ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin

Kvantitativní a indukovaná rezistence řepky ozimé k Leptosphaeria maculans disertační práce

Autor:

Vladimír Šašek

Školitel:

doc. Ing. Evženie Prokinová, CSc.

Konzultant:

doc. Ing. Lenka Burketová, CSc. Ústav experimentální Botaniky AV ČR, v.v.i.

Praha 2 0 1 1

Marijánce k prvním narozeninám

V Praze dne 1. dubna 2011

Děkuji paní Lence Burketové za vytrvalou a všestrannou podporu a neomezený rozlet, který mi poskytla.

Dále děkuji paní docentce Prokinové, profesoru Ryšánkovi a celé Katedře ochrany rostlin za skvělé vzdělání, podporu a ochotu vždy všechno rychle vyřešit paní Myrtě Pařízkové a Jitce Vidlákové za udržování bezchybného zázemí Shinichi Oidemu za všechno, co mě naučil Mirce Špácové, Lucii Ježkové, Lucii Lorkové a Martinu Jandovi za jejich nevídané nasazení pestrému kolektivu z Karlovky za rozptýlení, zvláště pak paní Kolčabové za její vlídná slova paní profesorce Valentové, Michale Klímové, Hance Hoffmeisterové, Daniele Kocourkové, Hance Návarové, Přemyslu Pejcharovi, Janu Martincovi a Tomáši Moravcovi za cenné rady Christině Dixelius, Peteru Ottovi a Károly Bókovi za možnost pobývat v jejich laboratořích mnohým vědcům z celého světa, kteří mi vždy laskavě poskytli materiál pro experimenty Zvláštní díky patří Jarmile, která opravila snad všechny moje hrupky Děkuji kamarádů, že vždy vydrželi alespoň několik minut líčení mých zážitků z labotoře, než utekli

Velmi si cením opory a inspirace v široké rodině Rád vzpomínám na život v rodině Zevlounových, kde jesme strávili většinu času, kdy tato práce vznikala

Ze všech nejvíc ale děkuju Janince, která se tolik načekala

Obsah 1. ÚVOD .................................................................................................................................. 3 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ................................................................ 4 2.2 IMUNITA ROSTLIN ZALOŽENÁ NA ROZPOZNÁNÍ MAMPS....................................................... 6 2.3 IMUNITA ROSTLIN ZALOŽENÁ NA ROZPOZNÁNÍ EFEKTORŮ (MONOGENNÍ REZISTENCE) .......... 7 2.4 ROSTLINNÉ HORMONY A JEJICH SIGNÁLNÍ DRÁHY ŘÍDÍCÍ IMUNITNÍ SYSTÉM .......................... 9 2.5 INDUKOVANÁ REZISTENCE A PRIMING .............................................................................. 13 2.6 KVANTITATIVNÍ REZISTENCE............................................................................................ 14 2.7 BRASSICA NAPUS A LEPTOSPHAERIA MACULANS ............................................................. 15 3. CÍLE................................................................................................................................... 19 4. METODY ........................................................................................................................... 20 5. VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................................................... 32 5.1 IDENTIFIKACE OBRANNÝCH REAKCÍ VYVOLANÝCH ROZPOZNÁNÍM GENU AVRLM1 ............... 32 5.2 ELICITORY OBRANNÝCH REAKCÍ Z PATOGENA L. MACULANS ............................................. 51 5.3 SCREENING INDUKTORŮ REZISTENCE K L. MACULANS ...................................................... 56 5.4 BABA ZMENŠUJE PŘÍZNAKY CHOROBY VYVOLANÉ L. MACULANS ...................................... 56 5.5 HYDROLYZÁTY ŽIVOČIŠNÝCH BÍLKOVIN ............................................................................ 63 6. ZÁVĚR............................................................................................................................... 72 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ................................................................................... 74 8. POUŽITÉ ZKRATKY ......................................................................................................... 83 9. PŘÍLOHY ........................................................................................................................... 84

1. Úvod

1. Úvod I v novém tisíciletí zůstává lidská populace nadále závislá na produktech zemědělství. Ačkoliv jsme se jako Evropané v nedávné době často setkávali s opačným problémem, zemědělské produkce je na světě nedostatek a vzhledem k rychlému růstu populace se situace bude patrně nadále zhoršovat tak, jak předpovídal Thomas Malthus na konci 18. století. To, že se Malthusova apokalyptická vize dosud nenaplnila, nelze přičítat jeho špatnému odhadu, ale objevům, které zapříčinily zvýšení zemědělské produkce. Díky použití minerálních hnojiv a intenzivnímu šlechtění je k nasycení jednoho člověka potřeba desetkrát méně zemědělské půdy než před dvěma sty lety (TREWAVAS, 2002). Nevíme, co nám pomůže vyřešit současný nedostatek potravin, ale nezdá se, že by vhodnou cestou v našich podmínkách bylo další zvyšování intenzity zemědělské výroby. Pozornost se upírá zejména k zvýšení odolnosti rostlin k nepříznivým abiotickým podmínkám a parazitujícím organizmům. Jen původci chorob rostlin nás připraví nejméně o jednu desetinu světové produkce potravin (STRANGE a SCOTT, 2005). Zemědělci využívají celou řadu prostředků, aby omezili škody způsobené patogeny rostlin. Patří mezi ně přímá chemická a biologická ochrana, konvenční šlechtění na rezistenci, transgenóze a celá řada přímých i nepřímých agrotechnických opatření. Zásadní a nezastupitelnou roli hraje chemická ochrana. Již dlouhodobě je ale diskutován její negativní vliv na lidské zdraví (ALAVANJA et al., 2004) a životní prostředí, především pak půdní úrodnost a působení na necílové organismy (JOHNSEN et al., 2001). Všechny tyto skutečnosti jsou sice obtížně prokazatelné, nicméně v současnosti dochází z těchto důvodů k restrikci mnoha používaných pesticidů. Je tedy třeba hledat nové způsoby, jak snížit ztráty způsobené škůdci a patogeny a zároveň se vypořádat s omezením některých pesticidů. Šlechtění rezistentních odrůd probíhá zřejmě od počátků zemědělství. Současné šlechtění na rezistenci k chorobám sice využívá řadu nových metod, ale je stále založené pouze na posuzování fenotypu, případně využívá molekulární markery pro požadované znaky. I geneticky modifikované rostliny s rezistencí k bakteriálním a houbovým patogenů jsou téměř výhradně založeny na primitivním principu využití antimikrobiálních peptidů z různých organismů (COLLINGE et al., 2010). Zcela nový pohled na imunitní systém rostlin, který přinesly objevy posledních 20 let, však zcela zásadně promění možnosti vytváření rezistentních odrůd. V této práci jsme se pokusili objasnit mechanismy rezistence rostlin řepky (Brassica napus) k hospodářsky významnému patogenem Leptosphaeria maculans. Studovali jsme signalizaci v imunitním systému B. napus při rozpoznání genu avirulence AvrLm1. V laboratorních podmínkách jsme testovali řadu látek s potenciálem indukovat rezistenci v rostlinách proti L. maculans i jiným patogenům. 3

2. Současný stav řešené problematiky

2. Současný stav řešené problematiky Přestože jsou rostliny považovány za evolučně méně vyspělé organismy než jsou živočichové, nemají imunitní systém v pravém slova smyslu a nemohou před svým parazitem utéci, je jejich obranný systém pozoruhodně účinný. Joseph Kuć, průkopník indukované rezistence, v této věci napsal: „Pokud je mi známo, žádný rostlinný druh nezmizel z povrchu zemského následkem choroby, ledaže bychom za ni považovali i lidské konání.“ (KUĆ, 2006). Rostliny mají jednak trvale přítomné - konstitutivní obranné mechanizmy a dále tzv. mechanizmy indukované, které se aktivují až v reakci na rozpoznání patogena, případně herbivora (AGRIOS, 1997). Konstitutivní obranné mechanizmy, zahrnující fyzické bariéry, např. v podobě silně hydrofobní kutikuly, nebo nízkomolekulární konstitutivně syntetizované toxické látky, nebyly předmětem této studie, a proto o nich zde nebude dále pojednáno. 2.1 Kořeny poznání imunitního systému rostlin V roce 1933 sepsal Kenneth S. Chester dodnes hojně citovaný přehledný článek (CHESTER, 1993). Shrnul v něm výsledky bezmála 200 původních prací zabývajících se „získanou imunitou“ rostlin, tedy jevem, kdy se náchylná rostlina po určitém stimulu stane odolnou k infekci. Mezi citovanými autory nechybí ani známí českoslovenští fyziologové rostlin Bohumil Němec a Silvestr Prát. Němec ve svých pokusech inokuloval listy rostlin zelí bakterií Pseudomonas aeruginosa a pozoroval, že při následné inokulaci vzdálené části listu byly rostliny k infekci odolné. Tento fenomén pozoroval pouze na bílých odrůdách. Na červených odrůdách imunizace nefungovala. Dále je v textu popisována inokulace rostlin tabáku oslabenou formou viru bramboru, která vyvolávala rezistenci k následné infekci týmž virem. Někteří postoupili v experimentování ještě dál. Asi nejbizarnější přístup spočíval v terapii nemocných rostlin sérem králíka imunizovaného fytopatogenní bakterií. O pět let později publikoval Francis Holmes práci, ve které popsal výsledky křížení, které prováděl mezi rostlinami tabáku Nicotiana glutinosa a Nicotiana tabacum (HOLMES, 1938). N. glutinosa je rezistentní k infekci virem mozaiky tabáku (TMV). Křížením amfidiploidního tabáku N. glutinosa x N. tabacum s N. tabacum Holmes zjistil, že se rezistence přenáší jako jednoduše dědičný znak. Gen rezistence pojmenoval „N“. Tato z dnešního pohledu běžná záležitost byla v tehdejší době velkým objevem. Šlechtění na monogenně založenou rezistenci se stalo jednou z nejúspěšnějších strategií ochrany rostlin před patogeny. S přibývajícími poznatky se začala utvářet představa o genetických mechanismech řídících rezistenci. Vznikl koncept „gen proti genu“ (FLOR, 1971). Podle něj existuje ke každému genu rezistence korespondující gen avirulence v genomu patogena. Pokud se setká rostlina nesoucí gen rezistence s patogenem nesoucím příslušný gen avirulence, dojde k inkompatibilní interakci, patogen je rozpoznán a spuštěním obranných mechanizmů je mu zabráněno v kolonizaci rostliny. Ve všech ostatních případech, kdy v interakci chybí jeden či oba korespondující

4

2. Současný stav řešené problematiky geny, dojde k rozvoji choroby. Taková interakce se pak nazývá kompatibilní. Ačkoliv je monogenní rezistence velmi účinná, často dojde k jejímu překonání. V takovém případě dojde v populaci v důsledku selekčního tlaku k eliminaci genu avirulence. Nutno však podotknout, že některé R-geny zůstávají v polních podmínkách nepřekonané již několik desetiletí (BENT a MACKEY, 2007). O obranných mechanismech, které stojí za projevy rezistence v rostlinách, se však nevědělo nic tehdy a ani o 30 let později nebyla situace výrazně lepší. V přehledném článku z roku 1966 je nejvíce pozornosti věnováno fytoalexinům. Zkoumání bylo značně omezeno dostupnými metodami. Proteiny byly sledovány jen z pohledu jejich aktivity. Analýza RNA byla omezena na stanovení jejího celkového množství. V náchylných rostlinách její množství během infekce rostlo, v rezistentních nikoliv (HARE, 1966). Krátce poté však VAN LOON a VAN KAMMEN (1970) využili v té době moderní metody polyakrylamidové elektroforézy, aby porovnali zastoupení proteinů v listech tabáku s genem rezistence N a náchylného tabáku při infekci TMV. K jejich úžasu se na gelu s proteiny z rezistentních rostlin po inokulaci objevily čtyři nové proužky. Prezentace těchto výsledků prvním posluchačům u nich prý vzbudila takový zájem, že diapozitiv pořízený z gelu se při dlouhé projekci zničil. V návaznosti na tento objev byly podobné proteiny popsány u řady dalších rostlin infikovaných avirulentními patogeny a vžil se pro ně název PR proteiny (Pathogenesisrelated proteins). Spekulovalo se, že jejich tvorba by v rostlinách mohla být řízena hormonem etylénem, protože jeho exogenní aplikace PR proteiny indukovala (VAN LOON, 1985). O funkci PR proteinů se ještě 15 let po jejich prvním objevu nevědělo nic. V roce 1988 byla u dvou PR proteinů popsána glukanázová a chitinázová aktivita. Tato funkce byla pochopitelná s ohledem na rezistenci k houbám, ale jak by tyto proteiny mohly pomáhat rostlinám k zastavení virové infekce, bylo nejasné (UKNES et al., 1993). V roce 1990 byla nezávisle dvěma skupinami vědců objevena kyselina salicylová jako hormon regulující expresi PR proteinů v rostlinách okurky a tabáku (MALAMY et al., 1990; MÉTRAUX et al., 1990). Tato látka byla popsána již o 11 let dříve jako chemický induktor PR proteinů (WHITE, 1979). Na myšlenku použít tuto látku k ošetření rostlin údajně navedla mladého vědce jeho babička, která přidávala do vody k řezaným květinám aspirin (kyselina acetylsalicylová), který prodlužoval jejich životnost. Ve stejné době, kdy van Loon objevil první PR proteiny, popsal Clarence Ryan inhibitory proteáz, které se v rostlinách indukovaly mechanickým poraněním, což přineslo důkaz o aktivní obraně rostlin proti herbivornímu hmyzu (GREEN a RYAN, 1972). Později tým stejného vědce popsal indukci týchž inhibitorů oligogalakturonidy uvolněnými z buněčné stěny rostliny hydrolytickými enzymy patogenů. V roce 1992 vyšlo najevo, že tyto obranné mechanizmy jsou řízeny kyselinou jasmonovou (FARMER a RYAN, 1992).

5

2. Současný stav řešené problematiky Tyto objevy odstartovaly rychlý rozvoj poznání imunitního systému rostlin. Kyselina salicylová, etylén a kyselina jasmonová v dnešní představě o spletité síti signálních drah zaujímají sice jen malé místo, ale stále výsadní. U většiny PR proteinů je dnes již známá jejich enzymová či biologická aktivita (Tab. 1), avšak i po tak dlouhé době, co uplynula od jejich nalezení, zůstává přesná funkce jednotlivých PR proteinů neobjasněna.

Rodina Zástupce

Vlastnosti

PR-1

Tobacco PR-1a

antifungální?

PR-2

Tobacco PR-2

b-1,3-glukanáza

PR-3

Tobacco P, Q

chitináza, typ I,II,IV,V,VI,VII

PR-4

Tobacco ‘R‘

chitináza, typ I,II

PR-5

Tobacco S

thaumatinu podobný protein

PR-6

Tomato Inhibitor I

inhibitor proteáz

PR-7

Tomato P69

endoproteáza

PR-8

Cucumber chitinase

chitináza, typ III

PR-9

Parsley ‘PR1‘

peroxidáza

PR-10

Tobacco

ribonukleáze podobný protein

PR-11

Tobacco ‘class V‘ chitinase

chitináza, typ I

PR-12

Radish Rs-AFP3

defensin

PR-13

Arabidopsis THI2.1

thionin

PR-14

Barley LTP4

lipid-transferový protein

PR-15

Barley OxOa

oxalát oxidáza

PR-16

Barley OxOLP

oxalát oxidáze podobný protein

PR-17

Tobacco PRp27

neznámá funkce

Tab. 1 Charakteristika rodin PR-proteinů podle TUZUN a SOMANCHI (2006).

2.2 Imunita rostlin založená na rozpoznání MAMPs Imunitní systém rostlin má dvě dobře odlišitelné složky. První složka imunitního systému odrážející útoky mikrobů je založena na receptorech umístěných na povrchu buněk. Tyto receptory rozpoznávají konzervované molekuly patogenů označované obecně jako MAMPs (microbe-associated molecular patterns). Tyto molekuly jsou zpravidla k nalezení u zástupců celých říší a organismy se bez nich jen těžce obejdou, tudíž patogen nemůže uniknout rozpoznání tím, že se této molekuly jednoduše zbaví (JONES a DANGL, 2006). Imunita vyvolaná MAPMs je zodpovědná za likvidaci většiny potenciálních parazitů. Patogeni jsou charakterističtí právě tím, že ji dokáží překonat. Rostliny nesoucí mutace v genech receptorů MAMPs a proteinů následných signálních kaskád jsou často náchylné k celé řadě patogenů, pro které jsou za normálních okolností nehostitelské (SCHWESSINGER a ZIPFEL, 2008). 6

2. Současný stav řešené problematiky Membránové receptory rostlin rozpoznávající MAMPs patří na základě své molekulové architektury do dvou skupin. Všechny mají LRR (leucine-rich repeat) doménu vázající rozpoznávaný motiv. Liší se však v přítomnosti kinázové domény. Svou funkcí i stavbou receptorů je tato část imunitního systému velmi podobná neadaptivní imunitě živočichů. Avšak zatímco genom člověka kóduje pouze 12 tzv. Toll-like receptorů, modelová rostlina Arabidopsis thaliana s poměrně malým genomem v sobě skrývá téměř 700 různých membránových receptorů (DODDS a RATHJEN, 2010). Některé receptory rostlin a živočichů rozpoznávají dokonce stejné molekuly, ale i přesto se předpokládá, že oba systémy se vyvinuly nezávisle (ZIPFEL a FELIX, 2005). Mezi nejlépe popsané MAMPs patří chitin jakožto hlavní složka buněčné stěny hub (MIYA et al., 2007) a flagelin, peptid utvářejí bičík mnoha fytopatogenních bakterií. Motiv 22 aminokyselin flagelinu je rozpoznáván membránovým receptorem FLS2 (GOMEZ-GOMEZ a BOLLER, 2000). Flagelin byl mezi prvními objevenými MAMPs a hned popřel jedno z hlavních dogmat. Přepokládalo se totiž, že patogen nemůže přímo uniknout rozpoznání membránovými receptory, protože daná molekula je pro něj životně nepostradatelná a rozpoznávaný motiv je natolik konzervovaný, že jeho sebemenší změna by ovlivnila funkci molekuly. Některé kmeny bakterie Xanthomonas campestris pv campestris vykazují záměnu v jedné z 22 aminokyseliny motivu flagelinu, která zabrání jeho rozpoznání receptorem FLS2, ale neovlivní růst ani virulenci (SUN et al., 2006). Jak ale bude uvedeno dále, tento případ je spíše výjimkou a patogeni tuto složku imunitního systému obcházejí jiným způsobem. 2.3 Imunita rostlin založená na rozpoznání efektorů (monogenní rezistence) Po naklonování a charakterizaci prvních genů avirulence se ukázalo, že většina z nich jsou malé sekretované proteiny. Brzy se ukázalo, že se jedná o efektory, které pomáhají patogenům zablokovat rozpoznání svých MAMPs. Experimentální důkazy se objevily především díky modelovému patosystému Arabidopsis thaliana – Pseudomonas syringae pt. tomato. Tato bakterie injikuje do hostitelské buňky efektor AvrPtoB, který dokáže ubikvitinem označit kinázy vedoucí signál od receptoru flagelinu FLS2. Ubikvitinace má za následek degradaci kináz proteazomem rostliny (ROSEBROCK et al., 2007). Interakce těchto dvou organismů je samozřejmě komplexnější a podobných molekulárních soubojů se odehrává celá řada. Tento příklad ale jasně demonstruje mechanismy překonání imunity vyvolané rozpoznáním MAMPs. Když molekulární biologové obrátili své pohledy na rostliny, zjistili, že většina genů rezistence kóduje cytoplazmatické receptory, které navzájem sdílí identickou molekulovou strukturu zahrnující LRR doménu, jež se váže na cílovou molekulu a nukleotid vázající doménu (NB). Na rozdíl od efektorů rozpoznávajících MAMPs jsou NB-LRR receptory

7

2. Současný stav řešené problematiky lokalizované v cytosolu. Ukázalo se tedy, že proteiny kódované geny rezistence nepůsobí přímo proti patogenům, ale slouží pouze jako receptory efektorů patogena, po jejichž rozpoznání aktivují imunitní systém (BENT a MACKEY, 2007). Pro tuto složku imunitního systému rostlin se proto vžilo označení efektory vyvolaná imunita (z angl. effector-triggered immunity). Významově se překrývá s monogenní či rasově specifickou rezistencí. Některé NB-LRR interagují s Avr proteinem nepřímo. V takovém případě NB-LRR receptor kontroluje stav proteinu nebo jiné molekuly, které jsou cílem daného efektoru. Mezi rostlinou a jejím patogenem se odehrává nekonečný evoluční souboj. Efektory potlačující vrozenou imunitu mohou být rozpoznány NB-LRR receptory rostliny, které spustí další obranné mechanismy. Patogen se pak vyhne rozpoznání modifikací efektoru nebo jeho náhradou za jiný, a tak se interakce mezi rostlinou a patogenem neustále přesouvá od náchylnosti k rezistenci a zpět. Kvůli tomu získala tato hypotéza od svých autorů přiléhavé pojmenování „cik-cak model“ (JONES A DANGL 2006). Tento model má však zásadní trhlinu. Těžko si jej lze představit v případě interakce s nekrotrofními patogeny. Z prostého důvodu. Dosud nebyl nalezen jediný NB-LRR receptor, který by zprostředkoval rezistenci k nekrotrofním patogenům. Jejich efektory jsou především toxiny a zdá se, že rostliny se před nimi snaží uniknout změnami nebo úplnou eliminací molekul, na které toxiny působí (OLIVER a SOLOMON, 2010). Situace tedy připomíná koncept „gen proti genu“, jen s obrácenými rolemi. 2.3.1 Hypersenzitivní reakce Efektory vyvolaná imunita se velmi často projevuje tzv. hypersenzitivní reakcí (HR). V tomto rostlinou řízeném procesu odumírají buňky v bezprostřední blízkosti patogena a vytvářejí se tak mikroskopické až okem viditelné ostrůvky nekrotického pletiva, ve kterých zůstává patogen uvězněn. Z tohoto důvodu je hypersenzitivní reakce účinná především proti biotrofním patogenům. Nekrotrofové mohou naopak celý mechanismus využívat ve svůj prospěch. Pomocí efektorů spouštějících hypersenzitivní reakci usmrcují buňky hostitele a následně na nich parazitují (LORANG et al., 2007). Na rozdíl od apoptózy u živočichů, která je spouštěna jednou centrální signální drahou, je HR rostlin velmi rozmanitý pochod výrazně se lišící napříč patosystémy. Klíčové regulační prvky v tomto procesu jsou především reaktivní formy kyslíku (ROS), oxid dusnatý, kyselina salicylová a změna koncentrace Ca2+ v cytosolu. Propojení těchto prvků však není známo. Kromě buněčné smrti dochází při HR také k tvorbě značného množství sekundárních metabolitů s antimikrobiálními vlastnostmi (MUR et al., 2008).

8

2. Současný stav řešené problematiky 2.4 Rostlinné hormony a jejich signální dráhy řídící imunitní systém Pouhé rozpoznání patogena rostlinu před infekcí neochrání. Signál je od receptorů veden složitou spletí signálních drah, která zajistí přeprogramování transkriptomu. Baterie nových proteinů pak společným působením zabrání patogenu v infekci. Zatímco obě vrstvy imunitního systému jsou dobře odlišeny typem receptorů a molekul, které rozpoznávají, obranné mechanismy jsou pro obě složky totožné. Srovnání transkriptomických dat z rostlin ošetřených flagelinem a inokulovaných avirulentním patogenem ukázalo značný překryv v profilu indukovaných genů (NAVARRO et al., 2004). Podobně se i změny v transkriptomu rostlin ošetřených flagelinem z poloviny překrývají se změnami indukovanými chitinem, tedy molekulami pocházejícími ze zcela odlišných skupin patogenů (SCHWESSINGER a ZIPFEL, 2008). Klíčovou roli v přenosu signálu od receptorů hrají rostlinné hormony, zejména kyselina salicylová, etylén a kyselina jasmonová (PIETERSE et al., 2009). 2.4.1 Kyselina salicylová a Systémově získaná rezistence Kyselina salicylová (SA) je v rostlinách indukována zejména při napadení biotrofními patogeny a exogenní aplikace SA zvyšuje rezistenci rostlin proti této skupině patogenů (GLAZEBROOK, 2005). SA je v rostlinách syntetizována z isochorismátu, jehož syntéza je katalyzována enzymem isochorismát syntázou kódovanou v Arabidopsis dvěma geny ICS1 a ICS2. První z dvojice je indukován patogeny a je zřejmě zodpovědný za tvorbu většiny SA v rostlině (GARCION et al., 2008). Receptor, na který se SA váže, nebo jiný mechanismus vedoucí signál dále po své kaskádě zatím není znám. Avšak byla nalezena hlavní molekula regulující genovou expresi v odpovědi na SA. Protein NPR1 (NONEXPRESSOR OF PR GENES1) se za normálních podmínek nachází v cytosolu jako oligomer spojený disulfidickými můstky. Při zvýšení hladiny SA dojde zatím neznámým způsobem ke změně redoxního potenciálu, což způsobí redukci oligomeru NPR1 na monomerní formu. Při tom dojde k obnažení jaderného lokalizačního signálu, který nasměruje molekulu do jádra, kde interaguje s TGA transkripčními faktory (MOUA et al., 2003). Jejich přímým cílem jsou mimo jiné i WRKY transkripční faktory, které jsou zodpovědné za změnu exprese mnoha genů v odpovědi na SA. Protože se jedná o rodinu 74 genů, mnoho z nich je redundantních a je tedy těžké určit jejich funkci pomocí zkoumání rostlin s mutacemi v jednotlivých genech. Jsou mezi nimi ale i výjimky. Recesivní mutanti wrky18 a wrky58 mají slabší odezvu na ošetření induktorem rezistence benzothiadiazolem, z čehož vyplývá, že jsou pozitivními regulátory SA (WANG et al., 2006). Naproti tomu mutanti wrky38 a wrky62 mají zvýšenou expresi SA dependentních genů a zvýšenou rezistenci, tudíž se jedná o negativní regulátory SA signální dráhy (KIM et al., 2008). S kyselinou salicylovou je přímo spojen i fenomén Systémově získané rezistence. Právě při jejím studiu byla SA objevena. Rostliny po inokulaci zpravidla avirulentním patogenem 9

2. Současný stav řešené problematiky mohou i v částech vzdálených od místa inokulace vykazovat značnou míru rezistence k virulentním patogenům. Taková rezistence pak může v rostlinách přetrvávat po dlouhou dobu. Jméno tento jev získal na základě publikace z roku 1961 (ROSS, 1961), ale popsán byl již na počátku století, jak bylo zmíněno dříve. Pro aktivaci SAR je nezbytná SA a průběh SAR koreluje se syntézou PR-proteinu, o kterých se předpokládá, že se na této formě rezistence podílejí. Nejzajímavější otázkou SAR je signál, který zajištuje systémové šíření. Původně za něj byla považována SA, avšak toto tvrzení bylo experimentálně vyvráceno (DURRANT a DONG, 2004). Screening mutantů neschopných indukce SAR odhalil gen DIR1, který kóduje lipid-transferový protein (MALDONADO et al., 2002). Zdálo se, že signální molekulou tedy musí být lipid, ale od zveřejnění objevu v roce 2004 nebyla publikována žádná navazující práce. Nedávno byla nalezena devítiuhlíkatá dikarboxylová kyselina, jež se v rostlinách vytváří po napadení avirulentním patogenem. Tato látka se systémově šíří a indukuje rezistenci k patogenům. Nicméně neindukuje syntézu SA v rostlině a nemůže tedy být považována za systémový signál. S největší pravděpodobností se ale jedná o dílčí komponent SAR (JUNG et al., 2009). Manipulace SAR, ať již geneticky či chemicky, v sobě skrývá velký potenciál jako součást ochrany rostlin v zemědělství. 2.4.2 Kyselina jasmonová Kyselina jasmonová (JA) je indukována především nekrotrofními patogeny a herbivory (GLAZEBROOK, 2005; BROWSE a HOWE, 2008). Prekurzorem JA je kyselina α-linolenová, která

vzniká

hydrolýzou

membránových

fosfolipidů

katalyzovanou

fosfolipázou

A.

Mechanismus spouštějící tuto reakci zatím není znám. První část metabolické dráhy vedoucí k JA probíhá v chloroplastech a je katalyzována enzymy lipoxygenázou (LOX), allenoxid syntázou (AOS) a allenoxid cyklázou (AOC). Tyto enzymy jsou pravděpodobně regulačním místem signální dráhy JA, zejména pak AOS, která je v A. thaliana kódována jediným genem a je indukována patogeny i samotnou JA. Mutace v tomto genu zcela zablokuje produkci JA a vede k pylové sterilitě (PARK et al., 2002). Centrálním regulačním uzlem v signální dráze JA je COI1 (CORONATINE INSENSITIVE 1). Tento protein byl identifikován již počátkem 90. let, až nedávno bylo odhaleno, že je receptorem JA, přesněji jejích konjugátů s aminokyselinami. Navázáním konjugátu JA na COI1 dojde k zformování ubikvitinačního komplexu s dalšími proteiny. Následná označení transkripčních represorů z rodiny JAZ proteinů a jejich degradace proteazomem vede ke spuštění transkripce JA dependentních genů. Protože u žádného z 12 JAZ proteinů A. thaliana nebyla identifikována DNA vázající doména, předpokládá se, že expresi regulují nepřímo přes jiné transkripční faktory (KATSIR et al., 2008). Nedávno byl popsán ještě další nečekaný účastník této interakce. Pro navázáni konjugátu JA na COI1 je nezbytný inositol-5-fosfát (SHEARD et al., 2010).

10

2. Současný stav řešené problematiky Transkriptom signální dráhy JA má nejméně dvě oddělené větve. První z nich reguluje obranné mechanismy v reakci na nekrotrofní patogeny, metabolizmus tryptofanu a je charakteristická expresí markerových genů Pdf1.2 a HEL. Druhá větev reguluje obranné mechanismy proti herbivorům a oxidativnímu stresu, syntézu flavonoidů a antokyanů, inhibici růstu kořenů a je charakteristická expresí markerového genu VSP2. Transkripční faktor MYC2 negativně reguluje první větev a pozitivně druhou. Naopak transkripční faktor ERF1 řízený etylénem reguluje obě dráhy opačným způsobem (LORENZO et al., 2004). MYC2 v in vitro podmínkách interaguje s JAZ3 proteinem. Z toho vyplývá, že MYC2 je za normálních okolností reprimován JAZ3. Podobným mechanismem je pravděpodobně řízena většina procesů souvisejících se signální dráhou kyseliny jasmonové (CHICO et al., 2008). Výsledky TSAI et al. (2011) však činí celou situaci komplikovanější. Induktor rezistence kyselina βaminomáselná (BABA) v rostlinách zablokuje působení bakteriálního efektoru koronatinu. Tento efektor napodobuje konjugát JA s isoleucinem (JA-Ile), nejaktivnější formu JA, a v rostlinách tak indukuje silnou expresi genů regulovaných JA signální dráhou. Doposud se zdálo, že účinek koronatinu a JA-Ile je naprosto stejný. Avšak BABA nedokáže zablokovat působení různých forem JA. Zdá se tedy, že aktivace signální dráhy JA může mít mnoho odlišných výstupů v závislosti na interakci různých forem JA s některým z JAZ proteinů a také na modulaci ostatními signálními drahami. 2.4.3 Etylén Plyn etylén (ET) je považován za hormon, který při obranných reakcích rostliny kooperuje s JA a společně antagonizují signální dráhu SA. Tento model je však zjednodušený a existují i opačné případy kooperace s SA. Etylén tedy „ladí“ obranné mechanismy v závislosti na organismu, který rostlinu napadá a podílí se tak na obraně proti všem skupinám patogenů i škůdců (BROEKAERT et al., 2006). Nejvíce prostudovaná je však společná aktivace signálních drah ET s JA při napadení nekrotrofními patogeny (GLAZEBROOK, 2005). Signální dráha ET je stejně jako v případě SA a JA regulována zejména na úrovni syntézy hormonu. Výchozí látkou je metionin, který je přes meziprodukt S-adenozylmetionin konvertován na 1-aminocyklopropankarboxylovou kyselinu (ACC). Enzym katalyzující druhý krok reakce je ACC syntáza (ACS) (ARGUESO et al., 2007). V A. thaliana je kódován 9 geny (TSUCHISAKA et al., 2009). To je velký kontrast v porovnání s jedním genem regulujícím syntézu SA i JA. Syntéza ET je regulována právě skrz tento enzym a to na transkripční i proteinové úrovni. Exprese genů ACS je specificky indukována různými faktory. Gen ACS2 vykazuje vysokou expresi po napadení nekrotrofními patogeny (BROEKAERT et al., 2006). Stabilita proteinů je regulována fosforylací kinázami MPK6 a CDPK (ARGUESO et al., 2007). ACS je aktivní jako dimer. Jednotlivé proteiny mezi sebou vytváří 45 různých homo- a hetrodimerů z nichž 25 je aktivních (TSUCHISAKA et al., 2009). K čemu rostlině slouží takto složitý regulační systém,

11

2. Současný stav řešené problematiky nazývaný autory „symfonický orchestr“, není jasné. Vrcholným kouskem této publikace bylo vytvoření rostliny A. thaliana s mutacemi v 8 genech ACS. Protože se různými postupy nepodařilo vytvořit mutanta ve všech genech pravděpodobně kvůli jeho embryonální letalitě, spekuluje se, že samotná ACC by mohla v rostlinách působit jako biologicky aktivní látka. ET totiž není pro rostlinu životně důležitý (TSUCHISAKA et al., 2009). ET se v membráně endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu váže na receptory, které přímo interagují s centrálním negativním regulátorem signální dráhy etylénu CTR1. Tato kináza negativně reguluje další dva v kaskádě uspořádané regulační proteiny EIN2 a EIN3. O proteinu EIN2 není známo takřka nic. EIN3 je klíčový transkripční faktor, řídící expresi mimo jiné i ERF1, o němž byla řeč dříve (KENDRICK et al., 2008). Pro zajímavost, aktivita kinázy CTR1 a její interakce s receptory etylénu je inhibována kyselinou fosfatidovou, o níž se diskutuje jako o významné signální molekule, avšak doposud bylo nalezeno jen málo přímých důkazů. Význam fosfolipidů v signální dráze ET není jasný, autoři pouze spekulují o roli kyseliny fosfatidové v iniciaci celé kaskády ET (TESTERINK et al., 2007). 2.4.4 Interakce mezi signálními drahami a další hormony Jak již bylo několikrát podotknuto, obranné signální dráhy neoperují samostatně, nýbrž se vzájemně pozitivně i negativně regulují. Dosavadní informace o propojení jednotlivých signálních drah jsou jen útržkovité a mnoho z nich si i vzájemně odporuje. Robustní analýza celého signálního komplexu, která byla provedena např. na dendritických buňkách myši (AMIT et al., 2009), u rostlin neexistuje. V této složité síti mají svou nezastupitelnou roli i auxiny, kyselina abscisová a další rostlinné hormony (PIETERSE et al., 2009). Hlubší náhled na tuto problematiku je mimo rámec této práce a dále je pojednáno jen o jednom konkrétním případu interakce mezi signálními drahami SA a JA, vztahující se částečně k této práci. Exprese markerových genů signální dráhy JA je inhibována ošetřením SA nebo při infekci biotrofním patogenem. Tento mechanismus je konzervovaný u 18 různých ekotypů A. thaliana, závisí na NPR1 proteinu a je spojen se změnami redoxního potenciálu (KOORNNEEF et al., 2008). Transkripční faktor WRKY70 je indukovaný SA a reprimovaný JA. Časná indukce tohoto genu je nezávislá na NPR1, ale pro maximální expresi je tento protein nezbytný.

Konstitutivní

SA-dependentních

genů

exprese a

WRKY70

naopak

jeho

má

za

následek

zvýšenou

expresi

umlčení

způsobí

zvýšenou

expresi

JA-dependentních genů (LI et al., 2004b). Mechanismus vzájemné interakce SA a JA by se tedy zdál být vyřešen, avšak velkou nejasnost do něj vnáší fakt, že pro potlačení JA není nezbytná monomerizace NPR1 (KOORNNEEF et al., 2008).

12

2. Současný stav řešené problematiky 2.5 Indukovaná rezistence a priming Ošetření rostlin patogenními i nepatogenními organismy, látkami pocházejícími z živých organismů, i chemikáliemi může v rostlinách vyvolat rezistenci. Zpravidla nedochází k úplné eliminaci patogena, ale k zmírnění příznaků choroby (HAMMERSCHMIDT, 1999). Tato ošetření zasahují na nejrůznějších místech do obranného systému rostliny. Mohou se vázat na receptory, spouštět nebo blokovat signální dráhy, mimikovat signální molekuly. Jejich účinek se může projevit aktivací stejných obranných mechanismů, jako vyvolává napadení patogenem. Metoda ochrany rostlin založená na stimulaci obranných mechanismů se označuje jako Indukovaná rezistence. Při studiu molekulárních mechanismů mnoha induktorů rezistence často nebyla pozorována indukce většího počtu genů i přes zjevný biologický účinek ošetření. Avšak při následné infekci patogenem došlo u rostlin ošetřených induktorem k rychlejší a intenzivnější obranné reakci. K tomuto fenoménu dochází jak po ošetření některými chemickými induktory, tak při indukci rezistence nepatogenními půdními bakteriemi a bývá označován termínem „priming“ (BECKERS a CONRATH, 2007). Předpokládá se, že priming je založen na akumulaci nebo aktivaci několika málo regulačních uzlů, které nejsou schopny spustit obrannou reakci, ale při napadení patogenem umožní rychlejší odezvu. Jedním z příkladů jsou kinázy MPK3 a MPK6. Po ošetření induktory dochází k jejich zvýšené expresi, ale vzniklá kináza je inaktivní. Následná inokulace patogenem obě kinázy aktivuje. Rostliny s mutací v jednom nebo druhém genu jsou necitlivé k induktorům rezistence (BECKERS et al., 2009). Priming je přirozenou součástí obranného systému rostlin a uplatňuje se i na úrovni společenstev. Napadené rostliny mohou do svého okolí vypouštět těkavé signální molekuly, které spouštějí priming v jejích distálních částech i v okolních rostlinách (KESSLER et al., 2006). O induktorech rezistence bylo publikováno možná několik stovek prací zahrnujících širokou paletu látek od anorganických solí, přes nízkomolekulární organické látky, makromolekuly až po celé organismy. Jejich vyčerpávající přehled je uveden v přehledných článcích SCHREIBER a DESVEAUX (2008) a KÚC (2001) Praktické využití indukované rezistence je zatím u svého zrodu. V četných pokusech mnoho látek i mikroorganizmů průkazně snižovalo napadení patogeny, avšak ne vždy se tento efekt odrazil na výnosu, protože mnoho induktorů působí při účinných koncentracích fytotoxicky (VALLAD a GOODMAN, 2004). 2.5.1 Benzothiadiazol a kyselina β-aminomáselná Komerčně nejúspěšnějším induktorem je bezesporu benzothiadiazol (BTH). Tato látka působí buď jako funkční analog SA, nebo níže v signální kaskádě SA. Každopádně obě látky indukují shodné obranné mechanismy, ale BTH působí při podstatně nižší koncentraci (LAWTON et al., 1996). BTH v podobě komerčního produktu je pod různými názvy prodáváno po celém světě a jeho účinnost byla testována na nejrůznějších rostlinách proti všem 13

2. Současný stav řešené problematiky skupinám patogenů (VALLAD a GOODMAN, 2004). Další látkou, do které jsou vkládány velké naděje, je kyselina β-aminomáselná (BABA). Mechanismus jejího účinku je obtížně uchopitelný, protože v závislosti na rostlině a patogenu jsou vyžadovány různé komponenty signálních drah. Tato látka funguje na principu primingu. V rostlinách, které byly pouze ošetřeny, lze pozorovat jen velmi slabou aktivaci obranných mechanismů. Avšak po inokulaci patogenem dojde mnohem silnější reakci rostliny, než v neošetřených rostlinách (ZIMMERLI et al., 2000). Mechanismus rezistence indukované BABA proti B. cinerea spočívá v primingu SA signální dráhy. Ošetřené rostliny reagují na infekci B. cinerea vyšší expresí SA markerového genu PR-1. V mutantních rostlinách s narušenou SA signální dráhou je ošetření BABA neúčinné. Překvapivě nejsou nezbytné signální dráhy ET a JA (ZIMMERLI et al., 2001). B. cinerea je typickým zástupcem nekrotrofních patogenů, proti nimž působí obranné mechanismy regulované právě ET a JA (GLAZEBROOK, 2005). BABA působí v A. thaliana i proti dalším dvěma nekrotrofům, Alternaria alternata a Plectosphaerella cucumerina. V tomto případě není vyžadována ani funkční signální dráha SA. Avšak k indukci nedocházelo v rostlinách s mutacemi v regulátorech signální dráhy kyseliny abscisové. Exogenní aplikace ABA působila podobně jako BABA a obě látky výrazně zvyšovaly intenzitu ukládání kalózy v infikovaném pletivu (TON a MAUCH-MANI, 2004). Více světla vrhl na celou záležitost screening T-DNA mutagenizovaných rostlin. BABA vyvolává při vysokých koncentracích sterilitu rostlin. Mezi 90.000 mutantními rostlinami byly identifikovány tři rostliny s mutacemi v různých genech, které zůstaly i po ošetření fertilní. Mutant ibs1 má inzerci v genu kódujícím protein podobný cyklin-dependentní kináze a nedochází u něj k primingu SA signální dráhy. Mutant ibs2 je narušen v genu AtSAC6 kódujícím polyfosfoinositol fosfatázu a mutant ibs3 je deficientní v ABA1, klíčovém enzymu biosyntézy kyseliny abscisové. U mutantů ibs2 a ibs3 pro změnu nedocházelo k primingu kalózy a k zvýšené odolnosti k solnému stresu po ošetření BABA (TON et al., 2005). Na základě těchto výsledků se zdá, že BABA na rostliny působí dvěma oddělenými mechanismy. O šest let později se objevil mechanismu třetí. TSAI at al. (2011) zjistili, že BABA brání bakteriálním efektoru koronatinu v otevření průduchů napadené rostliny. Jednoduchým vysvětlením by byl antagonizmus SA signální dráhy stimulované BABA vůči JA signální dráze, skrz kterou koronatin působí. Avšak BABA blokovala otevírání průduchů i v rostlinách narušených v třech různých uzlech SA signální dráhy. 2.6 Kvantitativní rezistence Při šlechtění rostlin se kromě monogenní rezistence využívá i tzv. rezistence kvantitativní (QDR), jejíž fenotyp je dán působením vícero genů. Svým polygenním založením je QDR stálejší než kvalitativní, protože při překonání jednoho genu se nevytváří tak silný selekční

14

2. Současný stav řešené problematiky tlak na populaci patogena. POLAND et al. (2009) navrhují několik hypotéz o mechanismech účinku QDR. Geny podílející se na QDR mohou regulovat vývoj a morfologii rostlin. Mezi tyto faktory patří rychlost vývoje, četnost a tvar průduchů, velikost, tvar a úhel nasazení listů nebo výška rostliny. Jiné geny mohou být součástí imunity vyvolané MAMPs, neboť fenotyp mutací v FLS2 a CERK1 se projevuje jen jako částečné snížení odolnosti k patogenům. Takovéto mutace mohou být přítomny i v odrůdách, kde je jejich fenotyp maskován přítomností genu rezistence. Další možností je, že některé QDR geny mohou být zodpovědné za syntézu toxických sekundárních metabolitů nebo naopak za odbourávání toxinů produkovaných patogenem. QDR geny by mohly být i součástí obranných signálních drah. V rostlinách A. thaliana bylo popsáno několik mutací v regulátorech signálních drah, které ovlivnily rezistenci k patogenům. QDR může být založena také na „slabších“ genech rezistence. U několika rostlin se lokusy QDR nacházely v blízkosti genů rezistence. Nedávno byly identifikovány dva geny z lokusů QDR proti rzím u pšenice. Jedním z nich je ABC transportér s vysokou homologií k PEN3 z A. thaliana. Tento protein se pravděpodobně podílí na transportu sekundárních metabolitů (KRATTINGER et al., 2009). Druhým genem je domnělá kináza s lipid-transferovou doménou. Tento gen není součástí genomu současně pěstovaných odrůd pšenice a předpokládá se, že má velký potenciál posílit rezistenci k Puccinia striiformis (FU et al., 2009) 2.7 Brassica napus a Leptosphaeria maculans Brukev řepka olejka (Brassica napus) společně s dalšími druhy rodu Brassica tvoří jednu z nejvýznamnějších skupin olejnin na světě a je i dominantní olejninou pěstovanou v České republice (POTMĚŠILOVÁ a ADAMEC, 2004). Leptosphaeria maculans je heterotalická, bipolární askomyceta, jejíž anamorfa Phoma lingam byla v polovině 19. století popsána jako původce choroby mnoha brukvovitých rostlin. Na základě agresivity byly izoláty řazeny do dvou skupin. Později byla skupina méně agresivních izolátů vyčleněna jako samostatný druh Leptosphaeria biglobosa (SHOEMAKER a BRUN, 2001). Přestože již v době svého objevu působil tento patogen mnoho škod na brukvovitých plodinách, více pozornosti se mu dostalo až v polovině minulého století, kdy se řepka stala dominantní olejninou v mnoha zemích světa. Epidemie fomové suché hniloby v 60. a 70. letech 20. století vedly téměř k zániku pěstování řepky v Austrálii a k velkým škodám v Severní Americe a Evropě (WEST et al., 2001). 2.7.1 Infekční cyklus L. maculans Infekce hostitele probíhá na podzim, kdy dochází k pohlavnímu rozmnožování jedinců L. maculans přežívajících na posklizňových zbytcích v půdě. Z plodniček se uvolňují askospory, které infikují děložní a pravé listy hostitelské rostliny. Rostoucí hyfy penetrují průduchy 15

2. Současný stav řešené problematiky a kolonizují mezibuněčné prostory uvnitř listu. Po několika dnech začne infikované pletivo nekrotizovat a ve vzniklých lézích se utvářejí pyknidy, jež jsou zdrojem sekundárního inokula. Následně patogen kolonizuje cévní svazky a zcela asymptomaticky prorůstá přes řapík a stonek až do kořenového krčku. Ke konci vegetace se na kořenovém krčku a stonku objevují nekrózy a v extrémním případě způsobí poléhání a předčasnou zralost rostlin. Po sklizni přežívá patogen na zbytcích rostlin a intenzivně je kolonizuje. V půdě může přežívat i několik let. Uvedený životní cyklus platí zejména pro Evropu a v ostatních částech světa se může výrazně lišit v závislosti na klimatických podmínkách a způsobu pěstování řepky (WEST et al., 2001). 2.7.2 Genetika rezistence B. napus k L. maculans Rezistence k časným fázím infekce L. maculans je založena monogenně, zatímco ve stádiu nekrózy kořenového krčku se uplatňuje polygenní rezistence. Právě monogenní rezistence se v minulosti stala hlavním nástrojem ochrany řepky před L. maculans, avšak ukázala se jako velmi nestálá. L. maculans rezistenci rychle překonává díky eliminaci genů avirulence v populaci patogena (ROUXEL a BALESDENT, 2005). Doposud bylo nalezeno 11 genů rezistence a 9 korespondujících genů avirulence (AvrLm1-9). Tři geny avirulence, AvrLm1 (GOUT et al., 2006), AvrLm6 (FUDAL et al., 2007) a AvrLm4-7 (PARLANGE et al., 2009), byly naklonovány. Všechny tři kódují malé proteiny s neznámou funkcí a predikovanou sekrecí z buňky. Vykazují konstitutivní expresi s nárůstem v počátečních fázích infekce. Nacházejí se v izolovaných lokusech obklopených nekódujícími sekvencemi repetetivní DNA. AvrLm1 je jediný gen v úseku 269 kb. Na stejně dlouhém úseku chromozomu se v A. thaliana nachází v průměru 46 genů. Rezistence založená na Rlm1 byla ve Francii překonána během tří let. Analýza 290 avrLm1 izolátů z celého světa nalezla u 90 % z nich podobnou, 260 kb dlouhou deleci a to i v izolátech pocházejících z doby před pěstováním Rlm1 odrůd. To potvrzuje domněnku, že překonání rezistence není založeno na nově vzniklých mutacích v Avr genech, ale pouze na rozšíření již existujících virulentních populací (GOUT et al., 2007). Produkt genu AvrLm4-7 je rozpoznáván nezávisle dvěma R-geny Rlm4 a Rlm7. Bodová mutace v AvrLm4-7 způsobila, že protein není nadále rozpoznáván proteinem Rlm4, avšak rozpoznání proteinem Rlm7 zůstalo zachováno (PARLANGE et al., 2009). AvrLm4-7 je pravděpodobně rozpoznáván přímo, protože kdyby byl rozpoznáván produkt jeho katalytické aktivity, musela by mutace způsobit i ztrátu specifity Rlm7. Lze se domnívat, že protein AvrLm4-7 je pro L. maculans nezbytný, a proto nebylo možné překonat rezistenci delecí celého genu jako v případě AvrLm1. Tuto myšlenku potvrzují i výsledky HUANG et al. (2010). Ztráta genu AvrLm4-7 vede ke značnému snížení schopnosti infikovat náchylné rostliny (bez genů Rlm4 a 7). Ztráta AvrLm1 má také analogický efekt, ale výrazně slabší. Tento fakt zároveň potvrzuje předpoklad, že geny avirulence AvrLm1 a AvrLm4-7 jsou efektory

16

2. Současný stav řešené problematiky napomáhající infekci. Nedávno byl odhalen fascinující mechanismus, který L. maculans využívá, aby unikla rozpoznání geny rezistence. Zároveň tento objev popírá výše uvedené tvrzení o mechanismech eliminace genů avirulence z populace patogena. VAN DE WOUW et al. (2010) porovnávali australské izoláty L. maculans z období kolem roku 2003, kdy v Austrálii došlo k prolomení rezistence založené na Rlm1. Zjistili, že kromě překonání rezistence založené na Rlm1 došlo i k překonání Rlm6, ačkoliv tento gen nebyl v odrůdách přítomný a tudíž na AvrLm6 nepůsobil selekční tlak. V izolátech odebraných po roce 2004 byly v genech AvrLm1 i AvrLm6 nalezeny bodové mutace, které nebyly detekovány v žádném ze 137 izolátu získaných před rokem 2003. Oba geny se společně s 5 dalšími nachází v jedné oblasti s bohatým zastoupení retrotranspozonů. Tyto elementy jsou cílem aparátu specifického pouze pro askomycety, který skrz metylaci nukleotidů indukuje bodové mutace. L. maculans zřetelně využívá tohoto atypického prostředí na chromozomu k indukci mutací v genech avirulence a nesmírným způsobem tak zrychluje jejich evoluci. Ve snaze vyšlechtit odrůdy se stabilnější rezistencí k L. maculans se v posledních letech využívá stále více kvantitativní rezistence. Několik odrůd, zejména Darmor a Jet Neuf, vykazují vysoký stupeň rezistence i při napadení virulentním izolátem (DELOURME et al., 2006). Jak již bylo zmíněno dříve, kvantitativní rezistence k L. maculans se projevuje až ve velmi pozdních fázích infekce, kdy dochází ke kolonizaci kořenového krčku. V průběhu podzimní infekce není mezi odrůdami s nízkou a vysokou úrovní kvantitativní rezistence rozdíl ani v počtu lézí, ani v množství mycelia v pletivu. Rozdíl v intenzitě kolonizace pletiva se objevuje až během dlouhé asymptomatické fáze kolonizace stonku (HUANG et al., 2009). Tato skutečnost komplikuje studium mechanismů podílejících se na kvantitativní rezistenci i samotné šlechtění, protože selekci je možné provádět až po sklizni hodnocením napadení kořenových krčků nebo během jarní vegetace metodou kvantifikace mycelia pomocí PCR (HUANG et al., 2009) 2.7.3 Obranné mechanismy podílející se na rezistenci k L. maculans Zatímco genetika rezistence B. napus k L. maculans je již dlouhou dobu intenzivně studována, o molekulárních mechanismech zprostředkujících rezistentní projev se neví takřka nic. Při obraně rostlin řepky proti L. maculans má důležitou úlohu signální dráha kyseliny salicylové. Ošetření rostlin benzothiadiazolem a preinokulace avirulentní bakterií zvyšuje odolnost rostlin jak k bakterii Pseudomonas syringae pv. maculicola, tak k L. maculans. Tento účinek trvá nejméně tři týdny. V obou případech byla zvýšená odolnost spojená s indukcí genů PR-1 a PR-2. Transgenní rostliny nesoucí bakteriální gen pro salicylát hydroxylázu, enzym hydrolyzující SA na katechol, nereagovaly na ošetření ani zvýšenou expresí, ani odolností vůči napadení (POTLAKAYALA et al., 2007). Mnohem více informací pochází ze studií na modelové rostlině Arabidopsis thaliana. Ze 168 testovaných

17

2. Současný stav řešené problematiky ekotypů L. maculans vykazuje mírné příznaky náchylnosti pouze jediný (An-1). Ani mutace v signálních dráhách SA, JA a ET nenarušují rezistentní fenotyp rostlin (BOHMAN et al., 2004). Křížením rezistentních ekotypů Col-0 a Ler byl získán jedinec náchylný k L. maculans zastoupený v F2 populaci v poměru 1:15, což indikovalo přítomnost dvou různých genů zodpovědných za rezistenci, z nichž každý byl přítomný pouze v jednom z ekotypů. Následným mapováním byly tyto geny identifikovány jako typické geny rezistence se strukturou NB-LRR, označené RLM1 a RLM2. Rezistence řízená těmito geny je založena především na depozici kalózy. Když byly do rostlin rlm1/rlm2 introdukovány mutace v uzlech signálních drah SA, ET a JA, byl podíl těchto drah na rezistenci již patrný. Signální dráha SA se neúčastní obranných reakcí ani v genetickém pozadí rlm1/rlm2, zatímco dráha JA se zdá být klíčovou. Mutace v hlavním regulátoru dráhy JA coi1 způsobila extrémně náchylný fenotyp. Naproti tomu ET reguluje obranné reakce negativně. Introdukce mutace ein2 do mutantů coi1 výrazně zmírnila náchylnost rostlin (PERSSON et al., 2009). Do rezistence A. thaliana k L. maculans je zapojena i signální dráha kyseliny abscisové. Několik mutantů s narušnou signalizací v této dráze vykazuje náchylný fenotyp i v genetickém pozadí ekotypu Col-0. (KALIFF et al., 2007) Od roku 2011 patří L. maculans mezi úzkou skupinu patogenů rostlin se známým genome (Rouxel et al., 2011).

18

3. Cíle

3. Cíle V této práci jsme chtěli odhalit molekulární mechanismy řídící rezistenci rostlin B. napus k patogenu L. maculans. Analýzou rostliných hormonů, sledováním genové exprese a farmakologickými experimenty jsme se pokusili identifikovat signální dráhy, které hrají klíčovou roli v regulaci obranných reakcí vyvolaných rozpoznáním genu avirulence AvrLm1. Pomocí reportérových genů a molekulárních metod kvantifikace patogena jsme chtěli detailně porovnat průběh infekce při kompatibilní a inkompatibilní interakci řepky s L. maculans. Současně jsme se snažili izolovat další látky produkované L. maculans, které rostlina rozpoznává a reaguje na ně aktivací obranných mechanismů. Druhým dílčím úkolem byl screening širokého spektra látek, které by řepce mohly indukovat rezistenci k L. maculans i dalším patogenům, s cílem praktického využití. Inokulačními testy v laboratorních podmínkách jsme testovali extrakty z rostlin, známé chemické induktory, či odpadní produkty potravinářského a kožedělného průmyslu. Poznatky získané ze studia interakce L. maculans s B. napus jsme chtěli využít pro objasnění mechanismu působení nalezených účinných látek.

19

4. Metody

4. Metody 4.1 Rostliny a Leptosphaeria maculans Rostliny řepky Brassica napus byly pěstovány hydroponicky v perlitu AGRO (Perlit Praha s.r.o.) a Steinerově živném roztoku (STEINER 1984) v režimu 14 hodin den (150 µE.m2.s-1, 23 °C), 10 hodin noc (18 °C). Semena odrůdy Columbus poskytla firma Dekalb a odrůdy Westar a Hanna prof. Christina Dixelius (SLU Uppsala, Švédsko). Veškeré rostliny pro pokusy, ve kterých byly srovnávány izoláty JN2 a JN3, byly pěstovány v kultivačním boxu AR-36L3 (PERCIVAL) se stálou relativní vlhkostí 65 %. Pro ostatní pokusy byly rostliny pěstovány v kultivační místnosti bez řízené vlhkosti, která se pak pohybovala mezi 30-70 %. Rostliny Arabidopsis thaliana Col-0 byly pěstovány v rašelinových tabletách Jiffy 7 v režimu 8 hodin den (250 µE.m2.s-1, 22 °C), 16 hodin noc (22 °C) v kultivačním boxu AR-36L3 (PERCIVAL) se stálou relativní vlhkostí 65 %. Izoláty Leptosphaeria maculans JN2 (v23.1.2) a JN3 (v23.1.3) poskytl Dr. Thierry Rouxel (INRA, Francie). Jejich charakteristika je popsána v Balesdent et al. (2001). Izolát hon č.40 poskytla Ing. Eva Plachká (VÚOl Opava). Životaschopnost izolátů byla zvýšena krátkodobou kultivací na děložním listu sterilně pěstované řepky položeném na plotně s agarem V8. Pro přípravu inokula bylo mycelium krátkodobě kultivováno na zpevněném živném médiu ze zeleninové šťávy V8. Příprava spor vychází z publikované metody (ANSAN-MELAYAH et al., 1995). Agar V8 s mladým myceliem byl nejprve rozmačkán skleněnou lopatkou a poté rozetřen na nové plotně s V8 agarem v co nejtenčí vrstvě. Následně byly plotny zalepeny prodyšnou chirurgickou páskou a inkubovány v kultivačním boxu při stejných podmínkách, jaké byly použity pro kultivaci řepky. Po 6 dnech byla chirurgická páska nahrazena parafilmem, aby nedošlo k úplnému vyschnutí agaru. Po 11 dnech byly plotny za sterilních podmínek převrstveny vodou a spory byly z pyknid uvolněny třením skleněnou lopatkou. Suspenze byla poté zfiltrována přes několik vrstev gázy do sterilní 50 ml zkumavky a doplněna vodou do 50 ml. Kvůli odstranění fytotoxických látek byla suspenze odstředěna 10 min při 1000 g a supernatant byl nahrazen 20 ml sterilní vody. Koncentrace spor byla spočítána v Bürkerově komůrce a suspenze byla naředěna na konečnou koncentraci 108 spor/ml. Spory určené k inokulaci rostlin byly uchovávány při -20 °C po dobu nejdéle 6 měsíců. Spory pro inokulaci tekutého média a dlouhodobé uchování izolátů byly zmraženy v 20 % glycerolu a uloženy v -70 °C. Před prvním použitím spor byla vždy ověřena jejich virulence na děložních listech řepky. Agar V8 zeleninová šťáva V8 CaCO3 agar celkový objem

200 ml 3 g 20 g 1000 ml

20

4. Metody 4.2 Transformace Leptosphaeria maculans Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformované konstruktem pSO1 nesoucí gen pro β-glucuronidázu (GUS) poskytl Dr. Shinichi Oide (PERSSON et al., 2009). Konstrukt pCAMBgfp nesoucí gen pro sGFP poskytla Dr. Ane Sesma (SESMA a OSBOURN, 2004). Transformace izolátů L. maculans byla provedena agrobakteriem přesně podle protokolu z laboratoře prof. Barbary Howlett (viz příloha č. 1). Oba konstrukty nesou gen pro rezistenci k hygromycinu, pomocí něhož byla provedena selekce. Vyrostlí transformanti byli přeneseni na nové plotny obsahující hygromycin B (50 μg/ml) a cefotaxim (200 μg/ml), aby se definitivně vyloučila kontaminace agrobakteriem. 4.2.1 Ověření transformantů s GUS V případě konstruktu GUS byly segmenty vykrojené z kultury transformantů na agaru V8 inkubovány

s barvícím

roztokem

obsahujícím

substrát

X-Gluc

(X-GLUC

DIRECT)

v plastových zkumavkách při 37 °C metodou modifikovanou podle SCHWEIZER et al. (1999).

Barvící roztok pro GUS X-Gluc rozpustit v DMF DMF 10 % Triton X-100 0,5 M EDTA pH 8,0 ferikyanid draselný ferokyanid draselný 1 M fosfátový pufr pH 7,0 metanol voda

15 0,6 0,3 0,6 49 63 3 6 19,5

mg ml ml ml mg mg ml ml ml

4.2.2 Ověření transformantů s GFP Segmenty agaru V8 s transformanty nesoucími sGFP byly kultivovány v tekutém médiu Fries po dobu 7 dnů. Narostlé mycelium bylo homogenizováno v mikrozkumavce pomocí plastového mikrohomogenizátoru a extrakčního pufru (30 mM Tris–HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl; a 5 mM DTT). Supernatant byl převeden do černé opakní mikrotitrační destičky a fluorescence byla stanovena pomocí fluorescenčního readeru Infinite F200 (Tecan) s použitím excitačního filtru 485/20 a emisního filtru 535/25 nm. L. maculans byla kultivována na plotnách V8 pokrytých celofánem, který zabrání prorůstání mycelia do agaru. Mycelium bylo seškrábáno kovovou špachtlí do mikrozkumavky a byla z něj pomocí kitu DNAzol (Molecular Research Center, Inc.; DN 127) dle instrukcí výrobce izolována DNA, která sloužila jako templát pro standardní PCR. Amplifikace byla provedena s kitem PCR Master Mix (Promega #M7501) a primery v konečné koncentraci 200 nM. Podmínky reakce byly 4 min při 94 °C počáteční denaturace, 30 cyklů: 10 s při 94 °C, 10 s při 55 °C a 30 s při 72 °C. Primery pro sGFP jsou uvedeny v Tab. 4. Produkty PCR byly 21

4. Metody separovány na 1,5 % agarózové elektroforéze a obarveny v roztoku 5 µl 1 % ethidium bromidu ve 100 ml deionizované vody. 4.2.3 Ověření přítomnosti genu avirulence AvrLm1 Suspenze spor obsahující 1,5x108 spor izolátů L. maculans JN2-GUS5 a JN2-GUS4 byla odstředěna 2 min při 13000 g. Pelet byl lyzován a použit jako templát pro PCR pomocí kitu Fast Tissue-to-PCR Kit (Fermentas; #K1099) dle instrukcí výrobce. Podmínky reakce byly 3 min při 95 °C počáteční denaturace, 35 cyklů: 30 s při 95 °C, 30 s při 55 °C a 30 s při 72 °C. Primery pro Tubulin a LmAvr1 jsou uvedeny v Tab. 4. Produkty PCR byly separovány na 2 % agarózové elektroforéze. 4.3 Ošetření induktory signálních drah Rostliny ve stáří 10 dnů byly ošetřeny postřikem na listy 32 µM benzothiadiazolem (BTH; komerční formulovaný přípravek Bion 50 WG obsahující 50 % účinné látky; Syngenta) a 5 mM

1-aminocyklopropankarboxylovou

kyselinou

(ACC;

Sigma-Aldrich;

#A3903).

2µl metyljasmonátu (MeJA; Sigma-Aldrich; #392707) byly smíchány s 18 µl etanolu a směs byla nanesena na smotek vaty umístněný společně s rostlinami v 20 l vzduchotěsném průhledném boxu. Listy pro analýzu exprese byly odebrány 24 hodin po ošetření a zmraženy v kapalném dusíku. 4.4 Inokulace rostlin patogenem Do děložních listů desetidenních rostlin byla pomocí 1 ml injekční stříkačky bez jehly infiltrována suspenze spor v koncentraci 105 spor/ml (pokud není uvedeno jinak) tak, aby byla celá plocha listu vyplněna kapalinou, což odpovídá zhruba 0,1 ml na list. Případně byly listy propíchnuty špendlíkem a na vpich bylo naneseno 10 μl suspenze spor v koncentraci 106 spor/ml. V obou případech byly 7 dní po inokulaci odstraněny pravé listy, aby nedošlo k senescenci děložních listů. 4.5 Kvantifikace kalózy v infikovaných listech Kalóza byla obarvena v 10 listových terčích o průměru 12 mm vykrojených z 10 rostlin pro každou variantu metodou vycházející z publikace CLAY et al. (2009). Všechny kroky probíhaly za stálého a mírného třepání. Pletivo bylo nejdříve fixováno v roztoku 3:1 etanol : ledová kyselina octová dokud se z terčů neodbarvil chlorofyl. V průběhu byl roztok jednou vyměněn. Poté byly terče rehydratovány 2 hodiny v 70 % etanolu, 2 hodiny v 50 % etanolu, 2 hodiny v 30 % etanolu a na závěr ponechány ve vodě přes noc. Ráno byly přeneseny do 10 % NaOH a inkubovány 2 hodiny při 37 °C. Následně bylo pletivo dvakrát promyto vodou a inkubováno nejméně 4 hodiny v roztoku 150 mM K2HPO4.(pH 9,5) obsahujícím 0,01 % anilinovou modř (Sigma-Aldrich; #415049). Poté byly terče přeneseny na podložní sklíčko s 50 % glycerolem jako montovacím médiem a přikryty krycím sklíčkem. Kalóza byla pozorována pod fluorescenčním mikroskopem Leica DM5000 B s použitím sestavy filtrů A 22

4. Metody (excitační filtr 360/40 nm, dichromatické zrcadlo a bariérový filtr 470/40 nm). Za těchto podmínek má obarvená kalóza intenzivní žlutozelené zbarvení. Z každého terče byly pořízeny náhodně 4 fotografie pomocí aplikace Leica IM50 při zvětšení 100x a konstantní délce expozice pro všechny snímky. V případě, že do zorného pole zasahovala silná žilnatina, která se intenzivně zbarvuje, bylo zorné pole změněno, aby nedošlo ke zkreslení výsledků. Kalóza byla kvantifikována jako počet žlutozelených pixelů na jednom snímku pomocí aplikace pro analýzu obrazu APS Assess 2.0. Prahování bylo nastaveno empiricky a vyhodnocení probíhalo v plně automatickém režimu, tak aby nedošlo k ovlivnění výsledků uživatelem. 4.6 Barvení peroxidu vodíku diaminobenzidinem (DAB) Histochemické barvení peroxidu vodíku bylo provedeno modifikovanou metodou dle THORDAL-CHRISTENSEN et al. (1997). V 200 µl dimetylformamidu bylo rozpuštěno 40 mg diaminobenzidinu (Sigma-Aldrich; #D8001) a směs byla smíchána s 40 ml 10 mM Tris/HCl pH 7,8. Do tohoto roztoku byly v kádince ponořeny odstřižené listy a stlačeny pod hladinu pomocí plastové síťky. Kádinka byla umístěna do exsikátoru, ze kterého byl následně odsát vzduch. Při pozvolném zvýšení tlaku dojde k nasátí roztoku do mezibuněčných prostor. Listy byly poté přeneseny do Petriho misky, mírně podlity vodou a uzavřená miska byla 4 hodiny inkubována při pokojové teplotě v temnu. Po odbarvení v 96 % etanolu a následné rehydrataci v 70 %, 50 %, 30 % etanolu a vodě za stálého třepání byly listy skenovány. Peroxid vodíku byl kvantifikován jako počet hnědých pixelů na jednom listu vztažený k celkové ploše listu pomocí aplikace pro analýzu obrazu APS Assess 2.0 (APS). Prahování bylo nastaveno empiricky a stejné hodnoty byly použity pro všechny listy, tak aby nemohlo dojít k ovlivnění výsledků uživatelem. 4.7 Histochemické barvení mycelia pomocí GUS Listy nebo listové terče byly ponořeny do barvícího roztoku v 6-ti jamkové kultivační destičce a stlačeny pod hladinu kádinkami. Destička byla umístěna do exsikátoru, ze kterého byl následně

odsát

vzduch.

Při

pozvolném

zvýšení

tlaku

dojde

k nasátí

roztoku

do mezibuněčných prostor. Zakrytá destička byla inkubována 4-6 hodin při 37 °C. Poté byly listy za stálého třepání dvakrát opláchnuty vodou, inkubovány postupně vždy 10 minut v 30 %, 50 % a 70 % etanolu a ponechány v 96 % etanolu do úplného odbarvení chlorofylu. Po následné rehydrataci v 70 %, 50 %, 30 % etanolu a vodě za stálého třepání byly listy skenovány. Mycelium bylo kvantifikováno jako počet modrých pixelů na jednom listu vztažený k celkové ploše listu pomocí aplikace pro analýzu obrazu APS Assess 2.0. Prahování bylo nastaveno empiricky a stejné hodnoty byly použity pro všechny listy tak, aby nemohlo dojít k ovlivnění výsledků uživatelem.

23

4. Metody 4.8 Analýza genové exprese Rostlinný materiál byl ihned po odebrání zmražen v kapalném dusíku a v případě potřeby uchováván při -70 °C. RNA byla izolována pomocí Spectrum Plant Total RNA Kit (SigmaAldrich #STRN250) podle návodu výrobce. Po spektrofotometrickém stanovení koncentrace (NanoDrop ND-1000; Thermo Scientific) bylo 2,5 µg celkové RNA ošetřeno DNAfree™ Kit (Ambion #AM1906) pro odstranění případné kontaminace genomovou DNA. Pro ověření integrity RNA bylo 0,5 µg takto ošetřené RNA v pufru naneseno na 1 % agarózový gel, separováno za nedenaturujících podmínek při 5V/cm po dobu 40 min a vizualizováno po obarvení v roztoku 5 µl 1 % ethidium bromidu ve 100 ml deionizované vody. Ošetřená RNA byla podrobena reverzní transkripci. Směs 1 µg RNA a 0,1 µmol anchored oligo dT21 (syntetizován v Metabion) byla inkubován 5 min při 70 °C a rychle zchlazen na ledu. Poté byly přidány dNTPs (konečná koncentrace 0,5 mM každého, Promega #U1511) 100 jednotek M-MLV RNase H- Point Mutant reverzní transkriptázy a dodaný pufr (Promega #M368A) a směs v celkovém objemu 20 µl byla inkubována 10 min při 40 °C a 50 min při 45 °C. Po ukončení reakce byla cDNA po naředění použita jako templát pro qPCR s kitem DyNAmoTM Capillary SYBR® Green qPCR Kit (Finnzymes #F- 420L). 2,5 μl 20x ředěné cDNA odpovídá ekvivalentu 6,25 ng celkové RNA. Reakce probíhala v polykarbonátových kapilárách (Genaxxon BioScience GmbH) a přístroji Roche LightCycler. Po skončení amplifikace byla provedena analýza křivek tání. CT byly stanoveny pomocí LightCycler® Software 4.1. Relativní exprese byla vypočtena s korekcí na účinnost, která byla stanovena z kalibrační přímky provedené se sériově ředěnou cDNA. Reakční směs

Ostatní primery

ACS2a

ITS1 a

DyNAmo FP (5 μM) RP (5 μM) voda cDNA

20x ředěná cDNA 95 °C 10 min 95 °C 10 s 45x 55 °C 10 s 72 °C 10 s

5x ředěná cDNA 95 °C 10 min 95 °C 10 s 45x 55 °C 20 s 72 °C 10 s

5x ředěná cDNA 95 °C 10 min 95 °C 10 s 45x 60 °C 20 s 72 °C 10 s

5 μl 1 μl 1 μl 0,5 μl 2,5 μl

Protože genom B. napus je doposud neznámý, byly sekvence k navržení primerů vyhledány na základě podobnosti s Arabidopsis thaliana. Kódující sekvence kandidátních genů z A. thaliana byly použity pro vyhledání ortologů v EST databázi sekvencí Brassica napus pomocí

nástroje

„discontiguous

megablast“

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Nalezené

sekvence vykazovaly podobnost na úrovni nukleotidové sekvence v rozmezí 75-90 %. Primery byly navrženy v aplikaci PerlPrimer v1.1.17 (MARSHALL, 2004) s nastavením upraveným pro DyNAmoTM Capillary SYBR® Green qPCR Kit (3 mM Mg2+; 500 nM oligo) a teplotou tání 60 °C.

24

4. Metody

Gen ACT PR-1 WRKY Y70 ICS1 ACS2a ACS2b ERF5 ERS2 EBF2 HEL Pdf1.2 2 bCHI LEC WRKY Y45 AOS LOX3 CLH1 VSP WRKY Y25 LEA1 WRKY Y22 SYP12 21 PAL1

Název primeru BnAct 200 08-L BnAct 200 08-R BnPR-1_2 2008-L BnPR-1_2 2008-R 008L BnW70-20 BnW70-20 008R BnICS1-20 009-FP BnICS1-20 009-RP S.a-2010-FPa BnaX.ACS BnaX.ACS S.a-2010-RPa S.b-2010-FP BnaX.ACS BnaX.ACS S.b-2010-RP BnERF5 2007-L 2 BnERF5 2007-R 2 BnERS2-2 2010-FP BnERS2-2 2010-RP BnEBF2-2 2010-FP BnEBF2-2 2010-RP BnHEL-20 008bL BnHEL-20 008bR BnPDF1.2 2 2007-L BnPDF1.2 2 2007-R BnCHI200 08-L BnCHI200 08-R BnLEC200 08-L BnLEC200 08-R BnW45-20 008-L BnW45-20 008-R BnAOS 20 007-L BnAOS 20 007-R BnLOX3-2 2008L BnLOX3-2 2008R BnCLH1-2 2008-L BnCLH1-2 2008-R BnVSP-20 008L BnVSP-20 008R BnWRKY2 25-2009 FP BnWRKY2 25-2009 RP BnLEA1 2007-L BnLEA1 2007-R BnWRKY2 22 2007-L BnWRKY2 22 2007-R BnSYP121 1-2008L BnSYP121 1-2008R BnPAL1-2 2010-FP BnPAL1-2 2010-RP

GB-ID AF111812 BNU21849 EV113862 EV225528 HM450312 HM450313 EV126309 CD828782 ES913596 FG577475 EE421691 X61488 DV643273 CD812804 EV124323 EV113862 EV143546

Ko onc.

Sekven nce primeru

5000 nM

CTGGA AATTGCTGACC CGTATGAG

5000 nM

TGTTG GGAAAGTGCTG GAGGGA

3000 nM

CATCC CCTCGAAAGCT TCAAGAC

3000 nM

CCACT TGCACGGGACC CTAC

5000 nM

ACATA ACATAGGAAACCACACG

5000 nM

ACTTG GGACTATCTTCA AGAATGC

5000 nM

CAAAC CTCATCATCTTC CCCTC

5000 nM

AGCGT TGACTTACTAA ACCAG

5000 nM

AGGTG GGTCAAAGACT TTAGATAG

5000 nM

ACCGA AGTCGTTGTAA AGAATA

5000 nM

GAACA ATTCACCTAGTCGTTG

5000 nM

ACCGA AGTCGTTGTAA AGAATA

5000 nM

CGCCG GAGATTCGTAG GATTTG

5000 nM

GGTTT TTGGTTGGTAC CGGAGA

5000 nM

GGAGA ATGAATCTTAC CTCACGA

5000 nM

TTCAC CCTCTTCACTTC CTCTT

5000 nM

CTTCA AAGACATCGAA ACTCTG

5000 nM

TCAAC CGTTAAGAGAC CTCCAA

5000 nM

GGAAC CACAAGGACTA AATGC

5000 nM

TTTCG GATAGCCATCACCA

5000 nM

TGCCC CTACTTTTTGCT TGCTC

5000 nM

CATGT TCGTGCTTTCTCAAGG

5000 nM

TGCTA ACATAGAAGAA AATAAACGG

5000 nM

TTCCA ATGATAGTTGAA ATCGG

5000 nM

GGTTA ATTGGGTTCAG GACGA

5000 nM

AGGTC CTCTTAGGTTTCTTCAC

5000 nM

ACCCT TCCGATAACTTCCA

5000 nM

CATTC CATCTAAACCCA ACCCA

5000 nM

CGCCA ACCAAAACAAC CAAAG

5000 nM

GGGAGGAAGGAGAG GAGGTTG

5000 nM

GAAGT TTTATGGCGGT TGGT

5000 nM

CCTGT TTTCTACGGTTA AGGA

5000 nM

GTTGG GACGATAATTTGCCC

5000 nM

CGAAT TCTCTGACATTTCACC CCTCT TCACTTTCACTT TCTCTTGC

CN726858

GTTCG GGCTTCGTCCT TCAATG TGATG GGTCTCTTGGT TGAA

EV141772 EE538232 EV193324 EV218912 DQ341308

ATGAT TGGTTTATGGTTGGAG 5000 nM

TCAGC CCACTCACTCA AACCAC

5000 nM

TGTTT TGTCCCGATAGGTTCTG

5000 nM

CTCAT TCAGCAACCAC CCACAG

5000 nM

GCCTC CTTCGGGGTAA ATTCAG

5000 nM

TTTAC CCAGAAGAACACCCGTA

5000 nM

TAACG GACAGCAAGAA ACCACAA

5000 nM

GACTA AATCTCATCTCG GCAAG

5000 nM

ATTCT TCCTCCAAGTGTCTTAG

D Délka

Charakteristika Ověř..

1442 bp

houseke eeping gene

900 bp

SA marker

A

1005 bp

SA marker

A

1992 bp

SA biosyntéza

A

1227 bp

ET biosyntéza

A

1992 bp

ET biosyntéza

A

1770 bp

ET mark ker

__

1337 bp

ET mark ker

A

1882 bp

ET mark ker

A

1220 bp

ET/JA marker m

A

1664 bp

ET/JA marker m

__

1 18 bp

ET/JA marker m

A

1664 bp

ET/JA marker m

__

1223 bp

ET/JA marker m

__

1 16 bp

JA biosy yntéza

A

1992 bp

JA biosy yntéza

A

1552 bp

JA mark ker

A

1221 bp

JA mark ker

A

1996 bp

C SA/ACC inducible

__

1442 bp

ABA ma arker

A

1883 bp

flg22 ma arker

__

877 bp

syntaxin n

A

1 12 bp

biosynté éza phenylp prop.

__

Tab. 2 Primery pro qPCR nav vržené na se ekvence B. napus. n GB-ID D – identifikáátor sekvenc ce v databázii GenB Bank; Konc.-- konečná ko oncentrace p primeru v rea akci; Ověř. – „A“ označujje, že byla id dentita genu u ověře ena pomocí chemické c ind dukce.

Obr. 0 Ověření dé élky produktů qPCR elekktroforézou na n 2 % agaró ózovém gelu..

25

4. Metody

Gen SAND PR-1 WRKY70 ICS1 PR-2 ACS2 ERF1 HEL Pdf1.2 AOS VSP2 ERF#018 CAF1-like BAP1 FRK1 PYK10

Název primeru AtSAND-2009 FP AtSAND-2009 RP AtPR1-2009 FP AtPR1-2009 RP AtWRKY70-2009 FP AtWRKY70-2009 RP AtICS1-2009 FP AtICS1-2009 RP AtPR2-2009 FP AtPR2-2009 RP AtACS2-2009 FP AtACS2-2009 RP AtERF1-2009 FP AtERF1-2009 RP AtHEL-2009 FP AtHEL-2009 RP AtPdf1.2a-2009 FP AtPdf1.2a-2009 RP AtAOS-2009 FP AtAOS-2009 RP AtVSP2-2010-FP AtVSP2-2010-RP AtERF#018 -2010-FP AtERF#018 -2010-RP AtCAF1-2010-FP AtCAF1-2010-RP AtBAP1-2010-FP AtBAP1-2010-RP AtFRK1-2009 FP AtFRK1-2009 RP AtPYK10-2009 FP AtPYK10-2009 RP

AGI At2g28390 At2g14610 At3g56400 At1g74710

Konc.

Sekvence primeru

500 nM

CTGTCTTCTCATCTCTTGTC

500 nM

TCTTGCAATATGGTTCCTG

500 nM

AGTTGTTTGGAGAAAGTCAG

500 nM

GTTCACATAATTCCCACGA

500 nM

CTTAATGCCAAATTCCCAAG

500 nM

TGTGGTTTCCTATGTATGTG

500 nM

GCAAGAATCATGTTCCTACC

500 nM

AATTATCCTGCTGTTACGAG TATAGCCACTGACACCAC

At3g57260

GCCAAGAAACCTATCACTG GTTAAGCTCAATGTGTCTCC

At1g01480

AAGCAAATCCTAAACCATCC ATCAAATCCGTAAGCTCAAG

At3g23240

CCAAACCCTAATACCGTTTC CAAGTGTTTAAGGGTGAAGA

At3g04720

CATTGCTACATCCAAATCCA CTGTTACGTCCCATGTTAAA

At5g44420

TTACTCATAGAGTGACAGAGAC GAACCGCCTTTAATTTCTTG

At5g42650

GAGAGTAATGGATGGAGATTG CCAAACAGTACCAATACGAC

At5g24770

CTTCTCTGTTCCGTATCCAT AGTGAGGAAGAGGAAATGG

At1g74930

CGGTGGATTATTAGGGAAAT ATCCCGACGATCTTTATACTC

At3g44260

AACTCCCAGATGAATCCTC ATGCCCATCAATGGTAATG

At3g61190

TCCCACACTTATCACCAAA TGGCTAATGAGAACTTAGGA

At2g19190

AGATGTTTGTTGGCTTCAC CAATGCTAAATGCCAAGAC

At3g09260

GATCTTCCCACCTTTACAC

Délka

Charakteristika

118 bp

housekeeping gene

106 bp

SA marker

133 bp

SA marker

122 bp

SA biosyntéza

99 bp

SA marker

68 bp

ET biosyntéza

117 bp

ET marker

100 bp

ET/JA marker

91 bp

ET/JA marker

124 bp

JA biosyntéza

167 bp

JA marker

175 bp

wound marker

139 bp

wound marker

187 bp

wound marker

165 bp

flg22 marker

127 bp

ISR marker

Tab. 3 Genově specifické primery pro qPCR navržené na sekvence A thaliana. AGI – identifikátor lokusu genu; Konc.- konečná koncentrace primeru v reakci.

Gen Actin Tubulin

Název primeru LmAct2008-L LmAct2008-R LmTub2008-L LmTub2008-R

ITS1 a

LmacDixan F

ITS1 b

LmacLucas F

AvrLm1 sGFP

LmacDixan R LmacLucas R LmAvr1-2009 FP LmAvr1-2009 RP

GenBankID AY748970 AY749017 FJ172239 FJ172239 AM084345

Konc.

Sekvence primeru

500 nM

GTCACCACTTTCAACTCCA

500 nM

TATGTCCTTGTTAGTGCGG

500 nM

TCAAGATGTCCTCCACCT

500 nM

GTACCAATGCAAGAAAGCC

500 nM

GGTGTTGGGTGTTTGTTCCAC

500 nM

GGCTGCCAATTGTTTCAAGG

500 nM

CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA

500 nM

GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG

500 nM

TTTAATCACGAAGACAACCC

500 nM

CACAACAAAGCAATAACGAG

pCAMBgfp2009 FP

ACCTGAAGTTCATCTGCACC

pCAMBgfp2009 RP

CATGATATAGACGTTGTGGCTG

a

primery pocházejí z publikace Persson et al. (2009)

b

primery pocházejí z publikace Liu et al. (2006)

Délka

Charakteristika

121 bp

housekeeping gene

113 bp

housekeeping gene

51 bp

housekeeping gene

331 bp

housekeeping gene

448 bp

Avr gene

332 bp

GFP

Tab. 4 Primery pro qPCR navržené na sekvence L. maculans. GeneBankID – identifikátor sekvence v databázi GenBank; Konc.- konečná koncentrace primeru v reakci.

26

4. Metody 4.9 Extrakce hormonů pro kvantifikaci pomocí hmotnostní spektrometrie Extrakce hormonů byla provedena v totožných vzorcích použitých pro analýzu genové exprese. K homogenátu bylo přidáno 500 µl extrakčního pufru pB (750 ml MeOH, 200 ml H2O, 50 ml 99 % HCOOH, pH 2) a 25 µl vnitřních standardů příslušných hormonů. Směs byla vortexována a 15 min inkubována při -20°C. Následně byla odstředěna 20 min při 14 000 g a 4°C. Supernatant byl přenesen do nové zkumavky. K peletu bylo přidáno 500 µl extrakčního pufru pB a směs byla vortexována a odstředěna 20 min při 14 000 g a 4°C. Supernatant byl přidán k předchozímu. Organická fáze byla odpařena na rotační vakuové odparce při 40°C a 20 mbar. Zbytek po odpařování byl v 500 µl 1 M HCOOH převeden na kolonku Oasis MCX 1cc/30 mg (Waters, #186000252) předem promyté MeOH a 1 M HCOOH. Následně byla kolonka promyta 500 µl 1 M HCOOH a 250 µl H2O. Vzorky byly dvakrát eluovány vždy 250 µl MeOH. 4.10 Klonování ortologů genu ACS2 Úsek cDNA genu ACS2 byl amplifikován s primery komplementárními k ES980359 (TGGATCAAAGAGAACCCAA) a AF338652 (CGAAACATTGAGCTTCACTT) pomocí PCR Master Mix (Promega #M7501) a primery v konečné koncentraci 500 nM. Podmínky reakce byly 4 min při 94 °C počáteční denaturace, 30 cyklů: 10 s při 94 °C, 10 s při 55 °C a 30 s při 72 °C a závěrečná elongace 5 min při 72 °C. PCR produkt byl po ověření délky agarózovou elektroforézou purifikován High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche #04983955001). 4.10.1 Příprava kompetentních buněk Veškeré kroky probíhaly za sterilních podmínek. Buňky Escherichia coli DH5α byly přeočkovány do 2 ml SOB v 15 ml zkumavce a inkubovány přes noc při 37 °C za stálého třepání 150 RPM. Do 50 ml SOB v 250 ml Erlenmayerově baňce bylo pasážováno 500 µl narostlé kultury a inkubováno při 28 °C a 150 RPM dokud OD600 nedosáhlo absorbance 0,4. Kultura byla přenesena do 50 ml centrifugační zkumavky a inkubována 20 min na ledu. Poté byla kultura odstředěna 8 min při 400 g. Supernatant byl nahrazen 15 ml TB (4 °C) a pelet byl resuspendován pipetováním. Poté byla kultura odstředěna 8 min při 400 g, supernatant byl nahrazen 5 ml TB (4 °C) a po resuspendování buněk bylo přidáno 350 µl dimetylsulfoxidu. Suspenze byla rozdělena do vymražených mikrozkumavek a okamžitě zmražena v kapalném dusíku. Buňky byly uchovávány pří -70 °C. SOB médium trypton kvasničný extract NaCl KCl MgSO47H2O MgCl26H2O celkový objem

4g 1g 117 mg 37 mg 493 mg 407 mg 200 ml

TB médium PIPES 6g CaCl2.2H2O 440 mg 3 M KCl 3,72 g doplnit vodou do 180 ml upravit pH na 6,7 (KOH) MnCl2.4H2O 2,18 g celkový objem 200 ml

27

LB médium/agar trypton 20 g kvasničný extract 10 g NaCl 10 g agar (neplatí pro tekuté) 20 g celkový objem 1000 ml

4. Metody sterilizace 0,2 µm filtrem

4.10.2 Ligace a transformace PCR produkt byl vložen do plazmidu pJET1.2 pomocí CloneJET™ PCR Cloning Kit (Fermentas #K1231) dle přiloženého protokolu. 5 µl ligační směsi bylo smícháno se 100 µl suspenze kompetentních buněk a inkubováno 30 min na ledu. Mikrozkumavka byla následně ponořena na 40 s do vodní lázně o teplotě 42 °C a poté rychle přenesena na led. Po přidání 600 µl LB media byla suspenze třepána 1 hodinu při 37 °C a 150 RPM. Poté byla suspenze odstředěna 1 min při 4000 RPM na stolní centrifuze. 600 µl supernatantu bylo odpipetováno a ve zbytku byly buňky resuspendovány a rozetřeny na LB agar se selekčním antibiotikem karbenicilinem (100 µg/ml). Plotna byla inkubována přes noc při 37 °C a přítomnost kýženého produktu v plazmidech vyrostlých kolonií byla ověřena pomocí PCR s primery specifickými pro plazmid pJET1.2 a primery použitými pro amplifikaci produktu. Podmínky rekce byly stejné jako při amplifikaci produktu, avšak pouze 25 cyklů PCR. Buňky vybraných kolonií byly do připravené rekční směsi přeneseny dřevěným párátkem a ihned byla zahájena reakce. Produkty byly separovány na 1 % agarózové elektroforéze. Vhodné kolonie byly pasážovány do 2 ml LB média (karbenicilin 100 µg/ml) a kultivovány přes noc při 37 °C za stálého třepání 150 RPM. Plazmid byl z kultury izolován pomocí GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas; #K0502) a odeslán k sekvenaci. 4.11 Ošetření induktory rezistence Rostliny řepky ve stáří 11 dnů a rostliny A. thaliana ve stáří 4-5 týdnů byly ošetřeny postřikem na listy vodou, 32 µM benzothiadiazolem (BTH), nebo některou z testovaných látek. Na 6 rostlin byly aplikovány přibližně 4 ml roztoku. Kyselina β-aminomáselná (SigmaAldrich; #A4,420-7) byla aplikována v požadované koncentraci ve Steinerově živném roztoku jako zálivka ke kořenům. 4.12 Inokulační test - L. maculans Do děložních listů byla 4 dny po ošetření pomocí 1 ml injekční stříkačky bez jehly infiltrována suspenze spor v koncentraci 105 spor/ml. Případně byly listy propíchnuty špendlíkem a na vpich bylo naneseno 10 μl suspenze spor v koncentraci 106 spor/ml. V obou případech byly 7 dní po inokulaci odstraněny pravé listy, aby nedošlo k senescenci děložních listů. Zpravidla 11 dní po inokulaci infiltrací byly listy skenovány. Poškozená a celková plocha listu byla změřena pomocí aplikace pro analýzu obrazu APS Assess 2.0. Prahování bylo nastaveno empiricky a stejné hodnoty byly použity pro všechny listy, tak aby nemohlo dojít k ovlivnění výsledků uživatelem. Míra napadení byla vyjádřena jako podíl poškozené plochy k ploše celého listu. Aby bylo možné pokusy snadno porovnat, byly všechny varianty vztaženy ke kontrole, která představuje 100 %. V případě inokulace na propíchnutý list byly

28

4. Metody léze skenovány 14 dní po inokulaci a plocha lézí byla změřena pomocí aplikace pro analýzu obrazu DPlan4Lab 0.5.1 a míra poškození byla vyjádřena jako absolutní hodnota plochy léze. Statistická významnost byla stanovena pomocí nepárového t-testu. 4.13 Inokulační test – P.syringae Kmen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 s operonem luxCDABE zajištujícím luminescenci bakterie (FAN et al., 2008) byl kultivován na zpevněném živném médiu NYGA obsahujícím rifampicin (50 mg/l) a kanamycin (35 mg/l). Pro přípravu inokula byla bakterie zhusta rozetřena na plotny NYGA s antibiotiky a inkubován přes noc při 26 °C. Následně byla kultura suspendována v 10 mM MgCl2. Suspenze byla naředěna, aby optická denzita při 600 nm dosáhla hodnoty 0,5. Do takto připravené suspenze obsahující 0,02 % Silwet L77 byly krátce ponořeny rostliny A. thaliana. V průběhu 3 dnů byl v jednotlivých rostlinách opakovaně měřen nárůst luminescence pomocí luminometru TD-20/20 (Turner BioSystems).

Médium NYGA kvasniční extrakt pepton glycerol agar celkový objem

3 5 20 20 1000

g g g g ml

4.14 Příprava elicitorů z L. maculans a jejich analýza Veškeré kultury L. maculans v tekutém médiu byly pěstovány v orbitální třepačce při 26 °C a 130 RPM v temnu. Pokud není uvedeno jinak, 100 ml kultury bylo pěstováno v 250 ml Erlenmayerových baňkách uzavřených gázovou zátkou a alobalem. Pro kultivaci byla použita níže uvedená média. Základ média Gamborg B5 byl komerční produkt Gamborg B5 medium including vitamins (Duchefa; G0210). Gamborg B5 - MES Gamborg B5 3,16 g sacharóza 30 g MES 1,95 g upravit pH na 6,8 (NaOH) celkový objem 1000 ml Gamborg B5 – PB Gamborg B5 sacharóza 0,5 M fosfátový pufr (pH 6,8) upravit pH na 6,8 celkový objem

3,16 g 30 g 10 ml

Médium Fries NH4NO3 tartarát amonný KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2 NaCl sacharosa kvasničný extrakt celkový objem

1000 ml

29

1 g 5 g 1 g 500 mg 130 mg 100 mg 30 g 5 g 1000 ml

4. Metody Inokulace byla provedena přidáním 100 μl suspenze spor L. maculans (108 spor/ml) do 100 ml média. Případně bylo do média přeneseno 30 segmentů o velikost 3x3x3 mm vykrojených z plotny s V8 agarem porostlým mladým myceliem. Po ukončení kultivace bylo médium vakuově filtrováno přes filtrační papír. Filtrát byl třikrát dialyzován proti destilované vodě přes membránu Spectra/Por MWCO 6-8 kDa (Spectrum), abychom odstranili látky obsažené v médiu a především nízkomolekulární látky produkované L. maculans během kultivace, které působí na rostliny řepky velmi toxicky. Elicitory L. maculans byly na rostliny aplikovány neředěné, pokud není uvedeno jinak. Srážení etanolem bylo provedeno smísením filtrátu kultivačního média s etanolem tak, aby jeho konečná koncentrace dosáhla 80 % (vol/vol). Během míchání byl z roztoku odstraněn velký precipitát (sacharidy). Následně byl vzorek odstředěn 20 min při 25.000 g. Pelet byl resuspendován v deionizované vodě a dialyzován výše popsaným postupem. Srážení síranem amonným bylo provedeno do 80 % a 94 % nasycení. K filtrátu kultivačního média byl za stálého míchání postupně přidán síran amonný. Po úplném rozpuštění byl roztok ještě 60 min míchán při 4 °C. Poté byl odstředěn 20 min při 50.000 g. Pelet byl rozpuštěn v deionizované vodě. Vzorek pro isoelektrickou fokusaci byl připraven smísením amfolytů Bio-Lyte 3/10 (BioRad; #163-1112) se vzorkem proteinů připraveným srážením filtrátu kultivačního média síranem amonným do 94 % nasycení. Vzorek proteinů byl naředěn vodou do konečné koncentrace 2 mg/ml a amfolyty byly přidány do konečné koncentrace 2%. Separace byla provedena na přístroji MicroRotofor (BioRad) při 10 °C a konstantní příkonu 1 W. Separace byla ukončena, když došlo k ustálení napětí, což bylo zpravidla po 90 min. Z komory bylo pod vakuem odsáto 10 frakcí, které byly analyzovány na 10 % Tricine SDS-PAGE 10 x 10 cm. Veškeré procedury včetně barvení stříbrem byly provedeny dle SCHÄGGER (2006). Peptidy byly separovány 15 min při 30 V a 70 min při 100 V. V jednotlivých frakcích byla stanovena koncentrace proteinů pomocí DC Protein Assay (BioRad; #500-0116). 4.15 Hydrolyzáty živočišných bílkovin Hydrolyzáty kolagenu poskytl prof. Karel Kolomazník (UTB ve Zlín). Byly aplikovány ve vodných suspenzích obsahujících 2 % sušiny, případně dále ředěny. To odpovídá v případě hydrolyzátů CH-4 a CH-8 dvacetinásobnému ředění (20x) výchozího roztoku, v případě HCu, C1, C2 a K1 rozpuštění 1 g pevné látky v 50 ml vody (50x). Hydrolyzáty CH-4 a CH-8 byly rozděleny na 2 frakce podle velikosti částic pomocí ultrafiltrace přes membránu s póry propouštějícími molekuly do 2 kDa (Vivaspin 15R; Sartorius; #VS15RH91). Suspenze hydrolyzovaného Cutisinu obsahující 2 % sušiny byla nejprve odstředěna 10 min při 3700 g, aby se odstranily velké částice. Poté byla štěpena přidáním kolagenázy (Collagenase; Sigma-Aldrich; #C0130) v poměru 0,125 mg enzymu k 1 g hydrolyzovaného

30

4. Metody Cutisinu. Ke kontrolnímu vzorku Cutisinu byl přidán tepelně inaktivovaný enzym. Po smíchání všech složek byly roztoky sterilizovány pomocí bakteriálního filtru Puradisc 25 mm (Whatman; #6780-2502). Štěpení probíhalo 24 hodin při 37 °C buďto v pufru (50 mM HEPES, 0,36 mM CaCl2.2H2O, pH 7,4), 0,36 mM CaCl2, nebo vodě. Následně byly všechny vzorky rozděleny na frakce podle velikosti molekul ultrafiltrací přes membránu propouštějící molekuly menší než 3 kDa. (Amicon Ultra 15 – Ultracel 3k; Millipore; #UFC900324) 210 min 3700 g při 10 °C. Po odstředění bylo 8 μl vzorku naneseno na 16 % (3 % bisAC) Tricin SDSPAGE 10 x 10 cm. Veškeré procedury včetně barvení byly provedeny dle SCHÄGGER (2006). Peptidy byly separovány 15 min při 30 V a 2 hodiny při 150 V. Jako standard pro určení molekulových hmotností byl použit Mark12 (Invitrogen; #LC5677). Gely byly po fixaci obarveny v 0.025 % Coomassie blue G-250 a skenovány. V jednotlivých vzorcích byla stanovena koncentrace peptidů pomocí DC Protein Assay (BioRad; #500-0116). Kalibrační přímka byla stanovena pomocí standardů BSA rozpuštěného ve stejném pufru jako vzorky. Suspenze hydrolyzátu Cutisinu HCu a hydrolyzátu kolagenu C2 obsahující 2 % sušiny byla nejprve odstředěna 10 min při 3700 g a poté sterilizovány pomocí bakteriálního filtru Puradisc 25 mm (Whatman; #6780-2502). Následně byly rozděleny na frakce podle velikosti molekul ultrafiltrací přes membránu propouštějící molekuly menší než 10 kDa. (Amicon Ultra 4 – Ultracel 10k; Millipore; #UFC801024) 180 min 3700 g při 10 °C. Ve frakcích byla stanovena koncentrace peptidů biuretovou metodou. Kalibrační přímka byla stanovena pomocí standardů BSA rozpuštěného ve vodě. 4.16 Antifungální test Do 20 ml média Gamborg B5 – AF bylo přidáno 106 spor L. maculans JN3 GFP1. Suspenze byla za sterilních podmínek pipetována po 75 µl do černé opakní 96-ti jamkové destičky (Nunc). DO každé jamky bylo přidáno 75 µl roztoku 10 mM MES (pH 6,8) s požadovanou koncentrací testované látky. Destička byla uzavřena transparentním víčkem a inkubována v temnu při 26 °C. V pravidelných intervalech byla odečítána fluorescence pomocí fluorescenčního readeru Infinite F200 (Tecan) s použitím excitačního filtru 485/20 a emisního filtru 535/25 nm.

Gamborg B5 - AF Gamborg B5

632 mg

sacharóza

600 mg

MES upravit pH na 6,8 (NaOH) celkový objem

390 mg 200 ml

31

5. V Výsledky a diskuze

5. V Výsledky a diskuz ze 5.1 Id dentifikace e obrannýc ch reakcí vy yvolaných rozpoznán ním genu A AvrLm1 Gen

avirulencce

askom mycety

Le eptosphaeria a

macula ans

AvrLm m1

je

zodpovědný z ý

nkompatibiln ní interakci s rostlinam i řepky nesoucími kore espondujícíí gen reziste ence Rlm1.. za in Zatím mco genetiická podsta ata této in nterakce je e detailně prozkoumáána, dopos sud nebyla a publiikována žád dná studie zabývající se obrannými mecha anismy rosttliny, které rozpoznáníí genu u AvrLm1 spouští. s Aby ychom moh hli sledovatt obranné reakce r řepkky vyvolané é specifickyy gene em AvrLm1, použili jsm me kombina aci dvou iz zolátů L. ma aculans lišíících se v alele a tohoto o genu u. Oba izolá áty pocháze ejí z totožné ého in vitro křížení a byly b charaktterizovány BALESDENT T et al.. (2001). Izo olát JN3 nes se funkční a alelu AvrLm m1. Izolát JN N2 má v mísstě genu ve elkou delecii a tato o alela je tu udíž označo ována jako a avrLm1 (GOUT O et al., 2006). 5.1.1 1Transform mace L. mac culans gen nem pro β-g glucuronid dáza (GUS)) Myce elium L. ma aculans je v rostlinném m pletivu obtížně o poz zorovatelnéé i po obarvení. Hyfyy prorů ůstají mezib buněčnými prostory p a ssplývají tak se stěnami rostlinnýchh buněk. Po okusili jsme e se p proto transfo ormovat ob ba izoláty L L. maculans s dvěma reportérovým mi geny, kte eré by nám m adnily pozorrování myce elia v infikovvaném plettivu a umož žnily přesněější kvantifik kaci rozvoje e usna choro oby. Prvním m reportéro ovým genem m je bakterriální β-gluc curonidáza (GUS). Te ento enzym m štěpíí substrát X-Gluc za vzniku syt ytě modré sraženiny. Protože e ukaryontní organizmyy postrrádají tuto enzymovou u aktivitu, je e barvení zcela z speciffické. Gen pro GUS v konstruktu u pSO1 jsme úsp pěšně vnesli do obou i zolátů. Účin nnost transformace byyla velmi vy ysoká a pro o každ dý izolát jsm me získali nejméně 1 0 linií. Mezi transform manty jsmee nepozorovali rozdílyy v rycchlosti růstu u in vitro. Od d každého izolátu jsme vybrali tři transformoované linie a porovnalii jejich h agresivitu s mateřský ými izoláty, abychom zjistili, z zda in nzerce neovvlivnila něk který z genů ů souvvisejících s patogenitou u. Kromě lin nie JN3 GU US5 se linie e transform mantů průkazně nelišilyy od svvých mateřřských linií (Obr. 1). N a základě těchto t výsle edků jsme pro další práci p vybralii linie JN2 GUS5 a JN3 GUS S4. Obr. O 2 Porovnání aggresivity výchozích a tra ansformovan ných izoolátů Lep ptosphaeria maculans m nesoucích genn pro β-glu ucuronidázu (G GUS). Listy y byly inookulovány nanesením su uspenze spo or na propíchhnutý list a po p 11 dnech by yla změřena plocha lézí ppomocí analýzy obrazu. Hodnoty jsou průměrem z 20 analyzo ovaných lézí a chybové úsečky ú předdstavují stře ední chybu prrůměru. Tra ansformanti lišící se na n základě ne epárového t-testu průkkazně od příslušného vý ýchozího izolátu jsou oznnačeni * (p < 0,05).

32

5. V Výsledky a diskuze V inffikovaných rostlinách bylo po ob barvení GU US možné mikroskoppicky pozorrovat různá á stádiia infekce od o klíčení sp por po tvorb bu pyknid (o obr. 3). Barv vení bylo zccela specific cké a dobře e patrn né byly i hyfy rostouc cí pod poko ožkou. V pozdějších p stádiích s byylo možné oblast listu u kolon nizovanou myceliem m po ozorovat i o okem.

Obr. 3 Mikroskopické snímk ky děložních listů řepky infikovaných h L. maculaans JN2 GUS5 po obarvvení metodo ou GUS. A - Vyklíčené spory v blíz zkosti průduchu; B - hyyfa pronikajíc cí skrz průdu uchovou štěrrbinu do nitra a listu; C - hyyfy rostoucí na n povrchu pokožkových p buněk; D, E - hyfy mezi buňkami parenchymu; F - počátek tvvorby nepohlavní plodničky, pyknidy.

5.1.2 2 Transform mace L. ma aculans gen nem pro ze elený fluore escenční p protein (GF FP) Jako o druhý rep portérový gen g jsme p použili zelený fluoresc cenční prottein (GFP) z medúzyy Aequ uorea victoria. Tento protein vyzzařuje po excitaci e mo odrým světtlem intenzivní zelené é světlo. Pro své é vlastnosti je jední m z nejpou užívanějších reportéroových genů zejména a pro lo okalizace proteinů v buňkách i pletivec ch a tkán ních (ZIMM MER 2002).. Účinnostt transsformace byyla výrazně nižší než v případě trransformace e genem G GUS. I přes opakovanýý poku us se pod dařilo trans sformovat pouze ně ěkolik jedin nců izolátuu JN3. Přříčinou byll pravd děpodobně nevhodný kmen agrob baktéria. Přitomnost genu u sGFP v genomu tran nsformovaných linií jsm me ověřili poomocí PCR R. Gen jsme e N3 GFP1 a JN3 GFP22 (Obr. 4). Funkčnostt detekkovali pouzze ve dvou liniích ozn ačených JN genu u jsme po oté potvrdili stanoven ním fluores scence v hrubých prooteinových extraktech h z myycelia. Vzorrky z obou transforman ntů měly srrovnatelnou u fluorescennci (Obr. 4)). Poměrně ě vysoká fluoresccence vzork ku bez GFP P nás překv vapila. Poz zději se ukáázalo, že mnoho m látekk

33

5. V Výsledky a diskuze použžitých např.. pro přípra avu kultivaččního média vykazuje e značnou fluorescenci v oblastii stejn né jako sGFP. Obr. 4 Ověření úspěšné tra ansformace izolátu u JN3 ze leným fluorescenčním proteinem sGFP. Vlevo: Ověřření přítomnosti inzertu v m ateřské linii JN3 (N) a dvou transformova t aných liniích JN3 GFP1 a JN3 GFP2 poomocí PCR R s primery speciffickými k sG GFP. Vpravo o: Fluorescence e hrubých proteinovýc ch extraktů z myc celia týchž linnií.

m z in n vitro kulturry pod fluorescenčním mikroskopeem byl signál naprosto o Při pozorování mycelia ované linie vykazovaly y intenzivní fluorescencci, přičemž za daného o speccifický. Obě transformo nasta avení nebyyl u netransformované é linie poz zorován anii náznak flluorescence e (Obr. 5).. Při pozorování infikovaného děložního o listu bylo mycelium zcela z zřetelnné bez názn naku rušivé é escence po ozadí (Obr. 5). Hyfy b bylo možné é dobře poz zorovat i hl uboko pod pokožkou,, fluore kde llemovaly buňky b houb bového parrenchymu. Protože se s nám vššak nepoda ařilo získatt átu JN2, ne emohli jsme e bohužel použít p tuto metodu prro srovnáníí transsformovanou linii izolá průbě ompatibilní interakce. Úspěšná Ú tra ansformacee obou linií se s nakonecc ěhu kompatibilní a inko poda ařila v rámcii diplomové é práce (ŠPÁ ÁCOVÁ, 2011).

Obr. 5 Vlevo: Mikroskopické M é snímky lin nií L. macula ans rostoucích na agarru V8. V ho orní řadě je e myce elium při pozo orování ve světlém s poli. V dolní řadě ě je totéž zorrné pole při ffluorescenci. Rodičovskýý izolátt JN3 v porovvnání s trans sformovaným mi liniemi JN3 GFP1 a JN N3 GFP2 nef efluoreskuje. Snímky bylyy pořízeny u všecch preparátů ů při stejné é intenzitě excitačního e záření a ddobě expozice. Vpravo:: Mikro oskopický sn nímek pletiva listu řepkky infikované ého JN3 GF FP1. Zeleněě fluoreskujíc cí mycelium m prorů ůstá mezibun něčnými pros story parench hymu, který je zbarven če erveně kvůli fluorescenci chlorofylu.

34

5. Výsledky a diskuze 5.1.3 Příznaky choroby vyvolané na děložních listech řepky Protože izoláty L. maculans JN2 a JN3 byly původně charakterizovány pouze na základě fenotypu při inokulačních testech se standardními sadou odrůd řepky, potvrdili jsme správné přiřazení alely na molekulární úrovni pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s primery navrženými na sekvenci genu AvrLm1 (Obr. 6 A). Pro určení virulence izolátů L. maculans na odrůdách řepky se tradičně používá inokulace suspenzí spor nanesenou na děložní list propíchnutý jehlou, což usnadňuje patogenu infekci. Tato metoda se však zdá být nevhodná pro studium obranných reakcí rostliny, protože infekcí je zasaženo jen málo buněk v okolí vpichu. Proto jsme suspenzi spor infiltrovali přímo do mezibuněčných prostor děložního listu řepky podle FRISTENSKY et al. (1999). Za těchto podmínek se poměrně mnoho buněk v celém děložním listu dostane do kontaktu s patogenem při stejné fázi infekce. Rozdíl v příznacích vyvolaných kompatibilním a inkompatibilním izolátem byl zcela zřejmý i při inokulaci infiltrací spor. Virulentní izolát JN2 způsoboval na listech odrůdy Columbus (Rlm1) 11 dní po inokulaci velké šedavé léze s difúzními okraji. Mycelium obarvené pomocí GUS zasahovalo podstatně větší část listu, než která byla zasažena lézí (Obr. 6 B). Naproti tomu izolát JN3 způsobil na listech téže odrůdy jen několik tmavých, ostře ohraničených, drobných lézí připomínajících projevy hypersenzitivní reakce. Mycelium bylo patrné jen v oblasti blízko léze a nezasahovalo do zdravého pletiva tak, jak tomu bylo v případě JN2 (Obr. 6 B). Avšak ani v případě inkompatibilní interakce nedošlo k úplnému zastavení patogena. Léze vyvolané JN3 se dále šířily a 14 dní po inokulaci se na těchto listech objevila chloróza (Obr. 6 C). Abychom zjistili, zda jsou rozdíly v příznacích choroby mezi oběma izoláty způsobeny výhradně genem AvrLm1, provedli jsme stejný inokulační test i s odrůdou Westar, která nemá korespondující gen rezistence Rlm1. Oba izoláty vyvolávaly na děložních listech velké léze podobné těm, které byly pozorovány při kompatibilní interakci JN2 – Columbus. Rovněž plocha zasažená myceliem byla u obou izolátů srovnatelná (Obr. 6 B). Tyto výsledky jasně ukazují, že rozdíly ve virulenci pozorované na odrůdě Columbus jsou způsobeny genem AvrLm1. Toto tvrzení je navíc podloženo i prací GOUT et al. (2006), kteří pomocí transgenóze do izolátu JN2 vnesli gen AvrLm1. Dvě nezávislé linie JN2 s genem avirulence AvrLm1 vykazovaly podobné symptomy jako JN3 na 16 různých odrůdách řepky s genem rezistence Rlm1.

35

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 6 A, Detekcce genu aviru ulence AvrLm m1 v izolátec ch L. macula ans JN2 a JN N3. Fragmen nty DNA bylyy ampliifikovány přímo ze spor pomocí PCR R. Tubulin by yl použit jako o kontrola prro rovnoměrrné množstvíí templátu nanesen né do PCR reakce. r B, P Příznaky cho oroby a myce elium obarveené pomocí aktivity a GUS S v dělo ožních listecch B. napus 11 dní po in nokulaci (dpi) infiltrací su uspenze spoor L. maculan ns. Příznakyy vyvolané izolátem m JN3 (AvrL Lm1) se liší mezi odrůd dou s genem m rezistence Rlm1 (Colu umbus) a na a odrůd dě bez něj (Westar). Příznaky vyvo olané JN2 jsou j na obo ou odrůdáchh podobné. C, Příznakyy choro oby vyvolané é oběma izolá áty na odrůd dě Columbus s (Rlm1) 14 dní d po inokulaaci.

Rozd díly v růstu mycelia v infikovanýých děložníích listech odrůdy Coolumbus jsme přesně ě stano ovili pomoccí RT-qPCR R kvantifika ace transkriptu LmITS S1 v cDNA z infikovaných rostlin.. Přestože se běžžně množsttví mycelia sstanovuje pomocí p kvan ntifikace DN NA, je za tím mto účelem m ně využíván na i metoda kvantifikacce konstitutivně exprim movaných g enů (BEDNA AREK et al.,, běžn 2009 9). Tento přístup nám umožnil u pou užít vzorky cDNA, ve kterých k bylaa zároveň analyzována a expre ese obrann ných genů. Expresi E Lm mITS1 jsme nejprve změřili v in vitrro kultuře obou o izolátů ů pěsto ovaných na a živném médiu m V8, abychom vyloučili v mo ožnost, že by rozdílné é množstvíí transskriptu LmIT TS1 v infiko ovaných listtech mohlo o být způsobeno rozdííly v expresi mezi JN2 2 a JN3. Množstvví transkriptu u se mezi izzoláty JN2 a JN3 průk kazně nelišiilo (Obr. 7 A). A Počátekk u byl v přípa adě JN2 i JN3 J pozoro ván počína aje druhým dnem od innokulace a pokračovall růstu po ccelou dobu experimentu, tedy do o 10. dne (Obr. ( 7 B). Izolát JN22 však rosttl průkazně ě rychlleji. Sedm dní po inokulaci bylo v listech in nfikovaných h JN2 čtyřikkrát více mycelia m nežž aných JN3.. Zatímco JJN2 pokračoval v expo onenciálním m růstu až do d 10. dne,, v liste ech infikova rychllost růstu izzolátu JN3 se s zmenšila a. Deset dní po inokula aci vzrostl ppodíl množs ství mycelia a oláty na 27 (Obr. 7 B). Kromě této o analýzy js sme zároveeň srovnáva ali množstvíí mezii oběma izo elia při interrakci s odrů ůdou Westa ar postrádajjící gen rez zistence Rlm m1 7 dní po o inokulaci.. myce V tom mto případě jsme na amísto transskriptu kva antifikovali množství D DNA LmITS S1, rovněžž meto odou qPCR. Mezi oběm ma izoláty n nebyl pozorrován průka azný rozdíl, což dále po otvrzuje, že e 36

5. V Výsledky a diskuze rozdííly v růstu mezi JN2 a JN3 na odrůdě Co olumbus jsou způsobbeny výhrad dně genem m AvrLm1. malo nás, jestli jsou obrané o reakkce vyvolan né při inkom mpatibilní innterakci s JN3 J účinné é Zajím proti virulentním mu izolátu JN2. J Uprosttřed polovin ny děložníh ho listu jsmee udělali je ehlou vpich,, anesli suspenzi spor J N2 nebo JN N3, případně vody, jakoo kontrolníh ho ošetření.. na ktterý jsme na S odstupem jed dnoho nebo o tří dnů jssme stejným m způsobem nanesli na opačno ou polovinu u s sp por izolátu JN2. Předp pokládali jsm me, že obraanné reakc ce vyvolané é děložžního listu suspenzi prvníí inokulací by b mohly ov vlivnit růst m mycelia poc cházejícího z druhé inookulace. Pre e-inokulace e izolátem JN3 sn nížila veliko ost léze způ ůsobené nás slednou ino okulací JN22 téměř o 50 0 %, pokud d o inokkulacemi 3 dny. d Pokud byl odstup inokulací 1 den, tento o byl ččasový rozestup mezi oběma efektt byl slabšíí, ale stále statisticky významný (Obr. 8) Zajímavé byylo, že i pre e-inokulace e virule entním izolá átem JN2 mírně sníž ila velikost léze způso obené týmžž izolátem na opačné é polovvině listu (O Obr. 8)

Obr. 7 Kvantifika ace růstu my ycelia L. macculans v dělo ožních listec ch řepky pom mocí qPCR. A, Srovnáníí 2 a JN3 v in vitro kultuře na živném agaru a V8. Hoodnoty jsou průměrem p ze e míry exprese mezzi izoláty JN2 dvou biologických opakování. B, Růstovvá křivka iz zolátů JN2 a JN3 v infikkovaném ple etivu odrůdyy Colum mbus (Rlm1)). Hodnoty js sou průměrem m ze tří biolo ogických opa akování. Chyybové úsečky y představujíí střední chybu prů ůměru. Hodnoty, kdy se m množství JN2 2 průkazně liší od JN3 nna základě ne epárového t-testu jsou označe eny * (p < 0,0 05). C, Množžství mycelia izolátů JN2 a JN3 v listeech odrůdy Westar W (rlm1)) 7 dníí po inokulacci stanovené pomocí qPC CR kvantifika ace DNA Lm mITS1. Hodnooty jsou prům měrem ze tříí biolog gických vzorků z jednoh ho experime entu. Chybov vé úsečky představují p sstřední chyb bu průměru.. Množžství JN2 se průkazně ne eliší od JN3 n na základě nepárového t--testu (p < 0,,01).

37

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 8 Indukce re ezistence prre-inokulací L L. maculans s v děložních listech B. nnapus odrůdy y Columbus.. Levá polovina dě ěložního listu u byla inoku ulována vodo ou (mock), virulentním v ((JN2) nebo avirulentním m izoláttem (JN3). Po P 1 dni nebo 3 dnech h byla inokullována pravá á polovina liistu virulentn ním izolátem m (JN2)). Po 14 dn nech byly analyzovány příznaky zp působené JN N2 na pravé vé polovině listu. Vlevo:: Repre ezentativní listy s lézemi způsobenýými jak pre-inokulací, tak k vlastní inookulací. Vpra avo: Velikostt lézí zzpůsobených h JN2 v záv vislosti na izo ém pro pre--inokulaci a časovém od dstupu mezii olátu použité oběm ma inokulace emi. Plocha byla změře ena pomocí analýzy obrrazu. Hodnooty jsou průměrem z 20 0 analyyzovaných lisstů pro každé é ošetření. C Chybové úse ečky představ vují střední cchybu průmě ěru. Hodnotyy průka azně se lišíccí od kontroly y (mock) na základě nep párového t-te estu jsou oznnačeny * (p < 0,05) a *** (p < 0 0,01).

5.1.4 4 Změny hladin rostlin nných horm monů vyvo olané rozpo oznáním geenu AvrLm m1 Obra anné reakcce rostlin napadených n h patogeny jsou často spojené s tvorbou rostlinných h horm monů (PIETERSE et al., a 2009). Proto jsme e chtěli zjistit, zda jje syntéza některého o z horrmonů ovliivněna roz zpoznáním genu AvrrLm1. Pom mocí kapal inové chro omatografie e s hm motnostně spektrometrickou detekkcí (LC-MS)) jsme v listtech infikovvaných jak virulentním, v , tak a avirulentním m izolátem v průběhu 1 0 dnů od in nokulace sle edovali změěny všech re elevantních h rostliinných horm monů s výjjimkou etyllénu. Stano ovena byla kyselina abscisová (ABA), jejíí katab bolický produkt kyselina fazeová á (PA), kys selina indolyl-3-octováá (IAA) a je ejí inaktivníí konju ugát IAA-asspartát (IAA A-Asp), kyse elina salicy ylová, jasmo onová, gibeerelin 4 a giberelin 20.. Změny v obsah hu hormonů ů jsme neslledovali po 10. dni od d inokulacee, abychom se vyhnulii patollogickým zm měnám spojjeným se vzznikajícími lézemi. Hladina většiny hormonů nebyla n infekkcí L. macu ulans ovlivn něna. Avšakk infekce avirulentním a m yntézu kyse eliny salicylové počínaje 5. dnem od inokulace. Hladina a izolátem JN3 indukovala sy prudce vzrůsstala až do 10. dne, kd dy dosáhla 13x vyšší koncentracee, než byla pozorována p a SA p v neiinokulovanýých rostlinác ch (Obr. 9).. Syntéza SA S byla indu ukována takké virulentníím izolátem m JN2, avšak pozzději a v podstatně m menší míře, než v příp padě JN3. Kromě SA A zvyšovala a infekkce JN2 i tvorbu t kyse eliny abscissové. Její nárůst n byl patrný až 10. den po o inokulaci.. Hladina kyselinyy abscisové é nebyla ovl ivněna infekcí izolátem m JN3 (Obr.. 9)

38

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 9 Stanoveníí hladiny rosttlinných horm monů v dělož žních listech B. napus cvv. Columbus infikovaných h virule entním (JN2) nebo aviru ulentním (JN N3) izolátem m L. maculan ns. Pomocí LC-MS byly y stanovenyy kyselina abscisovvá (ABA), ky yselina fazeo ová (PA), kyselina indoly yl-3-octová (IIAA), IAA-as spartát (IAA-Asp), kyselina sa alicylová (SA A), kyselina jasmonová (JA), gibere elin 4 (GA4)) a giberelin 20 (GA20).. Hodn noty jsou průměrem z třří biologickýých opaková ání. Chybové é úsečky přředstavují střední chybu u průměru. Hodnotyy průkazně se s lišící od ko ontroly (mock) jsou označ čeny * (p < 00,05) a ** (p < 0,01).

39

5. Výsledky a diskuze 5.1.5 Identifikace markerových genů pro obranné signální dráhy v B. napus Na základě výsledků stanovení rostlinných hormonů jsme chtěli dále studovat úlohu hormonální signalizace při rozpoznání genu AvrLm1. Standardním nástrojem pro tento účel je analýza exprese markerových genů. Mnoho takových genů je známo v modelových rostlinách Arabidopsis thaliana nebo rýži (Oryza sativa), avšak pro B. napus není až na výjimky dostupný žádný vhodný markerový gen. Využili jsme příbuznosti B. napus s rostlinou Arabidopsis thaliana a pokusili se nalézt homologní sekvence k známým markerovým genům z A. thaliana. Genom B. napus sice není dosud přečten, ale ve veřejných databázích nukleotidových sekvencí je uloženo velké množství EST (expressed sequence tag), které představují krátké a neanotované úseky cDNA. Při výběru markerových genů jsme se zaměřili na signální dráhy tří hormonů. Jasným kandidátem byla kyselina salicylová (SA). Dále jsme vybrali hormon etylén (ET), který nemohl být z technických důvodů stanoven pomocí LC-MS, a posledním kandidátem byla kyselina jasmonová (JA). I když jsme nepozorovali změnu v hladině JA po infekci L. maculans, vybrali jsme tuto signální dráhu pro další experimenty, protože společně s SA a ET patří ke klíčovým prvkům signalizace v reakci na napadení patogenem (PIETERSE et al., 2009). Homologní sekvence B. napus se podařilo nalézt pro většinu požadovaných markerových genů. Abychom ověřili, zda se skutečně jedná o markerové geny dané signální dráhy, změřili jsme expresi každého genu v rostlinách ošetřených benzothiadiazolem (BTH; funkční analog SA), kyselinou 1-aminocyklo-propankarboxylovou (ACC, prekurzor etylénu) a metyljasmonátem (MeJA), který je v rostlinách metabolizován na aktivní konjugáty JA (TAMOGAMI et al., 2008). Pro signální dráhu SA jsme vybrali markerové geny ICS1, PR-1 a WRKY70. ICS1 (ISOCHORISMATE SYNTHASE 1) se podílí na biosyntéze SA při napadení patogenem. Jeho exprese je indukována některými patogeny. Samotná SA jeho expresi neovlivňuje (WILDERMUTH et al., 2001). Jako ortolog ICS1 v B. napus jsme identifikovali EST EV225528. Obdobně jako v A. thaliana nebyla exprese tohoto genu v B. napus ovlivněna ani jedním z testovaných induktorů (Obr. 10). PR-1 (PATHOGENESIS-RELATED GENE 1) je široce používaným markerem signální dráhy SA u rostlin A. thaliana. Jeho ortolg v B. napus (BNU21849) byl již naklonován HANFREY et al. (1996). Dle očekávání byl gen PR-1 silně indukován BTH. ACC a MeJA rovněž průkazně zvyšovaly expresi PR-1, ale v porovnání s BTH jen zanedbatelně (Obr. 10). WRKY70 je transkripční faktor regulovaný SA (LI et al. 2004b). Jeho homologní EST v B. napus bylo průkazně a specificky indukováno BTH (Obr. 10). Gen ACS2 (1-AMINO-CYCLOPROPANE-1-CARBOXYLATE SYNTHASE 2) byl vybrán jako marker pro signální dráhu ET. Jedná se o zástupce rodiny genů kódujících ACC syntázu, klíčového enzymu biosyntézy ET. Podle analýzy veřejně dostupných transkriptomických dat v aplikaci Genevestigator (HRUZ et al., 2008) jsou patogeny indukovány pouze geny ACS2 40

5. Výsledky a diskuze a ACS6, přičemž ACS2 je indukován širším spektrem patogenů. V EST databázi GenBank jsme nalezli EST ES980359 s vysokou podobností k ACS2 z A. thaliana. Přes opakované pokusy s různými primery jsme nebyli schopni detekovat transkript v neošetřených rostlinách. Domnívali jsme se proto, že dochází k indukci jiného, blízce podobného genu. Špatnou účinnost qPCR reakce jsme si vysvětlovali neúplnou komplementaritou primerů. Kombinací primerů navržených na ES980359 a na sekvenci ACS3 (AF338652) z Brassica oleracea se nám podařilo amplifikovat produkt o délce 1 kb, který byl transkriptem hledaného genu, neboť byl detekován pouze ve vzorku cDNA z infikovaných rostlin (Obr. 11). Ze sekvenačních dat vyplynulo, že produkt amplifikace byl směsí dvou různých sekvencí. První byla zcela identická s EST ES980359. Podle nomenklatury genů rodu Brassica (ØSTERGAARD A KING, 2008) byla pojmenována BnaX.ACS.a a uložena do databáze GenBank, kde jí byl přidělen identifikátor HM450312. Druhá sekvence byla z 99 % identická se sekvencí ACS3 z B. oleracea. Sekvence byla pojmenována BnaX.ACS.b a bylo jí přiděleno číslo HM450313. Vzhledem k rovnoměrnému zastoupení obou transkriptů mezi sekvenovanými plasmidy, je exprese těchto genů v řepce podobně regulována. Sekvence navzájem vykazují identitu 95 % a liší se zejména v úseku 9 nukleotidů odpovídajících třem aminokyselinám,

které

v transkriptu

BnaX.ACS.b

chybí.

Této

delece

jsme

využili

pro navržení primerů specifických vždy jen k jedné ze sekvencí. Při analýze exprese však bylo opět obtížné detekovat transkripty obou genů v kontrolních rostlinách, přičemž exprese v infikovaných rostlinách byla velmi podobná u obou genů. Spolehlivě jsme mohli expresi v neošetřených rostlinách změřit až po optimalizaci podmínek reakce a zvýšení množství cDNA přidané do reakce. Protože reakce měla s primery pro BnaX.ACS.a na základě kalibračních křivek 99 % účinnost, domníváme se, že nízká bazální exprese odpovídá skutečnosti a není artefaktem metody. Problémy s detekcí transkriptů genů ACS v neindukovaných rostlinách byly popsány při pokusech s A. thaliana (TSUCHISAKA et al., 2009). Pro další práci jsme zvolili gen BnaX.ACS.a a v textu je dále uváděn jen jako ACS2a. Gen ACS2a byl indukován BTH, ACC i MeJA (Obr. 10). Tento fakt by mohl komplikovat interpretaci výsledků získaných z analýzy exprese ACS2a. Avšak exprese ACS genů koreluje přímo s produkcí ET (ARGUESO et al. 2007), tudíž ACS2a je vhodným markerem pro signální dráhu ET. Další dva markerové geny HEL, též zvaný PR-4 (PATHOGENESIS-RELATED 4), a chitináza (CHI), jsou v A. thaliana transkripčně regulovány jak signální dráhou ET, tak i JA (NORMANSETTERBLAD et al., 2000). Jako ortolog HEL v B. napus jsme identifikovali EST FG577475. Gen CHI byl již dříve naklonován v B. napus (RASMUSSEN et al., 1992) a tuto sekvenci (X61488) jsme použili pro navržení primerů. Stejně jako v Arabidopsis byly oba geny v B. napus indukovány ošetřením ACC a MeJA. Gen CHI byl navíc indukován i BTH a jeho expresní profil je tudíž velmi podobný ACS2a (Obr. 10). 41

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 10 Exprese e markerových genů v d děložních listech řepky 24 hodin poo ošetření an nalogem SA A benzo othiadiazolem m (BTH), prrekurzorem etylénu 1-am minocyklopro o-pankarboxy xylovou kyse elinou (ACC)) nebo po inkubacci v boxech s atmosférou u metyljasm monátu (MeJA). Kontrolnní rostliny by yly ošetřenyy vodou u nebo inku ubovány v uz zavřených bo oxech (moc ck). Hodnoty y jsou průměěrem ze tří biologických h opako ování a chybové úsečky y představuj í střední chy ybu průměru u. Hodnoty pprůkazně zvý ýšené oprotii kontrrole jsou ozna ačeny * (p < 0,05) a ** (p p < 0,01).

Jako o markerové é geny pro o signální d dráhu JA byly b vybrány y AOS a LLOX3. AOS S (ALLENE E OXID DE SYNTHA ASE) je gen podílejícíí se na bios syntéze JA. Jeho exprrese je regu ulovaná JA,, což představuje e pozitivní zpětnou va azbu (LAUD DERT et al., 1998). LO OX3 je člen nem rodinyy lipoxxygenáz, z nichž n někte eří zástupci se rovněž podílejí na a syntéze JJA. Pro gen n AOS byla a v řep pce nalezen na homolog gní sekvencce EV12432 23 a pro LO OX3 EV1133862. Stejn ně jako v A.. thalia ana byly ob ba geny silně induková ány ošetřeníím MeJA. Gen G AOS byyl zároveň indukován i i ACC C, ale v podsstatně menš ší míře (Ob r. 10). Obr. 11 P PCR amplifikace transkrip ptu domněléého genu AC CS2 z cDNA rostlin B. n napus. Produkty reakce byly separovvány na 2 % agarózové elektroforé éze. S – délk kový standarrd DNA, C – produkt reak kce s cDNA z neošetře ených rostliin, Lm – produkt reeakce s cD DNA rostlin infikovanýých L. macula ans.

42

5. Výsledky a diskuze 5.1.6 Exprese markerových genů v infikovaných rostlinách Nalezené markerové geny jsme použili pro sledování signalizace při interakci řepky nesoucí gen rezistence Rlm1 s izoláty L.maculans JN2 a JN3. Exprese markerových genů byla sledována v děložních listech v průběhu prvních 10 dnů infekce pomocí RT-qPCR. V souladu s výsledky stanovení rostlinných hormonů indukovaly oba izoláty všechny tři markerové geny SA. U rostlin infikovaných virulentním izolátem JN2 došlo ke zvýšení exprese WRKY70 a PR-1 sedm dní po inokulaci. Exprese genu ICS1 se průkazně zvýšila až 10. den (Obr. 12). Izolát JN3 nesoucí gen avirulence AvrLm1 indukovaly tyto geny podstatně dříve a ve větší míře. Geny ICS1 a WRKY70 byly v listech infikovaných JN3 indukovány již první den po inokulaci a jejich exprese společně s genem PR1 prudce narůstala počínaje 5. dnem po inokulaci (Obr. 12). Rozpoznání genu AvrLm1 je tudíž spojené se silnou indukcí genů signální dráhy SA. Poněkud překvapivě indukovala infekce izolátem JN3 i markerový gen signální dráhy ET ACS2a a geny HEL a CHI, jejichž exprese je regulována ET i JA. Expresní profil těchto tří genů byl podobný markerovým genům SA, ale k výrazné indukci došlo až 7 dní po inokulaci. JN2 indukoval pouze gen ACS2a. Nárůst exprese byl patrný až 10. den a v porovnání s JN3 byl slabší. Proto se zdá, že indukce těchto genů byla více specifická k interakci s genem AvrLm1, než tomu bylo u markerových genů signální dráhy SA. Tak, jako jsme nezaznamenali nárůst v koncentraci JA v infikovaných listech, nedošlo ani k ovlivnění exprese markerových genů JA. Exprese AOS i LOX3 setrvávala na stejné hladině po celou dobu experimentu nezávisle na ošetření (Obr. 12).

43

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 12 Exprese markerovýc ch genů sign álních drah kyseliny salicylové (SA),, etylénu (ET T) a kyselinyy jasmo onové (JA) v děložních h listech B. napus cv. Columbus infikovanýcch virulentním (JN2) a avirullentním (JN3 3) izolátem Leptosphaeri L ria maculans s. Kontrolní rostliny byly iinfiltrovány vodou v stejně ě jako p při procesu inokulace (m mock). Hodno oty jsou prům měrem ze tří nezávislých biologických h opakování.. Chyb bové úsečky představují střední chyybu průměru u. Hodnoty průkazně p se lišící od mock jsou na a zákla adě nepárové ého t-testu oz značeny * (p p < 0,05) neb bo ** (p < 0,01).

44

5. V Výsledky a diskuze 5.1.7 7 Úloha SA A, ET a JA v obrané re eakci na na apadení L. maculans m Aktivvace jakéko oliv signálníí dráhy by neměla být automatic cky spojováána s obran nnou reakcíí rostliiny. Mnoho patogenů manipuluje m hormonální signalizac ci hostitelskéé rostliny ja ako součástt své infekční sttrategie (PIETERSE ett al., 2009). Proto js sme farmakkologickým přístupem m umali úlohu signálních drah při intterakci B. napus n – L. maculans. m yly ošetřenyy zkou Rostliny by eJA za stejných podm mínek, jaké byly použity y pro ověřeení markero ových genů,, BTH, ACC a Me ány virulenttním izoláte em JN2. Léze L vyvolaané infekcíí byly poté é a nássledně bylyy inokulová změřřeny pomo ocí analýzy obrazu. A Aktivace signální dráh hy SA ošeetřením BT TH výrazně ě zmen nšila velikosst lézí. Obdobně, ale v menší míře e indukovalo rezistencci k JN2 i oš šetření ACC C (Obr. 13). Přízznaky vyvo olané JN2 2 na listec ch ošetřený ých BTH připomínaly y příznakyy 3 na neošettřených liste ech odrůdyy Columbus. Léze bylyy způssobené avirulentním izolátem JN3 drobné, tmavé a hluboce zanořené do pletiva. Oproti pře edchozím ddvěma látká ám nemělo o ošetřření MeJA na n rozvoj ch horoby žádn ný vliv (Obrr. 13).

Obr. 13 Indu ukce reziste nce ošetřením induktoryy signálních drah. Roostliny byly y ošetřenyy postřikem funkčním annalogem SA A benzothia-diazolem (B BTH), prekurz rzorem etylénu 1-amino-cyklopropankarboxylovouu kyselinou (ACC) nebo o po inkub baci v bboxech s atmosférou u metyljasmon nátu (MeJA)). Kontrolní rostliny bylyy ošetřeny vodou nebo innkubovány v uzavřených h boxech (mo ock). Po inookulaci izoláttem JN2 byll sledován rozvoj lézí anaalýzou obrazu. Hodnotyy jsou j průmě ěrem z 24 listů. Chybo ové úsečkyy představují střední chyybu průměrru. Hodnotyy průkazně se e lišící od ko kontroly jsou na základě ě nepárového t-testu oznaačeny ** (p < 0,01).

5.1.8 8 Tvorba pe eroxidu vodíku a uklá ádání kalóz zy Inkom mpatibilní in nterakce je e často dop provázena tvorbou t rea aktivních forrem kyslíku u v okolním m pletivvu (TORRES S et al., 200 06). Sledovvali jsme prroto tvorbu H2O2 běheem deseti dnů d infekce e izoláty JN2 a JN N3 pomocí barvení dia amnobenzidinem (DAB B). Tato láttka v přítom mnosti H2O2 meruje a vytváří v tak nerozpustn nou hnědou u sraženinu u. Zatímco v počátečn ních fázích h polym infekkce nebylo jakékoliv zb barvení pozo orováno, 8 dní po inok kulaci bylo nna listech in nfikovaných h JN3 patrné inte enzivní zba arvení loka alizující H2O2. Naproti tomu listyy infikované é JN2 bylyy zbarvveny jen slabě a sraž ženina mělla difúzní charakter c (O Obr. 14 A).. Intenzivně ě zbarvená á ploch ha listu byla a pětkrát vě ětší v děložžních listech h inokulova aných JN3, než tomu bylo u listů ů s JN2 2 (Obr. 14 4 B). V liste ech ze ste ejných rostlin jsme zároveň obarrvili myceliu um pomocíí aktivvity GUS, ab bychom mo ohli srovnat stav infekc ce mezi obě ěma izoláty v době, kdy y na listech h nejso ou patrné příznaky choroby. c Na a listech in nfikovaných h JN3 byloo obarvené é mycelium m

45

5. V Výsledky a diskuze sousstředěno do jednoho ne ebo několikka málo drobných ohnis sek. Ve stej ejnou dobu zasahovalo z o

A

B

5%

Obravená p plocha listu

myce elium JN2 jiiž značnou část listu (O Obr. 14 A).

4%

**

3% 2%

*

1% 0%

N2 neošš. mock JN

JN3

Obr. 14 Tvorba peroxidu p vod díku v listech h řepky 8 dn ní po inokulaci virulentním m (JN2) a avirulentním a (JN3)) izolátem Leptosphaeri L ia maculanss. Kontrolní rostliny r neby yly ošetřenyy nebo byly infiltrovány vodou u stejně jako o při procesu u inokulace ((mock). A, Reprezentativ R vní snímky liistů v době odběru o jsou takřka a bez přízna aků; tytéž listy s mycelie em obarven ným pomocí GUS; přítom mnost perox xidu vodíku v liste ech indikova aná hnědou sraženinou d diaminobenz zidinu (DAB)). B: Podíl ccelkové plochy listu, ve kterém byla analýzou a obrazu o dete ekována sraženina DAB. D Hodnnoty jsou průměrem z 20 a analyzovanýých listů pro každé ošettření. Chybové úsečky představují p sstřední chybu průměru. Hodn noty průkazně se lišící od kontroly (m mock) na základě nepáro ového t-testuu jsou označ čeny * (p < 0,05)) a ** (p < 0,0 01). Výsledky y byly potvrzzeny ve čtyřech nezávislý ých biologickýých opaková áních.

Rosttliny dokážží zpevnit svou buně ěčnou stěn nu v místě napadení patogenem m. Jednou u z nejjhojnějších látek ukládaných do n nově vznikajjících bariér je polysaccharid kalóz za (HÉMATY Y et al.., 2009). Ka alóza je nez zbytná pro rrezistenci ro ostlin A. thaliana k L. m maculans (S STAAL et al.,, 2006 6). Pomocíí barvení anilinovou modří jsm me kvantifik kovali depoozici kalóz zy v listech h infiko ovaných JN N2 a JN3, ab bychom objjasnili úlohu u tohoto obrranného meechanismu v rezistencii vyvolané rozpoznáním genu avirulen nce AvrLm1 1. Průkazná á depozice kalózy byla vyvolána a ma izoláty 3 dny po inokulaci (Ob br. 10 B). Její J množstv ví v listech narůstalo s průběhem m oběm infekkce, avšak v ostrém ko ontrastu se tvorbou SA A, expresí markerovýc m ch genů a tvorby H2O2 bylo více kalózzy detekov váno v liste ech infikova aných JN2 (Obr. 10 B). Uklád dání kalózyy indukkované infe ekcí JN3 byllo lokalizová áno do pom měrně malýc ch shluků v porovnání s JN2, kde e byla kalóza rozp ptýlena po velké v oblastti pletiva (O Obr. 10 A). 9 Gen AvrL Lm1 je zodp povědný za a rozdíl ve virulenci iz zolátů JN2 a JN3 5.1.9 Zjistili jsme, že e rostliny B. B napus ne esoucí gen n rezistence e Rlm1 od povídají na a napadeníí genem s korespondu ujícím gene em avirule ence AvrLm m1 aktivacíí několika obranných h patog mech hanismů. Tyy jsou příčin nou dramattického rozd dílu mezi virulentním a avirulentníím izolátem m L. ma aculans ve schopnosti kolonizova at hostitelsk ké pletivo (O Obr. 6 B). R Rostlina však k nedokáže e zcela a zastavit rů ůst avirulen ntního izoláttu (Obr. 7 B). B Rozdíl ve v virulenci mezi oběm ma izoláty je e 46

5. V Výsledky a diskuze jedno označně za apříčiněn ro ozpoznáním m genu AvrrLm1 rostlin nou, protožže při inoku ulaci rostlin n řepkyy postrádajících gen Rlm1 R se ob ba izoláty projevily p jak ko virulentníí (Obr. 6 B). B Obranné é reakcce vyvolan né avirulen ntním izolá átem zpom malily rozvo oj chorobyy virulentního izolátu u na op pačné polo ovině listu, což ukazu uje na existtenci přinejjmenším čáástečně sys stemického o signá álu spuštěn ného rozpoz znáním gen nu AvrLm1. Tento efek kt byl silnějšší při delším m časovém m odstu upu mezi oběma o inok kulacemi (O Obr. 8). Tudíž pro akttivaci obrannných mechanismů je e nezb bytný delší časový č úsek k.

A

Obr. 15 Ukládáníí kalózy v dě ěložních liste ch v průběhu u infekce L. maculans. K Kalóza byla obarvena o in situ a anilinovou modří a detek kována fluore escenční mik kroskopií. A, Reprezentaativní snímky y 10 dní po inoku ulaci virulentn ním (JN2) a avirulentním m (JN3) izolá átem při 50x x zvětšení. K Kontrolní rosttliny nebyly ošetřřeny nebo byly infiltrová ány vodou sstejně jako při p procesu inokulace (m mock). B, Kvantifikace K kalózzy analýzou obrazu mik kroskopickýcch snímků. Hodnoty H jsou průměrnýým počtem žlutozeleně ž zbarvvených pixellů na 40 sn nímcích z lisstů 10 rostlin n. Chybové úsečky přeedstavují stře ední chybu průměru. Hodnotty, které se na základ nepárového o t-testu liší mezi JN2 a JN3, jsou u označeny * (p < 0,05) nebo ** (p < 0,01)). Podobné vvýsledky byly y získány ve dvou nezávisslých opakov váních.

5.1.1 10 Souhra SA S a ET přři signalizac ci vyvolané é rozpozná áním AvrLm m1 Rozp poznání AvvrLm1 spouští v napa adené rosttlině syntéz zu SA (Obbr. 9) a expresi e SA A markkerových ge enů ICS1, PR-1 P a WRK KY70 (Obr. 12). Ošetře ení rostlin fuunkčním an nalogem SA A benzzothiadiazolem indukov valo v rostl inách rezis stenci k viru ulentnímu izzolátu (Obrr. 13). Tyto o výsle edky potvrzzují klíčovou úlohu SA A v rezistenci B. nap pus k L. maaculans. Ke e stejnému u závě ěru došli i POTLAKAYALLA et al. (2 007). Průběh exprese e SA markeerových genů koreluje e s růsstem avirule entního izolátu. Proto se domnívá áme, že ná árůst expresse je dán přibývajícím p m počte em buněk, které se dostanou d do přímého o kontaktu s patogeneem a nikoliv rostoucíí inten nzitou obran nné reakce v rámci jed dné buňky. Rostliny re eagovaly naa AvrLm1 již ž první den n po in nokulaci zvýýšenou exp presí SA ma arkerů ICS1 a WRKY70. V té doobě spory L. L maculanss teprvve začínajíí klíčit a exprese e ge enu AvrLm m1 je velm mi nízká (F FUDAL et al., 2007).. Mech hanizmus ro ozpoznávajjící AvrLm1 nebo jeho o působení musí být exxtrémně citlivý. Časné é

47

5. Výsledky a diskuze rozpoznání proteinu AvrLm1 zároveň ukazuje na jeho možnou úlohu v časných fázích infekce. Kromě aktivace signální dráhy SA jsme po infekci avirulentním izolátem pozorovali i indukci genu ACS2a podílejícím se na biosyntéze ET a dalších dvou genů HEL a CHI, jejichž exprese je v rostlinách regulována ET a JA (Obr. 12). Neboť exprese JA markerových genů AOS a LOX3 stejně jako hladina JA nebyly infekcí ovlivněny, jsme přesvědčeni, že indukce genů HEL a CHI byla důsledkem zvýšené hladiny ET v rostlinách. Podobně jako v případě SA, chemická indukce signální dráhy etylénu zvýšila odolnost rostlin k virulentnímu izolátu L. maculans (Obr. 13). To je další důkaz o zapojení ET do obranné reakce vyvolané rozpoznáním genu AvrLm1. Exprese markerových genů ET se zvýšila až 7. den po inokulaci a na rozdíl od SA k indukci téměř nedocházelo v rostlinách infikovaných virulentním izolátem (Obr. 12). Zajímavé je, že po 7. dnu došlo i k zpomalení růstu avirulentního izolátu. Tato souvislost naznačuje, že by ET mohl být vedle SA dalším prvkem nezbytným pro restrikci kolonizace pletiva patogenem. SA je v několika rostlinných druzích hlavním regulátorem obranných mechanismů účinných proti biotrofům (PIETERSE et al., 2009). Úloha ET v obranných reakcích tak jasná není. ET ovlivňuje vývoj choroby jak pozitivně, tak negativně v závislosti na konkrétní interakci rostlina-patogen (BROEKAERT et al. 2006). V modelové rostlině Arabidopsis thaliana ET společně s JA regulují obranné mechanismy účinné proti některým nekrotrofům. Vztah signálních drah ET a JA k signální dráze SA je neutrální nebo dokonce antagonistický (BROEKAERT et al., 2006). Tudíž současná aktivace signálních drah SA a ET po rozpoznání AvrLm1, jak jsme ji pozorovali v našich experimentech je neobvyklý jev, ale v několika publikacích byl již popsán. Rostliny rajčete produkují velké množství SA a ET při interakci s proteiny kódovanými geny avirulence Avr2 a Avr9 patogena Cladosporium fulvum (HAMMOND-KOSACK et al., 1996). Rostliny Nicotiana benthamiana s umlčenými geny ICS1 EIN2, nezbytnými pro funkci signální dráhy ET a SA, byly náchylnější k infekci patogenem Phytophtora infestans, zatímco umlčení hlavního regulátoru JA signalizace COI1 odolnost rostlin neovlivnilo (SHIBATA et al. 2010). SA i ET jsou nezbytné pro rezistenci rostlin A. thaliana k žlutému kmeni viru mozaiky okurky zprostředkované genem RCY1. (TAKAHASHI et al., 2002). Dvě poslední publikace rovněž ukázaly, že pro rezistenci nebyl nezbytný gen NPR1, což ukazuje na existenci alternativní SA signální dráhy nezávislé na proteinu NPR1. Infekce Xanthomonas campestris pv. vesicatoria se na rostlinách projevuje vznikem chlorózy. Tyto symptomy však nebyly patrné v rostlinách s narušenou signální dráhou SA a ET (O’DONNELL et al., 2001). Chlorózu jsme pozorovali i na děložních listech infikovaných avirulentním izolátem (Obr. 6 C). Mechanismus vzniku chlorózy je podobný senescenci, která je častou reakcí rostlin na stresy vyvolané vnějším prostředím, včetně infekce patogeny (GAN A AMASINO, 1997). Složitá regulace senescence zahrnuje kromě jiných faktorů 48

5. Výsledky a diskuze i produkci SA, ET a reaktivních forem kyslíku (LIM et al., 2007). Tyto tři prvky byly indukovány i infekcí avirulentním izolátem (Obr. 9, 12 a 14). Je tedy možné že rostliny řepky využívají senescenci jako obrannou strategii, aby zabránily šíření L. maculans skrz řapík do stonku. 5.1.11 Úloha peroxidu vodíku a kalózy v rezistenci zprostředkované genem Rlm1 Při inkompatibilní interakci řepky s L. maculans jsme detekovali tvorbu peroxidu vodíku krátce před vznikem příznaků připomínajících makroskopickou hypersenzitivní reakci. Protože oxidativní vzplanutí zpravidla předchází hypersenzitivní reakci (MUR et al., 2008), domníváme se, že i v interakci Rlm1 – AvrLm1 spočívá úloha H2O2 v zprostředkování hypersenzitivní reakce. Tvorba H2O2 patří mezi jedny z nejčasnější obranných reakcí. Poměrně pozdní výskyt této reakce v našich experimentech je možné vysvětlit i malou citlivostí metody založené na DAB. Buňky rostliny, které přijdou do přímého kontaktu s patogenem, zpevňují svou buněčnou stěnu kalózou (HÉMATY et al., 2009). V našich pokusech jsme pozorovali více kalózy v listech infikovaných izolátem virulentním než avirulentním (Obr. 15). Avšak množství mycelia bylo podstatně větší v listech inokulovaných virulentním izolátem, zejména v pozdějších fázích infekce (Obr. 7). Mnohem více buněk je tak přímo v kontaktu s hyfami a může na ně odpovídat depozicí kalózy. Nemůžeme tedy jasně říci, jestli je kalóza nezbytná pro rezistenci zprostředkovanou genem Rlm1, ale na rozdíl od H2O2 a signálních drah SA a ET není její ukládání specificky vyvolané rozpoznáním AvrLm1. V rozporu s našimi výsledky ROUSSEL et al. (1999) pozorovali pomocí imunologické detekce více kalózy v infikovaných listech rezistentních odrůd. 5.1.12 Obranné reakce při kompatibilní a inkompatibilní interakci Při srovnání obranných reakcí na napadení virulentním a avirulentním izolátem docházelo u obou patogenů k indukci stejných prvků signálních drah. Rozdíl mezi izoláty byl především v míře indukce těchto reakcí. Např. tvorba SA (Obr. 9) a exprese markerových genů SA a ET (Obr. 12) byla zvýšená po napadení oběma izoláty, avšak v případě avirulentního izolátu byla odezva rostliny vždy výrazně silnější. Protože aktivace obou drah chemickými induktory měla negativní vliv na rozvoj infekce (Obr. 13), nezdá se, že by jejich indukce virulentním izolátem byla součástí jeho infekční strategie. Pravděpodobnějším vysvětlením je přítomnost dalšího genu avirulence v genomu JN2, který v rostlinách vyvolává tytéž, ale výrazně slabší obranné reakce. Na základě teorie JONES A DANGL (2006) se nabízí i jiná příčina tohoto jevu. Aktivace signálních drah SA a ET by mohla být vyvolána rozpoznáním evolučně konzervovaných molekul přítomných v obou izolátech L. maculans. Za normálních okolností by efektory L. maculans výrazně tlumily obranné reakce rostliny a oba izoláty by byly schopné úspěšně kolonizovat pletivo hostitele tak, jak jsme to pozorovali v případě experimentů s odrůdou Westar postrádající gen rezistence Rlm1 (Obr. 6 B a 7 C). 49

5. Výsledky a diskuze Při interakci s rostlinami odrůdy Colmbus (Rlm1) by však v důsledku rozpoznání AvrLm1 došlo k aktivaci paralelní signální dráhy, což by mělo za následek vysokou produkci SA a ET, jakožto klíčových molekul řídících obranné mechanismy řepky proti L. maculans. V rostlinách inokulovaných virulentním izolátem L. maculans byla v pokročilém stádiu infekce detekována mírně zvýšená hladina kyseliny abscisové (ABA). Protože tento nárůst nebyl pozorován při inkompatibilní interakci, domníváme se, že zvýšená tvorba ABA není součástí obranných reakcí rostliny. L. maculans může indukovat ABA pro svůj vlastní prospěch. Pseudomonas syringae sekretuje do napadené buňky efektory, které v rostlině vyvolávají biosyntézu ABA, čímž potlačí ostatní signální dráhy, s kterými je ABA v antagonistickém vztahu (DE TORRES-ZABALA et al., 2007). Zvýšená hladina ABA by mohla být i důsledkem sesychání listu, které jsme pozorovali 14 dní po inokulaci virulentním izolátem (Obr. 6 C). Akumulace ABA během usychání je dlouho známým jevem (ZEEVAART, 2009). Mohlo by se jednat i o proces řízený rostlinou. ROUSSEL et al. (1999) pozorovali časté okluze cév při kompatibilní interakci řepky s L. maculans. Geny avirulence jsou často efektory, sloužící patogenům k překonání obranných mechanismů rostliny (JONES A DANGL, 2006). Jejich efekt bývá patrný při interakci s rostlinami bez příslušného genu rezistence. Při srovnání izolátů JN2 a JN3 na odrůdě Westar (rlm1) nebyl patrný rozdíl v množství mycelia v inokulovaných listech (Obr. 7 C) ani v příznacích (Obr. 6 B), takže jsme nepozorovali jakýkoliv efekt AvrLm1. Stejnou otázkou se zabývali i Huang et al. (2010). V jejich experimentech AvrLm1 zvyšoval počet lézí, jejich velikost a množství mycelia v listech. Rozpor s našimi výsledky může být způsoben zcela různými experimentálními podmínkami. V práci Huang et al. (2010) byly pomocí askospor neinvazivně inokulovány pravé listy. Protože se účinek AvrLm1 projevil i na počtu lézí, ovlivňuje tento gen úspěšnost infekce spor a musí se tedy účastnit raných stadií infekce. To je v souladu s naším závěrem uvedeným výše. 5.1.13 Mechanismy rezistence vůči L. maculans v rostlinách B. napus a A. thaliana Naše výsledky prokazující důležitou úlohu SA a ET v rezistenci B. napus k L. maculans jsou zcela v rozporu s tím, co je známo z modelové rostliny A. thaliana. V této rostlině není pro rezistenci k L. maculans signální dráha SA nezbytná a ET pravděpodobně podporuje infekci (PERSSON et al., 2009). Zatímco v našich experimentech nebyla při inkompatibilní interakci pozorována změněná hladina ABA (Obr. 9), při inkompatibilní interakci A. thaliana s L. maculans dochází k nárůstu tvorby tohoto hormonu a rostliny s mutacemi v uzlech signální dráhy ABA jsou k infekci L. maculans náchylnější (KALIFF et al., 2007). Pro rezistenci A. thaliana k L. maculans je nezbytná tvorba kalózy (STALL et al., 2006), zatímco v našich experimentech s B. napus se kalóza jako klíčový faktor rezistence nejevila (Obr. 15). Naše závěry jsou založeny na výsledcích analýzy genové exprese, stanovení hormonů

50

5. V Výsledky a diskuze a farmakologickkých experimentů, za atímco poznatky z A. thaliana pocházejí především m ze sledování ro ostlin s mutacemi v ge enech různých signáln ních drah. Přesto je zřejmé, že e anismy těch hto dvou ro ostlin jsou zcela z odlišn né, i když sse jedná o příslušníkyy obranné mecha stejn né čeledi. Ačkoliv studium obrannýých mechanismů A. th haliana protti L. macula ans přineslo o celou u řadu novvých pozna atků, nelze je z velké é části upla atnit v hosppodářsky významném v m patossystému B. B napus – L. macculans. Tento fakt podtrhuje p nnezbytnost zkoumáníí mech hanismů rezzistence na a přirozenýcch hostitelích. 5.2 E Elicitory ob branných re eakcí z pattogena L. maculans m Izolá át L. macula ans JN2 ind dukoval v ro ostlinách řepky několik k obrannýchh reakcí (Obr. 9 a 12).. Přestože se jed dná o virulen ntní izolát, rostliny řepky na něj zjevně z reaguují. Tudíž L. L maculanss ekuly, které é rostlina rrozpoznává á. Tyto molekuly, zvaané elicitory y, jsme se e produkuje mole usili z L. maculans izolo ovat a identtifikovat. poku 5.2.1 1 Optimalizzace metod dy izolace e elicitorů z kultury k L. maculans m Mikro obiální elicittory se častto izolují z ttekutého ku ultivačního média. m Tutoo metodu js sme využili i pro n náš účel. Nejprve N vša ak musely být optimalizovány po odmínky kuultivace, ab bychom bylii scho opni dlouhod době produ ukovat dosttatečné mno ožství elicitorů. V prvnním kroku js sme hledalii ideállní způsob inokulace média L. maculans. Jako ideální se ukázzala inokula ace sterilníí susp penzí spor L. maculan ns v konečn né koncenttraci 105 sp por v ml (O Obr. 16). Po o ukončeníí kultivvace bylo z média odstraněno m mycelium a filtrát byl použit k oššetření rosttlin. Postřikk neup praveným filtrátem vyvolával na ro ostlinách tv vorbu drobn ných nekrottických skvrrn, nejspíše e kvůli přítomnosti toxinů. Tento T efekt jsme odstrranili dialýz zou přes m embránu s vylučovacíí mezíí 6-8 kDa. Účinky taktto upravené ého roztoku u jsme testtovali na děěložních listtech řepky.. Postřřik indukovval v rostlin nách SA markerové geny PR R-1 a WRK KY70 (Obrr. 17 A a B) zzmenšoval příznaky p vyv volané inokkulací L. ma aculans JN2 2 (Obr. 17 C C). Tyto výsledky jasně ě dium po kulttivaci L. macculans obsa ahuje látky s elicitační schopností. ukazzují, že méd

Obr. 16 1 Testová ní způsobů ů inokulace e tekutého o média ppro potřeby y získáváníí elicitorů L. maculans ns. Tekuté médium m Friess bylo in nokulováno segmenty agaru V8 8 s myceliem L. macculans JN2 (mycelium)) nebo su uspenzí spo r v konečné koncentracii 105 ne ebo 107 sspor/ml. Kultury K bylyy pěstová ány 14 dní naa orbitální tře epačce.

Pro kkultivaci jsm me původně ě používali médium Fries. Ukáza alo se však , že samotné médium m indukkuje v rostliinách expre esi genu PR R-1 (Obr. 17 1 A). Příčiinou je asi kvasničný hydrolyzát,, 51

5. V Výsledky a diskuze kterýý je jednou ze z složek média. m Z kva asinek byl iz zolován glukan, jako jeeden z prvních elicitorů ů (HAH HN a ALBERSHEIM, 19 978). Navícc by nám proteiny a peptidy z hydrolyz zátu mohlyy komp plikovat příípadné pro oteomické a analýzy. Proto jsme hledali jinéé médium s dusíkem m v ano organické fo ormě. Jako vhodné se jevilo modiifikované médium Gam mborg B5. L. L maculanss rostla a v tomto médiu m podobně jako v médiu Frie es a filtrát média m měl ssrovnatelno ou elicitačníí aktivvitu (Obr. 17 7).

Obr. O 17 Tes stování účinnnosti elicito orů. Rostlinyy byly ošetřeny y samotnými médii Fries a Gamborg g (G G) nebo fiiltráty 14-ti denních kultur k (Lm).. Kontrolní K ros stliny byly oošetřeny vodou a jako o pozitivní p kontrola byl použžit BTH. A a B, Relativníí exprese ma arkerových genů sign nální dráhyy kyseliny salicylové PR-1 a WRKY70 24 hodin po o ošetření. o C, Indukce rezisstence elicito ory. Rostlinyy byly tři dny po ošetření innokulovány infiltrací sporr JN2 a následně byla změřena plocha p lézí.. Hodnoty H jsou u průměrem m z 20 listů pro každé é ošetření. o Hod dnoty průkazzně se lišící od kontrolyy (v voda) jsou označeny ** ((p < 0,01).

Pro ideální růst kultury bylo o nutné udrž ržovat pH média m okolo hodnoty 6,88. Za tímto účelem byll média přidán fosfátový ý pufr, kterýý však při sterilizaci s prrecipitoval a komplikov val dialýzu.. do m Vhod dnou náhra adou byla kyselina 2--morfolino-e ethansulfonová (MES)). Filtráty kultivačního k o médiia připraven ného s oběma pufry m měly srovna atelnou elicitační aktiviitu (Obr. 18 8). Zároveň ň jsme e testovali vliv délky y kultivace na účinn nost filtrátu. Dvoutýdeenní kulturry v médiu u pufro ovaném ME ES vyvoláva aly v rostliná ách silnějšíí expresi ge enů PR-1 a WRKY70 než kulturyy sedm midenní (Ob br. 18 A a B). B Tento ro ozdíl ale ne ebyl patrný v inokulačnním testu (O Obr. 18 C).. Pro d další přípravvu elicitorů byla doba kkultivace sta anovena na a 10 dní.

52

5. V Výsledky a diskuze

Obr. O 18 Účinnost Ú el icitorů v zá ávislosti na a použitém p puffru. Média bbyla připravena s pufrem m MES M a fosfá átovým pufreem (PB). Rostliny R bylyy ošetřeny o filtrráty 7 a 114-ti denníc ch kultur L.. maculans. m Ko ontrolní rostl iny byly oše etřeny vodou u a jako pozitiv vní kontrola byl použit BTH. B A a B,, Relativní R exp prese markkerových ge enů signálníí dráhy kyselin ny salicylovéé PR-1 a WRKY70 W 24 4 hodin po ošettření. C, Induukce rezisten nce elicitory.. Rostliny R byly y tři dny poo ošetření inokuloványy in nfiltrací spor JN2 a nnásledně by yla změřena a plocha p lézí. Hodnoty H jsou průměrem z 20 listů pro o každé ošetře ení. Hodnotyy průkazně se lišící od d kontroly (voda a) jsou označčeny ** (p < 0,01).

5.2.2 2 Charakte erizace elicitoru Před dběžné výsledky nazna ačily protein novou pova ahu elicitorů ů z kultury L. maculan ns. Štěpeníí ných frakccí z ionexové chroma atografie trypsinem t ční aktivitu u účinn snížilo jejiich elicitač v rosstlinách B. napus (Lo orková, 200 08). Pro id dentifikaci elicitoru e byylo nezbytn né připravitt dosta atečné mno ožství proteinového vzo orku. Použili jsme tři rů ůzné metoddy koncentra ace vzorku.. Lyofiilizace měla a největší výtěžnost v prroteinu a úč činek lyofiliz zovaného vvzorku byl srovnatelný s ý ateriálem ja ak při ana alýze expre ese, tak i v inokulačnním testu (Obr. 19).. s výcchozím ma Nevýýhodou ve srovnání s s dalšími me etodami je absence a jak kékoliv seleektivity k po ovaze látky.. Krom mě proteinu jsou ve vz zorku samozzřejmě kon ncentrovány y i všechny ostatní látk ky, které byy mohlly působit komplikace k v dalším p postupu. Přii srážení ettanolem byyl ze vzorku u odstraněn n značčně velký precipitát, p pravděpodo p bně sacharidy. Tato metoda měěla nejnižší výtěžnostt prote einu a také é exprese markerovýcch genů by yly v porovnání s ostaatními meto odami nižšíí (Obr. 19). Z těcchto důvodů ů je srážen ní etanolem m pro naše e potřeby nnevhodné. Při sráženíí nem amonn ným jsme ro ovněž odstrranili velkou u, pravděpo odobně saccharidovou, sraženinu.. síran Výtěžžnost meto ody byla ve e srovnání s etanolem m lepší. Zna ačná část proteinu vš šak zůstala a nesra ažena v sup pernatantu, i přesto že e jsme použ žili 80 % na asycení rozttoku síranu amonného o 53

5. V Výsledky a diskuze (Obr. 19). Výtěžžnost nebyla vyšší ani při 94 % nasycení. Te ento netypiccký jev by bylo b možné é vysvě ětlit vysokýým zastoupe ením malýcch peptidů v kultivačním médiu. JJe pravděpo odobné, že e aktivvitou proteázz L. macula ans docházíí během kultivace k čás stečnému šštěpení proteinů.

Obr. 19 Srovnán ní metod kon ncentrace prroteinů z kulttivačního mé édia. Filtráty kultur L. ma aculans bylyy konce entrovány lyofilizací (G lyof), nebo b byly proteiny sráženy eta anolem (G E EtOH), případ dně síranem m amon nným, kdy vzznikl pelet (G G S-Pel) a su pernatant (G G S-Sup). Kontrolní rostlinny byly ošetřřeny vodou a jako pozitivní kon ntrola byl po oužit BTH. A a B, Relativní exprese e markerovýých genů sig gnální dráhyy kyseliny salicylové PR-1 a WR RKY70 24 ho odin po ošetřření. C, Indukce rezistencce elicitory. Rostliny R bylyy čtyři dny po ošettření inokulovány infiltraccí spor JN2 a následně byla změře na plocha lé ézí. Hodnotyy jsou průměrem z 20 listů prro každé oššetření. Hodn noty průkazn ně se lišící od kontroly (voda) jsou u označčeny ** (p < 0,01). D, Sta anovení protteinů modifik kovanou meto odou dle Low wryho. Konc centrace byla a přepo očtena na ob bjem výchozíího vzorku a vyjadřuje tak k výtěžnost metody. m

Jako o další krok k identifikaci elicitoru jjsme separrovali proteiiny vysrážeené síranem m amonným m (94 % nasycení) prepara ativní isoel ektrickou fokusací. f Protože P jsm me neznali jakoukolivv akteristiku hledaného proteinu, použili jsm me široký gradient g pH H s hodnota ami od 3,5 5 chara do 9,,5. Po fokussaci bylo ve e frakcích an nalyzováno o zastoupen ní proteinů ppomocí elek ktroforézy a stano ovení konccentrace proteinů. Věttšina proteinů se nac cházela ve velmi kyse elé oblasti.. Nejvíce proužků ů bylo v dvo ou nejkysele ejších frakcích (Obr. 20 0). Bylo by proto vhodn né fokusacii akovat s úzkkým gradien ntem v obla asti kyselého pH. Předběžné testoování elicita ační aktivityy zopa 54

5. V Výsledky a diskuze přine eslo překva apivý výsled dek. Největtší účinek měla m frakce e 1, zatímcco účinek frrakce 2 byll témě ěř zanedbattelný. Hleda aný protein by tedy mohl vykazov vat extrémnně kyselý iz zoelektrickýý bod. Obě frakcce obsahují mnoho růzzných prote einů a peptidů, avšakk je mezi nimi n značnýý překrryv. Proto by porovnání protein nů identifiko ovaných po omocí hmootnostní spektrometrie e v obo ou frakcích mohlo odhalit hledanýý elicitor. Nicméně nejdříve musím me potvrdit předběžné é

Množství proteinu (mg)

výsle edky testová ání elicitačn ní aktivity (O Obr. 20).

7 6 5 4 3 2 1 0

Stan novení celko ového množžství protein nu ve frakcíc ch IEF

Obr.2 20 Separece e proteinů isoelektricko i ou fokusací (IEF; Rotofor). Vzorek proteinů sráže ených sírane em amonným m byl separovván v gradientu pH 3,5-9 9,5. Po rozděělení bylo ze vzzorku odebrá áno 10 frakc cí pokrývajíc ích rozpětí pH. p Nahoře:: Analýza zaastoupení prote einů ve frakccích separova aných na 10 0 % Tricin-S SDS-PAGE. Na N gel byl nnanesen i filtrát kultivačního o média (G-L Lm) a pelet vvysrážený síranem amonným nasycceným do 94 % (S 94). Dolle: Stanoven ní množství p proteinů mod difikovanou metodou m dle Lowryho ve fra akcích po IE EF. Proteiny byly stanovveny i ve vz zorku nanese eném na IEF F (Load). Souččet množství proteinu ve všech v frakcícch je uveden n ve sloupci A1-A10. A

55

5. V Výsledky a diskuze 5.3 S k L. macullans Screening induktorů i rezistence r Jedn ním z hlavních cílů tétto práce byylo nalézt látku či láttky, které bby v řepce indukovalyy rezisstenci k L. maculans. m Standardem m pro srov vnání byl benzothiadiaazol (BTH),, u kterého o jsme e již dříve prokázali vysokou ú činnost (Obr. 13). V průběhu ře řešení bylo testováno o 40 rů ůzných látek a prepará átů, o kterýých se před dpokládalo, že by moohly zvyšova at odolnostt rostliin k L. macu ulans. V tom mto souborru bylo nale ezeno pouze e pět látek se zajímavými účinky,, z nicchž čtyři jso ou podobné ého původu u. Čtyři dallší látky vykazovaly poouze názna aky účinku,, které é je nutno ještě j ověřitt. Všechny ostatní látky se jeví jako nezajíímavé. V ná ásledujícím m textu u jsou uvede eny nejzajím mavější výssledky. 5.4 B BABA zmen nšuje přízn naky choro oby vyvolan né L. macu ulans První z nalezen ných látek účinných p roti L. mac culans je ky yselina β-am minomáseln ná (BABA).. ná se o je eden z nejz známějších induktorů rezistence. Účinky B BABA na rajčeti r protii Jedn Phyttophtora infe estans byly popsány jižž v roce 19 960, ale ned dostalo se jiim pozornosti (COHEN, 2). K intenzivnímu zko oumání a p praktickému využití BA ABA došlo až v polovině 90. let.. 2002 Od té é doby byla a publikován na celá řada a prací pop pisujících úč činky BABA A na různých h rostlinách h proti širokému spektru pa atogenů. Ú činek BABA proti L. maculans byl popsán n v rostlině ě A. thaliana (KALLIFF et al., 2007).

Obr. 21 Účinek kyseliny β-a aminomáseln né na rozvo oj choroby vyvolané v L. maculans na n děložních h listecch řepky. Úččinná látka byla b přidána do živného roztoku v uvedené u konnečné konce entraci. Po 4 dnech h byly rostlin ny inokulován ny infiltrací ssuspenze spo or L. maculans. Vlevo: Přříznaky na listech 11 dníí po in nokulaci. Vprravo: Kvantiffikace přízna aků analýzo ou obrazu. Hodnoty H jsouu průměrem ze 60 listů.. Chyb bové úsečky představují střední chyb bu průměru. Hodnoty lišící se na zákkladě nepáro ového t-testu u od ne eošetřené ko ontroly jsou označeny * (p < 0,05) nebo ** (p < 0,01). Pookus byl pro oveden ve 3 biolog gických opakkováních s podobnými výýsledky.

Ošettření BABA A bylo na ro ozdíl od vššech ostatn ních látek provedeno p přidáním účinné látkyy přímo o do živnéh ho roztoku hydroponick h ké kultury. Tímto T způsobem je BA ABA rostlina ami nejlépe e přijím mána (JAKA AB et al., 20 001). BABA A je z kořenů transportována doo celé rostliny (COHEN N 56

5. V Výsledky a diskuze a GIS SI, 1994). Rostliny R oše etřené 300 µM BABA nevykazova aly téměř žáádné přízna aky infekce e L. m maculans (O Obr. 21) a účinek b byl silnější než u 30 µM BTH (Obr. 13).. Efekt byll konccentračně zá ávislý a i 12 2 µM roztokk BABA mě ěl průkazný vliv na rozv zvoj choroby y (Obr. 21).. BTH a BABA mají m zcela jin ný mechaniismus účink ku (JAKAB et e al., 2001)). Zajímalo nás, jak se e ans. V sériii od ssebe tyto látky liší v působen í na rostliny řepky napadené L. macula násle edujících exxperimentů jsme účinkyy obou látek detailně porovnali. p

Obr. 22 Vliv v BTH a BAB BA na růst dě ěložních listů ů rostlin B. na apus. Rostlinny byly ve stáří s 11 dnů ů ošetřeny po ostřikem BTH H nebo byla do živného o roztoku přid dána BABA.. Kontrolní rostliny bylyy ošetřeny pos střikem vodyy (H2O) nebo o neošetřenyy (nš.). Po 8 dnech kultivace byla b plocha a děložních listů změřeena analýzou obrazu.. Hodnoty jso ou průměrem m z 24 listtů. Chybové é úsečky pře edstavují stř třední chybu průměru.. Hodnoty lišící se na zákkladě nepáro ového t-testu u od příslušné é kontroly jjsou označe eny ** (p < 0,01). Obd dobné výslledky byly dosaženyy v dalších dvo ou opakovánních pokusu.

Mnoh ho induktorrů rezistenc ce působí na a rostliny ve e vyšších koncentracíc k ch fytotoxic cky (VALLAD D et al., 2004). Slledovali jsm me proto vlivv BTH a BA ABA na růs st rostlin B. napus. Ro ostliny jsme e m, jaký byl použit pro o inokulačn ní testy. Jaak BTH, ta ak i BABA A ošetřřili stejným způsobem průka azně zpom malovaly růs st děložních h listů a to o i v nejniž žších testovvaných kon ncentracích h (Obr. 22). Účine ek obou lá átek mezi ssebou nelz ze přímo srovnat kvů li odlišném mu způsobu u omalení rů ůstu rostlin n může do ocházet v důsledku eenergetický ých výdajů ů ošetřření. K zpo nezb bytných pro aktivaci obranných me echanismů. 5.4.1 1 BABA půs sobí toxick ky na L. ma aculans Charrakteristikou u induktoru u rezistencce je nepřímé působ bení na paatogena sk krz aktivacii obranných mecchanismů rostliny. P Přestože u BTH i BABA existtuje mnoho o publikacíí doka azujících, že tyto látky nemají p přímý toxic cký účinek na patogeena, rozhod dli jsme se e půso obení obou látek na L. maculans o ověřit v in vitro v testu. Zavedli Z jsmee zcela nov vou metodu u antifu ungálního testu t založenou na ku ultivaci L. maculans m v tekutém m médiu v 96--ti jamkové é destiičce. Použili jsme izolát JN3-GF P1 značený ý zeleným fluorescenččím protein nem (GFP),, kterýý nám umo ožnil sledov vat růst m ycelia pom mocí měření změn vee fluorescenci kultury.. K susspenzi sporr v kultivačn ním médiu b byly přidány y testované é látky v požžadované koncentraci. k . BABA A překvapivvě vykazova ala silné an ntifungální účinky. ú Růstt kultury obssahující 150 0 µM BABA A byl zzcela inhibo ován a u kultury s 9 µM M koncentra ací bylo na základě fluuorescence stanoveno o třikrá át menší mn nožství myc celia než v kontrole (O Obr. 23). Zda dochází k inhibici klíčení, nebo o k zasstavení růsttu v pozdější fázi bud e muset bý ýt objasněn no mikroskoopickým po ozorováním.. 57

5. V Výsledky a diskuze Při d detailní ana alýze publikovaných výýsledků o BABA B jsme nalezli dvěě práce, je ejichž autořii rovně ěž zmiňova ali antifungá ální účinky B BABA. POR RAT et al. (2 2003) pozorrovali inhibiici klíčení a růstu u hyf Peniciillium digitatum. FISCH ER et al. (2 2009) prokázali antifun gální účinky BABA na a Botryytis cinerea a a Saccha aromyces ccerevisiae. Do D jaké míry se antiffungální účinek BABA A podíllí na zpom malení růstu u L. macula ans v rostlin ně nelze z in vitro tesstu odvodit. Působeníí BABA A je v porovvnání s BTH H velmi kon ntrastní, ale e tebuconaz zol, fungicidd použitý jako pozitivníí kontrrola, působí srovnateln ně při stokrá át nižší konc centraci (Ob br. 23).

Obr. 23 Testován ní antifungáln ních účinků B BTH a BABA A na in vitro kultury k L. maaculans. Sus spenze spor v mod difikovaném kultivačním m médiu Ga mborg B5 byla b inkubov vána s testoovanými látk kami v 96-ti jamko ové destičce e. Jako pozitivní kontrola a byla použita fungicidní látka tebucoonazol Růst mycelia byl stano oven nepřím mo měřením fluorescencce GFP integrovaného do d genomu L. maculan ns. Hodnoty fluore escence bylyy odečteny 72 7 hod po zzačátku inkubace a jsou průměrem ze tří jamek k pro každé ošetřření. Chybové é úsečky pře edstavují stře ední chybu průměru. p

Otázzku antifung gálního působení BA ABA v rostliině jsme se s pokusili objasnit in nokulačním m teste em, kdy bylyy látky na ro ostliny řepkky aplikován ny v různých intervalecch před a po inokulaci.. Vych házeli jsme z předpokladu, že ind duktor rezis stence bude e působit ppouze za přředpokladu,, že m mezi ošetřen ním a napad dením rostli ny patogen nem bude dostatečný oodstup. Nao opak účinekk fungiicidní látky by měl bý ýt nejvyšší při aplikac ci paralelně ě s inokulaací. U L. maculans m je e obtížžné stanoviit dobu, kd dy je rostliina skutečn ně napadena, neboť spory klíčí postupně ě v prů ůběhu několika dní (LI et e al., 2004a a). Proto o jsme použili široké é časové rrozpětí oše etření. Půso obení BTH H odpovídalo našemu u předpokladu o působení induktoru. Účinek by yl závislý na n délce oodstupu od inokulace.. Aplikkace BTH 4 dny před inokulací sn nižovala roz zsah lézí o 87 %. BTH H aplikovan né 4 dny po o inoku ulaci také průkazně p zm menšovalo příznaky ch horoby, ale jen o 48 % (Obr. 24)). Působeníí BTH aplikované ého až po inokulaci si vysvětlujem me indukcí rezistence v buňkách h, které v té é

58

5. V Výsledky a diskuze době ě ještě nejsou a dojd de tak k p omalejšímu u šíření inffekce. BAB BA jsme ke e kořenům m aplikkovali v 60 µM µ koncentraci, protož e na rostlinách ošetřen ných 4 dny před inokulací 300 µM M konccentrací neb byly patrné téměř žád dné příznaky (Obr. 21)) a nemohlii bychom ta ak sledovatt přípa adný nárůstt účinku v souvislosti s s dobou ap plikace. Závislost účinnku BABA na termínu u aplikkace měla stejný trend jako v p případě BTH H, avšak pokles p účinnnosti při pozdnějších p h aplikkacích byl je en velmi mírný, na hra anici statisttické průkaz znosti (Obr.. 24). Pozo orovali jsme e sice trend poklesu účinku u charakterristický pro induktory, avšak tentto jev by bylo b možné é ětlit i jinak. BABA není v rostlinácch téměř vů ůbec metabo olizována (Z ZIMMERLI ett al., 2000).. vysvě Při zzkoumání přříjmu BABA A pomocí ra adioaktivníh ho značení byl v průbě hu 4 dnů experimentu e u orován konttinuální nárůst BABA v systemick kých částec ch rostliny ((COHEN a GISI, 1994).. pozo Tento o fakt jsme e zohlednili i při navrže ení tohoto experimentu e u. Při každéé aplikaci BABA B byl u rostliin všech va ariant pokus su vyměněn n živný rozttok, aby se e omezil da lší příjem lá átky, avšakk část roztoku zůstala i v pe erlitu, v které ém byly ros stliny pěstovány. Je teedy možné, že rostlinyy ovaly v klíčo ový momentt v inokulovvaných listech nejvyššíí ošetřřené 4 dny před inokullací obsaho množžství BABA A, tudíž pozorovaná závislost účinnosti na termínuu aplikace by mohla a odpo ovídat i antifungálním a mu působ bení. Ani tento exp periment nnám tedy neobjasnill mech hanismus účinku ú BABA A na zpoma alení infekce e L. macula ans.

Obr. 24 Vliv délky inteervalu mezi ošetřením o a inokulací na n rozvoj cchoroby. Ro ostliny byly 4 dny před d (- 4 d), sooučasně (0 d) a 4 dny (+ 4 d) po inokulaci L. maculan ns ošetřeny postřikem 30 µM BTH H nebo byla do živného roztoku přidána 60 µM BABA. Kontrolní rostliny byly ošetřeny postřikem vody v (H2O) nebo neošetřeny (nšš.). Plocha lézí byla změřena analýzou oobrazu. Hod dnoty jsou průměrem z 24 lisstů. Chybov vé úsečky představujíí střední chyybu průměrru. Hodnoty lišící se na n základě nepárového t-testu od příslušné kontroly k jsou označeny *** (p < 0,01). Obdobné výsledky byyly dosaženy v dalších dvou opako ováních pokuusu.

5.4.2 2 Analýza hormonů h a genové ex xprese po ošetření o BT TH a BABA A Rozh hodně nechceme vzb budit dojem m, že antiffungální úč činky jsou obecně zodpovědné z é za pů ůsobení BA ABA na pa atogeny. T Tato otázka a byla sam mozřejmě m mnoha auto ory řešena a a in vvitro testy neprokáza aly antifung gální účink ky na mnoho patoggenů (COHEN, 2002).. Nejsilnějším dů ůkazem me echanizmu působení skrz s induko ovanou rezzistenci je však v úplná á a účinku BABA B v ro ostlinách s mutacemi v klíčových h regulátorrech signállních drah.. ztráta Napřř. účinek BA ABA proti Pseudomona P as syringae e v A. thaliana je podm míněný funkč ční signálníí dráho ou SA. Rostliny s mutací v genu u NPR1 jso ou k infekci náchylné nezávisle na n ošetřeníí 59

5. Výsledky a diskuze (ZIMMERLI et al. 2000). Tento výsledek jasně vylučuje antifungální mechanismus účinku. V dalších experimentech jsme se proto zaměřili na působení BTH a BABA v rostlinách. Zajímalo nás zejména ovlivnění signálních drah. V prvním kroku jsme analyzovali změny v koncentraci vybraných hormonů po ošetření BTH a BABA. V rostlinách ošetřených oběma induktory jsme 72 hodin po ošetření stanovili pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí (LC-MS) koncentraci kyseliny abscisové (ABA), jejích katabolických produktů kyseliny fazeové, a dihydroxyfazeové, a inaktivního konjugátu glukosylesteru ABA. Dále byly stanoveny kyselina salicylová, kyselina indolyl-3-octová (IAA) a její inaktivní konjugát IAA-aspartát (IAA-Asp), kyselina jasmonová, její aktivní konjugát s isoleucinem a giberelin 4. Jediným hormonem ovlivněným BTH byl giberelin 4. Jeho hladina se po ošetření zvýšila o 50 % (Obr. 25). BABA indukovala v rostlinách tvorbu ABA a produktu její katalýzy kyseliny fazeové. Signální dráha ABA je nezbytná pro indukci rezistence BABA proti Plectosphaerella cucumerina (TON a MAUCH-MANI, 2004) a ošetření BABA zvyšuje expresi několika markerových genů ABA (ZIMMERLI et al., 2008). Zvýšení, které jsme pozorovali, je tedy opodstaněné a mohlo by souviset s alespoň částečnou aktivací signální dráhy ABA. KALIFF et al. (2007) a JAKAB et al. (2005) prováděli shodou okolností experimenty, ve kterých byla kromě jiného sledována i hladina ABA po ošetření BABA za podmínek velmi podobných našim experimentům. Ani jeden z autorů však zvýšení ABA v A. thaliana nepozoroval. Ve srovnání s desetinásobným nárůstem hladiny ABA při osmotickém stresu (JAKAB et al. 2005) je zvýšení po ošetření BABA velmi malé (Obr. 25), tudíž se domníváme, že mechanismus působení BABA v B. napus není založen na přímé aktivaci signální dráhy ABA. Kromě ABA a kyseliny fazeové indukovala BABA i tvorbu SA. Tři dny po ošetření byla v rostlinách detekována dvojnásobná hladina SA než v neošetřených rostlinách (Obr. 25). Stejně jako v případě ABA i toto zvýšení bylo velmi malé, např. v porovnání s indukcí SA vyvolanou avirulentním izolátem L. maculans (Obr. 12). Souběžně se stanovením hormonů jsme v rostlinách ošetřených BTH a BABA analyzovali i expresi markerových genů. Na základě předběžného pokusu jsme stanovili časy odběrů na 6, 24 a 72 hodin po ošetření. Ve vzorcích jsme metodou RT-qPCR změřili expresi markerových genů SA, ET, JA, ABA a genu SYP121 jehož funkce je dávána do spojitosti s depozicí kalózy (Kwon et al., 2008). BTH indukovalo dle očekávání oba markery SA PR-1 a PR-2. V 6. hodině po ošetření byl indukován i marker ET/JA HEL a v menší míře i gen SYP121 (Obr. 26). Poněkud překvapivě, i když v souladu se zvýšenou hladinou SA v předchozím experimentu (Obr. 25), indukovala i BABA markerové geny PR-1 a PR-2. Nedošlo však ke změně exprese genu ICS1 katalyzujícího biosyntézu SA. Je možné, že bazální množství proteinu ICS1 v buňce je dostatečné k zajištění mírného zvýšení SA. Případně by BABA mohla na signální dráhu SA působit nezávisle na SA. Exprese

60

5. V Výsledky a diskuze markkerových ge enů AOS (J JA), NCED3 3 a LEA1 (oba ( ABA) byla ošetřeením BABA nedotčena a (Obr. 26)

Obr. 25 Stanovení hladiny ro ostlinných ho ormonů v děložních listec ch B. napus 72 hod po ošetření o postřřikem 30 µM BTH nebo po přidání 6 60 µM BABA A do živného o roztoku. Koontrolní rostlliny byly ošetřřeny postřike em vody neb bo neošetřen ny. Pomocí LC-MS byly y stanoveny kyselina ab bscisová (ABA A), kyselina dihydroxyfaz d zeová (DPA)), kyselina fa azeová (PA)), ABA-glukoosylester (AB BA-GE), kyselina salicylová (SA), ky yselina indo olyl-3-octová á (IAA), IAA A-aspartát ((IAA-Asp), kyselina jasmo onová (JA), JA-isoleucin nát (JA-Ile), giberelin 4 (GA4). ( Hodnoty (pmol/g čerstvé hmo oty) jsou průměrem ze čtyř biologickýc ch opakován ní. Chybové úsečky před dstavují středdní chybu průměru. p Hodn noty průkazně ě se lišící od d příslušné ko ontroly jsou označeny o * (p < 0,05) a *** (p < 0,01).

Ani analýza ro ostlinných hormonů h a genové exprese e ná ám nedala jasnou od dpověď na a hanismus účinku ú BAB BA v B. nap pus. Důležittou oblastí,, kterou jsm me se dopo osud téměřř mech neza abývali je tzzv. priming. Již v roce e 2000 pub blikovaná práce p odhaalila, že ačk koliv BABA A v rosstlinách přím mo nevyvolává obran né reakce, ošetřené rostliny od povídají na a napadeníí mnoh hem rychle ejší a inten nzivnější re eakcí (ZIMM MERLI et all., 2000). V prvním předběžném m expe erimentu jsm me pozorov vali vyšší e xpresi genu u ICS1 v in nfikovaných rostlinách,, které bylyy před inokulací ošetřeny o BA ABA.

61

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 26 Analýza exprese markerových ge enů signálníc ch drah SA, ET, JA a AB BA v děložníích listech B.. napus 6, 24 a 72 2 hod po ošetření postři kem 30 µM BTH nebo po p přidání 660 µM BABA A do živného o roztoku. Kontroln ní rostliny by yly ošetřeny postřikem vody v nebo neošetřeny. H Hodnoty jsou u výsledkem m jedno oho experime entu.

62

5. V Výsledky a diskuze 5.5 H Hydrolyzáty y živočišný ých bílkovi n Další skupinou látek, u kterých k jsme e prokázali vliv na sttimulaci obbranných mechanismů m ů drolyzáty od dpadních žživočišných bílkovin. K jejich testoování jsme e se dostalii řepkyy, jsou hyd částe ečně náhod dou, ale ihned nás zau ujali v souvislosti se stá ále přibývajjícím počtem m publikacíí o spe ecifickém ro ozpoznáván ní krátkých p nitního systéému rostlin. peptidů receptory imun První testovano ou živočišn nou bílkovvinou byly vzorky připravené cchemickou hydrolýzou u erčně dostu upného hydrolyzátu ko lagenu Hyk kol E, který je vedlejším m produktem m při činěníí kome usní.. Následkem m používání chromitýc h solí jsou veškeré v odp pady činěníí toxické (KAŠPÁRKOVÁ A Á et all., 2009). Vyybrali jsme dva vzorkyy lišící se stupněm s hy ydrolýzy. Oššetření vzorky CH-4 a CH-8 8 zmenšova alo příznaky y způsoben né infekcí L. maculans.. Efekt byl v porovnání s pozitivníí kontrrolou BTH slabý, ale statisticky s p průkazný ve e dvou biologických oppakováních h (Obr. 27).. Vzorrky o největtší koncenttraci (dvace etkrát ředěn ný výchozí materiál) zzpůsobovaly y na listech h drobné nekrózy.

Obr. 27 Účinek hyddrolyzátů Hy ykolu E na a velikost příznaků p způůsobených L. L maculanss na listech h B. napus. Rostliny by yly ošetřenyy hydrolyzá áty CH-4 a CH-8 v růz zném stupnii ředění. Ko ontrolní rostlliny byly ošettřeny vodou.. Jako poz zitivní kontroola byl použ žit BTH. Po o třech dnech d bylyy listy inokuloványy L. macula ans hon č. 40 na prop píchnutý list.. Plocha lé ézí byla zm měřena pom mocí analýzyy obrazu. Hodnoty jjsou průměrem z 50 0 analyzova aných listůů. Chybov vé úsečkyy představu ují střední chhybu průmě ěru. Hodnotyy průkazně se lišící ood kontroly na základě ě nepárového t-testu jsoou označeny y * (p < 0,05)) a ** (p < 0,01). Pokuus byl proved den ve dvou u nezávislýc ch opakovánních.

kládali přímýý antifungá ální účinek, a proto js me si jejich h působeníí U vzzorků jsme nepředpok vysvě ětlovali stim mulací obran nných mech hanizmů ro ostliny. Sledovali jsme proto expre esi několika a markkerových ge enů v ošetře ených rostl inách. Ošetření hydrolyzátem CH H-4 i CH-8 indukovalo o markkerový gen SA signální dráhy PR--1 a marker dráhy ET//JA HEL (O Obr.28). Oba a geny jsou u indukkovány i při infekci L. L maculanss (Obr. 12)), takže jejich zvýšenná exprese naznačuje e mech hanismus účinku ú hydrrolyzátů Hyykolu E. Prrotože signá ální dráhy SA a ET/JA na sebe e půso obí spíše an ntagonistick ky (PIETERS SE et al., 20 009), nebyli jsme si jisstí, zda jsou u oba genyy indukkovány ste ejnou látkou u. Hydrolýzza vzorků CH-4 a CH-8 probíhhala v příto omnosti 4,8 8 molá ární kyselin ny mravenč čí, která byyla následně neutralizována hyydroxidem draselným.. Proto ože takto vyysoká koncentrace sol i by mohla rovněž indu ukovat exprresi některé ého z genů,, ošetřřili jsme rosstliny také 96 6 mM molá árním roztok kem mraven nčanu draseelného. Hlavní složkou u 63

5. V Výsledky a diskuze hydro olyzátů jsou u peptidy ro ozštěpenéh o kolagenu u. Nejedná se s o jasně definovanou látku, ale e o he eterogenní směs různ ně dlouhýcch peptidů. Rozdělili jsme protoo vzorky na n základě ě mole ekulové hmo otnosti pom mocí ultrafiltrrace na dvě ě frakce, z nichž n v jedn é byly mole ekuly menšíí než 2 kDa a v druhé větší než n 2 kDa, a ošetřili jim mi rostliny. Gen HEL byl v případě obou o izoláttů induková án frakcí menší m než 2 kDa. Zá ároveň byla a ese indukována i mra avenčanem draselným (Obr. 28). Vzhledem m k tomu, že e působeníí expre rozto oků solí na listy zvyšu uje účinek e etylénu na indukci ge enu HEL (LLAWTON et al., 1994),, domn níváme se, že mraven nčan drasellný se přine ejmenším podílí na inddukci genu HEL. I gen n PR-1 1 byl v přípa adě CH-8 in ndukován p ouze frakci menší než 2 kDa. Avššak účinek vzorku CH-4 byll rovnoměrn ně rozložen v obou fra kcích (Obr. 28). Vzore ek CH-4 máá na základě ě stanoveníí mole ekulové disttribuce hmo otnostní prů ůměr molárn ních hmotností 3 kDa, zatímco vz zorek CH-8 8 jen 2 2,2 kDa. Kvvůli vyššímu stupni hyydrolýzy vz zorku CH-8 mohla věttšina menších peptidů ů projítt skrz mem mbránu, zattímco peptid dy ve vzorrku CH-4 se rovnomě rně rozdělily do obou u frakccí. Domnívá áme se proto o, že gen P PR-1 je indukován hydrrolyzovaným m kolagenem m.

Obr. 28 Analýza exprese ma arkerových g genů signáln ní dráhy SA (PR-1; A) a dráhy ET/JA (HEL; B) v rosttlinách B. na apus 24 hodin po ošetřen ní 50x ředěn nými hydroly yzáty CH-4 a CH-8 a jejic ch frakcemi získa anými ultrafilttrací přes membránu m prropouštějící molekuly me enší než 2 kDa. Dále byly b rostliny ošetřřeny 96 mM mravenčane m m draselným m (HCOOK), který je obsa ažen i v hydrrolyzátech..

5.5.1 1 Hydrolyzá áty živočišných bílko ovin jsou silným induk ktorem SA A signální dráhy Abycchom se zb bavili nejasn ností způso obených vy ysokou konc centrací soolí a dalším mi aditivnímii látka ami, použili jsme pro další prácci enzymaticky hydro olyzovaný kkolagen z velmi v čisté é surovviny, kterou u je materiá ál pro výrob bu párkovýc ch střívek Cutisin C (HCuu). Tento hy ydrolyzát je e tedy čistý kolag gen s minim málním mno ožstvím přím měsí. Tento o vzorek js me testova ali společně ě ěma dalším mi hydrolyzá áty kolagen u C1 a C2 a hydrolyz zátem kerattinu K1. Vš šechny čtyřii s dvě vzorkky jsme ro ozpustili ve vodě tak, že roztoky y obsahova aly 2 % suššiny. Hydro olyzát HCu u průka azně snižovval příznak ky choroby způsobené é L. maculans. Účinek hydrolyzáttů C1 a C2 2 64

5. V Výsledky a diskuze byl n neprůkaznýý (Obr. 29)), z čehož vyplývá, že ž způsob hydrolýzy ovlivňuje biologickou u účinn nost. Napro oti tomu hyd drolyzát kerratinu, což je j rovněž strukturní bíílkovina, ale e v primárníí strukktuře od ko olagenu od dlišná snad d jen s výjjimkou vys sokého zasstoupení gllycinu, měll účinn nost ještě vyyšší než HC Cu (Obr. 29 9).

Obr. O 29 Účinek hydrolyzáátů kolagenu u na velikost příznaků p způsobených L. maculans na n rostlinách B. B napus. Rostliny R byyly ošetřeny y postřikem hydrolyzáty h HCu, H C1, C C2 a K1 (2 % sušiny). Kontrolní K ros stliny byly ošetřeny vo odou. Jako pozitivní p konttrola byl pouužit (BTH). Po 4 dnech byly b listy inokulovány inffiltrací spor L. maculans JN2 Plocha lézí a listů byla změře ena pomocí analýzy a obrazu. Hodnnoty jsou průměrem z 20 analyzov vaných listůů pro každé ošetření. Chybové C ús sečky předsstavují stře ední chybu průměru. p Hod dnoty průkazzně se lišící od kontroly (v voda) jsou označeny * (pp < 0,05) a ** (p < 0,01). Pokus P byl proveden p vve čtyřech nezávislých opakováních o s podobným mi výsledky.

U hyydrolyzátu HCu a K1 1 jsme sice e pozorova ali antifungální účinkyy v in vitro testu s L.. macu ulans, avša ak jen při použití p velm mi vysokých h koncentra ací. Působeení těchto hydrolyzátů h ů jsme e si proto vyysvětlovali spíše indukkcí obranný ých mechan nismů v rosstlinách. Pro ovedli jsme e proto o analýzu genové exprrese. V rosttlinách ošetřených koncentrační řaadou hydro olyzátu HCu u enů signáln jsme e sledovali expresi e markerových ge ní dráhy SA PR-1 a WR RKY70 a markerového o genu u signální drráhy ET/JA HEL. Hydro olyzát HCu indukoval expresi e gennů PR-1 a WRKY70 W ve e stejn né

míře

j jako

pozittivní

kontrrola

BTH

(Obr.

30 0).

Účinekk

byl

pa atrný

ještě ě

při pě ětadvacetin násobném ředění. ř V m enší míře byl b induková án i gen HE EL. Překvap pivě vysoká á expre ese markerrových genů ů signální d dráhy SA nekoreluje zcela s účinkkem na roz zvoj infekce e L. m maculans. Zde účinnos st HCu zda leka nedos sahovala effektu vyvolaaného BTH H (Obr. 29).. Tento ován dříve, např. při testování t úč činku elicitoorů. Tyto látky naopakk o rozpor byyl již pozoro dosa ahovaly v inokulačním testu účinn nosti srovna atelné s BTH H, ale jejichh působení na expresii genů ů PR-1 a WRKY70 W by ylo výrazně slabší. Ve e světle těchto výsledkků klesla na aše důvěra a v gen ny PR-1 a WRKY70 jako ideáln ní markery indukované rezistencce. Nicmén ně regulace e imun nitního systé ému rostlin je komplexxní regulac cí stovek, nebo možnáá tisíců prvk ků, a nelze e tedy očekávat, že jediný gen g bude p řesně odrážet stav ve eškerých obbranných mechanismů m ů n rezistenci k L. macculans. Snaž žíme se sic ce nalézt m arkery s lep pší korelacíí podíllejících se na s výssledky inoku ulačních tes stů, ale PR--1 i WRKY7 70 jsou vhod dnými markkery pro signální dráhu u SA ((Obr. 9 a 12) a tudíž ž výborně odrážejí pů ůsobení tes stovaných induktorů na n signálníí dráhu SA.

65

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 30 Analýza exprese ma arkerových g genů SA sig gnální dráhy PR-1 (A) a WRKY70 (B) a ET/JA dráhyy HEL (C) v rostlinách B. B napus 24 4 hodin po ošetření o hyd drolyzátem kkolagenu HC Cu. Výchozí konce entrace obsahovala 2 % sušiny (H HCu 1x) a byla b dále po ostupně ředěěna až na koncentraci 0,016 6 % sušiny (125x). Kontrrolní rostlinyy byly ošetřeny postřikem m vody a jakko pozitivní kontrola k byl použiit BTH. Podo obné výsledk ky byly pozorrovány v nez závislém opakování poku su.

Účinky na expre esi SA mark kerů PR-1 a WRKY70 jsme j otesto ovali i u hyd rolyzátů C1, C2 a K1. 2 a K1 by yly rovněž silnými ind duktory SA A markerovvých genů (Obr. 31).. Hydrrolyzáty C2 Do to ohoto pokusu nebyl za ařazen BTH H, tudíž účinnost těchto hydrolyzzátů nemůž žeme přímo o srovn nat s HCu. Zajímavá byla b podstattně slabší in ndukce genů PR-1 a W WRKY70 hy ydrolyzátem m C1 (O Obr. 31). I když k nejsou u k dispozic i přesné charakteristiky y jednotlivýcch hydrolyz zátů, vzorkyy C1 a C2 jsou stejného původu a liší se e nejspíše pouze p v déllce hydrolýzzy a tím i za astoupením m různýých peptidů. Tento výsledek je e dalším nepřímým důkazem, že účinno ou složkou u hydro olyzátu jsou u peptidy a nikoliv přím měsi jiných lá átek.

Obr. 31 Annalýza expre ese markerovýcch genů SA signální drááhy PR-1 (A A) a WRKY70 (B B) pomocí RTR B. qPCR v rrostlinách napus. E Exprese byla b změřena 224 hodin po hydrolyz ošetření záty kolagenu C C1 a C2 a m keratinu K1. hydrolyzátem všech lá Roztoky átek obsahovaly 2 % sušiiny. rostliny byly b Kontrolní ošetřeny poostřikem vody y.

5.5.2 2 Hydrolyzá át kolagenu u C2 induk kuje reziste enci v Arabidopsis thaaliana Indukktory rezisttence obyče ejně působ bí na široké é spektrum rostlin. Abbychom tuto vlastnostt ověřiili i u hyd drolyzátů bílkovin, b zm měřili jsme expresi markerovýc m h genů v ošetřených h 66

5. V Výsledky a diskuze rostliinách A. th haliana. Na avrhli jsme primery na a stejné markerové ggeny, jaké používáme e v řep pce. V rosttlinách ošettřených hyd drolyzáty ko olagenu HC Cu a C2 jsm me analyzov vali expresii SA m markerů PR R-1, WRKY Y70 a ICS1 . Zatímco HCu byl v Arabidopsiss téměř ne eúčinný, C2 2 odstatně vě indukkoval geny PR-1 a WRKY70 W v po ětší míře ne ež BTH. C22 indukoval i posledníí testo ovaný marke er, ICS1. Tento gen kó óduje klíčov vý enzym biosyntézy b S SA. Jeho indukce nám m přibliižuje mecha anismus úč činku C2. N Na rozdíl od BTH induk kuje v rostli nách tvorbu u SA, která á má zza následekk zvýšenou expresi ma rkerových genů g PR-1 a WRKY70. 0. Absence účinku ú HCu u v A. thaliana je velmi zajím mavá. Vysvvětlujeme si ji tím, že obě rostlinyy reagují na tyto látkyy velm mi specifickyy. Peptid ro ozštěpeného o kolagenu by mohl napodobovaat rozpozná ávaný motivv zcela a jiného pro oteinu, pro který k má rosstlina receptor.

Obr. 32 Analýza exprese ma arkerových g genů SA sign nální dráhy PR-1 P (A), W WRKY70 (B) a ICS1 (C) v rosttlinách Arab bidopsis thaliiana 24 hod din po ošetře ení postřikem m hydrolyzátty kolagenu HCu a C2 v kon nečné koncentraci 2 % sušiny. s Konttrolní rostliny y byly ošetře eny postřikem m vody a jako pozitivní kontrrola byl použit BTH.

Poch hopitelně ná ás zajímalo o, zda bude e hydrolyzá át C2 krom mě exprese SA marke erů zároveň ň indukkovat rezisttenci k pato ogenům. Ro ostliny ošetřřené hydrolyzáty HCu a C2 jsme inokulovalii bakte erií

Pseud domonas

syringae s

p pv.

tomato o

DC3000 0

nesoucí

operon

luxCDABE E

z Photorhabduss luminescens, který v bakteriích vyvolává v inttenzivní lum minescenci (FAN et al.,, 8). Počet ba akterií v infik kovaných ro ostlinách tak k lze snadno stanovit ppomocí luminometru. 2008 V ino okulovaných h

rostlinác ch

jsme

v několika

intervalec ch

měřili

luminesce enci,

která á

v kon ntrolních ro ostlinách inttenzivně na arůstala v důsledku d in ntenzivně sse množícíc ch bakterií.. Zatím mco v rostliinách ošetřřených HCu u byla dva dny po ino okulaci sta novena lum minescence e stejn ná jako v ko ontrole, lum minescence e v rostlinách ošetřených C2 doosahovala pouze p 6 % hodn noty naměře ené v kontro olních rostli nách. V podobné míře e indukoval rezistenci i BTH, kterýý byl p použit jako pozitivní ko ontrola (Ob br. 33). Hyd drolyzát kola agenu C2 jje tedy velm mi účinným m indukktorem rezisstence v A. thaliana prroti P. syring gae pv. tom mato.

67

5. V Výsledky a diskuze

Obr. 33 Indukce e rezistence hydrolyzátyy kolagenu v rostlinách Arabidopsis is thaliana proti p bakteriii Pseu udomonas syyringae pv. to omato. A, R ostliny byly ošetřeny o pon nořením do roztoku BTH H, HCu nebo o C2. K Kontrolní rosttliny byly oše etřeny ponoře ením do vod dy. Po čtyřech dnech bylyy inokulovány y ponořením m do su uspenze P. syringae s pv. tomato t značčné genem pro luminesce enci luxCDAB BE. Po 48 ho odinách byla a v celýých rostlinácch změřena luminescencce, která je přímo závis slá na počtuu bakterií. Hodnoty H jsou u průměrem z 10 analyzovanýc a ch rostlin pro o každé ošettření. Chybové úsečky ppředstavují sttřední chybu u průměru. Hodnotyy průkazně se s lišící od ko ontroly (voda a) na základě ě nepárovéhoo t-testu jsou u označeny * (p < 0,05) a ** (p p < 0,01). B, Žloutnutí a nekrózy na a starších listtech A. thaliiana vyvolan né ošetřením m hydro olyzátem kola agenu C2.

5.5.3 3 Charakte erizace účin nné složky y hydrolyzá átů bílkovin n Prokkázali jsme, že hydroly yzáty živočiššných bílko ovin jsou úč činné indukttory reziste ence rostlin.. Dosu ud nám vša ak chyběl dů ůkaz, že jejjich účinnou u složkou js sou peptidyy vzniklé přii hydrolýze.. Je tře eba si uvěd domit, že hy ydrolyzát je e pestrou sm měsí různě dlouhých ppeptidů, z nichž účinná á může e být celá frakce, f niko oliv jen jede en peptid. Za Z vhodnou u strategii k vyřešení této otázkyy jsme e považovali rozštěpen ní peptidů h ydrolyzátu proteázou, v důsledkuu čehož by mohlo dojítt ke zttrátě aktivitty induktoru u. K tomuto účelu jsme e vybrali hy ydrolyzát koolagenu HC Cu, protože e vykazoval nejvě ětší zastoup pení dlouhýých peptidů.. U ostatníc ch hydrolyzáátů se velik kost většinyy peptiidů pohybo ovala okolo 2 kDa, tud díž jsme se obávali, že by protteáza nedokázala tyto o peptiidy dále ště ěpit. Inkubace hydrolyzzátu HCu s kolagenázou vedla k rozštěpení velké částii velkýých peptidů a proteinů. Z elektrofo oretické sep parace vzorků bylo paatrné, že do ošlo k téměřř úplné ému odstra anění velmi dlouhých peptidů, ale zároveň se obohatiila frakce 5 – 10 kDa a (Obr. 34 A). Ovvěření biolo ogické účinn e štěpení nnesnížilo míru indukce e nosti však ukázalo, že genu u PR-1, ale naopak do ošlo k mírně ě větší indu ukci (Obr. 34 3 C). Abycchom tomutto výsledku u lépe porozuměli, pokusili jsme se zj zjistit, jak štěpení š ovliv vnilo distribbuci velikos stí peptidů.. ocí ultrafiltra ace na frakc ci s molekulami většímii a menšími než 3 kDa a Vzorrky jsme rozzdělili pomo a ve všech frakccích jsme stanovili kon ncentraci proteinů. Uká ázalo se, žee štěpení zm měnilo podíll peptiidů menších h než 3 kDa z 15 % n a 53 %. Av však ve štěp peném vzorrku stále zů ůstalo 47 % peptiidů větších než 3 kDa (Obr. 34 4 B). U vše ech frakcí jsme j násleedně ověřili účinek na a expre esi PR-1. Většina V účinné složky neštěpené ého hydroly yzátu HCu jje ve frakc ci větší nežž 68

5. V Výsledky a diskuze 3 kDa. Účinnou složkou ted dy nemůže být malá molekula. m Úč činnost frakkce větší ne ež 3 kDa po o štěpe ení nekleslla, avšak po p štěpeníí došlo k nárůstu n účin nnost frakcce menší než n 3 kDa a (Obr. 34 C). Aččkoliv štěpe ení kolagen názou nepřřineslo zce ela přesvěddčivý důkaz z o účinné é složcce hydrolyzá átu HCu, vš šechny tyto výsledky naznačují, že e se opravddu jedná o peptidy. p

Ob br. 34 Identiffikace účinnéé frakce hydrrolyzátu HCu u po omocí štěpen ní kolagenázzou. Vzorky byly 24 hod d ink kubovány přři 37 °C. C – hydroly yzát; C+E – hydrolyzát ro ozštěpený kolagenázou u; samotná á kolagenáza – E. E Po inkubaaci byly vzorrky rozdělenyy po omocí ultrfiltrrace na fra kci větší ne ež 3 kDa a me enší než 3 kDa. A, Seeparace frak kcí na 16 % Triicin SDS-PA AGE. B, Z Zastoupení peptidů ve e . fra akcích před a po roozštěpení kolagenázou k Ko oncentrace proteinů byyla stanove ena pomoccí mo odifikované metody dlee Lowryho. C, Analýza a ex xprese SA ma arkeru PR-1 v rostlinách B. napus 24 4 ho od po ošetře ení frakcem mi hydrolyzáttu. Kontrolní ros stliny byly oš šetřeny postřřikem vody.

Hydrrolyzát HCu u jsme dále separovalii pomocí ultrafiltrace. Protože P se většina účinné složkyy nach házela ve frrakci větší než n 3 kDa ((Obr. 34 C)), použili jsm me tentokráát ultrafiltrač ční kolonkyy s děllící mezí 10 0 kDa. Záro oveň s HCu jsme separovali i hydrolyzát C2, o kterém js sme věděli,, e složen z peptidů p pře evážně o ve elikosti kole em 2 kDa. Oba hydroolyzáty měly y navzájem m že je zcela a opačný podíl p zastou upení peptiidů v jedno otlivých frak kcích (Obr. 35 A). Po odíl peptidů ů hydro olyzátu HCu ve frakci menší nežž 10 kDa (O Obr. 34 B) je na první pohled ste ejný jako ve e frakcci menší nežž 3 kDa (Ob br. 35 A). T ento rozporr je způsobe en odlišným mi metodam mi stanoveníí konccentrace pro oteinů. U všech v frakccí jsme ově ěřili účinnos st pomocí aanalýzy exp prese genu u PR-1 1. V případ dě hydrolyz zátu HCu byl účinek k rovnoměrně zastouupen v obo ou frakcích h 69

5. V Výsledky a diskuze (Obr. 35 B). Porrovnání se separací s dělící mezíí 3 kDa (Ob br. 34 C) je zřejmé, že e velká částt účinn né složky se nachází právě p mezi 3 a 10 kDa a. Téměř ve eškerá účinnná složka hydrolyzátu h u C2 je e na rozdíl od HCu přítomna po ouze ve frak kci menší než n 10 kDaa (Obr. 35 B). Metoda a sepa arace pomo ocí ultrafiltrrace je vellmi nepřesná a slouž ží jen pro orientační stanovení.. Nicm méně na základě z těc chto výsled dků bude zajímavé zopakovat pokus se e štěpením m kolag genázou a následně n ro ozdělit vzorkky pomocí ultrafiltrace u k s vylučovaccí mezí 10 kDa.

Obr. 35 Separacce účinné frrakce hydrollyzátů HCu a C2 pomo ocí ultrafiltracce. Hydrolyz záty byly na a zákla adě molekulo ové hmotnos sti separován ny na dvě frakce obsahu ující molekully větší nebo o menší nežž 10 kD Da. A, Zasttoupení pep ptidů ve frakkcích hydrolyzátů HCu a C2. Konncentrace proteinů byla a stano ovena pomocí biuretové metody. B,, Analýza ex xprese SA markeru m PR--1 v rostlinác ch B. napuss 24 ho od po ošetře ení frakcemi hydrolyzáttů. Kontrolníí rostliny byly ošetřeny postřikem vody v a jako o pozitiivní kontrola byl použit BT TH.

Na zzákladě získkaných výsledků jsme e přesvědče eni, že účinnou složkoou hydrolyzá átů bílkovin n jsou peptidy, i přesto že e se nám dosud ne epodařilo provést expperiment, který k by to o jedno označně do okazoval. Zatím jsme n neprovedli žádné podrrobnější zkooumání mo olekulárního o mech hanismu jejich účinku. Nejjednodu ušším vysvětlením by bylo zcela nnespecifick ké působeníí vysokou koncen ntrací proteiinů. Rostlinyy by se v přirozených podmínkácch těžko ocitly v takové é situa aci. Avšak rozdílné úč činky jedno otlivých hyd drolyzátů na rostlinácch řepky (O Obr. 29-31)) a abssence účinku hydrolyz zátu HCu n na rostlinách A. thalian na (Obr. 322) této hypo otéze tvrdě ě opon nují. Pro mo olekulárního o biologa byy byla jistě lákavější představa vaazby peptid du na jeden n ze sttovek recep ptorů, kterým mi rostlinná buňka reag guje na své é okolí (DOD DDS a RATHJEN, 2010).. Nako onec proč by b nemohla a mít rostlin na receptor pro kolage en? Např. ggenom člov věka kóduje e nejm méně 12 recceptorů kola agenu (LEIT INGER a HOHENESTER O , 2007). Rosstliny jsou schopné s se e bránit proti herb bivornímu hmyzu h stejn ně jako protti patogenům (DE VOS et al. 2005 5). Kolagen n ho zvířete by tak mohl napodobov vat kolagen housenky okusující lis st. Prostým m z kůžže domácíh srovn náním sekvvencí je sn nadné zjistiit, že kolag gen včely medonosnéé i prasete e domácího o 70

5. Výsledky a diskuze je přibližně ze 40 % tvořen glycinem a prolinem. Protein s podobnou primární strukturou jsme v rostlinách nenalezli, tudíž by bylo logické, kdyby rostlina na takovou molekulu reagovala.

71

6. Závěr

6. Závěr Leptosphaeria maculans je jedním z nejvýznamnějších patogenů brukvovitých olejnin, zejména řepky. V minulosti v několika zemích téměř zlikvidoval pěstování těchto plodin. V současnosti jsou epidemie fomové hniloby omezeny díky účinné monogenní rezistenci nových odrůd. Avšak L. maculans je patogenem s mimořádným evolučním potenciálem, který dokáže dotčený gen avirulence ze své populace rychle odstranit, čímž dojde k překonání rezistence. Je tedy třeba nalézt nové strategie zvýšení odolnosti rostlin, případně využít další opatření pro ochranu rostlin. L. maculans se zároveň stala i významným modelovým organismem. Kvůli velkému množství sekvenčních dat izolátů získaných po celém světě v období několika desítek let je možná detailně studovat proměny v zastoupení genů avirulence a mechanismy, které je řídí. V této práci jsme zkoumali obranné reakce rezistentních rostlin řepky při interakci s genem avirulence AvrLm1. Současně jsme provedli screening látek s potenciálem indukovat v rostlinách řepky rezistenci. Rostliny B. napus s genem rezistence Rlm1 reagují na napadení avirulentním izolátem L. maculans aktivací signální dráhy kyseliny salicylové a etylénu. Aktivace těchto signálních drah chemickými induktory zvyšuje odolnost rostlin k infekci, což potvrzuje jejich důležitou úlohu v obraně rostliny proti L. maculans. Rozpoznání genu AvrLm1 je zároveň spojeno s intenzivní tvorbou peroxidu vodíku v pozdních fázích infekce. Vyztužování buněčné stěny kalózou, další důležitý obranný mechanismus rostlin, se na rezistenci vyvolané AvrLm1 nejspíše nepodílí. Současná aktivace signálních drah kyseliny salicylové a etylénu by v rostlinách také mohla vyvolat senescenci za účelem zabránit patogenu šíření řapíkem infikovaného listu. Obranné reakce řepky na napadení L. maculans se zcela zásadně liší od obranných reakcí modelové rostliny Arabidopsis thaliana, která byla doposud pro zkoumání interakce rostlin s L. maculans využívána. Ukázali jsme tedy, že i blízce příbuzné rostliny mohou na napadení stejným patogenem reagovat zcela odlišně a závěry z výsledků získaných na modelových rostlinách nelze zobecňovat. Rostliny B. napus v našich experimentech reagovaly i na napadení virulentním patogenem. Obranné reakce se z velké části překrývaly s reakcemi při inkompatibilní interakci, avšak jejich intenzita byla výrazně slabší. Tento fakt nás vedl k závěru, že použitý izolát L. maculans produkuje molekulu, kterou rostlina rozpoznává, podobně jako je tomu v případě genu AvrLm1. Hledaná molekula byla obsažena v pěstebním médiu kultury L. maculans, což jsme dokázali jeho účinky na aktivaci obranných mechanismů B. napus. Molekulu jsme se pokusili blíže charakterizovat a domníváme se, že se jedná o protein. Jeho identifikace se však dosud nezdařila.

72

6. Závěr Jedním z induktorů rezistence k L. maculans, který jsme nalezli, je kyselina β-aminomáselná (BABA). Tato látka je známým induktorem rezistence u řady jiných rostlin s účinkem na široké spektrum houbových i bakteriálních patogenů. V rozporu s obecnou představou o BABA jako typickém induktoru rezistence jsme však prokázali její silné antifungální účinky na L. maculans in vitro. BABA v rostlinách B. napus rovněž stimulovala tvorbu kyseliny salicylové a expresi jejích markerových genů. Pokusili jsme se objasnit, zda je její účinek založen na antifungálním působení nebo na indukci rezistence. Na tuto otázku jsme však získali nejednoznačnou odpověď. Dalším nalezeným induktorem rezistence k L. maculans byla skupina hydrolyzátů živočišných bílkovin. Účinky těchto látek na zpomalení infekce L. maculans byly slabší než u BABA nebo benzothiadiazolu, který jsme používali jako pozitivní kontrolu, avšak domníváme se, že modifikací výrobního postupu by mohla být jejich účinnost zvýšena. Ošetření rostlin těmito látkami indukovalo expresi markerových genů signální dráhy SA. Jeden z hydrolyzátů indukoval v rostlinách A. thaliana rezistenci k bakterii Pseudomonas syringae pv. tomato v míře srovnatelné s referenční látkou benzothiadiazolem. Na základě bližší charakterizace se jako účinná složka hydrolyzátů jeví peptidy o velikosti 2 - 10 kDa v závislosti na podmínkách hydrolýzy. Domníváme se, že by rostliny mohly mít receptor specificky rozpoznávající určitou část molekuly kolagenu. Kyselina β-aminomáselná i hydrolyzáty bílkovin by v budoucnu mohly najít uplatnění v ochraně řepky i dalších plodin proti různým patogenům. Jejich účinky proti L. maculans a Sclerotinia sclerotiorum jsou v současnosti testovány v polních podmínkách. Pro potřeby této práce jsme identifikovali a charakterizovali sadu markerových genů obranných signálních drah, které mohou v budoucnu sloužit vědecké veřejnosti k studiu signalizace v B. napus.

73

7. Seznam použité literatury

7. Seznam použité literatury Agrios G.N. (1997) Plant Pathology. San Diego: Academic Press. ISBN 0-12-044564-6. Alavanja M.C.R., Hoppin J.A. a Kamel F. (2004) Health effects of chronic pesticide exposure: cancer and neurotoxicity. Annual Review of Public Health 25: 155–197. Amit I., Garber M., Chevrier N., Leite A.P., Donner Y., Eisenhaure T., Guttman M., Grenier J.K., Li W., Zuk O., Schubert L.A., Birditt B., Shay T., Goren A., Zhang X., Smith Z., Deering R., McDonald R.C., Cabili M., Bernstein B.E., Rinn J.L., Meissner A., Root D.E., Hacohen N., a Regev A. (2009) Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326: 2572-63. Ansan-Melayah D., Balesdent M.-H., Buée M., a Rouxel T. (1995) Genetic characterization of AvrLm1, the first avirulence gene of Leptosphaeria maculans. Phytopathology 85: 15251529. Argueso C. T., Hansen M., a Kieber J. J. (2007) Regulation of ethylene biosynthesis. Journal of Plant Growth Regulation 26: 92–105. Balesdent M.H., Attard A., Ansan-Melayah D., Delourme R., Renard M., a Rouxel T. (2001) Genetic control and host range of avirulence toward Brassica napus cultivars Quinta and Jet Neuf in Leptosphaeria maculans. Phytopathology 91: 70-76. Bannenberg G., Martínez M., Hamberg M., a Castresana C. (2009) Diversity of the Enzymatic Activity in the Lipoxygenase Gene Family of Arabidopsis thaliana. Lipids 44: 8595. Beckers G.J.M., a Conrath U. (2007) Priming for stress resistance: from the lab to the field. Current Opinion in Plant Biology 10: 425–431.135) Bent A.F., a Mackey D. (2007) Elicitors, effectors, and R genes: The new paradigm and a lifetime supply of questions. Annual Review of Phytopathology 45: 399–436. Beckers G.J., Jaskiewicz M., Liu Y., Underwood W.R., He S.Y., Zhang S., a Conrath U. (2009) Mitogen-activated protein kinases 3 and 6 are required for full priming of stress responses in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 21: 944-953. Bednarek P., Pislewska-Bednarek M., Svatos A., Schneider B., Doubsky J., Mansurova M., Humphry M., Consonni C., Panstruga R., Sanchez-Vallet A., Molina A., a SchulzeLefert P. (2009) A glucosinolate metabolism pathway in living plant cells mediates broadspectrum antifungal defense. Science 323: 101-106. Bent A.F., a Mackey D. (2007) Elicitors, effectors, and R genes: the new paradigm and a lifetime supply of questions. Annual Review of Phytopathology 45: 399-436. Bohman S., Staal J., Thomma B.P., Wang M., a Dixelius, C. (2004) Characterisation of an Arabidopsis-Leptosphaeria maculans pathosystem: resistance partially requires camalexin biosynthesis and is independent of salicylic acid, ethylene and jasmonic acid signalling. Plant Journal 37: 9-20. Broekaert W.F., Delaure S.L., De Bolle M.F., a Cammue B.P. (2006) The role of ethylene in host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology 44: 393–416. Browse J., a Howe G.A. (2008) Update on jasmonate signaling: new weapons and a rapid response against insect attack. Plant Physiology 146: 832-838. Chester K.S. (1933) The Problem of Acquired Physiological Immunity in Plants. Quarterly Review of Biology 8: 275-324. Chico J.M., Chini A., Fonseca S., a Solano R. (2008) JAZ repressors set the rhythm in jasmonate signaling. Current Opinion in Plant Biology 11: 486–494.

74

7. Seznam použité literatury Clay N.K., Adio A.M., Denoux C., Jander G., a Ausubel F.M. (2009) Glucosinolate Metabolites Required for an Arabidopsis Innate Immune Response. Science 323: 95-101. Cohen Y., a Gisi U. (1994) Systemic translocation of 14C-DL-3-aminobutyric acid in tomato plants in relation to induced resistance against Phytophthora infestans. 45: 441-456. Cohen Y. (2002) β-Aminobutyric acid-induced resistance against plant pathogens. Plant Disease 86: 448–457. Collinge D.B., Jørgensen H.J., Lund O.S., a Lyngkjaer M.F. (2010) Engineering pathogen resistance in crop plants: current trends and future prospects. Annual Review of Phytopathology 48: 269-291. de Torres-Zabala M., Truman W., Bennett M.H., Lafforgue G., Mansfield J.W., Rodriguez Egea P., Bogre L., a Grant M. (2007) Pseudomonas syringae pv. tomato hijacks the Arabidopsis abscisic acid signalling pathway to cause disease. EMBO Journal 26: 14341443. de Vos M., Van Oosten V.R., van Poecke R.M.P., van Pelt J.A., Pozo M.J., Mueller M.J., Buchala A.J., Métraux J., van Loon L.C., Dicke M., a Pieterse C.M.J. 2005. Signal signature and transcriptome changes of Arabidopsis during pathogen and insect attack. Molecular Plant-Microbe Interactions 18: 923–937. Delourme R., Chèvre A.M., Brun H., Rouxel T., Balesdent M.H., Dias J.S., Salisbury P., Renard M., a Rimmer S.R. (2006) Major gene and polygenic resistance to Leptosphaeria maculans in oilseed rape (Brassica napus). European Journal of Plant Pathology 114: 41– 52. Dodds P.N., a Rathjen J.P. (2010) Plant immunity: towards an integrated view of plantpathogen interactions. Nature Reviews Genetics 11: 539-548. Durrant W.E., a Dong X. (2004) Systemic acquired resistance. Annual Review of Phytopathology 42: 185–209. Fan J., Crooks C., a Lamb C. (2008) High-throughput quantitative luminescence assay of the growth in planta of Pseudomonas syringae chromosomally tagged with Photorhabdus luminescens luxCDABE. Plant Journal 53: 393-399. Fischer M.J.C., Farine S., Chong J., Guerlain P., a Bertsch, C. (2009) The direct toxicity of BABA against grapevine ecosystem organisms. Crop Protection 28: 710-712. Flor H.H. (1971) Current status of the gene-for-gene concept. Annual Review of Phytopathology 9: 275-296. Fristensky B., Balcerzak M., He D., a Peijun Z. (1999) Expressed sequence tags from the defense response of Brassica napus to Leptosphaeria maculans. Molecular Plant Pathology. mppol/1999/0301fristensky. Published online. Fu D., Uauy C., Distelfeld A., Blechl A., Epstein L., Chen X., Sela H., Fahima T., a Dubcovsky J. (2009) A kinase-START gene confers temperature-dependent resistance to wheat stripe rust. Science 323: 1357-1360. Fudal I., Ross S., Gout L., Blaise F., Kuhn M.L., Eckert M., Cattolico L., Bernard-Samain S., Balesdent M.H., a Rouxel, T. (2007) Heterochromatin-like regions as ecological niches for avirulence genes in the Leptosphaeria maculans genome: map-based cloning of AvrLm6. Molecular Plant Microbe Interactions 20: 459–470. Gan S., a Amasino R. M. (1997) Making sense of senescence. Plant Physiology 113: 313– 319. Garcion C., Lohmann A., Lamodière E., Catinot J., Buchala A., Doermann P., a Métraux J.P. (2008) Characterization and biological function of the ISOCHORISMATE SYNTHASE2 gene of Arabidopsis. Plant Physiology 147: 1279-1287. 75

7. Seznam použité literatury Glazebrook J. (2005) Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annual Review of Phytopathology 43: 205-227. Green T.R, a Ryan C.A. (1972) Wound-Induced Proteinase Inhibitor in Plant Leaves: A Possible Defense Mechanism against Insects. Science 175: 776-777. Gomez-Gomez L. a Boller T. (2000) FLS2: An LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular cell 5: 1003-1011. Gout L., Fudal I., Kuhn M.L., Blaise F., Cattolico L., Balesdent M.H., a Rouxel T. (2006) Lost in the middle of nowhere: the AvrLm1 avirulence gene of Leptosphaeria maculans. Molecular Microbiology 60: 67–80. Gout L., Kuhn M.L., Vincenot L., Bernard-Samain S., Cattolico L., Barbetti M., MorenoRico O., Balesdent M.H., a Rouxel T. (2007) Genome structure impacts molecular evolution at the AvrLm1 avirulence locus of the plant pathogen Leptosphaeria maculans. Environmental Microbiology 9: 2978–2992. Hahn M.G. a Albersheim P. (1978) Host-Pathogen Interactions: XIV. Isolation and Partial Characterization of an Elicitor from Yeast Extract. Plant Physiology 62: 107-111. Hammerschmidt R. (1999) Induced disease resistance: how do induced plants stop pathogens? Physiological and Molecular Plant Pathology 55: 77-84. Hammond-Kosack K.E., Silverman P., Raskin I., a Jones J.D.G. (1996) Race-specific elicitors of Cladosporium fulvum induce changes in cell morphology and the synthesis of ethylene and SA in tomato cells carrying the corresponding Cf resistance gene. Plant Physiology 110: 1381-1394. Hanfrey C., Fife M., a Buchanan-Wollaston V. (1996) Leaf senescence in Brassica napus: expression of genes encoding pathogenesis-related proteins. Plant Molecular Biology 30: 597-609. Hématy K., Cherk C., a Somerville S. (2009) Host-pathogen warfare at the plant cell wall. Current Opinion in Plant Biology 12: 406–413. Holmes F. O. (1938) Inheritance of resistance to tobacco-mosaic disease in tobacco. Phytopathology 28: 553-561. Hruz T., Laule O., Szabo G., Wessendorp F., Bleuler S., Oertle L., Widmayer P., Gruissem W., a Zimmermann P. (2008) Genevestigator V3: a reference expression database for the meta-analysis of transcriptomes. Advances in Bioinformatics 2008: 420747. Huang Y.J., Pirie E.J., Evans N., Delourme R., King G.J., a Fitt B.D.L. (2009) Quantitative resistance to symptomless growth of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in Brassica napus (oilseed rape). Plant Pathology 58: 314-323. Huang Y.J., Balesdent M.H., Li Z.Q., Evans N., Rouxel T., a Fitt B.D.L. (2010) Fitness cost of virulence differs between the AvrLm1 and AvrLm4 loci in Leptosphaeria maculans (phoma stem canker of oilseed rape). European Journal of Plant Pathology 126: 279-291. Chung H.S., Koo A.J.K., Gao X., Jayanty S., Thines B., Jones A.D., a Howe G.A. (2008) Regulation and function of Arabidopsis JASMONATE ZIM-domain genes in response to wounding and herbivory. Plant Physiology 146: 952–964. Jakab G., Cottier V., Toquin V., Rigoli G., Zimmerli L., Metraux J.-P., a Mauch-Mani B. (2001) β-Aminobutyric acid-induced resistance in plants. European Journal of Plant Pathology 107: 29-37. Jakab G., Ton J., Flors V., Zimmerli L., Métraux J.P., a Mauch-Mani B. (2005) Enhancing Arabidopsis salt and drought stress tolerance by chemical priming for its abscisic acid responses. Plant Physiology 139: 267–274.

76

7. Seznam použité literatury Johnsen K., Jacobsen C.S., Torsvik V. a Sørensen J. (2001) Pesticide effects on bacterial diversity in agricultural soils – a review. Biology and Fertility of Soils 33: 443-453. Jones J.D.G., a Dangl J.L. (2006) The plant immune system. Nature 444: 323–329. Jung H.W., Tschaplinski T.J., Wang L., Glazebrook J., a Greenberg J.T. (2009) Priming in Systemic plant Immunity. Science 324: 89-91. Kaliff M., Staal J., Myrenås M., a Dixelius C. (2007) ABA is required for Leptosphaeria maculans resistance via ABI1 and ABI4 dependent signalling. Molecular Plant-Microbe Interactions 20: 335–345. Kašpárková V., Kolomazník K., Burketová L., Šašek V., a Šimek L. (2009) Characterization of low-molecular weight collagen hydrolysates prepared by combination of enzymatic and acid hydrolysis. Journal of the American Leather Chemists Association 104: 46-51. Katsir L., Chung H.S., Koo A.J.K, a Howe G.A. (2008) Jasmonate signaling: a conserved mechanism of hormone sensing. Current Opinion in Plant Biology 11: 428–435. Kendrick M.D., a Chang C. (2008) Ethylene signaling: new levels of complexity and regulation. Current Opinion in Plant Biology 11: 479–485. Kessler A., Halitschke R., Diezel C., a Baldwin I.T. (2006) Priming of plant defense responses in nature by airborne signaling between Artemisia tridentata and Nicotiana attenuata. Oecologia 148: 280-292. Kim K.C.; Lai Z.B., Fan B.F., a Chen Z. (2008) Arabidopsis WRKY38 and WRKY62 transcription factors interact with Histone Deacetylase 19 in basal defense. Plant Cell 20: 2357-2371. Koornneef A., Leon-Reyes A., Ritsema T., Verhage A., Den Otter F.C., van Loon L.C., a Pieterse C.M.J. (2008) Kinetics of salicylate-mediated suppression of jasmonate signaling reveal a role for redox modulation. Plant Physiol 147: 1358–1368. Krattinger S.G., Lagudah E.S., Spielmeyer W., Singh R.P., Huerta-Espino J., McFadden H., Bossolini E., Selter L.L., a Keller B. (2009) A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat. Science 323: 1360-1363. Kúc, J. (2001) Concepts and direction of induced systemic resistance in plants and its application. European Journal of Plant Pathology 107: 7–12. Kuć J. (2006) What`s Old and What`s New in Concepts of Induced Systemic Resistance in Plants, and its Application. in Multigenic and Induced Systemic resistance in Plants. Tuzun S., Bent E. New York: Springer, 2006. 521 s. ISBN 0-387-23265-6. Kwon C., Neu C., Pajonk S., Yun H.S., Lipka U., Humphry M., Bau S., Straus M., Kwaaitaal M., Rampelt H., El Kasmi F., Jurgens G., Parker J., Panstruga R., Lipka V., a Schulze-Lefert P. (2008) Co-option of a default secretory pathway for plant immune responses. Nature 451: 835–840. Lawton K.A., Potter S.L., Uknes S., a Ryals J. (1994) Acquired Resistance Signal Transduction in Arabidopsis is Ethylene lndependent. Plant Cell 6: 581-588. Lawton K., Friedrich L., Hunt M., Weymann K., Delaney T., Kessmann H., Staub T., a Ryals J. (1996) Benzothiadiazole induces disease resistance in Arabidopsis by activation of the systemic acquired resistance signal transduction pathway. Plant Journal 10: 71–82. Leitinger B., a Hohenester E. (2007) Mammalian collagen receptors. Matrix Biology 26: 146–155. Leon-Reyes A., Spoel S.H., De Lange E.S., Abe H., Kobayashi M., Tsuda S., Millenaar F.F., Welschen R.A.M., Ritsema T., a Pieterse C.M.J. (2009) Ethylene Modulates the Role 77

7. Seznam použité literatury of NPR1 in Cross-Talk Between Salicylate and Jasmonate Signaling. Plant Physiology 149: 1797-1809. Li H., Sivasithamparam K., Barbetti M.J., a Kuo J. (2004a) Germination and invasion by ascospores and pycnidiospores of Leptosphaeria maculans on spring-type Brassica napus canola varieties with varying susceptibility to blackleg. Journal of General Plant Pathology 70: 261–269. Li J., Brader G., a Palva E.T. (2004b) The WRKY70 Transcription Factor: A Node of Convergence for Jasmonate-Mediated and Salicylate-Mediated Signals in Plant Defense. Plant Cell 16: 319–331. Lim P.O., Kim H.J., a Nam H. G. (2007) Leaf senescence. Annual Review of Plant Biology 58: 115–136. Liu S.Y., Liu Z., Fitt B.D.L., Evans N., Foster S.J., Huang Y.J., Latunde-Dada A.O., a Lucas J.A. (2006) Resistance to Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in Brassica napus (oilseed rape) induced by L. biglobosa and chemical defence activators in field and controlled environments. Plant Pathology 55: 401–412. Lorang J.M., Sweat T.A., a Wolpert T.J. (2007) Plant disease susceptibility conferred by a ‘resistance’ gene. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104: 14861– 14866. Lorenzo O., Chico J.M., Sanchez-Serrano J.J., a Solano, R. (2004) JASMONATEINSENSITIVE1 encodes a MYC transcription factor essential to discriminate between different jasmonate-regulated defense responses in Arabidopsis. Plant Cell 16: 1938–1950. Lorková L. (2008) Elicitory z Leptosphaeria maculans indukující resistenci u rostlin řepky olejky (Brassica napus). Diplomová práce. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Praha. 67 s. Malamy J., Carr J.P., Klessig D.F., a Raskin I. (1990) Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Science 250: 1002–1004. Maldonado A.M., Doerner P., Dixon R.A., Lamb C.J., a Cameron R.K. (2002) A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis. Nature 419: 399–403. Marshall O.J. (2004) PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics 20: 2471-2472. Métraux J.P., Signer H., Ryals J., Ward E., Wyss-Benz M., Gaudin J., Raschdorf E., Schmid E., Blum W., a Inverardi B. (1990) Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber. Science 250: 1004–1006. Miya A., Albert P., Shinya T., Desaki Y., Ichimura K., Shirasu K., Narusaka Y., Kawakami N., Kaku H., a Shibuya N. (2007) CERK1, a LysM receptor kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104: 19613–19618. Moua Z., Fan W., a Dong X. 2003. Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell 113: 935-944. Mur L.A.J., Kenton P., Lloyd A.J., Ougham H., a Prats E. (2008) The hypersensitive response: the centenary is upon us but how much do we know? Journal of Experimental Botany 59: 501–520. Navarro L., Zipfel C., Rowland O., Keller I., Robatzek S., Boller T., a Jones J.D. (2004) The transcriptional innate immune response to flg22. Interplay and overlap with Avr genedependent defense responses and bacterial pathogenesis. Plant Physiol 135: 1113-1128.

78

7. Seznam použité literatury Norman-Setterblad C., Vidal S., a Palva E.T. (2000) Interacting signal pathways control defense gene expression in Arabidopsis in response to cell wall-degrading enzymes from Erwinia carotovora. Molecular Plant-Microbe Interactions 13: 430-438. O’Donnell P.J., Jones J.B., Antoine F.R., Ciardi J., a Klee H.J. (2001) Ethylenedependent salicylic acid regulates an expanded cell death response to a plant pathogen. Plant Journal 25: 315–323. Oliver R.P., a Solomon P.S. (2010) New developments in pathogenicity and virulence of necrotrophs. Current Opinion in Plant Biology 13: 415-419. Østergaard L., a King G.J. (2008) Standardized gene nomenclature for the Brassica genus. Plant Methods 4: 1-4. Parlange F., Daverdin G., Fudal I., Kuhn M.L., Balesdent M.H., Blaise F., Grezes-Besset B., a Rouxel T. (2009) Leptosphaeria maculans avirulence gene AvrLm4-7 confers a dual recognition specificity by the Rlm4 and Rlm7 resistance genes of oilseed rape, and circumvents Rlm4-mediated recognition through a single amino acid change. Molecular Microbiology 71: 851–863. Park J.-H., Halitschke R., Kim H.B., Baldwin I.T., Feldmann K.A., a Feyereisen R. (2002) A knock-out mutation in allene oxide synthase results in male sterility and defective wound signal transduction in Arabidopsis due to a block in jasmonic acid biosynthesis. Plant Journal 31: 1–12. Penninckx I.A., Thomma B.P., Buchala A., Metraux J.P., a Broekaert W.F. (1998) Concomitant activation of jasmonate and ethylene response pathways is required for induction of a plant defensin gene in Arabidopsis. Plant Cell 10: 2103–2113. Persson M., Staal J., Oide S., a Dixelius C. (2009) Layers of defense responses to Leptosphaeria maculans below the RLM1- and camalexin-dependent resistances. New Phytologist 182: 470-482. Pieterse C.M.J., Van Wees S.C.M., Van Pelt J.A., Knoester M., Laan R., Gerrits H., Weisbeek P.J., a Van Loon L.C. (1998) A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1571–1580. Pieterse C.M.J., Leon-Reyes A., van der Ent S., a Van Wees S.C.M. (2009) Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology 5: 308-316. Poland J.A., Balint-Kurti P.J., Wisser R.J., Pratt R.C., a Nelson R.J. (2009) Shades of gray: the world of quantitative disease resistance. Trends in Plant Science 14: 21-29. Porat R., Vinokur V., Weiss B., Cohen L., Daus A., Goldschmidt E.E., a Droby S. (2003) Induction of Resistance to Penicillium digitatum in Grapefruit by β-Aminobutyric Acid. European Journal of Plant Pathology 109: 901-907. Potlakayala S.D., Reed D.W., Covello P.S., a Fobert P.R. (2007) Systemic acquired resistance in canola is linked with pathogenesis-related gene expression and requires salicylic acid. Phytopathology 97: 794-802. Potměšilová, J., Adamec, J. (2004) Situační a výhledová zpráva olejniny. MZe ČR. 38 s. Potter S., Uknes S., Lawton K., Winter A.M., Chandler D., DiMaio J., Novitzky R., Ward E., a Ryals J. (1993) Regulation of a hevein-like gene in Arabidopsis. Molecular PlantMicrobe Interactions 6: 680-685. Rasmussen U., Bojsen K., a Collinge D.B. (1992) Cloning and characterization of a pathogen-induced chitinase in Brassica napus. Plant Molecular Biology 20: 277-287. Rosebrock T.R., Zeng L., Brady J.J., Abramovitch R.B., Xiao F., a Martin G.B. (2007) A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature 448: 370-374. 79

7. Seznam použité literatury Ross A.F. (1961) Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants. Virology 14: 340-358. Roussel S., Nicole M., Lopez F., Renard M., Chevre A.M., a Brun H. (1999) Cytological investigation of resistance to Leptosphaeria maculans conferred to Brassica napus by introgressions originating from B. juncea or B. nigra B genome. Phytopathology 89: 1200– 1213. Rouxel T., a Balesdent, M.H. (2005) The stem canker (blackleg) fungus, Leptosphaeria maculans, enters the genomic era. Molecular Plant Pathology 6: 225-241. Rouxel T., et al. (2011) Effector diversification within compartments of the Leptosphaeria maculans genome affected by Repeat-Induced Point mutations. Nature Communications 2: 202. Sesma A., a Osbourn A. (2004) The rice leaf blast pathogen undergoes developmental processes typical of root-infecting fungi. Nature 431: 582-586. Schägger H. (2006) Tricine–SDS-PAGE. Nature Protocols 1: 16-22. Schreiber K., a Desveaux D. (2008) Message in a bottle: Chemical biology of induced disease resistance in plants. Plant Pathology Journal 24: 245-268. Schweizer P., Pokorny J., Abderhalden O., a Dudler R. (1999) A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat. Molecular Plant-Microbe Interactions 12: 647-654. Schwessinger B. a Zipfel C. (2008) News from the frontline: recent insights into PAMPtriggered immunity in plants. Current Opinion in Plant Biology 11: 389–395. Sheard L.B., Tan X., Mao H., Withers J., Ben-Nissan G., Hinds T.R., Kobayashi Y., Hsu F.F., Sharon M., Browse J., He S.Y., Rizo J., Howe G.A., a Zheng N. (2010) Jasmonate perception by inositol-phosphate-potentiated COI1-JAZ co-receptor. Nature 468: 400-405. Shibata Y., Kawakita K., a Takemoto D. (2010) Age-related resistance of Nicotiana benthamiana against hemibiotrophic pathogen Phytophthora infestans requires both ethylene- and salicylic acid-mediated signaling pathways. Molecular Plant-Microbe Interactions 23: 1130-1142. Shoemaker R.A., a Brun H. (2001) The teleomorph of the weakly aggressive segregate of Leptosphaeria maculans. Canadian Journal of Botany 79: 412–419. Staal J., Kaliff M. Bohman S. a Dixelius C. (2006) Transgressive segregation reveals two Arabidopsis TIR-NB-LRR resistance genes effective against Leptosphaeria maculans, causal agent of blackleg disease. Plant Journal 46: 218-230. Steiner A.A. (1984) The universal nutrient solution. In: Proceedings of the Sixth International Congress on Soilless Culture, Lunteren: 633-650. International Society for Soilless Culture, Wageningen. Strange R.N. a Scott P.R. (2005) Plant disease: A threat to global food security. Annual Review of Phytopatholgy 43: 83-116. Strawn M.A., Marr S.K., Inoue K., Inada N., Zubieta C., a Wildermuth M.C. (2007) Arabidopsis isochorismate synthase functional in pathogeninduced salicylate biosynthesis exhibits properties consistent with a role in diverse stress responses. Journal of Biological Chemistry 282: 5919–5933. Sun W., Dunning F.M., Pfund C., Weingarten R., a Bent A.F. (2006) Within-species flagellin polymorphism in Xanthomonas campestris pv campestris and its impact on elicitation of Arabidopsis FLAGELLIN SENSING2-dependent defenses. Plant Cell 18: 764– 779.

80

7. Seznam použité literatury Špácová M. (2011) Obranná hormonální signalizace u rostlin a její manipulace efektory patogena. Diplomová práce. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Praha. V tisku. Takahashi H., Miller J., Nozaki Y., Sukamto, Takeda M., Shah J., Hase S., Ikegami M., Ehara Y., a Dinesh-Kumar S.P. (2002) RCY1, an Arabidopsis thaliana RPP8/HRT family resistance gene, conferring resistance to cucumber mosaic virus requires salicylic acid, ethylene and a novel signal transduction mechanism. Plant Journal 32: 655-667. Tamogami S., Ralkwal R., a Agrawal G.K. (2008) Interplant communication: Airborne methyl jasmonate is essentially converted into JA and JA-Ile activating jasmonate signaling pathway and VOCs emission. Biochemical and Biophysical Research Communications 376: 723-727. Testerink C., Larsen P., van der Does D., van Himbergen J., a Munnik T. (2007) Phosphatidic acid binds to and inhibits the activity of CTR1. Journal of Experimental Botany 58: 3905-3914. Thomma B., Eggermont K., Penninckx I., Mauch-Mani B., Vogelsang R., Cammue B.P.A., a Broekaert W.F. (1998). Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defenseresponse pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95: 15107–15111. Ton J., a Mauch-Mani B. (2004) β-amino-butyric acid-induced resistance against necrotrophic pathogens is based on ABA dependent priming for callose. Plant Journal 38: 119–130. Ton J., Jakab G., Toquin V., Flors V., Iavicoli A., Maeder M.N., Métraux J.P., a MauchMani B. (2005) Dissecting the β-aminobutyric acid induced priming pathways in Arabidopsis. Plant Cell 17: 987–999. Thordal-Christensen H., Zhang Z., Wei Y., a Collinge D.B. (1997) Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley—powdery mildew interaction. Plant Journal 11: 1187-1194. Trewavas A. (2002) Malthus foiled again and again. Science 418: 668-670. Torres M. A., Jones J. D. G., a Dangl J. L. (2006) Reactive Oxygen Species Signaling in Response to Pathogens. Plant Physiology 141: 373-378. Tsai C.H., Singh P., Chen C.W., Thomas J., Weber J., Mauch-Mani B., a Zimmerli L. (2011) Priming for enhanced defence responses by specific inhibition of the Arabidopsis response to coronatine. Plant Journal 65: 469-479. Tsuchisaka A., Yu G., Jin H., Alonso J.M., Ecker J.R., Zhang X., Gao S., a Theologis A. (2009) A combinatorial interplay among the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate isoforms regulates ethylene biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Genetics 183: 979-1003. Tuzun, S., a Somanchi, A. (2006) The posible role of PR proteins in multigenic and induced systemic resistance. In: Multigenic and induced systemic resistance in plants. Tuzun, S., Bent, E. New York: Springer, 521 s. ISBN 0-387-23265-6. Uknes S., Dincher S., Friedrich L., Negrotto D., Williams S., Thompson-Taylor H., Potter S., Ward E., a Ryals J. (1993) Regulation of pathogenesis-related protein-1a gene expression in tobacco. Plant Cell 5: 159-69. Vallad G.E., a Goodman R.M. (2004) Systemic acquired resistance and Induced systemic resistance in conventional agriculture. Crop Science 44: 1920–1934. van Loon L.C., a van Kammen A. (1970) Polyacrylamide disc electrophoresis of the soluble leaf proteins from Nicotiana tabacum var. "Samsun" and "Samsun NN". II. Changes in protein constitution after infection with tobacco mosaic virus. Virology 40: 190-211. van Loon L.C. (1985) Pathogenesis-related proteins. Plant Molecular Biology 4: 111-116. 81

7. Seznam použité literatury Van de Wouw A.P., Cozijnsen A.J., Hane J.K., Brunner P.C., McDonald B.A., Oliver R.P., a Howlett B.J. (2010) Evolution of Linked Avirulence Effectors in Leptosphaeria maculans Is Affected by Genomic Environment and Exposure to Resistance Genes in Host Plants. PLoS Pathogens 6: e1001180. van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., a Hays J.P. (2008) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. Springer Netherlands. ISBN 978-1-4020-6240-7. 325 stran. Věchet L., Burketová L., a Šindelářová M. (2009) A comparative study of the efficiency of several sources of induced resistance to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici) in wheat under field conditions. Crop Protection 28: 151-154. Wang D., Amornsiripanitch N., a Dong X. (2006) A genomic approach to identify regulatory nodes in the transcriptional network of systemic acquired resistance in plants. PLoS Pathogens 2: 1042-1050. West J.S., Kharbanda P.D., Barbetti M.J. a Fitt B.D.L. (2001) Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Australia, Canada and Europe. Plant Pathology 50: 10–27. Wildermuth M.C., Dewdney J., Wu G., Ausubel F.M. (2001) Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature 417: 562–565. White R.F. (1979) Acetylsalicylic acid (aspirin) induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco. Virology 99: 729-734. Zander M., La Camera S., Lamotte O., Métraux J.-P., a Gatz C. (2010) Arabidopsis thaliana class-II TGA transcription factors are essential activators of jasmonic acid/ethyleneinduced defense responses. Plant Journal 61: 200-210. Zeevaart J.A.D. (2009) My Journey from Horticulture to Plant Biology. Annual Review of Plant Biology 60: 1-19. Zimmer M. (2002) Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews 102: 759-781. Zimmerli L., Jakab G., Métraux J.P., a Mauch-Mani B. (2000) Potentiation of pathogenspecific defense mechanisms in Arabidopsis by β-aminobutyric acid. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 12920–12925. Zimmerli L., Metraux J.P., a Mauch-Mani B. (2001) β-aminobutyric acid-induced protection of Arabidopsis against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea. Plant Physiology 126: 517523. Zimmerli L., Hou B.H., Tsai C.H., Jakab G., Mauch-Mani B., a Somerville S. (2008) The xenobiotic β-aminobutyric acid enhances Arabidopsis thermotolerance. Plant Journal 5: 144– 156. Zipfel C., a Felix G. (2005) Plants and animals: a different taste for microbes? Current Opinion in Plant Biology 8: 353-360.

82

8. Použité zkratky

8. Použité zkratky ET 

etylén 

GFP 

green fluorescent protein 

GUS 

β‐glucuronidáza 

HR 

hypersenzitivní reakce 

IEF 

isoelektrická fokusace 

JA 

kyselina jasmonová 

LC‐MS 

kapalinová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí  

MAMPs 

Microbe‐associated molecular patterns 

MeJA 

metyljasmonát 

NB‐LRR receptor  cytosolický receptor s NB a LRR doménou  PAGE 

polyacrylamidová gelová elektroforéza 

PCR 

polymerázová řetězová reakce 

PR protein 

Pathogenesis‐related protein 

QDR 

kvantitativní rezistence 

qPCR 

kvantitativní polymerázová řetězová reakce 

R‐gen 

gen rezistence 

ROS 

reaktivní formy kyslíku 

RT‐qPCR 

reverzní transkripce následovaná qPCR 

SA 

kyselina salicylová 

SAR 

Systémově získaná rezistence 

83

9. Přílohy

9. P Přílohy Přílo oha č. 1 Pro otokol pro transforma aci L. macu ulans

Aggrobacterrium Tran nsformatiion of L. maculans m s

B lackleg

Re-rrevised by C C. Elliott September 20066 revised d by Candacee Elliott Nov vember 20055 oriiginally deveeloped by D. Gardiner, an nd L. Wilsonn La aboratory Refe erences: Gardiiner, D.M. annd B.J. How wlett. 2004. N Negative selecction using th hymidine kinnase increasees the efficieency of recovvery of transf sformants wiith targeted genes g in the filamentous f ffungus Lepto osphaeria macuulans. Currennt Genetics 45: 4 249-55. Gardiiner, D.M., A.J. A Cozijnseen, L.M. Willson, M.S. Peedras, and B..J. Howlett. 22004. The sirrodesmin biosyynthetic genee cluster of th he plant pathhogenic fungu us Leptospha aeria maculaans. Molecullar Microobiology 53: 1307-18.

Prottocol sum mmary: Fridaay:

1.Transform competent c A Agrobacterium m strain LBA A4404 with bbinary vectorr 2. Prepare 9cm m V8 agar pllate streaked d with L. macculans isolatee

day: Mond

3. Inoculate liiquid culturee of transform med agrobactterium strainn

Wedn nesday:

4. Transformaation of L. m maculans

Fridaay:

5. Apply agarr overlay with th antibiotic selection s

1. (F Friday) Tran nsformation n of Agrobaccterium with h binary vecctor  L LBA4404 straain purchaseed ready for eelectroporation (Invitrogeen) use 18 ll  Use conccentrated plassmid for elecctroporationss (1or 2 l; 500ng- 1 g) Electroporatoor: BRL Cellp porator  E  A Allow agrobaacterium to reecover 3 h inn 2 mL YM media m shakin ng 250 rpm 228C  P Plate on antibbiotic YM plates  L Leave at 28C C, should seee colonies in 2 days or ov ver weekend  T Take colony to t streak on another platee, and to creaate glycerol stock s 2. (F Friday) Streak L. macullans isolate  M M1 streaked onto o V8 agarr and grown at 22C undeer fluorescentt lights for att least 5 dayss to induce spporulation. 9cm plate sh hould give loots of spores 3. (M Monday am)) Culture off agrobacteriium cells forr L. mac tra ansformationn  Innoculate cultture of LB pllus antibioticc 7.5 mL in 50 5 mL tube with w single trransformed Agro A colony  G Grow at 28C C shaking forr 2 nights andd 1 day Wednesday)) Transform mation Day 4. (W  F First thing in morning! Taake 1 mL of overnight cu ulture and reaad OD at 6600nm on sppectrophotom meter  D Dilute O/N cuulture with sterile IM +A AS (AS at 200 0 uM final co onc.) to obtaain OD 660nm m=0.15 in 220 mL.  G Grow these cuultures in 10 00 mL conicaal flasks in 28C orbital shaker s for aroound 6 hourss or until O OD at 660nm m is close to 0.6 0 84

9. Přílohy Prepare M1 L. mac spores for transformation  Add 5 or 7 ml sterile water to top of week old sporulating plate of M1 and scrape with scalpel to loosen spores and allow to sit 20 minutes  Filter spore solution through sterile Miracloth and funnel  Count spores with haemocytometer  Concentrate or dilute spores as required (seems 107 - 106 works best)  Aliquot 400 uL of spores for each treatment Co-culture of Agrobacterium and L. maculans - Pour 25 mL IM+AS plates (15 cm dishes) - Mix 400ul of log phase agro cells with spore aliquot - Plate out 400 uL of each co-culture on each of 2 replicate plates - Incubate at 22C for 48 hours in the dark (seal plates) 5. (Friday) Overlay plates - Overlay plates with 25 mL 10 % V8 agar including antibiotics - (10 % V8 juice, 2 % agar, 400 ug/mL cefotaxime, 100 ug/mL hygromycin so that final concentration will be 200 ug/mL cefotaxime 50 ug/mL hygromycin over entire plate) - Seal plates and leave in growth cabinet (with lights) 22C - L. maculans colonies should be up within 5-10 days 6. (Monday 10 days post selection) Pick colonies - Sub colonies onto fresh V8 hyg cef plates for another round of selection and apply negative selection** if required. - To be sure only 1 colony is picked, use the dissecting microscope in laminar flow and excise a hyphal tip of a colony or the growing edge of the colony if it is a large one. - Pick as many colonies as you feel comfortable working with. Transformation plates will last several months at 4C, so you can pick more at a later date if the plates are kept clean. - Passage each colony through hygromycin with agar overlays at least twice before storing isolate on filter paper.

**Negative selection: For use with the targeting fragment cloned into pPZPtk8.10 (or pPZPtk3.5) Add thymidine analogues to the first subculture plates. To save analogue do this in 48 well plates and overlay the colonies. Use TFT at 5 mM (yes that is millimolar so you need a lot – that’s 3.75 mL per 50 mL media) Use FdU at 1 to 5 μM There is no need to include thymidine analogues in plates which transformants are subsequently subbed onto. Don Gardiner checked and once a transformant with the thymidine kinase gene intact is grown on a thymidine analogue it will die pretty quickly. When the chunk of agarose with the transformant in is plated without selection nothing grows.

85

9. Přílohy

Media YM media Yeast extract Mannitol NaCl MgSO4.7H20 K2HPO4 -

For 500mL 0.2 g 5g 0.05 g 0.1 g 0.25 g

Check pH 7 For agar add 7 g = 1.5 % Autoclave

5M KOH Dissolve 7.01 g KOH in 25 mL dH20

Cefotaxime (Cef) 100 mg/mL stock make up in sterile water from powder stock aliquot in eppis in freezer

Hygromycin (Hyg) 50mg/mL stock solution, purchased already in solution

Negative selection analogues Make TFT (trifluorothymidine) up at 67 mM (50 mL water for every 1 g) filter sterilise and freeze in aliquots Make stock of FdU (fluorodeoxyuridine) up at 10 mM filter sterilise and freeze in aliquots

MM salts for IM 1L of 2.5x stock KH2PO4 3.625 g 5.125 K2HPO4 NaCl 0.375 g MgSO4.7H2O 1.250 g CaCl2.2H2O 0.165 g FeSO4.7H2O 0.0062 g (NH4)2SO4 1.250 g Dissolve salts one at a time, don’t autoclave, store at RT

10 mM acetosyringone (AS) (3’,5’-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone – MW 196.2) -

0.0196 g in 10 mL dH2O dissolve on shaker pH with 5M KOH to pH 8 (not much, 1 drop) filter sterilise 0.25 uM filter Aliquot into sterile eppis

86

9. Přílohy

1 M MES for IM -

2-N (morphoethane sulfonic acid) 19.25 g MES in 80 mL H20 pH to 5.3 with 5M KOH make final volume up to 100 mL with H2O filter sterilise 0.45 uM filter 9 mL aliquots in freezer If salts precipitate on thawing heat in water bath

IM (induction media) Final concentration 1x MM salts 10 mM glucose 0.5 % glycerol dH2O -

For 200 mL 80 mL of 2.5x stock add after autoclaving 1 mL to 188 mL final vol.

autoclave cool to 50C Add 8 mL of 1 M MES stock = 40 mM Add 4 mL 500 mM Glucose (filter sterilised) (Add 4 mL AS if required)

IM agarose Final concentration 1 x MM salts 10 mM glucose 0.5 % glycerol dH2O 1.5 % agarose -

-

For 400 mL 160 mL 2.5 x stock add after autoclaving 2 mL to 376 mL final volume 6g

autoclave cool to 50C add 16 mL of 1 M MES stock = 40 mM add 8 ml 500mM Glucose (filter sterilised) (add 8 ml AS if required)

87