali pro biologický test purifikovaný izolát viru CpGV-M, ale jeho formulovanou podobu preparát Cyd-X (Certis, USA), a tak lze odlišné výsledky vysvětlit tím, ţe se různé šarţe biopreparátů mohou ve své účinnosti lišit (Lacey a kol, 2008; Stará, 2002). Výsledky Berling a kol. (2009) bylo třeba pro porovnání s našimi výsledky nejprve přepočítat na společné jednotky, protoţe autoři aplikovali na povrch diety koncentrační řadu viru 0,643 – 156,2 OB/mm2, ale LC50 neuvádějí v jednotkách OB/mm2, ale OB/μl. Tabulka 4.3 představuje přepočet mezi jednotkami OB/mm2 a OB/μl. V další tabulce 4.4 jsou 48
porovnány LC50 a LC90 našeho experimentu s pokusem Berling a kol. (2009). Náš experiment byl porovnán pouze s výsledky citlivého kmene obaleče jablečného (Sv) k CpGV-M původem z Francie po 7 dnech v letech 2007 a 2008 (Berling a kol., 2009).
Termín hodnocení mortality (dny)
Údaje známé z publikace Berling a kol. (2009) 7
Údaje podle podmínek našich testů 7
Objem diety v jedné komůrce (µl)
200
1000
6
30
28 4,666* 0,643 – 156,2 3 – 729
144 4,8* 0,0625 – 208 0,3 – 998
Objem aplikované suspenze CpGV (µl) Obsah povrchu komůrky (mm2) Faktor* Aplikovaný rozsah OB/mm2 Aplikovaný rozsah OB/µl
Tabulka 4.3: *faktor nebyl v publikaci uveden, ale byl vypočítán jako podíl obsahu povrchu komůrky a objemu aplikované suspenze.
Hodnoceno 7. den
Naše testy
Rok testování Označení kmene obaleče jablečného Počet housenek v testu (n) LC50 (OB/µl) 95 CL%(OB/µl) LC90 (OB/µl) 95 CL% (OB/µl) Sklon
2009
2007
2008
CpS
Sv
Sv
708
771
593
18,65 15,37 – 22,75 130,12 96,89 – 188,185 1,52
24,00 14,10 – 35,86 275,45 176,83 – 512,48 1,21
29,22 13,87 – 49,27 377,37 231,96 – 725,56 1,15
Berling a kol. (2009) Berling a kol. (2009)
Tabulka 4.4: Porovnání výsledků povrchové aplikace CpGV-M na dietu Premix s výsledky Berling a kol. (2009).
Přepočítaná LC50 z našeho testu spadá do 95% konfidenčních limitů stanovených Berling a kol. (2009) v letech 2007 i 2008 tabulka 4.4. V případě LC90 se 95% konfidenční limity vzájemně překrývají jen s rokem 2007, protoţe sklon křivek byl v našem biolgickém testu výrazně strmější neţ uvádí Berling a kol. (2009) pro rok 2008. Závěrem experimentu s povrchovou aplikací CpGV je, ţe nelze porovnávat výsledky z diet, které mají odlišné povrchy. Povrch diet s agarem nepropouští vodu, a tak částice zůstávají na povrchu podobně jako je tomu při aplikaci v přírodě (Lacey a kol., 2002). Proto byla v kapitole 6 III pro testování účinnosti biopreparátů na bázi různých izolátů CpGV zvolena dieta Iv-S na kterou byly preparáty aplikovány povrchově. Pro testování účinnosti čistých izolátů CpGV byla pouţívána metoda míchání viru do diety, a to buď s dietou Premix 49
(5 Cíl II) nebo dietou Iv-S (6 Cíl III), aby bylo moţné porovnat naše data s výsledky Fritsch a kol. (2005) a Eberle (2010). Součástí porovnávání diet byl i experiment sledující vývoj obaleče jablečného. Hodnocením přirozené mortality 1. a 7. den po umístění housenek na dietu bylo zjištěno, ţe druh diety tuto mortalitu neovlivňuje. Další dvě hodnocení porovnávala hmotnost housenek L5 (po 14 dnech) a hmotnost kukel (po 21 dnech). Hmotnost samců a samic housenek resp. kukel se statisticky významě lišila, coţ potvrzuje také (Howell, 1991). Dále se statisticky lišila hmotnost samců housenek a obou pohlaví kukel na dietě Premix. Vţdy byla niţší neţ na dietách Guenn a Iv-S. Při přípravě diet Iv-S a Guenn jsou přidávány konzervační látky, které zabraňují růstu mikroorganismů. Tyto látky jsou rozpuštěny v absolutním etanolu a jsou přidávány do diet krátce po uvaření (přílohy A.2, A.3). Přestoţe se etanol v horké dietě rychle odpařuje, byl porovnán vývoj obaleče na dietách, které byly po přípravě ponechány v otevřených boxech po dobu minimálně 16 hodin (standardní doba pro biologické testy) a dietách v boxech, které byly uzavřeny víkem ihned po vychladnutí (1,5 h). Vývoj byl hodnocen na základě zastoupení L4 a L5 instarů housenek po 10 dnech od umístění housenek na dietu a bylo zjištěno, ţe zbytkový etanol měl zásadní vliv na rychlost vývoje. V případě diety Guenn byl rozdíl vývoje housenek v boxech s dietou uzavřených po 1,5 hodině a po cca 16 hodinách větší neţ u diety Iv-S, protoţe při přípravě diety Guenn se přidávají dvě komponenty rozpuštěné v etanolu (metylparaben, kyselina benzoová), zatímco do Iv-S jen metylparaben (příloha A.2, A.3). Termín pro hodnocení vývoje byl stanoven na dobu, kdy se nejvíce housenek nachází ve 4. nebo 5. instaru, který lze velmi snadno rozeznat. Steineke a kol. (2002) sledovali vývoj housenek
obaleče
jablečného
v laboratorních
podmínkách
při
různých
teplotách
(15 °C – 32 °C). Hodnotili, za kolik dní dosáhne 50 % housenek dalšího instaru a u L5 při teplotě 26 °C uvádí, ţe 50 % housenek dosáhne tohoto instaru 11. den. Vývoj při 26 °C zároveň vyhodnotili jako nejrychlejší. Naše experimenty byly také prováděny při této teplotě a hodnoceny po 10 dnech, respektive jedenáctý den počítáme-li den umístění housenek na dietu. Pokud byla dieta připravena standardně, naše výsledky korespondovaly s daty uváděnými Steineke a kol. (2002). Na dietě Guenn bylo v průměru 40,3 % jedinců instaru L5, 62,3 % jedinců L5 na dietě Iv-S a 53,7 % jedinců L5 na dietě Premix. Dieta Premix byla pouţita jako referenční, protoţe se do ní etanol nepřidával. V boxech s dietou uzavřených po krátké době převaţoval instar L4 (Guenn: 6,1 % L5; Iv-S 37,5 % L5). Niţší podíl L5 na dietě Guenn proti dietě Iv-S by mohl být vysvětlen dvojnásobným objemem etanolu, který je do diety přidáván. 50
5
Cíl II: Biologické testy citlivosti obaleče jablečného k CpGV
5.1 Metodika 5.1.1 Zdroje obaleče jablečného 5.1.1.1 Laboratorní chovy obaleče jablečného Laboratorní chov obaleče jablečného (krymský kmen), dále „CpKrym― je udrţován ve VÚRV od roku 1997. Celý vývojový cyklus obaleče probíhá v klimatizované místnosti při teplotě 25±1°C a umělém osvětlení (fotoperioda 16L:8D h). Housenky jsou chovány ve skupinách (15-20 jedinců) na umělé dietě v jednorázových plastových miskách s perforovaným víčkem. Sloţení diety a její příprava jsou popsány v příloze A.1. Za 25-30 dní se ze zakuklených housenek líhnou motýli. Motýli jsou pravidelně odchytáváni z misek za pomoci skleněné trubičky a poté přeneseni do chovné klícky, kde dochází k páření a kladení vajíček. V klícce je umístěna trubička s buničinou nasáklou medovým roztokem, který prodluţuje ţivot dospělců aţ o několik dní (převzato od A. Alešové, ÚOCHB AV ČR). Strop klícky kryje voskovaný papír, na který kladou samičky vajíčka. Kaţdý druhý den se papír s čerstvě nakladenými vajíčky dezinfikuje roztokem formaldehydu (3,5 %), opláchne se vodou a po oschnutí je inkubován se při teplotě 25±1°C na navlhčeném filtračním papíru v uzavřené plastové krabici. Chov kmene CpS (více podkapitola 4.1.1) slouţil jako referenční senzitivní skupina pro hodnocení citlivosti CpKrym a biologických testů citlivosti polních populací obaleče jablečného k CpGV. 5.1.1.2 Přírodní populace obaleče jablečného Populace obaleče jablečného byly sbírány v přírodě (jabloňové sady, aleje) několikrát za sezónu (červenec – listopad). Housenky, popřípadě kukly, byly vybírány z pásů z vlnité lepenky, která byla obtočena hladkou stranou ven kolem kmene jabloní a zajištěna drátem (obrázek 5.1). Housenky byly umístěny do plastových krabiček s perforovaným víčkem, ve kterých si zalezly do připravených ruliček z vlnité lepenky. Housenky a kukly sebrané z pásů lepenky do začátku srpna byly nejprve uloţeny do klimatizovaného boxu s nastavenou teplotou 26 °C a fotoperiodou 16L:8D h. Některé z housenek první generace se zakuklily a daly vzniknout 2. generaci, u které byla hodnocena citlivost k viru. Nezakuklené housenky 1. generace a housenky z pozdějších sběrů vstupují do diapauzy, proto byly umístěny do klimatizovaného boxu s teplotou 10 °C na jeden aţ dva týdny a poté byla teplota sníţena minimálně na tři měsíce na 6 °C. Počátkem jara byla teplota opět zvyšována (týden při teplotě 10 °C, dva týdny při teplotě 16 °C a poté 20 °C. Při této konečné teplotě se líhnuli motýli. 51
Čerstvě vylíhnutí dospělci byli pravidelně odchytáváni a přenášeni do chovných klícek umístěných do klimatizovaného skleníku s přirozeným osvětelním. Kolem klícek byly rozmístěny nádoby s vodou pro zajištění vyšší relativní vlhkosti vzduchu a čerstvé větvičky a nezralá jablka pro podpoření páření a ovipozice dle Witzgall a kol. (2005). Metodika odchovu populací obaleče jablečného z přírody byla převzata z JKI, Darmstadt a publikace Fritsch a kol. (2005). Chovné klícky měly boční stěny z vinuté obvazové gázy, na kterou samičky nekladou vajíčka (osobní sdělení dr. J. Huber, Darmstadt, Německo). Strop klícky byl tvořen hladkým materiálem (parafilm nebo potravinová fólie), na který samičky mohou klást vajíčka. Příprava vajíček pro biologické testy byla obdobná jako u laboratorního kmene CpKrym, pouze vzhledem k menším snůškám vajíček byly snůšky nejprve uloţeny v chladničce (maximálně po dobu jednoho týdne) a poté inkubovány současně z více sběrů, aby bylo připraveno dostatečné mnoţství housenek pro zaloţení biologického testu. Vajíčka byla inkubována v plastových kelímcích s navlhčeným filtračním papírem v klimatizovaném boxu při teplotě 26 °C. Do pěti dnů se začaly líhnout housenky, které byly pouţity pro biologické testy citlivosti přírodních populací k CpGV.
Obrázek 5.1: A) pás z vlnité lepenky pro odchyt housenek L5 resp. kukel. B) Detail čerstvě odtrţeného pásu, kde byla housenka v zámotku připravená ke kuklení nebo přezimování.
5.1.2 Zdroj CpGV Mexický izolát CpGV-M (EU Standard) laskavě zapůjčil dr. J. A. Jehle (DLR Rheinpfalz, Německo). Podrobnosti ke kvantifikaci izolátu viz podkapitola 4.1.3. Izolát byl vţdy kvantifikován na začátku sezóny a poté bylo několik mikrolitrů z ředění 1:10 zamraţeno a pouţíváno po celou sezónu k přípravě biologických testů.
52
5.1.3 Testování citlivosti obaleče jablečného k CpGV Pro biologické testy byla vţdy pouţita F1 generace odchovaná v laboratoři. Buďto pocházeli oba rodičové z přírody, nebo byl z přírody pouze samec, který byl pářen se samicí laboratorního kmene CpKrym. Metodika biologických testů se v závislosti na získaných poznatcích lišila mezi lety 2008 a následnými dvěma lety 2009 a 2010. V roce 2008 byly populace testovány k různým koncentracím viru, zatímco v letech 2009 a 2010 byla k testování citlivosti přírodní populace pouţita jedna diagnostická koncentrace 3x105 OB/ml, která do 7 dnů usmrtí všechny citlivé jedince laboratorního kmene CpKrym. Výjimkou byla pouze populace VBII, která byla v roce 2010 testována také k různým koncentracím viru. Původ a označení všech populací testovaných v letech 2008-2010 je uveden v tabulce 5.1. V tabulce 5.2 jsou uvedeny pouţité koncentrace viru a počet testovaných jedinců. Pro biologické testy byla pouţita dieta Premix, kterou lze snadno a rychle připravit i v malém mnoţství. CpGV byl míchán do diety v průběhu přípravy (viz podkapitola 4.1.4). Laboratorní chov obaleče (CpKrym) byl testován se sedmi koncentracemi CpGV (3x102, 103, 3x103, 104, 3x104, 105, 3x105 OB/ml) ve třech nezávislých opakováních. Metoda pro hodnocení biologických testů 7. a 14. den po infekci je popsána v podkapitole 4.1.6. 5.1.4 Statistické vyhodnocení Citlivost CpKrym byla vyhodnocena za pomoci probitové analýzy (XLSTAT, 2010). Mortalita byla při vyhodnocování testů přepočtena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925). Biologický test byl proveden ve třech nezávislých opakováních. Výsledkem probitové analýzy bylo stanovení středních letálních koncentrací (LC50) s 95% konfidenčními limity (pásy spolehlivosti) 7. a 14. den testu. Mortalita housenek polních populací vystavených různým koncentracím viru byla 7. a 14. den testu porovnána s mortalitou CpKrym a CpS. Housenky populací vystavené jediné koncentraci CpGV (3x105 OB/ml) byly povaţovány za citlivé, pokud do 7 dnů uhynuly. Housenky, které přeţily 7. den, byly povaţovány za rezistentní. Mortalita byla upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925) a u jednotlivých populací bylo vyhodnoceno zastoupení rezistentních a citlivých jedinců (%) po 7 a 14 dnech testu. Mortalita housenek pocházejících z jednotlivých snůšek vajíček od různých skupin obalečů populace VBII a z hybridního kříţení VBII♂xCpKrym♀ byla v letech 2009 i 2010 hodnocena statisticky neparametrickým testem Mann-Whitney test (XLSTAT, 2010), který 53
porovnal průměrnou mortalitu populací VBII a VBII♂xCpKrym♀ v jednotlivých letech. Poté byly porovnány výsledky mezi lety 2009 a 2010.
Kód F1 generace*
Původ a ošetřování
Bulhary (B)
B08
Jiţní Morava n. a.
Drahoraz (D)
D10
Severovýchodní Čechy i. p.
Praha Ruzyně „Vrátnice― (PI)
PI08
Střední Čechy
PI09
n. a.
Populace (zkratka)
PI10 Praha Ruzyně „Experimentální sad― (PII)
PII09
Střední Čechy
PII09♂xCpKrym♀
o. p.+CpGV**
PII10 PII10♂xCpKrym♀ Slaný (S)
S10
Střední Čechy i. p.
Tuchoraz (T)
T10
Střední Čechy i. p.
Velké Bílovice „Studánky― (VBI)
VBI08
Jiţní Morava i. p.
Velké Bílovice „Špičáky― (VBII)
VBII08♂xCpKrym♀
Jiţní Morava
VBII09
i. p.+CpGV**
VBII09♂xCpKrym♀ VBII10 VBII10♂xCpKrym♀ Vinice u Třebnouševsi (V)
V09
Severovýchodní Čechy o. p.+CpGV**
Tabulka 5.1: Přehled populací, u kterých byla testována citlivost k CpGV -M v letech 2008-2010. *kód F1 generace je sloţen z místa sběru rodičovské populace a roku testování; **CpGV pouţíván experimentálně; n. a.=neošetřovaná alej; i. p.= integrovaná produkce; o. p.=organická produkce.
54
Kód F1 generace*
Počet testovaných jedinců**
Koncentrace (OB/ml)
B08
79
103, 3x103, 104, 3x104
D10
37
3x105
PI08
67
103, 3x103, 104, 3x104
PI09
92
3x105
PI10
72
3x105
PII09
103
3x105
PII09♂xCpKrym♀
39
3x105
PII10
91
3x105
PII10♂xCpKrym♀
188
3x105
S10
26
3x105
T10
26
3x105
V09
18
3x105
VBI08
30
104, 3x104
VBII08♂xCpKrym♀
181
103, 3x103, 104, 3x104
VBII09
550
3x105
VBII09♂xCpKrym♀
489
3x105
VBII10
212
3x105
VBII10
72
103, 3x103, 104, 3x104
VBII10♂xCpKrym♀
431
3x105
Tabulka 5.2: Přehled testovaných F1 generací přírodních populací. *kód F1 generace je sloţen z místa sběru rodičovské populace a roku testování. **počet jedinců po odstranění uhynulých v den umístění housenek na dietu.
5.1.5 Původ populací testovaných v roce 2008 Pro testování citlivosti F1 generace přírodních populací obaleče jablečného byly sbírány od července do listopadu 2007 přezimující housenky rodičovské generace. Sběr probíhal na jedné lokalitě ve středních Čechách: Praha Ruzyně „u vrátnice― (PI) a na dvou místech jiţní Moravy u obce Bulhary (B) a ve Velkých Bílovicích „Studánky― (VBI). Vzorky populace PI a B pocházely z jabloní rostoucích v neošetřované aleji, avšak alej v Praze Ruzyni se nachází ve vzdálenosti asi 400 m od experimentálního sadu několik let ošetřovaného biopreparátem na bázi CpGV (Carpovirusine; Arysta Lifescience, Francie). Vzorek populace VBI pocházel z jabloňového sadu se systémem integrované ochrany nedaleko Velkých Bílovic, kde byla část plochy ošetřována CpGV (Madex; Andermatt Biocontrol, Švýcarsko), a to přibliţně 500 m od místa sběru housenek. V roce 2008 byly v sadu ve Velkých Bílovicích z plochy zvané „Špičáky―(VBII) sbírány housenky první generace přímo z jablek. Tato plocha či její okolí bylo po dobu delší neţ 10 let 55
experimentálně ošetřovano CpGV. Nedorostlé housenky z jablek byly dokrmeny na dietě Premix a ponechány ke kuklení. Vylíhlo se několik samců, kteří byli pářeni se samičkami CpKrym a jejich potomstvo (VBII08♂xCpKrym♀) bylo následně testováno. Ostatní housenky, které vstoupily do diapauzy, byly přidány ke sběrům z podzimu 2008. 5.1.6 Původ populací testovaných v roce 2009-2010 Sběr přezimujících housenek rodičovské generace z pásů vlnité lepenky probíhal v roce 2008 a 2009 na dvou místech ve středních Čechách: Praha Ruzyně-neošetřovaná alej (PI) a Praha Ruzyně-experimentální sad v organickém reţimu pěstování a několikaletou aplikací CpGV (PII). V roce 2009 byly ve středních Čechách sbírány housenky ještě na lokalitách Slaný (S) a Tuchoraz (T). Tyto sady patří do systému integrované ochrany. V letech 2008 a 2009 byly na jiţní Moravě sbírány housenky z části CpGV ošetřovaného sadu ve Velkých Bílovicích „Špičáky― (VBII). V severovýchodních Čechách byly housenky sbírány v roce 2008 v sadu s organickou produkcí ovoce, kde byl 4 roky experimentálně pouţíván CpGV (Vinice u Třebnouševsi-V) a v roce 2009 ze sadu se systémem integrované ochrany v Drahorazi (D).
5.2 Výsledky 5.2.1 Citlivost laboratorního kmene CpKrym k CpGV V grafu na obrázku 5.2 je uvedena závislost mortality housenek CpKrym na CpGV ze třech nezávislých opakování biologického testu. Mortalita v kontrolách byla po sedmi dnech 1,1 % a po čtrnácti dnech 2,1 %. Mortalita se v čase významně zvýšila. LC50 se mezi hodnocením po sedmi a čtrnácti dnech 13,7 krát sníţila, coţ bylo přibliţně dvakrát více neţ v případě výsledků mortality CpS na dietě premix (5,6 krát). Mortalita housenek CpKrym se po sedmi dnech statisticky významně lišila od mortality CpS hodnocené biologickým testem v podkapitole 4.2.1 (obrázek 5.3). Po čtrnácti dnech byla mortalita stále statisticky významně odlišná, avšak 95% konfidenční limity CpS se jiţ dotýkaly limitů CpKrym. Sklony křivek CpS a CpKrym byly paralení. Střední letální koncentrace CpKrym stanovené po sedmi a čtrnácti dnech jsou uvedeny v tabulce 5.3.
CpKrym 7 dní 14 dní
počet housenek v testu (n) 677
LC50 (OB/ml x103)
95% konf. limity (OB/ml x103)
χ2
sklon
95% konf. limity
12,152
10,014 – 14,616
164,54
1,85
1,57 – 2,13
0,890
0,723 – 1,070
125,76
2,00
1,65 – 2,34
Tabulka 5.3: Střední letální koncentrace (LC50) laboratorního kmene CpKrym 7 a 14 dní po inokulaci virem (tři nezávislá opakování).
56
Obrázek 5.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek CpKrym na koncentraci CpGV. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích ve třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech opakování testu.
Obrázek 5.3: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV. Porovnání výsledků biologického testu CpKrym s výsledky CpS (dieta Premix). Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech opakování testu.
57
5.2.2 Citlivost polních populací obaleče jablečného k CpGV 5.2.2.1 Biologický test s koncentrační řadou viru Na kontrolních dietách bez viru byla v hodnocených termínech mortalita přírodních populací 0 %. Mortalita přírodních populací obaleče jablečného v závislosti na koncentraci CpGV byla vynesena v bodech do grafu mortality CpKrym, protoţe citlivost přírodních populací nebylo moţné z důvodu malého souboru testovaných jedinců vyhodnotit za pomoci probitové analýzy s uvedením LC50. Jednotlivé body vyjadřující mortalitu přírodních populací PI08, B08, VBI08 leţely v blízkosti modelové křivky i 95% konfidenčních limitů stanovených pro laboratorní kmeny CpKrym a CpS v obou termínech hodnocení (obrázek 5.4).
Obrázek 5.4: Logitová regrese citlivosti přírodních populací obaleče jablečného k CpGV-M v porovnání s laboratorními kmeny CpKrym a CpS. Hodnoceno 7. a 14. den po infekci.
58
Při hodnocení vzorku potomstva samců populace VBII kříţených s laboratorními samicemi v roce 2008 (VBII08♂xCpKrym♀) a čisté přírodní populace 2010 (VBII10) po sedmi dnech byly body do koncentrace 104 OB/ml (log c=4) poměrně blízko křivky CpKrym nebo CpS (obrázek 5.4 A), ovšem po 14 dnech uţ byly všechny body vzorku F1 generace kříţenců VBII08♂xCpKrym♀ hodnocené v létě roku 2008 zcela vzdáleny 95% pásům spolehlivosti obou citlivých laboratorních kmenů (obrázek 5.4 B). Mortalita v nejvyšší testované koncentraci 3x104 OB/ml (log c=4,477) nepřesáhla ani 17 % a v ostatních koncentracích se pohybovala od 16,7-36,4 %. V potomstvu populace VBII10 se vyskytovalo více citlivých jedinců, a to především v nejniţší testované koncentraci 103 OB/ml (log c=3), kde mortalita dosáhla 85 %. V ostatních koncentracích se mortalita pohybovala od 50 do 60 %. 5.2.2.2 Biologické testy s jednou diagnostickou koncentrací viru V roce 2009 byl testován vzorek čtyř přírodních populací (PI09, PII09, V09, VBII09). U dvou z těchto populací byli navíc někteří samci rodičovské generace kříţeni s laboratorními samicemi a citlivost jejich potomstva (PII09♂xCpKrym♀, VBII09♂xCpKrym♀) k viru byla také testována za pouţití jedné diagnostické koncentrace. Počet jedinců, kteří byli testováni, je uveden v tabulce 5.2. Mortalita v kontrolách byla po 7 dnech do 5,5 % a po 14 dnech se u některých populací zvýšila na 10 %, protoţe došlo k neočekávanému výskytu houby s rychlým růstem (Aspergillus sp.) v dietě. Všichni testovaní jedinci PI09, PII09, PII09♂xCpKrym♀
a
V09
uhynuli
do
7
dnů,
avšak
v populacích
VBII09
a VBII09♂xCpKrym♀ se celkově vyskytovalo 123 jedinců (23,6 %) a 102 jedinců (20,9 %), kteří v této vysoké koncentraci přeţili a nejevili známky infekce granulózou (obrázek 5.5 A). Po 14 dnech se počet jedinců, kteří přeţili, sníţil u VBII na 62 jedinců (12,5 %) a u VBII09♂xCpKrym♀ na 61 jedinců (14,3 %) (obrázek 5.5 B).
59
Obrázek 5.5: Grafické znázornění celkového podílu citlivých a rezistentních jedinců u hodnocených populací. A) po 7 dnech B) po 14 dnech v roce 2009. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925).
Podobně jako kolísal počet rezistentních a citlivých jedinců testovaných k různým koncentracím v roce 2008 (obrázek 5.4), i zde se v jednotlivých skupinách obalečů vyskytovaly různé poměry citlivých a rezistencích jedinců, a proto se také mortalita z odlišných snůšek vajíček lišila a pohybovala se od 45,5 % do 95,6 % (BVII09) a od 61,5 % do 100 % (VBII09♂xCpKrym♀) po sedmi dnech (obrázek 5.6 A) a od 75,6 % do 100 % (BVII09) a od 65,4 % do 100 % (VBII09♂xCpKrym♀) po čtrnácti dnech (obrázek 5.6 B).
60
Obrázek 5.6: Přehled mortality u potomstva VBII09 a VBII09♂xCpKrym♀ z různých snůšek vajíček v roce 2009. A) po 7 dnech; B) po 14 dnech při koncentraci 3x105 OB/ml. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925).
V roce 2010 byl testován vzorek šesti přírodních populací (D10, PI10, PII10, S10, T10, VBII10). U dvou z těchto populací byli opět někteří samci rodičovské generace kříţeni s laboratorními
samicemi
a
citlivost
jejich
potomstva
(PII10♂xCpKrym♀,
VBII10♂xCpKrym♀) k viru byla také testována za pouţití jedné diagnostické koncentrace. Počet jedinců, kteří byli testováni, je uveden v tabulce 5.2. Mortalita v kontrolách byla po 7 dnech i 14 dnech do 5,6 %. Výskyt houby Aspergillus sp. v dietě byl proti roku 2009 minimální. Všichni testovaní jedinci D10, PI10, PII10, S10, T10 a PII10♂xCpKrym♀ uhynuli do 7 dnů, avšak v populacích VBII10 a VBII10♂xCpKrym♀ se opět vyskytovali jedinci se sníţenou citlivostí k viru. Celkově se v populaci VBII10 vyskytovalo 74 jedinců (34,9 %) a v populaci VBII10♂xCpKrym♀ 123 jedinců (28,5 %), kteří v této vysoké koncentraci přeţili a nejevili známky infekce granulózou (obrázek 5.7 A). Po 14 dnech se počet jedinců, kteří
přeţili,
sníţil
u
VBII na
43
jedinců
(20,3 %)
a
73
jedinců
(16,9 %)
u VBII10♂xCpKrym♀ (obrázek 5.7 B). 61
Obrázek 5.7: Grafické znázornění celkového podílu rezistentních jedinců u hodnocených populací po A) 7 dnech B) 14 dnech v roce 2010. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925).
V roce 2010 byli obaleči VBII10 chováni ve více klíckách (I-X) a kříţenci, kteří vznikli pářením VBII10♂xCpKrym♀, pocházeli buďto z jednotlivých párů (pár I-II) nebo ze skupin (skupina I-II) (obrázek 5.8). Mortalita z odlišných snůšek vajíček se opět lišila. Nejniţší mortalita byla sedmý den pozorována u skupin VBII10 pocházejících z klícek II (23,8 %), VI (22,2 %) a IX (33,3 %) a u VBII10♂xCpKrym♀ skupiny II (39,9 %). Stoprocentní mortalita byla zjištěna u potomstva z klícek I, IV, VIII a páru I VBII10♂xCpKrym♀ (obrázek 5.8 A). Po čtrnácti dnech mortalita vzrostla, ale stále byla nejniţší u skupin VBII10 pocházejících z klícek II (57,1 %), VI (55,6 %) a IX (53,3 %) a u VBII10♂xCpKrym♀ skupiny II (63,3 %). Mortalita 100 % byla zjištěna navíc pouze u VBII (skupina X) (obrázek 5.8 B).
62
Obrázek 5.8: Přehled mortality u potomstva VBII10 z různých snůšek vajíček nakladených skupinami obalečů z odlišných klícek (I-X) a VBII10♂xCpKrym♀ z různých snůšek vajíček pocházejících od dvou párů a dvou skupin v roce 2010. A) po 7 dnech; B) po 14 dnech při koncentraci 3x105 OB/ml. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925).
5.2.3 Statistické porovnání mortality VBII a kříţenců VBII♂xCpKrym♀ Mortalita potomstva různých skupin obalečů kolísala jak při testování přírodní populace VBII, tak kříţenců VBII♂xCpKrym♀. Pomocí neparametrického testu (MannWhitney test) byla porovna mortalita potomstva z jednotlivých snůšek VBII s mortalitou kříţenců VBII♂xCpKrym♀ v letech 2009 a 2010. V roce 2009 byla porovnávána mortalita potomstva z devíti různých snůšek VBII09 s šesti snůškami kříţenců VBII09♂xCpKrym♀. Průměrná mortalita po 7 a 14 dnech byla porovnána v krabicovém grafu (obrázek 5.9). Po sedmi dnech dosáhla průměrná mortalita 72 % (VBII09) a 80,9 % (VBII09♂xCpKrym♀). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,328) nebyla zamítnuta hypotéza, ţe se průměry neliší. Ani po 14 dnech se průměry 86,75 %
63
(VBII09) a 87,27 % (VBII09♂xCpKrym♀) na hladině významnosti α=0,05 (p=0,774) statisticky významně nelišly.
Obrázek 5.9: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry populace VBII09 a kříţenců VBII09♂xCpKrym♀. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
V následujícím roce 2010 byla porovnávána mortalita potomstva z deseti různých snůšek VBII10 se čtyřmi snůškami kříţenců VBII10♂xCpKrym♀. Průměrná mortalita po 7 a 14 dnech byla porovnána v krabicovém grafu (obrázek 5.10). Po sedmi dnech dosáhla průměrná mortalita 65,26 % (VBII10) a 74,08 % (VBII10♂xCpKrym♀). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,605) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se průměry neliší.
Obrázek 5.10: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry populace VBII10 a kříţenců VBII10♂xCpKrym♀. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
Také po 14 dnech se průměry 80,73 % (VBII10) a 85,96 % (VBII10♂xCpKrym♀) na hladině významnosti α=0,05 (p=0,723) statisticky významně nelišly.
64
Protoţe se průměry mezi populací VBII a kříţenci VBII♂xCpKrym♀ v letech 2009 a 2010 nelišily, byla data obou skupin sloučena a byl porovnán rozdíl mezi lety 2009 a 2010 po 7 a 14 dnech. Průměrná mortalita potomstva byla stanovena z 15 různých snůšek vajíček v roce 2009 a 14 snůšek vajíček v roce 2010. Průměrná mortalita byla po 7 dnech 75,59 % (2009) a 67,79 % (2010). Pomocí neparametrického testu (Mann-Whitney test) byla na hladině významnosti α=0,05 (p=0,651) potvrzena hypotéza, ţe se průměry mezi lety neliší. Průměrná mortalita byla po 14 dnech 86,96 % (2009) a 82,22 % (2010). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,687) se průměry mezi lety 2009 a 2010 nelišily.
Obrázek 5.11: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry mortality mezi lety 2009 a 2010 ze sloučených dat populací VBII a kříţenců VBII♂xCpKrym♀. + aritmetický průměr; — medián; ┴ minimum; ┬ maximum; □ 25 % a 75 % kvartil; • minimální/maximální hodnota.
5.3 Diskuze Aby mohla být hodnocena citlivost přírodních populací k CpGV-M, byla nejprve stanovena probitovou analýzou citlivost laboratorního kmene CpKrym. Střední letální koncentrace byla po sedmi dnech 3,76 krát vyšší, neţ LC50 stanovená pro citlivý kmen CpS v Německu. Po 14 dnech se rozdíl sníţil a LC50 CpKrym byla jen 1,53 krát vyšší. Niţší mortalita chovu CpKrym můţe vypovídat o odlišné citlivosti housenek k CpGV v porovnání s výsledky CpS chovu, ovšem výsledky po 14 dnech jiţ byly velmi blízké. Není snadné porovnávat výsledky z různých laboratoří, protoţe na výsledky biologického testu má vliv celá řada faktorů. Kvantifikace částic můţe být ovlivněna objektivně (druh světelného mikroskopu), ale také subjektivně (kdo částice počítá, jak dlouho vzorek před počítáním míchá na vortexu apod.). Dále mohouu mít vliv na výsledky rozdílné podmínky v klimatizovaném boxu, kde kaţdý °C můţe ovlivnit délku vývoje housenek a také střední letální čas (LT50) viru se s různou teplotou liší (Steineke, 2004). Také v jedné laboratoři můţe mít stejný kmen odlišnou citlivost v různých letech. Autoři Fritsch a kol. (2006) stanovili 65
LC50 laboratorního kmene po 14 dnech v jednom roce 3,41x102 OB/ml a následující rok 8,77x102 OB/ml. Pro biologické testy s přírodními populacemi, kde byla pouţita koncentrační řada viru, měla význam především data získaná po 14 dnech, protoţe po sedmi dnech byla mortalita k viru citlivých jedinců v koncentracích do 104 OB/ml nízká podobně jako u jedinců se sníţenou citlivostí k CpGV. Teprve po čtrnácti dnech se mortalita citlivých jedinců zvýšila. 100 % mortality dosáhly housenky v koncentracích 104 OB/ml a 3x104 OB/ml, zatímco populace tvořené z části housenkami se sníţenou citlivostí k viru přeţívaly i při koncentraci 3x104 OB/ml. U výsledků biologického testu kříţenců VBII♂08xCpKrym♀ a populace VBII testovaných v letech 2008 a 2010 ke koncentrační řadě viru nebyla vysoká korelace mezi mortalitou a koncentrací viru, zatímco u citlivých populací a laboratorních kmenů byla tato korelace vysoká. U kříţenců VBII♂08xCpKrym♀ a populace VBII10 byl významnějším faktorem poměr citlivých a rezistentních jedinců v testované skupině, neţ koncentrace, které byli jedinci vystaveni. Fritsch a kol. (2005) a Fritsch a kol. (2006) testovali prvně populace obaleče
jablečného,
u
kterých
zcela
selhala
ochrana
preparáty
na
bázi
CpGV-M. V jejich případě byly populace natolik rezistentní, ţe při koncentraci 10 7 OB/ml mortalita těchto populací po šesti dnech nepřesáhla 20 %. Po 14 dnech stanovili pro tyto populace LC50 pohybující se od 8x104 do 3x105 OB/ml, tedy zhruba 1000 krát vyšší neţ u citlivého laboratorního kmene. Testovali také jednu populaci z konvenčního sadu, kde byl CpGV pouţíván jen jako doplňující prostředek a zde našli podobně jako v našem případě vysoce nehomogenní skupinu, u které stanovili po 14 dnech LC50 2x103 OB/ml, ovšem sklon proloţené křivky byl velice nízký (0,53). V našem případě nebylo dostatečné mnoţství housenek na testování vyšších koncentrací a z dat získaných z koncentrací 103-3x104 OB/ml nebylo moţné LC50 stanovit. Sklon proloţené křivky u kříţenců VBII♂08xCpKrym♀ byl 0,094 a u populace VBII10 dokonce záporný (-0,370). Z důvodu malého mnoţství potomstva přírodních populací byla pro následující roky zvolena metoda hodnocení citlivosti housenek jen k jedné diagnostické koncentraci viru (3x105 OB/ml). Při této koncentraci uhynuly všechny housenky citlivého kmene CpKrym do 7 dnů a bylo pak snadné rozeznat rezistentní a citlivé jedince jiţ při prvním hodnocení. Asser-Kaiser a kol. (2007) pouţívali niţší diskriminační dávku 5,8x104 OB/ml pro rozpoznání citlivých a rezistentních jedinců po 7 dnech. Tato koncentrace usmrtila po 7 dnech 95-98 % housenek CpS, ovšem testy byly prováděny na dietě Iv-S, kde byla zjištěna vyšší mortalita (4 Cíl I). Eberle a kol. (2008) hodnotili v průběhu 14 dní mortalitu všech instarů housenek CpS a CpR (nehomogenně rezistentní populace) při koncentraci 2x105 OB/ml izolátů CpGV66
M a CpGV-I12. Tato koncentrace CpGV-M usmrtila v průběhu 14 dní více neţ 99 % housenek CpS všech instarů a housenky přenesené na dietu v instaru L1 uhynuly do 7 dnů. Mortalita CpR při pouţití CpGV-M dosahovala po 6 dnech 25 % a po 14 dnech 51,4 %. Vycházíme-li tedy z toho, ţe citliví jedinci uhynuli do 7 dnů, potom rezistentních jedinců v populaci CpR bylo kolem 75 %, avšak dalších téměř 25 % housenek uhynulo do 14 dnů, přestoţe se jednalo o rezistentní jedince. Také námi zvolená diagnostická dávka 3x105 OB/ml usmrtila
po
14
dnech
i
některé
rezistentní
jedince
populace
VBII
respektive
VBII♂xCpKrym♀. Rozdíl mezi mortalitou 7. a 14. den činil v roce 2009 11,1 % a v roce 2010 14,6 %. Mortalitu rezistentních jedinců lze vysvětlit tím, ţe se v izolátu CpGV-M vyskytují ve velmi nízké koncentraci také částice viru, které dokáţou usmrtit rezistentní housenky. Vzhledem k nízké dávce těchto účinných částic, které housenky v průběhu vývoje mohly přijmout, uhynuly tyto housenky aţ ve 4. či 5. instaru, avšak měly typické příznaky granulózy a také detekce viru pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) potvrdila přítomnost viru. Mortalitu rezistentních housenek ve vysokých koncentracích CpGV-M pozorovali jiţ v roce 2006 v laboratořích Andermatt Biocontrol AG a pasáţováním izolátu CpGV-M přes rezistentní housenky získali izolát, ze kterého formulovali nový biopreparát Madex Plus (Zingg a Kessler, 2007; Jehle a Schmitt, 2009). Přestoţe na dietě s diagnosticku koncentrací viru 3x105 OB/ml přeţili do 14 dnů samci i samice, zakuklilo se jen několik samic kříţenců VBII♂xCpKrym♀ a některé samice VBII vstoupily do diapauzy. Ostatní samice a všichni samci uhynuli ve stádiu housenky. Ve vzorku populace z části sadu ve Velkých Bílovicích (VBII), kde byl preparát po více neţ deset let pouţíván, bylo nalezeno v roce 2009 23,6 % a v roce 2010 34,9 % rezistentních jedinců v potomstvu samců a samic této populace. Z těchto hodnot zjištěných po 7 dnech lze předpokládat, ţe se v současné době v populaci VBII vyskytuje od 20 % do 30 % rezistentních jedinců. Sníţení podílu rezistentních jedinců po 14 dnech na 12,5 % (2009) a 20,3 % (2010) bylo částečně ovlivněno příměsí částic viru, který dokáţe usmrtit rezistentní jedince. Mortalitu stanovenou po čtrnácti dnech můţeme porovnat s výsledky Schmitt a kol. (2008), kteří hodnotili podíl citlivých a rezistentních jedinců u populací pocházejících z 23 evropských sadů. Do hodnocení zahrnuli koncentrace 104 aţ 106 OB/ml, kdy uţ jsou po čtrnácti dnech všechny k viru citlivé housenky usmrceny. Podíl rezistentních jedinců se u 14 poulací pohyboval od 30 % do 90 %, u šesti populací se vyskytovali pouze citliví jedinci a u třech populací byl podíl rezistentních jedinců do 20 %. V této studii byla hodnocena také kříţová rezistence k několika běţným účinným látkám insekticidů, která však nebyla potvrzena. 67
V roce 2010 byly také dva samci VBII jednotlivě pářeni s citlivými samicemi z chovu. Podle studie Asser-Kaiser (2010) tak mohly vzniknout páry: A) ZSW x ZSZS, kdy je mortalita potomstva 100 %; B) ZSW x ZRZR, potomstvo je rezistentní nebo C) ZSW x ZSZR, kdy 50 % potomstva je rezistentní. Mortalita potomstva prvního páru byla 100 %, coţ odpovídá případu A) a mortalita druhého páru byla po 7 dnech 68,8 % a po 14 dnech 87,5 %. Tato mortalita by měla odpovídat případu C), ovšem v našich testech byla mortalita v obou termínech hodnocení vyšší neţ 50 %. Proto bylo dalším cílem práce ověřit, zda je rezistence zaloţena na pohlavním chromozomu Z, jak uvádí Asser-Kaiser a kol. (2007) viz 6 Cíl III. Porovnáním průměrných mortalit čisté populace VBII a kříţenců samců VBII s laboratorními samicemi v letech 2009 a 2010 nebyl nalezen statisticky průkazný rozdíl mezi průměry (Mann-Whitney test). Průměrná mortalita se nelišila ani mezi roky 2009 a 2010.
68
6
Cíl III: Účinnost nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného
6.1 Metodika 6.1.1 Zaloţení rezistentního kmene obaleče jablečného Homogenně rezistentní kmen obaleče jablečného (CpR-CZ) byl zaloţen z populace VBII09, která byla opakovaně kříţena s laboratorním kmenem CpKrym. Rezistentní jedinci byli získáni selekcí na dietě obsahující 3x103 OB/ml nebo 3x105 OB/ml. Odchov i selekce rezistentních jedinců probíhala v klimatizovaném boxu při 26 °C a fotoperiodě 16L:8D h po dobu deseti generací. Housenky byly chovány na dietě Premix, ke kuklení housenek byly pouţity pásky z vlnité lepenky a dospělci byli chováni po skupinách v plastových krabicích vyloţených gázou. Samice kladly vajíčka na voskovaný papír umístěný pod víčkem krabice. 6.1.2 Ověření zaloţení rezistence CpR-CZ k CpGV-M K ověření zaloţení rezistence CpR-CZ byla pouţita metodika podle Asser-Kaiser (2010). Jednotlivě byli kříţeni obaleči CpS (genotypy ZSZS, ZSW) s obaleči CpR-CZ (předpokládané genotypy ZRZR, ZRW). Celkem byly vytvořeny tři páry ZSZS x ZRW a tři páry ZRZR x ZSW. Pohlaví jedinců bylo rozlišeno ve stádiu kukly podle počtu abdominálních segmentů (obrázek 2.6 B). Jednotlivé páry byly chovány v jednorázových plastových kelímcích, na jejichţ povrch kladly samice vajíčka. Potomstvo těchto párů bylo umístěno na kontrolní dietu bez viru a dietu obsahující diskriminační koncentraci izolátu CpGV-M (2009). Byla pouţita stejná dieta (Ivaldi-Sender, 1974) i koncentrace viru (5,8x104 OB/ml), kterou ve svých experimentech pouţívala Asser-Kaiser (2010). Pokus byl vyhodnocen po 7 dnech stanovením mortality F1 housenek. Mortalita byla opravena dle mortality v kontrole (Abbott, 1925). Po 14 dnech bylo stanoveno zastoupení samců (%) v jednotlivých variantách. 6.1.3 Zdroj obaleče jablečného Selektovaný rezistentní kmen CpR-CZ, u kterého byla testována citlivost k různým izolátům CpGV. Kontrolně byla testována také účinnost izolátů k citlivým housenkám laboratorních kmenů CpS a CpKrym. 6.1.4 Zdroj CpGV 6.1.4.1 Izolát CpGV-M Mexický izolát CpGV-M (EU standard) byl vyuţíván jiţ při biologických testech (5 Cíl II) a slouţil k selekci rezistentního kmene škůdce. Izolát CpGV-M (2009) byl pouţit
69
v roce 2010 jako kontrola homogenity chovu rezistentního kmene CpR-CZ při biologických testech s novými izoláty CpGV. 6.1.4.2 Izoláty CpGV účinné proti rezistentním populacím Proti CpR-CZ byly testovány čtyři izoláty CpGV (CpGV-E2, -I08, -I12, -S), u kterých byla prokázána vysoká účinnost proti k viru rezistentním kmenům CpR a CpRR1 (Eberle, 2010), a dále izolát V015 purifikovaný z nově vyvíjeného přípravku označeného ABC
V015
(Andermatt
Biocontrol
AG,
Švýcarsko).
Izoláty
byly
purifikovány
v DLR Rheinpfalz nebo JKI Darmstadt (Německo) a před vlastním pokusem kvantifikovány viz podkapitola 4.1.3. 6.1.4.3 Formulované přípravky Preparát Madex Plus na bázi pasáţovaného izolátu CpGV-M a nově vyvíjený preparát ABC V015 na bázi izolátu CpGV-V015 laskavě poskytnula firma Andermatt Biocontrol AG (Švýcarsko). Přípravky obsahovaly 3x1010 OB/ml. 6.1.5 Biologický test účinnosti nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného Pro vyhodnocení účinnosti různých purifikovaných izolátů byla pouţita diskriminační koncentrace 5,8x104 OB/ml, kterou pouţívali Asser-Kaiser a kol. (2007) a Asser-Kaiser (2010) pro rozlišení citlivých a rezistentních jedinců nehomogenně rezistentní populace CpR. Tato koncentrace usmrtila 95-98 % citlivých jedinců laboratorního kmene CpS. Testování citlivosti CpR-CZ bylo provedeno v JKI (Darmstadt) za pouţití diety připravené podle IvaldiSender (1974). Pro testování účinnosti formulovaných preparátů byla pouţita metoda aplikace viru na povrch diety podle Ivaldi-Sender (1974) s jednou diskriminační koncentrací viru. Testování bylo provedeno v JKI (Darmstadt). Zvolená koncentrace 6,25 OB/mm2 odpovídala LC95 aţ LC99 po 7 dnech u housenek kmene CpS v pokusu s povrchovou aplikací CpGV-M (podkapitola 4.2.2). Experimenty hodnotící citlivost CpR-CZ k purifikovaným izolátům i formulovaným preparátům byly provedeny nejméně ve třech nezávislých opakováních a součástí testu byla i kontrolní dieta bez viru. K CpGV-M citlivé kmeny CpS a CpKrym byly testovány v jednom (izoláty) nebo ve třech (přípravky) nezávislých opakováních. Mortalita housenek byla hodnocena po 7 a 14 dnech. Korekce mortality byla provedena podle mortality v kontrolách (Abbott, 1925). Účinnost izolátů byla stanovena na základě porovnání průměrných mortalit
70
housenek a jejich směrodatných odchylek (SD) získaných ze všech opakování biologického testu. Účinnost izolátu V015 byla navíc testována biologickým testem o šesti koncentracích (3x102 - 105 OB/ml) zamíchaných do diety připravené podle Ivaldi-Sender (1974) a účinnost přípravků Madex Plus a ABC V015 byla stanovena biologickým testem o šesti koncentracích (0,0208 – 6,2500 OB/mm2) aplikovaných na povrch diety připravené dle Ivaldi-Sender (1974). Biologický test byl vyhodnocen probitovou analýzou 7. a 14. den (podkapitola 4.1.6).
6.2 Výsledky 6.2.1 Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného Biologický test (5 Cíl II) přeţili do 14 dnů samci i samice, avšak úspěšně dokončilo vývoj pouze několik samic F1 generace populace VBII09 a kříţenců VBII♂09xCpKrym♀. Samice F1 generace VBII09 vstoupily do diapauzy, a tak byl chov rezistentního kmene zaloţen ze samic F1 generace VBII♂09xCpKrym♀, které se zakuklily a vylíhli se z nich dospělci. Tyto samice byly pářeny se samci kříţenců z kontrolní diety bez viru nebo se samci CpKrym. Potomstvo kontrol VBII vstoupilo do diapauzy. F2 generace nově vznikajícího chovu CpR-CZ byla selektována při niţší koncentraci viru 3x103 OB/ml, aby mohli dokončit vývoj heterozygotní samci (ZSZR). Rezistentní samci a samice generací F3 a F4 byli také selektováni převáţně při niţší koncentraci 3x103 OB/ml. U dalších generací probíhala selekce především při koncentraci 3x105 OB/ml, aby se selektoval homogenně rezistentní kmen (ZRW, ZRZR). Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného probíhala rok, protoţe v průběhu selekce docházelo v některých generacích k nečekaně vysokým úhynům housenek posledního instaru, a to především v zimním období. Housenky se vyvíjely normálně, ale zakuklilo se jich jen několik a samice motýlů kladly málo, nebo ţádná vajíčka. Homogenně rezistentní kmen CpR-CZ byl získán aţ v druhé polovině roku 2010. 6.2.2 Ověření zaloţení rezistence u CpR-CZ Všechny tři páry tvořené homogenně rezistentním samcem a citlivou samicí R R
(Z Z x ZSW) nakladly dostatek oplozených vajíček. Mortalita housenek F1 umístěných na dietu s diskriminační koncentrací viru (5,8x104 OB/ml) byla sedmý den ve dvou případech 0 % a jednou 2,63 % (tabulka 6.1). Ze třech párů sloţených z citlivého samce a rezistentní samice (ZSZS x ZRW) nakladl dostatek oplozených vajíček pouze jeden pár. Od druhého páru se z několika oplozených vajíček vylíhlo 8 jedinců a u třetího páru samice nekladla. Sedmý den byla mortalita potomstva prvního páru 51,16 % a druhého 25 % (tabulka 6.1). Po čtrnácti 71
dnech se zastoupení samců v potomstvu párů ZRZR x ZSW pohybovalo od 46,51 %do 48,28 % a tvořilo tak přibliţně polovinu všech ţivých jedinců, zatímco v potomstvu párů ZSZS x ZRW přeţili pouze samci (tabulka 6.1).
Předpokládané genotypy rodičů
Počet Předpokládané testovaných potomstvo jedinců F1 (F1) (n)
CpR-CZ♂ x CpS♀ ZRZR x ZSW
ZSZR ZRW
CpS♂ x CpR-CZ♀ ZSZS x ZRW
ZSZR ZSW
47 38 35 43 8 -
7 dní Předpokádaná / skutečná mortalita (%)* 0 / 0,00 0 / 2,63 0 / 0,00 50 / 51,16 50 / 25,00 -
14 dní Předpokádané / skutečné zastoupení samců (%) 50 / 46,51 50 / 47,22 50 / 48,28 100 / 100 100 / 100
Tabulka 6.1: Mortalita (po 7 dnech) a zastoupení samců (po 14 dnech) v potomstvu pocházejícím od jednotlivých párů sloţených z kmenů CpS a CpR-CZ při diskriminační koncentraci CpGV-M (5,8x104 OB/ml). *Mortalita opravena dle mortality v kontrole (Abbott, 1924).
6.2.3 Purifikované izoláty Účinnost všech nových izolátů hodnocených po sedmi dnech byla vysoká, zatímco CpGV-M byl se stanovenou mortalitou 0,83 % zcela neúčinný (obrázek 6.1). Nejvyšší průměrná mortalita housenek CpR-CZ byla zjištěna při pouţití izolátů CpGV-E2 (97,4 %) a CpGV-I12 (99,6 %). Účinnost izolátů CpGV-I08, -S a -V015 byla v jednotlivých opakováních vysoce variabilní. U izolátů CpGV-S a -V015 byla vysoká směrodatná odchylka (SD) způsobena jedním z opakování, při kterém byla mortalita housenek velmi nízká 41,9 % (CpGV-S) a 69,8 % (CpGV-V015), zatímco v ostatních opakováních mortalita dosahovala 100 %. Izolát CpGV-I08 byl méně účinný ve všech opakováních a mortalita housenek se pohybovala od 36,7 % do 91,2 %. Proti housenkám CpS byly vysoce účinné všechny izoláty včetně CpGV-M (obrázek 6.1). Mortalita byla stanovena v jednom opakování a dosahovala 97 % - 100 %. Po 14 dnech testu byla nízká průměrná mortalita CpR-CZ zaznamenána pouze na dietě obsahující CpGV-M (10,83 %). Ostatní izoláty usmrtily do 14 dnů všechny housenky.
72
4
průměrná mortalita 7d (5,8x10 OB/ml) 120 110 100
mortalita (%)
90 80
CpGV-E2
70
CpGV-I08
60
CpGV-I12 CpGV-S
50
CpGV-V015
40
CpGV-M
30 20
I 177 102 201 196 105 77
33
33
31
33
32
30
SD
n
10 0 CpR-CZ
-10
CpS
Obrázek 6.1: Porovnání průměrné mortality housenek CpR-CZ a CpS při pouţití různých izolátů CpGV zamíchaných do diety v diskriminační koncentraci 5,8x 104 OB/ml. SD=výběrová směrodatná odchylka, n=počet testovaných jedinců. Mortalita upravena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925)
Účinnost izolátu V015 proti CpR-CZ byla vyhodnocena také probitovou analýzou (obrázek 6.2). Střední letální koncentrace byla po 7 dnech jen 3 krát vyšší neţ LC50 stanovená pro kmen CpS infikovaný CpGV-M (tabulka 4.1). Po 14 dnech se tento rozdíl sníţil a LC50 byla vyšší jen 1,8 krát (tabulka 6.2).
mortalita
V015: CpR-CZ 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
1
2
3
4
5
6
Log (OB/ml) 7 dní 14 dní
Lower bound (95%) Model
Upper bound (95%)
Obrázek 6.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek CpR-CZ na koncentraci CpGV-V015. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích biologického testu.
73
CpR-CZ počet housenek V015 v testu (n) 7 dní 256 14 dní
LC50 (OB/ml x103) 3,753 0,553
95% konf. limity (OB/ml x103) 2,536 – 5,513 0,343 – 0,788
χ2
Sklon
75,75 37,77
1,32 1,75
95% konf. limity 1,02 – 1,61 1,19 – 2,31
Tabulka 6.2: Střední letální koncentrace (LC50) CpR-CZ 7 a 14 dní po inokulaci CpGV-V015.
6.2.4 Formulované přípravky Účinnost formulovaných CpGV produktů byla ověřena ve třech nezávislých opakováních na rezistentním chovu CpR-CZ a citlivém chovu CpKrym. Účinnost všech třech přípravků byla proti housenkám CpKrym vysoká a motralita po 7 dnech dosahovala 88-100 % (obrázek 6.3 A).
Obrázek 6.3: Porovnání průměrné mortality housenek CpR-CZ a CpKrym při pouţití třech preparátů na bázi CpGV aplikovaných povrchově v diskriminační koncentraci 6,25 OB/mm2. SD=výběrová směrodatná odchylka, n=počet testovaných jedinců. Mortalita upravena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925).
Proti CpR-CZ nejlépe účinkoval nově testovaný přípravek ABC V015, který do sedmi dnů usmrtil 86-96,9 % housenek. Přípravek Madex Plus na bázi CpGV-M pasáţovaného přes rezistentní populaci způsobil mortalitu u 57,9-82,3 % housenek CpR-CZ, zatímco původní 74
produkt Madex nebyl účinný (obrázek 6.3 A). Po 14 dnech se účinnost preparátů Madex Plus a ABC V015 proti CpR-CZ jiţ významně nelišila a průměrná mortalita přesahovala 90 %. Průměrná mortalita housenek CpR-CZ na dietě ošetřené klasickým přípravkem Madex byla 5 % (obrázek 6.3 B). Účinnost přípravků Madex plus a ABC V015 byla následně hodnocena biologickým testem (obrázek 6.4). Porovnáním LC50 byl přípravek ABC V016 (0,364 OB/mm2) po 7 dnech účinnější neţ Madex Plus (1,500 OB/mm2) a 95% konfidenční limity se nepřekrývaly. Sklon křivek se nelišil (obrázek 6.4, tabulka 6.3). Porovnáním LC50 bylo zjištěno, ţe se účinnost přípravku ABC V015 proti CpR-CZ (tabulka 6.3) v obou termínech hodnocení nelišila od účinnosti CpGV-M proti CpS (tabulka 4.2). Účinnost přípravku Madex Plus byla po 7 dnech biologického testu niţší, avšak po 14 dnech se LC50 obou přípravků přiblíţily a 95% konfidenční limity se překrývaly nejen mezi sebou, ale také s LC 50 stanovenou pro CpGV-M proti CpS.
Obrázek 6.4: Logitová regrese závislosti mortality housenek CpR-CZ na koncentraci pouţitých preparátů na bázi CpGV. Mortalita hodnocena A) 7 dní B) 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích biologického testu.
75
CpR-CZ Přípravek
počet housenek v testu (n)
Madex Plus ABC V015
7 dní 95% konf. 2 LC50 (OB/mm ) limity (OB/mm2)
χ2
sklon
95% konf. limity
190
1,500
0,999 – 2,233 a
31,22
1,56
1,01 – 2,10 a
188
0,364
0,222 – 0,529 b
32,50
1,65
1,09 – 2,22 a
14 dní Madex Plus ABC V015
190
0,075
0,024 – 0,151 a
27,32
0,71
0,45 – 0,98 a
188
0,112
0,059 – 0,185 a
44,38
1,00
0,71 – 1,30 a
Tabulka 6.3: Střední letální koncentrace přípravků na bázi CpGV při aplikaci na povrch diety. Hodnoceno po 7 a 14 dnech, tři nezávislá opakování. Konfidenčí limity s rozdílnými symboly indikují statisticky významný rozdíl mezi LC50 a sklony křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV.
6.3 Diskuze Protoţe vývoj na dietě s diagnostickou koncentrací CpGV (3x105 OB/ml) dokončily pouze housenky samic F1 generace populace VBII09 a housenky samic kříţenců VBII♂09xCpKrym♀ (5 Cíl II), vycházelo se při zakládání chovu homogenně rezistentního kmene z toho, ţe se rezistence dědí přes pohlavní chromozom Z, jak uvádí Asser-Kaiser a kol. (2007). Samičí housenky F1 generace VBII09 vstoupily do diapauzy nebo uhynuly a tak byl rezistentní kmen CpR-CZ zaloţen z housenek samic F1 generace VBII♂09xCpKrym♀, které se zakuklily a vylíhli se z nich dospělci. Berling a kol. (2009) zaloţili z částečně rezistentní populace St-A chov rezistentního kmene RGv, který následně opakovaně kříţili s citlivým kmenem Sv a selektovali CpGV, aby se RGv geneticky přiblíţil kmenu Sv. V našem případě bylo kříţení populace VBII s kmenem CpKrym dáno nutností odstranit diapauzu a zvýšit plodnost samic. Zaloţení rezistence CpR-CZ bylo ověřeno za pomoci kříţení jednotlivých párů sloţených z rezistentního samce či samice (CpR-CZ) spářeného s citlivým protějškem (CpS). Potomstvo rezistentního samce mělo po 7 dnech vţdy velmi nízkou mortalitu (0-2,63 %) a do čtrnácti dnů byl poměr pohlaví u ţivých jedinců vyrovnaný (46,51-48,28 % housenek samců). Motralita potomstva rezistentní samice byla po 7 dnech u jednoho páru 51,16 % a u druhého 25 %. Potomstvo druhého páru bylo tvořeno jen osmi jedinci, coţ je pro biologický test nedostatečný počet. Po čtrnácti dnech byly v dietě nalezeny jen housenky samců a to u potomstva obou párů tvořených rezistentní samicí a citlivým samcem. Naše výsledky tak odpovídají hypotéze, ţe je rezistence děděna jedním genem rezistence přes pohlavní chromozom Z jak uvádí Asser-Kaiser (2010). 76
Po ověření zaloţení rezistence CpR-CZ k CpGV-M byla hodnocena citlivost tohoto kmene k novým izolátům CpGV. V našich testech patřily k nejvirulentnějším izolátům CpGV-E2 a -I12. Průměrná mortalita housenek CpR-CZ při pouţití těchto izolátů v diskriminační koncentraci 5,8x104 OB/ml byla po 7 dnech 97,4 % (CpGV-E2) a 99,6 % (CpGV-I12). Eberle (2010) hodnotila účinnost izolátů probitovou analýzou a stanovené LC50 po 7 dnech byly 1,27x104 OB/ml (I12 proti CpR) a 1,89x103 OB/ml (E2 proti CpRR1). Účinnost izolátu CpGV-I12 proti CpR-CZ byla tedy vyšším, neţ uvádí Eberle (2010) proti CpR. Izolát CpGV-E2 byl v testech Eberle (2010) nejúspěšnějším proti homogenně rezistentním housenkám CpRR1 a jeho účinnost po 7 i 14 dnech odpovídala účinnosti CpGV-M proti CpS. Eberle (2010) uvádí, ţe tento izolát na rozdíl od izolátů CpGV-I01, -I08, -I12 či -S neobsahuje jeden genotyp, ale jedná se o směs různých genotypů a předpokládá, ţe právě tato skutečnost zvyšuje jeho účinnost proti rezistentním housenkám. Účinnost další třech izolátů CpGV-I08, -S a -V015 byla v porovnání s účinností CpGV-M také vysoká, avšak v jednotlivých opakováních variabilní. Proti CpS vykazovaly všechny testované izoláty včetně CpGV-M vysokou účinnost jiţ po sedmi dnech (mortalita 97-100 %). Účinnost CpGV-M proti CpR-CZ byla po 7 i 14 dnech nízká (mortalita do 5 % po 14 dnech). Účinnost nových izolátů CpGV proti CpR-CZ se obvykle po 7 dnech lišila a srovnala se teprve po 14 dnech hodnocení (obrázek 6.3, 6.4). Pomalejší účinnek většiny nových izolátů proti rezistentním housenkám v porovnání s účinností proti citlivým pozorovala také Eberle (2010). Přestoţe byla účinnost většiny nových izolátů proti CpR-CZ po 7 dnech niţší neţ proti CpS, jsou tyto izoláty významně účinnější neţ CpGV-M proti rezistentním housenkám a vhodné pro pouţití v sadech se selektovanými rezistentními populacemi škůdce. Jak uvádí Eberle (2010), bude nutné kvůli niţšímu a zejména o několik dní pomalejšímu účinku nových izolátů CpGV proti rezistentním populacím obaleče jablečného zapojit také další metody ochrany. Se zavedením nových izolátů do praxe nastane opět riziko selekce nových odolných populací obaleče jablečného, proto bude třeba dodrţovat řadu antirezistentních strategií doporučovaných v současné době pro aplikaci CpGV-M (Stará a kol., 2009).
77
7
Cíl IV: Detekce CpGV
7.1 Metodika 7.1.1 Metody izolace nukleové kyseliny pro detekci CpGV v hostiteli Před vlastní detekcí CpGV byly testovány dva různé způsoby izolace nukleové kyseliny (NK). Pro rutinní detekci CpGV v hostiteli byla izolována pouze genomová DNA. CpGV byl detekován polymerázovou řetězovou reakcí (polymerase chain reaction; PCR) pomocí specifických primerů zacílených do úseku genu pro granulin (gran). Pro potřeby studia vertikálního přenosu CpGV podle Burden a kol. (2002) byl připraven protokol izolace, který umoţnil současně izolovat celkovou DNA i RNA z jednoho jedince. Tímto způsobem bylo moţné detekovat nejen DNA viru, ale také mRNA transkript gran pomocí PCR s reverzní transkripcí (RT-PCR). Přítomnost transkriptu mRNA gran CpGV potvrzuje probíhající infekční cyklus, protoţe mRNA tohoto pozdního genu se vytváří aţ po replikaci viru (Burden a kol., 2002). Přehled všech pouţívaných komerčních kitů (izolace NK, PCR, RT-PCR), chemikálií a sloţení připravovaných pufrů potřebných pro elektroforézu je uvedeno v příloze B.1-4. 7.1.1.1 Izolace genomové DNA K izolaci genomové DNA hostitele byl pouţit DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Pro optimalizaci metody detekce CpGV byli pouţiti i) zdraví jedinci obaleče jablečného přímo z laboratorního chovu CpKrym; ii) jedinci CpKrym infikovaní subletální dávkou viru, která jim umoţnila dokončit vývoj iii); housenky CpKrym infikované letální dávkou viru; iv) housenky L2-L5 ze sadů. Všichni jedinci byli zamraţeni jednotlivě v 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavkách (Eppendorf AG, Hamburg) a aţ do doby izolace byli uchováváni při -20°C. U housenek všech instarů (L1-L5) byla provedena homogenizace vzorku přímo v mikrocentrifugační zkumavce pomocí plastového autoklávovaného tloučku - micropestle (Eppendorf AG, Hamburg). Homogenizace byla dokončena po přidání doporučeného mnoţství ATL pufru a proteinázy K (20 µg/µl). Kukly a motýli byli homogenizováni keramickým tloučkem v třecí misce s tekutým dusíkem a vzniklý prášek byl přenesen předmraţenou nerezovou špachtlí do nové mikrocentrifugační zkumavky s doporučeným mnoţstvím pufru ATL a proteinázy K. Při izolaci bylo postupováno podle protokolu na purifikaci celkové DNA z ţivočišné tkáně za pomoci kolonek (Purification of Total DNA from Animal Tissues. Spin-Column Protokol). Izolovaná DNA byla z kolonky uvolněna TE pufrem (200 – 400 µl), který byl také součástí kitu.
78
7.1.1.2 Izolace genomové DNA a RNA K izolaci genomové DNA a RNA hostitele byl pouţit MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE). Protokol pro izolaci NK z ţivočišných tkání byl modifikován pro potřeby izolace obou NK z jednoho jedince. Pro optimalizaci detekce byli pouţíváni i) zdraví jedinci laboratorního kmene CpS (housenky L1 a L5, kukly, motýli); ii) subletálně infikovaní jedinci CpS (housenky L5, kukly a motýli); iii) zdravé housenky L5 CpKrym, které byly povrchově kontaminovány krátkým namočením do purifikovaného izolátu CpGV-M o koncentraci 107 OB/ml; iv) letálně infikované housenky L5 CpKrym. Jedinci byli zmraţeni odděleně v mikrocentrifugačních zkumavkách při -70 ºC. Subletální infekce housenek CpS (ii) byla provedena metodou „diet plug― (Hunter-Fujita a kol., 1998). Housenky L4 (10 dní staré) byly infikovány subletální dávkou CpGV-M (50 OB v 1 μl) aplikovanou dávkovací pipetou na malý kousek diety Iv-S. Kousky diety o velikosti 2 aţ 3 mm3 byly jednotlivě umístěny do středu komůrek, kam byly poté přidány housenky. Housenky, které do 24 hodin zkonzumovaly celý kousek diety, byly povaţovány za infikované a byly přeneseny na novou dietu bez viru. Ostatní byly vyřazeny z pokusu. Po šesti dnech bylo zamraţeno několik housenek L5 bez příznaků, po dalších šesti dnech bylo zamraţeno několik ţivých kukel a později ještě několik subletálně infikovaných motýlů. Povrchově kontaminované housenky CpKrym (iii) byly před izolací rozpůleny. Z jedné poloviny byly NK izolovány okamţitě, u druhé části housenky byla provedena solubilizace okluzních tělísek pomocí 1 M Na2CO3. Po inkubaci 5 min při pokojové teplotě bylo pH vzorku upraveno na 8,0 za pomoci 1 M HCl a byly izolovány obě NK. Homogenizace L1 housenek (skupina 10 ks L1) proběhla v mikrozkumavce plastovým autoklávovaným tloučkem – micropestle. Izolace ostatních stádií byla provedena pomocí třecí misky s tloučkem v tekutém dusíku. Prášek byl přenesen předmraţenou nerezovou špachtlí do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 600 μl pufru Tissue and Cell Lysis Solution a 2 μl proteinázy K (50 μg/μl). V případě větších housenek a kukel byla do zkumavky přenesena jen část homogenizovaného prášku. Vzorek byl krátce promíchán na vortexu a inkubován 15 min při 65 ºC (v průběhu 3x promíchán na vortexu). Následně byla polovina vzorku (300 μl) odpipetována do nové 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky, aby mohly být dále izolovány obě NK samostatně. Vzorek určený pro izolaci RNA byl ponechán na ledu po dobu 3-5 min, zatímco ke vzorku pro izolaci DNA byly přidány 2 μl (5 μg/μl) RNase A, byl dobře promíchán a inkubován při 37 ºC po dobu 30-60 min a aţ poté byl 3-5 min ponechán na ledu. Následující kroky byly pro izolaci obou NK totoţné. Precipitace DNA/RNA bylo docíleno přidáním 150 μl MPC Protein Precipitation Reagentu k lyzovanému 79
vzorku. Vzorek byl důkadně promíchán na vortexu po dobu 10 sekund a centrifugací 10 min při ≥10 000 x g při pokojové teplotě byly sedimentovány nečistoty. Supernatant byl pomocí pipety přenesen do čisté 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a peleta nečistot vyhozena. Při znečištění supernatantu sedimentem byl centrifugační krok opakován. Poté bylo do odebraného supernatantu přidáno 500 μl isopropanolu pokojové teploty. Obsah zkumavky byl promíchán obracením zkumavky (30-40x). Centrifugací při 4 ºC 12 000 x g 10 min v mikrocentrifuze se usadila DNA/RNA peleta. Isopropanol byl odlit a opatrně odpipetován z okolí pelety. K DNA peletě byl přidán 75 % etanol (300 μl) a poťukáním na dno zkumavky byla peleta uvolněna do etanolu. Otáčením zkumavky byla peleta promyta, krátkou centrifugací (10 000 x g) usazena a následovalo druhé promytí 75 % etanolem. Po další krátké centrifugaci byl odlit etanol a peleta byla vysušena v otevřené zkumavce v digestoři. Suchá peleta byla rozpuštěna v 35 μl TE pufru. Peleta obsahující RNA a neţádoucí DNA byla rozpuštěna v 200 μl roztoku DNase I obsahujícím 5 μl RNase-Free DNase I (1 U/ml) a 195 μl 1x DNázového pufru. Inkubace vzorku probíhala při 37 ºC po dobu 60 min. Poté bylo přidáno 200 μl 2x T and C Lysis Solution a vzorek byl okamţitě vortexován po dobu pěti vteřin. Po přidání 200 μl MPC Protein Precipitation Reagent byl vzorek vortexován 10 vteřin a umístěn na led (3-5 min). Centrifugací 10 min při ≥10 000 x g při pokojové teplotě vznikla peleta nečistot vytvořená z degradované DNA. Supernatant byl za pomoci pipety přenesen do čisté 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a peleta byla vyhozena. Poté bylo do odebraného supernatantu přidáno 500 μl isopropanolu (pokojové teploty). Obsah zkumavky byl promíchán obracením zkumavky (30-40x). Centrifugací při 4 ºC 12 000 x g 10 min v mikrocentrifuze se usadila peleta tvořená RNA. Isopropanol byl odlit a opatrně odpipetován z okolí pelety. K RNA peletě byl přidán 75 % etanol (300 μl) a poťukáním na dno zkumavky byla peleta uvolněna do etanolu. Otáčením zkumavky byla peleta promyta, krátkou centrifugací (10 000 x g) usazena a následovalo druhé promytí 75 % etanolem. Po další krátké centrifugaci byl odstraněn etanol a peleta byla vysušena v otevřené zkumavce v digestoři. Vysušená RNA peleta byla rozpuštěna v závislosti na izolovaném vývojovém stádiu obaleče v 10-35 μl TE pufru a ošetřena 1 μl ScriptGuard RNase inhibitorem. Kvalita vysokomolekulární DNA a RNA izolovaných vzorků byla prověřena elektroforeticky. Z agarózy (Seakem LE Agarose, Bio Science, Rockland, ME, USA) a 1xTAE pufru byl připraven 1% agarózový gel. Na gel bylo naneseno 3-5 µl DNA izolovaných vzorků spolu s 1 µl nanášecího pufru. Elektroforetická separace probíhala 1 h 80
při konstantním napětí 60 V. Gel byl obarven v lázni TAE s ethidium bromidem (5 µg EtBr/ml) po dobu 5 - 10 min, poté 10 odbarven v 1xTAE pufru a vizualizován na fotodokumentačním zařízení (Chemi-Genius Bio Imaging System; Syngene, Cambridge, UK) v UV světle. Intenzita bandu vysokomolekulární DNA byla porovnána s intenziotou bandu 1,5 µl hmotnostního standardu (markeru) Lambda DNA/HindIII (Fermentas International Inc, Kanada). Poté byly NK uskladněny v mrazáku při teplotě -20 °C 7.1.2 Detekce CpGV 7.1.2.1 Detekce CpGV pomocí PCR Pro detekci CpGV v housenkách byly navrţeny primery (tabulka 7.1) zacílené do oblasti velmi pozdního genu pro granulin (gran), který patří mezi konzervativní geny rodu Betabaculovirus (Kundu a kol., 2003). Primery Granulin F a Granulin R amplifikují 367 bp dlouhý fragment genu gran zástupců rodu Betabaculovirus (Kundu a kol., 2008), pár primerů CpGraF a CpGraR (607 bp) byl navrţen pro detekci CpGV. Pro amplifikaci DNA fragmentů byla pouţita Taq polymeráza (TaKaRa, Japan). Do 23-24,5 µl PCR mixu (1x PCR pufr obsahující 1,5 mM MgCl2; 0,25 mM dNTP; 0,2 µM přímý primer; 0,2 µM reverzní primer; 0,75 U Taq polymeráza; bdH2O) byly přidávány 0,5-2 µl DNA. PCR reakce s oběma páry primerů probíhala v termocykléru PTC-200 (MJ Research, USA) při programu uvedeném v tabulce 7.2. Název primeru Granulin F* Granulin R* CpGraF** CpGraR**
sekvence primerů 5`-GGGATATAACAAATCTTTGCG-3` 5`-GAACCACAGGTCCATGATCTC-3` 5`-GGCTGTGTCATCGACAACC-3` 5`-GGAGGTGGTGCCAACGTAC-3`
místo v genomu (3 nt – 23 nt) (349 nt – 369 nt) (46 nt – 64 nt) (633 nt – 652 nt)
Tabulka 7.1: Primery pro detekci CpGV. *Primery univerzální pro detekci Betabakulovirů (Kundu a kol., 2008); **primery specifické pro CpGV navrţené Kundu (nepublikováno).
Teplota 94 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C 10 °C
Čas 2 min 20 s 30 s 1 min 10 min ∞
Počet cyklů 30 cyklů -
Tabulka 7.2: Podmínky pro termocyklér při pouţití primerů Granulin F+Granulin R nebo CpGraF+CpGraR.
Přítomnost amplifikovaného fragmentu DNA byla ověřena elektroforeticky separací 6 µl PCR produktu promíchaného s 1 µl nanášecího pufru v 1,5% agarózovém gelu 81
(v 1xTAE). Hmotnostní standard (marker) GeneRuler 100 bp DNA Ledder nebo GeneRuler 100 bp Plus DNA Ledder (Fermentas International Inc, Kanada) slouţil jako kontrola délky amplifikovaného produktu a na gel ho bylo nanášeno 1,5 µl. Elektroforetická separace obvykle probíhala 1 h při konstantním napětí 60 V. Gel byl následně obarven v roztoku ethidium bromidu (5 μg/ml EtBr v 1xTAE) a PCR produkty byly vizualizovány pomocí transiluminátoru. Elektroforeogramy byly zaznamenány fotodokumentačním zařízením (Chemi-Genius Bio Imaging System; Syngene, Cambridge, UK) a uloţeny v počítači. Později byl navrţen ještě přímý primer Me53 F (tabulka 7.3) pro sekvenování části genu gran CpGV, který byl zacílen do posledního 143 ORF genu me53 (příloha D.3). Společně s reverzním primerem Granulin R vytváří produkt o délce 573 bp, s reverzním primerem CpGraR je výsledný fragment dlouhý 855 bp. Pro amplifikaci DNA fragmentů byla pouţita Taq polymeráza (TaKaRa, Japan). Do 24 µl PCR mixu (1x PCR pufr obsahující 1,5 mM MgCl2; 0,25 mM dNTP; 0,2 µM přímý primer; 0,2 µM reverzní primer; 0,75 U Taq polymeráza; bdH2O) byl přidáván 1 µl DNA. U podmínek PCR byla změněna annealingová teplota na 58 °C, jinak podmínky zůstaly stejné, jako uvádí tabulka 7.2. Název primeru Me53 F
sekvence primerů 5`-CCTTCTGGACCTACTCTTACG-3`
místo v genomu (123297 nt – 123317 nt)
Tabulka 7.3: Primer Me53 F navrţený pro sekvenování části genu gran.
7.1.2.2 Detekce CpGV pomocí PCR s vnitřní kontrolou Jako vnitřní kontrolu pro vyloučení falešně negativního výsledku při detekci CpGV byla vybrána mitochondriální DNA (mtDNA) hostitele. Primery C1-J-1718 (přímý primer) a C1-N-2191
(reverzní
primer)
uvedené
v
tabulce
7.4
jsou
zacíleny
na gen pro cytochromoxidázu podjednotku I (COI) a byly převzaty z literatury (Barcenas a kol., 2005). Geny mtDNA jsou běţně pouţívány ve fylogenetických studiích, kde je studována příbuznost organismů (Simon a kol. 1994), pro rozlišení druhů (Barcenas a kol., 2005), nebo i populací jednoho druhu (Meraner a kol., 2008). Fragment COI o délce 524 bp byl nejprve detekován z různých jedinců odlišných populací obaleče jablečného, aby byly nalezeny vhodné podmínky pro PCR. Následně byla provedena optimalizace metody detekce hostitelské DNA a přítomnosti CpGV v jedné reakci tzv. duplex PCR. Pro detekci CpGV byl pouţit přímý primer CpGraF a reverzní primer Granulin R zacílené do gran. Produkt měl délku 324 bp. Pro amplifikaci DNA fragmentů byla pouţita Taq polymeráza (TaKaRa, Japan). Do 24 µl PCR mixu (1x PCR pufr obsahující 1,5 mM MgCl2; 0,25 mM dNTP; 0,2 µM přímý primer 1; 0,2 µM přímý primer 2; 0,2 µM reverzní primer 1; 0,2 µM reverzní primer2; 82
0,75 U Taq polymeráza; bdH2O) byl přidáván 1 µl DNA resp. 2 µl cDNA připravené dle podkapitoly 7.1.3. Podmínky pro PCR zůstaly stejné, jako uvádí tabulka 7.2. Název primeru C1-J-1718* C1-N-2191*
sekvence primerů 5`-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3` 5`-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3`
místo v genomu mt DNA, COI mt DNA, COI
Tabulka 7.4: Primery pro detekci obaleče jablečného, převzaty z *Barcenas a kol. (2005) zacílené do COI mitochondirální DNA.
7.1.2.3 Detekce mRNA CpGV pomocí RT-PCR Metoda polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí (RT-PCR) byla pouţita pro detekci mRNA transkriptu gran. RNA byla po izolaci kitem MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE) viz podkapitola 7.1.1.2 dodatečně ošetřena roztokem DNázy I (DNA-free Kit, Ambion) podle následujícího protokolu. Do mikrozkumavky o objemu 0,5 ml bylo pipetováno 6 µl RNA a přidány 3 µl pufru 10x DNase I, 2 µl DNase I (2 U/µl) a 19 µl bd H2O. Tato směs byla inkubována 45 min při 37 °C. Poté bylo přidáno 5 µl DNase inactivation Reagent a výsledná směs byla inkubována 2 min při pokojové teplotě. Poté byl vzorek centrifugován 2 min při 14 000 rpm, aby mohl být odpipetován supernatant (30 µl) do nové zkumavky. Supernatant obsahující přečištěnou RNA byl následně pouţíván pro RT-PCR. RT-PCR byla provedena za pomoci RT-PCR kitu (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas International Inc, Kanada). První část reakční směsi na zpětnou transkripci (objem 12 µl) byla sloţena z 3-5 µl RNA (přečištěná DNA-free Kitem), 1 µl oligo (dT)18 primeru a 6-8 µl DEPC ošetřené H2O. Tato směs byla lehce promíchána, stočena krátce na stolní centrifuze, inkubována 5 min při 65 °C a ochlazena na ledu. Poté byla přidána druhá část směsi (objem 8 µl) sloţená ze 4 µl 5x reakčního pufru, 1 µl RiboLock RNase Inhibitoru (20 U/µl), 2 µl 10 mM DTP mixu a 1 µl RevertAid H Minus M-MuLV reverzní transkriptázy (200U/µl). Vzorek byl opět opatrně promíchán a stočen krátce na centrifuze. Následovala inkubace 60 min při 42 °C zakončená 5 min při 42 °C v termocykléru. Vzniklá cDNA byla uloţena do mrazáku při -70 °C. Pro PCR (7.1.2.1, 7.1.2.2) byly pouţity 2 µl cDNA/25 µl reakce.
83
7.2 Výsledky 7.2.1 Izolace NK 7.2.1.1 Kontrola kvality izolované DNA a RNA Kvalita izolované DNA a RNA byla vţdy před provedením PCR resp. RT-PCR prověřena elektroforeticky (obrázek 7.1). Pokud byli zamraţeni ţiví nebo čerstvě uhynulí jedinci, výtěţek i kvalita NK byly vysoké u všech vývojových stádií obaleče jablečného nezávisle na pouţité metodě izolace, pouze při extrakci DNA z jednotlivých housenek L1 byla výtěţnost niţší, a proto byla později izolována DNA ze skupiny cca 10 L1 housenek. V případě izolace DNA za pomoci DNeasy Blood & Tissue Kit byl rozdíl ve výtěţnosti mezi vzorky vyšší neţ u kitu MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit (obrázek 7.1). Kit pro izolaci DNA od firmy Qiagen neobsahoval RNázu A. Na gelu je u většiny vzorků viditelná také zbytková RNA (obrázek 7.1 A), která však PCR detekci nijak neomezovala.
Obrázek 7.1: A) kvalita DNA (neošetřená RNázou A) izolovaná kitem DNeasy Blood & Tissue Kit z housenek (1-7), kukel (8-11) a dospělce (12), M=marker Lambda DNA/HindIII B) kvalita DNA a RNA kukel obaleče jablečného izolované pomocí MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit, M=marker 1Kb.
7.2.2 PCR a RT-PCR detekce CpGV 7.2.2.1 Jednoduchá PCR detekce CpGV – po izolaci DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit) Nejprve byl CpGV detekován v letálně infikovaných housenkách L5 z laboratorního chovu CpKrym pomocí párů primerů CpGraF + CpGraR (obrázek 7.2 A) nebo Granulin F + Granulin R (obrázek 7.2 B). Při optimalizaci metody PCR byly pouţívány jako negativní kontrola specifity primerů zdravé housenky z chovu, jako pozitivná kontrola letálně infikované housenky s typickými 84
příznaky granulózy a součástí PCR byla také negativní beztemplátová kontrola, kde byla DNA nahrazena vodou. Detekce CpGV byla testována u housenek L1-L5, kukel a dospělců. Nejsnadněji byl virus detekován v housenkách, a to i po infekci niţšími koncentracemi viru. Naproti tomu do stádia kukly či dospělce se vyvinuly jen subletálně infikované housenky a virus zde byl detekován jen velmi slabě nebo vůbec. Detekce CpGV byla provedena také u 57 vzorků housenek (L2-L5) pocházejících ze třech sadů, kde byl aplikován CpGV a 55 vzorků housenek L3-L5 z jabloňové aleje bez ošetřování. Všechny testované vzorky byly CpGV negativní.
Obrázek 7.2: Elektroforeogramy detekce CpGV v housenkách pomocí párů primerů zacílených do gran. A) primery: CpGraF+CpGraR (607 bp) B) primery: Granulin F+Granulin R (367 bp). M=marker 100bp plus.
7.2.2.2 Jednoduchá PCR a RT-PCR detekce CpGV – po izolaci DNA a RNA (MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit) Detekce CpGV z izolované DNA a RNA housenek (L1, L5), kukel i dospělců byla optimalizována pro vyuţití při studiu moţnosti přenosu viru z rodičů na potomstvo (vertikální přenos). U subletálně infikovaných housenek, kde byla DNA CpGV detekována, byla obvykle DNA viru přítomna také v RNA. Kontrolní PCR s RNA templátem amplifikovala zbytkovou DNA ve vzorku (obrázek 7.3). Proto byly všechny vzorky před RT-PCR dodatečně ošetřeny roztokem DNase I (podkapitola 7.1.3).
Obrázek 7.3: Elektroforeogram PCR detekce CpGV v subletálně infikované housence L5 za pouţití primerů CpGraF+CpGraR (607 bp). 1: DNA; 2: RNA bez druhého ošetření DNázou I; 3: negativní kontrola; 4: pozitivní kontrola; M = marker 100 bp plus.
85
Výsledkem druhého ošetření RNA roztokem DNase I byl vţdy negativní signál v kontrolní PCR (obrázek 7.4 A). Teprve zpětnou transkripcí připravené cDNA potvrdily přítomnost mRNA transkriptu gran CpGV (obrázek 7.4 B), tedy replikaci viru v subletálně infikovaném jedinci. Touto metodou byl CpGv detekován ve všech letálně infikovaných housenkách a v 50 % subletálně infikovaných housenek a to jak v DNA, tak v mRNA transkriptu genu gran. U kukel a motýlů nebyl CpGV nikdy detekován v mRNA gran. V DNA některých vzorků kukel a motýlů byl zachycen slabý signál.
Obrázek 7.4: Elektroforeogram kontrolní PCR (A) a RT-PCR (B) detekce CpGV s primery CpGraF+CpGraR (607 bp). Výsledky třech subletálně infikovaných housenek CpS: A) 1-3: RNA po 2. ošetření DNázou I, 4: negativní kontrola; 5: DNA CpGV pozitivní kontrola B) 1-3: cDNA, 4: negativní kontrola, 5: DNA CpGV pozitivní kontrola; M = marker 100 bp plus.
Dále byla pro potřeby hodnocení vertikálního přenosu dle metodiky Burden a kol. (2002) ověřována moţnost detekce CpGV z housenek povrchově kontaminovaných čistým izolátem CpGV, který obsahuje pouze okluzní tělíska (OB). Při izolaci DNA přímo z povrchově kontaminovaných housenek nebylo moţné CpGV detekovat, zatímco po provedené solubilizaci pár primerů CpGraF a CpGraR virus ve stejné housence detekoval (obrázek 7.5 A). Pro detekci byl pouţit také pár primerů Granulin F a Granulin R, ten ovšem solubilizovaný virus nedetekoval (obrázek 7.5 B).
Obrázek 7.5: Detekce CpGV z okluzních tělísek povrchově kontaminovaných housenek. A) CpGraF+CpGraR (607 bp); B) GranulinF+Granulin R (367 bp). 1: DNA zdravé housenky; 2: DNA izolovaná z poloviny povrchově kontaminované housenky; 2S: DNA izolovaná z poloviny povrchově kontaminované housenky po solubilizaci okluzních tělísek; 3: DNA letálně infikované housenky; negativní kontrola; + pozitivní kontrola; M – marker 100 bp Plus.
86
V celkové RNA izolované z housenek po solubilizaci OB nebyla pomocí RT-PCR mRNA viru detekována, protoţe se v purifikovaném viru ţádná RNA nevyskytuje. Vzhledem k rozdílným výsledkům detekce částic viru uvolněných z OB solubilizací, byla přítomnost viru detekována také páry primerů CpGraF + Granulin R (324 bp) a Granulin F + CpGraR (649 bp) (obrázek 7.6). V tomto případě byl virus z povrchově kontaminovaných housenek detekován pouze párem primerů CpGraF + Granulin R. Z výsledků tedy vyplynulo, ţe problematickým byl přímý primer Granulin F, a proto byl navrţen přímý primer Me53 F zacílený do posledního genu CpGV, aby bylo ověřeno, zda se v místě nasedání primeru Granulin F nenachází bodová mutace.
Obrázek 7.6: Detekce CpGV z okluzních tělísek povrchově kontaminovaných housenek. A) CpGraF+Granulin R (324 bp); B) Granulin F+CpGraR (649 bp). 1: DNA zdravé housenky; 2S: DNA izolovaná z poloviny povrchově kontaminované housenky po solubilizaci okluzních tělísek; 3: DNA letálně infikované housenky; - negativní kontrola; M – marker 100 bp Plus.
Kombinací Me53 F s reverzním primerem Granulin R (324 bp) nebo CpGraR (649 bp) byly získány PCR produkty viru jak z letálně infikovaných housenek, tak z povrchově kontaminovaných housenek se solubilizovanými OB (obrázek 7.7). Tyto PCR produkty byly vyříznuty z gelu, přečištěny pomocí QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Německo) a odeslány k sekvenování (Biogen ve spolupráci se STAB VIDA, Austrálie). Výsledky sekvenování ukázaly, ţe se PCR produkty získané ze vzorků housenek povrchově kontaminovaných virem a letálně infikovaných neliší. Také při porovnání těchto sekvencí s úsekem genomu CpGV-M (NC_002816) publikovaného Luque a kol. (2001) nebyly nalezeny ţádné rozdíly.
87
Obrázek 7.7: Detekce CpGV pro sekvenování A) Me53 F+CpGraR (855 bp); B) Me53 F + Granulin R (573 bp). 1: DNA zdravé housenky; 2S: DNA izolovaná z poloviny povrchově kontaminované housenky po solubilizaci okluzních tělísek; 3: DNA letálně infikované housenky; - negativní kontrola; M – marker 100 bp Plus.
7.2.2.3 Detekce CpGV s vnitřní kontrolou Pro rozenání negativních a falešně negativních výsledků byla optimalizována metoda detekce viru a hostitele pomocí duplex PCR. Nejprve bylo u několika populací pocházejících z ČR a Německa ověřena specifita primerů zacílených do COI. Vzorky všech populací bylo moţné těmito primery detekovat. Poté byly sekvenováním porovnány vzorky k viru rezistentních a citlivých jedinců a ani zde nebyl nalezen ţádný rozdíl. Porovnáním sekvencí našich vzorků se sekvencemi genu COI obaleče jablečného dostupnými v databázi NCBI, nebyly nalezeny rozdíly v sekvencích. Na elektroforeogramu (obrázek 7.8) jsou výsledky detekce CpGV v hostiteli pomocí duplex PCR.
Obrázek 7.8: Duplex PCR detekce CpGV s vnitřní kontrolou. Primery pro detekci CpGV: CpGraF+Granulin R (324 bp); primery pro detekci obaleče jablečného: C1-J-1718 + C1-N-2191 (525 bp) publikované Simon a kol., 1994. 1: DNA zdravé housenky; 2: DNA/RNA/cDNA z poloviny povrchově kontaminované housenky; 2S: DNA z poloviny povrchově kontaminované housenky po solubilizaci okluzních tělísek; 3: DNA/RNA/cDNA letálně infikované housenky; - negativní kontrola; M – marker 100 bp Plus.
88
Ve zdravé housence (1) a CpGV povrchově kontaminované housence (2) nebyl virus detekován, avšak amplifikoval se úsek genu COI mtDNA obaleče jablečného. V případě, ţe byla povrchově kontaminovaná housenka před izolací vystavena solubilizaci OB (2S), anebo se jednalo o letálně infikovanou housenku (3), byl detekován CpGV i mtDNA hostitele, ovšem u vzorku 2S byl band COI jen velmi slabý, protoţe při solubilizaci došlo k silné degradaci hostitelské DNA (ověřeno elektroforeticky). Duplex PCR bylo moţné pouţít i pro detekci CpGV z cDNA.
7.3 Diskuze Při extrakci DNA oběma testovanými kity bylo dosaţeno velmi dobré výtěţnosti. Vzhledem k vysoké ceně kitu od firmy Qiagen (86,50 Kč s DPH/vzorek) byla cena kitu od Epicentre Biotechnologies (36,90 Kč s DPH/vzorek) příznivější. Navíc MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit umoţnil izolovat obě NK současně a vzhledem k tomu, ţe se nejedná o kit s kolonkami, je moţné všechny potřebné reagencie dokoupit zvlášť. Steineke (2004) porovnávala metody izolace DNA z jednotlivých housenek. Pouţila klasickou metodu fenol chloroformové extrakce, rychlou metodu extrakce pomocí 0,1% Triton X 100 a kit od firmy Qiagen (DNeasy Tissue Kit). Nejlepších výsledků dosáhla při pouţití poslední jmenované metody extrakce DNA. Zatímco po izolaci DNA ostatními metodami bylo třeba provést nested-PCR, tedy dvě PCR, kdy byl nejprve amplifikován delší fragment a následně byly pouţity primery zacílené do tohoto fragmentu. S kitem od firmy Qiagen byla PCR s pouţitím primerů pro kratší fragment dostatečně citlivá a vhodná pro studium populační dynamiky viru, kdy je moţné detekovat CpGV u bezpříznakových subletálně infikovaných housenek. Také v našich testech bylo moţné za pomocí primerů CpGraF + CpGraR či Granulin F + Granulin R detekovat virus v bezpříznakových housenkách, ovšem podobně jako uvádí Steineke (2004), docházelo někdy k detekci viru i u housenek z chovu, zejména při pouţití páru CpGraF + R. V souvislosti s detekcí viru u neinfikovaných housenek nelze jednoznačně určit, zda byl virus latentně či perzistentně přítomen v chovu, nebo došlo ke kontaminaci vzorku v průběhu izolace či PCR. V případě, ţe byly z jedince izolovány obě NK, mohla být ověřena přítomnost mRNA pozdního genu pro granulin. Touto metodou potvrdil Burden a kol. (2002) vertikální přenos Plodia interpunctella GV u zavíječe paprikového. V našich testech byl CpGV detekován z DNA také u některých kontrolních neinfikovaných jedinců, avšak v těchto případech nebyl detekován z mRNA. Pozitivní výsledky CpGV v DNA u těchto kontrolních housenek mohou být vysvětleny latentní infekcí, kdy nedochází k experesi většiny genů (Burden a kol., 2003) a tedy nebyl detekován pozdní gen pro granulin a nebo se jednalo o kontaminaci během 89
izolace či PCR. Výskyt latentních/perzistentních infekcí CpGV v chovu obaleče jablečného uvádí různí autoři (Perchat,1998; Cossentine a kol, 2005; Steineke, 2004; Eberle, 2010). Pro potřeby studia vertikálního přenosu CpGV bude třeba zajistit ještě přísnější podmínky, aby nedocházelo ke kontaminacím CpGV v chovu škůdce ani při extrakci NK a následné detekci pomocí PCR. Dalším cílem bylo detekovat virus spolu s vnitřní kontrolou, aby bylo moţné předejít falešně negativním výsledkům detekce. Jako vnitřní kontrola slouţila hostitelská mtDNA, která je vysoce konzervativní a zároveň hostitelsky specifická (Simon a kol., 1994). Byly pouţity univerzálními primery C1-J-1718 + C1-N-2191 zacílené do genu COI, kterými lze detekovat řadu druhů hmyzu (Simon a kol., 1994), avšak v amplifikovaném PCR produktu se nacházejí jednonukleotidové polymorfismy (SNP-Single Nucleotide Polymorphism), kterými lze rozlišit příbuzné druhy. Těchto polymorfismů vyuţili také Chen a Dorn (2009) k rozpoznání housenek obaleče jablečného (Cydia pomonella), obaleče východního (Grapholita molesta), obaleče švestkového (G. funebrana) a G. lobarzewskii za pomoci PCR-RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů, restriction fragment length polymorphism). Specifitu primerů k COI obaleče jablečného prověřili u 18 populací pocházejících z osmi evropských zemí, USA a Číny (databáze NCBI FJ217747- FJ217764). V našich podmínkách se podařilo optimalizovat metodu duplex PCR pro detekci CpGV v housenkách hostitele, a to jak z DNA, tak i z cDNA vytvořené z mRNA genu pro granulin. Vzhledem k méně úspěšné PCR detekci CpGV v kuklách a dospělcích byla duplex PCR testována pouze na housenkách.
90
8
Závěr Cílem práce bylo vyhodnotit v laboratorních podmínkách vztahy mezi CpGV a jeho
hostitelem obalečem jablečným za pomoci biologických testů a molekulární biologie. Biologickými testy byly porovnány dvě metody aplikace CpGV a vliv pouţité diety na tyto pokusy. Dále byla vyhodnocena citlivost přírodních populací obaleče jablečného k mexickému izolátu CpGV a otestována citlivost rezistentního kmene obaleče jablečného k novým izolátům CpGV. Molekulárně zaměřená část práce představuje dvě metody izolace nukleových kyselin a detekci CpGV pomocí PCR, duplex PCR a RT-PCR. Dílčí cíle byly zpracovány do čtyř kapitol, jejichţ závěry jsou zde představeny. Cíl I
Při pouţití metody aplikace CpGV do diety byla mortalita housenek obaleče jablečného mírně ovlivněna pouţitou dietou. Střední letální koncentrace na dietě Premix se statisticky významně lišila od LC50 na dietách Guenn a Iv-S v obou termínech hodnocení. Střední letální koncentrace se na dietách Guenn a Iv-S nelišily. Střední letální koncentrace byla na dietě Premix po 7 dnech 2,6 krát vyšší v případě porovnání s Iv-S a 1,8 krát vyšší při porovnání s Guenn. Po čtrnácti dnech se rozdíl sníţil a LC50 byla 1,9 krát vyšší při porovnání s Guenn i Iv-S. Přestoţe statisticky byl rozdíl v mortalitě mezi dietami významný, 95% konfidenční limity LC50 se na dietě Premix přibliţovaly 95% konfidenčním limitům Guenn a Iv-S a proto lze výsledky biologických testů s pouţitím těchto třech různých diet porovnávat.
Při pouţití metody povrchové aplikace na diety Iv-S a Premix bylo potvrzeno, ţe mortalita housenek obaleče jablečného se lišila. Důvodem byly odlišné vlatnosti povrchů pouţitých diet. Stanovené střední letální koncentrace se statisticky významně lišily a 95% konfidenční limity LC50 těchto dvou diet byly vzdálené. Na dietě Premix byla LC50 15,1 krát (7. den) a 8,6 krát (14. den) vyšší neţ u diety Iv-S. Nebylo moţné porovnat LC50 stanovenou na těchto odlišných dietách.
Vývoj housenek byl sledován na viruprostých dietách Guenn, Iv-S a Premix. Přirozená mortalita hodnocená 1. a 7. den se mezi dietami nelišila. V případě, ţe byly boxy s dietou Guenn a Iv-S po přípravě ponechány otevřené déle neţ 16 hodin, probíhal vývoj housenek na všech třech dietách srovnatelnou rychlostí. Po 10 dnech od umístění housenek na dietu dosáhla přibliţně polovina housenek 5. instaru (Guenn: 40,3 % L5; Iv-S: 62,3 % L5; Premix 53,7 % L5). V boxech uzavřených po 1,5 h nebyl dostatečně odpařen etanol, a proto na těchto dietách bylo zastoupení L5 niţší (Guenn:
91
6,1 % L5; Iv-S 37,5 % L5). Váţením housenek L5 po 14 dnech a kukel po 21 dnech vývoje byl potvrzen statisticky významný rozdíl mezi hmotností samců a samic. Průměrná hmotnost housenek samců a kukel obou pohlaví byla na dietě Premix statisticky průkazně niţší. Cíl II
Cilivost laboratorního kmene obaleče jablečného CpKrym k CpGV se statisticky průkazně lišila od citlivosti laboratorního kmene CpS. Pro porovnání byla pouţita aplikace CpGV do diety Premix. Po sedmi dnech byla LC50 CpKrym 3,8 krát vyšší neţ u CpS, po 14 dnech se rozdíl mezi LC50 významně sníţil a LC50 CpKrym byla jen 1,5 krát vyšší neţ u CpS. Přestoţe byla mortalita CpKrym niţší neţ CpS v obou termínech hodnocení, nebyly nalezeny ţádné housenky, které by do 14 dnů přeţily na dietě o koncentraci 104 OB/ml a vyšších koncentracích, coţ potvrzuje hypotézu, ţe je CpKrym k mexickému izolátu CpGV citlivý.
Hypotéza, ţe citlivost populací obaleče jablečného pocházejících z různých míst ČR je k CpGV-M vysoká, nebyla potvrzena. Ve vzorku populace, která pocházela z části plochy sadu ve Velkých Bílovicích (VBII) několik let experimentálně ošetřované virovými preparáty byli v roce 2008 nalezeni v nejvyšších koncentracích 104 a 3x104 OB/ml jedinci rezistentní k CpGV-M. V letech 2009 a 2010 byla sníţená citlivost VBII k CpGV-M ověřena na dietě obsahující diagnostickou koncentraci 3x105 OB/ml. Mortalita CpKrym i dalších šesti testovaných populací byla po 7 dnech při této koncentraci 100 %, zatímco mortalita VBII dosahovala 76,4 % (2009) a 65,1 % (2010). Z výsledků lze usuzovat, ţe se v populaci VBII vyskytuje přibliţně 20-30 % k viru rezistentních jedinců samců i samic a další pouţívání preparátů na bázi CpGV-M by mohlo tento podíl ještě zvýšit.
Cíl III
Z populace VBII byl kříţením s laboratorním kmenem CpKrym vytvořen nediapauzní laboratorní chov obaleče jablečného. Selekcí housenek na CpGV-M kontaminované dietě byl vytvořen homogenně rezistentní kmen (CpR-CZ). Na základě citlivosti potomstva pocházejícího od jednotlivých párů tvořených rezistentním samcem resp. samicí (CpR-CZ) a citlivým protějškem (CpS) bylo potvrzeno, ţe mechanismus rezistence CpR-CZ k CpGV-M je zaloţen na pohlavním chromozomu Z.
Nové izoláty CpGV pouţité v diskriminační koncentraci 5,8x104 OB/ml vykazovaly v porovnání s CpGV-M vysokou účinnost proti housenkám CpR-CZ, která se po 7 dnech pohybovala od 62,8 do 100 %. Nejúčinnějšími byly izoláty CpGV-I12 a -E2 92
které jiţ po 7 dnech usmrtily v průměru přes 97 % housenek. Dále byla testována účinnost dvou nových izolátů CpGV formulovaných do preparátů Madex Plus a ABC V015 v diskriminační koncentraci 6,25 OB/mm2. Po sedmi dnech měl vyšší účinnost přípravek ABC V015, avšak po 14 dnech byla účinnost obou preparátů srovnatelná. Přestoţe byla mortalita CpR-CZ způsobená novými izoláty obvykle niţší a průběh infekce delší neţ u CpS, jiţ po 7 dnech byla potvrzena statisticky významně vyšší účinnost všech testovaných izolátů v porovnání s CpGV-M. Cíl IV
Byly optimalizovány metody izolace celkové DNA hostitele různých vývojových stadií. Nejlépe byl virus detekován ze stádia housenky. Byla optimalizována metoda PCR pro detekci CpGV v hostiteli pro všechna vývojová stádia a duplex PCR s vnitřní kontrolou pro vývojové stádium housenky. Pro studium vertikálního přenosu CpGV byly navrţeny a optimalizovány metody izolace celkové DNA a RNA hostitele a byla připravena metoda RT-PCR pro detekci mRNA transkriptu genu gran CpGV u subletálně infikovaných jedinců. CpGV bylo moţné nejlépe detekovat v DNA i mRNA housenek. Úspěšnost detekce v subletální infikovaných housenkách byla 50 %. U ostatních vývojových stádií byl CpGV detekován jen u několika jedinců z DNA (vţdy slabý signál) a z mRNA detekován nebyl.
93
9
Literatura
Abbott W.S. (1925): A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, 265-267. Arends H.M. (2004): Molecular and biological analysis on the horizontal transfer of insect transposons in Baculoviruses. PhD Thesis. Johannes Gutenberg University Mainz, 98 pp. Arends H.M., Jehle J.A. (2002): Homologous recombination between the ITRs of transposon TCp3.2 causes an inversion in the genome of Cydia pomonella granulovirus. J. Gen. Virol. 83, 1573-1578. Asser-Kaiser S., Fritsch E., Undorf-Spahn K., Kienzle J., Eberle K.E., Gund N.A., Reineke A., Zebitz C.P.W., Heckel D.G., Huber J., Jehle J.A. (2007): Rapid emergence of baculovirus resistance in codling moth due to dominant, sex-linked inheritance. Science 317, 1916-1918. Asser-Kaiser S., Jehle J.A. (2009): Investigations on the mechanism of CpGV resistence in Cydia pomonella. IOBC/wprs Bulletin 45, 79-81. Asser-Kaiser S. (2010): On the inheritance and mechanism of baculovirus resistance of the codling moth, Cydia pomonella (L.). Dissertation. Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Germany, 127 pp. Asser-Kaiser S., Heckel D.G., Jehle J.A. (2010): Sex linkage of CpGV resistance in a heterogeneous field strain of the codling moth Cydia pomonella (L.). J. Invertebr. Pathol. 103, 59-64. Barcenas N.M., Unruh T.R., Neven L.G. (2005): DNA diagnostics to identify internal feeders (Lepidoptera: Tortricidae) of pome fruits of quarantine importance. J. Econ. Entomol. 98: 299-306. Berling M., Blachere-Lopez C., Soubabere O., Lery X., Bonhomme A., Sauphanor B., LopezFerber M. (2009): Cydia pomonella granulovirus genotypes overcome virus resistance in the codling moth and improve virus efficiency by selection against resistant hosts. Appl. Environ. Microbiol. 75, 925-930. Black B.C., Brennan L.A., Dierks P.M., Gard I.E. (1997): Commercializacion of baculoviral insecticides. In: The Baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 341-387. Bliss C.I. (1935): The calculation of the dosage-mortality curve. Ann. Appl. Biol. 22, 134167. Bliss C.I. (1938): The determination of the dosage-mortality curve from small numbers. Quart. J. Pharm. Pharmacol. 11, 192-216. Brown A.P. (2010): The effect of controlling codling moth (Cydia pomonella) with Steinernema carpocapsae (Nemasys® C) on crop yield. In: Proceedings of the 14th International Conference on Organic Fruit Growing, Ed. Foerdergemeinschaft Oekologischer Obstbau e. V. Weinsberg, pp. 156-162. Bulach D.M., Kumar C.A., Zaia A., Liang B., Tribe D.E. (1999): Group II nucleopolyhedrovirus subgroups revealed by phylogenetic analysis of polyhedrin and DNA polymerase gene sequences. J. Invertebr. Pathol.73, 59-73. Burden J.P., Grifiths C.M., Cory J.S., Smith P., Sait S.M. (2002): Vertical transmission of sublethal granulovirus infection in the Indian meal moth, Plodia interpunctella. Mol. Ecol. 11, 547-555.
94
Burden J.P.; Nixon C.P.; Hodgkinson A.E.; Possee R.D.; Sait S.M.; King, L.A.; Hails, R.S. (2003): Covert infections as a mechanism for long term persistence of baculoviruses Ecology Letters 6, 524-531. Burges H.D., Jones K.A. (1998): Formulation of bacteria, viruses and protozoa to control insects. In: Formulation of microbial biopesticides: beneficial microorganisms, nematodes and seed treatments. Ed. H.D. Burges, Kluwer Academic Publisher. pp. 33-127. Cadogan B.L., Scharbach R.D., Brown K.W., Ebling P.M., Payne N.J., Krause R.E. (2003): Experimental aerial application of a new isolate of the nucleopolyhedrovirus CfMNPV against Choristoneura fumiferana (Lepidoptera: Tortricidae). Crop Prot. 23, 1-9. Clem R.J. (1997): Regulation of programmed cell dead by baculoviruses. In: The Baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 237-266. Cory J.S., Myers J.H. (2003): The ecology and evolution of insect baculoviruses. Annu. Rev. Ecol. Evol. S. 34, 239-272. Cossentine J.E, Jensena L.B.M., Eastwell K.C. (2005): Incidence and transmission of a granulovirus in a large codling moth [Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae)] rearing facility. J. Invertebr. Pathol. 90, 187-192. Crook N.E., Payne C.C. (1980): Comparison of threemethods of ELISA for baculoviruses. J. Gen. Virol. 46, 29-37. Crook N.E., Spencer R.A., Payne C.C., Leisy D.J. (1985): Variation in Cydia pomonella granulosis virus isolates and physical maps of the DNA from three variants. J. Gen. Virol. 66, 2423-2430. Crook N.E., James J.D., Smith I.R., Winstanley D. (1997): Comprehensive physical map of the Cydia pomonella granulovirus genome and sequence analysis of the granulin gene region. J. Gen. Virol. 78, 965-974. Cross J.V., Solomon M.G., Chandler D., Jarrett P., Richardson P.N., Winstanley D., Bathon H., Huber J., Keller B., Langenbruch G.A., Zimmermann G. (1999): Biocontrol of pests of apples and pears in northern and central Europe: 1. Microbial agents and nematodes. Biocontr. Sci. Technol. 9, 125-149. Eastwell K.C., Cossentine J.E., Bernardy M.G. (1999): Characterisation of Cydia pomonella granulovirus from codling moths in a laboratory colony and in orchards of British Columbia. Ann. appl. Biol. 134, 285-291. Eberle K.E. (2010): Novel isolates of Cydia pomonella granulovirus (CpGV): deciphering the molecular mechanism for overcoming CpGV resistance in codling moth Cydia pomonella. Dissertation. Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Germany, 185 pp. Eberle K.E., Asser-Kaiser S., Sayed S.M., Nguyen H.T., Jehle J.A. (2008): Overcoming the resistance of codling moth against conventional Cydia pomonella granulovirus (CpGV-M) by a new isolate CpGV-I12. J. Invertebr. Pathol. 98, 293-298. Eberle K.E., Jehle J.A. (2006): Field resistance of codling moth against Cydia pomonella granulovirus (CpGV) is autosomal and incompletely dominant inherited. J. Invertebr. Pathol. 93, 201-206. Eberle K.E., Sayed. S., Rezapanah M., Shojai-Estabragh S., Jehle J.A. (2009): Diversity and evolution of the Cydia pomonella granulovirus. J. Gen. Virol. 90, 662-671. El Salamouny S., Shapiro M., Ling K.S. Shepard B.M. (2009): Black tea and lignin as ultraviolet protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus. Entomol. Sci. 44, 50-58. Finney D.J. (1971): Probit analysis. Cambridge University Press, Cambridge. 333 pp. 95
Fritsch E., Undorf-Spahn K., Kienzle J., Zebitz C.P.W., Huber J. (2005): ApfelwicklerGranulovirus: Erste Hinweise auf Unterschiede in der Empfindlichkeit lokaler ApfelwicklerPopulationen. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 57, 29-34. Fritsch E., Undorf-Spahn K., Kienzle J., Zebitz C.P.W., Huber J. (2006): Codling moth granulovirus: Variations in the susceptibility of local codling moth populations. In: Proceedings of the 12 International Conference on Cultivation Technique and Phytopathological Problems in Organic Fruit-Growing. Foerdergemeinschaft Oekologischer Obstbau e. V. Weinsberg, 7-13. Fuková I., Neven L.G., Bárcenas N.M., Gund N.A., Dalíková M., Marec F. (2008): Rapid assessment of the sex of codling moth Cydia pomonella (Linnaeus) (Lepidoptera: Tortricidae) eggs and larvae. J. Appl. Entomol. 133, 249-261. Funk C.J., Braunagel S.C., Rohrmann G.F. (1997): Baculovirus structure. In: The baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 7-27. Grzywacz D., Jones K.A., Moawad G., Cherry A. (1998): The in vivo production of Spodoptera littoralis nuclear polyhedrosis virus. J. Virol. Methods 71, 115-122. Guarino, L.A., Summers, M.D. (1987): Nucleotide sequence and temporal expression of a baculovirus regulatory gene. J. Virol. 61, 2091-2099. Guennelon G., Audemard H. , Fremond J.C., El Idrissi Ammari, M.A. (1981): Progrès réalisés dans l’elevage permanent du Carpocapse (Laspeyresia pomonella L.) sur milieu artificiel. Agronomie 1, 59-64. Herniou E.A., Luque T., Chen X., Vlak J.M., Winstanley D., Cory J.S.,O’Reilly D.R. (2001): Use of whole genome sequence data toinfer baculovirus phylogeny. J. Virol. 75, 8117-8126. Herniou E.A., Olszewski J.A., Cory J.S., O'Reilly D.R. (2003): The genome sequence and evolution of baculoviruses. Annu Rev Entomol 48, 211-234. Hluchý M., Ackermann A., Zacharda M., Bagar M., Jetmarová E., Vanek G. (1997): Obrazový atlas chorob a škůdců ovocných dřevin a vinné révy. Biocont Laboratory s.r.o., Brno, 425 pp. Holb I. (2004):Yield loss and disease development of Monilinia fructigena (Aderh. & Ruhl.) Honey in an organic apple orchard. Journal of Agricultural Sciences, Debrecen 15, 6-8. Holuša J., Weiser J. (2005): Biologické postupy boje s lesními škůdci. Zpravodaj ochrany lesa 11, 18-23. Howell J.F. (1991): Reproductive biology. In: Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. (World Crop Pests Volume 5), eds. L.P.S. van der Geest, H.H. Evenhuis. Elsevier Amsterdam, pp. 157-174. Hughes P.R., Wood H.A, Breen J.P., Simpson S.F., Duggan A.J., Dybas J.A. (1997) Enhanced bioactivity of recombinant baculoviruses expressing insect-specific spider toxins in lepidopteran crop pests. J. Invertebr. Pathol. 69, 112-118. Hunter-Fujita F.R., Entwistle P.F., Evans H.F., Crook N.E (1998): Insect viruses and pest management. John Wiley & Sons Inc., Baffins Lane, Chichester, 1-620 pp. Chen M. H., Dorn S. (2009): Reliable and Efficient Discrimination of four internal fruitfeeding Cydia and Grapholita species (Lepidoptera: Tortricidae) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. J. Econ. Entomol. 102, 2209-2216. Inlow, D., Shauger, A., and Maiorella, B. (1989): Insect cell culture and baculovirus propagation in protein-free medium. J. Tissue Culture Meth. 12, 13-16.
96
Inceoglu A.B., Kamita S.G., Hinton A.C., Huang Q., Severson T.F., Kang K., Hammock B.D. (2001): Recombinant baculoviruses for insect control. Pest Manag. Sci. 57, 981-987. Ivaldi-Sender C. (1974): Techniques simples pour élevage permanent de la tordeuse orientale, Grapholita molesta (Lep., Tortricidae), sur milieu artificiel. Ann. Zool. Ecol Anim 6, 337343. Jehle J.A., Backhaus H., Fritsch E., Huber J. (1992): Physical map of the Cryptophlebia leucotreta granulosis virus genome and ist relationship to the genome of Cydia pomonella granulosis virus. J. Gen. Virol. 73, 1621-1626. Jehle J.A., van der Linden I.F.A., Backhaus H., Vlak J.M. (1997): Identification and characterization of the insertion site of transposon TCp3.2 in the genome of Cydia pomonella granulovirus. Virus Res. 50, 151-157. Jehle J.A., Blissard G.W., Bonning B.C., Cory J.S., Herniou E.A., Rohrmann G.F., Theilmann D.A., Thiem S.M., Vlak J.M. (2006a): On the classification and nomenclature of baculoviruses: A proposal for revision. Arch. Virol. 151, 1257-1266. Jehle J.A., Lange M., Wang H., Hu Z., Wang Y., Hauschild R. (2006b): Molecular identification and phylogenetic analysis of baculoviruses from Lepidoptera. Virology 346, 180-193. Jehle J.A., Sayed S.M., Wahl-Ermel B. (2006c): What do we (need to) know about lowsusceptibility of codling moth against Cydia pomonella granulovirus (CpGV). In: Proceedings of the 12 International Conference on Cultivation Technique and Phytopathological Problems in Organic Fruit-Growing, Ed. Foerdergemeinschaft Oekologischer Obstbau e. V. Weinsberg, pp. 14-18. Jehle J.A. (2008a): The future of Cydia pomonella granulovirus in biological control of codling moth. Published in Boos, Markus, Eds. Ecofruit - 13th International Conference on Cultivation Technique and Phytopathological Problems in Organic Fruit-Growing, pp. 265270. Jehle J.A. (2008b): Apfelwicklergranulovirus-ie geht es weiter? Obstbau 4, 194-198. Jehle J.A. (2009): André Paillot (1885-1944): his work lives on. J. Invertebr. Pathol. 101, 162-168. Jehle J.A. Schmitt A. (2009): Resistance to baculoviruses – new answers to an old question. Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes IOBC/wprs Bulletin 45, 125-127. Jiang Y, Deng F, Rayner S, Wang H, Hu Z. (2009): Evidence of a major role of GP64 in group I alphabaculovirus evolution. Virus Res. 142, 85-91. Kalmakoff J. Ward V.K. (2003): Baculoviruses. [online] (cit. 27.7.2009). Dostupné z
Kariuki C.W., Mcintosh A.H., Goodman C.L. (2000): In vitro host range studies with a new baculovirus isolate from the diamondback moth Plutella xylostella (L.) (Plutellidae: Lepidoptera). In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 36, 271-276. Khachatourians G.G. (2009): Insecticides, microbial. In: Encyclopedia of microbiology (Third edition). Ed. M. Schaechter, Academic Press. pp. 95-109. Kienzle J., Zimmer J., Volk F., Zebitz C.P.W. (2008): Experiences with entomopathogenic nematodes for the control of overwintering codling moth larvae in Germany. 13th Int. Conference on Cultivation Technique and Phytopathological Problems in Organic FruitGrowing: 277-283.
97
Kukan B. (1999): Vertical transmission of nucleopolyhedrovirus in insects. J. Invertebr. Pathol. 74, 103-111. Kundu J.K., Stará J., Kocourek F., Pultar O. (2003): Polymerase chain reaction assay for Cydia pomonella granulovirus detection in Cydia pomonella population. Acta Virol. 47, 153157. Kundu J.K., Zichová T., Stará J., Kocourek F. (2008): Detection of Adoxophyes orana granuloviruses in Adoxophyes orana by PCR. Acta Virol. 52, 187-188. Lacey L.A, Vail P.V., Hoffmann D.F. (2002): Comparative activity of baculoviruses against the codling moth Cydia pomonella and three other tortricid pests of tree fruit. J. Invertebr. Pathol. 80, 64-68. Lacey L.A., Arthurs S.P., Headrick H.L. (2005): Comparative activity of the codling moth granulovirus against Grapholita molesta and Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae). J. Entomol. Soc. Brit. Columbia 102, 79-80. Lacey L.A., Unruh R.T. (2005): Biological control of codling moth (Cydia pomonella, Lepidoptera: Tortricidae) and its role in integrated pest management, with emphasis on entomopathogens. Vedali 12, 33-60. Lacey L.A., Headrick, H.L., Arthurs S.P. (2008) Effect of temperature on long-term storage of codling moth granulovirus formulations. J. Econ. Entomol. 101, 288-294. Luque T., Finch R., Crook N., O´Reilly D.R., Winstanley D. (2001): The complete sequence of the Cydia pomonella garnulovirus genom. J. Gen.Virol. 82, 2531-2547. Lange M., Jehle J.A. (2003): The genome of the Cryptophlebia leucotreta granulovirus. Virology 317, 220-236. Lange M., Wang H., Zhihong H., Jehle J.A. (2004): Towards a molecular identification and classification system of lepidopteran-specific baculoviruses. Virology 325, 36-47. Meraner A., Brandstätter A., Thaler R., Aray B., Unterlechner M., Niederstätter H., Parson W., Zelger R., Dalla Via J., Dallinger R. (2008): Molecular phylogeny and population structure of the codling moth (Cydia pomonella) in Central Europe: I. Ancient clade splitting revealed by mitochondrial haplotype markers. Mol. Phylogenet. Evol. 48, 825-37. Miller F. (1956): Zemědělská entomologie. ČSAV, Praha, 1056 pp. Miller L.K. (1997): Introduction to the baculoviruses. In: The baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 1-6. Moscardi F. (1999): Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera. Annu. Rev. Entomol. 44, 257-289. Payne, C.C. (1981): The susceptibility of the pea moth, Cydia nigricana, to infection by the granulosis virus of the codling moth, Cydia pomonella. J. Invertebr. Pathol. 38, 71-77. Pearson M.N., Rohrmann G.F. (2002): Transfer, incorporation, and substitution of envelope fusion proteins among members of the Baculoviridae, Orthomyxoviridae, and Metaviridae (insect retrovirus) families. J. Virol. 76, 5301-5304. Perchat S. (1998): Transmission verticale du virus de la granulose de Cydia pomonella,à ľétat latent, chez le carpocapse des pommes Cydia pomonella, L.). Thesis. Université des Sciences et Technologiques de Lille, France. 42 pp. Possee R.D., Rohrmann G.F. (1997): Baculovirus genome organization and evolution. In: The Baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 109-134.
98
Prikhod’ko E.A., Miller L.K. (1996): Induction of apoptosis by baculovirus transactivator IE1. J. Virol. 70, 7116-7124. Reineke A., Hauck M., Kulanek D. (2010) Infection of the plum fruit moth, Cydia funebrana (Lepidoptera: Tortricidae) by Cydia pomonella granulovirus (CpGV). In: Proceedings of the 14th International Conference on Organic Fruit Growing, Ed. Foerdergemeinschaft Oekologischer Obstbau e. V. Weinsberg, pp. 145-148. Reiser M., Groner A., Sander E. (1993): Cryptophlebia leucotreta (Lep.: Tortricidae)—a promising alternate host for mass-production of the Cydia pomonella granulosis virus (CpGV) for biological pest control. J. Plant. Dis. Protect. 100, 586-598. Rezapanah M., Shojai-Estabragh S., Huber J.,·Jehle J.A. (2008): Molecular and biological characterization of new isolates of Cydia pomonella granulovirus from Iran. J. Pest. Sci. 81, 187-191. Rohrmann G.F. (2008): Baculovirus molecular biology. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; November. [online] (cit.27.7.2009). Dostupné z Sauphanor B., Berling M., Toubon J.F., Reyes M., Delnatte J. (2006): Carpocapse des pommes cas de résistance aux virus de la granulose dans le Sud-Est. Phytoma 590, 24-27. Shel‘Deshova G.G. (1967): Ecological factors determining distribution of the codling moth Laspeyresia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) in the northern and southern hemispheres. Entomol. Rev. 46, 349-361. Schmitt, A., Sauphanor, B., Jehle, J.A. & Huber, J. (2008). Resistance of Cydia pomonella to granulovirus: occurrence in Europe and tests on cross resistance with chemical insecticides. [online] (cit.27.7.2009). Dostupné z Simon C., Frati F., Beckenbach A., Crespi B., Liu H., Flook P. (1994): Evolution, weighting, and phylogenetics utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reactions primers. Ann. Entomol. Soc. 87, 651-701. Smith G.E., Summers M.D. (1981): Application of a novel radioimmunoassay to identify baculovirus structural proteins that share interspecies antigenic determinants. J. Virol. 39, 125-137. Sorauer P. (1953): Handbuch der Pflanzenkrangheiten, Tierische Schädlinge an Nutzpflanzen. Berlin, 159-165. Stará J. (2002): Vyuţití viru granulózy v ochraně sadů proti obaleči jablečnému. Disertační práce, ČZU Praha 2002, 93 pp. Stará J., Kocourek F. (2003): Evaluation of efficacy of Cydia pomonella granulovirus (CpGV) to control the codling moth (Cydia pomonella L., Lep.: Tortricidae) in field trials. Plant Protect. Sci. 39, 117-125. Stará J., Kocourek F. (2007): Insecticidal resistance and cross-resistance in populations of Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) in central Europe. J. Econ. Entomol. 100, 15871595. Stará J., Falta V., Zichová T., Ouředníčková J., Kocourek F. (2009): Virus granulózy obaleče jablečného v integrované a organické produkci. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, certifikovaná metodika, SRS Praha, 28 pp. Steineke S.B., Jehle J.A., Fritsch E., Undorf-Spahn K., Huber J., Rossberg D., Backhaus H. (2002): Mathematische Modellierung der Populationsdynamik von genetisch veränderten Mikroorganismen am Beispiel von Baculoviren. UBA-Texte 63/02. 157 pp. 99
Steineke S.B. (2004): Populationsdynamik des Cydia pomonella Granulovirus. Dissertation. Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Germany, 138 pp. Steinhaus, E.A. (1947): A new disease of the variegated cutworm, Peridroma margaritosa (Haw.). Science 106, 323. Sun X., Chen X., Zhang Z., Wang H., Bianchi F.J., Peng H., Vlak J.M., Hu Z. (2002): Bollworm responses to release of genetically modified Helicoverpa armigera nucleopolyhedroviruses in cotton. J. Invertebr. Pathol. 81, 63-9. Szewczyk B., Hoyos-Carvajal L., Paluszek M., Skrzecz, I., Labo de Souza, M. (2006): Baculoviruses – re-emerging biopesticides. Biotechnol. Adv. 24, 143-160. Szewczyk B., Lukasz Rabalski, Krol E., Sihler W., de Souza M. L. (2009): Baculovirus biopesticides - a safe alternative to chemical protection of plants. J. Biopestic. 2, 209-216 Švestka M., Pultar O. (2002): Zhodnocení moţnosti biologické obrany před bekyní mniškou (Lymantria monacha L.) plošnou aplikací virového preparátu. Zprávy lesnického výzkumu 47, 221-231. Tabashnik B.E., Cushing N.L., Johnson M.W. (1987): Diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) resistance to insecticides in Hawaii: intra-island variation and cross-resistance. J. Econ. Entomol., 80, 1091-1099. Thaler R., Brandstätter A., Meraner A., Chabicovski M., Parson W., Zelger R., Dalla Via J., Dallinger R. (2008): Molecular phylogeny and population structure of the codling moth (Cydia pomonella) in Central Europe: II. AFLP analysis reflects human-aided local adaptation of a global pest species. Mol. Phylogenet. Evol. 48, 838-49. Theilmann D.A., Blissard G.W., Bonning B., Jehle J., O'Reilly D.R., Rohrmann G.F., Theim S., Vlak J.M. (2005): Baculoviridae. In: Virus Taxonomy. Eighth report of the international committee on taxonomy of viruses. Eds. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L.A., Elsevier/Academic Press, pp.177-185. Traut W., Marec F. (1997): Sex chromosome differentiation in some species of Lepidoptera (Insecta). Chromosome Res. 5, 283-291. van Beek N., Davis D.C. (2007): Baculovirus insecticide production in insect larvae. Methods Mol. Biol. 388, 367-78. Vincent C., Andermatt M., Valéro J. (2007): Madex® and VirossoftCP4®, viral biopesticides for codling moths control. In: Biological Control: A Global Perspective. Eds.Vincent C., Goettel M.S., Lazarovitz G. CAB International, pp. 336-343. Williams G.V., Faulkner P. (1997): Cytological changes and viral morphogenesis during baculovirus infection. In: The baculoviruses. Ed. L.K. Miller, Plenum Press, New York, pp. 61-107. Witzgall P., Ansebo L., Yang Z., Angeli G., Sauphanor B., Bengtsson M. (2005): Plant volatiles affect oviposition by codling moths. Chemoecology 15, 77-83. Woo S.D. (2001): Rapid detection of multiple nucleopolyhedroviruses using polymerase chain reaction. Mol. Cells. 11, 334-340. Wormleaton S., Kuzio J., Winstanley D. (2003): The complete sequence of the Adoxophyes orana granulovirus genome. Virology 311, 350-365. Zingg D., Kessler P. (2007): MADEX Plus - a solution to the problem codling moth granulovirus resistence. AG Journal, 14, 3-7.
100
10 Publikační aktivita autorky 10.1 Seznam publikací souvisejících s disertační prací Impaktovaná publikace Kundu J.K., Zichová T., Stará J., Kocourek F. (2008): Detection of Adoxophyes orana granulovirus in Adoxophyes orana by PCR. Acta Virol. 52, 187-188. Zichová T., Falta V., Stará J., Kocourek F. (2011): Differences in the susceptibility of codling moth populations to Cydia pomonella granulovirus in the Czech Republic. Hort. Sci. 38, 21-26. Vědecká publikace v recenzovaném časopise Zichová T., Stará J., Falta V., Ryšánek P., Kocourek F. (2010): Citlivost populací obaleče jablečného na virus granulózy obaleče jablečného v ČR. Zahradnictví 7, 64-66. Odborné publikace Falta V., Zichová T. (2008): Entomopatogenními viry proti obaleči jablečnému. Zahradnictví 12, 12-14. Falta V., Zichová T. (2009): Entomopatogenní viry v ochraně sadů proti obaleči jablečnému a perspektiva jejich vyuţití v našem ovocnářství. Vinař sadař 2, 54-56. Falta V., Zichová T. (2010): Virus granulózy obaleče jablečného. Nový impuls v ochraně sadů. Agromanuál 5, 23-25. Zichová T. (2010): Vyuţití viru granulózy v integrované ochraně sadů a v reţimech ekologického pěstování. Rostlinolékař 21, 24-24. Certifikovaná metodika Stará J., Falta V., Zichová T., Ouředníčková J., Kocourek F. (2009): Virus granulózy obaleče jablečného v integrované a organické produkci. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, Osvědčení č.j. SRS 037318/2009 o uznání uplatněné certifikované metodiky vydává Státní rostlinolékařská správa Praha. 28 pp. Příspěvek ve sborníku z vědecké konference (úplná struktura vědeckého článku) Zichová T., Stará J., Kocourek F., Ryšánek P., Kumar-Kundu J. (2007): Vývoj metodiky pro biologické testování citlivosti přírodních populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k bakuloviru Cydia pomonella granulovirus. In: Sborník příspěvků z konference doktorandů oboru ochrana rostlin, 26.9.2007, Praha, pp. 119-126. Zichová T., Stará J., Falta V., Ryšánek P., Kundu J.K. (2008): Citlivost přírodních populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k bakuloviru Cydia pomonella granulovirus (CpGV). In: Sborník příspěvků ze třetího ročníku konference doktorandů oboru ochrana rostlin 2008, 24.9.2008, Praha ČZU Praha, pp. 71-77. Kundu J.K., Stará J., Zichová T., Kocourek F. (2008): Evaluation of persistence of Adoxophyes orana granulovirus and Cydia pomonella granulovirus in populations of their hosts by molecular methods, IOBC/WPRS Bull. 31, 72-75. Zichová T., Stará J., Falta V., Kumar J., Jehle J.A. (2009): Influence of diet composition on mortality of Cydia pomonella larvae infected with CpGV. IOBC/WPRS Bull. 45, 110-113.
101
Abstrakt ve sborníku z mezinárodní vědecké konference (přednášky/postery) Zichová T., Kumar-Kundu J., Jehle J.A., Ryšánek P., Stará J., Kocourek F. (2009): Studium vertikálního přenosu subletální infekce Cydia pomonella granulovirus (Baculoviridae) obaleče jablečného (Cydia pomonella). In: Sborník abstraktů XVIII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin, 2.- 4. září 2009, MZLU v Brně, pp.179. Zichová T., Stará J., Falta V., Kocourek F, Ryšánek P., Kumar-Kundu J., (2009): Monitoring rezistence obaleče jablečného (Cydia pomonella) k Cydia pomonella granulovirus. In: Sborník abstraktů XVIII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin. 2. - 4. září 2009, MZLU v Brně, pp.180. Zichová T., Stará J., Falta V., Kocourek F. (2010): Monitoring of the susceptibility of codling moth (Cydia pomonella) populations to Cydia pomonella granulovirus. In: Programme and Book of abstracts of IXth European congress of Entomology in Budapest, pp.79.
10.2 Seznam ostatních publikací Impaktovaná publikace Zichová T., Kocourek F., Salava J., Naďová K., Stará J. (2010): Detection of organophosphate and pyrethroid resistance alleles in Czech Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae) populations by molecular methods. Pest. Manag. Sci. 66, 853860. Příspěvek ve sborníku z vědecké konference (úplná struktura vědeckého článku) Zichová T., Kocourek F., Salava J., Naďová K., Stará J. (2010): Optimalizace molekulárních metod pro detekci bodových mutací souvisejících s rezistencí mandelinky bramborové k organofosfátům a pyretroidům. Studentská vědecká konference. Sborník recenzovaných příspěvků kategorie Věda má budoucnost, 13. května 2010, Ostrava, 86-89.
102
Přílohy A Semisyntetické diety pro vývoj obaleče jablečného A.1 Umělá dieta pro laboratorní chov obaleče jablečného v České republice převzato od A. Alešové, ÚOCHB AV ČR. Agar
60 g
Ječné klíčky
480 g
Pšeničné klíčky
75 g
Kvasnice – sušené
75 g
Kyselina askorbová
15 g
Kyselina citronová
15 g
Methylparaben
5g
B-komplex
0,21 g
Kyselina sorbová
4g
Voda
3000 ml
Postup přípravy: Smísit 1500 ml vody s agarem a nechat přes noc nabobtnat. Druhý den rozvařit agar, přidat smísené klíčky a kvasnice a přilít dalších 1500 ml vody. Vařit asi 5 minut a po ochlazení na 50 °C přidat ostatní komponenty.
A.2 Umělá dieta podle Ivaldi-Sender (1974) pro laboratorní chov v Německu převzato od S. Asser-Kaiser, DLR Rheinpfalz. Agar
10 g
Kukuřičná polenta
32 g
Pšeničné klíčky
33 g
Kvasnice – sušené
15 g
Kyselina askorbová
2,28 g
Methylparaben
1,15 g
Voda
500 ml
Postup přípravy: Vodu s agarem a kukuřičnou polentou sterilizovat v autoklávu (program pro kapalné látky s pomalým chladnutím, sterilizace 20 min při 121 °C). Klíčky a kvasnice smísit, přidat horkou směs vody s agarem a kukuřicí a přilít Metylparaben rozpuštěný v 10 ml absolutního etanolu. Dobře promíchat a po schladnutí na 60 °C přidat kyselinu askorbovou rozpuštěnou ve 25 ml destilované vody. Po vychladnutí diety je nutné
I
nechat nejlépe přes noc volný přístup vzduchu k dietě, aby vyprchal všechen etanol. A.3 Umělá dieta podle Guennelon a kol. (1981) převzato od S. Schulze-Bopp, DLR Rheinpfalz. Agar
10 g
Kukuřičná polenta
95 g
Pšeničné klíčky
23 g
Kvasnice – sušené
25 g
Kyselina askorbová
3,5 g
Methylparaben
1,5 g
Kyselina benzoová
1,15 g
Voda
615 ml
Postup přípravy: Smísit 300 ml vody s agarem a krátce povařit v mikrovlnné troubě. Přidat metylparaben a kyselinu benzoovou (rozpuštěné v 10 ml 70 % etanolu). Klíčky, kukuřičnou polentu a kvasnice smísit a přidat k nim horkou směs vody s agarem. Dobře promíchat, přidat 315 ml vody ohřáté v mikrovlné troubě na cca 40 °C. Po schladnutí na 60 °C přidat kyselinu askorbovou rozpuštěnou ve 25 ml destilované vody. Po vychladnutí diety je nutné nechat nejlépe přes noc volný přístup vzduchu k dietě, aby vyprchal všechen etanol.
B Pufry a chemikálie pro molekulární biologii B.1 0,5 M EDTA (pH 8,0) EDTA
37,22 g
NaOH
dle potřeby
Postup přípravy: EDTA doplnit do 200 ml bidestilovanou vodou a za stálého míchání na magnetickém míchadle upravit pH pufru za pomoci NaOH.
B.2 50x TAE pufr (zásobní roztok) Tris
36,3 g
0,5 M EDTA (pH 8,0)
15 ml
kyselina octová
8,6 ml
II
Postup přípravy: Zásobní roztok připravit z uvedených chemikálií doplněných redestilovanou vodou do 150 ml. Pracovní roztok (1x TAE) připravit doplněním 20 ml zásobního 50 x TAE pufru redestilovanou vodou do 1 l.
B.3 10x ficoll nanášecí pufr Ficoll 400
2g
0,5 M EDTA (pH 8,0)
1,25 ml
bromophenol blue
10 mg
xylene cyanol FF
10 mg
oranţ G
20 mg
Postup přípravy: Smísit uvedené chemikálie, doplnit bidestilovanou vodou do 15 ml a dobře promíchat na třepačce.
B.4 Pouţívané komerční kity a chemikálie Izolace NK DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Německo) MasterPure™
Complete
DNA
and
RNA
Purification
Kit
(EPICENTRE
Biotechnologie, Madison, WI, USA) DNáza I kit DNA-free Kit (Applied Biosystems, USA) Kit pro PCR Taq polymeráza (TaKaRa, Japan) Kit pro reverzní transkripci RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas International Inc, Kanada) Hmotnostní standardy Lambda DNA/HindIII (Fermentas International Inc, Kanada) 1 Kb (Fermentas International Inc, Kanada) GeneRuler 100bp DNA Leader (Fermentas International Inc, Kanada) GeneRuler 100bp Plus DNA Ledder (Fermentas International Inc, Kanada)
III
C Biologické testy C.1 Tabulka pro kvantifikaci purifikovaného izolátu viru před biologickým testem Tabulka pro pouţití počítací komůrky Petroff-Hausser (hloubka 0,02 mm). Převzato z DLR Rheinpfalz Izolát viru: 1. ředění Počet OB v pěti čtvercích
1. počítání 1:
2. počitání 1:
1. počítání 1:
2. počítání 1:
Počet OBs v jednom čtverci OBs ve čtverci x 1250 počet OB před ředěním (OB/µl)
2. ředění Počet OB v pěti čtvercích Počet OBs v jednom čtverci OBs ve čtverci x 1250 počet OB před ředěním (OB/µl)
Ø počet OB před ředěním (OBs /µl) Ø počet OB před ředěním (OBs/ml)
IV
C.2 Tabulka pro hodnocení biologického testu v různých termínech
Datum nasazení housenek: 1. hodnocení:
Virový izolát: Populace obaleče:
2. hodnocení:
Larvální instar:
3. hodnocení:
Počet housenek nasazených na dietu:
V
D Rozměrné tabulky, obrázky a schémata D.1 Přehled virů bezobratlých Nezahrnuje viry rostlin a obratlovců, kterým slouţí hmyz pouze jako vektor přenosu. Podle Hunter-Fujita a kol., 1998, aktualizováno podle ICTV 2009 Čeleď
DNA viry - dsDNA Ascoviridae Baculoviridae
Iridoviridae
Rody napadající hmyz
Rody napadající obratlovce Rody napadající rostliny
Ascovirus Alphabaculovirus Betabaculovirus Gammabaculovirus Deltabaculovirus Iridovirus Chloriridovirus
-
-
Ranavirus, Lymphocystivirus, Megalocytivirus Rody Chordopoxvirinae
-
Poxviridae
Alphaentomopoxvirus Betabaentomopoxvirus Gammaentomopoxvirus
Polydnaviridae
Ichnovirus Bracovirus Whispovirus Nudivirus
-
-
-
-
Densovirinae
Densovirus, Iteravirus, Brevidensovirus, Pefudensovirus Bombyx mori densovirus 3
-
Entomobirnavirus
Aquabirnavirus, Avibirnavirus, Blosnavirus Aquareovirus, Coltivirus, Reovirus, Orbivirus, Orthoreovirus, Rotavirus, Seadornavirus
-
Betanodavirus -
-
Nimaviridae neklasifikovaný DNA viry - ssDNA Parvoviridae
RNA viry - dsRNA Birnaviridae Reoviridae
Cardoreovirus Coltivirus Cypovirus Idnoreovirus Orbivirus Seadornavirus
RNA viry – ssRNA (+) Dicistroviridae Cripavirus Iflaviridae Iflavirus Nodaviridae Alphanodavirus Roniviridae Okavirus Tetraviridae Betatetravirus Omegatetravirus
-
Phytoreovirus, Fujivirus
VI
D.2 Seznam preparátů na bázi bakulovirů pouţitelných v ochraně rostlin (zdroj: internet 2009) komodita
Škůdce (latinský a český název)
Název viru polyedrózy a jeho zkratka
Biopreparát (výrobce)
Autographa californica Trichoplusia ni Pseudoplusia includens Heliothis virescens Spodoptera exigua Estigmene acrea Plutella xylostella
Autographa californica NPV AcMNPV
VPN-80 (Agricola El Sol)
Alphabaculovirus Vojtěška a jiné plodiny
kovolesklec cizokrajný
brukvovitá zelenina, rajče, Mamestra brassicae bavlník Helicoverpa armigera Plutella xylostella Phthorimaea operculella Endopiza viteana
můra zelná černopáska bavlníková zápředníček polní makadlovka bramborová -
Mamestra brassicae NPV MabrNPV
Mamestrin* (Calliope SA)
bavlna a zelenina, brukvovitá zelenina
Trichoplusia ni Mamestra configurata
kovolesklec cizokrajný -
Mamestra configurata MNPV MacoNPV
VIROSOFTBA3** (BioTEPP)
bavlna a zelenina
Heliothis virescens Heliothis zea Heliothis armigera
šedavka kukuřičná černopáska bavlníková
Helicoverpa zea SNPV HzSNPV
Gemstar LC (Certis), Elcar* (Sandoz Crop Protection)
VII
komodita
Škůdce (latinský a český název)
Název viru polyedrózy a jeho zkratka
Biopreparát (výrobce)
Alphabaculovirus (pokračování) Kukuřice, slunečnice, Heliothis armigera brambory, luskoviny, zelenina a okrasné rostliny
černopáska bavlníková
Helicoverpa armigera NPV HaNPV
HELICOVEX (Andermatt Biocontrol)
zelenina, okrasné rostliny ve sklenících
Spodoptera exigua
blýskavka červivcová
Spodoptera exigua NPV SeMNPV
Spod-X LC (Certis), Vir-ex (Biocolor), SPEXIT (Andermatt Biocontrol) Spodopterin (Ajay Biotech)
bavlník, obilniny, rajče
Spodoptera littoralis
Spodoptera littoralis NPV SlNPV
Spodopterin* (Calliope SA), LITTOVIR (Andermatt Biocontrol)
Spodoptera albula (sunia) Spodoptera exigua Diaphania hyalinata
Spodoptera albula NPV
VPN-82 (Agricola el sol)
32 druhů zástupců rodu Lepidoptera
Spodoptera albula NPV + Autographa californica NPV AcMNPV
VPN ULTRA (Agricola el sol)
VIII
komodita
Škůdce (latinský a český název)
Název viru polyedrózy a jeho zkratka
Biopreparát (výrobce)
Spodoptera albula NPV + Autographa californica NPV AcMNPV
VPN ULTRA (Agricola el sol)
Lymantria dispar NPV LdMNPV
Gypchek (US Forest service) Dispavirus (Natural Resources Canada) Biolavirus-LD* (Biola Chelčice)
Alphabaculovirus (pokračování) 32 druhů zástupců rodu Lepidoptera
Lesní porosty
Lymantria dispar
bekyně velkohlavá
Lesní porosty
Orgyia pseudotsugata
Orgyia peudotsugata NPV OpNPV
TM Biocontrol, VIRTUSS (Natural Resources Canada)
sóje
Anticarsia gemmatalis
Anticarsia gemmatalis MNPV AgMNPV
Baculo Soja (Turfal) , Baculovirus Nitral (Nitral Urbana), Coopervirus PM (Coodetec), Protege*(Milenia) Baculovirus AEE (Embrapa Soja), Baculoviron* (Nova Era)
IX
komodita
Škůdce (latinský a český název)
Název viru polyedrózy a jeho zkratka
Biopreparát (výrobce)
Betabaculovirus Jabloň, hrušeň
Adoxophyes orana
obaleč zimolézový
Adoxophyes orana GV AdorGV
CAPEX (Andermatt Biocontrol)
Jabloň, hrušeň, ořešák, švestka
Cydia pomonella
obaleč jablečný
Cydia pomonella GV CpGV
Cyd-X (Certis), Madex, Madex Max a Madex Plus (Andermatt Biocontrol) Carpovirusine (Arysta LifeScience) Granupom (Probis), VirosoftCP4 (BioTEPP) Carposin* (Agrichem) Virin-CyAP * (NPO Vector) CARPOVIRUS Plus (INTA, Agro Roca)
bavlna, peckoviny, citrusy, Kukuřice, …
Cryptophlebia leucotreta
Cryptophlebia leucotreta GV CrleGV
CRYPTEX (Andermatt Biocontrol)
Sušené ovoce a ořechy
Plodia interpunctella
Plodia interpunctella GV PiGV
NutGuard-V FruitGuard-V (AgriVir)
zavíječ paprikový
X
komodita
škůdce
Název viru polyedrózy a jeho zkratka
Biopreparát (výrobce)
Neodiprion sertifer NPV NeseNPV
Monisärmiövirus Biolavirus-NS* (Biola Chelčice)
Gammabaculovirus borovice
Neodiprion sertifer
hřebenule ryšavá
* v současné době není registrován; **v procesu registrace; NPV=Nucleopolyhedrovirus; GV=Granulovirus
XI
D.3 Genom CpGV (Luque a kol., 2001)
XII
D.4 Fotografie okluzních tělísek (OB) z rastrovacího mokroskopu (J. T. Wennmann, JKI Darmstadt)
Okluzní tělíska betabakulovirů tzv. granule na příkladu Cydia pomonella granulovirus (CpGV).
Okluzní tělíska alfabakulovirů tzv. polyedry na příkladu Agrotis segetum nucleopolyhedroviruses (AgseNPV). Uprostřed extrémně velký polyedr, v pozadí jsou polyedry standardní velikosti. XIII
