ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů katedra chemie
Stanovení vlivu genotypových a agrotechnických faktorů na obsah a složení antioxidantů rajčat (Lycopersicon esculentum Mill.) doktorská disertační práce
Autor:
Ing. Zora Kotíková
Školitel:
Prof. Ing. Jaromír Lachman, CSc.
Školitel specialista:
Doc. Ing. Alena Hejtmánková, CSc.
Praha 2011
Poděkování: Touto cestou bych chtěla poděkovat především Prof. Ing. Jaromíru Lachmanovi, CSc., který byl vedoucím mé disertační práce a paní Doc. Ing. Aleně Hejtmánkové, CSc., která mi byla nepostradatelnou a výbornou konzultantkou a školitelkou specialistkou. Dále bych chtěla poděkovat všem pracovníkům katedry chemie za odbornou pomoc a výborné zázemí a také svým rodičům, kteří mě podporovali po celou dobu mého studia na ČZU v Praze.
OBSAH 1.
Úvod ............................................................................................................................1
2.
Literární rešerše ...........................................................................................................3 2.1.
Rajče jedlé (Lycopersicon esculentum Mill.) ..........................................................3
2.1.1.
Původ a historie ...............................................................................................3
2.1.2.
Botanická charakteristika ................................................................................4
2.1.3.
Odrůdy rajčat ...................................................................................................6
2.1.4.
Nároky na prostředí .........................................................................................7
2.1.5.
Technologie pěstování.....................................................................................9
2.1.6.
Chemické složení rajčat.................................................................................11
2.2.
Karotenoidy ...........................................................................................................13
2.2.1.
Základní charakteristika ................................................................................13
2.2.2.
Chemická charakteristika ..............................................................................14
2.2.2.1.
Karoteny...................................................................................................14
2.2.2.2.
Xantofyly .................................................................................................15
2.2.3.
Biosyntéza karotenoidů .................................................................................17
2.2.4.
Výskyt karotenoidů .......................................................................................19
2.2.5.
Funkce karotenoidů .......................................................................................20
2.2.5.1.
Účast při fotosyntéze................................................................................20
2.2.5.2.
Ochranná funkce ......................................................................................23
2.2.5.2.1. 2.2.5.3.
Antioxidační funkce .................................................................................24
2.2.5.4.
Karotenoidy jako prekurzory vitaminu A ................................................26
2.2.6.
2.3.
3.
Xantofylový cyklus ...........................................................................24
Karotenoidy obsažené v plodech rajčat .........................................................29
2.2.6.1.
Lykopen....................................................................................................29
2.2.6.2.
Ostatní karotenoidy ..................................................................................30
Vitamin C ..............................................................................................................31
2.3.1.
Chemická charakteristika ..............................................................................31
2.3.2.
Biosyntéza vitaminu C ..................................................................................32
2.3.3.
Fyziologie a výživa........................................................................................33
2.3.4.
Výskyt vitaminu C.........................................................................................35
2.3.5.
Funkce vitaminu C ........................................................................................36
2.3.6.
Vitamin C v plodech rajčat............................................................................38
Cíle práce...................................................................................................................40
4.
Materiál a metody......................................................................................................41 4.1.
Metodika pokusů ...................................................................................................41
4.1.1.
Polní pokus ....................................................................................................41
4.1.2.
Skleníkový pokus ..........................................................................................42
4.2.
Charakteristika stanoviště......................................................................................43
4.2.1.
Meteorologická charakteristika stanoviště ....................................................43
4.3.
Charakteristika pěstovaných odrůd rajčat..............................................................44
4.4.
Chemická analýza..................................................................................................45
4.4.1.
Přístroje a vybavení .......................................................................................45
4.4.2.
Chemikálie.....................................................................................................46
4.4.3.
Standardy.......................................................................................................47
4.4.4.
Příprava vzorků k analýze .............................................................................47
4.4.5. Stanovení celkového obsahu karotenoidů metodou molekulové absorpční UV-VIS spektrofotometrie ....................................................................................................47 4.4.5.1.
Princip metody .........................................................................................47
4.4.5.2.
Příprava a měření vzorků .........................................................................49
4.4.6.
Chromatografická separace analytů ..............................................................50
4.4.6.1.
Princip metody .........................................................................................50
4.4.6.2.
Chromatografická separace karotenoidů..................................................51
4.4.6.2.1.
Příprava vzorků .................................................................................51
4.4.6.2.2.
Příprava standardů.............................................................................52
4.4.6.2.3.
Chromatografické podmínky stanovení ............................................52
4.4.6.3.
4.4.6.3.1.
Příprava vzorků .................................................................................54
4.4.6.3.2.
Chromatografické podmínky stanovení ............................................54
4.4.7.
Stanovení antioxidační aktivity rajčat metodou ABTS .................................54
4.4.7.1.
Princip metody .........................................................................................54
4.4.7.2.
Příprava vzorků ........................................................................................55
4.4.7.3.
Příprava standardu Troloxu......................................................................56
4.4.7.4.
Měření vzorků metodou ABTS................................................................56
4.4.8. 5.
Chromatografická separace vitaminu C ...................................................53
Statistické zhodnocení naměřených dat.........................................................56
Výsledky a diskuze....................................................................................................58 5.1.
Obsah a složení karotenoidů v rajčatech ...............................................................58
5.1.1.
Celkové karotenoidy......................................................................................58
5.1.2.
Jednotlivé karotenoidy...................................................................................62
5.2.
Obsah vitaminu C v rajčatech................................................................................66
5.3.
Antioxidační aktivita rajčat ...................................................................................68
5.4.
Vliv různé úrovně minerálního hnojení na obsah antioxidantů rajčat...................74
5.4.1.
Celkové karotenoidy......................................................................................74
5.4.2.
Jednotlivé karotenoidy...................................................................................76
5.4.3.
Vitamin C ......................................................................................................79
5.4.4.
Antioxidační aktivita .....................................................................................80
6.
Závěr..........................................................................................................................83
7.
Literatura ...................................................................................................................85
8.
Přílohy .......................................................................................................................96
1.
ÚVOD Rajčata patří k nejrozšířenějším druhům zeleniny na světě. Roční světová produkce rajčat
činí přibližně 150 miliónů tun. Z toho je 50-60 miliónů tun ročně zpracováno na různé produkty. Průměrná roční spotřeba na osobu je 3,5 kg (v EU 14-15 kg, v Itálii a USA dokonce více než 30 kg). V České republice se spotřeba na osobu a rok pohybuje okolo 12 kg a v posledních několika letech stále mírně stoupá. Rajčata obsahují celou řadu látek příznivě působících na lidský organismus. Vedle vysokého obsahu vitaminů a minerálů jsou významným zdrojem antioxidačně aktivních látek. Důležitou skupinu antioxidantů rajčat, podílejících se na ochraně buněk před negativním působením volných radikálů, tvoří karotenoidy a vitamin C. Karotenoidy představují skupinu žlutých, oranžových a červených lipofilních barviv, vyskytujících se především v rostlinách. Živočichové si je neumějí sami syntetizovat, pouze je přijímají potravou. Z chemického hlediska patří karotenoidy mezi tetraterpeny, jejich molekula se
skládá z osmi isoprenových jednotek. Rozdělují se na karoteny (uhlovodíky) a kyslík
obsahující xantofyly. V rostlinných i živočišných organismech zastávají různé funkce. Mezi nejdůležitější z nich patří jejich antioxidační a provitaminová aktivita. Nepostradatelnou úlohu mají také v rostlinném organismu, kde se podílí na přenosech energie při fotosyntéze. V současnosti je známo okolo 800 různých karotenoidů, z nichž zhruba 50 sloučenin vykazuje aktivitu vitaminu A. Tyto sloučeniny se označují jako retinoidy. Z výsledků mnoha epidemiologických studií vyplývá, že karotenoidy působí jako velmi efektivní antioxidanty, čímž významně snižují rizika rozvoje srdečních onemocnění a některých typů rakoviny. Antioxidační aktivita karotenoidů je dána hydrofobním řetězcem, složeným z polyenových jednotek, který může zhášet singletový kyslík nebo neutralizovat volné radikály. Obecně lze říci, že čím má karotenoidní molekula delší řetězec konjugovaných dvojných vazeb, tím vykazuje vyšší antioxidační aktivitu. V rajčatech se celkový obsah karotenoidů pohybuje v rozmezí 70-200 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Majoritním karotenoidem rajčat je lykopen., který tvoří až 90 % jejich celkového obsahu. Dalším důležitým karotenoidem obsaženým v rajčatech je β-karoten, spolu s lykopenem způsobují charakteristické zabarvení zralých plodů. Tyto karotenoidy se významně podílejí na vnímání kvality čerstvých plodů a produktů z nich vytvořených, protože spotřebitelé upřednostňují rajčata s intenzivním červeným zabarvením.
1
Vitamin C je důležitým antioxidantem hydrofilní frakce rajčat. Strukturou se řadí mezi deriváty sacharidů, jeho základní biologicky aktivní sloučeninou je L-askorbová kyselina. Funkce vitaminu C souvisí především s jeho redoxními vlastnostmi. U rostlin má určitou úlohu při fotosyntéze, kde reguluje množství aktivních forem kyslíku, uplatňuje se též při růstu a diferenciaci buněk. U živočichů se vitamin C podílí především na hydroxylačních reakcích probíhajících v organismu. Vitamin C je nezbytný pro správnou funkci kardiovaskulárního a imunitního systému. Účastní se na syntéze kolagenu, tím je nezbytný pro tvorbu pojivových tkání. Podporuje také absorpci a transport železa v těle. Velmi důležité je jeho antioxidační působení, reaguje s aktivními formami kyslíku a dusíku, resp. s volnými radikály. Důležité jsou také jeho reakce s oxidovanými formami vitaminu E, které zabezpečují ochranu vitaminu E a lipidů membrán před oxidací. Rostliny a většina živočichů si tento vitamin sami syntetizují. U člověka schopnost syntetizovat askorbovou kyselinu chybí v důsledku ztráty L-gulono-1,4-lakton oxidoreduktasy, enzymu nutného při finálním kroku biosyntézy askorbové kyseliny. Vitamin C nemůže být skladován v těle, proto musí být pravidelně přijímán potravou. Ovoce a zelenina představují hlavní zdroje vitaminu C v lidské výživě. V rajčatech se obsah vitaminu C podle různých autorů pohybuje v rozmezí 100-400 mg.kg-1 čerstvé hmotnosti. Doporučovaný denní příjem byl stanoven v rozmezí 60-120 mg na den, v případě oslabení organismu jeho potřeba ještě stoupá. Obsah a složení antioxidantů rajčat a s tím související antioxidační aktivita mohou být ovlivněny celou řadou faktorů, jako je odrůda, stupeň zralosti, způsob pěstování a klimatické podmínky růstu. Cílem této práce je vyhodnotit vliv ročníku, odrůdy, stupně zralosti a vliv různé úrovně minerální výživy na obsah a složení zmiňovaných antioxidantů rajčat. Dalším cílem je stanovit antioxidační aktivitu plodů a vyhodnotit do jaké míry se na této aktivitě podílejí právě karotenoidy a vitamin C.
2
2.
LITERÁRNÍ REŠERŠE 2.1.
Rajče jedlé (Lycopersicon esculentum Mill.) 2.1.1.
Původ a historie
Historie pěstování dnes celosvětově rozšířených rajčat je u nás poměrně krátká. Předpokládá se, že divoce rostoucí druh pochází z horských oblastí peruánských And, odkud se rozšířil do střední a severní Ameriky společně s kukuřicí v průběhu lidských migrací před zhruba 2000 lety. Když se s nimi evropští dobyvatelé poprvé setkali v Mexiku, pěstovali je už tamní obyvatelé po celá staletí pod jmény tomati, tomatl, tumatle a tomatas (Biggs et al., 2004). Do Evropy se rajčata dostala společně s bramborami až po Kolumbově objevení Ameriky. Jako řada jiných lilkovitých rostlin byla nejprve považována za jedovatá. Původní plané typy byly drobnoplodé a měly poléhavé stonky (Petříková a Malý, 2003). Zpočátku se rajče pěstovalo jako okrasná jedovatá rostlina (ve střední a západní Evropě se tento názor udržel až do konce XVIII. století), relativně později jako konzumní zelenina. Od 18. století už se v Evropě šlechtilo a používalo. Výjimku mezi evropskými zeměmi tvoří Itálie, kde se rajče pěstuje a používá již od roku 1560. V našich zemích se rajče na trhu objevilo teprve začátkem 20. století (Troníčková a Krejčová, 1985). Jako mnoho druhů zeleniny introdukovaných z Nového světa, i rajče bylo považováno za afrodisiakum. Italské jméno pommi dei mori převzali Francouzi - pomme d'amour znamená „jablko lásky“, neboť se věřilo, že povzbuzuje vášeň (Biggs et al., 2004). Na zlato a ráj upomínají názvy i v jiných jazycích: pomidor, paradajky apod. V dnešní době se v důsledku přenesení rajčete do jiných podmínek, přirozeného výběru a mnohaletého šlechtitelského úsilí vyšlechtily výnosné odrůdy s dobrými chuťovými vlastnostmi. Lze říci, že rajče, které se dnes pěstuje jen vzdáleně připomíná svého předka rostoucího planě v přírodě (Šapiro et al., 1988).
3
2.1.2.
Botanická charakteristika
Taxonomické zařazení (podle Cronquista, 1988): Říše:
rostliny (Plantae)
Podříše:
vyšší rostliny (Cormobionta)
Oddělení:
krytosemenné (Magnoliophyta)
Třída:
dvouděložné (Magnoliopsida)
Podtřída:
asteridae (Asteridae)
Řád:
lilkotvaré (Solanales)
Čeleď:
lilkovité (Solanaceae)
Rod:
lilek (Solanum)
Druh:
rajče jedlé (Lycopersicon esculentum Mill.)
Rod Solanum (Lycopersicon), rajče, zahrnuje celkem 12 původních druhů z oblasti Chile, Peru, Ekvádoru a Galapág, vesměs s počtem chromozomů 2n = 24. Rajče je rostlina původně víceletá, v našich podmínkách však jednoletá (Mareček, 1994). Druh Lycopersicon esculentum se dále dělí na čtyři základní poddruhy (Silva et al., 2008): •
Lycopersicon esculentum var. esculentum - K tomuto poddruhu se řadí většina komerčně pěstovaných odrůd. Odrůdy jsou charakteristické vysokou variabilitou tvaru, barvy a velikosti plodů.
•
Lycopersicon esculentum var. cerasiforme - Odrůdy vycházející z tohoto poddruhu jsou známé jako třešňová rajčata tzv. "cherry tomato". Plody rajčat jsou malé, kulovité, obvykle 2 - 5 cm velké.
•
Lycopersicon esculentum var. pyriforme - Plody těchto odrůd mají hruškovitý tvar o průměrné velikosti 4 cm.
•
Lycopersicon esculentum var. grandifolium - Listy těchto odrůd jsou veliké a mají tvar bramborového listu
•
Lycopersicon esculentum var. validium - Rostliny tohoto poddruhu jsou vzpřímené, kompaktní s krátkými internodii.
Rajče patří k rostlinám s bohatým kořenovým systémem. Délka hlavního kořene závisí na způsobu pěstování a na vlastnostech půdy (pěstebního substrátu). Při pěstování rajčete z přímého výsevu dosahují kořeny až do hloubky 1,5 m. U rostlin vysazovaných se kořenový systém vyvíjí 4
převážně horizontálně a hlavní kořen proniká do hloubky 0,4-0,6 m. Na hypokotylu i na epikotylu se snadno vytvářejí adventivní kořeny, čehož se běžně využívá při výsadbě, kdy se rostliny pokládají šikmo do brázd. Rajče má mimořádnou zakořeňovací schopnost (Pekárková, 2000). Stonek je u mladých rostlin zpočátku bylinný, později dřevnatí. Na povrchu stonku, ale i listů jsou žláznaté trichomy, které vylučují látku na vzduchu tuhnoucí, dávající rostlinám typický zápach. Růst hlavního stonku může být neomezený - indeterminantní (tyčkové odrůdy), nebo ukončený květenstvím - determinantní (keříčkové odrůdy) (Petříková a Malý, 2003). Indeterminantní odrůdy zakládají květenství za každým třetím listem, zatímco determinantní za listem druhým. U obou typů rajčat se v paždí listů tvoří boční výhony, které se u indeterminantních odrůd vylamují (Pekárková, 2001). Listy rajčat jsou střídavé, řapíkaté, přetrhovaně lichozpeřené s lístky nepravidelně zubatými (viz, obrázek 1), jen u některých kultivarů téměř celistvé, laločnaté (Tomšovic, 1997). Skládají se z krátkého řapíku a rozšířené čepele. Čepel je rozdělena hlubokými výřezy na jednotlivé lístky různé velikosti (1. a 2. řádu). Lístky 1. řádu mohou mít ještě palístky. Mezi jednotlivými jařmy jsou u většiny odrůd vyvinuté úkrojky. Podle charakteru členění okraje čepele a jejího povrchu rozeznáváme 3 typy rajčatových listů: pravý rajčatový (nejčastější), bramborový a typ mikado (jednotlivé lístky nejsou vykrajované) (Štambera et al., 1984). Květenstvím je u rajčete rozmanitě členěný vijan ze 3-20 oboupohlavných kvítků. Vijan je jednoduchý nebo větvený, většinou mimoúžlabní, protistojný listům. Květy jsou složené, z pěti i více korunních plátků, mají sírově žlutě zbarvenou korunu. Kalich je hluboce členěný. Kališní lístky jsou pěticípé, šídlovité, bazálně srostlé. Tyčinky mají krátké nitky nebo mohou Obrázek 1. Rajče jedlé (Lycopersicon esculentum Mill.); 1. kvetoucí prýt, 2. typy
úplně chybět. Prašníky jsou protáhlé, dvoudílné a plodů, 3. semeno. srostlé v kužel obklopující bliznu. Otevírají se podélnou vnitřní štěrbinou. Semeník je dvou-, troj- i vícepouzdrý (Mareček, 1994). Květy jsou samosprašné, přirozená partenokarpie je u rajčat
5
velmi nízká. Opylování a oplodnění zhoršuje nízká teplota, vzdušná vlhkost a nízká světelná intenzita (Petříková a Malý, 2003). Plodem rajčat je dvou až vícekomorová bobule různého tvaru a zabarvení. Barva nezralých plodů může být v závislosti na odrůdě různě intenzívně zelená se žíháním nebo bez něj. Plody bez tmavšího zabarvení v okolí kalichu při dozrávání lépe vybarvují, tj. netvoří v okolí kalichu světlejší lem. Oranžová barva plodu je výsledkem vzestupu karotenu, červená barva je výsledkem vzestupu lykopenu (Petříková a Malý, 2003). Semeno je různé velikosti, jeho povrch je pokryt chloupky. Žlutoplodé odrůdy mají semena bez chloupků (Pekárková, 2000). Semeno je umístěno na placentě. Obchodní osivo se v poslední době upravuje obrušováním. Hmotnost tisíce semen je 2,5-3,5 g (Malý et al., 1998).
2.1.3.
Odrůdy rajčat
Odrůdy rajčat se dělí na tyčkové (indeterminantní) a keříčkové (determinantní). V seznamu odrůd pro rok 2008 je ve státní odrůdové knize zapsáno celkem 76 odrůd rajčat. Celkové množství tvoří 46 odrůd tyčkových a 30 odrůd keříčkových (ÚKZÚZ, 2009). Odrůdy jsou registrovány na základě prováděných polních a laboratorních zkoušek ke zjištění odlišnosti, uniformity, stálosti a užitné hodnoty odrůd. Tyto zkoušky provádí Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (ÚKZÚZ). Registrované odrůdy jsou zapsány ve “Státní odrůdové knize ČR” (Pulkrábek, 2005). Teprve zapsané odrůdy se stávají předmětem obchodu a právní ochrany (Pekárková, 2001). Rajčata mají ve svém sortimentu vysoké zastoupení F1 hybridů. Využívání F1 hybridů má jednoznačné přednosti, nazvané hybridní efekt, který se právě u plodových druhů projevuje ze všech zelenin nejvýrazněji. Spojuje především ranost a výnos, zkracuje vegetační dobu a zajišťuje kombinaci několika rezistencí k chorobám. Hybridní osivo je vždycky dražší než nehybridní, protože se každoročně získává novým křížením. Přesévání F1 hybridů do generace F2 se však nevyplatí, protože druhá generace je nejednotná a většinou v ní vyštěpí pěstitelsky nežádoucí typy rostlin (Pekárková, 2001). Rajče vyniká vysokou variabilitou v barvě i tvaru plodů. Nejoblíbenější jsou červenoplodé odrůdy, pro zajímavost se však pěstují i žluté, masově růžové, oranžové nebo bílé. Tvar plodů může být kulovitý, zploštělý, protáhlý nebo hruškovitý. Hmotnost plodů se pohybuje od 20 g u třešňových typů do více než 500 g u masitých odrůd (Pekárková, 2001).
6
Tyčkové odrůdy rajčat jsou určeny k přímému konzumu. Tento typ odrůd by se měl vyznačovat dobrými chuťovými vlastnostmi plodů, odolností vůči praskání a rychlému měknutí, schopností dobře snášet transport a rezistencí vůči houbovým chorobám (Petříková a Malý, 2003). U tyčkových rajčat pěstovaných především pod sklem nebo fólií se vyplatí dát přednost F1 hybridům před staršími nehybridními odrůdami. Jsou rané, výnosné, vyrovnané a zdravější (Pekárková, 2001). K tyčkovým domácím odrůdám patří např. Start S, Tornádo, Toro, Tipo, Orkado, Tajfun (všechny F1 hybridy). Keříčkové odrůdy se dělí na odrůdy k přímému konzumu, které se sklízí ručně, a na odrůdy pro průmyslové zpracování, které se sklízí mechanizovaně. U keříčkových odrůd určených k průmyslovému zpracování je kladen důraz na odolnost plodů vůči praskání, na pevnost, neopadavost, oddělitelnost plodu při sklizni v místě kalichu a na obsah refraktometrické sušiny (Petříková a Malý, 2003). Ke keříčkovým odrůdám určeným pro mechanizovanou sklizeň patří např. Odeon, Salus, Denár, Titan, Proton. Pro ruční sklizeň lze pěstovat z domácích odrůd např. odrůdy Hana, Aneta, Diana nebo žlutoplodou odrůdu Dulcia.
2.1.4.
Nároky na prostředí
Životní procesy rostlin závisí na řadě vnitřních a vnějších faktorů. Vnitřní faktory jsou především fytohormony, vliv druhu a odrůdy. K hlavním vnějším faktorům patří voda, světlo, teplo, ale také se k nim řadí vlastnosti půdy, pohyb vzduchu či spolupůsobení dalších rostlin, živočichů a člověka. Všechny tyto faktory se vzájemně ovlivňují (Tap, 2000). Voda je jeden z nejdůležitějších faktorů, který ovlivňuje růst všech rostlin. Voda ovlivňuje fyziologické funkce a tedy i výnosy pěstovaných plodin. Pro zeleninu je tedy optimalizace vodního režimu významným intenzifikačním faktorem (Malý et al., 1998). Potřeba vody u zelenin je závislá nejenom na rostlinném druhu, ale také na průběhu ontogeneze. Obecně lze konstatovat, že zeleniny se vyznačují spíše nehospodárným vodním provozem. Většinou mají relativně vysoký transpirační koeficient1, který například u rajčete nabývá hodnot 500-600. Výkyvy ve vodních poměrech vedou ve svém důsledku především ke zhoršení kvality většiny zelenin, u rajčat např. k praskání plodů (Malý et al., 1998).
1
Hmotnost vody v gramech, kterou rostlina potřebuje na vytvoření 1 g sušiny.
7
Rajče je rovněž náročné na dostatek vláhy, i když v porovnání s ostatními druhy teplomilných zelenin z čeledi lilkovitých (paprika, baklažán), je vůči suchu odolnější, což způsobuje jeho hlubší a bohatý kořenový systém a velká schopnost vytvářet adventivní kořeny. S nedostatkem vláhy se lépe vyrovnávají rostliny z přímého výsevu než rostliny vysazované, jejichž kořenová soustava nedosahuje takové hloubky (Malý et al., 1998). V průběhu vegetace rajče potřebuje 450-500 mm vody. Rajčata se zavlažují dávkami 20– 30 mm. První závlahovou dávku vyžadují po vysazení, další před začátkem kvetení. Nejvíce vody potřebují v době narůstání plodů, kdy by se mělo zavlažovat každých 8-12 dní. Závlaha se ukončí v době dozrávání plodů (Štambera et al., 1984). Světlo (sluneční záření) je další základní podmínkou tvorby biomasy. Z hlediska účinnosti na pěstované zeleniny je důležitá jeho intenzita, spektrální složení a délka fotoperiody (Duffek a Dolejší, 1998). Fotosyntetické pigmenty absorbují záření o vlnových délkách 400-700 nm. Toto záření se nazývá fotosynteticky aktivní radiace (FAR) a je prakticky shodné s viditelným zářením známým jako denní světlo (Dolejš, 2000). Infračervené záření s vlnovou délkou 720-1000 nm ovlivňuje vodní režim rostlin. Ultrafialové záření o vlnové délce 280-315 nm má velké formativní účinky, podmiňuje některé biosyntézy a podporuje tvorbu látek dusíkaté povahy (Pavlová, 1996). Podle fotoperiodické citlivosti patří rajče mezi krátkodenní rostliny, které vykvetou při délce dne pod 12 až 14 hodin. Gloser (1998) však rajče řadí k fotoperiodicky neutrálním druhům, které zakládají květy bez jakékoliv vazby na délku fotoperiody. Rajče je teplomilná, v našich podmínkách jednoletá rostlina. Vyžaduje teploty nad 20 °C. Při poklesu teploty pod 10 °C rostliny zastavují růst, při dlouhotrvajících teplotách pod 15 °C rostliny nekvetou. Poruchy růstu nastávají i při vysokých teplotách nad 30 °C. Nízké teploty vedou k opadávání květních poupat. Při teplotách pod 13 °C je pyl neklíčivý. Minimální teplota pro klíčení semen je 9 °C, optimální ale 22-25 °C. Červené barvivo plodů lykopen se tvoří při teplotách nad 16 °C a jeho tvorba přestává při teplotě nad 35 °C (Petříková a Malý, 2003). Autoři Silva et al. (2008) uvádějí jako optimální teplotu pro tvorbu lykopenu 20-24 °C v průběhu dne a kolem 18 °C přes noc. Teploty nad 30 °C inhibují tvorbu lykopenu a naopak podporují tvorbu ostatních karotenoidů zodpovědných za žluto-oranžové zbarvení plodů.
8
Rajče nesnáší pokles teplot pod bod mrazu, proto se vysazuje až v druhé polovině května. Rostliny pěstované z přímých výsevů jsou však otužilejší. Nepříznivý vliv na pěstování mají velké rozdíly mezi teplotou vzduchu a půdy, k čemuž se musí přihlížet především při rychlení. Naopak rozdíly mezi teplotami dne a noci jsou pro pěstování důležité (Štambera et al., 1984). Půdy pro pěstování rajčete mají být hluboké, úrodné, hlinité až hlinitopísčité. Rajče nesnáší půdy mokré a těžké. Na půdní reakci nejsou rajčata zvláště náročná, může být mírně kyselá, neutrální až mírně zásaditá. Náročná jsou však na obsah živin (Štambera et al., 1984). V osevním postupu se rajčata zařazují do první trati po vojtěšce nebo po jetelovinách, vhodné je i pěstování po zeleninách a jiných okopaninách, případně i po obilovinách. Velmi dobrými předplodinami jsou luskoviny, ale i kořenové zeleniny a cibuloviny. Zásadně se rajčata nepěstují po lilkovitých druzích zelenin, nebo po bramborách a tabáku. To proto, že hrozí nebezpečí přemnožení některých škůdců (mandelinka bramborová), ale také chorob, zejména houbových chorob a viróz (Štambera, 1986). Základní zpracování půdy se skládá z podmítky, zaorání chlévského hnoje střední orbou a z hluboké orby. Těžištěm podzimní přípravy půdy je hluboká orba, která musí být kvalitní, protože na ní závisí fyzikální vlastnosti půdy. Jarní příprava půdy se skládá z urovnání a prokypření povrchu, případně ze záhonování (Petříková a Malý, 1998). Fosforečná a draselná hnojiva se aplikují na podzim spolu s organickými. Protože jsou rajčata citlivá na chlór, používají se hnojiva síranového typu např. síran draselný. Vhodné je přihnojování během vegetace, protože rajče nesnáší příliš vysokou koncentraci živin v půdě. Přihnojuje se na počátku kvetení a v době tvorby plodů. Dusíkatá hnojiva se k rostlinám dodávají na jaře před výsadbou (popř. výsevem) ve formě nejlépe síranu amonného, močoviny nebo DAMu (Štambera et al., 1984). Rajčata jsou citlivá na čerstvé vápnění, na než reagují žloutnutím listů (Petříková a Malý, 1998). Mezi nejdůležitější choroby rajčat patří bakteriální vadnutí, plíseň bramborová, hnědá skvrnitost rajčat a septoriová skvrnitost rajčat. Ze škůdců se v polních podmínkách nejčastěji vyskytuje mandelinka bramborová a mšice. Z fyziologických poruch je nejzávažnější nedostatek vápníku a praskání plodů (Petříková a Malý, 1998).
2.1.5.
Technologie pěstování
Rajčatová sadba se pěstuje ve sklenících, fóliových krytech nebo v pařeništích z výsevu od poloviny března. Osivo mořené se vysévá do výsevních truhlíků s desinfikovanou zeminou nebo 9
přímo na záhon, či do minisadbovačů se 160 (keříčkové odrůdy) nebo 96 (tyčkové odrůdy) buňkami. Při předpěstování sazenic je potřebné dodržet kvalitu substrátu, rovnoměrnost závlahy a pravidelné přihnojování vodorozpustným hnojivem. Přihnojuje se třikrát po dobu předpěstování. Poprvé při tvorbě 1. pravého listu a dále po týdnu (Petříková a Malý, 2003). Hotové sazenice mají být kompaktní, tmavozelené, nikoli světlé a vytažené z nedostatku světla nebo nafialovělé z chladna či sucha. Na venkovní záhon se vysazují sazenice asi v polovině května. Delší sazenice se do půdy vysazují šikmo až po první listy. Na zahrnutém stonku se vytvoří přídatné kořeny (Pekárková, 2001). Keříčkové odrůdy z přímého výsevu - výsev je okolo 20. dubna, v závislosti na teplotě půdy, která má být alespoň 12 °C. Mořené osivo se vysévá do dvouřádků na záhon o šířce 1,2 m nebo na rovný povrch. Hloubka výsevu je 30-40 mm. Výsevek je 0,5-1 kg.ha-1 (Petříková a Malý, 2003). Keříčkové odrůdy z předpěstované sadby - technologie vhodná pro odrůdy určené k přímému konzumu. Rajčata z předpěstované sadby se vysazují po 15. květnu. po nebezpečí ranních mrazíků. Na ranost sklizně i výšku výnosu má rozhodující význam včasný termín výsadby. Doporučuje se proto vysazovat již začátkem května a po výsadbě na rostliny položit netkanou textilii. Textilie se po okrajích bodově upevní zeminou. Odstraní se za dva až tři týdny, když nebezpečí ranních mrazíků pomine. Rostliny se vysazují sazečem do brázd, kde se využívá možnost kladení rostlin šikmo. Vysazují se na rovný povrch nebo na záhony do dvouřádků na vzdálenost 0,3 m. Pro lepší násadu v prvních vijanech a dřívější kvetení je vhodné rostliny po zakořenění asi dva týdny nezavlažovat (Petříková a Malý, 2003). Tyčkové odrůdy - se vysazují co nejdříve s již nasazeným květenstvím. Při výsadbě začátkem května se využívá (stejně jako u keříčkových odrůd) k nakrývání porostu netkaná textilie. Ta může zlepšit podmínky pro počáteční růst a vývoj a zabraňuje poškození rostlin květnovými mrazíky. Obvykle se pěstují 4 rostliny na 1 m2. Po uplynutí nebezpečí mrazíků se textilie odstraní a do řad se instaluje opěrná konstrukce z drátu napnutého na kůly ve výšce 1,5 m. Rostliny se vyvazují k drátu a vedou se na jeden výhon. Postranní výhony je nutno odstraňovat včas, dokud nepřesáhnou 50 mm. Šířka meziřadí umožňuje mechanizaci prací. Jakmile rostliny dosáhnou nosného drátu, hlavní výhon se zaštípne. Obvykle je tomu po vytvoření 5-6 květenství, za kterým se ponechá jeden list. Zaštípnutím se urychlí dozrání plodů (Petříková a Malý, 2003).
10
Sklizeň rajčat začíná 8-10 týdnů po výsadbě. U rajčat konzumních (většinou odrůdy tyčkové) se sklízí v 4-6 denních intervalech. Sklizeň keříčkových druhů rajčat k průmyslovému zpracování začíná v srpnu a září. Měla by proběhnout do konce září, v opačném případě se zvyšují ztráty přezráním plodů, nebo je i riziko poškození mrazem. Po sklizni, která je většinou destruktivní, tj. s úplnou likvidací porostu, se plody oddělují na vytřasadle. Výnos stolních tyčkových odrůd dosahuje minimálně 40-50 t.ha-1, výnos u keříčkových odrůd 30-40 t.ha-1. Výnos u odrůd k průmyslovému zpracování je 25-35 t.ha-1 (Malý et al., 1998). Rajčata jsou jednou z hlavních komodit, které mají největší podíl na celkovém dovozu čerstvé zeleniny do ČR (Buchtová, 2004). V posledních letech, kdy sílí dovoz rajčat ze Španělska, Kanárských ostrovů apod., je zájem o pěstování odrůd z delší uchovatelností, přitom ale sklízených v červeném stavu, což zvyšuje jejich prodejnost a konkurenceschopnost. Jde o typ odrůd long life, které byly vyšlechtěny genovou manipulací. Lze je pěstovat v rychlírnách i v polních podmínkách. Plody po zčervenání na rostlině neměknou, nepraskají a mohou se sklízet až za 3 týdny. Obdobně po sklizni zůstávají 2-3 týdny pevné. Prodejnost rajčat lze dále zlepšit pěstováním odrůd se stejnoměrným vývinem plodů ve vijanech - tzv. hroznovitých rajčat. Sklízí se celé vijany s obvykle 5-7 plody, které se ukládají do obalů. Rovněž se přednostně využívají typy long life a semi long life. Lepší prodejnost hlavně v zimním období mají umožnit odrůdy cherry rajčat, která se prodávají v menším hmotnostním balení, obvykle 250 g (Petříková a Malý, 1998).
2.1.6.
Chemické složení rajčat
Rajčata obsahují značné množství vody, která představuje 93-95 % z celkové hmotnosti plodů. Zbývajících 5-7 % tvoří anorganické sloučeniny, organické kyseliny, cukry, sloučeniny nerozpustné v alkoholu (bílkoviny, polysacharidy, pektin), karotenoidy a lipidy. Obsah sušiny záleží na několika důležitých faktorech: odrůdě, charakteru půdy a zejména na zavlažování (Leoni, 2002). V tabulce 1 jsou uvedeny obsahy významných látek obsažených ve zralých plodech rajčat.
11
Tabulka 1. Chemické složení čerstvých rajčat (Mangels, 1993).
Složka
Obsah g.100 g-1 93,1-94,2 0,7-1,0 0,2-0,3 3,1-3,5 mg.100 g-1 16,0-24,2 0,80-1,22 0,90-9,30 0,30-0,52 0,04-0,10 0,49-2,80 0,04-1,61 µg.100 g-1 400-600 100-240 90-140 10-90
Voda Bílkoviny Tuky Cukry Vitamin C Vitamin E Lykopen β-karoten Lutein Fytoen γ-karoten Železo Zinek Mangan Měď
Z celkového obsahu cukrů převládají glukóza a fruktóza. Thakur et al. (1996) uvádí, že redukující cukry glukóza a fruktóza tvoří až 50 % sušiny plodů. Koncentrace cukrů v plodech rajčat velmi závisí na zvolené odrůdě a podmínkách pěstování. Podle Doraise et al. (2001) se může obsah cukrů měnit od 1,7 do 4 % celkové hmotnosti plodů v závislosti na odrůdě a podmínkách pěstování. Polysacharidy představují 0,7 % hmotnosti plodů (pektiny a arabinogalaktany 47 %, xylany a arabinoxylany 28 %, celulosa 25 %) (Leoni, 2002). Z organických kyselin je v rajčatech nejvíce zastoupená kyselina jablečná a kyselina citrónová. Ostatní kyseliny (vinná, octová, šťavelová) jsou přítomny pouze v nepatrném množství. V přezrálých plodech se také vyskytuje kyselina jantarová (Šapiro et al., 1988). Důležité jsou změny v poměrech kyseliny jablečné a kyseliny citrónové, které mění stupeň kyselosti plodů a tím významně ovlivňují jeho chuť (Silva et al., 2008). Bílkoviny jsou v rajčatech zastoupeny pouze v malém množství. V průběhu zpracování dochází k jejich denaturaci a k částečné hydrolýze, tím se zvyšuje obsah volných aminokyselin. V rajčatové šťávě je přítomno až 19 volných aminokyselin. V největším množství jsou obsaženy kyselina glutamová (tvoří více než 48 %) a kyselina asparagová. Při zpracování rajčat dochází k odštěpení amoniaku z asparaginu a glutaminu za vzniku příslušných aminokyselin (Leoni, 2002). Rajčata představují v lidské výživě významný zdroj vitaminů a minerálních látek. βkaroten (prekurzor vitaminu A) se v červenoplodých rajčatech vyskytuje pouze v menší míře. 12
Zbarvení červených plodů působí především karotenoid lykopen, který nemá provitaminovou aktivitu. V mnohem větší míře je β-karoten obsažen ve žlutých a oranžových plodech rajčat (Šapiro et al., 1988). Vedle karotenoidů jsou rajčata důležitým zdrojem vitaminů B1 (thiaminu), B2 (riboflavinu), B3 (niacinu), B5 (pantotenové kyseliny), B6 (pyridoxinu), folacinu, vitaminu H (biotinu), vitaminu C (askorbové kyseliny) a vitaminu E (α-tokoferolu) (Silva et al., 2008). Vitamin C (kyselina askorbová) se vyskytuje ve velké míře v čerstvých plodech rajčat. V čerstvých rajčatech je přítomen převážně v redukované formě (dehydroaskorbová kyselina tvoří pouze 1-5 %). Podle Mangelse (1993) obsahují čerstvá rajčata přibližně 160-240 µg vit.C .g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Při kulinárním zpracování dochází k jeho značným ztrátám a to zejména oxidací. Rozsah oxidace závisí na několika faktorech jako jsou: přístup vzduchu, přítomnost enzymů, některé kovové ionty (např. Cu), teplota aj. (Leoni, 2002). Podobně i obsah vitaminu E klesá v průběhu zpracování plodů. Vitamin E je obsažen převážně v semenech, která jsou během zpracování z většiny produktů odstraňována (Silva et al., 2008). Z minerálních látek je v rajčatech zastoupen hlavně, vápník, draslík, železo a hořčík (Petříková a Malý, 2003). Z mikroprvků jsou přítomny Cu, Mn a Zn, které jsou součástí několika antioxidačních enzymů (Leoni, 2002). Z fenolových sloučenin obsahují rajčata kyseliny chlorogenovou, kávovou, ferulovou a pkumarovou. V plodech jsou obsaženy také flavonoly (kvercetin, kempferol a naringenin), v malém množství také antokyany (petunidin), β-sitosterol, cholin a triterpenové saponiny (Martinez-Valverde et al., 2002). Zelené části rostlin a nezralé plody obsahují glykoalkaloidy tomatin a dehydrotomatin. Jedná se o složité organické sloučeniny, které mají aktivní fyziologický účinek. Ve velkých dávkách mohou působit na organismus toxicky. Negativní účinek spočívá v inhibici cholinesterasy (enzym ovlivňující přenos nervových vzruchů) a ochromení nervové soustavy. Během dozrávání obsah glykoalkaloidů v plodech klesá, ve zralých plodech se glykoalkaloidy prakticky nevyskytují (Šapiro et al., 1988).
2.2.
Karotenoidy 2.2.1.
Základní charakteristika
Karotenoidy jsou skupina žlutých, oranžových až červenofialových vysoce nenasycených alifatických a alicyklických uhlovodíků a jejich oxidačních produktů. Patří mezi nejvíce 13
rozšířená a důležitá lipofilní barviva. Nachází se ve vyšších rostlinách, řasách, houbách a bakteriích (Kodíček, 2007). Karotenoidy dostaly svůj název od hlavního zástupce skupiny, oranžového pigmentu βkarotenu, který byl poprvé izolován Wackenroderem v roce 1831 z mrkve karotky (Daucus carota) (Gross, 1991). V současné době je známo okolo 800 přirozeně se vyskytujících pigmentů. Z tohoto množství vykazuje asi 50 sloučenin aktivitu vitaminu A, a proto se označují jako retinoidy. Jejich roční produkce se v přírodě odhaduje na 1.108 tun (Velíšek, 2002).
2.2.2.
Chemická charakteristika
Z chemického hlediska patří karotenoidy do skupiny tetraterpenoidů. Jsou složeny z osmi isoprenových jednotek. Vlastní karotenoidy se vyznačují pouze několika variantami uhlíkového skeletu: mají buď ryze alifatický řetězec, nebo řetězec zakončený jedním či dvěma cykly (šestičlenným nebo pětičlenným). Dvojné vazby karotenoidů umožňují cis-trans-isomerii; většinou mají konfiguraci all-trans, konfigurace cis se vyskytuje jen ve dvojných vazbách nesubstituovaných methyly. Polohy základního skeletu se číslují symetricky, v jedné rovině prostě, v druhé s čárkovými indexy, přičemž číslem 1 začíná uhlík, který by byl podle běžné notace alifatického řetězce v pořadí druhý (Douša, 2009). Karotenoidy jsou nerozpustné ve vodě, jejich lipofilnost klesá zejména se vzrůstajícím počtem kyslíkových atomů v molekule. Za svoji barevnost vděčí řetězci konjugovaných dvojných vazeb, který se vyskytuje v několika základních strukturách a jejich kombinacích. Čím více konjugovaných dvojných vazeb, tím jsou absorpční maxima posunuta k delším vlnovým délkám (Šesták, 1985). Karotenoidy se dělí na dvě hlavní skupiny: •
karoteny - uhlovodíky
•
xantofyly -kyslíkaté sloučeniny (alkoholy, ketony aj.) odvozené od karotenů 2.2.2.1.
Karoteny
Nejjednodušším prototypem karotenů je acyklický polynenasycený uhlovodík lykopen. Běžně rozšířené jsou i deriváty lykopenu, jako je 3,4-dehydrolykopen, a další sloučeniny (neurosporen, ζ-karoten, fytofluen, fytoen).
14
17
CH3
18
19
20
CH3
CH3
CH3
3
H3C 16
1
7
2
6
4
14'
15
11 9
5
12
10
8
12 '
10 '
13'
13
14
15'
6'
5'
4'
7'
11'
CH3 20'
lykopen
8'
9'
2'
16'
1'
CH3
3'
CH3 19'
CH3 18'
CH3 17'
Další karoteny vznikají enzymově katalyzovanou cyklizací z acyklických ψ-karotenů, kdy se tvoří β- nebo α- jononové struktury. Struktura s β-jononovým cyklem se nazývá β-karoten, struktura s α-jononovým cyklem je ε-karoten. Příkladem uhlovodíků s β-jononovým cyklem pouze na jednom konci molekuly je γ-karoten neboli β,ψ-karoten. Cyklizací na obou koncích molekuly vznikají struktury přítomné například v β-karotenu nebo α-karotenu. Sloučenina βkaroten se nazývá přesněji β,β-karoten, α-karoten je potom β,ε-karoten. 17
18' H 3C
16
H 3C
CH3 1
CH3
CH3
9
13
β−karoten
3 5
3'
CH3
13'
9'
CH3
CH3
1' H 3C 16 '
CH3 17'
18
H 3C
CH3
CH3
H 3C
CH3
α−karoten
CH3
CH3
H 3C
CH3
CH3
Karoteny s β-jononovým cyklem, jako je β-karoten, α-karoten aj. karotenoidy, jsou prekurzory retinolu. Řadí se proto mezi retinoidy. 2.2.2.2.
Xantofyly
Xantofyly primárně vznikají jako produkty biochemické oxidace (hydroxylace) karotenů. Nejběžnějšími látkami jsou monohydroxysubstituované deriváty alicyklických karotenů nazývané kryptoxantiny. Většina rostlinných pletiv obsahuje malá množství α-kryptoxantinu (nazývá se také zeinoxantin, odvozen je od α-karotenu) a β-kryptoxantinu (odvozen je od βkarotenu), které jsou prekurzory xantofylů obsahujících dvě hydroxylové skupiny v molekule. Xantofyl β-kryptoxantin se řadí mezi retinoidy. H 3C
HO
CH3
CH3
CH3
H 3C
CH3
α-kryptoxantin
15
CH3
CH3
H 3C
CH3
Příkladem dihydroxysubstituovaných pigmentů je zeaxantin (jeho prekurzorem je βkaroten, resp. β-kryptoxantin) a lutein (prekurzorem je α-karoten, resp. α-kryptoxantin). H 3C
CH3
CH3
lutein
CH3
HO
H 3C
CH3
CH3
OH
H 3C
CH3
CH3
Oxidací těchto sloučenin vznikají následně 5,6-epoxidy, jakými jsou například antheraxantin odvozený od β-karotenu a taraxantin neboli luteinepoxid odvozený od α-karotenu. Oxidací na obou koncích molekuly vznikají 5,6,5΄,6΄-diepoxidy, jako je violaxantin. CH3 H 3C
CH3
CH3
O HO
CH3
OH
O
violaxantin
CH3
CH3
H 3C
CH3
CH3
Isomerací 5,6-epoxidů vznikají příslušné 5,8-epoxidy. Jejich příkladem je mutatochrom (odvozený od β-kryptoxantinu), mutatoxantin (odvozený od zeaxantinu) a flavoxantin (odvozený od luteinu). Přesmykem
5,6-epoxidů
vzniká
další
skupina
xantofylů,
které
se
nazývají
cyklopentylketony nebo také κ-karoteny. Nejvýznamnějšími κ-karoteny jsou kapsanthin a kapsorubin. Poměrně malou, avšak velmi významnou skupinou xantofylů jsou sloučeniny obsahující v molekule méně než 40 atomů uhlíku. Někdy se nazývají degradované karotenoidy. Mezi tyto látky se řadí tzv. apokarotenoidy, jako je dosti rozšířený β-citraurin. K degradovaným karotenoidům se dále řadí krocetin ze šafránu (20 atomů uhlíku) a bixin ze semen annatto (22 atomů uhlíku). Kvalitativní a kvantitativní složení karotenoidů závisí na mnoha faktorech, jako je druh a odrůda rostliny, sezóna, stupeň zralosti, způsob zpracování apod. V některých druzích ovoce a také v bramborách se karotenoidy vyskytují v jednotkách mg.kg−1, ve většině druhů ovoce a zeleniny jsou přítomny v desítkách mg.kg−1, v mrkvi, rajčatech a paprikách se nacházejí stovky mg.kg−1 karotenoidů (Velíšek, 2002).
16
K hlavním karotenoidům vyskytujícím se v rostlinných pletivech patří β-karoten, αkaroten, lutein, violaxantin a neoxantin. Kryptoxantin a zeaxantin jsou minoritní složky tzv. xantofylové frakce (Douša, 2009).
2.2.3.
Biosyntéza karotenoidů
Karotenoidy patří do množiny přírodních látek nazývaných isoprenoidy. Všechny tyto isoprenoidní látky, rostlinné i živočišné, mají společný původ v acetylkoenzymuA, jehož molekuly
mohou
vzájemně
kondenzovat
za
tvorby
acetoacetykoenzymuA.
AcetoacetylkoenzymA po kondenzaci s další molekulou acetylkoenzymuA a redukci účinkem NADPH+H+ přechází na kyselinu mevalonovou za uvolnění koenzymuA. Dekarboxylací, odštěpením vody a za spotřeby ATP se z kyseliny mevalonové tvoří isopentenylpyrofosfát (IPP). V rovnováze s IPP je jeho tautomer dimetylallylpyrofosfát (DAMPP), který je východiskem syntézy jednotlivých isoprenoidů. O 3 H3 C
HOOC
CH 2 C
C SCoA
CH3
acetylkoenzymA
O
OH
O
O P
CH 2
O
CH 2 OH
kyselina mevalonová
HO
P OH
OH
isopentenylpyrofosfát
Z isopentenylpyrofosfátu a jeho tautomerní formy dimetylallylpyrofosfátu, je potom tvořen adičními
reakcemi
postupně
geranylpyrofosfát
(GPP),
farnezylpyrofosfát
(FPP)
a
geranylgeranylpyrofosfát (GGPP) (Procházka et al., 1998). Vznik fytoenu z prefytoendifosfátu katalyzovaný fytoensyntasou (PSY), je první krok vedoucí specificky ke vzniku karotenoidů.
17
O
O
O
O
O
O P
P
P OH
O HO
HO
OH
IPP
P OH
O
OH
DAMPP O
O
O P
P
GPP
OH
O
HO
OH
+ 2 IPP přes FPP O
O O P
O O O
OH
OH
GGPP
O
O P
HO
P
P
HO OH
OH
prefytoendifosfát
PSY fytoen
Další stupeň biosyntézy karotenoidů, vznik lykopenu, spočívá v desaturaci lineárního řetězce a ve vytvoření systému konjugovaných dvojných vazeb, který je pro absorpci světla nezbytný. Proběhnou celkem 4 dehydrogenační reakce. Komplex desaturačních enzymů, fytoendesaturasa (PDS), je komplex oxidoreduktas, vázaný v membráně vnitřní obálky chloroplastu. Desaturace vyžaduje molekulární kyslík. V těchto fázích proběhne také isomerizace cis-zeta-karotenu (neurosporenu) na jeho trans formu. V další fázi biosyntézy karotenoidů dochází k cyklizaci konců alifatického řetězce a vzniká β-karoten. Tento krok je katalyzován cyklasami (LCY - lykopen cyklasy) a je s komplexem PDS v membráně těsně spojen. Základní syntéza karotenoidů probíhá ve vnitřní membráně chloroplastové obálky, většina karotenoidů je však lokalizována v thylakoidech (Pavlová, 1996).
18
fytoen
PDS (-8H) lykopen
LCY β − karoten
Syntéza karotenoidů není závislá na světle a probíhá i v naprosté tmě. Světlo však tvorbu těchto látek silně stimuluje, a to téměř okamžitě. Nepředpokládá se tedy působení světla na úrovni transkripce genů pro polypeptidy, které jsou prekurzory příslušných enzymů. Světlo patrně přímo přes fotosenzory ovlivňuje aktivitu některých enzymů biosyntézy karotenoidů. Světlo také bezprostředně působí na isomerizaci cis-zeta-karotenu (fotoreceptorem je sama molekula karotenu). Nepřímo je syntéza karotenoidů stimulována světlem přes tvorbu vazebných proteinů v PS I a II, což vede ke snížení hladiny volných karotenoidů v místě jejich syntézy a ke zvýšení jejich tvorby (Pavlová, 1996).
2.2.4.
Výskyt karotenoidů
Karotenoidy se vyskytují ve všech fotosyntetizujících rostlinných pletivech, kde jsou přítomny jako aktivní složky plastidů - chromoplastů a chloroplastů (Velíšek, 2002). Chromoplasty různých tvarů syntetizují a obsahují karotenoidy. Mohou se vytvořit z dříve existujících zelených chloroplastů odbouráním chlorofylu a jejich nahrazením karotenoidy nebo se mohou diferencovat z proplastidů (malá bezbarvá tělíska, ze kterých se diferencují nové plastidy). K tomuto procesu dochází při dozrávání plodů. Chromoplasty představují vlastně konečné stadium ontogeneze plastidů. Karotenoidy jsou dále spolu s chlorofyly lokalizovány v chloroplastech, a to výhradně v membránách. Na vnitřní straně thylakoidních membrán se nacházejí všechny chlorofyly a převážná část karotenoidů. Další část karotenoidů je obsažena v obalových membránách plastidů, kde způsobuje jejich žluté zabarvení. V obalových membránách je hlavním karotenoidem violaxantin, zatímco v thylakoidních membránách převládá β-karoten (Procházka et al., 1998).
19
Karotenoidy, jako součást fotosyntetických barviv, nejsou uloženy v thylakoidních membránách volně. Jsou vázány (většinou nekovalentními vazbami) s bílkovinami v pigmentproteinové komplexy. Pouze ve vazbě s bílkovinou také mohou vykonávat základní funkce ve fotosyntéze. Bílkovina především fixuje molekuly barviva ve vzájemné poloze příhodné pro jejich funkci. Přitom molekuly barviva mohou být lokálně v tak vysoké koncentraci, v níž by bez organizujícího účinku bílkoviny měly zcela nevhodné vlastnosti. Bílkovina dále udržuje správnou orientaci molekul barviva k rovině fotosyntetické membrány (Masinovskij a Věchet, 1986). Sekundárně se také karotenoidy vyskytují v potravinách živočišného původu. Živočichové nejsou schopni sami karotenoidy syntetizovat, pouze je přijímají potravou a přeměňují na látky odlišné struktury. Vyskytují se například v depotním tuku savců, vaječném žloutku, lososovitých rybách a také u mnoha korýšů (krevet, krabů, raků aj.) (Velíšek, 2002).
2.2.5.
Funkce karotenoidů
2.2.5.1.
Účast při fotosyntéze
Fotosyntéza - je biochemický proces, při kterém se mění přijatá energie světelného záření na energii chemických vazeb. Organismy, které zajišťují svoji potřebu energie pomocí fotosyntézy, se nazývají autotrofní (Gloser, 1998). Fotosyntéza je z hlediska existence současného života pokládána za jeden z nejdůležitějších biochemických procesů. Organické látky vytvářené při fotosyntéze jsou spotřebovávány pro výživu heterotrofních organismů, mezi které patří i člověk. Fotosyntetický proces je nejvýznamnějším procesem přeměny energie na Zemi. Fotoautotrofní organismy ročně zachytí asi 1071 kJ energie a její pomocí vyrobí asi 14.1011 t organické hmoty, uvolní 15.1011 t O2 a fixují 20.1011 t CO2 ze vzduchu a oceánů. Ze všech zdrojů energie, které člověk využívá, je až 95 % spojeno s procesem fotosyntézy, pouze 5 % připadá na energii vodních toků, větru, atomovou energii a jiné zdroje (Vodrážka, 1993). Mezi fotosyntetizující organismy patří některé typy baktérií, sinice (Cyanobacteria), ruduchy
(Rhodophyta),
obrněnky
(Dinophyta),
skrytěnky
(Cryptophyta),
hnědé
řasy
(Chromophyta), krásnoočka (Euglenophyta), zelené řasy (Chlorophyta), mechy (Bryophyta) a vyšší rostliny.
20
Fotosyntetické pigmenty - Zachycením světla rostlinným pigmentem začíná vlastní proces fotosyntézy, který spotřebuje energii světelného kvanta a přemění ji na energii chemické vazby. Vlnové délky viditelného světla mají hodnoty v intervalu 400-800 nm. Fotosyntéza zelených rostlin využívá světlo v rozsahu pouze 380-720 nm (tzv. fotosynteticky aktivní radiace - FAR) (Gloser, 1998). K fotosyntetickým pigmentům patří chlorofyly, fykobiliny a karotenoidy (Procházka et al., 1998). Činnost pigmentů může být rozdělena do tří postupně za sebou následujících dějů: •
zachycení části dopadajícího světelného záření (tento úkon provádějí všechny pigmenty)
•
převedení zachycené světelné energie z míst zachycení do reakčních center fotosystémů (rovněž se účastní všechny pigmenty)
•
přeměna světelné energie dopravené do reakčních center na chemickou energii primárních fotochemických produktů (tuto schopnost má pouze část přítomných molekul chlorofylu a, tzv. reakční centra fotosystémů I a II), neboli terminální pigmenty FSI a FSII (P700 a P680).
Všechny výše uvedené procesy probíhají výhradně na thylakoidních membránách, které tak mají pro fotosyntetickou přeměnu energie zásadní význam. Tyto membrány jsou jako všechny ostatní biologické membrány vybudovány převážně z bílkovin a lipidů. Kromě těchto dvou základních stavebních komponent obsahují membrány thylakoidů navíc ještě malá množství polysacharidů a všechny v thylakoidech přítomné pigmenty (chlorofyly, karoteny, xantofyly, fykobiliny). Struktura thylakoidních membrán je dvouvrstevná a molekuly pigmentů jsou pravidelně uspořádány do opakujících se strukturních jednotek, tzv. fotosystémů (FS). Všechny rostliny obsahují fotosystémy dva, přičemž FSI je umístěn na vnější straně zdvojené membrány, zatímco FSII tvoří vnitřní stranu zdvojené membrány (Fojtík et al., 1987). Oba fotosystémy se skládají ze tří hlavních podskupin, a to, periferní (distální) antény LHCI, LHCII (světlosběrný komplex, z anglického Light-harvesting complex), vnitřní antény a jádra fotosystému I a II. Vnitřní anténa pigmentového komplexu je přilehlá k jádru fotosystému a pravděpodobně působí jako most v převodech excitační energie z periferní antény k jádru fotosystému (Gilmore, 1999).
21
Tyto světlosběrné komplexy jsou složeny z několika odlišných pigment-proteinových komplexů, v nichž bílkoviny zajišťují prostorovou orientaci asociovaných molekul chlorofylu a karotenoidů. Přesná prostorová orientace jednotlivých pigment-proteinových komplexů jak v samotném světlosběrném systému, tak i v jádru je nezbytná pro účinný přenos energie absorbovaných kvant do reakčního centra (RC). Oba mají
fotosystémy
některé
shodné
a
některé rozdílné rysy. S každým z obou reakčních center je asociován soubor molekul
chlorofylů
a
karotenoidů, které fungují jako
anténní
absorbující
systém
světlo
a
převádějící excitron do RC Obrázek 2. Relativní rozložení pigmentů ve FS II (Gilmore, 1999). (Procházka et al., 1998). Oba fotosystémy se od sebe liší pigmentovým složením a účinností v jiné oblasti záření. FSI se skládá převážně z dlouhovlnných forem pigmentů, jehož výsadou je adsorpce v dlouhovlnné oblasti červeného záření, v FSII převažují krátkovlnné formy chlorofylu a a doplňkové pigmenty (chlorofyl b a karotenoidy), viz, obrázek 2. Karotenoidy jsou tudíž doplňková fotosyntetická barviva, absorbující v modré nebo fialové části spektra (tj. 400 až 500 nm). Jejich absorpční spektrum je obvykle širší pás se třemi maximy. Čím více konjugovaných dvojných vazeb, tím jsou absorpční maxima posunuta k delším vlnovým délkám (viz, tabulka 2) (Šesták, 1985).
22
Tabulka 2. Absorpční maxima běžně se vyskytujících karotenoidů.
Karotenoid Fytofluen ζ-Karoten Lykopen β-Zeakaroten α-Karoten β-Karoten Zeaxantin Antheraxantin Mutatoxantin Violaxantin Violeoxantin Kapsanthin
Konjugované dvojné vazby v řetězci v kruhu Abs. max. (nm) 5 348 7 400 11 472 8 1 428 9 1 444 9 1 451 9 2 451 9 1 444 8 1 427 9 440 9 436 9 (+1) 1 476
Pozn. Spektra karotenů byla proměřena v petroletheru, xantofyly v ethanolu.
Karotenoidy se jako funkční součást FSI a FSII podílejí na zachycování energie, která je využívána k tvorbě fotosyntetických faktorů (NADPH, ATP). Neoxantin a lutein udržují strukturální integritu a pevnost vnější a vnitřní světlosběrné antény a působí jako akcesorické světlosběrné pigmenty, převádějící absorbovanou sluneční energii k chlorofylu reakčního centra. Složkou jádra obou fotosystémů je β-karoten, působí jako fotoprotektivní antioxidant. Jeho účinek spočívá v deaktivaci potenciálně škodlivých triplet-excitovaných stavů chlorofylu, a v zneškodnění nebezpečného singletu kyslíku v jádru FS. Antheraxantin, violaxantin a zeaxantin, jsou pigmenty xantofylového cyklu, jejich hlavní role spočívá v rozptýlení nadbytku pohlcené světelné energie, viz, dále. Jsou lokalizovány ve vnitřní anténě FS (Gilmore, 1999). 2.2.5.2.
Ochranná funkce
Při nadměrném ozáření chrání karotenoidy fotosyntetický aparát. Nadbytečná energie absorbovaná chlorofylem ve světlosběrném komplexu může vést k excitovaným stavům molekulárního O2. Ten vzniká při nedostatku akceptorů elektronů, takže nakonec může excitovaný elektron vytvořit triplet chlorofylu reakčního centra, který reakcí s kyslíkem vytvoří vysoce toxický první excitovaný stav - singlet kyslíku 1O2. Singletový kyslík je velice reaktivní, ve chvilce, po kterou existuje, se slučuje například s nenasycenými mastnými kyselinami za vzniku nežádoucích lipidových peroxidů (Pavlová, 1996). Endogenním
senzibilátorem
fotodynamického
poškození,
jehož
základem
je
pravděpodobně destrukce chloroplastového proteosyntetického aparátu, může být samotný chlorofyl, který v excitovaném stavu způsobuje redoxní reakce, za vytvoření volných radikálů,
23
nebo již zmiňovaných singletů kyslíku, které mohou destruovat chlorofyl nebo narušit thylakoidní membránu. Protekční účinek karotenoidů spočívá ve zhášení buď tripletových molekul chlorofylu, a nebo bezprostředně singletového kyslíku. Fotoprotekce souvisí s délkou chromoforu obsaženého v molekule karotenoidu, musí obsahovat minimálně 9 konjugovaných dvojných vazeb (Masinovskij a Věchet, 1986).
2.2.5.2.1.
Xantofylový cyklus
Za jeden z ochranných mechanizmů proti nadměrné ozářenosti je považován také xantofylový cyklus, zahrnující vzájemné přeměny violaxantinu, antheraxantinu a zeaxantinu.Ve tmě nebo při nízkých intenzitách ozáření zůstávají karotenoidy xantofylového cyklu v epoxidové formě jako violaxantin v membráně thylakoidů. Při neúměrně vysokých ozářenostech je karotenoid violaxantin deepoxidován na antheraxantin a pak na zeaxantin právě v rámci xantofylového cyklu. Přitom rozsah této přeměny závisí na tom, do jaké míry je energie záření absorbovaná chlorofyly nadměrná. Touto změnou v konformační struktuře xantofylů dochází ke zvýšení disipace přebytku světelné energie. Zeaxantin může nejen deaktivovat singletový a tripletový stav chlorofylů, ale také ničit kyslíkové radikály. Tento komplex procesů probíhá v membránách thylakoidů, a to především ve světlosběrných komplexech FSI i FSII. Oba protisměrné procesy však probíhají v odlišných částech thylakoidu. Deepoxidasa při neutrálním pH (ve tmě) je mobilní v lumenu thylakoidu. Při nízkých hodnotách pH se však připojuje k membráně thylakoidu, kde získává přístup ke svému substrátu - violaxantinu. Disipace energie, tj. vnitřní přeměna elektronicky vybuzené energie na kinetickou energii pohybu molekul - teplo, vyvolaná aktivitou xantofylového cyklu, působí jako ochranný mechanizmus při nadbytku absorbované zářivé energie. Současně však snižuje účinnost fotosyntetické zářivé energie, jejíž určitý podíl takto není doveden až do reakčních center (Procházka et al., 1998). 2.2.5.3.
Antioxidační funkce
Antioxidanty lze nazvat všechny látky, které chrání cílovou molekulu před oxidačním poškozením způsobeným volnými radikály. Tato ochrana spočívá buď v zabránění jejich tvorby, a nebo v jejich likvidaci a minimalizaci další produkce.
24
Volné radikály jsou jakékoli atomy nebo molekuly, schopné samostatné existence, obsahující jeden nebo více nepárových elektronů ve svých orbitalech. K nejdůležitějším volným radikálům patří kyslíkové radikály (např. superoxidy, hydroxylové, peroxylové, alkoxylové radikály atd.). Díky volnému nepárovému elektronu, přitahují elektrony jiných molekul a vytvářejí tak nové volné radikály a v některých případech spouštějí řetězovou reakci. Volné radikály jsou zahrnuty do aerobního metabolismu živých organismů a jsou vytvářeny ve fyziologických i patologických procesech. Mohou být vytvářeny s cílem chránit biologické funkce jako například mikrobicidní látky ve fagocytujících buňkách. Ať vzniknou volné radikály jakkoliv a jejich produkce a odstranění není kontrolována, potom jejich chemická reaktivita může způsobit poškození všech buněčných makromolekul (Harper, 2000). Obzvláště náchylné k oxidaci jsou buněčné membrány, DNA, tkáně a enzymy. Tyto procesy jsou spojovány s celou škálou neblahých dopadů počínaje stárnutím organismu a srdečními a nádorovými onemocněními konče. Karotenoidy kromě zhášení částic tvořených při fotochemických reakcích (tripletový molekuly chlorofylu, singletový kyslík 1O2), mohou působit jako antioxidanty a tím chránit buňky a organismy před oxidačním zničením. Tato ochrana spočívá ve schopnosti karotenoidů zhášet volné radikály (především alkylperoxylové radikály v lipidech) (Gross, 1991). Karotenoidní molekuly mohou reagovat s volnými radikály dvojím způsobem, ovlivněným povahou volného radikálu. V prvním případě (např. reakce s NO2•) získá volný radikál elektron od karotenoidní molekuly, což vede ke vzniku radikálového kationtu [Car]•+. Druhým případem je reakce molekuly karotenoidu s volným radikálem za vzniku radikálové adiční sloučeniny [Car-RX]•. Příkladem může být reakce s thiylovým radikálem. Tyto radikálové kationty a radikálové adiční sloučeniny pomalu podstupují molekulární rozklad na neradikálové produkty (Mortensen et al., 1997). Schopnost karotenoidů zhášet volné radikály je ovlivněna přítomností polárních funkčních skupin (karbonylových a hydroxylových) na terminálních jononových kruzích stejně jako počtem konjugovaných dvojných vazeb (Miller et al., 1996). Většina autorů se shoduje na tom, že nejvíce efektivním antioxidantem je lykopen s jedenácti konjugovanými dvojnými vazbami (Miller et al., 1996; Di Mascio et al., 1989; Tinkler et al., 1994; Woodwall et al., 1997 aj.).
25
V účinnosti ostatních karotenoidů jsou už názory zmiňovaných autorů odlišné. Podle Millera et al. (1996) jsou karoteny s jedenácti konjugovanými dvojnými vazbami aktivnější zhášeči než xantofyly. Sekvenci aktivity určili: lykopen > β-kryptoxantin ≈ β-karoten > lutein ≈ zeaxantin > α-karoten > astaxantin ≈ canthaxantin. Nízkou účinnost astaxantinu a canthaxantinu vysvětlují přítomností karbonylových funkčních skupin na terminálních kruzích, které mají podle jejich názoru značný potlačující efekt na zhášení volných radikálů navzdory delšímu chromoforu s třinácti konjugovanými dvojnými vazbami. Podobný názor zastávají i Woodwall et al. (1997), kteří určili pořadí aktivity lykopen > zeaxantin > β-karoten > lutein > astaxantin > canthaxantin. Naproti tomu Di Mascio et al. (1989) a Tinkler et al. (1994) považují diketokarotenoidy astaxantin a canthaxantin za velmi efektivní zhášeče volných radikálů. Toto zvýšení aktivity připisují rozšířenému systému konjugovaných dvojných vazeb. 2.2.5.4.
Karotenoidy jako prekurzory vitaminu A
Jedna z nejdůležitějších funkcí karotenoidů je působení jako prekurzorů vitaminu A u živočišných organismů. Téměř všechny živočišné druhy jsou schopny enzymaticky přeměnit rostlinné karotenoidy ve speciální struktury vitaminu A. Z celkového množství karotenoidů vykazuje pouze 10 % aktivitu vitaminu A. Nazývají se retinoidy (Gross, 1991). Pro provitaminovou aktivitu karotenoidních prekurzorů je bezpodmínečně nutný alespoň jeden nesubstituovaný β-jononový kruh na jednom konci molekuly. Zbylý konec molekuly může být cyklický i necyklický, postranní řetězec může být delší, ale ne kratší než 11 atomů uhlíku. Cis-isomery jsou méně aktivní než all-trans-isomery. Nejdůležitějším provitaminem A je β-karoten, který je charakterizován cyklizací βjononového kruhu na obou koncích uhlíkatého řetězce. Teoreticky tedy z jedné molekuly βkarotenu mohou štěpením vzniknout dvě molekuly vitaminu A. Dalšími činnými provitaminy A jsou z karotenoidů α-karoten a γ-karoten. α-Karoten je tvořen na jednom konci β-jononovým a na druhém α-jononovým kruhem. γ-Karoten má na jednom konci otevřený řetězec a na druhém β-jononový kruh. Mají tudíž poloviční aktivitu β-karotenu. U kryptoxantinu dochází hydroxylací β-jononového kruhu ke ztrátě 50 % biologické aktivity β-karotenu. Hydroxylací obou βjononových kruhů dochází k úplné ztrátě biologické aktivity u luteinu (Bauernfeind, 1981). Vitamin A je isoprenoid tvořený trimethylcyklohexenylovým kruhem a methylovaným řetězcem obsahujícím čtyři konjugované dvojné vazby. Může se vyskytovat v různých isomerních formách, vyznačujících se rozdílnou biologickou aktivitou (Higdon, 2003).
26
Vitamin A se v těle vyskytuje ve třech různých oxidačních stupních. Retinol, volná alkoholová forma vitaminu A, může být pomocí enzymu retinol-dehydrogenasy reversibilně přeměněna na opticky aktivní aldehydickou formu, retinal. Ten může být dále za účasti retinaloxidasy ireversibilně oxidován na kyselinu retinovou, která v organismu působí jako účinný transkripční faktor (Palace et al., 1999). H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH2 OH
CH3 COOH
Retinol
Retinová kyselina
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CHO
Retinal CH3
Konverze provitaminů A na vitamin A se uskutečňuje ve sliznici tenkého střeva. Přijatý provitamin je ve střevech oxidačně rozštěpen za vzniku jedné nebo dvou molekul retinalu. Ten je za pomoci enzymu retinaldehyd-reduktasy redukován na retinol. V další fázi je retinol esterifikován dlouhým řetězcem mastné kyseliny (nejčastěji kyselinou palmitovou) a přes chylomikrony dopraven do krve, odkud je dále transportován do různých tkání, dle aktuální potřeby. Neupotřebený vitamin A je ve formě lipidesteru uskladněn v játrech (Higdon, 2003). Díky nerozpustnosti retinolu ve vodě zajišťují jeho transport v krvi k cílovým buňkám speciální bílkoviny zvané retinol-vazební protein a tyroxin-vazební prealbumin (Hlúbik a Opltová, 2004). Všechny fyziologicky aktivní formy vitaminu A jsou ve vysokých koncentracích toxické, proto musí být uskladněny. Primární skladovací formu tvoří estery retinolu s dlouhými řetězci vyšších mastných kyselin vytvořené v jaterních buňkách. Ve formě retinyl palmitátu, oleátu, myrsitátu, stearátu a linoleátu je retinol uskladněn v játrech, ledvinách, střevech a plicích ve specializovaných zásobních buňkách, zvaných hvězdicovité buňky. Když hladina retinolu v krevní plazmě poklesne, dojde pomocí hydrolytických enzymů k uvolnění nového retinolu z jeho zásobních retinyl esterových forem. Nedostatek tohoto vitaminu se tedy projeví až při dlouhotrvajícím deficitu v jeho příjmu (Nagy et al., 1997).
27
Vitamin A zasahuje v živočišných organismech do látkové přeměny na několika různých místech. Uplatňuje se především v biochemii zrakového vjemu, kde je nepostradatelný pro správnou funkci zraku. V tomto procesu isomeruje all-trans-retinol na 11-cis-retinol a ten je enzymově oxidován na příslušný aldehyd, 11-cis-retinal. Tato sloučenina asociuje s bílkovinami známými pod názvem opsiny (skotopsin). Vzniklé komplexy (rhodopsin) jsou vizuálními pigmenty (fotoreceptory). Světlo je destabilizuje, dochází ke změnám konformace bílkoviny, k isomeraci aldehydu a vzniká opět all-trans-retinal (=Waldův cyklus) (Velíšek, 2002). Koncentrace retinalu je vysoká pouze v oční sítnici (retině), ve všech ostatních tkáních se nachází jen v malém množství, což je dáno kinetikou enzymových reakcí, které podporují jeho zpětnou přeměnu na retinol, případně retinovou kyselinu (Blumhoff et al., 1990). Vitamin A dále působí na diferenciaci a růst epitelových buněk (sliznice, kožní a krvetvorné buňky). Je nezbytný i pro udržení stability biologických membrán, pro diferenciaci a zrání pohlavních buněk a pro vývoj plodu, zasahuje rovněž do syntézy bílkovin, nukleových kyselin a lipoproteinů (Hlúbik a Opltová, 2004). Vitamin A patří do skupiny antioxidačních vitaminů. Podle Tesoriera at al. (1993) je retinol velmi efektivní antioxidant, který se podílí na inhibici peroxidace lipidů. Slučuje se s peroxylovými radikály předtím než mohou tyto radikály vyvolat peroxidaci lipidové fáze buněčných stěn doprovázené vznikem velmi reaktivních hydroperoxidů. Tito autoři ve svých pokusech zjistili, že v určitých případech je retinol efektivnější zhášeč peroxylových radikálů než tokoferol. To platí v případě, kdy se volné radikály vyskytují uvnitř lipidové dvojvrstvy, a když nepocházejí z vodného prostředí. Tyto schopnosti retinolu autoři připisují jeho krátkému polyenovému řetězci, umožňujícímu vysokou pohyblivost a tím i lepší příležitost reagovat s peroxylovými radikály. Naproti tomu podle Hlúbika a Opltové (2004) má vitamin A jen mírné antioxidační vlastnosti, podstata jeho působení spočívá ve zhášení singletového kyslíku (1O2). Tento metabolit vzniklý fotochemickou reakcí, enzymaticky nebo při procesu peroxidace lipidů v membránách je velmi reaktivní okysličující agens o vysoké energii. Může reagovat s biomolekulami, a tak způsobovat poškození tkání. Zhášení sigletového kyslíku je umožněno schopností vitaminu A absorbovat energii bez chemické přeměny, takže excitovaný (1O2) se vrátí do základního stavu (O2) bez poškození okolních tkání.
28
Za pomoci peroxidačních systémů stanovil autor Das (1989) antioxidační aktivitu fyziologicky aktivních forem vitaminu A v následujícím pořadí: retinol > retinal > retinyl palmitát > kyselina retinová. Nedostatek vitaminu A (avitaminosa) se projevuje poruchami vidění. Nejranějším symptomem nedostatku je počínající šeroslepost. Prodloužený nedostatek vitaminu A vede k narušení oční tkáně, v důsledku postupující keratinizaci rohovky (xeroftalmie). K dalším symptomům nedostatku vitaminu A patří zvýšená náchylnost k infekcím, zpomalení růstu, deformace reprodukčních orgánů a zvýšení rizika vzniku nádorových onemocnění. K nadbytku vitaminu A (hypervitaminosa) může dojít konzumací potravin bohatých na vitamin A nebo při dlouhodobém léčebném podávání syntetického β-karotenu. Tento nadbytek se projeví zvracením, bolestí hlavy, loupáním kůže, bolestmi v kostech atd. V nejhorších případech může dojít až ke zničení jater, krvácení a smrti (Higdon, 2003).
2.2.6.
Karotenoidy obsažené v plodech rajčat
V průběhu zrání rajčat se barva plodů mění ze zelené přes oranžovou až na sytě červenou. Toto je způsobeno syntézou karotenoidů. Obsah a složení karotenoidů v plodech rajčat závisí na mnoha faktorech, kterými jsou zejména: odrůda, půda, klimatické podmínky, teplota, zavlažování, stupeň zralosti, doba sklizně a posklizňové skladování (Leoni, 2002). 2.2.6.1.
Lykopen
Nejvýznamnějším karotenoidem rajčat je lykopen, který u červenoplodých odrůd tvoří až 90 % celkového obsahu karotenoidů (Gross, 1991). Podle různých autorů se obsah lykopenu ve zralých plodech pohybuje v rozmezí 30-200 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Nejvyšší obsah lykopenu obsahují původní druhy rajčat, ve kterých se lykopen nachází až v dvakrát vyšším množství oproti kulturním odrůdám (Dorais et al., 2001). Z chemického hlediska je lykopen nepolární, fotosenzitivní sloučenina se strukturou uhlovodíkového řetězce obsahujícího 11 konjugovaných a 2 nekonjugované dvojné vazby. Tato polyenová struktura je zodpovědná za jeho dobré antioxidační vlastnosti, ale také za jeho rychlou degradaci způsobenou oxidací a isomerací (Agarwal, 2001). Lykopen neobsahuje cyklickou βjononovou strukturu a proto nepůsobí jako provitamin A. V rajčatech se vyskytuje převážně v all-trans konfiguraci (cca 90 %), což je jeho termodynamicky nejstabilnější forma (Hlúbik a Opltová, 2004). Větší množství cis konfigurace lykopenu se nachází ve zpracovaných rajčatech
29
(např. kečupy, pasty, omáčky). Při zpracování se totiž mění all-trans forma na cis formy lykopenu, které jsou lépe vstřebatelné díky své vyšší rozpustnosti (Hart a Scott, 1995). Lykopen je významným antioxidantem, kterému je v odborné literatuře věnována značná pozornost v souvislosti s prevencí civilizačních onemocnění (Hlúbik a Opltová, 2004). Během dozrávání obsah lykopenu v plodech rajčat významně narůstá. Chloroplasty zralých zelených plodů se přemění v chromoplasty, které akumulují lykopen ve formě krystalů vázaných v membránách. U zralých plodů se lykopen podílí z 80-90 % na jejich vybarvení. Vyšší obsah lykopenu se nachází ve slupce oproti dužnině plodů (Rao et al., 1998). 2.2.6.2.
Ostatní karotenoidy
Dalším důležitým karotenoidem obsaženým v rajčatech je β-karoten, spolu s lykopenem způsobuje charakteristické zabarvení zralých plodů. Podle Ronena et al. (1999) tvoří jeho obsah zhruba 1-5 % celkového obsahu karotenoidů. Obsah β-karotenu, podobně jako ostatních karotenoidů, velmi závisí na spoustě faktorů, z nichž nejdůležitější vliv má odrůda. Nově šlechtěné žluté a oranžové odrůdy neobsahují lykopen, naproti tomu vykazují mnohem vyšší obsah tohoto karotenoidu. Plody rajčat dále obsahují bezbarvé prekurzory karotenoidů - fytoen a fytofluen. V menším množství je ještě zastoupen γ-karoten a neurosporen (Lee a Robinson, 1980). Xantofyly se v plodech rajčat vyskytují pouze v malém množství. Podle Curla (1961) tvoří xantofyly 6 % celkového obsahu karotenoidů. Z tohoto množství zaujímají 15 % monoly, 49 % dioly, 4 % monoepoxid dioly, 22 % diepoxid dioly a 11 % polyoly. Fraser et al. (1994) stanovili jako majoritní xantofyl lutein, jeho obsah naměřili 6,4 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Obsahem a složením karotenoidů rajčat se zabývali také autoři Tonucci et al. (1995), kteří stanovili jako hlavní karotenoid lykopen, dále následoval λ-karoten, fytoen, neurosporen, fytofluen, β-karoten, ζ-karoten, lykopen-5,6-diol a lutein. Naměřené hodnoty identifikovaných karotenoidů uvádí tabulka 3. Tabulka 3. Obsah a složení karotenoidů v čerstvých rajčatech (obsah uveden v µg.g-1 čerstvé hm. plodů). β-karoten
λ-karoten
ζ-karoten
lutein
lykopen
neurosporen
fytoen
fytofluen
lykopen5,6-diol
2,3±0,4
15,0±2,8
2,1±0,5
0,8±0,2
92,7±10,2
11,1±1,3
18,6±2,9
8,2±1,4
1,1±0,1
30
2.3.
Vitamin C 2.3.1.
Chemická charakteristika
Vitamin C patří do skupiny hydrofilních vitaminů. Tvoří bezbarvé až světle žluté krystalky kyselé chuti, bez zápachu, dobře rozpustné ve vodě, mírně rozpustné v ethanolu a téměř nerozpustné v etheru, petroletheru, chloroformu, olejích a tucích (Velíšek, 2002). Základní biologicky aktivní sloučeninou je askorbová kyselina. Ze čtyř možných stereoisomerů (asymetrické uhlíky C-4 a C-5) vykazuje aktivitu vitaminu C pouze L-askorbová kyselina (1,4-lakton L-threo-hex-2-enonové kyseliny) viz, obrázek 3. Její isomer D-askorbová kyselina a druhý pár enantiomerů, tj. L- a D-isoaskorbová kyselina aktivitu vitaminu C prakticky nevykazují. 6
H2C
OH
5 CH
OH
O
4
H
1 3
O
2
OH
OH
Obrázek 3. L-askorbová kyselina
Názvem vitamin C se označuje nejen L-askorbová kyselina, ale také celý reversibilní redoxní systém (obrázek 4). Ten zahrnuje produkt jednoelektronové oxidace L-askorbylradikál (L-monodehydroaskorbovou
kyselinu)
a
produkt
dvouelektronové
oxidace
L-
dehydroaskorbovou kyselinu. Askorbová kyselina a skorbylradikál se v roztocích o fyziologickém pH převážně vyskytují jako anionty (Velíšek a Hajšlová, 2009).
Obrázek 4. Reversibilní redoxní systém kyseliny L-askorbové
Přenos elektronů je reversibilní, dokud není porušena kruhová struktura kyseliny Ldehydroaskorbové. Když dojde k jejímu rozštěpení, vzniká kyselina 2,3-dioxo-L-gulonová a aktivita vitaminu C zaniká (Hlúbik a Opltová, 2004). 31
2.3.2.
Biosyntéza vitaminu C
Vitamin C (askorbovou kyselinu) syntetizují všechny zelené rostliny, které zajišťují svoji potřebu energie pomocí fotosyntézy (fotoautotrofní rostliny). U živočichů schopnost syntetizovat vitamin C chybí jen u hmyzu a bezobratlých, u většiny ryb a několika druhů ptáků a savců. Vitamin C je vitaminem pouze pro člověka a některé další savce (primáti, morčata a netopýři živící se ovocem) (Velíšek a Hajšlová, 2009). Živočišné organismy, které nemají schopnost syntetizovat vitamin C, postrádají enzym L-gulono-1,4-lakton oxidoreduktasu, která je nezbytná ve finálním kroku biosyntézy vitaminu C (Zou et al., 2006). Živočichové syntetizují vitamin C z aktivní formy D-glukosy, kterou je UDP-D-glukosa (Velíšek a Hajšlová, 2009). Vitamin C je syntetizován v játrech nebo v ledvinách. D-glukosa je zde oxidována na šestém uhlíku za vzniku D-glukuronové kyseliny, která dále podléhá redukci na prvním uhlíku za vzniku L-gulonové kyseliny. Následuje laktonizace L-gulonové kyseliny. Oxidací L-gulono-1,4-laktonu vzniká kyselina askorbová. Přítomnost nebo nepřítomnost oxidasy katalyzující poslední krok k biosyntéze askorbové kyseliny je řízena požadavkem organismu na vitamin C (Nishikimi a Yagi, 1996). Rostliny syntetizují vitamin C z aktivní formy D-mannosy. V prvním kroku je GDP-Dmannosa epimerována na GDP-L-galaktosu. GDP-L-galaktosa je za účinku fosfatačních enzymů převedena na L-galaktosu, která je dále oxidována na L-galaktono-1,4-lakton. Oxidace Lgalaktono-1,4-laktonu je finálním krokem vedoucím k syntéze askorbové kyseliny (Zou et al., 2006). V nedávné době byla v rostlinách objevena alternativní biosyntetická dráha, která zahrnuje přeměnu D-galakturonové kyseliny (stavební jednotka pektinů obsažených v buněčné stěně) na L-galaktonovou kyselinu (viz, obrázek 5). L-galaktonová kyselina je následně přeměněna na L-galaktono-1,4-lakton (Agius et al., 2003).
32
Obrázek 5. Biosyntéza L-askorbové kyseliny v rostlinném organismu. GPI - glukosa-6-fosfát isomerasa, PMI - mannosafosfát isomerasa, PMM - fosfomannomutasa, GMP- GDP-mannosa pyrofosforylasa, GME- GDPmannosa-3,5-epimerasa, GPP-galaktosa-1-fosfát fosfatasa, GaIDH - L-galaktosa dehydrogenasa, GLDH - Lgalaktono-1,4-lakton dehydrogenasa, GaIUR - D-galakturonát reduktasa, MDHAR - monodehydroaskorbát reduktasa, DHAR - dehydroaskorbát reduktasa, AO- askorbát oxidasa, APX - askorbát peroxidasa, GSH redukovaný glutathion, GSSG - oxidovaný glutathion.
2.3.3.
Fyziologie a výživa
Vzhledem k tomu, že askorbová kyselina nemůže být skladována v těle, musí být vitamin pravidelně přijímán potravou (Zou et al., 2006). Přibližně 80-90 % z obsahu vitaminu C se v potravinách vyskytuje v jeho redukované formě, kyselině askorbové (AA), zbývající část připadá na kyselinu dehydroaskorbovou (DHAA). Absorpce vitaminu C probíhá v horní části tenkého střeva. V živočišném organismu jsou obě formy vitaminu C absorbovány odlišnými transportními mechanismy. V enterocytech střevního epitelu je DHAA enzymaticky redukována a akumulovaná AA je transportována skrz membránu do krevního oběhu. Schopnost enterocytů účinně redukovat DHAA je velmi důležitá, neboť vedle DHAA přijaté potravou se v gastrointestinálním traktu vyskytuje také DHAA vzniklá oxidací AA při snaze uchovat ostatní živiny v redukovaném stavu, např. při příjmu iontů železa. Askorbová kyselina se ve střevní trávenině vyskytuje z 99,9 % v ionizovaném stavu. Askorbát je z lumenu střeva transportován do enterocytu pomocí aktivního transportu, který je závislý na množství přijatého vitaminu C. Jedná se o symport, na stejném nosiči je přenášen 33
askorbát spolu se sodným kationtem. Energie potřebná na transport askorbátu je zajišťována pomocí vnitřního koncentračního gradientu. Gradient pro sodík je vytvářen a udržován pomocí sodíkové pumpy umístěné v membránách buněk střevního epitelu (Ball, 2006). Při vysokých gastrointestinálních koncentracích vitaminu C může probíhat střevní absorpce vitaminu také pomocí prosté disfuse (Kallner et al., 1979). Askorbát opouští enterocyty pomocí usnadněné difuse přes membrány střevního epitelu. Ačkoliv jsou vnitrobuněčná vysoká koncentrace askorbátu a negativní membránový potenciál energeticky příznivé pro přechod askorbového anionu přes membránu, je potřeba bílkovinný nosič k usnadnění přechodu hydrofilního anionu skrz lipidovou dvojvrstvu. DHAA je z lumenu tenkého střeva transportována dovnitř enterocytu pomocí usnadněné difuze poháněné vysokým koncentračním gradientem, který je udržován intracelulární redukcí DHAA na AA. Z krevního oběhu je DHAA do vnitř enterocytu také přenášena pomocí usnadněné difuze. DHAA postrádá disociabilní vodíky na C-2 a C-3 uhlících, bez kterých není schopná disociace a tudíž nemůže být přenášena aktivně spolu se sodíkem (Ball, 2006). Optimální příjem vitaminu C se pohybuje v rozmezí 30 až 180 mg na den, při tomto příjmu je vitamin C absorbován až devadesáti procent. Při vyšším příjmu účinnost absorpce klesá. (Ball, 2006). Vedle množství příjmu je absorpce řízena také renální tubulární reabsorpcí, při nízkém příjmu je vitamin sorbován zpět do těla, při zvýšeném příjmu je nemetabolizovaný vitamin ledvinami z těla vyloučen (Hornig, 1975). Mezibuněčný přenos AA a DHAA je zprostředkován aktivně pomocí přenašečů, kteří se liší podle typu buněk. DHAA je při průchodu buněčnými membránami nejprve redukována na AA (Jacob, 1999). Zásoby vitaminu C jsou v lidském organismu rozloženy nerovnoměrně v jednotlivých tkáních, přičemž vysokou koncentraci vitaminu C mají především tkáně s vysokým metabolickým obratem (Hlúbik a Opltová, 2004). Vysoké hladiny vitaminu C jsou udržovány ve žlázách s vnitřní sekrecí (především v hypofýze a nadledvinkách), v játrech, mozku, leukocytech a oční tkáni, naopak nízké hladiny vitaminu C se nachází v plasmě a ve slinách (Hornig, 1975). Klinické příznaky nedostatku se projevují, když se celková tělová zásoba vitaminu C sníží pod 300 mg. Požadavek na příjem vitaminu C se zvyšuje při extrémní tělesné zátěži, trvalém psychickém stresu, abúzu drog a alkoholu, u některých nemocí a infekcí a při enviromentální 34
zátěži. U kuřáků dochází ke snížené absorpci a zvýšenému obratu vitaminu C, takže doporučený příjem pro ně byl zvýšen o 50 %. V České republice je doporučený příjem vitaminu C pro muže i ženy v produktivním věku 75 mg vitaminu C na den (Hlúbik a Opltová, 2004). Mírný nedostatek vitaminu C (hypovitaminosa) se projevuje zpomaleným růstem, narušením stavby kostí (v dětství osteomalacií), nedostatečnou odolností proti infekcím, zvýšenou únavou a lámavými vlásečnicemi. Nedostatek vitaminu po dlouhou dobu (avitaminosa) je známý pod názvem skorbut (kurděje). Vitamin C se podílí na syntéze hydroxyprolinu a hydroxylysinu, které tvoří důležitou složku kolagenu. Proto projevy nedostatku souvisí s poruchami funkce pojivové tkáně. Stěny krevních cév ztrácejí pevnost a snadno praskají, dochází k častému krvácení do podkoží a k tvorbě modřin. Dochází také ke krvácení z dásní. V dutině ústní se nejvíc projeví porucha funkce pojivové tkáně držící zub, zuby se kývají a mají tendenci vypadávat. Vzhledem k tomu, že vitamin C zlepšuje také vstřebávání železa v trávicím traktu, začne se projevovat nedostatek železa a onemocnění doprovází chudokrevnost (Štefánek, 2008). Nadměrný příjem vitaminu C pak způsobuje zvýšení hladiny kyseliny močové a šťavelové v moči, snižuje hladinu cukrů v krvi a způsobuje nadměrné vstřebávání železa. Dávka vyšší než 4 g denně může zvýšit výskyt oxalátových ledvinných kamenů. Vysoké dávky tohoto vitaminu také zvyšují vstřebávání rtuti a zatěžují játra. Dalším nežádoucím účinkem je vymývání vitaminu B12 a B9 (Kleinwächterová a Brázdová, 2001).
2.3.4.
Výskyt vitaminu C
Vitamin C se vyskytuje především v potravinách rostlinného původu. V živočišných potravinách jsou nejvýznamnějším zdrojem játra. Další potraviny (maso, vejce, mléko) mají jako zdroj vitaminu téměř zanedbatelný význam. Přirozeně se vyskytuje téměř výhradně v redukované formě - jako L-askorbová kyselina (Velíšek a Hajšlová, 2009). Množství kyseliny dehydroaskorbové v potravinách bývá téměř vždy nižší a je závislé na rychlosti oxidace askorbátu a hydrolýzy dehydroaskorbové kyseliny na 2,3-diketogulonovou kyselinu. Obsah vitaminu C v potravinách rostlinného původu je závislý na vegetačních podmínkách během růstu, stupni zralosti, způsobu posklizňového zpracování a mnoha dalších faktorech (Fennema, 1996). Obsah vitaminu C ve vybraných potravinách je uveden v tabulce 4.
35
Tabulka 4. Obsah vitaminu C v některých potravinách (Velíšek a Hajšlová, 2009).
mg.kg-1 č. h.
Potravina
v jedlém podílu
jablka hrušky rybíz červený rybíz černý jahody melouny pomeranče citrony kiwi šípky
15-150 20-40 200-500 1100-3000 400-700 130-590 300-600 300-640 700-1270 2500-10000
2.3.5.
mg.kg-1 č. h.
Potravina
v jedlém podílu
mrkev petržel kořen. petržel kadeř. cibule česnek křen brokolice rajčata papriky brambory
50-100 230 1500-2700 90-100 150-160 450-1200 1100-1130 80-380 620-3000 80-400
Funkce vitaminu C
Funkce vitaminu C souvisejí především s jeho redoxními vlastnostmi (Velíšek a Hajšlová, 2009). V rostlinném organismu má vitamin C důležitou roli antioxidantu chránícího rostliny před oxidativním poškozením způsobeným volnými radikály a reaktivními formami kyslíku, které vznikají při fotosyntéze, oxidativním metabolismu a při různých stresech vyvolaných například nadbytkem světla, vodním deficitem, podmáčením, UV-B zářením nebo ozonem (Conklin et al., 1996). Vitamin C zajišťuje správnou činnost různých enzymů tím, že udržuje prostetické kovové skupiny v redukovaném stavu. Vitamin C je také zapojen do procesu regulace růstu a dělení buněk (Davey et al., 2000). Nedávné studie také potvrdily, že jeho redukovaný stav je do velké míry zodpovědný za schopnost apoplastů přenášet signály související s environmentálními změnami a obrannými procesy v rostlinách (Pignocchi a Foyer, 2003). Štěpením
molekuly
askorbové
kyseliny
navíc
vznikají
důležité
meziprodukty
biochemických reakcí, jako jsou L-threonová, L-vinná, L-glycerová a šťavelová kyselina. Enzym askorbát 2,3-dioxygenasa štěpí molekulu askorbové kyseliny mezi uhlíky C-2 a C-3 na šťavelovou a L-threonovou kyselinu. Toto oxidativní štěpení má v metabolismu většiny rostlin velký význam, neboť tak kromě šťavelové kyseliny, uplatňující se v metabolismu vápníku, vzniká další oxidací threonové kyseliny L-vinná kyselina (Velíšek a Hajšlová, 2009).
36
U živočichů se vitamin C podílí především na hydroxylačních reakcích probíhajících v organismu (Velíšek a Hajšlová, 2009). Jako takový funguje vitamin C primárně jako kofaktor metaloenzymů vyžadujících redukovaný ion železa nebo mědi a jako ochranný antioxidant, který působí intra- i extracelulárně ve vodné fázi (Tsao, 1997). Je známo, že vitamin C je donorem elektronů osmi enzymů působících v lidském organismu. Tři z nich se podílejí na hydroxylaci kolagenu, dva na biosyntéze karnitinu a tři na biosyntéze hormonů a aminokyselin. Do enzymů účastnících se biosyntézy hormonů a aminokyselin patří dopamin-β-hydroxylasa, která je důležitá pro biosyntézu katecholaminů, norepinefrinů a epinefrinů, peptidyl-glycin monooxygenasa, důležitá pro amidaci peptidových hormonů a 4-hydroxyfenylpyruvatdioxygenasa, která je zahrnutá do metabolismu tyrosinu (Levine et al., 1996). Jako kofaktor hydroxylasových a oxygenasových metaloenzymů redukuje vitamin C aktivní kovovou složku enzymu, což má za následek obnovení metalo-enzymového komplexu. Nejznámější z těchto reakcí je postranslační hydroxylace peptidicky vázaného prolinového a lysinového residua během tvorby kolagenu. V těchto reakcích vitamin C obnovuje funkci enzymů redukcí metalové části prolyl (železo) a lysyl (měď) hydroxylas. Vitamin C se také podílí na expresi genu pro kolagen, buněčné sekreci prokolagenu, a biosyntéze dalších pojivových tkání jako je elastin, fibronektin, proteoglykan a s elastinem spojený fibrillin (Ronchetti et al., 1996). Hlavním důsledkem nedostatku vitaminu C je nemoc zvaná kurděje (skorbut), podrobněji popsaná v předešlé kapitole, která dokládá důležitou roli vitaminu C při biosyntéze pojivových tkání. Vitamin C se podílí také na biosyntéze kortikosteroidů, aldosteronu a na hydroxylaci cholesterolu při jeho konverzi na žlučové kyseliny. Podporuje také absorpci iontových forem železa, jejich transport a skladování v těle (Gosiewska et al., 1996). Díky schopnosti darovat elektrony patří vitamin C mezi důležité ve vodě rozpustné antioxidanty působící v biologických tkáních. Obě jeho formy, askorbát i askorbylový radikál, mají nízký jednoelektronový redukční potenciál. Další jeho výhoda spočívá ve stabilitě a nízké reaktivitě askorbylového radikálu, který vzniká při vychytávání kyslíkových a dusíkatých radikálů (Hlúbik a Opltová, 2004). Vitamin C okamžitě zháší reaktivní formy kyslíku a reaktivní formy dusíku (např. hydroxyly, peroxyly, superoxidy, peroxynitily), singletový kyslík a také hypochlority (Frei et al., 37
1989). Produkty jedno- nebo dvouelektronové oxidace askorbátu jsou relativně netoxické a jsou snadno a okamžitě regenerovány donory elektronů, jako jsou glutathion, flavonoidy, α-tokoferol, NADH a NADPH. Vitamin C poskytuje antioxidační ochranu proti fotolyticky vytvořeným volným radikálům v čočce, rohovce, či na sítnici oka. Dále také zvyšuje aktivitu fagocytů a chrání jejich membrány před oxidačním poškozením (Henry a Chapman, 2002). Ochraňuje lipidy a lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) před oxidací vychytáváním reaktivních forem kyslíku ve vodné fázi před tím, než by spustily peroxidaci lipidů (Frei et al., 1989). Vitamin C poskytuje antioxidační ochranu také nepřímo tím, že regeneruje biologický antioxidant glutathion zpět do jeho aktivního stavu. Působí rovněž jako kooxidant při regeneraci α-tokoferolu. Při eliminaci radikálů rozpustných v tuku vznikají tokoferoxylové radikály, které jsou za účinku vitaminu C přeměněny na askorbylové radikály. Tato jeho funkce je velmi důležitá, neboť tak zabraňuje prooxidačnímu působení α-tokoferolu (Jacob, 1995).
2.3.6.
Vitamin C v plodech rajčat
Rajčata jsou významným zdrojem vitaminu C. Podle Offorda (1998) mohou rajčata poskytovat 20 až 40 % doporučené denní dávky pro vitamin C (při denní konzumaci zhruba 100 g čerstvých rajčat). V zemích Jižní Evropy, které jsou charakteristické jejich vysokou spotřebou, může být toto procento ještě vyšší. Obsah vitaminu C je v plodech rajčat velmi variabilní a závisí na mnoha faktorech, z nichž nejdůležitější jsou odrůda, stupeň zralosti a klimatické podmínky dané lokality. Podle autorů Abushity et al. (1997) se v odrůdách pěstovaných v Maďarsku obsah vitaminu C pohyboval v rozmezí 210 až 480 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Podstatně nižší hodnoty stanovili autoři Bajaj et al. (1990), kteří po analýze 35 odrůd stanovili obsah vitaminu C v rozmezí 61 až 175 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Původní druhy rajčat Lycopersicum peruvianum obsahují podstatně vyšší hladiny vitaminu C (1200 µg.g-1 č. h.) v porovnání s kulturními odrůdami. Také pro cherry rajčata je typický zvýšený obsah vitaminu C oproti běžným odrůdám (George et al., 2004). Vitamin C je vyšší ve slupce oproti dužnině plodů. Podle George et al. (2004) se obsah vitaminu C v rajčatech pohybuje v rozmezí 84 až 324 µg.g-1 č. h. v dužnině a 90 až 560 µg.g-1 č. h. ve slupce plodů. Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím obsah vitaminu C v rajčatech je intenzita slunečního záření. Světlo iniciuje expresi příslušného genu a tím přímo ovlivňuje biosynthesu 38
tohoto vitaminu (Tamaoki et al., 2003). Také podle autorů Dumase et al. (2003) vzrůstá obsah vitaminu C v plodech se vzrůstající intenzitou záření. Proto podle autorů Lopez-Andreu et al. (1986) rajčata pěstovaná ve skleníku obsahují nižší obsah vitaminu C proti rajčatům pěstovaným ve venkovních podmínkách.
39
3.
CÍLE PRÁCE Obsah a složení antioxidantů rajčat a s tím související antioxidační aktivita mohou být
ovlivněny celou řadou faktorů jako je odrůda, stupeň zralosti, způsob pěstování a klimatické podmínky dané lokality. Cílem disertační práce bylo: •
vypracovat a optimalizovat metody stanovení sledovaných analytů pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie
•
vyhodnotit vliv odrůdy, vliv ročníku a vliv stupně zralosti na obsah antioxidantů rajčat (karotenoidy, vitamin C)
•
stanovit antioxidační aktivitu a určit závislost mezi antioxidační aktivitou a obsahem sledovaných antioxidantů
•
stanovit vliv různé úrovně minerální výživy rostlin na obsah a složení antioxidantů rajčat (karotenoidy, vitamin C)
40
4.
MATERIÁL A METODY 4.1.
Metodika pokusů 4.1.1.
Polní pokus
V letech 2007 a 2008 proběhl polní pokus zaměřený na hodnocení vlivu ročníku, odrůdy a stupně zralosti na obsah a složení antioxidantů rajčat. V plodech rajčat byl sledován obsah celkových a jednotlivých karotenoidů lykopenu, β-karotenu a luteinu, obsah vitaminu C a hodnota hydrofilní a lipofilní antioxidační aktivity. Do pokusu bylo zařazeno celkem osm odrůd. Z toho šest běžně pěstovaných v našich klimatických podmínkách, vhodných pro polní nebo kombinované pěstování. Jednalo se o odrůdy: Bonset F1, Dominato F1, Orkado F1, Start S F1, Stupické polní rané a Tornádo F1. Současně s těmito odrůdami byla pěstována jedna odrůda žlutoplodá - Albertovské žluté a jedna odrůda s drobnými kulatými plody, tzv. koktejlové rajče Bejbino F1. Předpěstování sadby bylo provedeno v prostorách skleníku ČZU v Praze. V druhé polovině května byly rostliny vysazeny na pokusné pole školního pozemku ČZU v Praze. Na plochu cca 50 m2 bylo ve sponu 0,5 m × 1 m vysazeno dvanáct rostlin od každé odrůdy. V obou letech byl pozemek před výsadbou vyhnojen pevným NPK 15-15-15 v dávce 300 kg.ha-1. K přihnojení během vegetace byl použit ledek vápenatý v dávce 2 × 200 kg.ha-1. Rostliny byly pravidelně ošetřovány proti houbovým chorobám (RIDOMIL GOLD, ACROBAT MZ, CURZATE GOLD) a dle potřeb zavlažovány. Vzhledem k pěstování tyčkových (indeterminantních) odrůd rajčat bylo nutné v průběhu vegetace rostliny vyvazovat k dřevěným oporám a odstraňovat tvořící se boční výhony. V průběhu zrání byly uskutečněny celkem čtyři odběry v různých stádiích zralosti plodů. Plody rajčat byly odebírány ve vývojových fázích I. Breaker, II. Pink, III. Light Red a IV. Red (California Tomato Commission, 2008). Zvolená stádia zralosti plodů byla převzata z americké klasifikační stupnice, jejich podrobný popis je uveden v příloze 2. Každý odběr se skládal zhruba ze šesti plodů. Pro odběr plodů žlutoplodé odrůdy Albertovské žluté byla alternativně zvolena mezinárodní stupnice BBCH publikovaná autory Fellerem et al. (1995). Plody byly z rostlin odebírány ve vývojových stupních I. 81,801, II. 85,805, III. 87,807 a IV. 89,809 (podrobnější popis uveden v příloze 2). Tyto zvolené vývojové stupně byly srovnatelné s vývojovými stupni americké stupnice. 41
4.1.2.
Skleníkový pokus
V prostorách skleníku ČZU v Praze proběhl v roce 2008 nádobový pokus zaměřený na hodnocení vlivu různé úrovně minerálního hnojení na obsah karotenoidů, vitaminu C, hodnotu lipofilní a hydrofilní antioxidační aktivity v plodech rajčat. Pro pokus byla vybrána tyčková odrůda Start S F1, která se osvědčila v roce předešlém. Poskytovala dobrý výnos zdravých a pevných plodů s vysokým obsahem karotenoidů. Rostliny byly pěstovány v umělohmotných nádobách o objemu 20 l v substrátu určeném pro pěstování zeleniny. Byly hodnoceny tři varianty různé úrovně minerální výživy rostlin. Každá varianta zahrnovala šest rostlin. Varianta H1: rostliny pěstované bez přídavku minerálních hnojiv Varianta H2: rostliny hnojené optimalizovanou dávkou hlavních živin N, P, K Varianta H3: rostliny hnojené optimalizovanou dávkou hlavních živin N, P, K; současně bylo k této variantě aplikováno hnojivo s obsahem stopových prvků Cu, Mn, Zn Hlavní živiny N, P, K byly rostlinám dodávány ve formě hnojivé závlahy. Jako zdroj těchto živin bylo použito kapalné vícesložkové hnojivo LOVOFLOR NPK 4-2,5-3 obsahující draslík v bezchloridové formě. K rostlinám bylo aplikováno během celé vegetace ve čtrnáctidenních intervalech v objemu 1l a koncentraci 15 ml.l-1 vody. Mikroelementární výživa rostlin byla zajišťována mimokořenově formou postřiků na list. Jako zdroj stopových prvků byl použit MIKROKOMPLEX Cu-Mn-Zn 1,2-2,5-3. V tomto hnojivu jsou stopové prvky vázány v organické komplexové formě zvyšující jejich agronomickou účinnost. K rostlinám bylo aplikováno třikrát v průběhu vegetace v 0,5% koncentraci (1. aplikace: čtrnáct dní po výsadbě, 2. aplikace: v průběhu vegetace, 3. aplikace: po nasazení plodů). Rostliny byly v průběhu vegetace ošetřovány proti houbovým chorobám (0,6% KUPRIKOL) a proti fyziologickým poruchám způsobeným nedostatkem vápníku a hořčíku [Ca ve formě Ca(H2PO4)2, Mg ve formě Mg(NO3)2 · 6 H2O]. Plody rajčat byly z rostlin odebírány ve vývojových fázích I. Breaker,II. Pink, Light Red a Red (California Tomato Commission, 2008).
42
4.2.
Charakteristika stanoviště
Data jsou získána z fenologické stanice založené v roce 2003 na pokusných pozemcích České zemědělské univerzity v Praze (Brant et al., 2009). Název stanoviště:
ČZU v Praze, Praha-Suchdol
Kraj:
Praha
Geografická poloha:
284 m n.m., 50° 7,691’s.š., 14° 22,341’ v.d.
Půdně-klimatické podmínky stanoviště Půdní typ:
černozem
Půdní druh:
hlinitá půda
Průměrná roční teplota vzduchu:
9,3 °C
Průměrný roční úhrn srážek:
472 mm
4.2.1.
Meteorologická charakteristika stanoviště
V tabulce 5 jsou zaznamenány meteorologické charakteristiky stanoviště ČZU v Praze naměřené v letech 2007 a 2008. V tučně vyznačených sloupcích jsou uvedena mezinárodně doporučovaná standardizovaná kriteria - odchylka teploty od normálu a relativní vyjádření srážek pomocí procenta normálu, kterému je přiřazena hodnota 100 %. Tabulka 5. Meteorologická charakteristika stanoviště ČZU Praha-Suchdol.
měsíc
2007
2008
IV V VI VII VIII IX IV V VI VII VIII IX
teplota ( ºC) 12,8 16,3 19,8 19,7 19,1 13,1 9,2 15,1 19,1 19,6 19,3 13,7
normál ( ºC) 9,1 14,2 17,6 19,3 18,7 15,0 9,1 14,2 17,6 19,3 18,7 15,0
∆t 3,7 2,1 2,2 0,4 0,4 -1,9 0,1 0,9 1,5 0,3 0,6 -1,3
43
srážky (mm) 3,4 50,3 94,1 78,8 81,6 80,2 62,0 60,7 40,6 82,8 72,7 20,2
normál (mm) 35,0 58,0 66,0 78,0 67,0 39,0 35,0 58,0 66,0 78,0 67,0 39,0
% normálu 9,7 86,7 142,6 101,0 121,8 205,6 177,1 104,7 61,5 106,2 108,5 51,8
4.3.
Charakteristika pěstovaných odrůd rajčat
Albertovské žluté Polopozdní odrůda určená pro polní pěstování. Plod je středně velký (v průměru 90 g), ploše kulovitý, u stopky velmi slabě žebernatý, v botanické zralosti sytě žlutý (OSIVA, 2009). Registrována v roce: 1995 Udržovatel: SEMPRA PRAHA a.s., ČR Bejbino F1 Velmi rané, rychle rostoucí rajče vyššího vzrůstu. Poskytuje mimořádně chutné, dostatečně pevné, kulovité plody s dobrou skladovatelností o průměrné velikosti 2,5 cm a hmotnosti 30-40 g (koktejlové, baby). Lze pěstovat ve volné půdě, fóliovnících i sklenících (SEMO, 2009). Registrována v roce: 2006 Udržovatel: SEMO s.r.o., ČR Bonset F1 Výnosný raný hybrid určený pro polní pěstování. Menší, kulaté, dobře vybarvené plody. Odrůda je odolná k pěstování při nižších teplotách (SEMO, 2009). Registrována v roce: 1974 Udržovatel: ROYAL SLUIS (SEMINIS), SVS Holland BV Dominato F1 Výnosný raný hybrid určený pro polní pěstování a zejména pro rychlení ve fóliových krytech. Plody jsou kulovité až ploše kulovité, hladké, žebra pouze v náznaku. Barva je sytě červená se slabě vyvinutým prstencem. Vyžaduje vyrovnaný vláhový režim, aby se předešlo praskání plodů (SEMO, 2009). Od roku 2008 má tato odrůda ukončenou registraci. Bývalý udržovatel SEMO s.r.o., ČR. Orkado F1 Hybridní, indeterminantní odrůda, určená pro studené rychlení a polní pěstování. Rostlina je středně vzrůstná. Plod je větší, kulovitý, hladký a odolný proti praskání. Hmotnost plodů je 130-145 g (MORAVOSEED, 2009). Registrována v roce: 1999 Udržovatel: MORAVOSEED spol. s.r.o, ČR
44
Start S F1 Raný až poloraný hybrid vhodný pro rychlení i polní pěstování. Rostlina je středně vzrůstná. Plod je středně velký, se slabým náznakem žeber, intenzivně červený. Vyrovnané kulovité plody jsou odolné proti praskání. Hmotnost plodů je 75-90 g. Nutné pěstovat z předpěstované sadby (SEMO, 2009). Registrována v roce: 1981 Udržovatel: MORAVOSEED spol. s.r.o, ČR, SEMPRA PRAHA a.s., ČR, SEVA-FLORA s.r.o., ČR Stupické polní rané Velmi raná odrůda určená pro pěstování na poli i pod fólií. Poloindeterminantní odrůda vhodná především do okrajových oblastí. Rostliny mají slabší vzrůst. Lze je také pěstovat jako keříčkové bez vyvazování. Doporučuje se vést 2 až 3 výhony s ukončením hlavního výhonu nad 4. až 6. výhonem (SEMO, 2009). Plody jsou kulaté hladké, jasně červené, často mírně žebernaté. Dosahují hmotnosti okolo 55 g. Odrůda vyniká svými chuťovými vlastnostmi (MORAVOSEED, 2009). Registrována v roce: 1955 Udržovatel: MORAVOSEED spol. s.r.o, ČR, SEVA-FLORA s.r.o., ČR Tornádo F1 Poloraný hybrid s univerzálním použitím, poskytující stabilní výnosy. Vhodný pro fóliovníky, skleníky i polní pěstování. Plody jsou kulovité až ploše kulovité, pevné, hladké bez žíhání, středně velké až větší. Vyžaduje vyrovnaný vláhový režim, aby se předešlo praskání plodů. Nutné pěstovat z předpěstované sadby (OSIVA, 2009). Registrována v roce: 1988 Udržovatel: SEMO s.r.o., ČR
4.4.
Chemická analýza 4.4.1.
Přístroje a vybavení
•
lyofilizátor LYOVAC GT2 (GmbH, Německo)
•
ruční mixér Braun MR 6550 MCA (Braun, Německo)
•
kuchyňská lednice s mrazicím boxem (Gorenje, Slovinsko)
•
váhy s přesností na 3 a 4 desetinná místa (Kern&Sohn GmbH, Německo) 45
•
ultrazvuková lázeň Ultrasonic Compact Cleaner (Notus-Powersonic, Slovensko)
•
spektrofotometr Heλios γ (Spectronic Unicam, Anglie)
•
centrifuga MPW-56 (MPW Med. instruments, Polsko)
•
rotační vakuová odparka BÜCHI Rotavapor (BÜCHI Laboraltechnik AG, Švýcarsko)
•
chromatografický systém pro HPLC, Ultimate 3000 (Dionex, USA) - vysokotlaká kvartérní pumpa Ultimate 3000 - autosampler Ultimate 3000 - DAD detektor Ultimate 3000 - termostat kolon Ultimate 3000
•
elektronické stopky TimerClock (GmbH, Německo)
•
míchačka magnetická IKA RET control-visc C (ILABO, Česká republika)
•
pH-metr SHOTT (Camlab, Anglie)
•
filtrační papír Filtrak (č. 388), Spezielpapier Filtrak (GmbH, Německo)
•
jednorázové plastové kyvety 1,5 ml, Plastibrand (GmbH, Německo)
•
membránový filtr PVDF (0,45 µm) (SISw, Česká republika)
•
běžné laboratorní sklo
4.4.2.
Chemikálie
•
aceton, p.a. min. 99,5 % (Lachner, Česká republika)
•
ethylacetát, p.a. min. 99,5 % (Lachner, Česká republika)
•
ethanol, p.a. min 99,8 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
BHT [2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylfenol], min 99 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
methanol, HPLC grade, min. 99,9 % (Lachner, Česká republika)
•
acetonitril, HPLC grade, 99,9 % (Lachner, Česká republika)
•
tetrahydrofuran, HPLC grade, min. 99,8 % (J.T. Baker, Holandsko)
•
hexan, HPLC grade, min 98 % (Merck, Německo)
46
•
kyselina metafosforečná, p.a. (Penta, Česká republika)
•
kyselina sírová, p.a. min. 96 % (Chemapol, Česká republika)
•
hydrogenfosforečnan disodný, dodekahydrát, p.a. min. 98 % (Lachner, Česká republika)
•
dihydrogenfosforečnan draselný, p.a. min 99 % (Lachema, Česká republika)
•
ABTS [2,2’-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)], min 99 % (Fluka, USA)
•
oxid manganičitý, p.a. min 90 % (Lachner, Česká republika)
4.4.3.
Standardy
•
lykopen, čistota > 90 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
β-karoten, čistota > 95 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
lutein, čistota > 90 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
kyselina L-askorbová, čistota > 99 % (Sigma-Aldrich, USA)
•
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina), čistota > 97 % (Sigma-Aldrich, USA)
4.4.4.
Příprava vzorků k analýze
Po sklizni byly plody rajčat očištěny a zamraženy. Zmrazené vzorky byly následně přibližně jeden týden lyofilizovány2 . Po lyofilizaci byly suché vzorky rozemlety, poté převedeny do vzduchotěsných sáčků a znova uskladněny v mrazícím boxu (-22 °C) až do konečné analýzy.
4.4.5.
Stanovení
celkového
obsahu
karotenoidů
metodou
molekulové absorpční UV-VIS spektrofotometrie 4.4.5.1.
Princip metody
Díky experimentální nenáročnosti, automatizaci, přesnosti a citlivosti je spektrofotometrie jednou z nejvíce využívaných instrumentálních metod. Zabývá se měřením a vyhodnocením elektronových spekter látek, které absorbují elektromagnetické záření v rozsahu vlnových délek přibližně mezi 200-800 nm (Šmejkal et al., 2007).
2
Lyofilizace (vymrazování, sublimační sušení) - je jedním z nejšetrnějších způsobů sušení. Jedná se o mrazovou sublimaci, kdy se voda odpařuje ze zmrazeného vzorku pod vakuem a namrazuje se na kondenzační spirálu.
47
V ultrafialové a viditelné oblasti spektra dochází k absorpci záření v elektronových obalech molekul. Příjem kvanta elektromagnetického záření přivede molekulu do vyššího (excitovaného) energetického stavu. Protože molekuly mohou existovat pouze v určitých energetických stavech, absorbují elektromagnetické záření pouze určitých vlnových délek. Jestliže má molekula možnost přejít ze stavu s nižší energií Eq do stavu s energií vyšší Ep, absorbuje molekula záření o frekvenci v, která právě odpovídá rozdílu energií mezi energetickými hladinami Ep a Eq obou kvantových stavů podle Planckovy podmínky: ∆E = Ep Eq = h ⋅ v = h ⋅
c
λ
,
kde c je rychlost světla, λ je vlnová délka a h je Planckova konstanta. Vzdálenost dvou energetických hladin, mezi kterými molekula přechází, přímo určuje vlnovou délku elektromagnetického záření molekulou pohlcovaného. Elektronové přechody zapříčiňují absorpci ultrafialového (190-400 nm) a viditelného záření (400-800 nm). Látky absorbující viditelné světlo se jeví jako barevné. Prochází-li záření vhodným absorpčním prostředím o tloušťce l, dochází k zeslabení toku záření z původní hodnoty Φ0 na hodnotu Φ. Mohutnost absorpce se vyjadřuje hodnotou absorbance A nebo transmitance T. Vztah mezi absorbancí A, molární koncentrací analyzované látky c a tloušťkou vrstvy l vyjadřuje Lambert-Beerův zákon: Φ A = log 0 = ε λ ⋅ l ⋅ c , Φ kde absorbance A, definovaná jako logaritmus původního a prošlého zářivého toku, je úměrná tloušťce absorpčního prostředí l a koncentraci analyzované látky c. ελ je konstantou úměrnosti, která je při dané vlnové délce a konstantní teplotě charakteristická pro absorbující látku a nazývá se absorpční koeficient. Transmitance T (propustnost) je definována jako poměr toku záření prošlého absorpčním prostředím a zářivého toku do prostředí vstupujícího: T=
Φ . Φ0
Mezi transmitancí a absorbancí platí vztah: A = − log T .
48
Lineární závislost absorbance na koncentraci platí pro monochromatické záření při nízkých koncentracích (< 10−2 mol.l-1). Závislost transmitance či absorbance na vlnové délce (vlnočtu či frekvenci) určuje absorpční spektrum látek, které je v případě molekul tvořeno absorpčními pásy. Absorpční spektrum slouží ke kvalitativní identifikaci sloučenin s neúplným obsazením elektronových orbitalů, zejména organických sloučenin s chromoforními skupinami (tj. skupinami, které jsou příčinou zbarvení molekul), jako např. C=O, N=N, N=O, konjugovanými dvojnými vazbami apod. V těchto seskupeních může docházet k četným energetickým přechodům, a proto molekuly, obsahující tato uskupení, absorbují v ultrafialové či viditelné oblasti (Řezanka, 2009). Při analýze barviv, např. karotenoidů, lze využít jejich přirozené barevnosti, z čehož plyne, že se jedná o látky absorbující elektromagnetické záření ve viditelné oblasti spektra v rozmezí vlnových délek 400-800 nm. Ve spektru každé barvy se tedy nachází jedno nebo více absorpčních maxim v závislosti na barvě. 4.4.5.2.
Příprava a měření vzorků
Lyofilizované vzorky byly naváženy do nižších křemenných kádinek. Navážka činila 0,125 g ± 0,005 lyofilizátu. K naváženému vzorku bylo přidáno cca 15 ml 100% acetonu. Poté byly kádinky se vzorky obaleny hliníkovou folií a umístěny na dva dny do lednice. Po dvoudenní extrakci byly vzorky umístěny na patnáct minut do ultrazvukové lázně k podpoře homogenizace a rozpustnosti částic. V dalším kroku následovala filtrace vzorků přes skleněnou fritu. Filtrační koláč byl promýván acetonem do bílého zabarvení (třikrát cca 5 ml acetonu). Poté byl filtrát kvantitativně převeden do 25ml odměrných baněk a doplněn acetonem po rysku. Po celou dobu zmiňovaných operací bylo důležité uchovávat vzorky v temnu, aby nedocházelo ke světelné degradaci karotenoidů. Celkový obsah karotenoidů byl stanoven ve třech opakováních pro každý vzorek. Měření vzorků bylo prováděno na UV-VIS spektrofotometru Spectronic Heλios γ. Absorbance acetonového extraktu byla měřena v 1cm kyvetách při vlnových délkách 662 nm, 645 nm a 470 nm (A662, A645, A470) proti čistému acetonu. Celkový obsah karotenoidů a chlorofylů a a b byl vypočten z rovnic (Lichtenthaler a Wellburn, 1983): 49
Rovnice určené pro 100% aceton [v µg.(ml rostlinného extraktu)-1] Ca
= 11,75 A662 - 2,35 A645
Cb
= 18,61 A645 - 3,96 A662
C(c+x)
= (1000 A470 - 2,27 Ca - 81,4 Cb) / 227
Ca
- celkový obsah chlorofylu a
Cb
- celkový obsah chlorofylu b
C(c+x) - celkový obsah karotenoidů (karoteny a xantofyly)
4.4.6.
Chromatografická separace analytů
4.4.6.1.
Princip metody
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří k nejdůležitějším analytickým metodám a představuje nejvýznamnější pokrok analytické chemie ve 20. století. Rozsah použitelnosti HPLC s ohledem na chemickou povahu dělitelných látek je mimořádný. Lze analyzovat ionty, látky polární i nepolární, málo těkavé, tepelně nestabilní i vysokomolekulární (cca 80 % veškerých známých látek je možné analyzovat touto metodou). Metody HPLC se díky možnosti nasazení prakticky všech separačních chromatografických mechanismů a rychlému získání chromatogramu rázem dostaly do čela moderních technik pro kvalitativní i kvantitativní analýzu látek (Waters, 2011). Chromatografie obecně patří mezi separační (dělící) metody, je založena na rozdílné distribuci dělených látek mezi dvě různé nemísitelné fáze, fázi nepohyblivou (stacionární) a fázi pohyblivou (mobilní). V kapalinové chromatografii (LC) je mobilní fází kapalina. Na rozdíl od plynové chromatografie (GC) rozhodují o separaci složek ve vzorku nejen jejich interakce se stacionární fází, ale velmi výrazně i použitá mobilní fáze. Čas, který analyt stráví v jedné nebo druhé fázi, závisí na jeho afinitě ke každé z nich (Kardoš a Berek, 1979). HPLC je metoda, kdy dělení probíhá za zvýšeného tlaku na sorbentech s velmi malým průměrem částic. Základem chromatografického dělení je různá míra interakce dělených látek se stacionární a mobilní fází. Látka, která za daných podmínek nemá ke stacionární fázi žádnou afinitu, je po celou dobu separace rozpuštěna v mobilní fázi a z kolony vyjde v čase tm (mrtvý retenční čas) od okamžiku nástřiku. Mrtvý retenční čas je tedy retenční čas složky, která není v koloně zadržována. Ostatní látky vycházejí z kolony s retenčními časy t > tm (Káš et al., 2006).
50
Po separaci na koloně jsou rozdělené složky vzorku dále transportovány mobilní fází k detektoru, kde je každá separovaná složka zaznamenána jako pík ve tvaru Gaussovy křivky. Z naměřeného chromatogramu se sledují dva hlavní parametry (Pfander a Riesen, 1995): •
Retenční čas - (za identických podmínek stanovení konstantní) slouží k identifikaci sloučeniny
•
Plocha a výška píku - slouží ke kvantifikaci sloučeniny
Metody založené na HPLC používají k separaci normální nebo reverzní fázi. Chromatografie na normální fázi (NPLC) má polární stacionární fázi (např. silikagel, MgO, Ca(OH)2, Al2O3) a nepolární fázi mobilní, chromatografie na reverzní fázi (RPLC) má naopak stacionární fázi nepolární (např. silikagel s chemicky vázanými oktylovými nebo oktadecylovými zbytky) a mobilní fázi polární. 4.4.6.2.
Chromatografická separace karotenoidů
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je v současné době nejrozšířenější a nejúčinnější metodou
separace
karotenoidů,
nahrazující
standardní
kolonovou
chromatografii
a
chromatografii na tenké vrstvě. K separaci karotenoidů je častěji používána reverzní fáze, jejichž retence je na reverzní fázi větší než na fázi normální. Polární xantofyly vycházejí z kolony s kratšími retenčními časy než nepolární karoteny (Gross, 1991). Karoteny jsou zadržovány na reverzní fázi vlivem hydrofobních interakcí s ligandy C8, C18, zatímco retence xantofylů je řízena volnými stéricky dostupnými silanolovými skupinami (-Si-OH). K detekci karotenoidů se používá UV detekce v oblasti 400-500 nm v závislosti na stanovovaných karotenoidech. Proto se s výhodou používá UV detektor s programovatelnou vlnovou délkou nebo detektor diodového pole. Ke kvantifikaci se využívá nejčastěji externí kalibrace, ale s úspěchem byly použity i vnitřní standardy: β-apo-8´-karotenal, retinolpalmitát, isozeaxantin nebo decapreno-β-karoten. Při použití externí kalibrace se používají komerčně dodávané standardy karotenoidů (Douša, 2009).
4.4.6.2.1.
Příprava vzorků
Pro chromatografické stanovení jednotlivých karotenoidů rajčat bylo do skleněných centrifugačních kyvet naváženo 0,350 g ± 0,005 lyofilizovaného vzorku. Vzorky byly následně extrahovány dvakrát 10 ml ethylacetátu. K podpoře přechodu karotenoidních barviv do extrakčního činidla byly kyvety se vzorky na deset minut umístěny do ultrazvukové lázně. Následovala centrifugace vzorků po dobu 10 minut rychlostí 4000 RPM (1488 ×g RCF). 51
Supernatant byl převeden do kádinek. Ze spojených supernatantů bylo pipetováno 16 ml do odparných baněk. Na vakuové odparce bylo ze vzorků odpařeno rozpouštědlo. Extrahovaný organický zbytek obsahující karotenoidy byl znovu rozpuštěn v 5 ml směsi ethanol:aceton (6:4) s přídavkem 0,2 % BHT [2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylfenol]. Vzorky byly přefiltrovány přes 0,45 µm PVDF membránový filtr do tmavých vialek a ve dvou opakováních byly analyzovány na HPLC.
4.4.6.2.2.
Příprava standardů
Pro identifikaci karotenoidů ve vzorcích byly použity standardy hlavních karotenoidů obsažených v plodech rajčat - lykopen, β-karoten a lutein. Ze zakoupených standardů byly vytvořeny zásobní roztoky. 1 mg každého standardu byl rozpuštěn v 10 ml směsi ethanol:aceton (s přídavkem 0,2 % BHT) v poměru 6:4 (v/v). Tyto zásobní roztoky byly dále ředěny na koncentrace 0-80 µg.ml-1a proměřeny na HPLC. Zásobní roztoky standardů byly uchovávány v mrazicím boxu (-22 °C) po dobu maximálně čtrnácti dnů, během kterých proběhla analýza všech vzorků. Před každou analýzou byla spektrofotometricky stanovena přesná koncentrace standardů. Přesná koncentrace standardu byla vypočítána z níže uvedeného vztahu:
C std =
Ask A1
,
kde Cstd je koncentrace příslušného standardu, Ask je skutečná absorbance extraktu standardu při předpokládáné kocentraci 1 µg.ml-1 a A1 je absorbance extraktu standardu o koncentraci 1 µg.ml-1. Pro jednotlivé standardy byly použity následující extinkční koeficienty (E1%1 cm): lutein 2550 (445 nm) v ethanolu, lykopen 3450 (472 nm) a β-karoten 2592 (453 nm) v hexanu.
4.4.6.2.3.
Chromatografické podmínky stanovení
Podmínky separace v roce 2007 Nástřikový objem vzorku činil 20 µl. Pro separaci byla použita C18 OmniSpher kolona (250 × 4,6 mm, S-5 µm, VARIAN) s C18 předkolonou (10 × 3 mm, VARIAN). Karotenoidy byly eluovány izokratickou elucí mobilní fází složenou z 56 % methanolu, 40 % acetonitrilu a 4 % tetrahydrofuranu. Analýza vzorku trvala 30 min při průtoku mobilní fáze 2 ml.min-1.
52
Podmínky separace v roce 2008 Za účelem snížení detekčních limitů (zúžením píků) a snížení spotřeby HPLC rozpouštědel byla metoda stanovení karotenoidů v roce 2008 mírně modifikována. Pro separaci karotenoidů byla shodně použita C18 OmniSpher kolona (250 × 4.6 mm, S-5 µm, VARIAN) s C18 předkolonou (10 × 3 mm, VARIAN). Nástřikový objem vzorku činil 10 µl. Karotenoidy byly eluovány gradientovou elucí mobilní fází složenou z methanolu (A), acetonitrilu (B), tetrahydrofuranu (C) a hexanu (D). Průběh gradientové eluce je znázorněn níže: čas (min) mobilní fáze (%) A B C D 0 46 54 5 46 54 30 46 30 12 12 35 46 54 Analýza vzorku trvala 35 min při průtoku mobilní fáze 0,8 ml.min-1. V obou hodnocených letech byly chromatogramy zaznamenány pomocí detektoru s diodovým polem při vlnových délkách 444 nm, 450 nm a 470 nm. Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Pro kvantifikaci byla použita metoda externí kalibrace, při které byly srovnány plochy kalibračních standardů s plochami analytů ve vzorku. Detekční limity a ukázky chromatogramů z obou hodnocených let jsou uvedeny v přílohách 3 a 4. 4.4.6.3.
Chromatografická separace vitaminu C
Pro chromatografické stanovení vitaminu C existuje celá řada metodik HPLC. Při stanovení je využíváno různých typů kolon, detektorů a extrakčních technik při přípravě vzorku. Vzhledem k malé stabilitě vitaminu C je velmi důležité zvolit správný typ extrakčního media a stabilizační roztok, aby se zabránilo jeho oxidaci. Při extrakci je vitamin C stabilizován zajištěním nízkého pH, přítomností komplexotvorných látek a redukujících látek. Těmto podmínkám vyhovuje kyselina šťavelová, která v extraktu udržuje nízké pH a má i slabé komplexotvorné vlastnosti. Přítomnost vzdušného kyslíku je možno eliminovat probubláváním extraktu dusíkem. Rozklad také katalyzují přítomné kovy. K jejich omezení se používá EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) nebo se extrakce provádí organickými rozpouštědly. Při extrakci se nedoporučuje používat vyšších teplot, neboť při nich dochází k rychlému rozkladu
53
vitaminu C. Z dalších roztoků se pro extrakci používá kyselina metafosforečná, případně její směs s kyselinou octovou (Douša, 2011). Vitamin C patří do skupiny velmi malých polárních molekul, které je obtížné zadržet v běžném chromatografickém systému s reverzní fází a oddělit jej od mrtvého objemu. Proto se u HPLC-RP používají nejčastěji mobilní fáze s velkou převahou vody a s částí anorganické nebo organické kyseliny nebo anorganického pufru (Nováková et al., 2008).
4.4.6.3.1.
Příprava vzorků
Pro stanovení vitaminu C byla zvolena mírně modifikovaná metoda autorů Hejtmánková et al. (2009). Do skleněných kyvet bylo naváženo 0,08 g lyofilizovaného vzorku rajčat. K naváženému lyofilizátu bylo přidáno 10 ml 3% kyseliny metafosforečné (HPO3). Vzorky byly řádně promíchány skleněnou tyčinkou a vloženy na 10 minut do ultrazvukové lázně. Následovala 10 min centrifugace vzorků při 4000 RPM (1488 ×g RCF). Vzniklý supernatant byl přefiltrován přes 0,45 µm PVDF membránový filtr do skleněných vialek.
4.4.6.3.2.
Chromatografické podmínky stanovení
Stanovení vitaminu C bylo provedeno ve třech opakováních metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Nástřikový objem vzorku činil 10 µl. Pro separaci byla použita ACE 5C18 kolona od firmy HICHROM. Vitamin C byl z kolony eluován 2,5 mM kyselinou sírovou při průtoku mobilní fáze 1 ml.min-1. Analýza vzorku trvala 10 min. Eluce vitaminu C byla monitorována při 250 nm. Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Pro kvantifikaci byla použita metoda externí kalibrace, při které byly srovnány plochy kalibračních standardů s plochami analytu ve vzorku. Ukázky chromatogramů jsou uvedeny v příloze 5.
4.4.7.
Stanovení antioxidační aktivity rajčat metodou ABTS
4.4.7.1.
Princip metody
Metoda používající ABTS je jednou ze základních a nejpoužívanějších metod stanovení celkové antioxidační aktivity. Její hlavní výhody spočívají v dobré opakovatelnosti, jednoduchosti a možnosti stanovení antioxidační aktivity jak čistých látek, tak i komplexních matricí (Thaipong et al., 2006). Metoda testuje schopnost vzorku zhášet kation-radikál ABTS•+ 54
[2,2’-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)]. Je také označována jako metoda TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity), vzhledem k tomu, že výsledná antioxidační aktivita vzorku je srovnávána s antioxidační aktivitou syntetické látky Troloxu (6-hydroxy2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina) (Miller et al., 1996). Zhášení radikálu ABTS•+ antioxidanty, které se chovají jako donory vodíku, se sleduje spektrofotometricky na základě změn absorpčního spektra ABTS•+ (nejčastěji se měří absorbance při 734 nm). V reakční směsi se kation-radikál ABTS•+ generuje oxidací ABTS. Generování ABTS•+ lze provést např. pomocí oxidu manganičitého (Miller et al., 1996), peroxodisíranu draselného (Re et al., 1999) nebo systémem ABTS/H2O2/peroxidasy (Arnao et al., 2001). Vlivem antioxidantů dochází k odbarvení modrozelené reakční směsi, přičemž úbytek absorbance je úměrný antioxidační aktivitě. Celková antioxidační aktivita vzorků se hodnotí parametrem TEAC, který udává antioxidační kapacitu vzorku ekvivalentní definovanému množství syntetického derivátu TROLOXU. Díky schopnosti Troloxu rozpouštět se jak v hydrofilním (Trolox ve formě soli) tak v lipofilním (Trolox ve formě kyseliny) prostředí, lze pomocí metody ABTS stanovit látky hydrofilního i lipofilního charakteru (Arnao et al., 2001; Cano et al., 2003). 4.4.7.2.
Příprava vzorků
Ve vzorcích rajčat byla stanovena antioxidační aktivita látek rozpustných jak v hydrofilním tak v lipofilním prostředí. Pro stanovení lipofilní antioxidační aktivity (fáze obsahující karotenoidy) bylo do skleněných centrifugačních kyvet naváženo 0,500 g ± 0,005 lyofilizovaného vzorku. Další postup extrakce lipofilních sloučenin byl shodný s postupem extrakce karotenoidů pro chromatografické stanovení, viz, kapitola 4.4.6.2.1. Ze vzorku bylo na vakuové odparce odpařeno veškeré rozpouštědlo (ethylacetát). Extrahovaný organický zbytek byl znovu rozpuštěn ve 2 ml 100% acetonu a použit pro stanovení antioxidační aktivity lipofilních antioxidantů. Pro stanovení hydrofilní antioxidační aktivity (fáze obsahující hydrofilní antioxidantyzejména vitamin C a polyfenolické sloučeniny) byla peleta na dně skleněné kyvety, zbylá po extrakci organického podílu, vysušena pod dusíkem a zalita 10 ml fosfátového pufru (pH=7,4). Vzorky byly vloženy na 10 min do ultrazvukové lázně a poté byly 10 min centrifugovány (4000 RPM, 1488 ×g RCF). Čirý supernatant byl převeden do kádinek a použit pro stanovení antioxidační aktivity hydrofilních antioxidantů.
55
4.4.7.3.
Příprava standardu Troloxu
Do 50ml odměrné baňky byl připraven zásobní roztok standardu Troloxu o koncentraci 1 mg.ml-1. Z tohoto roztoku bylo postupným ředěním připraveno 10 pracovních roztoků o koncentracích 0-200 µg.ml-1. K 1 ml roztoku s radikálem ABTS•+ bylo pipetováno 20 µl standardních roztoků. Absorbance byla odečtena před začátkem měření a po pěti minutách od přidání standardu. Z naměřených hodnot byla vytvořena kalibrační křivka závislosti poklesu absorbance na koncentraci Troloxu. Pro hodnocení lipofilní antioxidační aktivity byl Trolox rozpuštěn v 100% acetonu, pro hodnocení hydrofilní antioxidační aktivity byl Trolox rozpuštěn ve fosfátovém pufru (pH=7,4). 4.4.7.4.
Měření vzorků metodou ABTS
Stanovení antioxidační aktivity vzorků pomocí ABTS bylo provedeno v souladu s metodou publikovanou Millerem et al. (1996). 54,8 mg ABTS bylo rozpuštěno v 20 ml destilované vody. Pro aktivaci kation-radikálu ABTS•+ byl k roztoku přidán přibližně 1 g oxidu manganičitého. Vzniklý roztok byl míchán po dobu 20 min na magnetické míchačce. Přebytečný oxid manganičitý byl z roztoku odstraněn filtrací přes 0,45 µm PVDF membránový filtr. Roztok byl následně naředěn 5 mM fosfátovým pufrem (pH=7,4) na základní absorbanci 0,7. Absorbance byla měřena při vlnové délce 734 nm proti destilované vodě ve srovnávací kyvetě. K 1 ml roztoku radikálu bylo přidáno 20 µl vzorku. Absorbance byla odečtena před začátkem měření a po pěti minutách od přidání vzorku. Naměřený pokles absorbance byl přepočten na ekvivalenty Troloxu. Relativní antioxidační aktivita byla vyjádřena jako koncentrace Troloxu odpovídající antioxidační aktivitě 1 g stanovovaného vzorku. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ze tří paralelních stanovení.
4.4.8.
Statistické zhodnocení naměřených dat
Naměřené hodnoty všech sledovaných parametrů byly statisticky zpracovány v programu STATISTICA 9.0. Ke statistickému zhodnocení naměřených dat byla použita metoda analýzy rozptylu (ANOVA) jednoduchého a dvojného třídění na hladině významnosti α=0,05. K podrobnějšímu vyhodnocení byl zvolen Tukeyův test. Naměřené hodnoty sledovaných parametrů jsou v obrázcích vyjádřeny jako průměry ± směrodatná odchylka stanovené ze třech paralelních opakování. Průkazné diference mezi sledovanými parametry jsou v grafech znázorněny pomocí písmen. Sloupce označené stejnými písmeny se od sebe významně neliší. 56
Stanovení
závislosti
antioxidační
aktivity
na
jednotlivých
antioxidantech
vyhodnoceno pomocí regresní a korelační analýzy v programu Microsoft Office Excel 2007.
57
bylo
5.
VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1.
Obsah a složení karotenoidů v rajčatech
V polních pokusech založených v letech 2007 a 2008 byl sledován vliv genotypu, vliv stupně zralosti a vliv ročníku na obsah a složení karotenoidů rajčat. V pěstebním roce 2007 byl v plodech rajčat stanoven celkový obsah karotenoidů, a to ve všech pěstovaných odrůdách ve všech hodnocených stadiích zralosti plodů. Složení jednotlivých karotenoidů rajčat bylo sledováno ve zralých plodech rajčat (IV. odběr) všech pěstovaných odrůd. V pěstebním roce 2008 byly celkové karotenoidy stanoveny jen ve zralých plodech rajčat. Shodně s rokem předešlým bylo ve zralých plodech také stanoveno zastoupení jednotlivých karotenoidů. Oproti roku předešlému bylo složení karotenoidů sledováno také v průběhu dozrávání plodů. Vliv stadia zralosti na obsah jednotlivých karotenoidů byl sledován ve vybraných odrůdách Albertovské žluté, Bejbino a Start S. Písmena nad jednotlivými sloupci v obrázcích 12-14 označující průkazné diference se vztahují k hodnocení vlivu různých stupňů zralosti. Vliv stupně zralosti je hodnocen zvlášť pro každou odrůdu. Vliv ročníku na obsah karotenoidů rajčat byl hodnocen porovnáním celkových obsahů karotenoidů naměřených ve všech odrůdách v letech 2007 a 2008. Písmena nad jednotlivými sloupci v obrázku 8 označující průkazné diference se vztahují k hodnocení vlivu odrůdy. Vliv odrůdy je hodnocen zvlášť pro každý sledovaný rok. Vliv ročníku je hodnocen pouze slovně v textu popisujícím příslušný obrázek.
5.1.1.
Celkové karotenoidy
Výsledky statistického hodnocení potvrdily, že existuje významný rozdíl ve schopnosti odrůd syntetizovat karotenoidy. Významné rozdíly byly nalezeny jak mezi jednotlivými odrůdami, tak mezi různými stadii zralosti plodů (příloha 6, tabulka 1 a 2). Ke stejným závěrům došli i autoři Abushita et al. (2000) a Thomson et al. (2000), kteří ve svých pokusech rovněž vyhodnotili významný vliv odrůdy a stadia zralosti na obsah karotenoidů rajčat. Ve zralých plodech byla v roce 2007 stanovena průměrná hodnota 629 µg.g-1 sušiny (41 µg.g-1 čerstvé hmotnosti). V průběhu zrání celkový obsah karotenoidů významně narůstal ve všech pěstovaných odrůdách. Výjimku tvořila pouze odrůda Albertovské žluté, ve které byl zaznamenán pouze nepatrný nárůst v obsahu karotenoidů (obrázek 6). Celkově se tato žlutoplodá 58
odrůda nevytvářející lykopen v období zrání plodů prezentovala nejnižším obsahem sledovaných látek (109 µg.g-1 suš.). Nízká schopnost tvorby karotenoidů během celého vývoje plodů byla zjištěna také v odrůdách Bejbino a Tornádo.
Celkové karotenoidy (µg.g-1 sušiny)
1200
I.odběr
II. odběr
III. odběr
IV. odběr
1000 800 600 400 200 0
Obrázek 6. Celkový obsah karotenoidů v různých stadiích zralosti plodů (rok 2007). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Naproti tomu odrůda Start S vykazovala během dozrávání vyrovnaný vyšší obsah karotenoidů, obzvláště v třetím a čtvrtém odběru. Ve čtvrtém odběru byl u této odrůdy naměřen obsah karotenoidů velmi vysoký (831 µg.g-1 suš.). Vysoký obsah karotenoidů během dozrávání byl zjištěn také v odrůdách Bonset (953 µg.g-1 suš.) a Orkado (820 µg.g-1 suš.). Tento rapidní nárůst se však projevil až v konečných stadiích vývoje plodů. V porovnání s odrůdami Bonset a Orkado byl v odrůdách Dominato a Stupické polní rané pozorován opačný trend ve změnách v obsahu karotenoidů během vývoje plodů. V těchto odrůdách byl pozorován velmi rychlý nárůst karotenoidů v počátečních fázích vývoje, který v dalších fázích nebyl tak výrazný jako v případě jiných odrůd. Ve čtvrtém odběru již tyto odrůdy vykazovaly obsah karotenoidů pouze průměrný. Odlišný průběh syntézy karotenoidů by mohl pravděpodobně souviset s odlišným způsobem vybarvování zmiňovaných odrůd. Pro tyto odrůdy bylo komplikované určit správnou dobu pro provedení prvního odběru. V prvním odběru ve vývojové fázi Breaker, charakterizované přechodem zeleného zabarvení plodů ve žluté, již měly 59
tyto odrůdy vybarvení dužniny plodů odpovídající spíše vývojové fázi Pink (růžové zabarvení zaujímá minimálně třicet procent povrchu plodu). Změny v obsahu a zastoupení fotosyntetických pigmentů během čtyř vývojových stadií plodů odrůdy Start S jsou zaznamenány na obrázku 7.
Obrázek 7. Změny absorpčního spektra karotenoidů a chlorofylů zaznamenané během čtyř stadií zralosti plodů (odrůda Start S).
Karotenoidní molekuly se vyznačují absorpcí světla v oblasti 400-550 nm. Jejich absorpční spektrum je širší pás se třemi maximy. Z obrázku je zřejmé, že se zvyšujícím se stupněm zralosti roste absorbance acetonového extraktu karotenoidů, zároveň stoupá koncentrace karotenoidů v plodech rajčat. Opačný průběh lze sledovat v zastoupení chlorofylů (píky v oblasti 430 a 662 nm), s rostoucím stupněm zralosti jejich obsah klesá. V roce 2008 byla stanovena průměrná hodnota obsahu karotenoidů 552 µg.g-1 sušiny (36 µg.g-1 čerstvé hmotnosti) ve zralých plodech, což je o 77 µg.g-1 sušiny méně ve srovnání s rokem předešlým. Ze statistického zhodnocení vyplynul významný vliv ročníku na obsah karotenoidů v plodech rajčat (příloha 6, tabulka 5). Téměř ve všech odrůdách byl naměřen nižší obsah karotenoidů oproti roku předešlému (viz, obrázek 8). Výjimku tvořily pouze odrůdy Start S a Tornádo.
60
rok 2007
rok 2008
Celkové karotenoidy (µg.g-1 sušiny)
1200 a
1000
a b b
800
b c
d
600
c
b
c
c c
d
c
400 200
e d
0
Obrázek 8. Celkový obsah karotenoidů ve zralých plodech rajčat.
V kapitole 4.2.1. jsou v tabulce 5 uvedeny meteorologické charakteristiky obou hodnocených let naměřené na stanovišti ČZU v Praze. Oba sledované roky 2007 a 2008 patřily k teplotně nadnormálním. Po celé vegetační období se teplota držela nad hranicí normálu, pod kterou klesla až v měsíci září, kdy už byly plody ze všech pěstovaných odrůd odebrané. Vyšší syntéza karotenoidů v roce 2007 mohla být podpořena teplotně výrazně nadnormálními měsíci květnem a červnem. V této době mohla vyšší teplota pozitivně ovlivnit celkový růst rostlin a prvotní syntézu karotenoidních látek. Z výsledků tohoto pokusu je opět patrný výrazný vliv odrůdy na obsah karotenoidů rajčat. Stejně jako v roce předešlém patřily odrůdy Start S, Bonset a Orkado k odrůdám s vyšší schopností syntézy karotenoidů a odrůdy Albertovské žluté a Bejbino k odrůdám s nízkou schopností syntézy karotenoidů. Obsahy karotenoidů naměřené v této práci jsou v dobré shodě s hodnotami publikovanými autory Abushita et al. (1997), kteří z patnácti maďarských odrůd stanovili průměrný obsah karotenoidů 36 µg.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Obsahy karotenoidů stanovené autory George et al. (2004) a Ilahy et al. (2011) dosáhly ještě vyšších hodnot. Ve dvanácti indických odrůdách stanovili autoři George et al. (2004) průměrný obsah lykopenu 40 µg.g-1 č. h. v dužnině plodů a 92 µg.g-1 č. h. ve slupce plodů. Ještě vyšší hodnoty naměřili autoři Ilahy et al. (2011), v šesti 61
odrůdách pěstovaných na jihu Itálie se obsah lykopenu pohyboval v rozmezí 97-233 µg.g-1 č. h. a obsah β-karotenu v rozmezí 6-20 µg.g-1 č. h. plodů. Tyto rozdíly mohou být způsobeny různými odrůdovými faktory, klimatickými podmínkami růstu a geografickou polohou. Důležitou roli může sehrát také proces lyofilizace použitý k přípravě vzorků. Autoři Georgé et al. (2011), kteří se zabývali vlivem lyofilizačního procesu na stabilitu antioxidantů obsažených v rajčatech, stanovili ve svých pokusech 11% a 14% pokles obsahu β-karotenu v červenoplodých a žlutoplodých odrůdách a až 47% pokles lykopenu v červenoplodých odrůdách rajčat. Tyto ztráty vzniklé lyofilizačním procesem jsou velmi významné a měly by být brány na zřetel při dalších analýzách. V souladu s touto prací, všichni výše citovaní autoři stanovili významný vliv odrůdy na obsah karotenoidů rajčat.
5.1.2.
Jednotlivé karotenoidy
Zastoupení individuálních karotenoidů bylo analyzováno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí (HPLC-UV). Naměřené obsahy celkových a individuálních karotenoidů stanovených ve zralých plodech osmi odrůd rajčat jsou znázorněny na obrázcích 9 a 10.
celkové karotenoidy
Obsah karotenoidů (µg.g-1 sušiny)
1200
lykopen
β-karoten
lutein
a
1000
b
b
800
c
c a
a
d
600
b
b
400
d
b
b
c 200
ab e
ab
c
bc
c
c
c
c
bc
c
a
ab
c c
a
c
0
Obrázek 9. Obsah celkových karotenoidů, lykopenu, β-karotenu a luteinu ve zralých plodech rajčat (rok 2007).
62
celkové karotenoidy
Obsah karotenoidů (µg.g-1 sušiny)
1200
β-karoten
lykopen
a
1000 b
800
b
600 400
c
b
c
200
lutein
cd
d
e
bc
c
d
cd
ab
d ab
cd
e
c
c
b cd
d bcd
a
e
a de
bc a
abc
0
Obrázek 10. Obsah celkových karotenoidů, lykopenu, β-karotenu a luteinu ve zralých plodech rajčat (rok 2008).
V červenoplodých odrůdách byly jako hlavní karotenoidy identifikovány lykopen (410 µg.g-1 suš.), β-karoten (130 µg.g-1 suš.) a lutein (40 µg.g-1 suš.). Jejich procentický podíl na celkovém obsahu znázorňuje obrázek 11.
lykopen
β-karoten
lutein
neidentifikované
6% 6%
21% 67%
Obrázek 11. Podíl jednotlivých karotenoidů na celkovém obsahu ve zralých plodech rajčat (rok 2008).
63
Autoři Burns et al. (2003) naměřili průměrný obsah karotenoidů v plodech rajčat 908 µg.g-1 sušiny. Z tohoto množství shodně představoval nejvyšší podíl lykopen (58 %). Na rozdíl od této studie následoval lutein (10 %) a až poté β-karoten (6 %). Zbylý procentický podíl připadl na fytoen (24 %) a violaxantin (2 %). Podstatně vyšší podíl lykopenu na celkových karotenoidech (90-96 %) stanovili autoři Ilahy et al. (2011) a Sass-Kiss et al. (2005). Tento rozdíl mohl být způsoben již zmíněnými odrůdovými rozdíly a odlišnou geografickou polohou, teplejší a jižněji orientované polohy mohou podporovat produkci lykopenu na úkor ostatních karotenoidů. Obsah lykopenu kontinuálně narůstal během všech čtyř vývojových stadií plodů (obrázek 12). Naproti tomu byly β-karoten a lutein nejintenzivněji syntetizovány v prvním a druhém stadiu zralosti plodů (od zelenožlutého do růžového zabarvení plodů, obrázky 13 a 14). V konečných stadiích zralosti plodů již syntéza těchto karotenoidů neprobíhala. Podobný trend nárůstu karotenoidů publikovali ve své studii i autoři Biacs et al. (1987) a Cano et al. (2003), naproti tomu autoři Abushita et al. (1997) a Giovanelli et al. (1999) pozorovali konstantní nárůst β-karotenu během celého vývoje plodů.
Start S
Obsah lykopenu (µg.g-1 sušiny)
800
Bejbino a
700 600 b
500 400
a
300
b c
200 100
c nd
nd
0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 12. Obsah lykopenu v různých stupních zralosti plodů (rok 2008, nd - nedetekováno). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
64
Start S
Bejbino
Albertovské žluté
Obsah β-karotenu (µg.g-1 sušiny)
250 a
200
a
a
a
a
150 b a
100 b
c
b
b
b
50 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 13. Obsah β-karotenu v různých stupních zralosti plodů (rok 2008). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Start S
Obsah luteinu (µg.g-1 sušiny)
70
Albertovské žluté
a
60 50
Bejbino
a
a
b
b
b
c
b 40
c
c
b
b
III.
IV.
30 20 10 0 I.
II. Stupeň zralosti
Obrázek 14. Obsah luteinu v různých stupních zralosti plodů (rok 2008). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Tento rozdíl je pravděpodobně způsoben různými funkcemi β-karotenu v plodech rajčat. V nezralých plodech zastává β-karoten primární funkci. Zde je zahrnut do procesu fotosyntézy, kde působí jako fotoprotektivní antioxidant v jádrech obou fotosystémů. Kromě toho může βkaroten v některých odrůdách převzít sekundární funkci a spolu s lykopenem tak může přispívat k celkovému vybarvení plodů. Toto pravděpodobně nastalo v odrůdě Albertovské žluté, kde byl 65
identifikován pouze β-karoten (67 %) a lutein (33 %). Syntéza luteinu probíhala shodně jako v červenoplodých odrůdách - nejvýrazněji mezi I. a II. stadiem zralosti plodů. Naproti tomu syntéza β-karotenu probíhala nejvýrazněji ve finálním stadiu dozrávání plodů.
5.2.
Obsah vitaminu C v rajčatech
V letech 2007 a 2008 byl ve všech testovaných odrůdách sledován také obsah vitaminu C. V obou sledovaných letech byl vitamin C stanoven ve zralých plodech rajčat (IV. odběr), v roce 2008 byl navíc sledován vliv stadia zralosti na obsah tohoto vitaminu. Obsah vitaminu C ve všech čtyřech stadiích zralosti byl stanoven ve vybraných odrůdách Start S, Bejbino a Albertovské žluté. Písmena nad jednotlivými sloupci na obrázku 16 označující průkazné diference se vztahují k hodnocení vlivu různých stupňů zralosti. Vliv stupně zralosti je hodnocen zvlášť pro každou odrůdu V roce 2007 byl v osmi testovaných odrůdách naměřen průměrný obsah vitaminu C 3495 µg.g-1 sušiny (255 µg.g-1 čerstvé hmotnosti). V porovnání s rokem 2008 byly naměřené hodnoty více variabilní. Statisticky významné rozdíly byly nalezeny téměř mezi všemi hodnocenými odrůdami (obrázek 15). Nejvyšší hodnoty vykazovaly odrůdy Bonset (4309 µg.g-1) a Stupické polní rané (4104 µg.g-1). Naopak nejnižší hodnoty byly naměřeny v odrůdách Dominato (2266 µg.g-1) a Orkado (2920 µg.g-1). V roce 2008 se obsah vitaminu C v plodech rajčat pohyboval v rozmezí 3095 µg.g-1 v odrůdě Orkado až 3684 µg.g-1 v odrůdě Tornádo. Průměrný obsah vitaminu C činil 3495 µg.g-1 sušiny (245 µg.g-1 čerstvé hmotnosti). Shodně s rokem 2007 byl v odrůdách Dominato a Orkado naměřen nízký obsah tohoto vitaminu ve srovnání s ostatními odrůdami (3120 µg.g-1, 3095 µg.g1
), ve kterých byl stanoven významně vyšší obsah vitaminu C, a které se v obsahu tohoto
vitaminu od sebe již významně nelišily (obrázek 15).
66
rok 2008
rok 2007
5000 a
4500
ab
b Obsah vitaminu C (µg.g-1 sušiny)
4000 3500
a c
a
b
a d
b
d
e
3000 2500
a
a
a
f
2000 1500 1000 500 0
Obrázek 15. Obsah vitaminu C ve zralých plodech rajčat.
Naměřené hodnoty obsahu vitaminu C byly srovnatelné s hodnotami uváděnými autory Ilahy et al. (2011) a George et al. (2004). Naproti tomu vyšší hodnoty, pohybující se od 310 do 710 µg.g-1 čerstvé hmotnosti v závislosti na době sklizně, stanovili autoři Raffo et al. (2006). Hodnota vitaminu C stanovená ve žlutoplodé odrůdě Albertovské žluté je relativně vysoká (3669 µg.g-1rok 2007, 3676 µg.g-1rok 2008) a je vyšší než hodnota stanovená autory Georgé et al. (2011), kteří se zabývali obsahem významných antioxidantů v červenoplodých i žlutoplodých odrůdách rajčat. V souladu s těmito autory je obsah vitaminu C ve žlutoplodých odrůdách srovnatelný s obsahem v červenoplodých odrůdách. Při srovnání let 2007 a 2008 nebyl prokázán statisticky významný vliv ročníku na obsah vitaminu C (příloha 7, tabulka 22). V roce 2007 naměřené hodnoty vitaminu v odrůdách velmi kolísaly, naproti tomu v roce 2008 se hodnoty pohybovaly velmi blízko průměru, který dosáhl shodně v obou hodnocených letech 3495 µg.g-1 sušiny.
67
Start S
Bejbino
Albertovské žluté
4000
a b
c
3500
a
a
Obsah vitaminu C (µg.g-1 sušiny)
b b
3000 c
2500
c
d
2000 d 1500
d
1000 500 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 16. Obsah vitaminu C v různých stupních zralosti plodů (rok 2008). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Ve všech třech testovaných odrůdách obsah vitaminu C významně narůstal během dozrávání plodů (obrázek 16) a dosáhl maximálních hodnot ve zralých plodech rajčat (IV. odběr). Tento trend nesouhlasí s výsledky publikovanými autory Abushita et al. (1997), kteří se zabývali zastoupením antioxidačních vitaminů v sedmnácti maďarských odrůdách rajčat. Zmiňovaní autoři stanovili nárůst vitaminu C až do II. stadia zralosti plodů, v dalších fázích zralosti již obsah vitaminu mírně klesal. Naopak podle španělských autorů Cano et al. (2003) zůstává obsah vitaminu C prakticky konstantní během prvních tří stadií zralosti a mírné narůstá až v plné zralosti plodů. Tyto rozdíly mohou být způsobeny různými genetickými faktory, klimatickými podmínkami dané lokality a s tím souvisejícím množstvím slunečního záření, případně také různými stresy působícími na rostliny.
5.3.
Antioxidační aktivita rajčat
Celková antioxidační aktivita (TAA) rajčat byla stanovena metodou ABTS/MnO2. Pomocí této metody byly stanoveny antioxidanty podílející se jak na lipofilní (LAA) tak na hydrofilní (HAA) antioxidační aktivitě. Podíl lipofilního extraktu (organická fáze obsahující karotenoidy) na TAA tvořil pouze 15 % v roce 2007 a 18 % v roce 2008. Toto zjištění je v dobré shodě s výsledky publikovanými autory Cano et al. (2003). Ještě nižší podíl lipofilních antioxidantů 68
stanovili autoři Toor a Savage (2005), kteří určili pouze 7-9% příspěvek lipofilních antioxidantů na TAA. Podílem lipofilních a hydrofilních antioxidantů na TAA rajčatových produktů se zabývali také autoři Arnao et al. (2001). V extraktech tomatových polévek naměřili 79,3% příspěvek hydrofilních antioxidantů k TAA. Podíl lipofilních antioxidantů tvořil pouze 20,7 %. Naproti tomu, 25 až 50% příspěvek lipofilních antioxidantů k TAA byl publikován autory Ilahy et al. (2011). Relativně vysoká LAA naměřená těmito autory mohla být způsobena použitím polárnějšího rozpouštědla (50% aceton) k extrakci lipofilních látek, což mohlo způsobit rozpuštění více polárních antioxidantů a tím zvýšit jejich příspěvek k LAA.
LAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
7 6
rok 2007
a
8 b
rok 2008
a b
b
b
c
c
5 4 3
d d
d d
d e
e f
2 1 0
Obrázek 17. Lipofilní antioxidační aktivita stanovená ve zralých plodech rajčat.
Na obrázku 17 jsou zaznamenány průměrné hodnoty lipofilní antioxidační aktivity zralých plodů rajčat naměřené v letech 2007 a 2008. Při porovnání obou hodnocených let nebyl prokázán vliv ročníku na LAA (příloha 8, tabulka 28). Lipofilní antioxidanty obsažené v 1 g sušiny dosáhly v obou letech v průměru stejné antioxidační aktivity jako 5,0 µM Troloxu (0,35 µM Troloxu.g-1 čerstvé hmoty). Vyšší hodnoty LAA byly v obou letech naměřeny v odrůdách Bejbino, Albertovské žluté a Tornádo. Naměřené hodnoty LAA byly srovnatelné s hodnotami publikovanými autory Cano et al. (2003) a Raffo et al. (2006), které se pohybovaly v rozmezí 0,26 až 0,88 µM Trolox.g-1 čerstvé hmoty a byly významně nižší než hodnoty LAA publikované autory Ilahy et al. (2011). Hodnoty naměřené těmito autory se pohybovaly v rozmezí 1,34 až 5,40 µM Trolox.g-1 čerstvé hmoty.
69
Lykopen, majoritní karotenoid rajčat, je považován za jeden z nejdůležitějších antioxidantů obsažených v plodech rajčat. Významné korelace mezi obsahem lykopenu a antioxidační aktivitou byly již publikovány mnoha autory (Cano et al., 2003; Ilahy et al., 2011; MartinezValverde et al., 2002; Toor a Savage, 2005). Nicméně v této studii se významné pozitivní korelace mezi LAA a obsahem karotenoidů (příp. lykopenu) nepodařilo prokázat (obrázek 18 a 19). V porovnání s obrázkem 8 znázorňujícím celkové obsahy karotenoidů pěstovaných odrůd je patrné, že v odrůdách vyznačujících se nízkým obsahem karotenoidů (Albertovské žluté, Bejbino, Tornádo) byla stanovena naopak vysoká LAA. Z toho lze usuzovat, že karotenoidy nejsou hlavními lipofilními antioxidanty rajčat. Na LAA mají pravděpodobně větší vliv různé nepolární organické sloučeniny nebo tokoferoly .
LAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
7
R² = 0,4294
6 5 4 3 2 1 0 0
200
400 600 800 -1 obsah karotenoidů (µg.g sušiny)
1000
1200
Obrázek 18. Závislost hodnoty LAA na obsahu karotenoidů (rok 2007).
LAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
8 R² = 0,1197
7 6 5 4 3 2 1 0 0
200
400 600 obsah karotenoidů (µg.g-1 sušiny)
Obrázek 19. Závislost hodnoty LAA na obsahu karotenoidů (rok 2008).
70
800
1000
Na celkové antioxidační aktivitě se daleko významnější měrou podílela hydrofilní antioxidační aktivita (85 % v roce 2007 a 83 % v roce 2008), za kterou jsou zodpovědné hydrofilní antioxidanty, zejména vitamin C, flavonoidy a různé polyfenolické sloučeniny. Ve sledovaných letech 2007 a 2008 byly naměřené velmi rozdílné hodnoty HAA v pěstovaných odrůdách (obrázek 20). V roce 2007 vykazovaly hydrofilní antioxidanty obsažené v 1 g sušiny v průměru stejnou antioxidační aktivitu jako 29,1 µM Troloxu (2,0 µM Troloxu.g-1 čerstvé hmotnosti). Ve srovnání s následujícím rokem byla tato hodnota významně vyšší než průměrná hodnota naměřená v roce 2008 (23,1 µM Troloxu.g-1 sušiny; 1,6 µM Troloxu.g-1 čerstvé hmotnosti). Výsledky statistické analýzy jsou uvedeny v příloze 9. Vyšší hodnoty HAA byly stanoveny v odrůdách Bonset, Bejbino a Tornádo.
rok 2007
45 a
HAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
40
rok 2008
a
35 30 25 20
b
b a
a
ab bc
cd
d
bc
a
d cd
d
d
15 10 5 0
Obrázek 20. Hydrofilní antioxidační aktivita stanovená ve zralých plodech rajčat.
Naměřené hodnoty HAA odpovídají hodnotám publikovaným autory Cano et al. (2003), kteří ve zralých plodech rajčat stanovili průměrnou hodnotu HAA 2,2 µM Troloxu.g-1 čerstvé hmotnosti, ale jsou významně nižší než hodnoty publikované autory Ilahy et al. (2011), kteří naměřili HAA pohybující se v rozmezí 4,4 až 5,7 µM Troloxu.g-1 čerstvé hmotnosti plodů. Naměřené hodnoty HAA vysoce korelovaly s obsahem vitaminu C (rok 2007: R2=0,61, rok 2008: R2=0,69), jak je patrné na obrázcích 21 a 22.
71
HAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
40 R² = 0,61
35 30 25 20 15 10 2000
2500
3000 3500 obsah vitaminu C (µg.g-1 sušiny)
4000
4500
Obrázek 21. Závislost hodnoty HAA na obsahu vitaminu C (rok 2007).
HAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
30 R² = 0,6909 25 20 15 10 3000
3100
3200
3300 3400 3500 3600 -1 obsah vitaminu C (µg.g sušiny)
3700
3800
Obrázek 22. Závislost hodnoty HAA na obsahu vitaminu C (rok 2008).
Vliv dozrávání na změny v LAA a HAA byl sledován v roce 2008 na třech dříve zmíněných odrůdách. Písmena nad jednotlivými sloupci na obrázcích 23 a 24 označující průkazné diference se vztahují k hodnocení vlivu různých stupňů zralosti. Vliv stupně zralosti je hodnocen zvlášť pro každou odrůdu. V červenoplodých odrůdách (Start S, Bejbino) hodnota LAA významně narůstala až do III. stupně zralosti (obrázek 23). Ve zralých plodech (IV. stupeň) již byl naměřen významný pokles v LAA. Tato tendence také ukazuje na nízkou hodnotu korelace mezi antioxidační aktivitou a obsahem karotenoidů, který na rozdíl od hodnot LAA narůstal během všech čtyř stadií zralosti plodů. Naproti tomu, žlutoplodá odrůda Albertovské žluté, charakteristická nízkým obsahem karotenoidů, dosáhla relativně vysoké hodnoty LAA (obrázek 17), která na rozdíl od červenoplodých odrůd narůstala po celou dobu zrání plodů. 72
Start S
Bejbino
Albertovské žluté
LAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
9
a
b
8 a
c
7
a
b
6
b
5
c
4 3
c
2
d
d
d
1 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 23. Změny v obsahu LAA v různých stupních zralosti plodů (rok 2008). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Změny v HAA během zrání plodů jsou znázorněny na obrázku 24. HAA kontinuálně narůstala ve všech testovaných odrůdách a dosáhla maxima v IV. stupni zralosti plodů.
Start S
Bejbino
Albertovské žluté
HAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
35 30
a
a
25
a
b
20
d
b
b
b
c
15 10
a
a
c
5 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 24. Změny v obsahu HAA v různých stupních zralosti plodů (rok 2008). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Změnami v LAA a HAA během zrání plodů se zabývali také autoři Cano et al. (2003). Podle těchto autorů hodnota LAA vzrůstala během celého procesu zrání plodů a vysoce korelovala s obsahem lykopenu (r = 0,91). Hodnota HAA zůstala prakticky konstantní během zrání plodů a v souladu s touto studií vysoce korelovala s obsahem vitaminu C (r = 0,90).
73
Významnou korelaci mezi hodnotou HAA a obsahem vitaminu C (r = 0,60) stanovili také autoři Ilahy et al. (2011).
5.4.
Vliv různé úrovně minerálního hnojení na obsah antioxidantů
rajčat V roce 2008 proběhl v prostorách skleníku ČZU nádobový pokus zaměřený na hodnocení vlivu minerální výživy rostlin na obsah antioxidantů rajčat. Shodně s polním odrůdovým pokusem byl v plodech rajčat odrůdy Start S sledován obsah celkových a jednotlivých karotenoidů lykopenu, β-karotenu a luteinu, obsah vitaminu C a hodnota hydrofilní a lipofilní antioxidační aktivity rajčatového extraktu. Naměřené hodnoty byly statisticky zpracovány metodou analýzy rozptylu dvojného třídění (I. faktor: varianta, II. faktor: stupeň zralosti) na hladině významnosti α=0,05. K podrobnějšímu vyhodnocení byl použit Tukeyův test. Výsledky statistického hodnocení jsou uvedeny v přílohách 10-12. Na obrázcích je vedle rostlin pěstovaných v různých variantách minerálního hnojení pro srovnání uvedena také polní varianta odrůdy Start S pěstovaná ve stejném roce ve venkovních podmínkách (označena HP). Z toho důvodu a také z důvodu většího důrazu na hodnocení vlivu testované varianty již nejsou v grafech statistické rozdíly zaznamenány pomocí písmen nad sloupci. Statistické zhodnocení je uvedeno pouze slovně v textu popisujícím obrázky.
5.4.1.
Celkové karotenoidy
Ze statistického zhodnocení naměřených výsledků byl prokázán vliv různé úrovně hnojení na obsah karotenoidů rajčat. Na obrázku 25 jsou uvedeny změny v obsahu celkových karotenoidů odrůdy Start S pěstované ve třech různých variantách hnojení. V rostlinách pěstovaných ve variantě H1 (rostliny pěstované bez přídavku minerálních hnojiv) byl v průměru naměřen nejnižší obsah karotenoidů (907 µg.g-1 sušiny ve zralých plodech). Tato varianta se významně lišila od varianty H2, ve které byly rostliny hnojeny optimálními dávkami základních živin N, P, K. Rostliny pěstované ve variantě H2 se s výjimkou III. odběru vyznačovaly nejvyšší schopností syntézy karotenoidů v průběhu zrání plodů, obzvláště pak ve IV. odběru, kdy byl v těchto rostlinách naměřen obsah karotenoidů velmi vysoký (1362 µg.g-1 sušiny). Vysoký obsah karotenoidů byl naměřen i pro variantu H3 (1112 µg.g-1 sušiny), tento nárůst oproti variantě H1. však nebyl statisticky prokázán. V této variantě byly rostliny hnojené optimálními dávkami N, P, K doplněné o mikroelementy Cu, Mn, Zn.
74
H1
Obsah karotenoidů (µg.g-1 sušiny)
1600
H2
H3
HP
1400 1200 1000 800 600 400 200 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 25. Celkový obsah karotenoidů v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Snahou této studie bylo zjistit, zda optimální výživa rostlin obohacená o přídavek dvojmocných kationtů Cu, Mn a Zn, může mít pozitivní vliv na syntézu karotenoidů. Dvojmocné kationty těchto kovů, obzvláště pak manganu, se jako kofaktory enzymů podílí na syntéze karotenoidů. Zvýšený nárůst karotenoidů ve variantě H3 byl zaznamenán pouze ve III. stadiu zralosti, kde mohly sledované prvky napomoci urychlení syntézy karotenoidů. Ve výsledném obsahu karotenoidů naměřeném ve zralých plodech se tento pozitivní efekt již neprojevil. V grafech jsou zaznamenány také hodnoty sledovaných parametrů v odrůdě Start S pěstované ve venkovních podmínkách (HP). Tato varianta nebyla zařazena do statistického hodnocení a je zde uvedena pouze pro porovnání vlivu venkovního a skleníkového prostředí na obsah sledovaných parametrů. V plodech odrůdy Start S pěstované ve venkovních podmínkách byl naměřen v průměru nejnižší obsah karotenoidů ve srovnání s plody rostlin všech variant pěstovaných ve skleníku. Nižší obsah karotenoidů byl ve variantě HP pozorován téměř po celou dobu zrání plodů. Výjimku tvořila pouze počáteční fáze vývoje plodů, tj. I. odběr, kde byl obsah karotenoidů naměřen naopak nejvyšší. Z toho lze usuzovat, že specifické skleníkové prostředí charakteristické vyšší teplotou a jinou skladbou slunečního záření neobsahující krátkovlnnou složku, pozitivně ovlivňuje tvorbu karotenoidů. Jedná se hlavně o karotenoidy, které mají v plodech sekundární funkci a slouží jako atraktanty pro roznašeče semen.
75
Naproti tomu zvýšený obsah karotenoidů v I. odběru venkovní varianty ukazuje na důležitou primární funkci karotenoidů, kdy slouží jako ochránci fotosyntetického aparátu před nadbytkem slunečního záření.
5.4.2.
Jednotlivé karotenoidy
Nárůst obsahu lykopenu, majoritního karotenoidu rajčat, v průběhu zrání plodů dobře koreloval s nárůstem obsahu celkových karotenoidů (obrázek 26.). Nejvyšší obsah byl naměřen ve variantě H2 ve zralých plodech (1048 µg.g-1 sušiny). Shodně jako v případě celkových karotenoidů byl v této variantě naměřen významně vyšší obsah lykopenu oproti kontrolní variantě H1 (652 µg.g-1 sušiny). Vyšší obsah lykopenu byl naměřen i ve variantě H3 (848 µg.g-1 sušiny ve zralých plodech). Vliv této zkušební varianty na obsah lykopenu se však nepodařilo prokázat.
H1
Obsah lykopenu (µg.g-1 sušiny)
1200
H2
H3
HP
1000 800 600 400 200 nd nd nd nd 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 26. Obsah lykopenu v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování (nd nedetekováno). Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Obsah lykopenu ve skleníkových variantách byl shodně jako obsah celkových karotenoidů vyšší než obsah lykopenu naměřený ve variantě venkovní. To potvrzuje pozitivní vliv skleníkového prostředí na tvorbu karotenoidů, které mají v plodech sekundární funkci. Výše uvedené tvrzení také souhlasí s prací Thomase a Jena (1975), kteří ve své práci studovali vliv červeného světla na biosyntézu karotenoidů rajčat. Podle těchto autorů světlo emitované Gro-Lux lampami, které vyzařují elektromagnetické záření převážně v červené oblasti spektra (625-740 nm), má podstatně vyšší vliv na syntézu karotenoidů oproti bílým lampám, 76
které v červené oblasti spektra prakticky nevyzařují. Významné formativní účinky červeného světla na tvorbu lykopenu zjistili také autoři Liu et al. (2009), kteří se zabývali vlivem různých typů záření na obsah karotenoidů v průběhu posklizňového skladování rajčat. Ve změnách v obsahu β-karotenu a luteinu (obrázky 27 a 28.) v průběhu zrání plodů byl nalezen podobný trend jako v odrůdách pěstovaných ve venkovních podmínkách. Obsah βkarotenu narůstal ve všech testovaných variantách až do III. stupně zralosti. Ve zralých plodech (IV. stupeň) již jeho obsah poklesl. Obsah luteinu byl nejvyšší v počátečních fázích vývoje plodů. V dalších stadiích již jeho obsah ve všech testovaných variantách mírně klesal.
H1
H2
H3
HP
Obsah β-karotenu µg.g-1 sušiny)
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 27. Obsah β-karotenu v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Obsah β-karotenu i obsah luteinu byl shodně naměřen nejvyšší ve variantě H3. Tento významný nárůst oproti variantám H1 a H2. byl sledován od počátku vývoje plodů až do III. stadia zralosti. Ve zralých plodech již obsahy obou karotenoidů dosahovaly srovnatelných hodnot, a to ve všech testovaných skleníkových variantách.
77
H1
H2
H3
HP
Obsah luteinu (ug.g-1 sušiny)
70 60 50 40 30 20 10 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 28. Obsah luteinu v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Tyto výsledky opět poukazují na možný vliv dvojmocných kationů testovaných prvků jako urychlovačů syntézy karotenoidních molekul. Tento efekt je patrný pouze v rychlejší syntéze karotenoidů v průběhu zrání, nikoliv v jejich zvýšeném obsahu ve finální zralosti plodů. Podle autorů Frasera a Bramleyho (2004) se dvojmocné kationty kovů, především manganu a hořčíku podílí na syntéze meziproduktů vedoucích k tvorbě karotenoidů. Jako kofaktory příslušných enzymů se účastní syntézy isopentenyl pyrofosfátu, geranylgeranyl pyrofosfátu a fytoenu - prvního prekurzoru karotenoidů. Z naměřených výsledků je však tento vliv patrnější u karotenoidů obsahující cyklické části ve své molekule. Je tedy pravděpodobné, že se tyto prvky podílí nejen na syntéze karotenoidních prekurzorů, ale zasahují i do samotné cyklizace karotenoidních molekul. Bohužel vzhledem k nedostatku prací zabývajících se podobným tématem není možné tyto závěry porovnat s výsledky jiných autorů. Z porovnání skleníkových variant s variantou venkovní vyplývá značný vliv prostředí na obsah sledovaných karotenoidů. S výjimkou II. odběru je obsah β-karotenu i luteinu nejvyšší ve variantě HP, což je pravděpodobně způsobeno již zmíněným jiným typem záření na rostlinu dopadajícího. UV složka záření dopadající na rostliny pěstované ve venkovních podmínkách zřejmě stimuluje tvorbu těchto karotenoidů, které v rostlinách plní převážně primární ochrannou funkci.
78
5.4.3.
Vitamin C
Obsah vitaminu C kontinuálně narůstal ve všech variantách v průběhu celého zrání plodů (obrázek 29). Nejvyšší obsah byl naměřen ve čtvrtém odběru ve zralých plodech všech testovaných variant. Celkově nejvyšší obsah byl naměřen v nehnojené variantě H1, a to ve všech stupních zralosti. Ve zralých plodech dosahoval obsah vitaminu C 3465 µg.g-1 sušiny. Tato varianta se významně lišila od obou hnojivy ošetřených variant. Významné rozdíly byly nalezeny i mezi variantou H2 a H3. Významně nejnižší obsah byl naměřen ve variantě H2 (3143 µg.g-1 sušiny, IV. odběr), kde byly rostliny hnojeny optimalizovanými dávkami N, P, K. Ve variantě H3, obohacené navíc o mikroelementy Cu, Zn a Mn, byl sledován podobný trend nárůstu vitaminu C jako v případě karotenoidů. Obsah vitaminu C intenzivně narůstal mezi I. a III. odběrem. Ve zralých plodech již byl obsah vitaminu C srovnatelný s obsahem vitaminu ve variantě H2 (3154 µg.g-1 sušiny). Polní varianta HP se presentovala relativně vysokým obsahem tohoto vitaminu v průběhu celého zrání plodů. Ve zralých plodech byl naměřen obsah 3291 µg.g-1 sušiny.
H1
H2
H3
HP
Obsah vitaminu C (µg.g-1 sušiny)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 29. Obsah vitaminu C v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Výsledky získané ze skleníkových i polních variant poukazují na významnou roli vitaminu C, který v rostlinách působí jako ochranný faktor proti různým stresům vyvolaným nedostatečnou výživou, teplotou či nadměrným ozářením. Toto působení zřejmě vyplývá z ochranné antioxidační funkce, kterou vitamin C v rostlinném metabolismu zastává. Výsledky 79
této studie souhlasí s pracemi autorů Daveyho et al. (2000) a Dumase et al. (2003), kteří uvádějí, že obsah vitaminu C v rostlinách závisí na intenzitě slunečního záření. Zjistili, že vysoká intenzita slunečního záření podporuje tvorbu vitaminu C v plodech rajčat. Nižší obsah vitaminu C v rajčatech pěstovaných ve skleníku oproti rajčatům pěstovaným ve venkovních podmínkách stanovili také autoři Lopez-Andreu et al. (1986). Zvýšený obsah vitaminu C v nehnojené variantě mohl být způsoben také nepřímo. Pro rostliny pěstované v obou hnojených variantách byl charakteristický větší nárůst biomasy, což mohlo způsobit větší zastínění plodů a v důsledku toho také snížení obsahu vitaminu C. Také autoři Dumas et al. (2003) uvádějí, že zvýšená aplikace dusíkatých hnojiv může snižovat obsah vitaminu C. Tento jev autoři připisují právě zmíněnému většímu nárůstu olistění, které má za následek větší zastínění vyvíjejících se plodů.
5.4.4.
Antioxidační aktivita
HAA kontinuálně narůstala v průběhu zrání plodů (obrázek 30). Pouze ve variantě H1 a H2 došlo k jejímu mírnému poklesu ve finální zralosti plodů. Ve zralých plodech dosahovala její hodnota 20,4 µM Trolox.g-1 sušiny ve variantě H1, 18,8 ve variantě H2 a 20,1 ve variantě H3 Celkově se nejvyšší hodnotou HAA presentovala nehnojená varianta H1, která se významně lišila od obou hnojivy ošetřených variant. Shodně jako v předešlém polním odrůdovém pokusu byl patrný vliv obsahu vitaminu C na její celkovou hodnotu. Obsah vitaminu C opět vysoce koreloval s hodnotou HAA, a tím potvrdil svoji roli majoritního kontributora k hydrofilní antioxidační aktivitě plodů rajčat. Hodnota HAA kontinuálně narůstala také v polní variantě HP. Ve zralých plodech došlo k jejímu výraznému nárůstu oproti HAA naměřené ve skleníkových variantách. Na vysoké hodnotě HAA (26,3 µM Trolox.g-1 sušiny) varianty HP se podílel již zmíněný vitamin C případně s jinými hydrofilními antioxidanty rajčat. Je známo, že vyšší intenzita záření příznivě ovlivňuje také tvorbu polyfenolických sloučenin. Stewart et al. (2000) uvedl, že rajčata pěstovaná ve venkovních podmínkách obsahují 4-5 krát více flavonoidů než rajčata pěstovaná ve skleníku. Také podle Hunta a Bakera (1980) světlo příznivě ovlivňuje tvorbu fenolických kyselin a flavonoidů v rajčatech. Proto rajčata pěstovaná ve venkovních podmínkách, kde jsou vystavená vyšší intenzitě světla a UV záření, obsahují vyšší množství těchto antioxidačně aktivních látek.
80
H1
H2
H3
HP
HAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
30 25 20 15 10 5 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 30. Hodnoty HAA v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
LAA plodů rajčat narůstala až do III. stupně zralosti, ve zralých plodech již její hodnota značně klesla. Celkově dosahovala LAA nízkých hodnot, na celkové antioxidační aktivitě se podílela pouze z patnácti procent. Porovnáním hodnot LAA (obrázek 31) s obsahem celkových karotenoidů (obrázek 25) je opět patrný malý vliv obsahu karotenoidů na LAA. Celkový obsah karotenoidů narůstal v průběhu zrání plodů, kdežto hodnota LAA na konci zrání značně poklesla. Významně nejvyšší hodnoty byly naměřeny ve variantě H3, a to hlavně v II. a III. stadiu zralosti plodů. Ve zralých plodech již hodnota LAA v této variantě poklesla (3,7 µM Trolox.g-1 sušiny). Bohužel nelze přesně říci, které lipofilní sloučeniny s antioxidační funkcí mohl způsob pěstování v této variantě ovlivnit. Ve zbylých dvou variantách byla ve zralých plodech naměřena hodnota LAA 2,9 µM Trolox.g-1 sušiny pro variantu H1 a 4,1 µM Trolox.g-1 sušiny pro variantu H2.
81
H1
7
H2
H3
HP
LAA (µM Trolox.g-1 sušiny)
6 5 4 3 2 1 0 I.
II.
III.
IV.
Stupeň zralosti
Obrázek 31. Hodnoty LAA v různých stupních zralosti plodů při různých variantách pěstování. Stupně zralosti: I. Breaker, II. Pink, III. Light Red, IV. Red.
Ve srovnávací polní variantě HP byly naměřeny vyšší hodnoty LAA oproti skleníkovým variantám. Ve zralých plodech byla naměřena hodnota LAA 4,6 µM Trolox.g-1 sušiny. Na základě experimentálních hodnot je opět zřejmý příznivý vliv venkovního záření obsahujícího i ultrafialovou složku na tvorbu antioxidačně aktivních látek.
82
6.
ZÁVĚR V letech 2007 a 2008 byl sledován vliv odrůdy, stupně zralosti, ročníku a vliv různé
úrovně minerální výživy na obsah a složení antioxidantů rajčat. Do polního pokusu bylo zařazeno celkem osm odrůd. Z výsledků statistického zhodnocení vyplynulo, že existuje významný rozdíl ve schopnosti odrůd syntetizovat karotenoidy. Významné rozdíly byly nalezeny jak mezi odrůdami, tak mezi různými stádii zralosti plodů. Mezi odrůdy s vysokým obsahem karotenoidů patřily odrůdy Boset, Start S a Orkado. Naopak odrůdy Albertovské žluté, Bejbino a Tornádo vykazovaly během celého vývoje nízkou schopnost syntetizovat karotenoidy. Průběh počasí na stanovišti byl ve sledovaných letech odlišný, rovněž se významně lišil obsah karotenoidů v plodech rajčat. V teplejším roce 2007 byl naměřen obsah karotenoidů průměrně o 14 % vyšší v porovnání s rokem následujícím. V červenoplodých odrůdách byly stanoveny jako hlavní karotenoidy lykopen, β-karoten a lutein. V žlutoplodé odrůdě (Albertovské žluté) byl identifikován pouze β-karoten a lutein. Obsah lykopenu kontinuálně narůstal během celého vývoje plodů. Naproti tomu probíhala syntéza β-karotenu a luteinu nejintenzivněji v počátečních stadiích vývoje plodů. Výjimku tvořila pouze žlutoplodá odrůda, kde syntéza β-karotenu probíhala nejintenzivněji až v konečném stadiu zralosti plodů. Obsah vitaminu C v plodech rajčat byl rovněž významně ovlivněn odrůdou. Mezi odrůdy s vysokým obsahem vitaminu C patřily v obou sledovaných letech odrůdy Bejbino, Bonset a Stupické polní rané. Naopak v odrůdách Dominato a Orkado byl v obou letech naměřen obsah vitaminu nejnižší. V roce 2007 naměřené hodnoty vitaminu C v odrůdách velmi kolísaly, naproti tomu v roce 2008 se hodnoty pohybovaly velmi těsně okolo průměru. Vliv ročníku na obsah vitaminu C se nepodařilo prokázat. Ve všech testovaných odrůdách obsah vitaminu C významně narůstal během dozrávání a dosáhl maximálních hodnot ve zralých plodech rajčat. Antioxidační aktivita lipofilních antioxidantů (LAA) byla významně ovlivněna odrůdou a tvořila pouze 15 a 18 % (rok 2007 a rok 2008) z celkové antioxidační aktivity. Z naměřených výsledků nebyla prokázána pozitivní korelace mezi hodnotou LAA a obsahem karotenoidů. Byl
83
sledován
spíše
opačný
trend,
v odrůdách
Albertovské
žluté,
Bejbino
a
Tornádo,
charakteristických nízkým obsahem karotenoidů, byla naměřena vysoká hodnota LAA. Na celkové antioxidační aktivitě se podstatně vyšší měrou podílela hydrofilní antioxidační aktivita (HAA). Hodnota hydrofilní antioxidační aktivity byla významně ovlivněna odrůdou a shodně jako obsah vitaminu C významně narůstala během dozrávání plodů. Naměřené hodnoty HAA vysoce korelovaly s obsahem vitaminu C. Shodně jako v případě vitaminu C byla naměřena vysoká hodnota HAA v odrůdách Bejbino a Bonset a nízká hodnota HAA v odrůdách Dominato a Orkado V nádobovém pokusu založeném v roce 2008 byl sledován také vliv minerální výživy na obsah antioxidantů rajčat. V rostlinách odrůdy Start S pěstovaných ve variantách ošetřených minerálními hnojivy byla zjištěna vyšší schopnost syntézy karotenoidů. V případě celkových karotenoidů a lykopenu byl tento vliv staticticky prokázán pouze ve variantě ošetřené optimalizovanými dávkami N, P, K. V případě β-karotenu a luteinu byl tento vliv statisticky prokázán ve variantě ošetřené optimalizovanými dávkami N, P, K s přídavkem mikroelementů Cu, Zn a Mn. Ošetření rostlin minerálními hnojivy mělo naproti tomu negativní efekt na obsah vitaminu C. Rostliny pěstované v nehnojené kontrolní variantě vykazovaly významně vyšší schopnost syntetizovat vitamin C. Hodnoty sledovaných parametrů odrůdy Start S naměřené ve skleníkových variantách byly srovnány s hodnotami naměřenými ve venkovní variantě této odrůdy. Specifické skleníkové prostředí mělo pozitivní vliv pouze na tvorbu lykopenu, hodnoty všech ostatních sledovaných parametrů (obsah β-karotenu, luteinu, vitaminu C, hodnota LAA a HAA) byly naměřeny vyšší ve variantě venkovní, obzvláště ve zralých plodech rajčat. Z těchto výsledků je patrný významný formativní vliv UV-složky záření na tvorbu biologicky aktivních sloučenin.
84
7.
LITERATURA
Abushita, A. A., Daood, H. G., Biacs, P. A. 2000. Change in carotenoids and antioxidant vitamins in tomato as a function of varietal and technoligical factors. Journal of the Agricultural and Food Chemistry, 48, 2075-2081. Abushita, A. A., Hebshi, E. A., Daood, H. G., Biacs, A. 1997. Determination of antioxidant vitamins in tomatoes. Food Chemistry, 60, 207-212. Agarwal, A., Shen, H., Agarwal, S., Rao, A. V. 2001. Lycopene content of tomato products: Its stability, bioavailability and in vivo antioxidant properties. Journal of Medicinal Food, 4, 9-15. Agius, F.,Gonza´lez-Lamothe, R., Caballero, J. L., Mun˜oz-Blanco, J., Botella, M. A., Valpuesta, V. 2003. Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpressing of a Dgalacturonic acid reductase. Nature Biotechnology, 21, 177-181. Arnao, M. B., Cano, A., Acosta, M. 2001. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chemistry, 73, 239-244. Bajaj, K. L., Mahajan, R., Kaur, P. P., Cheema, D. S. 1990. Chemical evaluation of some tomato varieties. Journal of Research Punjab Agricultural University, 27, 226-230. Ball, G. F. M. 2006. Vitamins in foods: Analysis, Bioavailability, and Stability, 1st edition. Boca Raton, FL: Taylor & Francis, 785 s. ISBN: 1-57444-804-8. Bauernfeind, J. C. 1981. Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors: Technological and Nutritional Applications, 1st edition. New York: Academic Press, p. 938. ISBN: 0-12082850-2. Biacs, P. A., Daood., H. G., Czinkotai, B., Hajdú, F., Kiss-Kutz, N. 1987. Effect of Titavit on the dynamics of tomato fruit ripeness. Acta Horticulturae, 220, 433-438. Biggs, M., Flowerdew, B., McVicarová, J. 2004. Velká kniha zeleniny, bylin a ovoce, 1. vydání. Praha: Volvox Globator, 640 s. ISBN: 80-7207-537-3. Blumhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. 1990. Transport and storage of vitamin A. Science, 250, 399-404. Brant, V., Pivec, J., Venclová, V. 2009. Fenologická stanice v Praze - Suchdole [online], [cit. 2009-03-12]. Dostupné z:
.
85
Buchtová, I. 2004. Situační a výhledová zpráva Zelenina. Praha: Ministerstvo zemědělství ČR, 65 s. ISBN: 80-7084-320-9. Burns, J., Fraser, P. D., Bramley, P. M. 2003. Identification and quantification of carotenoids, tocopherols
and
chlorophylls
in
commonly
consumed
fruits
and
vegetables,
Phytochemistry, 62, 939-947. California Tomato Commision. 2008. California tomato ripening stages [online], [cit. 2008-0115]. Dostupné z: . Cano, A., Acosta, M., Arnao, M. B. 2003. Hydrophilic and lipophilic antioxidant activity changes during on-vine ripening of tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.). Postharvest Biology and Technology, 28, 59-65. Conklin, P. L., Williams, E. H., Last, R. L. 1996. Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficient Arabidopsis mutant. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93, 9970-9974. Cronquist, A. 1988. The evolution and classification of flowering plants, 2nd edition. New York: Botanical Garden, p. 556. ISBN: 0893273325. Curl, A. L. 1961. The xanthophylls of tomatoes. Journal of Food Science, 26, 106-111. Das, N. P. 1989. Effects of vitamin A and its analogs on nonenzymatic lipid peroxidation in rat brain mitochondria. Journal of Neurochemistry, 52, 585-588. Davey, M. W., Van Montagu, M., Inzé, D., Sanmartin, M., Kanellis, A., Smirnoff, N., Benzie, I. J. J., Strain, J. J., Favell, D., Fletcher, J. 2000. Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80, 825-860. Di Mascio, P., Kaiser, S., Sies, H. 1989. Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher. Archives of Biochemistry and Biophysics, 274, 532-538. Dolejš, K. 2000. Základy fytotechniky. Praha: Česká zemědělská univerzita, 152 s. ISBN: 80213-0518-5. Dorais, M., Gosselin, A., Papadopoulos, A. P. 2001. Greenhouse tomato fruit quality. Horticultural revue, 26, 239-306. Douša M. 2009. Karotenoidy - Extrakce a metody stanovení karotenoidů [on-line], [cit. 2009-0305]. Dostupné z: . 86
Douša M. 2011. Vitaminy - Metody stanovení ve vodě rozpustných vitaminů [on-line], [cit. 2011-05-11]. Dostupné z < http://hplc1.sweb.cz/index.html>. Duffek, J., Dolejší, J. 1998. Zelinářství: Obecná část. Praha: Česká zemědělská univerzita, 112 s. ISBN: 80-902584-0-9. Dumas, Y., Dadomo, M., Di Lucca, G., Grolier, P. 2003. Effects of environmental factors and agricultural techniques on antioxidant content of tomatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 83, 369-382. Dumas, Y., Dadomo, M., DiLucca, G., Grolier, P. 2003. Review: Effects of environmental factors and agricultural techniques on antioxidant content of tomatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 83, 369-382. Feller, C., Bleiholder, H., Buhr, L., Hack, H., Hess, M., Klose, R. 1995. Phänologische Entwicklungsstadien von Geműsepflanzen: II. Fruchtgeműse und Hűlsenfrűchte. In: Meier, U. (ed.). 2001. Growth stages of mono- and dicotyledonous plants, extended BBCH scale, 2nd edition. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, pp. 109-111. ISBN: 395207490X. Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry, 3th edition. New York: Marcel Dekker, Inc., 1069 s. ISBN: 0-8247-9346-3. Fojtík, L. 1985. Fotosyntetické pigmenty. In: Kupka, J. 1987. Cvičení z fyziologie rostlin, 1. vydání. Praha: Česká zemědělská univerzita, s. 57-63. Fraser, P. D., Bramley, P. M. 2004. The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids. Progress in Lipid Research, 43, 228-265. Fraser, P. D., Truesdale, M. R., Bird, C. R., Schuch, W., Bramley, P. M. 1994. Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development. Plant Physiology, 105, 405-413. Frei, B., England, L., Ames, B. N. 1989. Ascorbate is an outstanding antioxidant in human blood plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86, 6377-6381. George, B., Kaur, Ch., Khurdiya, D. S., Kapoor, H. C. 2004. Antioxidants in tomato (Lycopersicon esculentum) as a function of genotype. Food Chemistry, 84, 45-51. Georgé, S., Tourniaire, F., Gautier, H., Goupy, P., Rock, E., Caris-Veyrat, C. 2011. Changes in the contents of carotenoids, phenolic compounds and vitamin C during technical
87
processing and lyophilisation of red and yellow tomatoes. Food Chemistry, 124, 16031611. Gilmore, A. 1999. How higher plants respond to excess light: Energy dissipation in photosystem 2. Canberra : Australian national university, pp. 513-548. Giovanelli, G., Lavelli, V., Peri, C., Nobili, S. 1999. Variation in antioxidant components of tomato during vine and postharvest ripening. Journal of the Science of Food and Agriculture, 79, 1583-1588. Gloser, J. 1998. Fyziologie rostlin, 2. vydání. Brno: Masarykova univerzita, 157 s. ISBN: 80210-1789-9. Gosiewska, A., Mahmoodian, F., Peterkofsky, B. 1996. Gene expression of iron-related proteins during iron deficiency caused by scurvy in guinea pigs. Archives of Biochemistry and Biophysics, 325, 295-303. Gross, J. 1991. Pigments in Vegetables: Chlorophylls and Carotenoids, 1st edition. New York: Van Nostrand Reinhold, p. 351. ISBN: 0-442-00657-8. Harper, J. 2000. Dietetické antioxidanty ve výživě psa a kočky [on-line], [cit. 2009-04-14]. Dostupné z: < http://www.veterina-info.cz/script/articledetail.asp?rid=4 >. Hart, D. J., Scott, K. J. 1995. Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in food, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chemistry, 54, 101-111. Hejtmánková, K., Pivec, V., Trnková, E., Hamouz, K., Lachman, J. 2009. Quality of coloured varieties of potatoes. Czech Journal of Food Sciences - Special Issue, 27, 310-313. Henry, C. J. K., Chapman, C. 2002. Nutrition Handbook for Food Processors, 1st edition. England: Woodhead Publishing, 416 s. ISBN: 1-85573-464-8. Higdon,
J.
2003.
Vitamin
A
[on-line],
[cit.
2009-02-16].
Dostupné
z:
. Hornig, D. 1975. Distribution of ascorbic acid, metabolites and analogues in man and animals. In: Institute of Medicine (USA). 2001. Dietary reference intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium and Carotenoids, 1st edition. Washington: National academy press, pp. 99-100. ISBN: 0-309-07279-4.
88
Hunt, G. M., Baker, E. A., 1980. Phenolic constituents of tomato fruit cuticles. Phytochemistry, 19, 1415-1419. Ilahy, R., Hdider, Ch., Lenucci, M. S., Tlili, I., Dalessandro, G. 2011. Phytochemical composition and antioxidant activity of high-lycopene tomato (Solanum lycopersicum L.) cultivars grown in Southern Italy. Scientia Horticulturae, 127, 255-261. Jacob, R. A. 1995. The integrated antioxidant system. Nutrition Research, 15, 755-766. Jacob, R. A. 1999. Vitamin C. In: Institute of Medicine (USA). 2001. Dietary reference intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium and Carotenoids, 1st edition. Washington: National academy press, pp. 99-100. ISBN: 0-309-07279-4. Kallner, A., Hartmann, D., Hornig, D. 1979. Steady-state turnover and body pool of ascorbic acid in man. In: Institute of Medicine (USA). 2001. Dietary reference intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium and Carotenoids, 1st edition. Washington: National academy press, pp. 99-100. ISBN: 0-309-07279-4. Kardoš, E., Berek, D. 1979. Základy kvapalinovej chromatografie. Bratislava: Alfa, 296 s. Káš, J., Kodíček, M., Valentová, O. 2006. Laboratorní techniky biochemie, 1. vydání. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 258 s. ISBN: 80-7080-586-2. Kleinwächterová, H., Brázdová, Z. 2001. Výživový stav člověka a jeho zjišťování, 2. vydání. Brno: NCO NZO, 102 s. ISBN: 80-7013-336-8. Kodíček, M. 2007. Biochemické pojmy - výkladový slovník [CD-ROM]. Verze 2.0, Praha: Vysoká škola chemicko-technologická. Lee, C. Y., Robinson, R. W. 1980. Influence of the crimson gene on vitamin A content of tomato. Hortscience, 15, 260 - 261. Leoni, C. 2002. Improving the nutritional quality of processed fruits and vegetables: the case of tomatoes. In: Jongen, W. (ed.). 2002. Fruit and vegetable processing: Improving quality, Woodhead Publishing, pp. 52-66. ISBN: 1-85573-548-2. Levine, M., Rumsey, S., Wang, Y., Park, J., Kwon, O., Xu, W., Amano, N. 1996. Vitamin C. In: Ziegler, E. E., Filer, L. J. (eds.). 1996. Present Knowledge in Nutrition, 7th edition. Washington DC: ILSI Press, pp. 469-488. ISBN: 0944398723.
89
Lichtenhaler, H. K., Wellburn, A. R. 1983. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical Society Transactions, 11, 591592. Liu, L. H., Zabaras, D., Bennett, L. E., Aguas, P., Woonton, B. W. 2009. Effects of UV-C, red light and sun light on the carotenoid content and physical qualities of tomatoes during postharvest storage. Food Chemistry, 115, 495-500. Lopez-Andreu, F. J., Lamela, A., Esteban, R. M., Collado, J. G. 1986. Evolution of quality parameters in the maturation stage of tomato fruit. Acta Horticulturae, 191, 387-394. Lopez-Andreu, F. J., Lamela, A., Esteban, R. M., Collado, J. G. 1986. Evolution of quality parameters in the maturation stage of tomato fruit. Acta Horticulturae, 191, 387-394. Malý, I. 1998. Polní zelinářství, 1. vydání. Praha: Agrospoj, 196 s. ISBN: 8023942328. Mangels, A. R., Holden, J. M., Beecher, G. R., Forman, M. R., Lanza, E. 1993. Carotenoid contents of fruits and vegetables: an evaluation of analytical data. In: Watson, R. R. (ed.). 2001. Vegetables, fruits, and herbs in health promotion, 1st edition. Boca Raton: CRC Press, pp. 46-48. ISBN: 0-8493-0038-X. Mareček, F. 1994. Zahradnický slovník naučný, 1. vydání. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 440 s. ISBN: 80-85120-51-8. Martinez-Valverde, I., Periago, M. J., Provan, G., Chesson, A. 2002. Phenolic compounds, lycopene and antioxidant activity in commercial varieties of tomato (Lycopersicon esculentum). Journal of the Science of Food and Agriculture, 82, 323-330. Masinovskij, Z., Věchet, B. 1986. Evoluční aspekty fotobiologie. Praha: Academia, 248 s. Miller, N. J., Sampson, J., Candeias, L. P., Bramley, P. M., Rice-Evans, C. A. 1996. Antioxidant activities of carotenes and xanthophylls, Federation of European Biochemical Societies. FEBS Letters, 384, 240-242. MORAVOSEED.
2006.
Rajče.
[online],
[cit.
2009-03-12].
Dostupné
z:
. Mortensen, A., Skibsted, L. H., Sampson, J., Rice-Evans, C., Everett, S. A. 1997. Comparative mechanisms and rates of free radical scavenging by carotenoid antioxidants. FEBS Letters, 418, 91-97.
90
Nagy, N. E., Holven, K. B., Roos, N., Senoo, H., Kojima, N., Norum, K. R., Blumhoff, R. 1997. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. Journal of Lipid Research, 38, 645-658. Nishikimi, M., Yagi, K. 1996. Biochemistry and molecular biology of ascorbic acid biosynthesis. In: Harris, J. R. (ed.). 1996. Subcellular Biochemistry, Plenum Press, pp. 17-39. ISBN: 0306-45148-4. Nováková, L., Solich, P., Solichová, D. 2008. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends in Analytical Chemistry, 27, 942-958. Offord, E. A. 1998. Nutritional and health benefits of tomato products. In: Preedy, V. R., Watson, R. R. (eds.). 2008. Tomatoes and Tomato Products. Nutritional, Medicinal and Therapeutic Properties, 1st edition. USA: Science Publishers, pp. 27-28. ISBN: 978-157808-534-7. OSIVA. 2009. Odrůdy rajčat [online], [cit. 2009-03-12]. Dostupné z: . Palace, V. P., Khaper, N., Qin, Q., Singal P. K. 1999. Antioxidant potentials of vitamin A and carotenoids and their relevance to heart disease. Free Radical Biology & Medicine, 26, 746-761. Pavlová, L. 1996. Fotomorfogeneze. Praha: Univerzita Karlova, 101 s. ISBN: 80-7184-681-3. Pekárková, E. 2000. Pěstujeme zeleninu, 2. vydání. Praha: Grada publishing, 150 s. ISBN: 80247-9040-8. Pekárková, E. 2001. Pěstujeme rajčata, papriky a další plodové zeleniny. Praha: Grada publishing, 68 s. ISBN: 80-247-0170-7. Petříková, K., Malý, I. 1998. Základy pěstování plodové zeleniny. Praha: Institut výchovy a vzdělávání MZe ČR, 44 s. ISBN: 80-7105-165-9. Petříková, K., Malý, I. 2003. Základy pěstování plodové zeleniny, 1. vydání. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 51 s. ISBN: 80-7271-141-5. Pfander, H., Riesen, R. 1995. Chromatography: Part IV High-Performance Liquid Chromatography. In: Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H. (eds.). 1995. Carotenoids Volume 1A: Isolation and Analysis. Basel: Birkhäuser Verlag, pp. 109-116. ISBN: 3-76432908-4.
91
Pignocchi, C., Foyer, C. H. 2003. Apoplastic ascorbate metabolism and its role in the regulation of cell signaling. Current Opinion in Plant Biology, 6, 379-389. Procházka, S., Macháčková, I., Krekule, J., Šebánek, J., et al. 1998. Fyziologie rostlin. Praha: Academia, 484 s. ISBN: 80-200-0586-2. Pulkrábek,
J.
2009.
Okopaniny
SMEP
[online],
[cit.
2009-04-17].
Dostupné
z
. Rafffo, A., La Malfa, G., Fogliano, V., Maiani, G., Quaglia, G. 2006. Seasonal variations in antioxidant components of cherry tomatoes (Lycopersicon esculentum cv. Naomi F1). Journal of Food Composition and Analysis, 19, 11-19. Rao, A. V. Zeeshan, W., Agarwal, S. 1998. Lycopene content of tomatoes and tomato products and their contribution to dietary lycopene. Food Research International, 31, 737-741. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26, 1231-1237. Ronen, G., Cohen, M., Zamir, D., Hirschberg, J. 1999. Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato fruit development: expression of the gene for lycopene epsilon-cyclase is down-regulated during ripening and is elevated in the mutant Delta. Plant Journal, 17, 341351. Ronchetti, I. P., Quaglino, D., Bergamini, G. 1996. Ascorbic acid and connective tissue. Subcellular Biochemistry, 25, 249-264. Řezanka, P. 2009. Spektrální metody v chemii - Spektrofotometrie ve viditelné oblasti spektra [online], [cit. 2009-03-02]. Dostupné z . Sass-Kiss, A., Kiss, J., Milotay, P., Kerek, M. M., Toth-Markus, M. 2005. Differences in anthocyanin and carotenoid content of fruits and vegetables. Food Research International, 38, 1023-1029. SEMO.
2006.
Rajče
tyčkové
[online],
[cit.
2009-03-12].
Dostupné
z:
. Silva, D. J. H., Abreu, F. B., Caliman, F. R. B., Antonio, A. C., Patel, V. B. 2008. Tomatoes: Origin, cultivation techniques and germplasm resources. In: Preedy, V. R., Watson R. R.
92
(eds.). 2008. Tomatoes and tomato products: nutritional, medicinal and therapeutic properties, 1st edition. USA: Science Publishers, pp. 4-25. ISBN: 978-1-57808-534-7. Stewart, A. J., Bozonnet, S., Mullen, W., Jenkins, G. I., Lean, M. E. J., Crozier, A. 2000. Occurrence of flavonols in tomatoes and tomatobased products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 2663-2669. Šapiro, D. K., Perednev, V. P., Matveev, V. A., Radjuk, A. F. 1988. Ovoce a zelenina ve výživě člověka. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 227 s. ISBN: 5-7860-0431-7. Šesták, Z. 1985. Photosynthesis during leaf development, 1st edition. Praha: Academia, p. 396. Šmejkal, P., Stratilová, Urválková, E., Trejbalová, I. 2007. Pokusy z obecné a fyzikální chemie [online].
Praha: Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy, 42 s. Dostupné z: <
http://web.natur.cuni.cz/~kudch/main/JPD3/navody2007/5seminar.pdf>. Štambera, J. 1984. Zelinářství: (část všeobecná, polní zelinářství, rychlení), 1. vydání. Brno: Vysoká škola zemědělská, 399 s. Štambera, J. 1986. Zelinářství - Pěstování zelinářských druhů na semeno. Brno: Vysoká škola zemědělská, 93 s. Štefánek, J. 2008. Nedostatek vitaminu C [online], [cit. 2011-09-12]. Dostupné z: http://www.stefajir.cz/?q=nedostatek-vitaminu-c Tamaoki, M., Mukai, F., Asai, N., Nakajima, N., Kubo, A., Aono, M., Saji, H. 2003. Lightcontrolled expression of a gene encoding L-galactono-gamma-lactone dehydrogenase which affects ascorbate pool size in Arabidopsis thaliana. Plant Science, 164, 1111-1117. Tap, F. 2000. Economics-based optimal control of greenhouse tomato crop production. Thesis Wagenigen Agricultural University, Wagenigen, p. 127. Tesoriere, L., Ciaccio, M., Bongiorno, A., Riccio, A., Pintaudi, A. M., Livrea, M. A. 1993. Antioxidant
activity
of
all-trans-retinol
in
homogeneous
solution
and
in
phosphatidylcholine liposomes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 307, 217-223. Thaipong, K., Boonprakob, U., Crosby, K., Cisneros-Zevallos, L., Byrbe, D. H. 2006. Comparison of ABTS, DPPH, FRAP and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis, 19, 669-675.
93
Thakur, B. R., Singh, R. K., Nelson, P. E. 1996. Quality attributes of processed tomato products. In: Watson, R. R. (ed.). 2001. Vegetables, fruits, and herbs in health promotion, 1st edition. Boca Raton: CRC Press, pp. 46-48. ISBN: 0-8493-0038-X. Thomas, R. L., Jen, J. J. 1975. Red light intensity and carotenoid biosynthesis in ripening tomatoes. Journal of Food Science, 40, 566-568. Thomson, K. A., Marshall, M. R., Sims, C. A., Wei, C. I., Sargent, S. A., Scott, J. W. 2000. Cultivar, maturity and heat treatment on lycopene content in tomatoes. Journal of Food Science, 65, 791-795. Tinkler, J. H., Böhm, F., Schalch, W., Truscott, T. G. 1994. Dietary carotenoids protect human cells from damage. Journal of Photochemistry and Photobiology, 26, 283-285. Tomšovic, P. 1997. Lycopersicon Mill. - rajče. In: Hejný, S., Slavík, B. (eds.). 1997. Květena České republiky. Praha: Academia, 280 s. ISBN: 80-200-0643-5. Tonucci, L. H., Holden, J. M., Beecher, G. R., Khachik, F., Davis, C. S., Mulokozi, G. 1995. Carotenoid content of thermally processed tomato-based food products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, 579-586. Toor, R. K., Savage, G. P. 2005. Antioxidant activity in different fractions of tomatoes. Food Research International, 38, 487-494. Troníčková, E., Krejčová, Z. 1985. Zelenina. Praha: Artia, 223 s. Tsao, C. S. 1997. An overview of ascorbic acid chemistry and biochemistry. In: Packer, L., Fuchs, J. (eds.). 1997. Vitamin C in Health and Disease. New York: Marcel Dekker, pp. 25-58. ISBN: 0824793137. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (ÚKZÚZ). 2008. Seznam odrůd zapsaných ve státní
odrůdové
knize
[online],
[cit.
2009-04-10].
Dostupné
z
Velíšek, J. 2002. Chemie potravin 3, 2. vydání. Tábor: OSSIS, 343 s. ISBN: 80-86659-02-X. Velíšek, J., Hajšlová, J. 2009. Chemie potravin I., 3. vydání. Tábor: OSSIS, 602 s. ISBN: 97880-86659-15-2. Vodrážka, Z. 1993. Biochemie 3. Praha: Academia, 191 s. ISBN: 80 200 0471-8.
94
Waters - firma zabývající se výrobou zařízení pro HPLC. 2011. [online], [cit. 2011-15-05]. Dostupné z: http://www.waters.com/waters/home.htm?locale=en_CZ Woodwall, A. A., Lee, S. W., Weesie, R. J., Jackson, M. J., Britton, G. 1997. Oxidation of carotenoids by free radicals: relationship between structure and reactivity. Biochimica et Biophysica Acta, 1336, 33-42. Zou, L., Li, H., Ouyang, B., Zhang, J., Ye, Z. 2006. Cloning and mapping of genes involved in tomato ascorbic acid biosynthesis and metabolism. Plant Science, 170, 120-127.
95
8.
PŘÍLOHY
Seznam příloh: Příloha 1.
Fotodokumentace pokusů
Příloha 2.
Fáze zralosti plodů
Příloha 3.
Chromatografické stanovení karotenoidů v roce 2007
Příloha 4.
Chromatografické stanovení karotenoidů v roce 2008
Příloha 5.
Chromatografické stanovení vitaminu C
Příloha 6.
Statistická analýza dat: Polní pokus - Karotenoidy
Příloha 7.
Statistická analýza dat: Polní pokus - Vitamin C
Příloha 8.
Statistická analýza dat: Polní pokus - LAA
Příloha 9.
Statistická analýza dat: Polní pokus - HAA
Příloha 10.
Statistická analýza dat: Skleníkový pokus - Karotenoidy
Příloha 11.
Statistická analýza dat: Skleníkový pokus - Vitamin C
Příloha 12.
Statistická analýza dat: Skleníkový pokus - HAA, LAA
96
