ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin
Charakterizace a diagnostika latentního viru meruňky disertační práce
Autor: Ing. Lenka Grimová Školitel: Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CSc. Konzultant: Ing. Miloslav Zouhar, PhD.
Praha 2011
Prohlašuji, že jsem tuto disertační práci vypracovala samostatně, pod vedením vedoucího disertační práce a s použitím citované literatury.
V Praze dne 26.3.2011
Ing. Lenka Grimová
Poděkování Na tomto místě bych ráda vyjádřila svou nejhlubší a srdečnou vděčnost všem, kteří jakýmkoliv způsobem přispěli k sepsání této práce. Především děkuji vedoucímu mé disertační práce Doc. Ing. Pavlu Ryšánkovi, CSc. za jeho odborné vedení, cenné rady, za jeho lidský přístup a vloženou důvěru v mé pracovní schopnosti. Mému konzultantovi a kolegovi Ing. Miloslavu Zouharovi, PhD. bych chtěla poděkovat za pomoc při zpracování laboratorních pokusů a za živé obohacující diskuze nad danou problematikou. Mé velké díky patří i Ing. Janě Mazákové, PhD. za její pomoc při závěrečném zpracování této práce a za její laskavost a dobrotu. Rovněž bych chtěla poděkovat mým spolužákům a kolegům z katedry ochrany rostlin za vytvoření klidné a přátelské atmosféry na našem pracovišti. Touto cestou také děkuji svým kolegům z Università Degli Studi Di Bari v Itálii za nabídnutou možnost působení na jejich pracovišti a za neocenitelné zkušenosti, které jsem díky nim v průběhu mých studijních stáží na tamní katedře získala. Jmenovitě bych chtěla poděkovat Dr. Maxovi Morelli za jeho spolupráci a za jeho upřímné přátelství. Mé poděkování také patří Doc. RNDr. Karlu Petrzikovi CSc. z Ústavu molekulární biologie rostlin Akademie věd České republiky za jeho cenné rady a doporučení při přípravě vzorků na klonování a sekvenování. Dále bych chtěla vyjádřit své díky mým nejlepším kamarádům, kteří respektovali mou práci a snažili se mé nadšení pro vědu, ač často bezvýsledně, ale zcela upřímně, vždy pochopit. Závěrem bych ráda z celého srdce poděkovala mým úžasným rodičům a mé milované sestře za neuvěřitelnou psychickou podporu, bez které by tato práce nebyla nikdy dokončena.
Tato disertační práce byla vypracována v rámci řešení projektů Národní agentury pro zemědělský výzkum Ministerstva zemědělství ČR - QG60123 „Výzkum a inovace postupů diagnostiky hospodářsky významných, regulovaných a karanténních fytopatogenních organismů pro systém certifikace ovocných dřevin s důrazem na molekulární metody“ a s přispěním výzkumného záměru MSM 6046070901 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR.
Obsah
Obsah 1. Úvod _______________________________________________________________1 2. Literární přehled ____________________________________________________2 2.1. Pěstování peckovin v České republice ______________________________________2 2.2. Viry peckovin __________________________________________________________2 2.2.1. Stručná charakteristika vybraných virů peckovin __________________________________ 3
2.3. Viry peckovin na území České republiky ___________________________________4 2.4. Čeleď Betaflexiviridae ___________________________________________________5 2.5. Rod Foveavirus_________________________________________________________6 2.5.1. Zástupci rodu Foveavirus ____________________________________________________ 7
2.7. Apricot latent virus ______________________________________________________8 2.7.1. Biologické vlastnosti ApLV __________________________________________________ 9 2.7.2. Molekulární vlastnosti ApLV ________________________________________________ 10 2.7.3. Geografické rozšíření ApLV _________________________________________________ 10 2.7.4. Metody detekce ApLV _____________________________________________________ 11 2.7.5. ApLV versus „Peach asteroid spot disease“ ____________________________________ 12
2.8. Hospodářský význam virů peckovin ______________________________________13 2.9. Ochrana proti virovým chorobám peckovin ________________________________14 2.9.1. Certifikační programy pro produkci zdravého pěstebního materiálu __________________ 15
2.10. Vybrané diagnostické metody pro detekci rostlinných virů __________________16 2.10.1. Diagnostika rostlinných virů dle příznaků _____________________________________ 16 2.10.2. Diagnostika rostlinných virů dle jejich biologických vlastností _____________________ 17 2.10.3. Diagnostika virů pomocí sérologických metod __________________________________ 18 2.10.4. Diagnostika virů pomocí molekulárně genetických metod _________________________ 19 2.10.4.1. Hybridizační techniky _________________________________________________ 20 2.10.4.2. Polymerázová řetězová reakce __________________________________________ 20 2.10.4.3. Sekvenační analýzy ___________________________________________________ 22
3. Cíle disertační práce _________________________________________________23 4. Metodika práce _____________________________________________________24 4.1. Biologická charakteristika ApLV ________________________________________24 4.1.1. Hostitelský okruh ApLV ____________________________________________________ 24 4.1.1.1. Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF 305 _______________________________ 24 4.1.1.2. Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin ______________________ 24
i
Obsah 4.1.1.3. Přenos ApLV na bylinné hostitele _________________________________________ 25 4.1.2. Studium symptomů ApLV __________________________________________________ 26 4.1.2.1. Vyhodnocení zdravotního stavu testovaných rostlin __________________________ 26
4.2. Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV ___________________28 4.2.1. Zdroje rostlinného materiálu _________________________________________________ 28 4.2.2. Odběr rostlinného materiálu _________________________________________________ 28 4.2.3. Uchování rostlinného materiálu ______________________________________________ 29 4.2.4. Izolace celkové RNA ______________________________________________________ 29 4.2.4.1. Homogenizace rostlinného materiálu ______________________________________ 29 4.2.4.2. Izolační techniky využité pro extrakci celkové RNA __________________________ 30 4.2.4.3. Stanovení koncentrace, čistoty a integrity celkové RNA _______________________ 32 4.2.4.4. Vyhodnocení jednotlivých izolačních metod ________________________________ 33 4.2.5. Detekční metody založené na RT-PCR _________________________________________ 33 4.2.5.1. Metoda Two-Step RT-PCR ______________________________________________ 34 4.2.5.2. Metoda One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit ____________ 36 4.2.5.3. Metoda One-Step RT-PCR „vlastní výroby“ ________________________________ 37 4.2.5.4. Metoda Direct binding RT-PCR __________________________________________ 37 4.2.5.5. Metoda Immuno-capture RT-PCT bez využití specifických protilátek _____________ 37 4.2.5.6. Metoda Spot-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek ________________ 38 4.2.5.7. Metoda Print-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek _______________ 38 4.2.5.8. Elektroforetická separace a vizualizace nukleových kyselin _____________________ 39 4.2.6. Detekční metody založené na hybridizaci nukleových kyselin _______________________ 40 4.2.6.1. Příprava templátové DNA _______________________________________________ 40 4.2.6.2. Příprava RNA sond značených digoxigeninem _______________________________ 41 4.2.6.3. Dot Blot hybridizace ___________________________________________________ 42 4.2.7. Vyhodnocení vybraných detekčních metod _____________________________________ 42 4.2.7.1. Vyhodnocení relativní citlivosti vybraných detekčních metod ___________________ 42 4.2.7.2. Vyhodnocení relativní spolehlivosti vybraných detekčních metod ________________ 43
4.3. Molekulární charakteristika ApLV _______________________________________43 4.3.1. Analýza dsRNA __________________________________________________________ 43 4.3.1.1. Izolace dsRNA _______________________________________________________ 43 4.3.1.2. Elektroforetická separace a vizualizace dsRNA ______________________________ 44 4.3.1.3. Purifikace a amplifikace dsRNA __________________________________________ 45 4.3.2. Studie genomu ApLV ______________________________________________________ 45 4.3.2.1. Zdroje rostlinného materiálu _____________________________________________ 45 4.3.2.2. Izolace celkové RNA, syntéza cDNA a PCR ________________________________ 45 4.3.2.3. Ligace PCR produktů a jejich transformace do bakteriálních buněk ______________ 46 4.3.2.4. Kontrola bakteriálních klonů _____________________________________________ 47 4.3.2.5. Příprava PCR produktů pro sekvenační analýzy ______________________________ 48
ii
Obsah 4.3.2.6. Příprava bakteriálních plazmidů pro sekvenační analýzy _______________________ 48 4.3.2.7. Analýzy sekvencí _____________________________________________________ 49
4.4. Monitoring ApLV na území ČR __________________________________________50 4.4.1. Odběr vzorků_____________________________________________________________ 50 4.4.2. Testování vzorků __________________________________________________________ 50
5. Výsledky __________________________________________________________51 5.1. Biologická charakteristika ApLV ________________________________________51 5.1.1. Hostitelský okruh ApLV ____________________________________________________ 51 5.1.1.1. Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF 305 _______________________________ 51 5.1.1.2. Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin ______________________ 51 5.1.1.3. Přenos ApLV na bylinné hostitele _________________________________________ 51 5.1.2. Studium symptomů ApLV __________________________________________________ 52 5.1.2.1. Semenáče broskvoní GF 305 _____________________________________________ 52 5.1.2.2. Kultivary broskvoní ____________________________________________________ 53 5.1.2.3. Kultivary meruněk _____________________________________________________ 55 5.1.2.4. Kultivary třešní a švestek _______________________________________________ 56 5.1.2.5. Výsledky testů ELISA a RT-PCR na přítomnost vybraných virových patogenů _____ 56
5.2. Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV ___________________56 5.2.1. Zdroje rostlinného materiálu _________________________________________________ 56 5.2.2. Doba odběru rostlinného materiálu ____________________________________________ 56 5.2.3. Způsob uchování rostlinného materiálu ________________________________________ 57 5.2.4. Izolace celkové RNA ______________________________________________________ 58 5.2.4.1. Homogenizace rostlinného materiálu ______________________________________ 58 5.2.4.2. Vyhodnocení izolačních technik __________________________________________ 58 5.2.5. Detekční metody založené na RT-PCR _________________________________________ 60 5.2.6. Detekční metody založené na Dot-blot hybridizaci _______________________________ 63 5.2.7. Vyhodnocení vybraných detekčních metod _____________________________________ 64 5.2.7.1. Specifita detekčních metod ______________________________________________ 64 5.2.7.2. Relativní citlivost vybraných detekčních metod ______________________________ 64 5.2.7.3. Relativní spolehlivost vybraných detekčních metod ___________________________ 68
5.3. Molekulární charakteristika ApLV _______________________________________69 5.3.1. Analýza dsRNA __________________________________________________________ 69 5.3.1. Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV ______________________________ 70 5.3.1.1. Molekulární charakteristika ApLV izolátů __________________________________ 70 5.3.1.2. Procentuální sekvenční identita ___________________________________________ 73 5.3.1.3. Fylogenetické analýzy __________________________________________________ 75
5.4. Monitoring ApLV na území ČR __________________________________________79
iii
Obsah
6. Diskuze ___________________________________________________________81 6.1. Biologická charakteristika ApLV ________________________________________81 6.1.1. Hostitelský okruh _________________________________________________________ 81 6.1.2. Studium symptomů ApLV __________________________________________________ 83
6.2. Diagnostické metody pro detekci ApLV ___________________________________84 6.2.1. Detekce ApLV pomocí molekulárně genetických technik __________________________ 85 6.2.1.1. Rostlinný materiál a izolace celkové RNA __________________________________ 85 6.2.1.2. Detekční metody založené na RT-PCR _____________________________________ 87 6.2.1.3. Detekční metody založené na molekulární hybridizaci _________________________ 91
6.3. Molekulární charakteristika ApLV _______________________________________92 6.3.1. dsRNA__________________________________________________________________ 92 6.3.2. Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV ______________________________ 92
6.4. Monitoring ApLV na území ČR __________________________________________94
7. Závěry ____________________________________________________________95 Seznam použité literatury ______________________________________________97 Přílohy _____________________________________________________________111
iv
Seznam obrázků a tabulek v textu
Seznam obrázků a tabulek v textu Obr. 4. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech semenáčů broskvoní GF 305........................53 Obr. 5. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech kultivarů broskvoní......................................54 Obr. 6. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech meruňky cv. Tirynthos ................................55 Obr. 7. Detekce ApLV v průběhu vegetačního období........................................................................57 Obr. 8. Porovnání integrity izolované celkové RNA............................................................................60 Obr. 9. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR. .........................................................................61 Obr. 10. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA.....................61 Obr. 11. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s využitím UDG........................................61 Obr. 12. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA s využitím UDG..................................................61 Obr. 13. Detekce ApLV metodou Co-RT-PCR.....................................................................................62 Obr. 14. Detekce ApLV metodou Nested RT-PCR...............................................................................62 Obr. 15. Detekce ApLV metodou One-Step RT-PCR s využitím QIAGEN® OneStep RT-PCR kit...62 Obr. 16. Detekce ApLVmetodou One-Step RT-PCR „vlastní výroby“................................................62 Obr. 17. Detekce ApLV metodou DB-RT-PCR....................................................................................62 Obr. 18. Detekce ApLV metodou IC-RT-PCR......................................................................................63 Obr. 19. Detekce ApLV metodou SC- a PC-RT-PCR...........................................................................63 Obr. 20. Detekce ApLV metodou dot-blot hybridizace.........................................................................63 Obr. 21. Relativní citlivost metody Two-step RT-PCR.........................................................................65 Obr. 22. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA...................65 Obr. 23. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s využitím UDG.............................................65 Obr. 24. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG........................................................................................................................................66 Obr. 25. Relativní citlivost metody Co-RT-PCR..................................................................................66 Obr. 26. Relativní citlivost metody Nested RT-PCR............................................................................66
v
Seznam obrázků a tabulek v textu Obr. 27. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR s využitím QIAGEN® OneStep RT-PCR kit...............................................................................................................................................67 Obr. 28. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR „vlastní výroby“ ............................................67 Obr. 29. Elektroforeogram dsRNA …………………………………...................................................69 Obr. 30. Detekce ApLV z dsRNA metodou Two-step RT-PCR...........................................................69 Obr. 31. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů.................................................................................................................................71 Obr. 33. Organizace parciálního genomu moldávského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů................................................................................................................................72 Obr. 34. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů ...............................................................................................................................................73 Obr. 37. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF2 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus........................................................................................................76 Obr. 38. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF3 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus .......................................................................................................77 Obr. 39. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF4 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus .......................................................................................................78 Obr. 40. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF5 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus........................................................................................................79
Tab. 13. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách broskvoní................................55 Tab. 14. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách meruněk……...........................56 Tab. 15. Výtěžnosti a čistota celkové RNA...........................................................................................59 Tab. 16. Porovnání izolačních metod na základě výtěžnosti, čistoty a integrity celkové RNA............60 Tab. 17. Relativní citlivost vybraných RT-PCR metod.........................................................................67 Tab. 18. Relativní spolehlivost vybraných RT-PCR metod...................................................................68 Tab. 19. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV.................................................71 Tab. 20. Organizace parciálního genomu moldavského izolátu ApLV.................................................72
vi
Seznam obrázků a tabulek v textu Tab. 21. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV.........................................................73 Tab. 22. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Pal s vybranými izoláty ApLV a ASPV........74 Tab. 23. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Mol s vybranými izoláty ApLV a ASPV…...75 Tab. 24. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Tom s vybranými izoláty ApLV a ASPV…..75
Není-li v textu uvedeno jinak, autorem obrázků je autorka disertační práce.
vii
Seznam použitých zkratek
Seznam použitých zkratek Zkratka
Anglický název
Český název
A
absorbance
absorbance
aa
amino-acid
aminokyselina
AAF
acetylaminofluoren
acetylaminofluoren
ACSLV
Apple chlorotic leaf spot virus
virus chlorotické skvrnitosti jabloně
ApLV
Apricot latent virus
latentní virus meruňky
ApMV
Apple mosaic virus
virus mozaiky jabloně
ASGV
Apple stem grooving virus
virus žlábkovitosti kmene jabloně
ASPV
Apple stem pitting virus
virus mělké vrásčitosti kmene jabloně
BSA
bovine serum albumin
hovězí sérový albumin
bp
pair of bases
pár bází
cDNA
complementary deoxyribonucleic acid
komplementární deoxyribonukleová kyselina
CMV
Cucumber mosaic virus
virus mozaiky okurky
Co-RT-PCR
co-operational RT-PCR
co-operational RT-PCR
CP
coat protein
bílkovinný obal
cv.
cultivar
kultivar
Da
Dalton
Dalton
DAS-ELISA
double antibody sandwich ELISA
double antibody sandwich ELISA
DB-RT-PCR
direct binding RT-PCR
direct binding RT-PCR
ddH2O
double-destilled water
re-destilovaná voda
DIBA
dot immunoblot assay
dot immunoblot assay
DMSO
dimethyl sulfoxide
dimetyl sulfoxid
DNA
deoxyriboluncleic acid
deoxyribonukleová kyselina
dNTP
deoxiribonucleic triphosphate
deoxyribonukleotid trifosfát
dUTP
deoxiuridine triphosphate
deoxyuridin trifosfát
dsRNA
double-stranded nucleic acid
dvouvlákenná ribonukleová kyselina
DTT
dithiothreitol
dithiothreitol
EDTA
ethylene diamino tetraacetic acid
etylen diamin tetraoctová kyselina
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
imunochemická testovací metoda na pevné fázi
EPPO
European plant protection organization
Evropská organizace pro ochranu rostlin
g (RCF)
relative centrifugal force
relativní odstředivá síla
GRSPaV
Grapevine rupestris stem pitting associated virus
virus spojovaný s mělkou vrásčitostí kmene révy vinné
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
[4-(2-hydroxyethyl)-piperazin]-ethan sulfonová kyselina
IC-RT-PCR
immunocapture RT-PCR
immunocapture RT-PCR
IgG
immunoglobulin G
imunoglobulín G
IgG-AP
immunoglobulin G conjugated with alcaline phosfatase
IgG konjugovaný s alkalickou fosfatázou
ISEM
immunosorbent electron microscopy
imunosorbentní elektronová mikroskopie
kDa
kiloDalton
kiloDalton
kbp
pair of 1 000 bases
tisíc párů bází
MLRSV
Myrobalan latent ringspot virus
virus latentní kroužkovitosti myrobalánu
MP
movement protein
„movement“ bílkovina
mRNA
messenger ribonucleic acid
mediátorová ribonukleová kyselina
nt
nucleotide
nukleotid
ORF
open reading frame
otevřený čtecí rámec
PAGE
polyacrylamide gel electrophoresis
polyakrylamidová gelová elektroforéza
viii
Seznam použitých zkratek
Seznam použitých zkratek (pokračování) Zkratka
Anglický název
Český název
PAS
Peach asteroid spot disease
nemoc projevující se asteroidními skvrnami na broskvoni
PCMoV
Peach chlorotic mottle virus
virus chlorotické strakatosti broskvoně
PCR
polymerase chain reaction
polymerázová řetězová reakce
PC-RT-PCR
print capture RT-PCR
print capture RT-PCR
PDV
Prune dwarf virus
virus zakrslosti slivoně
PNRSV
Prunus necrotic ringspot virus
virus nekrotické kroužkovitosti slivoně
Pol
complex of replicase proteins
komplex replikačních bílkovin
PPV
Plum pox virus
virus šarky švestky
PVP
polyvinylpyrrolidone
polyvinylpyrolidon
RdRp
RNA dependent RNA polymerase
RNA dependentní RNA polymeráza
RIPA
rapid immunofilter paper assay
analýza s bočním proudem
RNA
ribonucleic acid
ribonukleová kyselina
rpm
rounds per minute
otáčky za minutu
RpRV
Raspberry ringspot virus
virus kroužkovitosti maliníku
RT
reverse transcription
reverzní transkripce
RT-PCR
reverse transcription polymerase chain reaction
reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce
SC-RT-PCR
Spot capture RT-PCR
spot capture RT-PCR
SDS
sodium dodecyl sulphate
dodecylsulfát sodný
SLRSV
Strawberry latent ringspot virus
virus latentní kroužkovitosti jahodníku
ssRNA
Single-strand ribonucleic acid
jednovlákenná ribonukleová kyselina
TAS -elisa
triple antibody sandwich ELISA
triple antibody sandwich ELISA
Taq
DNA polymerase from Thermus aquaticus
DNA polymeráza z Thermus aquaticus
TGB
triple gene block
triple gene block
TMV
Tobacco mosaic virus
virus mozaiky tabáku
TIBA
tissue-blot immunoassay
tissue-blot immunoassay
Tris
trishydroxymethylaminomethane
trishydroxymethylaminomethan
Tth
DNA Polymerase from Thermus thermophilus
DNA polymeráza z Thermus thermophilus
U
unit
jednotka
UDG
uracil DNA Glykosylase
Uracil-DNA Glykosyláza
UV
ultraviolet light
ultrafialové záření
X-GAL
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-thiogalaktoctoside
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid
ix
Kapitola 1: Úvod
Kapitola 1
Úvod Pěstování peckovin má v České republice dlouholetou tradici. Mezi nejvýznamnější druhy ovocných stromů jsou řazeny švestka domácí (Prunus domestica L.), broskvoň obecná (P. persica L.), meruňka obecná (P. armeniaca L.), třešeň obecná (P. avium L.) a višeň obecná (P. cerasus L.). Rozhodujícími faktory pro stabilizaci a ekonomicky výhodné pěstování těchto ovocných stromů jsou bezesporu správný výběr odrůd, příznivé klimatické podmínky a v neposlední řadě dobrý zdravotní stav samotných rostlin. Široká druhová diverzita rodu Prunus L. se odráží ve velkém počtu virů vyvolávajících na těchto rostlinách choroby. Některé z nich se stávají v rozsáhlých oblastech pro ovocnářskou komoditu nepřehlédnutelným problémem, neboť jsou častou příčinou vzniku ať již přímých či nepřímých ekonomických ztrát. Peckoviny jsou nejčastěji přirozenými hostiteli virů z rodů Ilarvirus, Potyvirus a Trichovirus. Jednou z dalších skupin virů infikujících tyto dřeviny jsou i někteří zástupci rodu Foveavirus, jejichž rozšíření a ekonomický význam pro ovocnářství je doposud ne zcela známý. Do tohoto rodu je taxonomicky řazený i latentní virus meruňky (Apricot latent virus, ApLV). Včasná detekce virových patogenů a přesná diagnostika nemocí, které vyvolávají, mají pro prevenci, nebo alespoň částečné snížení škod na ovocných plodinách obrovský význam a jsou bezesporu nepostradatelné pro zhodnocení efektivity metod ochrany rostlin a pro zajištění zdravých, viruprostých plodin či jejich rozmnožovacích orgánů pro další pěstování. Aby mohl být původce virózy určen, je nezbytné virus identifikovat, odhalit jeho přítomnost v infekční rostlině a ověřit, že tento patogen je s ohledem na Kochovy postuláty opravdu zodpovědný za vznik pozorovaných symptomů. Z výše uvedených důvodů bylo hlavním cílem předkládané disertační práce rozšířit dosavadní znalosti o latentním viru meruňky, jak na biologické, tak i molekulární úrovni, na jejichž základě by bylo možné navrhnout dostatečně citlivé a spolehlivé diagnostické metody pro jeho diagnostiku.
1
Kapitola 2: Literární přehled
Kapitola 2
Literární přehled 2.1. Pěstování peckovin v České republice V současné době se na našem území rozkládá 22 736 ha ovocných sadů. Nejvýznamnějším ovocným druhem je jabloň domácí (Malus domestica L.), která se pěstuje na ploše 9 026 ha (plodné stromy). Velmi rozšířené je i pěstování peckovin, které má v České republice dlouholetou tradici. Mezi nejvýznamnější druhy jsou řazeny višeň obecná (Prunus cerasus L.), švestka domácí (P. domestica L.), meruňka obecná (P. armeniaca L.), třešeň obecná (P. avium L.) a broskvoň obecná (P. persica L.). V roce 2010 zaujímaly produkční sady peckovin přibližně 5 970 ha zemědělské půdy, z čehož rozloha sadů višní byla 1 747 ha, slivoní a švestek 1 388 ha, meruněk 1 174 ha, broskvoní 781 ha a třešní 880 ha. Průměrný výnos višní byl v roce 2010 3,15 t/ha, slivoní a švestek 4,01 t/ha, meruněk 1,24 t/ha, broskvoní 3,37 t/ha a třešní 2,78 t/ha. Meruňky, broskvoně, slivoně a švestky se nejvíce pěstují na území jižní Moravy, pěstování třešní a višní je hlavní ovocnářskou komoditou středních Čech (Anonym 1, 2, 2010). Seznam nejčastěji pěstovaných odrůd peckovin v ČR je uveden v tab. 1 (kapitola Přílohy).
2.2. Viry peckovin Velmi široká druhová diverzita rodu Prunus L. se odráží ve velkém počtu virů vyvolávajících na těchto rostlinách choroby, z nichž se některé stávají v rozsáhlých oblastech pro ovocnářskou komoditu závažným problémem (Uyemoto & Scott, 1992). Peckoviny jsou napadány zejména viry rodů Ilarvirus, Potyvirus a Trichovirus. Mezi hospodářsky nejvýznamnější viry patří virus šarky švestky (Plum pox virus), virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (Prunus necrotic ringspot virus), virus zakrslosti slivoně (Prune dwarf virus), virus mozaiky jabloně (Apple mosaic virus) a virus chlorotické skvrnitosti jabloně (Apple chlorotic leaf spot). Výskyt rodu Nepovirus není v evropských zemích tak častý. Jedná 2
Kapitola 2: Literární přehled se např. o virus latentní kroužkovitosti jahodníku (Strawberry latent ringspot virus), virus latentní kroužkovitosti myrobalánu (Myrobalan latent ringspot virus) a virus kroužkovitosti maliníku (Raspberry ringspot virus). Viry z rodů Foveavirus a Closterovirus byly v poslední době zaznamenány jen na určitých omezených lokalitách, informace o jejich výskytu a ekonomickém významu jsou omezeny (Myrta et al., 2003).
2.2.1. Stručná charakteristika vybraných virů peckovin Plum pox virus (PPV). Virus šarky švestky, zástupce rodu Potyvirus čeledi Potyviridae (López-Moya et al., 2000), způsobuje významné ztráty na výnosech peckovin, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95 %. Přítomnost a intenzita symptomů vyvolaných infekcí PPV se liší na základě jednotlivých kmenů patogena, druhů, kultivarů, a zdravotního stavu hostitelských rostlin. Příznaky se objevují na listech, plodech (včetně pecek) a někdy i na květních orgánech (Llácer & Cambra, 2006). PPV je široce rozšířen ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky (Simon et al., 1997), pravděpodobně i v Číně a v Severní i Jižní Americe (Malinowski et al., 2006). PPV je přenosný vegetativním množením (Németh, 1986) a velkým počtem různých druhů mšic necirkulativním nepersistentním způsobem (Labonne et al., 1994). Prune dwarf virus (PDV). Virus zakrslosti slivoně, zástupce rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae je jedním z ekonomicky nejvýznamnějších virů peckovin. Jeho hostitelskými rostlinami jsou broskvoň, třešeň, višeň, švestka a mandloň (Nemeth, 1986; Uyemoto & Scott, 1992). Velmi často se vyskytuje ve směsné infekci spolu s PNRSV a ApMV. Tento celosvětově rozšířený virus je přenosný semeny, pylem a vegetativním množením (Mink, 1992; Brunt et al., 1996). Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV). Virus nekrotické kroužkovitosti slivoně je taxonomicky zařazený do rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae. Přítomnost PNRSV byla zaznamenána po celém světě. Patogen způsobuje na celé řadě dřevinných opadavých druhů stromů a keřů různě se projevující choroby. Infekce může být latentní nebo se projevuje širokou škálou symptomů, jako jsou listové chlorózy, mozaiky, redukce růstu i výnosu (Mink, 1992; Uyemoto & Scott, 1992). Do této doby nebyli u tohoto viru indentifikováni žádní vektoři. Je přenosný pylem, semeny nebo vegetativním množením (Fulton, 1996). V současné době je známo několik desítek kmenů viru lišících se navzájem biologickými, serologickými či molekulárními vlastnostmi (Fulton, 1981; Hammond et al., 1999; Vašková et al., 2000; Myrta et al., 2001). 3
Kapitola 2: Literární přehled Apple mosaic virus (ApMV). Virus mozaiky jabloně je zástupce rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae. Tento kosmopolitně se vyskytující virus má velmi široký okruh hostitelů (Fulton, 1972), mezi něž řadíme ostružiník, maliník, jabloň, meruňku, třešeň, mandloň, švestku, broskvoň, lísku, růži, chmel a břízu (Brunt et al., 1997; Francki et al., 1991). Do této doby nebyl popsán přenos pomocí vektorů. Virus je přenosný velmi pravděpodobně pylem, vegetativním množením z infekčních stromů či mechanicky. ApMV je velmi často přítomen ve směsné infekci s PNRSV a PDV, ale četnost výskytu ApMV je o hodně nižší než četnost zbylých dvou virů (Fulton, 1972). Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Virus chlorotické listové skvrnitosti jabloně je zařazený do rodu Trichovirus, čeledi Flexiviridae. Jeho hostitelský okruh je velmi široký, mezi nejčastější hostitele patří jabloň, hruška, broskvoň, švestka, třešeň a meruňka (Nemeth, 1986; Desvignes & Boye, 1989). Jeho ekonomická významnost je velká, neboť je celosvětově rozšířen a je velmi často v ovocných školkách příčinou inkompatibility při roubování. I když se většina kmenů viru na peckovinách neprojevuje příznaky, některé mohou být příčinou rozetky a odumírání podnoží (Desvignes & Boye, 1989). Přenos patogena se uskutečňuje vegetativním množením (Németh, 1986).
2.3. Viry peckovin na území České republiky Nejzávažnější virovou chorobou peckovin v České republice je bezesporu šarka švestky (Polák, 1997). Příznaky PPV byly na rostlinách peckovin poprvé pozorovány ve východních Čechách na počátku 40. let 20. století, od té doby se virus rozšířil do většiny regionů, kde se tyto stromy pěstují (Navrátil, 2006). V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Onemocnění peckovin šarkou se v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních Čechách a na jižní Moravě. K přirozeným hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly infikovány přenosem mšicemi z infikovaných švestek, slivoní a myrobalánu a staly se sekundárním zdrojem infekce (Polák, 2006). Mezi nejvýznamnější ilarviry napadající peckoviny v České republice patří virus zakrslosti slivoně a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně. V současnosti je PDV v České republice rozšířen převážně na trnkách, třešni a myrobalánu, PNRSV je rozšířen na třešni a myrobalánu.
4
Kapitola 2: Literární přehled Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně a viru mozaiky jabloně, které mohou na slivoních vyvolávat příznaky podobné šarce, tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus svinutky třešně, avšak i jeho výskyt je sporadický (tab. 2, kapitola Přílohy) (Polák, 2006). O systematickém průzkumu výskytu virů na teplomilných ovocných dřevinách, to jest na broskvoních a meruňkách na našem území nebyly v literatuře nalezeny žádné odkazy. Po ústní konzultaci s Doc. Ing. Jaroslavem Polákem DrSc. jsme se ujistili, že se touto problematikou v poslední době v České republice nikdo podrobně nezabýval.
2.4. Čeleď Betaflexiviridae Čeleď Betaflexiviridae, taxonomicky řazená do řádu Tymovirales, je pojmenována podle pružného virionu jejich zástupců („flexuous“ znamená ohybný, pružný, vlnící se). Čeleď zahrnuje rostlinné viry rodů Capillovirus, Carlavirus, Citrivirus, Foveavirus, Trichovirus a Vitivirus, společně s některými příbuznými nezařazenými viry (Anonym 3, 2011). Čeleď je odvozena od fylogenetické analýzy sekvencí RNA polymerázy a obalového proteinu. Hlavní charakteristiky zástupců čeledi jsou: pružný vláknitý virion o průměru 12 - 13 nm monopartitní pozitivní jednovlákenný RNA genom s 3´ polyadenylovým koncem translace alespoň několika otevřených čtecích rámců (ORF) ze subgenomických mRNA až 6 otevřených čtecích rámců organizovaných od 5´ k 3´ konci: 1. alpha-like replikační protein (150 – 250 kDa) zahrnující konzervativní methyl-transferázu, helikázu a RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) (Koonin & Dolja, 1993) 2. jeden nebo více „movement“ proteinů, které umožňují translokaci viru v rostlině (MP) 3. jednoduchý kapsidový obalový protein (CP) (22 - 44 kDa) 4. u některých virů šestý otevřený čtecí rámec, který může částečně přesahovat 3´-konec genu obalového proteinu a je možné, že má nukleotidové vazebné vlastnosti (Adams et al., 2004).
5
Kapitola 2: Literární přehled Řád zahrnuje viry obsahující jak jednoduchý movement protein „30K“ nadčeledi i viry kódující triple gene block (TGB) (Morozov & Solovyev, 2003), avšak analýzy RdRp a CP sekvencí naznačují, že se jedná o jednu soudržnou taxonomickou jednotku (Adams et al., 2004). Z hlediska biologických vlastností jsou jednotlivé viry čeledi Betaflexiviridae velmi odlišné. Jejich přítomnost byla prokázána na řadě bylinných i dřevinných, jedno i dvouděložných rostlinných druzích, avšak hostitelský okruh jednotlivých členů je obvykle omezený. K přirozené infekci zástupců rodů Foveavirus, Capillovirus, Vitivirus a Trichovirus dochází většinou nebo výhradně u dřevinných hostitelů. Většina virů má na hostitele poměrně mírné dopady. Všechny rody této čeledi mohou být často bezproblémově přenášeny mechanicky. Většina virů této skupiny nemá žádné známé vektory. Výjimku tvoří zástupci rodu Trichovirus, které jsou pravděpodobně přenášeny roztoči a většina druhů z rodu Carlavirus, jež jsou neperzistentně přenášeny mšicemi. Řada vektorů je zaznamenána také u různých druhů z rodu Vitivirus (Adams et al., 2004).
2.5. Rod Foveavirus Rod Foveavirus je zařazen do čeledi Betaflexiviridae. Název rodu je odvozen od latinského slova „fovea“, které v češtině znamená důlek, díra (tyto výrazy mají představovat základní symptomy u typového zástupce rodu Apple stem pitting virus). Pružná vlákna virionu o průměru 12 - 15 nm jsou dlouhá od 800 do 1 000 nm. RNA molekuly mají helikalní symetrii. Viriony neobsahují lipidy ani sacharidy, mají positivní ssRNA genom o velikosti 8,4 až 9,3 kb s 3´polyadenylovým koncem a jednoduchý typ bílkovinného obalu o velikosti 28 - 44 kDa. Jejich genom je složen z 5 otevřených čtecích rámců (ORF), které kódují proteiny v pořadí: bílkoviny související s replikací (ORF 1), „movement“ proteiny (ORF 2 - 4, triple gene block) a obalový protein (ORF 5). Genomová struktura a organizace je úzce podobná rodům Potexvirus, Carlavirus a Allexvirus, ale ORF 1 a bílkovinný proteinový cistron rodu Foveavirus je podstatně delší. Okruh přirozených hostitelů jednotlivých druhů rodu je omezen na jeden jediný (Grapevine rupestris stem pitting-associated virus) nebo jen na několik hostitelů (Apple stem pitting virus, Apricot latent virus). Viry nejsou přenášeny žádným vektorem. K přenosu virů dochází mechanicky, k jejich rozšiřování napomáhá infekční množitelský materiál.
6
Kapitola 2: Literární přehled Experimentální hostitelský okruh je omezen, ale v přirozeném prostředí jsou viry poměrně široce geograficky rozšířeny (Martelli & Jelkmann, 1998). Typovým zástupcem rodu Foveavirus je Apple stem pitting virus, dalšími druhy jsou Apricot latent virus, Grapevine rupestris stem pitting-associated virus a Peach chlorotic mottle virus (Anonym 3, 2011).
2.5.1. Zástupci rodu Foveavirus Apple stem pitting virus (ASPV), virus mělké vrásčitosti kmene jabloně, je široce rozšířený patogen. ASPV byl poprvé zaznamenán na M. silvestris ve středozápadní části USA (Smith, 1954). Ačkoliv je ASPV na většině komerčně pěstovaných kultivarů jabloní a hrušní bezpříznakový, na citlivých indikátorových rostlinách jsou symptomy přítomné (Yanase et al., 1990). Virus způsobuje vrásčitost kmene M. pumila Virginia Crab a epinastii s celkovým oslabením okrasné jabloně Spy 227. Dhir et al. (2009) detekovali ASPV v Indii na rostlinách třešní (P. avium) cv. Stella a višní (P. cerasus) a Youssef et al. (2011) v pletivech révy vinné, což naznačuje, že hostitelský okruh ASPV je širší, než se dříve předpokládalo. ASPV je příčinou onemocnění způsobující nekrotické skvrny a žlutou žilkovitost hrušní, Pear vein yellows disease (Lemoine, 1979; Nemeth, 1986; Jelkmann, 1997). Virus se často objevuje ve směsné infekci s dalšími latentními viry jako např. Apple chlorotic leaf spot virus a Apple stem grooving virus. ASPV je přenosný roubováním (Leone et al. 1998; Kundu, 2003). Jeho ekonomická významnost pro pěstování jabloní a hrušní je nepřehlédnutelná. Redukce růstu může u jabloní dosáhnout 10 % a u hrušní 10 - 15 %. Snížení výnosu u obou komerčně pěstovaných ovocných druhů může dosahovat 30 - 50 % (Lemoine, 1979; Desvignes, 1999; Lemoine, 2000). Poslední monitoring tohoto patogena v České republice označil asi 28 % jabloní jako ASPV pozitivní (Kundu, 2003). Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), virus spojovaný s mělkou vrásčitostí kmene révy vinné, je asi nejčastěji přítomným virem rodu Vitis L. (Meng & Gonsalves, 2003). Tento patogen je velmi často spojován s chorobou mělké vrásčitosti kmene révy vinné „Rupestris stemp pitting“ (RSP) (Goheen, 1988), která představuje jednu z komplexu 4 chorob nazývaného „Rugose wood“ (RW). RW je celosvětově rozšířené, rouby či očky přenosné onemocnění, napadající dřevní části rostlin (Martelli, 1993). Samotný GRSPaV vyvolává na rostlinách pouze mírné symptomy, některé jeho kmeny jsou i latentní (Meng et al., 2005), avšak směsná infekce s jinými viry révy vinné, například s Grapevine virus A, může vznik virových příznaků silně podnítit (Bonfiglioli et al., 1998; Gribaudo et al., 7
Kapitola 2: Literární přehled 2006). Nedávno byla popsána velmi blízká souvislost mezi přítomností GRSPaV a symptomy nekrotické žilkovitosti listů révy (Bouyahia et al., 2005). GRSPaV nemá žádného přirozeného vektora, experimentálně byl zjištěn přenos pylem a semeny (Rowhani et al., 2000; Lima et al., 2006). Virus není mechanicky přenosný (Azzam & Gonsalves, 1991). Peach chlorotic mottle virus (PCMoV), virus chlorotické strakatosti broskvoně, byl na základě molekulárních analýz klasifikován jako nový virový zástupce rodu Foveavirus, čeledi Betaflexiviridae (James et al., 2007). V předchozích studiích byl virus definován jako Prunus persica cv. Agua virus (4N6) a je jedním z blíže neurčených virů získaných ze směsné infekce rostlin broskvoní, které křížově reagují s protilátkami proti PPV a ASPV (James et al., 1996). Na indikátorové rostlině P. persica GF 305 vytváří symptomy v podobě chlorotické strakatosti a kroužkovitosti (James et al., 1994). Bližší informace o jeho biologických, strukturních a molekulárních vlastnostech a jeho rozšíření nejsou v současné době dostupné. Apricot latent virus (ApLV) je předmětem následující kapitoly.
2.7. Apricot latent virus Latentní virus meruňky (Apricot latent virus, ApLV) definovaný jako zástupce rodu Foveavirus, čeledi Betaflexiviridae (Martelli & Jelkmann, 1998; Adams et al., 2004; Martelli et al., 2007) byl objeven v Moldávii (Zemtchik & Verderevskaya, 1993). První zprávu o tomto viru a o chorobě, kterou patogen vyvolává, podali Zemtchik et al. (1998). V roce 1989 byl během běžného skleníkového pokusu na přítomnost virů naroubován na broskvoňový semenáč bezpříznakový kultivar meruňky Silistra N4 přivezený z Bulharska kvůli jeho rezistenci k velkému množství patogenů. Na listech semenáče se po několika týdnech objevily chlorotické léze a zelené skvrny. Pokus byl zopakován v roce 1990 se stejným výsledkem. V roce 1998 byly za využití imuno-elektronové mikroskopie v extraktu broskvoňových listů pozorovány virové částice vláknitého tvaru, které pozitivně reagovaly s protilátkou specifickou k ASPV (Nemchinov et al., 2000, Adams et al., 2004). Analýzy sekvencí aminokyselin odvozených od nukleotidů kódující obalový protein viru vykazovaly vysokou homologii s ASPV (87 %), podle které by se mohlo předpokládat, že ApLV je pouze jeho kmen, avšak zbývající část fragmentu, která pravděpodobně představovala N-terminální část CP, byla vysoce odlišná. Z těchto informací byl vyvozen závěr, že ApLV je buď samostatný virus, nebo pouze rekombinant vzniklý z nukleové kyseliny ASPV a neznámé RNA, buď hostitelského, nebo virového původu. Na základě těchto výsledků a dalších
8
Kapitola 2: Literární přehled dodatečných testů (molekulární hybridizace a western blot analýzy) může být ApLV označen jako nový, od ASPV odlišný vláknitý virus, patřící do téhož rodu (Nemchinov et al., 2000).
2.7.1. Biologické vlastnosti ApLV Informace o hostitelském okruhu ApLV jsou velmi omezené (Martelli & Jelkmann, 1998). Přirozená infekce ApLV byla popsána pouze na rostlinách meruněk, kde se infekce virem téměř nikdy neprojevuje viditelnými příznaky. Výjimkou jsou kultivary meruněk Tirynthos a Haward, které dle Jarrar et al. (2006) vykazují na listových čepelích příznaky ve formě chlorotické difuzní skvrnitosti, zakrslostí a malformací listů. Informace o ekonomické významnosti viru jsou zatím omezené (Myrta et al., 2003). ApLV byl experimentálně přenesen pomocí infekční šťávy z rostlin na bylinné hostitele a pomocí oček na různé druhy peckovin. Za účelem prostudování hostitelského okruhu ApLV byla testována řada bylin z čeledí Chenopodiaceae (Chenopodium quinoa, Ch. bushianum, Ch. amaranticolor, Ch. foetidum, Ch. murale, Ch. rubrum), Solanaceae (Nicotiana occidentalis, N. clevelandii, N. benthamiana, N. cavicola, N. glutinosa, N. quadrivalvis, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xantii, N. tabacum cv. Samsung, N. rustica, Petunia hybrida), Lamiaceae (Ocimum basilicum), Cucurbitaceae (Cucumis sativus), Fabaceae (Vigna unguiculata), Amaranthaceae (Gomphrena globosa). Ze všech těchto testovaných rostlin vykazovaly symptomy 10 - 15 dnů po inokulaci pouze N. occidentalis N37 a N. occidentalis spp. obligua, a to v podobě jemné žluté žilkovitosti a nekróz na čepelích listů (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001a; Gentit et al., 2001b; Abou GhanemSabanadzovic et al., 2005). Na broskvoni, která patří k nejcitlivějším druhům z rodu Prunus L. na experimentální přenos ApLV pomocí oček, byly na listech pozorovány příznaky popsané jako asteroidní nebo sazovité kruhové skvrny (Zemtchik et al., 1998, Grasseau et al., 1999, Nemchinov et al., 2000; Gentit et al., 2001b). Během čtyř až šesti měsíců od naočkování se objevují jasné příznaky na kultivarech broskvoní GF 305, Springtime a Elberta ve formě asteroidních žlutých skvrn, které se postupně přeměňují v kroužky se zeleným středem a na odrůdách třešní Bing, Candidex a Sam symptomy ve formě červených až purpurových kroužků a skvrnek. Na P. cerasifera jsou v určitých případech pozorovatelné chlorotické zelené skvrny podobné symptomům na broskvoni. Kultivary meruněk Luizet, Priana, Tilton a P. serrulata cv. Shirofungen byly bezpříznakové, ale na základě testů hybridizace byly pozitivní na
9
Kapitola 2: Literární přehled přítomnost ApLV (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001b; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005). ApLV není přenášen žádným vektorem, k šíření patogena přispívá používání infekčního množitelského materiálu (Martelli & Jelkmann, 1998).
2.7.2. Molekulární vlastnosti ApLV Genom ApLV je tvořen jedním úsekem pozitivní ssRNA (Martelli & Jelkmann, 1998). Jeho velikost byla na základě elektroforetické analýzy dsRNA autory Nemchinov et al. (2001) stanovena na 9,6 kb, což odpovídalo velikostnímu rozpětí ostatních členů rodu Foveavirus (Martelli & Jelkmann, 1998; Nemchinov et al., 2001). Rozložení genomu ApLV tvořeného 9 312 nt, polyadenylový konec nepočítaje, vykazuje typickou genomovou organizaci zástupců rodu Foveavirus. Pětice identifikovaných otevřených čtecích rámců kóduje gen virové replikázy (ORF1; RdRp), gen pro triple gene block (TGB) spojovaný s translokací viru v hostitelských rostlinách (ORF2-ORF4; TGBp1TGBp3) a gen pro bílkovinný obal (ORF5; CP). Vypočítaná molekulární hmotnost jednotlivých proteinů je následující: RdRp 247,2 - 247,8 kDa, TGBp1 25,2 - 25,3 kDA, TGBp2 12,7 - 12,8 kDa, TGBp3 7,4 - 7,6 kDa a CP 43,0 - 44,8 kDa. Dle publikovaných výsledků autorů Abou-Ghanem-Sabanadzovic et al. (2005), získaných western blot analýzou, byla velikost separovaného obalového proteinu ApLV odhadována na zhruba 50 kDa, což výše uvedenému údaji odpovídá. Do dnešní doby bylo osekvenováno celkem pět genomů, dvou italských a dvou francouzských izolátů ApLV (acc. nos. NC 014821, HQ339959, HQ339958, HQ339957, HQ339956; Youssef et al., 2011), dále pak bílkovinný obal ApLV [acc.no. AF057035 (Nemchinov et al., 2000); acc.no. GQ919051 (Garcia-Ibarra et al., 2010)] a několik kratších fragmentů genů kódujícího bílkovinný obal či RdRp. Data získaná ze sekvenční homologie jednotlivých genomů patogena naznačují, že stejně jako u mnoha jiných zástupců čeledi Beatflexiviridae, je i zde patrný vysoký stupeň variability (Youssef et al., 2011).
2.7.3. Geografické rozšíření ApLV ApLV byl poprvé popsán v Moldávii (Zemtchik & Verderevskaya, 1993). Později byly o jeho výskytu podány zprávy z Francie a Itálie (Grasseau et al., 1999; Gentit et al., 2001a),
10
Kapitola 2: Literární přehled z Palestiny (Myrta et al., 2003), západního Turecka (Gümüs et al., 2004), Egypta (El Maghraby et al., 2006), Libanonu (Jarrar et al. 2007) a Španělska (García-Ibarra et al., 2010).
2.7.4. Metody detekce ApLV Detekce ApLV pomocí biologických testů. ApLV může být detekován pomocí očkování či roubování infekčního materiálu na indikátorové rostliny broskvoní GF 305, Elberta nebo Springtime. Symptomy ve formě žlutých asteroidních skvrn se na rostlinách pěstovaných ve skleníkových prostorách objevují 6 měsíců od provedené inokulace a ve venkovních podmínkách během jednoho roku (Desvignes et al., 1999; Jelkmann, 2004). Jedinými bylinnými indikátory ApLV byly do dnešní doby povrzeny pouze N. occidentalis 37B a N. occidentalis spp. obliqua, na jejichž listových čepelích se po 10-15 dnech po inokulaci objevují symptomy ve formě mírného žilkování a nekrotických skvrn (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001b; Abou Ghanem Sabanadzovic et al., 2005). Detekce ApLV pomocí elektronové mikroskopie. Ačkoliv Zemtchik et al. (1998) identifikovali virové částice v extraktu listů broskvoňových semenáčů infikovaných ApLV, ostatní autoři přítomnost patogena, ať již v infekčních rostlinách peckovin, či rostlinách N. occidentalis nepotvrdili. Dle metody Martelli & Russo (1984) byly při cytopatologické studii buněk listů příznakových rostlin N. occidentalis patrné vláknité částice rozptýlené nebo ve svazečcích nahloučené v cytoplasmě (Zemtchik et al., 1998; Abou Ghanem Sabanadzovic et al., 2005). V některých buňkách byly také pozorovány membránové měchýřky vyčnívající z tonoplastu s vláknitým materiálem uvnitř. Na buněčné úrovni byly pozorovány minimální změny, virové inkluze nebyly v buňkách N. occidentalis přítomné, což odpovídá i ostatním virovým zástupcům rodu Foveavirus (Martelli & Jelkmann, 1998). Detekce ApLV pomocí sérologických metod. Veškeré snahy purifikovat virus pro imunizační účely byly neúspěšné (Zemtchik et al., 1998; Abbadi et al., 2003; Jarrar, 2007). Extrakt z ApLV infekčních rostlin tabáku křížově reagoval s protilátkou k ASPV při DASELISA, imuno-elektronové mikroskopii a western blot analýzách (Nemchinov & Hadidi, 1998; Zemtchik et al. 1998). Stejně tak byla při western blot analýzách pozorována reakce ApLV s polyklonálními protilátkami k PPV (Nemchinov & Hadidi, 1998). Již dříve byla prokázána sérologická reakce protilátek ASPV a PPV s některými dalšími viry peckovin (Zhang et al., 1992; James et al., 1996). Předpokládá se tedy, že na virionech ApLV, ASPV a PPV se nachází uniformně rozložené společné epitopy (James et al., 1996; Abou GhanemSabanadzovic et al., 2005). 11
Kapitola 2: Literární přehled Detekce ApLV pomocí analýzy dsRNA. Pro detekci replikativní formy ApLV, tedy molekuly dsRNA z rostlinného materiálu infekčních rostlin P. persica či N. occidentalis byly v minulých studiích využity různé druhy technik. Nemchinov & Hadidi (1998) provedli izolaci dsRNA dle Pallas et al. (1987) s využitím finálního enzymatického ošetření RNA molekul (Coffin & Coutts, 1992). Gentit et al. (2000a) postupovali dle protokolu Morris & Dodds (1979) a Gentit et al. (2000b) a Abou Ghanem-Sabanadzovic et al. (2005) dle protokolu Valverde et al. (1990). Detekce
ApLV
pomocí
molekulární
hybridizace
a
RT-PCR.
Díky
znalosti
nukleotidových sekvencí genomu několika izolátů ApLV bylo možné vyvinout diagnostické metody založené na molekulárně genetických technikách. S extraktem z
infekčních
broskvoní napadených ApLV pozitivně reagovaly digoxigeninem označené RNA sondy pro ASPV, navržené na 3´ terminální část genu pro CP (Nemchinov et al., 2000). Gentit et al. (2001a). Abou Ghanem-Sabanadzovic et al. (2005) dále vytvořili zcela specifické hybridizační sondy, které nereagovaly křížově s ASPV a uplatnily se pro detekci rozdílných izolátů ApLV z rostlin N. occidentalis, broskvoní GF 305 a dalších peckovin. Na základě známých sekvencí ApLV bylo pro účely RT-PCR navrženo několik párů specifických oligonukleotidových primerů amplifikujících část či celý gen bílkovinného obalu viru.
Jednalo
se
o
pár
primerů
H-ALV1(5´GGAATAGAGCCCCAAGAAG3´)/C-ALV1
(5´AGCAAGGTAAACGCCAAC3´), využíváný pro detekci ApLV ve většině doposud publikovaných prací (Gümüs et al., 2004; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005; Jarrar et al., 2007; El Maghraby
et
al.,
2006);
dále
H-ALV2
(5´TGATTCCCAAACTGCTTCTAC3´)/C-ALV2
(5´TGAGACCCTCGCTAAAACC3´), H-ALV3 (5´CTGCCACACCATTGACATTTA3´)/C-ALV3 (5´ATACAT TATGCTCCTAAGGCC3´)
(Nemchinov & Hadidi, 1998; Nemchinov et al., 2000) a ApLVr (5′
CCCGACCATGGCTACAAGC
3′) /ApLVf (5′ TTGCCGTCCCGATTAGGTTG 3′) (García-Ibarra et
al., 2010). Metoda RT-PCR byla optimalizována pro detekci ApLV z různých rostlinných orgánů, jmenovitě z listů, jednoletých letorostů, kůry a plodů stromů peckovin (Gümüs et al., 2007, García-Ibarra et al., 2010).
2.7.5. ApLV versus „Peach asteroid spot disease“ Nemoc projevující se asteroidními skvrnami na broskvoni, „Peach asteroid spot disease“ (PAS), byla poprvé popsána v roce 1938 v Kalifornii (Cochran & Smith, 1938) a později byla choroba zaznamenána i v několika dalších státech na západě USA (Williams et al., 1976). Název onemocnění je odvozen od symptomů na stromech broskvoní, které mají 12
Kapitola 2: Literární přehled v prvních jarních měsících podobu malých hvězdovitých chlorotických skvrn, v průběhu dalších měsíců příznaky zesilují, listy postupně předčasně opadávají ze stromů a v extrémních případech mohou být stromy na konci léta zcela bez listů (Németh, 1986). PAS byla později také spojována s nemocí Utah Dixie vyvolávající rzivou kroužkovitost třešní (Richards & Wandley, 1950) a s nemocí purpurové mozaiky broskvoně, o níž byla podána zpráva z Bulharska (Christoff, 1938). Choroba byla popsána na celé řadě druhů rodu Prunus L., včetně meruněk, japonských švestek a třešní (Wagnon et al., 1963; Williams et al., 1976). V průběhu posledních let byla korelace mezi infekcí ApLV a touto chorobou neznámého původu často předmětem vědeckých studií (Gentit et al., 2001a, 2001b). Celá řada izolátů ApLV pocházejících z různých geografických území způsobuje při experimentálním přenosu viru na rostliny P. persica tvorbu asteroidních nepravidelných skvrn, tedy identických příznaků způsobených právě původcem „Peach asteroid spot disease“ (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001b; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005). Avšak k potvrzení této hypotézy je třeba získat více informací. Pokud se nepodaří virus z infekčních indikátorových rostlin purifikovat a/nebo nebude vytvořen infekční transkript použitelný jako inokulum pro infekci broskvoňových stromů, zůstane původce choroby PAS nejistý (Rao et al., 2008). Za zmínku jistě stojí, že choroba PAS, respektive patogen neznámého původu vyvolávající toto onemocnění je začleněn do EPPO programu na produkci zdravého rostlinného materiálu pro pěstování. Dle certifikačního programu musí být na jeho přítomnost za využití biologických testů s dřevinnými indikátorovými rostlinami GF 305 testovány stromy meruněk a broskvoní (přítomnost agens je potvrzena, pokud do 4 měsíců od inokulace dojde na listech peckovin k tvorbě příznaků v podobě sazovitých skvrn) (Anonym 5, 2008). Pokud by tedy došlo k potvrzení hypotézy, že ApLV je patogenem vyvolávajícím výše zmiňovanou chorobu, byl by začleněn do tohoto seznam a jeho přítomnost ve školkařském materiálu by byla striktně kontrolována.
2.8. Hospodářský význam virů peckovin Rostlinné viry se staly pro ovocnářství v rozsáhlých oblastech závažným problémem. Škody způsobené virovými chorobami nemusí být vždy okamžitě zjevné (Blažek et al., 1998). Mezi přímé škody způsobené virovými patogeny patří redukce růstu (nižší výnos, nevzcházení porostu), snížená vitalita rostlin (přecitlivělost na mráz a vlhkost, zvýšená
13
Kapitola 2: Literární přehled náchylnost vůči jiným patogenům a škůdcům), snížení kvality a tržní hodnoty plodin (neodpovídající velikost, tvar, barva, chuť, skladovatelnost, struktura, složení a zhoršená kvalita množitelského materiálu). Dále také dochází k nepřímým škodám v podobě vyšších nákladů na ochranu rostlin při boji proti virovým vektorům, na produkci viruprostého rozmnožovacího materiálu, dále pak nákladů spojených s karanténními a eradikační opatřeními, se šlechtěním rostlin na rezistenci a s finančními prostředky věnovanými na výzkum a vzdělání (Hadidi et al., 1998). Škodlivé účinky viróz je možno pozorovat jak ve školkách, tak ve výsadbách. Ovocné školky se mohou stát v případě zamoření zvláště nebezpečnými ohnisky šíření viróz do blízkého i vzdálenějšího okolí (Blažek et al., 1998).
2.9. Ochrana proti virovým chorobám peckovin V současné době neexistují žádná chemická ošetření proti virovým chorobám, která by mohla být aplikována přímo v polních podmínkám. Z tohoto důvodu jsou virová onemocnění vyvolaná virovými patogeny nazývána „nevyléčitelná“, jestliže je jednou rostlina infikována virem, zůstane infekční po celý svůj život (Jones, 2004). Postupy využívané v ochraně plodin proti těmto patogenům vychází z takových opatření, která jsou odvozena z dostupných znalostí o jejich biologii (Jones, 2004). Metody zahrnují tři hlavní směry. V první řadě musí být používáno zdravé osivo a sadba ve zdravém prostředí. Dále musí být eliminován možný zdroj virové infekce, a to jak přímo v místě, tak i kolem pěstebních ploch. Využívání těchto preventivních metod přizpůsobených konkrétnímu typu plodiny a jednotlivým virům v dnešní době docela efektivně napomáhá kontrolovat virové choroby a v mnoha případech i snižuje škody do takové míry, že jsou ekonomicky přijatelné. Za druhé, musí být využívány metody, které naruší aktivitu nebo efektivitu jejich vektorů. V neposlední řadě by také měly být pěstovány takové rostliny, které jsou vůči virové infekci rezistentní. Tato rezistence může být získána např. křížovou ochranou využitím mírných kmenů virů, což je jedna z možností biologické ochrany, nebo výběrem rezistentních odrůd pomocí metod konvenčního šlechtění. Současný vývoj genetického inženýrství dále otevírá nové možnosti získání transgenních rezistentních rostlin (Astier et al., 2007).
14
Kapitola 2: Literární přehled
2.9.1. Certifikační programy pro produkci zdravého pěstebního materiálu V současné době je v mnoha zemích využíváno programů certifikace pro produkci zdravého rostlinného materiálu pro pěstování (semena, školkařský materiál) (Agrios, 2005), jehož hlavním cílem je produkce zdravých rostlin. Tyto programy jsou rozpracovány v mnoha zemích pro širokou škálu vegetativně rozmnožovaných rostlin (např. brambory, réva vinná, peckoviny, pelargonie). Certifikační programy se mezi jednotlivými plodinami a zeměmi výrazně liší, a to v rámci navržených cílů programů, dostupných možností, financí a technik, a v neposlední řadě podle závažnosti problémů spojených s virózami (Waterworth, 1998). Jelikož je Česká republika členem Evropské unie, zavádějí se zde certifikační normy dle European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO), což je mezivládní organizace zodpovědná za mezinárodní spolupráci v ochraně rostlin v Evropě a Středozemí. EPPO pravidelně vydává standardy (normy) a publikace se zaměřením na informace o škodlivých organismech, o fytosanitárních předpisech a výrobcích určenými na ochranu rostlin (Anonym 4, 2010). Jedním z těchto standardů je právě program na produkci zdravého rostlinného materiálu pro pěstování. Tento standard popisuje jednotlivé kroky přípravy vegetativně rozmnožovaného rostlinného materiálu, jehož dobrý zdravotní stav je následně potvrzen oficiálním certifikátem (Anonym 4, 2010). Certifikační program pro mandloně, meruňky, broskve, švestky (PM 4/30) a třešně (PM 4/29) udává podrobné informace o způsobu výběru, pěstování a udržování testovaného materiálu a o jeho rozmnožování. Druhy peckovin pěstovaných v EPPO regionech, na které se tento program vztahuje, jsou P. armeniaca, P. domestica, P. dulcis, P. persica, P. salicina, P. avium, P.cerasus, jejich podnože P. besseyi, P. cerasifera, P. davidiana, P. avium, P. mahaleb a jejich mezidruhové hybridy. Program je také vhodný pro certifikaci příbuzných okrasných rostlin z téhož rodu. Pro testování rostlinného materiálu na přítomnost jednotlivých patogenů se využívá různých postupů, mezi které je zařazeno testování rostlin pomocí dřevinných a bylinných indikátorů (na poli i ve sklenících), detekce patogenů pomocí fluorescenční a elektronové mikroskopie, ELISA metody, molekulární hybridizace a PCR. Pro ozdravování infekčních plodin se využívá termoterapie, meristémové kultury, mikroroubování nebo ošetření pomocí chemických sloučenin in vitro (Anonym 5, 2010).
15
Kapitola 2: Literární přehled
2.10. Vybrané diagnostické metody pro detekci rostlinných virů Rostlinné viry jsou častou příčinou vzniku přímých či nepřímých ekonomických ztrát v zemědělství. Včasná detekce těchto patogenů a přesná diagnostika nemocí, které vyvolávají, má pro prevenci nebo alespoň částečné snížení těchto škod obrovský význam (MaroonLango, 2004). Světový obchod s plodinami a rostlinnými produkty neustále stoupá a tím narůstá nebezpečí přenášení různých patogenů a jejich vektorů z jedné země do druhé. Testy, které jsou schopné spolehlivě, rychle a levně detekovat přítomnost rostlinného patogena, jsou pro zamezení propuknutí epidemií na novém území nezbytné (Dickinson, 2003). Diagnostické metody jsou rovněž nepostradatelné pro zhodnocení efektivity metod ochrany rostlin a pro zajištění zdravých, viruprostých plodin či jejich rozmnožovacích orgánů pro další pěstování (Astier et al., 2007). Aby mohl být původce virózy charakterizován, je nezbytné virus identifikovat, odhalit jeho přítomnost v infekční rostlině a ověřit, že tento patogen je s ohledem na Kochovy postuláty opravdu zodpovědný za vznik pozorovaných symptomů (Dickinson, 2003). Současné metody detekce virů jsou převážně založené na biologických testech, sérologických rozborech, technikách založených na studii nukleových kyselin a elektronové mikroskopii. Všeobecně vzato, výběr konkrétní metody závisí na samotném agens daného onemocnění, dále na typu a množství testovaných vzorků, dostupnosti reagencií či laboratorního vybavení a v neposlední řadě času a finančních prostředcích vyhrazených k práci (Maroon-Lango, 2004).
2.10.1. Diagnostika rostlinných virů dle příznaků Pozorování příznaků na rostlinách, zvážení okolností za jakých vznikly a sledování postupného vývoje infekce představují první krok v samotné diagnostice rostlinných virů (Astier et al., 2007). Vznik symptomů je složitý proces, při kterém se za určitých podmínek prostředí navzájem ovlivňují genetické vlastnosti viru a rostliny. Příznaky vyvolané virovou infekcí mohou být pozorovatelné uvnitř rostlinné buňky nebo přímo na povrchu pletiv rostliny (Vidhyasekaran, 2004). Symptomy virových chorob se mohou lišit v závislosti na mnoha faktorech, tj. na vlastnostech kmene viru a hostitelské rostliny, na období vzniku infekce a na přírodních podmínkách (Astier et al., 2007). Vzhledem k obvykle malé specifitě příznaků samotných viróz je tento typ diagnostikých metod velmi omezený (např. mozaika u bramboru může být způsobena virem X, Y, M a A). 16
Kapitola 2: Literární přehled Pouze v několika výjimečných případech za optimálních podmínek můžeme určitý virus víceméně spolehlivě podle příznaků poznat, jako např. čárkovitost bramboru, rizománie cukrové řepy a výrůstkové mozaiky luskovin (Ryšánek, osobní sdělení). Řada symptomů vyvolaných viry je velmi podobná těm, které jsou způsobené např. genovými mutacemi, nedostatkem živin, toxickými látkami, poškozeními vzniklými sáním hmyzu či roztočů nebo jinými patogeny. Proto musí být před samotným testováním všechny ostatní možné příčiny vzniku příznaků nejprve vyloučeny (Agrios, 2005). Pozorování příznaků není proto pro stanovení spolehlivé a přesné diagnostiky rostlinných virů dostatečné, ale osvědčilo se jako velmi užitečný nástroj pro nasměrování dalších diagnostických testů (Astier et al., 2007).
2.10.2. Diagnostika rostlinných virů dle jejich biologických vlastností Experimentální mechanický přenos viru nebo roubování či očkování viru na zdravé rostliny jsou metody založené na biologických vlastnostech těchto patogenů. Každý virus je charakterizován určitým hostitelským okruhem rostlin, který může za přirozených či experimentálních podmínek infikovat. Rostlinné viry mohou být experimentálně přenášeny na indikátorové nebo jiné kulturně pěstované či v přírodě se vyskytující rostliny. Mnohé z nich na přítomnost viru specificky reagují (lokální léze, systemové příznaky) a vzniklé symptomy mohou být pro daný virus charakteristické (Astier et al., 2007). Při experimentálním mechanickém přenosu nazývaném též mechanická inokulace nebo přenos infekční šťávou jsou zdravé rostliny vystaveny inokulu obsahující virové částice (Khan & Dijkstra, 2006). Při mechanickém přenosu virů není taxonomicky příbuzenský vztah donoru (infekční rostliny) a indikátorové rostliny důležitý. Jeden virus získaný z jednoho druhu hostitele, ať již byliny či dřeviny, může být přenesen na celou řadu nepříbuzných rostlin, např. na různé druhy zeleniny, květin či plevelů (Agrios, 2005). Je známo, že rostlinné viry mají různě široký okruh hostitelů, extrémními případy jsou např. Barley stripe mosaic virus, jehož výskyt v přírodě je striktně omezen pouze na rostliny ječmene, zatímco např. Cucumber mosaic virus (CMV) má potenciál infikovat více než 1 300 různých druhů rostlin z více jak 100 botanických čeledí (Hull, 2009). Některé druhy rostlin, jako jsou např. Chenopodium quinoa a C. amaranticolor, N. benthamiana nebo N. clevelandii, jsou náchylné vůči více než 100 různým rostlinným virům, a proto jsou hodnoceny jako téměř univerzální testovací rostliny (Astier et al., 2007).
17
Kapitola 2: Literární přehled Očkování či roubování (štěpování) indikátorových rostlin je nejstarší metoda přenosu infekčního agens z nemocných rostlin na zdravé a je využívána pro přenos virů, které jsou těžko přenosné jinými metodami, např. viry, které se nacházejí pouze ve floémovém pletivu či jsou nestabilní anebo nemají žádného známého vektora (Khan & Dijkstra, 2006). Tato metoda je také využívaná pro detekci virů nebo infekčních agens částečně nebo zcela neznámého původu, zejména patogenů ovocných dřevin a révy vinné. Dřevinné indikátorové rostliny využívané pro přenos virů jsou vybírány dle spolehlivého a rychlého vývoje symptomů (Astier et al., 2007). Experimentální mechanický přenos viru a přenos virů pomocí oček či roubů představuje v současné době stále velmi významnou metodu, využívanou nejen při diagnostice chorob, ale i pro propagaci viru a jeho udržování a pro studii interakcí mezi patogenem a hostitelem (Khan & Dijkstra, 2006). Metoda je obzvláště ceněnná díky její univerzálnosti, citlivosti a možnosti detekovat viry neznámého původu. Tato technika je v současné době jedinou možností pro charakteristiku virulence specifických kmenů virů (patotypy, intenzita příznaků). Nevýhodou metody je nutnost pravidelné přípravy rostlin a jejich pěstování ve skleníkových prostorách chráněných před hmyzími vektory (to vše se také samozřejmě odráží ve finančních nákladech), časová náročnost a ztížená interpretace výsledků v případě směsné infekce více viry najednou (Astier et al., 2007).
2.10.3. Diagnostika virů pomocí sérologických metod Sérologické metody využívané v rostlinné virologii jsou založené na antigenních vlastnostech některých virů, tj. na jejich schopnosti indukovat v krvi teplokrevných živočichů tvorbu protilátek (Baudyš et al., 1959). V diagnostických testech jsou nejčastěji využívány protilátky
ze
skupiny
IgG,
které
představují
nejpočetnější
skupinu
rozpustných
imunoglobulinů obratlovců. Rozdíl v sekvencích aminokyselin na vazebných místech IgG udává specifitu reakcí, zatímco jiná místa na protilátce mohou být označena, např. navázáním enzymů, a využita pro následnou detekci patogena (Dickinson, 2003). Antisérum získané proti antigenům může obsahovat buď směs protilátek, což jsou tzv. polyklonální protilátky rozpoznající různé epitopy patogena, nebo tzv. monoklonální protilátky, které dokáží rozpoznat pouze jeden epitop, díky čemuž jsou schopné rozlišovat i geneticky příbuzné jedince (Kohler & Milstein, 1975). Oba dva typy protilátek jsou využívány v řadě diagnostických metod (Vidhyasekaran, 2007), nicméně v sobě nesou řadu nevýhod. Při použití polyklonálních protilátek je velkou nevýhodou nemožnost dlouhodobého 18
Kapitola 2: Literární přehled udržování jejich zdroje a velmi omezující je i jejich nízká specifita (Dickinson, 2003). Monoklonální protilátky představují spolehlivější zdroj specifických protilátek, avšak i u nich je popsána řada nedostatků, jako jsou např. vysoká finanční a pracovní náročnost jejich přípravy a udržování (Ziegler & Torrance, 2002). Jednou z dalších možností je využívání rekombinatních protilátek, které je sice v současné době spíše na experimentální úrovni, ale představuje techniku s velmi slibnou budoucností. Exprese proteinů v bakteriálních kulturách totiž dokáže poskytnout standardizované diagnostické reagencie, které jsou teoreticky schopné nahradit konvenční monoklonální či polyklonální protilátky s konjugáty a tím značně snížit časovou a pracovní náročnost daných technik (López et al., 2003). Nejčastěji používaná sérologická metoda je v současné době ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ve které se komplex antigen/protilátky absorbuje na jamky plastických mikrotitračních destiček (Dijkstra & De Jager, 1998). ELISA v sobě kombinuje specifičnost interakce antigen/protilátka spolu s detekcí patogena pomocí konjugovaného enzymu na protilátku. Aktivita enzymu je měřena spektrofotometricky přidáním příslušného substrátu, který mění barvu v závislosti na množství enzymu v reakci, její intenzita se může využít pro měření množství patogena v daném vzorku (Dickinson, 2003). ELISA je jednoduchá, lehce standardizovatelná metoda s možností testování velkého množství vzorků najednou. Zařízení potřebné pro provedení ELISA testů je relativně levné (Hull, 2009; Astier et al., 2007) a finančně dostupné jsou i veškeré potřebné sloučeniny používané při testování. V dnešní době existuje několik variant klasické ELISA (Vidhyasekaran, 2007). Dalšími využívanými sérologickými metodami v rostlinné virologii jsou např. analýza s bočním proudem (rapid immunofilter paper assay, RIPA), dot immunoblot assay (DIBA), tissue-blot immunoassay (TIBA) a imunosorbentní elektronová mikroskopie (ISEM) (Maroon-Lango, 2004).
2.10.4. Diagnostika virů pomocí molekulárně genetických metod Molekulární techniky založené na hybridizaci a amplifikaci nukleových kyselin byly v průběhu let přizpůsobeny pro detekci většiny významných fytopatogenních virů (López et al., 2003). Oproti sérologickým metodám, které obvykle detekují obalový protein virů, umožňují tyto techniky detekovat jakékoliv oblasti virového genomu. Nepřehlédnutelnou výhodou analýz nukleových kyselin je i jejich nezávislost na genové expresi, a tím i na faktorech vnějšího prostředí (Astier et al., 2005).
19
Kapitola 2: Literární přehled 2.10.4.1. Hybridizační techniky Detekce patogenů pomocí hybridizace nukleových kyselin je založena na specifickém párování cílových sekvencí nukleové kyseliny viru s komplementární RNA či DNA sondou. Oligonukleotidové sondy se můžou označit buď radioaktivním izotopem (32P) nebo neradioaktivní reportérem, jako jsou např. biotin, acetylaminofluoren (AAF), flourocytosin nebo digoxigenin (Astier et al., 2005), což umožní jejich finální vizualizaci pomocí autoradiografie, fluorescence či enzymatické reakce (Maroon-Lango, 2004). Při detekci rostlinných virů se hybridizace nejčastěji provádí na pevných nosičích (nitrocelulóze či nylonové membráně), na nichž se nukleová kyselina nejprve musí imobilizovat při teplotě 80 °C nebo pomocí UV záření. Samotná hybridizace probíhá za přítomnosti značené sondy a po promytí a vysušení membrány je přítomný duplex detekován pomocí výše zmiňovaných technik (Astier et al., 2005). Úspěšná hybridizace závisí na reakčních podmínkách, obzvláště na teplotě a iontové síle hybridizačních a promývacích pufrů. Podmínky během hybridizace a promývání membrány udávají nejen citlivost reakce, ale i její specifitu (Hull, 1993). Samotný test je rychlý a relativně snadně proveditelný. Typická senzitivita technik využívající radioaktivní izotopy je vyšší než citlivost DAS-ELISA testu, avšak radioaktivní značení sond není v řadě laboratoří možné. Proto jsou spíše preferovány testy využívající neradiaktivní sondy, ačkoliv jejich detekční limit je postatně nižší (Astier et al., 2005).
2.10.4.2. Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je molekulárně genetická metoda, jejíž podstatou je enzymatické zmnožení určitého úseku nebo více úseků DNA. Reakce je tvořena opakovanými reakčními cykly. Každý cyklus se skládá ze tří kroků, jež jsou charakterizovány odlišnými teplotními požadavky: denaturace DNA, přisedání primerů (hybridizace primerů nebo také „anelace“) a prodlužování fragmentů DNA (Krčmář & Břicháček, 1993). Procedura kroků se opakuje, nově syntetizované fragmenty (amplifikáty, amplikony) pak slouží jako templáty, takže během následujících cyklů jsou převládajícím produktem PCR jednoduché, přesně vymezené DNA fragmenty, jejichž vzdálenost koresponduje se vzdáleností mezi dvěma původními primery (Ruml et al., 2007). Zahřívací krok v každém cyklu reakce vyžaduje použití termostabilních DNA polymeráz, z nichž nejčastěji využívané jsou enzymy získané z termofilních bakterií Termus aquaticus (Taq enzym) či Thermus thermophilus (Tth enzym) (Waller et al., 2001). 20
Kapitola 2: Literární přehled Výsledné amplifikované DNA fragmenty lze separovat pomocí agarózové gelové elektroforézy, polyakrylamidové elektroforézy a agarózo-akrylamidové gelové elektroforézy. Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějším separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů. Jejím principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli, kdy hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny (Rosypal et al., 2002). Elektroforetická mobilita DNA fragmentů je závislá na velikosti fragmentů (bp) a nezávislá na sekvenci fragmentů. Na základě odlišné pohyblivosti různě dlouhých DNA fragmentů se jejich směs rozdělí na jednotlivé stejně dlouhé složky, které se pak v gelu pohybují společně. Výběr gelového systému závisí z největší části na velikostním rozpětí vzorků, druhu nukleové kyseliny, dalším využití separovaných nukleových kyselin a stupni složitosti přípravy a provedení elektroforézy (Krčmář & Břicháček, 1993).
2.10.4.2.1. Metoda RT-PCR
V případě rostlinných virů s jednovlákenným RNA genomem (zhruba 90 % všech známých virových patogenů) je nezbytné zahrnout před samotnou amplifikační reakcí reverzní transkripci (RT), během níž je RNA enzymaticky zkopírována do komplementární DNA (cDNA). Při RT se využívají oligonukleotidové primery, které nasednou na molekulu RNA a enzym RNA dependentní DNA polymeráza vytvoří kopii v podobě cDNA. Tato cDNA může být následně použita pro PCR. Záleží přímo na daném protokolu, zda tyto dva kroky, transkripce a amplifikace, jsou prováděny odděleně nebo souběžně v jedné mikrozkumavce (Astier et al., 2005). RT-PCR je pro detekci a identifikaci virů jednou z nejčastěji používaných metod. Metoda je extrémně citlivá, finančně poměrně nenáročná a její provedení nevyžaduje přílišnou odbornost (Webster et al., 2004). V minulých letech bylo vyvinuto nespočetné množství detekčních technik, založených na principu této metody. V následujícím textu jsou některé z nich uvedeny: Immunocapture RT-PCR s využitím či bez využití specifických virových protilátek je metoda kombinující PCR a ELISA techniku dohromady bez nutnosti předchozí extrakce nukleové kyselin (Wetzel et al., 1992; Nolasco et al., 1997). Print/squash capture RT-PCR jsou dvě varianty metody Immunocapture RT-PCR, při kterých je rostlinný materiál imobilizovaný na pevném nosiči rozmačknutím či otiskem rostlinného pletiva (Olmos et al., 1996; Olmos et al., 1997).
21
Kapitola 2: Literární přehled Nested RT-PCR je metoda založená na dvoufázové amplifikaci PCR produktů. V každé z fází hybridizují s cílovou DNA návzájem se lišící páry primerů. Technika se zejména využívá při detekci rostlinných virů, které jsou ve výchozím testovaném materiálu ve velmi nízké koncentraci (Yourno, 1992; Robberts, 1996; Osiowy, 1998; Llop et al., 1999; Olmos et al., 2002; Bertolini et al., 2003; Olmos et al., 2003). Co-opeartional RT-PCR je typ RT-PCR s vysokou citlivostí využívající tří až čtyř specifických primerů v jedné reakci (Olmos et al., 2002). Multiplex RT-PCR je metoda umožňující simultánní a specifickou detekci odlišných cílových DNA nebo RNA molekul v jedné reakci (James, 1995; Osiowy, 1998; Rosenfield & Jaykus, 1999; Williams et al., 1999; Nassuth et al., 2000) Realtime RT-PCR představuje rychlejší a výkonnější techniku RT-PCR detekující amplifikované produkty pomocí zabudovaného fluoroforu. Zahrnuje v sobě nejen detekci určitého patogena, ale i meření množství amplifikovaných produktů při každém jejím cyklu (Schneider et al., 2004; Olmos et al., 2005; Osman & Rowhani, 2005).
2.10.4.3. Sekvenační analýzy Sekvenační techniky poskytují výhody spojené s velkou citlivostí metod, která není klasickými metodami v takové míře dosažena (Mills et al., 1992; O´Donell, 1992). Využívání informací o sekvencích molekul DNA se v poslední době stává neodmyslitelným nástrojem ve fytopatologii, jak při samotné diagnostice či pro objasnění vztahů mezi jednotlivými organismy. Sekvenování DNA je také velmi významný prostředek pro identifikaci a charakterizaci specifických genů, které jsou zodpovědné za patogenitu a rezistenci, a je stále více využíváno při šlechtění. Existuje celá řada možností, jak sekvence DNA získat, ale většina z nich je v poslední době realizována pomocí automatických sekvenátorů s fluorescenčními barvami a laserovou detekcí. Aby mohla být nukleová kyselina osekvenována, musí být nejprve oddělena od buněčného materiálu, purifikována a zakoncentrována. Dvěma hlavními způsoby přípravy vzorků na sekvenační analýzy jsou ligování DNA fragmentu do vektora a jeho následná propagace v bakteriálních buňkách či příprava vzorků technikou PCR (Waller et al., 2001).
22
Kapitola 3: Cíle disertační práce
Kapitola 3
Cíle disertační práce Hlavními cíli této disertační práce byly charakterizace ApLV na biologické a molekulární úrovni, dále vývoj a optimalizace metod pro detekci ApLV z rostlinném pletivu a v neposlední řadě monitoring viru na území České republiky. Dílčími experimentálními cíli byly:
získání a udržení izolátů ApLV na hostitelských rostlinách evaluace vybraných diagnostických metod pro detekci ApLV studie genetické variability ApLV izolátů a jejich fylogenetických vztahů s vybranými virovými zástupci rodu Foveavirus.
23
Kapitola 4: Metodika práce
Kapitola 4
Metodika práce 4.1. Biologická charakteristika ApLV 4.1.1. Hostitelský okruh ApLV 4.1.1.1. Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF 305 V roce 2004 byly z Instituts Agronomiques Méditerrannéens de Valenzano (Itálie) převezeny do České republiky letorosty broskvoní GF 305 naočkované palestinským izolátem ApLV Apr-47. V prostorách karanténního skleníku katedry ochrany rostlin bylo v letech 2005 a 2006 nainokulováno očky z těchto rostlin celkem 30 broskvoňových semenáčů GF 305. V následujícím roce byly rostliny přemístěny do venkovních prostor, kde byly pěstovány buď ve venkovních izolátorech, nebo přímo na otevřeném pozemku. Všechny rostliny byly v průběhu prvních dvou let od inokulace testovány na přítomnost ApLV v rostlinném pletivu. Pro detekci patogena byly využity metody izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), Two-Step RT-PCR analýza a finální vizualizace výsledků pomocí agarózové elektroforézy. Veškeré protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.1.1.2. Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin Experiment zaměřený na okruh dřevinných hostitelů ApLV z rodu Prunus L. byl založen v roce 2003 v Itálii na Universitá degli Studi di Bari výzkumnými pracovníky tamní katedry ochrany rostlin. Pokus byl součástí disertační práce studenta doktorského studia Samera Jarrara. Jako rostlinný materiál bylo použito 33 kultivarů peckovin, jež se ve zdejších podmínkách běžně komerčně pěstují, jmenovitě 5 kultivarů meruněk, 11 kultivarů broskvoní, 11 kultivarů japonských a evropských švestek a 6 kultivarů třešní (tab. 3, kapitola Přílohy). Pokus byl založen v zimě na přelomu let 2003 a 2004. Na viruprosté podnože byly
24
Kapitola 4: Metodika práce naroubovány rouby jednotlivých kultivarů. Pro stromy meruněk a švestek byla použita podnož P. myrobalan, pro broskvoně P. persica GF 677 a pro třešně P. mahaleb. V roce 2004 byly jednotlivé kultivary peckovin naočkovány očky z letorostů broskvoně cv. Missour infikované palestinským izolátem ApLV Apr-47. Od každého kultivaru byly naočkovány 3 rostliny, které byly spolu s jednou nenaočkovanou rostlinou, později použitou jako negativní kontrola, vysazeny na univerzitní experimentální farmě „P. Martucci“ ve Valenzanu (Itálie). V roce 2007 jsme volně navázali na předchozí pokusy. Všechny pěstované kultivary peckovin byly otestovány na přítomnost ApLV. Pro detekci patogena byly využity metody izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), Two-Step RT-PCR analýza a finální vizualizace výsledků pomocí agarózové elektroforézy. Veškeré protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.1.1.3. Přenos ApLV na bylinné hostitele V průběhu let 2006 až 2010 bylo na katedře ochrany rostlin ČZU testováno 300 bylinných zástupců (tab. 4, kapitola Přílohy). Jako inokulum byly použity čerstvé listy z rostlin P. persica GF 305 infikovaných ApLV. Rostlinný materiál byl homogenizován ve třecích miskách za přítomnosti několika odlišných inokulačních pufrů, jmenovitě za využití 0,02 M fosfátového pufru draselného s 2,5% nikotinem, 0,02 M fosfátového pufru draselného s 10% PVP, 0,02 M fosfátového pufru sodného, HEPES pufru A a HEPES pufru B. Pro přenos byly použity rostliny ve vývojovém stádiu dvou pravých listů, byliny byly vždy jeden den před inokulací umístěny do krytého izolátoru bez přístupu světla. Listové čepele byly mírně poprášeny karborundovým práškem, následně potřeny šťávou z infikovaných rostlin a nakonec pomocí střičky omyty vodou. Jako negativní kontroly byly použity rostliny ošetřené jednotlivými inokulačními pufry bez přítomnosti virového inokula. Pro detekci patogena byly využity metody izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), Two-Step RT-PCR analýza a finální vizualizace výsledků pomocí agarózové elektroforézy. Veškeré protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4., a 4.2.5.). Složení inokulačních pufrů je uvedeno v kapitole Přílohy.
25
Kapitola 4: Metodika práce
4.1.2. Studium symptomů ApLV V průběhu let 2007 a 2008 byly na ApLV pozitivních rostlinách broskvoní GF 305 kultivovaných v České republice a komerčně pěstovaných druzích peckovin v Itálii sledovány symptomy spojované s virovou infekcí. Práce byla zaměřena na charakter, lokalizaci a vývoj symptomů během vegetačních období. V rámci této studie byla vytvořena stupnice příznaků od 0 - 2, která byla při charakterizaci symptomů využita: 0: bez příznaků 1: příznaky pozorované jen na víceletých větvích u báze stromů 2: příznaky pozorované po celé koruně stromů.
4.1.2.1. Vyhodnocení zdravotního stavu testovaných rostlin Aby mohlo být alespoň částečně potvrzeno, že jsou pozorované symptomy na peckovinách vyvolané pouze infekcí ApLV, a že k jejich vzniku nedochází přítomností jiných virových patogenů, bylo pomocí sérologických a molekulárně genetických metod otestováno 30 náhodně vybraných příznakových semenáčů a kultivarů ovocných druhů na přítomnost v Evropě se nejčastěji vyskytujících virů peckovin z rodů Ilarvirus, Trichovirus a Potyvirus. Sérologické testy byly provedeny pomocí technik DAS a TAS ELISA (Clark & Adams, 1977; Clark & Joseph Bar, 1984). Polyklonální protilátky byly komerčně připraveny firmou Agritest s.r.l. (Valenzano, Itálie), monoklonální protilátky byly vyrobené na Univerzitá degli Studi di Bari v Itálii (Imed et al., 1997). Metoda DAS ELISA byla využita pro detekci Apple chlorotic leaf spot virus, Prune dwarf virus a Plum pox virus a metoda TAS ELISA pro detekci Apple mosaic virus a Prunus necrotic ringspot virus. DAS ELISA. Povrch jamek mikrotitračních destiček byl nejprve potažen 100 μl potahovacího pufru se specifickou polyklonální protilátkou proti určitému antigenu (zásobní roztok IgG byl ředěn potahovacím pufrem dle návodu výrobce). Destičky byly inkubovány 2 h při 37 ˚C. Během této doby byly homogenizovány vzorky testovaných rostlin spolu s extrakčním pufrem v poměru 1:10. Po inkubaci byly jamky třikrát promyty promývacím pufrem. Do jednotlivých jamek bylo převedeno 100 μl homogenátu (každý vzorek dvakrát). Do předem vyznačených jamek byl napipetován pouze extrakční pufr (slepá kontrola), homogenát z viruprostých rostlin (negativní kontrola) a extrakt z rostlin napadených daným virem (pozitivní kontrola). Mikrotitrační destičky byly ponechány ve 4 ˚C přes noc. Následující den byly jamky třikrát promyty promývacím pufrem. Do jamek bylo přidáno 100
26
Kapitola 4: Metodika práce μl extrakčního pufru s polyklonální protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou (zásobní roztok IgG-AP byl ředěný dle návodu výrobce). Destičky byly inkubovány 2 h při 37 ˚C, po této byly třikrát promyty promývacím pufrem a do jamek bylo převedeno 100 μl substrátového pufru. Následovala inkubace vzorků při laboratorní teplotě bez přístupu světla. Po 2 h byla vyhodnocena barevná reakce alkalické fosfatázy se substrátem při 405 nm pomocí spektrofotometru Multiskan MS photometric plate reader (LabSystems, Italy). Složení pufrů a roztoků je uvedeno v kapitole Přílohy. TAS ELISA. Povrch jamek mikrotitračních destiček byl nejprve potažen 100 μl potahovacího pufru se specifickou polyklonální protilátkou proti určitému antigenu (zásobní roztok IgG byl ředěn potahovacím pufrem dle návodu výrobce). Destičky byly inkubovány 2 h při 37 ˚C. Během této doby byly homogenizovány vzorky testovaných rostlin spolu s extrakčním pufrem v poměru 1:10. Po inkubaci byly jamky třikrát promyty promývacím pufrem. Do předem vyznačených jamek jamek bylo napipetováno 100 μl homogenátu (každý vzorek dvakrát). Do předem vyznačených jamek byl napipetován pouze extrakční pufr (slepá kontrola), homogenát z viruprostých rostlin (negativní kontrola) a extrakt z rostlin napadených daným virem (pozitivní kontrola). Mikrotitrační destičky byly ponechány ve 4 ˚C přes noc. Následující den byly jamky třikrát promyty promývacím pufrem. Do jednotlivých jamek bylo připipetováno 100 μl extrakčního pufru s monoklonální protilátkou (zásobní roztok IgG byl ředěný dle návodu výrobce). Destičky byly inkubovány 2 h při 37 ˚C, poté byly třikrát promyty promývacím pufrem a do jamek bylo přidáno 100 μl extrakčního pufru s polyklonální protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou (zásobní roztok protilátkyAP byl ředěný dle návodu výrobce). Destičky byly inkubovány 2 h při 37 ˚C, poté byly třikrát promyty promývacím pufrem a do jamek bylo připipetováno 100 μl substrátového pufru. Následovala inkubace vzorků při laboratorní teplotě bez přístupu světla. Po 2 h byla vyhodnocena barevná reakce alkalické fosfatázy se substrátem při 405 nm pomocí spektrofotometru Multiskan MS photometric plate reader (LabSystems, Italy). Složení pufrů a roztoků je uvedeno v kapitole Přílohy. Molekulárně genetické testy byly realizovány pomocí RT-PCR analýzy. Izolace celkové RNA z rostlinného pletiva byla provedena metodou dle Rott & Jelkmann (2001) a samotná detekce vybraných patogenů na základě již dříve publikovaných protokolů. Detekce ApMV byla provedena dle Petřík et al. (2002), detekce PNRSV dle Sánchez-Navarro et al. (2005), ACLSV dle Candresse et al. (1995), PDV dle Rowhani et al. (1998) a PPV dle Glasa et al. (2002).
Konečná
vizualizace
výsledků
byla
27
provedena
pomocí
agarózové
či
Kapitola 4: Metodika práce polyakrylamidové elektroforézy. Protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4., a 4.2.5.).
4.2. Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV 4.2.1. Zdroje rostlinného materiálu Rostlinný materiál byl odebírán ze semenáčů a kultivarů peckovin naočkovaných palestinským izolátem ApLV Apr-47. Materiál získaný z ozdravěných viruprostých peckovin sloužil ve všech testech jako negativní kontrola. Za účelem potvrdit či vyvrátit možnost detekce ApLV z odlišných rostlinných orgánů, byly v průběhu vegetace odebírány a následně testovány vzorky květů, řapíků, plodů, větviček a listů z 12 náhodně vybraných kultivarů broskvoní, meruněk, třešní a švestek infikovaných ApLV. Detekce patogena byla realizována pomocí metod izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), Two-Step RT-PCR a konečná vizualizace výsledků na agarózové či polyakrylamidové elektroforéze. Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.2.2. Odběr rostlinného materiálu V roce 2008 a 2009 byl na univerzitní experimentální farmě „P. Martucci“ ve Valenzanu v Itálii realizován test zaměřený na detekovatelnost ApLV během celého vegetačního období hostitelských rostlin. Vždy na začátku daného měsíce (duben, květen, červen, červenec, srpen, září, říjen, listopad) byly odebrány vzorky listů 12 náhodně vybraných ApLV pozitivních kultivarů broskvoní, meruněk, třešní a švestek, které byly následně analyzovány. Souběžně s tímto pokusem byla detekovatelnost ApLV sledována i na čtyřech indikátorových rostlinách broskvoní GF 305 ve venkovních prostorách katedry ochrany rostlin ČZU v České republice. Pro detekci virového patogena byly využity metody izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), Two-Step RT-PCR a konečná vizualizace výsledků na agarózové či polyakrylamidové elektroforéze. Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
28
Kapitola 4: Metodika práce
4.2.3. Uchování rostlinného materiálu Vzorky použité pro jednotlivé analýzy byly zpracovávány buď přímo v čerstvém stavu, nebo jako chlazené (uskladněny v lednici +/- jeden týden) či zamražené (uskladněné v mrazicím boxu při -24 ˚C maximálně 6 měsíců; při -70 ˚C maximálně 1 rok). Za účelem určit optimální způsob dlouhodobého skladování rostlinného materiálu byly listy infikovaných peckovin lyofilizovány, dehydratovány pomocí CaCl2 nebo glycerolu či vysušeny dle Sipahioglu et al. (2006). Po dvouměsíčních intervalech byl takto uchovaný materiál pravidelně testován na přítomnost ApLV. Detekce patogena byla realizována pomocí metod izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001), Two-Step RT-PCR a konečné vizualizace výsledků na agarózové či polyakrylamidové elektroforéze. Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.2.4. Izolace celkové RNA 4.2.4.1. Homogenizace rostlinného materiálu Vedle časově a pracovně náročné homogenizace biologického materiálu pomocí tekutého dusíku a třecích misek byly testovány dvě alternativní techniky drcení rostlinných pletiv listů, a to homogenizace pomocí extrakčních sáčků (12 × 14 cm) a ručního homogenizátoru (Bioreba) a rozdrcení materiálu pomocí oscilačního mlýnu Retsch MM 400 (obr. 1, kapitola Přílohy). Infikovaný rostlinný materiál byl pomocí sterilních nůžek nastříhán na terčíky a rozdělen na 24 vzorků. Třetina vzorků byla homogenizována pomocí tekutého dusíku a třecích misek, dalších část pomocí extrakčních sáčků a ručního homogenizátoru a poslední skupina vzorků byla rozdrcena pomocí oscilačního mlýna. Během homogenizace pomocí extrakčních sáčků byl rostlinný materiál (100 mg) převeden do sáčku spolu s 1 000 μl extrakčního pufru a pomocí ručního homogenizátoru rozdrcen. Homogenát byl převeden pipetou do mikrozkumavky. V případě homogenizace pomocí oscilačního mlýna byl rostlinný materiál (100 mg) spolu s třemi drtícími koulemi (o průměru 3 mm) a se 100 μl extrakčního pufru převeden do 2 ml mikrozkumavky. Mikrozkumavka byla umístěna do mlýna a po dobu 1,5 min byla třepána rychlostí 30 kmitů za sekundu. Poté bylo do mikrozkumavky přidáno dalších 900 μl extrakčního pufru a vzorek byl po dobu 30 s třepán stejnou rychlostí.
29
Kapitola 4: Metodika práce Všechny homogenizované vzorky byly podrobeny extrakci celkové RNA, po níž byla pomocí spektrofotometru porovnávána výtěžnost jednotlivých metod. Následovala detekce patogena pomocí Two-Step RT-PCR s konečnou vizualizací výsledků pomocí agarózové či polyakrylamidové elektroforézy. Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.). 4.2.4.2. Izolační techniky využité pro extrakci celkové RNA Pro izolaci celkové RNA z rostlinného materiálu byly vybrány čtyři extrakční metody: 1. izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001) 2. fenol-chloroformová izolace celkové RNA dle Sambrook & Russel (2001) 3. izolace celkové RNA pomocí RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) 4. izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche) Veškeré centrifugace probíhaly v centrifuze Jouan MR 23i při teplotě 4 ˚C, pro třepání vzorků byla využita horizontální třepačka IKA-Vibrax-VXR nebo dotyková třepačka IKALab dancer a pro inkubaci byl využit termoblok TDB-120 BIOSAN.
4.2.4.2.1. Izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001)
K 100 mg biologického materiálu bylo po homogenizaci přidáno 1000 μl „grinding“ pufru. Po centrifugaci (6 000 × rpm, 3 min) bylo do nové mikrozkumavky převedeno 500 μl vodní fáze a spolu se 100 μl 10% N-lauronyl-sarkosinu byl vzorek inkubován 10 min při teplotě 70 ˚C, v průběhu inkubace byla mikrozkumavka každé 3 min promíchávána na dotykové třepačce. Následovala inkubace na ledu (5 min) a centrifugace (13 000 × rpm, 10 min). [*Po centrifugaci bylo do nové mikrozkumavky převedeno 300 μl supernatantu a ke vzorku bylo přidáno 300 μl směsi fenol (pH 4,3) : chloroformu v poměru 1:1. Vzorek byl třepán (600 RPM, 2 min) a následně centrifugován (13 000 × rpm, 10 min)]. Do nové mikrozkumavky bylo převedeno 300 μl vodní fáze a ke vzorku přidáno 150 μl vychlazeného absolutního etanolu, 300 μl roztoku jodidu sodného a 30 μl silika suspenze. Následovala inkubace při laboratorní teplotě (10 min), během níž byl vzorek mírně promícháván na třepačce v horizontální poloze (600 RPM). Po centrifugaci (6 000 × rpm, 1 min) byla vodní fáze odlita a peleta byla promyta 500 μl promývacího pufru. Tento krok byl jednou zopakován. Po odstranění supernatantu byla mikrozkumavka ponechána při laboratorní teplotě na pracovní desce (10 min). Peleta byla resuspendována v 150 μl sterilní ddH2O, následovala inkubace při 70 ˚C (4 min) a centrifugace (13 000 × rpm, 3 min). 120 μl 30
Kapitola 4: Metodika práce supernatantu bylo převedeno do nové mikrozkumavky a vzorek byl uskladněn v mrazicím boxu (-28 ˚C) či ihned použit pro další analýzy. Složení pufrů a roztoků je uvedeno v podkapitole 9.2. * Efektivnější přečištění RNA
4.2.4.2.2. Fenol-chloroformová izolační metoda dle Sambrook & Russel (2001)
K 100 mg biologického materiálu bylo po homogenizaci přidáno 700 μl extrakčního pufru pro izolaci RNA. Homogenát byl převeden do mikrozkumavky a ke vzorku bylo přidáno stejné množství směsi fenol (pH 4,3) : chloroform-izoamylalkoholu (24:1) v poměru 1:1. Vzorek byl třepán (2 200 RPM, 10 min) a následně centrifugován (7 000 × g, 10 min). Poté byla do nové mikrozkumavky převedena vodní fáze a tento krok byl dvakrát zopakován [přidáno stejné množství směsi fenol (pH 4,3): chloroform-izoamylalkoholu (24:1) v poměru 1:1, třepání, centrifugace]. Vodní fáze byla převedena do nové mikrozkumavky, ke směsi bylo přidáno stejné objemové množství chloroform-izoamylalkoholu (24:1). Vzorek byl třepán (2 200 RPM, 10 min) a poté centrifugován (7 000 × g, 10 min). Vodní fáze byla převedena do nové mikrozkumavky, do které bylo následně přidáno 1/10 objemu 3 M octanu sodného a dvojnásobné množství ledového absolutního etanolu. Směs byla mírně promíchána a ponechána přes noc v mrazicím boxu (-24 ˚C). Poté byl vzorek centrifugován (10 000 × g, 10 min) a vodní fáze byla odstraněna. Peleta byla promyta v 70% ledovém etanolu a následovala centrifugace (10 000 × g, 10 min). Po odstranění vodní fáze byla mikrozkumavka ponechána při laboratorní teplotě 10 min. Peleta byla rozpuštěna ve 150 μl sterilní ddH2O a vzorek byl uskladněn v mrazicím boxu (-28 ˚C) či ihned použit pro další analýzy. Složení pufrů a roztoků je uvedeno v podkapitole 9.2.
4.2.4.2.3. Izolace celkové RNA pomocí RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)
100 mg biologického materiálu bylo po homogenizaci převedeno pomocí sterilní tyčinky do 2 ml mikrozkumavky. Ke vzorku bylo přidáno 450 μl RLT buffer, k němuž byl těsně před použitím přidán 2-merkaptoetanol v poměru 1:100. Vzorek byl inkubován 3 min při 56 °C. Poté byla směs převedena do QIAshredder spin mikrozkumavky a centrifugována (10 000 × g, 2 min). Vodní fáze byla převedena do nové mikrozkumavky a ke vzorku byl přidán ledový absolutní etanol (poloviční množství objemu vzorku). Po promíchání pomocí pipety byl homogenát převeden do RNeasy mini spin mikrozkumavky a centrifugován (8 000 31
Kapitola 4: Metodika práce × g, 1 min). Vodní fáze byla odstraněna a ke vzorku bylo přidáno 700 μl RW1 buffer, následovala centrifugace (8 000 × g, 1 min). Vodní fáze byla odstraněna a ke vzorku bylo přidáno 500 μl RPE buffer a následovala centrifugace (8 000 × g, 1 min). Vodní fáze byla odlita, ke vzorku bylo přidáno 500 μl RPE buffer a následovala centrifugace (10 000 × g, 2 min). Kolonka byla přenesena do nové mikrozkumavky a RNA byla eluována ve 40 μl RNase-Free H2O (centrifugace 8000 × g, 1 min). Vzorek byl uskladněn v mrazicím boxu (-28 ˚C) či ihned použit pro další analýzy. Uvedený postup byl doporučen výrobcem (Qiagen), složení roztoků není uvedeno.
4.2.4.2.4. Izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche)
K 75 mg biologického materiálu bylo po homogenizaci přidáno 1000 μl TriPure Isolation Reagent a homogenát byl převeden do mikrozkumavky. Vzorek byl inkubován po dobu 5 min při laboratorní teplotě a následně k němu bylo převedeno 200 μl chloroformu. Roztok byl krátce promíchán na vortexu a ponechán při laboratorní teplotě (3 min). Následovala centrifugace (12 000 × g, 15 min), supernatant byl převeden do nové mikrozkumavky a k vodní fázi bylo přidáno 500 μl izopropanolu. Po mírném promíchání byla mikrozkumavka inkubována při laboratorní teplotě (10 min) a následovala centrifugace (12 000 × g, 10 min). Po odstranění vodní fáze byla peleta promyta 1000 μl 75% ledového etanolu. Po centrifugaci (12 000 × g, 5 min) byla vodní fáze odstraněna a mikrozkumavka inkubována při laboratorní teplotě (8 min). Peleta byla resuspendována v 80 μl sterilní ddH2O a poté inkubována 10 min v 55 °C. Vzorek byl uskladněn v mrazicím boxu (-28 ˚C) či ihned použit pro další analýzy. Uvedený postup byl doporučen samotným výrobcem (Roche).
4.2.4.3. Stanovení koncentrace, čistoty a integrity celkové RNA Množství a kvalita celkové RNA byla určena spektrofotometricky (Hélios Gamma ThermoSpectronic, USA) při vlnové délce 260 nm, respektive 280 nm (A260 = 1 je koncentrace 40 μg/ml celkové RNA; kvalita RNA je poměr A260/A280, doporučená hodnota se pohybuje v intervalu 1,6 - 2,0). Pro stanovení integrity celkové RNA byla využita semi-denaturační elektroforetická separace RNA na horizontální agarózové elektroforéze (MultiSUB Midi, Cleaver Scientific Ltd). 1% agarózový gel byl připraven rozpuštěním agarózy v 1× TBE pufru v mikrovlnné troubě. Po ztuhnutí gelu byly vzorky celkové RNA o jednotné koncentraci 100 ng/μl
32
Kapitola 4: Metodika práce smíchány s nanášecím barvivem 2× RNA Loading Dye (Fermentas) a před nanesením do gelu byly 10 min inkubovány při teplotě 70 °C a poté rychle zchlazeny na ledu. Separace celkové RNA probíhala jednu hodinu při konstantním stejnosměrném napětí 4 - 6 V/cm, po ukončení byly nukleové kyseliny vizualizovány na UV-transiluminátoru při vlnové délce 260 nm. K vizualizaci RNA molekul byl použit etidium bromid v konečné koncentraci 0,5 μg/ml. Fragmenty byly porovnány s hmotnostním standardem RiboRuler™ High Range RNA Ladder (Fermentas).
Výsledné
elektroforeogramy
byly
zdokumentovány
automatickým
dokumentačním a analytickým Bio-Imaging systémem InGenius (Syngene). Složení pufru je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.2.4.4. Vyhodnocení jednotlivých izolačních metod 4 g listů odebraných z infikovaných rostlin byly homogenizovány za přítomnosti tekutého dusíku ve třecí misce. Následně bylo do 32 mikrozkumavek převedeno po 80 mg rostlinného materiálu (8 opakování na jeden typ izolace) a po zmražení v tekutém dusíku byly mikrozkumavky uskladněny v mrazicím boxu (-70 ˚C) či ihned využity pro izolaci nukleové kyseliny všemi výše popsanými extrakčními metodami. Po dokončení extrakcí byla změřena pomocí spektrofotometru koncentrace a čistota RNA získaná z jednotlivých izolačních postupů (měření jednoho vzorku bylo vždy ve třech opakováních) při vlnových délkách A260 a A280. Dále po naředění všech vzorků na jednotnou cílovou koncentraci (100 ng/μl) byla provedena semi-denaturační elektroforetická separace RNA za účelem vyhodnocení integrity RNA. Jednotlivé extrakční metody byly mezi sebou dále porovnány na základě časové, pracovní a finanční náročnosti.
4.2.5. Detekční metody založené na RT-PCR Pro detekci ApLV pomocí reverzní transkripce a polymerázové řetězové reakce byly vybrány následující techniky: 1. Two-Step RT-PCR: a. RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA dle Menzel et al. (2002) b. RT-PCR s využitím Uracil-DNA Glykosylázy (UDG) c. RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG d. Co-operational RT-PCR (Co-RT-PCR) dle Olmos et al. (2002) 33
Kapitola 4: Metodika práce
e. Nested RT-PCR 2. One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit 3. One-Step RT-PCR „vlastní výroby“ 4. Direct binding RT-PCR (DB-RT-PCR) dle Rowhani et al. (1995) 5. Immuno-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek (IC-RT-PCR) dle Olmos et al. (1996) 6. Spot-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek (SC-RT-PCR) dle Olmos et al. (1996) 7. Print-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek (PC-RT-PCR) dle Olmos et
al. (1996) V průběhu vývoje jednotlivých detekčních metod byl kladen důraz na řadu aspektů zajišťujících správný průběh RT-PCR reakcí. V rámci optimalizace detekčních metod byly testovány různé typy a koncentrace PCR reagencií, již dříve publikované či nově navržené kombinace oligonukleotidových primerů a v neposlední řadě byl optimalizován samotný průběh jednotlivých PCR reakcí (délka jednotlivých kroků amplifikace, počet cyklů, teplotní gradienty pro hybridizaci primerů). Pro ověření bezproblémového průběhu reakcí byly ke každé analýzy přiřazeny pozitivní a negativní kontroly v podobě již dříve ověřeného pozitivního vzorku celkové RNA, sterilní ddH2O a vzorku celkové RNA získaného z ozdravěných viruprostých peckovin. V následujících kapitolách jsou uvedeny již optimalizované protokoly jednotlivých metod. Seznam oligonukleotidů využitých pro detekci ApLV pomocí RT-PCR je uveden v tab. 5 (kapitola Přílohy).
4.2.5.1. Metoda Two-Step RT-PCR 4.2.5.1.1. Reverzní transkripce
Syntéza cDNA probíhala v reakčních objemech 50 μl. Nejprve byl připraven premix o objemu 30 μl obsahující přibližně 750 ng celkové RNA a 0,5 μg náhodných primerů (Roche). Vzorek byl 5 min inkubován při 100 °C a poté ponechán 2 min na ledu. K premixu bylo následně přídáno 1× First Strand Buffer (Invitrogen), 4 mM DTT (Invitrogen), 0,5 mM každého dNTP (Fermentas), 40 U RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas) a 40 U Mu-MLV Reverse Transciptase (Invitrogen). Mikrozkumavka byla ponechána při 42 °C po dobu 55 min, poté byla 10 min inkubována v 70 °C.
34
Kapitola 4: Metodika práce
4.2.5.1.2. Metoda PCR
Reakce byla prováděna v objemu 25 μl obsahujícím 1× DreamTaq™ Buffer (Fermentas), 2 mM MgCl2 (Fermentas), 0,1 mM každého dNTP (Fermentas), 0,2 μM reverzní primer R-ALV, 0,2 μM forwardový primer F-ALV, 1 U DreamTaq™ DNA Polymerase (Fermentas) a 3 μl cDNA vzorku. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 95 °C 2 min; 35 cyklů: 95 °C 30 s, 58 °C 30 s, 72 °C 45 s; 72 °C 7 min.
4.2.5.1.3. Metoda PCR s koamplifikací rostlinné mRNA
Reakce byla prováděna v 25 μl objemu obsahujícím 1× TrueStart™ Taq DNA Buffer (Fermentas), 4 mM MgCl2 (Fermentas), 0,1 mM každého dNTP (Fermentas), 2,5 μM reverzního primeru ANESr1, 2,5 μM vedoucího primeru ANESf3, 0,2 μM reverzního primeru NAD5as, 0,2 μM vedoucího primeru NAD5s, 1 U TrueStart™ DNA Polymerase (Fermentas) a 3 μl cDNA vzorku. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 95 ˚C 2 min; 35 cyklů: 95 ˚C 30 s, 58 ˚C 30 s, 72 ˚C 45 s; 72 ˚C 7 min.
4.2.5.1.4. Metoda PCR s využitím Uracil-DNA Glykosylázy
Reakce byla prováděna v 25 μl objemu obsahujícím 1× Taq DNA Buffer + KCl without MgCl2, 4mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého nukleotidu (zásobní roztok 10mM ATP, GTP, CTP; 20 mM UTP, Fermentas), 0,2 μM reverzního primeru R-ALV (nebo C-ALV1), 0,2 μM vedoucího primeru F-ALV (nebo H-ALV1), 1 U Taq DNA Polymerase (Fermentas), 0,25 U Uracil-DNA Glycosylase (Fermentase) a 3 μl cDNA vzorku. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 37 ˚C 10 min; 95 ˚C 10 min; 37 cyklů: 95 ˚C 30 s, 58 ˚C 30 s, 72 ˚C 45 s; 72 ˚C 7 min.
4.2.5.1.5. Metoda PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím Uracil-DNA Glykosylázy
Reakce byla prováděna v 25 μl objemu obsahujícím 1× TrueStart™ Taq DNA Buffer (Fermentas), 4 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého nukleotidu (zásobní roztok 10mM ATP, GTP, CTP; 20 mM UTP; Fermentas), 2,5 μM reverzního primeru ANESr1, 2,5 μM vedoucího primeru ANESf3, 0,2 μM reverzního primeru NAD5as, 0,2 μM vedoucího primeru 35
Kapitola 4: Metodika práce
NAD5s, 1 U TrueStart™ DNA Polymerase (Fermentas), 0,25 U Uracil-DNA Glycosylase (Fermentas) a 3 μl cDNA vzorku. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 37 ˚C 10 min, 95 ˚C 10 min, 37 cyklů: 95 ˚C 30 s, 58 ˚C 30 s, 72 ˚C 45 s; 72 ˚C 7 min.
4.2.5.1.6. Metoda Co-operational PCR
Reakce byla prováděna v 25 μl objemu obsahujícím 1× Taq Buffer + KCl without MgCl2 (Fermentas), 4 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého dNTP (Fermentas), 0,16 μM reverzního primeru RALV a 0,16 μM forwardového primeru FALV (externí primery), 0,08 μM reverzního primeru ANESr1 a 0,08 μM forwardového primeru ANESf3 (interní primery), 5% DMSO (Top Bio), 1 U Taq DNA Polymerase (Fermentas) a 3 μl cDNA. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 95 °C 2 min; 60 cyklů: 95 °C 10 s, 61 °C 10 s, 72 °C 15 s; 72 °C 7 min.
4.2.5.1.7. Metoda Nested PCR
Reakce byla prováděna v 50 μl objemu. První premix o objemu 45 μl obsahoval 1× DreamTaq™ Buffer (Fermentas), 4 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého dNTP (Fermentas), 0,01 μM reverzního primeru ENDr, 0,01 μM forwardového primeru H-ALV1 (externí primery), 1 U DreamTaq Polymerase (Fermentas) a 3 μl cDNA. Poté bylo naneseno 30 μl minerálního oleje a přidán druhý premix o objemu 5 μl obsahující 1 μM R-ALV a 1μM F-ALV (interní primery). Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 95 °C 2 min; 15 cyklů: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 45 s; následovala centrifugace vzorků (6 000 rpm; 1 min) a dalších 30 cyklů: 95 °C 30 s, 64 °C 30 s, 72 °C 45 s; 72 °C 7 min.
4.2.5.2. Metoda One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit Pro detekci ApLV pomocí metody One-Step RT-PCR využívající komerční soupravu jsme využili QIAGEN® OneStep RT-PCR kit (Qiagen). Reakce probíhala v 25 μl objemu obsahujícím 1× QIAGEN OneStep RT-PCR buffer (Qiagen), 0,4 mM dNTP Mix (Qiagen), 0,2 μM reverzního primeru R-ALV, 0,2 μM vedoucího primeru F-ALV, 8 U RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas), 2,0 μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix a 3 μl RNA. Pro PCR jsme použili termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během reverzní transkripce a 36
Kapitola 4: Metodika práce amplifikace byly následující: 50 ˚C 30 min, 95 ˚C 15 min, 35 cyklů: 94 ˚C 30 s, 58 ˚C 30 s, 72 ˚C 45 s; 72 ˚C 7 min.
4.2.5.3. Metoda One-Step RT-PCR „vlastní výroby“ Reakce probíhala v 25 μl objemu obsahujícím 1× Taq Buffer + KCl without MgCl2 (Fermentas), 1,5 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého dNTP (Fermentas), 0,4 μM reverzního primeru R-ALV, 0,2 μM forwardového primeru F-ALV, 40 U RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas), 5 μM DTT (Invitrogen), 8 U AMV reverse transcriptase (Fermentas), 2 U Taq DNA Polymerase (Fermentas) a 3 μl celkové RNA. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během reverzní transkripce a amplifikace byly následující: 42 °C 45 min, 95 °C 15 min; 35 cyklů: 94 °C 45 s, 58 °C 45 s, 72 °C 1 min; 72 °C 10 min.
4.2.5.4. Metoda Direct binding RT-PCR Biologický vzorek (100 mg listů) byl rozdrcen ve třecí misce spolu s 1 ml extrakčního pufru (ELISA). Vzorek byl inkubován 10 min při pokojové teplotě, poté bylo převedeno 100 l homogenátu (vrchní fáze roztoku) do nové 0,5 ml polypropylénové mikrozkumavky a následovala inkubace 2 h při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚C. Poté byla mikrozkumavka třikrát promyta promývacím pufrem (ELISA) a následovala detekce patogena pomocí One-Step RTPCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit dle protokolu uvedeného v tomto oddílu (podkapitol 4.2.5.). Složení pufrů je uvedeno v kapitole Přílohy. . 4.2.5.5. Metoda Immuno-capture RT-PCT bez využití specifických protilátek Biologický vzorek (100 mg) byl rozdrcen ve třecí misce spolu s 3 ml IC pufru. 100 μl homogenátu bylo převedeno do polypropylénové mikrozkumavky, potažené potahovacím pufrem spolu s jednou z následujících složek: 5% odstředěné mléko (w/v), 5 % BSA (w/v) nebo 5 % Tripton (w/v) *. Poté byla mikrozkumavka inkubována 2 h při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚C. Poté byla mikrozkumavka třikrát promyta promývacím pufrem (ELISA) a následovala detekce patogena pomocí One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RTPCR kit dle protokolu uvedeného v tomto oddílu (podkapitola 4.2.5.). Složení pufrů je uvedeno v kapitole Přílohy.
37
Kapitola 4: Metodika práce *Potažení polypropylénové zkumavky: odstředěné mléko, BSA nebo Tripton byly rozpuštěny v potahovacím pufru, do mikrozkumavky bylo naneseno 100 μl tohoto roztoku, následovala 2 h inkubace při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚C. Mikrozkumavka byla třikrát promyta promývacím pufrem (ELISA).
4.2.5.6. Metoda Spot-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek Biologický vzorek (100 mg) byl rozdrcen ve třecích miskách spolu s 3 ml IC pufru. Na hybridizační membrámu SensiBlot
TM
Plus Nylon Membrane (Fermentas) byly naneseny 4 μl
homogenizované šťávy, následovala 5 min inkubace membrány při laboratorní teplotě. Membrána
byla
přemístěna
pomocí
sterilní
pinzety
do
2
ml
polypropylénové
mikrozkumavky, ke vzorku bylo přidáno 120 μl 0,5% tritonu X - 100. Mikrozkumavka byla promíchána pomocí vortexu a inkubována 2 min při pokojové teplotě. Roztok byl následně převeden do polypropylénové mikrozkumavky potažené potahovacím pufrem spolu s jednou z následujících složek: 5% odstředěné mléko (w/v), 5 % BSA (w/v) nebo 5 % Tripton (w/v) *. Poté byla mikrozkumavka třikrát promyta ELISA promývacím pufrem a následovala detekce patogena pomocí One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit dle protokolu uvedeného v tomto oddílu (podkapitola 4.2.5.). Složení pufrů je uvedeno v kapitole Přílohy. * Potažení polypropylénové zkumavky: odstředěné mléko, BSA nebo Tripton byly rozpuštěny v potahovacím pufru, do mikrozkumavky bylo naneseno 100 μl tohoto roztoku, následovala 2 h inkubace při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚C. Mikrozkumavka byla třikrát promyta promývacím pufrem (ELISA).
4.2.5.7. Metoda Print-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek List testované rostliny byl srolován a seříznut sterilním skalpelem. Hrana listu byla otisknuta na hybridizační membránu SensiBlot
TM
Plus Nylon Membrane (Fermentas).
Membrána byla 5 min inkubována při laboratorní teplotě a poté přendána pomocí sterilní pinzety do 2 ml polypropylénové mikrozkumavky. Ke vzorku bylo přidáno 120 μl 0,5% tritonu X-100, mikrozkumavka byla promíchána pomocí dotykového vortexu a inkubována 2 min při pokojové teplotě. Roztok byl následně převeden do polypropylénové mikrozkumavky potažené potahovacím pufrem spolu s jednou z následujících bílkovin: 5% odstředěné mléko (w/v), 5% BSA (w/v) nebo 5% Tripton (w/v). Poté byla mikrozkumavka inkubována 2 h při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚C. Vzorek byl třikrát promyt promývacím pufrem (ELISA).
38
Kapitola 4: Metodika práce Následovala detekce patogena pomocí One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RTPCR kit dle protokolu uvedeného v tomto oddílu (podkapitola 4.2.5.). Složení pufru je uvedeno v kapitole Přílohy. *Potažení polypropylénové zkumavky: odstředěné mléko, BSA nebo Tripton byly rozpuštěny v potahovacím pufru, do mikrozkumavky bylo naneseno 100 μl tohoto roztoku, následovala 2 h inkubace při 37 ˚C nebo přes noc při 4 ˚˚. Mikrozkumavka byla třikrát promyta promývacím pufrem (ELISA).
4.2.5.8. Elektroforetická separace a vizualizace nukleových kyselin 4.2.5.8.1. Agarózová elektroforéza
Pro separaci PCR produktů byla využita souprava pro horizontální elektroforézu (HE 33 Mini Submarine Unit, Basic, Amerscham Biosciensis nebo MultiSUB Midi, Cleaver Scientific Ltd). 1,5% agarózový gel byl připravený rozpuštěním agarózy v 1× TBE pufru v mikrovlnné troubě. K vizualizaci DNA molekul byl použit etidium bromid v konečné koncentraci 0,5 μg/ml, který byl přidán do rozpuštěné agarózy před ztuhnutím gelu. Poté byly testované DNA vzorky smíchány s nanášecím barvivem 6× Loading Dye Solution (Fermentas) v poměru 5:1,5 a naneseny do gelu. Separace DNA probíhala 1 h při konstantním stejnosměrném napětí 4-6 V/cm. Po ukončení byly fragmenty vizualizovány na UVtransiluminátoru při vlnové délce 260 nm. Fragmenty byly porovnány s hmotnostním standardem Mass Ruler Low Range (Fermentas). Výsledné elektroforeogramy byly zdokumentovány automatickým dokumentačním a analytickým Bio-Imaging systémem InGenius (Syngene). Složení pufru je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.2.5.8.2. Polyakrylamidová vertikální elektroforéza (PAGE)
Separace PCR fragmentů probíhala v soupravě pro vertikální elektroforézu Multigel Biometra v homogenním 6,5% polyakrylamidovém gelu. Gel na přípravu elektroforézy se separačními skly o velikosti 11 × 7 cm byl připraven smícháním 7,7 ml sterilní ddH2O, 1 ml 10× TBE pufru, 1,3 ml 40% akrylamide/bis roztoku, 100 µl 10% peroxodisulfátu amonného (w/v) a 10 µl N, N, N´, N´- tetramethylethylenediaminu. Po promíchání byl roztok převeden mezi separační sklíčka vertikální elektroforézy a byl ponechán 15 min při laboratorní teplotě. Vzorky s barvivem 6 × Loading Dye Solution (Fermentas) byly nanášeny v poměru 5:1, jako
39
Kapitola 4: Metodika práce hmotnostní standard byl použit hmotnostní standard Mass Ruler Low Range (Fermentas). Elektroforéza probíhala 1 h při konstantním stejnosměrném napětí 10-15 V/cm. Po ukončení separace DNA byl polyakrylamidový gel barven pomocí stříbra. Objem jednotlivých roztoků je určen pro obarvení dvou gelů o velikosti 11 × 7 cm. DNA byla nejprve fixována 30 min v 100 ml 10% kyseliny octové. Po fixaci byl gel třikrát promyt destilovanou vodou a umístěn po dobu 3 min do 100 ml 1% kyseliny dusičné. Následovalo třikrát promývání gelu destilovanou vodou, poté byl gel umístěn do PAGE barvícího roztoku. Po 17 min byl gel krátce promyt destilovanou vodou a inkubován v PAGE vyvíjejícím roztoku. Jakmile se na gelu začaly objevovat proužky DNA, reakce byla zastavena 100 ml 3% roztoku kyseliny octové. Výsledné elektroforeogramy byly zdokumentovány automatickým dokumentačním a analytickým Bio-Imaging systémem InGenius (Syngene). Složení roztoků je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.2.6. Detekční metody založené na hybridizaci nukleových kyselin Pro detekci ApLV pomocí hybridizačních technik byla vybrána metoda Dot-blot hybridizace využívající neradioaktivní RNA sondy značené digoxigeninem. V průběhu vývoje metody bylo testováno několik technik značení sond, různé typy hybridizačních roztoků s různou iontovou sílou a rozdílné teploty prehybridizace, hybridizace a promývání membrán. Pro ověření bezproblémového průběhu reakcí byly ke každé analýze přiřazeny i pozitivní a negativní kontroly v podobě již dříve ověřeného pozitivního vzorku celkové RNA, sterilní ddH2O a vzorku celkové RNA získaného z ozdravěných viruprostých peckovin. V následujících kapitolách jsou podrobně popsány již optimalizované pracovní protokoly.
4.2.6.1. Příprava templátové DNA Jako templát pro přípravu RNA sond jsme použili cDNA získanou z rostlinného materiálu infikovaného ApLV. Podrobné protokoly pro izolaci celkové RNA a pro RT jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.). Seznam oligonukleotidů využitých pro detekci ApLV je uveden v tab. 6 (kapitola Přílohy). PCR reakce probíhala v 25 μl objemu obsahujícím 1× LA PCR™ Buffer ll (Mg2+ free; Takara), 2,5 mM MgCl2 (Takara), 2,5 mM každého dNTP (Takara), 6,25 μM reverzního primeru C-ALV1T7, 6,25 μM vedoucího primeru H-ALV1T7, 1,25 U TaKaRa LA Taq ™.
40
Kapitola 4: Metodika práce Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 94 ˚C 1 min; 30 cyklů: 94 ˚C 20 s, 59 ˚C 30 s, 72 ˚C 1 min; 72 ˚C 5 min. Výsledné PCR produkty byly naneseny na 1,5% horizontální agarózový gel a po elektroforetické separaci byly z gelu purifikovány pomocí komerčního kitu MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Fragment byl nejprve pomocí sterilního skalpelu vyříznut z gelu, přenesen do mikrozkumavky a zvážen. Ke vzorku byl přidán QG buffer, množství pufru odpovídalo trojnásobku hmotnosti vyříznutého gelu (μl = mg). Vzorek byl 10 min inkubován při 50°C, v průběhu inkubace byla mikrozkumavka každé 3 min promíchávána na vortexu. Ke vzorkům byl následně přidán izopropanol, objem izopropanolu odpovídal hmotnosti vyříznutého gelu (μl = mg). Homogenní roztok byl převeden do MiniElute kolonky a centrifuguván (10 000 × g, 1 min). Po odstranění vodní fáze bylo do kolonky převedeno 500 μl QG buffer a zkumavka byla centrifugována (10 000 × g, 1 min). Vodní fáze byla odlita a kolonka byla promyta 750 μl PE buffer pomocí centrifugace (10 000 × g, 1 min). Poté byl vzorek centrifugován „na prázdno“ (10 000 × g, 1 min). Na závěr byla minikolonka přemístěna do nové mikrozkumavky a na její membránu bylo napipetováno 10 μl EB buffer. Po 1 min inkubaci byla mikrozkumavka centrifugována (10 000 × g, 1 min). Uvedený postup byl doporučen výrobcem (Qiagen), složení roztoků není uvedeno. Koncentrace purifikovaného PCR produktu byla odhadnuta na základě hmotnostního standardu po separaci na horizontální elektroforéze. Podrobný protokol je uveden v tomto oddílu (podkapitola 4.2.5.). PCR produkt byl následně využit pro přípravu RNA sondy.
4.2.6.2. Příprava RNA sond značených digoxigeninem Pro přípravu RNA sond jsme využili DIG RNA Labeling Kit SP6/T7 (Roche), jehož součástí byly uvedený postup i chemické sloučeniny. Reakce probíhala v 20 μl objemu. Nejprve byl připraven premix o objemu 13 μl obsahující 100 ng - 1 μg purifikované templátové DNA. Vzorek byl umístěn na ledu a postupně k němu bylo napipetováno 1× NTP labeling mix, 1× Transcription buffer, 20 U Protector RNase Inhibitor a 40 U T7 RNA polymerase. Vzorek byl inkubován 2 h při 37 ˚C. Poté bylo k reakční směsi přidáno 20 U DNase I a vzorek byl inkubován 15 min při 37 ˚C. Reakce byla ukončena 0,02 M EDTA (pH 8).
41
Kapitola 4: Metodika práce
4.2.6.3. Dot Blot hybridizace Extrakce RNA byla provedena dle Rott & Jelkmann (2001), podrobný protokol je popsán v tomto oddílu (podkapitola 4.2.4). Celková RNA byla nejprve tepelně denaturována 5 min inkubací při 100 ˚C a prudkým zchlazením na ledu. Takto připravené vzorky byly naneseny na membránu SensiBlot TM Plus Nylon Membrane (Fermentas) nebo byly uchovány v mrazicím boxu při -20 ˚C maximálně 1 rok. Na povrch membrány byly naneseny 2 µl vzorku, membrána byla ponechána 10 min při laboratorní teplotě a poté vystavena UV záření na transiluminátoru (260 nm) po dobu 5 min. Membrána byla umístěna do sáčku spolu s 3,2 ml hybridizačního roztoku a při mírném míchání ponechána 2 h při 65 ˚C. Následně byla umístěna do nového sáčku s 1 ml hybridizačního roztoku spolu se specifickou RNA sondou o konečné koncentraci 100 ng/ml a za mírného míchání (100 RPM) byla přes noc inkubována při 65 ˚C. Všechny uvedené objemy jednotlivých roztoků byly využity pro detekci vzorků na membráně o velikosti 4 × 4 cm. Složení pufrů je uvedeno v kapitole Přílohy. Druhý den po hybridizaci byla membrána nejprve promyta v 10 ml hybridizačního promývacího roztoku A (dvakrát 5 min při 65 ˚C), následně v promývacím hybridizačním roztoku B (dvakrát 5 min při 65 ˚C) a na závěr v promývacím hybridizačním roztoku C (1 min). Následovala inkubace membrány v 16 ml 1 × blokovacího roztoku (30 min) a ve 3,5 ml detekčního roztoku s protilátkou (30 min). Poté byla membrána inkubována v 16 ml hybridizačního promývacího pufru C (dvakrát 15 min). Po inkubaci v 3,5 ml detekčního pufru (3 min) byla membrána ponechána spolu se 1,6 ml detekčního substrátového roztoku v temném prostředí (přibližně 3 h). Reakce byla ukončena promytím membrány v TE purfu. Všechny uvedené objemy jednotlivých pufrů a roztoků byly využity pro detekci vzorků na membráně o velikosti 4 × 4 cm. Složení pufrů a roztoků je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.2.7. Vyhodnocení vybraných detekčních metod 4.2.7.1. Vyhodnocení relativní citlivosti vybraných detekčních metod Relativní citlivost testovaných metod byla vyhodnocena pomocí sériového ředění šťávy z rostlin infikovaných ApLV. Rostlinný materiál byl homogenizován v extrakčním pufru v poměru 1:10 a následně sériově naředěn šťávou z viruprostých peckovin (ředění 1:100 až 1:1 000 000). Tímto způsobem byla kontinuálně snížena koncentrace viru v jednotlivých 42
Kapitola 4: Metodika práce vzorcích, což umožnilo následné sledování detekčního limitu jednotlivých RT-PCR reakcí. Ze všech vzorků byla následně vyizolována celková RNA dle protokolu Rott & Jelkmann (2001) a testovaný materiál byl podroben RT-PCR analýzám. Dle získaných výsledků byly jednotlivé techniky evaluovány. Podrobné protokoly detekčních technik jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.2.7.2. Vyhodnocení relativní spolehlivosti vybraných detekčních metod Za účelem vyhodnocení relativní spolehlivosti použitých metod byla dle protokolu Rott & Jelkmann (2001) izolována celková RNA z 20 infikovaných vzorků rostlin odebraných v různém vegetačním období (podzim 2009, jaro 2010, léto 2010, podzim 2010) během něhož koncentrace virových partikulí v rostlinách kolísá a může být příčinou vzniku falešně negativních výsledků. Vzorky byly následně podrobeny jednotlivým RT-PCR technikám a na základě získaných výsledků byly následně vyhodnoceny. Podrobné protokoly detekčních technik jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.3. Molekulární charakteristika ApLV 4.3.1. Analýza dsRNA 4.3.1.1. Izolace dsRNA dsRNA byla izolována dle protokolu Valverde (1990) (obr. 2, kapitola Přílohy). Veškeré centrifugace probíhaly v centrifuze Jouan MR 23i při teplotě 4 ˚C, pro třepání vzorků byla využita horizontální třepačka IKA-Vibrax-VXR. 3,5 g listů odebraných z rostlin P. persica GF 305 infikovaných ApLV bylo homogenizováno za přítomnosti tekutého dusíku ve třecí misce. Rozdrcený rostlinný materiál byl převeden pomocí sterilní lžičky do 50 ml centrifugační zkumavky a ke vzorku bylo přidáno 8 ml 1× STE pufru, 1 ml 10% SDS (w/v), 0,5 ml 2% bentonitu (w/v) a 9 ml saturovaného fenolu 1× STE pufrem. Homogenát byl 30 min promícháván na horizontální třepačce (600 RPM) a poté centrifugován (8 000 × g; 15 min). Po centrifugaci byl odebrán supernatant (10 ml, pokud byl objem nižší, byl doplněn 1× STE pufrem) a bylo k němu přidáno 2,5 ml absolutního etanolu. Vzorek byl uskladněn v lednici do druhého dne či ihned zpracován.
43
Kapitola 4: Metodika práce Na dno 25 ml sterilních injekčních stříkaček byl vložen jednovrstevný filtr miracloth a injekční stříkačky byly připevněny na železný stojan ve vertikální poloze (obr. 3, kapitola Přílohy). 1 g celulózy Whatman CF-11 byl společně s 25 ml 1× STE pufru s 16% ethanolem důkladně promíchán a převeden do první kolonky. Po odkapání pufru byl do kolonky převeden získaný supernatant. Po odkapání vodní fáze byla kolonka promyta 40 ml 1× STE pufrem s 16% etanolem. Poté bylo do kolonky převedeno 2,5 ml 1× STE pufru a profiltrovaný roztok byl odstraněn. Následně bylo připipetováno10 ml 1× STE pufru, prokapaný roztok byl odebrán do 50 ml sterilní centrifugační zkumavky a bylo k němu přidáno 2,5 ml absolutního etanolu. Poté byla stejným způsobem připravena druhá kolonka (1 g celulózy Whatman CF-11 byl společně s 25 ml 1× STE pufru s 16% ethanolem důkladně promíchán a převeden do kolonky). Po odkapání pufru byl do kolonky převeden vzorek. Kolonka byla následně promyta 40 ml 1× STE pufru s 16% etanolem. Do kolonky bylo převedeno 2,5 ml 1× STE pufru a prokapaný roztok byl vylit. Následně bylo přidáno 6 ml 1× STE pufru a přefiltrovaný roztok byl odebrán do sterilní 50 ml centrifugační zkumavky. Ke vzorku bylo přidáno 0,5 ml 3 M octanu sodného (pH 5,5) a 20 ml absolutního etanolu. Vzorek byl ponechán přes noc v -24 ˚C. Druhý den byl vzorek centrifugován (8 000 × g, 25 min) a supernatant odlit. Centrifugační zkumavka s peletou byla 15 min sušena při laboratorní teplotě a následně byla peleta homogenizována s 60 ml EG pufru. Složení pufrů a roztoků je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.3.1.2. Elektroforetická separace a vizualizace dsRNA Separace dsRNA byla provedena pomocí horizontální agarózové elektroforézy MultiSUB Midi, Cleaver Scientific Ltd.. 1% agarózový gel byl připraven rozpuštěním agarózy v 1× TBE pufru v mikrovlnné troubě. Po ztuhnutí gelu bylo do gelu naneseno 30 μl dsRNA spolu s hmotnostním standardem GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Fermentas) a s dsRNA vybraných virů (Tobacco mosaic virus a Plum pox virus) připravených výše uvedeným způsobem. Separace nukleových kyselin probíhala 3 h při konstantním stejnosměrném napětí 6 V/cm. K vizualizaci dsRNA byl použit etidium bromid v konečné koncentraci 0,5 μg/ml, barvení gelu bylo provedeno po elektroforetické separaci. dsRNA byla vizualizována na UV-transiluminátoru při vlnové délce 260 nm a výsledné elektroforeogramy byly zdokumentovány automatickým dokumentačním a analytickým Bio-Imaging systémem InGenius (Syngene). Složení pufru je uvedeno v kapitole Přílohy.
44
Kapitola 4: Metodika práce
4.3.1.3. Purifikace a amplifikace dsRNA Purifikace molekul dsRNA z gelu byla provedena pomocí soupravy GenEluteTM Gel Extraction Kit (Sigma Aldrich). Fragment dsRNA byl nejprve pomocí sterilního skalpelu z gelu vyříznut, přenesen do mikrozkumavky a zvážen. Ke vzorku byl přidán Gel Solubilization buffer, jeho množství odpovídalo trojnásobku hmotnosti vyříznutého gelu (μl = mg). Následovala inkubace vzorku při 55 ˚C (10 min). V průběhu tohoto kroku byla minikolonka GenElute Binding Column G umístěna do mikrozkumavky a spolu s 500 μl Column Preparation solution centrifugována (12 000 × g, 1 min). Po inkubaci byl ke vzroku přidán izopropanol, jehož objem odpovídal hmotnosti vyříznutého gelu (μl = mg). Po promíchání byl homogenní roztok převeden do minikolonky a centrifugován (12 000 × g, 1 min). Vodní fáze byla odlita a kolonka byla promyta 700 μl Washing solution. Po odlití vodní fáze byla kolonka „na prázdno“ centrifugována (12 000 × g, 1 min). Na závěr byla po přenesení minikolonky do nové mikrozkumavky dsRNA centrifugací (12 000 × g, 1 min) eluována 30 μl Tris-HCl pufru (pH 8,0). Uvedený postup byl doporučen výrobcem (Sigma Aldrich), složení roztoků není uvedeno. Purifikovaná dsRNA byla použita jako templát pro detekční techniku Two-Step RTPCR. Konečná vizualizace výsledků byla realizována pomocí agarózové elektroforézy. Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
4.3.2. Studie genomu ApLV 4.3.2.1. Zdroje rostlinného materiálu Jako výchozí biologický materiál byly využity tři izoláty ApLV (tab. 7) pocházející z geograficky odlišných oblastí. Dva izoláty ApLV, palestinský a moldavský, byly získány v roce 2009 ze sbírky patogenů Universita degli Studi di Bari v Itálii. Zbývající izolát viru pocházel z vlastního sběru vzorků provedeného na území České republiky v roce 2010.
4.3.2.2. Izolace celkové RNA, syntéza cDNA a PCR Izolace celkové RNA. Celková RNA z infikovaných listů peckovin byla extrahována pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche), podrobný protokol je uveden v tomto oddílu (podkapitola 4.2.4.).
45
Kapitola 4: Metodika práce Reverzní transkripce. Syntéza cDNA
probíhala za využití kitu Transcriptor High
Fidelity cDNA synthesis kit (Roche) v reakčním objemu 20 μl. Nejprve byl připraven premix o objemu 11,4 μl obsahující 500 ng - 1 μg celkové RNA a 60 μM primeru Random Hexamer Primer nebo 2,5 μM primeru Anchored-oligo(dT)18 Primer. Vzorek byl 10 min inkubován v 65 °C a poté ponechán 2 min na ledu. K premixu bylo následně přidáno 1× Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase Reaction buffer, 20 U Protector RNase Inhibitor, 1 mM každého dNTP, 5 mM DTT a 10 U Transcriptor High Fidelity Reverse Transkriptase. Pro reverzní transkripci byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během transkripce byly v případě využití Random Hexamer Primer následující: 29 °C 10 min; 48°C 60 min, 85 °C 5 min. Při využití Anchored-oligo(dT)18 Primer byly podmínky transkripce následující: 55 °C 30 min; 85 °C 5 min. Primery. Na počátku práce byly využity již dříve publikované nebo na základě konzervativních oblastí genomů virů rodu Foveavirus nově navržené specifické či degenerované primery. Na základě nově získaných sekvencí byly následně navrženy další primery amplifikující úseky spojující jednotlivé fragmenty izolátů ApLV mezi sebou (tab. 8, 9, 10, 11; kapitola Přílohy). PCR reakce. PCR reakce probíhala v 25 μl objemu obsahujícím 1 × LA PCR™ Buffer ll Mg2+ free (Takara), 2,5 mM MgCl2 (Takara), 2,5 mM každého dNTP (Takara), 6,25 μM reverzního primeru a 6,25 μM vedoucího primeru, 1,25 U TaKaRa LA Taq ™ polymerase (Takara) a 3 μl cDNA. Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. PCR podmínky během amplifikace byly následující: 94 ˚C 1 min; 30 cyklů: 94 ˚C 30 s, 42 – 62 ˚C 45 s (specifické Ta jednotlivých párů primerů jsou uvedeny v tab. 9, 10, 11, kapitola Přílohy), 72 ˚C 1 – 3 min (závislost na velikosti amplifikovaného produktu; na vytvoření 1 000 párů bází je doporučena prolongace v délce 1 min); 72 ˚C 5 min. Separace a purifikace PCR produktů. Produkty byly separovány na agarózové elektroforéze a purifikovány z gelu pomocí MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.5. a 4.2.6.). Výsledné produkty byly buď přímo použity na sekvenační analýzy, nebo byly zaligovány do plazmidových vektorů.
4.3.2.3. Ligace PCR produktů a jejich transformace do bakteriálních buněk Pro ligaci PCR fragmentů do plazmidových vektorů a pro jejich následnou transformaci do bakterií byl použit StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies, USA). Ligace probíhala v objemu 3 μl obsahujícím 1,5 μl StrataClone™ Cloning buffer, 0,5 μl 46
Kapitola 4: Metodika práce StrataClone™ Vector Mix (pSC-A plazmidový vektor) a 1 μl purifikovaného PCR produktu. Směs byla pomocí pipety promíchána a ponechána 20 min při laboratorní teplotě. Na ledu byla současně pozvolna rozmražena směs 25 μl kompetentních bakteriálních buněk StrataClone SoloPack Competent Cells (Agilent Technologies, USA). Po inkubaci byl celý objem ligační směsi převeden k bakteriálním buňkám a po mírném promíchání byla mikrozkumavka ponechána 30 min na ledu. Poté následoval teplotní šok při 42 ˚C po dobu 45 s a 2 min inkubace na ledu. K bakteriálním buňkám bylo přidáno 250 μl tekutého LB média předem zahřátého na 42 ˚C a vzorek byl ponechán v horizontální poloze v termostatu při 37 ˚C 1 h. Po celou dobu inkubace byl vzorek mírně promícháván na horizontální třepačce (100 RPM). Následně bylo 100 μl kompetentních buněk rozetřeno na pevné LB médium v Petriho miskách (90 mm) obsahující ampicilin v koncentraci 100 μg/ml. Půl hodiny před samotným naočkováním bakterií bylo na plochu agaru rozetřeno 40 μl 2% xgal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid).
Petriho
misky
s vysetými
bakteriálními buňkami byly ponechány přes noc v 37 ˚C (zhruba 12 h od vysetí). Složení média je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.3.2.4. Kontrola bakteriálních klonů Druhý den byly na miskách pozorovány narostlé bílé kolonie bakterií, u kterých došlo k transformaci vektoru a porušení genu pro β-galaktosidázu a modré kolonie, u kterých s nejvyšší pravděpodobností PCR produkt do vektoru inkorporován nebyl (exprese genu pro β-galaktosidázu, štěpení substrátu). Kompetentní buňky, které neobsahovaly plazmidový vektor, na agaru vůbec nenarostly (díky nepřítomnosti bla ApR gen pro β-laktamázu). Pro ověření této modro-bílé selekce byly bílé kolonie bakterií použity jako templát pro PCR. Kolonie byly vypíchnuty sterilním párátkem z gelu, přeneseny na novou Petriho misku s pevným LB médiem a následně hrotem párátka převedeny do předpřipraveného PCR mastermixu. PCR probíhala v objemu 25 μl obsahujícím 1× DreamTaq buffer (Fermentas), 2 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2 mM každého dNTP (Fermentas), 2,5 μM reverzního primeru, 2,5 μM forwardového primeru a 1,25 U DreamTaq polymerse (Fermentas). Pro práci byly využity specifické primery využité při přípravě samotného PCR templátu (tab. 9, 10, 11). Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 95 °C 2 min; 35 cyklů: 95 °C 30 s, 42 – 62 ˚C 45 s (specifické Ta jednotlivých párů primerů jsou uvedeny v tab. 9, 10, 11, kapitola Přílohy), 72 ˚C 1 – 3 min (závislost na velikosti amplifikovaného produktu; na vytvoření 1 000 párů bází je doporučena 47
Kapitola 4: Metodika práce prolongace v délce 1 min); 72 °C 7 min. PCR fragmenty byly vyzualizované pomocí elektroforetické separace na horizontální agarózové elektroforéze, podrobný protokol je uveden v tomto oddílu (podkapitola 4.2.5.). Pokud byly na výsledném elektroforeogramu přítomné fragmenty s námi predikovanou velikostí, byly kolonie baktérií použity pro další analýzy. Pokud nebyl na elektroforeogramu patrný žádný signál či fragment velikostně neodpovídal našim požadavkům, byly tyto testované bakterie z pokusu vyřazeny. Klony bakterií obsahující specifický insert byly následně využity buď pro přímou amplifikaci fragmentů pomocí metody PCR anebo po namnožení v tekutém LB médiu pro purifikaci rekombinantních plazmidů.
4.3.2.5. Příprava PCR produktů pro sekvenační analýzy Vybrané klony baktérie byly vypíchnuty párátkem z gelu, přeneseny na novou Petriho misku a hrotem párátka následně převedeny do předpřipraveného master mixu pro PCR. PCR reakce probíhala v 25 μl objemu obsahujícím 1× LA PCR™ Buffer ll Mg2+ free (Takara), 2,5 mM MgCl2 (Takara), 2,5 mM každého dNTP (Takara), 6,25 μM reverzního primeru M13R-pUC(-40), 6,25 μM vedoucího primeru M13F(-20), 1,25 U TaKaRa LA Taq ™ polymerase (Takara). Pro PCR byl použit termocykler MJ Research PTC 200. Podmínky během amplifikace byly následující: 94 ˚C 1 min; 30 cyklů: 94 ˚C 20 s, 42 ˚C 30 s, 72 ˚C 1 – 3 min (závislost na velikosti amplifikovaného produktu; na vytvoření 1 000 párů bází je doporučena prolongace v délce 1 min);
72 ˚C 5 min. Po separaci DNA na agarózové
elektroforéze byly PCR fragmenty vyříznuty a izolovány z gelu pomocí GenEluteTM Gel Extraction Kit (Sigma Aldrich). Podrobné protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.5. a 4.3.1.). Výsledné PCR produkty byly použity pro sekvenaci.
4.3.2.6. Příprava bakteriálních plazmidů pro sekvenační analýzy Bílé kolonie bakterií byly vypíchnuty párátkem z gelu a párátko bylo vloženo do centrifugační zkumavky obsahující 15 ml tekutého LB média s ampicilinem (100 μg/ml). Vzorek byl za stálého míchání (100 RPM) inkubován přes noc při 37 ˚C (cca 12 h). Druhý den následovala izolace plazmidové DNA z bakteriálních buněk. Pro naše účely byla využita sada GenEluteTM Plasmid MiniPrep Kit (Sigma-Aldrich). Postupně byly v jedné mikrozkumavce centrifugovány (11 000 × g, 2 min) 4 ml LB média s bakteriálními buňkami. Sediment buněk byl resuspendován v 200 μl Resuspension
48
Kapitola 4: Metodika práce solution. Ke směsi bylo připipetováno 200 μl Lysis solution a celý obsah byl jemně promíchán převrácením mikrozkumavky v ruce. Po 3 min bylo ke směsi přidáno 350 μl Neutralization solution a vzorek byl centrifugován (12 000 × g, 1 min). Vodní část byla převedena do mikrozkumavky se speciální kolonkou a mikrozkumavka byla centrifugována (12 000 × g, 1 min). Po dvojitém promytí kolonky 500 μl Wash solution a jednou centrifugací „na sucho“ byla plazmidová DNA centrifugací (12 000 × g, 1 min) eluována do 50 μl Elution solution. Takto připravené vzorky mohly být použity pro sekvenaci. Uvedený postup byl doporučen výrobcem (Sigma Aldrich), složení roztoků není uvedeno. Složení média je uvedeno v kapitole Přílohy.
4.3.2.7. Analýzy sekvencí PCR produkty nebo fragmenty plazmidové DNA byly oboustranně komerčně osekvenovány na automatických sekvenačních analyzátorech (ABI3130, 3730 DNA Analyzer (ABI) sequencers, 23 ABI 3730XLs) ve firmách Biogen s.r.o. (Česká republika), Primm s.r.l. (Italy) a Macrogen (Holandsko). Pro sekvenování PCR fragmentů byly využity specifické primery nebo universální primery plazmidového vektoru (tab. 8, 9, 10, 11). Získané sekvence nukleotidů byly porovnány za využití BLAST (Altschul et al., 1997) a následně analyzovány pomocí programu BioEdit 7.0.9 (Ibis Biosciences, USA). Pomocí programu NCBI ORF Finder byly identifikovány otevřené čtecí rámce (ORF) a konzervativní domény aminokyselin byly určeny pomocí NCBI Conserved Domain Database využívající CD-Search (Marchler-Bauer & Bryant, 2004). Získané sekvence nukleotidů a od nich odvozených aminokyselin byly porovnány s již publikovanými sekvencemi a byla stanovena jejich procentuální sekvenční identita pomocí programu Clustal X algorithm, version 2.0 (Larkin et al., 2007). Fylogenetické analýzy byly provedeny na základě shlukové analýzy dat pomocí metody Neighbour-joining algoritmu (Saitou et al., 1987) za využití programu Clustal X, version 2.0 (Larkin et al., 2007) s bootstrap hodnotou 1000 replikací (Felsenstein, 1985). Sekvenační data použitá v naší studii jsou uvedena v tab. 12 (kapitola Přílohy).
49
Kapitola 4: Metodika práce
4.4. Monitoring ApLV na území ČR 4.4.1. Odběr vzorků Odběr vzorků listů meruněk na území České republiky probíhal v letech 2005 a 2006. Sběr byl soustředěn převážně na hlavní pěstitelské oblasti tohoto teplomilného ovocného druhu, a to na Jihomoravský a Zlínský kraj. Během dvou let bylo odebráno celkem 260 vzorků rostlin z produkčních sadů. V roce 2009 byl dále ve spolupráci se Zahradnickou fakultou Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity (MZLU) v Lednici proveden odběr vzorků rostlinného materiálu z místního genofondu meruněk čítající 358 evropských kultivarů meruněk LAM., jejich mezidruhových hybridů a rostlin meruněk SCOPOLI. Odběr vzorků probíhal vždy v červenci a srpnu. Jelikož je infekce na rostlinách meruněk ve většině případů latentní, nebyl kladen žádný důraz na výběr rostlinného materiálu s etiologicky neznámými příznaky. Listy byly dopraveny v přenosných chladničkách na katedru ochrany rostlin ČZU, kde byly ihned otestovány nebo přemístěny do chladících či mrazících zařízení. Rostlinné vzorky byly před samotnou analýzou skladovány v lednici při 4 °C maximálně jeden týden a v mrazicím boxu při -24 ˚C nejdéle 3 měsíce.
4.4.2. Testování vzorků Pro detekci ApLV v rostlinném materiálu byla použita izolace celkové RNA pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001), dále metoda Two-Step RT-PCR a konečná vizualizace výsledků pomocí agarózové elektroforézy. Veškeré protokoly jsou uvedeny v tomto oddílu (podkapitoly 4.2.4. a 4.2.5.).
50
Kapitola 5: Výsledky
Kapitola 5
Výsledky 5.1. Biologická charakteristika ApLV 5.1.1. Hostitelský okruh ApLV 5.1.1.1. Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF 305 Z 22 semenáčů broskvoní GF 305 naočkovaných v průběhu let 2005 a 2006 palestinským izolátem ApLV bylo na základě výsledků Two-Step RT-PCR analýz vyhodnoceno 17 testovaných rostlin jako pozitivní na přítomnost ApLV v rostlinném pletivu. Přenos patogena na tyto hostitelské rostliny tedy proběhl se 78% úspěšností.
5.1.1.2. Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin Z 33 kultivarů peckovin byly dle výsledků Two-Step RT-PCR analýz vyhodnoceny všechny testované odrůdy ovocných druhů jako pozitivní na přítomnost ApLV v rostlinném pletivu. Dosud známý hostitelský okruh byl tedy nově rozšířen o kultivary broskvoní Spring Gold, Baracca, Baby Gold 7, Baby Gold 9, Baby Gold 6, Anderson, Vivian-ppc-199, Armking, Nectared, O´Henry; dále o kultivary třešní Fucilletta Primizia, Adriana, Roma, Napolitana, Lapins, Moreau; o odrůdy meruněk Harcot, Bulida, Oranged a vůbec poprvé o kultivary japonských a evropských švestek Autumn Giant, Ozark Premium, Regina, St. Angeleno, Blue Free, Sangue di Drago, Friar, Burbank, Black Star, Stanley a President.
5.1.1.3. Přenos ApLV na bylinné hostitele V průběhu let 2008 až 2010 bylo vypěstováno a nainokulováno celkem 300 testovacích rostlin z šesti bylinných čeledí. Jednalo se o druhy Tetragonia ssp., Gomphrena globosa, Cucumis sativus cv. Baby, C. sativus cv. Perseus, Cucurbita pepo var. oleifera, Phaseolus vulgaris cv. Novares, P. vulgaris cv. Maxidor, Chenopodium amatanticolor, Ch. botrys, Ch.
51
Kapitola 5: Výsledky
capitatum, Ch. giganteum, Ch. schraderianum, Ch. bonus-henricus, Lycopersicum ssp., Nicotiana benthamiana, N. cavicola, N. clevelandii, N. glutinosa, N. longiflora, N. occidentalis ´N37 ´, N. occidentalis ´Obligua´, N. rustica, N. sanderae, N. silvestris, N. tabacum cv. Samsun, N. tabacum ´White Burley´, N. tabacum ´Watson´ a Physalis peruviana. Ačkoliv rostliny nevykazovaly v průběhu kultivace žádné viditelné příznaky vyvolané virovými patogeny, byl veškerý rostlinný materiál podroben RT-PCR analýzám na přítomnost ApLV v rostlinném pletivu. Na základě námi získaných výsledků však nedošlo k přenosu patogena ani u jednoho testovaného druhu. Přestože byl během experimentálního přenosu viru kladen důraz na velké množství důležitých aspektů přenosu (jmenovitě na širokou škálu druhů rostlin, různorodost pufrů i odlišných pěstebních podmínek během samotné kultivace rostlin), nedošlo k potvrzení ani rozšíření již známého, ale striktně limitovaného bylinného hostitelského okruhu ApLV.
5.1.2. Studium symptomů ApLV 5.1.2.1. Semenáče broskvoní GF 305 Všechny testované semenáče broskvoní GF 305 vykazující na základě výsledků TwoStep RT-PCR analýz přítomnost ApLV v rostlinném pletivu byly označeny jako symptomatické. Příznaky měly podobu žlutých nepravidelných hvězdicovitých skvrn po celé čepeli listů (obr. 4). Zdravé nenaočkované rostliny použité jako negativní kontroly pokusu nevykazovaly žádné fyziologické odchylky. Příznaky byly ve všech případech nejprve patrné na listech nejstarších větví u báze stromů, později se symptomy postupně rozšiřovaly po celé koruně. Na nově přirostlých letorostech byly listy nejčastěji bezpříznakové, avšak z výsledků detekčních testů bylo patrné, že je virus v tomto mladém listovém pletivu přítomen také. Příznaky se na rostlinách začaly objevovat v průběhu měsíce června, jejich intenzita během vegetačního období stoupala a byly přítomné až do opadu listů. Dle navržené stupnice symptomů byly semenáče charakterizovány číslem 2 (symptomy se vyskytovaly po celé koruně stromu) (tab. 13).
A 52
Kapitola 5: Výsledky
A
B
C
D
Obrázek 4. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech semenáčů broskvoní GF 305. A: listy odebrané v letních měsících; B: detail listu broskvoně GF 305; C: list odebraný na podzim; D: detail listu broskvoně GF 305.
5.1.2.2. Kultivary broskvoní Virové symptomy byly pozorovány u všech testovaných kultivarů broskvoní, jmenovitě u odrůd Spring Gold, Baracca, Baby Gold 7, Baby Gold 9, Baby Gold 6, Anderson, Vivianppc-199, Missour, Armking, Nectared a O´Henry. Viruprosté rostliny jednotlivých odrůd peckovin použité jako negativní kontroly pokusu byly bez jakýchkoliv viditelných příznaků. Symptomy měly stejnou povahu jako u semenáčů broskvoní GF 305, tedy v podobě žlutých skvrn hvězdicovitého charakteru lokalizovaných po celé ploše listové čepele (obr. 5). U většiny kultivarů byly symptomy patrné od začátku května. Na přelomu měsíce června a července byla četnost příznaků největší. Odrůdy Spring Gold, Missour a Armking byly dle navržené stupnice symptomů charakterizovány číslem 2 (symptomy se vyskytovaly 53
Kapitola 5: Výsledky po celé koruně stromu). Tyto tři odrůdy si také jako jediné uchovaly příznaky až do konce vegetace (tab. 13).
A
B
C
D
E
Obrázek 5. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech kultivarů broskvoní. A, B: kultivar Anderson, C: kultivar Missour, D: kultivar Spring Gold, E: kultivar Nectared.
54
Kapitola 5: Výsledky Tabulka 13. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách broskvoní. Symptomatická stupnice: 0: bez příznaků; 1: příznaky pozorované jen na víceletých větvích u báze stromů; 2: příznaky pozorované po celé koruně stromů.
Kultivary broskvoní
Duben
Květen
Červen
Červenec
Srpen
Září
Říjen
Listopad
GF 305*
0
0
1
2
2
2
1
1
Armking**
0
1
2
2
2
2
1
1
Missour**
0
1
2
2
2
2
1
1
Spring Gold**
0
1
2
2
2
1
1
1
Anderson**
0
1
1
1
1
0
0
0
Baracca**
0
1
1
1
1
0
0
0
Vivian-ppc-199**
0
1
1
1
1
0
0
0
Baby Gold 7**
0
1
1
1
1
0
0
0
Baby Gold 9**
0
1
1
1
1
0
0
0
Baby Gold 6**
0
1
1
1
0
0
0
0
Nectared**
0
1
1
1
0
0
0
0
O´Henry**
0
0
1
1
0
0
0
0
* Pokus realizovaný na ČZU v České republice ** Pokus realizovaný na Univerzità degli Studi di Bari v Itálii
5.1.2.3. Kultivary meruněk Symptomy spojované s infekcí ApLV byly pozorovány pouze na stromech meruňky cv. Tirynthos (obr. 6). Příznaky byly od typických symptomů ApLV na rostlinách P. persica odlišné, na celé čepeli listů byla patrná žlutá difúzní skvrnitost. Odrůda byla dle symptomatické stupnice zařazena do skupiny označované číslem 1 (symptomy pozorované jen na víceletých větvích u báze stromů). Příznaky byly patrné od konce května, v červnu byly příznaky nejvýraznější a během července začaly kontinuálně ustupovat (tab. 14).
Obrázek 6. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech meruňky cv. Tirynthos.
55
Kapitola 5: Výsledky Tabulka 14. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách meruněk. Symptomatická stupnice: 0: bez příznaků; 1: příznaky pozorované jen na víceletých větvích u báze stromů; 2: příznaky pozorované po celé koruně stromů. Kultivary meruněk Tirynthos*
Duben
Květen
Červen
Červenec
Srpen
Září
Říjen
Listopad
0
1
1
2
1
0
0
0
* Pokus realizovaný na Univerzità degli Studi di Bari v Itálii.
5.1.2.4. Kultivary třešní a švestek Pozitivní rostliny třešní a japonských a evropských švestek neprojevovaly během našeho dvouletého pozorování žádné viditelné příznaky.
5.1.2.5. Výsledky testů ELISA a RT-PCR na přítomnost vybraných virových patogenů Výsledky sérologických testů DAS a TAS ELISA na přítomnost virů z rodů Ilarvirus, Trichovirus a Potyvirus, jmenovitě PNRSV, PDV, PPV, ApMV a ACLSV byly u všech testovaných rostlin negativní. Jelikož nebyla směsná infekce s výše jmenovanými virovými patogeny potvrzena ani metodami RT-PCR, byly naše výsledky tímto testem verifikovány. S vysokou pravděpodobností tedy můžeme pozorované příznaky na rostlinách peckovin připsat právě infekci ApLV.
5.2. Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV 5.2.1. Zdroje rostlinného materiálu Z výsledků RT-PCR analýz vyplývá, že u broskvoní a meruněk je možné ApLV detekovat ve všech testovaných rostlinných orgánech, tedy jmenovitě z lýkové části větviček, celých květů, listových řapíků, listů a plodů. U třešní a japonských a evropských švestek bylo možné detekovat patogena pouze z listového pletiva.
5.2.2. Doba odběru rostlinného materiálu Na základě výsledků RT-PCR analýz bylo potvrzeno, že z lýkové části větviček stromů broskvoní bylo možné ApLV detekovat již od samotného počátku vegetace, tedy od konce měsíce března. Koncentrace viru v rostlinách však v tomto období bývá velmi nízká, což 56
Kapitola 5: Výsledky vedlo s určitou pravidelností ke vzniku nežádoucích falešně negativních výsledků. Z těchto důvodů bylo pro spolehlivou detekci ApLV v klimatických podmínkách České republiky doporučeno odebírat rostlinný materiál až od měsíce června do opadu listů (konec října, listopad), tedy v období, kdy byla detekce patogena z rostlin vždy stoprocentní. Díky teplejším klimatickým podmínkám jižní Itálie byla doba odběru vzorků z rostlin broskvoní na tomto území prodloužena na období od měsíce dubna až do konce vegetační doby (konec října, listopad). Detekce viru u kultivarů meruněk, třešní a švestek byla komplikovanější, byly zde patrné i drobné rozdíly mezi jednotlivými odrůdami peckovin. Nejvhodnější doba pro spolehlivou detekci byla tedy zúžena na období července, srpna a září B
D
(obr. 7).
B
A
C
B
D
D
Obrázek 7. Detekce ApLV v průběhu vegetačního období. Elektroforeogramy RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery C-ALV1/H-ALV1, velikost PCR produktu 198 pb. A: broskvoň cv. Spring Gold; B: meruňka cv. Tirynthos; C: třešeň cv. Adriana; D: japonská švestka cv. Autumn Giant. M: DNA marker Mass ruler low range (Fermentas); H: H2O; N: vzorek z viruprostých peckovin; 1: duben; 2: květen; 3: červen; 4: červenec; 5: srpen; 6: září; 7: říjen. B
D
5.2.3. Způsob uchování rostlinného materiálu Za účelem určit optimální způsob dlouhodobého skladování rostlinného materiálu určeného pro detekci ApLV byly pomocí metody Two-Step RT-PCR porovnány čtyři odlišné techniky dehydratace listů, jmenovitě lyofilizace, dehydratace pomocí CaCl2, glycerolu a vysušení dle Sipahioglu et al. (2006). Z výsledků testů vyplývá, že biologický materiál lze dlouhodobě uchovávat všemi výše zmiňovanými technikami. Detekce ApLV byla ve všech čtyřech případech úspěšná se stoprocentní spolehlivostí. Poslední testování proběhlo 10
57
Kapitola 5: Výsledky měsíců od založení pokusu, zda je možné virus detekovat z materiálu i v delším časovém odstupu, bude v budoucnu potvrzeno či vyvráceno dalšími analýzami.
5.2.4. Izolace celkové RNA 5.2.4.1. Homogenizace rostlinného materiálu Na základě výsledků testu zaměřeného na evaluaci alternativních způsobů homogenizace biologického materiálu pomocí extrakčních sáčků a ručního homogenizátoru (Bioreba) a oscilačního mlýnu Retsch MM se obě techniky drcení listů osvědčily. Hodnoty výtěžnosti celkové RNA byly u obou dvou variant shodné s hodnotami získanými klasickou technikou využívající třecí misky a tekutý dusík a úspěšnost detekce ApLV pomocí Two-step RT-PCR analýzy z takto připravených vzorků byla vždy stoprocentní.
5.2.4.2. Vyhodnocení izolačních technik Veškeré testované metody extrakce celkové RNA, jmenovitě izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001), fenol-chloroformová izolace dle Sambrook & Russel (2001), izolace pomocí RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) a izolace pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche) použité pro detekci ApLV z pletiv listů, řapíků a květů peckovin byly na základě RT-PCR analýz vyhodnoceny jako spolehlivé, přítomnost viru byla potvrzena ve všech analyzovaných vzorcích. Při extrakci nukleové kyseliny z lýkové části větviček a plodů stromů byly použitelné všechny výše jmenované extrakční metody vyjma izolace celkové RNA pomocí RNeasy Plant Mini Kit. Tato technika se projevila jako méně vhodná, jelikož detekce patogena nebyla u všech testovaných pozitivních vzorků stoprocentní. Nejvyšší výtěžnost celkové RNA vypočítaná na základě změřené koncentrace nukleové kyseliny byla sledována u metody izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent. Dále následovala metoda fenol-chloroformové izolace, izolace pomocí „silika“ a izolace pomocí RNeasy Plant Mini Kit (tab. 15). Čistota RNA byla u izolace pomocí „silika“, izolace pomocí RNeasy Plant Mini Kit a izolace pomocí TriPure Isolation Reagent srovnatelná, u všech testovaných vzorků se koeficient pohyboval v doporučeném intervalu 1,7 - 2,0, zatímco u metody fenolchloroformové izolace se hodnoty dostaly až pod jeho spodní hranici (tab. 16). Dle testů zaměřených na integritu RNA se jako jediná neodpovídající metoda projevila fenol-chloroformová izolace. Ribozomální podjednotky RNA 28S a 18S byly viditelně 58
Kapitola 5: Výsledky nekompaktní a separované fragmenty nebyly na agarózovém gelu ostré. U zbylých izolačních technik byla integrita vyhodnocena jako dobrá (obr. 8). Z hlediska časové náročnosti byly jako optimální vyhodnoceny metody izolace celkové RNA pomocí RNeasy Plant Mini Kit a izolace pomocí TriPure Isolation Reagent. Celková doba samotného izolačního procesu byla u obou dvou technik výrazně kratší a jejich další neopominutelnou výhodou byla bezesporu i přítomnost všech nezbytných reagencií potřebných k samotné analýze bez nutnosti jejich přípravy předem. Na druhé straně se však tato přednost odrazila ve vyšší pořizovací ceně. Jistě stojí za zmínku i zhodnocení zdravotního rizika při samotné aplikaci extrakčních technik. Během extrakce RNA bylo u všech zmiňovaných testovaných metod využíváno toxických chemických sloučenin, jmenovitě fenolu, 2-merkaptoetanolu, chloroformu a/nebo guadinin thiokyanátu. Pokud jsou však během práce striktně dodržovány bezpečnostní pokyny a se sloučeninami je manipulováno ve vymezených, částečně nebo zcela uzavřených prostorách digestoře, není důvod, proč by měly být tyto velmi efektivní způsoby extrakce nukleových kyselin zavrhovány. Na základě výše demonstrovaných výsledků není pro detekci a dodatkové analýzy ApLV jako jediná doporučena metoda fenol-chloroformové izolace celkové RNA. Ostatní výše uvedené techniky splňovaly všechna námi předem určená kritéria spolehlivé extrakce RNA (tab. 17). V rámci předkládané disertační práce byla nejčastěji využívána metoda izolace celkové RNA pomocí „silika“. Pro účely sekvenování byla upřednostňována finančně nákladnější izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent, která se během testování projevila ze všech typů extrakce nukleových kyselin z hlediska všch sledovaných kritérií jako nejlepší.
Tabulka 15. Výtěžnosti a čistota celkové RNA. Izolace celkové RNA pomocí komerčního kitu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) Vzorek
Koncentrace (ng/µl)
1 101,9 2 164,9 3 150.0 4 222,8 5 170,4 6 138,2 7 201,7 8 191,2 Průměrná hodnota výtěžnosti: Směrodatná odchylka:
A260/A280
Výtěžnost (μg)
2,0 1,8 1,9 1,7 2.0 1,9 1,9 1,8
4,0 6,6 6 8,9 6,8 5,5 8,1 7,6 6,7 ±1,16
59
Izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001) Koncentrace Výtěžnost Vzorek A260/A280 (ng/µl) (μg) 1 72,2 2,1 9,4 2 32,4 2,0 4,2 3 40,5 2,0 5,3 4 62,6 2,1 8,1 5 71,4 2,1 9,3 6 54,5 2,0 7,1 7 82,6 2,1 10,7 8 45,4 2,1 5,9 Průměrná hodnota výtěžnosti: 7,5 Směrodatná odchylka: ±1,88
Kapitola 5: Výsledky Tabulka 15. Výtěžnosti a čistota celkové RNA (pokračování). Izolace celkové RNA pomocí fenol-chloroformové extrakce dle Sambrook & Russel (2001) Koncentrace Vzorek A260/A280 Výtěžnost (μg) (ng/µl) 1 152,9 1,5 22,9 2 98,5 1,5 14,8 3 82 1,4 12,3 4 99,7 1,6 15 5 92,8 1,5 13,9 6 105,1 1,4 15,8 7 101,9 1,4 15,3 8 152 1,4 22,8 Průměrná hodnota výtěžnosti: 16,6 Směrodatná odchylka: ±3,13
Izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche) Koncentrace Výtěžnost Vzorek A260/A280 (ng/µl) (μg) 1 318 1,7 25,4 2 391,4 1,7 31,3 3 404,4 1,7 32,4 4 379,9 1,7 30,4 5 379,2 1,7 30,3 6 383,5 1,7 30,7 7 378,8 1,7 30,3 8 398,5 1,7 31,9 Průměrná hodnota výtěžnosti: 30,3 Směrodatná odchylka: ±1,25
Obrázek 8. Porovnání integrity izolované celkové RNA. Elektroforeogramy polymerů RNA po separaci na agarózovém gelu. M: RiboRuler™ High Range RNA Ladder (Fermentas); K1-K4: izolací pomocí RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); S1-S4: izolace pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001); F1-F4: izolace pomocí fenol-chloroformové extrakce (Sambrook & Russel, 2001); T1-T4: izolace pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche).
Tabulka 16. Porovnání izolačních metod na základě výtěžnosti, čistoty a integrity celkové RNA Izolační metoda
Průměrná výtěžnost celkové RNA (µg)
Čistota celkové RNA
Integrita celkové RNA
6,7
dobrá
dobrá
7,5
dobrá
dobrá
16,6
špatná
špatná
30,3
dobrá
dobrá
Izolace celkové RNA pomocí komerčního kitu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) Izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001) Izolace celkové RNA pomocí fenol-chloroformové extrakce dle Sambrook &Russel (2001) Izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche)
5.2.5. Detekční metody založené na RT-PCR V předkládané práci bylo pro detekci ApLV v rostlinném materiálu optimalizováno dvanáct detekčních RT-PCR technik, jmenovitě Two-Step RT-PCR, Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA, Two-Step RT-PCR s využitím UDG, Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG, Co-RT-PCR, Nested RT-PCR, One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit, One-Step RT-PCR „vlastní výroby“, 60
Kapitola 5: Výsledky
DB-RT-PCR,
IC-RT-PCR bez využití specifických protilátek, SC-RT-PCR bez využití
specifických protilátek a PC-RT-PCR bez využití specifických protilátek. Výsledné elektroforeogramy PCR produktů jednotlivých RT-PCR analýz jsou uvedeny na obr. 9 - 19. Obrázek 9. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
Obrázek 10. Detekce ApLV metodou Two-Step RTPCR
s koamplifikací
rostlinné
mRNA.
Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery ANESr1/ANESf3 a NAD5s/NAD5as, velikost PCR produktů 128 bp a 181 bp. M:
hmotnostní
standard
Mass
ruler
low
range
(Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV. Obrázek 11. Detekce ApLV metodou Two-Step RT. PCR s využitím UDG. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery ANESr1/ANESf3, velikost PCR produktu 128 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
Obrázek 12. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA (B) a Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG (C). Elektroforeogramy RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery ANESr1/ANESf3 a NAD5s/NAD5as, velikost PCR produktů 128 bp (ApLV) a 181 bp (mRNA). M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; 1, 2: vzorky z listů viruprosté broskvoně, kontaminované PCR produktem; 3, 4: vzorky z listů viruprosté broskvoně; 5, 6: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
61
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 13. Detekce ApLV metodou Co-RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery ANESr1/ANESf3 a RALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
Obrázek 14. Detekce ApLV metodou Nested RT-PCR. Elektroforeogram
produktů
RT-PCR
produktů
po
separaci na agarózovém gelu. Použité primery HALV/ENDr a R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV. Obrázek 15. Detekce ApLV metodou One-Step RT-PCR s
využitím
QIAGEN®
OneStep
RT-PCR
kitu.
Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV. Obrázek 16. Detekce ApLV metodou One-Step RTPCR „vlastní
výroby“.
Elektroforeogram RT-PCR
produktů po separaci na agarózovém gelu.
Použité
primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M:
hmotnostní
standard
Mass
ruler
low
range
(Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV. Obrázek 17. Detekce ApLV metodou DB-RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po
separaci na
polyakrylamidovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-3: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
62
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 18. Detekce ApLV metodou IC-RT-PCR bez využití specifických protilátek. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na polyakrylamidovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: H2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1 - 4: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV.
Obrázek 19. Detekce ApLV metodou SC- a PC-RT-PCR bez yužití specifických protilátek. Elektroforeogram RTPCR produktů po separaci na polyakrylamidovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: H2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-2: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (SC-RT-PCR); 3-4: vzorky z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV ( PC-RT-PCR).
5.2.6. Detekční metody založené na dot-blot hybridizaci Další optimalizovanou metodou pro detekci ApLV v rostlinném pletivu byla metoda dot-blot hybridizace nukleových kyselin za využití RNA sond značených digoxigeninem. Výsledná membrána se vzorky vizualizovanými pomocí enzymatické reakce alkalické fosfatázy se substrátem je zdokumentována na obr. 20.
Obrázek 20. Detekce ApLV metodou dot-blot hybridizace. Hybridizační membrána. H: ddH2O; N: vzorky z viruprosté P. persica; 1-3: vzorky z z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV; 4-6: vzorky z z listů broskvoně negativní na přítomnost ApLV.
63
Kapitola 5: Výsledky
5.2.7. Vyhodnocení vybraných detekčních metod 5.2.7.1. Specifita detekčních metod Jako dostatečně specifické byly v průběhu našeho testování vyhodnoceny metody TwoStep RT-PCR, Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA, Two-Step RT-PCR s využitím UDG, Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG v jedné reakci, Co-RT-PCR, Nested RT-PCR, One-Step RT-PCR využívající QIAGEN® OneStep RT-PCR kit a One-Step RT-PCR „vlastní výroby“. Pomocí specifických primerů využívaných ve vybraných technikách pro detekci ApLV bylo možné bezproblémově detekovat všechny nám dostupné izoláty ApLV, čímž byla potvrzena jejich univerzálnost. Kontroly pokusů v podobě viruprostých rostlin peckovin byly vždy negativní. Tyto vybrané metody byly následně podrobeny testům relativní citlivosti a spolehlivosti. Na rozdíl od výše zmiňovaných technik docházelo opakovaně u metod DB-RT-PCR, IC-RT-PCR, SC-RT-PCR a PC-RT-PCR ke vzniku falešně pozitivních či negativních výsledků. Celkově nízká specifita byla patrná i u dot-blot molekulární hybridizace. Ačkoliv byl během vývoje těchto technik kladen velký důraz na celou řadu aspektů, nepodařilo se je během studie efektivně optimalizovat. Z výše uvedených důvodů proto nejsou tyto metody pro diagnostické účely detekce ApLV doporučeny a byly z následných dodatkových testů vyloučeny.
5.2.7.2. Relativní citlivost vybraných detekčních metod Testy sledující relativní citlivost detekce osmi vybraných RT-PCR metod poukázaly na značné rozdíly mezi jednotlivými technikami. Detekční limit metod RT-PCR s využitím UDG a Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG v jedné reakci, One-step RT-PCR využívající QIAGEN® OneStep RT-PCR kit a One-Step RT-PCR „vlastní výroby“ byl vyhodnocen jako nejnižší. Dále následovaly techniky Co-RT-PCR, Twostep RT-PCR a RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA. Metoda Nested RT-PCR vykazovala nejlepší výsledky, byla až 10 000× citlivější než první jmenované metody (obr. 21 - 28, tab. 17).
64
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 21. Citlivost metody Two-step RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×; 11: 100 000×; 12: 500 000×; 13: 1 000 000 ×; 14: 5 000 000 ×).
Obrázek 22. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery ANESr1/ ANESf3 a NAD5s/ NAD5as, velikost PCR produktů 128 bp a 181 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×).
Obrázek 23. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s využitím UDG. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×).
65
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 24. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu.
Použité primery ANESr1/ ANESf3 a NAD5s/
NAD5as, velikost PCR produktů 128 bp a 181 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×).
Obrázek 25. Relativní citlivost metody Co-RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery H-ALV1/ENDr a R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-14: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×; 11: 1 000 000×; 12: 5 000 000×; 13: 10 000 000 ×; 14: 50 000 000 ×).
Obrázek 26. Relativní citlivost metody Nested RT-PCR. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery H-ALV/ENDr a R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-14: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×; 11: 1 000 000×; 12: 5 000 000×; 13: 10 000 000 ×; 14: 50 000 000 ×).
66
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 27. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR využívající QIAGEN® OneStep RT-PCR kitu. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×).
Obrázek 28. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR „vlastní výroby“. Elektroforeogram RT-PCR produktů po separaci na agarózovém gelu. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů viruprosté broskvoně; 1-10: ředění vzorků získaných z listů broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV (1: 10×; 2: 50×; 3: 100×; 4: 500×; 5: 1000×; 6: 5000×; 7: 10 000×; 8: 50 000×; 9: 100 000×; 10: 500 000×).
Tabulka 17. Relativní citlivost vybraných RT-PCR metod.
Sériové ředění šťávy z listů broskví Metody Two-Step RT-PCR Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA Two-Step RT-PCR + UDG Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA + UDG Co-RT-PCR Nested RT-PCR One-Step RT-PCR využívající QIAGEN® OneStep RT-PCR kit One-Step RT-PCR "vlastní výroby"
10× 50× 100× 500× 1 000× 5 000× 10 000× 50 000× 100 000× 500 000× 1 000 000× 5 000 000×
+ + + + + + + +
+ + + + + + + +
+ + + + + + + +
+ + + + -
+ + + + -
+ + + + -
67
+ + + -
+ -
+ -
+ -
+ -
-
Kapitola 5: Výsledky 5.2.7.3. Relativní spolehlivost vybraných detekčních metod Test relativní spolehlivosti RT-PCR technik byl rozdělen na dvě části. Do prvního testu byly zahrnuty rostlinné vzorky odebírané během celého vegetačního období peckovin, včetně jarních a podzimních měsíců. Druhá část pokusu byla zaměřena pouze na analýzy rostlinného materiálu odebíraného v námi doporučeném období sběru, tedy v měsících červenci, srpna a září. Z výsledků prvního experimentu vyplývá, že pouze metoda Nested RT-PCR má potenciál detekovat virus se stoprocentní spolehlivostí ve všech testovaných rostlinách. Nejnižší spolehlivost vykazovaly metody Two-Step RT-PCR s využitím UDG a Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG v jedné reakci, při kterých bylo identifikováno pouze 12 z 20 vzorků pozitivních na přítomnost ApLV. Spolehlivost těchto metod tedy byla zhodnocena pouze na 60 % (tab. 18). Při testování vzorků odebíraných v námi doporučeném termínu byla situace velmi odlišná. Vyjma dvou technik, jmenovitě metody Two-Step RT-PCR s využitím UDG a metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a využitím UDG technologie v jedné reakci, při kterých byla úspěšnost detekce z 80 %, se všechny zbylé techniky prokázaly jako stoprocentně spolehlivé (tab. 18).
Tabulka 18. Relativní spolehlivost vybraných detekčních metod. Počet testovaných rostlin (ks)
Počet rostlin pozitivní na přítomnost ApLV (ks)
Relativní spolehlivost (%)
Two-Step RT-PCR
20*/15**
18
90*/100**
Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA
20*/15**
17
85*/100**
Two-Step RT-PCR + UDG
20*/15**
12
60*/80**
Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA + UDG
20*/15**
12
60*/80**
Co-RT-PCR
20*/15**
18
90*/100**
Nested RT-PCR
20*/15**
20
100*/100**
One-Step RT-PCR (Qiagen)
20*/15**
15
75*/100**
One-Step RT-PCR "vlastní výroby"
20*/15**
16
80*/100**
Metody
* vzorky odebírané během celé vegetační doby peckovin (jaro, léto, podzim 2010) ** vzorky odebírané pouze v doporučeném termín pro detekci ApLV (červenec, srpen, září 2010)
68
Kapitola 5: Výsledky
5.3. Molekulární charakteristika ApLV 5.3.1. Analýza dsRNA Po elektroforetické separaci dsRNA izolované z infikovaných listů byl na výsledném elektroforeogramu patrný jeden vysokomolekulární fragment. Jeho velikost byla na základě porovnání s DNA hmotnostním standardem GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas) a dsRNA molekulami Tobacco mosaic virus (6 395 nt) a Plum pox virus (9 741 nt) odhadnuta přibližně na 9 kb (obr. 29). Vzorky izolované z viruprostých listů byly na výsledném elektroforeogramu bez signálu. Pro potvrzení našich výsledků byly vysokomolekulární fragmenty z agarózového gelu za využití komerčního kitu purifikovány a použity jako templát pro metodu Two-Step RTPCR s využitím specifických primerů R-ALV/F-ALV komplementárně nasedajících na část genu kódujícího bílkovinový obal viru ApLV (312 bp). Na výsledném elektroforeogramu byly přítomny PCR produkty odpovídající predikované velikosti. Přítomnost ApLV a z toho vyplývající úspěšná izolace replikativní formy patogena byla tedy tímto testem potvrzena (obr. 30).
Obrázek 30. Detekce ApLV z dsRNA metodou Twostep RT-PCR. Použité primery R-ALV/F-ALV, velikost Obrázek 29. Elektroforeogram dsRNA po separaci na
PCR produktu 311 bp. M: hmotnostní standard Mass ruler
agarózové
standard
low range (Fermentas); H: ddH2O; N: vzorek z listů
GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); TMV:
viruprosté broskvoně; 1-6: dsRNA izolovaná z listů
Tobacco mosaic virus, PPV: Plum pox virus; ApLV:
broskvoně pozitivní na přítomnost ApLV; Po: pozitivní
Apricot latent virus.
kontrola.
elektroforéze.
M:
hmotnostní
69
Kapitola 5: Výsledky
5.3.1. Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV V rámci naší studie byly analyzovány tři izoláty ApLV, jmenovitě palestinský, moldavský a český. Fragmenty RT-PCR produktů získané izolací celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche), reverzní transkripcí (Transcriptor High Fidelity cDNA synthesis kit; Roche) a PCR za využití několika specifických či degenerovaných primerů byly následně buď přímo sekvenovány, nebo byly nejprve ligovány do bakteriálních plazmidových vektorů pSC-A (Agilent Technologies, USA) a následně zaslány na sekvenaci.
5.3.1.1. Molekulární charakteristika ApLV izolátů Palestinský izolát (Pal). V průběhu našich testů se podařilo amplifikovat celkem devět vzájemně se překrývajících fragmentů cDNA (obr. 31). Po sekvenaci a vzájemném spojení úseků jsme získali parciální část genomu ApLV o velikosti 4 572 nt, polyadenylový konec nepočítaje, ve kterém bylo identifikováno pět otevřených čtecích rámců. Celý zápis sekvencí nukleotidů je uveden na obr. 32 (kapitola Přílohy). 5´konec analyzovaného fragmentu byl identifikován jako ORF1 (1–2 178 nt), kódující C-koncová část genu virové replikázy RdRp (725 aa) s konzervativní doménou RNAdependentní RNA polymerázy „RdRp_2 Superfamily“ (300-711 aa). Další identifikované otevřené čtecí rámce, jmenovitě ORF2 (2 237-3 390 nt), ORF3 (2 910-3 269 nt) a ORF4 (3 178-3 390 nt) vytvářejí skupinů genů „triple gene block“ (TGB) kódující proteiny TGBp1 (223 aa), TGBp2 (119 aa) a TGBp3 (70 aa) o vypočítané molekulární hmotnosti 25 464 Da (25 kDa), 12 676 Da (13 kDa) a 7 532 DA (8 kDa). TGBp1 obsahuje konzervativní doménu UvrD helikázy „UvrD helicase Superfamily“ (24-222 aa) a TGBp2 konzervativní doménu movement proteinu „Plant_vir_prot super family“ (3-106 aa). Poslední identifikovaný otevřený čtecí rámec ORF5 (3 477-4 742 nt) kóduje gen virového obalového proteinu (421 aa) s vypočítanou molekulární hmotností 44 775 Da (45 kDA). Jeho součástí je konzervativní doména obalového proteinu „Flexi_CP super family“ (241-377 aa). 3´nekódující region (4743-4873 nt) je tvořen 130 nt. Organizace genomu je podrobně popsána v tab. 19.
70
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 31. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů. Schéma navrženo dle organizace genomu izolátu ApLV acc. no. NC_014821. Pal 1 - Pal 9: sekvenované cDNA fragmenty. RdRp: RNA-dependetní RNA polymeráza (pozice 1–2 178 nt); TGB1: triple gene block 1 (pozice 2 237-3 390 nt); TGB2: triple gene block 2 (pozice 2 910-3 269 nt) ; TGB 3: triple gene block 3 (pozice 3 178-3 390 nt); CP:coat protein (pozice 3 477-4 742 nt). Tabulka 19. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV. Molekulární hmotnost (kDa)
Pozice (nt)
Kódovaná bílkovina
ORF1*
1-2 178*
RdRp
2 175 nt*
725 aa*
x
ORF2
2 237-2 932
TGBp1
693 nt
223 aa
25,5
ORF3
2 910-3 269
TGBp2
356 nt
119 aa
12,7
ORF4
3 178-3 390
TGBp3
210 nt
70 aa
7,5
ORF5
3 477-4 742
cp
1 263 nt
421 aa
44,8
3´UTR
4 743-4 873
x
130 nt
x
x
* Pouze
Velikost
Konzervativní doména, pozice (aa) RdRp_2 Superfamily 300-711 UvrD helicase Superfamily 24-222 Plant_vir_prot super family 3-106 x Flexi_CP super family 241-377 x
část ORF1.
Moldavský izolát (Mol) a český izolát (Tom). V rámci analýzy moldavského izolátu se nám podařilo amplifikovat pět vzájemně se překrývajících cDNA fragmentů (obr. 33, kapitola Přílohy). Celková velikost úseku genomu po sekvenaci a vzájemném spojení parciálních částí činila
3 184 nt, poly (A) konec nepočítaje, s 5 identifikovanými otevřenými čtecími rámci.
Studie molekulární charakteristiky českého izolátu ApLV byla z důvodu nedostatečného množství biologického materiálu značně limitována. Koncentrace ApLV v rostlinách infekčních meruněk byla velmi nízká, což se samozřejmě odrazilo v konečné přípravě vzorků pro sekvenaci. Nakonec se nám podařilo amplifikovat pouze čtyři, částečně se překrývající
71
Kapitola 5: Výsledky kratší úseky DNA (obr. 34), po jejichž sekvenaci a vzájemném spojení jsme získali dva úseky genomu o velikosti 500 nt a 1 409 nt, poly (A) konec nepočítaje, obsahující tři otevřené čtecí rámce. Celý zápis sekvencí nukleotidů těchto dvou izolátů je uveden na obr. 35 a obr. 36 (kapitola Přílohy). Rozložení jejich parciálních genomů se shoduje s uspořádáním části genomu palestinského izolátu patogena. Veškeré údaje jsou uvedeny v tab. 20 a tab. 21.
Obrázek 33. Organizace parciálního genomu moldavského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů. Schéma navrženo dle organizace genomu izolátu ApLV, acc. no. NC_014821. Mol 1- Mol 5: osekvenované cDNA fragmenty. RdRp: RNA-dependetní RNA polymeráza (pozice 1- 2 178 nt); TGB1: triple gene block 1 (pozice 2 237 – 2 932 nt); TGB2: triple gene block 2 (pozice 2 910 – 3 269 nt); TGB3: triple gene block 3 (pozice 3 178 – 3 390 nt); CP: coat protein (pozice 3 477 – 4 742 nt).
Tabulka 20. Organizace parciálního genomu moldavského izolátu ApLV. Molekulární hmotnost (kDa)
Pozice (nt)
Kódovaná bílkovina
ORF1*
1-492
RdRp
489 nt
153 aa
x
ORF2
551-1 246
TGBp1
693 nt
223 aa
25,2
ORF3
1 224-1 583
TGBp2
356 nt
119 aa
12,8
ORF4
1 492-1 704
TGBp3
210 nt
70 aa
7,6
ORF5
1 792-3 057
cp
1 263 nt
421 aa
45
3´UTR
3 058-3 184
x
127 nt
x
x
Velikost
* Pouze část ORF4.
72
Konzervativní doména, pozice (aa) RdRp_2 Superfamily 1 - 139 UvrD helicase Superfamily 24-222 Plant_vir_prot super family 3-106 x Flexi_CP super family 241-377 x
Kapitola 5: Výsledky
Obrázek 34. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů. Schéma navrženo dle organizace genomu izolátu ApLV,acc. no. NC_014821. Tom1-Tom4: osekvenované DNA fragmenty. TGB2: triple gene block 2 (pozice 2 910 – 3 269 nt); TGB3: triple gene block 3 (pozice 3 178 – 3 390 nt); CP: coat protein (pozice 3 477 – 4 742 nt).
Tabulka 21. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV. Molekulární hmotnost (kDa)
Konzervativní doména, pozice (aa)
x
x
x
x
x
356 nt
119 aa
12,6
TGBp3*
x
x
11-1 276
cp
1 263 nt
421 aa
44,7
1 276-1 410
x
134 nt
x
x
x Plant_vir_prot super family 3-106 x Flexi_CP super family 241-377 x
Pozice (nt)
Kódovaná bílkovina
ORF1
x
x
x
ORF2
x
x
x
ORF3
64-423
TGBp2
ORF4*
332-500*
ORF5 3´UTR
Velikost
* Pouze část ORF4.
5.3.1.2. Procentuální sekvenční identita Nukleotidové a od nich odvozené aminokyselinové sekvence našich tří izolátů ApLV zahrnující čtyři celé otevřené čtecí rámce (vyjma českého izolátu Tom s dvěma celými a jedním parciálním ORF) byly na základě procentuální sekvenční identity mezi sebou a v rámci dalších publikovaných sekvencí izolátů ApLV a ASPV porovnány. Nejvyšší procentuální identita mezi nukleotidovými sekvencemi byla u izolátů Pal a Mol pozorována v rámci putativního proteinu TGBp1 (u českého izolátu tyto informace chybí) a na druhé straně nejnižší u genu kódující putativní bílkovinný obal virů. Výsledky
73
Kapitola 5: Výsledky byly potvrzeny i na úrovni odvozených sekvencí aminokyselin. Dle našich výsledků sdílí tento izolát nejvyšší podobnost s českým izolátem Tom, italským izolátem A18IT a španělským MurES, zatímco nejvyšší variabilita je pozorována v porovnání s italským izolátem Cas12IT (tab. 22).
Tabulka 22. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Pal s vybranými izoláty ApLV a ASPV.
Virus
Název izolátu
ORF2 (TGBp1)
ORF3 (TGBp2)
ORF4 (TGBp3)
ORF5 (cp)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
84
93
82
90
88
87
76
82
ApLV
Mol
ApLV
Tom
na
na
91
92
95
95
86
87
ApLV
A18IT
90
93
91
94
96
97
86
90
ApLV
Cas12IT
79
89
78
83
85
83
70
73
ApLV
LA2FR
84
92
81
90
85
80
75
81
ApLV
SB1245FR
79
91
80
87
86
80
71
73
ApLV
MurES
na
na
na
na
na
na
87
90
ApLV
NemMD
na
na
na
na
na
na
76
82
ASPV
ASPV
76
91
76
87
80
79
65
59
Acc. nos.: A18IT (NC 014821); Cas12IT (HQ339959); LA2FR (HQ339958); SB12452FR (HQ339957); MurES (GQ919051); NemMD (AF057035); ASPV (NC 003462). na: sekvenční zápis není dostupný.
Identity sekvencí jednotlivých putativních proteinů izolátů Mol a Tom jsou uvedeny v tab. 23 a v tab. 24. Dle našich výsledků sdílí izolát Mol nejvyšší podobnost s francouzským izolátem LA2FR a moldavským izolátem NemMD, zatímco nejvyšší variabilita je pozorována v porovnání s italským izolátem Cas12IT. U izolátu Tom je patrná nejvyšší podobnost s italským izolátem A18IT a španělským izolátem MurES, zatímco nejvyšší variabilita je pozorována v porovnání s italským izolátem Cas12IT a francouzským izolátem SB12452.
74
Kapitola 5: Výsledky Tabulka 23. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Mol s vybranými izoláty ApLV a ASPV. Virus
Název izolátu
ORF2 (TGBp1)
ORF3 (TGBp2)
ORF4 (TGBp3)
ORF5 (cp)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
ApLV
Pal
84
93
82
90
88
87
76
82
ApLV
Tom
na
na
80
92
88
82
77
81
ApLV
A18IT
83
96
80
93
89
86
76
82
ApLV
Cas12IT
78
94
72
80
80
71
70
75
ApLV
LA2FR
94
100
94
98
95
93
91
92
ApLV
SB12452FR
80
95
76
82
84
93
70
75
ApLV
MurES
na
na
na
na
na
na
77
81
ApLV
NemMD
na
na
na
na
na
na
99
98
ASPV
ASPV
79
94
77
84
80
73
65
59
Acc. nos.: A18IT (NC 014821); Cas12IT (HQ339959); LA2FR (HQ339958); SB12452FR (HQ339957); MurES (GQ919051); NemMD (AF057035); ASPV (NC 003462). na: sekvenční zápis není dostupný.
Tabulka 24. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Tom s vybranými izoláty ApLV a ASPV.
Virus
Název izolátu
ORF3 (TGBp2)
ORF4 (TGBp3) *
ORF5 (cp)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
nt (%)
aa (%)
ApLV
Pal
91
92
95
95
86
87
ApLV
Mol
80
92
88
82
77
81
ApLV
A18aIT
97
98
98
98
95
94
ApLV
Cas12IT
76
84
82
75
70
72
ApLV
LA2FR
80
92
84
77
76
82
ApLV
SB12452FR
78
86
82
77
71
73
ApLV
MurES
na
na
na
na
96
93
ApLV
NemMD
na
na
na
na
76
82
ASPV
ASPV
78
85
78
70
66
61
* Pouze parciální fragment ORF 4. Acc. nos.: A18IT (NC 014821); Cas12IT (HQ339959); LA2FR (HQ339958); SB12452FR (HQ339957); MurES (GQ919051); NemMD (AF057035); ASPV (NC 003462). na: sekvenční zápis není dostupný.
5.3.1.3. Fylogenetické analýzy Fylogenetické vztahy mezi izoláty ApLV získanými v průběhu naší studie a vybranými zástupci rodu Foveavirus jsou demonstrovány pomocí fylogenetických analýz založených na sekvencích aminokyselin kódujících putativní bílkoviny TGBp1, TGBp2, TGBp3 a CP.
75
Kapitola 5: Výsledky Fylogenetická analýza vybraných virových zástupců proteinu TGBp1 naznačuje, že izolát Pal je nejvíce příbuzný s italským izolátem A18IT a izolát Mol s francouzským izolátem LA2FR. Společně s ASPV vytvářejí jedno rameno fylogramu, zatímco izoláty CAS12IT a SB12452FR formují rameno druhé (obr. 37).
Obrázek 37. Fylogenetický strom založený na odvozených sekvencích aminokyselin ORF2 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus. Zkratky a acc. nos.: Apricot latent virus (Pal, XX), Apricot latent virus (Mol, XX), Apricot latent virus (A18IT, NC 014821), Apricot latent virus (Cas12IT, HQ339959), Apricot latent virus (LA2FR, HQ339958), Apricot latent virus (SB12452FR, HQ339957), Apple stem pitting virus (ASPV,NC 003462), Grapevine rupestris stem pitting accociated virus (GRSPaV, FR691076), Peach chlorotic mottle virus (PCMoV, NC 009892). GRSPaV a PCMoV jsou použity jako outgroop.
76
Kapitola 5: Výsledky V rámci fylogenetické analýzy proteinu TGBp2 byl do studie zařazen i český izolát Tom. Výsledky naznačují, že tento český izolát je nejvíce příbuzný s izolátem A18IT a izolát Mol, stejně jako v předešlém případě, s izolátem LA2FR. Společně spolu s Pal a ASPV vytvářejí jedno rameno stromu, zatímco izoláty CAS12IT a SB12452FR formují rameno druhé. Topografický vztah je silně podpořen vysokými hodnotami bootstrap (obr. 38).
Obrázek 38. Fylogenetický strom založený na odvozených sekvencích aminokyselin ORF3 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus. Zkratky a acc. nos.: Apricot latent virus (Pal), Apricot latent virus (Mol), Apricot latent virus (Tom), Apricot latent virus (A18IT, NC 014821), Apricot latent virus (Cas12IT, HQ339959), Apricot latent virus (LA2FR, HQ339958), Apricot latent virus (SB12452FR, HQ339957), Apple stem pitting virus (ASPV,NC 003462), Grapevine rupestris stem pitting accociated virus (GRSPaV, FR691076), Peach chlorotic mottle virus (PCMoV, NC 009892). GRSPaV a PCMoV jsou použity jako outgroop.
77
Kapitola 5: Výsledky Fylogenetická analýza vybraných zástupců rodu Foveavirus proteinu TGBp3 nasvědčuje tomu, že izolát Tom opět vykazuje nejvyšší příbuznost s izolátem A18IT a Pal. Moldavský izolát vytváří jedno rameno s izoláty LA2FR a SB12452FR a společně se všechny zmíněnými izoláty se shlukuje do jednoho ramena, zatímco ApLV izolát CAS12IT a ASPV formují rameno druhé. Topografický vztah je i v tomto případě silně podpořen vysokými hodnotami bootstrap (obr. 39).
Obrázek 39. Fylogenetický strom založený na odvozených sekvencích aminokyselin ORF4 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus. Zkratky a acc. nos.: Apricot latent virus (Pal), Apricot latent virus (Mol), Apricot latent virus (Tom), Apricot latent virus (A18IT, NC 014821), Apricot latent virus (Cas12IT, HQ339959), Apricot latent virus (LA2FR, HQ339958), Apricot latent virus (SB12452FR, HQ339957), Apple stem pitting virus (ASPV,NC 003462), Grapevine rupestris stem pitting accociated virus (GRSPaV, FR691076), Peach chlorotic mottle virus (PCMoV, NC 009892). GRSPaV a PCMoV jsou použity jako outgroop.
78
Kapitola 5: Výsledky V rámci fylogenetické analýzy CP byly do studie zařazeny i sekvence španělského izolátu MurES a moldavského izolátu NemMD. Výsledky testu naznačují, že český izolát Tom je nejvíce příbuzný s izoláty A18IT, MurES a Pal, moldavský izolát se shlukuje s izoláty NemMD a LA2FR a společně s izoláty CAS12IT a SB12452FR formují jedno rameno, zatímco ASPV formuje rameno druhé. Topografický vztah je opět silně podpořen vysokými hodnotami bootstrap (obr. 40).
Obrázek 40. Fylogenetický strom založený na odvozených sekvencích aminokyselin ORF5 izolátů latentního viru meruňky a ostatních zástupců rodu Foveavirus. Zkratky a acc. nos.: Apricot latent virus (Pal, XX), Apricot latent virus (Mol, XX), Apricot latent virus (Tom, XX), Apricot latent virus (A18IT, NC 014821), Apricot latent virus (Cas12IT, HQ339959), Apricot latent virus (LA2FR, HQ339958), Apricot latent virus (SB12452FR, HQ339957), Apricot latent virus (NemMD, AF057035), Apricot latent virus (MurES, GQ919051), Apple stem pitting virus (ASPV, NC 003462), Grapevine rupestris stem pitting-accociated virus (GRSPaV, FR691076), Peach chlorotic mottle virus (PCMoV, NC 009892). GRSPaV a PCMoV jsou použity jako outgroop.
5.4. Monitoring ApLV na území ČR V rámci monitoringu ApLV probíhajícího v letech 2005 a 2006 na území České republiky v produkčních sadech bylo odebráno a následně testováno celkem 260 vzorků meruněk. Ani v jednom případě se však nepodařilo přirozený výskyt tohoto patogena na našem území prokázat. 79
Kapitola 5: Výsledky Jako pozitivní rostlina na přítomnost ApLV byla z 358 testovaných kultivarů meruněk genofondu Zahradnické fakulty (MZLU) v Lednici identifikována odrůda Tomis. ApLV byl ze vzorků listů této původem rumunské odrůdy detekován v roce 2009, v následujícím roce jsme odběr opakovali a přítomnost patogena byla na základě RT-PCR analýz potvrzena. Letorosty odrůdy Tomis byly v srpnu v roce 2010 odebrány, převezeny na naše pracoviště a použity pro přenos tohoto nového izolátu ApLV na semenáče meruněk a broskvoní GF 305. Zda byla inokulace úspěšná a naše sbírka ApLV bude rozšířena o nový exemplář, bude potvrzeno v nastávajícím roce (2011).
80
Kapitola 6: Diskuze
Kapitola 6
Diskuze 6.1. Biologická charakteristika ApLV 6.1.1. Hostitelský okruh Každý rostlinný virus je charakterizován určitým okruhem hostitelů, které může za určitých přirozených či experimentálních podmínek infikovat (Astier et al., 2007). Přirozený hostitelský okruh ApLV i dalších virových zástupců rodu Foveavirus, jmenovitě ASPV a GRSPaV, byl charakterizován jako velmi striktně omezený (Adams et al., 2004). Jediným přirozeným hostitel ApLV byl do dnešní doby identifikován pouze druh P. armeniaca (Myrta et al., 2003). Experimentální pokusy založené na přenosu ApLV na dřevinné hostitele pomocí oček v předešlých studiích prokázaly, že je virus schopný infikovat i celou řadu dalších rostlinných zástupců z rodu Prunus L., jmenovitě kultivary rostlin broskvoní, dále odrůdy třešní, meruněk, myrobalánu a třešně sakury (Zemtchik et al., 1998, Grasseau et al., 1999, Nemchinov et al., 2000; Gentit et al., 2001b; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005). Na základě našich výsledků byl doposud známý hostitelský okruh částečně ApLV potvrzen. Semenáče broskvoní GF 305 byly předkládanou studií vyhodnoceny jako nejvhodnější hostitelé tohoto patogena. Výsledná 22% neúspěšnost přenosu ApLV na tyto rostliny byla ve většině případů způsobena spíše než inkompatibilitou viru k rostlině neuchycením oček na stromové podnože. Dalším z možných důvodů mohla být zcela určitě nepřítomnost či nedostatečná koncentrace viru v samotném očku letorostů, což je u dřevinných hostitelů, u nichž je distribuce viru v rostlinném pletivu často vysoce nehomogenní, velmi běžné (Agrios, 2005). Naší studií byl okruh hostitelů ApLV dále rozšířen o nové kultivary broskvoní (Spring Gold, Baracca, Baby Gold 7, Baby Gold 9, Baby Gold 6, Anderson, Vivian-ppc-199, Armking, Nectared, O´Henry), kultivary třešní (Fucilletta Primizia, Adriana, Roma, Napolitana, Lapins, Moreau), odrůdy meruněk (Harcot, Bulida, Oranged) a vůbec poprvé o kultivary japonských a evropských švestek (Autumn Giant, Ozark Premium, Regina, St.
81
Kapitola 6: Diskuze
Angeleno, Blue Free, Sangue di Drago, Friar, Burbank, Black Star, Stanley a President). Všechny výše zmiňované rostlinné druhy a jejich kultivary patří do botanického rodu Prunus L.. Zemtchick et al. (1998) se pokoušeli přenést patogena na indikátorové stromy jabloní, ale bezvýsledně. Zda je ApLV schopný infikovat i jiné rody čeledi Rosaceae či jsou zástupci rodu Prunus L. opravdu jedinými vhodnými kandidáty pro přenos tohoto patogena zůstává otázkou a možným předmětem dalších studií. Okruh bylinných hostitelů ApLV byl v předchozích publikacích definován jako striktně omezený. Jedinými bylinnými zástupci vhodnými pro přenos a následnou propagaci ApLV v rostlinném materiálu byly na základě předešlých pokusů vyhodnoceny N. occidentalis ssp. obligua a N. occidentalis 37B (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001b; Abou GhanemSabanadzovic et al., 2005). Jak je dobře známo, úspěšnost mechanického přenosu závisí nejen na samotném charakteru rostlinného viru (jeho stabilitě, koncentraci, přítomnosti jiných inhibičních látek v inokulu), ale i velkou měrou na hostitelské rostlině (Djirk & Jager, 1998). V průběhu zpracování této disertační práce bylo proto testováno celkově 300 indikátorových rostlin zařazených do 28 botanických druhů včetně N. occidentalis, který jakožto jediný potvrzený bylinný hostitel ApLV měl sloužit jako pozitivní kontrola prováděného pokusu. Ačkoliv byl během testování kladen opravdu velký důraz na mnoho důležitých aspektů ovlivňujících úspěšnost přenosu patogena, k mechanickému přenosu nedošlo ani u jednoho z testovaných druhů, N. occidentalis nevyjímaje. Extrémně úzký hostitelský okruh bylinných indikátorů byl popsán i u typového zástupce rodu Foveavirus ASPV a u GRSPaV byl mechanický přenos úplně vyloučen (Adams et al., 2004). Zda se u ApLV opravdu jedná o tak vyhraněného patogena, nebo samotné inokulační či kultivační podmínky nebyly pro přenos viru vyhovující, zůstává otázkou. Jednou z dalších možností přenosu virových patogenů na bylinné hostitelské rostliny může být využití alternativních způsobů inokulace, jako jsou např. agroinfekce pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens (Leiser et al., 1992; Liu & Lomonossoff, 2002) nebo přenos virového agens na hostitele pomocí biolistické inokulace (Fakhfakh et al., 1996; Briddon et al., 1998; Khan & Dijkstra, 2006), jejichž využití může v budoucnu představovat případné řešení tohoto problému. Absence bylinných indikátorových rostlin představuje obecně pro virologickou praxi řadu nevýhod, zvláště když jsou primárními hostiteli právě rostliny peckovin. Přítomnost inhibitorů a nerovnoměrná, a častokrát nízká koncentrace virů v rostlinných vzorcích vytrvalých plodin můžou velkým podílem omezovat jejich bezproblémovou diagnostiku
82
Kapitola 6: Diskuze
(Hopkins, 1989; Daire et al., 1992; Minafra et al., 1992; Rowhani et al., 1995; Hendson et al., 2001). Avšak při výběru vhodných strategií při zpracování rostlinného materiálu je možné případné problémy alespoň částečně obejít.
6.1.2. Studium symptomů ApLV Na základě našich výsledků byly všechny testované semenáče a kultivary broskvoní vyhodnoceny jako symptomatické. Příznaky spojované s virovou infekcí měly podobu žlutých nepravidelných asteroidních skvrn po celé čepeli listů, což zcela koresponduje se symptomy popsanými v předešlých publikacích (Zemtchik et al., 1998, Grasseau et al., 1999, Nemchinov et al., 2000; Gentit et al., 2001b; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005; Jarrar, 2005). Příznaky se na rostlinách začaly plně projevovat zhruba jeden rok po provedené inokulaci, tedy o 6 měsíců později, než je uvedeno v předchozích publikacích (Zemtchik et al., 1998; Gentit et al., 2001b). Tento rozdíl může být zcela oprávněně připisován rozdílným klimatickým podmínkám ve skleníkových prostorách či přímo na venkovních stanovištích katedry ochrany rostlin na území České republiky. Infekce ApLV na rostlinách meruňky byla popsána téměř vždy jako bezpříznaková (Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005), vyjma kultivarů Tirynthos a Haward, na kterých byly dle Jarrar et al. (2006) opakovaně pozorovány symptomy v podobě chlorotické difuzní skvrnitosti, zakrslosti či malformace listů. V průběhu našich pokusů byla odrůda Tirynthos vyhodnoceny také jako příznaková. Symptomy měly charakter žluté difúzní skvrnitosti, zakrslost ani deformace listů však nebyla v průběhu tříletého pozorování sledována. Odrůda Haward byla naproti tomu na základě našich výsledků vyhodnocena jako zcela bezpříznaková. U rostlinných virů je poměrně časté, že infikované rostliny v časném období po inokulaci vykazují silné příznaky, které mohou v určitých případech vést až k úhynu letorostů či celého stromu. Nicméně pokud hostitel tento počáteční šok přežije, infekce se postupně zmírňuje až do úplného vymizení symptomů (Agrios, 2005). Je tedy otázkou, zda se na výše zmiňovaných kultivarech Tirynthos a Haward opravdu jednalo o symptomatické projevy ApLV, nebo byly popsané příznaky vyvolány jinými, ať už biotickými či abiotickými faktory. U rostlin třešní nebyly v průběhu našich testů zaznamenány žádné projevy virózy. Gentit et al. (2001b) došli při svém experimentu ke stejným výsledkům. Abou GhanemSabanadzovic et al. (2005) popsali příznaky spojované s přítomností ApLV na odrůdách Bing, Candidex a Sam ve formě červených až purpurových kroužků a skvrn. Jediným 83
Kapitola 6: Diskuze podstatným rozdílem mezi uvedenými pokusy byl způsob kultivace testovaných rostlin. V obou případech, kdy rostliny nevykazovaly příznaky, byl pokus založen ve venkovních podmínkách, zatímco Abou Ghanem-Sabanadzovic et al. (2005) prováděli pokus ve skleníku. Zda může být příčinou odlišného biologického projevu viru na rostlinách variabilita jednotlivých izolátů ApLV, odlišné podmínky při pěstování či chybné vyhodnocení pokusu zůstává předmětem dalších studií. Rostliny evropských a japonských švestek byly vyhodnoceny na základě našich výsledků jako bezpříznakové. Jelikož se jedná o vůbec první informaci o možnosti přenosu ApLV na tyto hostitelské rostliny, neexistují v současné době žádné informace týkající se této problematiky. Ačkoliv byla v rámci našich testů založených na sérologických a molekulárně genetických technikách vyloučena směsná infekce ApLV s nejběžněji se vyskytujícími viry peckovin, tvorba příznaků mohla být samozřejmě důsledkem přítomnosti dalších, do našich testů nezařazených virových patogenů. Není ani možné opominout, že řada symptomů vyvolaných rostlinnými viry je velmi podobná těm, které jsou způsobené např. genovými mutacemi, nedostatkem živin, toxickými látkami, poškozeními vzniklými sáním hmyzu či roztočů nebo jinými patogeny (Agrios, 2005). Nicméně, všechny výše uvedené příčiny tvorby nespecifických příznaků byly v rámci našeho experimentu velkou měrou eliminovány souběžnou kultivací nenaočkovaných, tedy ApLV-prostých testovaných kultivarů rostlin stejného stáří. Nepřítomnost jakýchkoliv fyziologických odchylek na těchto negativních kontrolách pokusu naše hypotézy významně potvrdila.
6.2. Diagnostické metody pro detekci ApLV V současné době je v
rostlinolékařské virologii k dispozici několik desítek
diagnostických technik a u každé z nich lze sledovat určité výhody, i nevýhody z hlediska jejich využitelnosti v praxi (Webster et al., 2004). Pozorování příznaků na rostlinách, zvážení okolností za jakých vznikly a sledování postupného vývoje infekce představují první krok v samotné diagnostice rostlinných virů (Astier et al., 2007). Na základě pokusů založených na biologické charakteristice ApLV bylo prokázáno, že je virus schopný po umělé inokulaci infikovat široký okruh hostitelů z rodu Prunus L., avšak z našich testů zcela jasně vyplývá, že pouze u rostlin broskvoní a u jediné odrůdy meruňky patogen vyvolává viditelné příznaky.
84
Kapitola 6: Diskuze Diagnostika založená na sledování virových symptomů tedy rozhodně není v případě ApLV dostačující. Další ve virologické praxi často využívanou diagnostickou metodou je detekce patogena založená na jeho přenosu na dřevinné či bylinné indikátorové rostliny (Astier et al., 2007). Nejcitlivějšími dřevinnými hostiteli ApLV byly dle našich a v předchozích letech publikovaných výsledků (Zemtchik et al., 1998, Grasseau et al., 1999, Nemchinov et al., 2000; Gentit et al., 2001b) identifikovány semenáče broskvoní GF 305. Vývoj symptomů spojovaných s ApLV infekcí v klimatických podmínkách České republiky je však dle našich poznatků při kultivaci stromků ve venkovních prostorách velmi zdlouhavý. Ke vzniku symptomů dochází přibližně jeden rok po provedené inokulaci. Druhý výše uvedený způsob detekce patogena, tedy přenos ApLV na bylinné indikátorové rostliny, nebyl v rámci našich testů ani v jednom případě potvrzen. Obě techniky přenosu viru jsou navíc velmi pracovně náročné a často nespolehlivé (Stouffer & Fridund, 1989). Neopomenutelnou nevýhodou metod je jistě i ztížená interpretace výsledků v případě přítomnosti směsné infekce více viry najednou (Astier et al., 2007). Z výše uvedených důvodů proto není ani jeden z předložených způsobů přenosu viru na hostitelské rostliny pro spolehlivou diagnostiku ApLV prakticky využitelný. V současné době jsou v rostlinolékařské diagnostice nejčastěji využívané techniky založené na sérologických a molekulárně genetických vlastnostech rostlinných virů (López et al., 2003). Jelikož veškeré snahy purifikovat ApLV za účelem získání protilátek byly v předchozích studiích neúspěšné (Zemtchik et al., 1998; Abbadi et al., 2003; Jarrar, 2007), představují analýzy v podobě RT-PCR a molekulární hybridizace jednu z mála možných alternativ pro spolehlivou detekci ApLV v rostlinném pletivu.
6.2.1. Detekce ApLV pomocí molekulárně genetických technik 6.2.1.1. Rostlinný materiál a izolace celkové RNA Výběr vhodného biologického materiálu a určení nejpříznivější doby pro jeho odběr je pro spolehlivou detekci patogena v rostlinném pletivu neodmyslitelným počátečním krokem. V naší studii byly jako nejvhodnější experimentální materiál vyhodnoceny listy peckovin, ty jediné totiž představovaly u všech analyzovaných druhů spolehlivý zdroj pozitivního materiálu. Při správném způsobu odběru listů, tedy z několika míst po obvodu a z jednoho místa středu koruny stromů, představují listy i dostatečně reprezentativní vzorek pro detekci
85
Kapitola 6: Diskuze rostlinných virů, jejichž distribuce v hostitelích je, jak známo, velmi nerovnoměrná (Agrios, 2005). Pro detekci ApLV byly listy peckovin využívány i ve všech předchozích studií (Zemtchik et al., 1998; Grasseau et al., 1999; Nemchinov et al., 2000; Gentit et al., 2001a,b; Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2005). Vhodná doba odběru rostlinného materiálu, během níž je na základě našich experimentů koncentrace viru v rostlinách pro spolehlivou detekci ApLV dostačující, byla stanovena na měsíce červenec, srpen a září. Nemožnost monitoringu patogena v období vegetačního klidu, či na samém počátku či konci vegetace je sice částečně omezující, ale pro výzkumné účely může být tento problém lehce řešitelný celoroční kultivací indikátorových rostlin v zateplených skleníkových prostorách. Pracná a časově náročná homogenizace listových pletiv ve třecích miskách za přítomnosti tekutého dusíku může být dle našich výsledků bezproblémově nahrazena alternativními metodami drcení za využití ručního homogenizátoru (Bioreba) nebo oscilačního mlýnu Retsch MM. S ohledem na pracovní a časovou nenáročnost se z těchto dvou technik lépe osvědčila druhá zmiňovaná homogenizační technika, neboť při jejím využití odpadá počáteční krok převádění biologického materiálu z drtícího sáčku do mikrozkumavky, který může mít za následek nežádoucí ztrátu objemu testovaného vzorku a na druhé straně zvýšení pravděpodobnosti možné kontaminace. Využití těchto alternativních způsobů homogenizace rostlinného materiálu bylo popsáno i celou řadou dalších autorů (Nassuth et al., 2000; Li & Mock, 2005) a je velmi pravděpodobné, že se v budoucnu stanou v rostlinolékařské diagnostice neodmyslitelnou pomůckou. Úspěšnost detekce rostlinných patogenů nezávisí pouze na samotných laboratorních technikách v podobě RT-PCR či molekulární hybridizaci, ale velkou měrou i na efektivitě metod extrakce nukleových kyselin z rostlinného pletiva (López et al., 2003). Zvolení správné a spolehlivé izolační metody je v rostlinolékařské diagnostice nezbytné, zvláště při práci s dřevinnými rostlinami, jako jsou právě ovocné stromy (Korschineck et al., 1991). Nízká koncentrace virů v rostlinných vzorcích vytrvalých plodin často velkým podílem omezuje jejich bezproblémovou diagnostiku (Hopkins, 1989;; Daire et al., 1992; Minafra et al., 1992; Rowhani et al., 1995; Hendson et al., 2001), dřevinný materiál navíc obsahuje vysokou koncentraci fenolických sloučenin a polysacharidů, které jsou častými inhibitory navazujících technik (Newbury & Possingham, 1977; Rezaian & Krake, 1987; Demeke &Adams, 1992). V rámci předložené práce byly optimalizovany čtyři metody extrakce ribonukleové kyseliny z rostlinných pletiv, jmenovitě izolace celkové RNA pomocí „silika“ dle Rott & Jelkmann (2001), fenol-chloroformovou izolace dle Sambrook & Russel (2001), izolace pomocí RNeasy
86
Kapitola 6: Diskuze Plant Mini Kit (Qiagen) a izolace pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche) využívající pro purifikaci RNA sloučenin fenolu, chloroformu, guadinin thiokyanátu, 2-merkaptoetanolu a trizolu. Jako jediná ne zcela spolehlivá extrakce nukleových kyselin byla označena fenolchloroformová izolace, jelikož neodpovídala námi navrženým kritériím a z tohoto důvodu proto byla na základě našich výsledků z doporučených technik vyřazena. Jako nejefektivnější byla označena izolační metoda využívající sloučeninu trizol, tedy izolace celkové RNA pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche). Tato technika je ve virologické praxi hojně využívaná (Bertolini et al., 2001; Itaya et al., 2001; Cui et al., 2004, Eastwell et al., 2010) a ačkoliv je pořizovací cena poměrně vysoká, její nezanedbatelné přednosti mohou efektivně napomoci k dosažení kvalitních výsledků.
6.2.1.2. Detekční metody založené na RT-PCR Metoda RT-PCR charakterizovaná extrémně vysokou citlivostí a na druhé straně ne příliš velkou finanční a pracovní náročností je v současné době jednou z nejčastěji využívaných detekčních technik aplikovaných v rostlinné virologii. Do dnešní doby bylo vyvinuto a popsáno velké množství jejích variant (Webster et al., 2004). V rámci naší studie jsme optimalizovali a na základě několika zvolených kritérií mezi sebou porovnali celkem dvanáct způsobů enzymatické amplifikace cDNA ApLV. První z námi testovaných analýz byla klasická metoda RT-PCR provedená ve dvou oddělených krocích, kdy v první fázi dochází k přepsání celkové RNA na cDNA a ve druhé fázi k amplifikaci specifického úseku genomu patogena. Tato technika byla na základě testů zaměřených na specifitu, citlivost a spolehlivost reakcí vyhodnocena jako velmi dobrá. Nicméně při zavádění metod určených pro rutinní diagnostiku v praxi uživateli neposkytuje úplnou jistotu o jejím bezproblémovém průběhu. Vysoce spolehlivá detekční metoda by měla účinně rozpoznat přítomnost daného cílového organismu bez přítomnosti falešně pozitivních či negativních výsledků (López et al., 2003), což výše zmiňovaná metoda zcela potvrdit nedokáže. Jedním z možných a velmi často využívaných řešení tohoto problému je začlenění negativní a pozitivní kontroly do samotných PCR reakcí, tím může být spolehlivost reakce částečně monitorována, avšak ne se stoprocentní jistotou. Vznik falešně pozitivních výsledků je nejčastěji způsobený tzv. přenášenou kontaminací, kdy se do reakce dostanou PCR produkty z předchozích reakcí. Díky nadměrnému množství DNA vzniklého během jedné reakce a jednoduchosti, se kterou se daný produkt znovu reamplifikuje, se může tento typ kontaminace stát pro diagnostickou 87
Kapitola 6: Diskuze laboratoř závažným problém (Kwok & Higuchi, 1989; Gibbs & Chamberlain, 1989). V praxi je často využívána dekontaminační technika založená na enzymatické kontrole PCR reakce pomocí Uracil-DNA glykosilázy (UDG) (Hartley & Rashtchian, 1993). V rámci naší studie se nám podařilo metodu Two-Step RT-PCR využívající UDG optimalizovat, avšak na základě našich dodatečných testů nebyla v porovnání s klasickou metodou Two-step RT-PCR dostatečně citlivá a spolehlivá. Longo et al. (1990) připisují nízkou efektivitu reakcí přítomností deoxyuridin trifosfátů (dUTP), které při syntéze nového řetězce nahrazují trifosfáty deoxytyminu. Na základě jejich výsledků byla výkonnost reakce spíše než délkou amplifikovaného produktu negativně ovlivňována konkrétním nukleotidovým zápisem cílového fragmentu. Z tohoto důvodu jsme při vývoji samotné metodiky využívali několik párů primerů navržených na odlišné regiony genomu ApLV, ale bezvýsledně. Wang & Mosbaugh (1988) doporučili využívat v rámci reakce vyšší koncentrace sloučenin dUTP a MgCl2, avšak ani tento optimalizační krok bohužel nepřispěl k uspokojivějším výsledkům. Další častou příčinou nesprávného vyhodnocení testů může být přítomnost falešně negativních výsledků, kdy je pozitivní vzorek rostliny na základě nesprávně provedené reakce vyhodnocen jako negativní. Jednou z hlavních příčin jejich vzniku je samotná nespolehlivost lidského faktoru. Efektivním nástrojem pro zajištění spolehlivosti analýz může být RT-PCR s koamplifikací tzv. interní kontroly v podobě rostlinné RNA. V minulých letech byla publikována celá řada typů interních kontrol (např. Bariana et al., 1995; Pastrik, 2000), ale žádná z nich nerozlišovala mezi templátovými molekulami RNA a DNA (Nassuth et al., 2000). Možným řešením tohoto problému je využití takového setu primerů, kdy je jeden z dvojice oligonukleotidů navržen takovým způsobem, že přemosťuje intron mediátorové RNA (mRNA), díky čemuž je jeho nasednutí a následná amplifikace PCR fragmentu možné pouze za přítomnosti post-transkripčně upravené mRNA (Innis & Gelfand, 1990; Kwok et al., 1990). Při aplikaci takto navržených primerů není denaturace zbytkové DNA nutná, čímž se celý proces detekce patogena znatelně usnadní. V předkládané práci byla optimalizována metoda využívající právě výše uvedenou techniku s koamplifikací úseku genu nad5 kódujícího enzym NADH dehydrogenázu (Menzel et al., 2002). Na základě našich optimalizačních testů bylo patrné, že důležitým předpokladem správného průběhu PCR reakce je využívání DNA polymeráz s Hot-Start aktivitou, které jako jedny z mála enzymů dokáží zajistit bezproblémový průběh analýz s vysokou reakční specifitou. Tato technika byla na základě testů zaměřených na specifitu, citlivost a spolehlivost reakcí vyhodnocena jako velmi dobrá.
88
Kapitola 6: Diskuze V rámci naší studie se nám v návaznosti s předchozími testy podařilo optimalizovat další metodu Two-Step RT-PCR využívající simultánně obě výše popsané techniky, tedy metodu Two-step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA a s využitím UDG v jedné reakci. Metoda si však samozřejmě v sobě nesla i nevýhody spojené s využíváním UDG technologie. Detekční limit byl v porovnání s ostatními reakcemi nejnižší a její spolehlivost nebyla dostačující. Dalšími z vybraných detekčních metod byly techniky Co-RT-PCR a Nested RT-PCR. Co-RT-PCR je v literatuře charakterizována vysokou citlivostí a časovou, finanční a pracovní nenáročností (Olmos et al., 2002, Caruso et al., 2003; Bertolini et al., 2007). Na základě testů zaměřených na detekci několika rostlinných virů (Cherry leaf roll virus, Strawberry latent ringspot virus, Cucumber mosaic virus, Plum pox virus a Citrus tristeza virus) byla senzitivita této reakce vyhodnocena autory Olmos et al. (2002) jako stokrát vyšší než u klasické metody RT-PCR a srovnatelná s citlivostí Nested RT-PCR. Námi optimalizovaná reakce Co-RT-PCR však takto vysokou senzitivitu nevykazovala, její detekční limit byl o proti klasické metodě Two-step RT-PCR nižší a citlivost Nested RT-PCR ji daleko přesahovala. Jelikož však spolehlivost metody byla vyhodnocena jako stoprocentní a samotná příprava reakční směsi je oproti již zmiňované nested RT-PCR znatelně jednodušší, není důvod, proč by nemohla být využívaná pro diagnostiku ApLV v praxi. Metoda Nested RT-PCR je díky své velmi vysoké citlivosti často využívána při diagnostice takových virů, jejichž koncentrace v rostlinných vzorcích je velmi nízká. V předchozích letech v sobě nesla tato technika podstatnou nevýhodu v podobě nutnosti provádět jednotlivé kroky dvoufázové PCR v odlišných mikrozkumavkách, což mělo za následek časté nežádoucí kontaminace testovaných vzorků (Roberts, 1996). Nicméně v průběhu několika let se podařilo navrhnout a do praxe aplikovat několik jejích alternativ, které tento problém částečně či zcela vyřešily (Yourno, 1992; Robberts, 1996; Osiowy, 1998; Llop et al., 1999; Olmos et al., 2002; Bertolini et al., 2003; Olmos et al., 2003). Metoda Nested PCR využívaná v naší studii představuje jednu z mnoha možných variant řešení. Reakce probíhá pouze v jedné mikrozkumavce, v níž jsou přítomny dvě reakční směsi se dvěma odlišnými páry primerů, jež jsou mezi sebou oddělené vrstvou minerálního oleje. Po proběhnutí první části PCR je mikrozkumavka s reakční směsí stočena, čímž dojde ke smísení obou premixů a následně je podrobena druhé fázi PCR. Nested RT-PCR byla na základě našich výsledků vyhodnocena jako nejcitlivější metoda, což samozřejmě korespondovalo i s její stoprocentní spolehlivostí při detekci patogena. Technika umožnila detekci ApLV i v
89
Kapitola 6: Diskuze rostlinných vzorcích odebraných v měsících, kdy je koncentrace viru v rostlinách znatelně snížená. Nevýhodou metody je jistě pracnější způsob provedení samotné reakce. Z tohoto důvodů by mohl být tento způsob ApLV detekce využíván pouze u rostlinných vzorků, u kterých se předpokládá nižší koncentrace patogena v rostlinném pletivu, jako např. právě při detekci ApLV na počátku či na konci vegetačního období či při práci s dlouhodobě skladovaným rostlinným materiálem. Dalšími z optimalizovaných diagnostických metod této studie byly techniky založené na metodě One-Step RT-PCR. Tato technika využívající spojení dvou základních kroků klasické Two-step RT-PCR analýzy, tedy reverzní transkripce a PCR do jedné reakce je v aplikované rostlinné virologii velmi často využívaná (Lopez et al., 2003). Její neopominutelnou výhodou je zjednodušení přípravy vzorků odrážející se na menší časové náročnosti. Jakákoliv manipulace s otevřenými mikrozkumavkami během detekčních analýz často zvyšuje pravděpodobnost kontaminace vzorků. Metoda One-step RT-PCR tedy i výrazně přispívá ke snížení rizika vzniku falešně pozitivních výsledků. V současné době je na trhu velmi široká nabídka komerčních kitů určených pro tyto analýzy (např. od firem Qiagen, Sigma-Aldrich, Ambion), nicméně jejich cena je často vysoká. V rámci naší studie se nám podařilo optimalizovat metodu One-step RT-PCR „vlastní výroby“, která je v porovnání s metodou využívající komerční kit QIAGEN® OneStep RT-PCR (Qiagen) srovnatelně citlivá, ale náklady na její provedení jsou podstatně nižší. Detekční limit obou dvou technik byl na základě naší studie oproti Nested RT-PCR až tisíckrát menší, avšak z výsledků testů spolehlivosti byly obě metody vyhodnoceny jako vhodné techniky pro detekce ApLV. Metoda One-Step RT-PCR je využívána i v detekčních technikách DB-RT-PCR (Rowhani et al., 1995), IC-RT-PCR, SC-RT-PCR a PC-RT-PCR bez využití specifických protilátek (Olmos et al., 1996). Principem analýz je schopnost virových partikulí se navázat na polystyrénový či polypropylénový povrch mikrozkumavek nebo na povrch membrán. Tyto nosiče se následně po několikanásobném promytí od rostlinných kontaminantů využijí jako zdroj templátové RNA pro samotnou RT-PCR analýzu. Jednou z velkých výhod těchto detekčních technik je jistě eliminace časově i pracovně náročné izolace celkové RNA, neboť výchozím materiálem reakcí je hrubý extrakt rostlin. V případě detekčních technik IC-RTPCR, SC-RT-PCR a PC-RT-PCR představuje využití levných nespecifických bílkovin, jako jsou např. BSA, odstředěné mléko či tripton, snížení nákladů na provedení reakce a možnost aplikace i u takových patogenů, u nichž nejsou, jako v případě ApLV, v současné době specifické protilátky komerčně dostupné (Olmos et al., 1996). DB-RT-PCR byla již
90
Kapitola 6: Diskuze v dřívějších publikacích vyhodnocena jako metoda s nižším detekčním limitem (Rowhani et al., 1995), na druhé straně IC-RT-PCR, SC-RT-PCR a PC-RT-PCR byly definovány jako velmi citlivé techniky využitelné v rutinní diagnostice virových patogenů (Olmos et al., 1996). Na základě našich výsledků však ani jedna z výše popsaných metod nesplňovala naše požadavky. Jedním ze zásadních nedostatků byla opakovaná přítomnost falešně pozitivních výsledků. Hlavní příčinou problémů byla jistě nemožnost zajištění zcela nezbytných sterilních pracovních podmínek, což vedlo ke kontaminaci viruprostých rostlinných vzorků. Na druhé straně, důsledkem velmi nízké citlivosti reakcí nedocházelo s určitou pravidelností k amplifikaci specifických fragmentů u pozitivních jedinců. Jedním z vysvětlení může být fakt, že při metodách SP-RT-PCR a PC-RT-PCR je využíváno relativně malého množství výchozího biologického materiálu, což může být v případě testování rostlin s nestejnoměrnou distribucí viru v pletivech důvodem selhání detekce. Možným problémem detekce patogena u metod DB-RT-PCR a IC-RT-PCR může být ne vždy zcela efektivní a reproduktivní navázání látek na povrch mikrozkumavek (Nassuth et al., 2000).
6.2.1.3. Detekční metody založené na dot-blot hybridizaci Ačkoliv jsou hybridizační metody využívající neradioaktivně značené sondy v rostlinolékařské praxi pro detekci virových patogenů velmi často využívány (Ivars et al., 2003; Harper & Creamer, 1995) a bezproblémově splňují všechna předem stanovená kritéria pro spolehlivou a dostatečně citlivou diagnostiku rostlinných virů, námi navržená metoda dotblot hybridizace naším požadavkům nevyhovovala. Hlavním problémem byla poměrně vysoká nespecifita reakce. Přestože byl během vývoje techniky kladen velký důraz na optimalizaci všech potřebných aspektů, byl slabý signál ve většině případů po obarvení membrány patrný i u vzorků získaných z viruprostých peckovin. Jedním z možných řešení tohoto problému je stanovení prahové hodnoty pozitivity dle intenzity signálu negativních vzorků. Výsledná evaluace pokusu je však vždy zatížena určitou chybou. Dalším řešením by mohlo být využití citlivějšího způsobu detekce patogena pomocí chemiluminiscence či pomocí autoradiografie, avšak tyto možnosti nejsou v současné době na našem pracovišti dostupné.
91
Kapitola 6: Diskuze
6.3. Molekulární charakteristika ApLV 6.3.1. dsRNA Dle elektroforetické analýzy dsRNA byla velikost genomu ApLV odhadnuta přibližně na 9 kb, což plně odpovídá velikostnímu rozpětí ostatních zástupců rodu Foveavirus, které bylo vymezeno intervalem od 8,4 do 9,3 kb (Martelli & Jelkmann, 1998) a zcela koresponduje s informacemi uvedenými v genové databance, dle kterých je velikost genomu jednotlivých izolátů ApLV v rozmezí od 9 295 do 9 311 nt, polyadenylový konec nepočítaje (Youssef et al., 2010). Metoda izolace replikativní formy ApLV dle protokolu Valverde (1990) se tedy na základě výsledků našich testů velmi osvědčila. Oproti požadavkům jiným izolačních technik na velké množství vstupního biologického materiálu a na dodatkové postizolační enzymatické ošetření molekul dsRNA restrikčními enzymy před samotnou elektroforetickou separací molekul (Coffin & Coutts, 1992; German et al., 1992; Pallas et al., 1987), představuje tato technika snadnější, avšak stejně efektivní řešení.
6.3.2. Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV V době zpracovávání této části studie zaměřené na molekulární charakteristiku tří geograficky odlišných izolátů ApLV byly v genomových databázích dostupné pouze parciálních sekvence genomu tohoto patogena, jmenovitě sekvence genu pro bílkovinný obal (acc. no. AF057035, Nemchinov et al., 2000; acc. no. GQ919051, Garcia-Ibarra et al., 2010; Peach asteroid spot disease, acc. no. AF318061, Peach sooty ringspot virus, acc. no. AF318062, Gentit et al., 2001) a krátké segmenty sekvencí o délce 200 až 300 bp lokalizované na genech pro obalový protein a virovou replikázu. V lednu tohoto roku (2011) byly v databázi GeneBank poprvé uveřejněny sekvence kompletního genomu ApLV dvou italských a dvou francouzských izolátů (acc. no. NC 014821, HQ339959, HQ339958, HQ339957, HQ339956; Youssef et al., 2011). V té době však byla naše studie již z větší části dokončena. Sekvence těchto izolátů byly využity pro dodatkové analýzy v podobě procentuální sekvenční identity a analýzy fylogenetických vztahů. Za účelem identifikace neznámých oblastí genomu ApLV bylo z výše uvedených důvodů na počátku studie nezbytné využít degenerované primery navržené dle konzervativních regionů ostatních zástupců rodu Foveavirus, jmenovitě dRWdo2/dRWup1 využívané pro detekci vybraných virů rodů Vitivirus a Foveavirus (Dovas & Katis, 2003) a FODr3/FODf2 (předkládaná studie). Na základě nově získaných sekvenčních dat byly 92
Kapitola 6: Diskuze navrženy nové primery spojující jednotlivé oblasti genomu mezi sebou. Na tomto principu byly komerčně sekvenovány a následně charakterizovány tři parciální fragmenty genomů doposud nepopsaných izolátů ApLV, jmenovitě palestinského izolátu Pal, moldavského izolátu Mol a českého izolátu Tom. Velikost jednotlivých úseků byla 4 572 nt (Pal), 3 184 nt (Mol) a 500 nt + 1 409 nt (Tom) představující přibližně 52,3 % (Pal), 34,12 % (Mol) a 20,5 % velikosti kompletního genomu ApLV (procentuální odhad byl proveden dle izolátu ApLV A18IT, acc. no. NC 014821). Na těchto úsecích bylo identifikováno celkem pět otevřených čtecích rámců, což odpovídá genomovému uspořádání ostatních zástupců rodu Foveavirus (Martelli & Jelkmann W, 1998) a je identické s ostatními izoláty ApLV (Youssef et al., 2011). Na základě procentuální sekvenční identity izolátů Pal, Mol, Tom s referenčním izolátem ApLV A18IT (acc. no. NC 014821, Youssef et al., 2011) můžeme potvrdit, že dle stanovaného molekulárního kritéria pro vymezení virových druhů pro čeleď Betaflexiviridae, které je na úrovni nukleotidů nad 72 % a na úrovni aminokyselin nad 80 % (Adams et al., 2004, 2005), jsou tyto parciálně sekvenované izoláty druhovými zástupci ApLV. Nicméně výše zmiňovaná kritéria se vztahují na sekvence genů nejen pro bílkovinný obal, ale i pro virovou replikázu. Z našich výsledků je zřejmé, že u izolátů Pal a Mol jsou informace o sekvencích RdRp pouze částečné a u izolátu Tom zcela chybí. Je tedy nutné brát v úvahu, že výsledné hodnoty po následném doplnění chybějících sekvenčních údajů N-koncové části RdRp budou částečně ovlivněny, jelikož tento region bývá důležitým znakem při určování taxonomických statusů. Do jaké míry však zůstává předmětem dalších studií. Dle fylogenetických analýz vybraných izolátů ApLV založených na aminokyselinových sekvencích ORF2, ORF3, ORF4 a ORF5 je patrné, že izoláty Pal, Tom a italský izolát A18IT (acc. no. NC 014821, Youssef et al., 2011) sdílí v rámci jednotlivých fylogenetických stromů ve všech případech identickou topografickou pozici a navzájem se shlukují, což je silně podpořeno hodnotami bootstrap. Podobné chování je pozorováno u izolátu Mol, který se vždy seskupuje s italským izolátem LA2IT (ac. no. HQ339958; Youssef et al., 2011) a moldavským izolátem NeMD (ac. no.AF057035; Nemchinov et al., 2000). Všechny použité izoláty ApLV byly získány z geograficky odlišných území, jmenovitě z Francie, Itálie, České republiky a Moldávie. Z výsledků fylogenetické příbuznosti je patrné pouze shloučení moldávských izolátů Mol a NemMD do jednoho ramena, ostatní izoláty neprojevují žádnou viditelnou návaznost s místem jejich původu.
93
Kapitola 6: Diskuze Jako nejkonzervativnější otevřený čtecí rámec se dle fylogenetické analýzy izolátů Pal, Mol a Tom projevil region ORF2 kódující protein TGBp1. Tento fenomén byl zmapován i u ostatních izolátů ApLV a ASPV (Youseff et al., 2011), avšak pro ostatní zástupce čeledí Alfaa Betaflexiviridae není typický (Adams et al., 2004). Nejvíce konzervativním regionem komplexu MP je u ostatních patogenů těchto čeledí ORF3 kódující protein TGB2 (Mozorov & Solovyev, 2003). Na druhé straně nejvariabilnější částí genomu ApLV byl na základě fylogenetických analýz jednotlivých izolátů vyhodnocen čtecí rámec ORF5 kódující bílkovinný obal patogena. Takto vysoká variabilita je obecně pro čeleď Betaflexiviridae typická a odhaluje existenci menšího selektivního tlaku v rámci tohoto regionu. Právě z tohoto důvodu hraje oblast bílkovinného obalu velmi významnou roli při navrhování diagnostických metod (Youseff et al., 2011).
6.4. Monitoring ApLV na území ČR Na základě našich výsledků byla touto prací poprvé prokázána přítomnost ApLV na území České republiky. Pozitivním nálezem byla rostlina meruňky cv. Tomis získaná z genofondu meruněk Zahradnické fakulty MZLU v Lednici. Ačkoliv se v genofondu udržují od jedné odrůdy vždy 3 až 4 stromy, u tohoto kultivaru byl přítomen pouze jeden exemplář, zbylé stromy v předešlých letech uhynuly. Z tohoto důvodu nebylo možné odvodit, zda se jednalo pouze o náhodný přenos patogena na tuto rostlinu či byly všechny kultivované stromy dané odrůdy virem ApLV infikované. Výskyt ApLV byl v minulých letech zaznamenán v Moldávii (Zemtchik & Verderevskaya, 1993), ve Francii a Itálii (Grasseau et al., 1999; Gentit et al., 2001a), v Palestině (Myrta et al., 2003), západním Turecku (Gümüs et al., 2004), Egyptě (El Maghraby et al., 2006), Libanonu (Jarrar et al., 2007) a Španělsku (García-Ibarra et al., 2010), tedy ve většině případů v zemích nacházejících se oproti našemu území v teplejším klimatickém pásmu. Nyní vyvstává otázka, zda může být rozšíření viru opravdu určitým způsobem limitováno vyššími teplotami, či nikoliv. Na většině míst, kde byla přítomnost ApLV zaznamenána, představují teplomilné peckoviny velmi důležitou komoditu zemědělství, a proto je důraz na zdravotní stav stromů a s ním spojený i monitoring virových patogenů podstatně vyšší. Chybějící informace o rozšíření ApLV i v dalších evropských či mimoevropských státech může být tedy pouze důsledkem samotného nezájmu o danou problematiku.
94
Kapitola 7: Závěry
Kapitola 7
Závěry I.
Úvodní část předkládané práce byla věnována studii ApLV z hlediska jeho
biologických vlastností. Díky úspěšné inokulaci indikátorových rostlin byla rozšířena virová sbírka patogenů katedry ochrany rostlin ČZU o nativní formu ApLV v podobě infikovaných semenáčů broskvoně GF 305. Doposud známý hostitelský okruh ApLV byl nově rozšířen o komerčně pěstované kultivary broskvoní, třešní, meruněk a vůbec poprvé o odrůdy evropských a japonských švestek. Na všech testovaných semenáčích a kultivarech broskvoní byly patrné příznaky v podobě žlutých nepravidelných skvrn po celé čepeli listů. Kultivar meruňky Tirynthos byl vyhodnocen jako jediný příznakový zástupce tohoto druhu s příznaky ve formě žluté difúzní skvrnitosti po celé čepeli listů. Na rostlinách třešní a švestek nebyly během experimentu pozorovány symptomy žádné. Přenos ApLV na bylinné hostitele se nezdařil. Přestože byl během inokulací kladen velký důraz na celou řadu důležitých aspektů v podobě široké škály potenciálních hostitelů ApLV, různorodost pufrů i pěstebních podmínek během samotné kultivace rostlin, nedošlo k potvrzení ani rozšíření již známého, ale striktně limitovaného hostitelského okruhu tohoto patogena.
II.
Druhá část předkládané práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci
diagnostických metod určených pro spolehlivou detekci ApLV v rostlinných vzorcích. Jako spolehlivý výchozí materiál pro detekci ApLV jsou doporučeny listy peckovin odebírané v průběhu měsíců července, srpna a září. Pokud není z časových, či jiných důvodů možné rostlinné vzorky zpracovat v čerstvém či chlazeném stavu během prvního týdne od sběru, může být materiál dlouhodobě uchováván v dehydratovaném stavu. 95
Kapitola 7: Závěry Užitečnou náhradou pracovně a časově náročné homogenizace rostlinného materiálu pomocí třecích misek a tekutého dusíku představuje drcení vzorků listů za využití extrakčních sáčků a ručního homogenizátoru (Bioreba) či oscilačního mlýnu Retsch MM. Pro extrakci celkové RNA jsou doporučeny metody izolace pomocí „silika“ (Rott & Jelkmann, 2001) a pomocí TriPure Isolation Reagent (Roche) zajišťující dostatečnou výtěžnost, čistotu a neporušenost nukleové kyseliny. Pro specifickou, citlivou a spolehlivou detekci ApLV jsou doporučeny metody TwoStep RT-PCR, Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mRNA, Co-RT-PCR, Nested RT-PCR, One-Step RT-PCR za využití QIAGEN® OneStep RT-PCR kit a One-Step RTPCR „vlastní výroby“.
III.
Třetí část předkládané práce byla věnována studii ApLV z hlediska jeho
molekulárních vlastností. Na základě dsRNA analýz byla odhadnuta velikost ApLV genomu na 9 000 bází. V rámci této studie byly identifikovány a následně molekulárně charakterizovány parciální části genomů tří do dnešní doby nepopsaných izolátů ApLV, jmenovitě palestinského, moldavského a českého. Na základě výsledků procentuální sekvenční identity byly tyto tři izoláty označeny jako možní zástupci druhu ApLV. Fylogenetické analýzy nastínily jejich vzájemnou příbuznost a podaly informace o konzervativnosti či variabilitě jejich putativních proteinů.
IV.
Poslední, ale jistě neméně významná část předkládané práce byla věnována
monitoringu ApLV na území České republiky. Ačkoliv bylo v rámci tříletého monitoringu ApLV otestováno celkem 260 stromů meruněk, nebyla přítomnost patogena v přirozené populaci těchto peckovin v produkčních sadech na našem území potvrzena. Přítomnost ApLV byla prokázána na odrůdě meruňky Tomis kultivované v genofondu peckovin Zahradnické fakulty MZLU. Tím byla podána první zpráva o výskytu ApLV v České republice.
96
Seznam použité literatury
Seznam použité literatury Abbadi H., Abou Ghanem-Sabanadzovic N., Myrta A., Castellano M. A. (2003): Identification of Apricot latent virus from apricot in Palestine. 47-49. In: Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (eds.). Options Méditerranéennes, Virus and virus-like diseases of stone-fruits, with particular reference to the Mediterranean region. CIHEAM/Mediterranean Agronomic Institute, Bari, Italy. Sér. B/n˚ 45, p. 172. Abou Ghanem-Sabanadzovic N., Abbadi H., AL Rwahnih A., Castellano M. A., Myrta A. (2005): Identification and partial characterization of an isolate of Apricot latent virus from Palestine. Journal of Plant Pathology, 87 (1): 33-37. Adams M. J., Antoniw J. F., Bar-Joseph M., Brunt A. A., Candresse T., Foster G. D., Martelli G. P., Milne R. G., Fauquet C. M. (2004): The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Archives of Virology, 149: 1045-1060. Adams M. J., Antoniw J. F., Fauquet C. M. (2005): Molecular criteria for genus and species discrimination withinthe family Potyviridae. Archieves of Virology, 150 (3): 459-479. Agrios G. N. (2005). Plant pathology. 5th ed. Elsevier Academic Press, p. 922. Altschul S. F., Madden T. L., Schäffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402. Anonym 1 [online] [cit. 2010-12-22]. Ovocnářská unie České republiky. Dostupné z: < http://www.ovocnarska-unie.cz/pdf/svz_ovoce_2010.pdf>. Anonym 2 [online] [cit. 2008-08-22]. Ovocnářská unie České republiky. Dostupné z: . Anonym 3 [online] [cit. 2011-01-29]. International Committee on Taxonomy of Viruses. Dostupné z: . Anonym 4 [online] [cit. 2010-12-15]. European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Dostupné z: . Anonym 5 [online] [cit. 2010-12-15]. European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Dostupné z: . Astier S., Albouy J., Maury Y., Robaglia C., Lecoq H. (2007): Principles of plant virology, genome, pathogenicity, virus ecology. Science Publisher, New Hampshire, p. 472. Azzam O. I., Gonsalves D. (1991): Detection of dsRNA in grapevines showing symptoms of Rupestris stem pitting disease and the variabilities encountered. Plant Disease, 75: 960-964. Bariana H. S., Shannon A. L., Chu P. W. G., Waterhouse P. M. (1995): Detection of five legume viruses in one sensitive multiplex polymerase chain reaction test. Phytopathology, 84: 1201– 1205.
97
Seznam použité literatury Blažek J., Beneš V., Dlouhá J., Janečková M., Kneifl V., Kosina J., Lánský M., Paprštein F., Pražák M., Plíšek B., Svoboda A., Staněk J., Sus J. (1998): Ovocnářství. 1. vydání. Český zahrádkářský svaz, nakladatelství KVĚT, s. 383. Baudyš E., Benada J., Dvořák K., Kvíčala B., Kuhn F., Mráz F., Novák J. B., Skalický V., Šesťák J., Špaček J., Vacek V., Vězda A., Voříšek V. (1959): Zemědělská fytopatologie I. Československá akademie zemědělských věd, s. 703. Bertolini E., Olmos A., Martinez C. M., Gorris M. T., Cambra M. (2001): Single-step multiplex RT-PCR for simultaneous and colourimetric detection of six RNA viruses in olive trees. Journal of Virological Methods, 96 (1): 33-41. Bertolini E., Olmos A., López M. M., CambraM (2003): Multiplex nested reverse-transcription polymerase chain reaction in a single tube for sensitive and simultaneous detection of four RNA viruses and Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi in olive trees. Phytopathology, 93: 286– 292. Bertolini E., Torres E., Olmos A., Martín M. P., Bertaccini A., Cambra M. (2007): Co-operational PCR coupled with dot blot hybridisation for detection and 16SrX grouping of phytoplasmas. Plant Pathology, 56: 677–682. Bonfiglioli R. G., Habili N., Green M., Schliefert L. F., Symons R. H. (1998): The hidden problem – rugose wood associated viruses in Australian viticulture. Australian Grapegrower and Winemaker, 420: 9-13. In: Gribaudo I., Gambino G., Cuozzo D., Mannini F. (2006): Attemps to eliminate Grapevine rupestris stem pitting-associated virus from grapevine clones. Journal of Plant Pathology, 88: 293-298. Bouyahia H., Boscia D., Savino V., La Notte P., Pirolo C., Castellano M. A., Minafra A., Martelli G. P. (2005): Grapevine rupestris stem pitting-associated virus is linked with grapevine vein necrosis. Vitis, 4: 133-137. Briddon R. W., Liu S., Pinner M. S., Markham P. G. Infectivity of African cassava mosaic virus clones to cassava by biolistic inoculation. Archieves of virology, 143, 12: 2487-2492. Brunt A. A., Crabtree K., Dallwitz M. J., Gibbs A. J., Watson, L. (1996): Viruses of Plants. CAB International, Wallingford, UK, p. 1484. Candresse T., Lanneau M., Revers F., Macquaire G., German S., Grasseau N., Dunez J., Malinowski T. (1995): An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus. Acta Horticulturae, 386: 136147. Caruso P., Bertolini E., Cambra M., López M. M. (2003): A new and co-operational polymerase chain reaction (Co-PCR) for rapid detection of Ralstonia solanacearum in water. Journal of Microbiological Methods, 55 (1): 257-272.
98
Seznam použité literatury
Clark M. F., Adams A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34: 475483. Clark M. F., Bar J. M. (1984): Enzyme immunosorbent assay in plant virology. Methods in Virology, 7: 51-85. Coffin R. S., Coutts R. H. A, (1992): DsRNA cloning and diagnosisof beet pseudo-yellows virus by PCR and nucleic acid hybridisation. Intervirology, 33: 197–203. Cochran L. C., Smith C. O. (1938): Asteroid spot, a new virosis of peach. Phytopathology, 28: 381436. Cui X., Tao X., Xie Y., Fauquet C. M., Zhou X. (2004)“ A DNAß associated with Tomato yellow leaf curl china virus is required for symptom induction. Journal of Virology, 78 (24): 1396613974. Daire, X., Boudon-Padieu, E., Berville, A., Schneider, B., Caudwell, A. (1992): Cloned DNA probes for the detection of grapevine Flavescence doree mycoplasma-like organism (MLO). Annal of Applied Biology, 121: 95–103. Desvignes J. C., Boye R., Cornaggia D., Grasseau N. (1999): Virus diseases of fruit trees.
Centre
techniques interprofessionnel des fruits et légumes Editions, Paris, France, p. 202. In: Rao G. P., Myrta A., Ling K. S. (2008): Plant pathogens series: Characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops. Studium Press LLC, U.S.A., p. 302. Demeke T., Adams R. P. (1992): The effects of plant polysaccharides and buffer additives on PCR. BioTechniques, 12: 332-334. Dhir S., Tomar M., Thakur P. D., Ram R., Hallan V.,Zaidi A. A. (2009): Molecular evidence for Apple stem pitting virus infection in India. Plant Pathology, 59: 393. Dickinson M. (2003): Molecular plant pathology. Bios Scientific Publishers, p. 244. Dijkstra J., Jager C. P. de (1998): Practical plant virology. Springer–Verlag Berlin Heidelberg, p. 459. Dovas C. I., Katis N. I. (2003): A spot nested RT-PCR method for the simultaneous detection of members of the Vitivirus and Foveavirus genera in grapevine. Journal of Virological Methods, 107: 99-106. Eastwell K. C., Villamor D. V., McKinney C. L., Druffel K. I. (2010): Characterization of an isolate of Sowbane mosaic virus. Archieves of Virology, 155 (12): 2065-2067. El Maghraby I., Sanchez-Navarro J., Matic S., Myrta A., Pallas V. (2006): First report of two filamentous particles from stone fruit trees in Egypt. Journal of Plant Pathology, 88 (3): S69. Fakhfakh H., Vilaine F., Makni M., Robaglia Ch. (1996): Cell-free cloning and biolistic inoculation of an infectious cDNA of potato virus Y. Journal of General Virology, 77: 519-523.
99
Seznam použité literatury
Felsenstein, J. (1985): Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 39: 783-791 Francki R. I. B., Fauquet C. M., Knudson D. L., Brown F. (1991): Classification and nomenclature of viruses. Archives of Virology Suplementum 2, fifth report of the International Commitee on Taxonomy of viruses. New York: Springer-Verlag. Fulton, R. W. (1972): Apple mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses No. 83. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK. Fulton, R. W. (1981): Ilarviruses. In: Kurstak E. (ed.). Handbook of Plant virus Infections and Comparative Diagnosis. Elsevier/Noth-Holland Biomedical Press, p. 943. Fulton R. W. (1996): Prunus necrotic ringspot ilarvirus. In Brunt A. A., Crabtree K., Dallwitz M. J., Gibbs A. J., Watson L. (eds.). Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database.
Version:
20th
August
1996.
Dostupný
na
. Garcia-Ibarra A., Martinez-Gomez P., Rubio M., Dicenta F., Soler A., Pallas V., Sanchez-Navarro, J. A. (2010): First report of Apricot latent virus and Plum bark necrosis stem pitting-associated virus in apricot from Spain. Plant Disease, 94: 275. Gentit P., Foissac X., Svanella-Dumas L., Peypelut M., Candresse T. (2001a): Characterization of two different Apricot latent virus variants associated with peach asteroid spot and peach sooty ringspot diseases. Archives of Virology, 146: 1453-1464. Gentit P., Foissac X., Svanella-Dumas L., Peypelut M., Candresse T. (2001b): Variants of Apricot latent foveavirus (ApLV) isolated from south European orchards associated with peach asteroid spot and peach sooty ringspot diseases. Acta Horticulturae, 550: 213-219. German S., Candresse T., Le Gall O., Lanneau M., Dunez J. (1992): Analysis of the dsRNAs of Apple chlorotic leaf spot virus. Journal of General Virology, 73: 767-773. Gibbs R. A., Chamberalin J. S. (1989): The polymerase chain reaction: A meeting report. Genes & Development, 3: 1095-1098. Glasa, M., Marie-Jeanne, V., Moury, B., Ku´ dela, O. & Quiot, J. B. (2002): Molecular variability of the P3-6K1 genomic region among geographically and biologically distinct isolates of Plum pox virus. Archives of Virology, 147: 563–575. Goheen A. C. (1988): Rupestris stem pitting. In Compendium of grape diseases, p. 53. Edited by Pearson R. C., Goheen A. C.. St Paul, MN: American Phytopathological Society Press. In: Meng B., Rebelo A. R., Fisher H. (2006): Genetic diversity analyses of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus reveal distinct population structures in scion versus rootstock varieties. Journal of General Virology, 87: 1725-1733.
100
Seznam použité literatury
Grasseau N., Macquaire G., Boye R., Cornaggia D., Desvignes J. C. (1999): Peach red marbling and peach sooty ringspot, two new virus-like degenerative diseases of Prunus. Plant Pathology, 48 : 395-401. Gribaudo I., Gambino G., Cuozzo D., Mannini F. (2006): Attemps to eliminate Grapevine rupestris stem pitting-associated virus from grapevine clones. Journal of Plant Pathology, 88: 293-298. Gümüs M., Rowhani A. M., Myrta A. (2004): First report of Apricot latent virus in Turkey. Journal of Plant Pathology, 86, 1: 91-92. Gümüs M., Sipahioğlu H. M., Paylan I. C., Erkan S. (2007): Optimalization of cDNA amplification of Apricot latent virus (ApLV) from various plant tissues sources. Pakistan Journales of Biological Sciences, 10 (6): 936-940. Hadidi A., Khetarpal R. K., Koganezawa H. (1998): Plant virus disease control. The American Phytopathological Society, Minnesota, p. 684. Hammond J., Lecoq H., Raccah B. (1999): Epidemiological risks from mixed virus infections and transgenic plants expressing viral genes. Advances in Virus Research, 54: 189-314. Harper K., Creamer R. (1995): Hybridization detection of insect-transmitted palnt viruses with digoxigenin-labeled probes. Plant Disease, 79: 563-567. Hartley J. L., Rashtchian A. (1993): Dealing with contamination: enzymatic control of carryover contamination in PCR. PCR Methods and Applications, 3: S10-S14. Hopkins, D. L. (1989): Xylella fatidiosa: a xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annual review of Phytopathology, 27: 271–290. Hull R. (1993): Nucleic acid hybridization procedures. In: Matthews REF (ed) Diagnosis of plant virus diseases. CRC, Boca Raton, str. 253-271. Hull R. (2009): Comparative plant virology. 2nd ed., Elsevier Academic press. USA, p. 376. Christoff A. (1938): Virus diseases of genus Prunus in Bulgaria. Phytopathologische Zeitschrift, 31: 381-436. In: Rao G. P., Myrta A., Ling K. S. (2008): Plant Pathogens Series: Characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops, p. 302. Imed A., Boscia D., Boari A., Saldarelli P., Digiaro M., Savino V. (1997): A comparison of Apple mosaic virus isolates from prunus trees and production of specific monoclonal antibodies. EPPO Bulletin 27: 149. Innis M. A., Gelfand D. H. (1999): Optimization of PCR. In: Innis M. A., Gelfand D. H., Sinninsky J. J. (Eds.), PCR applications: Protocols For Functional Genomics. Academic Press, San Diego, 3–27. Itaya A., Folimonov A., Matsuda Y., Nelson R. S., Ding B. (2001): Potato spindle tuber viroid as inducer of RNA silencing in infected tomato. APS Journal, 14: 11.
101
Seznam použité literatury
Ivars, P., Alonso, M., Borja, M., & Hernandez, C. (2004): Development of a non-radioactive dotblot hybridisation assay for the detection of Pelargonium flower break virus and Pelargonium line pattern virus. European Journal of Plant Patholology, 110: 275–283. James D., Goodkin S. E., Eastwell K. C., MacKanzie D. J. (1996): Identification and differentiation of Prunus isolates that cross-react with Plum pox virus and Apple stem pitting virus antisera. Plant Disease, 80: 536-543. James D., Thompson D. A., Godkin S. E. (1994): Cross reactions of an antiserum to plum pox potyvirus. EPPO Bulletin, 24: 605–614 James D., Varga A., Croft H. (2007): Analysis of the complete genome of peach chlorotic mottle virus: identification of non-AUG start codons, in vitro coat pro- tein expression, and elucidation of serological cross-reactions. Archives of Virology, 152: 2207–2215 Jarrar S., Boscia D., Myrta, A., Minafra A., Lonconsole G., Savino V. (2006): Studies on the biological and molecular diagnosis of Apricot latent virus. Journal of Plant Patology, 88 (3, Supplement): S46. Jarrar S., Choueiri E., Sanchez-Navarro J. A., Myrta A., El Zammar S., Savino V., Pallas V. (2007): First report of Apricot latent virus in Lebanon. Journal of Plant Pathology, 89: 303. Rosenfield S. I., Jaykus L. A. (1999): A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction method for the detection of foodborne viruses. Food Protection, 62: 1210–1214. Jelkmann W. (1994): Nucleotide sequences of Apple stem pitting virus and of the coat protein gene of similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potex- and carlaviruses. Journal of General Virology, 75: 1535-1542. Jelkmann W. (1997): Apple stem pitting virus, p. 133-141. In: Vesely D., Monette P. (eds.). Filametous viruses of woody plants. Research Signpost, Trivandrum-695008, India. Jelkmann W. (2004): Detection of virus and virus-like diseases of fruit trees: laboratory assays, bioassays and indicators. Acta Horticulturae, 657: 575-596 Jones R. A. (2004): Using epidemiological information to develope effective integrated virus diseases managment strategies. Virus Research, 100: 5-30. Khan J. A., Dijkstra J. (2006): Handbook of plant virology. Food Products Press, Oxford, p. 452. Kohler G., Milstein C. (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predetermined specifity. Nature, 256: 495-497. In: Vidhyasekaran P. (2007): Handbook of molecular technologies in crop disease management. Haworth Food & Agricultural Products Press TM, NY, p. 462. Koonin V. K., Dolja V. V. (1993): Evolution and taxonomy of positive strand RNA viruses: Implications of comparative analysis of aminoacid sequences. Critical Reviews in Biochemistry and Mololecular Biology, 28: 375–430.
102
Seznam použité literatury
Korschineck I., Himmler G., Sagl R., Steinkellner H., Katinger H. W. D. (1991): A PCR membrane spot assay for the detection of plum pox virus RNA in bark of infected trees. Journal of Virological Methods, 31: 139-146. Krčmář M., Břicháček B. (1993): Molekulárně biologické metody ve virologické diagnostice. IDVZ Brno, s. 87. Kundu J. K. (2003): The occurence of Apple stem pitting virus and Apple stem grooving virus within field-grown apple cultivars evaluated by RT-PCR. Plant Protectection Science, 38: 1317. Kwok S, Higuchi R. (1989): Avoiding false positives with PCR. Nature, 339: 237 Kwok S., Kellog D. E., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C., Sninsky J. J. (1990): Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: Human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucleic Acids Research, 18: 999–1005. Labonne G., Lauriaut F., Yvon M., Quiot J. B. (1994): Dissémination du plum pox potyvirus par les pucerons: analyse des vecteurs potentiels du virus dans un verger d'abricotiers. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 24: 681-690. Larkin M. A., Blackshields G., Brown N. P., Chenna R., McGettigan P. A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I. M., Wilm A., Lopez R., Thompson J. D., Gibson T. J., Higgins D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23: 2947–2948. Leiser R. M., Ziegler-Graff V., Reutenauer A., Herrbach E., Lemaire O., Guilley H., Richards K., Jonard G. (1992): Agroinfection as an alternative to insects for infecting plants with beet western yellows luteovirus. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 89: 9136–9140. Lemoine J. (1979): Manifestation de symptoms de stony pit sur les fruits d´especes differentes a partir de certaines sources de vein yellows du poirier. Ann. Phytopathology, 11: 519-523. In: Rao G. P., Myrta A., Ling K. S. (2008): Plant Pathogens Series: Characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops. Studium Press LLC, U.S.A., p. 302. Lemoine J. (2000): Maladies de dégénerescence des Arbes fruiters a Pepina (pommiers Poiries): Maladies
a
viroides,
virus,
phytoplasmes.
INRA-d´Angers.
Dostupné
na
<
http://www.angers.inra.fr/dossiers/virus/fichvir10.html>. Leone G., Lindner J. L., Jongedijk G., van der Meer F. A. (1995): Back transmission of a virus associated with apple stem pitting and pear vein yellows from Nicotiana occidentalis to apple and pear. Acta Horticulturae, 386: 72-77. Li R., Mock R. (2005): An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses in Prunus spp. Journal of Virological Methods, 129: 162–169.
103
Seznam použité literatury
Liu L., Lomonossoff G. P. (2002): Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus-based constructs. Journal of Virological Methods, 105 (2): 343-348. Lima M. F., Rosa C., Golino D. A., Rowhani A. (2006): Detection of Rupestris stem pitting associated virus in seedlings of virus-infected maternal grapevine plants. Extended Abstracts 15th Meeting of ICVG, Stellenbosch 2006, 244-245. In: Gribaudo I., Gambino G., Cuozzo D., Mannini F. (2006): Attemps to eliminate Grapevine rupestris stem pitting-associated virus from grapevine clones. Journal of Plant Pathology, 88: 293-298. Llácer G., Cambra M. (2006): Hosts and symptoms of Plum pox virus: fruiting Prunus species. EPPO Bulletin, 36 (2): 219-221. Llop P., Caruso P., Cubero J., Morente C., López M. M. (1999): A simple extraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods, 37: 23–31 Longo M. C., Berninger M. S., Hartley J. L. (1990): Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93: 125-128. Lopez-Moya J., Fernandez-Fernandez M., Camra M., Garcia J. (2000): Biotechnological aspects of Plum pox virus, Journal of Biotechnology, 76: 121-136. López M., Bertolini E., Olmos A., Caruso P., Gorris M. T., Llop P., Penyalver R., Cambra M. (2003): Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bakteria. International Microbiology, 6: 233-243. Maroon-Lango C. J. (2004): Virus assays: Detection and Diagnosis. Encyclopedia of plant and crop science. USDA-ARS, Beltsville, Maryland, U.S.A. Marchler-Bauer A., Bryant S. H. (2004): CD-Search: protein domain annotations on the fly. Nucleic Acids Research, 32: W327-W331. Martelli G. P., Russo M. (1984): Use of thin sectioning for visualization and indentification of plant viruses. Methods in Virology, 8: 143-224. In: Martelli G. P., Jelkmann W. (1998): Foveavirus, a new plant virus genus. Archives of Virology, 143: 1245-1249. Martelli G. P., Jelkmann W. (1998): Foveavirus, a new plant virus genus. Archives of Virology, 143: 1245-1249. Martelli G. P. (1993): Rugose wood complex. In: G. P. Martelli (ed.). Graft-transmissible diseases of Grapevines. Handbook for detection and diagnosis. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. Martelli G. P., Adams M. J., Kreuze J. F., Dolja V. V. (2007): Family Flexiviridae: acase study in virion and genome plasticity. Annual Review of Phytopathology, 45: 73–100. Meng B., Gonsalves D. (2003): Rupestris stem pitting-associated virus of grapevines: Genome structure, genetic diversity, detection, and phylogenetic relationship to other plant viruses. Current Topics in Virology, 3: 125–135.
104
Seznam použité literatury
Meng B., Li C., Wang W., Goszczynski D., Gonsalves, D. (2005): The complete genome sequences of two new variants of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and comparative analyses. Journal of General Virology, 86: 1555–1560. Menzel W., Jelkmann W., Maiss E. (2002): Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods, 99: 81-92. Mills P. R. Screenvasaprasad S., Brown A. E. (1992): Detection and differentiation of Colletotrichum gloeosporides isolates using PCR. FEMS Microbiology Letters, 98: 137-144. In: Cook B. M., Gareth Jones D., Kaye B. (2006): The epidemiology of plant diseases. Springer, The Netherlands, p. 576. Minafra A., Hadidi A., Martelli G. P. (1992): Detection of grapevine closterovirus A in infected grapevine tissue by reverse-transcription polymerase chain reaction. Vitis, 31: 221-227. Mink, G. I. (1992): Ilarvirus Vectors. Advances in Disease Vector Research, 9: 261- 281. Morelli M., Minafra A., Boscia D., Martelli G. P. (2011): Complete nucleotide sequence of a new variant of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus from southern Italy. Archives of Virology, 156 (3): 543-546. Morris T. J., Dodds J. A. (1979): Isolation and analysis of double-stranded RNA from virusinfected plant and fungal tissue. Phytopatology, 69: 854–858. Morozov S. Y., Solovyev A. G. (2003): Triple gene block: modular design ofa multifunctional machine for plant virus movement. Journal of General Virology, 84: 1351–1366. Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (2003): Virus diseases affecting the mediterranean stone fruit industry: a decade of surveys. In: Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (eds.). Options Méditerranéennes, Virus and virus-like diseases of stone fruits, with particular reference to the Mediterranean region. CIHEAM/Mediterranean Agronomic Institute, Bari, Italy, Sér. B/n˚ 45, p. 172. Myrta A., Terlizzi B., Boscia D., Choueiri E., Gatt M., Gavriel I., Caglayan K., Varveri C., Zeramdini H., Aparicio P. V., Savino V. (2001): Serological characterisation of Mediterranean Prunus necrotic ringspot virus isolates. Journal of Plant Pathology, 83(1): 45-49. Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S. A. (2000): Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts. Journal of Virological Methods, 90: 37–49. Navrátil M. (2006): Plum pox virus (PPV) in the Czech Republic. Bulletin Organisation Europeenne et Mediterraneenne pour la protection des plantes, 36 (2): 208. Németh M. (1986): Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands, p. 840.
105
Seznam použité literatury
Nemchinov L. G., Hadidi A. (1998): Apricot latent virus: a novel stone fruit pathogen and it is relationship to apple stem pitting virus. Acta Horticulturae, 472: 159-173. Nemchinov L. G., Shamloul A. M., Zemtchik E. Z., Verderevskaya T. D., Hadidi A. (2000): Apricot latent virus: A new species in the genus Foveavirus. Archives of Virology, 145: 18011813. Newbury H. J., Possingham J. V. (1977): Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiology, 60: 543-547. Nolasco G., Sequeira Z., Santos M. T., Sequeira J. C., Sequeira O. A. (1997): IC/RT-PCR coupled to exonuclease fluorescent assay. Early-spring detection of GLRaV-3 in leaf petioles. In: Extended Abstracts, 12th Meeting ICVG, Lisbon Portugal, 29 .09.–02. 10, p 91. O´Donell K. (1992): Ribosomal DNA internal transcribed spacers are highly divergent in the phytopathogenic ascomycetes Fusarium sambucinum (Gibberella pulicaris). Current genetics, 22: 213-220. In: Cook B. M., Gareth Jones D., Kaye B. (2006): The epidemiology of plant diseases. Springer, The Netherlands, p. 576. Olmos A., Dasí M. A., Candresse T., Cambra M. (1996): Print-capture PCR: a simple and highly sensitive method for the detection of Plum pox virus (PPV) in plant tissues. Nucleic acids Research, 24 (11): 2192-2193. Olmos A., Cambra M., Dasí M. A., Candresse T., Esteban O., Gorris M. T., Asensio M. (1997): Simultaneous detection and typing of plum pox potyvirus (PPV) isolates by heminested-PCR and PCR-ELISA. Journal of Virological Methods, 68: 127–137. Olmos A., Bertolini E., Cambra M. (2002): Simultaneous and Co-operational amplification (CoPCR) for detection of plant viruses. Journal of Virological Methods, 106: 51–59. Olmos A., Esteban O., Bertolini E., Cambra M. (2003): Nested-PCR in a single closed tube. 151– 159. In: Bartlett, J., Stirling, D. (Eds.), Methods in Molecular Biology. PCR Protocols: Methods and Applications, vol. 226, 2a ed. Humana Press, Totowa, p. 545. Olmos A., Bertolini E., Gil M., Cambra M. (2005): Real-time assay for quantitative detection of non-persistently transmitted Plum pox virus RNA targets in single aphids. Journal of Virological Methods, 128, 151–155. Osiowy, C. (1998): Direct detection of respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, and adenovirus in clinical respirátory specimes by a multiplex reverse transcription-PCR assay. Journal of Clinical Microbiology, 36: 3149-3154. Osman F., Rowhani A. (2005): Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods, 133 (2): 130-136.
106
Seznam použité literatury
Pallas V., Navaro A., Flores R. (1987): Isolation of viroid-like RNA from hop different from hop stunt viroid. Jouranl of General Virology, 68: 3201-3205. Pastrik K. H. (2000): Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Patholology: 106, 155–165. Petřík K., Lenz O. (2002): Remarkable variability of apple mosaic virus capsid protein gene after nucleotide position 141. Archives of Virology, 147: 1275-1285. Polák J., Zieglerová J., Bouma J. (1997): Diagnostika a rozšíření viru chlorotické skvrnitosti jabloně na jádrovinách v České republice. Horticultural Science Prague, 24: 89-94. Polák J. (2006): Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and ornamental species of Prunus. OEPP/EPPO bulletin, 36: 225–226. Polák J. (2007): Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and sour cherries in the Czech Republic. Plant Protectection Science, 43: 1–4. Rao G. P., Myrta A., Ling K. S. (2008): Plant pathogens series: characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops, Studium Press LLC, U.S.A., p. 302. Rezaian M. A., Krake L. R. (1987): Nucleic acid extraction and virus detection in grapevine. Journal of Virological Methods, 17: 277-285. Richards B. L., Wadley B. N. (1950): Utah Dixie rusty mottle of sweet cherry. Phytopathology, 40: 969. Roberts P. D. (1996): Survival of Xanthomonas fragariae on strawberry in summer nurseries in Florida detected by specific primers and nested polymerase chain reaction. Plant Disease, 80: 1283–1288. Rosypal S., Doškar J., Petrzik K., Růžičková V. (2002): Úvod do molekulární biologie, díl čtvrtý; Molekulární biologie rostlinných virů, priony, molekulární evoluce, vznik života, metody molekulární biologie, genové inženýrství. 3. vyd. Prof. RNDr. Stanislav Rosypal, DrSc., s. 540. Rott M. E., Jelkmann W. (2001): Characterization and detection of several viruses of cherry: adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR) and modification of RNA extraction protocol. European Journal of Plant Patology, 107: 411 – 420. Rowhani A., Chay C. Golino D. A. Falk B. W. (1993): Development of Polymerase chain reaction technique for the detection of grapevine fanleaf virus in grapevine tissue. Phytopathology, 83 (7): 749-753. Rowhani A., Maningas M. A., Lile L. S., Daubert S. D., Golino D. A. (1994): Development of a detction system for viruses of woody plants based on PCR Analysis of immobilized virions. Phytopathology, 85: 347-352.
107
Seznam použité literatury
Rowhani, A., Maningas, M. A., Lile, L. S., Daubert, S. D., Golino, D. A. (1995): Development of a detection system for viruses of woody plants based on PCR analysis of immobilized virions. Phytopathology, 85, 347–352. Rowhani A., Biardi L., Routh G., Daubert S. D., Golino D. A. (1998): Development of sensitive colorimetric-PCR assay for detection of viruses in woody plants. Plant Disease, 82: 880–884. Ruml T., Rumlová M., Pačes V. (2007): Genové inženýrství. Vysoká škola chemickotechnologická v Praze, s. 270. Saitou N., Nei M. (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4: 406-425. Sambrook J., Russell D. W. (2001): Molecular cloning. Laboratory manual. Third ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Sanchez-Navarro J. A., Apaticko F., Herranz M. C., Minafra A., Myrta A., Pallas V. (2005): Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one step RT-PCR. European Journal of Plant Pathology, 111: 77-84. Simon L., Saenz P., Garcia J. A. (1997): Filamentous viruses of woody plants. Chapter 7 Plum pox virus. 75-86. In: Monnette P. (ed.). Trivandrum, India: Research Singspost. Sipahioglu H. M., Usta M., Ocak M. (2006): Use of dried high-phelolic laden host leaves for virus and viroid preservativ and detction by PCR methods. Journal of virological methods, 137: 120124. Smith W. W. (1954): Occurence of stem pitting and necrosis in some body stocks for apple trees. Proc. Am. Soc. Hort. Sci., 63: 101. In: Rao G. P., Myrta A., Kai Shu Ling (2008): Plant pathogens series: characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops, Studium Press LLC, U.S.A., p. 302. Schneider W. L., Sherman, D. J., Stone A. L., Damsteeegt V. D., Frederick R. D. (2004): Specific detection and quantification of Plum pox virus by real-time fluorescent reverse transcriptionPCR. Journal of Virological Methods, 120 (1): 97-105. Stouffer R. F., Fridund P. R. (1989): Apple stem pitting. In “Virus and Virus like Diseases of Pome Fruits and Simulating Noninfectious Disorders”. Cooperative Extension College of Agriculture and Home Economics Washington State University. Uyemoto J. K., Scott S. W. (1992): Important diseases of Prunus caused by viruses and other grafttransmissible pathogens in California and South Carolina. Plant Disease, 5-11. Vaskova D., Petrzik K., Karesova R. (2000): Variability and molecular typing of the woody-tree infecting prunus necrotic ringspot ilarvirus. Archives of Virology, 145 (4): 699-709. Valverde R. A. (1990): Analysis of double-stranded RNA for plant virus diagnosis. Plant Disease, 74: 255–258.
108
Seznam použité literatury
Vidhyasekaran P. (2004): Consice encyclopedia of plant pathology. Food Products Press, Haworth Reference Press, Inc., p. 619. Vidhyasekaran P. (2007): Handbook of molecular technologies in crop disease management. Haworth Food & Agricultural Products Press TM, NY, p. 462. Wagnon H. K., Traylor J. A., Williams H. E., Weiner A. C. (1963): The natural occurrence of Peach asteroid spot virus in a native Prunus (P. andersoni L.) in California and Nevada. Phytopathologia Mediterranea, 2: 196-198. Waller J. M., Lenné J. M., Waller S. J. (2001): Plant pathologist´s pocketbook. 3rd edition, CAB International, London, p. 516. Wang X. T., Chen T., Kim D., Piomelli S. (1992): Prevention of carryover contamination in the detection of βs and βc genes by polymerase chain reaction. American Journal of Hematology, 40: 146-148. Webster C. G., Wylie S. J., Jones M. G. K. (2004): Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science, 86: 12. Williams H. E., Wadley B. N., Wagnon H. K. (1976): Asteroid spot. In: Rao G. P., Myrta A., Ling K. S. (2008): Plant pathogens series: characterization, diagnosis & management of plant viruses, Vol. 2, Horticultural Crops, p. 302. Waterworth H. E. (1998): Certification for plant viruses-an overview. In: Hadidi A., Khetarpal R. K., Koganezawa H. (1998): Plant virus disease control. The American Phytopathological Society, Minnesota, p. 684. Webster C. G., Wylie S. J., Jones M. G. K. (2004): Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science, 86, 12. Wetzel T., Candresse T., Macquaire G., Ravelonandro M., Dunez J. (1992): A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox virus detection. Journal of Virological Methods, 39: 27-37. Williams K., Blake S., Sweeney A., Singer J. T., Nicholson B. L. (1999): Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses. Journal of Clinical Microbiology, 37: 4139-4141. Yanase H., Mink G. I., Sawamura K., Yamaguchi A. (1990): Apple topworking disease. Pages 7475. In: Jones A. L., Aldwincle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear Diseases. The American Phytopathological Society, St. Paul, MN. Yourno J. (1992): A method for nested PCR with single closed reaction tubes. Genome research, 2: 60-65. Youssef F., Marais A., Faure Ch., Barone M., Gentit P., Candresse T. (2011): Characterization of Prunus-infecting Apricot latent virus - like Foveaviruses: Evolutionary and taxonomic implications. Virus Research, 155(2): 440-445.
109
Seznam použité literatury
Zemtchik E. Z., Verderevskaya T. D. (1993): Latent virus on apricot unknown under moldavian conditions. Selskohozeaystvennaya Biologia (Russian Agricultural Biology), 3: 130-133. Zemtchik E. Z., Verderevskaya T. D., Kalashyan Yu A. (1998): Apricot latent virus: transmission, purification and serology. Acta Horticulturae, 472: 153-158. Zhang Y. P., Mink G. I., Tiffany M. G., Howell W. E. (1992): Isolation of viruses associated with cherry twisted leaf, apricot ring pox, and pit pox diseases and their relationship to Apple stem pitting virus. Phytopathology, 82: 1149. Ziegler A., Torrance L. (2002): Applications of recombinant antibodies in plant pathology. Molecular Plant Pathology, 3 (5): 401– 407.
110
Přílohy
Přílohy Seznam obrázků a tabulek v příloze Obr. 1. Způsoby homogenizace rostlinného materiálu. Obr. 2. Schématický postup izolace dsRNA dle Valverde (1990). Obr. 3. Kolonkový systém využitý při izolace dsRNA. Obr. 33. Zápis sekvencí nukleotidů palestinského izolátu ApLV. Obr. 35. Zápis sekvencí nukleotidů moldavského izolátu ApLV. Obr. 37. Zápis sekvencí nukleotidů českého izolátu ApLV. Tab. 1. Seznam nejčastěji pěstovaných kultivarů peckovin v České republice (Anonym 1, 2008). Tab. 2. Rozšíření virů peckovin v České republice (Polák, 2007). Tab. 3. Seznam kultivarů peckovin na univerzitním pozemku „P. Martucci“ ve Valenzanu (Itálie). Tab. 4. Seznam bylinných indikátorových rostlin. Tab. 5. Přehled primerů využitých při RT-PCR. Tab. 6. Přehled primerů využitých při dot-blot molekulární hybridizaci. Tab. 7. Sbírka ApLV izolátů použitých v předkládané práci. Tab. 8. Seznam primerů využitých při studii genomu ApLV. Tab. 9. Seznam primerů využitých pro studii palestinského izolátu ApLV. Tab. 10. Seznam primerů využitých pro studii moldavského izolátu ApLV. Tab. 11. Seznam primerů využitých pro studii českého izolátu ApLV. Tab.12. Seznam a popis izolátů ApLV a virových zástupců rodu Foveavirus využívaných v předkládané práci.
111
Přílohy
A B
B
C
B
C
Obrázek 1. Způsoby homogenizace rostlinného materiálu. A: homogenizace rostlinného materiálu pomocí třecích misek a tekutého dusíku; B: homogenizace rostlinného materiálu pomocí oscilačního mlýnu Retsch MM 400; C: homogenizace rostlinného materiálu pomocí extrakčních sáčků (12cm x 14cm) a ručního homogenizátoru od firmy Bioreba.
Přílohy
Obrázek 2. Schématický postup izolace dsRNA dle Valverde (1990).
Obrázek 3. Kolonkový systém využitý při izolace dsRNA.
Přílohy Obrázek 32. Zápis sekvencí nukleotidů palestinského izolátu ApLV. 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CAATTCTTCCCGCCAGGCTACATTGATCTAATAATTCTTGGGTTAAAGCAGAACGTCAACATAATAATTGCCGGGGATCC 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTGCCAAAGTGATTATGATAGTAGTTCTGACAGGCACATTTTTGCTGGTAGTGAGAGCGATATTATGAGGATATTGAGTG 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCAGAACCTATAAATTTAATATTTTGAGCCAAAGGTTTAGAAATCCTGTCTTTGTAGGGAGGCTGCCATGCAATCTGAAC 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAATCTCGACTAACCCTTGATGAGGAGGAATACACACTTTGGGAAAGCATCCAAGAGTTCTCAATGATGGGGAGGAAGGA 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGCCCGGTTGTTCTGGTTTCAAGCTTTGAGGAGAATAAGATCATTGCGGCGCACCTTGGTCTTAAAATGAAATGCATCA 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTTATGGTGAGTCAACTGGTCTCAATTTCCAAAAGGGAGCTATTCTTGTGACTTATGAGAGTGCTTTAACTAGCGATCGT 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGGTGGTGGACGGCTTTGTCCAGGTTTAGTCATGATATCCATTTCATAAATGGAATGGGAGTCACTTGGGACAATGCCTT 570 580 590 600 610 620 630 640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AACGCATTTTGTTGGTAAACCCCTGCATAAATTCTTAACCAAGAGGGCTTGCAACGATGATATCATTGATCTATTACCTG 650 660 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCCGTCCAGAGTTGATTGAGGGTTTTCAGAGTCAAGTTGGGGCAGATGAAGGTGTTCGAGAAGCAAAGCTAGTTGGAGAT 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCCTGGCTAAAGACAAAAATTTTCCTTGGTCAATCTCCAGACTTTGAATTAGAAGATTTTGAAGAGATTCAAGCAGCAGA 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGATTGGTTCAAAACTCATGTACCAATAATGGGGCTTGAAGCTGTTAGGGCTCAATGGGTCAGCAAGTTGCTAGCCAAAG 890 900 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAGATCGAGAATTCCGAATTGGGGACATCACCACAGAGCAATTCACTGATGAGCACAGCAAGAATAGGGGGCTTGAACTC 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACCAACGCAGCTGAGAGGTATGAAGCCATTTATCCAAGACATAAGGGAACAGATACCGCCACGTTCCTAATGGCAGTGAA 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAAAAGATTAAGTTTCTCTTCTCCAGCTGCTGAACATGCCAAGTTGAGAAGGGCCCGCCCTTTTGGAAAATTCCTCCTTG 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATACCTTCCTGAAGAGAATCCCTTTGAATCGCAAACATAGCAGTGAAATGATGGAATCTGCTGTTCATGCCTTTGAAGAG 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAAAAGCTCTCAAAGAGTATGGCCACTATTGAGAATCACTCTGGTCGTTCCTGTGAAGATTGGCCAATTGACAAGGCATT 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GATCTTCATGAAGTCACAATTATGCACGAAGTTTGACAACAGATTTCGAAGTGCCAAGGCTGGGCAGACTTTAGCTTGCT 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTCAACATTCTGTCTTGTGCAGGTTTGCTCCTTACATGAGAATATCGAAGTCTAAAGTGGTGGAGTCACTCCCAAAGAAT
Přílohy Obrázek 32. Zápis sekvencí nukleotidů palestinského izolátu ApLV (pokračování) 1450
1460
1470
1480
1490
1500
1510
1520
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTTTATATTCATTCTGGGAAGAATATTGATGATCTGGCTGATTGGGTCAAAATTCACAAATTCAATGGCGTGTGCACAGA 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATCTGATTACGAAGCTTTTGATGCATCACAGGATCACTTTATTTTGGCCTTTGAACTGGAAATCATGAAATATCTTGGTT 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TACCTGCTGATTTAATTTCAGACTATACGTTCATTAAAACCCACCTTGGGTCAAAGCTCGGGAATTTTGCCATAATGCGA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTCACTGGTGAAGCAAGCACCTTTCTTTTCAATACCATGGCCAACATGCTATTCACTTTTTTGAGGTATGATCTCAACGG 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 1840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAAGGAGGCAATCTGTTTTGCTGGTGATGACATGTGTGCGAATTCGAGGTTGAAGGTAACCAATAAAAACTCCAATTTTT 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGGACAAGATTAAACTGAAGGCTAAGGTCCAGTTCACTGCGACTCCAACATTCTGTGGTTGGGGACTTTGCGAGCACGGG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTTTTTAAAAAACCAGATTTGGTTCTTGAGAGACTCCAGATTGCTAGGGAGACCCGAAATCTTGAAAACTGTATTGATAA 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTATGCTATTGAGGTTTCTTGTGCCTACCAGATGGGTGAAAATCTAAATCTTTACCTCTCCCCTCATGAGATGGATGCTC 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATTATAATTGCGTGAGGTTCATCATCTTGCACAACCATCTTCTGAAATCAAACATCAGAGATCTCTTTAGAGGTGAACCA 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCCATTGTCACTTTTTGATTTACCTACTAGTAGATTTAGTTTAAAGCGTATTAGGTTAAGCTAATTAGTGTTAATAATGG 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAACTGTGCTAAGTTTATTGAATGAGTTTGGATTTGAACGCACTGTGAGCCTTTGGAGTGATCCCATTGTTGTGCATGCA 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGGTTTCCCTTGGGAAAGACAACTTTAATTAAGCAGGCTTTGATAAGAAATCATAATATTGAGGCTGTGACTTTTGGAGT 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCCGGAAAAAGCGAACATTCACGGTACTTATATCAAAAAGGCTAGGCAGGGTCAGAGAGGTAGGGGCAACTTTAGCATTT 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550 2560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGGACGAGTACCTCTCAGGTGAATACTCAACCGGCTTCAACTGCTTATTTTCTGATCCCTATCAAAACCACGGTGACTGC 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630 2640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTTCGAGCTCATTTCATTGGACGTTGCTCACATAGGTTTGGCAATCAGACTGTGCAGGTTTTGCGAAATTTGGGCTACAA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 2710 2720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TATTGCCAGTAGCAAAGAGGACGTAGTTGAGAGAAAGAATATCTTTAGGCTTGTGGAGCCTGAAGGTGTAATCATCTGTC 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGAAAAGGAAGTTGAGGAATTCCTCACCTGGCATCACGTTGAATACAAATTGCCTTGTCAAGTTCGTGGTGCTACATTT 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GATATTGTAACCTTCATCCACGAGAAACCTCTAGAGGAGCTGGTTGGTCCTGATTTGTACGTTGCGCTGACTAGACACAG
Přílohy Obrázek 32. Zápis sekvencí nukleotidů palestinského izolátu ApLV (pokračování) 2890 2900 2910 2920 2930 2940 2950 2960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCACAAATTGGTGCTTGTTACGAATTAGTATGCCTTTTTCCCAACCTCCTGATTATTCTAAGAGTGTCTTCCCAATAGCC 2970 2980 2990 3000 3010 3020 3030 3040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATCGGTGCAGCTGTTGCTCTGGTCCTATTCACTTTAACCCGCAGCACTTTACCACAGGTAGGTGACAACATCCACAACTT 3050 3060 3070 3080 3090 3100 3110 3120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCCTCATGGTGGAAATTATCAGGACGGAACAAAGAGAATTAGCTACTGTGGGCCTAAGAATTCCTATCCAAGTAGTTCTT 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 3200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGATATCTAGTGGCACGCCTATGATCATCATAGTTATTCTCCTGATTGTGGCTATCTATGTATCCGAGAAGTGGCTTGGC 3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCAGGGAATCGTCGCTGCAGTTGTTGTTTACCTGGTGCTCCTGCTTGCACAGCAACTAATCATGAGTAGAACAAATTCAT 3290 3300 3310 3320 3330 3340 3350 3360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCACAATTGTGATAACCGGGGAGTCAGTTTCCATTGTAGGTTGTACGTATTCTGACGCTTTCATAGAATTGGTGAAGGGC 3370 3380 3390 3400 3410 3420 3430 3440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTTAAGCCTTATTATCACCCATTAGGTTAGGGTGTGATGGATCAATGTTAAATAGAAGTTTGTGTGTGATTGATTTCAAA 3450 3460 3470 3480 3490 3500 3510 3520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTCAAGTTTTAATAGTCTAAATTTCAATTCCAGACCATGACGACAAGCGGGCAAGATACAACGAGTTCTAATCCGGCTGT 3530 3540 3550 3560 3570 3580 3590 3600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GACCAGAGATGAAGAGACGCCGGTTGTGACAGATGTTCAAACCACAAATGCTGCAGCAGTCACCTCTGAGGCAACACCTA 3610 3620 3630 3640 3650 3660 3670 3680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGCCATTGCTCCATTGTCTGCGTCCACGCAGCCAATAGCGACTACTTCCAGTTTTGAGTTCACCTTCACTCCTGCAACC 3690 3700 3710 3720 3730 3740 3750 3760 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCTGTTTCAGCCACTCCCATGACATTTCCGGAGCCAGTTGTGTCACAATTGGTGCCTTTCCCACCCTTAATTGCAACTGG 3770 3780 3790 3800 3810 3820 3830 3840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCAGAGTTCAGCACAGACAACTGCAATTCCTGATGCTTCAAGGCTGCAACAGATGGCTGCTGCAAATAGGGGCTTTAGTG 3850 3860 3870 3880 3890 3900 3910 3920 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGGGTCTCAGTGCATACCCGCTACCTATAACCCCATCAAGCTCAAACCCTTTCACAACTGGGAATGTCTTCACCAGCTCC 3930 3940 3950 3960 3970 3980 3990 4000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTATTCTCTGGACGAGGTTCTAATACAGCCACGCCATCTGAAGCTCCTGGAGGACCTACCCCTCAGAGGGTATTCCAATC 4010 4020 4030 4040 4050 4060 4070 4080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACCACAGGATTTGAATCTTTCTGCCCAGAGTCAGAGCTCACAACTGCACACATCTGGCCGTGTTGGTGATATAATTACCC 4090 4100 4110 4120 4130 4140 4150 4160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CGTTCACGCTTGGGAATAGAGCCCCTAGAAGGGCAGCTTCGTCAGTAGGGGGAACTAGGAGGAGGTTGGACTCTGTTGGA 4170 4180 4190 4200 4210 4220 4230 4240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGAAGAGCATAATGTATGAACCTCAAGCTGGTGTGGTTGCTACTGATGCAAAGATGAGGGCCATTGGCAGAGCTCTTAT 4250 4260 4270 4280 4290 4300 4310 4320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGAGATGGGAATTAGGGAGGATCAGCTCACTGAAGTTGGAGTTTACCTTGCCAGGCACTGTGCAGACGTTGGTGCCTCCG
Přílohy Obrázek 32. Zápis sekvencí nukleotidů palestinského izolátu ApLV (pokračování) 4330 4340 4350 4360 4370 4380 4390 4400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATAAANCCACTCTCTTGGGTACATTCCCTGGGTCCGACATAACGCTGGAGGAGGTAGGCACAAGAATCAAGCAAACTGAA 4410 4420 4430 4440 4450 4460 4470 4480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGCTGCACCCTCAGGCAATACTGTGCTTACTATGCAAAGCATGTTTGGAATCTAATGCTCCAAACTCAAAAGCCACCAGC 4490 4500 4510 4520 4530 4540 4550 4560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAATTGGGTTGGGAAGGAGTTCAAATTTGAAACAAGGTATGCAGCTTTCGATTTCTTCTTTGGAGTTGAGAGTTCTGCTG 4570 4580 4590 4600 4610 4620 4630 4640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCTTAGAGCCAGCTGATGGTTTAATCAGGCTCCCTACCCAATCTGAGAGGGTTGCGAATAACACCAGCAAGGAAATTCAA 4650 4660 4670 4680 4690 4700 4710 4720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATGTACCGCATCAGGTCAATGGAGGGAACTCAAGCCGTGAACTTTGGAGAAGTCACTGGCGGTAAAATAGGACCAAAGCC 4730 4740 4750 4760 4770 4780 4790 4800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGTTTTGTCAATAAAGAAATAA-GGTCGAGTGCCTTGCTTTCAATTCTTCAGTATTTATGCTTTTAAATAAAGTTGATCC 4810 4820 4830 4840 4850 4860 4870 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|... CAACCTAATCGGGACGGCAGAGTGTGTTTATTTCAATTCCTACTTTGCTTATTTTTGTTTTAACTAGATTTCC
Obrázek 35. Zápis sekvencí nukleotidů moldavského izolátu ApLV 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGTGAGGCTAGTACCTTTCTTTTCAATACTATGGCCAATATGTTGTTCACCTTTTTGAGGTATGATCTAAATGGAAAAGA 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGCTATCTGCTTTGCTGGTGATGATATGTGTGCTAATTCTAGGCTGAAGATCACCAACAAAAATTCAAAGTTTTTGGACA 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAATCAAGTTAAAAGCCAAGGTTCAATTCACTGCAACTCCAACATTCTGTGGCTGGGGACTTTGTGAGCATGGTGTTTTT 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AAAAAACCGGACTTGGTTCTGGAGAGGCTTCAAATTGCAAGAGAAACTCGAAATCTTGAAAACTGCATTGACAATTATGC 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TATTGAAGTTTCTTGCGCTTACCAAATGGGTGAGAATTTGAGTCTCTACCTCACCCCCCATGAAATGGATGCTCATTATA 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACTGTGTGAGATTTATTGTGCTGCATAATCACCTCCTGAAATCCAACATAAAGGACCTCTTTAGAGGTGAACCAACCTGC 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATTTCTCTATAATTACTTACTAATA-GGATTAGTTTAAAGCGTATTAGGTTAAGCTAATTAGTATTAATAATGGAAACTG 570 580 590 600 610 620 630 640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGCTTAGTTTGCTGAATGAGTTTGGATTTGAACGCACTGTCGAGCCCTTGAGTGATCCGATTGTTGTACATGCAGTGCCT 650 660 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGTTCTGGGAAAACAACATTGATTAAACAGGCTTTGATCAGGAACAATAACATCGAGGCTGTAACTTTTGGAGTTCCGGA
Přílohy Obrázek 35. Zápis sekvencí nukleotidů moldavského izolátu ApLV (pokračování) 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAAGGCCAACATCCACGGCACATATATTAAGAAAGCTAGACAGGGCCAAAGAGGTAGAGGCAACTTTAGCATTTTAGACG 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGTACCTATCTGGTGAGTATTCAACAGGCTTCAATTGCCTATTTTCAGATCCTTACCAAAATCACGGTGATTGTCTTCGA 890 900 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCACACTTCATTGGCCGTTGCTCCCACAGGTTTGGCAATCAAACAGTGCAGGTGCTTAGGAATTTGGGCTACAACATAGC 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TAGTAGCAAGGAGGACATTGTTGAAAAGAAAAATATCTTTAAGCTTGTTGAGCCTGAAGGTGTGATCATCTGTCTTGAAA 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGAGCGTTGAGGACTTCTTGGCTTGGCATCACGTTGAGTACAAATTGCCTTGTCAGGTTCGAGGGGCAACATTTGATGTT 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTAACTTTTATTCACGAGAAACCCCTTGAGGAGCTAGTTGGACCTGATCTGTACGTTGCCCTAACTAGGCATCGTAATAA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATTGGTTCTTGTGACCAACTAGCATGCCTTTCTCCCAACCTCCTGATTACTCCAAAAGCATCTTCCCAATAGCCATTGGT 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCAGCAGTTGCATTAGTGCTTTTCACCCTGACCCGAAGCACATTGCCACAGGTGGGGGACAATATTCATAACTTGCCTCA 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CGGTGGAAATTATCAAGATGGTACTAAAAGGATAAGCTACTGTGACCCAAAGAATTCTTTTCCAAGCAGTTCTCTAATCT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTAGTGGCACTCCCATGTTCATCATAGTGGTTCTTTTAACTATTGCCATCTATGTATCTGAGAAATGGTTTGGTTCAGGG 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CATCGGCGCTGCAGTTGTTGTATACCTGGTGCTCCTGCTTGCACAGCTACTCCTCATGAATAAAACCAACCCATGTACCA 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGTGATAACTGGGGAATCAGTTTCCATTGTAGGTTGTACATATTCTGATGCTTTCATAGAATTGGTGAAAGGTCTTAAA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCTTATTATCACCCATTAGGTTAGGGTGTGGTAGATTAATATTAAATAGAAGTTTGTGTGCAATAAATTTAA-GTTTGAA 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 1840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTTT-GATACTTTCTGATCTTATTCCCGACCATGGCTACAAGCGGACAGAACACATCTGGCACTGACCCTATCATTTCCG 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTGGTGAGGAAACACCAGCTGTCACGAATGTTCTGACCACAAATACTGCAGCCACAACCACTGAGGCAACTCCTGTCATT 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCTGATTCCCAAACTGCTTCTACACAGCCACCAGCCACGACTTCAAGTTTTGAATTCACTTTCACTCCTGCAACCTCTGT 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTCTGCCACACCATTGACATTTACTGAACCAGTCGTTTCTCAGTTGGAAGCTTTTCCACCTTTGATTTCGGCTGGTCGAA 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTACTGAGCAGACAACTGTGGCTTCTGACACTCAGAGATTGCAKCAAATGGCTGCTGCGAATAGAGGTTTTAGCGAGGGT
Přílohy Obrázek 35. Zápis sekvencí nukleotidů moldavského izolátu ApLV (pokračování) 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTCAGATCTCGCCCCTTACCCCTGACTCCATCAAGTTCAAATCCGTTCACCACTGGGAACACCTTCACCAGCTCCATATT 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCCTGGGCAAGGTTCCAATGCGGCCGTATTCTCTGAAGCCTCTGGTGAACCCTCTTCACAGAGGGTATTTCAATCACCTC 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TAGGGGCTGATTCTCTTGCCCAGGGCCAACACCCTCAACAAAGGACATCTGGYCGTACTGGGGAGGTTATCACCCCATTC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACGCTAGGGAATAGAGCCCCAAGAAGAGCTACTTCAACCTTGGGTGGAACCCGAAGACGGCTAGATTCTGTTGGCCTTAG 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550 2560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGCATAATGTATGAACCCCAGGCTGGAGTTGTTGCCACAGATGCTAAAATGAGAGCAATCGGTAGAGCACTGATTGAGA 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630 2640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGGGTATTCGTGAAGATCAACTCACGGAAGTTGGCGTTTACCTTGCTAGACATTGTGCTGATGTTGGTGCATCTGACAAA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 2710 2720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCAACTCTTCTTGGTACCTTTCCTGGGTCAGACATAACTCTCGAGGAGGTTGGTACGAGGATTAAGCAGACTGATGGCTG 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CACTCTCAGACAATACTGTGCATACTATGCRAAGCATGTGTGGAACCTCATGCTTCAAACTCAGAAGCCGCCAGCGAATT 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGGTGGGCAAAGAATTTAAATTCGAAACAAGGTATGCAGCCTTCGACTTTTTCTTTGGAGTTGAAAGTTCTGCTGCCTTA 2890 2900 2910 2920 2930 2940 2950 2960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGCCGGCTGATGGTCTGATTAGACTCCCAACCCAGTCTGAAAGGGTAGCCAACAATACCAGCAAGGAAATACAAATGTA 2970 2980 2990 3000 3010 3020 3030 3040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCGCATTAGATCAATGGAAGGTACCCAGGCTGTGAACTTTGGAGAAGTCACAGGTGGCAAGATTGGGCCCAAACCCGTTC 3050 3060 3070 3080 3090 3100 3110 3120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TATCTATAAAGAAATAAGGTCAAACCCTTAGTTTCAATCTCTACAGTACTTATGCTTTTAAATAAAGTTGATCCCAACCT 3130 3140 3150 3160 3170 3180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... AATCGGGACGGCAGAGTGTGATTTAATTTATGCTTTTGCTTATTTTTGTTTTAACTAGATTTCC
Obrázek 36. Zápis sekvencí nukleotidů české izolátu ApLV, část 1 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTCCTGATTTGTACGTTGCGCTAACCAGACACAGGCACAAATTGGTGCTTGTTTCGAATTAGTATGCCTTTTTCCCAACC 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCCTGATTACTCTAAGAGTGTTTTTCCAGTAGCTATAGGTGCAGCTGTTGCTCTGGTTCTATTTACTTTGACCCGAAGCA 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CTTTACCACAGGTAGGTGATAACATTCACAATTTGCCTCATGGTGGTAACTATCAGGACGGAACTAAGAGAATCAGTTAC 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGCGGTCCCAAGAATTCCTTTCCAAGTAGTTCTTTAATATCCAGTGGTACGCCTATGATCATCATAGTCATTCTCCTGAC
Přílohy Obrázek 36. Zápis sekvencí nukleotidů české izolátu ApLV, část 1 (pokračování) 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TGCAGCTATCTATGTATCCGAGAGGTGGTTTGGCTCAGGGCATCGTCGCTGCAGTTGTTGTTTACCTGGTGCTCCTGCTT 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCACAGCAACTAATCATGGGTAGAGCAAATTCATGCACAATTGTAATAACTGGGGAATCAGTTTCCATTGTAGGTTGTAC 490 500 ....|....|....|....| GTATTCTGACGCTTTCATAG
Obrázek 37. Zápis sekvencí nukleotidů české izolátu ApLV, část 2 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATTCCCGACCATGGCTACAAGCGGGCAAGACACAACAAGCGCTAATCCAGCTGTGACCAGAAATGAAGAAACGCCAGTGG 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TAACAGAGGTTCAAGCTACTAATGCTGTAGCCACCACCTCTGAAGTAGCACCTGTTGCTACTGCTCCACTGCCTGCGCCC 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATGCAGCCAACTGCGACAGCTTCCAACTTTGAGTTCTCTTTCACTCCTGCTACCTCAGTTTCAGCGACTCCCTTGACATT 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTCTGAGCCTGTTGTGTCACAGTTGGTGCCTTTTCCACCTTTAGTTGCAACTGGCCAAAGCTCAGCGCAAACGACTGCTG 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTCCTGATACTGCAAGGCTGCAGCAGATGGCCGCTGCAAATAGGGGCTTTAGTGAGGGTCTCAGAGTGCACCCACTACCC 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATAACTCCATCAAGCTCAAATCCTTTCACAACTGGGAATATTTTCACCAGCTCTGTATTCTCTGGGCAAGGTTCTAACGC 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CACTACATCTTCAGAAGCTATTGGAGAGCCTACTCCTCAGAGGGTGTTCCAATCATCACAGGGTTTAAATCCTCTTGCTC 570 580 590 600 610 620 630 640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGGGTCATGATTCACGACAATACACATCTGGTGGTGTTGGGAATGCGATCACCCCTTTCACTCTTGGAAATAGAGCCCCA 650 660 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGAAGGGCAACTTCATCAATAGGGGGAACCAGAAGGAGGCTGGATTCAGTTGGACTCAAGAGTATAATTTACGAACCTCA 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGCTGGTGTGGTTGCCACTGACGCAAAGATGAGAGCCATTGGCAGAGCCCTCATAGAGATGGGAATCAGGGAGGATCAGC 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCACTGAAGTTGGAGTTTACCTTGCCAGGCACTGTGCAGACGTTGGCGCCTCTGATAAATCCACTCTCTTGGGAACTTTT 890 900 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCTGGGTCTGATATAACGCTGGAAGAGGTTGGTACAAGGATCAAGCAGACTGAAGGCTGCACCCTCAGGCAATACTGTGC 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTACTATGCGAAGCATGTTTGGAATCTAATGCTTCAAACTCAGAAACCGCCAGCAAACTGGGTTGGGAAGGAGTTTAAAT 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTGAAACAAGATATGCAGCTTTTGACTTCTTCTTTGGAGTTGAGAGTTCTGCTGCTTTGGAGCCAGCTGATGGTTTGATA
Přílohy Obrázek 36. Zápis sekvencí nukleotidů české izolátu ApLV, část 2 (pokračování) 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGGCTCCCAACCCAATCTGAGAGGGTCGCGAACAACACCAGCAAAGAAATACAGATGTACCGCATCAGATCGATGGAGGG 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GACTCAAGCCGTGAACTTTGGGGAAGTCACTGGCGGTAAAATAGGACCAAAGCCTGTTTTGTCAATAAAGAAATAAGGTT 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTGTGCCTTGTTTTCAGTTTCTCCAGTATTTATGCTTTTAAATAAAGTTGATCCCAACCTAATCGGGACGGCAGAGTGTG 1370 1380 1390 1400 1410 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TTTTTCTTTCAAATTCCTACTTTGCTTATTTTTGTTTTAACTAGATTTCC
Tabulka 1. Seznam nejčastěji pěstovaných kultivarů peckovin v České republice (Anonym 1, 2008). P. armeniaca L.
P. persica L.
P. domestica L.
P. avium L.
P. cerasifera L.
Velkopavlovická
Redhaven
Stanley
Kordia
Morela pozdní
Maďarská
Sunhaven
Čačanská lepotica
Napoleonova
Morellenfeuer
Karola
Cresthaven
Domácí velkoplodá
Van
Újfehértoi fürtös
Bergeron
Fairhaven
Čačanská najbolja
Burlat
Fanal
Rakovského
Dixired
Gabrovská
Karešova
Érdi bötermö
Harbinger
Požegača
Hedelfingenská
Zelená renklóda
Kaštánka
Čačanská rodná
Těchlovan
Valjevka
Granát
Tabulka 2. Rozšíření virů peckovin v České republice (Polák, 2007). PPV
PDV
PNRSV
ACLSV
ApMV
CLRV
P. domestica
74 %
2%
27 %
1%
1%
-
P. cerasifera
26 %
11 %
18 %
1,8 %
0,6 %
-
P. spinosa P. cerasus a P. avium
5%
27 %
4%
0%
0%
-
0%
25 %
22 %
-
-
1,8 %
Přílohy Tabulka 3. Mapa pokusného pole na univerzitním pozemku „P. Martucci“ ve Valenzanu (Itálie).
P. persica Spring Gold
Baracca
Baby Gold 7
Baby Gold 9
Baby Gold 6
Anderson
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
Vivian-ppc-199
Missour
Armking
Nectared
O´Henry
zdravá
zdravá
-
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
P. avium Fucillitta primizia
Moreau
Roma
Adriana
Lapins
Napolitana
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
-
-
P. armeniaca Orangred
Harcot
Bulida
Tirynthos
Haward
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
-
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
P. domestica a P. salicina Friar
Ozark premier
Burbank
Black star
Autumn giant
S. Angeleno
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
Regina d´Italia
Blue free
Stanley
President
Sangue di drago
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
zdravá
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
infikovaná
Přílohy Tabulka 4. Seznam testovaných bylinných indikátorových rostlin.
Čeleď
Druh
Čeleď
Druh
Aizoaceae
Tetragonia ssp.
Solanaceae
Nicotiana benthamiana
Amaranthaceae
Gomphrena globosa
Solanaceae
N. cavicola
Cucurbitaceae
Cucumis sativus cv. Baby
Solanaceae
N. clevelandii
Cucurbitaceae
C. sativus cv. Perseus
Solanaceae
N.glutinosa
Cucurbitaceae
Cucurbita pepo var. oleifera
Solanaceae
N. longiflora
Fabaceae
Phaseolus vulgaris cv. Novares
Solanaceae
N. occidentalis N37
Fabaceae
P. vulgaris cv. Maxidor
Solanaceae
N.occidentalis ssp. obligua
Chenopodiaceae
Chenopodium amatanticolor
Solanaceae
N. rustica
Chenopodiaceae
Ch. botrys
Solanaceae
N. sanderae
Chenopodiaceae
Ch. capitatum
Solanaceae
N.sylvestris
Chenopodiaceae
Ch. giganteum
Solanaceae
N.tabacum cv. White Burley
Chenopodiaceae
Ch. schraderian
Solanaceae
N. tabacum cv. Samsun
Chenopodiaceae
Ch. bonus-henricus
Solanaceae
N. tabacum cv. Watson
Solanaceae
Lycopersicum ssp.
Solanaceae
Physalis peruviana
Tabulka 5. Přehled primerů použitých při RT-PCR.
Název
Sekvence 5´→ 3´
Orientace
ENDr
GGAAATCTAGTTAAAACAAAAATAAG
reverzní
H-ALV
GGAATAGAGCCCCAAGAAG
forwardový
C-ALV1
AGCAAGGTAAACGCCAAC
reverzní
H-ALV1
GGAATAGAGCCCCAAGAAG
forwardový
R-ALV
GCTGGCTCTAAGGCAGCAGAAC
reverzní
F-ALV
TCAGCTCACGGAAGTTGGCG
forwardový
ANESr1
AGAGTGCAGCCCTCAGTTTG
reverzní
ANESf3
TTACCTGCTAGGCACTGTG
forwardový
NAD5as
CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA
reverzní
NAD5s
GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT
forwardový
Velikost
Lokace
produktu
produktu
Autoři předkládaná práce
779 bp
cp; 3´NTR
Nemchinov
&
Hadidi, 1998 Nemchinov &
198 bp
cp
311 bp
cp
předkládaná práce
128 bp
cp
předkládaná práce
181 bp
nad5 gene
Hadidi, 1998
Menzel 2002
et
al.,
Přílohy Tabulka 6. Přehled primerů použitých při dot-blot molekulární hybridizaci. Název
C-ALV1T7
H-ALV1T7
Sekvence 5´→ 3´
Velikost
Orientace
TAATACGACTCACTATAGGGAGCA
TAGAGCCCCAAGAAG
Autoři
produktu produktu
reverzní
AGGTAAACGCCAAC TAATACGACTCACTATAGGGGGAA
Lokace
238 bp
cp
předkládaná práce
forwardový
Tabulka 7. Sbírka izolátů ApLV použitých v předkládané studii. Izolát
Označení
Hostitelská rostlina
Původ
Palestinský
Pal
P. persica cv. Missour
Palestina (Abbadi et al., 2004)
Moldávský
Mol
P. persica GF 305
Moldávie (Nemchinov & Hadidi, 1998)
Český
Tom
P. armeniaca cv. Tomis
Česká republika (současná práce)
Tabulka 8. Seznam primerů využitých při studii genomu ApLV. Název
Sekvence 5´→ 3´
Orientace
Autoři
dRW do2
RMYTCICCISWRAAICKCAT
vedoucí
Dovas & Katis, 2003
dRW up1
WGCIAARGCIGGICARAC
reverzní
Dovas & Katis, 2003
ENDr
GGAAATCTAGTTAAAACAAAAATAAG
reverzní
předkládaná práce
FODr3
GAYTTCATRAARATUARWGC
reverzní
předkládaná práce
FODf2
CARYTVTTYCCICCWGGHTA
vedoucí
předkládaná práce
H-ALV
GGAATAGAGCCCCAAGAAG
vedoucí
Nemchinov & Hadidi, 1998
M13R-pUC(-40)
DCAGGAAACAGCTATGAC
reverzní
-
M13F(-20)
DGTAAAACGACGGCCAGT
vedoucí
-
MOLGAPR1
CAGAGGCTTCAGAGAATACG
reverzní
předkládaná práce
MOLGAPF1
TGATCCGATTGTTGTACATGC
vedoucí
předkládaná práce
MOLGAPrr3
CACAATGGTACATGGGTTGG
reverzní
předkládaná práce
MOLGAPff5
CAATAGCCATTGGTGCAGC
vedoucí
předkládaná práce
PALENDr2
GTGAACTTTGGAGAAGTC
reverzní
předkládaná práce
PALFODGAPrII
TCTTGGATAAATGGCTTCATACC
reverzní
předkládaná práce
PALFODGAPfII
AGGTGGTGGACGGCTTTRTC
vedoucí
předkládaná práce
PALGAPr1
AGATGTGTGCAGTTGTGAGC
reverzní
předkládaná práce
PALGAPf2
TGGGATTTGAACGCACTGTG
vedoucí
předkládaná práce
PALGAPrr2
CTATGAAAGCGTCAGAATACG
reverzní
předkládaná práce
PALGAPff2
GTCCTGATTTGTACGTTGC
vedoucí
předkládaná práce
R-ALV
GCTGGCTCTAAGGCAGCAGAAC
reverzní
předkládaná práce
REPs
AACCCACCTTGGGTCAAAGCTC
vedoucí
předkládaná práce
REPas
CTCATGTAAGGAGCAAACCTGC
reverzní
předkládaná práce
TOMf2
ATTCCMGACCATGRCKACAAGC
vedoucí
předkládaná práce
TOMR2
CACACCAGCTTGAGGTTCG
reverzní
předkládaná práce
Přílohy Tabulka 9. Seznam primerů využitých pro studii palestinského izolátu ApLV. Název cDNA Pal 1
Pal 2
Pal 3
Pal 4
Pal 5
Pal 6
Pal 7
Pal 8
Pal 9
Primery ENDr H-ALV PALENDr2 polyA primer dRWdo2 dRW up1 R-ALV REPs PALGAPr1 PALGAPf2 PALGAPrr2 PALGAPff2 FODr3 FODf2 PALFODGAPrI PALFODGAPfII REPas PALFODGAPfII
Ta (˚C)
Velikost cDNA
Pozice cDNA *
Pozice cDNA
60
774 bp
8529 - 9303
cp; 3´ NTR
48
198 bp + polyA
9 113 - polyA
cp; 3´ NTR
42
368 bp
5 769 - 6 137
RdRp
63
2 934 bp
6 075 - 9 009
58
1 786 bp
6 705 - 8 491
54
499 bp
7 284 - 7 783
TGB1;TGB2; TGB3
42
1 294 bp
4 438 - 5 732
RdRp
59
210 bp
4 918 - 5 128
RdRp
60
919 bp
4 918 - 5 837
RdRp
RdRp; TGB1; TGB 2; TGB 3; cp TGB1;TGB2; TGB3; cp
* dle sekvenací izolátu ApLV acc.no. NC_014821.1
Tabulka 10. Seznam párů primerů využitých pro studii moldavského izolátu ApLV.
Název cDNA Mol 1
Mol 2
Mol 3
Mol 4
Mol 5
Primery ENDr H-ALV PALENDr2 polyA primer R-ALV REPs MOLGAPr1 MOLGAPf1 MOLGAPrr3 MOLGAPff5
Ta (˚C)
Velikost cDNA
Pozice cDNA*
Pozice cDNA
60
776 bp
8529 - 9303
cp; 3´ NTR
48
198 bp + polyA
9 113 - polyA
cp; 3´ NTR
63
2 934 bp
6 075 - 9 009
54
1 652 bp
6 736 - 8 388
TGB1; TGB2; TGB3; cp
60
338 bp
7 390 - 7 728
TGB2; TGB3; cp
* dle sekvenací izolátu ApLV acc.no. NC_014821.1
RdRp; TGB1; TGB2; TGB3; cp
Přílohy Tabulka 11. Seznam párů primerů využitých pro studii českého izolátu ApLV.
Název cDNA
Primery
Ta (˚C)
Velikost cDNA
Pozice cDNA*
Pozice cDNA
60
776 bp
8529 - 9303
cp; 3´ NTR
48
198 bp + polyA
9 113 - polyA
cp; 3´ NTR
57
730 bp
7 903 - 8 632
cp
54
500 bp
7 284 - 7 783
TGB2; TGB3
ENDr
Tom 1
H-ALV PALENDr2
Tom 2
polyA primer TOMr2
Tom 3
TOMf2 PALGAPrr2
Tom 4
PALGAPff2
* dle sekvenací izolátu ApLV acc.no. NC_014821.1
Tabulka 12. Seznam a popis izolátů latentního viru meruňky a ostatních virových zástupců rodu Foveavirus.
Virus
Název izolátu
Původ izolátu
Hostitelská rostlina
Publikace
ApLV
Pal
Palestina
P. persica GF 305
předkládaná práce
ApLV
Mol
Moldávie
P. persica GF 305
předkládaná práce
ApLV
Tom
Česká republika
P. armeniaca
předkládaná práce
Acc.no.
ApLV
A18IT
NC 014821
Itálie
P. armeniaca var. Sorrentina GF 305
Youseff et al., 2011
ApLV ApLV
Cas12IT LA2FR
HQ339959 HQ339958
Itálie Francie
P. armeniaca var. Sorrentina GF 305 P. armeniaca GF 305
Youseff et al., 2011 Youseff et al., 2011
ApLV
SB12452FR
HQ339957
Francie
P. persica var. Neptune GF 305
Youseff et al., 2011
ApLV
MurES
GQ919051
Španělsko
P. armeniaca cv. Murciana
García-Ibarra et al., 2010
ApLV
NemMD
AF057035
Moldávie
P. persica
Nemchinov et al., 2000
ASPV
ASPV
FR691076
Německo
Malus spp.
Jelkman, 1994
GRSPaV
GRSPaV
NC 003462
Itálie
Vitis vinifera cv. Moscato giallo
Morelli et al., 2011
PCMoV
PCMoV
NC 009892
Kanada
P. persica
James et al., 2007
Přílohy
Složení a příprava roztoků, pufrů a médií Inokulace rostlin
0,02 M fosfátový pufr draselný s 2,5 % nikotinem. 6,15 ml 1 M K2HPO4; 3,85 ml 1 M KH2PO4; těsně před použitím 2,5 % nikotin (V/V); doplníme sterilní ddH2O do 500 ml. Skladování při 4 ˚C.
0,02 M fosfátový pufr draselný s 10 % PVP. 6,15 ml 1 M K2HPO4; 3,85 ml 1 M KH2PO4; 10 % PVP (w/V); doplníme sterilní ddH2O do 500 ml. Skladování při 4 ˚C.
0,02 M fosfátový pufr sodný. 5,77 ml 1 M Na2HPO4; 4,23 ml 1 M NaH2PO4; doplníme sterilní ddH2O do 500 ml. Skladování při 4 ˚C.
HEPES varianta A. 0,71 g HEPES; 5 g PVP; doplníme sterilní ddH2O do 100 ml. Skladování při 4 ˚C.
HEPES varianta B. 1,19 g HEPES; těsně před použitím 2,5 % nikotin; doplníme sterilní ddH2O do 100 ml. Skladování při 4 ˚C.
DAS a TAS ELISA
10X PBS (pH 7,4). 80 g NaCl, 2 g KH2PO4,11,5 g Na2HPO4, 2 g KCl, 2 g NaN3 doplníme sterilní ddH2O do 1 000 ml. Skladování v tmavé láhvi při 4 ˚C.
Extrakční pufr. 2 % PVP (w/V), 0,2 % BSA (w/V), 0.5 ml Tween 20 rozpustíme v 1 000 ml 1X PBS pufru. Skladování při 4 ˚C.
Promývací pufr. 0,5 ml Tween 20 rozpustíme v 1 000 ml 1X PBS. Skladování při 4 ˚C.
Potahovací pufr (pH 9,6). 1.59 g Na2CO3, 2,93 g NaHCO3, 0,2 g NaN3 rozpustíme v 1000 ml sterilní ddH2O. Skladování při 4 ˚C.
Substrátový pufr (pH 9,8). 9,7 ml diethanolamin, 0,2 g NaN3, 0,095 g MgCl2 rozpustíme v 1 000 ml sterilní ddH2O. Skladování v tmavé láhvi při 4 ˚C.
Izolace celkové RNA
Grinding pufr (pH 5,6). 4 M guadinin thiokyanát; 0,2 M octan sodný; 1 M octan draselný; 25 mM EDTA; 2,5 % PVP (w/V); těsně před použitím 2 % metabisulfát sodný (w/V). Skladování v tmavé láhvi při 4 ˚C.
Jodid sodný. 0,75 g Na2SO3 rozpustíme v 40 ml sterilní ddH2O a přidat 36 g NaI. Skladování v tmavé lahvi při 4 ˚C.
Promývací pufr (pH 7,5). 10 mM Tris–HCl; 0,5 mM EDTA; 50 mM NaCl. Sterilizace pomocí autoklávu. Poté přidáme absolutní etanol (50 % objemu). Skladování při 4 ˚C.
Silika suspenze (pH 2,0). Ve 250 ml sterilní ddH2O rozpustíme 30 g silika částic, směs promícháme a necháme do druhého dne sedimentovat. Následující den odstraníme horní fázi (cca 235 ml), zbylou část roztoku doplníme sterilní ddH2O do 250 ml, roztok promícháme a ponecháme 5 h sedimentovat. Odpipetujeme 220 ml horní fáze, zbylý roztok důkladně homogenizujeme. Sterilizace pomocí autoklávu. Skladování v tmavé láhvi při 4 ˚C.
Extrakční pufr pro izolaci RNA (pH 7,0). 50 mM Tris; 100 mM NaCl; 20 mM EDTA; 1 % SDS. Sterilizace pomocí autoklávu. Skladování při 4 ˚C.
Přílohy
IC pufr. 2 % PVP (w/V); 0,2 % sodium diethyl dithiocarbamate (w/V); 1X PBS. Skladování při 4 ˚C.
Elektroforetická separace nukleových kyselin
10X TBE (pH 8,0). 890 mM Tris-HCl; 890 mM kyselina boritá; 20 mM EDTA. Sterilizace pomocí autoklávu. Skladování při laboratorní teplotě.
PAGE barvící roztok. 100 mg AgNO3 rozpustíme ve100 ml sterilní ddH2O a přidáme 150 l 37 % formaldehydu. Příprava těsně před využitím.
PAGE vyvíjející roztok. 3g CaCO3 rozpustíme v 100 ml sterilní ddH2O a přidáme 150
l 37 %
formaldehydu a 6 l roztoku thiosulfátu sodného (200 mg/ml). Příprava těsně před využitím.
Dot-blot molekulární hybridizace
20× SSC (pH 7,0). 3 M NaCl; 0,3 M Na3 Citrát. Sterilizace pomocí autoklávu. Skladování při 4 ˚C.
Pufr maleinové kyseliny (pH 7,5). 0,1 M maleinová kyselina; 0,15 M NaCl. Skladování při 4 ˚C.
10 × Blocking reagent. 10 % zásobní Blocking reagent Roche (w/V) rozpustíme při konstantním zahřívání při 65 ˚C v pufru maleinové kyseliny. Skladování při 4 ˚C.
Hybridizační roztok. 5× SSC; 0,5 ml 10× Blocking reagent Roche; 0,1 % N-Lauroylsarcosine sodium salt; 0,02 % SDS (w/V); 50 % formami (V/V). Skladování při 4 ˚C.
Promývací hybridizační roztok A. 2× SSC; 0,1 % SDS. Skladování při 4 ˚C.
Promývací hybridizační roztok B. 0,1× SSC; 0,1 % SDS. Skladování při 4 ˚C.
Promývací hybridizační roztok C (pH 7,5). 0,1 M maleinová kyselina; 0,15 M NaCl; 0,3 % Tween 20 (V/V). Skladování při 4 ˚C.
10× blokovací roztok. Součást DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche).
Detekční pufr (pH 9,5). 0,1 M Tris-HCl; 0,1 M NaCl. Skladování při 4 ˚C.
Detekční roztok s protilátkou. Protilátky centrifugujeme (10 000 × g, 5 min), poté odebereme přímo z povrchu potřebné množství protilátky a smísíme s 1X blokovacím roztokem v poměru 1 : 5 000. Skladování při 4 ˚C max. 12 hod.
Detekční substrátový roztok. 200 μl NBT/BCIP rozpustíme v 10 ml detekčního pufru. Skladování při 4 ˚C max. 12 hod. Příprava těsně před použitím.
TE pufr (pH 7,5). 10 mM Tris; 1 mM EDTA. Skladování při 4 ˚C.
dsRNA analýza
10X STE (pH 6,8). 1 M NaCl; 0,5 M Tris; 0,01M EDTA. Skladování při 4 ˚C.
10X dsRNA elektroforetický pufr (pH 7,8). 0,04 M Tris; 0,02 M octan sodný; 0,001 M EDTA. Skladování při 4 ˚C.
EG pufr. 10 ml 10X dsRNA elektroforetický pufr, 20 ml glycerol a 0,01 g bromofenolová modř rozpustíme v 70 ml sterilní ddH2O. Skladování při 4 ˚C.
Přílohy Kultivace bakteriálních buněk
LB médium tekuté (pH 7,0). 20 g LB rozpustíme v 1 000 ml sterilní ddH2O. Sterilizace pomocí autoklávu. Skladování při 4 ˚C.
LB médium s agarem a ampicilinem (pH 7,0). 35g LB s agarem rozpustíme v 1 000 ml sterilní ddH2O. Sterilizace pomocí autoklávu. Po vychladnutí na 60 ˚C přidáme ampicilin v koncentraci 100 μg/ml a rozlijeme do Petriho misek. Skladování při 4 ˚C.
Seznam publikovaných prací
Seznam publikovaných prací Impaktovaná publikace Grimová L., Bazzoni A., Ryšánek P., Palmisano P., Zouhar M., Minafra A., Savino V. (2010): Biological characterization and variability in the coat protein gene of an isolate of Apricot latent virus. Journal of Plant Pathology, 92, 1: 111-116. Vědecká publikace v recenzovaném časopise Grimová L., Zouhar M., Ryšánek P. (2008): Studies of Apricot latent virus in the Czech Republic. Acta Horticulturae, 781: 75-77. Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M. (2010): Vývoj a optimalizace laboratorních technik pro detekci ApLV. In: Badalíková B., Bartlová J. (eds.), Vědecká příloha časopisu Úroda, 58, 12: 255258. Příspěvek ve sborníku z vědecké konference (úplná struktura vědeckého článku) Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M., Bazzoni A., Savino V. (2007): Biologická charakteristika latentního viru meruňky (Apricot latent virus, ApLV) na dřevinných hostitelích. In: Zouhar M., Mazáková J., Ryšánek P. (eds.), Sborník příspěvků z konference „II. konference doktorandů ochrany rostlin“, 26.09.2007, ČZU Praha, Česká republika, p. 5-32, ISBN: 978-80-213-1710-9. Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M., Bazzoni A., Minafra A., Palmisano F., Savino V. (2008). Biologická charakteristika latentního viru meruňky (Apricot latent virus, ApLV). In: Zouhar M. (ed.), Sborník příspěvků z konference „III. konference doktorandů ochrany rostlin“, 26.09.2008, ČZU Praha, Česká republika, s. 8-16, ISBN: 978-80-213-1881-6. Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M. (2010): Optimalizace laboratorních metod pro detekci latentního viru meruňky. In : Maršálek (ed.), Sborník příspěvků z konference „Studentská vědecká konference 2010 Věda má budoucnost“, 30.04.2010, Ostravská univerzita v Ostravě, s. 31-34, IBSN 978-80-7368-719-9. Abstrakt ve sborníku z vědecké mezinárodní konference včetně posterů Grimová L., Zouhar M., Ryšánek P. (2006): Development of RT- PCR for detection of Apricot latent virus and its survey in the Czech Republic. In: Herda G., Mazáková J., Zouhar M. (eds.), Sborník abstraktů z „XVII. Česká a slovenská konference o ochraně rostlin Praha“, 12.09.14.09.2006, ČZU Praha, Česká republika, p. 39-44, ISBN:80-213-1564-4. Ryšánek P., Zouhar M., Grimová L., Hassan M. (2007): Survey of some viruses and viroids on stone fruits in the Czech Republic. In: Sborník abstraktů z konference „International Symposium On Viruses of Ornamental and Temperate Fruit Crops“, 17.12.2007, Palampur, India, p. 14.
Seznam publikovaných prací Ryšánek P., Zouhar M., Grimová L., Hassan M., Ketta H. (2007): Occurrence of some viruses and viroids on stone fruits in the Czech Republic. In: Sborník abstraktů z konference „10th Internatinal Plant Virus Epidemiology Symposium“, 15.10.2007, Patancheru, India, p. 120. Grimová L., Bazzoni A., Zouhar M., Palmisano F., Ryšánek P., Minafra A., Savino V. (2009): Biological characterization of Apricot latent virus and its survey in the Czech Republic. In: Journal of Plant Pathology, Sborník abstraktů z konference „XV Congresso Nazionale di Patologia Vegetale Locorotondo“, Societa Italiana di Patologia Vegetale, Locorotondo, Italy, 28.09.-30.09.2009, 91 (4): S4.64. Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M., Bazzoni A., Zouhar M., Minafra A., Palmisano F., Savino V. (2009):
Biological characterization of Apricot latent virus (ApLV). In: Sborník abstraktů z
konference „21st International Conference on Virus and other Graft Transmissible Diseases of Fruit Crops“, Braunschweig, Německo, Julius Kuhn Institute, Neustadt, Německo, 05.07.2009, p. 58, ISBN: 1866-590X. Grimová L., Bazzoni A., Zouhar M., Palmisano F., Ryšánek P., Minafra A., Savino V. (2009): Biological characterization of Apricot latent virus (ApLV). In: Sborník abstraktů z konference „XVIII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin Brno“, 02.09.2009, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Česká Republika, p. 18, ISBN: 978-80-7375-316-0. Grimová L., Ryšánek P., Zouhar M. Bazzoni A., Minafra A., Palmisano P., Savino V. (2010): Development of several laboratory assays for the detection of Apricot latent virus. In: Sborník abstraktů z konference „11th International Plant Virus Epidemiology Symposium and 3rd Workshop of the Plant Virus Ecology Network“; 20.06.- 24.06.2010, Cornell University, Ithaca, New York, USA, (nestránkováno).
