ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ ZEM UNIVERZITA V PRAZE
Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních írodních zdrojů
Katedra chemie FAPPZ
Téma: Mechanismus vlivu abiotického stresu těžkými t žkými kovy (kadmiem a zinkem) na kvantitu a kvalitu alkaloidů alkaloid v máku (Papaver Papaver somniferum L.)
Disertační práce
Autor:
Ing. Petr Tluka
Školitel:
Prof. Ing. Jaromír Lachman, CSc.
Školitel specialista: Doc. Ing. Alena Hejtmánková, CSc.
2010
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto disertační práci vypracoval samostatně a že jsem uvedl všechny využité prameny a literaturu, ze kterých jsem čerpal.
V Praze 30.4.2011 2
Poděkování Velice děkuji paní Doc. Ing. Aleně Hejtmánkové, CSc. a panu Prof. Ing. Jaromíru Lachmanovi, CSc. za odborné vedení a pomoc při zpracování disertační práce, panu Ing. Pavlu Cihlářovi, Ph.D., Ing. Romanu Honzíkovi a Ing. Sergeji Usťakovi, CSc. za odborné rady a pomoc při realizaci pokusů a panům Ing. Zdeňku Pechovi, Ing. Stanislavu Najmrovi a Ing. Jaroslavu Dudovi za poskytnutí pokusných pozemků.
3
1 Obsah 1
Obsah .................................................................................................................. 4
2
Úvod .................................................................................................................... 8
3
Literární rešerše ................................................................................................ 10 3.1
Mák ............................................................................................................ 10
3.1.1
Rod Papaver ......................................................................................... 10
3.1.2
Mák setý (Papaver somniferum L.) ....................................................... 10
3.1.3
Pěstování máku v České republice ....................................................... 13
3.1.4
Kvalita máku ......................................................................................... 14
3.2
3.1.4.1
Škůdci............................................................................................. 14
3.1.4.2
Choroby .......................................................................................... 15
Těžké kovy ................................................................................................. 16
3.2.1 3.3
Kadmium a zinek .................................................................................. 20
Alkaloidy ..................................................................................................... 21
3.3.1
Opiové alkaloidy.................................................................................... 22
3.3.1.1
Morfin ............................................................................................. 23
3.3.1.2
Kodein ............................................................................................ 24
3.3.1.3
Papaverin ....................................................................................... 25
3.3.1.4
Narkotin (Noskapin) ........................................................................ 25
3.3.1.5
Thebain .......................................................................................... 26
3.3.2
Biosyntéza alkaloidů máku.................................................................... 27
3.3.3
Faktory ovlivňující tvorbu alkaloidů v rostlině ........................................ 33
3.4
Abiotický stres ............................................................................................ 35
3.4.1
Vliv kadmia a zinku na rostlinu .............................................................. 37
3.4.2
Vliv kadmia a zinku na tvorbu alkaloidů máku setého ........................... 40
3.4.3
Prolin ..................................................................................................... 41
3.4.3.1
Biosyntéza prolinu .......................................................................... 42
4
Hypotézy a cíle .................................................................................................. 44
5
Materiál a metody .............................................................................................. 45 5.1
Rostlinný materiál ....................................................................................... 45
5.1.1
Odrůda Major ........................................................................................ 45
5.1.2
Maloparcelové pokusy .......................................................................... 46
5.1.3
Nádobové pokusy ................................................................................. 48
4
5.1.3.1 5.2
Chemický materiál a metody ...................................................................... 52
5.2.1
Chemikálie pro přípravu vzorku alkaloidů: ............................................ 52
5.2.2
Stanovení alkaloidů pomocí HPLC s hmotnostní detekcí ..................... 52
5.2.3
Stanovení obsahu kadmia a zinku ........................................................ 56
5.2.4
Analýza těžkých kovů přístupných pro rostliny v půdě .......................... 57
5.2.4.1
Pracovní postup ............................................................................. 58
5.2.4.2
Chemikálie...................................................................................... 58
5.2.5 5.3
6
Popis stanovišť ............................................................................... 48
Stanovení prolinu .................................................................................. 59
Statistické metody ...................................................................................... 59
5.3.1
Metoda Pearsonova lineárního korelačního koeficientu: ....................... 59
5.3.2
Metoda Spearmanova korelačního koeficientu: .................................... 60
Výsledky ............................................................................................................ 61 6.1
Polní pokusy ............................................................................................... 61
6.1.1
6.1.1.1
První termín odběru (vývojová fáze 65) .......................................... 61
6.1.1.2
Druhý termín odběru (vývojová fáze 79)......................................... 68
6.1.1.3
Morfin ............................................................................................. 75
6.1.1.4
Kodein ............................................................................................ 77
6.1.1.5
Narkotin .......................................................................................... 80
6.1.1.6
Papaverin ....................................................................................... 82
6.1.1.7
Thebain .......................................................................................... 84
6.1.2
Obsah kadmia a zinku v rostlinách z polních pokusů............................ 85
6.1.2.1
První termín odběru (vývojová fáze 65) .......................................... 85
6.1.2.2
Druhý termín odběru (vývojová fáze 79)......................................... 91
6.1.2.3
Obsah těžkých kovů v půdě polních pokusů .................................. 96
6.1.3
6.2
Obsah alkaloidů v rostlinách z polních pokusů ..................................... 61
Obsah prolinu v rostlinách z polních pokusů ......................................... 97
6.1.3.1
První termín odběru (vývojová fáze 65) .......................................... 97
6.1.3.2
Druhý termín odběru (vývojová fáze 79)....................................... 101
Nádobové pokusy..................................................................................... 105
6.2.1
Obsah alkaloidů v rostlinách z nádobových pokusů............................ 105
6.2.2
Obsah kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů .................. 108
6.2.2.1
Obsah kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů ........... 108
6.2.2.2
Obsah těžkých kovů v půdě nádobových pokusů......................... 109 5
6.2.3 7
Obsah prolinu v rostlinách z nádobových pokusů ............................... 110
Diskuse............................................................................................................ 111 7.1
Polní pokusy ............................................................................................. 111
7.1.1
Obsah alkaloidů v rostlinách z polních pokusů ................................... 111
7.1.2
Obsah kadmia zinku v rostlinách z polních pokusů............................. 116
7.1.3
Obsahy kadmia a zinku v půdě polních pokusů .................................. 119
7.1.4
Obsah prolinu v rostlinách z polních pokusů ....................................... 119
7.1.5
Statistické vyhodnocení polních pokusů ............................................. 121
7.2
7.1.5.1
Vztah mezi sledovanými parametry .............................................. 121
7.1.5.2
Vztah mezi sublokalitami .............................................................. 132
7.1.5.3
Vliv termínu sklizně....................................................................... 134
Nádobové pokusy..................................................................................... 135
7.2.1
Obsah alkaloidů v rostlinách z nádobových pokusů............................ 135
7.2.2
Obsahy kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů ................ 136
7.2.3
Obsah kadmia a zinku v půdě nádobových pokusů ............................ 137
7.2.4
Obsah prolinu v rostlinách z nádobových pokusů ............................... 137
7.2.5
Statistické vyhodnocení nádobových pokusů...................................... 138
8
Závěr ............................................................................................................... 142
9
Literatura ......................................................................................................... 144
6
Seznam zkratek AAS
atomová absorpční spektrometrie
ABA
kyselina abscisová
ADP
adenosindifosfát
ATP
adenosintrifosfát
AtMRP
Arabidopsis thaliana multidrug resistance-associated protein
ČZU
Česká zemědělská univerzita v Praze
DNA
2-deoxyribonukleová kyselina
ET-AAS
atomová absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací
F-AAS
atomová absorpční spektrometrie s atomizací plamenem
FAPPZ
Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
NADP+
nikotin-amid adenindinukleotidfosfát
PS
fotosystém
PTGS
post-transkripční umlčení genů
TVCV
virus prosvětlení žilek brukvovitých
VÚRV
Výzkumný ústav rostlinné výroby
7
2 Úvod Do rodu Papaver se řadí asi 120 druhů rostlin, ve kterých bylo zjištěno přes 130 alkaloidů. Zástupci tohoto rodu rostou především v mírném pásmu severní polokoule. Ve střední Evropě je z tohoto počtu 7 druhů domácích a na území České republiky jsou domácí 4 druhy. Mák setý (Papaver somniferum L.) je jednoletou bylinou. Původ této velmi staré kulturní rostliny, nevyskytující se ve volné přírodě jako planě rostoucí, je nejistý. Všeobecně se soudí, že tato kulturní forma vznikla z planého druhu Papaver setigerum DC, který se vyskytuje ve středním a západním Středomoří a dosahuje výšky 0,5 až 2 m. Zubaté až vykrajované listy objímají stonek, květy jsou nejčastěji bílé s fialovou skvrnou. Plody jsou mnohosemenné tobolky - makovice. Mák setý je pěstován k účelům potravinářským (semena, olej), ale také za účelem izolace alkaloidů pro potřeby farmaceutického průmyslu. Zóna růstu máku setého je udána klimatickými podmínkami, kde průměrná teplota se pohybuje od 7 do 23 °C, ro ční srážky jsou 300 až 1700 mm a hodnota pH půdy 4,5 až 8,3. Papaver somniferum roste nejlépe na bohatých vlhčích půdách. I přesto, že při získávání alkaloidů pro farmaceutické účely je preferována syntetická příprava u papaverinu, pro ostatní se stále upřednostňuje izolace z rostliny. Je zde tedy zájem o jejich maximální kvantitativní zastoupení. Z potravinářského hlediska je naproti tomu snaha o dosažení produkce máku setého s minimálním množstvím alkaloidů. Pro optimalizaci použití je proto důležité poznat vlivy, které působí na tvorbu těchto alkaloidů. Výskyt alkaloidů závisí na odrůdě máku a mnoha vnějších vlivech, především na klimatických podmínkách, obsahu organických a anorganických látek v půdě a ovzduší, či způsobu pěstování. V druhu Papaver somniferum patří mezi nejvýznamnější alkaloidy dle procentuálního zastoupení hmotností v opiu: morfin (10 až 17 %), kodein (0,5 až 3,5 %), thebain (0,5 až 7,4 %),
noskapin, zvaný též
narkotin (4 až 6 %) a papaverin (0,1 až 2 %). Alkaloidy se v rostlině nevyskytují volně, ale většinou jako soli kyseliny mesakonové, mléčné, sírové a jiné. Minerální výživa máku je jedním z důležitých faktorů produkce alkaloidů. Vzhledem k tomu, že se mák vyznačuje schopností vysoké akumulace kadmia a současně se jedná o významný polutant, byl tento prvek zvolen jako jeden ze stresorů. Jeho četný
8
vysoký obsah v půdě je dán mimo jiné následkem spalování fosilních paliv a aplikací čistírenských kalů. Zinek byl zvolen podobně jako kadmium pro svůj vysoký obsah v máku. Na rozdíl od kadmia má však do jisté míry pozitivní vliv na růst rostliny, kde zastává důležitou funkci v metabolismu bílkovin a cukrů. Ve větších množstvích však rovněž působí na rostlinu negativně. Stres rostlin může být biotický a abiotický. Zahrnuje tak celou řadu faktorů, které mohou působit na rostlinu během jejího růstu. Hlavní abiotické stresové vlivy jsou dány klimatickými extrémy a odchylkami ve výživě rostlin. Stejně tak, jak jsou rozmanité jednotlivé stresové faktory, jsou i různorodé vlivy na rostlinu. Viditelný vliv stresu na rostlinu, například vadnutí, je však pouze výsledkem mnoha různých stresových reakcí, které probíhají v rostlině. Cílem předkládané disertační práce je určit, zda a do jaké míry působí abiotický stres vyvolaný vybranými těžkými kovy na kvantitu a kvalitu alkaloidů v máku. Za tímto účelem byly studovány možné korelace mezi obsahy těchto prvků, jednotlivých alkaloidů a vybraného ukazatele stresu - aminokyseliny prolinu. Jedná se o způsob kvantitativního vyčíslení míry stresu, který byl ověřen a využit v mnoha výzkumech.
9
3 Literární rešerše 3.1 Mák 3.1.1 Rod Papaver
Rod Papaver zahrnuje 50 až 120 druhů, které lze rozdělit do jedenácti sekcí: Argemonorhoades,
Californicum,
Carinatea,
Horrida,
Macrantha,
Meconella,
Mecodium, Papaver, Pilosa, Pseudopilosa a Rhoeadium (Kadereit, 1988). Významnou charakteristikou tohoto rodu je produkce latexu, který obsahuje alkaloidy specifické pro danou sekci. Alkaloidy rodu Papaver se řadí mezi isochinolinové a biogeneticky od nich odvozené varianty. Podle základního skeletu je lze rozdělit na několik skupin: (a) isochinolinové a benzylisochinolinové, (b) proaporfinové, (c) aporfinové, (d) promorfinanové, (e) morfinanové, (f) isopavinové, (g) berberinové, (h) protopinové,
(i)
ftalidisochinolinové,
(j)
narceinové,
(k)
rhoeadinové
a
papaverrubinové, (l) benzofenantridinové (Novák a Preininger, 1981).
3.1.2 Mák setý (Papaver somniferum L.)
Původ máku setého, velmi staré kulturní rostliny nevyskytující se ve volné přírodě jako planě rostoucí, je nejistý. Všeobecně se soudí, že tato kulturní forma vznikla z planého druhu Papaver setigerum DC., který se vyskytuje ve středním a západním Středomoří (Novák a Bechyně, 1987). Papaver somniferum je jednoletá robustní bylina, která má obvykle větvenou lodyhu, a dosahuje výšky až kolem 2,0 m. Tobolky jsou 35 – 60 mm, v některých případech až 70 mm dlouhé a 20 až 50 mm široké. Somatický počet chromozómů je ve všech odrůdách 2(N) = 22 (Novák, 1990). V
druhu
Papaver
somniferum
tertahydroisochinolinové aporfinové,
a
promorfinové,
jsou
obsaženy
následující
benzyltertahydroisochinolinové, protoberberinové,
protopinové,
typy
alkaloidů:
benzylisochinolinové, ftalidisochinolinové,
narceinové, benzofenantridinové a ve stopové míře i rhoeadinové a papaverrubinové (Novák a Preininger, 1981). Toto rozdělení je uvedeno na obrázku 1. obr.
10
Obr. 1: Biogeneze isochinolinových alkaloidů odvozených od norlaudanosinu (Zdroj: Novák, 1990)
Pro sekci Papaver čeledi Papaveraceae je charakteristická přítomnost morfiových alkaloidů thebainu, kodeinu a morfinu v druzích Papaver somniferum a Papaver setigerum.
Zatímco thebain se nachází v celé řadě rostlin sekcí Orthorhoeades,
Pilosa, Miltantha a Macrantha, kodein a morfin byly nalezeny pouze v rostlinách Papaver somniferum a Papaver setigerum. Oxidace fenolových skupin vedoucí k tvorbě thebainu je tedy jevem obecnějším. Ale pouze rostliny druhů P. somniferum
11
a P. setigerum mají specifickou schopnost demethylace methoxylových skupin kruhů A a D, čímž vzniká kodein a morfin (Novák a Preininger, 1981; Ziegler et al., 2005). K biosyntéze alkaloidů dochází v průběhu vývoje rostliny postupně, v jednotlivých orgánech jsou zastoupeny v různých množstvích (Novák a Bechyně, 1987). Množství alkaloidů je rovněž závislé na vývojové fázi rostliny, kdy největší obsah alkaloidů se nachází ve fázi zelené zralosti (Märculescu a Dobit, 2001). Přehled vývojových fází máku je uveden v tabulceTab. 1. Tab. 1: Vývoj rostliny máku v průběhu vegetace dle Bechyněho 00 suché semeno, v této fázi jsou semena mořena 01 semena bobtnají 05 klíční kořen vystoupil ze semene 08 hypokotyl s děložními listy prorůstá k povrchu půdy 09 vzcházení, děložní listy pronikají na povrch půdy 10 děložní listy plně vyvinuty 11 první pravý list vyvinutý 12 druhý pravý list vyvinutý 13 třetí pravý list vyvinutý 14 čtvrtý pravý list vyvinutý 15 pátý pravý list vyvinutý 16 šestý pravý list vyvinutý, konec vegetativní fáze 17 sedmý pravý list vyvinutý, začátek generativní 18 osmý pravý list vyvinutý 19 devět a více listů vyvinuto, desátý list-fáze diferenciace tyčinek, kopisťovitý tvar 30 počátek prodlužovacího růstu 35 internodia celkem do 5 cm 39 internodia celkem do 10 cm 51 květní pupen již rozpoznatelný mezi listy, dosud skrytý-fáze pylových tetrád, prodlužovacího růstu viditelnéintenzivního poupě 52 začátek
53 54 58 59 60 61 65 69 79 87 89 99
poupě se odděluje od listové růžice-poupě na stonku poupě se sklání poupě na hlavním stonku skloněné, stonek dlouhý poupě se vypřimuje, až vzpřímené květ na hlavním stonku počátek květu – 10% rozkvetlých rostlin plný květ – 30 % rozkvetlých rostlin konec květu- všechna vyvinutá poupata dokvétají zelená zralost-2 týdny po odkvětu-největší akumulace alkaloidů v rostlině fyziologická zralost: semeno uvolněno na dně tobolky plná zralost: semeno je suché, po vyklepání nemění barevný odstín sklizňová zralost semeno ze všech tobolek suché, vlhkost do 10% max. 12%
12
Alkaloidy máku se nacházejí v nejvyšších koncentracích v latexu, který je produkován mléčnicemi. Kromě četných alkaloidů jsou v latexu přítomny i bílkoviny, pryskyřice, kyseliny, cukry, barviva, slizy, vosky a jiné látky (Novák a Bechyně, 1987). Latex je tak složen z mnoha nejrůznějších sloučenin, mezi kterými jsou velice významné i nejrůznější proteiny (Neseper et al., 1985; Facchini a Bird, 1998). Izolovaný latex je znám schopností vykonávat běžné buněčné aktivity, jakými je dýchání, syntéza proteinů, či díky obsahu specifických buněk, akumulovat nebo syntetizovat velké množství alkaloidů (Neseper et al.,1985; Hsu a Pack, 1989). Historicky sporná byla otázka produkce alkaloidů v semenech máku. Semena však alkaloidy neprodukují, jelikož zárodek v žádné své části (ani endospermu nebo testě) neobsahuje mléčnice (Novák a Preininger, 1987). Stopová množství alkaloidů v semenech jsou dána znečištěním semen latexem z tobolky. Tato otázka je ale relevantní především při zpracování makového semene pro potravinářské účely. Jako příklady širokého rozpětí obsahů alkaloidů v semenech mohou být uvedeny studie, které provedli Hoffmann a Blasenbrei (1986), Pelders a Ros (1996), Meadway et al. (1998) a Möller et al. (2004), kteří při analýzách morfinu a kodeinu v semenech odrůd z různých lokalit naměřili obsahy morfinu v rozsahu 2– 294 mg.kg-1 a kodeinu 0,4–57,1 mg.kg-1 . Toto široké rozpětí hodnot je dáno jednak rozdílným obsahem alkaloidů v různých odrůdách máku a nerovnoměrnou kontaminací semen latexem.
3.1.3 Pěstování máku v České republice
Pěstování máku v České republice se v posledním desetiletí vyznačovalo uspokojivými ekonomickými zisky a tím i nárůstem sklizňových ploch. V porovnání s rokem 1990/1991 (cca 9 000 ha) dosáhly sklizňové plochy máku v roce 2008/2009 v České republice 69 800 ha. Hektarové výnosy semene jsou srovnatelné s dvacetiletým průměrem, který činí 0,69 t.ha-1 (2008: 0,7 t.ha-1; 2009: 0,61 t.ha-1). Celková sklizeň vzrostla z 10 200 t v roce 1990/19991 na 49 400 t v roce 2008/2009. Produkce makového semene je v dlouhodobém průměru z 88 % exportována (MZE, 2010). Výhradním odběratelem české makoviny je v současnosti slovenský farmaceutický průmysl. V České republice se pěstují téměř výlučně slovenské odrůdy máku, jako 13
Major, Maraton, Opal a Malsar, které mají standardní obsahy morfinu kolem 0,3 až 0,6 % a téměř nemléčí. Jsou tedy značně bezpečné z pohledu možného zneužití latexového mléka – opia. Jejich mimořádnou výhodou je, že jsou dosti odolné vůči poškození herbicidy (Poláková, 2007). Mák zaujímá významné postavení nejen v oblasti olejnin, kde je po řepce druhou nejvýznamnější plodinou, ale zároveň díky jeho farmaceutickému využití je mák nejvýznamnější exportní komoditou ze skupiny léčivých rostlin. Tento podíl činil v roce 2006 hmotnostních 82,9 % celkového vývozu léčivých rostlin z ČR (Zemědělství, 2006).
3.1.4 Kvalita máku
Kvalitní makovina je suchá, zdravá, bez plísně a škůdců, zpravidla hnědožluté barvy se světlejším nebo tmavším odstínem, sklízená v období biologické zralosti. Pro objektivní analýzu je naprosto nezbytné, aby bylo využito pouze zdravých rostlin bez nemocí a škůdců. Tyto faktory by mohly významně ovlivnit stav rostliny a způsobit metabolické změny, které by zkreslovaly vliv těžkých kovů na obsah alkaloidů. Z tohoto důvodu je dále uveden stručný přehled nejvýznamnějších škůdců a chorob máku. 3.1.4.1 Škůdci Krytonosec kořenový (Stenocarus ruficornis) škodí na vzcházejícím máku, který tím může být silně poškozen. Jedná se o nosatcovitého brouka o velikosti 3 až 3,5 mm. Přezimuje jako dospělec v půdě a na jaře migruje na vzcházející porosty máku, kde škodí žírem. Významné škody způsobuje žír brouků na porostech máku v období od vzcházení do 4. až 5. listu. Ochrana je prováděna mořením osiva a postřikem v období vzcházejícího máku, tj. ve fázi prvního až druhého listu. Krytonosec makovicovitý (Neoglocianus maculaalba) je nosatcovitý brouk, asi 3 mm velký s výraznou bělavou skvrnou ve švu krovek. Brouci se po přezimování vyskytují v první polovině května. Po zralostním žíru samičky kladou vajíčka do nejmenších makovic maximálně 2 až 3 dny a opouštějí ji. Kuklí se v půdě a ve stádiu imag přezimují. 14
Mšice maková (Aphis fabae) může mák napadat od období migrace samiček mšice z primárních hostitelů až do období tvorby makovic. V letech s teplým a mírně vlhkým počasím se vyskytují ve větší početnosti a mohou poškodit mák. Listy žloutnou, vegetační vrcholy zasychají a semena nebo celé makovice se nedokonale vyvíjejí. Spolu s kyjatkou zahradní (Macrosiphum euphorbiae) jsou efektivními přenašeči viróz. Žlabatka stonková (Timaspis papaveris) je jednou ze tří žlabatek škodících na máku. Jedná se o drobný blanokřídlý hmyz, jehož larvy způsobují žír ve stoncích máku. Při žíru larev jsou poškozovány svazky cévní a podle stupně poškození rostliny žloutnou, předčasně dozrávají nebo mohou i celé odumírat. Klopušky – na porostech máku se vyskytují především klopuška dvoutečná (Colocoris norvegicus) a klopušky rodu Lygus, převážně klopuška chlupatá (Lygus rugulipennis). Jedná se o polyfágní druhy škodící na řadě kulturních plodin. Na máku dospělci i nymfální stádia poškozují sáním listy, poupata, květy i semena. Sáním na květních stoncích a mladých makovicích způsobují deformace, zbrzdění růstu a snížení výnosu. Neexistují registrovaná ochranná opatření proti klopuškám na máku, ale při aplikaci insekticidů proti makovicovým škůdcům lze jejich populační hustotu významně snížit. Bělomorka maková (Dasineura papaveris) je drobný, 2 až 3 mm dlouhý komárek, jehož oranžově žluté až oranžově červené larvy se vyvíjejí uvnitř makovic, kde vysávají pletiva vnitřních stěn a mladých makovic. Vlivem sání jsou makovice zakrnělé a dávají méně hodnotná semena (Rotrekl, 2006)
3.1.4.2 Choroby „Helmintosporióza“ je způsobena houbou Pleospora papaveracea (konidiové stádium – Dendryphion penicillatum). Jedná se o chorobu, která se může na rostlinách máku vyskytovat po celou jeho vegetaci a napadat všechny orgány. Může se šířit z posklizňových zbytků, ale také infikovaným semenem, kde se konidie zachycují na vroubkovaném povrchu. Za příznivých podmínek pak mycelium z konidií přerůstá na děložní lístky, nebo napadá mladé rostlinky, které může i zničit. Další vývoj probíhá na listech, které následkem choroby předčasně usychají. Napadeny mohou být i makovice, kde je chorobě vstupní branou poškození makovic, způsobované 15
krytonoscem makovicovým. Houba se tak může dostat až dovnitř makovice a znehodnotit i maková semena. Plíseň maková (Peronospora arborescens) je na rostlinách máku nejlépe patrná v době zrání makovic, kdy v napadených rostlinách dochází k deformacím stonku pod makovicí, k jeho zčernání a pokroucení. Na povrchu takto deformovaného stonku je patrný hustý povlak konidioforů. Makovice na napadených rostlinách zasychají a při silném napadení odumírá celá rostlina. Plíseň maková napadá také listy v různých stádiích vývoje máku a způsobuje jejich usychání, přičemž na napadených listech se na spodní straně vyvíjí konidiofory. Příznaky choroby na listech mohou být podobné „helmintosporióze“ a míra škodlivosti závisí na době, kdy došlo k napadení. Rané infekce jsou nejnebezpečnější a likvidují celou rostlinu (Spitzer, 2000). Pro analýzy je sice na jedné straně velice důležité získat nepoškozené rostliny, ale současně je nutné znát, jaký vliv na sledované faktory mají přípravky na ochranu rostlin. V otázce akumulace těžkých kovů rostlinou nebyl zjištěn vliv fungicidů. Obsah kadmia v rostlině máku je primárně ovlivněn obsahem tohoto prvku v půdě a prostředí (Spitzer, 2000). Při výzkumu vlivu aplikace fungicidů na množství semen byla prokázána výrazně vyšší produkce. Nárůst je obzvláště patrný ve vlhkých letech, kdy jsou rostliny více napadány houbovými chorobami (Cihlář, 2006). Snížení fytotoxicity herbicidů na rostliny může být dáno přítomností růstových stimulátorů, které zvyšují koncentraci aromatických dusíkatých sloučenin, které se v přirozených podmínkách nacházejí v rostlinách, což má za následek zrychlení proudění cytoplazmy v buňkách. Tento efekt podporuje rychlejší syntézu všech životně důležitých látek (bílkovin, tuků, enzymů). Zvýšená a zrychlená tvorba jmenovaných látek pomáhá rostlinám rychleji překonat stresy vyvolané vlivy vnějšího prostředí. (Poláková, 2007)
3.2 Těžké kovy Pro příjem těžkých kovů rostlinou je rozhodující jejich obsah v půdě. Do půdy se těžké kovy dostávají ve větší míře především z průmyslové činnosti spolu s prachovými částicemi a aplikací hnojiv. I přesto, že používání průmyslových hnojiv obsahující těžké kovy bylo v České republice v posledních desetiletích výrazně 16
omezeno, dochází stále k jejich zavádění do půdy v jiných formách. Významným zdrojem kontaminace jsou zde například odpadní vody a čistírenské kaly, které jsou využívány jako náhrada běžných hnojiv a zavlažování (Singh a Agrawal, 2008; Mahdavi a Jafari, 2010). Pro výskyt těžkých kovů v půdě jsou zásadní vlastnosti půdy a forma, ve které se kovy v půdě nacházejí, nebo ve které jsou do půdy dodávány. Hlavní roli hraje jejich rozpustnost. Rozpustnost sloučenin kadmia klesá v pořadí síran > oxid ≥ uhličitan > sulfid. V závislosti na kvalitě půdy dochází k uvolnění kadmia do půdy po přibližně 20 dnech u síranu, oxidu a uhličitanu, zatímco ze sulfidů je doba uvolnění přibližně 60 dní. Po této době dojde ale pouze k částečnému rozložení. Teprve po zhruba třech měsících dojde k úplnému rozložení. Tato prodleva je pravděpodobně dána vlivem ochrany povrchu částic adsorpcí inhibitorů vyskytujících se v půdě (Bataillard et al. 2003). Pro růst rostlin není zásadní celkový obsah těžkých kovů v půdě, ale pouze frakce, která je pro rostliny přístupná. Hlavní faktory ovlivňující mobilitu a tak i přístupnost těžkých kovů v půdě jsou: pH, obsah a kvalita organických látek, obsah a kvalita jílové frakce a obsah oxidů železa a manganu (Balík et al., 2002; Barančíková a Makovníková, 2003). Kvalita organické části půdy je důležitá vzhledem ke schopnosti vázat část kovů do organických struktur. Tato vlastnost je výhradně asociovaná s humusovými látkami, konkrétně s humusovými kyselinami. Každý těžký kov tvoří komplexy s organickými látkami různé kvality. Mobilní fáze kadmia se tak přednostně váže na alifatickou část humusových látek. Naproti tomu měď vytváří silné vazby s humusovými kyselinami s vysokou mírou humifikace (Barančíková a Makovníková, 2003). Nelze ovšem jednoznačně konstatovat, že přidáním organické hmoty do půdy se zároveň snižuje příjem těžkých kovů rostlinou. Například při pokusech s hnojem bylo zjištěno, že při jeho aplikaci do půdy s vysokým podílem kadmia je naopak příjem kadmia rostlinou zvýšen (Mathew et al., 2002). Zatížení rostlin těžkými kovy probíhá i jejich příjmem z ovzduší, buď přímo přes listy, nebo po smytí do půdy kořenovým systémem. V České republice došlo s omezením průmyslové výroby po roce 1989 k omezení emisí kadmia. Od roku 2003 však dle ČHMÚ emise kadmia v ovzduší opět narůstají (obr. 2 a obr. 3)
17
Obr. 2: Celková emise kadmia a rtuti (tun za rok) v ČR v letech 1990-2006
Zdroj: Usťak et al. (2009)
Obr. 3: Celková emise olova a zinku (tun za rok) v ČR v letech 1990-2006
Zdroj: Usťak et al. (2009)
Dle měření různých institucí (VÚMOP, ÚKZÚZ, VÚRV, ČHMÚ) jsou v podmínkách České republiky největším zdrojem vstupu řady rizikových prvků atmosférické spady. Usťak et al. (2009) uvádí, že podíl vstupu rizikových prvků do půd atmosférickými spady činí u Cd cca 60 % a u Zn přes 50 % z celkových vstupů prvků přírodního a
18
antropogenního původu. ůvodu. Tento vysoký podíl příjmu p kadmia z atmosféry potvrzují například íklad i Hovmand et al. (1983) z Dánska. Těžké kovy jsou ve formě ě iontů translokovány do nadzemních orgánů, orgán kde nejvíce ovlivňují fyziologické yziologické procesy v listech, v prvé řadě fotosyntézu (Procházka et al. 1998). Těžké žké kovy po vstupu do buněk bun inaktivují některé které enzymy a redoxní systémy (obr. 4). Inhibice dělení ělení a dlouživého růstu r buněk, k, která se projevuje zejména zpomalením růstu stu primárního kořene, ko bývá jedním z prvních příznaků říznaků jejich toxického působení.
Obr. 4: Rozdíly v citlivosti některých ně enzymů v listech Silene cucubalus cucuba při zatížení zinkem
Zdroj: Procházka et al. (1998)
V odolnosti rostlin k působení ůsobení těžkých t kovů existují velké rozdíly nejen mezi druhy, ale i uvnitř téhož druhu. Odolné rostliny (např. (nap některé které trávy) mohou především p značně znesnadňovat ovat vstup toxických toxick iontů do cytosolu, a to vylučováním vylu organických kyselin do rhizosféry, sorpcí na pektinové látky v buněčných buněč stěnách a konečně i větší tší selektivitou transportních proteinů protein v plazmatické membráně. membrán K vnitrobuněčným ným detoxikačním detoxikač mechanizmům patří zejména tvorba vorba stresových proteinů zahrnující odolnější jší izoenzymy, ale také proteasy proteasy a ubikvitin pro urychlení rozkladu poškozených proteinů. proteinů (Procházka et al., 1998)
19
3.2.1 Kadmium a zinek
Kadmium a zinek patří spolu se rtutí do skupiny IIb periodického systému prvků. Kovy skupiny zinku mají úplně zaplněné orbitaly a neměly by být proto považovány za přechodné kovy. Chemické chování ale odpovídá přechodným kovům. Typické oxidační číslo je +II. Kovy skupiny zinku se nejčastěji vyskytují v sulfidových minerálech, jako je ZnS (sfalerit) nebo CdS (greenockit). Zinek se dále vyskytuje v přírodě ve formě oxidu ZnO (zinkit) a uhličitanu
ZnCO3 (smithsonit). Kadmium
velmi často doprovází zinkové rudy. Na rozdíl od kadmia, které je silně toxické, je zinek důležitý mikrobiogenní prvek, který ovlivňuje enzymové pochody. V rostlinách při nedostatku zinku dochází k poruchám metabolizmu cukrů a bílkovin. Zn je důležitý pro tvorbu chlorofylu a askorbové kyseliny. Nejvyšší koncentrace zinku jsou v semenech rostlin. Kadmium je významným polutantem. Je přijímáno kořenovým systémem a hromadí se převážně v zelených částech rostlin (Kouteník, 1996). Ionty zinku a kadmia jsou velmi snadno přijímány kořeny, neboť selektivita transportních proteinů je zřejmě nedostatečná pro jejich odlišení od prvků, které jsou pro život rostliny nezbytné. Po vstupu do buněk inaktivují některé enzymy a systémy. Inhibice dělení a dlouživého
růstu buněk, která se projevuje zpomalením růstu
primárního kořene, bývá jedním z prvních příznaků jejich toxického působení (Procházka et al. 1998). V minulosti byly provedeny četné studie příjmu a vlivu těžkých kovů na rostlinu. Vliv těžkých kovů na mák byl však zkoumán pouze omezeně. Chizzola (1997) popisuje nutriční příjem a distribuci mikroelementů v máku setém. Největší koncentrace kadmia byla nalezena v semenech, kde dosahovala 1,7 mg.kg-1. Obsah kadmia byl stanoven v různých odrůdách máku, které se lišily počtem semen v tobolce. Celkové množství akumulovaného kadmia dosáhlo přibližně stejných hodnot, a to v průměru 1,3 mg.kg−1. Semena tvořila hmotnostně 2,5 až 12,9 % celkové biomasy, ale obsahovala 15 až 42 % celkového množství kadmia akumulovaného celou rostlinnou, což dokazuje přednostní translokaci kadmia do semen máku setého. Zároveň byla pozorována redukce růstu při celkovém obsahu kadmia 6 mg.kg−1 substrátu o 25 %. K redukci růstu přidáním kadmia do substrátu došlo i v pokusech s rostlinami Arabidopsis thaliana (Tan-Kristanto et al., 2003). Vysokou schopnost akumulace kadmia v druhu Papaver rhoeas L. pozoroval také Haensler (2003). 20
Ukládání kadmia do semen bylo v podobné míře pozorováno i v jiných rostlinách. Například Harris a Taylor (2001) zkoumali obsah kadmia v jednotlivých částech rostlin Tritium turgidum L. var. durum. Došli k závěru, že čím nižší byl obsah kadmia ve stonku a listech, tím byl ve větší míře zastoupen v semeni. Zároveň zjistili, že přidáváním zinku do substrátu s kadmiem nemělo vliv na rozložení a obsah přijatého kadmia. I přesto, že vliv těžkých kovů na produkci alkaloidů v máku byl doposud prozkoumán jen v malé míře, byla provedena řada studií vlivu těžkých kovů na jiné rostliny. Tento vliv je zde však nejednoznačný a je tak dán jednak mírou zatížení a rostlinou, která na zátěž reaguje. Například Furze et al. (1991) nezjistili změnu obsahu alkaloidů v durmanu (Datura stramonium) při podávání vysokých dávek kadmia a mědi. Naproti tomu u Brugmansia candida, rostliny blízké durmanu, byl sledován pozitivní efekt působení CdCl2 na obsah tropanových alkaloidů (Pitta-Alvarez et al. 2000).
Při
vysokých dávkách kadmia a mědi, které byly aplikovány k rostlinám Atropa beladona, nebylo možné sledovat změny obsahu alkaloidů, protože docházelo k rozkladu rostlinného materiálu (Lee et al., 1998). Toivonen et al. (1992) pozorovali produkci alkaloidů v Catharanthus roseus v závislosti na teplotě prostředí. Zjistili, že alkaloidy byly v rostlině obsaženy ve větším množství, pokud byly pěstovány v chladnějším prostředí.
3.3 Alkaloidy Jedná se o rozsáhlou skupinu dusíkatých látek s mnoha odlišnými strukturami. Alkaloidy se vyskytují převážně v rostlinách. Přibližně dvacet procent rostlin obsahuje alkaloidy a celkový počet doposud popsaných alkaloidů dosahuje počtu 12 000 (Weid, 2004). I přesto, že je tato skupina natolik rozsáhlá, hlavní kroky jejich biosyntézy se dají zařadit do několika málo odlišných reakcí. Jedná se o spojení aldehydu a aminu na Schiffovu bázi, připojení uhlíku Mannichovou reakcí a rozsáhlé pole reakcí oxidace aromatických uhlovodíků (Kindl, 1991). Neexistuje žádné hodnotící hledisko, které by dovolilo popsat alkaloidy jako ostře ohraničenou homogenní skupinu přírodních látek. Za alkaloidy jsou tak převážně považovány bazické organické sloučeniny s jedním nebo několika heterocyklickými 21
dusíkovými atomy v molekule, vyskytující se v přírodě ve formě solí s organickými kyselinami. Rostliny obvykle obsahují směs alkaloidů podobné struktury (Vodrážka, 1999). Alkaloidy byly rozčleněny do třech hlavních skupin podle jejich prekurzorů a finální struktury. Pravé alkaloidy jsou odvozeny od aminokyselin a obsahují ve svém skeletu atom dusíku začleněný v heterocyklu. Běžné struktury alkaloidů obsahují cykly pyridinové,
pyrrolové,
indolové,
pyrrolidinové,
isochinolinové
a
piperidinové.
Pseudoalkaloidy, například kofein a solanidin, nejsou odvozeny od aminokyselin. Protoalkaloidy jsou odvozeny od aminokyselin, ale nemají heterocyklický řetězec. Příkladem těchto alkaloidů je například mezkalin. (Bennett a Wallsgrove, 1994) Vedle mnoha způsobů využití isochinolinových alkaloidů ve farmacii bylo prokázáno, že jsou rovněž účinnou ochranou proti mnoha škůdcům - hmyzu, měkkýšům a savcům (Steppuhn a Baldwin, 2007; Chen et al., 2007). Tyto alkaloidy byly rovněž účinné proti některým houbám a bakteriím (Bennett a Wallsgrove, 1994).
3.3.1 Opiové alkaloidy
V roce 1806 popsal německý lékárník Sertürner izolaci čistého krystalického morfinu jako první odborně popsané organické látky získané z rostlin. Na tento objev navázal v roce 1832 Robiquet izolací kodeinu a v roce 1835 Pelletier izolací thebainu. Většina izolací morfinu a kodeinu na dlouhá následující léta probíhala Gregoryho postupem, poprvé popsaném v roce 1833. Objasnění struktury morfinových alkaloidů dále pokračovala jen pomalu popsáním správného vzorce morfinu Laureátem (1847) a popsáním jednoduchých transformací jako acetylace morfinu na heroin (Wright 1874) a methylací na kodein (Grimaux 1881) (Phillipson, 1985). Strukturní vzorec morfinu byl uveřejněn v roce 1923 Gullandem a Robinsonem, kteří však neměli prostředky k jeho potvrzení. Tento důkaz struktury byl dodán až v roce 1955 MacKayem a Hodgkinem za využití rentgenové strukturní analýzy (Guguta et al., 2008). Obsahy alkaloidů v makovině jsou výrazně nižší, než v opiu. V tabulce 2 je uveden Tab.
přehled obsahů pěti alkaloidů máku z různých studií získaných z literatury. Rozpětí hodnot je zde výrazné a to nejen mezi jednotlivými studiemi. Toto široké rozpětí hodnot je například u Prajapatiho et al. (2002) a Schulze et al. (2008) možné vysvětlit 22
analýzou rostlinného materiálu materi z různých odrůd d máku setého, což potvrzují i Sharma et al. (1999) a Lachman et al. (2006). Rozpětí R obsahů alkaloidů ů dle Szabó et al. (2008) je významný vliv pěstebních ěstebních podmínek, konkrétně konkrétn vliv vodního režimu.
Tab. 2: Obsah vybraných alkaloid kaloidů v makovině v předešlých edešlých studiích [mg.kg-1] Autor Rok Morfin Kodein Narkotin Papaverin Thebain Krenn et al. Bajpei et al. Prajapati et al. Schulz et al. Szabó et al.
1998 2000 2002 2008 2008
min 200 910 300 800 562
max min 10500 60 4100 90 10000 40 61100 0 1207 10,29
max 1300 1570 1300 13000 26,16
min <MD 80 100 -
max 0 1730 23000 -
min max min 0 <MD - 100 - 12000 <MD - 1,65
max 0 1080 2400 36,93
3.3.1.1 Morfin Morfin je nejdůležitějším ějším alkaloidem máku setého. Spolu s kodeinem je mák setý také hlavním zdrojem tohoto alkaloidu. I přesto, p esto, že syntéza morfinu byla poprvé úspěšně úsp popsána již v roce 1952 Gatesem a Tschudim a od té doby přibylo přibylo mnoho způsobů zp jeho syntézy, z ekonomických důvodů d je stále hlavním zdrojem jeho extrakce z opia (Guguta et al., 2008).
Morfin
V molekule morfinu jsou obsaženy tři t kyslíkové atomy, z nichž dva jsou ve formě form hydroxylových skupin, protože morfin poskytuje diacetylderivát (působením (p (pů směsi acetanhydridu a kyseliny sírové se do molekuly morfinu vpraví vpraví tři tř a do molekuly kodeinu pouze dva acetylové zbytky). Jedna z hydroxylových skupin má fenolický charakter, lze ji alkalizovat za podmínek alkylace fenolů. fenolů. Druhá skupina má sekundární alkoholický charakter (Staněk, (Stan 1957).
23
Morfin je znám jako silné analgetikum. analgetikum. 10 mg morfinu podaného orálně oráln sníží práh bolesti o 50 % a 30 mg až o 90 %. Ve vyšších dávkách působí působí jako narkotikum a sedativum. Kodein má asi desetinu analgetického účinku ú inku morfinu (Bentley, 1954). Základní vlivy působící sobící na rostliny máku v průběhu jejího růstu ůstu jsou uvedeny v obrázku (obr. 5). Z diagramu je patrné, že obsah morfinu nejvíce ovlivňuje ovliv volba odrůdy dy a zásobení vodou a dusíkem. Zásobení fosforem a působení působení chorob a škůdců ovlivňuje především ředevším výnos rostlin. ros Obr. 5: Výnosotvorné prvky morfinu
Zdroj: Vlk (2004)
3.3.1.2 Kodein Kodein byl poprvé izolován Robiquetem v roce 1832. V rostlině ě se objevuje třicet t dní po vyklíčení ení semene a je tak druhým vyprodukovaným alkaloidem v pořadí. Obsah kodeinu v tobolce a ve stonku je stejný až vyšší ve srovnání s obsahem kodeinu v opiu (Bentley, 1954).
Kodein
24
3.3.1.3 Papaverin Papaverin je jedním z alkaloidů máku setého, v němž mž je obsažen zvláště zvlášt před dobou zrání. Z tohoto důvodu vodu se také získává, pokud se izoluje iz z přirozeného řirozeného materiálu, z opia (Staněk, 1957). Papaverin je nejjednodušším benzylisochinolinovým alkaloidem. Jeho biosyntéza byla poprvé provedena v roce 1910 Pictetem a Gamsem. Z důvodu dů relativně jednoduché přípravy ípravy je papaverin rovněž rovn jediným ze zkoumaných koumaných pěti p alkaloidů, který není pro farmaceutické účely ú získáván z přírodního írodního materiálu (Bhat et al. 2005).
Papaverin
Papaverin je skvělou lou spasmolytickou drogou, která relaxuje hladké svalstvo cév. Výhodou použití papaverinu je možnost odstranění odstran křečíí podáním malého množství látky bez vlivu na peristaltickou aktivitu gastrointestinálního systému (Bentley, 1954).
3.3.1.4 Narkotin (Noskapin) Narkotin byl izolován z opia v roce 1804 a v dalších letech značně čně studován. Jeho obsah v Papaver somniferum kolísá od 0,008 do 0,276 %. Získává se z opia, kde je obsažen v množství 0,76 až 6,4 %, přičemž p některé které druhy perského opia dosahují až 11 % narkotinu. Obsah narkotinu klesá sušením opia (Staněk, (Staněk, 1957). Narkotin patří mezi nejdůležit ůležitější alkaloidy v opiu. Obsahuje je tři methoxy-, methoxy jednu methylendioxy- a jednu N-methyl methyl-skupinu (Döpke, 1968).
25
Narkotin
Narkotin působí sobí na zpomalení peristaltiky žaludku a střev. st Stejně ě jako kodein tlumí kašel, ovšem ve vyšších dávkách může m že ochromit nervové centrum dýchání. Mimo jiné také působí sobí spasmolyticky na hladké svalstvo (Döpke, 1968).
3.3.1.5 Thebain Thebain je prekurzorem morfinu a kodeinu. V Papaver somniferum je však jeho výskyt minimální. Jeho obsah závisí na odrůdě odr a době sklizně ě máku. Jedná se o alkaloid, který může že sloužit jako surovina pro výrobu řady léků a přitom není návykový. Jako hlavní zdroj se dosud využíval vytrvalý druh mák listenatý (Papaver ( bracteatum)) s velmi obtížnou agrotechnikou. V roce 1997 byla v Austrálii (Tasmánie) registrována mutagenezí vzniklá odrůda odr da máku setého Norman, která obsahuje místo morfinu alkaloidy thebain a oviparin. (Zehnálek, 2002)
Thebain
26
3.3.2 Biosyntéza alkaloidů máku Základním krokem biosyntézy alkaloidů máku je přeměna tyrosinu na dopamin a 4-hydroxyfenylacetaldehyd sledem dekarboxylací, ortho-hydroxylací a deaminací. Dopamin a 4-hydroxyfenylacetaldehyd se spojí za účasti norkoklaurin synthasy a dají
za
vznik
(S)-norkoklaurinu,
který
je
centrálním
prekurzorem
všech
benzochinolinových alkaloidů (Balážová a Psenak, 1998; Weid et al., 2004; Facchini et al., 2007) (obr. 6).
Obr. 6: Biosyntéza (S)-norkoklaurinu z L-tyrosinu
Zdroj: Moss (2002)
(S)-Norkoklaurin je přeměněn na (S)-retikulin pomocí 6-O-methyltransferasy, tetrahydrobenzyl-isochinolin-N-methyltransferasy 27
((S)-N-methylkoklaurin),
P450
hydroxylasy (3‘-hydroxy-N-methyl methyl-(S)-koklaurin) a 3‘-hydroxy-N-methyl methyl-(S)-koklaurin4‘-O-methyltransferasa methyltransferasa ((S)-retikulin). ((S) Obr. 7:: Biosyntéza thebainu z (S)-norkoklaurinu (S)
Zdroj: Moss (2002)
Po převedení (S)-retikulinu retikulinu na (R)-retikulin (R) pomocí enzymů ů 1,2-dehydroretikulin 1,2 synthasy a 1,2-dehydroretikulin dehydroretikulin reduktasy, které katalyzují stereospecifickou redukci 1,2-dehydroretikulinu dehydroretikulinu na
(R) (R)-retikulin, je tento sledem reakcí za pomoci tří t
základních enzymů ů převeden řeveden eveden na thebain. Jedná se o salutaridinsynthasu salutaridinsynt (v přeměně na salutaridin), salutaridin: NADPH 7-oxidoreduktasu 7 (na 7-(S) (S)-salutaridinol) a
28
acetyl-CoA: salutaridinol-7--O-acetyltransferasu (na salutaridinol-7-O O-acetát). Ten se následně spontánně ě při ři pH 8-9 8 transformuje na thebain (obr. 7a obr. 8) (Balážová a Psenak, 1998; Facchini et al., 2007). Z thebainu je následně ě odštěpena odštěpena methylová skupina. Tento proces může probíhat ve dvou cestách. Hlavní cesta vede přes p meziprodukt na neopinon za účasti thebain 6‐O‐demethylasy.. Ten se spontánně mění ní na kodeinon. Kodeinon je kodeinon reduktasou měněn n na kodein, což je přímý p ímý prekurzor morfinu. Morfin vzniká z kodeinu dalším odštěpením ěpením methylové skupiny pomocí enzymu kodein-Ok demethylasy.. Vedle této hlavní cesty existuje v máku ještě alternativní způsob zp tvorby morfinu z thebainu.
Obr. 8:: Biosyntéza kodeinu a morfinu z thebainu
Zdroj: Moss (2002)
29
Tato cesta probíhá v prvních dvou krocích odštěpením odšt pením dvou uhlíků rovněž za účasti kodein-O-demethylasy na oripavin a thebain 6‐O‐demethylasy na morfinon. Morfinon je poté kodeinon reduktasou změněn zm n na morfin (Balážová a Psenak, 1998; 1998 Facchini et al, 2007;; Hagel a Facchini, 2010) 2010 (Obr. 8). Hagel a Facchini (2010) rovněž rovn zdokumentovali možný způsob ůsob sob regulace metabolické cesty vedoucí k morfinu blokem přeměny ny thebainu na neopinon a oripavinu na morfinon. Hlavní roli v tomto procesu má omezení produkce enzymu thebain 6‐O‐demethylasy.
Biosyntéza narkotinu není doposud přesně p objasněna. Předpokládá edpokládá se, že probíhá od (S)-retikulinu přeměnou ěnou na (S)-skoulerin (S) erin (berberine bridge enzym) a dále přes p (S)tetrahydrokolumbamin enzymem (S)-kanadin (S) synthasou na (S)-kanadin kanadin. (S)-kanadin je tetrahydroprotoberberin N-methyltransferasou N přeměněn ěn na N-methylkanadin, který je s možnými dalšími mezikroky přeměněn na narkotin tin (Ziegler et al, 2009) (Obr. 9). Obr. 9: Biosyntéza narkotinu z (S)-retikulinu (
Zdroj: Ziegler et al. (2009)
Biosyntéza papaverinu rovněž rovně není zcela objasněna. Výchozím krokem je opět (S)koklaurin. Od opět (S)-koklaurin laurin probíhá biosyntéza dvěma dv ma možnými cestami. První cesta přes (S)-retikulin, retikulin, který je následně následn retikulin 7-O-methyltransferasou methyltransferasou přeměněn p na (S)-laudanin. Za účasti časti několika ně enzymů je v dalším kroku (S)-laudanin laudanin přeměněn p 30
na (S)-laudanosin a demethylací převeden p na (S)-tetrahydropapaverin, tetrahydropapaverin, který je v posledním kroku za účasti časti asti doposud neidentifikované dehydrogenasy převeden p na papaverin.
Druhá
cesta
probíhá
od
(S) (S)-koklaurinu
přeměnou ř ěnou
na
(S) (S)-6-O-
methylnorlaudanosolin s různými rů meziprodukty opět k (S)-tetrahydropapaverinu tetrahydropapaverinu a dále k papaverinu (Pienkny et al. 2009) (obr. 10). Obr. 10:: Biosyntéza papaverinu z (S)-koklaurinu
Poznámka: V krocích označených čených p přerušovanou čarou doposud nebyly identifikovány všechny enzymy. Dvojitá čára označuje čuje podíl více enzymů enzym na daném kroku. Zkratky použité pro jména enzymů: 4′OMT - (S)-3′hydroxy ′hydroxy N-methylkoklaurin 4′O-methyltransferasa;; 7OMT - retikulin 7-Omethyltransferasa; CNMT - (S))-koklaurin N-methyltransferasa; CYP80B3 - (S S)-N-methyl koklaurin 3′hydroxylasa; N7OMT - (S)-norreti norretikulin 7-O-methyltransferasa. Zdroj: Pienkny et al. (2009)
Tvorba alkaloidů v rostlině není lokalizovaná na jediném místě, ě, ale jedná se o spolupráci, mezi různými ůznými částmi rostliny a částmi buněk. Stručný čný přehled př lokalizace základních metabolických kroků krok biosyntézy alkaloidů je uveden na obrázkuObr. obrázku 11.
31
Obr. 11: Lokalizace jednotlivých kroků biosyntézy alkaloidů máku v rostlině
Zdroj: Facchini a Bird (1998)
Díky tomu, že jsou kodein a thebain přímými prekurzory morfinu, existuje i korelace mezi jejich obsahy. Metabolická cesta, vedoucí od thebainu přes kodein k morfinu je ve dvou krocích katalyzována enzymem kodeinon reduktasou. Tyto kroky jsou přeměna kodeinonu na kodein a morfinonu na morfin. Kodeinon reduktasa v máku slouží k regulaci metabolismu morfinu a zásadně ovlivňuje i cestu produkce morfinu od thebainu. (Prajapati et al., 2002; Shukla et al. 2006). Tab. 3: Vztahy mezi obsahy osmi alkaloidů máku setého dle Parjapati et al. (2002)
32
Korelace byla dle Parjapatiho et al. (2002) významná shodně na hladině α=0,01 a α=0,05 u dvojic morfin-narkotin, kodein-thebain a narkotin-papaverin (tab. 3). Dalším významným vztahem je obsah dopaminu k obsahu pěti nejdůležitějších alkaloidů máku. Dopamin je jednou ze základních stavebních jednotek pro biosyntézu alkaloidů máku a proto rostliny, produkující větší množství dopaminu obsahují i vyšší množství těchto alkaloidů (Shukla et al., 2006).
3.3.3 Faktory ovlivňující tvorbu alkaloidů v rostlině Obsah alkaloidů může být ovlivněn nejrůznějšími faktory. Felklová a Ferenčík (1982) popisují snížení celkového obsahu alkaloidů v máku setém vlivem pozdního výsevu. Rovněž Felklová a Vaverková (1983) udávají, že tvorba morfinu silně podléhá vlivu vnějšího prostředí, převážně klimatických faktorů. Ty způsobují citelné výkyvy v obsahu morfinu, takže vlastní genetický základ četných kulturních odrůd máku může být za určitých okolností maskován. Rozdíly v obsahu morfinu jsou značné zejména ve druhé polovině vegetace v průběhu opiové a biologické zralosti, kdy je nutno počítat i se změnami sekundárními, kterým podléhá již vytvořený morfin. Negativně působí deště a zvlhnutí již zralých tobolek, ve kterých tak dochází k vymývání morfinu. Naopak pozitivně působí pěstování v teplých a sušších lokalitách. Obsah morfinu v tobolkách a natích klesá s intenzivnějším prouděním vzduchu. Podle Tookey et al. (1976) mechanické poranění makovice během růstu s výtokem latexu nemá sice patrný vliv na celkový obsah kodeinu a morfinu, jejich poměr je však výrazně pozměněný ve prospěch kodeinu. Morfin není finálním metabolickým produktem. Během vegetativního vývoje je morfin často metabolizován. Tento proces probíhá převážně v makovině. Metabolizované formy morfinu jsou následně translokovány do semen (Fairbairn a Steele, 1980). Podle Morimota et al. (2003) v reakci na stres se morfin rychle metabolizuje na bismorfin, který se skládá ze dvou morfinových jednotek, a následně je akumulován v buněčné stěně. Bismorfin se zde převážně váže na pektiny. Formování bismorfinu je katalyzováno aniontovou peroxidasou, která se běžně nachází v tobolkách a listech opiových máků. Společná přítomnost morfinu a bismorfin tvořící peroxidasy umožňuje máku výrazně zvýšit obranný systém.
33
Obsahy alkaloidů jsou v různých rů částech ástech rostlin rozdílné. Maximální obsah se nachází v tobolce (obr. 12).. Obr. 12: Obsah morfinu v závislosti na sklizňové skliz výšce
Zdroj: Kosek a Bečvář (2005)
Obsah morfinu je také odlišný v různých vývojových fázích (Roberts Roberts et al., 1983; Märculescu a Dobiţ, ţ, 2001). Nejvyšší obsah morfinu se nachází v rostlině ve fázích mléčné zralosti tobolky přes řes fázi začátku za átku vývoje semen až po fázi nezralé tobolky se sadou semen v hlavním pouzdru a bílých semen v sekundárním pouzdru. Poté obsah morfinu postupně klesá (obr. obr. 13). Obr. 13: Obsah alkaloidů v rostlině rostlin máku v jednotlivých fázích vývoje
Zdroj: Marculescu a Dobit, 2001
34
Ghiorghitǎ et al. (1984) nezjistili rozdíly v obsahu morfinu v různě velikých makovicích. Rovněž nebyly pozorovány rozdíly při zkoumání závislosti obsahu morfinu na tvaru makovic. Rovněž kvalita osiva neovlivňuje obsahy alkaloidů v makovině. Při pokusech s tříděným osivem byl pozorován vliv na celkový výnos makoviny, ale třídění nemělo vliv na obsah alkaloidů v makovině (Zukalová et al., 2008). Tříděním se tak pouze zvýší celkový výnos alkaloidů z jednotky plochy Obsah morfinu v makovině získané z tříděného osiva podle velikosti semen a jejich specifické hmotnosti je uveden v tabulce 4. Tab.
Tab. 4: Obsah morfinu v makovině z tříděného osiva
Velikost/hmotnost semen
Odrůda Major Obsah morfinu
Výnos makoviny
(%) v sušině
(%)
Velikost semen nad 1,1 mm
0,39
118
Velikost semen 1,1 – 1,0 mm
0,44
165
Velikost semen pod 1,0 mm
0,44
97
Netříděná semena (kontrola)
0,43
100
Těžká semena
0,41
113
Středně těžká semena
0,42
112
Lehká semena
0,37
109
Zdroj: Zukalová et al. (2008)
3.4 Abiotický stres Termín stres je obvykle používán pro souhrnné označení stavu, ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů. Nejde přitom nikdy o nějaký ustálený a snadno definovatelný stav, ale spíše o dynamický komplex mnoha reakcí (Procházka et al., 1998) Při sledování vlivu stresu těžkými kovy na obsah a složení alkaloidů v máku je nutné předpokládat nejen tento stresový vliv, ale počítat s tím, že na rostliny působí celý
35
komplex stresorů. Nejdůležitě ůležitější stresové vlivy jsou uvedeny v následujícím přehledu p na obrázku 14. Obr.
Obr. 14: Přehled nejdůležitě ůležitějších stresových faktorů,, se kterými se rostliny setkávají v přírodě
Zdroj: Procházka et al. (1998)
Pro zkoumání stresu je nejen důležité d poznat mechanismy předcházení ředcházení stresu, ale hlavně mechanismy aktivní odolnosti (stress tolerance) tolerance) omezující negativní dopad stresorů až po jejich proniknutí k plazmatické membráně ě buněk ěk a do symplastu. V takovém případě ě dochází ke spuštění spušt řetězce změn, n, který bývá označován ozna jako stresová reakce (Procházka et al. 1998) (obr. ( 15.). Obr. 15: Idealizovaný průběh ů ěh stresové reakce
Zdroj: Procházka et al. (1998)
36
3.4.1 Vliv kadmia a zinku na rostlinu
Těžké kovy ovlivňují rostliny mnoha různými způsoby. Na buněčné úrovni mají rostliny několik základních mechanismů detoxikace, mezi které patří chelace a sekvestrace a využití membránových přenašečů těžkých kovů a chaperonů pro mezibuněčný transport (Gasic a Korban, 2006). Fytochelatiny v cytozolu váží kadmium a převádějí jej do vakuol (Rauser, 1995; Clemens, 2001; Schützendübel et al., 2001). Zároveň dochází ke zvýšení produkce prekurzoru fytochelatinů glutathionu (Zenk, 1996;
Rauser, 1995). Fytochelatiny jsou syntetizovány z glutathionu
enzymem fytochelatin synthetasa (Clemens et al. 1999; Weghe a Ow, 2001). Při přenosu kadmia ve formě Cd2+ do vakuol má zřejmě zásadní roli ABC přenašeč s širokou působností AtPDR8 (Kim et al. 2007). Rovněž byla dokázána působnost přenašečů AtMRPs (Bovet et al., 2003). Tento protein působí pouze na přenos na krátké vzdálenosti, tedy z cytozolu do vakuoly. Pro detoxikaci rostliny je rovněž důležitý transport fytochelatinů s navázaným kadmiem na delší vzdálenosti, tedy vodivými pletivy. Při pokusech s rostlinami Brassica napus bylo zjištěno, že se na transportu na delší vzdálenosti podílí prakticky pouze floém, ve kterém bylo nalezeno veliké množství komplexů kadmia s fytochelatiny, nebo kadmia s glutathiony (Mendoza-Cózatl et al., 2008). Vliv stresu těžkými kovy na fotosyntézu byl zkoumán na rostlinách hrachu Pisum sativum a bobu Vicia faba. Při pokusech s dávkami kadmia ve formě CdCl2 byl zjištěn snížený transport elektronů v PSII. Snížený transport je dán inhibicí kyslík vyvíjejících komplexů fotosystému II.
Rostliny měly odlišnou toleranci vůči stresu kadmiem.
Příčinou nebylo ani odlišné množstvím přijatých kovů, ani jejich rozdílná vazba na PSII komplex. V obov rostlináchách se vyskytovala nejdříve zvýšená syntéza a následně zvýšená degradace proteinu D1 (Geiken et al., 1998). Rovněž se projevoval vliv kadmia na snížení produkce glutathionu a askorbátu. Spolu s tím se snížila i aktivita enzymů katalasy, glutathion-reduktasy a guaiacol-peroxidasy. Vysoká dávky kadmia způsobila hyperakumulaci O2 a H2O2 a redukci obsahu dusičnanů v kořenech. Dále bylo možné pozorovat zvýšenou produkci salicylové kyseliny, jasmonové kyseliny a ethylenu (Rodriguez-Serrano et al., 2006). Hyperakumulace O2 a H2O2 může být relativně významná. V porovnání s rostlinami bez zátěže byl jejich obsah až šestinásobný. Nárůst obsahu H2O2 byl především
37
pozorován v buňkách transportních pletiv, mezofylu, tonoplastu a epidermálních buňkách. V mezofylových buňkách byl pozorován nárůst obsahu H2O2 v mitochondrii a peroxizómech. Původ H2O2 není jednoznačně vysvětlen, ale předpokládá se, že peroxid vodíku je tvořen NADPH oxidasou. (Romero-Puertas et al., 2004) Vliv kadmia na rostlinu se může také projevovat ve vztahu k odolnosti proti chorobám. Při experimentech s rostlinami tabáku vystavenými vlivu kadmia byla zjištěna závislost mezi koncentrací dodaného kadmia a odolností rostliny proti tobamoviru TVCV. Při nízké, netoxické zátěži kadmiem byla pozorována zvýšená odolnost proti tomuto viru. Odolnost byla dána inhibicí pohybu viru v rostlině, a tedy jeho přenosem z napadených na nenapadené listy. Při větších koncentracích kadmia se inhibice neprojevovala (Citovski et al. 1998). Ueki a Citovsky (2001) zkoumali posttranskripční umlčení genu (PTGS) vlivem netoxických dávek kadmia. Kadmium zde působilo jako specifický inhibitor v systému PTGS, podobně jako v procesu rozšiřování tobamoviru. Nejedná se však o obecný vliv rizikových kovů, jelikož pokusy se zinkem a hliníkem neprokázaly podobné efekty. Při pokusech s hyperakumulací zinku v Arabidopsis halleri bylo zjištěno, že na akumulaci zinku se značnou mírou podílejí čtyři defensinové geny (AhPDFs), které byly indukovány zinkem, nikoliv však přítomností kadmia (Frérot et al. 2005; Mirouze et al., 2006). Vliv stresu na rostlinu má velice rychlou odezvu. První změny jsou pozorovány do 30 minut od aplikace. Exprese genů je specifická pro různé druhy stresu. Zvýšením, či snížením exprese genů tak rostlina reaguje na konkrétní formu stresu. Při pokusech s rostlinami Arabidopsis byl tento rozdíl demonstrován na stresu salinitou a osmotickým stresem. Zatímco rostliny byly schopné reagovat a chránit se proti salinitě mimo jiné uzavřením průduchů, osmotický stres způsobil trvalou odezvu exprese genů, která se výrazně zvyšovala s časem. Existuje však skupina genů, která je výrazně indukována nezávisle na druhu stresu. Zhruba 50 % těchto genů reprezentují transkripční regulátory, které kódují základní, ale nespecifické základní regulátory aktivní při reakcích rostliny na stres (Kilian et al., 2007).
38
Vij a Tyagi (2007) uvádějí další reakci rostliny na stres aktivací malých, nekódujících RNA, které působí jako regulátory transkripčního a posttranskripčního umlčování genů. Obr. 16: Přehled známých transportérů těžkých kovů v rostlinách
Zdroj: Gasic, K. a Korban, S.S. (2006)
Vliv na změny v rostlině má nejen přítomnost těžkých kovů, ale také jejich obsahy. Při pokusech s buněčnou kulturou tabáku Nicotiana tabacum (TBY-2) bylo zjištěno, že při koncentraci kadmia v živném médiu 50-100 mmol.m-3 ve formě CdSO4 dochází mimo jiné k fragmentaci DNA na oligonukleotidy. Při vyšších koncentracích 39
(1 mol.m-3) se projevuje silná cytotoxicita kadmia, ale nedochází k fragmentaci DNA (Fojtová a Kovařík, 2000). Stres rostliny kadmiem má vliv i na obsah jiných prvků. Při pokusech s Brassica napus docházelo při dodání kadmia k výraznému poklesu obsahu železa. Naproti tomu obsah jiných esenciálních elementů jako zinku a manganu byl nezměněn (Mendoza-Cózatl, 2008).
3.4.2 Vliv kadmia a zinku na tvorbu alkaloidů máku setého
V dříve provedených pokusech (Lachman et al., 2006; Tluka et al., 2007) byl zkoumán vliv kadmia a zinku na obsah alkaloidů v semenech máku a v makovině. Byla provedena analýza 14 vzorků 8 různých odrůd se skupinou sedmi vzorků odrůdy Opal. Vzorky pocházely z různých lokalit a ze stejného roku. Byly provedeny analýzy těžkých kovů v rostlinném materiálu. Obsah těžkých kovů v půdě nebyl analyzován. Na základě provedených analýz bylo stanoveno, že těžké kovy jsou přednostně ukládány do semen máku. Statistickou analýzou s vyjádřením Spearmanova korelačního koeficientu byla závislost stanovena mezi dvojicemi morfin – kadmium, papaverin – zinek a slabá závislost mezi narkotinem – kadmiem. Na základě hodnot Pearsonových korelačních koeficientů byla u těchto dvojic zkoumána možnost vyloučení lineární nezávislosti. Ta byla s více než 95% jistotou vyloučena mezi vztahy narkotin – kadmium v semenech a morfin – kadmium v makovině. S pravděpodobností vyšší než 97,5 % byly lineárně závislé vztahy narkotin – zinek v semenech a papaverin – zinek v makovině. Vztah morfin – kadmium v semenech nebyl prokazatelně lineárně závislý. Lovkova et al. (2006) zkoumaly vliv různých prvků a jejich koncentraci na obsah alkaloidů v mladých rostlinách máku setého a došli k závěru, že všechny zkoumané prvky měly vliv na obsah isochinolinových alkaloidů v rostlině. Dalším závěrem této studie bylo, že je možné sledované prvky rozdělit do skupin dle průběhu reakce na jejich aplikaci. V první skupině se nacházely Mo, Co, W, a Cr. Ve druhé skupině Cu a Ni a ve třetí skupině B, Fe, V, Mn, Zn a Ca. Zinek tedy se zvyšující se koncentrací snižoval obsah isochinolinových alkaloidů (obr. 17). 40
Obr. 17: Vliv obsahu prvků ů na obsah alkaloid alkaloidů
Zdroj: Lovkova et al. (2006)
3.4.3 Prolin V rostlinách se často asto jako ukazatele ukaza míry stresu využívá mimo jiných aminokyselin prolinu, alaninu, argininu, glycinu, serinu, leucinu a valinu. Jejich akumulace v průběhu hu reakce rostliny na stres byla zdokumentována mnohými výzkumy. Prolin je často asto využívaným indikátorem stresu suchem, zasolením a těžkými ěžkými kovy (Rhodes et al, 1999; Hare et al., 1999; 1999 Tripathi et al., 2004; Szabó et al., 2008, 2008 Dinakar et al., 2009). Během stresové reakce vykonává prolin několik n kolik zásadních funkcí, mezi které patří regulace osmotického tlaku, navázání volných radikálů, ů, ochrana makromolekul před ed denaturací, regulace kyselosti cytosolu a zásobárna uhlíku a dusíku po ukončení vlivu stresoru (Vendruscoloa Vendruscoloa et al., 2007).
Prolin
41
Schopnost napomáhat osmoregulaci byla pozorována v bakteriích a následně potvrzena mnohými autory (Rhodes et al, 1999; Hare et al., 1999; Tripathi et al., 2004; Szabó et al., 2008) u různých rostlin. Nelze však zobecnit, že vyšší obsah prolinu v rostlině by znamenal pro rostlinu i vyšší odolnost vůči stresu. Zdá se, že tato schopnost je rozdílná pro různé druhy rostlin. Například u ječmene setého (Hordeum vulgare), byly sice zjištěny vysoké obsahy prolinu, ale ty nezvyšovaly jeho odolnost vůči stresu zasolením. (Chen et al., 2007; Widodo et al., 2009; Szabados a Savouré, 2009). Korelace mezi abiotickým stresem a produkcí prolinu byla zkoumána i v rostlinách máku setého. Szabó et al. (2008) zkoumali vliv vodního režimu a stresu suchem na produkci prolinu. Rostliny reagovaly na stres suchem zvýšenou akumulací prolinu v listech (268,10 mg.kg-1), a to 5 až 6,6 krát vyššími obsahy v porovnání s rostlinami pěstovanými v režimu optimální závlahy (40,75 mg.kg-1). Zvýšenou akumulaci prolinu v listech máku setého pozorovali i Balážová et al. (2008), kteří zkoumali reakci rostliny na různou míru zasolení chloridem sodným. Autoři rovněž pozorovali 5-6 násobné navýšení obsahu prolinu v reakci na 50 mmol.l-1 NaCl a 100 mmol.l-1 NaCl. Zajímavým zjištěním zde byl vývoj obsahu prolinu, kdy při koncentraci zasolení 50 mmol.l-1 NaCl došlo k návratu obsahu prolinu v listech na hladinu obsahu v kontrolních rostlinách. V rostlinách zatížených 100 mmol.l-1 NaCl došlo rovněž k výraznému snížení obsahu prolinu po pěti dnech, nicméně jeho obsah v listech byl stále mírně navýšený v porovnání s kontrolními rostlinami. Tento efekt může být vysvětlen aktivací jiných obranných mechanismů v rostlině. Tento jev byl uveden i v jiných studiích (Kavikishor et al., 2005; Niknam et al., 2006).
3.4.3.1 Biosyntéza prolinu Prolin je ve vyšších rostlinách syntetizován především z glutamátu. Glutamát je redukován za přítomnosti enzymu pyrrolin-5-karboxylát
synthetasy
(P5CS) na
glutamát-semialdehyd (GSA). Ten se spontánně mění na pyrrolin-5-karboxylát (P5C). Pyrrolin-5-karboxylát reduktasa (P5CR) následně redukuje pyrrolin-5-karboxylát na prolin. Prolin může být následně v mitochondrii zpětně přeměněn v několika krocích pomocí prolin dehydrogenasy, případně prolin oxidasy (PDH; POX) za vzniku 42
pyrrolin-5-karboxylátu. Pyrrolin-5-karboxylát dehydrogenasa (P5CDH) jej může dále přeměnit na glutamát. Alternativní cestou produkce prolinu v rostlinách je přeměna ornithinu
transaminací
ornithin-delta-aminotransferasou
(OAT)
na
glutamát-
semialdehyd odkud pokračuje biosyntéza stejně jako v předchozím případu Vendruscoloa et al., 2007; Szabados a Savouré, 2009) . Obr. 18: Biosyntéza prolinu ve vyšších rostlinách
Zdroj: Szabados a Savouré (2009)
Při stresu dochází k akumulaci prolinu. Tato akumulace je pravděpodobně zprostředkována dvěma signálními cestami, ABA dependentní a ABA independentní. Významnou roli při zvýšené tvorbě prolinu při dehydrataci, zasolení a aplikaci ABA posttranskripční úpravy. Při posttranskripčních úpravách se jedná především o geny RD29A, KIN2 a RAB18. (Hare et al, 1999)
43
4 Hypotézy a cíle H1: Obsah kadmia a zinku v makovině má vliv na kvantitu a kvalitu alkaloidů v máku setém C1: Stanovit obsahy Cd a Zn a množství a složení alkaloidů v makovině a definovat, jakým způsobem spolu souvisí
H2: Existuje vztah mezi obsahy jednotlivých alkaloidů v rostlině C2: Stanovit obsahy jednotlivých alkaloidů v makovině a definovat, jakým způsobem na sobě závisí
H3: Obsah kadmia a zinku v půdě má vliv na obsah těžkých kovů v makovině C3: Stanovit obsahy kadmia a zinku v půdě a v makovině a definovat, jakým způsobem tyto spolu souvisí
H4: Je možné určit míru stresu máku na základě obsahu prolinu v rostlině C4: Na základě obsahů kadmia a zinku přijatých rostlinou určit jejich vztah k množství prolinu
H5: Množství kadmia a zinku v roztoku při aplikaci na list ovlivňuje množství a složení alkaloidů v makovině C5: Stanovit obsahy kadmia a zinku v makovině rostlin s aplikací na list a s aplikací do půdy a stanovit, do jaké míry jsou tyto srovnatelné
44
5 Materiál a metody 5.1 Rostlinný materiál Zdrojem rostlinného materiálu pro stanovení alkaloidů byla odrůda máku setého Major z odlišných lokalit. Pokusy byly založeny jako kombinace maloparcelových a nádobových pokusů. Maloparcelové pokusy probíhaly na 7 různých stanovištích v okresech Litoměřice a Praha-západ (tab. 6). Mořené a kalibrované osivo bylo získáno z Výzkumné stanice Červený Újezd České zemědělské univerzity v Praze.
5.1.1 Odrůda Major •
Odrůda registrovaná v roce 2002. Udržovatelem je Výskumný ústav rastlinnej výroby, SK.
•
Odrůda určená k produkci semene modravé barvy pro potravinářské účely a makoviny pro farmaceutický průmysl.
•
Středně raná odrůda, rostliny středně vysoké až vysoké, odolné proti poléhání.
•
Odrůda středně odolná proti napadení helmintosporiózou na listech, středně odolná proti napadení helmintosporiózou na tobolkách. Odrůda středně odolná proti napadení plísní makovou.
•
Odrůda typu slepák, výskyt hleďáků nízký až středně vysoký.
•
Obsah morfinu v makovině středně vysoký (cca 0,4-0,6 %).
•
Další charakteristiky odrůdy Major jsou uvedeny v tabulce 5
45
Tab. 5: Průměrné hodnoty vybraných hospodářských vlastností odrůdy Major v registračních zkouškách ÚKSÚP (2007 a 2008)
Hospodářská vlastnost rok registrace barva semen výnos semen výnos v řepařské výrobní oblasti výnos v bramborářské výrobní oblasti výnos makoviny vegetační doba délka rostlin odolnost k poléhání vyrovnanost v nasazení tobolek vyrovnanost ve tvaru tobolek výskyt hleďáků odolnost: helmintosporióza – listy odolnost: helmintosporióza – tobolky odolnost: plíseň maková hmotnost tisíce semen obsah morfinu v makovině obsah oleje v semenech
Jednotka Hodnota 2002 modrá % 98,8 % 97,3 % 99,4 % 106,2 dny 131 cm 121 9–1 7,7 9–1 7,2 9–1 8 % 0,48 9–1 7,8 9–1 7,7 9–1 6,9 g 0,51 % 0,48 % 46,2
poznámka: 9 - nejlepší projev znaku; 1 - nejhorší projev znaku
Zdroj: Vrbovský (2009)
5.1.2 Maloparcelové pokusy
Tab. 6: Lokality maloparcelových pokusů
Lokalita
Okres
Bohušovice
Litoměřice
Hostěnice
Litoměřice
Mšené-lázně
Litoměřice
Červený Újezd
Praha-západ
V okrese Litoměřice byly pokusy založeny vždy na dvou sublokalitách. Pěstování máku na sublokalitách umožňuje srovnání sledovaných parametrů na lokalitách s podobným klimatem, za účelem eliminace vlivu podnebí, které je jedním z hlavních
46
faktorů při tvorbě alkaloidů. (Tookey et al., 1976; Felklová a Ferenčík, 1982; Felklová a Vaverková, 1983; Morimoto et al., 2003)
Rostliny byly pěstovány na parcelách o rozloze 1,5 × 6 m ve čtyřech opakováních. Vedle parcel zatížených dávkou kadmia a zinku byly pěstovány rostliny tvořící kontrolní variantu, která zůstala bez zátěže. K rostlinám byla aplikována základní a dvojitá dávka zatížení těžkými kovy. Přehled aplikačních dávek je uveden v tabulce 7. Tab.
Koncentrace aplikovaných kovů byla zvolena na základě limitních obsahů pro zemědělské půdy, na kterých jsou pěstovány obilniny v rámci modelu dlouhodobého příjmu (May et al., 1991). V polních pokusech tak bylo dbáno na praktické využití závěrů pokusů. Uvedené dávky byly vztaženy k běžné zemědělské praxi s uvážením, že mák je pěstován pouze na půdách bez vysoké kontaminace sledovanými těžkými kovy. Vysoká kontaminace by totiž neměla případný vliv jen na obsahy alkaloidů, ale rovněž na nadlimitní obsahy vybraných těžkých kovů v rostlině, a tím i k nevhodnosti pro potravinářské účely. Rovněž nebyly porovnávány obsahy kadmia a zinku v půdě před aplikací. Vzhledem k tomu, že nebyl zkoumán celkový obsah těchto prvků v půdě, ale pouze jejich část přístupná pro rostliny, nebylo by možné nastolit stejné podmínky na všech lokalitách. Podíl kadmia zinku přístupných pro rostliny je totiž ovlivňován mnoha faktory. Tab. 7: Aplikační dávky kadmia a zinku v polních pokusech
Označení vzorku Cd1 Cd2 S Zn1 Zn2
Koncentrace kadmia a zinku v roztoku 2,47 g.l-1 4,94 g.l-1 kontrolní vzorek 10,24 g.l-1 20,47 g.l-1
•
Aplikace (200 l/ha) – ručním postřikem na list
•
Vývojová fáze 15 a 65
•
Kadmium ve formě Cd(NO3)2.4H20
•
Zinek ve formě ZnSO4.6H20
Rostlinný materiál byl odebírán ve dvou termínech ve vývojové fázi 65, před druhou aplikací kadmia a zinku, a ve fázi zelené zralosti (79) a analyzován na obsahy sledovaných těžkých kovů, množství jednotlivých alkaloidů a obsah prolinu. Rostlinný 47
vzorek byl připraven jako směsný vzorek homogenizovaného materiálu z přibližně dvaceti rostlin.
5.1.3 Nádobové pokusy Nádobové pokusy byly založeny na pozemku Výzkumného ústavu rostlinné produkce, oddělení ekotoxikologie v Chomutově. Rostliny byly pěstovány v 28 nádobách naplněných 10 l půdy, pocházející z pole poblíž výsypky hnědouhelných dolů v Chomutově. Nádobové pokusy byly zatíženy různými dávkami vybraných těžkých kovů (tab. 8). Pokusy byly prováděny ve čtyřech opakováních. Rostliny byly odebírány ve vývojové fázi 79. Tab. 8: Rozložení pokusů
Označení vzorku Koncentrace Cd [mg.kg-1] Označení vzorku Koncentrace Zn [mg.kg-1]
Cd1(N)
Cd2(N)
Cd3(N)
10
20
40
Zn1(N)
Zn2(N)
Zn3(N)
100
200
400
Označení vzorku Kontrolní vzorek
S(N) bez dodatečného zatížení těžkými kovy
Aplikace byla provedena zálivkou ve dvou termínech odpovídajících vývojovým fázím 15 a 65. Rostlinný materiál byl odebrán v zelené zralosti a analyzován na obsahy vybraných těžkých kovů a množství jednotlivých alkaloidů. Rovněž byl analyzován obsah aminokyseliny prolinu. 5.1.3.1 Popis stanovišť 5.1.3.1.1 Červený Újezd Stanice Červený Újezd je výzkumnou stanicí FAPPZ České zemědělské univerzity v Praze. Klimatické podmínky
•
Červený Újezd spadá do oblasti mírně teplé, mírně suché, převážně s mírnou zimou. Průměr srážek za vegetační období je 333 mm a průměr teplot za vegetační období je 13,8 ºC.
•
Doba slunečního svitu za vegetační období je dle dlouhodobého průměru 1396 hodin. 48
•
Nachází se v nadmořské nadmoř výšce 405 m.
Půdní podmínky
•
Hnědozem, hnědozem ědozem dozem ilimerizovaná, vyluhované vrchní půdní p pů horizonty s posunem koloidních částic č do spodiny.
•
Hloubka ornice 22--28 cm, se silným sklonem k tvorbě ě hrud a půdního p škraloupu (Kroutil et al., al. 2003).
•
Území je tvořeno o opukami křídového k stáří, překrytými ekrytými sprašemi a sprašovými pokryvy pleistocenními. Opuky jsou vápnité se štěrkovým št rkovým rozpadem. Spraše a nevápnité pokryvy jsou převažujícím p půdním dním druhem. (Fogl, 2000)
Vodní a výživný režim
•
Promyvný, sorpční ční systém nasycený, nasycený půdy dy výživné, bohaté (Kroutil, 2003)
5.1.3.1.2 Okres Litoměřice ěřice Obr. 19: Lokalizace pokusných pozemků: pozemk B Bohušovice, ČÚ – Červený Újezd, M – Mšené-lázně, H – Hostěnice
Obrázek 19 udává rozložení ro polních Obr.
pokusů v okrese Litoměřice. Litoměř Důležité je zde obzvláště ě rozložení sublokalit, které byly zvoleny tak, aby od sebe seb byly v malé vzdálenosti pro možnost sledování
klimatických
vliv vlivů
na
rostliny.
Pro přehled ehled hydrometeorologických charakteristikk za rok 2007 pro území polních
pokusů
z Mšeného-lázní, ze
Hostěnic nic a Bohušovic nad Ohří Oh byla použita data z hydrometeorologické stanice Doksany.
49
Průměrná teplota vzduchu
Průměrná teplota vzduchu v Doksanech v roce 2007 byla 10,5 °C (tab. 9) a pohybovala se o více než jeden stupeň nad dlouhodobým průměrem teplot v České republice (tab. 10). Tab. 9: Průměrná teplota vzduchu v Doksanech v roce 2007 Doksany Průměrná teplota vzduchu (° C) Měsíc
1.
Teplota (°C)
5
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
4,1
6,2 11,3 15,6 19,3 19,6 19,3 12,8
10. 7,9
11.
12.
3,3
Rok 10,5
1,1
Průměrná teplota vzduchu v roce 2007 ve srovnání s dlouhodobým normálem 1961– 1990 Tab. 10: Odchylky teplot v roce 2007 od dlouhodobého normálu Měsíc Území 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Rok 10.
11.
12.
7,2
1,4
-0,9
9,1
8
2,7
-1
7,5
-0,8
-1,3
0,1
1,6
T
3,2
2,8
N
-2,8
-1,1
2,5
O
6
3,9
2,6
3
T
4,1
3,6
5,8
11
15 18,7 18,9 18,2
12
7,8
2
0
9,8
Středočeský N
-2
-0,4
3,4
8,1
13 16,3 17,8 17,2 13,6
8,6
3,3
-0,2
8,2
6,1
4
2,4
2,9
-0,8
-1,3
0,2
1,6
5,1 10,3 14,4 18,1 18,3 17,7 11,3
Česká 7,3 12,3 15,5 16,9 16,4 12,8
republika
Praha a
kraj
O
2,1
2,6
2
1,4
2,4
1,3 -1,5
1,1
1 -1,6
Poznámka: T: Průměrná měsíční teplota vzduchu (°C) N: Dlouhodobý normál 1961–1990 (°C) O: Odchylka od normálu (°C)
Úhrn srážek byl v Doksanech, tedy v hydrometeorologické stanici, která je nejblíže sledovaným lokalitám v okrese Litoměřice, v roce 2007 podprůměrný. Zatímco byl v Doksanech úhrn srážek 497,3 mm (tab. 11), je dlouhodobý úhrn srážek v Praze a Středních Čechách 604 mm (tab. 12). Tab. 11: Úhrn srážek v Doksanech v roce 2007 Doksany Úhrn srážek (mm) Měsíc
1.
Úhrn srážek (mm) 38,3
2.
3.
33 17,7
4. 4,2
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Rok
94 48,4 51,5 67,6 67,1 13,7 47,3 14,5 497,3
50
Tab. 12: Odchylky srážek v roce 2007 od dlouhodobého normálu Měsíc Území 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Česká republika
Rok 10.
11.
12.
S
75
44
53
5
79
78
86
71 117
36
76
35 755
N
42
38
40
47
74
84
79
78
42
49
48 674
%
181 116 132
11 107
52
93 109
91 224
85 154
73 112
S
55
33
32
3
66
72
78
73
87
20
64
21 604
N
32
30
36
43
70
75
72
73
46
36
40
35 590
171 109
90
7
94
96 108
56 159
60 102
Praha a Středočeský kraj
%
99 189
Poznámka: S: Průměrný úhrn srážek N: Dlouhodobý normál 1961–1990 (mm) %: Průměrný úhrn srážek v procentech dlouhodobého normálu
5.1.3.1.3 Chomutov Pozemky Výzkumného ústavu rostlinné výroby, oddělení Ekotoxikologie. Lokalizace
•
Západní okraj města Chomutova, lokalita Nové Spořice, rovina pod úpatím Krušných hor. Zeměpisná šířka 50°26´30´´, délka 13°23´30´´.
Klimatické podmínky
•
Typ mírně teplý, mírně suchý, převážně s mírnou zimou.
•
Úhrn srážek: 525 mm za rok, z toho 300 mm za vegetační období.
•
Teplota vzduchu: 7,6 °C v pr ůměru za rok, 13,8 °C za vegetační období.
•
Imisní zátěž: vysoká.
•
Převládající směr větrů: severozápadní.
•
Nadmořská výška - 363 m n.m.
51
5.2 Chemický materiál a metody 5.2.1 Chemikálie pro přípravu vzorku alkaloidů:
Pro kvalitativní a kvantitativní stanovení vzorků metodou HPLC (vysokoúčinné kapalinové chromatografie) ve vzorcích makoviny bylo použito následujících chemikálií udaných koncentrací a čistoty: methanol p.a.
CH3-OH
chloroform p.a.
CHCl3
kyselina sírová p.a. 3%
H2SO4
síran sodný bezvodý čistý
Na2SO4
hydroxid amonný p.a.
NH4OH
diethylether p.a.
C2H5-O-C2H5
hydrogenfosforečnan sodný p.a.
Na2HPO4
dihydrogenfosforečnan sodný p.a.
NaH2PO4
5.2.2 Stanovení alkaloidů pomocí HPLC s hmotnostní detekcí
Makovina (prázdné makovice nenapadené škůdci a chorobami) byla rozemleta na elektrickém mlýnku najemno. Dále se vzorky připravily k extrakci. Do baňky s obsahem 150 ml byly naváženy na analytických vahách 4 g mletého materiálu. Poté bylo k vzorku přidáno 100 ml methanolu a baňky se umístily do ultrazvukové lázně po dobu jedné hodiny. Methanolový podíl byl přelit a přefiltrován a k vzorku makoviny bylo přidáno opět 100 ml a postup byl opakován. Následně byl methanolový extrakt přefiltrován a oba podíly byly spojeny. V další fázi se extrakt odpařil do sucha na vakuové rotační odparce. Po odpaření do sucha byl extrakt vytřepán 3x 10 ml 3% kyselinou sírovou. Po spojení podílů byl extrakt přefiltrován přes filtrační papír. Zde došlo k zachycení nečistot a alkaloidy přešly ve formě solí do kyselého vzorku. Kyselý extrakt byl třepán 2x 15 ml diethyletheru za účelem odstranění tuků ze vzorku. Po oddělení v dělicí nálevce byla vodná vrstva zalkalizována přidáním hydroxidu amonného. Tím došlo k převedení
52
alkaloidů ve volné organické báze. Následným protřepáním 2x 15 ml chloroformem došlo k odstranění vody z extraktu. Chloroformové podíly byly poté spojeny a vysušeny bezvodým síranem sodným. Dále byl extrakt přefiltrován a znovu odpařen na vakuové odparce do sucha. Odparek byl převeden na 50% methanolický extrakt a analyzován metodou vysokoúčinné
kapalinové
chromatografie
s tandemovou
hmotnostní
detekcí
(LC/MS/MS) na chromatografické koloně HyPURITY AQUASTAR. Meze detekce a meze stanovitelnosti jsou uvedeny v tabulce 13. Tab.
Tab. 13: Meze detekce a meze stanovitelnosti (ng/ml extraktu)
Alkaloid
LOD
LOQ
Morfin
2
6
Kodein
1,5
4,5
Papaverin
0,5
1,5
Thebain
3,5
10,5
Narkotin
0,5
1,5
LOD – mez detekce, LOQ – mez stanovitelnosti
Interference Na základě volby konfirmačních MRM přechodů lze předpokládat, že k interferencím nedochází.
Vlastní stanovení • Chromatografický systém pro HPLC – Ultimate 3000 RS, Dionex, USA •
Hmotnostní detektor - 3200 QTRAP, Applied Biosystems, USA
•
Analytická kolona: HyPURITY AQUASTAR (100 × 4.6 mm; 3 µm) (Thermo, USA)
•
Průtok:
•
Teplota kolony:
40 °C
•
Objem nástřiku:
1 µl
•
Doba analýzy:
15,5 min
•
Všechna činidla i chemikálie musí být určena pro HPLC, případně čistoty p.a.
1 ml/min
53
Analytické standardy • Pentahydrát síranu morfinia (Morphine sulfate pentahydrate), Sigma-Aldrich, USA •
Kodein (Codeine), Sigma-Aldrich, USA
•
Thebain (Codeine), Sigma-Aldrich, USA
•
Chlorid papaverinia (Papaverine hydrochloride), Sigma-Aldrich, USA
•
Hydrát chloridu narkotinia (Noscapine hydrochloride hydrate), Sigma-Aldrich, USA
Mobilní fáze pro HPLC • složka A – ( 0.1% HCOOH v MeOH, v/v) - 1 objemový díl mravenčí kyseliny se smíchá s 999 objemovými díly methanolu. •
složka B – (0.1% HCOOH v deionizované vodě, v/v) - 1 objemový díl mravenčí kyseliny se smíchá s 999 objemovými díly deionizované vody.
Obě komponenty mobilní fáze je nutné před použitím odplynit. Tab. 14: Nastavení gradientového režimu
Čas (min)
A (%)
B (%)
Režim
0 – 1,5 1,5 – 3 3–4 4–5 5–6 6–7 7 – 10 10 – 11 10 – 12 12 – 13 13 – 15,5
10 30 30 40 40 50 50 100 100 10 10
90 70 70 60 60 50 50 0 0 90 90
prodleva lineární gradient prodleva lineární gradient prodleva lineární gradient prodleva lineární gradient prodleva lineární gradient ekvilibrace
54
Podmínky detekce Tab. 15: Nastavení ESI zdroje
ESI CUR CAD IS TEM GS1 GS2
Mode Curtain Gas Collision Gas Ion Spray Voltage Temperature Ion Source Gas 1 Ion Source Gas 2
Positive (+) 20 psi medium 5500 V 650 °C 50 psi 70 psi
Tab. 16: Parametry MRM přechodů
molekulový ion (Da)
analyt
přechod kvantifikační morfin konfirmační kvantifikační kodein konfirmační kvantifikační narkotin konfirmační kvantifikační papaverin konfirmační kvantifikační thebain konfirmační
čas DP EP CEP CE CXP (ms) (V) (V) (V) (V) (V) 75 51 11 16 51 4 83 46 9 26 37 27 4 90 46 6 22 27 4 37 4 61 4 30 57 4 2 81 116 2 24 33 4
fragmentační ion (Da) 152,2 165,3 152,2 215,3 220,2 353,2 202,3 308,3 152,2 251,3
286,1 300,1 414,2 340,2 312,2
DP - Dectlustering potential; EP - Entrance potential; CEP - Cell entrance potential; CE - Collision energy; CXP - Cell exit potential
Příklady chromatogramů reálného vzorku a standardů jsou uvedeny na obrázkuObr. 20.
Obr. 20: Chromatogram měřených alkaloidů XIC of +MRM (10 pairs): 286.1/152.2 Da ID: morfin from Sample 7 (285) of TLUKA_2cast.wiff (Turbo Spray)
Max. 9866.7 cps.
XIC of +MRM (10 pairs): 286.1/152.2 Da ID: morfin from Sample 3 (std 1/0.1) of TLUKA_1cast.wiff (Turbo Spray)
2.2e4
smesny standard
1.20e4
2.0e4
1.15e4
1.9e4
papaverin 0.1 ug/ml
1.10e4
kodein
1.8e4
kodein 1 ug/ml
1.05e4 1.00e4
1.7e4
9500.00
1.6e4
9000.00 1.5e4
narkotin 0.1 ug/ml
8500.00
1.4e4
8000.00
1.3e4
7500.00 Intensity, cps
Intensity, cps
Max. 3833.3 cps.
1.25e4
vzorek makoviny
2.1e4
1.2e4 1.1e4
morfin
1.0e4
2.66
narkotin
9000.0
7000.00 6500.00 6000.00 5500.00 5000.00
8000.0
4500.00
7000.0
4000.00
6000.0
3500.00
5000.0
3000.00
morfin 1 ug/ml 2.69
2500.00
4000.0
2000.00 3000.0
1500.00
2000.0
papaverin
thebain
1000.00
1000.0 0.0
thebain 0.1 ug/ml
500.00 1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0 Time, min
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0
0.00
55
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0 Time, min
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0
5.2.3 Stanovení obsahu kadmia a zinku Vzorky makoviny byly na obsah kadmia a zinku analyzovány v laboratoři Výzkumného ústavu rostlinné výroby, oddělení Ekotoxikologie v Chomutově. Suché vzorky o hmotnosti 0,5 g byly pro stanovení požadovaných prvků rozloženy na mokré cestě směsí superčisté kyseliny dusičné (4 ml) a peroxidu vodíku (1 ml) v patronách při mikrovlnném záření v mikrovlnné jednotce MLS-1200 MEGA po dobu 18 minut v programu uvedeném v tabulce 17. Tab.
Tab. 17: Program mikrovlnného rozkladu
Krok 1 2 3 4 5
Výkon 250 W 0W 250 W 400 W 600 W
Pro měření koncentrace kadmia a zinku
Čas 1 min 2 min 5 min 5 min 5 min
v připravených použita
metoda
mineralizátech atomové
byla
absorpční
spektrometrie. Koncentrace kadmia a zinku byla měřena metodou atomizace v plameni (F-AAS) na přístroji Perkin
Elmer AAS 3110. Úroveň pozadí laboratoře byla monitorována analýzou 5 slepých vzorků,
kvalita
analytických
dat
prověřena
souběžnou
analýzou
interního
referenčního materiálu VÚRV oddělení Ekotoxikologie v Chomutově a referenčního materiálu ÚKZUZ o známém obsahu sledovaných prvků (tab. 18 a tab. 19)
Tab. 18: Referenční materiál - kadmium
Číslo vzorku ETO2010-R01 ETO2010-R02 ETO2010-R03 ETO2010-R04 ETO2010-R05 4026 4306 4307 4022 4023 4507 4508 4543 4544
Popis pšenice zrno tráva jetel brambory pšenice sláma kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ kontr. vz.ÚKZÚZ
Koncentrace (mg.kg-1 sušiny) 0,05 0,45 0,85 0,25 0,35 0,55 0,25 0,85 2,55 1,85 1,85 1,25 5,75 1,55
56
Tab. 19: Referenční materiál - zinek
Číslo vzorku Popis ETO2010-R01 pšenice zrno ETO2010-R02 tráva ETO2010-R03 jetel ETO2010-R04 brambory ETO2010-R05 pšenice sláma 4026 kontr. vz.ÚKZÚZ 4306 kontr. vz.ÚKZÚZ 4307 kontr. vz.ÚKZÚZ
Koncentrace (mg.kg-1 sušiny) 22,3 19,2 19,0 11,6 10,4 14,9 8,7 27,7
Měření vybraných těžkých kovů proběhlo s nastavením přístroje, které je uvedeno v tabulce 20. Tab.
Tab. 20: Nastavení přístroje pro F-AAS
Element Vlnová délka Štěrbina Flame nm nm gases Cd 228,8 0,7 Air-Acetylene Zn 213,9 0,7 Air-Acetylene
5.2.4 Analýza těžkých kovů přístupných pro rostliny v půdě
Při analýze sledovaných těžkých kovů v půdě je důležité vycházet z jejich vlastností a přístupností pro rostlinu. Vzhledem k tomu, že se těžké kovy v půdě vyskytují v různých vázaných a volných formách, které jsou rozdílně přístupné pro rostliny, nebyl stanoven celkový obsah kadmia a zinku v půdě, ale pouze obsah, který je pro rostliny přístupný. Za vyhovující pro určení přístupnosti živin (makro i mikro) a rizikových prvků pro rostliny se považuje extrakce 0,01 M roztokem CaCl2. Důvodem je především nízká koncentrace chloridu vápenatého, která se blíží průměrné koncentraci iontů v půdním roztoku, v němž je také zastoupen především vápník. Další velkou výhodou je možnost stanovení téměř všech parametrů (stanovení přístupných sledovaných těžkých kovů, obsahy přístupných živin a hodnota pH) v jednom půdním extraktu. Tím se významně snižují náklady na analýzu a navíc je možné vyhodnotit poměry jednotlivých prvků, které jsou pro interpretaci výsledků velmi důležité (K a Mg, Cd a
57
Zn, Cu a Ni atd.). Extrakční činidlo je levné a není problematické z hlediska laboratorního odpadu (tento aspekt nabývá na stále větší důležitosti).
5.2.4.1 Pracovní postup Extrakce: 10,00 g upraveného půdního vzorku se v polyethylenové lahvi 250 ml extrahuje 100 ml extrakčního roztoku (1). Na rotační třepačce je při 45 -55 ot.min-l a 20 oC dosaženo rovnováhy za dvě hodiny. V případě využití horizontální třepačky je doba prodloužena na 6 hodin. Úprava extraktu pro měření: Potřebná část extraktu se odstředí při 3000 ot.min-l po dobu 10 min. Čistý supernatant se použije pro stanovení dalších parametrů (obsah přístupných živin a hodnota pH). Pokud vzorek obsahuje lehké částice, je možné supernatant přefiltrovat přes suchý kvantitativní filtr. Vzhledem k možným sorpcím a kontaminacím spojeným s kontaktem supernatanu s filtračním papírem je třeba prvních 30 ml filtrátu odstranit. Vzorek se uchovává v pečlivě vymyté, dobře uzavíratelné polyethylenové nádobě. V každé sérii je třeba stanovit nejméně dva slepé pokusy. Pro stanovení mikroelementů a rizikových prvků (Pb, Cd, Cr, Ni, Cu, Zn, apod.) je třeba vzorek okyselit, aby se zamezilo ztrátám sorpcí na stěny nádobky. Pro okyselení se na každých 5 ml extraktu přidává 0,1 ml kyseliny dusičné o koncentraci 5 mol.l-1 (2). Extrakce roztokem chloridu vápenatého probíhá při pH půdy a iontové síle blízké průměrné iontové síle půdního roztoku. Po ustavení rovnováhy mezi půdou a extrakčním roztokem se vzorky analyzovaly na obsahy kadmia a zinku metodou atomizace v plameni (F-AAS) na přístroji Perkin Elmer AAS 3110.
5.2.4.2 Chemikálie 1.
Extrakční roztok - chlorid vápenatý c(CaCl2) = 0,01 mol.l-1: 1,470 g dihydrátu
chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O) se rozpustí v 1000 ml destilované vody. 2.
Kyselina dusičná zředěná, c(HNO3) = 5 mol.l-1: 34,7 ml koncentrované kyseliny
dusičné (65%) se přidá k 50 ml demineralizované vody a po vytemperování na pokojovou teplotu se objem upraví na 100 ml.
58
5.2.5 Stanovení prolinu
Standardní metodou analýzy obsahu prolinu je postup dle Batese se (1973). (1973) Prolin byl analyzován v plně vyvinutých listech. Vzorky (50 mg suchého materiálu) byly extrahovány 10 ml 3% roztoku sulfosalicylové kyseliny po dobu 1 hodiny hodin při pokojové teplotě. Následně byl extrakt přefiltrován. p Část extraktu byla přidána př do 4 ml ninhydrinového roztoku (1,25% (1 w/v ninhydrinu do 2,4 4 M kyseliny fosforečné fosfore v kyselině octové) a 4 ml kyseliny octové a vše je inkubováno ve vroucí vodě vod po dobu 1 hodiny. odiny. Po rychlém ochlazení ledem je ke vzorkům vzork přidáno idáno 5 ml toluenu. Roztok byl následně silně protřepán. řepán. Po protřepání epání a následném ustálení byly vytvořeny vytvo 2 vrstvy, spodní vodná a horní toluenová. Absorbance toluenové fáze obsahující barevný komplex byla proměřena proměř při 515 nm oproti slepému vzorku (čistý čistý toluen). toluen Byly připraveny ipraveny standardy od 0 do 15 mg.kg-1 prolinu a na jejich základě ě byla vytvořena vytvo kalibrační křivka. ivka. Na základě této kalibrační křivky ivky byly stanoveny hodnoty prolinu pro příslušné p absorbance. K měření byl použit přístroj ístroj spektrofotometr NV203.
5.3 Statistické metody Výsledky byly hodnoceny programy Excel a Statistica 9.0. Pro vyhodnocení výsledků ů byly použity dvě dv různé zné statistické metody.
5.3.1 Metoda Pearsonova earsonova lineárního korelačního korela ního koeficientu:
Pearsonův korelační ní koeficient byl počítán po podle vzorce:
59
kde pro dvojici těžký kov – alkaloid byla proměnná x obsah zinku nebo kadmia a proměnná y obsah daného alkaloidu. alkalo Proměnná kadmia nebo zinku a
je aritmetický průměr pr obsahů
je aritmetický průměr pr obsahů daných alkaloidů. alkaloid N je počet
dvojic hodnot.
5.3.2 Metoda Spearmanova pearmanova korelačního korela koeficientu: Spearmanůvv koeficient patří patř mezi neparametrické korelační ční koeficienty, tj. není závislý na normálním rozložení a lineární závislosti proměnných. ěnných. Lineární hodnoty proměnných jsou převedeny řevedeny na jejich pořadí po a výpočet et je proveden na základě základ rozdílu pořadí adí spárovaných hodnot v proměnných. Jedním z předpokladů ů využití parametrických testů test je vyhovění vyhově podmínkám kladeným na analyzovaný soubor. soubo Soubor musí být v dostatečném čném rozsahu (od cca 30 jednotek) a dále musí prokazovat značnou zna homogenitu dat. Vzhledem k tomu, že se jedná spíše o několik ěkolik souborů soubor nehomogenních dat, byly výsledky ověřovány ov přepočtem tem pomocí Spearmanova korelačního korela koeficientu rs dle vzorce:
rs =
kde pro dvojici těžký žký kov – alkaloid byla proměnná Xi pořadové řadové číslo č vzorku v souboru dle obsahu kadmia nebo zinku a proměnná prom Yi byla pořadové řadové číslo vzorku v souboru dle obsahu vybraného alkaloidu. Proměnná Prom n je počet čet vzorků v souboru.
60
6 Výsledky 6.1 Polní pokusy 6.1.1 Obsah alkaloidů v rostlinách z polních pokus pokusů 6.1.1.1 První termín odběru ru (vývojová fáze 65) 6.1.1.1.1 Bohušovice – sublokalita 1 Tab. 21: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
< MD 267,2 388,9 303,4 262,6 185,6 489,0 318,0 20,9 191,0 227,2 260,3 279,5 339,6 285,7 321,9
σ 319,8
46,03
σ 313,8
89,71
σ 174,8
76,97
σ 306,7
24,06
< MD 100,8 151,7 106,6 89,7 70,3 134,4 148,8 6,2 105,6 87,7 143,0 95,7 79,8 143,0 133,4
σ 119,7
21,33
σ 110,8
30,82
σ 85,6
39,72
σ 113,0
25,25
< MD 33,47 9,45 6,00 8,26 7,83 7,41 15,03 17,13 4,86 5,12 2,99 9,10 27,76 12,73 16,43
61
papaverin
thebain
-1
σ 16,31
11,44
σ 9,63
2,70
σ 7,53
4,80
σ 16,50
5,63
< MD 0,58 0,13 0,51 3,47 0,32 0,20 0,25 2,91 0,49 0,55 0,19 1,02 7,02 0,03 0,37
σ 0,41
0,18
σ 1,06
1,21
σ 1,04
0,94
σ 2,11
2,46
< MD < MD 20,58 7,95 9,78 < MD 6,95 87,15 < MD 49,46 46,94 13,76 46,10 56,28 39,90 90,83
σ 14,26
6,32
σ 34,63
35,02
σ 36,72
15,31
σ 58,28
16,28
6.1.1.1.2 Bohušovice – sublokalita 2 Tab. 22: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
212,5 < MD 240,2 45,5 240,2 207,1 292,6 59,8 418,9 88,6 323,4 196,4 367,3 127,8 < MD 222,5 136,3 116,3 244,9 244,1
σ 166,1
80,39
σ 199,9
70,06
σ 256,8
114,4
σ 239,2
85,38
σ 185,4
59,10
216,0 < MD 444,5 80,9 348,5 144,0 289,0 138,2 218,9 164,2 440,6 349,4 163,2 209,3 < MD 263,0 166,1 276,5 217,0 472,3
σ 247,1
131,56
σ 229,9
88,80
σ 293,3
101,76
σ 211,8
34,13
σ 283,0
94,68
4,81 < MD 24,45 4,62 9,28 8,40 10,92 3,81 8,45 9,68 17,64 2,87 36,77 2,40 < MD 5,21 4,23 4,07 5,42 62,42
62
papaverin
thebain
-1
σ 11,29
8,77
σ 8,10
2,15
σ 9,66
4,00
σ 14,80
14,65
σ 19,04
21,69
0,13 < MD 0,30 0,05 4,45 1,05 0,07 0,19 0,12 1,70 0,54 0,13 0,12 0,20 < MD 2,94 0,19 0,19 0,05 0,10
σ 0,16
0,09
σ 1,44
1,51
σ 0,62
0,54
σ 1,09
1,24
σ 0,13
0,06
17,85 < MD 79,07 7,85 51,14 18,06 161,70 < MD 172,20 14,70 54,18 4,62 20,58 < MD < MD 2,22 6,24 49,14 28,04 15,86
σ 34,92
29,43
σ 76,97
56,49
σ 61,43
55,39
σ 11,40
9,18
σ 24,82
13,77
6.1.1.1.3 Hostěnice – sublokalita 1 Tab. 23: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
217,1 124,0 388,9 395,8 18,3 308,0 321,1 120,9 206,4 258,7 162,5 93,9 12,7 354,2 < MD 285,7 105,5 365,0 117,8 229,5
σ 281,4
110,9
σ 192,1
122,47
σ 180,4
52,17
σ 217,5
136,55
σ 204,4
92,79
147,8 138,2 194,9 210,2 144,0 217,0 234,2 217,0 213,1 196,8 113,3 145,0 7,9 305,3 < MD 222,7 258,2 283,2 178,6 218,9
σ 172,8
29,76
σ 203,0
29,52
σ 167,0
37,92
σ 178,6
113,8
σ 234,7
36,00
5,32 55,01 59,12 48,10 14,63 64,13 30,56 10,32 31,76 39,98 41,68 8,07 141,2 34,47 < MD 54,71 50,70 46,79 4,65 22,14
63
papaverin
thebain
-1
σ 41,89
18,28
σ 29,91
17,43
σ 30,37
11,15
σ 76,82
42,97
σ 31,07
17,68
0,12 0,34 0,58 0,04 7,53 20,24 0,09 0,17 0,33 0,39 0,07 0,37 4,17 0,28 < MD 15,16 0,19 0,16 0,07 0,34
σ 0,27
0,19
σ 7,01
6,88
σ 0,29
0,11
σ 6,53
5,75
σ 0,19
0,07
134,4 26,04 51,77 48,09 < MD 11,45 63,21 47,36 15,02 15,23 < MD 2,02 8,44 20,16 < MD 13,34 < MD 15,65 < MD < MD
σ 65,07
34,66
σ 40,67
19,48
σ 10,75
5,82
σ 13,98
4,12
σ 15,65
0,00
6.1.1.1.4 Hostěnice – sublokalita 2 Tab. 24: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
467,4 187,9 341,1 312,6 268,7 312,6 223,3 268,7 234,9 318,8 177,9 311,9 405,8 299,5 244,1 231,0 469,7 605,2 586,0 486,6
σ 327,3
77,00
σ 268,3
22,52
σ 260,8
54,48
σ 295,1
57,56
σ 536,9
58,71
183,4 200,6 219,8 239,0 217,9 161,3 218,9 224,6 186,2 186,2 200,6 298,6 218,9 105,6 191,0 210,2 217,9 180,5 225,6 218,9
σ 210,7
18,72
σ 205,7
22,20
σ 217,9
40,32
σ 181,4
37,92
σ 210,7
15,12
55,71 46,99 52,50 79,66 28,56 55,21 33,27 65,33 8,93 19,34 28,86 16,83 30,76 21,24 33,07 62,73 59,02 77,15 88,78 67,33
64
papaverin
thebain
-1
σ 58,72
10,47
σ 45,59
14,68
σ 18,49
5,61
σ 36,95
12,89
σ 73,07
9,89
0,09 0,34 0,26 0,05 0,43 0,23 0,09 0,03 0,04 0,17 0,07 0,72 0,06 0,18 3,73 0,20 20,76 0,17 0,03 0,21
σ 0,19
0,12
σ 0,19
0,14
σ 0,25
0,24
σ 1,04
1,34
σ 5,29
7,74
41,48 11,87 < MD < MD 38,85 < MD 20,27 < MD < MD < MD < MD 2,22 8,60 12,81 9,11 8,33 < MD 18,59 36,86 58,70
σ 26,67
14,81
σ 29,56
9,29
σ 2,22
0,00
σ 9,71
1,55
σ 38,05
13,77
6.1.1.1.5 Mšené-lázně - sublokalita 1 Tab. 25: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
375,0 439,7 294,9 252,6 486,6 442,0 < MD 280,3 490,5 345,7 399,6 278,0 142,5 401,2 464,3 311,9 276,4 228,7 334,2 < MD
σ 340,5
66,80
σ 403,0
81,79
σ 378,5
66,61
σ 329,9
102,80
σ 279,8
36,28
391,7 394,6 291,8 201,6 299,5 343,7 < MD 389,8 313,0 344,6 202,6 248,6 382,1 272,6 159,4 302,4 192,0 185,3 164,2 < MD
σ 319,9
73,20
σ 344,3
30,29
σ 277,2
51,60
σ 279,1
63,12
σ 180,5
10,88
47,09 18,14 37,17 81,36 22,24 38,88 < MD 38,28 71,14 20,74 24,25 17,13 16,33 33,47 26,25 30,76 41,88 8,09 30,16 < MD
65
papaverin
thebain
-1
σ 45,94
18,29
σ 33,13
7,26
σ 33,32
18,91
σ 26,70
5,41
σ 26,71
12,42
5,21 0,45 0,04 0,22 0,37 0,21 < MD 0,29 0,60 0,87 0,14 0,23 0,53 0,10 0,09 0,16 0,10 0,27 12,35 < MD
σ 1,48
1,87
σ 0,29
0,06
σ 0,46
0,27
σ 0,22
0,15
σ 4,24
5,41
13,55 6,71 7,64 < MD < MD 39,69 < MD 22,37 41,90 83,48 19,74 17,22 51,66 < MD < MD 9,94 < MD < MD 6,18 < MD
σ 9,30
2,83
σ 31,03
8,66
σ 40,58
22,10
σ 30,80
20,86
σ 6,18
0,00
6.1.1.1.6 Mšené-lázně - sublokalita 2 Tab. 26: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin
papaverin
thebain
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
298,0 345,0 266,4 447,4 297,2 317,2 306,5 380,4 278,0 391,9 402,7 340,3 < MD 318,8 337,3 277,2 314,2 306,5 441,2 288,0
σ 339,2
56,98
σ 325,3
27,53
σ 353,2
44,08
σ 311,1
22,59
σ 337,5
51,88
325,4 440,6 353,3 220,8 227,5 281,3 311,0 409,9 226,6 405,1 395,5 282,2 < MD 399,4 400,3 263,0 221,8 608,6 377,3 375,4
σ 335,0
61,92
σ 307,4
53,04
σ 327,4
72,96
σ 354,2
60,80
σ 395,8
106,4
41,78 36,27 14,83 38,48 39,38 40,58 27,35 37,27 39,58 82,56 25,15 44,59 < MD 36,27 52,40 8,14 33,77 45,19 71,44 57,41
66
σ 32,84
9,01
σ 36,15
4,40
σ 47,97
17,30
σ 32,27
16,09
σ 51,95
12,47
0,42 0,17 3,97 5,11 1,02 14,10 0,17 0,25 6,94 7,53 0,07 0,04 < MD 0,15 0,54 0,14 0,24 0,20 12,26 10,95
σ 2,42
2,12
σ 3,88
5,11
σ 3,64
3,59
σ 0,28
0,18
σ 5,91
5,70
23,52 14,81 < MD 18,17 6,71 15,44 < MD 7,23 < MD 17,12 10,15 < MD < MD 12,18 < MD < MD 48,51 25,41 9,88 12,71
σ 18,83
3,13
σ 9,79
3,76
σ 13,63
3,48
σ 12,18
0,00
σ 24,13
12,83
6.1.1.1.7 Červený Újezd Tab. 27: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
46,2 330,3 511,3 < MD 181,7 16,3 268,7 370,4 316,5 191,0 160,9 278,0 212,5 304,9 167,1 229,5 150,9 42,7 220,2 344,2
σ 295,9
166,5
σ 209,3
110,3
σ 236,6
60,64
σ 228,5
38,69
σ 189,5
92,71
32,8 242,9 145,9 < MD 116,2 17,9 121,9 145,0 294,7 231,4 149,8 291,8 65,6 409,9 125,8 172,8 72,6 76,0 110,4 219,8
σ 140,5
71,81
σ 100,2
41,18
σ 241,9
51,36
σ 193,5
108,2
σ 119,7
50,06
2,04 33,87 58,12 < MD 35,57 69,64 10,32 53,21 16,03 43,09 25,15 34,17 3,50 26,45 10,02 22,55 5,27 9,83 52,71 24,85
67
papaverin
thebain
-1
σ 31,34
19,53
σ 42,18
19,24
σ 29,61
9,02
σ 15,63
8,87
σ 23,16
15,61
0,09 0,20 43,98 < MD 0,76 8,76 0,06 0,72 19,62 0,34 4,82 6,04 0,43 0,42 8,85 0,66 6,56 0,15 2,54 10,60
σ 14,75
19,48
σ 2,58
3,09
σ 7,70
5,96
σ 2,59
3,13
σ 4,96
3,62
< MD 10,82 14,91 < MD < MD < MD 2,43 22,58 < MD 11,24 16,70 8,04 < MD 22,58 < MD 2,85 < MD < MD 5,78 36,23
σ 12,86
2,05
σ 12,50
10,07
σ 11,99
3,14
σ 12,71
9,86
σ 21,00
15,23
6.1.1.2 Druhý termín odběru ru (vývojová fáze 79) 6.1.1.2.1 Bohušovice – sublokalita 1 Tab. 28: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
288,8 204,8 460,5 178,6 20,4 126,3 129,4 163,2 242,6 160,2 132,4 331,9 49,6 157,1 118,6 153,2 < MD 172,5 < MD 114,7
σ 283,2
91,44
σ 109,8
44,71
σ 216,8
70,46
σ 119,6
35,54
σ 143,6
28,88
73,2 111,4 182,4 91,3 10,2 106,6 91,6 82,4 190,1 62,2 94,7 191,0 27,4 108,5 93,2 143,0 < MD 108,5 < MD 76,0
σ 114,6
33,91
σ 72,7
31,25
σ 134,5
56,06
σ 93,0
32,83
σ 92,3
16,22
8,36 3,34 4,08 7,23 4,85 3,31 14,93 19,34 4,97 9,07 9,46 17,23 2,75 < MD 3,51 2,03 < MD 13,73 < MD 9,28
68
papaverin
thebain
-1
σ 5,75
2,04
σ 10,61
6,53
σ 10,18
3,53
σ 2,76
0,50
σ 11,50
2,22
2,53 0,08 2,13 1,82 0,47 0,19 8,23 0,06 0,40 0,40 0,15 0,11 0,09 < MD < MD 0,28 < MD 0,07 < MD 0,19
σ 1,64
0,78
σ 2,23
3,00
σ 0,27
0,13
σ 0,20
0,10
σ 0,13
0,06
< MD < MD < MD 20,06 4,59 11,24 11,13 16,28 8,13 4,12 6,39 < MD < MD < MD < MD < MD < MD 5,76 < MD 9,52
σ 20,06
0,00
σ 10,81
3,11
σ 6,21
1,40
σ -
-
σ 7,64
1,88
6.1.1.2.2 Bohušovice – sublokalita 2 Tab. 29: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
240,2 363,4 376,5 337,3 319,6 < MD 184,8 204,1 35,6 339,6 303,4 258,7 311,1 194,8 211,0 221,0 220,2 194,0 203,3 249,5
σ 329,4
44,56
σ 236,1
55,61
σ 234,3
99,37
σ 234,5
38,31
σ 216,8
18,10
203,5 278,4 267,8 196,8 255,4 < MD 211,2 173,8 17,1 214,1 221,8 130,6 186,2 171,8 130,6 222,7 180,5 120,0 327,4 275,5
σ 236,6
36,48
σ 213,4
27,95
σ 145,9
72,05
σ 177,8
26,64
σ 225,8
75,60
10,72 26,65 6,60 10,12 11,62 < MD 1,76 1,57 18,04 5,79 5,70 34,37 2,37 2,86 1,46 2,90 8,61 16,23 4,60 3,95
69
papaverin
thebain
-1
σ 13,52
6,56
σ 4,99
4,42
σ 15,97
10,23
σ 2,40
0,48
σ 8,35
4,07
0,82 0,45 0,42 0,40 3,39 < MD < MD 0,17 1,53 2,69 < MD 0,06 2,74 0,07 0,32 0,30 0,35 1,03 0,06 0,50
σ 0,52
0,15
σ 1,78
1,61
σ 1,43
0,91
σ 0,86
0,94
σ 0,49
0,28
195,3 40,64 8,39 16,28 27,83 < MD < MD < MD 8,37 26,46 17,01 9,94 < MD 18,17 < MD 12,81 7,81 < MD 24,36 < MD
σ 65,15
65,08
σ 27,83
0,00
σ 15,45
6,29
σ 15,49
2,68
σ 16,09
8,27
6.1.1.2.3 Hostěnice – sublokalita 1 Tab. 30: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
304,9 247,2 274,1 175,6 252,6 199,4 264,9 299,5 127,1 < MD 144,0 < MD 284,1 259,5 192,5 196,4 219,5 < MD 127,8 288,0
σ 250,4
39,08
σ 254,1
28,11
σ 135,5
8,47
σ 233,1
38,69
σ 211,8
55,95
131,5 158,4 161,3 76,1 304,3 241,9 255,4 291,8 231,4 < MD 196,8 < MD 206,4 256,3 233,3 255,4 288,0 < MD 156,5 134,4
σ 131,8
28,01
σ 273,4
24,72
σ 214,1
17,28
σ 237,8
18,00
σ 193,0
63,36
26,15 31,36 19,74 4,02 46,09 36,27 15,93 52,40 53,01 < MD 46,99 < MD 41,98 36,47 19,04 51,80 33,57 < MD 14,73 40,08
70
papaverin
thebain
-1
σ 20,32
8,44
σ 37,68
11,57
σ 50,00
3,01
σ 37,32
9,57
σ 29,46
9,82
0,54 2,47 0,32 0,44 0,14 0,37 0,40 0,25 0,27 < MD 0,62 < MD 0,49 4,94 0,22 1,09 0,59 < MD 0,36 0,95
σ 0,94
0,76
σ 0,29
0,10
σ 0,44
0,18
σ 1,69
1,63
σ 0,63
0,21
< MD 10,92 2,79 < MD 8,86 < MD < MD 24,36 34,13 < MD 13,23 < MD 9,85 < MD 0,30 10,82 11,55 < MD 33,71 10,21
σ 6,86
4,06
σ 16,61
7,75
σ 23,68
10,45
σ 6,99
4,46
σ 18,49
10,15
6.1.1.2.4 Hostěnice – sublokalita 2 Tab. 31: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
261,8 257,2 165,6 403,5 129,4 55,5 175,6 237,2 158,6 237,9 254,9 275,7 < MD 150,9 262,6 157,1 211,8 163,2 315,7 284,9
σ 272,0
65,74
σ 149,4
56,96
σ 231,8
36,58
σ 190,2
48,25
σ 243,9
56,40
193,0 151,7 153,6 176,6 156,5 49,7 156,5 190,1 254,4 128,6 166,1 216,0 < MD 120,0 255,4 238,1 169,0 135,4 133,4 279,4
σ 168,7
16,08
σ 138,2
44,23
σ 191,3
43,92
σ 204,5
56,32
σ 179,3
50,04
35,07 17,84 33,37 52,81 28,26 3,63 20,94 9,78 26,35 21,74 43,39 24,55 < MD 38,58 65,13 75,25 41,58 58,12 56,41 9,24
71
papaverin
thebain
-1
σ 34,77
9,17
σ 15,65
8,95
σ 29,01
7,19
σ 59,65
14,05
σ 41,34
16,05
0,15 0,20 0,42 7,66 0,09 0,17 1,80 0,31 0,56 0,17 0,21 0,81 < MD 0,96 0,24 5,38 0,44 0,10 0,65 0,26
σ 2,11
2,78
σ 0,59
0,60
σ 0,44
0,25
σ 2,19
2,12
σ 0,36
0,18
< MD 2,12 < MD 16,28 4,31 < MD 0,82 0,16 14,91 < MD < MD < MD < MD < MD 14,70 18,90 < MD 7,08 < MD 23,63
σ 9,20
7,08
σ 1,76
1,70
σ 14,91
0,00
σ 16,80
2,10
σ 15,35
8,27
6.1.1.2.5 Mšené-lázně - sublokalita 1 Tab. 32: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
207,1 249,5 246,4 345,0 16,4 261,8 209,4 282,6 281,8 217,9 238,7 < MD 276,4 251,8 181,0 177,9 122,4 206,4 149,4 322,6
σ 262,0
41,48
σ 192,6
88,08
σ 246,1
23,78
σ 221,8
42,35
σ 200,2
64,30
268,8 195,8 226,6 342,7 14,9 182,4 337,9 247,7 225,6 231,4 186,2 < MD 292,8 201,6 145,0 152,6 139,2 158,4
125,8 246,7
σ 258,5
47,28
σ 195,7
97,08
σ 214,4
18,77
σ 198,0
49,20
σ 167,5
39,60
13,63 15,03 28,96 42,28 28,56 30,86 23,35 30,16 28,76 20,54 15,73 < MD 19,24 21,14 3,36 6,78 6,44 12,53
1,83 12,22
72
papaverin
thebain
-1
σ 24,97
10,65
σ 28,23
2,44
σ 21,68
4,72
σ 12,63
7,56
8,26
σ 4,12
0,32 0,16 0,40 3,82 0,54 0,35 0,43 0,36 0,26 0,16 0,24 < MD 1,41 0,44 0,87 1,49 0,12 0,60
0,32 0,51
σ 1,18
1,32
σ 0,42
0,07
σ 0,22
0,04
σ 1,05
0,40
0,39
σ 0,17
< MD < MD 17,33 14,39 2,09 6,52 21,42 < MD 7,79 6,71 1,54 < MD 11,34 < MD 11,87 < MD < MD < MD
< MD 0,25
σ 15,86
1,47
σ 10,01
7,61
σ 5,35
2,54
σ 11,60
0,26
0,25
σ 0,00
6.1.1.2.6 Mšené-lázně - sublokalita 2 Tab. 33: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
< MD 67,6 112,4 260,3 160,9 453,5 247,2 267,2 234,1 266,4 160,9 256,4 358,1 177,1 406,6 136,3 174,0 511,3 183,3 425,8
σ 146,8
75,67
σ 282,2
85,66
σ 229,5
34,27
σ 269,5
112,8
σ 323,6
145,0
< MD 148,8 127,7 399,4 90,3 223,7 225,6 434,9 165,1 229,4 268,8 247,7 295,7 222,7 231,4 276,5 249,6 283,2 261,1 403,2
σ 225,3
116,05
σ 243,6
95,63
σ 227,8
31,32
σ 256,6
29,52
σ 299,3
51,96
< MD 8,17 1,07 32,97 9,75 56,21 21,04 24,05 9,42 24,25 28,56 5,16 32,06 6,93 11,02 52,81 32,46 12,63 9,31 15,83
73
papaverin
thebain
-1
σ 14,1
12,60
σ 27,8
14,22
σ 16,8
9,56
σ 25,7
16,73
σ 17,6
7,45
< MD 0,99 3,16 0,51 0,07 0,14 0,64 0,43 17,61 0,18 0,53 0,86 0,07 0,26 0,29 0,37 2,97 0,09 1,94 1,04
σ 1,6
1,07
σ 0,3
0,22
σ 4,8
6,41
σ 0,2
0,09
σ 1,5
0,94
< MD 2,65 < MD 0,70 < MD 9,29 11,76 < MD < MD < MD < MD 0,04 < MD < MD < MD < MD 12,60 < MD 18,17 13,97
σ 1,7
0,97
σ 10,5
1,23
σ 0,0
0,00
σ -
-
σ 14,9
2,17
6.1.1.2.7 Červený Újezd Tab. 34: Obsah alkaloidů v makovině Zatížení morfin
kodein
narkotin mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
156,3 220,2 176,3 191,7 364,2 174,8 166,3 104,0 184,0 280,3 199,4 111,7 221,0 244,9 < MD 189,4 552,1 171,7 251,8 177,1
σ 186,1
19,83
σ 202,3
80,95
σ 193,8
46,01
σ 218,4
19,34
σ 288,2
132,0
168,0 234,2 91,2 150,7 205,4 169,0 120,0 130,6 168,0 131,5 103,7 112,3 227,5 122,9 < MD 121,9 285,1 97,0 110,4 104,6
σ 161,0
40,08
σ 156,2
30,96
σ 128,9
20,88
σ 157,4
46,72
σ 149,3
67,92
21,54 9,38 9,01 21,44 20,54 5,91 11,52 8,34 33,97 4,65 16,33 3,09 19,54 2,94 < MD 13,63 45,59 6,52 5,26 13,63
74
papaverin
thebain
-1
σ 15,34
6,15
σ 11,58
4,48
σ 14,51
10,64
σ 12,03
6,07
σ 17,75
13,92
0,16 0,51 1,51 1,08 2,16 0,19 0,33 0,44 0,38 11,13 0,29 0,53 2,46 4,76 < MD 0,19 0,49 13,75 15,51 0,64
σ 0,81
0,48
σ 0,78
0,69
σ 3,08
4,02
σ 2,47
1,52
σ 7,60
7,03
< MD < MD 8,14 < MD 10,41 < MD < MD 8,40 6,71 < MD 2,09 < MD 25,20 0,10 < MD 0,90 46,31 < MD < MD < MD
σ 8,14
0,00
σ 9,40
1,00
σ 4,40
2,31
σ 8,73
10,98
σ 46,31
0,00
6.1.1.3 Morfin 6.1.1.3.1 První termín odběru (Vývojová fáze 65) Průměrný obsah morfinu v makovině v prvním termínu byl 278,9 mg.kg-1 a pohyboval se v rozpětí od 166,1 mg.kg-1 ve vzorcích po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 na sublokalitě 2 v Bohušovicích do 536,9 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin ze sublokality 2 v Hostěnicích po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2. V Bohušovicích na sublokalitě 1 v prvním termínu dosahovaly naměřené hodnoty morfinu v makovině od 174,8 mg.kg-1 do 319,8 mg.kg-1, přičemž hodnoty ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1, S, Zn1 a Zn2 dosahovaly podobných hodnot v rozmezí od 306,7 – 319,8 mg.kg-1) (tab. 21). Hodnoty obsahů morfinu v rostlinách ze sublokality 2 byly výrazně odlišné. Minimální hranice obsahu byla sice srovnatelná (166,1 mg.kg-1) s hodnotami ze sublokality 1, ale tato dolní hranice byla zaznamenána ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1(tab. 22). Celkový rozsah hodnot dosahoval od zmíněných 166,1 mg.kg-1 po 256, 8 mg.kg-1 ve vzorcích bez zatížení těžkými kovy. V Hostěnicích na sublokalitě 1 byl v rostlinách máku v makovině naměřen nejvyšší obsah morfinu v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (281,4 mg.kg-1) a nejnižší hodnoty byly naproti tomu naměřeny v makovině rostlin bez dodatečného zatížení těžkými kovy (tab. 23). Na sublokalitě 2 byly naměřeny výrazně vyšší obsahy morfinu než v předešlých lokalitách (tab. 24). Toto bylo obzvláště významné v porovnání se sublokalitou 1 rovněž v Hostěnicích. Bližší statistická analýza je součástí kapitoly diskuse. Nejvyšších množství morfinu bylo dosaženo v rostlinách se zatížením zinkem variantě
Zn2, kde obsah morfinu byl průměrně 536,9 mg.kg-1. Nejnižší hodnota
260,8 mg.kg-1 byla stanovena ve vzorcích bez zatížení stresory. Tato minimální hodnota byla srovnatelná s některými maximálními naměřenými hodnotami v rostlinách z ostatních sublokalit. Vyšších hodnot dosáhly rovněž obsahy morfinu z rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (327,3 mg.kg-1). Ve
Mšeném-lázních
byly
rovněž
naměřeny
nadprůměrné
hodnoty
morfinu
-1
v makovině. Na sublokalitě 1 (tab. 25) byl největší obsah 403,0 mg.kg v rostlinách se zátěžovým faktorem s označením Cd2. Rovněž vysoký byl obsah morfinu v
75
rostlinách bez zatížení (378, 5 mg.kg-1). Nejnižší hodnota byla zjištěna v rostlinách zatížením Zn2, ve výši 279,8 mg.kg-1, což je rovněž nadprůměrná hodnota. Na sublokalitě 2 (tab. 26) byly naměřeny s výjimkou jednoho zatížení rovněž nadprůměrné hodnoty i přesto, že byly nižší, než na sublokalitě 1. Rozpětí hodnot se pohybovalo od 233,3 mg.kg-1, v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1, po 353,2 mg.kg-1 v rostlinách bez zatížení stresovými faktory. V tabulce 27 jsou uvedeny stanovené obsahy vybraných alkaloidů z pokusného pole Tab.
v Červeném Újezdě, kde byl založen pouze jeden maloparcelový pokus. Hodnoty zde naměřených obsahů morfinu dosahovaly od 189,5 mg.kg-1 ve vzorcích Zn2 po 295,9 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1.
6.1.1.3.2 Druhý termín odběru (vývojová fáze 79) V druhém termínu byl průměr obsahu morfinu všech zkoumaných vzorků 224,8 mg.kg-1 a dosahuje tak o 20 % nižších hodnot, než v prvním termínu. Rozsah hodnot se pohybuje mezi 109,8 mg.kg-1 v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 na sublokalitě 2 Bohušovice a nejvyšší hodnotou 329,4 mg.kg-1 , která byla zjištěna v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 ze sublokality 2 rovněž v Bohušovicích. V přehledu všech výsledků bylo na sublokalitě 1 v Bohušovicích dosaženo jednak celkově nejnižší hodnoty 109,8 mg.kg-1 v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2, ale i další vzorky vykazovaly výrazně podprůměrné hodnoty (tab. 28). Uvést je možné především obsah morfinu v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 (119,6 mg.kg-1), který byl i celkově druhou nejnižší naměřenou hodnotou v druhém termínu. Maximum bylo naměřeno v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (283,2 mg.kg-1). Zároveň byla tato stanovená hodnota jediná, která byla nadprůměrná ve vztahu k obsahu morfinu. V druhé sublokalitě v Bohušovicích byly zjištěné obsahy alkaloidů výrazně vyšší než v předešlé sublokalitě (tab. 29). Nejvyšších hodnot dosahovalo množství morfinu opět v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (329,4 mg.kg-1). Rostliny s ostatními zatíženími, případně bez zatížení vykazovaly obsahy morfinu na podobné úrovni v rozmezí 20 mg.kg-1, kdy nejnižší hodnotou byl obsah morfinu v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 (216,8 mg.kg-1). 76
V Hostěnicích byla na sublokalitě 1 v porovnání s ostatními hodnotami výrazně nižší množství morfinu v rostlinách máku bez dodatečného zatížení stresovými faktory zinkem a kadmiem (135,5 mg.kg-1). Ostatní hodnoty se pohybovaly v rozmezí od 211 do 255 mg.kg-1 s nejvyšší naměřenou hodnotou ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 (254,1 mg.kg-1) (tab. 30). Na sublokalitě 2 byl naproti tomu obsah morfinu v makovině rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 nejnižší (149,4 mg.kg-1). Nejvyšší obsah byl zjištěn v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1, který dosahoval 272,0 mg.kg-1 (tab. 31). Maximální hodnoty morfinu v rostlinách ze sublokality 1 ve Mšeném-lázních byly naměřeny ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (262,0 mg.kg-1) a tak stejně jako na sublokalitě 2 v Hostěnicích. Tato shoda byla rovněž potvrzena v minimu hodnot, kdy rostliny rovněž po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 obsahovaly na sublokalitě 1 ve Mšeném-lázních 192,6 mg.kg-1 (tab. 32). Naopak v rostlinách pěstovaných na sublokalitě 2 bylo stanoveno nejvyšší množství morfinu v prostředí, kde na rostliny byl aplikován roztok s vyšším obsahem Zn (Zn2 323,6 mg.kg-1) a nejnižší množství morfinu bylo stanoveno v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (146,8 mg.kg-1) (tab. 33). V Červeném Újezdě byl nejnižší obsah morfinu v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (186,1 mg.kg-1) a naopak nejvyšší ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 (288,2 mg.kg-1) (tab. 34).
6.1.1.4 Kodein 6.1.1.4.1 První termín odběru (vývojová fáze 65) Průměrný obsah kodeinu ve vzorcích ze všech lokalit v prvním termínu byl 223,4 mg.kg-1 s rozmezím hodnot, které se pohybovaly od minima 85,6 mg.kg-1 ve vzorcích Zn1 na sublokalitě 1 v Bohušovicích, po maximální hodnotu, která byla naměřena v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 ve Mšeném-lázních na sublokalitě 2 (395,7 mg.kg-1). Obsah kodeinu v Bohušovicích na sublokalitě 1 byl ve všech případech podprůměrný (tab. 21). Na této sublokalitě bylo rovněž stanoveno absolutní minimum obsahu kodeinu v prvním termínu odběru, a sice 85,6 mg.kg-1 ve vzorcích Zn1. Maximální
77
hodnota byla zjištěna v rostlinách ze skupiny Cd1 (119,7 mg.kg-1). I tato hodnota je však výrazně podprůměrná. Na sublokalitě 2 byly naměřené hodnoty výrazně odlišné od hodnot ze sublokality 1 (tab. 22). Obsahy zde byly průměrné, či dokonce nadprůměrné. Minimální obsahy byly naměřeny v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 (211,8 mg.kg-1) a maximální hodnoty v rostlinách bez dodatečného zatížení stresovými faktory (293,3 mg.kg-1). V rostlinách z Hostěnic a sublokality 1 byly naměřeny převážně mírně podprůměrné hodnoty (tab. 23). Opět zde byla jediná výjimka, která udává maximální hodnotu, a sice obsah kodeinu v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2. Minimální hodnota se vyskytovala v rostlinách bez zatížení (167,0 mg.kg-1). Obsahy alkaloidů v rostlinách ze sublokality 2 v Hostěnicích byla srovnatelná s množstvím kodeinu jako v předešlém případě (tab. 24). Rozsah hodnot zde však byl ještě menší. Minimální obsah se zde vyskytoval v souboru rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 (181,4 mg.kg-1) a maximální obsah kodeinu byl zjištěn shodně ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 a Zn2 (210,7 mg.kg-1). Rostliny
ve
Mšeném-lázních
obsahovaly
na
obou
sublokalitách
zpravidla
nadprůměrné množství kodeinu (tab. 25). Podprůměrné množství bylo zjištěno pouze v jediném souboru po aplikaci roztoku o koncentraci
Zn2 (180,5 mg.kg-1) na
sublokalitě 1. Maximem zde byla hodnota 319,7 mg.kg-1 v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1. V rostlinách ze sublokality 2 dosahovaly celkové obsahy kodeinu ještě vyšších hodnot s minimem 265,7 mg.kg-1
ve vzorcích rostlin po -1
aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 a maximem 395,8 mg.kg ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 (tab. 26). V Červeném Újezdě dosahovaly obsahy nižších hodnot, kdy nadprůměrná byla pro tuto sublokalitu pouze varianta bez dodatečného zatížení (241,9 mg.kg-1). Minimální množství kodeinu bylo ve variantě po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 (tab. 27).
6.1.1.4.2 Druhý termín odběru (vývojová fáze 79) Průměrný obsah kodeinu v rostlinách máku z polních pokusů v druhém termínu byl nižší, v porovnání s termínem předešlým. Dosahoval pouze hodnoty 185,3 mg.kg-1. Maximální množství kodeinu v makovině bylo v souboru rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 v druhé sublokalitě ve Mšeném-lázních (299,3 mg.kg-1) a nejnižší 78
obsah v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 ze sublokality 1 v Bohušovicích (72,7 mg.kg-1). Nejnižší množství na sublokalitě 1 v Bohušovicích tak bylo naměřeno v souboru rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2. Ovšem i další hodnoty z této sublokality byly podprůměrné. Celkem tři varianty měly obsah kodeinu nižší než 100 mg.kg-1. Maximální obsah kodeinu byl opět podprůměrný a dosahoval hodnoty 134,5 mg.kg-1 ve srovnávací variantě bez dodatečného zatížení S (tab. 28). Obsahy ze sublokality 2 v Bohušovicích dosahovaly výrazně vyšších hodnot, ale i tak v celku dosahovaly spíše průměru (tab. 29). Minimální obsah byl zjištěn v rostlinách bez zatížení (145,9 mg.kg-1), což je tedy opakem rozložení v předešlé sublokalitě a maximální obsah pro zatížení Zn2 (225,8 mg.kg-1). V Hostěnicích byla většina zjištěných obsahů kodeinu nad průměrem celkového souboru rostlin v druhém termínu (tab. 30). Jedinou výjimku tvoří obsah kodeinu v souboru rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 131,8 mg.kg-1, který tak zároveň byl minimálním obsahem na této sublokalitě. Maximální hodnota byla 273,4 mg.kg-1 v souboru rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2. Obsahy kodeinu v rostlinách ze sublokality 2 se pohybovaly kolem průměru celého souboru (tab. 31). Minimum dosahoval na rozdíl od sublokality 1 soubor rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 a maximum kodeinu bylo zjištěno ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2. Obsahy kodeinu v souboru rostlin na sublokalitě 1 ve Mšeném-lázních byly průměrné až nadprůměrné s minimem ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 (167,5 mg.kg-1) a maximem (258,5 mg.kg-1) ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (tab. 32). Hodnoty v rostlinách ze sublokality 2 pak byly shodně výrazně nadprůměrné, kdy minimální množství kodeinu bylo zjištěno ve variantě Cd1 (225,3 mg.kg-1) a maximální množství ve variantě Zn2 (299,3 mg.kg-1), což jak již bylo zmíněno, byla i maximální hodnota celého souboru rostlin v druhém termínu (tab. 33). Obsah kodeinu v rostlinách z Červeného Újezdu byl mírně podprůměrný (tab. 34). Nejnižší
obsah
byl
ve
variantě
bez
dodatečného
zatížení
těžkými
(128,9 mg.kg-1) a nejvyšší obsah byl zjištěn ve variantě Cd1 (161,0 mg.kg-1).
79
kovy
6.1.1.5 Narkotin 6.1.1.5.1 První termín odběru (vývojová fáze 65) Obsahy narkotinu v jednotlivých vzorcích jsou výrazně nižší, než obsahy morfinu a kodeinu. Průměrná hodnota obsahu narkotinu v prvním termínu byla ze souboru všech rostlin 31,37 mg.kg-1. Nejvyšší hodnoty byly naměřeny v Hostěnicích na sublokalitě 1 ve variantě Zn1 (76,82 mg.kg-1) a nejnižší shodně s minimem kodeinu na sublokalitě 1 v Bohušovicích ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 (7,53 mg.kg-1). I ostatní varianty na sublokalitě 1 vykazovaly nízké hodnoty, které byly všechny výrazně podprůměrné s maximem ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 při 16,50 mg.kg-1. Maximální obsah narkotinu na této sublokalitě byl téměř poloviční oproti celkovému průměru (tab. 21). Podobně nízké hodnoty byly zjištěny i ve vzorcích rostlin ze sublokality 2 (tab. 22). Minimální hodnota byla prakticky shodně nízká (8,10 mg.kg-1), s rozdílem, že na této sublokalitě bylo minima dosaženo ve variantě Cd2. Maximální hodnota byla rovněž podprůměrná, když dosahovala pouze 19,04 mg.kg-1 ve variantě Zn2, tedy ve shodě se sublokalitou 1. V rostlinách ze sublokality 1 v Hostěnicích byly zjištěny průměrné až výrazně nadprůměrné hodnoty (tab. 23). Minimální hodnoty narkotinu byly zjištěny ve variantě Cd2, ale varianty bez zatížení a Zn2 jsou od této v rozsahu pouhých 2,2 mg.kg-1. Maximální hodnota, která byla výrazně vyšší než uvedené zbylé obsahy, byla ve variantě Zn1, kde dosahovala 76,82 mg.kg-1. Na sublokalitě 2 byly hodnoty prakticky rovnoměrně rozloženy od minima 18,49 mg.kg-1 ve variantě bez zatížení, až po 73,07 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2. Zjištěné obsahy tak byly ve velikém rozsahu (tab. 24). Obsahy narkotinu v rostlinách z první sublokality ve Mšeném-lázních se pohybovaly kolem průměru celkového souboru (tab. 25). Prakticky shodné byly vzorky s minimálním obsahem Zn1 (26,70 mg.kg-1) a Zn2 (26,71 mg.kg-1), dále se pak kolem průměru pohybovaly obsahy vzorků se zatížením Cd2 (33,13 mg.kg-1) a S (33,32 mg.kg-1). Maximum tvořil obsah narkotinu ve variantě Cd1 dosahující 45,94 mg.kg-1.
80
V Červeném Újezdě obsahovaly analyzované rostliny ve většině případů průměrné hodnoty narkotinu (tab. 27). Pouze minimum ve variantě Zn1 (15,63 mg.kg-1) a maximum v Cd2 (42,18 mg.kg-1) se od průměru výrazněji odchylovaly.
6.1.1.5.2 Druhý termín odběru (vývojová fáze 79) Průměrný obsah narkotinu v makovině celého souboru rostlin z polních pokusů v druhém termínu byl výrazně nižší, než tomu bylo v prvním termínu a dosahuje 19,95 mg.kg-1. Nejnižší obsah byl opět ve variantě Zn1. Nízké obsahy narkotinu v makovině ve variantě Zn1 byly stanoveny především na sublokalitě 2 (2,40 mg.kg-1) a sublokalitě 1 (2,76 mg.kg-1) v Bohušovicích. Maximální množství narkotinu bylo naměřeno v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Zn1 ze sublokality 2 v Hostěnicích (59,65 mg.kg-1). V Bohušovicích byla naměřená množství narkotinu shodně nižší oproti celkovému průměru se zmíněným minimem ve variantě Zn1 (2,76 mg.kg-1). I v ostatních variantách byl zjištěný obsah narkotinu pod průměrem s maximem ve variantě Zn2 (11,50 mg.kg-1) (tab. 28). Na sublokalitě 2 se nacházelo celkové minimum, a to v již dříve zmíněné varianty Zn1 (2,40 mg.kg-1). Rovněž na této sublokalitě nedosáhl maximální obsah narkotinu, který byl ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy, hodnoty průměrného obsahu narkotinu v souboru všech vzorků (tab. 29). Všechny zjištěné obsahy narkotinu z rostlin ze sublokality 1 v Hostěnicích byly nadprůměrné (tab. 30). Nejnižší hodnota, která byla zjištěna ve variantě Cd1, překračovala průměr pouze minimálně (20,32 mg.kg-1). Maximální hodnota ve variantě bez dodatečného zatížení (50,00 mg.kg-1) pak převyšovala průměr výrazně. Výsledky ze sublokality 2 potvrdily vysoké obsahy narkotinu z druhého termínu sklizně v Hostěnicích (tab. 31). Jedinou výjimkou byla minimální hodnota tohoto souboru zjištěná ve variantě Cd2 (15,65 mg.kg-1). V tomto souboru se nacházelo i již dříve zmíněné maximum celého souboru, a to ve variantě Zn1 (59,65 mg.kg-1). Obsahy narkotinu v rostlinách ze sublokality 1 ve Mšeném-lázních se pohyboval kolem průměrných hodnot pro celý soubor (tab. 32). Výrazněji se vychylovaly pouze minimum s hodnotou 8,26 mg.kg-1 ve variantě Zn2 a maximum s hodnotou 28,23 mg.kg-1 ve variantě Cd2. Podobných výsledků, ovšem ještě těsněji rozložených kolem průměru celkového souboru, bylo dosaženo v rostlinách ze sublokality 2 (tab. 81
33). Minimum bylo mírně vyšší, než v předešlé sublokalitě a dosahovalo 16,85 mg.kg-1 ve variantě bez zatížení těžkými kovy. Obsah narkotinu ve variantě Zn2, pro kterou byl minimální v předešlém souboru sublokality 1, byl na sublokalitě 2 rovněž nízký (17,56 mg.kg-1). Maximální obsah narkotinu byl stanoven v rostlinách z varianty Zn1 (25,71 mg.kg-1). Zjištěné hodnoty narkotinu v makovině rostlin pěstovaných v Červeném Újezdě byly rovněž podprůměrné (tab. 34). Nevyskytovaly se zde však extrémně nízké obsahy, jako tomu bylo na předešlých dvou sublokalitách. Minimální obsah narkotinu byl naměřen ve variantě Cd2 (11,58 mg.kg-1) a maximum bylo zjištěno opět ve variantě Zn2 (17,75 mg.kg-1).
6.1.1.6 Papaverin Průměrný obsah papaverinu, který byl naměřen v souboru všech rostlin, byl více než stokrát, v druhém termínu dokonce téměř dvěstěkrát nižší, než průměrný obsah morfinu v tomto souboru. Při interpretaci výsledků je zde nutné přihlédnout k extrémním hodnotám a četným obsahům pod mezí stanovitelnosti, které výrazně ovlivňují průměrné obsahy v jednotlivých variantách. Dále prezentované výsledky je tak nutné uvažovat s tímto omezením. Průměrný obsah papaverinu byl v souboru všech vzorků 2,43 mg.kg-1. Relativně vysoký obsah byl dán několika jednotlivými vzorky, v kterých obsahy více než stonásobně přesahovaly obsahy naměřené v ostatních vzorcích. Například obsah papaverinu v druhém opakování varianty Cd1 v Červeném Újezdu byl 43,98 mg.kg-1. Díky tomuto vysokému obsahu byl průměrný obsah varianty 14,75 mg.kg-1, což bylo maximum z celého souboru. Naměřené hodnoty v dalších dvou opakováních s touto hodnotou však ostře kontrastovaly a dosahovaly pouhých 0,09 mg.kg-1 a 0,20 mg.kg-1. Minimální hodnoty byly zjištěny ve variantě Zn2 v Bohušovicích na sublokalitě 2 (0,13 mg.kg-1). Popsaný problém je patrný z následujícího grafického znázornění (obr. 21 a obr. 22). Naprostá většina vzorků obsahovala méně než 1 mg.kg-1 papaverinu v rostlinném materiálu.
82
Obr. 21:: Rozložení obsahů papaverinu ve vzorcích z prvního termínu v mg.kg-1
Obr. 22:: Rozložení obsahů obsah papaverinu ve vzorcích z druhého termínu v mg.kg-1
Při vyloučení 10 % extrémních hodnot, tedy kolem minima i maxima rovnoměrně, rovnom pak by průměrný rný obsah papaverinu v celém souboru klesl na 1,53 mg.kg-1 a při vyloučení 20 % vzorků ů dle stejného s pravidla průměrr klesl dokonce na 1,09 1,0 mg.kg-1. I toto tedy vypovídá o nerovnoměrnosti nerovnom rnosti rozložení hodnot obsahů obsah papaverinu v celkovém souboru. Z tohoto důvodu d budou v následujícím přehledu řehledu průkaznější pr data minimálních, než maximálních obsahů obsah papaverinu. V druhém termínu nastal stejný jev výskytu extrémních hodnot, který byl popsán i v případě prvního termínu. Průměrný Pr rný obsah papaverinu zde byl 1,34 mg.kg-1. Tato hodnota je tedy téměř ěř poloviční polovi v porovnání s průměrnou ěrnou hodnotou obsahů obsah papaverinu z prvního o termínu. Na tuto hodnotu však mohou mít vliv extrémní hodnoty. Proto byla provedena stejná analýza odstranění odstran ní extrémních hodnot. Při P odstranění 10 % extrémů byl průměr obsahů papaverinu ve zbylých vzorcích vzor rostlin 0,83 mg.kg-1 a přii odstranění odstraně 20 % extrémů dokonce 0,67 mg.kg-1 . I tyto hodnoty
jsou tak výrazně nižší než průměrný prů obsah papaverinu z prvního termínu bez 10 a 20 % extrémů.. Minimální obsah papaverinu v celém souboru vzorků z druhého termínu odběru byl ve variantě Zn2 ze sublokality 1 v Bohušovicích vicích (0,13 mg.kg-1) se směrodatnou rodatnou odchylkou 0,06 mg.kg-1. Maximum bylo naměřeno ěřeno rovněž rovn ve variantě Zn2, tentokrát však v rostlinách z Červeného Újezdu. Směrodatná ěrodatná odchylka byla v tomto obsahu 7,03 mg.kg-1. Z tohoto důvodu vodu byl zvolen pro vyhodnocení obsahů obs papaverinu v makovině makovin medián. Mediánem obsahů papaverinu v prvním termínu odběru je 0,29 mg.kg-1 a mediánem v druhém termínu 0,42 mg.kg-1. Hodnoty mediánů jednotlivých variant jsou uvedeny v tabulce 68 pro první termín odběru odb a v tabulce 69 pro termín druhý. Oproti hodnotám tab.
Tab.
83
průměrů byla hodnota mediánu obsahu papaverinu v druhém termínu odběru vyšší, než hodnota mediánu z prvního termínu. 6.1.1.7 Thebain 6.1.1.7.1 První termín odběru (vývojová fáze 65) Průměrný obsah thebainu v prvním termínu byl 29,05 mg.kg-1. Podstatné je uvést, že i přes poměrně vysoké naměřené hodnoty thebainu některých vzorků, vyskytovalo se v souboru i veliké množství vzorků, které byly pod mezí detekce. Podrobný přehled těchto nedefinovaných vzorků je v předešlých tabulkách. Minimální naměřený obsah thebainu byl ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy na sublokalitě 2 v Hostěnicích (2,22 mg.kg-1). Zde však byl definován pouze jediný vzorek. Maximální naměřené množství thebainu pak bylo zjištěno ve variantě Cd2 na sublokalitě 2 v Bohušovicích (76,97 mg.kg-1). 6.1.1.7.2 Druhý termín odběru (vývojová fáze 79) V druhém termínu došlo k výraznému poklesu průměrného obsahu thebainu v rostlinách máku, když dosahoval poloviční hodnoty průměru z prvního termínu (14,56 mg.kg-1). Shodně s prvním termínem však bylo veliké množství vzorků pod mezí detekce. Ve variantách Zn1 na sublokalitě 2 ve Mšeném-lázních a ve variantě Zn1 v Bohušovicích na sublokalitě 1 tak například nebylo možné definovat obsahy thebainu ani v jednom opakování. Minimální hodnota obsahu thebainu byla tentokrát ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy na sublokalitě 2 ve Mšenémlázních (0,04 mg.kg-1). Ovšem i zde se tato hodnota zakládala pouze na obsahu thebainu z jediného opakování. Maximální hodnota byla naměřena ve variantě Cd1 v Bohušovicích na sublokalitě 2, kde byl obsah thebainu 65,15 mg.kg-1. Z tohoto důvodu byl pro hodnocení, stejně jako v případě hodnocení papaverinu, medián, který omezí vliv extrémních hodnot. Medián obsahů thebainu v makovině v prvním termínu odběru 17,18 mg.kg-1. V druhém termínu odběru hodnota mediánu klesla na 10,41 mg.kg-1.
84
6.1.2 Obsah kadmia a zinku v rostlinách z polních pokusů 6.1.2.1 První termín odběru (vývojová ojová fáze 65) 6.1.2.1.1 Bohušovice Tab. 36: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 35: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
2,3 1,5
1,90
0,40
1,5 2,3
σ
2,1 2,3
2,10
0,10
1,9 2,1
σ
1,8
1,2
1,70
0,25
1,8 2,0
σ
1,9 2,0
1,50
0,45
1,4 0,7
2,0 1,4 1,9 1,9
σ 1,80
0,20
17,3 21,5 28,7 35,3 17,5 18,3 21,6 21,4 27,1 29,5 35,4 35,5 34,1 35,6 10,4 14,5 35,0 14,1 30,7 30,0
-1
-1
mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 25,70
6,30
σ 19,70
1,80
σ 31,88
3,58
σ 23,65
11,20
σ 27,45
6,68
85
2,0 1,4
σ 1,60
0,20
1,4 1,6
σ
1,4 1,5
1,90
0,65
1,5 3,2
σ
2,4 1,8
1,80
0,30
1,2 1,8
σ
1,6 1,4
1,50
0,05
1,5 1,5
σ
1,7
1,1 1,3 1,5
1,40
0,20
15,9 17,6 19,5 24,2 14,9 17,6 18,0 17,5 18,6 18,8 21,9 29,3 27,9 14,3 14,9 20,8 16,3 14,1 16,1 30,2
σ 19,30
2,55
σ 17,00
1,05
σ 22,15
3,58
σ 19,48
4,88
σ 19,18
5,51
6.1.2.1.2 Hostěnice Tab. 38: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 37: Obsah kadmia a zinku v makovině ě (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
1,4 1,6
1,55
0,08
1,6 1,6
σ
1,3 1,4
1,45
0,10
1,6
1,5 σ
1,6 1,7
1,73
0,08
1,8 1,8
σ
1,1 1,4
1,20
0,20
0,9
1,4 σ
1,4 1,9 1,1
1,5
1,48
0,23
8,5 13,8 11,1 40,3 16,3 14,8 21,9 12,1 11,6 17,7 8,6 12,8 8,5 12,0 12,6 16,3 9,8 11,9 14,3 12,3
-1
mg.kg
-1
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 18,43
10,94
σ 16,28
2,83
σ 12,68
2,58
σ 12,35
2,10
σ 12,08
1,23
86
σ
1,6 1,4
1,40
0,10
1,4 1,2
σ
1,7 1,7
1,78
0,08
1,8 1,9
σ
1,6 1,7
1,45
0,20
1,3 1,2
σ
1,5 1,3
1,48
0,18
1,3 1,8
σ
1,6 1,6 1,5 1,4
1,53
0,08
11,8 14,0 14,4 13,3 11,1 17,5 21,4 31,8 7,5 11,8 7,8 9,4 12,0 16,4 15,2 11,5 13,2 11,5 8,6 11,3
σ 13,38
0,83
σ 20,45
6,15
σ 9,13
1,48
σ 13,78
2,03
σ 11,15
1,28
6.1.2.1.3 Mšené-lázně Tab. 40: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 39: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
2,2
1,4
1,60
0,30
1,5 1,3
1,4 1,4
σ 1,45
0,23
1,1 1,9
1,8 1,9
σ 1,75
0,13
1,8 1,5
σ
1,5 1,5
1,55
0,08
1,5 1,7
σ
1,4 0,9 1,5 1,6
1,35
0,23
10,9 12,5 25,9 9,5 11,5 13,2 9,2 14,8 21,3 14,3 9,1 9,9 11,6 12,0 14,3 11,9 9,0 9,8 11,3 10,9
-1
-1
mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 14,70
5,60
σ 12,18
1,83
σ 13,65
4,15
σ 12,45
0,93
σ 10,25
0,85
87
σ
1,8
1,4
1,60
0,15
1,5 1,7
σ
1,4
1,6 1,5
1,63
0,19
2,0
σ
1,6 1,3
1,53
0,18
1,4 1,8
σ
1,6 1,4
1,43
0,13
1,2 1,5
σ
1,4 1,7 1,6 1,2
1,48
0,18
11,7 10,8 8,1 9,6 11,6 10,0 9,0 10,2 12,0 10,8 26,4 15,1 8,9 8,4 10,0 7,2 9,1 9,9 10,3 11,0
σ 10,05
1,20
σ 10,20
0,70
σ 16,08
5,16
σ 8,63
0,83
σ 10,08
0,58
6.1.2.1.4 Červený Újezd
Tab. 41:: Obsah kadmia a zinku v makovině Zatížení Cd
Zn
mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
2,1 1,6
1,83
0,23
2,0 1,6
σ
2,2 2,1
2,05
0,13
1,8 2,1
σ
1,5 1,3
1,43
0,08
1,4 1,5
σ
1,2 1,3
1,45
0,20
1,7 1,6
σ
1,4 1,5
1,48
0,13
1,7 1,3
-1
15,2 24,5 22,3 16,2 18,0 22,5 15,3 16,4 20,8 25,0 23,7 17,3 18,9 16,8 24,5 17,9 17,1 18,5 17,8 18,9
σ 19,55
3,85
σ 18,05
2,23
σ 21,70
2,65
σ 19,53
2,49
σ 18,08
0,62
Průměrná naměřená ená hodnota obsahu zinku z prvního termínu byla 16,58 mg.kg-1 s maximem ve variantě bez dodatečného dodate zatížení těžkými žkými kovy S (31,88 (31,8 mg.kg-1) na sublokalitě 1 v Bohušovicích a minimem ve variantě Zn1 na sublokalitě sublokalit 2 ve Mšeném-lázních. Maximální naměřený ený obsah kadmia v rostlinách ze sublokality 1 v Bohušovicích byl ve variantě Cd2 (2,10 mg.kg-1). Tato hodnota byla i maximálním obsahem ze všech sledovaných variant.
Minimální hodnota kadmia byla naproti tomu zjištěna zjišt ve
variantě Zn1 (1,5 mg.kg-1) (tab. ( 35). Maximální hodnota obsahu zinku byla naměřena ve variantě S bez dodatečného dodate zatížení těžkými žkými kovy (31,88 (31,8 mg.kg-1). I ostatní obsahy zinku ve variantách pěstovaných stovaných na této sublokalitě sublokalit byly nadprůměrné. rné. Druhou nejvyšší hodnotou pak
88
byl obsah ve variantě Zn2 (27,45 mg.kg-1).
Minimum bylo tvořeno obsahem ve
variantě Cd2 (19,70 mg.kg-1). Na sublokalitě 2 byl maximální obsah kadmia naměřen opět ve variantě Cd2 i přesto, že byl o 0,2 mg.kg-1 nižší než v předešlé sublokalitě a dosahoval tak 1,90 mg.kg-1. Minimální obsah kadmia byl naproti tomu ve variantě Zn2. Nejvyšší obsahy zinku byly naměřeny opět ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (22,15 mg.kg-1). I zbývající naměřené hodnoty však přesahovaly průměrný obsah zinku v rostlinném materiálu z celého souboru. Minimem zde byla hodnota 17,0 mg.kg-1 ve variantě Cd2 (tab. 36). Obsah kadmia na sublokalitě 1 v Hostěnicích dosahoval maxima ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (1,73 mg.kg-1). Jednalo se zároveň o jedinou nadprůměrnou hodnotu na této sublokalitě (tab. 37). Minimum bylo shodné s minimem celého souboru rostlin sebraných v prvním termínu, a sice 1,20 mg.kg-1 ve variantě Zn1. Nízkých hodnot dosahuje překvapivě i varianta Cd2 (1,45 mg.kg-1) a opakovaně pak varianta Zn2 (1,48 mg.kg-1). Zinek se v maximálním obsahu nacházel ve vzorcích rostlin z varianty Cd1 (18,43 mg.kg-1). Průměrná byla dále hodnota ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 (16,28 mg.kg-1). Zbylé varianty se pohybovaly v úzkém intervalu od 12,65 mg.kg-1 ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy po minimum 12,08 mg.kg-1 ve variantě Zn2. Na druhé sublokalitě byly maximální obsahy zjištěny ve variantě Cd2 (1,78 mg.kg-1). Zbylé varianty byly mírně podprůměrné s minimem ve variantě Cd1 (1,40 mg.kg-1). Zinek byl na této sublokalitě v maximu ve variantě Cd2 (20,45 mg.kg-1. Zbylé hodnoty byly podprůměrné s výrazným minimem ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy S (9,13 mg.kg-1) (tab. 38). Ve Mšeném-lázních bylo na sublokalitě 1 naměřeno minimum obsahu kadmia ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (1,75 mg.kg-1). Vysoké hodnoty vykazovala dále varianta Cd1 (1,60 mg.kg-1). Naproti tomu bylo minimum ve variantě Zn2 (1,35 mg.kg-1). Zinek se vyskytoval s maximálním obsahem ve variantě Cd1 (17,70 mg.kg-1) a minimem ve variantě Zn2 (10,25 mg.kg-1). Obsahy zinku tak byly ve všech variantách shodně podprůměrné (tab. 39).
89
Na sublokalitě 2 odpovídala pořadí množství dodaného kadmia a pořadí množství obsahu kadmia v makovině, když byly dva nejvyšší obsahy nalezeny ve variantách Cd1 (1,60 mg.kg-1) a Cd2 (1,63 mg.kg-1) (tab. 40). Minimální obsah kadmia byl zaznamenán ve variantě Zn1 (1,43 mg.kg-1). Zinek se v největší míře nacházel ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (16,08 mg.kg-1 s tím, že tento obsah byl jediný, který přesahoval průměrnou hladinu celého souboru. Tři varianty vykazovaly hodnoty kolem 10 mg.kg-1 (Cd1, Zn2 a Cd2) a minimum bylo i celkovým minimem souboru (8,63 ve variantě Zn1). V Červeném Újezdu byly obsahy kadmia ve dvou případech nadprůměrné a ve třech podprůměrné, a to ve velice malém rozsahu (tab. 41). Maximum se nacházelo ve variantě Cd2 (2,05 mg.kg-1) a minimum ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (1,43 mg.kg-1). Již zmíněné dvě varianty obsahovaly podobně nízké obsahy kadmia, a sice varianta Zn1 (1,450 mg.kg-1) a Zn2 (1,48 mg.kg-1). Obsah zinku byl opět maximální ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (21,70 mg.kg-1) a minimem obsah zinku ve variantě Cd2 (18,05 mg.kg-1) prakticky shodné hodnoty ale dosahovala i varianta Zn2 (18,08 mg.kg-1), která by teoreticky měla vykazovat nejvyšší obsahy tohoto prvku. Na hodnotě minima lze i pozorovat, že všechny obsahy zinku v rostlinách v Červeném Újezdě byly nadprůměrné, ale bez výraznějších extrémních hodnot.
90
6.1.2.2 Druhý termín odběru ru (vývojová fáze 79) 6.1.2.2.1 Bohušovice Tab. 43: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 42: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
1,3 1,7
1,85
0,35
2,1 2,3
σ
3,0 2,2
2,40
0,35
2,5 1,9
σ
1,7 1,5
1,78
0,21
2,2 1,7
σ
1,9
1,7
1,78
0,08
1,7 1,8
1,8 2,2 1,9 2,0
σ 1,98
0,13
mg.kg
-1
20,5 22,5 37,5 30,0 40,7 28,9 33,7 28,3 24,2 25,3 37,9 38,9 40,9 40,4 34,1 40,7 39,8 38,3 25,1 29,8
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 27,63
6,13
σ 32,90
4,30
σ 31,58
6,83
σ 39,03
2,46
σ 33,25
5,80
91
σ
1,9 1,8
1,73
0,16
1,8 1,4
σ
1,5
1,7 2,5
1,93
0,33
2,0
σ
1,3 1,4
1,33
0,08
1,4 1,2
σ
1,3 1,2
1,20
0,05
1,2 1,1
σ
1,3 1,3 1,3 1,1
1,25
0,08
-1
26,9 21,2 23,4 17,7 25,1 37,6 27,2 22,5 16,6 22,9 27,5 18,7 30,0 15,2 24,3 27,9 38,3 23,2 26,8 10,5
σ 22,30
2,85
σ 28,10
4,75
σ 21,43
3,78
σ 24,35
4,60
σ 24,70
7,85
6.1.2.2.2 Hostěnice Tab. 45: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 44: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
1,3 1,2
1,38
0,13
1,5 1,5
1,4 1,5
σ 1,48
0,08
1,6 1,4
σ
1,3 1,2
1,43
0,19
1,4 1,8
σ
1,3 1,4
1,33
0,04
1,3 1,3
1,3 1,7 2,5 1,5
σ 1,75
0,38
-1
10,1 15,2 11,8 13,2 13,4 9,7 9,3 10,9 12,1 10,2 15,0 10,3 7,7 11,4 14,0 14,3 11,5 13,6 12,4 20,1
mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 12,58
1,63
σ 10,83
1,33
σ 11,90
1,65
σ 11,85
2,30
σ 14,40
2,85
92
σ
1,5 1,3
1,73
0,39
1,6 2,5
σ
1,5 1,5
1,55
0,13
1,4 1,8
σ
1,5 1,4
1,38
0,08
1,3 1,3
σ
1,3 1,2
1,38
0,16
1,7 1,3
σ
1,0 1,5 1,2
1,1
1,20
0,15
-1
9,0 9,5 11,2 27,9 16,1 17,6 17,0 22,7 13,6 11,1 8,0 15,8 12,1 13,7 16,1 22,7 12,0 19,0 11,9 25,8
σ 14,40
6,75
σ 18,35
2,18
σ 12,13
2,58
σ 16,15
3,28
σ 17,18
5,23
6.1.2.2.3 Mšené-lázně Tab. 47: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 2) Zatížení Zn Cd
Tab. 46: Obsah kadmia a zinku v makovině (sublokalita 1) Zatížení Zn Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
1,9 1,5
1,50
0,20
1,1
1,5 σ
1,7 2,0
1,50
0,35
1,3 1,0
σ
1,4 1,5
1,40
0,05
1,4
1,3 σ
1,9 1,7
1,55
0,25
1,3 1,3
σ
1,5 1,4 1,7 1,4
1,50
0,10
-1
18,2 13,1 11,1 28,9 18,0 33,5 8,1 13,5 12,9 11,9 14,8 12,6 18,7 17,2 26,9 12,8 19,8 18,5 20,6 13,5
mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ 17,83
5,73
σ 18,28
7,61
σ 13,05
0,88
σ 18,90
4,00
σ 18,10
2,30
93
σ
1,6 1,5
1,53
0,08
1,6 1,4
σ
1,5 1,5
1,43
0,11
1,2 1,5
σ
1,4
1,2 1,2
1,35
0,15
1,6
σ
2,3
1,7
1,68
0,33
1,3 1,4
σ
1,4 1,2 1,1 1,4
1,28
0,13
-1
12,7 13,9 14,3 10,8 14,0 10,6 26,5 12,5 13,1 15,9 14,7 9,4 19,3 12,0 11,6 9,9 13,6 11,3 22,6 10,6
σ 12,93
1,18
σ 15,90
5,30
σ 13,28
2,03
σ 13,20
3,05
σ 14,53
4,04
6.1.2.2.4 Červený Újezd Tab. 48:: Obsah kadmia a zinku v makovině Zatížení Cd mg.kg
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
σ
1,9 1,1
1,63
0,26
1,8 1,7
σ
2,5 2,1
2,25
0,15
2,3 2,1
σ
1,5 1,1
1,28
0,13
1,2 1,3
σ
1,6 1,3
1,55
0,15
1,5 1,8
σ
1,7 1,6 1,4 1,5
1,55
0,10
V druhém
Zn
-1
termínu
byla
23,5 18,6 0,0 15,4 18,2 15,9 20,0 17,4 21,9 15,2 9,0 24,7 24,7 23,4 29,7 20,9 26,0 21,8 20,7 16,4
σ 14,38
7,19
pr průměrná
hodnota
obsahu
kadmia
prakticky
totožná s hodnotou v σ 17,88
1,23
prvním
termínu
dosa dosahovala
a jen
mírně nižší hladiny σ 17,70
5,60
mg.kg-1.
1,56 Maximální
σ 24,68
2,53
σ 21,23
2,68
obsah
kadmia
byl
zaznamenán
ve
variant variantě
na
Cd2
sublokalit sublokalitě
1
v Bohušovicích
a
minimum shodně shodn ve variantách Zn2 na sublokalit sublokalitě
2
v Hostěnicích nicích a Zn1 na sublokalitě sublokalit 2 v Bohušovicích. Pro zinek došlo k výraznějšímu navýšení průměru obsahů ů tohoto prvku v makovině oproti prvnímu termínu na 19,34 19,3 mg.kg-1. Maximální hodnota byla zaregistrována ve variantě Zn1 na sublokalitě sublokalit 1 v Bohušovicích (39,03 mg.kg-1) a minimum ve variantě Cd2 na sublokalitě sublokalit 1 v Hostěnicích (10,83 mg.kg-1). Maximum a minimum obou vzorků vzork tak byla zaznamenána na stejných lokalitách a sublokalitách. Při pohledu na průměrné ů ěrné rné obsahy kadmia jednotlivých variant byly potvrzeny maximální obsahy ve variantách Cd1 a Cd2 dle následujícího přehledu: S (1,418 mg.kg-1), Zn1 (1,49 mg.kg-1), Zn2 (1,50 mg.kg-1), Cd1 (1,62 mg.kg-1) a Cd2 (1,79 mg.kg-1). Pro zinekk došlo ke změně zm rozložení, kdy obě zinkové varianty obsahovaly také nejvyšší obsahy tohoto prvku, pouze v opačném pořadí adí dle přehledu: př S (17,29
94
mg.kg-1), Cd1 (17,43 mg.kg-1), Cd2 (20,32 mg.kg-1), Zn2 (20,48 mg.kg-1) a Zn1 (21,16 mg.kg-1). V jednotlivých sublokalitách pak bylo již zmíněné maximum obsahu kadmia na sublokalitě 1 v Bohušovicích (2,40 mg.kg-1) a minimum shodně ve variantách bez dodatečného zatížení těžkými kovy a Zn1 (1,78 mg.kg-1). Všechny naměřené hodnoty tak byly výrazně nadprůměrné (tab. 42). I obsahy zinku byly shodně nadprůměrné. Jednak se zde nacházelo již zmíněné maximum celého souboru (39,03 mg.kg-1 ve variantě Zn1), ale i další hodnoty byly vysoké, což potvrzuje i hodnota minima 27,63 mg.kg-1 ve variantě Cd1. Zbylé varianty shodně přesahovaly hranici 30 mg.kg-1. Na sublokalitě 2 byly obsahy kadmia nadprůměrné pouze ve dvou variantách a sice Cd1 (1,73 mg.kg-1) a Cd2 (1,93 mg.kg-1). Nízké obsahy kadmia byly naopak registrovány ve variantách Zn2 (1,25 mg.kg-1) a Zn1 (1,20 mg.kg-1). Pro zinek bylo maximum registrováno ve variantě Cd2 (28,10 mg.kg-1) a minimum ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (21,43 mg.kg-1) (tab. 43). V Hostěnicích na sublokalitě 1 byly s výjimkou maxima ve variantě Zn2 (1,75 mg.kg1
) všechny ostatní obsahy kadmia jednotlivých variant podprůměrné (tab. 44).
Minimum se nacházelo ve variantě Zn1 (1,33 mg.kg-1), ale i varianta Cd1 obsahovala překvapivě nízké obsahy kadmia (1,38 mg.kg-1). Všechny naměřené hodnoty obsahů zinku byly výrazně podprůměrné, což udává i hodnota maxima, která byla registrována ve variantě Zn2 (14,40 mg.kg-1). Minimum obsahu zinku pak bylo ve variantě Cd2 (10,83 mg.kg-1). Na sublokalitě 2 v Hostěnicích byl zaznamenán minimální obsah kadmia celého souboru, a to ve variantě Zn2 (1,20 mg.kg-1). I ostatní hodnoty však byly až na jedinou výjimku (1,73 mg.kg-1 ve variantě Cd1) podprůměrné (tab. 45). Rovněž hodnoty obsahu zinku byly podprůměrné. Maximum bylo zjištěno ve variantě Cd2 (18,35 mg.kg-1) a minimum dosahovalo pouhých 12,13 mg.kg-1 ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy. Na sublokalitě 1 ve Mšeném-lázních byly dosaženy shodně nízké hodnoty, a to opět jak pro kadmium, tak i pro zinek (tab. 46). Minimální hodnota pro kadmium byla naměřena ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (1,40 mg.kg-1), kdy se obsahy kadmia nalézaly v rozmezí pouhých 0,05 mg.kg-1 s maximem ve variantě
95
Zn1 (1,55 mg.kg-1). Maximální obsah zinku byl tedy na této sublokalitě rovněž podprůměrný (18,90 mg.kg-1 ve variantě Zn1). Minimum bylo opět ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy (13,05 mg.kg-1). Tyto nízké hodnoty se vyskytovaly i na sublokalitě 2 ve Mšeném-lázních (tab. 47). Jedinou výjimkou je zde obsah kadmia ve variantě Zn1 (1,68 mg.kg-1), která je zde tak i maximem. Naopak minimum se pohybovalo jen mírně nad minimem celého souboru a bylo zaznamenáno ve variantě Zn2 (1,28 mg.kg-1). Stanovené hodnoty zinku byly rovněž podprůměrné. Maximum bylo ve variantě Cd2 (15,90 mg.kg-1) a minimum ve variantě Cd1 (12,93 mg.kg-1). V Červeném Újezdu byly naměřené hodnoty výrazně nadprůměrné v maximu (2,25 ve variantě Cd2), ale také výrazně podprůměrné v minimu (1,28 mg.kg-1 ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy). Obsahy zinku měly podobné rozložení, kdy se rozpínaly v intervalu od 24,68 mg.kg-1 ve variantě Zn1 po minimum 14,38 mg.kg-1 ve variantě Cd1 (tab. 48).
6.1.2.3 Obsah těžkých kovů v půdě polních pokusů
Tab. 49: Obsah těžkých kovů přístupných pro rostliny v sušině půdy polních pokusů při odběru vzorků ve vývojové fázi 79 Zatížení Cd Zn Bohušovice 1
mg.kg-1 0,200
0,590
Bohušovice 2
0,240
0,870
Červený Újezd
0,220
0,530
Hostěnice 1
0,220
0,520
Hostěnice 2
0,220
0,590
Mšené-lázně 1
0,220
0,510
Mšené-lázně 2
0,210
0,480
Obsah kadmia a zinku v půdních materiálech byl zkoumán ne ve vztahu k absolutnímu obsahu těchto prvků v půdě, ale k obsahu těchto těžkých kovů, které jsou přístupné pro rostliny. Tyto obsahy tak byly podstatně nižší, než obsahy absolutní (Tlustoš et al., 2008).
96
V případě polních pokusů byly výsledky v relativně malém rozsahu (tab. 49). Nejvyšší ejvyšší množství kadmia bylo naměřeno nam v Bohušovicích na sublokalitě sublokali 2 (0,24 mg.kg-1) a nejnižší hodnota byla zjištěna zjišt rovněž v Bohušovicích na sublokalitě sublokalit 1 (0,20 mg.kg-1). Výsledky se tak pohybovaly v rozsahu pouhých 0,04 mg.kg-1. Pro zinek bylo toto rozpětí hodnot širší, když maximum bylo naměř ěřeno shodně na sublokalitě 2 v Bohušovicích (0,87 mg.kg-1) a minimum ve Mšeném-lázních Mšeném na sublokalitě 2 (0,48 mg.kg-1).
6.1.3 Obsah prolinu v rostlinách z polních pokusů 6.1.3.1 První termín odběru (vývojová fáze 65) 6.1.3.1.1 Bohušovice Tab. 50:: Obsah prolinu v makovině (sublokalita 1) Zatížení Prolin
Tab. 51:: Obsah prolinu v makovině (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
6,37 7,35 5,85 6,88 8,04 7,35 8,34 6,84 6,67 9,12 6,71 7,10 8,77 7,91 5,59 8,95 6,67 6,24 6,32 5,72
mg.kg-1 σ
6,61
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
0,51
σ 7,64
0,54
σ 7,40
0,86
σ 7,80
1,11
σ 6,24
0,26
5,85 4,95 5,46 5,42 7,01 6,19 5,29 5,94 6,24 10,45 9,29 6,54 6,11 7,27 5,51 7,01 8,86 6,15 7,74 6,67
σ 5,42
0,24
σ 6,11
0,50
σ 8,13
1,74
σ 6,47
0,67
σ 7,35
0,95
V Bohušovicích na sublokalitě kalitě 1 se pohybovaly obsahu prolinu ve velice úzkém intervalu od 6,24 mg.kg-1 ve variantě Zn2 po 7,81 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin po
97
aplikaci roztoku o koncentraci Zn1. Zn Na sublokalitě 2 byl tento rozsah minimálně minimáln širší s maximem ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 1 (5,42 (5 mg.kg-1) a maximem ve variantě bez dodatečného dodate zatížení těžkými kovy (8,13 3 mg.kg-1) (tab. 50 a tab. 51).
6.1.3.1.2 Hostěnice Tab. 52: Obsah prolinu (sublokalita 1) Zatížení Prolin
v makovině
Tab. 53: Obsah prolinu (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
6,02 6,02 6,15 8,04 5,59 13,03 8,47 6,92 5,46 8,30 6,84 7,23 6,06 5,29 5,72 6,41 5,42 5,12 5,42 6,41
mg.kg-11 σ
6,56
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
0,74
σ 8,50
2,26
σ 6,96
0,81
σ 5,87
0,37
σ 5,59
v makovině
0,41
6,02 6,11 6,19 5,98 6,75 5,29 10,92 5,63 5,12 5,46 5,42 5,33 9,29 8,73 8,52 8,60 5,98 5,68 5,85 6,24
σ 6,0 6,08
0,08
σ 7,15
1,89
σ 5,33
0,11
σ 8,78
0,25
σ 5,9 5,94
0,17
V Hostěnicích nicích byla minimální hodnota zjištěna zjišt na sublokalitě 1 ve variantě variant Zn2 (tab. 52).. Obsahy prolinu byly v tomto souboru sublokality 1 až na jedinou výjimku podprůměrné. rné. Tato výjimka byla tvořena tvo maximálním álním obsahem prolinu ve variantě Cd2, který dosahoval 8,50 50 mg.kg-1. Podobně nízké hodnoty obsahu prolinu byly zjištěny i v rostlinách z polních pokusů pokus na sublokalitě 2 v Hostěnicích Hostě (tab. 53). Maximum zde e dosahovalo sice podobných hodnot (8,78 (8 mg.kg-1), ale bylo zjištěno zjišt ve variantě Zn1. Minimum prolinu v rostlinném materiálu obsahovaly rostliny z varianty
98
bez dodatečného ného zatížení těžkými tě kovy, což tvořilo již zmíněné ěné minimum celého souboru v prvním termínu. 6.1.3.1.3 Mšené-lázně Tab. 54: Obsah prolinu (sublokalita 1) Zatížení Prolin
v makovině
Tab. 55: Obsah prolinu (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
6,15 5,55 12,43 12,99 6,28 6,67 6,11 6,49 6,37 6,62 6,54 7,96 7,74 8,00 8,56 8,13 5,29 8,17 8,52 8,64
mg.kg-11 σ
9,28
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
3,43
σ 6,39
0,19
σ 6,87
0,54
σ 8,11
0,24
σ 7,66
v makovině
1,18
18,71 8,09 7,05 20,90 11,83 11,22 10,36 11,44 7,66 7,18 7,96 7,14 7,35 9,59 6,54 5,76 6,15 6,06 11,18 6,28
σ 13,6 13,69
6,12
σ 11,21
0,43
σ 7,48
0,32
σ 7,31
1,16
σ 7,4 7,42
1,88
Ve Mšeném-lázních byly naměřené nam hodnoty rozloženy kolem průmě ůměru s podobnými extrémy. Maximální obsah byl ve variantě Cd1 (9,28 mg.kg-1) a minimum bylo Cd2 (6,39 mg.kg-1). Podobně ě nízká hladina hladina obsahu prolinu byla zaznamenána i ve variantě bez dodatečného čného zatížení těžkými t kovy S (6,87 87 mg.kg-1) (tab. 54). Na sublokalitě 2 byly obzvláště významné dva vysoké obsahy prolinu jednak ve variantě Cd1 (13,69 mg.kg-1), což bylo i dříve zmíněné maximum celého souboru rostlin, a dále ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 Cd2 (11,21 (11 mg.kg-1). Ostatní hodnoty byly mírně podprůměrné s minimem ve variantě Zn1 (7,31 (7 mg.kg-1) (tab. 55).
99
6.1.3.1.4 Červený Újezd Tab. 56: Obsah prolinu v makovině makovin Zatížení Prolin mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
10,28 7,05 10,97 5,89 7,74 9,20 7,74 8,13 7,10 10,11 9,25 12,00 9,72 15,01 7,57 6,67 9,29 22,28 5,55 11,18
V
Červeném erveném
byla
již
zmín zmíněná
maximální hodnota celého souboru, a to ve σ
8,55
2,08
variantě
Zn2
8,20
0,50
1,44
σ 9,74
prolinu
Minimum se nacházelo ve
variantě Cd2 (8,20 mg.kg-1) (tab. 56).
σ 9,61
s obsahem
12,07 mg.kg-1. I zbylé obsahy prolinu byly nadprůměrné. rné.
σ
2,63
σ 12,07
Újezdu
5,10
100
6.1.3.2 Druhý termín odběru odbě (vývojová fáze 79) 6.1.3.2.1 Bohušovice Tab. 57: Obsah prolinu (sublokalita 1) Zatížení Prolin
v makovině
Tab. 58: Obsah prolinu (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
27,61 5,68 6,15 6,80 7,57 5,76 6,75 5,89 8,13 5,55 5,63 5,12 6,62 7,18 6,15 6,11 15,31 6,49 7,44 6,32
mg.kg-11 σ
11,56
8,03
σ 6,49
0,67
σ 6,11
1,01
σ 6,52
0,39
σ 8,89
v makovině
3,21
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
6,37 6,54 6,19 6,71 7,91 9,33 13,59 15,09 10,02 6,49 7,01 7,74 6,11 6,49 6,24 6,45 6,75 5,16 6,58 6,58
σ 6,45
0,17
σ 11,48
2,86
σ 7,8 7,82
1,10
σ 6,32
0,15
σ 6,2 6,27
0,55
V Bohušovicích byla zjištěna ěna výrazně výrazn vyšší hodnota obsahu prolinu ve variantě Cd1 (11,56 mg.kg-1). Tři ři varianty vykazovaly podobně nízké hodnoty Zn1 (6,52 ( mg.kg-1), Cd2 (6,49 mg.kg-1) a minimální hodnota ve variantě bez dodatečného dodateč zatížení těžkými kovy (6,11 mg.kg-11) (tab. 57). Na sublokalitě 2 byl naproti tomu maximální obsah prolinu zjištěn ve variantě variant Cd2 s 11,48 mg.kg-1. Naproti tomu maximální hodnota ze sublokality 1 Zn1 zde dosahovala pouhých pouhýc 6,45 mg.kg-11. Nižší obsah byl zjištěn pouze ve variantě Zn1 (6,32 mg.kg-1), tedy ve variantě,, která vykazovala shodně nízké hodnoty i na sublokalitě sublokalit 1 (tab. 58).
101
6.1.3.2.2 Hostěnice Tab. 59: Obsah prolinu inu (sublokalita 1) Zatížení Prolin
v makovině
Tab. 60: Obsah prolinu (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
8,13 6,88 4,95 8,34 8,95 6,62 9,16 7,48 5,89 9,68 7,35 7,66 6,45 5,51 5,81 5,89 13,37 6,19 6,32 6,15
mg.kg-11 σ
7,08
1,16
σ 8,05
1,00
σ 7,64
1,02
σ 5,91
0,27
σ 8,01
v makovině
2,68
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
7,35 8,90 7,87 6,15 9,72 5,38 16,99 6,71 5,20 5,20 5,55 5,12 7,35 6,75 5,85 6,06 7,48 5,59 5,16 6,28
σ 7,5 7,57
0,82
σ 9,70 70
3,66
σ 5,2 5,27
0,14
σ 6,5 6,51
0,55
σ 6,1 6,13
0,75
Na sublokalitě 1 v Hostěnicích ěnicích byly zjištěné zjišt né obsahy prolinu ve všech případech p podprůměrné (tab. 59).. Nejvyšší obsahy byly ve variantách Zn2 (8,,01 mg.kg-1) a Cd (8,05 mg.kg-1). Minimum bylo naproti tomu naměřeno nam ve variantě Zn1 (5,91 (5 mg.kg-1). Tyto nízké hodnoty byly potvrzeny i v rostlinách na sublokalitě 2 (tab. ( 60). Jedinou výjimkou a zároveň ň i jediným obsahem prolinu ve variantách na této sublokalitě, sublokalit který přesahoval průměrný rný obsah celého souboru rostlin, byl ve variantě ě Cd2 s obsahem prolinu 9,70 mg.kg-1. Minimální hodnota pak byla zároveň zárove minimální hodnotou celého souboru a nacházela se ve variantě bez dodatečného ného zatížení těžkými tě kovy S (5,27 mg.kg-1).
102
6.1.3.2.3 Mšené-lázně Tab. 61: Obsah prolinu (sublokalita 1) Zatížení Prolin
v makovině
Tab. 62: Obsah prolinu (sublokalita 2) Zatížení Prolin
mg.kg-1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
12,82 15,27 7,66 7,61 14,19 11,91 5,68 14,66 15,91 6,11 8,09 8,30 12,82 10,28 5,94 6,84 13,89 6,45 6,62 7,44
mg.kg-11 σ
10,84
3,20
σ 11,61
2,97
σ 9,60
3,16
σ 8,97
2,58
σ 8,60
v makovině
2,65
Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
13,63 11,91 14,19 17,80 8,56 7,31 5,51 5,38 8,95 12,60 8,52 12,94 6,58 10,45 9,89 14,66 19,52 9,46 7,05 12,94
σ 14,3 14,39
1,71
σ 6,6 6,69
1,25
σ 10,75
2,02
σ 10, 10,40
2,16
Σ 12,2 12,25
3,99
Oproti výsledkům z Hostěnic ěnic, byly výsledky obsahů prolinu v rostlinách ze Mšenéholázní výrazně vyšší a nacházely nacháze se až na jedinou výjimku nad průměrem prů celého souboru (tab. 61 a tab. 62). 62 Maximální hodnota v rostlinách ze sublokality 1 byla v rostlinách po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 (11,61 mg.kg-11) a minimum ve variantě Zn2 (8,60 mg.kg-1). Na sublokalitě sublokalit 2 byla ona podprůměrná ů ěrná hodnota obsahu prolinu naměřena ve variantě Cd2 (6,688 mg.kg-1) a maximum dané obsahem ve variantě Cd1 (14,39 mg.kg-1) bylo i celkovým maximem celého souboru rostlin v druhém termínu.
I obsahy prolinu v ostatních variantách dosahovaly vysokých vysok
hodnot, kdy kromě ě minima všechny zbylé varianty obsahovaly více než 10 1 mg.kg-1 prolinu v rostlinném materiálu.
103
6.1.3.2.4 Červený Újezd Tab. 63: Obsah prolinu v makovině makovin Zatížení Prolin mg.kg Cd1 Cd1 Cd1 Cd1 Cd2 Cd2 Cd2 Cd2 S S S S Zn1 Zn1 Zn1 Zn1 Zn2 Zn2 Zn2 Zn2
6,84 5,33 5,85 6,32 21,42 7,87 7,18 9,33 15,40 7,83 8,04 7,31 11,22 9,33 12,51 5,94 10,62 8,52 5,63 9,46
-1
V Červeném erveném Újezdu bylo pouze minimum pod průměrným rným obsahem prolinu pro celý
σ 6,09
0,49
soubor (tab. 63).. Toto minimum bylo ve variantě Cd1 a dosahovalo 6,09 6 mg.kg-1. Průměrná rná
σ 11,45
4,98
hodnota
byla
zjišt zjištěna
ve
vzorcích rostlin po o aplikaci roztoku o koncentraci Zn2 (8,56 mg.kg-1) a zbývající varianty výrazněji převyšovaly řevyšovaly průměrný pr
σ 9,64
2,88
obsah. Maximální obsah v rostlinách z Červeného erveného Újezdu byl naměřen nam ve variantě
σ 9,75
2,12
11,45 mg.kg-1.
σ 8,56
Cd2
1,48
104
s obsahem
prolinu
6.2 Nádobové pokusy 6.2.1 Obsah alkaloidů v rostlinách z nádobových pokusů
V nádobových pokusech byly ve všech variantách stanoveny v makovině výrazně nižší hodnoty obsahů morfinu ve srovnání s rostlinami pěstovanými na poli (tab. 64). Nejvyšší množství morfinu obsahovaly rostliny po aplikaci roztoku o koncentraci Cd3(N) (186,8 mg.kg-1). Ovšem i tato hodnota je pod průměry z polních pokusů. Ostatní varianty dosahovaly shodně výrazně nižších hodnot v rozmezí 20 mg.kg-1 od 70,65 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn3(N) po 89,47 mg.kg-1 ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1(N). Průměrná hodnota obsahu morfinu v nádobových pokusech byla 93,93 mg.kg-1. Množství zjištěného kodeinu bylo shodně nízké v porovnání s obsahy v polních pokusech. Průměrný obsah kodeinu v nádobových pokusech byl pouze 6,25 mg.kg-1 s minimem ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1(N) (3,82 mg.kg-1) a maximem ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd3(N) (11,06 mg.kg-1). I tato maximální hodnota je však téměř třicetkrát nižší, než průměrná hodnota obsahu kodeinu v rostlinách z polních pokusů. Oproti předešlým výsledkům, kdy průměrný obsah morfinu a kodeinu byl v nádobových pokusech v porovnání s polními pokusy výrazně nižší, byl průměrný obsah narkotinu v nádobových pokusech téměř dvojnásobný v porovnání s druhým termínem a prakticky stejně vysoký jako v případě termínu prvního a dosahoval hodnoty 32,43 mg.kg-1. Stanovená vysoká průměrná hodnota byla ovlivněna maximálním obsahem narkotinu, který byl zjištěn ve variantě Cd3(N) (67,96 mg.kg-1), který tak rovněž přesahoval maximum v druhém termínu polních pokusů a dále to, že zde nebyla varianta, která by vykazovala výrazně nižší obsahy. Minimum tak bylo ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy S(N (14,14 mg.kg-1).
105
Tab. 64: Obsah alkaloidů v makovině rostlin z nádobových pokusů Zatížení morfin kodein Cd1(N) Cd1(N) Cd1(N) Cd1(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd3(N) Cd3(N) Cd3(N) Cd3(N) S(N) S(N) S(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn3(N) Zn3(N) Zn3(N) Zn3(N)
18,1 90,7 229,9 19,2 125,9 21,3 98,2 61,2 332,8 118,8 150,3 145,4 95,5 1,8 117,8 87,0 17,8 120,9 71,3 122,4 67,9 89,3 49,9 77,0 93,1 37,5 74,9
σ 89,5
70,80
σ 76,7
35,38
σ 186,8
72,99
σ 71,7
46,58 σ
74,2
29,72
σ 82,4
23,49
σ 70,6
16,57
1,02 3,81 9,28 1,16 12,44 1,82 17,24 1,48 19,95 7,76 10,68 5,87 5,61 0,19 7,56 10,37 1,48 7,18 1,17 7,14 9,44 5,00 4,36 2,85 5,34 5,88 2,79
σ 3,82
2,73
σ 8,24
6,59
σ 11,06
4,44
σ 4,45
2,84 σ
5,05
3,72
σ 6,48
1,80
σ 4,22
1,40
5,53 30,06 102,3 23,84 12,56 19,50 21,87 20,20 88,29 88,31 47,19 48,06 23,05 1,33 18,04 29,26 18,74 22,55 52,85 21,64 16,73 24,05 28,36 23,35 35,20 15,13 37,52
106
narkotin mg.kg-1
papaverin σ
40,44
30,95
σ 18,53
2,98
σ 67,96
20,33
σ 14,14
8,54 σ
30,85
11,00
σ 22,70
3,51
σ 27,80
8,56
1,51 1,60 6,09 3,93 2,77 5,29 2,31 2,98 9,83 2,75 6,25 2,70 2,59 0,31 14,54 5,15 12,97 6,18 0,53 3,64 6,40 2,05 2,63 1,04 15,60 9,20 3,86
thebain σ
3,28
σ 3,34 3,3
σ 5,38
σ 5,81 σ 6,21 6,2
σ 3,68
σ 7,43 7,4
< MD 1,73 < MD < MD < MD < MD 0,98 4,73 6,09 < MD < MD 2,66 < MD < MD < MD < MD 5,82 < MD 10,31 17,43 3,38 < MD 8,20 < MD 10,50 1,36 35,81 < MD < MD < MD 4,97 5,13 < MD < MD
σ -
-
σ 5,41
0,68
σ -
-
σ 10,31
0,00 σ
12,82
4,61
σ 23,15
12,65
σ 5,13
0,00
Obsah papaverinu v nádobových pokusech byl výrazně vyšší než obsah papaverinu v makovině rostlin z polních pokusů. Konkrétně v porovnání s průměrnými obsahy papaverinu v polních pokusech, které byly v prvním termínu 2,43 mg.kg-1 a v druhém termínu 1,34 mg.kg-1, je průměrný obsah papaverinu v nádobových pokusech 4,99 mg.kg-1. Výrazné je i to, že tato vysoká hodnota nebyla dána pouze sadou extrémních hodnot, ale celkově vyššími obsahy papaverinu v jednotlivých vzorcích. Při úpravě průměru odstraněním 10 % extrémních hodnot se průměr změní pouze nepatrně na 4,75 mg.kg-1 a při výpočtu průměru bez 20 % extrémů dostaneme 4,51 mg.kg-1.
Z tohoto důvodu byl stejně jako při vyhodnocení obsahů papaverinu
v makovině rostlin z polních pokusů použit také medián. Medián obsahu papaverinu celého souboru rostlin z nádobových pokusů byl 3,64 mg.kg-1. Medián souboru byl výrazně nižší, než průměr souboru, což opět potvrzoval výskyt extrémních hodnot. Minimální obsah papaverinu v nádobových pokusech byl pak zjištěn ve variantě Cd1(N) (3,28 mg.kg-1 se směrodatnou odchylkou 1,73 mg.kg-1) a maximum bylo tvořeno obsahem papaverinu ve variantě Zn3(N) (7,43 mg.kg-1
se směrodatnou
-1
odchylkou 4,03 mg.kg ). V nádobových pokusech byl průměrný obsah alkaloidu thebainu všech variant 12,28 mg.kg-1. Stejně jako tomu bylo už u polních pokusů, je i zde nutné upozornit na množství vzorků rostlin, v kterých nebylo možné definovat obsah thebainu. V nádobových pokusech byla tato četnost dokonce ještě vyšší, než v předešlých případech. Bez hodnoty obsahů thebainu tak byly varianty Cd1 a Cd3. Ve variantě Zn3 pak bylo možné zjistit obsah thebainu pouze v jediném opakování. V ostatních variantách bylo možné definovat obsahy pouze ve dvou opakováních. Nízké obsahy thebainu byly zaznamenány především ve variantě Cd2 (5,41 mg.kg-1) a již zmíněné varianty Zn3 (5,12 mg.kg-1). Pouze v jediné variantě byla naměřená hodnota výrazně vyšší oproti průměru, a to ve variantě Zn2 s obsahem thebainu v makovině 23,15 mg.kg-1.
107
6.2.2 Obsah kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů 6.2.2.1 Obsah kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů Tab. 65: Obsah kadmia a zinku v makovině Zatížení Zn Cd mg.kg
76,2
Cd1(N)
12,8 42,70 26,85 40,90 21,2 20,85
Cd1(N)
18,9
15,5
Cd1(N)
62,9
22,7
Cd2(N)
186,8
Cd2(N)
133,9 118,4 41,95 121,9 20,6 26,68
̅
σ
σ
24,0
26,0
nádobových
pokusech
nebylo
Cd1(N)
̅
V
-1
̅
σ
2,68 21,95
potvrzeno
očekávání, že se vzrůstající aplikací kadmia a zinku do půdy dojde i k výraznému
̅
σ
nárůstu obsahu těchto kovů
4,76 24,95 v rostlinném materiálu (tab.
Cd2(N)
43,0
23,9
65). Maximální obsah tak
Cd2(N)
109,9
36,2
nebyl
registrován
ve
Cd3(N)
43,2
variantě
Cd3(N),
byl
Cd3(N)
19,8 84,65 91,23 31,50 15,9 27,23 12,59 20,30
Cd3(N)
8,50
21,5
obsah
kadmia
Cd3(N)
267,1
52,4
mg.kg-1,
ale
̅
σ
19,1
S(N)
6,1
̅
σ
S(N)
3,0
6,87
3,09
S(N)
11,5
Zn1(N)
1,3
̅
σ
Zn1(N)
5,3
6,43
4,24
Zn1(N)
14,9
59,8
Zn1(N)
4,2
32,9
Zn2(N)
3,6
Zn2(N)
33,1
̅
̅
6,10 29,2 30,63
σ
σ
̅
σ
517,4 131,8 192,8
102,9
21,1
ve
variantě
mg.kg-1.
Celkově
však obsah ve variantách ̅
σ
4,75 31,7 56,83 24,53 46,35
84,65
Cd2(N) dosahující hodnoty
1,64 29,60 118,4
29,6
kde
po aplikaci roztoku kadmia byl výrazně vyšší než ve variantách
̅
σ
Minimum
4,15 66,7 44,80 14,20 45,70 variantě
bez tak
zatížení. bylo
Zn2(N)
ve (3,30
Zn2(N)
4,7
40,1
mg.kg-1)
Zn2(N)
1,6
51,3
hodnota ve vzorcích bez
Zn3(N)
5,5
Zn3(N)
2,6 12,55 13,93
̅
σ
37,8
̅
4,05 61,3 57,50
Zn3(N)
40,4
58,2
Zn3(N)
1,7
72,7
σ
9,85 59,75
a
maximální
zatížení byla ve variantě Zn3(N)
(12,55
mg.kg-1).
Obsahy zinku v rostlinném materiálu byly rovněž vyšší
ve variantách po aplikaci zinku. Rozdíl oproti variantám bez zatížení zinkem nebyl natolik výrazný, jak tomu bylo v případě obsahů kadmia. Maximální naměřená hodnota je ve vzorcích rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn3(N) (57,50 mg.kg-1), ale dosahuje prakticky stejných hladin jako ve variantě Zn1(N)
108
(56,83 mg.kg-1). Minimum obsahu zinku bylo registrováno ve variantě Cd1(N) (20,85 mg.kg-1). Průměrné obsahy kadmia byly překvapivě vyšší než průměrné obsahy zinku, kdy pro kadmium dosahovaly 41,90 mg.kg-1 a pro zinek pouhých 38,05 mg.kg-1. Výrazný vliv na těchto hodnotách měly extrémní obsahy kadmia a zinku v makovině u rostlin z několika opakování. Z tohoto důvodu byl rovněž vypočítán medián obsahů vybraných těžkých kovů.
6.2.2.2 Obsah těžkých kovů v půdě nádobových pokusů
Tab. 66: Obsah těžkých kovů přístupných pro rostliny v sušině půdy nádobových pokusů při odběru vzorků ve vývojové fázi 79 Zatížení Cd Zn Cd1(N)
mg.kg-1 0,250
0,790
Cd2(N)
0,190
1,660
Cd3(N)
0,210
4,120
S(N)
0,230
0,850
Zn1(N)
0,230
1,260
Zn2(N)
0,150
1,040
Zn3(N)
0,420
0,530
Nejvyšší obsah kadmia byl v nádobových pokusech zjištěn ve variantě Zn3(N) (0,42 mg.kg-1), kde byl obsah oproti druhé nejvyšší variantě Cd1(N) téměř dvojnásobný (tab. 66). Minimální obsah zinku byl ve vzorku rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2(N) (0,15 mg.kg-1). Maximální dostupný obsah ve variantě Cd3(N) (4,12 mg.kg-1) a naopak nejnižší ve variantě Zn3(N) (0,53 mg.kg-1).
109
6.2.3 Obsah prolinu v rostlinách z nádobových pokusů
Tab. 67: Obsah prolinu v makovině makovin Zatížení
Cd1(N) Cd1(N) Cd1(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd2(N) Cd3(N) Cd3(N) Cd3(N) Cd3(N) S(N) S(N) S(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn1(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn2(N) Zn3(N) Zn3(N) Zn3(N) Zn3(N)
5,03 4,9 4,99 5,76 6,8 6,84 5,46 4,9 4,95 5,4 5,42 5,16 6,1 6,11 5,3 5,38 4,90 5,1 5,12 5,4 5,42 6,92 5,5 5,51 5,16 5,72 5,8 5,81 5,76 5 5,85 5,1 5,12 5,4 5,42 5,33 5,4 5,42 5,1 5,12 5,8 5,81
Prolin
V nádobových pokusech pokus byl
mg.kg-1
zaznamenán σ
5,26
5,67
nižší
průměrný ěrný obsah prolinu, než 0,33
σ
výrazn výrazně
tomu bylo v případě polních pokusů (tab. tab. 67). Toto bylo
0,59 vzhledem
k vyšším
dávkám
kadmia a zinku oproti polním σ 5,39
pokusům ů překvapivé. řekvapivé. Průměrný 0,36 obsah
prolinu
dosahoval
pouhých 5,53 mg.kg-1. Dalším σ 5,82
překvapivým ekvapivým
zjišt zjištěním
byl
0,74 velice úzký interval, ve v kterém σ
se pohybovaly ovaly veškeré obsahy 0,22 prolinu
5,55
jednotlivých
variant.
Tento rozsah se rozpínal rozpín od σ
minima
ve
variant variantě
Cd3(N)
-1 0,27 s obsahem prolinu 5,39 mg.kg
5,54
po 5,82 mg.kg-1 σ
bez
dodateč dodatečného
0,19 těžkými kovy.
5,42
110
ve variantě zatížení
7 Diskuse 7.1 Polní pokusy 7.1.1 Obsah alkaloidů v rostlinách z polních pokusů V rostlinách máku odrůdy Major byl v makovině rostlin z polních pokusů v nejvyšším množství stanoven obsah morfinu, následovaný obsahem kodeinu. Obsahy narkotinu a thebainu byly více jak desetinásobně nižší. Obsahy papaverinu byly v mnohých případech pod mezí detekce (obr. 23). Obsahu morfinu v kontrolní variantě dosahoval
282,9
mg.kg-1
a
pohyboval
se
v rozmezí
od
88,6
mg.kg-1 do 490,5 mg.kg-1 (tab. 68). Obsah kodeinu byl v kontrolní variantě v rozmezí od 70,27 mg.kg-1 do 440,6 mg.kg-1 a průměrná hodnota byla 233,6 mg.kg-1. Obsahy morfinu jsou v porovnání s literaturou poměrně nízké. Z uvedených studií se k podobným výsledkům částečně dobrali i Krenn et al. (1998), kteří uvádějí minimální hranici obsahu morfinu 200 mg.kg-1. Stejní autoři však uvádějí nejvyšší obsahy morfinu ve vzorcích makoviny 10 500 mg.kg-1. Podobný rozsah pak udává Prejapati et al. (2002) (300-10000 mg.kg-1). Bajpei et al. (2000), Schulz et al. (2008) a Szabó et al. (2008) udávají naproti tomu minimální obsahy morfinu od 562 do 910 mg.kg-1. Možným vysvětlením zde může být vliv odrůdy máku, jak potvrzují i Sharma et al. (1999) a Lachman et al. (2006). Nízké obsahy v porovnání s uvedenými autory však nebyly pozorovány u všech alkaloidů. Medián obsahu kodeinu v rostlinách z polních pokusů byl ve vývojové fázi 65 roven 217 mg.kg-1. Tento obsah byl sice výrazně nižší, než maximální zjištěné obsahy kodeinu uvedených autorů, ale rovněž několikanásobně převyšoval minimální zjištěné obsahy a leží tak v intervalu uvedeném všemi autory. Možným vysvětlením je zde vývojová fáze, ve které se rostliny při odběru vzorků nacházely. Jak uvádí Roberts et al., (1983) a Märculescu a Dobiţ, (2001), je obsah alkaloidů odlišný v různých vývojových fázích. Vzhledem k tomu, že se rostliny při odběru vzorků nacházely ve vývojové fázi, ve které nedochází ve větší míře k produkci morfinu, je možné předpokládat, že většina kodeinu, který byl vyprodukován, nebyla prozatím přeměněna na morfin. Kodein je v rostlině ve vývojové fázi 65 ve větší míře akumulován jako meziprodukt, který je v dalším vývoji rostliny přeměněn na morfin (Balážová a Psenak, 1998; Facchini et al, 2007; Hagel a Facchini, 2010).
111
Obr. 23: Průměrné hodnoty mediánů obsahů alkaloidů ve VF 65 (mg.kg-1) 300
283
250
217
200 150 100 50
28,71
17,17 0,285
0 morfin
kodein
narkotin
papaverin
thebain
Tento předpoklad však byl ve druhém termínu potvrzen jen částečně (tab. 69) (obr. 24). Celkový obsah alkaloidů a i obsahy jednotlivých alkaloidů dosahovaly v tomto termínu nižších hodnot, což je v souladu s pozorováním Marculescu a Dobit, (2001) (obr. 25 - obr. 29). Průměrný obsah morfinu klesl na 217,4 mg.kg-1 a obsah kodeinu na 175,4 mg.kg-1. Tento fakt potvrzuje i to, že ke snížení množství morfinu v druhém termínu odběru došlo shodně ve všech lokalitách. Redukce obsahu alkaloidů je dána částečně klimatickými vlivy (Felklová a Veverková, 1983) a rozkladem (Fairbairn a Steele, 1980) a přeměnou alkaloidů na jiné látky (Fairbairn et al. 1978; Morimoto et al., 2003). Obr. 24: Průměrné hodnoty mediánů obsahů alkaloidů ve VF 79 (mg.kg-1) 250 214,8 200
181,4
150
100
50 15,73 0,424
10,41
0 morfin
kodein
narkotin
112
papaverin
thebain
Tab. 68: Základní statistické vyhodnocení obsahů alkaloidů v makovině (mg.kg-1) při odběru vzorků ve vývojové fázi 65 σ d max min Cd1 300,0 303,4 117,4 91,76 511,3 45,51 Cd2 260,4 280,3 117,3 88,29 486,6 16,32 S 282,9 278,0 104,5 84,99 490,5 88,55 morfin Zn1 256,7 260,3 107,6 84,12 464,3 12,71 Zn2 291,9 285,7 137,5 104,6 605,2 42,66 Celkem 278,9 283,0 118,7 91,08 605,2 12,71 σ d max min Cd1 227,0 210,2 109,4 86,44 444,5 32,83 Cd2 226,9 218,9 95,0 75,27 409,9 17,86 S 233,6 216,0 94,8 78,16 440,6 70,27 kodein Zn1 207,7 209,3 114,4 92,71 409,9 6,20 Zn2 221,1 217,0 119,7 82,17 608,6 72,58 Celkem 223,4 217,0 107,6 82,96 608,6 6,20 σ d max min Cd1 35,77 37,17 22,81 18,92 81,36 2,04 Cd2 32,48 33,27 19,21 15,73 69,64 3,81 S 25,58 20,04 18,75 14,40 82,56 2,87 narkotin Zn1 28,76 26,25 28,36 18,43 141,28 2,40 Zn2 34,79 30,16 25,47 22,47 88,78 4,07 Celkem 31,37 28,71 23,54 18,64 141,28 2,04 σ d max min Cd1 2,54 0,26 8,59 3,85 43,98 0,04 Cd2 2,66 0,29 5,12 3,63 20,24 0,03 S 2,00 0,34 4,03 2,60 19,62 0,04 papaverin Zn1 1,73 0,42 3,37 2,19 15,15 0,06 Zn2 3,225 0,205 5,395 4,291 20,76 0,030 Celkem 2,430 0,285 5,595 3,314 43,98 0,030 σ d max min Cd1 29,32 17,85 30,87 21,92 134,4 6,71 Cd2 35,23 22,37 38,02 25,41 161,7 2,43 S 30,48 15,12 40,45 28,65 172,2 2,02 thebain Zn1 18,41 12,81 15,31 11,87 51,7 2,22 Zn2 31,94 28,04 22,10 18,43 90,8 5,78 Celkem 29,05 17,17 31,36 22,06 172,2 2,02 Poznámka: ̅ - průměr; – medián; σ – směrodatná odchylka; d - absolutní směrodatná odchylka; max – maximální hodnota souboru; min – minimální hodnota souboru
Průměrný obsah narkotinu byl v makovině rostlin z druhého termínu odběru rovněž nižší než v odběru předešlém. Průměrný obsah narkotinu v prvním termínu odběru byl 25,58 mg.kg-1 a v termínu druhém 20,44 mg.kg-1. 113
Tab. 69: Základní statistické vyhodnocení obsahů alkaloidů v makovině (mg.kg-1) při odběru vzorků ve vývojové fázi 79 σ d max min Cd1 250,8 247,2 88,4 68,37 460,5 67,61 Cd2 202,6 199,4 97,8 76,29 453,5 16,40 S 217,4 237,9 72,7 60,78 339,6 35,57 morfin Zn1 213,1 195,6 74,6 57,94 406,6 49,59 Zn2 240,5 206,4 110,6 82,96 552,1 114,7 Celkem 224,8 214,8 91,8 70,15 552,1 16,40 σ d max min Cd1 183,7 168,0 76,5 58,21 399,4 73,25 Cd2 203,0 205,4 91,1 69,50 434,9 14,88 S 175,4 190,1 62,6 51,95 268,8 17,09 kodein Zn1 190,0 204,0 67,4 58,18 295,7 27,36 Zn2 193,9 158,4 85,8 76,79 403,2 76,03 Celkem 185,3 181,4 79,3 64,04 434,9 10,18 σ d max min Cd1 18,55 15,03 13,10 11,09 52,81 1,07 Cd2 21,68 20,94 15,15 12,13 56,21 1,57 S 20,44 18,04 13,79 11,29 53,01 3,09 narkotin Zn1 21,42 13,63 21,49 17,82 75,25 1,46 Zn2 19,38 12,63 16,52 13,78 58,12 1,83 Celkem 19,95 15,73 16,18 13,08 75,25 1,07 σ d max min Cd1 1,239 0,505 1,603 1,125 7,66 0,084 Cd2 0,598 0,355 0,791 0,509 3,39 0,065 S 1,672 0,386 3,978 2,200 17,61 0,062 papaverin Zn1 1,240 0,404 1,593 1,208 5,38 0,073 Zn2 1,741 0,498 3,860 2,176 15,51 0,061 Celkem 1,341 0,424 2,770 1,504 17,61 0,056 σ d max min Cd1 25,43 12,65 48,15 26,44 195,3 0,705 Cd2 10,48 8,86 8,54 6,69 27,8 0,155 S 10,47 7,96 8,83 6,67 34,1 0,035 thebain Zn1 11,25 11,60 7,47 5,71 25,2 0,095 Zn2 16,06 12,08 11,88 9,41 46,3 0,251 Celkem 14,56 10,41 23,33 10,32 195,3 0,035 Poznámka: ̅ - průměr; – medián; σ – směrodatná odchylka; d - absolutní směrodatná odchylka; max – maximální hodnota souboru; min – minimální hodnota souboru
Průměrný obsah papaverinu byl v obou termínech výrazně ovlivněn extrémními hodnotami a tím, že veliké množství vzorků obsahovalo obsahy papaverinu pod mezí stanovitelnosti. Při porovnání mediánů obsahů papaverinu v rostlinách z vývojových fází 65 a 79 je pouze možné konstatovat, že v obou případech byly hodnoty pod hladinou 1 mg.kg-1. I přesto jsou tyto výsledky srovnatelné se závěry Bajpeie et al. 114
(2000), kteří rovněž uvádějí, že u některých rostlin byly obsahy tohoto alkaloidu pod mezí stanovitelnosti. Obr. 25: Změna obsahu morfinu mezi VF Obr. 26: Změna obsahu kodeinu mezi VF 65 a VF 79 (mg.kg-1) 65 a VF 79 (mg.kg-1) 350 300 250 200 150 100 50 0
250 200 150 100 50 0
Obr. 27: Změna obsahu narkotinu mezi Obr. 28: Změna obsahu papaverinu mezi VF 65 a VF 79 (mg.kg-1) VF 65 a VF 79 (mg.kg-1) 40
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
30 20 10 0
Obr. 29: Změna obsahu thebainu mezi VF 65 a VF 79 (mg.kg-1) 30 25 20 15 10 5 0
Hodnoty mediánu je možné použít i pro srovnání tendence stanovených množství thebainu. Medián je zde rovněž vhodnějším kritériem, protože v souboru všech hodnot byla veliké část pod mezí detekce a dále se v souboru vyskytoval vysoký počet extrémních hodnot. Hodnota mediánu obsahu thebainu v rostlinách z kontrolní
115
varianty byla stejně jako u předešlých alkaloidů vyšší v prvním termínu odběru (15,12 mg.kg-1) oproti hodnotě mediánu z druhého termínu odběru (7,96 mg.kg-1).
7.1.2 Obsah kadmia zinku v rostlinách z polních pokusů Obsahy kadmia a zinku v makovině byly zkoumány rovněž ve vzorcích máku sklizených ve dvou různých termínech dle vývojové fáze. Průměrný obsah kadmia všech vzorků z prvního termínu byl 1,59 mg.kg-1 s maximální naměřenou hodnotou 2,10 mg.kg-1 ve variantě Cd2 v Bohušovicích na sublokalitě 1 a minimem ve variantě Zn1 v Hostěnicích na sublokalitě 1 (1,20 mg.kg-1). Hodnoty obsahu vybraných těžkých kovů u kontrolních variant odpovídají výsledkům zjištěným v makovině dle Pavlíkové et al. (2007) na černozemi, kde hodnota kadmia dosahovala 2,406 ±0,611 mg.kg-1. Oproti naměřeným hodnotám na luvizolních půdách jsou tyto výsledky mírně vyšší, kdy stanovené hodnoty dle Pavlíkové et al. (2007) dosahovaly pouhých 0,149 ±0,122 mg.kg-1. Tyto hodnoty byly rovněž potvrzeny předešlými pozorováními, kde se obsahy kadmia pohybovaly ve vzorcích bez zatížení těžkými kovy od 0,07 ±0,05 mg.kg-1 do 1,09 ±0,16 mg.kg-1. Pro zinek byly zjištěné hodnoty od 4,98 ±0,20 mg.kg-1 po 37,4 ±1,35 mg.kg-1 (Lachman et al., 2006). Podobné obsahy kadmia v rostlinách máku setého uvádí i Škarpa et al. (2007), kteří při různých dávkách aplikace kadmia buď samostatně, nebo ve spojení s hořečnatými hnojivy, udávají obsahy kadmia v rostlině od 0,11 mg.kg-1 (bez aplikace Cd) do 1,02 mg.kg-1. Obr. 30: Obsah kadmia v makovině rostlin s různým zatížením ve vývojových fázích 65 a 79 (mg.kg-1) 2 1,8
1,76 1,64
1,79 1,63
1,62
1,6
1,42
1,44
1,49
1,5
1,5
1,59
1,56
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Cd1
Cd2
S
Zn1
116
Zn2
Celkem
Kadmium a zinek byly v polních pokusech aplikovány na list. Rostlina sice přijímá největší podíl těchto vybraných těžkých kovů kořeny, ale jak uvádí Usťak et al. (2009), jsou u kadmia a zinku hlavním zdrojem emise z ovzduší. Příjem povrchem rostliny se rovněž podílí na celkovém příjmu těžkých kovů rostlinou, jak uvádí Cakmak et al. (2009).
Obr. 31: Obsah zinku v makovině rostlin s různým zatížením ve vývojových fázích 65 a 79 (mg.kg-1) 25 21,16
20,32 20
17,3 17,43
18,18
20,48
17,29
16,26
15,69
15,46
19,34 16,58
15
10
5
0 Cd1
Cd2
S
Zn1
Zn2
Celkem
Proto bylo důležité zjistit, zda aplikované dávky kadmia a zinku mají vliv na obsah těchto prvků v makovině. Obsahy kadmia a zinku v makovině rostlin v prvním termínu odběru po aplikaci roztoků s rozdílnými koncentracemi těchto vybraných těžkých kovů jsou uvedeny v tabulce 70. Z tabulky je patrné, že nejvyšší průměrný Tab.
obsah kadmia byl stanoven v makovině rostlin po aplikaci nejvyšších dávek kadmia Cd2. Druhý nejvyšší průměrný obsah byl stanoven v rostlinách, na které byl aplikován roztok o koncentraci Cd1. V druhém termínu byl nejvyšší průměrný obsah kadmia opět v makovině rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd2 a druhý nejvyšší průměrný obsah byl stanoven v makovině rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Cd1 (tab. 71) (obr. 30). Na základě toho se dá předpokládat, že aplikace různých koncentrací kadmia na list měla přímý vliv na koncentraci kadmia v makovině což je ve shodě se závěry dle Cakmaka et al. (2009). Posloupnost průměrných obsahů zinku byla v prvním termínu odběru následující: Zn2 (15,46 mg.kg-1), Zn1 (15,69 mg.kg-1), Cd2 (16,26 mg.kg-1), Cd1 (17,30 mg.kg-1) 117
a S (18,18 mg.kg-1). Ve druhém termínu varianty, na které byl aplikován roztok zinku, obsahovaly vyšší množství tohoto prvku oproti ostatním variantám. Nejvyšší obsah byl na základě průměrné hodnoty stanoven u varianty Zn1. Druhý nejvyšší obsah byl stanoven v makovině rostlin po aplikaci roztoku o koncentraci Zn2, tedy roztoku s nejvyšší koncentrací zinku. Vliv aplikace zinku na obsah tohoto prvku v makovině se tedy projevil až v druhém termínu odběru (obr. 31).
Tab. 70: Základní statistické vyhodnocení obsahů kadmia a zinku v makovině (mg.kg-1) (VF 65) σ d max min Cd1 1,64 1,60 0,30 0,23 2,30 1,20 Cd2 1,76 1,70 0,41 0,32 3,20 1,10 S 1,63 1,65 0,27 0,23 2,40 1,20 kadmium Zn1 1,44 1,50 0,27 0,20 2,00 0,70 Zn2 1,50 1,50 0,25 0,19 2,00 0,90 Celkem 1,59 1,50 0,33 0,24 3,20 0,70 σ d max min Cd1 17,30 14,80 7,90 6,20 40,30 8,10 Cd2 16,26 16,35 4,98 3,84 31,80 9,00 S 18,18 17,50 8,19 6,93 35,50 7,50 zinek Zn1 15,69 14,30 7,06 5,16 35,60 7,20 Zn2 15,46 12,75 7,19 5,43 35,00 8,60 Celkem 16,58 14,80 7,22 5,62 40,30 7,20 Tab. 71: Základní statistické vyhodnocení obsahů kadmia a zinku v makovině (mg.kg-1) (VF 79) σ d max min Cd1 1,62 1,55 0,33 0,26 2,50 1,10 Cd2 1,79 1,65 0,46 0,39 3,00 1,00 S 1,42 1,40 0,22 0,16 2,20 1,10 kadmium Zn1 1,49 1,35 0,28 0,24 2,30 1,10 Zn2 1,50 1,40 0,34 0,26 2,50 1,00 Celkem 1,56 1,50 0,36 0,28 3,00 1,00 σ d max min Cd1 17,43 15,30 7,91 6,44 37,50 0,00 Cd2 20,32 17,80 8,78 7,37 40,70 8,10 S 17,29 14,90 7,86 6,17 38,90 8,00 zinek Zn1 21,16 19,00 9,52 7,98 40,90 7,70 Zn2 20,48 19,95 8,39 6,61 39,80 10,50 Celkem 19,34 17,30 8,67 7,09 40,90 0,00
118
7.1.3 Obsahy kadmia a zinku v půdě polních pokusů Obsahy kadmia a zinku (tab. 49) byly zkoumány na jejich statisticky významnou odlišnost. Tato odlišnost byla potvrzena pro obsahy zinku v půdě. Odlišnost obsahů kadmia v půdě se nepodařilo prokázat. Tento výsledek může být zapříčiněn vysokou mobilitou kadmia v půdě, kdy dodané kadmium bylo v půdě polních pokusů distribuováno do hlubších, pro rostlinu nepřístupných, půdních vrstev, jak uvádí například Barančíková et al. (2003) a Pavlíková et al. (2007). I přesto, na základě stanovených obsahů kadmia a zinku v tabulce 70 a tabulce 71, byl uveden vliv Tab.
Tab.
aplikace těchto vybraných těžkých kovů na list na obsah kadmia a zinku v makovině rostlin. Možností je zde částečný příjem kadmia a zinku nadzemní částí rostliny. Možnost tohoto příjmu kadmia a zinku rostlinou popisují například Hovmand et al. (1983), Cakmak et al. (1999) a Usťak et al. (2009).
7.1.4 Obsah prolinu v rostlinách z polních pokusů Průměrný obsah prolinu celkového souboru rostlin v prvním termínu sběru byl 7,7 mg.kg-1. Minimální hodnota obsahu prolinu byla zjištěna ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy v Hostěnicích na sublokalitě 2, kde dosahovala hodnoty 5,33 mg.kg-1. Maximální hodnota byla naproti tomu naměřena ve variantě Cd1 na sublokalitě 2 ve Mšeném-lázních (13,69 mg.kg-1). Obsahy prolinu jsou tak v užším intervalu, než tomu bylo u alkaloidů a těžkých kovů. Směrodatná odchylka obsahu prolinu v prvním termínu byla 2,72 mg.kg-1 (tab. 72) Tab. 72: Základní statistické vyhodnocení obsahů prolinu v makovině (mg.kg-1) – VF 65 σ d max min Cd1 8,03 6,17 3,86 2,73 20,90 4,95 Cd2 7,89 7,18 2,13 1,73 13,03 5,29 S 7,40 7,10 1,65 1,29 12,00 5,12 prolin Zn1 7,73 7,66 1,92 1,38 15,01 5,29 Zn2 7,47 6,26 3,29 2,05 22,28 5,12 Celkem 7,70 6,86 2,72 1,84 22,28 4,95
V druhém termínu byl v porovnání s termínem prvním vyšší průměrný obsah prolinu v rostlinném materiálu ze čtyř pokusných lokalit (8,552 mg.kg-1). Maximum bylo
119
zjištěno stejně jako v souboru rostlin z prvního termínu ve variantě Cd1 na sublokalitě 2 ve Mšeném-lázních (14,385 mg.kg-1) a minimum ve variantě bez dodatečného zatížení těžkými kovy v Hostěnicích (5,269 mg.kg-1). Celkový rozsah hodnot tak byl větší než v předešlém souboru z prvního termínu odběru.
Tab. 73: Základní statistické vyhodnocení obsahů prolinu v makovině (mg.kg-1) – VF 79 σ d max min Cd1 9,14 7,12 4,84 3,52 27,61 4,95 Cd2 9,35 7,89 3,96 3,05 21,42 5,38 S 8,12 7,70 2,88 2,09 15,91 5,12 prolin Zn1 7,77 6,54 2,50 2,07 14,66 5,51 Zn2 8,39 6,69 3,48 2,69 19,52 5,16 Celkem 8,55 7,25 3,68 2,71 27,61 4,95
Obr. 32: Obsah prolinu v makovině rostlin s různým zatížením ve vývojových fázích 65 a 79 (mg.kg-1) 9 7,66
8 7
7,18
7,1
6,86 6,26
6,17
6 5 4 3 2 1 0 Cd1
Cd2
S
Zn1
Zn2
Celkem
Obsah prolinu byl nižší v porovnání s pozorováním Szabó et al. (2003), kteří udávají rozsah hodnot od 40,75 mg.kg-1 – 268,10 mg.kg-1. Obsahy prolinu rovněž oproti závěrům těchto autorů nevykazovaly nárůst hodnot v závislosti na způsobu ošetření. Ke stejnému závěru se dobraly i Jamalomidi et al. (2006), kteří zkoumali závislost různých dávek zinku na obsah prolinu v rýži. Možným vysvětlením je zde jev pozorovaný Balážovou et al. (2008), kdy došlo k 5-6 násobnému nárůstu obsahu prolinu v rostlinách máku s vyšší zátěží stresoru, ale tento nárůst nebyl trvalý, a po 4 120
dnech se ve většině případů obsahy vrátily na hodnoty měřené u kontrolních rostlin. Tento jev potvrzují i Kavikishor et al. (2005) a Niknam et al. (2006).
7.1.5 Statistické vyhodnocení polních pokusů V rámci statistického vyhodnocení byly zkoumány možné vztahy mezi jednotlivými parametry. Hlavní otázkou, danou též vyslovenou hypotézou, bylo, zda a do jaké míry má vliv obsah těžkých kovů na kvantitu a kvalitu alkaloidů v makovině máku setého. Další otázkou, která se kladla mimo jiné díky vzájemné návaznosti některých alkaloidů v metabolické cestě, bylo, jaký je vztah mezi tvorbou jednoho alkaloidu vůči syntéze dalších ze zkoumaných alkaloidů. Podobné statistické vyhodnocení pak bylo provedeno i pro vztah mezi kadmiem a zinkem a tedy, zda je obsah kadmia v makovině spjatý s množstvím přijatého zinku a opačně. Posledním vztahem, který byl zkoumán, byla možná závislost obsahu kadmia a zinku na obsahu prolinu, případně pak sekundárně, zda existuje statisticky prokazatelný vztah mezi obsahem prolinu a množstvím alkaloidů v makovině.
7.1.5.1 Vztah mezi sledovanými parametry 7.1.5.1.1 První termín odběru (vývojová fáze 65) Při vyhodnocení výše zmíněných možných korelací parametrů v prvním termínu bylo zjištěno, že na hladině pravděpodobnosti α = 0,05 existuje možný vztah mezi obsahy morfinu a kodeinu (obr. 33), morfinu a narkotinu (obr. 34), kodeinu a thebainu (obr. 35), kodeinu a zinku (obr. 36), narkotinu a papaverinu (obr. 37), narkotinu a zinku (obr. 38), papaverinu a prolinu (obr. 39) a kadmia a zinku (obr. 40). Veškeré uvedené korelace jsou však velice nízké s maximální hodnotou R dosahující hodnoty 0,371 ve vztahu mezi morfinem a kodeinem. Většina korelací je kladná pouze se třemi výjimkami, kterými je vztah mezi kodeinem a thebainem, kodeinem a zinkem a narkotinem a zinkem (tab. 74). Jak je tedy patrné z maximální hodnoty korelačního koeficientu ve vztahu mezi morfinem a kodeinem, tento i ostatní vztahy jsou velice mírné. Toto je možné vysvětlit především tím, že se jedná o biologický materiál, který je ovlivněn nejen 121
jedním případně několika málo stresovými vlivy, ale působí jako součást komplexního systému vlivů (Vlk, 2004). I z tohoto důvodu tak můžeme vyjádřit, že v prvním termínu byl vztah obsahu morfinu s obsahem kodeinu vysvětlen z 13,75 % (R=0,371). Tab. 74: Korelační matice vztahů jednotlivých parametrů v prvním termínu
V případě vztahu papaverinu a prolinu, který byl z uvedených nejslabší, je sice statisticky dokázán vztah mezi těmito parametry, ale vliv obsahu prolinu na obsah papaverinu je vysvětlen z pouhých 2,5 % (R=0,174). Z hledaných závislostí tak byl významný vztah alkaloidů s tím, že čím blíže si byly jednotlivé alkaloidy na metabolické cestě, tím těsnější jsou i vztahy obsahů těchto alkaloidů. Toto platí nejvíce pro již zmíněný vztah mezi morfinem a kodeinem (Facchini et al, 2007; Ziegler et al. 2009). Tyto vztahy mezi jednotlivými alkaloidy potvrdili rovněž Parjapati et al. (2002), kteří uvedli významné vztahy u dvojic morfin-narkotin, kodein-thebain a narkotin-papaverin (tab. 3) Na hladině α=0,05 byl rovněž významný vztah mezi obsahem kadmia a obsahem zinku v makovině. Tento vztah byl vysvětlen z 9 % (R=0,300). Toto je v souladu s výsledky, ke kterým se dobral Abdel-Sabour et al. (1988). Chizzola a Mitteregger (2005) rovněž pozorovali vztah mezi kadmiem a zinkem, ale uvádějí, že obsah kadmia měl negativní vliv na obsah zinku. Tento jev je možná vysvětlit podobností kadmia a zinku, coby dvojmocných prvků, které tak konkurují o receptory v buněčné stěně a plasmatické membráně (Ozkutlu et al., 2007). Již zmíněný vztah mezi papaverinem a obsahem prolinu byl minimální. Zároveň se pro pokusy v prvním termínu nepodařilo prokázat vztah mezi obsahem dalších
122
alkaloidů a prolinem a oproti předpokladům ani vztah mezi obsahem prolinu a obsahem kadmia a zinku, což je v rozporu s nejrůznějšími pozorováními (Nakamura et al., 2008; Sudha a Ravishankar, 2002; Kolodyazhnaya et al., 2009). Reakce rostliny na stres však nemusí být trvalého charakteru. Spíše slouží jako rychlá odezva rostliny na změnu podmínek, která je následována dalšími mechanismy adaptace na stres jak uvádí i Balážová et al. (2008).
Obr. 33: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy morfinu a kodeinu (mg.kg-1)
123
Obr. 34: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy morfinu a narkotinu (mg.kg-1)
Obr. 35: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a thebainu (mg.kg-1)
124
Obr. 36: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a zinku (mg.kg-1)
Obr. 37: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy narkotinu a papaverinu (mg.kg-1)
125
Obr. 38: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy narkotinu a zinku (mg.kg-1)
Obr. 39: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy papaverinu a prolinu (mg.kg-1)
126
Obr. 40: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kadmia a zinku (mg.kg-1)
7.1.5.1.2 Druhý termín odběru (vývojová fáze 79) V druhém termínu byly částečně potvrzeny některé vztahy, které byly prokázány jako statisticky významné již v prvním termínu (tab. 75). Tab. 75: Korelační matice vztahů jednotlivých parametrů v druhém termínu
Mezi tyto vztahy patří především vliv morfinu na obsah kodeinu (obr. 41), který byl z uvedených vztahů nejsilnější. Obsah kodeinu bylo možné vysvětlit obsahem morfinu z 29,9 % (R=0,547).
127
Rovněž významný byl opět vztah mezi obsahem kadmia a zinku v rostlinném materiálu, který je vysvětlitelný z 20,09 % (R=0,448) (obr. 47). Shodně s prvním termínem bylo rovněž možné prokázat vztah mezi kodeinem a zinkem (obr. 44) a narkotinem a zinkem (obr. 45). Shodné je zde nejen zjištění vlivu, ale také záporná orientace tohoto vlivu. V druhém termínu se dále podařilo prokázat vliv obsahů kodeinu na narkotinu (obr. 42), kodeinu na kadmiu (obr. 43) a papaverinu na zinku (obr. 46). Pro kadmium se tak jedná o první potvrzení možného vlivu i přesto, že je toto dáno pouhými 6,68 % (R=-0,258). Oproti očekávání rovněž nebyl potvrzen vztah mezi obsahem těžkých kovů a obsahem prolinu v rostlinném materiálu, což je možné vysvětlit již dříve zmíněným efektem návratu obsahu prolinu na obsahy v kontrolních rostlinách (Balážová et al. 2003).
Obr. 41: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy morfinu a kodeinu (mg.kg-1)
128
Obr. 42: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a narkotinu (mg.kg-1)
Obr. 43: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a kadmia (mg.kg-1)
129
Obr. 44: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a zinku (mg.kg-1)
Obr. 45: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy narkotinu a zinku (mg.kg-1)
¨
130
Obr. 46: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy papaverinu a zinku (mg.kg-1)
Obr. 47: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kadmia a zinku (mg.kg-1)
131
7.1.5.2 Vztah mezi sublokalitami
Ve výsledcích byly popsány průměrné hodnoty, maxima a minima na jednotlivých lokalitách a sublokalitách. Nebyl však hodnocen vztah obsahů na jednotlivých sublokalitách. Cílem rozložení pokusů do sublokalit bylo sledování vlivu podobného prostředí na rostliny.
Na sublokality, které jsou v blízkosti, působí podobné
klimatické vlivy a mají podobné půdní podmínky, proto se dá předpokládat, že by obsahy alkaloidů mohly vykazovat stejné tendence. Za tímto účelem byla provedena analýza korelace obsahů vybraných alkaloidů na jednotlivých sublokalitách. Vzhledem k tomu, že z jednotlivých lokalit je k dispozici pouze 5 dat daných pěti variantami, nebylo možné použít parametrický test. Pro výpočet korelačních koeficientů uvedených v tabulce 76 byl proto využit výpočet Spearmanovy korelace. Tab.
Z korelační matice je patrné, že se nepodařilo prokázat vztah mezi obsahy alkaloidů na sledovaných sublokalitách. I přesto, že byly nalezeny možné vztahy, nejedná se o vztahy mezi alkaloidy na sublokalitách stejných lokalit. Rovněž nalezené vztahy nejsou potvrzeny u ostatních alkaloidů. Jediný možný vztah obsahů alkaloidu na sublokalitách jedné lokality je vztah v Bohušovicích (R=0,833), ovšem vzhledem k množství hodnot obsahů thebainu, které byly pod mezí detekce je tento výsledek relativizován. Jediný vztah, který byl potvrzen u více alkaloidů, byl mezi sublokalitami 1 v Bohušovicích a 2 v Hostěnicích, kde byla korelace mezi obsahy morfinu a dále mezi obsahy thebainu.
Vzhledem, k tomu, že tento výsledek nebyl potvrzen u
ostatních sublokalit, můžeme předpokládat, že korelace byla výrazně ovlivněna opět množstvím obsahů thebainu, které byly pod mezí detekce a dále malým rozsahem hodnot pro samotnou analýzu.
132
Tab. 76: Hodnoty Spearmanových korelačních koeficientů morfin b1 morfin b2 morfin c morfin h1 morfin h2 morfin m1 morfin m2
morfin b1 1,000 -0,183 0,150 -0,133 0,766* 0,866* 0,533
morfin b2 -0,183 1,000 -0,248 0,006 -0,321 -0,152 -0,442
kodein b1 kodein b2 kodein b1 kodein b2 kodein c kodein h1 kodein h2 kodein m1 kodein m2
narkotin b1 narkotin b2 narkotin c narkotin h1 narkotin h2 narkotin m1 narkotin m2
morfin c 0,150 -0,248 1,000 0,152 0,018 0,212 0,588
morfin h1 -0,133 0,006 0,152 1,000 0,067 -0,297 -0,152
morfin h2 morfin m1 morfin m2 0,766* 0,866* 0,533 -0,321 -0,152 -0,442 0,018 0,212 0,588 0,067 -0,297 -0,152 0,636* 0,455 1,000 0,636* 1,000 0,612 0,455 0,612 1,000
-0,400 -0,503 -0,430 1,000 -0,182 -0,503 -0,079
0,435 0,559 -0,176 -0,182 1,000 0,365 0,638*
kodein m1 0,317 0,164 0,042 -0,503 0,365 1,000 0,200
narkotin narkotin c b2
narkotin h1
narkotin h2
narkotin m1
narkotin m2
0,317 1,000 0,176 0,248 0,079 0,018 0,091
0,050 0,248 -0,261 1,000 -0,067 0,139 0,091
0,233 0,079 0,370 -0,067 1,000 -0,091 0,321
0,367 0,018 0,588 0,139 -0,091 1,000 0,709*
0,483 0,091 0,648* 0,091 0,321 0,709* 1,000
1,000 0,133 -0,433 -0,400 0,435 0,317 -0,167
0,133 1,000 0,030 -0,503 0,559 0,164 0,467
narkotin b1 1,000 0,317 0,500 0,050 0,233 0,367 0,483
kodein c kodein h1 kodein h2 -0,433 0,030 1,000 -0,430 -0,176 0,042 -0,103
0,500 0,176 1,000 -0,261 0,370 0,588 0,648*
kodein m2 -0,167 0,467 -0,103 -0,079 0,638* 0,200 1,000
papaverin papaverin papaverin papaverin papaverin papaverin papaverin b1 b2 c h1 h2 m1 m2 papaverin b1 papaverin b2 papaverin c papaverin h1 papaverin h2 papaverin m1 papaverin m2
1,000 0,167 -0,367 -0,450 0,300
0,167 1,000 -0,633 0,600 -0,133
-0,367 -0,633 1,000 -0,430 -0,503
-0,450 0,600 -0,430 1,000 -0,006
0,300 -0,133 -0,503 -0,006 1,000
0,367 -0,716* 0,164 -0,564 0,273
0,250 -0,433 0,418 -0,406 -0,212
0,367
-0,716*
0,164
-0,564
0,273
1,000
0,103
0,250
-0,433
0,418
-0,406
-0,212
0,103
1,000
thebain thebain thebain c thebain thebain thebain b1 b2 h1 h2 m1 thebain b1 1,000 0,833* 0,262 0,595 0,714* 0,667 thebain b2 0,833* 1,000 0,321 0,709* 0,552 0,455 thebain c 0,262 0,321 1,000 0,067 0,261 0,236 thebain h1 0,595 0,709* 0,067 1,000 0,491 0,079 thebain h2 0,714* 0,552 0,261 0,491 1,000 0,418 thebain m1 0,667 0,455 0,236 0,079 0,418 1,000 thebain m2 0,262 0,050 0,467 0,017 0,100 -0,117 Poznámka: b – Bohušovice (b1 – sublokalita 1 a b2 – sublokalita 2); c – Červený Újezd; h – Hostěnice; m – Mšené-lázně
133
thebain m2 0,262 0,050 0,467 0,017 0,100 -0,117 1,000
7.1.5.3 Vliv termínu sklizně Termín sklizně měl vliv na většinu sledovaných parametrů. Jediný parametr, který nevykazoval tendenci mezi dvěma odběry, byl obsah kadmia. Jak již bylo zmíněno dříve, byl obsah alkaloidů ve všech případech klesající od prvního do druhého termínu odběru, což je ve shodě s pozorováním dle Märculescu a Dobit (2001). Naopak stoupající tendenci vykazoval obsah prolinu. Toto vypovídá o vyšší míře stresu, ale jak bylo uvedeno u analýzy korelace, tento nárůst obsahu prolinu není jednoznačně vysvětlen obsahem těžkých kovů. Tab. 77: Vyhodnocení obsahů v prvním a druhém termínu odběru Mean 2. termín 225,8697 186,9055 20,39284 1,354613 15,11211
t-value
df
p
morfin kodein narkotin papaverin thebain
Mean 1. termín 280,2265 226,0310 32,36135 2,604149 29,47887
0,000134 0,001776 0,000015 0,042143 0,025374
Valid N 1. termín 118 118 117 114 45
Valid N 2. termín 118 118 117 114 45
Std.Dev. 1. termín 121,4741 110,1962 24,04961 5,880631 31,22746
Std.Dev. 2. termín 91,37912 76,99211 16,72806 2,834364 28,64294
F-ratio Variances 1,767150 2,048521 2,066925 4,304637 1,188606
p Variances 0,002270 0,000128 0,000113 0,000000 0,569048
3,884467 3,161626 4,419117 2,043703 2,274382
234 234 232 226 88
prolin
7,700457
8,552471
-2,19676
278
0,028863
140
140
2,727494
3,690629
1,830935
0,000412
kadmium zinek
1,594286 16,58000
1,563571 19,33786
0,743610 -2,88137
278 278
0,457741 0,004268
140 140
140 140
0,328233 7,249284
0,362090 8,700727
1,216941 1,440525
0,248334 0,032200
134
7.2 Nádobové pokusy 7.2.1 Obsah alkaloidů v rostlinách z nádobových pokusů Obsahy morfinu v rostlinách nádobových pokusů byly v porovnání s obsahy polních pokusů výrazně nižší. K podobnému závěru došli i Larkin et al. (2007), kteří uvádí redukci obsahu morfinu v rostlinách pěstovaných v nádobových pokusech. Ve srovnání s obsahy vybraných alkaloidů, které udávají Krenn et al. (1998), Prejapati et al. (2002), Bajpei et al. (2000), Schulz et al. (2008) a Szabó et al. (2008) byly pro většinu alkaloidů pod hranicí těmito autory udávaných intervalů obsahů. Zajímavým faktem je, že obsahy narkotinu byly srovnatelné s obsahy těchto alkaloidů v rostlinách z polních pokusů. Obsahy papaverinu byly v porovnání s obsahy v polních pokusech dokonce několikanásobně vyšší (tab. 78). Možným vysvětlením je zde odlišná biosyntéza těchto alkaloidů. Je tedy možné, že došlo k regulaci některého z kroků vedoucího od (S)-retikulinu k thebainu jak uvádí Facchini et al. (2007) a Hagel a Facchini (2010). Obr. 48: Obsah vybraných alkaloidů dle míry zatížení kadmiem a zinkem (mg.kg-1) 200 180 160 140 morfin
120
kodein
100
narkotin 80
papaverin
60
thebain
40 20 0 Cd1(N)
Cd2(N)
Cd3(N)
S(N)
Zn1(N)
135
Zn2(N)
Zn3(N)
Tab. 78: Přehled průměrných obsahů alkaloidů v rostlinách z nádobových pokusů (mg.kg-1) Zatížení morfin kodein narkotin papaverin thebain σ σ σ σ σ Cd1(N) 89,5 70,8 3,82 2,73 40,44 30,95 3,28 1,73 Cd2(N) 76,7 35,38 8,24 6,59 18,53 2,98 3,34 0,98 5,41 0,68 Cd3(N) 186,8 72,99 11,06 4,44 67,96 20,33 5,38 2,66 S(N) 71,7 46,58 4,45 2,84 14,14 8,54 5,81 5,82 10,31 0 Zn1(N) 74,2 29,72 5,05 3,72 30,85 11 6,21 3,38 12,82 4,61 Zn2(N) 82,4 23,49 6,48 1,8 22,7 3,51 3,68 1,36 23,15 12,65 Zn3(N) 70,6 16,57 4,22 1,4 27,8 8,56 7,43 4,97 5,13 0
7.2.2 Obsahy kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů Obsahy kadmia a zinku v makovině rostlin z nádobových pokusů byly výrazně vyšší v porovnání s obsahy těchto těžkých kovů v polních pokusech. To odpovídá i výrazně vyšší dávce těžkých kovů, která byla aplikována k rostlinám v přepočtu na kilogram zeminy. Obsahy kadmia a zinku byly rovněž vyšší ve vzorcích půdy (tab. 66). Obsahy těžkých kovů v makovině rovněž vykazovaly řadu extrémních hodnot v jednotlivých opakováních což je i vyjádřeno vysokou hodnotou směrodatné odchylky (tab. 65). Jak je patrné z obrázku 49, měla dávka aplikace kadmia a zinku Obr.
vliv na obsah těchto těžkých kovů v rostlině. Toto bylo v souladu s pozorováním, které provedli Chizzola (2001) a Škarpa et al. (2007). Obr. 49: Obsah kadmia a zinku v rostlinách z nádobových pokusů (mg.kg-1) 140 120 100 80 Cd 60
Zn
40 20 0 Cd1(N)
Cd2(N)
Cd3(N)
S(N)
Zn1(N)
Zn2(N)
136
Zn3(N)
7.2.3 Obsah kadmia a zinku v půdě nádobových pokusů Stejně jako v případě polních pokusů, byly obsahy kadmia a zinku zkoumány na jejich statisticky významnou odlišnost. Tato odlišnost byla potvrzena pro obsahy zinku v půdě. Odlišnost obsahů kadmia v půdě se opět nepodařilo prokázat (obr. 50). I zde je možným vysvětlením, že prvky byly spolu se zálivkou vyplaveny o čemž svědčí i obsahy těchto vybraných těžkých kovů v rostlinném materiálu. Obsahy těžkých kovů jsou i přes vyšší dávky porovnatelné s obsahy v polních pokusech. Obr. 50: Obsah kadmia a zinku v půdě nádobových pokusů (mg.kg-1) 4,5 4 3,5 3 2,5 Zn
2
Cd 1,5 1 0,5 0 Cd1(N)
Cd2(N)
Cd3(N)
S(N)
Zn1(N)
Zn2(N)
Zn3(N)
7.2.4 Obsah prolinu v rostlinách z nádobových pokusů Obsah prolinu byl v rostlinách z nádobových pokusů v porovnání s obsahy této aminokyseliny v rostlinách z polních pokusů nižší. Podobný zde byl fakt, že obsah prolinu byl u všech rostlin ve velice úzkém intervalu rozpínajícím se od 5,26 po 5,82 mg.kg-1. Rovněž již z obrázku 51 není patrný žádný trend obsahu v závislosti na Obr.
aplikační dávce kadmia a zinku. Stejně jako v případě polních pokusů je zde možné vysvětlení návrat obsahu prolinu na hladinu obsahu v kontrolních rostlinách, jak uvádí Balážová et al. (2008).
137
Obr. 51: Obsah prolinuv makovině dle míry zatížení kadmiem a zinkem (mg.kg-1) 5,9 5,8 5,7 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5,1 5 4,9 Prolin
Cd1(N)
Cd2(N)
Cd3(N)
S(N)
Zn1(N)
Zn2(N)
Zn3(N)
5,261
5,666
5,387
5,82
5,548
5,537
5,419
7.2.5 Statistické vyhodnocení nádobových pokusů
Jak je patrné z hodnot v tabulce 79, byla v nádobových pokusech vyloučena Tab.
nezávislost pouze ve třech případech. Shodně s polními pokusy se prokázal vztah mezi obsahy morfinu a kodeinu (obr. 52), kdy se stoupajícím obsahem morfinu v makovině byl i vyšší obsah kodeinu. Tentokrát byla prokázaná závislost silná, s korelačním koeficientem R = 0,761. Vztah je tak daný z 57,96 %. Podobně silná závislost pak byla prokázána i ve vztahu mezi morfinem a narkotinem, která dosahovala 56,6 % (R=0,752) (obr. 53). Jako možná závislost byla rovněž určena i mezi obsahy kodeinu a narkotinu (obr. 54). Jak již bylo zmíněno, jsou morfin a narkotin syntetizovány rozdílnou metabolickou cestou. Zmíněná závislost narkotinu a morfinu je tak pravděpodobně dána vlivem jiných faktorů, které ovlivňovaly již produkci (S)-retikulinu, coby společného prekurzoru. V podmínkách, které byly pozitivní pro produkci (S)-retikulinu tak docházelo i k vyšším obsahům morfinu a narkotinu v rostlinách. Tímto pozitivním efektem zde mohl být i výskyt jiného stresoru, jak například uvádí Szabó et al. (2008). Ze statistické analýzy nevyplývá závislost obsahu kadmia a zinku na obsah alkaloidů v makovině což je v případě kadmia ve shodě s pozorováním Škarpy et al. (2007). Rovněž nebyl prokázán vztah mezi obsahem těžkých kovů a obsahem prolinu, což stejně jako v případě polních pokusů může být dáno adaptací rostliny na stres
138
(Balážová et al., 2008). V polních pokusech byla dávka těžkých kovů orientována na praxi, a proto nemusela být dostatečná pro výskyt stresových vlivů na rostlinu, a tím dle autorů Nakamura et al., 2008; Sudha a Ravishankar, 2002; Kolodyazhnaya et al., 2009 pro stresovou reakci rostliny indikovanou zvýšenou produkcí prolinu. Tab. 79: Korelační matice vztahů jednotlivých parametrů v nádobových pokusech
V nádobových pokusech jsou korelační koeficienty výrazně vyšší než u polních pokusů. Tím je dána i průkaznější závislost jednotlivých jevů. Důvodem těchto průkaznějších hodnot je menší vliv dalších faktorů, které na rostliny v průběhu vegetace působí. Rostliny jsou v nádobových pokusech v prostředí bez extrémních vlivů podnebí, s kontrolou dalších případných stresových vlivů a dalších faktorů, které mohou ovlivnit obsahy alkaloidů v rostlině. Statistické vyhodnocení průměrných obsahů v jednotlivých variantách zatížení kadmiem a zinkem spolu s obsahy těchto těžkých kovů v půdě nádobových pokusů (tab. 66) udává silnou korelaci mezi obsahy zinku v půdě a morfinu (R=0,94), kodeinu (R=0,92) a narkotinu (R=0,80) (tab. 80). Vztah mezi obsahem zinku v substrátu a obsahem alkaloidů v máku udávají i Lovkova et al. (2006). Nicméně v této studii byl vztah obsahů záporný, tedy s narůstající koncentrací zinku se snižoval celkový obsah alkaloidů. Možnou příčinou zde byl malý soubor pozorování.
139
Tab. 80: Korelační matice vztahů průměrných hodnot jednotlivých parametrů v nádobových pokusech
Při analýze korelačních koeficientů dle Spearmana totiž korelační koeficient pro vztah morfin-zinek dosahoval pouhých 0,54 a pro vztah narkotin-zinek dokonce 0,18. Pouze pro vztah kodein-zinek byla prokázána pozitivní závislost vyjádřena korelačním koeficientem Rs=0,93. Pro jednoznačné určení tohoto vztahu by však bylo nutné potvrzení analýzou většího množství vzorků. Obr. 52: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy morfinu a kodeinu (mg.kg-1)
140
Obr. 53: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy morfinu a narkotinu (mg.kg-1)
Obr. 54: Grafické znázornění vztahu mezi obsahy kodeinu a narkotinu (mg.kg-1)
141
8 Závěr V rámci disertační práce byly zhodnoceny vlivy těžkých kovů na obsahy pěti alkaloidů v makovině máku setého. Pro pokusy byla zvolena odrůda Major, která byla pěstována na sedmi polních a jednom nádobovém pokusu. Pro zjištění míry stresu byl dále analyzován obsah prolinu v rostlinném materiálu. Zjištěné obsahy alkaloidů morfinu a kodeinu se ve většině případů nacházeli v intervalu obsahů uvedených jinými autory, avšak byly srovnatelné spíše s minimem těchto intervalů. Důvodem pro nízké obsahy může být především odrůdová odlišnost obsahů alkaloidů, jak uvádí Lachman et al. (2006) a Sharma et al. (1999). Při statistickém vyhodnocení obsahů všech sledovaných alkaloidů, vybraných těžkých kovů kadmia a zinku a aminokyseliny prolinu byly zjištěné závislosti, až na výjimky v nádobových pokusech, slabé. Závislost byla potvrzena ve vztazích: obsahy morfinu na kodeinu, morfinu na narkotinu, kodeinu na thebainu, kodeinu na zinku, kodeinu na narkotinu, kodeinu na kadmiu, narkotinu a papaverinu, narkotinu na zinku, papaverinu na prolinu, papaverinu na zinku a kadmia na zinku. První vyslovená hypotéza o vlivu obsahu kadmia a zinku v makovině na kvantitu a zastoupení alkaloidů v máku setém byla potvrzena v případě polních pokusů. I přesto jsou však nalezené vztahy slabé. Můžeme říci, že se zvyšujícím se obsahem kadmia v makovině se snižuje množství kodeinu a se zvyšujícím se obsahem zinku v makovině se snižuje množství kodeinu a narkotinu. Vzhledem ke slabým závislostem není možné prokázat primární vliv těžkých kovů na obsah alkaloidů a jedná se tak spíše o jeden z mnoha faktorů ovlivňující produkci alkaloidů v máku setém. Z uvedených vztahů zároveň vyplývá, že existuje vztah mezi obsahy jednotlivých alkaloidů v rostlině, což byla druhá zkoumaná hypotéza. Vztahy mezi alkaloidy byly prokázány obzvláště u morfinu a kodeinu. Tento vztah byl statisticky potvrzen v makovině z obou termínů odběru a také v rostlinách z nádobových pokusů. Vztah mezi těmito alkaloidy je pozitivní, a tak s přibývajícím množstvím morfinu je zvýšené i množství kodeinu v makovině. Tento vztah je dán především tím, že kodein je prekurzorem morfinu. Na základě tohoto argumentu by se dala očekávat i závislost obsahu morfinu a kodeinu na obsahu thebainu v makovině. Tento vztah se však nepodařilo s dostatečnou jistotou prokázat. Naproti tomu byl statisticky významný vztah obsahu
142
morfinu a narkotinu. Tento vztah byl nejvíce statisticky průkazný v rostlinách pěstovaných v nádobových pokusech. Vliv obsahu kadmia a zinku v půdě na obsah těžkých kovů v makovině nebyl i přes vysoké dávky kadmia a zinku do půdy potvrzen. Předpoklad, že s vysokou dávkou kadmia, případně zinku budou tyto prvky i ve vysoké míře v půdě tak nebyl naplněn. Možným vysvětlením je zde časový odstup aplikace těžkých kovů od termínu odběru půdních vzorků. Během této doby pravděpodobně došlo k vyplavení kadmia a zinku při zálivce a částečnému převodu z půdy do rostliny. Toto potvrzují i obsahy kadmia a zinku v makovině, které jsou vyšší v makovině rostlin, ke kterým byly aplikovány vyšší dávky těchto těžkých kovů. Z toho vyplývá, že pro analýzu vlivu kadmia a zinku na obsahy alkaloidů je vhodnější zkoumat obsahy těchto prvků přímo v rostlinném materiálu. Z analýzy korelace mezi obsahy prolinu a obsahy kadmia a zinku, která byla provedena na základě vyslovení hypotézy o možnosti určení míry stresu máku na základě obsahu prolinu v rostlině, je patrné, že se nepodařilo prokázat vztah mezi prolinem a oběma těžkými kovy. Obsah prolinu tak byl na aplikovaných dávkách těžkých kovů nezávislý. Vyslovená hypotéza o tom, že dávka kadmia a zinku při aplikaci na list ovlivňuje množství a složení alkaloidů v makovině, byla rovněž potvrzena pro vybrané alkaloidy. Pro potvrzení této hypotézy bylo nutné nejdříve stanovit, zda aplikace kadmia a zinku na list má vliv na obsah těchto těžkých kovů v makovině. Tato závislost byla potvrzena srovnáním průměrných obsahů a mediánů obsahů kadmia a zinku v jednotlivých variantách. Zde byl s vyšším zatížením vybraným těžkým kovem i vyšší obsah tohoto kovu v makovině. V druhém kroku byla provedena statistická analýza testování korelačních koeficientů, při které byl statisticky průkazný negativní vztah mezi obsahem kadmia a obsahem kodeinu a mezi obsahem zinku a kodeinu a zinku a narkotinu a naopak pozitivní vztah mezi obsahy zinku a papaverinu. Zároveň se podařilo prokázat pozitivní vztah mezi obsahem kadmia a obsahem zinku v makovině, kdy se vzrůstajícím obsahem kadmia v makovině vzrůstá i obsah zinku v makovině.
143
9 Literatura Abdel-Sabour, M.F., Mortvedt, J.J., Kelsoe, J.J.: Cadmium–zinc interactions in plants and extractable cadmium and zinc fractions in soil. Soil Science, 145, 1988, 424–431. Allen, R.S., Miller, J.A. C., Chitty, J.A., Fist, A.J., Gerlach, W.L, Larkin, P.J.: Metabolic engineering of morphinan alkaloids by over-expression and RNAi suppression of Salutaridinol-7-O-acetyltransferase in opium poppy. Plant Biotechnology Journal, 6, 2008, 22–30. Bajpai, S., Gupta, A.P., Gupta, M.M., Sharma, S., Govil, C.M., Kumar, S.: Interrelation between descriptors and morphine yield in Asian germplasm of opium poppy Papaver somniferum. Genetic Resources and Crop Evolution, 47, 315322. Balážová, A., Psenak, M.: Tvorba morfinanov: Enzymový a molekulárno-biologický aspekt, Chemické Listy, 92, 1998, 1006-1015. Balažová, A., Bilka, F., Blanáriková, V., Bilková, A.: Effect of salt stress on content of proline, sanguinarine formation and polyphenol oxidase activity in poppy seedlings. Acta Facultatis Pharmaceuticae Universitatis Comenianae, 55, 2008, 51-57. Balík, J., Tlustoš, P., Száková, J., Pavlíková, D., Černý, J.: The accumulation of zinc in oat grown in soils treated by incubated sewage sludge with peat and straw. Rostlinná výroba, 48 (12), 2002, 548–555. Barančíková, G., Makovníková, J.: The influence of humic acid quality on the sorption and mobility of heavy metals. Plant Soil Environment, 49 (12), 2003, 565–571. Bataillard, P., Cambier, P., Picot, C.: Short-termtransformations of lead and cadmium compounds in soil after contamination. European Journal of Soil Science, 54, 2003, 365–376. Bates, S.: Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil, 39, 1973, 205–207. Bennett, R.N., Wallsgrove, R. M.: Tansley Review No. 72 - Secondary metabolites in plant defence mechanisms. New Phytologist, 127, 1994, 617-633. Bentley, K.W.: The Chemistry of the Morphine Alkaloids. Clarendon Press Oxford, 1954. Bhat, S.V., Nagasampagi, B.A., Sivakumar, M.: Chemistry of Natural Products. Springer Verlag, Berlin, 2005. Boit, H.G.: Fortschritte der Alkaloidchemie seit 1933. Akademia Verlag Berlin, 1950. Bovet, L., Eggmann, T., Meylan-Bettex, M., Polier, J., Kammer, P., Marin, E., Feller, U., Martinoia, E.: Transcript levels of AtMRPs after cadmium treatment: induction of AtMRP3. Plant, Cell and Environment, 26, 2003, 371–381. Cakmak, I., Welch, R.M., Hart, J., Norvell, W.A., Oztürk, L., Kochian, L.V.: Uptake and retranslocation of leaf‐applied cadmium (109Cd) in diploid, tetraploid and hexaploid wheats. Journal of Experimental Botany, 51 (343), 1999, 221-226. Cihlář, P.: Aplikace fungicidů do porostů máku, Agrotip 5, 2006. Citovsky, V., Ghoshroy, S., Tsui, F. and Klessig, D.F.: Nontoxic concentrations of cadmium bit tobamoviral systemic movement by a salicylic acid-independent mechanism. Plant Journal, 16, 1998, 13-20. Clemens, S., Kim, E.J., Neumann, D., and Schroeder, J.I.: Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast. EMBO Journal, 18, 1999, 3325–3333. 144
Clemens, S: Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta, 212, 2001, 475–486. Di Martino, C., Delfine, S., Pizzuto, R., Loreto, F., Fuggi, A.: Free amino acids and glycine betaine in leaf osmoregulation of spinach responding to increasing salt stress. New Phytologist,158, 2003, 455–463. Dinakar, N., Nagajyothi, P.C., Suresh, S., Damodharam, T., Suresh, C.: Cadmium induced changes on proline, antioxidant enzymes, nitrate and nitrite reductases in Arachis hypogaea L.. Journal of Experimental Biology, 30 (2), 2009, 289-294. Döpke, W.: Einführung in die Chemie der Alkaloide. Akademia Verlag Berlin, 1968. Facchini, P.J., Bird, D.A.: Developmental regulation of benzyisoquinoline alkaloid byosinthesis in opium poppy plants and tissue cultures. In Vitro Cellular Development Biology & Plant, 34, 1998, .69–79. Facchini, P.J., Hagel, J.M., Liscombe, D.K., Loukanina, N., MacLeod, B.P., Samanani, N., Zulak, K.G.: Opium poppy: blueprint for an alkaloid factory. Phytochemistry Reviews, 6, 2007, 97–124. Fairbairn, J.W., Handa, S.S., Gürkan, E., Phillipson, J.D.: In Vitro conversion of morphine to its N-oxide in Papaver somniferum latex, Phytochemistry, 17, 1978, 261-262. Fairbairn, J.W., Steele, M.J.: Bound forms of alkaloids in Papaver somniferum and P. bracteatum. Phytochemistry, 19, 1980, 2317-2321. Felklová, M., Ferenčík, S.: Vliv termínu výsevu na produkci makoviny a výtěžek morfinu z máku setého (Papaver somniferum L.). Československá farmacie, 31 (6), 1982, 214-218. Felklová, M., Veverková, Š.: Výnos makoviny a obsah morfinu Papaver somniferum L. v různých klimatických podmínkách. Československá farmacie, 32 (3-4), 1983, 133-139. Fogl, J.: Charakteristika výzkumné stanice AF ČZU v Praze – Červený Újezd. Agrokom, 2000. Fojtová, M., Kovařík, A.: Genotoxic effect of cadmium is associated with apoptotic changes in tobacco cells. Plant, Cell & Environment. 23 (5), 2000, 531-537. Frérot, H., Lefèbvre, C., Petit, C., Collin, C., Dos Santos, A., Escarré, J.: Zinc tolerance and hyperaccumulation in F1 and F2 offspring from intra and interecotype crosses of Thlaspi caerulescens. New Phytologist, 165, 2005, 111–119. Furze J.M., Rhodes M.J.C., Parr A.J., Robins R.J., Withehead I.M., Threlfall D.R.: Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultrures of Datura stramonium. Plant Cell Reports, 10 (3), 1991, 111-114. Gasic, K., Korban, S.: Heavy metal stress. Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants, Springer Netherlands, 2006, 219-254. Geiken, B., Masohlídek, J., Rizzuto, M., Pompili, M.L., Giardi, M. T.: Incorporation of [35S]methionine in higher plants reveals that stimulation of the D1 reaction centre II protein turnover accompanies tolerance to heavy metal stress. Plant, Cell & Environment, 21 (12), 1998, 1265-1273. Ghiorghitǎ, G.I., Gille, E.V., Roşu, R.: The Morphine content – a selection criterion in obtaining some more productive forms of Papaver somniferum by means of experimental mutagenesis. I. Effects of the succesive treatments with gamma rays and alkylating agents in the 4th generation, Revue Roumaine de Biochimie, 21 (4), 1984, 279-286. 145
Goodwin, T.W., Mercer, E.I.,: Introduction to Plant Biochemistry. Pergamon Press, Oxford, 1983. Guguta, C., Peters, T.P.J., de Gelder, R.: Structural Investigations of Hydrate, Anhydrate, Free Base, and Hydrochloride Forms of Morphine and Naloxone. Crystal Growth & Design, 8 (11), 2008, 4150-4158. Haensler, J.: Phytoremediation schwermetallbelasteter Böden durch einjährige Pflanzen in Einzel- und Mischkultur. Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, 2003. Hagel, J.M., Facchini, P.J.: Dioxygenases catalyze the O-demethylation steps of morphine biosynthesis in opium poppy. Nature Chemical Biology, 6, 2010, 273–275. Hare, P.D., Cress, W.A., van Staden, J.: Proline synthesis and degradation: a model system for elucidating stress-related signal transduction. Journal of Experimental Botany, 50 (333), 1999, 413–434. Harris, N.S., Taylor, G.J.: Remobilization of cadmium in maturing shoots of near isogenic lines of durum wheat that differ in grain cadmium accumulation, Journal of Experimental Botany, 52 (360), 2001, 1473-1481. Hoffmann, J., Blasenbrei, P.: Cadmium in blue poppy seeds and poppy seedcontaining products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 182 (2), 1986, 121-122. Hovmand, M.F., Tjell, J.C., Mosbaek, H.: Plant uptake of airborne cadmium. Environmental Pollution. 30 (A), 1983, 27–38. Hsu A.F., Pack J.: Metabolism of 14C-codeine in cell cultures of Papaver somniferum. Phytochemistry, 28 (7), 1989, 1879-1881. Chen, Z., Cuin, T.A., Zhou, M., Twomey, A., Naidu, B.P., Shabala, S.: Compatible solute accumulation and stress-mitigating effects in barley genotypes contrasting in their salt tolerance. Journal of Experimental Botany, 58, 2007, 4245-4255. Chizzola, R.: Comparative cadmium uptake and mineral composition of cadmium treated Papaver somniferum, Triticum durum and Phaseolus vulgaris. Journal of Applied Botany, 71 (5-6), 1997, 147-153. Chizzola R.: Micronutrient composition of Papaver somniferum L. grown under low cadmium stress condition. Journal of Plant Nutrition, 24 (11), 2001, 16631677. Chizzola, R., Mitteregger, U.: Cadmium and Zinc Interactions in Trace Element Accumulation in Chamomile. Journal of Plant Nutrition, 28 (8), 2005, 1383 – 1396. Jamalomidi, M., Esfahani, M., Carapetian, J.: Zinc and salinity interaction on agronomical traits, chlorophyll and proline content in lowland rice (Oryza sativa L.) genotypes. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9 (7), 2009, 13151319. Kadereit, J.W.: Sectional affinities and geographical distribution in the genus Papaver L. (Papaveraceae). Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 63, 1988, 139-156. Kavikishor, P.B., Sangam, S., Amrutha, R.N., Sri Laxmi, P., Naidu, K.R., Rao, K.R.S.S., Rao, S., Reedy, K.J., Theriappan, P., Sreenivasulu, N.: Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Current Science, 88, 2005, 424-438. Kilian, J., Whitehead, D., Horak, J., Wanke, D., Weinl, S., Batistic, O., D’Angelo, C., Bornberg-Bauer, E., Kudla, J., Harter, K.: The AtGenExpress global stress 146
expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. The Plant Journal, 50, 2007, 347– 363. Kim, D.-Y., Bovet, L., Maeshima, M., Martinoia, E., Lee, Y.: The ABC transporter AtPDR8 is a cadmium extrusion pump conferring heavy metal resistance. The Plant Journal, 50 (2), 2007, 207-218. Kindl, H.: Biochemie der Pflanzen. Springer-Lehrbuch, 3. Auflage, Berlin, 1991. Kol. autorů.: Zemědělství 2006. MZE, 2007. Kolodyazhnaya, Y.S., Kutsokon, N.K., Levenko, B.A., Syutikova, O.S., Rakhmetov, D.B., Kochetov, A.V.: Transgenic Plants Tolerant to Abiotic Stresses. Cytology and Genetics, 43 (2), 2009, 132–149. Kosek, Z., Bečvář, J.: Sklizeň máku s makovinou v roce 2004. 4. Makový občasník, 2005. 18-22. Kouteník, V.: Chemie – Systematika prvků. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 1996. Krenn, L., Glantschnig, S., Sorgner, U.: Determination of the five major opium alkaloids by reverse-phase high-performance liquid chromatography on a base-deactivated stationary phase. Chromatographia, 47 (1/2), 1998, 21-24. Kroutil, P., Štranc, P., Prokinová, E., Vašák, J.: Vliv brukvovitých plodin a hnojení sírou na výskyt chorob a škůdců. Sborník „Řepka, Mák, Hořčice“, 2003, 69-75. Lachman, J., Hejtmánková, A., Miholová D., Kolihová, D., Tluka, P.: Relations among alkaloids, cadmium and zinc contents in opium poppy (Papaver somniferum L.). Plant Soil Environment, 52 (6), 2006, 282-288. Larkin, P.J. Miller, J.A.C, Allen, R.S., Chitty, J.A., Gerlach, W.L., Frick, S., Kutchan, T.M., Fist, A.J.: Increasing morphinan alkaloid production by over-expressing codeinone reductase in transgenic Papaver somniferum. Plant Biotechnology Journal, 5, 2007, 26–37. Lee, K.T., Yamakawa, T., Kodaky, T., Shimomura K.: Effects of chemicals on alkaloid production by transformed roots of belladona. Phytochemistry, 49 (8), 1998, 2343-2347. Lovkova, M.Ya., Buzuk, G.N., Sokolova, S. M.: Regulatory Role of Elements in the Formation and Accumulation of Alkaloids in Papaver somniferum L. seedlings. Applied Biochemistry and Microbiology, 42 (4), 2006, 420–423. Mahdavi, M., Jafari, J.: Environmental Risks due to Application of Sewage Sludge in Farmlands. Ozean Journal of Applied Sciences, 3(2), 2010, 303-311 Märculescu, A., Dobiţ, D.: Studies of the Morphine Content of Papaver somniferum L.. Roumanian Biotechnological Letters, 6 (5), 2001, 403-409. Mathew, U., Venugopal, V. K., Saraswathi, P.: Cadmium content of plants as affected by soil application of cadmium and farmyard manure. Journal of Tropical Agriculture, 40 (½), 2002, 78-80. May, T.W., Scholz, R.W., Nothbaum, N.: Die Anwendung des Donator-AkzeptorModells am Beispiel Cadmium für den Pfad „Boden-Wizen-Mensch“. Ableitung von Sanierungswerten für kontaminierte Böden, 1991, 99-183. Meadway, C., George, S., Braithwaite, R.: Opiate concentrations following the ingestion of poppy seed products—evidence for ‘the poppy seed defence’. Forensic Science International, 96 (1),1998, 29-38. Mendoza-Cózatl, D.G., Butko, E., Springer, F., Torpey, J.W., Komives, E.A., Kehr, J., Schroeder, J.I.: Identification of high levels of phytochelatins, glutathione and cadmium in the phloem sap of Brassica napus. A role for thiol-peptides in the
147
long-distance transport of cadmium and the effect of cadmium on iron translocation, The Plant Journal, 54, 2008, 249–259. Mirouze, M., Sels, J., Richard, O., Czernic, P., Loubet, S., Jacquier, A., Francois, I.E.J.A., Cammue, B.P.A., Lebrun, M., Berthomieu, P., Marques, L.: A putative novel role for plant defensins: a defensin from the zinc hyper-accumulating plant, Arabidopsis halleri, confers zinc tolerance. The Plant Journal, 47, 2006, 329–342. Möller, M.R., Hammer, K., Engel, O.: Poppy seed consumption and toxicological analysis of blood and urine samples. Forensic Science International, 143 (23), 2004, 183-186. Morimoto, S., Suemori, K., Taura, F., Shoyama, Y.: New dimeric morphine from opium poppy (Papaver somuniferum) and its physiological function. Journal of Natural Products, 66 (7), 2003, 987-989. Moss, G.P.: International Union of Biochemistry and Molecular Biology: the web version [online]. London (Great Britain): Queen Mary University, 2002. [cit. 2005-3-4]. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/alkaloid/42178.html, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/alkaloid/morphine.html, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/alkaloid/retic.html, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/alkaloid/thebaine.html, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/AminoAcid/dopa.html Nakamura, S., Akiyama, C., Sasaki, T., Hattori, H., Chino, M.: Effect of cadmium on the chemical composition of xylem exudate from oilseed rape plants (Brassica napus L.). Soil Science and Plant Nutrition, 54, 2008, 118–127. Neseper, C.L., Allen, R.D., Galewsky, S.: Identification and characterization of latexspecific proteins in opium poppy. Plant Physiology, 79, 1985, 499-504. Niknam, V., Razavi, N., Ebrahimzadeh, H., Sharifizadeh, B.: Effect of NaCl on biomass, proteine and proline contents, and antioxidant enzymes in seedlings and calli of two Trigonella species. Biologia Plantarum, 50, 2006, 591-596. Novák, J., Bechyně, M.: Biologie máku a systém jeho produkce. Vysoká škola zemědělská v Praze, 1987. Novák, J., Preininger, V.: Taxonomické a fytochemické hodnocení rodu Papaver (Papaveraceae). Vysoká škola zemědělská v Praze. 1981. Novák, J.: Genetické zdroje Papaver somniferum L. a příbuzných druhů. Vysoká škola zemědělská v Praze, 1990. Ozkutlu, F., Ozturk, L., Erdem, H., McLaughlin, M.J., Cakmak. I.: Leaf-applied sodium chloride promotes cadmium accumulation in durum wheat grain. Plant and Soil, 290, 2007, 323-331. Pavlíková, D., Balík, J., Tlustoš, P.: Effect of cadmium content in soil and crop rotation on cadmium accumulation in plant biomass. Ecological Chemistry and Engineering, 14 (3-4), 2007, 363-369. Pelders M.G., Ros J.J.W.: Poppy seeds: Differences in morphine and codeine content and variation in inter- and intra-individual excretion. Journal of Forensic Science, 41 (2),1996, 209-12. Phillipson, J. D., Roberts, M. F., Zenk, M. H.: The Chemistry and Biology of Isoquinoline Alkaloids. Springer Verlag Berlin, 1985. Pienkny, S., Brandt, W., Schmidt, J., Kramell, R., Ziegler, J.: Functional characterization of a novel benzylisoquinoline O-methyltransferase suggests
148
its involvement in papaverine biosynthesis in opium poppy (Papaver somniferum L). Plant Journal, 60 (1), 2009, 56-67. Pitta-Alvarez, S.I., Spolansky, T.C., Giulietti, A.M.: The influence of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida. Enzyme And Microbial Technology, 26 (2-4), 2000, 255-258. Poláková, L.: Perspektivy pro mák v letošním roce. Agroweb, http://www.agroweb.cz/rostlinna-vyroba/Perspektivy-pro-mak-v-letosnimroce__s44x27346.html Prajapati, S., Bajpai, S., Singh, D., Luthra, R., Gupta, M.M., Kumar, S.: Alkaloid profiles of the Indian land races of the opium poppy Papaver somniferum L.. Genetic Resources and Crop Evolution, 1–0, 2002, 1-6. Procházka, S, Macháčková, I., Krekule, J., Šebánek, J., et al: Fyziologie rostlin. Academia Praha, 1998. Rauser, W.E.: Phytochelatins and related peptides: Structure, biosynthesis and function. Plant Physiology, 109, 1995, 1141-1149. Rhodes, D., Verslues, P.E., Sharp, R.E.: Role of amino acids in abiotic stress resistance. In (BK Singh ed.) “Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology”, Marcel Dekker, New York (USA), 1999, 319-356. Roberts, F.M., McCarthy, D., Kutcham, T.M., Coscia, C.J.: Localization of enzymes and alkaloid metabolites in Papaver latex, Archives of Biochemistry and Biophysics, 222 (2), 1983, 599-609. Rodriguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M., Zabalza, A., Corpas, F.J., Gomez, M., Del Río, L.A., Sandalio, L.M.: Cadmium effect on oxdative metabolism of pea (Pisum sativum L.) roots. Imaging of reactive oxygen species and nitric oxide accumulation in vivo. Plant, Cell and Environment, 29, 2006, 1532-1544. Romero-Puertas, M.C., Rodriguez-Serrano, M., Corpas, F.J., Gomez, M., Del Río, L.A.: Cadmium induced subcellular accumulation of O2 a H2O2 in pea leaves. Plant, Cell and Environment, 27, 2004, 1122-1134. Rotrekl, J.: Hmyzí škůdci na máku a ochranná opatření proti nim. Agromanuál, 1 (5), 2006, 43–45. Sharma, J.R., Lal, R.K., Gupta, A.P., Mistra, H.O., Pant, V., Singh, N.K., Pandey, V.: Development of non-narcotic (opiumless and alkaloid-free) opium poppy, Papaver somniferum. Plant Breeding, 118, 1999, 449–452. Shukla, S., Singh, S.P., Yadav, H.K., Chatterjee, A.: Alkaloid spectrum of different germplasm lines in opium poppy (Papaver somniferum L.). Genetic Resources and Crop Evolution, 53, 2006, 533–540. Schulz, H., Baranska, M., Quilitzsch, R., Schütze, W.: Determination of alkaloids in capsules, milk and ethanolic extracts of poppy (Papaver somniferum L.) by ATR-FT-IR and FT-Raman spectroscopy. The Analyst, 129, 2008, 917-920. Schützendübel, A., Schwanz, P., Teichmann, T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold, D.L., Polle, A.:Cadmium-Induced Changes in Antioxidative Systems, Hydrogen Peroxide Content, and Differentiation in Scots Pine Roots. Plant Physiology, 127 (3), 2001, 887–898. Singh, R.P., Agrawal, M.: Potential benefits and risks of land application of sewage sludge. Waste Management, 28 (2), 2008, 347-358. Spitzer, T.: Mohou fungicidy ovlivnit obsah těžkých kovů v semenech máku a makovině?. Obilnářské listy, 3, 2000. Staněk J.: Alkaloidy. Československá akademie věd, 1957.
149
Steppuhn, A., Baldwin, I.T.: Resistance management in a native plant: nicotine prevents herbivores from compensating for plant protease inhibitors. Ecology Letters, 10 (6), 2007 499–511. Sudha, G., Ravishankar, G.A.: Involvement and interaction of various signaling compounds on the plant metabolic events during defense response, resistance to stress factors, formation of secondary metabolites and their molecular aspects. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 71, 2002, 181–212. Szabados, L, Savoure, A.: Proline: a multifunctional amino acid. Trends in Plant Science, 15 (2), 2010, 89-97. Szabó, B., Lakatos, A., Koszegi, T., Botz, L.: Investigation of abiogenic stress induced alterations in the level of secondary metabolites in poppy plants (Papaver somniferum L.). Acta Biologica Hungarica 59 (4), 2008, 425-438. Škarpa, P., Lošák, T., Richter, R.: Effect of magnesium fertilisation with soil supplementation of cadmium on the yield and qualitative parameters of poppy (Papaver somniferum). Ecological Chemistry and Engeneering, 14 (8), 2007, 875-881. Tan-Kristanto, A., Hoffmann, A., Woods, R., Batterham, P., Cobbett, C., Sinclair, C.: Translational asymmetry as a sensitive indicator of cadmium stress in plants: a laboratory test with wild-type and mutant Arabidopsis thaliana. New Phytologist, 159, 2003, 471–477. Tluka, P., Lachman, J., Hejtmánková, A., Miholová, D., Kolihová, D.: Vliv vybraných abiotických stresových faktorů (kadmiem a zinkem) na obsah a složení alkaloidů máku (Papaver sp.). Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2007 – Sborník příspěvků, VÚRV a ČZU, Praha, 2007, 409414. Tlustoš, P., Mühlbachová, G., Balík, J., Komárek, M., Pavlíková, D., Száková, J., Najmanová, J., Jakl, M.: Vývoj a optimalizace fytoremediační technologie s využitím podporované fytoextrakce těžkých kovů při zachování biologické stability půd. Redakčně upravená zpráva o průběhu a výsledcích řešení projektu QH 81167 za rok 2008, ČZU, 2008. Toivonen, L., Laakso, S., Rosenqvist, H.: The Efffect of temperature on hairy root cultures of Catharanthus roseus growth, indole alkaloid accumulation and membrane lipid composition. Plant Cell Reports, 11 (8), 1992, 395-399. Tookey, H.L., Spencer, G.F., Grove, M.D., Kwolek, W.F.: Codeine and morphine in Papaver somniferum grown in a controlled environment. Planta medica, 30 (4), 1976, 331-336. Tripathi, B.N., Gaur, J.P.: Relationship between copper- and zinc-induced oxidative stress and proline accumulation in Scenedesmus sp.. Planta, 219, 2004, 397404. Ueki, S., Citovsky V.: Inhibition of systemic onset of post-transcriptional gene silencing by non-toxic concentrations of cadmium. The Plant Journal, 28(3), 2001, 283-291. Usťak, S., Váňa, V., Honzík, R., Slejška, A.: Kauzální monitoring vlivu imisí na zemědělskou výrobu - 2004 – 2008. Výroční zpráva úkolu číslo 9/MCL/2008, Výzkumný ústav rostlinné produkce v Praze, 2009. Vande-Weghe, J.G., Ow, D.W.: Accumulation of metal-binding peptides in fission yeast requires hmt2 1, Molecular Microbiology, 42(1), 2001, 29–36. Vendruscoloa, E.C.G., Schusterb, I., Pileggic, M., Scapimd, C.A., Molinarie, H.B.C., Marure, C.J., Vieirae, .G.E.: Stress-induced synthesis of proline confers
150
tolerance to water deficit in transgenic wheat. Journal of Plant Physiology, 164, 2007, 1367-1376. Vij, S., Tyagi, A.K.: Emerging trends in the functional genomics of the abiotic stress response in crop plants. Plant Biotechnology Journal, 5, 2007, 361–380. Vlk, R.: Možnosti zvyšování obsahu morfinu v makovině. 3. Makový občasník, 2004, 77-80. Vodrážka, Z.: Biochemie. Academia, Praha, 1999. Vrbovský, V.: Odrůdy máku. Semináře pro pěstitele máku a slunečnice, rentabilní technologie pěstování při dodržení zásad Cross-compliance, 2009. 24-33. Weghe, J.G.V, Ow, D.W.: Accumulation of metal-binding peptides in fission yeast requires hmt2+. Molecular Microbiolog. 42 (1), 2001, 29-36. Weid, M., Ziegler, J., Kutchan, T.M.: The roles of latex and the vascular bundle in morphine biosynthesis in the opium poppy, Papaver somniferum. Plant Biology, 101 (38), 2004, 13957–13962. Weid, M.: Gewebe- und zellspezifische Lokalisation der Alkaloidbiosynthese in Papaver somniferum L.. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der MathematischNaturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, 2004. Widodo, Patterson, J.H., Newbigin, E., Tester, M., Bacic, A., Roessner, U.: Metabolic responses to salt stress of barley (Hordeum vulgare L.) cultivars, Sahara and Clipper, which differ in salinity tolerance. Journal of Experimental Botany, 60, 2009, 4089–4103. Zehnálek, P.: Současné trendy ve šlechtění máku setého a jejich odraz v registračním řízení ÚKZÚZ. 1. Makový občasník, 2002, 17-19. Zenk, M.H.: Heavy metal detoxification in higher plants: a review. Gene.179, 1996, 21–30. Ziegler, J., Diaz-Chávez, M.L., Kramell, R., Ammer, C., Kutchan, T.M.: Comparative macroarray analysis of morphine containing Papaver somniferum and eight morphine free Papaver species identifies an O-methyltransferase involved in benzylisoquinoline biosynthesis. Planta, 222 (3), 2005, 458-471. Ziegler, J., Facchini, P.J., Geissler, R., Schmidt, J., Ammer, Ch., Kramell, R., Voigtlander, S., Gesell, A., Pienkny, S., Brandt, W.: Evolution of morphine biosynthesis in opium poppy. Phytochemistry, 70, 2009, 1696–1707. Zukalová, H., Cihlář, P., Vašák, J.: Kvalita máku a makoviny v roce 2007. Sborník z konference „Prosperující olejniny“, 2008, 93-96.
151
