ABSTRAK. Kata kunci : hipertensi, DOCA-salt, WSE yogurt susu kambing, MDA, histopatologi jantung. ABSTRACT

Pengaruh Terapi Water Soluble Extract (WSE) Yogurt Susu Kambing Terhadap Kadar Malondialdehyde (MDA) dan Gambaran Histopatologi Jantung Tikus (Rattus norvegicus) Model Hipertensi Induksi Deoxycorticosterone Acetate (DOCA)-Salt Effect Water Soluble Extract (WSE) of Goat Milk Yogurt to Malondialdehyde (MDA) Levels and Heart Histopathology Hypertensive Rat (Rattus norvegicus) Induced by Deoxycorticosterone Acetate (DOCA)-Salt Ika Kusnia Widyanti, Masdiana C. Padaga, Dyah Kinasih Wuragil Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya [email protected] ABSTRAK

Hipertensi dicirikan dengan peningkatan tekanan darah sistolik > 140 mmHg dan diastolik > 90 mmHg, dapat menyebabkan hipertrofi ventrikel kiri, stroke dan gagal ginjal. Hipertensi diinduksi dengan deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt, menyebabkan retensi natrium dan air yang berujung terjadinya stres oksidatif yang berdampak pada kerusakan jantung. Water soluble extract (WSE) yogurt susu kambing diketahui mengandung peptida bioaktif dengan aktivitas antihipertensi dan antioksidan. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui pengaruh terapi WSE yogurt susu kambing terhadap kadar MDA dan gambaran histopatologi jantung. Parameter yang diukur adalah kadar MDA dengan metode thiobarbituric acid (TBA) dan gambaran histopatologi jantung dengan pewarnaan hematoxylin eosin. Penelitian ini menggunakan 20 ekor tikus wistar jantan yang dibagi dalam 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol, kelompok hipertensi, kelompok terapi captopril 5 mg/kg BB, kelompok WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB dan 600 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukkan kadar MDA kelompok hipertensi (0,651±0,049 µg/mL) berbeda nyata (p<0,05) dibandingkan kontrol (0,306±0,069 µg/mL). Kadar MDA terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (0,436±0,065 µg/mL) tidak berbeda nyata dibandingkan terapi captopril 5 mg/kg BB (0,524±0,047 µg/mL) dan terapi WSE yogurt susu kambing dosis 600 mg/kg BB (0,377±0,045 µg/mL) tidak berbeda nyata dibandingkan kontrol. Gambaran histopatologi jantung menunjukkan perbaikan myosit dan struktur myofibril. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa dosis terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB menunjukkan dosis yang paling efektif menurunkan kadar MDA dan perbaikan gambaran histopatologi jantung. Kata kunci : hipertensi, DOCA-salt, WSE yogurt susu kambing, MDA, histopatologi jantung. ABSTRACT Hypertension is characterized with a systolic blood pressure over 140 mmHg and diastolic blood pressure over 90 mmHg. It leads to left ventricle hypertrophy, stroke and renal failure. Hypertension induced by deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt caused sodium and water retention which lead to oxidative stress, that impact the heart damage. Water soluble extract (WSE) of goat milk yogurt containing bioactive peptides which have antihypertensive and antioxidant activities. The aim of this study was to study effect WSE of goat milk yogurt therapy to malondialdehyde (MDA) levels and histopathology of the heart. 1

Parameters measured were the MDA levels with thiobarbituric acid method (TBA) and histopathology of the heart with hematoxylin eosin staining. This study used 20 male wistar rats that were divided into 5 groups, namely control group, hypertension group, captopril 5 mg/kg BW therapy group, WSE of goat milk yogurt 300 mg/kg BW and 600 mg/kg BW therapy group. The results showed MDA levels of hypertension group (0.651±0.049 µg/mL) was significantly different (p<0.05) compare to control group (0.306±0.069 µg/mL). MDA levels of WSE goat milk yogurt 300 mg/kg BW therapy group (0.436±0.065 µg/mL) was not significantly different compare to captopril 5 mg/kg BW therapy group (0.524±0.047 µg/mL) and WSE of goat milk yogurt 600 mg/kg BW therapy group (0.377±0.045 µg/mL) was not significantly different compare to control group. Histopathology observation of the heart showed repairing of myocyte and myofibrile structure. Therapeutic dose of 600 mg/kg BW of WSE goat milk yogurt was the most effective dose to decrease levels of MDA and repair heart histopathology. Key words : hypertension, DOCA-salt, WSE of goat milk yogurt, MDA and heart hystopathology. PENDAHULUAN Hipertensi merupakan keadaan yang ditandai dengan peningkatan tekanan darah sistolik dan diastolik diatas normal (Yusuf, 2008). Pada manusia terjadi hipertensi jika tekanan darah sistolik > 140 mmHg dan tekanan darah diastolik > 90 mmHg (Groziak & Miller, 2000) sedangkan tekanan darah normal adalah tekanan darah sistolik < 120 mmHg dan tekan darah diastolik < 80 mmHg (Nafrialdi, 2007). Pada tahun 2000, lebih dari 25% populasi dunia atau sekitar 1 milyar orang mengalami hipertensi (Tedjasukmana, 2012) dan 80% kasus terjadi di negara berkembang (Gaziano, 2007). Dari berbagai penelitian epidemiologis yang dilakukan di Indonesia menunjukkan 1,8-28,6% atau lebih kurang 35 juta penduduk yang berusia di atas 20 tahun adalah penderita hipertensi (Hapsari, 2010; Zuhir, 2011). Selain pada manusia hipertensi dapat terjadi pada hewan peliharaan anjing dan kucing dengan prevalensi 0,5-10% pada anjing dan 2% pada kucing (Braslasu et al., 2008). Hipertensi dapat menyebabkan komplikasi berupa kerusakan organ pada jantung, otak, ginjal dan pembuluh darah (Nadar & Lip, 2009; Nafrialdi, 2007). Kerusakan pada jantung menyebabkan terjadinya hipertrofi ventrikel kiri hingga gagal jantung (Nadar & Lip, 2009), kerusakan pada otak menyebabkan terjadinya

stroke, kerusakan pada ginjal menyebabkan penyakit ginjal kronik hingga gagal ginjal dan pada aorta dapat menyebabkan aneurisma serta robeknya lapisan intima (Nafrialdi, 2007). Untuk memahami patogenesis dan mempelajari pengobatan penyakit hipertensi perlu menggunakan hewan model, salah satu hewan model hipertensi yaitu dengan induksi deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt. Induksi DOCA-salt dipilih karena menghasilkan waktu paling cepat untuk menimbulkan hipertensi, yaitu 43 hari setelah induksi (Badyal et al., 2003; Sharma et al., 2010). Hipertensi induksi DOCA-salt menyebabkan terjadinya peningkatan aldosteron yang memicu terjadinya retensi natrium dan air dalam tubuh sehingga menyebabkan kenaikan volume dan tekanan darah (Hemalatha, 2013; Prahalatan et al., 2012). Hipertensi induksi DOCA-salt juga menyebabkan stres oksidatif akibat meningkatnya superoksida yang bersifat radikal bebas (Jimenez et al., 2007). Stres oksidatif dalam tubuh dapat diukur melalui kadar malondialdehyde (MDA) (Arkhaesi, 2008). Obat penurun tekanan darah yang sudah beredar di pasar bebas cukup banyak, akan tetapi masalah yang ada adalah efektivitas terapi dan efek samping (Aziza, 2008). Pada umumnya pengobatan hipertensi 2

membutuhkan jangka waktu yang lama dengan mengkonsumsi obat penurun tekanan darah secara teratur sepanjang hidup yang disertai dengan efek samping (Armenia dkk., 2007). Salah satu obat penurun tekanan darah adalah captopril. Penggunaan captopril menimbulkan efek samping gejala reaksi hipersensitivitas berupa gatal-gatal dan gejala infeksi saluran pernapasan atas berupa batuk (Ikawati dkk., 2008). Susu kambing memiliki kandungan gizi yang lebih unggul, globula lemak lebih kecil hal ini membuat lemak susu tersebar dan homogen sehingga lebih mudah dicerna, kandungan laktosa yang lebih rendah sehingga dapat dikonsumsi bagi orang-orang yang mengalami gangguan pencernaan (lactose intolerance) dan sifat alergi yang lebih rendah karena kandungan αs1-casein yang rendah dibandingkan susu sapi (Haenlein, 2004; Selee et al., 2009; Silanikove et al., 2010; Tomotake et al.,

2006). Selain itu protein susu kambing merupakan sumber peptida bioaktif yang memiliki berbagai efek fisiologi menguntungkan, antara lain sebagai imunomodulator, antimikroba, antioksidan dan antihipertensi yang bekerja sebagai ACE-inhibitor (Park, 2009). Salah satu metode untuk mendapatkan peptida bioaktif yaitu melalui fermentasi dengan bantuan bakteri asam laktat (Korhonen & Pihlanto, 2006). Penelitian yang dilakukan Silva et al. (2006) menyebutkan bahwa water soluble extract (WSE) susu kambing menghasilkan peptida bioaktif dengan aktivitas ACEinhibitor dan antioksidan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah terapi WSE yogurt susu kambing dapat mengobati hipertensi melalui pengukuran kadar MDA organ jantung dan pengamatan gambaran histopatologi jantung tikus (Rattus norvegicus) model hipertensi induksi DOCA-salt.

MATERI DAN METODE Peralatan yang digunakan yaitu : inkubator (Memmert Ine500), freeze dryer (Christ Beta 1-8 K), sentrifus (Thermoscientific Sorvall Biofuge Primo R Centriffuge), sentrifus dingin (Thermoscientific Sorvall Legend Micro 17), blood pressure analyzer (IITC, Model 179, Woodland Hills-USA), spektrofotometer (Thermoscientific Genesys 20), mikroskop cahaya (Olympus BX 51) yang dilengkapi dengan program Olympus Viewer for Imaging Applications (OlyVIA), kamera (Olympus XC 10), autoclave, refrigerator, pH meter (Eutech Instrument Cyberscan pH 310), timbangan digital (Precisa 3000 D), kompor gas, kandang besi ukuran 41 cm x 31 cm x 27 cm yang dilengkapi botol minum & box pakan, microtome, tissue processor, tissue embedding, water bath, paraffin cassette, vortex, botol schott (Duran), gelas ukur (Pyrex Iwaki), tabung erlemeyer (Pyrex Iwaki), gelas beker (Pyrex Iwaki), pipet ukur (Pyrex Iwaki), karet bulb, termometer, pengaduk kaca, microtube, alat sonde dan penyaring minyak jagung (Sartorius Minisart).

Bahan yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar berumur 10-12 minggu dengan berat badan 200-250 gram sebanyak 20 ekor, pakan komersial AD II (Comfeed, Indonesia), air minum reverse osmosis (RO), susu kambing Peranakan Etawa (Balai Besar Pelatihan Peternakan-Batu), starter yogurt mengandung bakteri L. bulgaricus, S. thermophilus dan L. acidophilus (Yogourmet, Lyo San Inc 500 Aeroparc, C.P 598, Lachute, Qc, Canada, J8H 4G4), deoxycorticosterone acetate (DOCA) (Sigma Pcode 1001376001, USA), minyak jagung (Sigma Pcode 1000925370, USA), NaCl (Merck, Denmark), phospat buffer saline (PBS), aquades, formaldehid 10%, kloroform 10%, standar MDA (Sigma, USA), TCA 10%, HCl 1 N, Na-Thio 1%, etanol, parafin, xilol dan captopril 25 mg (Indofarma, Indonesia). Hewan coba yang digunakan yaitu tikus (Rattus novergicus) jantan strain Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM Yogyakarta. Pengunaan hewan coba telah 3

• Pembuatan Water Soluble Extract (WSE) Water soluble extract (WSE) yogurt susu kambing diperoleh dengan cara sentrifugasi yogurt pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 5oC, kemudian supernatan dipisahkan. WSE yang dihasilkan dikering bekukan (freeze dry) dan selanjutnya disimpan ke dalam refrigerator suhu 4-5oC (Modifikasi Ledesma et al., 2005 & Aloglu et al., 2011).

mendapatkan persetujuan laik etik oleh Komisi Ethical Clearence Penelitian Praklinik Universitas Gadjah Mada. Tikus diadaptasikan selama 3 hari di laboratorium dengan diberi pakan komersial AD II dan air minum RO secara ad libitum. Tikus dibagi menjadi lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol (A), kelompok hipertensi (B), kelompok hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (C), kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) dan kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E).

Pembagian Kelompok Perlakuan Kelompok A (kontrol), tikus diberi pakan komersial dan minum RO secara ad libitum. Kelompok hipertensi (B), tikus diinduksi DOCA+NaCl 2% adlibitum selama 5 minggu. Kelompok hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (C), tikus diinduksi DOCA+NaCl 2% ad libitum selama 5 minggu setelah itu diterapi captopril dosis 5 mg/kg BB yang dilarutkan dalam air minum RO 1 ml (Contreras et al., 2009). Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D), tikus diinduksi DOCA+NaCl 2% ad libitum selama 5 minggu setelah itu diterapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg yang dilarutkan dalam air minum RO 1,5 ml. Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E), tikus diinduksi DOCA+NaCl 2% ad libitum selama 5 minggu setelah itu diterapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (Contreras et al., 2011). Pemberian terapi dilakukan secara sonde lambung 1 kali sehari selama 4 minggu.

Persiapan Tikus Hipertensi Tikus kelompok B, C, D dan E diinjeksi dengan DOCA yang dilarutkan pada minyak jagung 0,5 ml secara subkutan pada bagian cervical dengan dosis 20 mg/kg 5 kali injeksi pertama dan dosis 10 mg/kg BB 5 kali injeksi selanjutnya (Modifikasi Khorshid et al., 2012 & Badyal et al., 2003). Pembuatan WSE Yogurt Susu Kambing • Pembuatan Starter Susu kambing 100 ml dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit, kemudian didinginkan hingga suhu mencapai 40–45oC, inokulasi starter yogurt kering beku 0,5 gram dalam 100 ml susu kambing (w/v), dihomogenkan dengan cara menggoyangkan secara perlahan, inkubasi pada suhu 40–45oC selama 4–8 jam hingga pH starter yogurt cair 4,5-5. Pada penelitian ini didapatkan pH starter yogurt cair 4,63 dan selanjutnya starter yogurt cair disimpan dalam refrigerator suhu 4-5oC (www.yogourmet.com/usage). • Pembuatan Yogurt Susu kambing 1.000 ml dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit, kemudian didinginkan hingga suhu mencapai 40–45oC, inokulasi dengan starter yogurt cair 3% (v/v), dihomogenkan dengan cara menggoyangkan secara perlahan, inkubasi pada suhu 40–45oC selama 4–8 jam hingga pH yogurt 4,5–5. Pada penelitian ini didapatkan pH yogurt 4,52 dan selanjutnya yogurt disimpan dalam refrigerator suhu 4-5oC (Posecion et al., 2005).

Pengukuran Tekanan Darah Pengukuran tekanan darah tikus dengan cara metode tail cuff menggunakan alat blood pressure analyzer. Pengukuran tekanan darah pada tikus yaitu tikus dimasukkan ke dalam holder dengan memegang ekornya, hewan coba harus dalam keadaan tenang dalam holder sebelum pengukuran dilakukan dan tanpa stres karena dingin maupun panas, ekor dimasukkan ke lubang ekor pada manset, manset dikencangkan dan tikus siap diukur (Prahalatan et al., 2012). Tekanan darah sistolik normal adalah 116 - 145 mmHg dan 4

• Pengukuran Kadar MDA Organ Jantung Metode Thiobarbituric Acid (TBA) Penentuan kadar MDA dilakukan dengan metode TBA. Jantung bagian kanan ditimbang 0,5 gram, digerus hingga halus, ditambahkan 1 mL NaCl 0,9 %, homogenat dipindahkan ke microtube, disentrifus 8.000 rpm selama 20 menit, supernatan 100 µL dimasukkan microtube baru, ditambahkan 550 µL aquades, 100 µL TCA 10%, 250 µL HCl 1 N dan 100 µL Na-Thio 1%. Setelah itu dihomogenkan dan disentrifus 500 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke microtube baru dan direndam dalam water bath pada suhu 100oC selama 30 menit. Supernatan didinginkan pada suhu ruang 2627oC, kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 530 nm. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplotkan pada persamaan linear sehingga diperoleh nilai kadar MDA (Aulanni’am dkk., 2011).

tekanan darah sistolik hipertensi adalah > 145 sampai ≤ 200 mmHg (Krinke, 2000). Pengambilan Organ Jantung Tikus Pengambilan organ jantung tikus dilakukan setelah 4 minggu pemberian terapi. Pengambilan organ jantung dilakukan dengan nekropsi. Sebelum nekropsi, tikus dieuthanasi menggunakan kloroform 10%. Nekropsi dilakukan pada rongga abdomen, dimana tikus diletakan dengan posisi rebah dorsal di atas papan pembedahan. Organ jantung diambil dan dibagi menjadi dua bagian. Bagian kanan jantung dimasukkan ke dalam PBS untuk pengukuran kadar MDA dan bagian kiri jantung dimasukkan ke dalam formaldehid 10% untuk pembuatan preparat histopatologi (Wati dkk., 2013). Pengukuran Kadar MDA • Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan standar MDA 4 ppm 100 µL, ditambahkan aquades 550 µL, 100 µL TCA 10%, 250 µL HCl 1 N, 100 µL Na-Thio 1% dan dihomogenkan. Setelah itu direndam dalam water bath pada suhu 100oC selama 30 menit, kemudian didiamkan pada suhu ruang (26-27oC) dan selanjutnya diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λ 500-600 nm (Aulanni’am dkk., 2011). • Pembuatan Kurva Standar Larutan stok kit MDA dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 µg/mL diambil masing-masing 100 µL, dimasukkan dalam microtube yang berbeda, ditambahkan 550 µL aquades, 100 µL TCA 10%, 250 µL HCl 1 N dan 100 µL Na-Thio 1%. Setelah itu dihomogenkan. Kemudian disentrifus 500 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil, dipanaskan dalam water bath suhu 100°C selama 30 menit. Kemudian didiamkan pada suhu ruang 26-27oC dan selanjutnya diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 530 nm. Hasil absorbansi kemudian dibuat kurva standar MDA dan dihasilkan persamaan linear (Aulanni’am dkk., 2011).

Pembuatan Preparat Histopatologi Jantung Tahap pembuatan preparat histopatologi dimulai dengan fiksasi jantung yaitu merendam dalam formaldehid 10% selama 24 jam, kemudian diiris (trimming) dengan ukuran 2 x 1 x 0,5 cm agar dapat dimasukkan ke dalam kotak untuk diproses dalam tissue processor. Tahap selanjutnya, jantung dimasukkan ke dalam etanol 70%, etanol 80%, etanol 90%, etanol 95%, xilol I dan II masing-masing selama 2 jam. Selanjutnya dimasukkan ke dalam parafin cair dengan suhu 56oC selama 2 jam. Jaringan kemudian diambil dengan pinset, dilanjutkan dengan pemblokan menggunakan parafin blok yang berukuran sesuai dengan ukuran tempat blok microtome. Pemotongan (cutting) dilakukan dengan menggunakan microtome dengan ketebalan 4-5 µm. Jaringan yang terpotong direndam pada water bath bersuhu 40oC, kemudian diambil dengan object glass. Selanjutnya dikeringkan dalam suhu kamar 26-27oC (Wati dkk., 2013).

5

Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) Tahapan pewarnaan HE dimulai dengan tahapan deparafinasi, preparat dimasukkan dalam xilol bertingkat I-III masing-masing selama lima menit. Berikutnya dilakukan tahapan rehidrasi preparat dimasukkan dalam etanol dimulai dari etanol absolut I-III, etanol 95, 90, 80 dan 70% masing-masing selama lima menit. Lalu direndam dalam aquades selama lima menit. Setelah itu dilakukan tahapan pewarnaan, preparat dimasukkan dalam pewarnaan hematoxylin selama kurang lebih 10 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 30 menit, dibilas dengan aquades dan dimasukkan dalam pewarnaan eosin selama 5 menit. Lalu preparat direndam dalam aquades untuk menghilangkan kelebihan eosin. Berikutnya dilakukan tahapan dehidrasi dengan memasukkan preparat dalam etanol

bertingkat dari 80, 90 dan 95% hingga etanol absolut I-III. Selanjutnya dilakukan clearing yaitu dengan memasukkan preparat pada xilol I-II dan dikeringkan. Setelah itu dilakukan mounting dengan entellan (Wati dkk., 2013). Perubahan yang diamati adalah myosit dan myofibril pada bagian myokardium ventrikel kiri. Analisis Data Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Analisa kadar MDA menggunakan uji ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) atau Tukey (p<0,05) meggunakan SPSS version 16.0 for windows dan analisa gambaran histopatologi jantung dilakukan secara deskriptif (Kusriningrum, 2008).

HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Water Soluble Extract (WSE) Yogurt Susu Kambing Terhadap Kadar Malondialdehyde (MDA) Tikus Model Hipertensi Induksi Deoxycorticosterone Acetate (DOCA)-Salt Hasil penelitian pengaruh terapi WSE yogurt susu kambing terhadap kadar MDA

organ jantung tikus model hipertensi induksi DOCA-salt menunjukkan perbedaan nyata dari masing-masing kelompok perlakuan (Tabel 1.)

Tabel 1. Nilai Kadar MDA Organ Jantung Berbagai Kelompok Perlakuan Rata-rata Kadar MDA Perlakuan (µg/mL) Kelompok kontrol (A) 0,306±0,069a Kelompok hipertensi (B) 0,651±0,049d Kelompok hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (C) 0,524±0,047c Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt 300 mg/kg BB (D) 0,436±0,065bc Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt 600 mg/kg BB (E) 0,377±0,045ab Keterangan : nilai kadar MDA dengan notasi berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) antara kelompok perlakuan.

Berdasarkan Tabel 1. diketahui nilai kadar MDA organ jantung pada kelompok kontrol (A) adalah 0,306±0,069 µg/mL. Nilai tersebut menunjukkan standar nilai kadar MDA tikus dalam keadaan normal. Kadar MDA organ jantung kelompok hipertensi (B) adalah 0,651±0,049 µg/mL, menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dibandingkan kelompok kontrol (A), hal ini berarti induksi DOCA-salt pada kelompok hipertensi (B)

telah mengakibatkan stres oksidatif pada organ jantung. Iyer et al. (2010) dan Jiménez et al. (2007) menyebutkan bahwa induksi DOCA-salt melalui aktifasi oksidasi NADPH meningkatkan produksi superoksida (O2-) yang bersifat radikal bebas. Peningkatan radikal bebas mengakibatkan stres oksidatif yaitu ketidakseimbangan antara radikal bebas dengan antioksidan endogen. Stres oksidatif menyerang 6

kontrol (A), namun kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E) adalah 0,377±0,045 µg/mL, menunjukkan perbedaan yang tidak nyata dibandingkan kelompok kontrol (A). Hal tersebut menunjukkan bahwa kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) memiliki efek penurunan kadar MDA organ jantung yang berbeda dibandingkan dengan kelompok kontrol (A) sedangkan kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E) memiliki efek penurunan kadar MDA organ jantung mendekati normal sehingga merupakan kelompok dengan dosis terapi yang paling efektif. Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) dan 600 mg/kg BB (E) menunjukkan penurunan kadar MDA organ jantung dikarenakan WSE yogurt susu kambing mengandung peptida bioaktif yang bekerja sebagai antioksidan melalui penghambatan peroksidasi lipid dengan scavenger (penangkap) radikal bebas. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Korhonen & Pihlanto (2006) bahwa peptida bioaktif WSE susu kambing dapat menurunkan kadar MDA melalui penghambatan peroksidasi lipid secara enzimatik dan nonenzimatik. Mekanisme penghambatan radikal bebas WSE yogurt susu kambing adalah dengan menghambat proses oksidasi melalui penghambatan inisiasi dan propagasi reaksi oksidasi radikal bebas. Peptida bioaktif dalam WSE yogurt susu kambing menangkap radikal superoksida (O2-) sehingga menjadi produk yang stabil. Hal ini sesuai dengan pendapat Kullisaar et al. (2003) & Liu et al. (2005) bahwa peptida bioaktif susu kambing terfermentasi akan menghambat formasi superoksida. Radikal superoksida yang ditangkap oleh peptida bioaktif WSE yogurt susu kambing akan mencegah inisiasi pembentukan radikal lipid yang bersifat tidak stabil karena hilangnya satu atom hidrogen (H) dari molekul lipid dan menghambat transfer elektron molekul oksigen pada radikal peroksil serta mencegah proses propagasi sehingga radikal bebas

komponen berbagai tubuh termasuk lipid sehingga menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid yang ditandai dengan meningkatanya kadar MDA (Arkhaesi, 2008; Hemalatha et al., 2013; Jiménez et al., 2007). MDA merupakan produk akhir peroksidasi lipid sehingga secara tidak langsung pengukuran kadar MDA organ jantung menunjukkan kadar radikal bebas (Arkhaesi., 2008). Kadar MDA organ jantung kelompok hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (C) adalah 0,524±0,047 µg/mL, menunjukkan perbedaan yang tidak nyata dibandingkan kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) dan menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dibandingkan kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E). Hal tersebut menununjukkan bahwa pengaruh terapi captopril 5 mg/kg BB memiliki efek penurunan kadar MDA yang sama dengan WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) dan efek penurunan kadar MDA yang berbeda dengan WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E). Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Bolterman et al. (2005) bahwa captopril menurunkan sedikit kadar MDA pada tikus hipertensi. Captopril kurang efektif sebagai antioksidan pada hipertensi dimungkinkan karena tingkat stres oksidatif yang ditimbulkan oleh induksi DOCA-salt dan penggunaan dosis terapi captopril yang rendah dalam penelitian ini yaitu dosis 5 mg/kg BB. Hasil penelitian Pechanova (2007) menunjukkan bahwa dosis captopril 50 mg/kg/hari memiliki efek antioksidan pada tikus. Captopril memiliki aktivitas antioksidan golongan sulfhydryl, antioksidan tersebut bekerja dengan meningkatkan penangkapan radikal bebas melalui oksidan endogen serta menetralkan radikal oksigen melalui donasi hidrogen atau mekanisme transfer elektron (Kojšová et al., 2006; Rao et al., 2011). Kadar MDA organ jantung kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) adalah 0,436±0,065 µg/mL, menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dibandingkan dengan kelompok 7

tidak akan bereaksi dengan oksigen (Liu et al., 2005).

induksi DOCA-salt sehingga menyebabkan remodeling ventrikel dengan kompensasi hipertrofi dalam mempertahankan perfusi jaringan akibat beban jantung yang meningkat karena peningkatan tekanan darah (Fantinelli et al., 2012). Gambaran histopatologi kelompok hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (Gambar 1. C) menunjukkan inti myosit piknotik, struktur myofibril yang tidak teratur dan myosit tidak berbatas jelas serta adanya hipertrofi myosit. Aktivitas antioksidan captopril kurang efektif dalam perbaikan histopatologi dimungkinkan karena penggunaan dosis captopril yang rendah dalam penelitian ini yaitu 5 mg/kg BB. Hasil penelitian Pechanova (2007) menunjukkan bahwa dosis captopril 50 mg/kg/hari memiliki efek antioksidan pada tikus dan hasil penelitian Kojšová et al. (2006) & Sládková et al. (2007) bahwa penggunaan captopril dosis 10 mg/kg/hari dapat menurunkan tekanan darah tetapi tidak menunjukkan peningkatan aktivitas sintesis NO sehingga kurang efektif dalam menurunkan hipertrofi jantung. Dosis captopril untuk mencegah terjadinya hipertrofi ventrikel kiri adalah 100 mg/kg/hari. Kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (Gambar 1. D) menunjukkan perbaikan myosit dengan penurunan inti myosit piknotik dan perbaikan myofibril namun masih terdapat hipertrofi myosit sedangkan kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (Gambar 1. E) mengalami perbaikan yang ditunjukkan dengan banyaknya inti myosit normal, struktur myofibril dan ketebalan myosit mendekati normal sehingga gambaran histopatologi kelompok terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB lebih baik dibandingkan terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB. Perbaikan gambaran histopatologi kelompok hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB dan 600 mg/kg BB karena adanya pengaruh antioksidan dalam WSE yogurt susu kambing.

Pengaruh Water Soluble Extract (WSE) Yogurt Susu Kambing Terhadap Histopatologi Jantung Tikus Model Hipertensi Induksi Deoxycorticosterone Acetate (DOCA)-Salt Hasil penelitian pengaruh WSE yogurt susu kambing terhadap gambaran histopatologi organ jantung dengan pewarnaan HE disajikan pada Gambar 1. Gambaran histopatologi organ jantung pada masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan myosit dan myofibril pada bagian myokardium ventrikel kiri. Hasil penelitian pada kelompok kontrol (Gambar 1. A) menunjukkan bentuk normal myosit dan myofibril. Gambaran ini sesuai dengan Kuehnel (2003) dan Mescher (2010) bahwa gambaran histologi organ jantung adalah batas antara sel-sel jelas, myosit memiliki satu inti yang terletak di tengah dan myofibril atau serabut otot jantung yang teratur. Pada kelompok hipertensi (Gambar 1. B) terdapat kerusakan myosit yang ditandai dengan perubahan inti myosit menjadi inti piknotik yang ditandai dengan inti myosit berwarna biru gelap dan pengerutan inti atau disebut proses piknosis yang merupakan tahapan awal nekrosis, kerusakan struktur myofibril yang tidak teratur dan hipertrofi yang ditandai dengan penebalan myosit. Hal ini sesuai dengan penelitian Rocha et al. (2000) bahwa terjadi piknosis pada tikus induksi aldosteron, hasil penelitian Yudomustopo (2006) & Martinez et al. (2002) bahwa terjadi nekrosis myokardium yang ditandai dengan myofibril yang tidak teratur akibat radikal bebas pada keadaan hipertensi diet tinggi garam dan penelitian Khorshid et al. (2012) bahwa terjadi hipertrofi myokardium yang ditandai dengan penebalan myosit. Mekanisme hipertrofi menurut Fenning et al. (2010) yaitu terjadinya inaktivasi NO yang disebabkan

8

Gambar 1.

Histopatologi myokardium organ jantung dengan perbesaran 400x. Keterangan : Tikus kontrol (A), Tikus hipertensi (B), Tikus hipertensi terapi captopril 5 mg/kg BB (C), Tikus hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (D) dan Tikus hipertensi terapi WSE yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (E). Pewarnaan HE. Inti myosit normal (IN), inti myosit piknotik (IP), myofibril (MF) dan Hipertrofi (H). Gambar insert A: inti myosit normal, B, C, D: inti myosit piknotik dan E: inti myosit normal.

Mekanisme perbaikan gambaran histopatologi myosit dan myofibril yaitu aktivitas antioksidan WSE yogurt susu kambing menghambat peroksidasi lipid dengan menangkap radikal bebas sehingga menekan pembentukan ROS yang merupakan penyebab kerusakan jaringan dan mencegah reaksi autokatalitik sel jantung berupa nekrosis dan kerusakan struktur myofibril. Kullisaar et al. (2003) & Palaniswamy et al. (2012) mengatakan

bahwa peptida bioaktif susu kambing terfermentasi dapat mengurangi stres oksidatif melalui proteksi seluler dan proses perbaikan. Pengaruh aktivitas antioksidan terhadap hipertrofi menurut Alvarez et al. (2008) bahwa penangkapan radikal bebas O2dan donasi hidrogen menghasilkan produk yang stabil seperti H2O2 yang berfungsi sebagai vasodilatasi yang akan menurunkan ritme sistem pembuluh darah sehingga beban jantung berkurang. Selain itu aktivitas 9

peptida biaoktif dengan aktivitas antihipertensi bekerja dengan menurunkan tekanan darah melalui peningkatan aktivitas

NO yang merupakan substansi vasodilator dalam mekanisme ACE-inhibitor (Erdmann et al., 2008).

KESIMPULAN Pemberian terapi WSE yogurt susu kambing dapat menurunkan kadar MDA organ jantung dan memperbaiki gambaran histopatologi organ jantung tikus model hipertensi induksi DOCA-salt. Dosis 600 mg/kg BB merupakan dosis terapi paling efektif dalam penurunan kadar MDA dan perbaikan gambaran histopatologi organ jantung dibandingkan dosis 300 mg/kg BB terapi captopril 5 mg/kg BB.

Armenia., Welmidayani., Y. Yuliandra dan Rusdi. 2007. Daun Tanaman Akar Mambu (Connarus grandis jack.) Sebagai Obat Antihipertensi : Efektivitas Ekstrak Etanolnya Pada Tikus Hipertensi 2k1c Goldblatt. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi 12(2): 100-107. Aulanni’am, A. Rosdiana dan N. L. Rahma. 2011. Potensi Fraksi Etanol dan Etil Asetat Rumput Laut Coklat (Sargassum duplicatum Borry) Terhadap Penurunan Kadar Malondialdehid dan Perbaikan Gambaran Histologis Jejunum Usus Halus Tikus IBD (Inflammatory Bowel Disease). Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan 4 (1): 57-64. Aziza, L. 2007. Peran Antagonis Kalsium Dalam Penatalaksanaan Hipertensi. Majalah Kedokteran Indonesia 57(8) Agustus 2007. Badyal D. K., H. Lata and A. P. Dadhich. 2003. Animal Model of Hypertension and Effect of Drugs. Indian Journal of Pharmacology 35: 349-362. Bolterman, R. J., M. C. Manriquez., M. C. O. Ruiz., L. A. Juncos and J. C. Romero. 2005. Effects of Captopril on the Renin Angiotensin System, Oxidative Stress, and Endothelin in Normal and Hypertensive Rats. Hypertension 46: 943947. Braslasu, M. C., D. E Braslasu and S. Joita. 2008. Aspects Regarding Arterial Hypertension in Dog and Cat. Lucrari Stiintifice Medicina Veterinara XLI. Contreras, M. del Mar., R. Caron., M. J. Montero., M. Ramos and I. Recio. 2009. Novel Casein-Derived Peptides with Antihypertensive Activity. International Dairy Journal 19:566-573. Contreras, M. del Mar., M. A. Sevilla., J. M. Ruiz., L. Amigo., B. G. Sala., E. Molina., M. Ramos and I. Recio. 2011. Food-grade Production of an Antihypertensive Casein

UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner PKH UB, Laboratorium Biokimia FMIPA UB, Laboratorium Biosains UB, Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi UNAIR, Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi FK UGM, Laboratorium Patologi Anatomi FK UGM dan LPPT UGM serta staf laboratorium yang telah membantu dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Aloglu, H. S. and Z. Oner. 2011. Determination Of Antioxidant Activity Of Bioactive Peptide Fractions Obtained From Yogurt. Journal Dairy Science 94: 5305-5314. Álvarez, M. C., C. Caldiz., J. C. Fantinelli., C. D. Garciarena., G. M. Console., G. E. C. De Cingolani and S. M. Mosca. 2008. Is Cardiac Hypertrophy in Spontaneously Hypertensive Rats the Cause or the Consequence of Oxidative Stress?. Hypertension Research 31(7): 1465-1476. Arkhaesi, N. 2008. Kadar Malondialdehyde (MDA) Serum Sebagai Indikator Prognosis Keluaran Pada Sepsis Neonatorum [Tesis]. Program Pascasarjana Magister Ilmu Biomedik dan Program Pendidikan Dokter Spesialis-I Ilmu Kesehatan Anak. Universitas Diponegoro. Semarang. 10

Ikawati, Z., S. Djumiani dan I Dewa Putu P. S. 2008. Kajian Keamanan Pemakaian Obat Anti-Hipertensi Di Poliklinik Usia Lanjut Instalasai Rawat Jalan Rs. Dr. Sardjito. Majalah Ilmu Kefarmasian V(3): 150-169. Iyer, A., V. Chan and L. Brown. 2010. The DOCA-Salt Hypertensive Rat as a Model of Cardiovascular Oxidative and Inflammatory Stress. Current Cardiology Reviews 6: 291-297. Jiménez, R., R. L. Sepúlveda., M. Kadmiri., M. Romero., R. Vera., M. Sánchez., F. Vargas., F. O'Valle., A. Zarzuelo., M. Dueñas., C. S. Buelga and J. Duarte. 2007. Polyphenols Restore Endothelial Function in DOCA-salt Hypertension: Role of Endothelin-1 and NADPH Oxidase. Free Radical Biology & Medicine 43: 462–473. Khorshid, O., E. Abdel-Ghaffar., A. Mishriki., A. Galal1 and A. Hareedy. 2012. Possible Cardiovascular Protective Effect of Some Ppar Activators in Experimentally-Induced Hypertensive Model in Rats. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 5(3): 67-72. Kojšová, S., L. Jendeková., J. Zicha., J. Kuneš., R. Andriantsitohaina and O. Pecháňová. 2006. The Effect of Different Antioxidants on Nitric Oxide Production in Hypertensive Rats. Physiological. Research 55 (1): S3-S16. Korhonen, H and A. Pihlanto. 2006. Bioactive Peptides : Production and Functionality. International Dairy Journal 16: 945-960. Krinke, G. J. 2000. The Hand Book of Laboratory Animal. The Laboratory Rat. Midas Printing Ltd., Scotland 349-353. Kuehnel, W. 2003. Color Atlas of Cytology, Histology, and Microscopic Anatomy 4th edition, revised and enlarged. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-Germany. Kullisaar, T., E. Songisepp., M. Mikelsaar., K. Zilmer., T. Vihalemm and M. Zilmer. 2003. Antioxidative Probiotic Fermentef

Hydrolysate and Resistance of Active Peptides to Drying and Storage. International Dairy Journal 21: 470-476. Erdmann, Kati., B. W. Y. Cheung and H. Schröder. 2008. The Possible Roles of Food-Derived Bioactive Peptides in Reducing The Risk Of Cardiovascular Disease. Journal of Nutritional Biochemistry 19: 643–654. Fantinelli, J. C., C. Caldiz., M. C. Álvarez., C. D. Garciarena, G. E. C. de Cingolani and Susana M. Mosca. 2012. Oxidative Damage in Cardiac Tissue from Normotensive and Spontaneously Hypertensive Rats: Effect of Ageing, Oxidative Stress and Diseases. InTech 141-156. Fenning, A., G. Harrison., R. Rose’meyer., A. Hoey and L. Brown. 2005. L -Arginine Attenuates Cardiovascular Impairment in DOCA-Salt Hypertensive Rats. AJP Heart and Circulatory Physiology 289: 1408-1416. Gaziano, T.A. 2007. Reducing The Growing Burden of Cardiovascular Disease in The Developing World. Health Aff (Millwood) 26:13-24. Groziak, S. M and G. D. Miller. 2000. Natural Bioactive Substances in Milk and Colostrum : Effects on The Arterial Blood Pressure System. British Journal of Nutrition 84(1): S119-S125. Haenlein, G. F. W. 2004. Goat Milk In Human Nutrition. Journal Small Ruminant Research 51: 155-163. Hapsari, B. D. A. 2010. Pengaruh Hipertensi Primer Terhadap Timbulnya Premenstrual Syndrome Pada Wanita Di Kelurahan Jati Kecamatan Jaten Karanganyar [Skripsi]. Fakultas Kedokteran. Universitas Sebelas Maret. Surakarta. Hemalatha, G., K. V. Pugalendi and R. Saravanan. 2013. Modulatory Effect of Sesamol on Doca-Salt Induced Oxidative Stress in Uninephrectomized Hypertensive Rats. Mol Cell Biochem. DOI 10.1007/s11010-013-1647-1.

11

of Spontaneous Hypertension. Physiological Research 56(2): S41-8 (Abstract). Posecion, N. C., N. L. Crowe., A. R. Robinson and S. K. Asiedu. 2005. The Development of A Goat’s Milk Yogurt. Journal of The Science of Food and Agriculture 85: 1909-1913. Prahalatan, P., S. Kumar and B. Raha. 2012. Effect Of Morin, A Flavanoid Against Doca-Salt Hypertensive Rats : A Dose Dependent Study. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 443-448 Rao, Y. M., I. A. Lakshmi., C. H. Bhargavi and S. Umavenkatesh. 2011. Effect of Ace Inhibitors on Antioxidant Status in Streptozotocin Induced Diabetic Rats. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 4(1): 134-137. Rocha, R., C. T. Stier, Jr., I. Kifor., M. R. Ochoa-Maya., H. G. Rennke., G. H. Williams and G. K. Adler. 2000. Aldosterone: A Mediator of Myocardial Necrosis and Renal Arteriopathy. Endocrinology 141 (10): 3871-3878. Seelee,W,. W. Tungjaroenchai and M. Natvaratat. 2009. Development of Low Fat Set-type Probiotic Yoghurt From Goat Milk. Asian Journal of Food and AgroIndustry 2(04): 771-779. Sharma, P. K., N. S. Vyawahare and A. Ladhha. 2010. Preclinical Screening Models For Hypertension in Rodents : A Review. Phamacology 3: 458-472. Silanikove, N., G. Leitner., U. Merin., C. G. Prosser. 2010. Recent Advances in Exploiting Goat’s Milk: Quality, Safety and Production Aspects. Small Ruminant Research 89: 110–124. Silva, S. V., A. Pihlanto and F. X. Malcata. 2006. Bioactive Peptides in Ovine and Caprine Cheeselike Systems Prepared with Proteases from Cynara cardunculus. Journal Dairy Science 89: 3336–3344. Sládková, M., S. Kojšová., L. Jendeková and O. Pecháňová. 2007. Chronic and Acute Effects of Different Antihypertensive Drugs on Femoral Artery Relaxation of L-

Goats’ Milk Decreases Oxidative-StressMediated Atherogenicity in Human Subjects. British Journal of Nutrition 90:449-456. Kusriningrum, R. S. 2008. Perancangan Percobaan : Untuk Penelitian Bidang Biologi, Pertanian, Peternakan, Peikanan, Kedokteran, Kedokteran Hewan, Farmasi. Cetakan Pertama. Airlangga University Press. Surabaya. Ledesma, B. H., B. Miralles., L. Amigo and M. Ramos. 2005. Identification of Antioxidant and Ace-Inhibitory Peptides in Fermented Milk. Journal of The Science of Food and Agriculture 85: 1041-1048. Liu, J. R., Y. Y. Lin., M. J. Chen., L. J. Chen and C. W. Lin. 2005. Antioxidative Activities of Kefir. Asian-Australia Journal Animal Science 18(4): 567-573. Martinez, D. V., R. Rocha., M. Matsumura., E. Oestreicher., M. Ochoa-Maya., W. Roubsanthisuk., G. H. Williams and G. K. Adler. 2002. Cardiac Damage Prevention by Eplerenone: Comparison With Low Sodium Diet or Potassium Loading. Hypertension 39: 614-618. Mescher, A. L. 2010. Junqueira's Basic Histology. The McGraw-Hill Companies, Inc.United States of America. Nadar, S and G. Lip. 2009. Hypertension. Oxford University Press Inc., New York 53-63. Nafrialdi. 2007. Antihipertensi. Farmakologi dan Terapi. Edisi Kelima. Balai Penerbit FKUI. Jakarta. Palaniswamy, M., B. Nandhini. and J. Angayarkanni. 2012. Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Activity and Antioxidant Properties of Goat Milk Hydrolysates. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 4 (4) ISSN-0975-1491. Park, Y. W. 2009. Bioactive Components In Goat Milk. Willey-Blackwell. ISBN 9780-8138-198202. Singapore Pechanova, O. 2007. Contribution of Captopril Thiol Group to The Prevention 12

NAME Hypertensive Rats. Physiological. Research 56 (2): S85-S91. Tedjasukmana, P. 2012. Tata Laksana Hipertensi. CDK-192 39(4): 251-255. Tidona, F., A. Criscione., A. M. Guastella., A. Zuccaro., S. Bordonaro and D. Marletta. 2009. Bioactive Peptides in Dairy Products. Italian Journal Animal Science 8: 315-340. Tomotake, H., R. Okuyama., M. Katagiri., M. Fuzita M. Yamato and F. Ota. 2006. Comparison Between Holstein Cow's Milk and Japanese Saanen Goat's Milk in Fatty Acid Composition, Lipid Digestibility and Protein Profile. Biotechnology and Biochemistry 70: 2771-2774. Wati, I. P., Aulanni’am dan C. Mahdi. 2013. Aktivitas Protease dan Gambaran

Histologi Ginjal Tikus Putih (Rattus norvegicus) Pasca Induksi CyclosporineA. Kimia.Studentjournal 1(2): 257-263. Yudomustopo, B. 2006. Abstrak Peroksida Lipid dan Glutation Peroksidase Jantung Akibat Diet Makanan Tinggi Garam: Penelitian Eksperimental pada Model Hewan Coba Tikus Sprague Dawley Bunting. Penelitian Kesehatan Seri 24 (Abstrak). Yusuf, I. 2008. Hipertensi Sekunder. Medical Review 21(3) Edisi Juli. Zuhir, E. 2011. Hubungan Gangguan Fungsi Kognitif Dengan Hipertensi Ditinjau Dari Aspek Il-6 Dan Tnf-Αlfa [Thesis]. Program Pascasarjana. Universitas Andalas. Padang.

13