Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS) dan Kadar Malondialdehida (MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia The Therapeutic Effect of Goat Milk Yogurt to Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS) Expression and Malondialdehyde (MDA) Levels in Aorta of Animal Model (Rattus norvegicus) Hypercholesterolemia
Muhammad Sugiarto*, Masdiana C. Padaga, Dyah K. Wuragil Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya *
[email protected]
ABSTRAK Hiperkolesterolemia adalah kondisi ketika kolesterol yang beredar di dalam darah melebihi batas normal. Diet yang kaya akan kolesterol dan lemak jenuh dapat menekan pembentukan reseptor Low Density Lipoprotein (LDL) sehingga meningkatkan jumlah kolesterol yang beredar di dalam darah, keadaan ini dapat memicu terjadinya kondisi hiperkolesterolemia. Yogurt susu kambing memiliki kandungan seperti antioksidan, bakteri asam laktat (BAL) dan biopeptida yang dapat menurunkan kadar kolesterol plasma sehingga dapat digunakan sebagai alternatif penurun kolesterol. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh terapi yogurt susu kambing terhadap ekspresi inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS) dan kadar malondialdehida (MDA) pada aorta. Penelitian ini menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan berumur 10-12 minggu yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok kontrol yang diberi pakan diet hiperkolesterol, kelompok tikus yang diberi pakan hiperkolesterol dan terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB. Analisis statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah one way Analisis of Variance (ANOVA) dengan uji lanjutan Tukey 5%. Terapi yogurt susu kambing berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap ekspresi iNOS yang ditunjukkan dengan penurunan ekspresi iNOS pada aorta tikus hiperkolesterolemia. Ekspresi iNOS pada terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis optimal dalam menurunkan ekspresi iNOS yang menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol. Terapi dosis 900 mg/kg BB memberikan hasil optimal yang tidak berbeda nyata dengan kontrol. Penelitian ini menunjukkan terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB mampu menurunkan ekspresi iNOS 69,7% dan menurunkan kadar MDA 50,04% pada aorta tikus hiperkolesterolemia. Kata kunci : Hiperkolesterolemia, Yogurt susu kambing, inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS) dan Malondialdehida (MDA).
1
ABSTRACT Hypercholesterolemia is a state when the cholesterol level on the blood over the normal range. The consumption of high cholesterol and saturated fatty acid can suppress the formation of Low Density Lipoprotein (LDL) receptor that increase cholesterol level on the blood and triggers hypercholesterolemia. Goat milk yogurt contains antioxidant, probiotics of lactic acid bacteria, and biopeptide to decrease cholesterol levels. The purpose of this research was to study therapeutic effect of goat milk yogurt to inducible nitric oxyde synthase (iNOS) expression and malondialdehyde (MDA) levels in aorta. This research used male Rattus norvegicus, aged 10-12 weeks, devided into five groups: control group, hypercholesterolemic group, hypercholesterolemic with goat milk yogurt therapy dose of 300 mg/kg BW, 600 mg/kg BW, and 900 mg/kg BW. This research were analysed using one way Analysis of Variance (ANOVA), continued by Tukey test (p<0.05). The therapeutic goat milk yogurt resulted significantly different (p<0.05) of iNOS expression in aorta. iNOS expression in therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW was an optimum dose in decreasing iNOS expression that was not significantly different with control group. MDA level in theraupeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW not significantly different from normal rat. The therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW gave an optimilized result that was not significantly different with control. This research also showed the goat milk yogurt therapy dose of 900 mg/kg BW had a potential to decrease iNOS expression to be 69.7% and decrease MDA levels to be 50.04% in aorta of hypercholesterolemic rat. Keywords: Hypercholesterolemia, Goat Milk Yogurt, iNOS, MDA. PENDAHULUAN Penyakit jantung koroner merupakan salah satu penyakit kardiovaskuler yang menyebabkan kematian. Salah satu penyebabnya yaitu hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia adalah suatu keadaan dimana kadar kolesterol darah melebihi batas normal, karena asupan dan perombakan kolesterol tidak seimbang (Dalimartha, 2008). Aterosklerosis merupakan suatu kelainan yang terdiri atas pembentukan fibrolipid dalam bentuk plak-plak yang menonjol atau penebalan yang disebut ateroma yang terdapat di dalam tunika intima dan bagian dalam tunika media pembuluh darah arteri (Gani, 2013). Resiko terjadinya penyakit jantung koroner meningkat pada peningkatan kadar kolesterol LDL dalam darah (Butterfield, 2006). Menurut Bastard (2006) LDL yang tinggi dalam darah akan menempel dan menumpuk pada dinding pembuluh darah. Radikal bebas dan LDL akan bereaksi menyebabkan terjadinya LDL teroksidasi. LDL teroksidasi akan menempel pada
endotel dan menyebabkan kerusakan selsel endotel. Kerusakan ini akan memicu teraktivasinya makrofag sehingga akan meningkatkan produksi mediatormediator inflamasi atau sitokin proinflamasi seperti tumor necrosis factor (TNF), interleukin (IL) serta interferon gamma (IFN- γ). Peningkatan mediatormediator inflamasi ini akan memacu peningkatan produksi nitric oxide (NO) dalam jumlah besar melalui aktivasi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS). Tubuh dalam keadaan hiperkolesterolemia akan berusaha untuk menyeimbangkan kadar kolesterol dengan cara sintesis asam empedu. Semakin banyak asam empedu yang disintesis maka semakin banyak pula radikal bebas yang dihasilkan sebagai hasil sampingan. Bila produksi radikal bebas terjadi secara berlebih, maka enzim antioksidan tubuh tidak mampu mengatasinya (Wresdiyati dkk, 2006). Menurunnya enzim antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh akan menyebabkan H2O2 oleh pereaksi 2
fenton akan diubah menjadi radikal hidroksil (OH-) yang bersifat lebih toksik terhadap senyawa PUFA. Radikal bebas akan terbentuk terus-menerus dan berperan dalam oksidasi LDL. Salah satu indikator terjadinya oksidasi LDL adalah malondialdehida (MDA). Malondialdehida digunakan sebagai tolak ukur dari banyaknya radikal bebas di dalam tubuh. Semakin tinggi kadar MDA maka semakin tinggi pula jumlah radikal bebas dalam tubuh. Salah satu metode pengukuran MDA adalah dengan Thiobarbituric Acid Reactivity Test (Ratnawati, 2010). Dalam penelitian yang dipublikasi The American Journal of Clinical Nutrition, susu kambing terbukti mempercepat pembakaran lemak rendah kolesterol dan kadar laktosa lebih rendah 13% dari susu sapi dan 41% lebih rendah dari air susu ibu. Susu kambing tidak mengandung beta-lactoglobulin, senyawa ini sering disebut sebagai pemicu reaksi alergi. Susu kambing memiliki potensi yang besar sebagai pembawa bakteri probiotik karena memiliki komposisi bahan yang relatif baik, yang dapat mendukung ketersediaan energi bagi fungsi dan aktifitas metabolisme bakteri probiotik di dalamnya. Yogurt terbuat dari susu yang kemudian ditambahkan dengan bakteri yang akan membentuk asam laktat. Bakteri yang digunakan dalam proses pembuatan yogurt adalah bakteri Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, dan Streptococcus thermophilus. Berdasarkan penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa bakteri asam laktat berpotensi menurunkan kadar kolesterol darah karena bakteri dalam produk tersebut menghasilkan asam-asam organik seperti asam propionat dan asam laktat yang dapat berperan sebagai agen penurun kadar kolesterol darah (Muti, 2002). Bakteri asam laktat mampu memetabolisme kolesterol dari makanan dalam usus halus sehingga tidak diserap oleh tubuh. Bakteri asam laktat memiliki kemampuan mendekonjugasi garam empedu karena
aktivitas Bile salt hydrolase (BSH) (Liong dan Shah, 2005). Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh enzim BSH yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau terdekonjugasi. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian yogurt susu kambing sebagai bahan terapi hiperkolesterol berdasarkan gambaran ekspresi iNOS dan kadar MDA pada organ aorta hewan model tikus (Rattus norvegicus) wistar jantan yang mendapat diet hiperkolesterolemia. MATERI DAN METODE Preparasi Hewan Coba Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol (A), kelompok hiperkolesterolemia (B), hiperkolesterolemia dan terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB (C), dosis 600 mg/kg BB (D), dan dosis 900 mg/kg BB (E). Masing-masing kelompok perlakuan terdiri dari empat ekor tikus sebagai ulangan. Hewan coba menggunakan hewan coba tikus (Rattus norvegicus) yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dengan umur 10-12 minggu dan berat badan sekitar 150 gram. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini mendapatkan persetujuan laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya, No: 217-KEP-UB. Pembuatan Diet Hiperkolesterol Pakan hiperkolesterol dibuat dengan mencampurkan minyak babi, asam kolat dan kuning telur puyuh rebus. Hasil campuran kemudian dilarutkan dengan akuades sebanyak 2 ml. Pakan diet hiperkolesterol diberikan setiap hari selama 14 hari dan disondekan pada masing-masing tikus. Pakan standar yang diberikan sebanyak 20 g/ekor/hari (Gani, 2013). Komposisi bahan pakan
3
hiperkolesterol dalam 20 gram pakan dapat dilihat pada Tabel 1.
hiperkolesterolemia selama 14 hari. Kelompok tikus yang diberikan terapi yaitu kelompok C, D, dan E dengan dosis berturut-tutut sebesar 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB. Terapi diberikan secara per oral dengan sonde lambung sebanyak 1,5 ml selama 28 hari.
Tabel 1. Komposisi bahan pakan hiperkolesterol dalam 20 gram pakan Bahan Jumlah Jumlah Kandungan Bahan (%) (gram) Asam 0,1 0,02 kholat Minyak 10 2 babi Kuning 5 1 telur puyuh
Pembuatan Kurva Baku MDA Larutan stok kit standar MDA dengan konsentrasi sebesar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 mg/mL diambil masing-masing 100 μL. Larutan dimasukkan ke tabung reaksi yang berbeda dan ditambahkan 550 μL akuades dan 100 μL TCA 100% lalu dihomogenkan degan vortex. Larutan ditambahkan 250 μL HCl 1N dan 100 μL Na-Thio 1% ke dalam tabung dan dihomogenkan. Sentrifugasi pada kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Setelah itu, dipanaskan selama 30 menit dalam suhu 1000C. Larutan didiamkan pada suhu ruang lalu supernatan diambil dan larutan standar kemudian dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimun dan hasil absorbansi MDA larutan baku dan dibuat kurva.
Pembuatan Starter Yogurt Susu Kambing Susu kambing 100 ml dituangkan ke dalam erlenmeyer 250 ml steril lalu ditutup dengan aluminium foil. Susu dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit, kemudian didinginkan hingga suhu turun sampai 40oC-45oC. Starter ditimbang sebanyak 0,5 gram lalu dicampur sedikit dengan susu kambing dan dihomogenkan. Inokulasi starter selanjutnya dilakukan ke dalam susu kambing 100 ml (w/v). Inkubasi dilakukan pada suhu 40 oC-45oC selama 4-8 jam dan sampai pH rata-rata yogurt sekitar 4,00-4,5 (Posecion et al., 2005).
Pengukuran Kadar MDA Aorta dengan berat 0,5 gram dimasukkan ke dalam mortar dingin dan digerus hingga halus. Ditambahkan 500 μl NaCl 0,9% dan dihomogenkan. Homogenat diambil dan dipindahkan ke tabung microtube. Disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan diambil supernatannya. Supernatan sebanyak 100 μL dimasukkan ke dalam microtube, ditambah 550 μl akuades dan dihomogenkan. Dimasukkan 100 μl TCA 100% dan dihomogenkan. Ditambahkan 100 μL HCL 1 N dan Na-Thio 1 % sebanyak 100 μL dan dihomogenkan. Mulut tabung ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam water bath 1000C selama 10 menit. Didinginkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan supernatannya diambil untuk dipindah ke tabung
Pembuatan Yogurt Susu Kambing Susu kambing 485 ml dituangkan ke dalam botol tutup berulir 1000 ml lalu ditutup dengan aluminium foil. Susu dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit kemudian didinginkan hingga suhu susu turun sampai 40oC-45oC. Inokulasi starter dengan kosentrasi 3% ke dalam susu kambing 485 ml (v/v) lalu dihomogenkan secara perlahan. Inkubasi dilakukan pada suhu 40oC-45oC selama 48 jam dan sampai pH rata-rata yogurt sekitar 4,5-5 (Posecion et al., 2005). Yogurt susu kambing dijadikan kering beku dan disimpan pada suhu 4-5oC. Pemberian Terapi Yogurt Susu Kambing Terapi yogurt susu kambing diberikan setelah tikus diinduksi diet 4
microtube. Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum (Aulanni’am et al., 2012).
acak untuk setiap kelompok perlakuan menggunakan software Axio Vision. Analisa Data Data yang diperoleh dari hasil pengukuran ekspresi iNOS dan kadar MDA pada aorta dianalisis dengan suatu program SPSS versi 16.0 dengan melakukan uji analisis varian (ANOVA) dan dilakukan analisis lebih lanjut dengan uji Tukey (α = 5 %), apabila terdapat perbedaan yang nyata.
Pengamatan Ekspresi iNOS Preparat direndam dalam larutan xylol 1, xylol 2 kali, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80% dan alkohol 70% dan akuades steril masing-masing selama 2 menit. Disimpan selama 24 jam pada suhu 4oC. Preparat dicuci dalam PBS pH 7,4 dan direndam dalam 3% Hidrogen Peroksida (H2O2) selama 10 menit (dalam PBS) dan dicuci dalam PBS pH 7,4, direndam dalam 1% BSA selama 1 jam pada suhu ruang. Preparat ditetesi dengan antibodi primer, anti-rat iNOS (dalam BSA 1% dalam PBS) 1:100 dan diinkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam. Preparat dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan selama 30 menit dalam suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4. Ditambahkan antibody sekunder, anti rabbit labelled biotin dalam PBS (1:200) selama 1 jam pada suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditambahkan SA-HRP dalam PBS (1:500) selama 40 menit pada suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditambahkan kromogen DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride) selama 20 menit pada suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Dilakukan counter staining dengan pewarna Major hematoxylin secukupnya hingga warna biru terlihat, dibilas dengan air 2x5 menit dan akuades steril 1x5 menit, dibiarkan semalam dalam suhu ruang. Dilakukan mounting dengan entellan. Hasil akhir diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran sedang (400x). Keberadaan iNOS pada aorta yang diamati melalui metode imunohistokimia (IHK) dianalisis secara kualitatif dengan cara membandingkan distribusi iNOS pada sediaan histologi aorta kontrol dengan perlakuan pada perbesaran rendah (400x) yang kemudian dibandingkan penghitungan per luas bidang pandang pada 5 seri sayatan yang diambil secara
HASIL DAN PEMBAHASAN Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Kadar Malondialdehida (MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Rata-rata hasil kadar MDA aorta pada kelompok perlakuan (Tabel 2) menunjukkan adanya perbedaan nyata antar perlakuan (p<0,05). Tabel 2. Rata-rata kadar MDA aorta pada kelompok perlakuan Rata-rata Penurunan Kelompok kadar MDA (%) (μg/ml) A 1,72 ± 0,51a c B 4,41 ± 0,44 C 3,75 ± 0,48bc 14,80 D 2,81 ± 0,38ab 36,10 a E 2,20 ± 0,19 50,04 Keterangan : (A) Kontrol ; (B) Hiperkolesterolemia (C) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 300 mg/kg BB ; (D) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 600 mg/kg BB ; (E) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a, b dan c menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok perlakuan. Berdasarkan rata-rata kadar pada Tabel 2 rata-rata kadar tertinggi didapatkan pada hiperkolesterolemia yang berbeda dengan tikus hiperkolesterolemia 5
MDA MDA tikus nyata yang
diterapi yogurt susu kambing 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB, namun tidak berbeda nyata dengan tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB. Hal ini menunjukkan terapi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB mampu menurunkan kadar MDA aorta tetapi memiliki pengaruh yang berbeda. Dosis terapi yogurt susu kambing yang paling berpotensi untuk menurunkan kadar MDA aorta yaitu dosis 900 mg/kg BB dengan intensitas penurunan kadar MDA aorta sebesar 50,04%. Peningkatan kadar MDA yang tinggi sebesar 156% terjadi pada tikus kelompok hiperkolesterolemia. Kadar MDA yang tinggi mengindikasikan meningkatnya jumlah radikal bebas yang diakibatkan karena hiperkolesterolemia. Peningkatan radikal bebas mengakibatkan stres oksidatif yaitu jumlah radikal bebas lebih banyak dari jumlah antioksidan dalam tubuh. Diet hiperkolesterol mampu meningkatkan jumlah radikal bebas dalam tubuh yang merupakan hasil samping dari sintesis asam empedu dari hati. Reaksi 7αhidroksilasi merupakan tahap pertama pada biosintesis asam empedu yang memerlukan oksigen, NADPH dan sitokrom p-450. Menurut Wresdiyati dkk. (2006) pada kondisi hiperkolesterolemia, tubuh akan berusaha menyeimbangkan kolesterol dalam tubuh dengan cara mengubah kolesterol menjadi asam empedu. Semakin banyak asam empedu yang disintesis, semakin banyak oksigen yang diperlukan. Peningkatan tersebut akan menghasilkan radikal bebas O2sebagai hasil sampingan. Radikal bebas dalam jumlah yang berlebihan dapat berpotensi untuk menimbulkan kerusakan membran yang merupakan akibat dari peristiwa peroksidasi lipid, yaitu reaksi berantai radikal bebas oleh radikal hidroksil (OH·) yang sangat reaktif dapat bereaksi dengan lipid membran, yaitu polyunsaturated fatty acid (PUFA) sehingga terbentuk Malondialdehida (MDA), suatu radikal
bebas hasil metabolit reaktif peroksidasi lipid yang umumnya digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid untuk menilai stress oksidatif. Radikal bebas dapat diukur dengan mengetahui kadar peroksidasi lipid, yaitu pengukuran kadar MDA jaringan yang dilakukan dengan metode TBA. MDA dapat diidentifikasi sebagai produk hasil dekomposisi asam amino kompleks, karbohidrat, pentosa dan heksosa. MDA juga merupakan produk yang dihasilkan oleh radikal bebas. Pengukuran MDA dengan TBA didasarkan pada reaksi antara MDA dan TBA dalam suasana asam. Penurunan kadar MDA terendah didapatkan pada tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing 900 mg/kg BB yang tidak berbeda nyata dengan tikus kontrol dengan penurunan sebesar 50,04%. Hal ini menunjukkan bahwa tikus hiperkolesterolemia yang mendapat terapi yogurt susu kambing dapat menurunkan kadar MDA aorta. Penurunan kadar MDA dikarenakan adanya antioksidan dan bakteri asam laktat (BAL) yang terdapat dalam yogurt susu kambing. Antioksidan di dalam yogurt susu kambing seperti vitamin C dan E mampu berikatan dengan radikal bebas, sehingga peroksidasi lipid pun dapat dicegah. Vitamin C Sebagai antioksidan dapat langsung bereaksi dengan anion superoksida, radikal hidroksil, oksigen singlet dan lipid peroksida. Vitamin C sebagai reduktor akan mendonorkan satu elektron membentuk semidehidroaskorbat yang tidak bersifat reaktif dan selanjutnya mengalami reaksi disproporsionasi membentuk dehidroaskorbat yang bersifat tidak stabil. Dehidroaskorbat akan terdegradasi membentuk asam oksalat dan asam treonat. Vitamin E sebagai sumber antioksidan yang larut dalam lemak dan mudah memberikan hidrogen dari gugus hodroksil (OH) pada struktur cincin ke radikal bebas. Cara kerja vitamin E dengan cara mencari, bereaksi, dan merusak rantai reaksi radikal bebas serta mencegah lipid
6
peroksidasi dari asam lemak tak jenuh dalam membran sel. Penelitian Rival (2001) menyatakan bahwa biopeptida dalam yogurt susu kambing mampu menangkap radikal bebas salah satunya yaitu laktoferin. Menurut Artym (2003) laktoferin merupakan extraceluller iron binding. Iron (besi) intraseluler disimpan dalam bentuk ferritin, sedangkan ekstraseluler terikat oleh protein transferin atau laktoferin. Besi yang tidak terikat akan mengkatalis produksi ROS melalui reaksi fenton yang akan mengubah H2O2 menjadi radikal hidrosil (OH-) yang bersifat toksik terhadap senyawa lipid tidak jenuh. Melalui biopeptida laktoferin besi akan diikat, sehingga pembentukan ROS terhambat dan jumlah ROS di dalam tubuh juga akan berkurang. Muti (2002) menyatakan bakteri asam laktat (BAL) sebagai probiotik alternatif penurun kolesterol memiliki kemampuan bertahan terhadap garam empedu, kondisi asam, dapat mengikat kolesterol dengan menempel pada dinding saluran pencernaan dan mampu menghambat bakteri patogen dengan cara menghasilkan senyawa anti mikroba seperti bakteriosin. Bakteriosin adalah toksin yang menyerupai protein yang disekresikan oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain. Menurut penelitian Liong dan Shah (2005) bakteri asam laktat mampu memetabolisme kolesterol dari makanan dalam usus halus sehingga tidak diserap oleh tubuh. Bakteri asam laktat memiliki kemampuan mendekonjugasi garam empedu karena aktivitas Bile salt hydrolase (BSH). Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh enzim BSH yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan garam empedu terdekonjugasi dalam bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Hal ini menyebabkan garam empedu yang
kembali ke hati selama sirkulasi enterohepatik menjadi berkurang, sehingga total kolesterol dalam tubuh menjadi berkurang. Beberapa jenis BAL memiliki dinding sel yang mampu mengikat kolesterol dalam usus halus sebelum kolesterol diserap oleh tubuh. Pemberian terapi yogurt susu kambing dalam penelitian ini menunjukkan adanya penurunan kadar MDA. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam menurunkan kadar MDA aorta tikus hiperkolestreolemia yang menghasilkan penurunan mendekati normal. Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) Pada Aorta Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Hasil penelitian pada kelompok tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing dibandingkan dengan kelompok tikus hiperkolesterolemia menunjukkan penurunan ekspresi iNOS. iNOS merupakan enzim penanda adanya inflamasi dan diinduksi oleh sitokin yang akan menghasilkan NO dalam jumlah yang besar. Sitokin-sitokin proinflamasi yang muncul pada saat terjadinya inflamasi akan menstimulus iNOS pada sel otot polos. NO dihasilkan salah satunya di sel otot polos yang dibentuk dari asam amino L-arginin oleh Nitric Oxyde Synthase (NOS) menjadi L-citrulin dan NO. Ekspresi iNOS diamati pada preparat aorta dengan metode imunohistokimia. Ekspresi iNOS ditunjukkan dengan warna coklat yang menunjukkan dua reaksi antara iNOS pada jaringan dengan antibodi yang ditambahkan (antibodi primer antiiNOS, anti rabbit labeled biotin, Strep avidin horseradish peroxidase dan kromagen DAB) dapat dilihat pada Gambar 1.
7
A
B
C
D
E
Gambar 1. Ekspresi iNOS Pada Aorta (400x) Keterangan: (A) kontrol; (B) Hiperkolesterolemia; (C) Hiperkolesterolemia yang diterapi yoghurt dosis 300 mg/kg BB; (D) Hiperkolesterolemia yang diterapi yoghurt dosis 600 mg/kg BB; (E) Hiperkolesterolemia yang diterapi yoghurt dosis 900 mg/kg BB dan tanda panah menunjukkan ekspresi iNOS.
8
Ekspresi inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS) pada kelompok normal atau kontrol terlihat muncul namun dalam intensitas yang rendah (2,26 ± 1,25) (Gambar 1 A), sedangkan pada tikus hiperkolesterolemia ekspresi iNOS terlihat mengalami kenaikan (15,65 ± 1,73) yang tersebar pada tunika media (Gambar 1 B). Ekspresi iNOS pada kelompok tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing menunjukkan penurunan intensitas pada bagian tunika media dibandingkan dengan kelompok tikus hiperkolesterolemia (Gambar 1 C, D, E). Hasil analisa statistik menggunakan SPSS. 16 dan hasil uji lanjutan menggunakan uji Tukey menunjukkan bahwa pemberian pakan hiperkolesterol dan terapi yogurt susu kambing menyebabkan perbedaan yang signifikan terhadap ekspresi iNOS aorta (p<0,05) yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Ekspresi iNOS pada tikus normal terjadi karena adanya apoptosis pada sejumlah sel (Mahdi, 2008). Rata-rata ekspresi iNOS tertinggi didapatkan pada tikus hiperkolesterolemia yang berbeda nyata dengan tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB. Dosis terapi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB tidak berbeda nyata dengan dosis 600 mg/kg BB namun berbeda nyata dengan dosis 900 mg/kg BB. Hal ini menunjukkan terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB mampu menurunkan ekspresi iNOS aorta tetapi memiliki pengaruh yang berbeda. Peningkatan ekspresi iNOS aorta yang tinggi sebesar 116% terjadi pada kelompok hiperkolesterolemia. Peningkatan ekspresi iNOS ini mengindikasikan adanya inflamasi yang diakibatkan radikal bebas karena kondisi hiperkolesterolemia. Menurut penelitian Djatmiko (2010), Nitric oxide (NO) merupakan radikal bebas yang dibentuk dari asam amino Larginin oleh Nitric Oxide Synthase (NOS). NO banyak terdapat pada kondisi inflamasi. Kerusakan sel endotel diakibatkan oleh LDL yang teroksidasi yang akan melepaskan anionsuperoksida (O2-), dimana endotel menjadi lebih permeabel terhadap lipoprotein, sehingga LDL penetrasi ke dinding vascular dan menuju tunika intima. LDL oksidasi kemudian merangsang ekspresi dari Vascular Cell Adhesion Molecule – 1 (VCAM-1) dan Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) yang akan menarik monosit ke dinding arteri dan monosit berdiferensiasi menjadi makrofag sebagai respon atas diproduksinya Monocyte Colony Stimulating Factor (MCSF). Menurut Chapman dan Kontush (2006), LDL oksidasi akan difagositosis oleh makrofag sehingga makrofag penuh dengan lemak yang biasa disebut dengan sel busa (Foam cell). Sel busa akan memacu keluarnya sitokin-sitokin proinflamasi seperti TNF-α, IL-1, dan
Tabel 3. Rata-rata ekspresi iNOS aorta pada kelompok perlakuan Rata-rata Penurunan Kelompok ekspresi (%) iNOS A 2,26 ± 1,25a c B 15,65±1,73 C 9,75 ± 0,94b 37,6 D 7,86 ± 0,38b 49,7 a E 4,74 ± 0,31 69,7 Keterangan : (A) Kontrol ; (B) Hiperkolesterolemia (C) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 300 mg/kg BB ; (D) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 600 mg/kg BB ; (E) Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a, b dan c menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok perlakuan. Berdasarkan rata-rata ekspresi iNOS aorta pada Tabel 3 rata-rata ekspresi iNOS terendah didapatkan pada tikus normal yang tidak berbeda nyata dengan tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB. 9
iNOS. Menurut Bray (2006), ROS akan menyebabkan aktifnya Nuclear Factor Kappa Beta (NF-κB) dengan cara ROS akan menginisisai cascade serin sehingga iKB akan mengalami fosforilasi (penambahan fosfat) sehingga ikatan antara NF-κB dan iKB terlepas, NF-κB akan berpindah ke dalam inti sel sehingga menginduksi keluarnya sitokin-sitokin proinlamasi. Penurunan ekspresi iNOS aorta terendah didapatkan pada tikus hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing 900 mg/kg BB yaitu sebesar 69,7% dari tikus hiperkolesterolemia. Menurut Mirsha (2008) penurunan ekspresi iNOS menunjukkan adanya biopeptida aktif dan vitamin yang terkandung dalam yogurt susu kambing. Biopeptida aktif, vitamin dan kandungan BAL yang terkandung dalam yogurt susu kambing mampu untuk mengurangi jumlah radikal bebas dalam tubuh, sehingga ekspresi iNOS yang terbentuk pada kondisi hiperkolesterolemia dapat menurun. Biopeptida aktif seperti laktoferin yang terkandung di dalam yogurt susu kambing mampu menurunkan sitokin proinflamasi iNOS melalui peranan NF-κB. Mekanisme penurunan aktivasi NF-κB tersebut, antara lain melalui biopeptida laktoferin besi akan diikat, sehingga pembentukan ROS terhambat dan jumlah ROS di dalam tubuh juga akan berkurang. Berkurangnya jumlah ROS akan menghambat translokasi NF-κB ke dalam nucleus, menghambat fosforilasi iKB, menghambat aktivasi gen yang mengkode transaktivasi NF-κB dan degradasi iKB ataupun hambatan degradasi iKB oleh proteasome. Penurunan aktivasi NF-κB mengakibatkan turunnya signaling NF-κB pada sel imun sehingga meregulasi turunnya iNOS. Berkurangnya ROS dalam tubuh dapat mencegah terjadinya LDL oksidasi sehingga kerusakan endotel pembuluh darah dapat berkurang. Sesuai dengan penelitian Pribadi (2009), bahwa antioksidan bekerja mencegah proses
oksidasi dari LDL dengan cara menangkap radikal bebas, sehingga tidak akan terjadi oksidasi LDL. Pendapat tersebut didukung oleh Brasier et al. (2002), antioksidan merupakan penangkap dari radikal bebas yang kuat, dapat menurunkan adhesi monosit terhadap sel endotel dan menghambat oksidasi LDL. Pemberian terapi yogurt susu kambing dalam penelitian ini menunjukkan adanya penurunan ekspresi iNOS. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam menurunkan ekspresi iNOS aorta tikus hiperkolestreolemia yang menghasilkan penurunan mendekati normal.
KESIMPULAN 1. Pemberian terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan kadar MDA pada aorta tikus hiperkolesterolemia tetapi memiliki pengaruh yang berbeda. Penurunan terbaik sebesar 50,04% dihasilkan dari terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB. 2. Pemberian terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan ekspresi iNOS pada aorta tikus hiperkolesterolemia tetapi memiliki pengaruh yang berbeda. Penurunan terbaik sebesar 69,7% dihasilkan dari terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB. UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Ir. Chanif Mahdi, MS sebagai ketua dari payung penelitian atas kesempatan bergabung dalam penelitian ini. 2. Staff Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Laboratorium Biokimia, Laboratorium Fisiologi Hewan, Universitas Brawijaya, Malang dan staff Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas
10
Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. 3. Staff Poliklinik Universitas Brawijaya, Malang.
Chapman, L.P dan Kontush, W. 2006. Role of Oxidative Stress in Atherosclerosis, Am.J Cardiol, 91:7A-11A.
DAFTAR PUSTAKA Artym, J. 2003. Orally Administered Lactoferrin Restores Humoral Immune Response in Immunocompromised Mice. Immunol Lett. 9(1):9-15.
Dalimartha, S. 2008. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jakarta : Trubus Agriwidya. Djatmiko. 2010. The protective ability of Mediterranean dietary plants against the oxidative damage: The role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol, flavonoid and sterol content. J. Food Chemistry. Vol. 112 : 587-594.
Aulanni’am. 2012. The Potency of Sargassum duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6: 144-154.
Gani, N., IM Lidya, MP. Mariska. 2013. Profil Lipida Plasma Tikus Wistar yang Hiperkolesterolemia pada Pemberian Gedi Merah (Abelmoschus manihot L.). Jurnal MIPA UNSRAT Online 2 (1) 44-49.
Bastard, J.P., Maachi, M., Lagathu , C., Kim, M.J., Caron, M., Vidal, H., Capeau, J.,dan Feve, B. 2006. Recent Advances in the Relationship Between Obesity, Inflamation, and Insulin Resistance. Eur Cytokin Netw. Mar;17(1);4-12. PubMed US National Library of Medicine.
Liong , K. H dan Shah, R. 2005. Production Of Free Conjugated Linoleic Acid by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei Of Human Intestinal Origin. Journal Dairy Sci. 86 : 673-681.
Bray, L. 2006. Oxidative Stress in Toxicology: Established Mammalian and Emerging Piscine Model Systems. J Enviromental Health Perspective, 106(7).
Mahdi,
Brasier, B. 2002. Reactive species and antioxidants: Redox biology is fundamental theme of aerobic life. J Plant Physiology, 141:312–322.
Chanif. 2010. Efek Paparan Formaldehid dan Suplementasi Yogurt terhadap Aktivitas Antioksidan Kerusakan Oksidatif, Profil dan Karakter Protein Jaringan Hepar Tikus (Rattus norvegicus). Indo. J. Chem (1) : 132 – 137.
Mirsha, K.V. 2008. Immunomodulatory and Anticancer Potential of Yogurt Probiotic. Biotechnology 7. 177174.
Butterfield, TA., TM. Best dan MA. Merrick. 2006. The dual Roles of Neutrophils and Macrophages in Inflamation : A Critical Balance Between Tissue Damage and Repair. Journal of Athelic Trainning 41 (4) : 457-465.
Muti, T.W. 2002. Effect of Low pH On The Ability of Lactobacillus acidophilus To Survey and Adherence To Human Intestinal 11
Cells. Journal of Food Science 53: 1514-1516. Posecion, N.C., Crowe, N.L., Robinson, A.R., Asiedu, S.K. 2005. The Development Of A Goat’s Milk Yogurt. Journal of the science of Food and Agriculture, 85(11): 1909-1913. Pribadi, J. 2009. Free Radical and Antioxidant Vitamints in Degenerative Disease. J IMA, 2(5):1-3. Ratnawati. 2010. Blood Cholesterol Level of Hypercholesterolemia Rat (Rattus norvegicus) After VCO Treatment. Journal Bioscience Vol 1 No 2 : 5358. Rivai, A. 2001. Ace Inhibitory and Radical Scavenging Activity of Peptides Derived from Lactoglobulin. J. Agric Food Chem. 55 : 33923397. Wresdiyati, T, Astawan M, Hastanti LY. 2006. Profil Imunohistokimia Superoksida Dismutase (SOD) Pada Jaringan Hati Tikus Dengan Kondisi Hiperkolesterolemia. Jurnal Hayati 13: 85-89.
12
