ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra agroenvironmentální chemie a výživy rostlin

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra agroenvironmentální chemie a výživy rostlin

DISERTAČNÍ PRÁCE

2011

Ing. Michal Jakl

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra agroenvironmentální chemie a výživy rostlin

Vliv rostlinných exudátů na mobilitu těžkých kovů v půdě (disertační práce)

Autor:

Ing. Michal Jakl

Školitel:

doc. Ing. Jiřina Száková, CSc.

Školitel specialista: prof. Ing. Pavel Tlustoš, CSc. RNDr. Ivana Šestáková, CSc. RNDr. PhDr. Ing. Jana Jaklová Dytrtová, Ph.D.

Praha 2011

Prohlášení Prohlašuji, že jsem dizertační práci na téma „Vliv rostlinných exudátů na mobilitu těžkých kovů v půdě“ vypracoval samostatně za použití citované literatury. Výsledky v práci uvedené jsem zjistil popsanými metodami.

V Praze dne 15.8. 2011 ….……….…………..

Poděkování Děkuji za cenné rady, vedení a podnětné připomínky školitelce doc. Ing. Jiřině Szákové, CSc. a školitelům specialistům RNDr. PhDr. Ing. Janě Jaklové Dytrtové, Ph.D. (ÚOCHB AV ČR, v.v.i.), RNDr. Ivaně Šestákové, CSc. (ÚFCHJH AV ČR, v.v.i.) a prof. Ing. Pavlovi Tlustošovi, CSc. (KAVR FAPPZ ČZU v Praze). Paní Ing. Daniele Miholové, CSc. a Ing. Daně Kolihové, CSc. děkuji za spolupráci při spektrometrických analýzách a za poskytnutí prostoru ve stopové laboratoři katedry chemie FAPPZ ČZU v Praze.

Obsah Abstrakt..................................................................................................................8 Úvod.....................................................................................................................10 Hypotézy práce ....................................................................................................12 Cíle práce.............................................................................................................12 1 Teoretická část ...............................................................................................13 1.1 Rizikové prvky v interakci s rostlinou ........................................................13 1.1.1 Transport přes buněčnou membránu ................................................. 13 1.1.1.1 Struktura biomembrány................................................................13 1.1.1.2 Transportní procesy .....................................................................14 1.1.2 Rostlinné exudáty...............................................................................17 1.1.2.1 Nízkomolekulární organické kyseliny ...........................................18 1.1.3 Rostliny v roli akumulátorů a stabilizátorů prvků ................................21 1.2 Technika patch clamp...............................................................................22 1.2.1 Izolace protoplastů .............................................................................23 1.3 Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce ........................26 1.3.1 Sací lysimetry.....................................................................................28 1.3.2 Extrakce .............................................................................................30 1.3.2.1 Jednostupňová extrakce ..............................................................31 1.3.2.2 Postupná extrakce .......................................................................31 1.3.3 Technika difúzního gradientu v tenkém filmu .....................................32 1.3.4 Hydroponické studie...........................................................................33 1.3.5 Dvoufázové hydroponické studie .......................................................34 1.4 Vybrané analytické postupy......................................................................35 1.4.1 Ionty vylučující chromatografie...........................................................36 1.4.2 Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem.........................36 1.4.3 Elektrody pro voltametrická měření....................................................38 1.4.3.1 Uhlíková pastová elektroda..........................................................38 1.4.3.2 Visící rtuťová kapková elektroda..................................................39 1.4.4 Diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie ...........................39 1.4.5 Rozpouštěcí chronopotenciometrie....................................................41 1.4.6 Pseudopolarografie ............................................................................42

1.5 Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí...........................................43 1.5.1 Rostliny hyperakumulující kadmium a zinek ......................................43 1.5.2 Rychle rostoucí dřeviny akumulující rizikové prvky ............................47 2 Metodická část................................................................................................49 2.1 Použité systémy .......................................................................................49 2.1.1 Dvoufázové hydroponické experimenty .............................................49 2.1.2 Nádobový pokus ................................................................................50 2.1.3 Zalesňování v exponované horské oblasti .........................................51 2.2 Charakteristika testovaných půd ..............................................................53 2.3 Instrumentace a analýza ..........................................................................55 2.3.1 Chemikálie .........................................................................................55 2.3.2 Příprava vzorků ..................................................................................56 2.3.2.1 Odběr a rozklad rostlinných vzorků..............................................56 2.3.2.2 Odběr půdních roztoků ................................................................56 2.3.2.3 Aplikace DGT...............................................................................58 2.3.2.4 Odběr a rozklad vzorků půdy .......................................................59 2.3.3 Vlastní stanovení obsahu prvků v půdních a rostlinných vzorcích .....59 2.3.4 Analýzy spojené s detekcí komplexů LMWOAs .................................60 2.3.4.1 Elektrochemické metody..............................................................60 2.3.4.2 Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem...................61 3 Výsledky a diskuse .........................................................................................63 3.1 Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou ..............................................63 3.1.1 Šťavelová kyselina s dusičnanem kademnatým.................................63 3.1.2 Šťavelová kyselina s chloridem kademnatým ....................................65 3.2 Komplexy kadmia a olova se šťavelovou kyselinou..................................67 3.2.1 Šťavelová kyselina s dusičnanem kademnatým a olovnatým ............67 3.3 Komplexy kadmia s citronovou kyselinou .................................................68 3.3.1 Citronová kyselina s chloridem kademnatým .....................................68 3.4 Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou ..................................................70 3.4.1 Jablečná kyselina s chloridem a jodidem kademnatým......................70 3.5 Komplexy v půdním roztoku .....................................................................77 3.5.1 Nádobový pokus s vrbou v kontaminované půdě z lokality Litavka....77 3.6 Dvoufázové hydroponické experimenty....................................................82

3.6.1 Průběžné změny koncentrace vybraných prvků v roztoku .................82 3.6.1.1 Kadmium......................................................................................85 3.6.1.2 Olovo ...........................................................................................87 3.6.1.3 Měď..............................................................................................87 3.6.1.4 Zinek ............................................................................................88 3.6.1.5 Hliník............................................................................................89 3.6.2 Obsah vybraných prvků v rostlinách ..................................................90 3.6.2.1 Kadmium......................................................................................90 3.6.2.2 Olovo ...........................................................................................92 3.6.2.3 Měď..............................................................................................94 3.6.2.4 Zinek ............................................................................................95 3.6.2.5 Hliník............................................................................................96 3.7 Možnosti stanovení mobility prvků v terénu..............................................97 3.7.1 Příjem a přijatelnost prvků olší po aplikaci bazických mouček ........... 97 4 Závěry...........................................................................................................107 5 Seznam zkratek ............................................................................................109 6 Použitá literatura...........................................................................................111

Abstrakt

Abstrakt Tato práce se především zabývá různými analytickými postupy stanovení nízkomolekulárních organických kyselin v přítomnosti rizikových prvků (RP) Cd, Pb, Cu a Zn v půdním roztoku a jemu podobných matricích. Práce směřuje od studia jednodušších, modelových systémů (směsí nízkomolekulárních organických kyselin s kovy), přes hydroponické studie ve dvoufázových systémech po nádobové a v závěru terénní pokusy. Přínosem práce je především nastínění metodiky přímého stanovení komplexů nízkomolekulárních organických kyselin (LMWOAs) s rizikovými prvky pomocí hmotnostní spektrometrie s elektrosprayovou ionizací (ESI-MS) aplikovatelné jak na ideální roztoky, tak i na vodní systémy a v konečném důsledku i na půdní roztoky. Práce též zahrnuje srovnání s přímým stanovením pomocí elektrochemických metod. Právě vzájemné porovnání dostupných analytických technik a jejich kombinace s různými metodami přípravy vzorku a modelovými experimenty umožňuje přesnější popis procesů interakce kořenů rostlin a půdního roztoku. Výsledkem

práce

je

popis

stechiometrie

různých

specií

vybraných

nízkomolekulárních kyselin (šťavelové, citronové a jablečné) s kadmiem. Vzniká tak nová představa o struktuře komplexů, které často neobsahují jako ligandy pouze jednotlivé kyseliny, ale více různých ligandů, tvořících směsné komplexy, ať už se jedná o anorganický ligand, např. Cl-, nebo o transformační produkty jednotlivých kyselin. Závěrem je též navrženo, na základě výsledků z kolizních experimentů ESIMS, schéma možných energeticky závislých přeměn jablečné a citronové kyseliny. Praktickým výstupem je potom zobecnění informací o komplexech rizikových prvků

s LMWOAs

na

environmentální

systémy

různého

stupně

složitosti.

Nejjednodušším systémem byl systém hydroponický, navržený jako dvoufázový, který přinesl mnoho informací o uvolňování kovů do půdního roztoku, příjem kovů rostlinou z roztoku a vliv exudační činnosti rostlin na uvolňování RP do roztoku. Výsledkem byly popisy koncentračních tolerančních optim, průběh koncentračních změn bylo možné popsat polynomem třetího řádu pro většinu sledovaných kovů.

8

Abstrakt

V nádobovém pokusu byly zejména sledovány změny ve složení půdního roztoku z hlediska tvorby komplexů kadmia se šťavelovou kyselinou. Exudační činnost rostlin tak byla sledována v systému již blízkém přírodnímu. Jako environmentálně komplexní systém pro studium mobility kovů v půdě byl vybrán zalesňovací pokus, kde byl hodnocen vliv meliorace bazickými moučkami na mobilitu rizikových prvků v půdě a jejich příjem olší šedou, což je z praktického hlediska poměrně aktuální a častý problém. Bylo potvrzeno, že vápnění zvyšuje koncentraci některých prvků (zejména Cu, Cd, Mn, Al) v nejtenčí kořenové frakci, a že vzrůstá vlivem meliorace absolutní množství většiny RP v biomase. Tento efekt lze zejména přisoudit celkově vyššímu nárůstu biomasy vápněných porostů. Dále bylo potvrzeno pomocí techniky difúzního gradientu v tenkém filmu (DGT), že vápnění zvyšuje přístupnost Al.

9

Úvod

Úvod Studium mobility rizikových prvků v půdě má zásadní důležitost v pochopení a předpovědi možného rizika jejich vstupu do potravních řetězců souvisejících s často dlouhodobým hromaděním v životním prostředí. Mobilita rizikových prvků v půdě je ovlivněna mnoha faktory, které komplikují její jednoznačný popis i odhad. Kromě fyzikálně-chemických procesů ovlivněných samotnou půdní matricí má velký vliv na mobilitu také působení rostlin. Ať již se jedná o zemědělskou plodinu, hospodářskou dřevinu, nivní louku, nebo remediační rostlinu, je nezbytné jejich vliv na mobilitu kontaminantu (ve vztahu k daným půdním vlastnostem, vodnímu režimu a klimatickým podmínkám, případně náhlým vstupům) dostatečně popsat. Fytoremediace představuje dekontaminaci stanoviště in situ pomocí růstu rostlin, a to fixací, akumulací, či rozkladem polutantu. Z ekologického, ekonomického, jakož i sociálního pohledu se ukazuje fytoremediace jako velmi vhodná „čisticí“ metoda a je také často z těchto důvodů doporučována. Složení půdního roztoku ovlivňuje reaktivitu, mobilitu a přístupnost všech prvků v něm obsažených [Nolan et al. 2003]. Rizikové prvky mohou být v půdním roztoku přítomny jako volné ionty, jednoduché anorganické komplexy a komplexy s organickými

ligandy

[Buffle,

Tercier-Waeber

2000;

Ure,

Davidson

2002].

Koncentrace potenciálně rizikových prvků v půdním roztoku a jejich speciace (distribuce jednotlivých prvků mezi jejich různé fyzikální a chemické formy a možné oxidační stavy) má rozhodující vliv na jejich toky v životním prostředí. Jedním z mnoha rostlinných kořenových exudátů, které silně interagují s okolím, jsou nízkomolekulární organické kyseliny. Jejich interakce s půdními složkami jsou natolik komplexní, že nebyly prozatím uspokojivě popsány, přestože ovlivňují přijatelnost, sorpci a vyluhování nejen živin v půdě, ale i rizikových prvků. V důsledku přítomnosti rizikových prvků v půdě (půdním roztoku) dochází ke zvýšené exudaci nízkomolekulárních organických kyselin (nejen jich, jinými exudáty se však tato práce nezabývá), které následně tvoří s rizikovými prvky komplexy. Ty jsou buď transportovány v „netoxické“ formě do buňky, nebo jsou „deponovány“ v půdním roztoku.

10

Úvod

Tato práce se především zaměřuje na metody vhodné k vytvoření komplexního popisu interakce rizikových prvků s rostlinou, která probíhá v půdním roztoku, či v půdě v těsné blízkosti kořenových buněk. Jde především o aplikace přímého stanovéní pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem a metod elektrochemických. V práci je též využita další srovnávací metoda pro detekci nízkomolekulárních organických kyselin v půdním roztoku na základě separace ionty vylučující chromatografií. Též jsou popsány metody izolace protoplastů (pro patch clamp), odběru půdního roztoku pro studium komplexů a stanovení biopřístupných podílů většiny rizikových prvků technikou difúzního gradientu v tenkém filmu.

11

Hypotézy práce

Hypotézy práce 

Cd i Pb tvoří v půdním roztoku (i v modelových roztocích) komplexy s nízkomolekulárními organickými látkami i s anorganickými ligandy.



V jednom komplexu lze očekávat větší množství různých ligandů, stejně jako existenci bimetalických komplexů, jejichž stabilita bude vyšší než u monometalických.



Detekci těchto komplexů v půdním roztoku lze provádět metodikou kombinující citlivou diferenční pulsní anodickou rozpouštěcí voltametrii a selektivní hmotnostní spektrometrii s ionizací elektrosprayem.

Cíle práce 

V půdním roztoku získaném různými způsoby stanovit specie olova a kadmia a zhodnotit vliv použité metody.



Zdokonalit navržený dvoufázový hydroponický systém.



Možnosti speciace v modelovém a půdním roztoku pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie porovnat s možnostmi speciace pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem.



Vytvořit vhodnou metodiku pro speciaci Cd a Pb v půdním roztoku pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem.



Pomocí analýzy půdního roztoku s ohledem na celkový příjem Cd a Pb charakterizovat vliv vybraných druhů rostlin (vrba Smithova, vrba jíva, olše šedá a olše lepkavá) na speciaci Cd a Pb v půdním roztoku.

12

Rizikové prvky v interakci s rostlinou

1 Teoretická část 1.1 Rizikové prvky v interakci s rostlinou Mezi rizikové prvky (RP) patří především tzv. „těžké kovy“ (TK). Označení TK je nejčastěji chápáno (a v různých textech různě definováno) jako označení kovů s hustotou větší než 5 g/cm3 (kadmium, rtuť, olovo [Kafka, Punčochářová 2002]), či jinou, případně dané určitým protonovým číslem, či atomovou hmotností, eventuelně na základě toxicity. Nejednotně a také nesprávně (navzdory IUPAC [Duffus 2002]) se tak mezi TK řadí např. měď, zinek, nikl, arzén a další prvky. V dalším textu bude z hlediska vlivu na organismy požíván souhrnný termín „rizikové prvky“ (RP). Z ekologického, či fyziologického hlediska je možné za toxický (rizikový) považovat prvek, jenž se v daném prostředí (stanovišti) vyskytuje v nefyziologickém (toxickém) nadbytku vzhledem k dané rostlině (či rostlinnému společenstvu). Obecně lze říci, že se většina rostlin (kromě rostlin využívaných k fytoextrakci, tzv. (hyper)akumulátorů) snaží příjmu rizikových prvků nějakým způsobem bránit. Většinou je jejich způsobem obrany exudace komplexujících (chelatačních) látek organické povahy, mezi které patří fenolické látky, aminokyseliny a nízkomolekulární organické kyseliny [Jones 1998; Jones et al. 2003].

1.1.1 Transport přes buněčnou membránu Rostlinnou buňku je možné rozdělit na buněčnou stěnu a protoplast (obsahující buněčné organely) obalený plasmatickou membránou. Zjednodušeně lze říci, že všechny buněčné organely jsou ohraničeny určitým typem biomembrány, jejíž složení je specifické pro jednotlivé organely, ale všechny biomembrány zprostředkovávají důležité životní děje na buněčné úrovni týkající se především transportu látek, transformace energie a komunikace mezi jednotlivými organelami, či buňkami.

1.1.1.1 Struktura biomembrány Základními komponentami biomembrán jsou lipidy (fosfolipidy) a bílkoviny (nejfrekventovanější globulární) v nejčastějším poměru 1:1, dále jsou zastoupeny glykoproteiny, glykolipidy a steroly. Klíčovou vlastností biomembrán z fyzikálně-

13

Rizikové prvky v interakci s rostlinou chemického hlediska je její amfifilní charakter, který předurčuje povahu transportních procesů. Základním „skeletem“ je víceméně souvislá dvojvrstva molekul lipidů, které tvoří „nosnou konstrukci“ pro bílkoviny. Z hlediska vazby bílkovin na fosfolipidový film lze rozlišit membránové bílkoviny na periferní proteiny (jsou připojeny na povrch filmu) a integrální proteiny (jsou zabudovány přímo ve dvojvrstvě lipidů). V současnosti je model biomembrán popisován jako model fluidní mozaiky, což naznačuje, že bílkoviny jsou mozaikovitě zapojeny do fosfolipidového filmu, ve kterém je možný i jejich horizontální posuv. Možnost pohybu bílkovin v lipidovém filmu má zásadní význam

pro

funkci

membrán,

umožňuje

přeskupování

funkčních

proteinů,

inkorporování nových proteinů a též schopnost biomembrán splývat mezi sebou navzájem. Tento jev splývání membrán je možné pozorovat i za laboratorních podmínek, kdy například uměle vytvořená membrána je schopna splynout s vloženou částí plasmatické membrány odebrané ze skutečné buňky [Navrátil et al. 2010]; tento jev zejména vyplývá z fyzikálně-chemických vlastností fosfolipidů, jejichž molekula má hydrofilní a zároveň hydrofobní charakter. Propojení membrán je pak pouze důsledkem „snahy“ molekul fosfolipidů minimalizovat negativní interakce polárního rozpouštědla (zpravidla vodného roztoku elektrolytu, či bioelektrolytu). Klíčovou schopností biomembrán je jejich semipermeabilita, která umožňuje na obou jejich stranách vytvořit (především biochemicky) rozdílné prostředí s různou koncentrací elektrolytů, či živin. Většina funkcí biomembrán je vázána na činnost membránových bílkovin, jsou to: specifická translokace molekul skrz membránu (což je proces, kterému bude dále věnována tato kapitola), dále konverze energie a recepce hormonálních signálů z okolí [Procházka et al. 1998].

1.1.1.2 Transportní procesy Transportní děje lze rozdělit na transporty na dlouhé vzdálenosti a na krátké vzdálenosti; z hlediska pochopení příjmu rizikových prvků rostlinou spřažených s exudací nízkomolekulárních organických kyselin je významný především transport na krátké vzdálenosti, a to zejména transporty přes biomembrány. Lze rozlišit několik principů a mechanismů, které se v těchto dějích uplatňují [Procházka et al. 1998; Voet, Voetová 1995]: 

Prostá difúze, kdy je přenos látek přes membránu řízen různou koncentrací těchto látek uvnitř a vně membrány, kdy skutečnou koncentraci látky

14

Rizikové prvky v interakci s rostlinou v okamžiku jejího vstupu do buňky (nebo ven z buňky) lze vypočítat na základě znalosti difúzního a rozdělovacího koeficientu (poměr koncentrace dané látky v membráně a její koncentrace v okolním prostředí v okamžiku dosažení rovnováhy). 

Usnadněná difúze přes biomembrány probíhá za přispění transportních molekul a vyznačuje se vyšší rychlostí (než prostou difúzí) a specificitou přenosu a je řízena saturační kinetikou (rychlost přenosu dané látky závisí na koncentraci této látky ve vnějším prostředí (vztah Michaelise a Mentenové, jak uvádějí např. [Seuntjens et al. 2004]). Při tomto typu přenosu je možné vysledovat kompetitivní inhibice (látky podobné transportované látce mohou inhibovat její transport tak, že obsadí – saturují přenašečová místa na membráně); dále je možné transport dané látky chemicky inhibovat pomocí látek modifikujících strukturu membránových bílkovin. Usnadněná difúze neboli pasivní zprostředkovaný transport je realizován pomocí o přenašečů, selektivně poutajících přenášenou látku (nejčastěji ion) a o kanálů, jimiž může většina iontů důležitých pro výživu rostliny volně difundovat.



Aktivním transportem se označují buď endergonické procesy přímo spojené s hydrolýzou ATP (nebo s oxidací substrátu na vnitřní straně membrány mitochondrií, či absorpcí fotonu u některých rodů baktérií), pak jde o primární aktivní transport, nebo je k transportu využíván rozdíl elektrochemických potenciálů vzniklý při zajišťování syntézy ATP, pak se jedná o tzv. sekundární aktivní transport. Přechody mohou být obecně elektroneutrální (výsledný rozdíl nábojů přenášených iontů na obou stranách membrány je nulový) a elektrogenický (výsledkem přenosu iontů je změna náboje na obou stranách membrány, a tedy její polarizace, přenos zajišťují elektrogenní pumpy (H+-ATPasa) za souběžné hydrolýzy ATP). Aktivního transportu se může zúčastnit buď jedna molekula (ion), nebo jde o kotransport více různých molekul (iontů): o uniport – přenos jedné molekuly (iontu), o symport – přenos dvou různých molekul (iontů) stejným směrem, o antiport – jedna přenášená látka je transportována dovnitř, druhá vně.

15

Rizikové prvky v interakci s rostlinou Pokud již k příjmu rizikových prvků v různém množství dochází, lze říci, že RP může být do buňky transportován v iontové podobě (jako kation), k čemuž bude využito usnadněné difúze a přenašeči budou především iontové kanály a přenašeče určené pro přenos živin [Rosypal 2006], nebo i ve formě komplexu s rostlinným exudátem [Jaklová Dytrtová et al. 2009b; Jaklová Dytrtová et al. 2008], kdy bude využita nějaká forma aktivního transportu. Zejména druhý mechanismus nebyl dosud v literatuře uspokojivě doložen; není zcela objasněno, které přenašeče, či jiné (snad i specifické – u hyperakumulátorů) procesy se zde uplatňují. Především zajímavý je typ přenosu poháněný protonmotorickou silou [Michelet, Boutry 1995]. Tato energie vytvořená H+-ATPasou se využívá k symportu sacharidy/H+ nebo aminokyseliny/H+. Nízkomolekulární organické kyseliny se dostávají z buňky zejména pomocí exudace aniontovými kanály za současného uvolňování kationtů [Jones 1998; Neumann, Römheld 2007] (obr. 1). Bylo prokázáno, že sekundární transport umožněný aktivitou H+-ATPasy je častý zejména v kořenových buňkách, nejvíce pak v kořenové čepičce. Je možné, že podobný mechanismus je využit i pro transport komplexů rizikových prvků s nízkomolekulárními organickými kyselinami dovnitř buňky. Cytoplasma (pH 7,0) Pasivní difúze Tok iontovým kanálem ATP-H + pumpa

Půdní roztok (pH 5,5)

Obr. 1. Transport látek přes buněčnou membránu ve směru exudace [Jones 1998] (autor ilustrace J.J. Dytrtová).

16

Rizikové prvky v interakci s rostlinou

1.1.2 Rostlinné exudáty Exudace kořeny je aktivním projevem každé rostliny ve snaze ovlivňovat, měnit a přizpůsobovat vnější prostředí. Chemicky lze rostlinné exudáty (tab. 1) rozdělit na sacharidy, aminokyseliny, organické kyseliny, mastné kyseliny, enzymy, alkoholy (fenoly), anorganické látky [Adriano 2001]. Z fyziologického hlediska se jedná především o látky zajišťující homeostázi (anorganické ionty), výživu a jsou též důsledkem změn vnějšího prostředí, zpravidla odklon od optimálních (fyziologických) podmínek, jako je nefyziologická koncentrace rizikových látek, nedostatek kyslíku, či živin [Procházka et al. 1998]. Tab. 1. Přehled hlavních rostlinných exudátů [Adriano 2001] Skupina chemických látek Sacharidy

Jednotlivé komponenty Arabinosa, fruktosa, galaktosa, glukosa, maltosa, rafinosa, rhamnosa, ribosa, sacharosa, xylosa

Aminokyseliny, amidy

Všech 20 kódovaných aminokyselin, aminobutanová k., homoserinová k., cystathionin

Alifatické kyseliny

Octová, butanová, citronová, fumarová, glykolová, jablečná, maleinová,

šťavelová,

propionová,

jantarová,

vinná,

valerová Aromatické kyseliny

4-hydroxybenzoová, gallová, protokatechuová, syringová, vanilová, kávová, kumarová, ferulová, sinapová, salicylová

Mastné kyseliny

Linolová, linolenová, olejová, palmitová, stearová

Steroly

Campesterol, cholesterol, sitosterol, stigmasterol

Enzymy

Amylasy,

deoxyribonukleasy,

invertasy,

peroxidasy,

fosfatasy, ribonukleasy Ostatní

Vitamíny, regulátory růstu, auxiny, cytokininy, gibereliny, inhibitory a další

Problematika rostlinných exudátů je stále se rozšiřující náplní vědeckého bádání; na www.sciencedirect.com bylo nalezeno téměř 5 tisíc publikací s klíčovým slovem „plant exudates“, přičemž počet článků publikovaných za jeden rok často přesahuje 300. V článcích jsou hodnoceny kořenové exudáty z mnoha aspektů růstu rostliny

17

Rizikové prvky v interakci s rostlinou (výživa, stres), i z hlediska fytoremediací. Následující text se zaměřuje na nízkomolekulární organické kyseliny, které byly v této práci sledovány a studovány.

1.1.2.1 Nízkomolekulární organické kyseliny Organické kyseliny s nízkou molekulovou hmotností (LMWOAs) představují významný produkt exudace kořenů rostlin do půdy z hlediska účinku, zároveň je jejich nejčastějším zdrojem v půdě právě kořenová exudace, spolu s mikrobiální aktivitou [Jones 1998; Jones et al. 2003]. Zjednodušeně lze hlavní toky a depozice LMWOAs vyjádřit schématem, obr. 2 [Jones 1998].

Obr. 2. Vztah mezi LMWOAs exudovanými kořeny a půdními procesy. LMWOAs zahrnují hlavně alifatické kyseliny, méně často i aromatické. Nejběžněji jsou do půdy vylučovány kyseliny zúčastňující se Krebsova cyklu, především citronová (CA), jantarová, fumarová, jablečná (MA) kyselina, dále z cyklu mastných kyselin mravenčí (FA), octová (AA), propionová kyselina, stejně tak i šťavelová (OA), mléčná, L-vinná kyselina (obr. 3) a další. V relativně vysokých koncentracích byly v půdním roztoku řady rostlinných druhů nalezeny zejména šťavelová a citronová kyselina [Jones 1998; Srivastava et al. 1999]. Pro odhad vazebných možností příslušných kyselin je v prvé řadě třeba znát jejich strukturu, proto je zde uvedena, spolu s často používaným triviálním názvem (obr. 3).

18

Rizikové prvky v interakci s rostlinou O O

O

C

C

O H3C

OH H3C

H

mravenčí

octová

C H2

OH

CH3

mléčná

O

C C

OH

propionová

O HO

CH

C

OH

C

HO

H2 C

HO

OH

C

O

O

C C H2

H C

OH OH

O

šťavelová

C

C

C H

OH

O

jantarová

fumarová HO

OH HO

O

CH C

OH

C C H2

O

OH

OH

C O

jablečná

C

O C

CH CH

O

OH O

OH

L-vinná

H2C

C

C

OH OH

CH2 C

O

HO

citronová

Obr. 3. Strukturní vzorce nejčastěji exudovaných LMWOAs. Ionty LMWOAs se podílejí na mnoha procesech v rhizosféře, zahrnujících získávání živin, detoxikaci kovů, zmírnění anaerobního stresu kořenů, minerální zvětrávání a atrakci patogenů [Curl, Truelove 1986; Fox 1995; Jones 1998; Marschner 1995], ale jsou také spolu s huminovými kyselinami a fulvokyselinami součástí pufračních mechanismů [Bergelin et al. 2000]. Disociované karboxylové kyseliny nesoucí alespoň jeden záporný náboj mohou vytvářet s rozpuštěnými kationty kovů jak soli, tak i komplexy a ovlivňovat tak mobilizaci, rozpustnost a příjem kovů rostlinou [Uren, Reisenauer 1988] (obr. 4).

19

Rizikové prvky v interakci s rostlinou

Nadzemní část rostliny Kořeny rostliny Půda Rostlinné exudáty Příjem

OA AA Cu

As

CA

MA

Al

Pb

Cd-MA

Cd

Sorpční komplex

Obr. 4. Schéma interakce rizikových prvků s rostlinnými exudáty v půdě; AA – octová, CA – citronová, MA – jablečná, OA – šťavelová kyselina ([Jones 1998]; autor ilustrace J. J. Dytrtová). Obecně jsou organické kyseliny považovány za kyseliny slabé, či středně silné; stupeň

disociace

(charakteristický

pro

každou

kyselinu

jejími

disociačními

konstantami, pKa) bude tedy velmi záviset na pH prostředí. V kyselém prostředí (pH nižší než je pKa kyseliny) se bude daná kyselina vyskytovat spíše v nedisociované neutrální formě, někdy při extrémně nízkém pH i jako kladně nabitá (když přijala H+ od silnější kyseliny, což je princip pufrování půd s extrémně nízkým pH). Pro pochopení významu LMWOAs při detoxikaci RP je důležité si uvědomit, že komplexy s prvky přechodných kovů může LMWOA tvořit i v neutrálním stavu (při nízkém pH vazbu zprostředkovávají d orbitaly přechodného kovu, tzv. vazba dativní), tedy i při nízkém pH. Znalost stechiometrie komplexů RP s LMWOAs může pomoci v charakterizaci interakce těchto komplexů s buněčnou membránou a jejich transportu do buňky. Informace o stabilitě zase napoví, zda bude mít komplex spíše přechodné trvání, tedy tendenci se v protoplastu rozpadnout, či nikoli. Dále je zajímavé zjistit, zda RP s LMWOAs tvoří pouze monoligandové komplexy nebo se na tvorbě komplexů podílí i anorganické anionty vždy přítomné v půdním i rostlinném prostředí (např. Cl-).

20

Rizikové prvky v interakci s rostlinou

1.1.3 Rostliny v roli akumulátorů a stabilizátorů prvků Toto rozdělení vybraných rostlin bylo vytvořeno na základě dvou protichůdných strategií fyroremediace půd; fytoextrakce a fytostabilizace [Kidd et al. 2009]. V souvislosti s fytoextrakcemi rizikových prvků z půdy se často pro specifické rostliny používá označení „hyperakumulátor“ [Kumar et al. 1995]. Tento termín použili poprvé Brooks et al. [1977] pro rostliny hromadící nikl v koncentracích nad 1 g/kg sušiny

biomasy.

Limitní

koncentrace

v biomase

pro

zařazení

rostlin

mezi

hyperakumulátory je však pro každý prvek (kov) jiná, proto jsou obecně definovány jako rostliny s obsahem vybraného prvku (kovu) výrazně vyšším, než je v půdě, nebo jiné (neakumulující) rostlině [Boyd 2007]. Pokud není při vlastní fytoextrakci klíčová koncentrace, ale absolutní pojmuté množství, je též možné takto využít rostlin s velkým nárůstem biomasy [Pulford, Watson 2003]. K tomu lze navíc využít chemicky asistovanou (indukovanou, usnadněnou,

podporovanou)

fytoextrakci

přidáváním

různých

syntetických

chelatačních činidel (EDTA, EDDS) do půdy [Komárek et al. 2008; Salt et al. 1998]. Oproti tomu rostliny, které omezují mobilitu rizikových prvků v půdě, tedy zejména jejich biopřístupnost [Vangronsveld et al. 1995], lze nazývat “fytostabilizátory”. Obecně platí, že musí být kořenový systém schopen zadržet a tolerovat vysoké koncentrace rizikových prvků [Dominguez et al. 2009], a to i v symbióze s kořenovými bakteriemi. Cílem fytostabilizace je pak vytvořit na kontaminované lokalitě plný vegetační pokryv z převážně tolerantních rostlin ke konkrétnímu druhu kontaminace [Wenzel et al. 1999].

21

Technika patch clamp

1.2 Technika patch clamp Tato technika (někdy překládaná jako „technika terčíkového zámku“) je elektrofyziologickou technikou umožňující studovat jak výslednou aktivitu iontových kanálů v celé buňce, tak i jednotlivé iontové kanály na buněčné membráně. Poskytuje přímé informace o membránové struktuře iontových kanálů, např. kolik proudu prochází jedním iontovým kanálem, jak dlouho zůstává kanál otevřený, jak závisí doba jeho otevření a zavření na napětí, na aktivující molekule a další. Obvykle je uplatňována při studiu elektrochemických aktivit neuronů, svalových vláken a beta buněk pankreatu, bakteriálních iontových kanálů. Klasické uspořádání patch clamp (vyvinuto E. Neherem a B. Sakmannem; Nobelova cena r. 1991 v oblasti fyziologie a medicíny) sestává z tenké skleněné pipety s otevřeným tupým zakončením („hrdlo láhve“) s průměrem v řádu μm. Vnitřek pipety je naplněn různými elektrolyty (pipetový roztok) v závislosti na použité technice. Například pro tzv. „whole cell“ záznamy se používá roztok blízký složení intracelulární tekutiny. Vhodná elektroda je v kontaktu s vnitřním roztokem a elektrické

signály

jsou

přiváděny

k vyhodnocovacím

elektrickým

obvodům

(operačnímu zesilovači, potenciostatu atd.). Mikropipeta s elektrodou je natlačena proti membráně, která je podtlakem nasáta dovnitř hrotu elektrody. Již mírný podtlak způsobí pevné připojení membrány k elektrodě (tzv. "gigaohm seal", protože elektrický odpor takto vytvořené soustavy se pohybuje v řádu G). Měření proudu probíhá v tzv. voltage-clamp módu [Molleman 2003], kde je konstantní a kontrolované napětí (clamped) a měří se proud vznikající prostupem iontů přes fosfolipidovou membránu, proud, kterého je třeba k udržení daného napětí na konstantní hodnotě (proudová měření). Proudy měřené touto metodou jsou řádově v rozsahu pikoampér až mikroampér, tedy v oblasti, ve kterých se pohybuje obvyklý šum nejcitlivějších běžných elektrochemických metod. V dalším možném uspořádání, v tzv. current-clamp módu [Molleman 2003], se provádí napěťová měření – membránový potenciál je měřen při „nulovém“ proudu vhodnou elektrodou. Přestože

žádná

varianta

neodpovídá

přirozeným

podmínkám,

jedná

se

o přijatelnou aproximaci, neboť držení napětí na konstantní hodnotě eliminuje kapacitní proud a proudy, které tečou přes membránu, jsou úměrné pouze

22

Technika patch clamp membránové vodivosti, tzn. počtu otevřených iontových kanálů. Měření proudu lze provádět několika způsoby, z nichž každý má své výhody a nevýhody. Při těchto měřeních se používá v závislosti na typu měření buď jedné, nebo dvou elektrod. Liší se také např. v tom, pro buňky jakých rozměrů jsou užívány. Pro velké buňky nebo plochy se používá spíše dvouelektrodový voltage clamp, pro malé diskontinuální jednoelektrodový voltage clamp (dSEVC). U tohoto typu probíhá měření napětí a procházejícího proudu pomocí jedné pipety [Navrátil et al. 2010]. Techniky se dále rozdělují podle polohy pipety a membrány a podle účelu měření na tzv. „excised patch“ (odtržený výstřižek membrány), „cell attached“ (pipeta přitisknutá k buňce) a „whole-cell“ (měření na celé buňce) techniky. Vytržené terčíky se ještě dělí na „inside-out“ (vnitřek ven) a „outside-out“ (vnějšek ven). Techniky přiložené i vytržené membrány se používají ke studiu jednoho nebo několika iontových kanálů na výřezu membrány přitisknuté k elektrodě [Molleman 2003]. Celobuněčná měření umožňují registrovat membránové proudy celé buňky, které představují sumu jednotkových proudů vznikajících aktivací/deaktivací jednotlivých iontových kanálů. Lze registrovat i membránové proudy vznikající aktivací napěťově nebo chemicky řízených iontových kanálů na různých úrovních membránového potenciálu a určit hodnotu, při níž dochází ke zvratu polarity odpovědí. Tato hodnota má velký význam při zjišťování selektivity propustnosti kanálů pro různé ionty i při analýze jejich vlastností [Navrátil et al. 2010].

1.2.1 Izolace protoplastů Izolace nativních protoplastů rostlinných buněk spočívá v uvolnění buněk z pletiva, odstranění buněčné stěny a separaci. Takovouto nativní buňku ohraničenou pouze plasmatickou membránou je pak možné použít pro měření odezvy rostlinné buňky na vnější změny koncentrace chemických látek pomocí techniky patch clamp (obr. 5). Odezvy rostliny jsou obvykle měřeny uvnitř buňky jako změny potenciálu vůči vnějšímu prostředí. Je možné stanovit jak celkovou změnu potenciálu, tak změny pro každý ion [Ujec et al. 1980].

23

Technika patch clamp

Obr. 5. Část zařízení pro studium buněčné odezvy technikou patch clamp a detail izolovaných protoplastů v mikroskopu (foto autor). Postup a činidla vlastní izolace nativních protoplastů se liší v závislosti na typu preparátu, použité rostlině a strategii [Babaoğlu 2000; Bhojwani, Razdan 1996; BlomZandstra et al. 1995; Divakaran et al. 2008; Kanchanapoom et al. 2001]. Pro listy rostlin je obecně nejběžnější postup, který je zde uveden především pro pochopení jeho principu: 

Odříznutí listů, mechanické odstranění epidermu pomocí smirkového (karborundového) papíru, nylonového kartáčku, či seškrábání nožem a nařezání na tenké plátky (0,5 – 1 mm).



Přiměřené množství plátků je pak na několik hodin (většinou 2 – 24 h) ponořeno do loužicího média, které obsahuje enzymy trávící celulosu a pektiny a oddělující buňky (Cellulase Onozuka R10, Macerozyme R10), sacharid pro zachování osmomolarity (D-sorbitol nebo mannitol), aby nedošlo k plasmolýze nebo prasknutí buňky, pufr pro úpravu kyselosti prostředí na pH 5,5 – 6,0 (MES – morfolinoethansulfonová kyselina s KOH) a CaCl2, případně KCl a MgCl2, jako zdroj iontů. Někdy je výhodné loužicí medium vyměňovat po 1 hodině,

aby

se

obměnily

enzymy

inaktivované

látkami

uvolněnými

z poškozených buněk. Také se u různých postupů operuje s různými teplotami (12–37 °C) a režimem osvitu.

24

Technika patch clamp 

Po ukončení inkubace je loužicí médium opatrně odstraněno. Obsahuje pouze malé množství funkčních protoplastů a nevyužívá se.



Dalším, vymývacím roztokem, který má stejné složení, ale neobsahuje enzymy, jsou několikrát plátky protřepávány a zachycovány na hrubém sítu (0,5 – 1 mm). Filtrát obsahující vymyté protoplasty je dále čištěn od nerozloženého materiálu a pletiva na jemnějším sítu (100 – 200 μm).



Protoplasty jsou ve filtrátu usazovány na dně nádoby centrifugací (50 – 100 x g). Supernatant je odstraněn.



Jelikož usazenina obsahuje značné množství chloroplastů a poškozených a neodhalených buněk, je výhodné ji ještě před vlastním využitím přečistit. K tomu se využívají celkem 3 roztoky stejné jako vymývací roztok, pouze s náhradou části látkového množství původního sacharidu (D-sorbitolu) jiným sacharidem (sacharosou). Pro oddělení je totiž žádoucí, aby byly vytvořeny v centrifugační zkumavce tři vrstvy v gradientu hustoty od nejvyšší, kde jsou na počátku resuspendovány protoplasty (sacharosa), přes střední (sacharosa + D-sorbitol) po nejnižší.



Soustava je následně odstředěna (300 x g), protoplasty jsou z horní vrstvy odsáty do pracovního roztoku.

Jiný postup naopak změnu osmomolarity využívá k „nafouknutí“ a smrštění protoplastů a následně jejich snadnějšímu uvolnění jak z pletiva, tak buněčné stěny. Tím však může dojít ke snížení kvality a vitality izolovaných protoplastů pro měření. V rámci hledání vhodného postupu izolace protoplastů z buněk listů hrachu a buněk listů a kořenů penízku modravého bylo k přípravě využito [Navrátil et al. 2010] 2 odlišných protokolů [Kyseláková 2007; Pineros, Kochian 2003]: aplikace pouze enzymů nebo aplikace enzymů v kombinaci s osmotickým uvolněním buněčných stěn. Takto připravené protoplasty lze následně využít pro měření např. technikou “whole cell”, “perforated patch” nebo “isolated patch”. Pomocí vtlačení ostré kapiláry je možné připravit reálnou fosfolipidovou dvojvrstvu (PBL) s iontovými kanály, které mohou být také zabudovány do PBL membrán.

25

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce

1.3 Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce Před vlastním popisem jednotlivých technik odběru je třeba definovat, co vlastně představuje termín „půdní roztok“ a „půdní výluh“. Půdní roztok je kapalná složka půdy (půdní voda, či pórová voda) obsahující rozpustné anorganické anionty (NO3-, Cl- atd.) a kationty, organické sloučeniny (aminokyseliny, sacharidy, extracelulární enzymy), volné ionty rizikových prvků a jejich komplexy s organickými ligandy a další [Buffle, Tercier-Waeber 2000; Jones et al. 2003; Kabata-Pendias 2001]. Složení této poměrně složité biologické matrice je závislé na mnoha faktorech; na typu, zásobenosti a kontaminaci půdy, na činnosti rostlin v ní pěstovaných (obr. 6), samozřejmě na termodynamických procesech ovlivněných redox potenciálem, pH, teplotou a také na vlastní půdní vlhkosti a vodozádržné kapacitě dané strukturou a texturou půdy.

Příjem a uvolňování látek rostlinou Formace a dekompozice organické hmoty

Precipitace a vznik minerálů

Půdní roztok

Adsorpce a výměna s organickou hmotou

Fixace a uvolňování látek mikroorganismy

Výměna a adsorpce minerálních složek

Výměna s plynnou fází

Obr. 6. Komplexní procesy probíhající mezi půdními kompartmenty a půdním roztokem (upraveno dle [Kabata-Pendias 2001]).

26

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce Síla, kterou je voda poutána v půdě (obr. 7), ovlivňuje její přístupnost rostlinám, a tedy i hmotový tok látek v ní rozpuštěných. Síla vazby pórové vody v pórech je závislá na velikosti pórů: čím jsou menší, tím je voda zadržována silněji, a tím se zvyšuje množství nepřístupné pro rostliny.

Obr. 7. Rozdělení potenciálů půdní vody zadržované v okolí půdních částic [Conklin 2005]. Odběr půdního roztoku představuje ve speciační analýze možnost sledovat interakce půda-rostlina in situ, bez narušení rovnováh [Grossmann, Udluft 1991]. K odběrům půdního roztoku se používají různé vzorkovací techniky, které se od sebe vzájemně liší svými metodickými aspekty. Nejdůležitějším z nich je intenzita, jakou je půdní roztok odebírán, a proto mohou různé techniky poskytovat odlišné údaje o složení takového půdního roztoku [Nambu et al. 2005]. Terminologicky zde dochází ke sjednocení „nativního“ půdního roztoku s roztokem více či méně „vytrženým“ ze systému. Markantnější rozdíl nastane při krátkodobém přídavku demineralizované vody pro zajištění dostatečného obsahu vody pro odběrovou techniku. Ta se pak může stát extraktantem a roztok by měl být již nazýván „vodný výluh“.

27

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce Výběr vzorkovací techniky není závislý pouze na přístupnosti půdního roztoku, tedy zda je možné ho získat přímo, či nikoli. Spolu se vzorkováním je třeba se také zabývat změnami vlivem instalace aparátu a v průběhu vlastního odběru vzorku, jako jsou změny termodynamických rovnováh v půdě, možná sorpce analytu na vzorkovacím aparátu, vysrážení, zakoncentrování, ředění, narušení půdní struktury atp. Zejména v případě speciačních studií interakcí rizikových prvků s LMWOAs je potenciální

narušení

termodynamických

rovnováh

během

vzorkování

velmi

komplikujícím faktorem. Kromě uvedeného se samozřejmě z širšího hlediska na složení půdního roztoku projevují další významné faktory jako je prostorová heterogenita celého stanoviště, vliv aktuálních podmínek (teplota, srážky, odplavování) a další. O jednotlivých běžných technikách používaných k získání půdního roztoku a půdních výluhů bylo blíže pojednáno v Rigorózní práci [Jakl 2010], kde byly zmíněny: gravitační (beztlaké) lysimetry, odvodňovací strouhy (drenáž), sací lysimetry, sací mikro-lysimetry, centrifugace, extrakce (jednostupňová i postupná extrakce), hydroponické studie a pilotně dvoufázové hydroponické studie. Dále budou již zmíněny pouze techniky použité v této práci.

1.3.1 Sací lysimetry Aplikací tzv. sacích lysimetrů je možné sáním získat méně přístupnou půdní vodu zachycovanou tlakovým potenciálem zhruba mezi -6 a -50 kPa [Nambu et al. 2005]. Tyto lysimetry jsou použitelné pro odběr vody zachycené v makropórech v případě plné saturace. Makropórní voda představuje kombinaci dešťové, závlahové a průsakové vody z povodí, vody ze splachů a vody zadržované v půdní matrici [Booltink, Bouma 1991]. Množství makropórní vody získané lysimetry závisí na půdních vlastnostech, jako je struktura, textura a vlhkost, závisí též na vlastní konstrukci lysimetru. Vzhledem k uvedeným skutečnostem se může výsledný roztok získaný touto technikou značně lišit od půdních roztoků získaných jinými vzorkovacími technikami [Zabowski, Ugolini 1990]. Sací lysimetry jsou porózní sondy z keramiky, skla, či nylonu, které se používají k vzorkování půdy in situ. Výhoda spočívá v tom, že jsou schopny do jisté míry

28

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce simulovat nasávání vody kořeny rostlin. Má to ovšem několik omezení. Vynaložený tlak, aby skutečně došlo k nasátí vzorku, musí být vyšší, než je kapilární tlak půdy, který je ovšem u každé půdy jiný. Na druhou stranu příliš vysoký podtlak může způsobit chemické změny odebíraného vzorku půdní vody. Beier a Hansen [1992] doporučují nejvyšší tlak nasávání 40 kPa. Dalším nezanedbatelným aspektem při vzorkování je sorpce chemických látek v půdním roztoku na povrch lysimetru. Materiál je tedy důležité vhodně vybrat a předem testovat [Litaor 1988]. Adsorpci rizikových prvků lze na základě testování [McGuire et al. 1992; Wenzel et al. 1997] seřadit podle její klesající síly v pořadí materiálů: keramický > nerezový > skleněný = polytetrafluorethylenový. Také intenzita sorpce jednotlivých kovů je různá, klesá v pořadí: Zn >> Co > Cr > Cd. Podle požadavků na odběr bylo vyvinuto mnoho lysimetrů různé konstrukce, lišících se především tvarem, velikostí, použitým materiálem, reprodukovatelností a obnovitelností (např. [Rausch et al. 2006; Wenzel, Wieshammer 1995]). Liší se také způsob aplikace. Jeden příklad umístění, vhodný zejména pro krátkodobé vzorkování, spočívá v bočním vpichu lysimetru do půdního profilu. Systém byl vyvinut firmou Prenart (Dánsko; www.prenart.de) a je používán na řadě především evropských pracovišť pro sledování mobility prvků v půdním profilu. Nejprve je proveden dostatečný odkop zeminy, následně je odtud nerezovou trubkou vytvořen boční otvor v nenarušeném profilu pro vsunutí vlastní sondy. Ta je válcovitého tvaru se špičatým koncem, opatřena dostatečně dlouhou hadičkou pro sání vzorku, je vyrobena z odolného teflonu a porézní keramiky. Vtláčí se menší trubkou, v níž je vedena hadička. Poté je otvor pro zajištění kontaktu s okolím a dostatečného sání zalit suspenzí oxidu křemičitého (obr. 8a). Po ustavení rovnováhy je napojena přes jímací lahev na hadičku pumpa a podtlakem (-85 kPa) je půdní voda nasávána (obr. 8b).

29

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce a

b

Obr. 8. Aplikace krátkodobého lysimetru v terénu (foto autor, 2009). Mezi dalšími zařízeními komerčně dostupnými je možné doporučit např. vzorkovač Rhizon nebo půdní sondy od Gottfried Wiesshammer (Rakousko), či UMS (Německo).

1.3.2 Extrakce Extrakce půd se uplatňuje v případech, kdy je třeba získat roztok ze suchých půd, nebo půd s heterogenním rozložením půdní vody, tedy tam, kdy není principiálně možné použít lysimetrů nebo centrifugace [Strobel 2001]. Do jisté míry se dá vodný výluh považovat za roztok podobný půdnímu roztoku, o extrakci se v tomto případě hovoří, pokud je přidáno vody více, než je maximální vodozádržná kapacita dané půdy (půdního profilu). Často se využívá také v případech, kdy je zkoumána jiná než vodná frakce, eventuelně při zařazení celé postupné extrakce. Pro stanovení různých frakcí se používá celá řada extrakčních činidel o různé iontové síle a hodnotě pH. Pro odběr výluhů se používá oddělovací kolona, či klasická extrakce výtřepem extrakčním činidlem a dále filtrace, odstředění, nebo usazení. Pro extrakci LMWOAs se jeví jako nejvhodnější extrakční činidlo voda, jelikož dochází k minimálnímu narušení půdního systému.

30

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce 1.3.2.1 Jednostupňová extrakce Jednostupňová extrakce je nejčastější způsob, jak jsou podklady pro odhad biopřístupné frakce rizikových prvků v půdě získávány. Je využíváno široké spektrum extrakčních činidel [Meers et al. 2007], často jde zároveň o první krok postupné extrakce. Běžně je na základě doporučení BCR používána pro extrakci rostlinou přijatelné (biopřístupné) frakce 0,11 mol L-1 octová kyselina, nebo 0,01 mol L-1 CaCl2 [Degryse et al. 2003], 1 mol L-1 NH4NO3, 0,43 mol L-1 octová kyselina, 0,05 mol L-1 EDTA při pH 7, voda, nebo 1 mol L-1 MgCl2 [Tessier et al. 1979]. Metody jsou neustále porovnávány, testovány, modifikovány pro různé prvky, půdy i rostliny. Nejuniverzálnější, jednoznačně determinující extrahovadlo dosud nebylo nalezeno, je publikováno mnoho prací, které mají vzájemně protichůdné závěry a navržené postupy tak pro daný systém vyvrací.

1.3.2.2 Postupná extrakce Pro stanovení různých frakcí rizikových prvků bylo vyvinuto mnoho různě modifikovaných i originálních metodik postupné extrakce, které se obvykle odvíjí od vhodnosti aplikace na danou analyzovanou matrici půdy. Nabízí se možnost použít některou z metod postupné extrakce při posuzování vlivu rostliny na zastoupení prvků, tj. na jejich mobilizaci/imobilizaci, v jednotlivých půdních frakcích opakovaným vzorkováním stejné půdy v průběhu vegetace. Vybrané metodiky jsou uvedeny a porovnávány např. v Krishnamurti et Naidu [2007], Quevauviller [2002], Wenzel et al. [1995], Beckett [1989], Zimmerman et Weindorf [2010]. Z nejdůležitějších (nejpoužívanějších) lze uvést následující postupy stanovení frakcí rizikových prvků v uvedených publikacích: 

Tessier et al. [1979] – 1 mol L-1 MgCl2 (výměnná); 1 mol L-1 CH3COONa (uhličitanová); 0,04 mol L-1 NH2OH.HCl v 25% CH3COOH (Fe/Mn oxidy); 0,02 mol L-1 HNO3, 30% H2O2, 3,2 mol L-1 CH3COONH4 (organicky vázaná); 2x 70% HNO3, 40% HF / 72% HClO4 (residuální),



Zeien et Brümmer [1989] – 1 mol L-1 NH4NO3 (výměnná); 1 mol L-1 CH3COONH4 při pH 6 (specificky adsorbovaná); 0,1 mol L-1 NH2OH.HCl, 0,1 mol L-1 HNO3 (Mn oxidy); 0,2 mol L-1 (COONH4)2 při pH 3,25 (amorfní Fe oxidy); 0,1 mol L-1 askorbová kyselina, 0,2 mol L-1 (COONH4)2 při pH 3,25

31

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce (krystalické Fe oxidy); 0,025 mol L-1 NH4EDTA při pH 4,6 (organicky vázaná); konc. HNO3, nebo konc. HClO4, nebo konc. HClO4/HF (residuální), 

Wenzel et al. [2001] – 0,05 mol L-1 (NH4)2SO4 (výměnná); 0,05 mol L-1 (NH4)H2PO4 (specificky vázaná); 0,2 mol L-1 (COONH4)2 při pH 3,25 (amorfní Fe oxidy); 0,1 mol L-1 askorbová kyselina, 0,2 mol L-1 (COONH4)2 (krystalické Fe oxidy); konc. HNO3, H2O2 (residuální); metoda vyvinutá speciálně pro frakcionaci As.



Kaasalainen et Yli-Halla [2003] na základě BCR – 0,11 mol L-1 CH3COOH (výměnná a specificky adsorbovaná); 0,5 mol L-1 NH2OH.HCl při pH 1,5 (Fe/Mn oxidy a hydroxidy); 8,8 mol L-1 H2O2 při pH 2-3, 1 mol L-1 CH3COONH4 při pH 2 (uvolněná oxidací); aqua regia (residuální, ISO 11466 [1995]).

V práci Bacon et Davidson [2008] byla srovnávána metoda dle Tessier et al. [Tessier et al. 1979] s původní a upravenou metodou BCR a kriticky zhodnoceno použití metod postupné extrakce frakcí rizikových prvků. Metody postupné extrakce také hodnotí souborně Filgueiras et al. [2002] a Zimmerman et Weindorf [2010]. Z těchto přehledných prací vyplývá, že vzhledem k široké škále extrakčních činidel používaných v rámci jednotlivých metod a nedostatečné selektivitě těchto metod je odhad podílu prvku vázaného na jednotlivé složky půdy jen informativní.

1.3.3 Technika difúzního gradientu v tenkém filmu Tato separační a prekoncentrační technika využívající difúzní gradient v tenkém filmu (diffusive gradient in thin films; DGT) byla vyvinuta v roce 1994 pro potřeby sledování obsahu rizikových prvků ve vodách [Davison, Zhang 1994]. Možnosti jejího využití se rozšířily na stanovení labilní (biopřístupné) frakce kovů v sedimentech [Diviš et al. 2003], půdách [Diviš et al. 2005; Harper et al. 1999; Řezáčová-Smetková et al. 2005] a v půdním roztoku [Jaklová Dytrtová et al. 2008]. Technika DGT je založena na Fickových zákonech difúze, kdy množství sorbovaného prvku (kovu) na sorpční (iontoměničový) gel (Mt) závisí přímo na jeho koncentraci v okolním prostředí (vodě, půdě, sedimentech, či půdním roztoku) (Cb), době expozice (t), ploše (A), nepřímo na tloušťce celé difúzní vrstvy (δ), tedy tloušťce difúzního gelu (Δg) a tloušťce vznikající hraniční difúzní vrstvy, tzv. DBL (δh) (Zhang

32

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce et Davison, 1995). Směrnicí této závislosti je difúzní koeficient (D), který závisí na teplotě a je charakteristický pro každou látku.

h g 1   M t DC b tA DC b tA Pro charakterizaci difúze se často používá také veličina difúzní tok (F), vyjadřující koncentrační gradient sledovaného elementu [Salvador et al. 2006]:

F

Mt . At

Difúze RP difúzním gelem a jeho množství zachycené na sorpčním gelu závisí nejen na celkové koncentraci RP v matrici, ale také na síle vazby prvku na jednotlivé komponenty matrice [Gimpel et al. 2001]. Různě složitá matrice se stejnou celkovou koncentrací RP tedy může obsahovat různá množství labilních forem RP. Při použití techniky DGT na roztoky obsahující kadmium a nízkomolekulární organické kyseliny běžně se vyskytující v půdním roztoku (octová, šťavelová a citronová) bylo prokázáno, že svou přítomností snižují míru zachycení kadmia na sorpčním gelu ve srovnání s roztokem Cd bez přítomnosti těchto ligandů [Jaklová Dytrtová et al. 2009a]. Velikost sorpce je charakterizována příslušnými difúzními toky Cd v roztocích s různou koncentrací sledovaných kyselin. S vyšší koncentrací kyselin v roztoku dochází ke snižování množství Cd zachyceného na sorpční gel. Důvodem je tvorba komplexů testovaných kyselin s Cd. V důsledku jejich rozpadání během sorpce Cd dochází ke zpomalení difúzních toků daných systémů o příspěvek kinetického toku (Fkin). Závislost difúzních toků na koncentraci ligandu lze popsat exponenciální funkcí prvního stupně s dobrou spolehlivostí.

1.3.4 Hydroponické studie Hydroponií obecně rozumíme pěstování rostlin bez půdy v živném roztoku připraveném z vodorozpustných forem živin v žádaném poměru. Kromě rychlejšího růstu, definovaného složení roztoku a menšího rizika chorob a škůdců spočívá výhoda hydroponických experimentů ve snadné přístupnosti kořenů bez jejich mechanického narušení. Tím může být také umožněno průběžně sledovat kořenovou exudaci v souvislosti s prostorovou variabilitou kořenů.

33

Techniky odběru půdního roztoku, výluhů a půdní frakce Různé kořenové zóny jsou pro posouzení prostorové variability kořenové exudace studovány odděleně například s pomocí malých plastových kroužků (průměr 1,2 cm), které mohou být buď prokládány agarovými pláty [Hoffland et al. 1989], nebo utěsněny vakuovým tmelem [Ryan et al. 1993]. Jednotlivé roztoky s exudáty jsou po určitém čase (1 až 2 hodiny) exudace jímány a analyzovány. Ke stejnému účelu lze také použít agarové pláty kladené na povrch kořenů, kdy kořenové exudáty difundují do agarových vrstev, které jsou následně analyzovány [Marschner et al. 1987]. Další způsob jímání exudátů s ohledem na prostorovou variabilitu spočívá v inkubaci kořenů po definovaný čas (3 hodiny) mezi dvěma vrstvami vlhčených filtrů vyrobených z chromatografického papíru [Neumann et al. 1999]. Obdobně lze aplikovat celuloso-acetátový filtr s vysokou sorpční kapacitou vhodnou např. pro stanovení flavonoidů uvolňovaných sazenicemi soji [Kape et al. 1993]. Pro stanovení celkové kořenové exudace je možné analyzovat celý hydroponický roztok a porovnat jeho složení s původním roztokem.

1.3.5 Dvoufázové hydroponické studie Dvoufázová (půda – voda) hydroponie byla navržena [Jakl et al. 2009] jako systém, který by teoreticky umožňil studovat tvorbu spécií v roztoku průběžně ovlivňovaném půdou i rostlinou a související rovnováhy. Koncepce tohoto systému se liší od jednofázového z hlediska matrice pro rostliny zásadním způsobem. Zatímco je u obvyklé hydroponie třeba nejprve pro expozici vytvořit půdní extrakt, nebo simulovaný půdní roztok „sestavený“ z jednotlivých chemických látek, zde se nabízí i teoretická možnost částečného postižení dynamiky celého systému půda – voda – rostlina [Jakl et al. 2009]. Hlavní výhodou pak je mobilizace/imobilizace látek v půdě v souvislosti s exudací a mikrobiální aktivitou, zůstává snadná přístupnost kořenů pro následné i průběžné analýzy. Vzhledem k tomu, že se nejedná o běžně popsanou techniku, resp. nebyla o ní nalezena zmínka v odborné literatuře, je stále předmětem našeho výzkumu, zda ji bude možné použít pro rozsáhlejší studia interakcí. Blíže je představena v metodické části.

34

Vybrané analytické postupy

1.4 Vybrané analytické postupy Prvním stupněm vlastní analýzy LMWOAs je obvykle jejich oddělení na separační koloně předřazené detekčnímu zařízení. Často jsou pro tyto účely používány metody s chromatografickou [Birkler et al. 2010; Ross et al. 2007; Szmigielska et al. 1997] či elektroforetickou [Dahlén et al. 2000] separací. Na koloně dochází k oddělení komponent

(alifatických

karboxylových

kyselin)

ze

směsi

pomocí

např.

(vysokoúčinné) kapalinové chromatografie (iontově-párové, (an)iontově-výměnné, ionty vylučující, s obrácenými fázemi), plynové chromatografie, nebo pomocí kapilární zónové elektroforézy. V případě, že je koncentrace analytu pod detekčním limitem zařízení nebo je účinnost separační kolony pro směs nedostatečná, je možné zařadit ještě prekoncentrační krok. Kromě standardních zahušťovacích operací lze využít extraktor či mikroextraktor na pevné fázi. Konstrukce i funkce mikroextraktorů se značně liší v závislosti na použitém pevném sorbentu. Problematičnost použití těchto kroků pro stanovení RP/LMWOAs specií však tkví ve změně speciace ať již prekoncentrací nebo separací, jsou tedy vhodné zeména pro stanovení celkových obsahů jednotlivých složek. Dále je důležité, aby bylo možné pomocí použité instrumentální metody stanovit komplexy i v neideálních roztocích, např. půdním roztoku. Pro stanovení komplexů nepozměněných předpřípravou vzorku je tedy třeba využít citlivých metod umožňujících přímé vzorkování [Jaklová Dytrtová et al. 2011c; Jaklová Dytrtová et al. 2009b], viz dále. Jako analytická metoda umožňující též určit stechiometrii a stabilitu komplexů se jeví

použitelná

hmotnostní

spektrometrie

s elektrosprayovou

ionizací

vzorku

(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS), která již byla použita v přímém vzorkování pro detekci specií fungicidů s kovy [Jaklová Dytrtová et al. 2011b]. V této práci byly využity uvedené techniky, popis dalších separačních a detekčních technik použitelných pro stanovení LMWOAs a prvků lze nalézt v řadě knih [Cornelis et al. 2003; Crompton 2000; Loconto 2006; Zhang 2007] a byly stručně shrnuty též v autorově Rigorózní práci [Jakl 2010].

35

Vybrané analytické postupy

1.4.1 Ionty vylučující chromatografie Ionty vylučující chromatografie (ion-exclusion chromatography; IEC) představuje modifikaci běžné vysokoúčinné kapalinové chromatografie a též se v ní uplatňuje stejná kolona, detektor i rozpouštědlo. Nejčastěji je využívána pro stanovení organických kyselin, sacharidů, alkoholů, fenolů a organických bází. Představuje vhodný způsob, jak oddělovat molekuly kyselin od vysoce ionizovaných látek [Papadoyannis, Samanidou 2002]. IEC je založena na principu, že elektrický náboj jednotlivých funkčních skupin zachycených ve stacionární fázi (na iontoměniči) a oddělovaných iontů látek je shodný [Fischer 2002], a na kombinaci separačních mechanismů iontové exkluze, adsorpce a velikostního vylučování [Tanaka, Haddad 2000]. Iontové sloučeniny jsou (za daných podmínek) díky Donnanově exkluzi stacionární pryskyřičnou fází odmítnuty a jsou vymyty mezerami v koloně. Neionizované nebo jen slabě iontové látky procházejí póry kolony a jsou zadržovány, separace je dosaženo při oddělení kapaliny uvnitř a vně částic pryskyřice [Tanaka, Haddad 2000]. Tato separační technika bohužel není zcela vhodná ke stanovení šťavelové a maleinové kyseliny, jelikož mají krátký retenční čas a projdou spolu s rozpouštědlem v čele kolony, kde jsou maskovány přítomností anorganických iontů, a jejich detekční limity jsou příliš vysoké (10 mg kg-1 u šťavelové a 1 mg kg-1 u maleinové kyseliny). V případě oddělení anorganických iontů je možné detekci vylepšit [Fischer 2002]. Detekční limity většiny organických kyselin stanovených vodivostním detektorem nebo hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprayem se pohybuje kolem 10 µg kg-1. Pro další studium stanovení karboxylových kyselin v rostlinných exudátech (či jiných matricích) touto technikou je možné kromě uvedených odkázat např. na práce: Chen et al. [2008], Bylund et al. [2007], Gamoh et al. [2003] a Tanaka et al. [2002].

1.4.2 Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem Technika

hmotnostní

spektrometrie

s ionizací

elektrosprayem

(ESI-MS)

představuje spolu s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (APCI) jeden z hlavních možných způsobů, jak provádět speciační analýzu víceméně neporušené

36

Vybrané analytické postupy matrice vzorku, tedy i detekci neporušených iontů větších molekul a komplexů kovů, či metaloidů v roztoku [Donard, Caruso 1998; Fenn et al. 1989; Rosenberg 2003]. ESI-MS může poskytnout užitečné informace [Jaklová Dytrtová et al. 2011d] o nekovalentních komplexech v plynné fázi [Aggerholm et al. 2003; Gatlin et al. 1994; Hofstadler, Griffey 2001], v řadě případů data dobře korelují při studiích v roztoku [Di Marco, Bombi 2006; Tsierkezos et al. 2009b; Urabe et al. 2009] a podmínky ESI-MS mohou být často podobné přírodním biologickým matricím [Aggerholm et al. 2003; Daniel et al. 2002; Gatlin et al. 1994; Hofstadler, Griffey 2001; Koch et al. 2002; Ma et al. 2006; Pramanik et al. 2002]. Analyzovaný roztok je pomocí elektrického pole, případně i inertního plynu (pro zvýšení stupně zmlžení), převeden na jemný aerosol. Vyhřívanou kapilárou je pak dávkován do hmotnostního spektrometru [Rosen, Hieftje 2004]. Z nabité kapky se odpařuje rozpouštědlo do chvíle, kdy je dosaženo Rayleighova limitu (stavu, kdy jsou stejné repulsní síly a povrchové napětí držící kapku pohromadě). V této fázi se kapka deformuje, stane se nestabilní a v procesu zvaném Coulombovo štěpení (exploze) emituje proud nabitých částic. Během štěpení ztratí kapka malé množství své hmoty (1,0-2,3 %) společně s relativně velkým množstvím náboje (10-18%) [Cole 1997]. Jelikož je při tvorbě iontů třeba značného odpaření rozpouštědla, bývá obvykle rozpouštědlo připravováno ve směsi s těkavými organickými látkami (např. methanol, acetonitril). Pro snížení počáteční velikosti kapiček jsou přidávány do roztoku ještě látky zvyšující vodivost (např. octová kyselina) [Cole 1997]. Díky nižší ionizační síle (oproti např. hmotnostní spektrometrii s indukčně vázaným plasmatem; ICP-MS) nedochází k fragmentaci molekul, ale pouze k jejich ionizaci. Kromě toho je výstupem přímo spektrum molárních hmotností jednotlivých sloučenin vztažených k náboji (m/z), včetně isotopů, a odpovídající intenzita signálu. Není tedy třeba používat pro identifikaci molekul (tj. u kolonových separačních zařízení stanovení retenčních časů) standardů, které často nemohou být k dispozici [Rosenberg 2003]. Dalšími nezanedbatelnými výhodami jsou nižší spotřeba vzorku a menší nutnost přečišťování vzorku před vlastní analýzou, než u jiných zavedených technik (např. ICP-MS [Rosen, Hieftje 2004]). Mezi hlavní nevýhody patří relativně vysoká hodnota meze detekce měření, která je obecně o dva až tři řády horší než ICP-MS, tedy na úrovni ng.L-1. Tento problém je

37

Vybrané analytické postupy často řešen předřazenou prekoncentrací chromatografických frakcí vzorku. V případě, že je předřazen separační krok (HPLC nebo kapilární elektroforéza), je sice omezena interference mezi jednotlivými komponentami roztoku [Rosenberg 2003], nicméně dochází k supresi signálu analytu způsobené potlačením ionizace analytu přítomností různých pufrů ve vysokých koncentracích [Rosen, Hieftje 2004]. Kromě uvedeného se i v ESI mohou vyskytnout nežádoucí elektrochemické procesy během sprayování a efekt povrchové aktivity, která snižuje citlivost ESI [Cody 2002]. Pro získání více informací o struktuře molekul je obecně vhodné zařadit do analýzy dvourozměrnou (multi-dimenzionální) spektrometrickou detekci [Rosenberg 2003]. Detektorem může být tak např. tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS), kde je využito rozpadu pomocí vyvolané srážky (collision-induced dissociation; CID) vybrané molekuly (iontu) s vhodným atomem, nejčastěji inertním plynem [Rosen, Hieftje 2004], nebo hmotnostní spektrometr s iontovou pastí (ion trap MS; MSn).

1.4.3 Elektrody pro voltametrická měření 1.4.3.1 Uhlíková pastová elektroda Metoda stanovení LMWOAs s využitím uhlíkové pastové elektrody jako sorbentu analytu je vyvíjena na Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i. v týmu RNDr. I. Šestákové. Kompozitní elektroda připravená z uhlíkového prachu, síranu olovnatého a parafínového oleje může být použita pro akumulaci a následnou oxidaci šťavelové kyseliny [Cai et al. 1995]. Akumulace šťavelové kyseliny na heterogenní pevné fázi probíhá na základě chemické reakce: PbSO4(s) + (COO)22-(l) → Pb(COO)2(s) + SO42-(l). Pasta může být plněna do teflonového pouzdra opatřeného pohyblivým pístem, který umožňuje obnovovat aktivní povrch elektrody pro jednotlivé voltametrické záznamy vytlačováním pasty [Švancara et al. 2009]. Měření může být uskutečněno buď přímo v (zředěném půdním) roztoku, nebo po předchozím odstranění kovů, které by mohly poutat kyselinu, na chelexové koloně. V prvním, akumulačním kroku je elektroda s definovaným povrchem uhlíkové pasty ponořena do analyzovaného roztoku pufrovaného na pH 4 acetátovým pufrem (1 mol L-1 CH3COONa/CH3COOH) po určenou dobu. V další fázi je elektroda vyjmuta

38

Vybrané analytické postupy a důkladně omyta deionizovanou vodou a ponořena do Britton-Robinsonova pufru (0,04 mol L-1 H3BO3, 0,04 mol L-1 H3PO4, 0,04 mol L-1 CH3COOH) s přídavkem NaOH (1 mol L-1) na pH 8. Oxidace šťavelanu je pak zaznamenávána pomocí diferenční pulsní voltametrie [Šestáková et al. 2008]. Jako největší nevýhoda se dosud jeví nedostatečná reprodukovatelnost výsledků daná především přípravou pasty a nepřesným dodržením jednotlivých kroků.

1.4.3.2 Visící rtuťová kapková elektroda Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) je jednou z nejběžnějších a nejlepších elektrod pro elektrochemické stanovení kovů a jejich komplexů v modelových roztocích i ve vodách a půdních roztocích [Jaklová Dytrtová et al. 2011d]. Její nespornou výhodou je především široké potenciálové okno díky přepětí vodíku na rtuti [Heyrovský, Kůta 1962; Wang 2006] a dokonale hladký povrch. Další výhodou je dokonale obnovitelný povrch; každé měření je vlastně provedeno na „nové“ elektrodě (tj. na nové kapce), a na výsledku měření se neprojeví tzv. paměťový efekt, či pasivace povrchu elektrody. V rámci měření tak odpadává někdy časově náročné čištění elektrod, či obnova povrchu, kdy při nedokonalém provedení čisticích operací může dojít ke zkreslení výsledků. Oproti jiným elektrodám na bázi rtuti je navíc spotřeba rtuti minimální. V rámci autorovy disertační práce bylo na všechna voltametricky provedená měření spotřebováno ca. 1,5 mL čisté rtuti. Rtuťové elektrody se ovšem obecně nehodí pro detekci mnoha anodicky oxidovatelných organických sloučenin, resp. obecně celé řady oxidačních procesů [Heyrovský, Kůta 1962].

1.4.4 Diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie Anodická (nebo katodická) rozpouštěcí voltametrie (anodic/cathodic stripping voltammetry; ASV/CSV) se od klasických voltametrických technik liší prekoncentračním

krokem

elektroaktivních

látek

na

elektrodě

a

následným

elektrolytickým rozpouštěním (obr. 9). Prekoncentrace z ní činí metodu velice citlivou, a tedy vhodnou i pro stanovení řady rizikových prvků v environmentální matrici. U diferenční pulsní ASV (DPASV) je vkládáním diferenčních pulsů dosaženo ještě větší

39

Vybrané analytické postupy citlivosti, mez detekce se pak pohybuje okolo 10-11 mol L-1 (při 360 s akumulace) [Barek et al. 2005; Wang 2006]. Rozpouštěcí voltametrie probíhá obecně ve třech krocích [Klouda 2003]:  První krok, prekoncentrace (naakumulování) stanovované látky na pracovní elektrodě (visící rtuťová kapková, uhlíková pastová, amalgamová, Hg-filmová elektroda)

probíhá

za

dokonalého

míchání

při

konstantním

potenciálu

odpovídajícímu limitnímu proudu analytu v daném akumulačním čase.  Po zrušení míchání dojde k poklesu a ustálení proudu na úroveň stacionárního limitního difúzního proudu.  Lineární změnou potenciálu dochází k opětovnému elektrolytickému rozpouštění a vzniku charakteristické polarografické vlny, resp. soustavy píků (při použití diferenčních pulsů) určujících pozicí (potenciálem) analytu a výškou (proudem) jeho koncentraci závislou na akumulačním čase. U ASV s HMDE se tvoří na povrchu rtuťové kapky v akumulačním kroku s kovy amalgám; kationt Mn+ se po danou dobu vylučuje na elektrodě jako M0-Hg. Po prekoncentraci dochází při proudu odpovídajícímu proudu limitnímu k anodickému rozpouštění kovu (oxidaci) z elektrody do roztoku, potenciál se postupně mění směrem ke kladnějším potenciálům (obr. 9) [Wang 2006].

Obr. 9. Fáze potenciálové vlny v ASV založené na elektrolytické akumulaci [Wang 2006]. Díky nízké ceně a vysoké citlivosti je tato metoda hojně využívána při orientačním monitorování obsahů Zn, Cd, Pb, Cu, Tl, Sb, Hg a As ve vodách [Huang, Dasgupta

40

Vybrané analytické postupy 1999], také např. v palubním monitoringu mořské vody u hladiny [Clavell, Zirino 1985]. Dále je možné DPASV v různých modifikacích využít ke speciačním analýzám a studiu komplexace rizikových prvků s organickými ligandy [Chang Chien et al. 2006; Jaklová Dytrtová et al. 2009b; Jaklová Dytrtová et al. 2008; Puy et al. 2001; Robinson, Brown 1991].

1.4.5 Rozpouštěcí chronopotenciometrie Chronopotenciometrie patří mezi nestacionární, galvanostatické metody. Důležité pro tuto metodu je, že lze data využít, kromě běžných analytických účelů, také pro studium kinetiky elektrodových reakcí [Barek et al. 2005]. Při chronopotenciometrii se sleduje časová závislost elektrodového potenciálu při kontrolovaném proudu (nejčastěji při konstantním proudu) [Vydra et al. 1976]. Tato elektroanalytická metoda zahrnuje obdobný prekoncentrační krok jako rozpouštěcí voltametrie, k rozpouštění nahromaděného analytu je používán konstantní proud buď kladný (oxidace) nebo záporný (redukce). V prvním kroku [Vydra et al. 1976] rozpouštěcí chronopotenciometrie (anodické, adsorpční) se mezi měrnou a pomocnou elektrodu vkládá konstantní proud (nA – μA) v nemíchaném systému, po definovaný čas a dochází k akumulaci analytu na elektrodě. V druhém kroku [Vydra et al. 1976] se po otočení směru proudu sleduje v časové funkci vývoj potenciálu měrné elektrody proti referentní elektrodě (E = f(τ)). Přechodový čas τ je pak doba (s), za kterou klesne koncentrace látky na povrchu elektrody z hodnoty c0 na nulovou hodnotu, což je funkcí koncentrace analytu dle Faradayova zákona a Sandovy rovnice: τ1/2 = n . F . π-1/2 . D1/2 . c0ox / 2j , kde n … počet elektronů vyměněných při elektrodové reakci, c0ox … počáteční molární koncentrace analytu v roztoku, j … hustota elektrického proudu (proudová hustota; A m-2) D … difúzní koeficient reagující látky (systém bez míchání), F … Faradayova konstanta (96 484,56 C mol−1). Zaznamenávané E-τ křivky mají tři intervaly:

41

Vybrané analytické postupy 1. Nabíjení elektrické dvojvrstvy od rovnovážného potenciálu Er na potenciál Ei, při kterém probíhá elektrodová reakce měřitelnou rychlostí. 2. Trvání elektrodové reakce, určené koncentrací elektroaktivní látky a kinetikou elektrodové reakce. 3. Pokles koncentrace analytu v mezifází na nulovou hodnotu; značná část proudu se dále spotřebuje na nabíjení dvojvrstvy k potenciálu, kdy začne reagovat další systém; současně ještě pokračuje první elektrodová reakce. V kinetice

reakcí

se

nejčastěji,

jak

uvádí

[Hammerich

2001],

používá

chronopotenciometrie s módem reversního proudu, kdy je po určitém čase obrácena polarita proudu. Obvykle je výhodnější použít polarizační proud proměnný s druhou odmocninou času, kdy je přechodový čas přímo úměrný koncentraci analytu. Zásadní nevýhoda této metody spočívá v schopnosti dostatečně přesného stanovení přechodového času. Řešením je např. aplikace konvoluce, tedy v tomto případě užitím matematické operace pro vytvoření jedné funkce ze dvou signálů, nebo použití exponenciální funkce proud – čas [Hammerich 2001]. Pro analytické využití je závislost E – τ obvykle transformována na dτ/dE – E [Town, van Leeuwen 2001].

1.4.6 Pseudopolarografie Další metodou, která umožňuje určení stability komplexů, je pseudopolarografie. Vlastní měření vychází z po sobě následujících ASV skenů při různém akumulačním potenciálu. Výstupem těchto měření je pseudopolarogram, tj. závislost výšky píku/ů na potenciálu akumulace. Pro jednotlivé pracovní elektrody lišící se především tvarem byly vypracovány různé postupy vyhodnocování pseudopolarografických křivek, pro rtuťovou filmovou elektrodu [Brown, Kowalski 1979], rtuťovou polokulovou ultramikroelektrodu [Kounaves 1992] a visící rtuťovou kapkovou elektrodu [Zirino, Kounaves 1977], která byla použita i v této práci. Různé přístupy vyplývají zejména z různého tvaru elektrod a především zohledňují různou trajektorii difúze během akumulačního kroku ASV skenu.

42

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí Vedle stanovení konstanty stability je možné z pseudopolarogramu také určit stechiometrii komplexů a také rozlišit mezi inertním a labilním komplexem. Labilita/stabilita komplexu je definována na základě kinetického efektu rychlosti rozpadu komplexu během akumulační elektrodové reakce (tj. oxidace kovu). Ze strmosti pseudopolarogramu je též možné určit, zda je elektrodová reakce spíše reverzibilní, či irrevezibilní [Branica, Lovric 1997]. Další výhodou pseudopolarografie je možnost použití rtuťových filmových elektrod přímo, tj. in situ ke speciaci v biologických matricích [Pizeta et al. 2005]. Možnost aplikace na biologické matrice, kde je většinou nízká koncentrace jednotlivých specií, je též dána vysokou citlivostí této metody (pro většinu kovů 10-11 mol/L) vyplývající z akumulačního kroku. Jako zásadní nevýhodu této metody lze považovat časovou a instrumentální náročnost a relativně komplikované matematicko-fyzikální vyhodnocení pseudopolarogramů. Aplikace pseudopolarografie na biologické matrice umožňuje vytvořit tzv. pseudopolarografický „fingerprint“ vynesením všech závislostí výšky píku (nA) na různých potenciálech akumulace (mV). Na základě fingerprintu každého biologického vzorku je možné provést statistické porovnávání jednotlivých matric [Louis et al. 2009].

1.5 Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí 1.5.1 Rostliny hyperakumulující kadmium a zinek Doposud jedním z nejlépe prostudovaných hyperakumulátorů Cd a Zn (Ni) je penízek modravý (Thlaspi caerulescens J. & C. Presl). Patří do čeledi brukvovitých (Brassicaceae), která čítá dalších 87 prokázaných nebo potenciálních rodů akumulujících těžké kovy [Milner, Kochian 2008]. Penízek modravý je dvouletá (některé ekotypy i vytrvalá) bylina vysoká 15 až 35 cm s přízemní růžicí eliptických listů s bílými, narůžovělými či nafialovělými květy uspořádanými do hroznu (obr. 10).

43

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí

Obr. 10. Penízek modravý (foto autor). Existují ekotypy penízku, které jsou podle některých zdrojů [Assuncao et al. 2003; Milner, Kochian 2008] schopné akumulovat až 30 000 mg.kg-1 Zn a 10 000 mg.kg-1 Cd do nadzemní biomasy; tato čísla by činila z penízku velmi slibnou rostlinu pro účinnou fytoremediaci kontaminovaných půd, což je však vzhledem k jeho pomalému růstu a celkovému malému vzrůstu poněkud problematické. Ukazuje se však, že se jedná o velmi vhodnou rostlinu právě pro studium mechanismů příjmu Cd a Zn a v souladu s tím i s přítomností genů zodpovědných za tyto děje [Rigola et al. 2006]. Na penízku byl také studován fyziologický příjem Zn, který probíhá zjednodušeně ve čtyřech fázích (obr. 11; [Milner, Kochian 2008]): 1) podpořený vstup kovu (M) před plasmatickou membránu do buňky kořenu, 2) omezené uskladnění kovu ve vakuole, 3) zvýšený přísun kovu do xylému a jeho transport do nadzemní biomasy, 4) podpořený vstup kovu přes plasmatickou membránu listu a následná depozice ve vakuole listu.

44

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí

Obr. 11. Transport zinku, obecně kovu (M) z půdy do buněk kořene (hnědá barva) a xylémem do listu (zelená barva), upraveno podle [Milner, Kochian 2008]. Porovnáním transportérů (resp. Michaelisových konstant Km) pro Zn u penízku modravého a penízku rolního (není hyperakumulátorem) bylo zjištěno, že afinity těchto transportérů pro Zn jsou u penízku rolního 8 µmol L-1 a u penízku modravého 6 µmol L-1, přesto byl maximální příjem Zn u penízku modravého 6x větší než u penízku rolního [Lasat et al. 1996]. Z tohoto srovnání vyplývá, že efektivita transportérů penízku modravého není vyšší než u běžných neakumulujících rostlin, ale jejich hustota v plasmatické membráně musí být větší, aby bylo dosaženo výše zmíněného rychlejšího příjmu. U penízku rolního, jakož i u jiných neakumulujících rostlin, se řídí příjem Zn (ale i jiných kovů) deficitem (příjem se zvyšuje) a dostatkem (příjem se snižuje), oproti tomu penízek modravý intenzitu příjmu nesnižuje i pokud jsou jeho fyziologické potřeby na příjem Zn saturovány; snížení intenzity příjmu Zn bylo pozorováno až za pěstování p. modravého v živném roztoku obsahujícího 50-1000 µmol L-1 Zn [Papoyan et al. 2007]. Z chemického i fyziologického hlediska je velmi zajímavé zjištění [Papoyan et al. 2007], že pokud penízek modravý roste v prostředí s vysokými koncentracemi Zn,

45

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí stává se více tolerantní vůči Cd a akumuluje ho s větší intenzitou. Zajímavé je i to, že relace platí i opačně, tedy pokud p. modravý roste v prostředí s vysokou koncentrací Cd, zvyšuje se i jeho příjem Zn. Tato stimulovaná akumulace do nadzemní biomasy je asociována s urychleným tokem kovu do kořenových buněk a xylémovým transportem těchto kovů z kořenů do nadzemních orgánů. Právě tok kovů z kořenů do nadzemních orgánů xylémem může mít rozhodující vliv na rychlost a intenzitu příjmu [Milner, Kochian 2008]. Hyperakumulující aktivitu p. modravého je tedy možné přisoudit právě transportu z kořenů do nadzemní biomasy. Pokud tedy Zn (Cd) vstoupí do buňky, rostlina má dvě možnosti, jak jeho toxické účinky eliminovat; uložit kov ve vakuole kořenové buňky, nebo jej transportovat dále xylémem do zelených částí rostliny. Pokud je tento problém chápán pouze na základě rozdílů chemických potenciálů, je možné tvrdit, že varianta uložení kovu ve vakuole kořenových buněk má za následek snížení příjmu kovů z půdy následkem snížení jejich chemického potenciálu (závisí na rozdílu koncentrací daného kovu – prvku v půdě a v kořeni). Oproti tomu rozptýlení kovu do celé rostliny nemá za následek snížení jeho chemického potenciálu, příjem z hlediska energetického není bráněný (pomineme-li fyziologické aspekty příjmu prvků přes plasmatickou membránu popsané v kapitole 1.1.1). Tato tvrzení jsou též podpořena empirickou studií [Lasat et al. 1998] udávající, že p. rolní uchovává přibližně 2,5x více Zn ve vakuolách kořenových buněk ve srovnání s p. modravým. Též bylo zjištěno [Lasat et al. 1998] z dlouhodobé studie, že Zn se z vakuoly kořenové buňky p. rolního vyplavuje 6x pomaleji než je tomu u p. modravého. Z těchto výsledků je možné usuzovat, že hyperakumulační schopnosti p. modravého jsou způsobeny jak rychlejším příjmem kovů (vyšší koncentrací transportérů v membráně), tak i vyšší mobilitou kovů v buňce. Dalším faktorem podporujícím teorii jeho vyšší akumulační schopnosti je koncentrace kovů v transpiračním proudu, která je u p. modravého celkově 5x vyšší, než u p. rolního za stejných podmínek [Lasat et al. 1998]. Dalo by se říci, že společným znakem hyperakumulátorů je právě zvětšená koncentrace kovů v xylému způsobená zvýšenou

aktivitou

P-typu

ATPasy

a

HMA4

(heavy

metal

ATPase;

transmembránového přenašeče iontů Cd a Zn) [Cosio et al. 2004]. Nejvyšší koncentrace Cd a Zn v nadzemní biomase byly u penízku modravého nalezeny v epidermálních buňkách listu, koncentrace kovů byla 4x vyšší než v buňkách mezofylu [Küpper et al. 1999]. Hlavním důvodem pro deponování kovů do

46

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí epidermálních buněk listu může být to, že v epidermálních buňkách nejsou chloroplasty, a proto nehrozí narušení fotosyntézy [Procházka et al. 1998]. Původní domněnkou bylo, že za hyperakumulační schopnosti penízku modravého mohou především fytochelatiny, ale tento předpoklad se ukázal jako nejednoznačný. Hladiny fytochelatinů v p. modravém a p. rolním se totiž při porovnání ukázaly být stejné [Ebbs et al. 2002]. Velice zajímavé je i zjištění, jak se mezi sebou v příjmu Cd liší jednotlivé ekotypy p. modravého. Bylo pozorováno [Hernández-Allica et al. 2006] zvýšení citlivosti p. modravého cv. Prayon na přítomnost Cd v důsledku inhibice syntézy fytochelatinů (inhibován byl enzym γ-glutamylcysteinsyntetasa). Z této studie vyplývá, že fytochelatiny v příjmu kovů penízkem hrají pouze iniciační roli. Oproti tomu penízek modravý cv. Ganges nevykazoval po inhibici aktivity γ-glutamylcysteinsyntetasy žádné změny v příjmu Cd [Cosio et al. 2004]. Z uvedeného vyplývá, že problematika příjmu kovů je velmi komplexním problémem, který bude mít své proměnné i v rámci jednoho rostlinného druhu.

1.5.2 Rychle rostoucí dřeviny akumulující rizikové prvky K těmto rostlinám patří zejména dřeviny rodu vrba (Salix) (obr. 12a), topol (Populus) a bříza (Betula). Z hlediska příjmu kovů a potenciálního využití k fytoremediacím půd byly zejména zkoušeny různé druhy a kříženci rodu Salix [Dos Santos Utmazian et al. 2007]. Většina testů byla prováděna na hydroponických experimentech za kontrolovaných podmínek. Z jiných experimentů [Tlustoš et al. 2007] vyplývá, že výhodným druhem pro potenciální fytoremediační využití je vrba Smithova, tedy přirozený hybrid vrby košíkářské a vrby jívy. Zástupci rodu Betula, dřeviny známé jako pionýrská dřevina, často rostou i na rumištích, kde je potenciální riziko nadlimitního výskytu kovů v půdě pravděpodobné [Borgegard, Rydin 1989]. Zajímavé jsou především pokusy, které hodnotí vzájemnou variabilitu jednotlivých ekotypů [Kopponen et al. 2001; Pulford, Watson 2003], ze kterých plyne velmi vysoká variabilita v rezistenci vůči kontaminaci v rámci populace. Někdy k těmto dřevinám bývá řazen i další rod z čeledi Betulaceae, rod olše (Alnus) (obr. 12b,c). Tyto dřeviny jsou typickou dřevinou přimísenou, často se vyskytující

i

na

extrémních

klimatických

stanovištích.

Vzhledem

k malému

47

Možnosti výběru rostlin pro studium interakcí hospodářskému významu olše je počet publikací v porovnání se smrkem, vrbou a dalšími skromnější. Její potenciál lze zejména spatřit v symbióze s kořenovými bakteriemi [Gutiérrez Mañero et al. 1994] a výraznou exudační aktivitou [Grayston et al. 1997]. Obecně je možné tvrdit, že přítomnost symbiotických organismů zvyšuje exudaci kořenů po kvalitativní i kvantitativní stránce [Ingham, Molina 1991]. a

b

c

Obr. 12. Vrba Smithova, olše šedá, olše lepkavá (foto autor).

48

Použité systémy

2 Metodická část Pro získávání půdního roztoku byly zvoleny metody užívané na KAVR, tj. odběr půdního roztoku z nádobových pokusů pomocí trvale umístěných půdních sond, dvoufázové hydroponické systémy umožňující snadné odebírání v jakékoli fázi vegetačního růstu bez výrazného narušení termodynamických rovnováh a extrakce půd z terénních pokusů.

2.1 Použité systémy 2.1.1 Dvoufázové hydroponické experimenty Krytokořenná sadba rostlin pěstovaných technologií "na vzduchovém polštáři" v sadbovačích o objemech kořenové oblasti 200-300 cm3 (olše šedá – Alnus incana a olše lepkavá – Alnus glutinosa), nebo o objemech buněk 100-300 cm3 (vrba jíva – Salix caprea), nebo 20 cm řízky (vrba Smithova – Salix smithiana) byly umístěny do 2L plastových nádob, do kterých bylo naváženo 500 g suché jemnozemě odebrané na kontaminované lokalitě, vložena tkanina (0,2 µm) proti prorůstání kořenů do půdy a přelito 1,25 L deionizované vody [Jakl et al. 2009] (obr. 13).

Obr. 13. Schéma uspořádání dvoufázového hydroponického systému (autor ilustrace J. J. Dytrtová).

49

Použité systémy Systém byl opatřen aerací (obr. 14). Kořenová část byla vně nádoby zakryta neprůsvitnou fólií a celé nádoby byly umístěny do místnosti s řízenými podmínkami teploty, osvitu a vlhkosti pro režim den/noc. Teplota byla nastavena na 22°C po dobu 16 hodin a 16°C po dobu 8 hodin, režim světlo/tma byl nastaven na 16/8 hodin a relativní vlhkost vzduchu na 70/60 %.

síť vzduchovacích hadiček

vzduchovadlo promývačka nádoba s rostlinou

Obr. 14. Schéma celého hydroponického experimentu (autor ilustrace J. J. Dytrtová). V rámci časového plánu bylo odebíráno 1x týdně z každé nádoby 10 mL roztoku, celkový obsah rizikových prvků byl stanovován pomocí ETAAS (atomová absorpční spektrometrie s bezplamenovým atomizátorem; AA280Z/GTA 120/PSD 120, Varian, Austrálie), hodnota pH pomocí pH-metru (pH 301i/SET, WTW, Německo), vodivost pomocí laboratorního konduktometru (inoLab® Cond 720, WTW, Německo). Odebrané a odpařené množství vody bylo průběžně doplňováno na původní objem, tj. 1,25 L. Časové závislosti příjmu rizikových prvků byly vypočteny z úbytku prvků v roztoku.

2.1.2 Nádobový pokus Nádobový

pokus

byl

založen

pro

fluvizem

z lokality

Litavka.

Detailní

charakteristika zvolené půdy následuje v kapitole 2.2. V něm byla testována vrba Smithova z hlediska příjmu prvků (akumulace) a vlivu její exudace na složení půdního

50

Použité systémy roztoku. Do každé nádoby byly umístěny sací sondy (DI Gottfried Wieshammer, Wien, Rakousko) s membránou o velikosti ok 0,2 µm. V pokusu byl především odebírán půdní roztok, v němž byl sledován celkový obsah Cd, Pb a Cu a obsah vybraných specií těchto prvků pomocí voltametrických měření a hmotnostní spektrometrie. Dále byl sledován nárůst biomasy a také obsah zmíněných kovů v biomase.

2.1.3 Zalesňování v exponované horské oblasti Pokusná výsadba olše šedé (Alnus incana (L.) Moench) byla vytvořena na pasece na hřebeni Orlických hor (50°49'34'' SŠ, 15°21'19'' VD) chráněné proti okusu. Lokalita se nachází ve výšce 950 – 960 m n.m. na svahu s orientací na jihozápad. Průměrná roční teplota (1996 – 2007) je 5,1°C a průměrné roční srážky (1994 – 2007) dosahují 1093 mm [Balcar, Kacálek 2008]. Matečná hornina je biotitický granit, půda horský humusový podzol. Výsadba představuje část komplexního výzkumného projektu založeného na začátku 90. let 20. století na testování různých rostlinných druhů za nepříznivých podmínek [Balcar, Podrázský 1994]. Na stanovišti převažuje třtina chloupkatá (Calamagrostis villosa (Chaix) J. F. Gmelin). Průměrné roční koncentrace v ovzduší po omezení jeho znečišťování byly u SO2 4 µg m-3 (2005–2008), u NO2 5 µg m-3 (2006–2008) a u O3 102 µg m-3 (2003–2008) (www.chmi.cz). Navzdory tomu, že jsou hodnoty pod limitem přímého narušování lesa, jsou stále dost vysoké (v souvislosti s ročními srážkami) na to, aby způsobovaly degradaci lesní půdy. Experimentální stanoviště bylo založeno v květnu 2003. Celkem 350 sazenic olše šedé (roční prostokořenný sadební materiál pocházející z Jizerských Hor, 6. lesní výškové zóny) byly vysazeny celkem v sedmi opakováních po 50ti stromech v rozteči 1 × 2 m. Byly vytvořeny 3 varianty: (1) kontrolní varianta (3 opakování) a 2 s přídavkem meliorantu. Do variant s přídavkem byla aplikována směs 0,5 kg drceného vápence a 1,0 kg mletého amfibolitu na každý strom. U varianty s (2) povrchovou aplikací (2 opakování) byla bezprostředně po zasazení směs aplikována na povrch v kruhu ca. 0,5 m kolem sazenic olše. U varianty s (3) jamkovou aplikací (2 opakování) bylo stejné množství směsi smícháno homogenně s půdou ve výsadbové jámě (25 × 25 × 25 cm) během sázení.

51

Použité systémy Drcený vápenec obsahoval 93,5% částic menších než 1 mm v průměru a mletý amfibolit obsahoval 45,5% částic menších než 0,06 mm, 46,6% částic 0,06 až 0,1 mm, 6,3% částic 0.1 až 0.6 mm a 1,6% částic větších než 0,6 mm v průměru. Průměrné koncentrace vybraných prvků jsou uvedeny v tab. 2. Tab. 2. Chemické složení přidaných meliorantů (mg kg-1; ±SE, n = 3) Al Vápenec (průměr) SE SE

Cd

Cu

Fe

K

Mg

Mn

5121 142990 0,125 1,76 1108 1629 48225 291

Amfibolit (průměr)

Ca

7518 0,005 0,03

75

85 2998

Pb

Zn

396 4,41 46,9 4 0,06

0,1

49293 56768 1,35 156 69660 1091 4538 1850 9,52 111,6 2428

438 0,00

3

399

54

8

39 0,59

1,7

Pro stanovení biopřístupného podílu kovů v půdě byla použita technika DGT. DGT jednotky byly na stanovišti exponovány organickému horizontu půdy (vertikálně, 8 cm hluboko, ve dvou opakováních) po určený čas. Expoziční čas (ca. 24 hodin, vyjádřen v sekundách) a půdní vlhkost byly měřeny pro každou jednotku DGT zvlášť. Průměrná teplota půdy byla během expozice 8 ± 2°C. Pro sledování příjmu prvků různými rostlinnými částmi byly rostliny zpracovávány následujícím postupem: Nadzemní část každého vzorku stromu byla rozdělena na část: (1) listy, (2) větve a větvičky, (3) kmínek a (4) kůra. Kůra byl odloupnuta z čerstvých kmínků. Větve a větvičky byly rozsekány včetně kůry. Vzorky dřeva z kmínků byly získány vrtem na bazální, střední a vrcholové úrovni kmene a promíchány. Kořenový systém byl opatrně vyjmut z půdy, propláchnut vodou a rozdělen do frakcí: (1) kořeny pod 0,2 cm v průměru, (2) kořeny 0,5–1,0 cm, (3) kořeny 1,0–3,0 cm a (4) kořeny nad 3 cm v průměru. Nadzemní i kořenové části byly následně usušeny, zváženy, namlety, homogenizovány a po mikrovlnném rozkladu analyzovány na obsahy vybraných (rizikových) prvků.

52

Charakteristika testovaných půd

2.2 Charakteristika testovaných půd Pro nádobové pokusy, ze kterých byl odebírán půdní roztok, byly použity různé typy půd (tab. 3) o různých půdních charakteristikách (tab. 4) a s různým obsahem živin (tab. 5) a různým stupněm kontaminace (tab. 6). Půda odebraná z lokality Litavka je fluvizem s nízkým obsahem živin i oxidovatelného

uhlíku,

vysoce

kontaminovaná

více

rizikovými

prvky.

Půda

pocházející z lokality Příbram je kambizem odebraná z louky se středním obsahem živin i oxidovatelného uhlíku a s vysokou kontaminací především olovem. Lesní půdu představuje fluvizem z lokality Píšťany s vyšší kontaminací olovem a kadmiem, průměrným obsahem živin i oxidovatelného uhlíku. Tab. 3. Zrnitostní kategorie použitých půd (%) fyz. jíl lokalita

půdní typ

půdní druh

Litavka

fluvizem

Příbram

kambizem hlína

Píšťany

fluvizem

I. kat.

II. kat.

III. kat.

IV. kat.

<0,002 mm <0,01 mm 0,01-0,05 mm 0,05-0,1 mm 0,1-2 mm

písek jílnatohlinitý písek jílnatohlinitý

6,69

14,17

18,76

12,64

54,42

9,64

29,96

23,87

8,56

37,59

11,63

21,70

12,86

8,92

56,51

Tab. 4. Půdní charakteristiky; pH vodorozpustné, výměnné, kationtová výměnná kapacita (CEC) a obsah oxidovatelného uhlíku lokalita

pH(H2O)

pH(KCl)

Píšťany

6,76

6,24

sm.odch.

0,02

0,02

Příbram

6,59

5,77

sm.odch.

0,02

0,02

Litavka

5,13

4,58

sm.odch.

0,01

0,01

Cox

CEC -1

(mmol(+) kg ) 201

(%) 1,77 0,03

166

2,30 0,08

134

1,17 0,11

53

Charakteristika testovaných půd Tab. 5. Obsah živin (mg.kg-1) v půdách ve výluhu dle metody Mehlich III [Mehlich 1984] lokalita Píšťany sm.odch. Příbram sm.odch. Litavka sm.odch.

K

Ca

214,3 8670 67,9

312

127,2 2306

Mg

P

262 146,9 20

1,6

128 43,06

6,4

19

4

0,33

76,1

987

108

9,16

2,8

111

1

0,09

Tab. 6. Celkové obsahy vybraných prvků v půdách v mg kg-1 suché půdy (20°C) [Száková et al. 2005] lokalita Píšťany sm.odch. Příbram sm.odch. Litavka sm.odch.

Al

As

Cd

Co

Cr

Cu

Fe

5886 37,0 2,10 3,75 130,1 41,1 16117 94

0,5 0,16 0,01

1,9

0,1

62

2731 98,7 5,03 2,58 41,5 19,7 11952 79 3697 30

5,0 0,06 0,08

0,2

0,2

323

Mn

Mo

Ni

Pb

Sr

Ti

760 0,617 22,6 78,5 70,1 2762 4 0,069

13

704 0,298 16,6 1215 33,2 3987

180

0,2

2,2 41

3,4

232

52

19 0,036

0,1

Zn

1,2

17

3

279 26,9 4,62 38,2 63,2 18889 2717 2,502 13,0 2667 19,5 2903 2697 26

0,0 0,33

2,7

5,0 1322

199 0,217

0,8

200

2,4

280

43

Metodou postupné extrakce dle standardizované procedury BCR (popsáno v [Rauret et al. 1999] byl stanoven obsah vybraných prvků (tab. 7) ve frakci 1 (0,11 mol L−1 octová kyselina), frakci 2 (0,11 mol L−1 NH2OH·H2O) a frakci 3 (8,8 mol L−1 H2O2 následováno 1 mol L−1 CH3COONH4). Tab. 7. Celkové obsahy vybraných prvků v půdních frakcích (mg.kg-1 suché půdy) uvolnitelných metodou postupné extrakce [Rauret et al. 1999] Frakce 1

Al

Píšťany

21,3 0,480 0,227 0,171 0,380 1,583

sm.odch. Příbram sm.odch. Litavka sm.odch.

As

Cd

Cr

Cu

Fe

Mn

Ni

Pb

Ti

V

Zn

44,0 0,849 0,571 0,0428 0,0746 19,50

0,1 0,052 0,011 0,017 0,061 0,049

0,3 0,022 0,305 0,0010 0,0015

0,16

14,6 0,814 0,772 0,061 0,115 0,102

19,0 0,725 15,178 0,0458 0,0757

4,91

0,0 0,228 0,017 0,033 0,006 0,075

0,7 0,091 0,153 0,0042 0,0015

0,02

14,2 0,492 5,846 0,046 2,930 4,846 0,3 0,081 0,027 0,006 0,035 0,324

47,7 0,870 50,258 0,0284 0,1271 525,59 0,7 0,003 1,081 0,0027 0,0027

3,31

54

Instrumentace a analýza Frakce 2 Píšťany

Al

Píšťany sm.odch. Příbram sm.odch. Litavka

Cu

Mn

Ni

93 1,016

1

0,08 0,016 0,002 0,014

0

1 0,004

172

5,78 0,312 0,071 1,244

285

1

0,56 0,054 0,039 0,021

4

119 25,90 0,988 0,269 5,203

1446

4

Al

1,89 0,035 0,026 0,267

As

Cd

Cr

Cu

58

Fe

Pb

Ti

V

Zn

15,4 1,096 1,370 12,69 0,8 0,004 0,009

0,07

117 0,640 216,6 0,163 0,689

3,16

10 0,069

2,0 0,010 0,023

0,14

421 0,477 454,7 0,737 0,965 122,69 25 0,015

Mn

Ni

32,2 0,023 0,065

6,05

Pb

Zn

Ti

V

192 0,523 0,050 18,353 1,549

248

7,0 0,966

1,54 3,778 0,652

7,76

7 0,327 0,004 1,361 0,105

5

0,3 0,136

0,01 0,556 0,043

0,61

227 3,094 0,091 1,137 0,807

265

11,8 0,683 16,79 10,966 1,127

7,85

13 0,264 0,038 0,081 0,184

12

57 1,100 0,122 0,595 1,416

sm.odch.

Fe 699

sm.odch.

Frakce 3

Cr

1,83 0,110 2,075 2,840

sm.odch. Litavka

Cd

193

sm.odch. Příbram

As

3 0,157 0,005 0,042 0,007

0,2 0,004

1,90 2,290 0,039

0,66

501 193,5 0,456 22,58 0,534 0,162 28,83 16

6,6 0,026

0,95 0,033 0,022

0,44

2.3 Instrumentace a analýza 2.3.1 Chemikálie Veškerá použitá činidla byla v čistotě Suprapur® (Merck, ČR), případně p.a. s ověřením použitelnosti, ředění bylo prováděno deionizovanou destilovanou vodou z jednoho zdroje (18 M cm-2, PCS Sybron Barnstead). Roztoky kadmia byly ředěny ze standardu 1 g Cd L-1 ve 2% HNO3 (p.a., Analytika Ltd., ČR) a pevného CdCl2.2½H2O (p.a., Analytika Ltd., ČR), roztoky olova byly ředěny ze standardu 1 g L-1 ve 2% HNO3 (p.a., Analytika Ltd., ČR), výsledná koncentrace kovů byla ověřena pomocí ETAAS, ICP-OES a DPASV. Roztoky kyselin byly ředěny ze standardních roztoků o koncentraci kyseliny -1

1 g L (Analytika Ltd., ČR). V případně použití NaClO4 jako základního elektrolytu v DPASV se vycházelo z navážky pevného NaClO4 (p.a., Merck, ČR) rozpuštěného do zásobního roztoku o koncentraci 0,1 mol L-1.

55

Instrumentace a analýza

2.3.2 Příprava vzorků 2.3.2.1 Odběr a rozklad rostlinných vzorků Suchý rozklad Od rostlin byla oddělena biomasa (kořeny i listy), zvážena a sušena při 60°C po dobu 7 dní. Následně byla biomasa homogenizována a poté mineralizována na suché cestě následujícím způsobem: Alikvot (~1g) usušené a homogenizované rostlinné biomasy byl navážen s přesností na 1 mg do borosilikátových skleněných ampulí a rozložen ve směsi oxidujících plynů (O2+O3+NOx) při teplotě 400°C po dobu 10 hodin v Apion Dry Mode Mineralizer (Tessek, ČR). Popel byl rozpuštěn ve 3 mL lučavky královské a po jedné hodině stání při laboratorní teplotě (cca 25°C) byl objem doplněn na 20mL 1,5% kyselinou dusičnou (electronic grade purity, Analytika Ltd., ČR) a rozpuštěné mineralizáty ponechány ve skleněných zkumavkách až do doby analýzy [Miholová et al. 1993]. Mikrovlnný rozklad Alikvot (0,15 g) suché jemně mleté biomasy rostlin (60 °C, < 1 mm) byl rozložen metodou mokrého rozkladu za zvýšeného tlaku s mikrovlnným ohřevem ve směsi 1 mL HNO3 (konc.) + 7 mL H2O2 v přístroji Ethos1 (MLS GmbH, Německo) při 220°C po dobu 28 minut. Poté byl vzorek převeden do 20mL zkumavek, doplněn po značku deionizovanou vodou a ponechán při laboratorní teplotě do doby analýzy.

2.3.2.2 Odběr půdních roztoků Metodika odběrů půdních roztoků pomocí půdních sond a následná analýza je v literatuře hojně popsána (viz Teoretická část, podkapitola Sací lysimetry), pro naše účely byla upravena metodika dle Wenzel et Wieshammer [1995]. Půdní sondy (suction cups, obr. 15) jsou z akrylátu a nylonu (DI Gottfried Wieshammer, Wien, Rakousko). Povrch sondy je potažen nylonovou filtrační membránou (velikost pórů 0,2 μm), pod ní je porézní (velikost pórů 20 µm) polyetylenová vrstva, uvnitř sondy je akrylátová vzorkovací hadička. Sonda je na obou koncích uzavřena akrylátovými koncovkami.

56

Instrumentace a analýza Obr. 15. Půdní sonda (suction cup), pomocí které byl podtlakem injekční stříkačkou odebírán půdní roztok (foto autor).

Půdní sondy byly do půdy zaváděny mírně šikmo, při zakládání nádob. Půdní roztok byl odebírán podle předem stanoveného časového plánu 1x za 6 týdnů, tedy celkem 3x za vegetační období. Vlastnímu odběru předcházela saturace půdy v nádobě demineralizovanou vodou na 100 % retenční vodní kapacity po dobu 24 hodin pro ustavení rovnováhy. Po jejím ustavení byly na teflonové hadičky od půdních sond připojeny injekční stříkačky a půdní roztok byl podtlakem odsáván (obr. 16).

Obr. 16. Schéma odběru půdního roztoku půdní sondou z nádobového pokusu. Nejvíce se nám osvědčilo neodebírat předem definované množství půdního roztoku (např. 10 mL, jak uvádějí Wenzel et Wieshammer [1995]), ale prodloužit odsávání do samovolného ukončení (nedostatkem vody v půdě). Tento způsob

57

Instrumentace a analýza minimalizuje rozdíly v obsazích prvků mezi jednotlivými opakováními. Ve výsledku bylo tedy odebíráno 10 až cca 30 mL půdního roztoku. Takto odebraný půdní roztok byl bezprostředně po odběru uložen do vodotěsných plastových kontejnerů a do analýzy skladován při teplotě 4°C.

2.3.2.3 Aplikace DGT Technika DGT byla použita pro stanovení biopřístupné části kovů. Vlastní DGT jednotky (DGT REsearch Ltd., Lancaster, GB) jsou tvořeny diskem difúzního gelu (Diffusive Gel Disc 0.8 mm) v 0,1 mol L-1 NaCl, diskem chelexového gelu (Chelex Gel Disc 0.4 mm) v deionizované vodě (Millipore®) a membránovým filtrem (Tuffryn® Membrane Filter 25 mm, 0.45 μm, Pall Corporation) (obr. 17). DGT jednotky byly exponovány v půdě/půdním roztoku po definovaný čas (vyjádřený v sekundách). Po expozici byly jednotky bezprostředně rozebrány a chelexové disky (resiny) byly louženy po 48 hodin (4°C) v 1,5 mL uzavíratelných plastových nádobkách s 1 mL 2 mol L-1 HNO3 [Jaklová Dytrtová et al. 2008].

Obr. 17 Schéma konstrukce a fotografie DGT jednotky (vizualizace autor). Celkový obsah kovů ve výluhu (3x zředěném) byl stanoven pomocí ICP-OES (VARIAN VistaPro, Varian, Australia).

58

Instrumentace a analýza Přístupná koncentrace prvků Cb [μg L-1] byla vypočítána podle Zhang et al. [1998]:

Cb 

Mg , kde DtA

M [μg] je množství prvku sorbovaného na expoziční plochu A [3,14 cm2] za čas t [s], Δg [cm] je tloušťka difúzní vrstvy (0,093 cm) a D [cm s-1] je difúzní koeficient daného prvku v gelu (www.dgtresearch.com). Množství prvku M bylo vypočítáno podle Zhang et al. [1998]: M  Ce

Vg  Ve , kde fe

Ce je změřená (ICP-OES) koncentrace prvku [µg L-1] ve výluhu 2 mol L-1 HNO3, Vg [L] je objem sorpčního gelu (resinu), Ve [L] je objem vyluhovadla a fe je eluční faktor prvku a vyluhovadla (pro 1 mol L-1 HNO3 většinou fe = 0,8 [Zhang et al. 1998]).

2.3.2.4 Odběr a rozklad vzorků půdy Celkové obsahy rizikových prvků v půdě byly stanoveny na základě následujícího postupu (popsáno v [Száková et al. 2009]): Alikvot (0,5 g) suché půdy (60 °C, < 2 mm) byl rozložen metodou mokrého rozkladu za zvýšeného tlaku s mikrovlnným ohřevem ve směsi 8 mL HNO3(konc.), 5 mL HCl (konc.) a 2 mL HF (konc.) v přístroji Ethos1 (MLS GmbH, Německo) při 210 °C po dobu 33 minut. Reakční směs byla poté kvantitativně převedena do 50mL Teflon® nádoby a odpařena do sucha (160 °C). Následně byl odparek rozpuštěn v 3 mL lučavky královské a převeden do 25mL zkumavek, roztok byl doplněn deionizovanou vodou a ponechán při laboratorní teplotě do doby analýzy.

2.3.3 Vlastní stanovení obsahu prvků v půdních a rostlinných vzorcích Stanovení celkových obsahů rizikových prvků v mineralizátech půd a rostlin bylo prováděno optickou emisní spektrometrií s indukčně vázaným plasmatem (ICP-OES) na přístroji VARIAN VistaPro (Varian, Austrálie). Pro stanovení celkových obsahů Cd, Pb, Zn a Cu v půdních roztocích pak byly použity ICP-OES (VARIAN VistaPro, Austrálie) a pro nízké obsahy analytů ETAAS (AA280Z s GTA 120, Varian, Austrálie).

59

Instrumentace a analýza Obsah oxidovatelného uhlíku byl měřen na přístroji Zeiss Spekol 221 (Zeiss, Německo) dle metody Sims et Haby [1971]. Kationtová výměnná kapacita byla stanovena jako součet obsahů Ca, Mg, K, Na a Al extrahovatelných 0,1 mol L-1 roztokem BaCl2 (m/v v poměru 1:20; ISO 11260 [1994]). Obsah živin byl stanoven ve výluhu Mehlich III [Mehlich 1984] kolorimetricky (P) na segmentovém průtokovém analyzátoru Skalar SAN PLUS System (Skalar, Holandsko) a pomocí plamenové AAS (K, Ca, Mg) na přístroji Varian SpectrAA-400 (Varian, Austrálie).

2.3.4 Analýzy spojené s detekcí komplexů LMWOAs 2.3.4.1 Elektrochemické metody Speciační analýza pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV) byla provedena podle metodiky popsané např. v [Jaklová Dytrtová et al. 2009b; Jaklová Dytrtová et al. 2008], proto zde není popsána detailně. DPASV sloužila po okyselení roztoku na pH 1 HNO3 i jako referenční metoda stanovení celkového obsahu prvků. DPASV

byla

použita

v tříelektrodovém

zapojení

potenciostatu

(computer

controlled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP, Polaro-Sensors, Prague, ČR), vybaveným MultiElchem v. 2.1 software (ÚFCHJH, v.v.i., ČR) a POLAR.PRO software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Prague, ČR). Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková

elektroda

(HMDE)

(Polaro-Sensors,

Prague,

ČR)

referentní

byla

-1

Ag/AgCl/KCl(3 mol L ) (upravená RAE 113; Monokrystaly, Turnov, ČR) a pomocnou Pt drátek. Voltamogramy byly pořízeny za konstantní iontové síly s použitím 0,01 mol L-1 NaClO4 (Fluka, Suprapur®) jako základního elektrolytu, jehož použitím je umožněno zachovat původní pH půdních roztoků. Pro doplňková měření byly použity modelové roztoky sestávající z roztoků sledovaných rizikových prvků (ze standardů 1 g L-1 v 2% HNO3; Analytika, ČR) a kyselin (Merck), jejichž pH bylo upraveno přídavkem NaOH (Fluka, Suprapur®); modelové roztoky byly měřeny za stejných podmínek jako půdní roztoky: výška pulsu 50 mV, rychlost polarizace 10 mV s-1, délka pulsu 80 ms, klidový čas 10 s. Před měřením byl z roztoku kyslík odstraněn probubláváním argonem (10 min). Ředění, potenciál akumulace, rozsah, akumulační časy a další podmínky jsou uvedeny v citovaných pracích.

60

Instrumentace a analýza 2.3.4.2 Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem Metodika

speciační

analýzy

pomocí

hmotnostní

spektrometrie

s ionizací

elektrosprayem (ESI-MS) byla nejprve vyvinuta a optimalizována s využitím modelových roztoků (tab. 8) a dále upravena pro půdní roztok [Jaklová Dytrtová et al. 2011d]. Měření probíhala na přístroji Finnigan LCQ (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA) [Tintaru et al. 2008], kde je detekce iontů z ESI zdroje realizována na iontové pasti pracující jak v pozitivním, tak i negativním modu. Jako optimální prostředí pro sledování komplexů pomocí ESI-MS byla vybrána směs metanol/voda v poměru 1:1, ostatní zkoušená rozpouštědla se jevila jako méně vhodná (voda, acetonitril) pro detekci či tvorbu komplexů. Parametry přístroje byly pro sledování kationtů a aniontů optimalizovány. Jednotlivé komplexy byly ve spektru identifikovány podle m/z a podle isotopového otisku charakteristického pro kadmium, olovo a intermetalický otisk kadmia a olova (obr. 18).

Bližší

identifikace

složení

komplexů

byla

provedena

na

základě

fragmentace z MS/MS experimentů a též na základě vyloučení komplexů (jejich m/z) s pouze

anorganickými

ligandy

identifikovaných

v systémech

neobsahujících

organický ligand (roztoky A, B a C). Složení komplexu bylo též ověřeno výpočtem (Isotope viewer) v programu Xcalibur 2.0 (Thermo Electron Corp.).

3,0 5

x10

6

Cd

5

x10

2,5

5

2,0

4

1,6 5 x10 1,4

Pb

CdPb

1,5

1,0

Intensity

Intensity

intensity

1,2

3

1,0

2

0,5

1

0,0

0 203

0,8 0,6 0,4

106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116

Mass

0,2

204

205

206

207

208

209

0,0 310

312

Mass

314

316

318

320

322

324

Mass

Obr. 18. Rozdělení výskytu jednotlivých isotopů. Jako nosný plyn ve zmlžovači byl použit dusík, optimální parametry přístroje byly následující: spray voltage 4,5 kV, capillary voltage 3 V, heated capillary temperature 75 – 100 °C, tube lens offset 50 V, sheath gas flow rate a auxiliary gas flow rate 30 arbitrary units. Vzorek byl přiváděn do ESI zdroje přes jehlu kapilárou rychlostí toku 5 μL min-1. Spektrum bylo sledováno v rozsahu m/z 50 až 2000.

61

Instrumentace a analýza Disociace vyvolaná srážkou (CID) hmotnostně vybraného prekurzoru byla dosahována pomocí rf-excitace iontů v inertní atmosféře helia přítomného v iontové pasti jako kolizní partner. Kolizní energie byla optimalizována pro každý jednotlivý experiment a byla vyjádřena hodnotou vztaženou k normalizované kolizní energii (NCE) danou výrobcem (%), která se udává v rozsahu od 0 do 100 % v souladu s rezonancí excitačního signálu (0 – 2,5 V) se střídavým proudem (zero-to-peak) za dlouhodobé frekvence sledovaného komplexu. Tato energie závisí na hodnotě m/z daného komplexu (rodičovského iontu), proto ji nelze vyjádřit přímo ve voltech. Měření bylo nejprve prováděno a optimalizováno na modelových roztocích složených z dusičnanu kademnatého, či olovnatého, chloridu kademnatého a šťavelové kyseliny (OA) podle schématu uvedeného v tab. 8. Tab. 8. Složení jednotlivých analyzovaných modelových roztoků (mol L-1) označení

CdCl2

Cd(NO3)2

Pb(NO3)2

2,5·10-5

A

2,5·10-5 2,5·10-5

B

OA 2,5·10-5

2,5·10-5

C D

2,5·10-5

E

1,25·10-5

2,5·10-5 2,5·10-4

1,25·10-5

2,5·10-5

Následně byly i půdní roztoky analyzovány stejným způsobem jako roztoky modelové, přítomnost komplexů identifikovaných v modelových roztocích byla provedena na základě srovnání dceřiných fragmentů po aplikaci tandemového MS/MS měření.

62

Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou

3 Výsledky a diskuse 3.1 Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou Šťavelová kyselina (OA) je významným organickým ligandem pro většinu přechodných kovů, se kterými tvoří poměrně stabilní komplexy [Jaklová Dytrtová et al. 2011d]. Protože OA patří mezi významné rostlinné exudáty a byl pozorován jejich průchod umělými fosfolipidovými membránami [Navrátil et al. 2010], je důležité pro pochopení možností průchodu komplexů znát jejich strukturu a stabilitu. V tomto oddíle bylo cílem charakterizovat možné komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou v modelových roztocích s využitím ESI-MS, příčemž bylo navázáno na studie elektrochemické [Jaklová Dytrtová 2008; Jaklová Dytrtová et al. 2009b]. Modelové roztoky byly připraveny buď z dusičnanu kademnatého a dihydrátu šťavelové kyseliny nebo z chloridu kademnatého a dihydrátu šťavelové kyseliny (popřípadě jejich kombinací), aby tak byly zastoupeny významné anionty vždy přítomné v půdě (půdním roztoku).

3.1.1 Šťavelová kyselina s dusičnanem kademnatým Pomocí ESI-MS v modelovém roztoku (viz [Jakl et al. 2010a]) sestávajícím z Cd(NO3)2 a šťavelové kyseliny (OA) byly nalezeny 3 pozitivně nabité komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou (tab. 9, obr. 19). V roztoku je kadmium přítomno jako dvojmocný kation a jako Cd(II) i tvoří komplexy se šťavelovou kyselinou. Avšak během ionizačního procesu (vkládané napětí 4,5 kV) způsobil redoxní děj redukci Cd(II) na Cd(I). Podobné procesy jsou v literatuře popsány, zejména jedná-li se o redukci dvojmocných kationtů v přítomnosti chelatačních látek [Tsierkezos et al. 2009a]. Nalezeným komplexům kadmia se šťavelovou kyselinou náležejí molekulové hmotnosti 239,9; 257,9 a 271,9 (jedná se o jedenkrát nabité komplexy). Pro komplex s m/z 240 by mohlo existovat i jiné vysvětlení než je podáno v tab. 9; mohl by být představován komplexem o složení: [Cd(H2O)7]+, ale jeho existence byla vyloučena měřením, kde byla veškerá H2O (Mr = 18) nahrazena D2O (Mr = 19). První

komplex

[Cd(OA)(H2O)2]+

má

m/z

poměr

240,

druhý

komplex

[Cd(OA)(H2O)3]+ obsahuje jednu molekulu vody navíc oproti prvnímu komplexu; tento

63

Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou komplex byl též popsán v krystalické formě [Huang et al. 1990]. Třetí komplex [Cd(OA)(H2O)2(CH3OH)]+ obsahuje místo jedné molekuly vody molekulu methanolu. Vzhledem k těmto výsledkům lze strukturu [Cd(OA)(H2O)2]+ považovat za základní. Při vyšších hodnotách poměru m/z bylo pozorováno několik di- a trinukleárních klastrů výše popsaných komplexů. Tab. 9. Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou ve směsi methanol/voda (1:1 v/v). Molekulová hmotnost

Navržený vzorec

Označení v obr. 19

[239,9]+

114 + 90 + 2·18 = 240 [Cd(OA)(H2O)2]+

[257,9]+

240 + 18 = 258 [Cd(OA)(H2O)3]+

[271,9]

+

1 2 +

240 + 32 = 272 [Cd(OA)(H2O)2(CH3OH)]

3

24000

3

intensity, cps

20000

1

16000 12000

2

8000 4000 0 230

235

240

245

250

m/z

255

260

265

270

275

270

275

intensity, cps

10000 8000

3

6000 4000

1

2000 0 230

2 235

240

245

250

m/z

255

260

265

Obr. 19. a) ESI-MS spektra (pozitivní mód) Cd(NO3)2 (2,5·10-5 mol L-1) a šťavelové kyseliny (2,5·10-5 mol L-1) v methanol/voda (1:1 v/v). b) MS/MS rodičovského iontu

m/z 271,9 při Ecoll = 20%, izolační šířka ± 5. Legenda viz tab. 9.

64

Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou

3.1.2 Šťavelová kyselina s chloridem kademnatým Analýza složení modelových roztoků pomocí ESI-MS (viz [Jaklová Dytrtová et al. 2011d]) byla použita také na systém obsahující CdCl2 a OA, kde bylo nalezeno několik záporně nabitých kadmiových komplexů (obr. 20) srovnáním se simulovanými poměry isotopů (paterny). Za podmínek slabé ionizace poskytuje silný signál negativní mód, v němž se objevuje deprotonovaná šťavelová kyselina (OA-H, m/z 89) a její dimer s jedním vázaným vodíkem [OA-H • OA]− (m/z 179). Dále bylo potvrzeno, že deprotonovaná šťavelová kyselina váže 2 molekuly vody [(OA-H)(H2O)2]− (m/z 125). V negativním módu bylo kromě nich identifikováno několik komplexů obsahujících kadmium, jimž byl empiricky přiřazen vzorec [Cdn(X,Y)(2n+1)]−, kde n je počet atomů kadmia a X a Y značí jednovazné aniontové ligandy, tedy X = Cl− a Y = (OA-H)−. Většina komplexů předpovězených

na

základě

tohoto

vzorce

byla

identifikována

podle

charakteristických poměrů isotopů, viz obr. 20. Část záznamu A ukazuje jednoatomové specie kadmia [CdCl3]− (m/z 219), [CdCl2(OA-H)]− (m/z 273), [CdCl(OA-H)2]− (m/z 327) a [Cd(OA-H)3]− (m/z 381). Část B ukazuje dvouatomové specie [Cd2Cl4(OA-H)]− (m/z 457), [Cd2Cl3(OA-H)2]− (m/z 511), [Cd2Cl2(OA-H)3]− (m/z 565) a [Cd2Cl(OA-H)4]− (m/z 619). Část C představuje slabší signály příslušející tříatomovým klastrům jako je [Cd3Cl6(OA-H)]− (m/z 641), [Cd3Cl5(OA-H)2]− (m/z 695) a [Cd3Cl4(OA-H)3]− (m/z 749). Všechny hodnoty m/z jsou uvedeny pro kombinaci isotopů s největším zastoupením, 114Cd a 35Cl.

65

Komplexy kadmia se šťavelovou kyselinou 7000 -

[CdCl3]

A

-

[CdCl2(OA-H)]

-

[CdCl(OA-H)2] 0 2500

250

300

-

[Cd(OA-H)3]

350

400

-

[Cd2Cl3(OA-H)2]

B

intensity

-

[Cd2Cl2(OA-H)3]

-

[Cd2Cl4(OA-H)]

-

[Cd2Cl(OA-H)4]

0 500

450

500

550

600 -

[Cd3Cl5(OA-H)2]

C -

[Cd3Cl4(OA-H)3]

-

[Cd3Cl6(OA-H)]

0 640

660

680

m/z

700

740

760

Obr. 20. ESI-MS spektra (záporný mód) roztoku CdCl2 (5·10-6 mol L-1) a šťavelové kyseliny (5·10-4 mol L-1) ve vodě. Rozsah vertikální osy poskytuje měření pro relativní iontový proud vytvářený při ionizaci elektrosprayem. Hodnota pH modelového roztoku byla asi 4,5 a nebyla upravována na pH odpovídající půdnímu roztoku, jelikož by mohl přídavek pufru (jakož i NaOH) způsobit překrytí signálů studovaných komplexů v ESI-MS. Zejména solvatované alkalické kationty (jako je Na+ a K+) a jejich aniontové klastry (např. NanCl(n+1)–) by pak vzhledem k jejich nadbytku v roztoku převládly ve spektru. Obdobně přídavek vhodného pufru, jako je acetátový nebo borátový, způsobuje přítomnost ligandů pufru v komplexech s Cd. Jako kompromis mezi rozdílným pH a nežádoucími změnami složení byly modelové roztoky ponechány bez úpravy.

66

Komplexy kadmia a olova se šťavelovou kyselinou

3.2 Komplexy kadmia a olova se šťavelovou kyselinou 3.2.1 Šťavelová kyselina s dusičnanem kademnatým a olovnatým V modelovém roztoku (viz [Jaklová Dytrtová et al. 2011d]) připraveném z Cd(NO3)2, Pb(NO3)2, šťavelové kyseliny, vody a methanolu (jako volatilního rozpouštědla) v pozitivním módu ESI [Jaklova Dytrtova et al. 2010] byly nalezeny především „jednoduché“ komplexy Pb (obr. 21); kromě [Pb(NO3)(CH3OH)]+ též [Pb(OA-H)(CH3OH)]+ a [Pb(OA-H)(H2O)2]+. Také byly identifikovány dva „směsné“ komplexy Cd/Pb: komplex [CdPb(OA-H2)(NO3)(H2O)3(CH3OH)3]+ pro m/z = 558 (hlavní isotopy

208

Pb a

114

Cd) a komplex [CdPb(OA-H2)(NO3)(H2O)2(CH3OH)2]+ pro

m/z = 572. Podobné experimenty byly prováděny bez přítomnosti methanolu a objevily se podobné komplexy: [Cd(OA-H)(H2O)n]+, kde n je 2, 3, 4, a [CdPb(OA-H)2(H2O)4]+.

10000

intensity, cps

8000 6000 4000 2000 0 100

1 200

300

400

m/z

2

500

600

Obr. 21. ESI-MS spektrum Pb(NO3)2, Cd(NO3)2 (obě 1,25·10-5 mol L-1) a šťavelové kyseliny (2,5·10-5 mol L-1) ve směsi methanol/voda (1:1) v pozitivním modu; 1 – [CdPb(OA)(H2O)3NO3(CH3OH)3]+ a 2 – [CdPb(OAH)2(H2O)4]+.

67

Komplexy kadmia s citronovou kyselinou

3.3 Komplexy kadmia s citronovou kyselinou 3.3.1 Citronová kyselina s chloridem kademnatým Ve spektru pozitivního modu (obr. 22) jsou ukázány komplexy kadmia s citronovou kyselinou (CA), které je možné rozdělit do tří skupin podle stupně deprotonace CA přpadně podle přítomnosti Cl v komplexu; uvedené hodnoty m/z jsou platné pro lehké isotopy (1H,

12

C,

35

Cl, and

110

Cd): (i) dikationty v neutrálním ligandem CA: [Cd(CA)2]2+

(m/z 247) a [Cd(CA)3]2+ (m/z 342); (ii) monokationty s deprotonovanou CA jako ligandem (CA-H): [Cd(CA-H)(H2O)]+ (m/z 319), [Cd(CA)(CA-H)]+ (m/z 493) a [Cd(CA)2(CA-H)]+ (m/z 685); (iii) monokationty s neutrální CA Cl- jako ligandy, jejichž původ lze odvodit z chloridu kademnatého: [CdCl(CA)]+ (m/z 337). Vysokou schopnost CA tvořit komplexy lze též doložit na přítomnosti jejích komplexů se sodíkem a draslíkem, které byly v roztoku přítomny jako menšinové kontaminanty. Komplex s největším zastoupením byl [Cd(CA)(CA-H)]+. 6

300

m/z

500

+

[Cd(CA)2(CA-H)]

[K(CA)2]

+

400

510

[Cd(CA)(CA-H)]

500

+

490

[Na(CA)2]

2+

[Cd(CA)3]

2+

[Cd(CA)2]

0 200

+

6

1x10

[CdCl(CA)]

[Cd(CA-H)(H2O)]

+

[Na(CA)]

Intensity

+

+

2x10

700

Obr. 22. MS spektrum pozitivního modu ESI roztoku obsahujícího CdCl2 (5·10-5 mol L-1) a citronovou kyselinu (CA, 5·10-4 mol L-1) v deionizované vodě jako rozpouštědle. Obr. 23 ukazuje fragmentaci hlavních komplexů vznikajících z CdCl2 a CA, tj. [Cd(CA)(CA-H)]+ a [CdCl(CA)]+, přičemž stabilnější z těchto dvou komplexů je [CdCl(CA)]+ jeho AE (prahová energie) má hodnotu 170 kJ mol-1, kdy je možné říci, že ion chlóru má výraznější stabilizující účinek, než je tomu u homoligandového komplexu [Cd(CA)(CA-H)]+, jehož AE je 124 kJ mol-1.

68

Komplexy kadmia s citronovou kyselinou

100

+

[CdCl(CA)] + [CdCl(AcA)] + [CdCl(OgA)] + [CdCl(GaA)]

AE = 170 kJ mol

50

0

0

20

Normalized intensity

Normalized intensity

100

-1

40 60 Ecoll(%)

80

100

+

[Cd(CA)(CA-H)] + [Cd(AcA)(CA-H)] + [Cd(CA)(GaA)]

50 -1

AE = 124 kJ mol

0

0

20

40 60 Ecoll(%)

80

100

Obr. 23. Energeticky závislé fragmentace hlavních iontů spekter (a) [CdCl(CA)]+, (b) [Cd(CA)(CA-H)]+ odvozené z nezávislých CID experimentů; AcA – akonitová kyselina, GaA – glutakonitová kyselina, OgA – 3-oxoglutarová kyselina. Na základě informací získaných z CID spekter bylo možné sestavit schema (obr. 24) pravděpodobného rozpadu CA během elektroionizačního procesu. Děje v elektrosprayi mohou naznačit, jakým způsobem se může CA v přírodě přeměňovat a jaké jsou pravděpodobné produkty jejího rozpadu. Z CA je energeticky nejdostupnější nejprve odštěpení jedné molekuly vody za vzniku akonitové kyseliny (AcA) se sumárním vzorcem C6H6O6. Dále potom odštěpením vody a skupiny COO (Mr 44) vzniká glutakonitová kyselina (GaA) se sumárním vzorcem C5H6O4; prakticky zde dochází k nahrazení celé karboxylové skupiny vodíkem. Energeticky nejnáročnější přeměnou je odštěpení COOH2 (Mr 46), kdy dochází k přesmyku a vzniku vazby C=O, vzniká tak 3-oxoglutarová kyselina (OgA) se sumárním vzorcem C5H6O5.

69

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou

Obr. 24. Schéma pravděpodobného rozpadu citronové kyseliny v ESI.

3.4 Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou Dalším

významným

rostliným

exudátem

z hlediska

potenciálního

stresu

kontaminací rizikovými prvky je jablečná kyselina (2-hydroxybutanová kyselina, MA), o níž se též předpokládá, že tvoří s kovy více méně stabilní komplexy a hraje důležitou roli v příjmu rizikových prvků [Jones 1998]. Jablečná kyselina je kyselinou obsahující dvě karboxylové skupiny a jednu hydroxylovou, je schopna disociovat do druhého stupně (pKa1 = 3,40 a pKa2 = 5,20) [Bylund et al. 2007].

3.4.1 Jablečná kyselina s chloridem a jodidem kademnatým Obr. 25 ukazuje hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu roztoku jablečné kyseliny (MA) a CdCl2 ve vodě získaný mírnými ionizačními podmínkami, pro které převládá předpoklad tvorby vícesubstituovaných komplexů [Cech, Enke 2001; Schröder et al. 2002; Trage et al. 2006]. Hlavní pozorované ionty ve spektru lze rozdělit do dvou skupin (uvedené hodnoty

m/z jsou pro lehké isotopy 1H,

12

C,

35

Cl,

127

I, and

110

Cd): (i) Několik Cd(II) komplexů

obsahuje chloridový anion (z prekurzoru kademnaté soli), např. [CdCl(MA)]+ (m/z 279) a [CdCl(MA)2]+ (m/z 413). (ii) Ostatní komplexy Cd(II) sestávají z deprotonované

70

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou jablečné kyseliny [MA-H]− jako aniontového ligandu, např. [Cd(MA-H)]+ (m/z 243) a s ním související (a více zastoupený) adukt s vodou [Cd(MA-H)(H2O)]+ (m/z 261), nejvíce zastoupený komplex [Cd(MA-H)(MA)]+ (m/z 377) a komplex s vyšším zastoupením ligandů [Cd(MA-H)(MA)2]+ (m/z 511). 6

372

+

378

384

[Cd(MA)2(MA-H)]

+

+

300

zoom

390

[CdCl(MA)2]

0

[Cd(MA)(MA-H)]

1x10

[CdCl(MA)]

6

[Cd(MA-H)(H2O)]

Intensity

+

+

2x10

375

m/z

450

525

Obr. 25. Hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu v rozsahu m/z 250 až 550 směsi jablečné kyseliny (MA, 5·10-3 mol L-1) a CdCl2 (5·10-4 mol L-1) v deionizované vodě. Jako příklad isotopového otisku nejvíce zastoupené spécie je ukázán komplex [Cd(MA-H)(1)]+ v rozšířené hmotnostní škále. Stechiometrie komplexu s přesnou hmotností 278.80 není určena jednoznačně, existují dvě možná řešení: (i) [CdCl(MA)]+ (s přesnou hmotností 278.89), nebo (ii) [Cd(MA-H)(H2O)]+ (s přesnou hmotností 278.94). Bohužel ani kolizní experimenty (obr.

26a)

nepotvrdily

jednoznačně

jednu

z možných

navržených

struktur.

Pozorovaná ztráta vody může pocházet jak z vody koordinované v komplexu, tak může být molekula vody odštěpena přímo z jablečné kyseliny. Pro potvrzení správné stechiometrie bylo nutné provést experimenty, ve kterých byl přítomen I- místo Cl(obr. 27). Absencí komplexu s hmotností 278.80 ve spektru získaném s použitím CdI2 bylo potvrzeno, že k jeho vzniku je třeba Cl-, navíc v roztoku s CdI2 byl pozorován analog [CdCl(MA)]+, tedy [CdI(MA)]+ s přesnou molekulovou hmotností 370,93. Oba analogy [CdX(MA)]+ (kde X značí halogenid) byly podrobeny kolizním disociačním experimentům (obr 26ab). Oba mateřské ionty vykazovaly stejný frakmentační otisk, tedy ztrátu jedné molekuly vody z ligandu jablečné kyseliny a také

71

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou přeměnu jablečné kyseliny na produkt se sumárním vzorcem C3H4O3 (PA), který lze charakterizovat např. jako pyrohroznová kyselina (2-oxopropanová kyselina). Stabilita (v tomto případě vyjádřena pomocí tzv. appearance energy) [CdCl(MA)]+ je 146 kJ mol-1, což je výrazně více než pro [CdI(MA)]+ (129 kJ mol-1), což by mohlo být přisouzeno nižší stabilitě v důsledku velikosti jódu oproti chlóru. Fragmentace nejvíce zastoupeného iontu [Cd(MA-H)(MA)]+ (obr. 26c) v obou typech roztoků (CdCl2 i CdI2) ukázala ztrátu vody z jednoho nebo z obou ligandů jablečné kyseliny a jedné karboxylové skupiny, čímž se jedna z jablečných kyselin přeměnila přímou dekarboxylací na mléčnou kyselinu (2-hydroxypropanová, LA). Komplex [Cd(MA-H)(MA)]+ má podobnou stabilitu jako [CdCl(MA)]+, tj. 140 kJ mol-1.

Normalized intensity

80

-1

40

AE = 146 kJ mol

20

0

20

40

100

Ecoll (%)

60

80 +

[Cd(MA)(MA-H)] + [Cd(FA)(MA-H)] + [Cd(FA)(LA-H)] + [Cd(FA)(FA-H)]

80

100

(b)

+

[CdI(MA)] + [CdI(FA)] + [CdI(PA)]

80

60

0

Normalized inzensity

(a)

+

[CdCl(MA)] + [CdCl(FA)] + [CdCl(PA)]

Normalized intensity

100

AE = 129 kJ mol

60

-1

40 20 0

0

20

Ecoll (%)

40

60

(c)

60 AE = 140 kJ mol

40

-1

20 0

0

20

Ecoll (%)

40

60

Obr. 26. Energeticky závislé fragmentace hlavních iontů spekter (a) [CdCl(MA)]+, (b) [CdI(MA)]+, (c) [Cd(MA)(MA-H)]+ odvozené z nezávislých CID experimentů; FA – maleinová kyselina, LA – mléčná kyselina, PA – pyrohroznová kyselina.

72

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou

5

1x10

378

0 300

375

m/z

450

384

+

372

+

366

[CdI(MA)]

5

[Cd(MA-H)(H2O)]

Intensity

2x10

zoom

[Cd(MA)2(MA-H)]

[Cd(MA)(MA-H)]

+

5

+

3x10

525

Obr. 27. Hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu v rozsahu m/z 250 až 550 směsi jablečné kyseliny (MA, 5·10-4 mol L-1) a CdI2 (5·10-5 mol L-1) v deionizované vodě. Jako příklad isotopového otisku nejvíce zastoupených specií jsou ukázány komplexy [Cd(MA-H)(MA)]+ a [CdI(MA)]+ v rozšířené hmotnostní škále. Podobně jako u CA bylo možné na základě informací získaných z CID spekter sestavit schema (obr. 28) pravděpodobného rozpadu MA během elektroionizačního procesu. Děje v elektrosprayi mohou naznačit, jakým způsobem se může MA v přírodě přeměňovat a jaké jsou pravděpodobné produkty jejího rozpadu.

Obr. 28 Schéma pravděpodobného rozpadu jablečné kyseliny v ESI.

73

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou Z MA je energeticky nejdostupnější za odštěpení jedné molekuly vody a vzniku fumarové resp. maleinové kyseliny (FA) se sumárním vzorcem C6H6O6. Dále potom odštěpením skupiny COO (Mr 44), tedy formálně dekarboxylací vznikne mléčná kyselina (LA) se sumárním vzorcem C3H5O3. Další postupnou přeměnou, sumárně odštěpením COOH2 (Mr 46), dojde k přesmyku na C=O, a produktem je pak pyrohroznová kyselina (PA) se sumárním vzorcem C3H4O3. Na formování komplexů má jistě vliv i přítomnost dalších aniontů i kationtů, z toho důvodu byl navržen experiment, kdy do původního roztoku CdCl2 s jablečnou kyselinou byl přidán KCl ve výsledné koncentraci 10-6 mol L-1. Význam tohoto experimentu je dvojí, KCl je v elektrochemii běžně používaný základní elektrolyt, který je vhodný i pro elektrochemické studie komplexů nízkomolekulárních organických kyselin s kovy [Jaklová Dytrtová et al. 2011c; Jaklová Dytrtová et al. 2009b; Jaklová Dytrtová et al. 2008], a také protože je přítomnost draslíku (stejně jako chlóru) v půdním roztoku očekávatelná; všechny uvedené hodnoty m/z jsou vztaženy k isotopu 39K. Přítomnost K+ v roztoku se projeví výskytem [K(MA)2]+ specie (m/z 308) ve spektru (obr. 29).

0 250

300

+

400

m/z

500

+

[Cd2(MA-H)3]

[CdK(MA)(MA-H)2]

[CdKCl2(MA)2]

+

+

[Cd(MA)(MA-H)]

+

[Cd(LA)(PA)]

+

6

[CdCl(MA)]

1x10

[Cd(MA-H)(H2O)]

+

[K(MA)2]

+

6

Intensity

2x10

600

Obr. 29. Hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu v rozsahu m/z 250 do 650 směsi jablečné kyseliny (MA, 5·10-4 mol L-1) a CdCl2 (5·10-5 mol L-1) v deionizované vodě za přítomnosti KCl (10-6 mol L-1); PA – pyrohroznová kyselina.

74

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou Celá molekula KCl byla inkorporována do [CdCl(MA)2]+ (m/z 413), což vedlo ke vzniku klastru [CdKCl2(MA)2]+ (m/z 487). Vznik specie [CdK(MA)(MA-H)2]+ (m/z 549) lze vysvětlit konjugací [CdCl(MA)2]+ a [K(MA)2]+ za současné disociace dvou molekul HCl. Zavěrem je též zajímavé zjištění, že KCl v roztoku zvyšuje intenzitu měřeného signálu téměř o jeden řád, což může být přičteno zvyšené vodivost roztoku [Jaklová Dytrtová et al. 2011a]. Podobným způsobem byla zjišťována komplexace za přítomnosti širšího spektra minerálních látek představovaných mírně komplikovanou matricí kohoutkové vody, kdy byl měřen roztok jablečné kyseliny (2.5·10-4 mol L-1) s CdCl2 (2.5·10-5 mol L-1) ve směsi v/v deionizovaná voda/kohoutková voda (1:1) (obr. 30). Nejvíce zastoupenými speciemi jablečné kyseliny byly [Cd(MA-H)(MA)]+ (m/z 377) a [K(MA)2]+ (m/z 308), přičemž intenzita signálu byla cca o jeden řád nižší než v roztoku 10-6 mol L-1 KCl. 5

[Cd(MA)(MA-H)]

+ +

0 250

[K(MA)2]

5

[CdCl(MA-H)]

2x10

[Cd(MA-H)(H2O)]

+

Intensity

+

4x10

300

m/z

350

400

Obr. 30. Hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu v rozsahu m/z 250 do 400 směsi jablečné kyseliny (MA, 2,5·10-4 mol L-1) a CdCl2 (2,5·10-5 mol L-1) ve směsi v/v deionizovaná voda/kohoutková voda (1:1). Analogickým způsobem byl zjišťován i vliv matrice půdního roztoku získaného z lesního pokusu s olší [Jakl et al. 2011; Kuneš et al. 2009] (obr. 31). Kromě signálu nejvíce zastoupené specie kadmia a jablečné kyseliny [Cd(MA-H)(MA)]+ (m/z 377) byl pozorován i signál náležející [Na(MA)]+ (m/z 157, hodnota uvedena pro

23

Na), který

v porovnání s draselným komplexem obsahoval jen jednu molekulu jablečné kyseliny, což lze vysvětlit menším průměrem sodíkového kationtu v porovnání s draselným kationtem.

Absolutní

intenzita

[Cd(MA-H)(MA)]+

je

srovnatelná

s intenzitou

75

Komplexy kadmia s jablečnou kyselinou v deionizované vodě (obr. 26), což, s přihlédnutím k tomu, že jablečná kyselina jako ligand i kadmium (oba ve stejné koncentraci jako v experimentu z obr. 26) jako centrální atom budou disipovány mezi složky půdního roztoku, lze vysvětlit zvýšenou

300

350

m/z

+

[Cd(MA)2(MA-H)]

+

[CdCl(MA)2]

+

[Cd(MA-H)(H2O)]

[Na(MA)] 0 150

[Cd(MA)(MA-H)]

6

+

1x10

[CdCl(MA)]

6 +

2x10

+

vodivostí roztoku deionizovaná voda/půdní roztok (1:1).

400

450

500

550

Obr. 31. Hmotnostní spektrum ESI v pozitivním modu v rozsahu m/z 150 až 550 směsi jablečné kyseliny (MA, 5·10-3 mol L-1) a CdCl2 (5·10-4 mol L-1) ve směsi v/v deionizovaná voda/půdní roztok (1:1).

76

Komplexy v půdním roztoku

3.5 Komplexy v půdním roztoku 3.5.1 Nádobový pokus s vrbou v kontaminované půdě z lokality Litavka Na voltamogramech půdního roztoku odebraného od vrby [Jaklová Dytrtová et al. 2011d] byl nalezen „jednoduchý“ komplex Pb se šťavelovou kyselinou a také „směsný” komplex Cd a Pb se šťavelovou kyselinou. Identifikace těchto komplexů byla založena na analýze posuvu potenciálu píků [Jaklová Dytrtová et al. 2009b]. Stabilita “směsného” komplexu je o něco vyšší než je stabilita komplexu Pb-šťavelová kyselina, hodnoty následných konstant stability „směsného“ komplexu byly stanoveny na log(β1) = 4,67 a log(β2) = 8,62 [Jaklová Dytrtová et al. 2009b] a pro „jednoduchý“ komplex log(β1) = 3,30 and log(β2) = 5,00 [Nyholm, Wikmark 1989], ale oba komplexy je třeba považovat za labilní [Berbel et al. 1997]. Na voltamogramech půdního roztoku nebyl nalezen žádný pík ani volného Cd, ani Pb, vzhledem k relativnímu přebytku šťavelové kyseliny nad celkovým množstvím Cd a Pb (tab. 10). Vazba s dalšími organickými látkami je samozřejmě možná, nicméně žádný signál náležející těmto komplexům s Cd a Pb nebyl ve voltamogramech nalezen. V rámci aproximace metody k určení konstant stability [Heyrovský, Kůta 1962] byla existence všech potenciálních ligandů a volných iontů Cd a Pb zanedbána. Bylo stanoveno, že „jednoduchý“ komplex olova obsahuje jeden atom olova a jeden ligand šťavelové kyseliny [Nyholm, Wikmark 1989]. Lze předpokládat, že se pík „směsného“ komplexu překrývá s píkem (píky) náležejícím(i) „jednoduchému“ („jednoduchým“) komplexu (komplexům) kadmia. Během vegetačního období měla koncentrace kadmia v půdním roztoku narůstající trend od 1,0·10-7 mol L-1 přes 1,6·10-6 mol L-1 k 3,0·10-6 mol L-1. Na druhou stranu se výška jakož i pozice píku „směsného“ komplexu měnila (od 37 nA ~ 541,5 mV (1. odběr) přes 390 nA ~ 551,0 mV (2. odběr) ke 290 nA ~ 550,0 mV (3. odběr); obr. 32). Variabilita potenciálu píku „směsného“ komplexu závisí na poměru koncentrací Cd/Pb, což je v souladu s lineárním vztahem mezi tímto poměrem a potenciálem píku [Jaklová Dytrtová et al. 2009b]. Rozpor mezi výškou píku může pocházet z rozdělení OA (jakožto ligandu) mezi další prvky uvolněné z pevné části půdy do půdního roztoku [Jakl et al. 2007]. Lze říci, že nadbytek Cd způsobuje posun

77

Komplexy v půdním roztoku potenciálu k negativnějším hodnotám. Na základě toho se dá v komplexech očekávat záměna olova za kadmium. Tímto způsobem se „směsný“ komplex transformuje do „jednoduchých“ komplexů Cd. Vzhledem k možnosti, že zobrazený pík „směsného“ komplexu představuje též píky „jednoduchých“ komplexů kadmia, interpretace ve smyslu stanovení koncentrace komplexu je komplikovaná a díky překryvu nemůže být stanovena ani koncentrace „směsného“, ani „jednoduchého“ komplexu kadmia. 400

A

-7

-1

-7

-1

400

Cdtotal = 1.010 mol L

400

B

Pbtotal = 4.410 mol L

pH 6.2 pH 1.0

100

0 -800

-600

-400

-200

E/mV

0

-8

-1

Pbtotal = 6.410 mol L

-1

200

-1

300

-5

pH 7.0 pH 1.0

100

200

0 -800

-600

-400

-200

E/mV

0

200

-6

-1

-7

-1

Cdtotal = 3.010 mol L -4

300

-1

OAtotal = 6.710 mol L

200

C

Pbtotal = 1.310 mol L

i/nA

-5

OAtotal = 1.810 mol L

i/nA

i/nA

300

-6

Cdtotal = 1.610 mol L

-1

OAtotal = 4.510 mol L

200

pH 7.6 pH 1.0

100

0 -800

-600

-400

-200

0

200

E/mV

Obr. 32. Voltamogramy půdních roztoků odebíraných v průběhu vegetace vrby (A – 1. odběr, B – 2. odběr, C – 3. odběr). DPASV, scan od -900 do +250 mV, Eacc = -900 mV, tacc = 30 s, výška pulsu 50 mV, rychlost scanu 10 mV s-1, délka pulsu 80 ms, klidová doba 10 s. Celkové koncentrace Cd a Pb byly stanoveny s relativní standardní chybou ≤ 3%. Celková koncentrace olova v půdním roztoku se v průběhu vegetace měnila od 4,4·10-7 mol L-1 přes 6,4·10-8 mol L-1 k 1,3·10-7 mol L-1, zatímco výška píku „jednoduchého“ komplexu olova (při ca. -450 mV) se změnila z 20 nA (1. odběr) k ca. 10 nA (2. a 3. odběr). Pokles celkové koncentrace nebyl v rámci chyby signifikantní. Příjem olova a kadmia vrbou Smithovou byl shodně relativně nízký (tab. 11); vrba akumulovala do sušiny biomasy pouze 15,8 mg kg-1 Cd a 2.8 mg kg-1 olova. V půdním roztoku bylo množství Cd i Pb o 1 až 2 řády nižší než množství šťavelové kyseliny (tab. 10), na druhou stranu se dá očekávat komplexace šťavelové kyseliny s dalšími prvky přítomnými v půdním roztoku, podobně tak i komplexace Cd a Pb s jinými organickými ligandy (téměř neznámými). Rozdělení kovů mezi mnoho specií je očekávatelné a tvoří dynamickou rovnováhu půdního roztoku jako systému a umožňuje zadržet relativně vysoká množství rizikových prvků v matrici půdního roztoku. Desetkrát zředěný půdní roztok byl schopen při nezměněném pH plně absorbovat 6 µg L-1 Cd2+ [Jakl et al. 2007]. Tento systém vytváří podmínky pro

78

Komplexy v půdním roztoku přiblížení prostředí rostlin jejich fyziologickému optimu. Exudace šťavelové kyseliny vrbou dosahovala o řád vyššího množství než Cd a Pb v prvním a druhém odběru a ve třetím dokonce o dva řády (téměř 150krát) vyšší množství. Tab. 10. Celková množství nejčastěji přítomných prvků a karboxylových kyselin

(mol L-1) v půdním roztoku vrby (relativní standardní chyba instrumentace pro prvky ≤ 3 %, pro kyseliny ≤ 5 %) pH

Cd

Cu

Pb

Zn

FA

OA

OA/(Cd+Pb)

μmol L-1 1. odběr

6,2

0,102

2. odběr

7,0

3. odběr

7,6

0,114

0,437

31,6

6,50

18,0

33

1,61

0,208 0,0637

370

140

67,0

40

2,97

0,724

762

0,076

450

145

0,134

Tab. 11. Celkové obsahy rizikových prvků (mg kg-1 s.hm.; n = 3) v nadzemní biomase

vrby s.hm.*

Cd

sm.odch. *

Cu

Zn

mg kg-1

g průměr

Pb

2,1

15,82

2,80

11,51

1290

±1%

±0,80

±0,10

±0,50

±35

hmotnost sušiny V půdním roztoku se vyskytuje v relativně vysokých koncentracích chlór, který

tvoří druhý ligand (kromě OA) v negativně nabitých komplexech. Koncentrace chloridových iontů v půdním roztoku vrby byla 2,4 mg L-1 ± 2% (stanoveno IEC s vodivostním detektorem). Při použití ESI-MS byly v půdním roztoku nalezeny některé komplexy kadmia obsahující šťavelovou kyselinu a chlór stejné jako v modelovém roztoku: [CdCl3]−, [CdCl2(OA-H)]− a [CdCl(OA-H)2]− (obr. 33). Signály nebo isotopové paterny dalších komplexů byly příliš nízké nebo komplikované na to, aby mohly být spolehlivě identifikovány. Vzhledem k vyššímu pH půdního roztoku (6,2 až 7,6) oproti modelovému roztoku (pH asi 4,5) byla přítomna šťavelová kyselina také v plně deprotonované formě (OOC-COO)2− (označeno jako OA-H2) a obdobně byly nalezeny komplexy [CdCl(OA-H2)]− a [CdCl(OA-H2)(H2O)]−. Tyto specie se vyskytují

79

Komplexy v půdním roztoku také v modelových roztocích, ale v mnohem menším zastoupení, což lze právě přisoudit rozdílnému pH. 4

4x10

-

intensity

[CdCl3]

4

2x10

-

[CdCl(OA-H2)(H2O)] [CdCl(OA-H2)] [CdCl2(OA-H)] [CdCl(OA-H)2]

0 200

250

m/z

300

350

400

Obr. 33. ESI-MS spektra třetího odběru půdního roztoku od vrby (zředěno 2x deionizovanou vodou) Při voltametrických měřeních (kdy úprava pH neovlivňuje intenzitu signálu [Jaklová Dytrtová et al. 2009b] a není pro reálné vzorky nezbytná) půdního roztoku, kde bylo vedle Cd přítomno Pb, se vyskytoval překryv komplexů kadmia se šťavelovou kyselinou „směsným“ komplexem kadmia a olova. Z tohoto důvodu nemůže být počet ligandů stanoven ani pro „jednoduché“ komplexy Cd, ani pro „směsný“ komplex Cd a Pb [Jaklová Dytrtová et al. 2009b]. “Jednoduché” komplexy Cd i „směsné“ komplexy Cd a Pb byly ve voltamogramech (obr. 32) přítomny jako jeden pík, který se po okyselení (pH 1) rozdělil, protože se komplexy rozpadly. Z důvodu relativně vysoké koncentrace chloridových iontů v půdním roztoku (u vrby 2,4 mg L-1 ± 2%; stanoveno IEC) byly v MS-spektru hojně zastoupeny Cl-komplexy, a to i s dalšími kovy (Zn). Interpretace spekter půdních roztoků je komplikovaná s ohledem na relativně nízké

koncentrace

kadmia

a

šťavelové

kyseliny

a

přítomnosti

mnoha

neidentifikovaných organických i anorganických látek. V použitém vzorku nebyly intenzity „směsných“ komplexů Cd-Pb v ESI-MS signifikantní, nicméně byly nalezeny i v pozitivním módu [Jaklova Dytrtova et al. 2010]. Zařazení chromatografické separace před ESI by sice pomohlo identifikovat více komplexů, ale také by mohlo

80

Komplexy v půdním roztoku dojít k úplné změně zastoupení spécií v půdním roztoku. Je pouze možné realizovat modelové experimenty a zahrnout více citlivé (avšak méně selektivní) voltametrické techniky. Byl potvrzen velmi důležitý aspekt chování Cd v půdním roztoku, a to, že se vyskytuje především ve formě komplexů; nebyly nalezeny volné ionty Cd ani pomocí ESI-MS, ani DPASV. V tomto smyslu je tedy třeba zaměřit studium na to, zda je Cd schopno vstupovat do rostlinných buněk skrz polopropustnou membránu ve formě komplexů [Navratil et al. 2009; Navratil et al. 2010] spíš, než se omezovat na studium nekomplexovaných hydratovaných kationtů.

81

Dvoufázové hydroponické experimenty

3.6 Dvoufázové hydroponické experimenty 3.6.1 Průběžné změny koncentrace vybraných prvků v roztoku Půdní roztok je jednou z nejdynamičtějších složek půdy [Kabata-Pendias 2001] a reflektuje svým složením působení rostliny na půdu, proto bylo průběžné sledování celkových obsahů Cd, Pb, Cu a Zn v půdním roztoku využito ke zjednodušenému popisu působení rostliny na uvolňování těchto kovů z půdy do půdního roztoku respektive jejich příjem rostlinou. Za účelem zevrubného studia byla též provedena postupná extrakce studovaných půd (tab. 7, kap. 2.2), jejíž výsledky byly dále podrobeny korelační analýze s obsahy prvků v rostlinných částech, přičemž korelační analýza neodhalila významnou souvislost (p < 0,05) mezi naakumulovaným množstvím prvků a jejich obsahy v jednotlivých frakcích půdy. Dále, aby byl eliminován vliv úbytku organické hmoty na půdní sorpci, byl v půdě stanoven obsah oxidovatelného uhlíku (tab. 12) po ukončení hydroponických experimentů. Nejprve byl roztok s povrchu půdy odsán, půda byla usušena, homogenizována a analyzována. Porovnáním s tab. 4 (kap. 2.2) vyplývá, že k mírnému úbytku uhlíku sice došlo, ale je průkazný pouze u půdy Píšťany a u půdy Litavka s pěstovanou A. glutinosa. Nebyly nalezeny ani průkazné rozdíly mezi pěstovanými rostlinami na jednotlivých půdách, opět vyjma varianty Litavka – A. glutinosa. Tento výsledek je očekávatelný z hlediska délky pokusu, a také s ohledem na exudační činnost rostlin. Tab. 12. Obsah oxidovatelného uhlíku v půdě po sklizni rostlina

půda

průměr

sm.odch.

Píšťany

1,49

0,08

A. glutinosa Píšťany

1,59

0,03

S. caprea

Píšťany

1,53

0,04

A. incana

Příbram

2,23

0,06

A. glutinosa Příbram

2,25

0,09

S. caprea

Příbram

2,32

0,12

A. incana

Litavka

1,08

0,02

A. glutinosa Litavka

0,75

0,10

Litavka

0,97

0,18

A. incana

S. caprea

82

Dvoufázové hydroponické experimenty Zjednodušeně lze říci, že v průběhu pokusu probíhaly závisle na sobě dva protichůdné procesy, tj. příjem prvků rostlinou z půdního roztoku (output) a uvolňování těchto prvků z půdy do půdního roztoku (input), jejichž výsledkem pak byla aktuální koncentrace daných prvků (obr. 34). Samotné uvolňování prvků z půdy do půdního roztoku bylo především ovlivňováno: 1) záporným koncentračním gradientem příslušného prvku (v půdním roztoku byla koncentrace nižší než v půdě), což též souvisí s příjmem prvku rostlinou, 2) silou, jakou byl daný prvek vázán na půdní matrici, 3) exudační činností rostlin, přičemž exudáty působily v narušení termodynamických rovnováh mezi jednotlivými speciemi prvků v půdě obsaženými tak, že vzniklá specie (prvek-exudát) o vyšší konstantě stability způsobovala rozpad původních specií s nižšími konstantami stability.

Obr. 34. Zjednodušené znázornění dějů působících změny v obsahu jednotlivých prvků v půdním roztoku, jejichž výsledná koncentrace byla experimentálně zjištěna. Na tomto místě je třeba připomenout, že aktuální hodnota koncentrace daného prvku neříká, v jakém množství rostlina prvek přijímala, či do jaké míry byl z půdy uvolňován. Toto posouzení je třeba udělat na základě zjištěného obsahu daného prvku v biomase a zbytkového množství kovu v půdě. V této sekci bylo především za

83

Dvoufázové hydroponické experimenty cíl kladeno najít matematický model popisující kolísání celkových koncentrací vybraných prvků v půdním roztoku. Bylo potvrzeno [Jaklová Dytrtová et al. 2009b], že většina kovů je v půdním roztoku přítomna ve velkém množství specií s organickými i anorganickými ligandy [Jaklová Dytrtová et al. 2011b; Jaklová Dytrtová et al. 2011d] a tvoří takzvanou přístupnou část z celkového přítomného množství v půdě, proto se zdálo být výhodnější pro obecný popis sledovat změny v celkových obsazích prvků v půdním roztoku, než sledovat koncentrační změny jednotlivých specií. Do celkového hodnocení průběhu koncentračních změn nebyla zahrnuta tzv. nulová hodnota (obsah prvků v půdním roztoku v době založení pokusu), protože tato hodnota byla silně ovlivněna především ustavováním rovnováh mezi půdou a přidanou deionizovanou vodou a nebyla dosud ovlivněna samotnou činností rostliny. Pro průběh koncentračních změn většiny sledovaných prvků v čase u většiny testovaných rostlin a půd byl nalezen podobný trend popsatelný polynomem 3. řádu (obr. 35). Nejprve dojde u většiny prvků k poklesu celkové koncentrace, následuje nárůst a v závěru již kodnota kolísá okolo jedné střední hodnoty, u které se dá předpokládat, že se jedná o jakési „koncentrační optimum“. Pod slovem „optimum“ je zde třeba chápat určitý kompromis daný dispozicemi půdy (zejména z hlediska obsahu sledovaných prvků a organické hmoty, na kterou jsou prvky poměrně silně vázané) a fyziologickým optimem dané rostliny. Fyziologické optimum dané rostliny pro esenciální prvky, jako je Cu a Zn, jejichž přítomnost v půdním roztoku může mít ambivalentní účinek, je dáno fyziologickými nároky každého rostlinného druhu (ovlivněného též ekotypem) na obsah těchto prvků v půdním roztoku. Výraznou afinitu rostlinných exudátů (jablečné kyseliny) k esenciálním prvkům (Cu) oproti pro rostlinu rizikovým prvkům (Cd) lze vysledovat z výrazně vyšších stabilit specií mědi než kadmia [Jaklová Dytrtová et al. 2012]. U rizikových prvků (jako jsou Cd a Pb) nelze hovořit o nějaké optimální hodnotě (optimální hodnota je „0“), ale spíše o koncentraci, kterou je rostlina s pomocí svých fyziologických mechanismů schopna tolerovat. Výsledná koncentrace rizikového prvku v půdním roztoku, za předpokladu, že rostlina neuhyne a roste dál, je tedy koncentrací, kterou je daná rostlina za daných podmínek (koncentrace v půdě a půdní charakteristika) schopna tolerovat.

84

Dvoufázové hydroponické experimenty 100 2

80 relativní hodnota

3

y = A0 + A1x + A2x + A3x A0 = 100 A1 = -50 A2 = 9,15

60

A3 = 0,5 40 x0 = 0 dx = 0,0503

20 0

střední hodnota

0

2

4 6 čas (týden)

8

10

Obr. 35. Simulace polynomu 3. řádu (kubický polynom) daného systému. Dá se předpokládat, že s postupem času, za předpokladu ideálních podmínek (v čase se neměnící koncentrace prvků v půdě), bude koncentrace těsněji (s menší amplitudou) oscilovat okolo střední hodnoty a dlouhodobý vývoj koncentrace bude možné popsat polynomem vyššího řádu.

3.6.1.1 Kadmium

Výše popsaný trend je zejména patrný pro kolísání obsahu Cd ve všech variantách pokusu (obr. 36), tj. s A. glutinosa, A. incana i S. caprea, a to na všech testovaných půdách (Příbram, Píšťany, Litavka; viz Metodika - popis půdy).

Píšťany

4

3

Příbram

2

1

1

Litavka

A. glutinosa A. incana S. caprea

35 30 25

-1

-1

2

40

A. glutinosa A. incana S. caprea

3

Cd (g L )

-1

Cd (g L )

4

A. glutinosa A. incana S. caprea

Cd (g L )

5

20 15 10 5

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

1

2

3

4

týden

5

6

Obr. 36. Změny v celkovém obsahu kadmia v půdním roztoku u hydroponických experimentů s půdou (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka, kde byly pěstovány A. glutinosa, A. incana a S. caprea.

7

85

Dvoufázové hydroponické experimenty Protože se jedná o prvek poměrně mobilní oproti např. Pb [Kabata-Pendias 2001; Lindsay 1979], lze očekávat, že se výsledná rovnovážná koncentrace ustaví poměrně rychle. Půdní roztoky odebírané z pokusů na příbramské půdě i píšťanské měly podobnou celkovou koncentraci Cd, přičemž půda příbramská byla bohatší na organickou hmotu (Cox = 2,30 %) než píšťanská (Cox = 1,77 %), proto nepřekvapí, že pokles celkové koncentrace Cd byl u pokusu s píšťanskou půdou rychlejší, tj. postupný pokles bylo možné zachytit pouze u A. incana a částečně i u A. glutinosa. U S. caprea byla koncentrace již v prvním týdnu na hodnotě odpovídající střední hodnotě. Oproti tomu pozvolný pokles koncentrace Cd bylo možné na příbramské půdě zaznamenat pro všechny testované dřeviny. Hodnota koncentrace Cd tedy po 14 dnech sledování oscilovala okolo kocentrace 1 µg L-1. Podobný průběh lze vysledovat též v pokusech na půdě Litavka, přičemž koncentrace Cd v půdním roztoku byla po týdnu od založení experimentu ca. 10x vyšší než u půdy Příbram a Píšťany. Také je možné díky velmi nízkému obsahu organické hmoty této půdy (Cox = 1,17 ± 0,11 %) usuzovat, že se kadmium do půdního roztoku uvolňovalo z půdy poměrně snadno. K pozvolnému poklesu koncentrace Cd u obou olší docházelo postupně v průběhu 3 týdnů od založení pokusu (A. glutinosa 7 µg L-1, A. incana 23 µg L-1), přičemž především u A. incana byl výrazně potlačen růst. U S. caprea došlo k poklesu obsahu Cd rychleji (již během 14 dnů), než u obou olší na hodnotu cca 2,5 µg L-1. Z výsledků pokusu na variantě s půdou Litavka lze tedy usuzovat na „exudační sílu“ daného rostlinného druhu, tj. na schopnost ovlivňovat koncentraci kadmia v půdním roztoku a také jej přijímat. Z tohoto pohledu se jako velmi nadějný druh (z hlediska fytoremediací) jeví S. caprea. Nutno zdůraznit, že všechny rostlinné druhy pěstované na Litavce byly zřejmě nuceny zvýšit exudační sílu, která primárně u rostlin slouží k uvolňování nepřístupných živin do půdního roztoku [Jones et al. 2003], protože litavská půda je velmi chudá na živiny. Doprovodným jevem zvýšené exudace nízkomolekulárních organických kyselin je uvolňování jiných kationtů do půdního roztoku než živinových, tj. i rizikových prvků pro rostlinu toxických. Rostlina následně může dané toxické prvky přijmout společně s živinami a dále je deponovat ve svých strukturách za přispění funkčních mechanismů [Procházka et al. 1998] často specifických pro rostlinný druh a někdy jen ekotyp. Tento způsob se patrně uplatnil u S. caprea, což lze předpokládat z výrazného poklesu koncentrace kadmia v roztoku v porovnání s oběma olšemi a informace o celkovém přijatém množství Cd do pletiv

86

Dvoufázové hydroponické experimenty vrby. Další teoretickou možností je použití specifické blokace příjmu Cd přímo na plasmatické membráně, která však nebyla dosud dostatečně u rostlin popsána. Tyto dva mechanismy samozřejmě mohou být uplatňovány u každého rostlinného druhu v různé míře, a to také v kombinaci se sníženým příjmem živin souvisejícím s omezením, či inhibicí růstu.

3.6.1.2 Olovo

Podobný trend (sledující polynom 3. řádu) lze vysledovat i pro olovo, přičemž veškeré procesy probíhaly ve srovnání s kadmiem pomaleji (obr. 37), což je plně v souladu s předpokládanou nižší mobilitou Pb [Lindsay 1979]. K velmi pozvolnému snižování celkové koncentrace docházelo v průběhu 4 týdnů, kdy jeho koncentrace dosáhla na všech testovaných půdách lokálního minima.

Píšťany

30

A. glutinosa A. incana S. caprea

25

Příbram

25

Pb (g L )

-1

-1

Pb(g L )

15

15

Litavka

A. glutinosa A. incana S. caprea

15 -1

20

20

20

A. glutinosa A. incana S. caprea

Pb (g L )

30

10

10

10

5 5

5 0

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

1

2

3

4

5 týden

6

7

Obr. 37. Změny v celkovém obsahu olova v půdním roztoku u hydroponických experimentů s půdou (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka, kde byly pěstovány A. glutinosa, A. incana a S. caprea.

3.6.1.3 Měď

Kolísání koncentrace mědi (obr. 38) je zajímavější o to, že se jedná o prvek esenciální, o kterém se dá předpokládat, že bude rostlinami aktivně přijímán. Celková koncentrace Cu byla ve všech půdních roztocích přibližně stejná, proto lze lépe posoudit vliv obsahu organické hmoty v půdě, případně přítomnosti rizikových prvků (např. Cd) a celkového prospívání rostliny na obsah mědi v půdním roztoku.

87

Dvoufázové hydroponické experimenty 20

20

A. glutinosa A. incana S. caprea

Píšťany

15

0

15

10

5

0

1

2

3

4 5 týden

6

0

7

A. glutinosa A. incana S. caprea

-1

10

5

Litavka

Cu (g L )

-1

-1

10

20

A. glutinosa A. incana S. caprea

Cu (g L )

Cu (g L )

15

Příbram

5

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

Obr. 38. Změny v celkovém obsahu mědi v půdním roztoku u hydroponických experimentů s půdou (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka, kde byly pěstovány A. glutinosa, A. incana a S. caprea. U A. glutinosa rostoucí v půdním roztoku na příbramské a píšťanské půdě lze vysledovat poměrně silnou poptávku po mědi, která se projevila v půdním roztoku nejprve prudkým úbytkem a následně výrazným zvýšením její koncentrace, způsobeným patrně uvolňováním z půdy vlivem exudátů, a dále kulminací okolo střední hodnoty. Podobný trend je naznačen též u varianty s Litavkou, kde je však celý proces zpomalen v důsledku zpomalení růstu rostliny (následkem nízkého obsahu

živin

v Litavce

a

vysokým

obsahem

Cd).

Téměř

totožný

průběh

koncentračních změn lze vysledovat u S. caprea, jen s tím rozdílem, že u vrby je koncentračně posunut níže než u A. glutinosa. Zajímavé je i to, a potvrzují to i předchozí odhady schopnosti S. caprea tolerovat vyšší koncentrace Cd než obě olše, že na Litavce nedošlo k tak výraznému zpomalení rychlosti průběhu koncentračních změn, jako tomu bylo na Litavce u olše. Nejvíce byly procesy spojené s koncentračními změnami mědi na Litavce potlačeny u A. incana, což je podporováno i skutečností, že A. incana téměř přestala růst a také tím, že se koncentrace kadmia u A. incana ve variantě s Litavkou téměř neměnila. Pro varianty na příbramské a píšťanské půdě lze konstatovat, že koncentrace mědi v půdním roztoku byla pro A. incana dostačující a nedocházelo tak v průběhu růstu k vyčerpávání mědi ani k jejímu následnému uvolňování do půdního roztoku z půdy.

3.6.1.4 Zinek

V roztoku na půdě Litavka (obr. 39c) byl u všech pěstovaných rostlin zaznamenán u zinku podobný trend jako u kadmia. Vzhledem k vysokému obsahu (ca. 200x vyšší

88

Dvoufázové hydroponické experimenty oproti ostatním testovaným půdám) došlo u A. incana k omezení růstu, což se projevilo od počátku stagnující koncentrací Zn v roztoku (stejně jako u Cd), oproti tomu u S. caprea již 2. týden Zn v roztoku významně poklesl. I u A. glutinosa se projevil značný příjem, ale pokles koncentrace v roztoku byl menší. Po tomto rapidním skoku došlo opět k mírné převaze uvolňování Zn z půdy nad příjmem. U píšťanské půdy (obr. 39a) se projevilo vlivem nízké koncentrace setrvalé vyčerpávání Zn z roztoku. Koncentrace Zn v roztoku byla pravděpodobně ve fyziologickém optimu pěstovaných rostlin, proto nedocházelo k jejím dramatickým výkyvům. Oproti tomu v pokusech s příbramskou půdou (obr. 39b) nebyla koncentrace Zn v roztoku dostačující pro zajištění optimálního přísunu do rostlin, proto je zde možné pozorovat jak vyčerpávání Zn v důsledku jeho aktivního příjmu, tak zejména jeho uvolňování do roztoku způsobeného pravděpodobně exudační činností rostlin. Tento trend je zejména patrný u A. incana a později se projevil i u S. caprea. Pro A. glutinosa byla koncentrace Zn okolo 10 µg L-1 patrně optimální, protože nedocházelo k výrazným změnám v průběhu sledovaného růstu rostliny. 30

Píšťany

A. glutinosa A. incana S. caprea

25

25

Zn (g L )

A. glutinosa A. incana S. caprea

4000

15

15

10

10

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

2000

1000

5

5

3000

-1

-1

-1

Zn (g L )

Litavka

20

20

0

5000

A. glutinosa A. incana S. caprea

Příbram

Zn (g L )

30

1

2

3

4 5 týden

6

7

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

Obr. 39. Změny v celkovém obsahu zinku v půdním roztoku u hydroponických experimentů s půdou (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka, kde byly pěstovány A. glutinosa, A. incana a S. caprea.

3.6.1.5 Hliník

Pořadí celkových obsahů Al v půdách se při srovnání s obsahem organického uhlíku (TOC), který klesal v pořadí Příbram > Píšťany > Litavka (tab. 4, kap. 2.2), značně lišilo: Píšťany >> Litavka > Příbram (tab. 6, kap. 2.2), tedy nebylo v korelaci. Vývoj koncentrace Al v roztocích (obr. 40) lze popsat polynomem různých řádů

89

Dvoufázové hydroponické experimenty v závislosti na TOC a celkové koncentraci Al v půdě a frakcionaci. Tento trend lze popsat jako u ostatních prvků polynomickou funkcí a lze nalézt oscilaci kolem střední hodnoty.

40

(b)

30

50

A. glutinosa A. incana S. caprea

40

20 10 0

30 20

1

2

3

4 5 týden

6

7

8

A. glutinosa A. incana S. caprea

30

0

20 10

10

0

(c)

40

-1

Al (g L )

-1

Al (g L )

50

A. glutinosa A. incana S. caprea

-1

(a)

Al (g L )

50

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

8

0

0

1

2

3

4 5 týden

6

7

8

Obr. 40. Vývoj celkové koncentrace Al v roztoku v hydroponickém experimentu na půdě (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka. Pro varianty s půdou Píšťany byla oscilace „pomalá“ s širokou amplitudou popsanou polynomem 3. řádu, střední hodnota koncentrace Al je 18,15 ± 5,25 µg L-1. S časem lze očekávat pokles amplitudy. Na půdě Příbram byla oscilace rychlejší než na Píšťanech a amplituda byla užší, proložená polynomem 5. řádu se střední hodnotou koncentrace Al 16,15 ± 1,05 µg L-1. Poněkud komplikovanější může být případ varianty s půdou Litavka; celková koncentrace v roztoku oscilovala s poměrně úzkou amplitudou v polynomu 6. řádu, nicméně v čase ampituda vzrůstala vlivem stresu rostlin způsobeným kontaminací dalšími kovy [Jakl et al. 2010b]. Až do 6 týdnů experimentu oscilovala amplituda kolem 11,50 ± 1,05 µg L-1 a poté se amplituda rapidně zvýšila v souladu s narušením rostliny.

3.6.2 Obsah vybraných prvků v rostlinách 3.6.2.1 Kadmium

Shodně nejvyšší koncentrace kadmia byla nalezena v kořenech dřevin (obr. 41) a odrážela celkový obsah Cd v půdě. Na Příbrami a Píšťanech se koncentrace Cd pohybovala u všech dřevin v rozmezí 1 – 5 mg kg-1, u Litavky dosahovala nejvyšších hodnot u obou olší (cca 50 mg kg-1), u S. caprea (20 mg kg-1). Vzhledem k tomu, že je Cd považováno za poměrně mobilní prvek [Kabata-Pendias 2001], dalo se

90

Dvoufázové hydroponické experimenty předpokládat, že bude z kořenů přecházet do nadzemních částí, k čemuž však nedošlo, proto lze usuzovat, že Cd bylo nějakým způsobem chemicky vázáno a imobilizováno na povrch kořenů. Koncentrace nalezená v listech a dřevní hmotě byla shodně velmi malá (0,1 – 1,1 mg kg-1) u všech dřevin na všech půdách bez rozdílu výše kontaminace půdy, resp. půdního roztoku, což u Příbrami a Píšťan u obou olší odpovídá ca. 10 % celkové koncentrace v kořenech; u Litavky je toto procento menší než 0,5 %. S. caprea oproti olším transportovala Cd do listů ve zvýšené míře. Poměrně i absolutně převyšuje schopnost S. caprea transportovat a deponovat Cd do listoví možnosti obou olší. Z hlediska gradientu bylo v listech u Píšťan 35 % celkové koncentrace Cd v/na kořenech a u Příbrami 86 % celkové koncentrace Cd v/na kořenech. U vrby rostoucí na Litavce též bylo možné pozorovat (zřejmě vlivem vysoké deponované koncetrace Cd, Zn a jiných kovů) seschnutí a opad listů a rostlina založila na listy nové. Závěrem lze shrnout, že Cd je pravděpodobně nějakým způsobem vázáno na povrch kořenů (což platí zejména pro obě olše) a do tkáně rostlin se tak ve zvýšené míře nedostává. Otázkou však zůstává, jaké substance, či mechanismy jsou za tuto chemickou adsopci odpovědny. V současné chvíli na základě informací o stabilitě některých komplexů Cd s LWMOAs můžeme vyloučit samostatnou úlohu těchto kyselin (OA, CA, MA) v imobilizaci Cd na povrch kořenů, protože konstanty stability jejich komplexů s kadmiem jsou shodně relativně malé (cca 140 kJ mol-1). Není však vyloučeno, že se jedná o velmi komplexní proces, jehož některého kroku se LMWOAs účastní. Z praktického hlediska se pro extrakci Cd z půd lépe hodí S. caprea, která je schopna transportovat a deponovat až 86 % Cd z kořenů do listů. Je též vybavena účinným tolerančním mechanismem proti intoxikaci kadmiem, který spočívá v opadu listoví kontaminovaného Cd a následném založení nových listů.

91

Dvoufázové hydroponické experimenty 4

Píšťany

6

listy větve kořeny

3

80

Příbram

listy větve kořeny

5

Litavka

listy větve kořeny

40

2

1

0

-1

-1

Cd (mg kg )

Cd (mg kg )

-1

Cd (mg kg )

2

1

0,2

0,1

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0,0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

Obr. 41 Celkové obsahy Cd (mg kg-1) v listech, větvích a kořenech A. glutinosa, A. incana a S. caprea pěstovaných hydroponicky na půdách (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka.

3.6.2.2 Olovo

Olovo je ve většině případů distribuováno v pořadí koncentrací: kořeny >> listy > větve (obr. 42). Může to například znamenat, že k transportu do rostliny dochází v omezené míře a pak nevstupuje významně do pletiv větví, ale je pouze xylémem větví (kmínku) transportováno dále do listů, kde je deponováno. Na základě statistického vyhodnocení závislosti nelze prokázat žádnou korelaci mezi koncentrací Pb v roztoku jednotlivých půd a koncentracemi v rostlinných částech jednotlivých rostlin, ani mezi koncentrací Pb v roztoku a celkovým naakumulovaným množstvím v jednotlivých částech, resp. celých rostlinách. Na druhou stranu srovnáním přijatého (sorbovaného) množství Pb kořeny rostlin s množstvím Ca+Mg v půdě ve výluhu Mehlich III (tab. 5, kap. 2.2) a s CEC půdy lze již nalézt negativní vztah, tedy čím je živin více, tím méně je Pb přijímáno. To přispívá k teorii, že RP jsou přijímány v důsledku zvýšené exudace rostlin za účelem uvolňování živin z půdní matrice do půdního roztoku, jsou tedy často přijímány společně s živinami [Strobel 2001]. Toto tvrzení platí zejména v případě, že je živin nedostatek, nebo jsou hůře přístupné (tj. silně vázané do půdní matrice). Pb bylo shodně u všech testovaných půd i rostlin nejvíce obsaženo v kořenech, což je v souladu s jeho předpokládanou nízkou mobilitou [Kabata-Pendias 2001]. Přičemž koncentrace nalezená v kořenech se odrážela v celkovém množství olova stanoveném v půdě. Též je možné spekulovat o pouze možné adsopci na kořeny, tedy, že Pb ve skutečnosti nebylo (nebo alespoň jeho valná část) transportováno do živé vnitřní tkáně kořene.

92

Dvoufázové hydroponické experimenty V celkovém obsahu Pb následovalo po kořenech listoví, kde se jeho koncentrace pohybovala v rozmezí 1–5 mg kg-1, a dalo by se říci, že vyšší koncentrace, tj. 3–5 mg kg-1, byla nalezena na Litavce u všech třech rostlin a u A. glutinosa na Příbrami. Dalo by se říci, že přesun toxické látky do listí (tedy částí, které následně mohou opadat) je jedna z možných strategií, jak se vyhnout toxickému působení na fyziologické procesy v rostlině [Procházka et al. 1998]. Tento jev bylo možné pozorovat až do konečného důsledku u S. caprea pěstované na Litavce (listoví seschlo a opadalo, ale následně začalo rašit nové). Obecně lze konstatovat, že do dřevní hmoty (tedy větví), jakožto do orgánů, kterých se rostlina nemůže snadno zbavovat, nebylo olovo deponováno ani na půdě silně kontaminované olovem. Koncentrace olova ve větvích se pohybovala okolo 1,5 mg kg-1. Dalo by se říci, že extrakční síla jednotlivých dřevin by se dala porovnat právě na obsahu Pb v listoví, kdy se projeví schopnost rostliny daný kov přijímat, transportovat, deponovat a následně se zbavovat těch částí, do kterých byl kov deponován a bez kterých rostlina dokáže krátkodobě přežít. Z tohoto pohledu se jako vhodnou rostlinou pro extrakci olova jeví A. glutinosa, která tolerovala i deponovala do listoví největší množství olova za udržení stálého růstu na obou půdách kontaminovaných olovem, a to na půdě poměrně bohaté na živiny i organickou hmotu i na půdě velmi chudé na živiny i organický uhlík.

60

listy větve kořeny

8

20 -1

Pb (mg kg )

-1

Pb (mg kg )

listy větve kořeny

40

6

2

100

Příbram

5 4 3

listy větve kořeny

4 3 2

2

1

1

1 0

Litavka

50

-1

Píšťany

Pb (mg kg )

10

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

Obr. 42. Celkové obsahy Pb (mg kg-1) v listech, větvích a kořenech u A. glutinosa, A. incana a S. caprea pěstovaných hydroponicky na půdách (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka.

93

Dvoufázové hydroponické experimenty 3.6.2.3 Měď

U koncentrací mědi v jednotlivých částech testovaných dřevin (obr. 43) lze nalézt některé podobnosti jako pro olovo, samozřejmě s přihlédnutím, že Cu je považována spíše za prvek esenciální, tedy pro rostlinu toxický až při nadlimitních množstvích. Nejmenší koncentrace Cu byla nalezena shodně u všech testovaných půd i rostlin v dřevní hmotě. Hodnota koncentrace mědi ve větvích byla u A. incana a S. caprea v úzkém rozmezí 30–90 mg kg-1, a to na všech testovaných půdách bez ohledu na stupeň kontaminace půdy, oproti tomu koncentrace Cu ve větvích A. glutinosa dosahovala hodnot i více než 150 mg kg-1. Zvýšený transport Cu do listoví, kde na Píšťanech (půdě nejvíce kontaminované Cu) dosahovala koncentrace hodnot až 600 mg kg-1 u A. glutinosa, by mohl naznačovat tomu, že Cu se vyskytovala v půdě již v nadlimitním množství. Tento trend je patrný i u ostatních půd a je výrazný zejména u A. glutinosa. Koncentrace Cu v kořenech opět odráží celkovou koncentraci Cu v půdě a je největší u A. glutinosa. Závěrem je možné podotknout, že pro měď, jakožto pro esenciální prvek může rostlina v rámci toxického stresu použít drah a mechanismů, které normálně využívá pro příjem mědi v případě jejího nedostatku, proto její extrakce probíhala efektivnějším a v důsledku účinnějším způsobem. V hodnocení extrakční síly pro měď je opět nejvhodnější dřevinou A. glutinosa, která byla schopna transportovat a deponovat poměrně velké množství Cu do listů. Což je v souladu i s výsledky získanými i z půdního roztoku, kdy docházelo ke značnému uvolňování Cu z půdní matrice do půdního roztoku právě u A. glutinosa.

-1

-1

400

200

0

Příbram

400

Cu (mg kg )

600

Cu (mg kg )

500

listy větve kořeny

400

listy větve kořeny

A. incana

S. caprea

300 200

0

listy větve kořeny

300

100

A. glutinosa

Litavka

-1

Píšťany

Cu (mg kg )

800

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

200

100

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

Obr. 43. Celkové obsahy Cu (mg kg-1) v listech, větvích a kořenech u A. glutinosa, A. incana a S. caprea pěstovaných hydroponicky na půdách (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka.

94

Dvoufázové hydroponické experimenty 3.6.2.4 Zinek

Obsahy Zn byly zejména na Litavce velmi vysoké, což se projevilo jeho enormní koncentrací v/na kořenech dřevin nasledně: S. caprea (0,7 g kg-1) < A. glutinosa (3,3 g kg-1) < A. incana (3,7 g kg-1). Vzhledem k tomu, že jen malá část Zn byla z kořenů transportována, lze usuzovat, že se především jednalo o Zn naadsobovaný na povrch kořenů. U dalších dvou půd byl obsah Zn v kořenech v rozmezí 50 až 100 mg kg-1. Koncentrace Zn v listech byla větší než jeho koncentrace ve větvích u A. glutinosa a S. caprea, u A. incana (100–200 mg kg-1) byla srovnatelná s koncentrací Zn ve větvích, což bylo platné pro všechny testované půdy. Nejlépe transportovala do listoví Zn S. caprea následována A. glutinosa. Navzdory

skutečnosti,

že

byl

zinek

přítomen

v půdě

Litavka

přibližně

v 200násobné koncentraci oproti ostatním půdám, v půdním roztoku u A. glutinosa byla jeho koncentrace v roztoku (obr. 39) již jen 100násobná. Vysoká koncentrace v roztoku pak sice vedla k vysoké koncentraci Zn v kořenech (obr. 44), ale naopak v listech A. glutinosa se koncentrace Zn vyrovnala na pravděpodobném fyziologickém optimu u všech použitých půd přibližně stejně (135 ± 44 mg kg-1 sušiny). Podobně i u A. incana byla koncentrace Zn v listech v zásadě vyrovnaná (62,1 ± 14,0 mg kg-1 sušiny), ale přibližně poloviční než u A. glutinosa.

Píšťany

Příbram

300

Zn (mg kg )

100

listy větve kořeny

3500

100

50 0

Litavka

4000

-1

150

4500

listy větve kořeny

-1

-1

Zn (mg kg )

200

400

listy větve kořeny

3000 800

Zn (mg kg )

250

600 400 200

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

Obr. 44. Celkové obsahy Zn (mg kg-1) v listech, větvích a kořenech u A. glutinosa, A. incana a S. caprea pěstovaných hydroponicky na půdách (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka. V případě dvou druhů olše se tedy neprokázala souvislost mezi koncentrací Zn v roztoku (půdě) a koncentrací v listech. Může to tedy znamenat, že mají tyto rostliny velmi dobře vybudovaný aparát na rozpoznání Zn a regulaci jeho distribuce. Čemuž

95

Dvoufázové hydroponické experimenty nasvědčují i koncentrační změny Zn v půdním roztoku během hydroponického pokusu, kdy se projevila silná regulační tendence rostlin.

3.6.2.5 Hliník

Na první pohled je vývoj celkové koncentrace Al v roztoku nezávislý na typu pěstované rostliny, nicméně sledované stromy akumulovaly Al rozdílnými způsoby. Obecně vzato, všechny stromy akumulovaly tím více Al, čím byl obsah organiky v půdě nižší (obr. 45), tento trend neodráží celkovou koncentraci Al v půdě (tab. 6). 1500

Píšťany

1800

listy větve kořeny

Příbram

1400

1000

2600

listy větve kořeny

1600

Al (mg kg )

-1

-1

Al (mg kg )

-1

Al (mg kg )

1000

1000 800 600 400

40

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

800 600 400 200

200 0

listy větve kořeny

2400

1200 500

Litavka

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

0

A. glutinosa

A. incana

S. caprea

Obr. 45. Celkové obsahy Al (mg kg-1) v listech, větvích a kořenech u A. glutinosa, A. incana a S. caprea pěstovaných hydroponicky na půdách (a) Píšťany, (b) Příbram a (c) Litavka. Pro kvantifikaci příjmu je důležitý poměr mezi koncentracemi v kořenech a v nadzemních částech rostliny [Pettersson 1976]. A. glutinosa drží jak poměr obsahů listy/kořeny (0,11), tak větve/kořeny (0,55) na stejné hodnotě u všech testovaných půd (obr. 45). A. incana žádný z těchto poměrů nedržela. Jakmile je množství organické hmoty velmi nízké (Litavka, obr. 45c), je poměr obsahů kořeny/nadzemní část vyšší. Koncentrace Al v nadzemních částech (listy a větve) signifikantně vzrostla v porovnání s koncentrací v kořenech. S. caprea udržel poměr obsahů větve/kořeny na hodnotě 0,02 u všech testovaných půd. Navzdory tomu, že byl trend obsahu Al v roztoku u vrby rozdílný od olší, byla stále zaznamenána negativní korelace mezi obsahem organické hmoty a rozpustného Al. Také je patrný podobný trend příjmu Al jako pro olše: méně organické hmoty v půdě – více Al v kořenech.

96

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu

3.7 Možnosti stanovení mobility prvků v terénu 3.7.1 Příjem a přijatelnost prvků olší po aplikaci bazických mouček Jedním ze základních faktorů, o němž se předpokládá, že určuje mobilitu prvků v půdě je půdní pH [Lindsay 1979]. Lze očekávat, že bude přídavek bazických kationtů zvyšovat pH [Saarsalmi et al. 2011]. Rozdíly mezi aktivním pH, ani mezi obsahy organického (oxidovatelného) uhlíku půd jednotlivých variant se však po sedmi letech od vápnění neprojevily průkazně (tab. 13). Tab. 13. Aktivní pH a obsah oxidovatelného uhlíku v půdě povrch pH(H2O) sm.odch. Cox (%) sm.odch.

kontrola

jamka

4,81

4,55

4,85

0,12

0,35

0,16

6,41

6,48

6,26

0,37

0,32

0,42

Celková množství stanovovaných prvků v rostlinných částech (mg; obr. 46) byla vypočítána z koncentrace a celkové hmotnosti sušiny každé rostlinné části (listy, kmen, kůra, větve, kořeny). Signifikantní nárůst celkového množství mědi a kadmia v obou upravených variantách v porovnání s kontrolou byl pozorován od kořenové frakce průměru 0,5-1 cm více, ve větvích, kmínku, kůře, jakož i v listech (obr. 46). Byl pozorován také signifikantní nárůst celkového množství zinku v kořenových frakcích tlustších než 0,5 cm u jamkové aplikace a u obou upravovaných variant ve větvích, kmínku a listech. U celkového množství olova byl signifikantní nárůst pozorován v kořenech 0,5-1 cm u jamkové aplikace a u obou upravovaných variant v kořenech tlustších než 1 cm, větvích a kmínku. Signifikantní zvýšení množství železa mohlo být též způsobeno aplikovanou bazickou moučkou (tab. 2, kap. 2.1.3), taktéž celkové množství hliníku mohlo být způsobeno jeho přítomností v bazické moučce. Na druhé straně žádné signifikantní zvýšení přijatelné koncentrace (obr. 47), vodorozpustné koncentrace (obr. 48) a celkové koncentrace (obr. 49) Al a Fe v půdě nebylo prokázáno.

97

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu 5

4

Kořeny 0,0 - 0,2 cm jamka kontrola povrch

4

jamka kontrola povrch

3

3

2

2

mg

mg

Kořeny 0,2 - 0,5 cm

1

1

0,01 0,00

0,005

Al

Cd 1x10

2

Cu

Fe

-2

Mn

Pb

Zn

0,000

Kořeny 0,5 - 1 cm jamka kontrola povrch

1

Al

Cd

Cu

Fe

1,5

Mn

Zn

Kořeny nad 1 cm jamka kontrola povrch

1,0

0,2

Pb

mg

mg

0,5 0

Cd

0,01 0,0 7

Al

Cd

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

0,00

Větve

6

jamka kontrola povrch

5

Al

Cd

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

Kmen jamka kontrola povrch

2

4 1

2

mg

mg

3

1

0,02

0,02 0,00

7

0,01

Al

Cd

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

0,00

8

Kůra jamka kontrola povrch

6 5

4 2

3 2

mg

mg

Cd jamka kontrola povrch

6

0,015

4

Al Listy

1

0,000

0,2

Cd

0,1 0,1 0,0

Al

Cd

Cu

Fe

Mn

Pb

Zn

0,0

Al

Cd

Obr. 46 Celkové množství prvků v jednotlivých částech olše (mg; ±SE, n = 6)

98

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu V nejtenčí kořenové frakci (0–0,2 cm) byl pozorován signifikantní rozdíl v koncentraci (mg kg-1) Cd, Cu a Mn mezi kontrolou a oběma upravenými variantami a signifikantní rozdíl v koncentraci Zn mezi kontrolou a jamkovou aplikací. Ale zvýšená biopřístupnost těchto prvků v půdě (stanoveno pomocí DGT; obr. 47), ani vodorozpustnost (obr. 48) nebyly prokázány. Nárůst koncentrace Mn v nejtenčí kořenové frakci byl v souladu se signifikantně vyšší koncentrací Mn v půdě u obou upravených variant (obr. 49). Zvýšený obsah prvků v biomase by mohl být vysvětlen aktivací příjmových mechanismů evokovaný úpravou půdy bazickými moučkami [Ingerslev, Hallbäcken 1999]. Ale signifikantní rozdíly v koncentracích testovaných prvků v biomase byly prokázány jen v nejtenčí kořenové frakci (do 0,2 cm), v dalších pletivech nebyly potvrzeny. Tento výsledek by mohl nasvědčovat také tomu, že zmíněné prvky byly na povrch kořenů spíše adsorbovány, což bylo pozorováno i u hydroponických experimentů. Zvýšení přítomnost rizikových prvků ve většině rostlinných částí bylo prokázáno pouze na úrovni celkových množství (mg), což bylo pravděpodobně způsobeno „zřeďovacím efektem“ vyšším nárůstem biomasy u rostlin pěstovaných na půdě obohacené o bazické prvky, nebo blízkostí pletiv půdě, tedy v nejtenčí kořenové frakci. 12 9

jamka kontrola povrch

2000

6

-1

CDGT(mg L )

2

-1

CDGT(mg L )

jamka kontrola povrch

4000

1

100 75 50 25

0

0 Cd

Cu

Mn

Al

B

Fe

Zn

Pb

Ca

K

Obr. 47. Přijatelné množství prvků v půdě stanovené pomocí DGT (±SE, n = 6).

Mg

99

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu 1,6

350

jamka kontrola povrch -1

koncentrace v H2O (mg kg )

-1

jamka kontrola povrch

300

koncentrace v H2O (mg kg )

1,4 1,2

250

1,0

200

0,8

150

0,6

100

0,4 0,2 0,0

Cd

Cu

Mn

Pb

50 0

Zn

Al

Ca

Fe

K

Mg

Obr. 48. Zastoupení vodorozpustných množství prvků v suché půdě (±SE, n = 6).

25000 20000

300

jamka kontrola povrch

200

koncentrace (mg kg )

-1

-1

koncentrace (mg kg )

15000 10000

2000 1500 1000

150 100 50

1

500 0

jamka kontrola povrch

250

Al

Fe

K

Ca

0

Mn

Pb

Mg

Zn

Cr

Cu

Ni

Cd

Obr. 49. Celkové koncentrace prvků v suché půdě (±SE, n = 6). V nejtenčí kořenové frakci všech variant byla nalezena velmi vysoká koncentrace Al a Fe ve srovnání s ostatními částmi rostlin (obr. 50). Je známo [Perry 1982], že většina příjmu živin z půdy je zajišťována nejtenčí kořenovou frakcí, a také, že se Al pasivuje (adsorbuje) na povrch kořenů, kde může blokovat příjem kationtů s nižším nábojem [Eldhuset et al. 2006]. Tato pasivace může omezovat kořenový příjem Mg, především je-li zaznamenán jeho deficit v půdě [de Wit et al. 2010]. V upravených variantách byla koncentrace Al v nejtenčí kořenové frakci vyšší (536 mg kg-1 jamková a 451 mg kg-1 povrchová aplikace), než v kontrolní variantě (364 mg kg-1), nicméně tento rozdíl nebyl signifikantní. Pokles koncentrace Al byl zaznamenán v kontrolní variantě od nejtenčí kořenové frakce (364 mg kg-1) k frakci 0,2–0,5 cm (170 mg kg-1). Koncentrace Al vzrostla v kořenové frakci 0,5–1 cm (236 mg kg-1) a v nejtlustších kořenech (> 1 cm) opět poklesla (34 mg kg-1). U upravených variant nebyla zvýšená

100

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu koncentrace Al v kořenové frakci 0,5–1 cm zaznamenána, s rostoucím průměrem kořenů koncentrace setrvale klesala. Ve všech variantách byly koncentrace Al v listech a kůře výrazně vyšší než ve větvích a kmínku (obr. 50). Stejný trend byl zaznamenán také u železa; v kontrole poklesla koncentrace Fe od nejtenčí kořenové frakce (347 mg kg-1) k frakci 0,2–0,5 (207 mg kg-1) a následně vzrostla ve frakci 0,5–1 cm (265 mg kg-1). V obou upravených variantách tento nárůst pozorován nebyl (obr. 50). V nadzemních částech rostlin byla distribuce Fe analogická trendu Al.

600

600

-1

Fe (mg kg )

-1

Al (mg kg )

500

500

400

400

300

300

200

200

100

100

0

0 jamka

jamka kořeny 0-0,2 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 1+ cm větve kmen

kontrola kůra

povrch

kořeny 0-0,2 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 1+ cm větve kmen

listy

kontrola kůra

povrch listy

Obr. 50. Distribuce Al a Fe v jednotlivých částech olše (mg kg-1 sušiny). V nejtenčí kořenové frakci u obou upravených variant byl nalezen signifikantně vyšší obsah Cd (u jamkové aplikace 1,2 ± 0,1 mg kg-1 a u povrchové aplikace 1,5 ± 0,2 mg kg-1) než u kontrolní varianty (0,6 ± 0,2 mg kg-1). Tato skutečnost může být podpořena často pozorovanou vyšší adsorpcí/precipitací Cd po vápnění (např. [Gray et al. 1999]). V kontrole byla koncentrace Cd v sušině ve všech částech olše (obr. 51) přibližně stejná (v rozsahu od 0,2 mg kg-1 v listech do 0,6 mg kg-1 v kořenech tlustších než než 1 cm); toto zjištění je v souladu s relativně vysokou mobilitou Cd2+ v rostlinách [Kabata-Pendias 2001]. Distribuce Pb v pletivech olše je předurčena jeho obecně nízkou mobilitou v rostlinách [Kabata-Pendias 2001]. Distribuce olova v jednotlivých částech olše (obr. 51) od nejvyšší koncentrace po nejnižší je následující: kořeny > větve > kůra > kmínek a listy. Signifikantní rozdíl v koncentraci Pb v sušině byl nalezen v kůře; v kůře kontroly byla nalezena vyšší koncentrace Pb (5,3 ± 0,4 mg kg-1) než u jamkové (3,4 ± 0,2 mg kg-1) a povrchové aplikace (2,0 ± 0,2 mg kg-1).

101

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu

30

2,0

-1

Cd (mg kg )

-1

Pb (mg kg )

25

1,5

20 15

1,0

10

0,5

kořeny 0-0,2 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 1+ cm větve kmen

0,0 jamka kontrola kůra

povrch

5

kořeny 0-0,2 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 1+ cm větve kmen

listy

0 jamka kontrola kůra

povrch listy

Obr. 51. Distribuce Cd a Pb v jednotlivých částech olše (mg kg-1 sušiny) Podobně jako u Pb byla nejvyšší koncentrace Cu nalezena v kůře (obr. 52), kde byla též rozpoznána signifikantní rozdílnost v obsazích mezi kontrolní variantou a oběma upravenými variantami. Koncentrace mědi v kůře kontroly byla 37 ± 5 mg kg-1 v kontrastu s 21 ± 3 mg kg-1 u jamkové a 23 ± 4 mg kg-1 u povrchové aplikace. V nejtenčí kořenové frakci byl nalezen signifikantně nižší obsah Cu na kontrole (10 ± 4 mg kg-1) v porovnání s více než dvojnásobnými koncentracemi na obou upravených variantách (20 ± 4 mg kg-1 u jamkové a 23 ± 3 mg kg-1 u povrchové aplikace). Distribuce Cu v rostlině (obr. 52) je obecně jiná u kontrolní varianty a obou upravených variant. Vápnění obecně zvyšuje adsorpci Cu v půdě [Derome, Saarsalmi 1999] a komplexaci s organickou hmotou [McBride, Bouldin 2009]. Oba tyto procesy předurčují pokles příjmu Cu rostlinou [Tyler, Olsson 2001]. Nejvyšší koncentrace Zn byly také nalezeny v kůře (obr. 52), kde byly hodnoty kontrolní (238 ± 63 mg kg-1) a jamkové (234 ± 55 mg kg-1) aplikace srovnatelné a výrazně (byť nesignifikantně) vyšší, než u povrchové aplikace (164 ± 42 mg kg-1). Koncentrace Zn byly také značně vysoké v listech (132–154 mg kg-1). Poněkud nižší obsahy byly zaznamenány ve větvích (70–135 mg kg-1), následovanými hodnotami v nejtenčí kořenové frakci, kmenem a nakonec kořenovými frakcemi nad 2 mm v průměru. V nejtenčí kořenové frakci byl zaznamenán signifikantní rozdíl mezi kontrolou (40 mg kg-1) a jamkovou aplikací (67 mg kg-1). U Zn i Cu jsou trendy podobné [Bolan et al. 2003].

102

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu Distribuce Mn vykazuje podobný trend jako Zn (obr. 52), nejvyšší koncentrace byla nalezena v kůře, následně v listech a větvích. Signifikantní rozdíly byly nalezeny v nejtenčí kořenové frakci mezi všemi variantami. Zvýšení koncentrace Mn v tlustší kořenové frakci bylo pravděpodobně způsobeno jak samotnou úpravou půdy, tak i konkrétním použitým přípravkem (tab. 2, kap. 2.1.3), které se projevilo signifikantním zvýšením celkové koncentrace Mn v půdě (obr. 49).

40

250

-1

Zn (mg kg )

-1

Cu (mg kg ) 200

30

150 20 100 10 0 jamka kontrola povrch

listy kůra kmen větve kořeny 1+ cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0-0,2 cm

50 0 jamka kontrola povrch

listy kůra kmen větve kořeny 1+ cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0-0,2 cm

200 -1

Mn (mg kg ) 150 100 50 0 jamka kontrola povrch

listy kůra kmen větve kořeny 1+ cm kořeny 0,5-1 cm kořeny 0,2-0,5 cm kořeny 0-0,2 cm

Obr. 52. Distribuce Cu, Zn a Mn v sušině jednotlivých částí olše. Distribuce Cu, Mn a Zn v rostlině je kromě koncentrací v listech v zásadě analogická jako v případě makroprvků (N, P, K, Mg a Ca), kdy jsou nejvyšší koncentrace prvků v listech, následně v kůře nebo větvích a nejnižší koncentrace jsou obvykle v kmeni. S rostoucí tloušťkou kořenů klesala koncentrace těchto prvků v kořenových frakcích (např. [Kuneš et al. 2007]). Vypadá to, že přídavek meliorantu snížil koncentraci Cu v kůře, což je v souladu i s jinými studiemi [Tyler, Olsson 2001],

103

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu a zvýšil koncentraci Cu v nejtenčích kořenech, což se může dít na základě jeho zvýšené sorpce [Derome, Saarsalmi 1999]. Koncentrace Mn a částečně Zn v nejtenčích kořenech byly také přídavkem meliorantu zvýšené. U hnojených variant jsou Cu, Mn a Zn hojně zastoupeny v nejtenčích kořenech a Cu je méně deponováno v kůře (obr. 52). Zastoupení prvků může být také posouzeno z hlediska absolutních množství [Kuneš

et

al.

2007],

což

však

nepostihuje

distribuci

prvků

v souvislosti

s koncentračním gradientem, který je důležitý ve vztahu k přijatelnosti prvků [Bolan et al. 2003]. Použití techniky DGT odhalilo zajímavou skutečnost, že přídavek meliorantu nezměnil signifikantně přijatelnost Cd, Cu a Mn (obr. 47), což by mohlo být očekáváno na základě zvýšených koncentrací těchto prvků v nejtenčích kořenech. Toto zjištění je také podpořeno myšlenkou, že jsou tyto kovy více adsorbovány na nejtenčí kořeny, než obsaženy v pletivech [Bolan et al. 2003]. Na druhou stranu zvýšení příjmu Mn, Cu a Cd kořeny bylo ovlivněno kotransportem odebíraných živin, nebo bylo ovlivněno/evokováno meliorací na fyziologické bázi [Tlustoš et al. 2006], případně kombinací; DGT technika umožňuje pouze stanovit přijatelnost prvků na základě chemické speciace [Jakl et al. 2009], ale nezměněná přijatelnost kovů může potvrdit adsorpci kovů na nejtenčí kořeny. Na základě výsledků z DGT přídavek meliorantu snížil přijatelnost hliníku v obou upravených variantách (obr. 47) z hodnoty 52 mg L-1 u kontrolní na 31 mg L-1 u povrchové a 12 mg L-1 u jamkové aplikace. Tato skutečnost by mohla mít pozitivní vliv na porost olše a je podpořena faktem, že vápnění zvyšuje adsorpci Al (např. [Mora et al. 1999]). Kromě signifikantního nárůstu koncentrace Al v nejtenčí kořenové frakci obou upravených variant byl nárůst pozorován také ve frakci 0,2–0,5 cm u povrchové aplikace. Oproti tomu v ostatních částech olše byl pozorován pokles koncentrace Al u upravených variant oproti variantě kontrolní (obr. 47), podobně jako uvádějí Tyler et Olsson [2001]. U draslíku způsobila meliorace půdy pokles jeho přijatelnosti téměř o 50% (obr. 47), od hodnoty 4202 mg L-1 u kontroly na 2407 mg L-1 u povrchové aplikace a 2796 mg L-1 u jamkové aplikace. To může být ovšem způsobeno v důsledku zvýšeného příjmu K rychleji rostoucími olšemi (84 g sušiny u kontrolní, 226 g sušiny u povrchové a 232 g sušiny u jamkové aplikace) na upravené půdě. Podobný efekt byl

104

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu zaznamenán Derome et Saarsalmi [1999]. Celé stromy dohromady na upravených variantách inkorporovaly asi dvakrát vyšší celkové množství K než stromy na kontrole, zřejmě v důsledku vyšší akumulace v biomase. Zvýšená přijatelnost olova v půdě může být negativním důsledkem meliorace půdy [Tlustoš et al. 2006]. V tomto případě se tento jev projevil částečně v půdě u povrchové aplikace (obr. 47), což ovšem nemělo statisticky významný vliv na růst koncentrace Pb v jednotlivých částech olše. V případě kůry byla dokonce koncentrace signifikantně nižší u bou upravených variant ve srovnání s kontrolou. Množství informací může být doplněno koncentracemi prvků ve vodě (obr. 48). Tato charakteristika je obvykle považována za určující přijatelné nebo mobilní množství prvků, nicméně pouze určuje výskyt forem prvků rozpustných ve vodě, jedná se v tomto smyslu o chemický, nikoli biologický parametr. Nicméně vodorozpustná koncentrace může podat doplňující informace o mobilitě a nebezpečí vyplavování [Bolan et al. 2003]. Technika DGT odhalila signifikantní ochuzení (ve smyslu „efektivní“ koncentrace) půdy o Al po přídavku meliorantu (obr. 47), ochuzení o vodorozpustnou část Al byla nalezena jen o povrchové aplikace (obr. 48). Ochuzení o „efektivní“ koncentraci Zn bylo také u upravených variant patrno, což bylo též podpořeno signifikantně nižším obsahem vodorozpustnostné frakce v obou upravených variantách. Oproti těmto zjištěním byla přijatelnost Pb u povrchové varianty mírně vyšší než u ostatních variant, které byly zhruba stejné. Taktéž mobilita Pb byla u kontrolní a jamkové aplikace zhruba stejná, avšak u povrchové aplikace byl zaznamenán neprůkazný pokles této frakce (obr. 48). Tento rozpor výsledků může vycházet z rozdílného principu obou metod. V technice DGT musí ionty difundovat skrz gel a sorbovat se na skupinách iminodioctové kyseliny pryskyřičné vrstvy. Tyto mechanismy v podstatě imitují difúzi iontů v prostředí a pasivní sorpci na buněčné stěně [Degryse et al. 2009]. Oproti tomu koncentrace ve vodorozpustné frakci podává jen informaci o rozpustnosti různých forem prvků. Posouzením těchto faktů lze tedy říci, že z hlediska přijatelnosti rostlinou se „efektivní“ koncentrace (získaná z DGT) zdá přinejmenším pro některé rizikové prvky slibnější, než „vodorozpustná“ koncentrace, jelikož DGT technika neukázala žádné signifikantní změny v přijatelnosti mezi variantami, jako se mezi variantami neukázaly rozdíly v obsahu prvků v rostlinných částech. Nárůst množství prvků v nejtenčí kořenové frakci byl nejspíš způsoben sorpcí [Bolan et al. 2003] na

105

Možnosti stanovení mobility prvků v terénu vysoký povrch nejtenčích kořenů [Jakl et al. 2009]. Toto zjištění je podpořeno koncentracemi Pb stanovenými v sušině různých částí olše (obr. 51). Dále vodorozpustná koncentrace Mn a Zn byla u upravených variant nižší než u kontroly, což se ale nezobrazilo u částí olše; v nejtenčí kořenové frakci byl zaznamenán signifikantní nárůst koncentrace Mn a Zn v obou upravených variantách (obr. 52). Nicméně koncentrace prvků ve vodorozpustné frakci může pomoci při posuzování možného nebezpečí jejich mobilizace a vyplavování z půdy. Z tohoto pohledu může meliorace půdy jednoznačně (u jamkové aplikace) ochránit proti vyplavování Pb, Mn, Zn, Cd a mírně Al (obr. 48), navzdory jejich obsahu v použitém meliorantu. Na druhou stranu může meliorant způsobit vyplavování Fe a K (u povrchové aplikace). Zvýšení vodorozpustnosti Ca v obou upravených variantách může být způsoben zvýšením celkového obsahu Ca v půdě vlivem použitých materiálů.

106

Závěry

4 Závěry Předložená práce zejména shrnuje a navrhuje analytické postupy vhodné k monitorování mobility rizikových prvků v půdě, které jsou zde zmíněny především ve vztahu k obsahu nízkomolekulárních organických kyselin (LMWOAs). Nutným základem pro obecnější závěry a pochopení principů bylo především navržení možných struktur komplexů LMWOAs s kadmiem (olovem) na základě studia modelových roztoků pomocí ESI-MS. V tomto ohledu lze říci, že šťavelová kyselina (OA) tvoří jak záporně, tak i kladně nabité komplexy. Tyto komplexy obsahují kromě OA jako ligandu často i anorganický anion (Cl-, NO3-), výjimkou není ani výskyt klastrů. Pro jablečnou (MA) a citronovou (CA) kyselinu nebyl výskyt záporně nabitých komplexů potvrzen. Opět zde bylo nalezeno velké množství smíšených struktur tvořených jak ligandy samotných kyselin, tak i anorganických aniontů (Cl-, I-), tak i do komplexu vstupovala celá neutrální molekula (např. KCl), nebo kationty (Na+, K+). Pro CA a MA byly též pozorovány fragmentace vedoucí ke vzniku dalších v půdě se vyskytujících LMWOAs. Na základě kolizních experimentů byly navrženy schémata jejich možné transformace v půdě. Tyto informace pak byly použity ve vypracování postupu přímého stanovení komplexů v složitějších matricích (kohoutková voda a půdní roztok). V těchto matricích

byly

uspěšně

detekovány

hlavní

specie

pozorované

v roztocích

modelových. Vliv exudace LMWOAs na mobilitu rizikových prvků byl zejména studován v navržených dvoufázových hydroponických experimentech s vrbou jívou, olší lepkavou a olší šedou, kde bylo možné změny v půdním roztoku průběžně monitorovat a studovat tak uvolňování vybraných prvků do půdního roztoku, jejich příjem rostlinou a následné ustavování optima. Porovnáním výsledků mezi jednotlivými dřevinami i použitými půdami ze třech lokalit bylo následně možné získat informace o vlivu složení půdy (půdního roztoku), vlivu či preference rostliny k příjmu daných rizikových prvků a jejich transportu do nadzemních pletiv. Získané informace byly využity v hodnocení nádobového pokusu s vrbou Smithovou, kde byly studovány především změny v určitých intervalech odebíraného půdního roztoku.

107

Závěry

Zmíněné postupy byly též využity v analýzách pro lesní pokus a zejména pro pochopení vlivu vápnění na porost i půdu. V lesním pokusu byl sledován jeho vliv na složení a nárůst biomasy, složení půdního roztoku, vliv na efektivní koncentraci rizikových prvků (pomocí DGT) a vyluhovatelnost a nepřímo přijatelnost jednotlivých rizikových prvků.

108

Seznam zkratek

5 Seznam zkratek zkratka

význam

AA

octová kyselina

AAS

atomová absorpční spektrometrie

AE

prahová energie

APCI-MS

hmotnostní spektrometrie s chemickou ionizací za atmosférického tlaku

ASV

anodická rozpouštěcí voltametrie

ATP

adenosintrifosfát

BCR

Bureau Communautaire de Référence

CA

citronová kyselina

CID

disociace vyvolaná srážkou

CSV

katodická rozpouštěcí voltametrie

DBL

difúzní hraniční vrstva

DGT

difúzní gradient v tenkém filmu

DPASV

diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie

DPCSV

diferenční pulsní katodická rozpouštěcí voltametrie

dSEVC

diskontinuální jednoelektrodový voltage clamp

EDDS

ethylendiamin-N,N'-dijantarová kyselina

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

ESI-MS

hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprayem

ETAAS

atomová absorpční spektrometrie s bezplamenovým atomizátorem

FA

mravenčí kyselina

HMDE

visící rtuťová kapková elektroda

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

ICP-MS

hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plasmatem

ICP-OES

optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plasmatem

IEC

ionty vylučující chromatografie

LMWOAs

nízkomolekulární organické kyseliny

MA

jablečná kyselina

MS

hmotnostní spektrometrie (detekce)

MS/MS

tandemová hmotnostní spektrometrie

109

Seznam zkratek

NCE

normalizovaná kolizní energie

OA

šťavelová kyselina

PBL

fosfolipidová dvojvrstva

RP

rizikový prvek nebo rizikové prvky

TK

těžký kov nebo těžké kovy

110

Použitá literatura

6 Použitá literatura ADRIANO, D.C. Trace Elements in Terrestrial Environments: Biogeochemistry, Bioavailability, and Risks of Metals. 2. vyd. New York: Springer, 2001, 867 s. ISBN 0-387-98678-2. AGGERHOLM, T. - NANITA, S.C. - KOCH, K.J. - COOKS, R.G. Clustering of nucleosides in the presence of alkali metals: Biologically relevant quartets of guanosine, deoxyguanosine and uridine observed by ESI-MS/MS. Journal of Mass Spectrometry, 2003, roč. 38, č. 1, s. 87-97. ASSUNCAO, A.G.L. - SCHAT, H. - AARTS, M.G.M. Thlaspi caerulescens, an attractive model species to study heavy metal hyperaccumulation in plants. New Phytologist, 2003, roč. 159, č. 2, s. 351-360. BABAOĞLU, M. Protoplast isolation in Lupin (Lupinus mutabilis Sweet): determination of optimum explant source and isolation conditions. Turkish Journal of Botany, 2000, roč. 24, s. 177-185. BACON, J.R. - DAVIDSON, C.M. Is there a future for sequential chemical extraction? The Analyst, 2008, roč. 133, č. 1, s. 25-46. BALCAR, V. - KACÁLEK, D. Growth and health state of silver fir (Abies alba Mill.) in the ridge area of the Jizerské hory Mts. Journal of Forest Science, 2008, roč. 54, č. 11, s. 509-518. BALCAR, V. - PODRÁZSKÝ, V. Založení výsadbového pokusu v hřebenové partii Jizerských hor. Zprávy lesnického výzkumu, 1994, roč. 39, č. 2, s. 1-7. BAREK, J. - OPEKAR, F. - ŠTULÍK, K. Elektroanalytická chemie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2005, 188 s. ISBN 80-246-1146-5. BECKETT, P.H.T. The use of extractants in studies on trace metals in soils, sewage sludges and sludge-treated soils. Advances in Soil Science, 1989, roč. 9, s. 143176. BEIER, C. - HANSEN, K. Evaluation of porous cup soil-water samplers under controlled field conditions: comparison of ceramic and PTFE cups. Journal of Soil Science, 1992, roč. 43, č. 2, s. 261-271. BERBEL, F. - DÍAZ-CRUZ, J.M. - ARIŃO, C. - ESTEBAN, M. Voltammetry of metal ions in mixtures of ligands Part I. Theoretical formulation and application to 1:1

111

Použitá literatura

labile complexes. Journal of Electroanalytical Chemistry, 1997, roč. 431, č. 1, s. 99110. BERGELIN, A. - VAN HEES, P.A.W. - WAHLBERG, O. - LUNDSTROM, U.S. The acid-base properties of high and low molecular weight organic acids in soil solutions of podzolic soils. Geoderma, 2000, roč. 94, č. 2-4, s. 223-235. BHOJWANI, S.S. - RAZDAN, M.K. Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Editor S.S. BHOJWANI A M.K. RAZDAN. Amsterdam: Elsevier, 1996, 767 s. ISBN 0-444-81623-2. BIRKLER, R.I.D. - STØTTRUP, N.B. - HERMANNSON, S. - NIELSEN, T.T. GREGERSEN, N. - BØTKER, H.E. - ANDREASEN, M.F. - JOHANNSEN, M. A UPLC-MS/MS application for profiling of intermediary energy metabolites in microdialysis samples--A method for high-throughput. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, roč. 53, č. 4, s. 983-990. BLOM-ZANDSTRA, M. - KOOT, H.T.M. - VAN HATTUM, J. - VOGELZANG, S.A. Isolation of protoplasts for patch-clamp experiments: an improved method requiring minimal amounts of adult leaf or root tissue from monocotyledonous or dicotyledonous plants. Protoplasma, 1995, roč. 185, č. 1, s. 1-6. BOLAN, N.S. - ADRIANO, D.C. - CURTIN, D. Soil acidification and liming interactions with nutrient and heavy metal transformation and bioavailability. Advances in Agronomy, 2003, roč. 78, s. 215-272. BOOLTINK, H.W.G. - BOUMA, J. Physical and morphological characterization of bypass flow in a well-structured clay soil. Soil Science Society of America Journal, 1991, roč. 55, č. 5, s. 1249-1254. BORGEGARD, S.O. - RYDIN, H. Biomass, root penetration and heavy metal uptake in birch in a soil cover over copper tailings. Journal of Applied Ecology, 1989, roč. 26, č. 2, s. 585-595. BOYD, R.S. The defense hypothesis of elemental hyperaccumulation: status, challenges and new directions. Plant and Soil, 2007, roč. 293, č. 1-2, s. 153-176. BRANICA, G. - LOVRIC, M. Pseudopolarography of totally irreversible redox reactions. Electrochimica Acta, 1997, roč. 42, č. 8, s. 1247-1251. BROOKS, R.R. - LEE, J. - REEVES, R.D. - JAFFRE, T. Detection of nickeliferous rocks by analysis of herbarium specimens of indicator plants. Journal of Geochemical Exploration, 1977, roč. 7, č. 1, s. 49-57.

112

Použitá literatura

BROWN, S.D. - KOWALSKI, B.R. Pseudopolarographic determination of metal complex stability constants in dilute solution by rapid scan anodic stripping voltammetry. Analytical Chemistry, 1979, roč. 51, č. 13, s. 2133-2139. BUFFLE, J. - TERCIER-WAEBER, M.-L. In situ voltammetry: concepts and practice for trace analysis and speciation. In J. BUFFLE A M.-L. TERCIER-WAEBER. In Situ Monitoring of Aquatic Systems: Chemical Analysis and Speciation. 1. vyd. IUPAC Series on Analytical and Physical Chemistry of Environmental Systems, Chichester, UK: John Wiley, 2000, s. 279-405. BYLUND, D. - NORSTRÖM, S.H. - ESSÉN, S.A. - LUNDSTRÖM, U.S. Analysis of low

molecular

mass

organic

acids

in

natural

waters

by

ion

exclusion

chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, roč. 1176, č. 1-2, s. 89-93. CAI, X. - OGOREVC, B. - TAVČAR, G. - KALCHER, K. Insoluble inorganic salts as carbon

paste

electrode

modifiers

for

preconcentration

and

voltammetric

determination of oxalic acid. Electroanalysis, 1995, roč. 7, č. 7, s. 639-643. CECH, N.B. - ENKE, C.G. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Mass Spectrometry Reviews, 2001, roč. 20, č. 6, s. 362-387. CLAVELL, C. - ZIRINO, A. On-line shipboard determination of trace metals in seawater with a computer-controlled voltammetric instrument. In Mapping Strategies in Chemical Oceanography. 1. vyd. Advances in Chemistry 209, Washington: American Chemical Society, 1985, roč. 209, s. 139-154. CODY, R.B. Electrospray ionization mass spectrometry: History, theory, and instrumentation. In B.N. PRAMANIK, A.K. GANGULY A M.L. GROSS. Applied Electrospray Mass Spectrometry. 1. vyd. Practical Spectroscopy, New York, Basel: Marcel Dekker, 2002, roč. 32, s. 1-98. COLE, R.B. (Editor). Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications. 1. vyd. New York: Wiley, 1997, 577 s. ISBN 0471-14564-5. CONKLIN, A.R. Introduction to Soil Chemistry: Analysis and Instrumentation. Hoboken: Wiley, 2005, 218 s. ISBN 978-0-471-46056-5.

113

Použitá literatura

CORNELIS, R. - CREWS, H. - CARUSO, J. - HEUMANN, K. (Editor). Handbook of Elemental Speciation: Techniques and Methodology. 1. vyd. Chichester: Wiley, 2003, 657 s. ISBN 0-471-49214-0. COSIO, C. - MARTINOIA, E. - KELLER, C. Hyperaccumulation of cadmium and zinc in Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri at the leaf cellular level. Plant Physiology, 2004, roč. 134, č. 2, s. 716-725. CROMPTON, T.R. Determination of Organic Compounds in Natural and Treated Waters. 1. vyd. London: E & FN Spon, 2000, 884 s. ISBN 0-419-24360-7. CURL, E.A. - TRUELOVE, B. The Rhizosphere. Springer-Verlag, 1986, 288 s. ISBN 9783540158035. DAHLÉN, J. - HAGBERG, J. - KARLSSON, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 2000, roč. 366, č. 5, s. 488-493. DANIEL, J.M. - FRIESS, S.D. - RAJAGOPALAN, S. - WENDT, S. - ZENOBI, R. Quantitative determination of noncovalent binding interactions using soft ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, 2002, roč. 216, č. 1, s. 1-27. DAVISON, W. - ZHANG, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature, 1994, roč. 367, č. 6463, s. 546-548. DE WIT, H.A. - ELDHUSET, T.D. - MULDER, J. Dissolved Al reduces Mg uptake in Norway spruce forest: Results from a long-term field manipulation experiment in Norway. Forest Ecology and Management, 2010, roč. 259, č. 10, s. 2072-2082. DEGRYSE, F. - BROOS, K. - SMOLDERS, E. - MERCKX, R. Soil solution concentration of Cd and Zn can be predicted with a CaCl2 soil extract. European Journal of Soil Science, 2003, roč. 54, č. 1, s. 149-157. DEGRYSE, F. - SMOLDERS, E. - ZHANG, H. - DAVISON, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry, 2009, roč. 6, č. 3, s. 198218. DEROME, J. - SAARSALMI, A. The effect of liming and correction fertilisation on heavy metal and macronutrient concentrations in soil solution in heavy-metal polluted scots pine stands. Environmental Pollution, 1999, roč. 104, č. 2, s. 249-259.

114

Použitá literatura

DI MARCO, V.B. - BOMBI, G.G. Electrospray mass spectrometry (ESI-MS) in the study of metal-ligand solution equilibria. Mass Spectrometry Reviews, 2006, roč. 25, č. 3, s. 347-379. DIVAKARAN, M. - PILLAI, G.S. - BABU, K.N. - PETER, K.V. Isolation and fusion of protoplasts in Vanilla species. Current Science, 2008, roč. 94, č. 1, s. 115-120. DIVIŠ, P. - DOČEKALOVÁ, H. - ŘEZÁČOVÁ, V. Gelové techniky pro měření in situ ve vodách, v půdách a v sedimentech. Chemicke Listy, 2005, roč. 99, s. 640-646. DIVIŠ, P. - DOČEKALOVÁ, H. - SMETKOVÁ, V. Hloubkové profily labilních kovových specií v sedimentech a jejich in situ měření technikou difuzního gradientu v tenkém filmu. Chemicke Listy, 2003, roč. 97, č. 12, s. 1184-1189. DOMINGUEZ, M.T. - MADRID, F. - MARANON, T. - MURILLO, J.M. Cadmium availability in soil and retention in oak roots: potential for phytostabilization. Chemosphere, 2009, roč. 76, č. 4, s. 480-486. DONARD, O.F.X. - CARUSO, J.A. Trace metal and metalloid species determination: evolution and trends. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 1998, roč. 53, č. 2, s. 157-163. DOS SANTOS UTMAZIAN, M.N. - WIESHAMMER, G. - VEGA, R. - WENZEL, W.W. Hydroponic screening for metal resistance and accumulation of cadmium and zinc in twenty clones of willows and poplars. Environmental Pollution, 2007, roč. 148, č. 1, s. 155-165. DUFFUS, J.H. "heavy metals" - A meaningless term? (IUPAC technical report). Pure and Applied Chemistry, 2002, roč. 74, č. 5, s. 793-807. EBBS, S. - LAU, I. - AHNER, B. - KOCHIAN, L. Phytochelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescens (J. & C. Presl). Planta, 2002, roč. 214, č. 4, s. 635-640. ELDHUSET, T.D. - LANGE, H. - DE WIT, H.A. Fine root biomass, necromass and chemistry during seven years of elevated aluminium concentrations in the soil solution of a middle-aged Picea abies stand. Science of the Total Environment, 2006, roč. 369, č. 1-3, s. 344-356. FENN, J.B. - MANN, M. - MENG, C.K. - WONG, S.F. - WHITEHOUSE, C.M. Electrospray ionization for mass spectrometers of large biomolecules. Science, 1989, roč. 246, s. 64-70.

115

Použitá literatura

FILGUEIRAS, A.V. - LAVILLA, I. - BENDICHO, C. Chemical sequential extraction for metal partitioning in environmental solid samples. Journal of Environmental Monitoring, 2002, roč. 4, č. 6, s. 823-857. FISCHER, K. Environmental analysis of aliphatic carboxylic acids by ion-exclusion chromatography. Analytica Chimica Acta, 2002, roč. 465, č. 1-2, s. 157-173. FOX, T.R. The influence of low-molecular-weight organic acids on properties and processes in forest soils. In W.W. MCFEE A J.M. KELLY. Carbon Forms and Functions in Forest Soils. vyd., Madison: SSSA, 1995, s. 43-62. GAMOH, K. - SAITOH, H. - WADA, H. Improved liquid chromatography/mass spectrometric analysis of low molecular weight carboxylic acids by ion exclusion separation

with

electrospray

ionization.

Rapid

Communications

in

Mass

Spectrometry, 2003, roč. 17, č. 7, s. 685-689. GATLIN, C.L. - TURECEK, F. - VAISAR, T. Determination of soluble Cu(I) and Cu(II) species in jet fuel by electrospray-ionization mass-spectrometry. Analytical Chemistry, 1994, roč. 66, č. 22, s. 3950-3958. GIMPEL, J. - ZHANG, H. - HUTCHINSON, W. - DAVISON, W. Effect of solution composition, flow and deployment time on the measurement of trace metals by the diffusive gradient in thin films technique. Analytica Chimica Acta, 2001, roč. 448, č. 1-2, s. 93-103. GRAY, C.W. - MCLAREN, R.G. - ROBERTS, A.H.C. - CONDRON, L.M. Effect of soil pH on cadmium phytoavailability in some New Zealand soils. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 1999, roč. 27, č. 2, s. 169-179. GRAYSTON, S.J. - VAUGHAN, D. - JONES, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology, 1997, roč. 5, č. 1, s. 29-56. GROSSMANN, J. - UDLUFT, P. The extraction of soil water by the suction-cup method: a review. Journal of Soil Science, 1991, roč. 42, č. 1, s. 83-93. GUTIÉRREZ MAÑERO, F.J. - PROBANZA LOBO, A. - POZUELO GONZÁLEZ, J.M. LLINARES, F. Effects on nodular extracts of Alnus glutinosa (l.) Gaertn. on ammonification, nitrification and CO2 production in different soils. Orsis: Organismes i Sistemes, 1994, roč. 9, s. 3-12.

116

Použitá literatura

HAMMERICH, O. Methods for studies of electrochemical reactions. In H. LUND A O. HAMMERICH. Organic Electrochemistry. 4. (revised and expanded) vyd., New York: Marcel Dekker, 2001, s. 95-182. HARPER, M.P. - DAVISON, W. - TYCH, W. Estimation of pore water concentrations from DGT profiles: A modelling approach. Aquatic Geochemistry, 1999, roč. 5, č. 4, s. 337-355. HERNÁNDEZ-ALLICA, J. - GARBISU, C. - BECERRIL, J.M. - BARRUTIA, O. GARCÍA-PLAZAOLA, J.I. - ZHAO, F.J. - MCGRATH, S.P. Synthesis of low molecular weight thiols in response to Cd exposure in Thlaspi caerulescens. Plant, Cell & Environment, 2006, roč. 29, č. 7, s. 1422-1429. HEYROVSKÝ, J. - KŮTA, J. Základy polarografie. 1. vyd. Praha: Nakladatelství ČSAV, 1962, 426 s. HOFFLAND, E. - FINDENEGG, G. - NELEMANS, J. Solubilization of rock phosphate by rape. II. Local root exudation of organic acids as a response to P-starvation. Plant and Soil, 1989, roč. 113, č. 2, s. 161-165. HOFSTADLER, S.A. - GRIFFEY, R.H. Analysis of noncovalent complexes of DNA and RNA by mass spectrometry. Chemical Reviews, 2001, roč. 101, č. 2, s. 377390. HUANG, H. - DASGUPTA, P.K. A field-deployable instrument for the measurement and speciation of arsenic in potable water. Analytica Chimica Acta, 1999, roč. 380, č. 1, s. 27-37. HUANG, S.H. - WANG, R.J. - MAK, T.C.W. Crystal structures of isomorphous cadmium(II) and lead(II) oxalate trihydrates. Journal of Crystallographic and Spectroscopic Research, 1990, roč. 20, č. 2, s. 99-104. CHANG CHIEN, S.W. - WANG, M.C. - HUANG, C.C. Reactions of compost-derived humic substances with lead, copper, cadmium, and zinc. Chemosphere, 2006, roč. 64, č. 8, s. 1353-1361. CHEN, Z. - KIM, K.-R. - OWENS, G. - NAIDU, R. Determination of carboxylic acids from plant root exudates by ion exclusion chromatography with ESI-MS. Chromatographia, 2008, roč. 67, č. 1, s. 113-117. INGERSLEV, M. - HALLBÄCKEN, L. Above ground biomass and nutrient distribution in a limed and fertilized Norway spruce (Picea abies) plantation: Part II.

117

Použitá literatura

Accumulation of biomass and nutrients. Forest Ecology and Management, 1999, roč. 119, č. 1-3, s. 21-38. INGHAM, E.R. - MOLINA, R. Interactions among mycorrhizal fungi, rhizosphere organisms, and plants. In P. BARBOSA, V.A. KRISCHIK A C.G. JONES. Microbial Mediation of Plant-Herbivore Interactions. 1. vyd., New York: Wiley, 1991, s. 169198. ISO_11260. Standard of Soil Quality - Determination of Effective Cation Exchange Capacity and Base Saturation Level Using Barium Chloride Solution. International Organization for Standardization, 1994. ISO_11466. Soil Quality - Extraction of Trace Elements Soluble in Aqua Regia. International Organization for Standardization, 1995. JAKL, M. Vliv rostlinných exudátů na mobilitu těžkých kovů v půdě. Rigorózní práce. Česká zemědělská univerzita v Praze: Katedra agroenvironmentální chemie a výživy rostlin, 2010, 82 str. JAKL, M. - DYTRTOVA, J. - TLUSTOS, P. Study of abilities of soil solutions to bond the cadmium ions using anodic stripping voltammetry (In Czech). In J. BAREK A T. NAVRATIL. Modern Electrochemical Methods XXVII. Jetrichovice: BEST Servis, 2007, 51-54 str. JAKL, M. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - KUNEŠ, I. - BALÁŠ, M. - TLUSTOŠ, P. Micronutrient uptake and bioavailability of metals after amelioration of alder plantation with crushed basic rocks. European Journal of Forest Research, 2011, roč. submitted. JAKL, M. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - MIHOLOVÁ, D. - KOLIHOVÁ, D. - SZÁKOVÁ, J. - TLUSTOŠ, P. Passive diffusion assessment of cadmium and lead accumulation by plants in hydroponic systems. Chemical Speciation and Bioavailability, 2009, roč. 21, č. 2, s. 111-120. JAKL, M. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - TLUSTOŠ, P. The study of cadmium - oxalic acid complexes using DPASV and ESI-MS. In T. NAVRÁTIL A J. BAREK. Modern Electrochemical Methods XXX. Jetřichovice: BEST Servis, Ústí nad Labem, 2010a, 85-88 str. JAKL, M. - KUNEŠ, I. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - BALÁŠ, M. - TLUSTOŠ, P. Uptake and bioavailability of copper after liming of alder plantation. In Reasonable Use of Fertilizers. CULS Prague, 2010b, roč. 16, 68-72 str.

118

Použitá literatura

JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. Speciace těžkých kovů v půdním roztoku. Ph.D. Thesis. Czech University of Life Sciences Prague: Department of Agrochemistry and Plant Nutrition, 2008, 189 str. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - KOLIHOVÁ, D. - MIHOLOVÁ, D. - TLUSTOŠ, P. The effect of low-molecular-weight organic acids on cadmium assay using diffusive gradient in thin film technique. Chemicke Listy, 2009a, roč. 103, č. 5, s. 401-406. JAKLOVA DYTRTOVA, J. - JAKL, M. - SCHRODER, D. Cadmium and lead in mixed complexes with oxalic acid. In P. TUNON-BLANCO A J. WANG. 13th International Conference on Electroanalysis ESEAC 2010. Gijon, 2010, OST 23 str. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - SCHRÖDER, D. The oxidation of ferrocene; a hyphenation of voltammetry with electrospray ionization mass spectrometry. Editor T. NAVRÁTIL A J. BAREK. Jetřichovice: BEST Servis, Ústí nad Labem, 2011a. ISBN 978-80-254-9634-3. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - SCHRÖDER, D. Complexation of the tree exudate malic acid with cadmium(II) probed by electrospray ionization mass spectrometry. v přípravě, 2012. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - SCHRÖDER, D. - ČADKOVÁ, E. KOMÁREK, M. Complexation between the fungicide tebuconazole and copper(II) probed by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2011b, roč. 25, s. 1037-1042. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - SCHRÖDER, D. - NAVRÁTIL, T. Electrochemical and spectrometric detection of low-molecular-weight organic acids and their complexes with metals. Current Organic Chemistry, 2011c, roč. 15, č. 17, s. 2970-2982. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - ŠESTÁKOVÁ, I. - ZINS, E.-L. - SCHRÖDER, D. - NAVRÁTIL, T. A new approach to study cadmium complexes with oxalic acid in soil solution. Analytica Chimica Acta, 2011d, roč. 693, č. 1-2, s. 100-105. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - ŠESTÁKOVÁ, I. - JAKL, M. - NAVRÁTIL, T. Electrochemical detection of cadmium and lead complexes with low molecular weight organic acids. Electroanalysis, 2009b, roč. 21, č. 3-5, s. 573-579. JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - ŠESTÁKOVÁ, I. - JAKL, M. - SZÁKOVÁ, J. - MIHOLOVÁ, D. - TLUSTOŠ, P. The use of differential pulse anodic stripping voltammetry and

119

Použitá literatura

diffusive gradient in thin films for heavy metals speciation in soil solution. Central European Journal of Chemistry, 2008, roč. 6, č. 1, s. 71-79. JONES, D.L. Organic acids in the rhizosphere – a critical review. Plant and Soil, 1998, roč. 205, č. 1, s. 25-44. JONES, D.L. - DENNIS, P.G. - OWEN, A.G. - VAN HEES, P.A.W. Organic acid behavior in soils – misconceptions and knowledge gaps. Plant and Soil, 2003, roč. 248, č. 1-2, s. 31-41. KAASALAINEN, M. - YLI-HALLA, M. Use of sequential extraction to assess metal partitioning in soils. Environmental Pollution, 2003, roč. 126, č. 2, s. 225-233. KABATA-PENDIAS, A. Trace elements in soils and plants. 3. vyd. Boca Raton: CRC Press, 2001, 413 s. ISBN 9780849315756. KAFKA, Z. - PUNČOCHÁŘOVÁ, J. Těžké kovy v přírodě a jejich toxicita. Chemicke Listy, 2002, roč. 96, č. 7, s. 611-617. KANCHANAPOOM, K. - JANTARO, S. - RAKCHAD, D. Isolation and fusion of protoplasts from mesophyll cells of Dendrobium Pompadour. ScienceAsia, 2001, roč. 27, s. 29-34. KAPE, R. - WEX, K. - PARNISKE, M. - GORGE, E. - WETZEL, A. - WERNER, D. Legume root metabolites and VA-mycorrhiza development. Journal of Plant Physiology, 1993, roč. 141, č. 1, s. 54-60. KIDD, P. - BARCELÓ, J. - BERNAL, M.P. - NAVARI-IZZO, F. - POSCHENRIEDER, C. - SHILEV, S. - CLEMENTE, R. - MONTERROSO, C. Trace element behaviour at the root–soil interface: Implications in phytoremediation. Environmental and Experimental Botany, 2009, roč. 67, č. 1, s. 243-259. KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2. vyd. Ostrava: Nakladatelství Pavel Klouda, 2003, 132 s. KOCH, K.J. - AGGERHOLM, T. - NANITA, S.C. - COOKS, R.G. Clustering of nucleobases with alkali metals studied by electrospray ionization tandem mass spectrometry: implications for mechanisms of multistrand DNA stabilization. Journal of Mass Spectrometry, 2002, roč. 37, č. 7, s. 676-686. KOMÁREK, M. - TLUSTOŠ, P. - SZÁKOVÁ, J. - CHRASTNÝ, V. The use of poplar during a two-year induced phytoextraction of metals from contaminated agricultural soils. Environmental Pollution, 2008, roč. 151, č. 1, s. 27-38.

120

Použitá literatura

KOPPONEN, P. - UTRIAINEN, M. - LUKKARI, K. - SUNTIOINEN, S. - KÄRENLAMPI, L. - KÄRENLAMPI, S. Clonal differences in copper and zinc tolerance of birch in metal-supplemented soils. Environmental Pollution, 2001, roč. 112, č. 1, s. 89-97. KOUNAVES,

S.P.

Pseudopolarography

at

the

mercury

hemisphere

ultramicroelectrode: theory and experiment. Analytical Chemistry, 1992, roč. 64, č. 23, s. 2998-3003. KRISHNAMURTI, G.S.R. - NAIDU, R. Chemical speciation and bioavailability of trace metals. In Biophysico-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments. vyd. IUPAC Series, Hoboken: Wiley, 2007, s. 419-466. KUMAR, P. - DUSHENKOV, V. - MOTTO, H. - RASKIN, I. Phytoextraction - the use of plants to remove heavy metals from soils. Environmental Science & Technology, 1995, roč. 29, č. 5, s. 1232-1238. KUNEŠ, I. - BALCAR, V. - BENEŠOVÁ, T. - BALÁŠ, M. - ZADINA, J. - ZAHRADNÍK, D. - VÍTÁMVÁS, J. - KACÁLEK, D. - ŠPULÁK, O. - JAKL, M. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - PODRÁZSKÝ, V. Influence of pulverized limestone and amphibolite mixture on the growth performance of Alnus incana (L.) Moench plantation on an acidified mountain site. Journal of Forest Science, 2009, roč. 55, č. 10, s. 469-476. KUNEŠ, I. - BALCAR, V. - VYKYPĚLOVÁ, E. - ZADINA, J. - ŠEDLBAUEROVÁ, J. ZAHRADNÍK, D. Vliv jamkové a pomístné povrchové aplikace dolomitického vápence na množství a chemické složení biomasy smrku ztepilého v Jizerských horách. Zprávy lesnického výzkumu, 2007, roč. 52, č. 4, s. 316-327. KÜPPER, H. - JIE ZHAO, F. - MCGRATH, S.P. Cellular compartmentation of zinc in leaves of the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Plant Physiology, 1999, roč. 119, č. 1, s. 305-312. KYSELÁKOVÁ,

H.

Isolation

of

chloroplasts

from

protoplasts.

Personal

communication. In Olomouc, 2007. LASAT, M.M. - BAKER, A.J.M. - KOCHIAN, L.V. Physiological characterization of root Zn2+ absorption and translocation to shoots in Zn hyperaccumulator and nonaccumulator species of Thlaspi. Plant Physiology, 1996, roč. 112, č. 4, s. 17151722. LASAT, M.M. - BAKER, A.J.M. - KOCHIAN, L.V. Altered Zn compartmentation in the root symplasm and stimulated Zn absorption into the leaf as mechanisms involved

121

Použitá literatura

in Zn hyperaccumulation in Thlaspi caerulescens. Plant Physiology, 1998, roč. 118, č. 3, s. 875-883. LINDSAY, W.L. Chemical Equilibria in Soils. New-York ; Toronto: John Wiley & Sons., 1979, 449 s. ISBN 9780471027041. LITAOR, M.I. Review of soil solution samplers. Water Resources Research, 1988, roč. 24, č. 5, s. 727-733. LOCONTO, P.R. Trace Environmental Quantitative Analysis: Principles, Techniques and Applications. 2. vyd. Boca Raton: CRC/Taylor & Francis, 2006, 732 s. ISBN 08247-5853-6. LOUIS, Y. - GARNIER, C. - LENOBLE, V. - OMANOVIC, D. - MOUNIER, S. PIZETA, I. Characterisation and modelling of marine dissolved organic matter interactions with major and trace cations. Marine Environmental Research, 2009, roč. 67, č. 2, s. 100-107. MA, L. - IEZZI, M. - KAUCHER, M.S. - LAM, Y.F. - DAVIS, J.T. Cation exchange in lipophilic G-quadruplexes: Not all ion binding sites are equal. Journal of the American Chemical Society, 2006, roč. 128, č. 47, s. 15269-15277. MARSCHNER, H. Mineral Nutrition of Higher Plants. 2. vyd. London: Academic Press, 1995, 904 s. ISBN 0-12-473543-6. MARSCHNER, H. - RÖMHELD, V. - KISSEL, M. Localization of phytosiderophore release and of iron uptake along intact barley roots. Physiologia Plantarum, 1987, roč. 71, č. 2, s. 157-162. MCBRIDE, M.B. - BOULDIN, D.R. Long-term reactions of copper(II) in a contaminated calcareous soil. Soil Science Society of America Journal, 2009, roč. 48, č. 1, s. 56-59. MCGUIRE, P.E. - LOWERY, B. - HELMKE, P.A. Potential sampling error: trace metal adsorption on vacuum porous cup samplers. Soil Science Society of America Journal, 1992, roč. 56, č. 1, s. 74-82. MEERS, E. - DU LAING, G. - UNAMUNO, V. - RUTTENS, A. - VANGRONSVELD, J. - TACK, F.M.G. - VERLOO, M.G. Comparison of cadmium extractability from soils by commonly used single extraction protocols. Geoderma, 2007, roč. 141, č. 3-4, s. 247-259.

122

Použitá literatura

MEHLICH, A. Mehlich 3 soil test extractant: A modification of Mehlich 2 extractant. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1984, roč. 15, č. 12, s. 14091416. MIHOLOVÁ, D. - MADER, P. - SZÁKOVÁ, J. - SLÁMOVÁ, A. - SVATOŠ, Z. Czechoslovakian biological certified reference materials and their use in the analytical quality assurance system in a trace-element laboratory. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 1993, roč. 345, č. 2-4, s. 256-260. MICHELET, B. - BOUTRY, M. The plasma membrane H+-ATPase. A highly regulated enzyme with multiple physiological functions. Plant Physiology, 1995, roč. 108, č. 1, s. 1-6. MILNER, M.J. - KOCHIAN, L.V. Investigating heavy-metal hyperaccumulation using Thlaspi caerulescens as a model system. Annals of Botany, 2008, roč. 102, č. 1, s. 3-13. MOLLEMAN, A. Patch Clamping: An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. Chichester: Wiley, 2003, 175 s. ISBN 978-0-471-48685-5. MORA, M.L. - BAEZA, G. - PIZARRO, C. - DEMANET, R. Effect of calcitic and dolomitic lime on physicochemical properties of a Chilean Andisol. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1999, roč. 30, č. 3-4, s. 427-439. NAMBU, K. - VAN HEES, P.A.W. - ESSÉN, S.A. - LUNDSTRÖM, U.S. Assessing centrifugation technique for obtaining soil solution with respect to leaching of low molecular mass organic acids from pine roots. Geoderma, 2005, roč. 127, č. 3-4, s. 263-269. NAVRATIL, T. - SESTAKOVA, I. - JAKLOVA DYTRTOVA, J. - JAKL, M. - MARECEK, V. Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers. In M. OTESTEANU, S. CELIKYAY, N. MASTORAKIS, S. LACHE A F.K. BENRA. 7th

WSEAS

International

Conference

on

Environment,

Ecosystems

and

Development. vyd., Puerto de la Cruz, SPAIN: World Scientific and Engineering Acad. and Soc., 2009, s. 212-217. NAVRATIL, T. - SESTAKOVA, I. - JAKLOVA DYTRTOVA, J. - JAKL, M. - MARECEK, V. Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers. WSEAS Transactions on Environment and Development, 2010, roč. 6, č. 3, s. 208219.

123

Použitá literatura

NAVRÁTIL, T. - ŠESTÁKOVÁ, I. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. - JAKL, M. - MAREČEK, V. Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers. WSEAS Transactions on Environment and Development, 2010, roč. 6, č. 3, s. 208219. NEUMANN, G. - MASSONNEAU, A. - MARTINOIA, E. - RÖMHELD, V. Physiological adaptations to phosphorus deficiency during proteoid root development in white lupin. Planta, 1999, roč. 208, č. 3, s. 373-382. NEUMANN, G. - RÖMHELD, V. The release of root exudates as affected by the plant physiological status. In R. PINTON, Z. VARANINI A P. NANNIPIERI. The Rhizosphere: Biochemistry and Organic Substances at the Soil-Plant Interface. 2. vyd., New York, Basel: CRC Press, 2007, s. 23-72. NOLAN, A.L. - LOMBI, E. - MCLAUGHLIN, M.J. Metal bioaccumulation and toxicity in soils - Why bother with speciation? Australian Journal of Chemistry, 2003, roč. 56, č. 2-3, s. 77-91. NYHOLM, L. - WIKMARK, G. Precise polarographic determination of the stability constants of cadmium and lead with oxalate and sulphate. Analytica Chimica Acta, 1989, roč. 223, s. 429-440. PAPADOYANNIS, I.N. - SAMANIDOU, V.F. Ion-exclusion chromatography. In J. CAZES. Encyclopedia of Chromatography [online]. 2. vyd. New York: Marcel Dekker, 2002. ISBN 0-8247-4123-4. PAPOYAN, A. - PIÑEROS, M. - KOCHIAN, L.V. Plant Cd2+ and Zn2+ status effects on root and shoot heavy metal accumulation in Thlaspi caerulescens. New Phytologist, 2007, roč. 175, č. 1, s. 51-58. PERRY, T.O. The ecology of tree roots and the practical significance thereof. Journal of Arboriculture, 1982, roč. 8, s. 197-211. PETTERSSON, O. Heavy-metal ion uptake by plants from nutrient solutions with metal ion, plant species and growth period variations. Plant and Soil, 1976, roč. 45, č. 2, s. 445-459. PINEROS, M.A. - KOCHIAN, L.V. Differences in whole-cell and single-channel ion currents across the plasma membrane of mesophyll cells from two closely related Thlaspi species. Plant Physiology, 2003, roč. 131, č. 2, s. 583-594.

124

Použitá literatura

PIZETA, I. - BILLON, G. - OMANOVIC, D. - CUCULIC, V. - GARNIER, C. - FISCHER, J. Pseudopolarography of lead (II) in sediment and in interstitial water measured with a solid microelectrode. Analytica Chimica Acta, 2005, roč. 551, č. 1-2, s. 65-72. PRAMANIK, B.N. - GANGULI, A.K. - GROSS, M.L. Applied Electrospray Mass Spectrometry. New York, Basel: Marcel Dekker, 2002. PROCHÁZKA, S. - MACHÁČKOVÁ, I. - KREKULE, J. - ŠEBÁNEK, J. (Editor). Fyziologie rostlin. 1. vyd. Praha: Academia, 1998, 488 s. ISBN 80-200-0586-2. PULFORD, I. - WATSON, C. Phytoremediation of heavy metal-contaminated land by trees—a review. Environment International, 2003, roč. 29, č. 4, s. 529-540. PUY, J. - TORRENT, M. - GALCERAN, J. - CECILIA, J. - SALVADOR, J. - MONNE, J. - COMPANYS, E. - GARCES, J.L. - MAS, F. Voltammetry of heterogeneous labile metal-macromolecular systems for any ligand-to-metal ratio - Part II. Obtaining the binding curve from the normalised limiting currents. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2001, roč. 514, č. 1-2, s. 83-93. QUEVAUVILLER, P. (Editor). Methodologies for Soil and Sediment Fractionation Studies. 1. vyd. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2002, 180 s. ISBN 085404-453-1. RAURET, G. - F. LOPEZ-SANCHEZ, J. - SAHUQUILLO, A. - RUBIO, R. DAVIDSON, C. - URE, A. - QUEVAUVILLER, P. Improvement of the BCR three step sequential extraction procedure prior to the certification of new sediment and soil reference materials. Journal of Environmental Monitoring, 1999, roč. 1, č. 1, s. 57-61. RAUSCH, N. - UKONMAANAHO, L. - NIEMINEN, T. - KRACHLER, M. - ROUX, G. SHOTYK, W. Evaluation of samplers and filter materials for the establishment of trace metal concentration profiles in peat bog porewaters using inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2006, roč. 558, č. 1-2, s. 201210. RIGOLA, D. - FIERS, M. - VURRO, E. - AARTS, M.G.M. The heavy metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens expresses many species-specific genes, as identified by comparative expressed sequence tag analysis. New Phytologist, 2006, roč. 170, č. 4, s. 753-766.

125

Použitá literatura

ROBINSON, M.G. - BROWN, L.N. Copper complexation during a bloom of Gymnodinium sanguineum Hirasaka (Dinophyceae) measured by ASV. Marine Chemistry, 1991, roč. 33, č. 1-2, s. 105-118. ROSEN, A. - HIEFTJE, G.M. Inductively coupled plasma mass spectrometry and electrospray

mass

spectrometry

for

speciation

analysis:

applications

and

instrumentation. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 2004, roč. 59, č. 2, s. 135-146. ROSENBERG, E. The potential of organic (electrospray- and atmospheric pressure chemical ionisation) mass spectrometric techniques coupled to liquid-phase separation for speciation analysis. Journal of Chromatography A, 2003, roč. 1000, č. 1-2, s. 841-889. ROSS, K.L. - TU, T.T. - SMITH, S. - DALLUGE, J.J. Profiling of organic acids during fermentation

by

ultraperformance

liquid

chromatography−tandem

mass

spectrometry. Analytical Chemistry, 2007, roč. 79, č. 13, s. 4840-4844. ROSYPAL, S. Úvod do molekulární biologie. Díl 1. 4. vyd. Brno: Stanislav Rosypal, 2006, 288 s. ISBN 80-902562-5-2. RYAN, P.R. - DITOMASO, J.M. - KOCHIAN, L.V. Aluminium toxicity in roots: An investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap. Journal of Experimental Botany, 1993, roč. 44, č. 2, s. 437-446. ŘEZÁČOVÁ-SMETKOVÁ, V. - DOČEKAL, B. - DOČEKALOVÁ, H. Použití techniky difuzního gradientu v tenkém filmu při charakterizaci půd. Chemicke Listy, 2005, roč. 99, s. 594-599. SAARSALMI, A. - TAMMINEN, P. - KUKKOLA, M. - LEVULA, T. Effects of liming on chemical properties of soil, needle nutrients and growth of Scots pine transplants. Forest Ecology and Management, 2011, roč. 262, č. 2, s. 278-285. SALT, D.E. - SMITH, R.D. - RASKIN, I. Phytoremediation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1998, roč. 49, č. 1, s. 643-668. SALVADOR, J. - PUY, J. - CECILIA, J. - GALCERAN, J. Lability of complexes in steady-state finite planar diffusion. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2006, roč. 588, č. 2, s. 303-313. SEUNTJENS, P. - NOWACK, B. - SCHULIN, R. Root-zone modeling of heavy metal uptake and leaching in the presence of organic ligands. Plant and Soil, 2004, roč. 265, č. 1-2, s. 61-73.

126

Použitá literatura SCHRÖDER, D. - WEISKE, T. - SCHWARZ, H. Dissociation behavior of Cu(urea)+ complexes generated by electrospray ionization. International Journal of Mass Spectrometry, 2002, roč. 219, č. 3, s. 729-738. SIMS, J.R. - HABY, V.A. Simplified colorimetric determination of soil organic matter. Soil Science, 1971, roč. 112, č. 2, s. 137-141. SRIVASTAVA, S. - PRAKASH, S. - SRIVASTAVA, M.M. Studies on mobilization of chromium with reference to its plant availability - Role of organic acids. BioMetals, 1999, roč. 12, č. 3, s. 201-207. STROBEL, B.W. Influence of vegetation on low-molecular-weight carboxylic acids in soil solution - a review. Geoderma, 2001, roč. 99, č. 3-4, s. 169-198. SZÁKOVÁ, J. - TLUSTOŠ, P. - GOESSLER, W. - FRKOVÁ, Z. - NAJMANOVÁ, J. Mobility of arsenic and its compounds in soil and soil solution: the effect of soil pretreatment and extraction methods. Journal of Hazardous Materials, 2009, roč. 172, č. 2-3, s. 1244-1251. SZÁKOVÁ, J. - TLUSTOŠ, P. - KOLIHOVÁ, D. Použití instrumentálních analytických technik pro stanovení rizikových prvků v zemědělských materiálech. 1. vyd. Praha: ČZU v Praze, 2005, 47 s. ISBN 80-213-1407-9. SZMIGIELSKA, A.M. - VAN REES, K.C.J. - CIESLINSKI, G. - HUANG, P.M. Comparison of liquid and gas chromatography for analysis of low molecular weight organic acids in rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1997, roč. 28, č. 1-2, s. 99-111. ŠESTÁKOVÁ, I. - JAKL, M. - JAKLOVÁ DYTRTOVÁ, J. Chemically modified carbon paste electrode for fast screening of oxalic acid levels in soil solution. In Proceedings of the 12th International Conference on Electroanalysis, Česká společnost chemická, Praha 2008, Chemicke Listy 102, 140-140. ŠVANCARA, I. - VYTŘAS, K. - KALCHER, K. - WALCARIUS, A. - WANG, J. Carbon paste electrodes in facts, numbers, and notes: A review on the occasion of the 50years

jubilee

of

carbon

paste

in

electrochemistry

and

electroanalysis.

Electroanalysis, 2009, roč. 21, č. 1, s. 7-28. TANAKA, K. - DING, M.-Y. - HELALEH, M.I.H. - TAODA, H. - TAKAHASHI, H. - HU, W. - HASEBE, K. - HADDAD, P.R. - FRITZ, J.S. - SARZANINI, C. Vacancy ionexclusion chromatography of carboxylic acids on a weakly acidic cation-exchange resin. Journal of Chromatography A, 2002, roč. 956, č. 1-2, s. 209-214.

127

Použitá literatura

TANAKA, K. - HADDAD, P.R. Ion exclusion chromatography: Liquid chromatography. In I.D. WILSON, E.R. ADLARD, M. COOKE A C.F. POOLE. Encyclopedia of Separation Science. 1. vyd., San Diego: Academic Press, 2000, roč. 1, s. 31933201. TESSIER, A. - CAMPBELL, P.G.C. - BISSON, M. Sequential extraction procedure for the speciation of particulate trace metals. Analytical Chemistry, 1979, roč. 51, č. 7, s. 844-851. TINTARU, A. - ROITHOVÁ, J. - SCHRÖDER, D. - CHARLES, L. - JUŠINSKI, I. GLASOVAC, Z. - ECKERT-MAKSIĆ, M. Generation and dissociation pathways of singly and doubly protonated bisguanidines in the gas phase. Journal of Physical Chemistry A, 2008, roč. 112, č. 47, s. 12097-12103. TLUSTOŠ, P. - SZÁKOVÁ, J. - KOŘÍNEK, K. - PAVLÍKOVÁ, D. - HANČ, A. - BALÍK, J. The effect of liming on cadmium, lead, and zinc uptake reduction by spring wheat grown in contaminated soil. Plant, Soil and Environment, 2006, roč. 52, č. 1, s. 1624. TLUSTOŠ, P. - SZÁKOVÁ, J. - VYSLOUŽILOVÁ, M. - PAVLÍKOVÁ, D. - WEGER, J. JAVORSKÁ, H. Variation in the uptake of arsenic, cadmium, lead, and zinc by different species of willows Salix spp. grown in contaminated soils. Central European Journal of Biology, 2007, roč. 2, č. 2, s. 254-275. TOWN, R.M. - VAN LEEUWEN, H.P. Fundamental features of metal ion determination by stripping chronopotentiometry. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2001, roč. 509, č. 1, s. 58-65. TRAGE, C. - DIEFENBACH, M. - SCHRÖDER, D. - SCHWARZ, H. Innocent and less-innocent solvent ligands: A systematic investigation of cationic iron chloride/alcohol

complexes

by

electrospray

ionization

mass

spectrometry

complemented by DFT calculations. Chemistry–A European Journal, 2006, roč. 12, č. 9, s. 2454-2464. TSIERKEZOS, N.G. - BUCHTA, M. - HOLY, P. - SCHRODER, D. Complexation of late transition metal(II) ions (M = Co, Ni, Cu, and Zn) by a macrocyclic thiacrown ether studied by means of electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009a, roč. 23, č. 11, s. 1550-1556. TSIERKEZOS, N.G. - ROITHOVÁ, J. - SCHRÖDER, D. - ONČÁK, M. - SLAVÍČEK, P. Can electrospray mass spectrometry quantitatively probe speciation? Hydrolysis of

128

Použitá literatura

uranyl nitrate studied by gas-phase methods. Inorganic Chemistry, 2009b, roč. 48, č. 13, s. 6287-6296. TYLER, G. - OLSSON, T. Plant uptake of major and minor mineral elements as influenced by soil acidity and liming. Plant and Soil, 2001, roč. 230, č. 2, s. 307-321. UJEC, E. - KELLER, E.E.O. - KRIZ, N. - PAVLIK, V. - MACHEK, J. Low-impedance, coaxial, ion-selective, doble-barrel microelectrodes and their use in biological measurements. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1980, roč. 7, č. 2, s. 363369. URABE, T. - TSUGOSHI, T. - TANAKA, W. Characterization of aluminum species with nitrate, perchlorate and sulfate ions in the positive and negative ion mode by electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry, 2009, roč. 44, č. 2, s. 193-202. URE, A.M. - DAVIDSON, C.M. (Editor). Chemical Speciation in the Environment. 2. vyd. Oxford: Wiley-Blackwell, 2002, 452 s. ISBN 9780632058488. UREN, N.C. - REISENAUER, H.M. The role of root exudates in nutrient acquisition. Editor P.B. TINKER A A. LÄUCHLI. New York: Praeger Publishers, 1988, 253 s. VANGRONSVELD, J. - VANASSCHE, F. - CLIJSTERS, H. Reclamation of a bare industrial area contaminated by nonferrous metals - in-situ metal immobilization and revegetation. Environmental Pollution, 1995, roč. 87, č. 1, s. 51-59. VOET, D. - VOETOVÁ, J. Biochemie. Překlad A. KOTYK. 1. vyd. Praha: Victoria Publishing, 1995, 1362 s. ISBN 80-85605-44-9. VYDRA, F. - ŠTULÍK, K. - JULÁKOVÁ, E. Electrochemical Stripping Analysis. 1. vyd. Chichester: Ellis Horwood, 1976, 283 s. ISBN 0-853-12017-X. WANG, J. Analytical Electrochemistry. 3. vyd. New York: Wiley-VCH, 2006, 245 s. ISBN 0-471-67879-1. WENZEL, W.W. - ADRIANO, D.C. - SALT, D. - SMITH, R. Phytoremediation: a plantmicrobe-based remediation system. In D.C. ADRIANO, J.M. BOLLAG, W.T. FRANKENBERGER A R.C. SIMS. Bioremediation of Contaminated Soils. 1. vyd. Agronomy Monograph 37, Madison, 1999, s. 456-508. WENZEL, W.W. - BLUM, W.E.H. Assessment of metal mobility in soil methodological problems. In H.E. ALLEN, C.P. HUANG, G.W. BAILEY A A.R. BOWERS. Metal Speciation and Contamination of Soil. vyd., London: Lewis, 1995, s. 227-236.

129

Použitá literatura

WENZEL, W.W. - KIRCHBAUMER, N. - PROHASKA, T. - STINGEDER, G. - LOMBI, E. - ADRIANO, D.C. Arsenic fractionation in soils using an improved sequential extraction procedure. Analytica Chimica Acta, 2001, roč. 436, č. 2, s. 309-323. WENZEL, W.W. - SLETTEN, R.S. - BRANDSTETTER, A. - WIESHAMMER, G. STINGEDER, G. Adsorption of trace metals by tension lysimeters: Nylon membrane vs. porous ceramic cup. Journal of Environmental Quality, 1997, roč. 26, č. 5, s. 1430-1434. WENZEL, W.W. - WIESHAMMER, G. Suction cup materials and their potential to bias trace-metal analyses of soil solution: A review. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 1995, roč. 59, č. 2-4, s. 277-290. ZABOWSKI, D. - UGOLINI, F.C. Lysimeter and centrifuge soil solutions - seasonal differences between methods. Soil Science Society of America Journal, 1990, roč. 54, č. 4, s. 1130-1135. ZEIEN, H. - BRÜMMER, G.W. Chemische extraktion zur bestimmung von schwermetallbindungsformen

in

böden.

Metteilungen

der

Deutschen

Bodenkundlichen Gesellschaft, 1989, roč. 39, s. 505-510. ZHANG, C. Fundamentals of Environmental Sampling and Analysis. 1. vyd. Hoboken: Wiley, 2007, 456 s. ISBN 978-0-471-71097-4. ZHANG, H. - DAVISON, W. - KNIGHT, B. - MCGRATH, S. In situ measurements of solution concentrations and fluxes of trace metals in soils using DGT. Environmental Science & Technology, 1998, roč. 32, č. 5, s. 704-710. ZIMMERMAN, A.J. - WEINDORF, D.C. Heavy metal and trace metal analysis in soil by sequential extraction: A review of procedures. International Journal of Analytical Chemistry, 2010, roč. 2010. ZIRINO, A. - KOUNAVES, S.P. Anodic stripping peak currents: electrolysis potential relations for reversible systems. Analytical Chemistry, 1977, roč. 49, č. 1, s. 56-59.

130