PENGARUH PEMBERIAN PERASAN BUAH LABU SIAM (Sechium edule (Jacq.) Sw.) TERHADAP EKSPRESI INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE (iNOS) PADA MENCIT (Mus musculus) HASIL INDUKSI STREPTOZOTOCIN (STZ) Fadilatus Shoimah, Betty Lukiati, dan Nugrahaningsih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang Email:
[email protected]
ABSTRAK: Diabetes Melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang ditandai dengan peningkatan kadar glukosa darah (hiperglikemia) akibat defisiensi insulin, penurunan sensitivitas jaringan terhadap insulin atau keduanya. Salah satu indikator diabetes yaitu kerusakan sel beta pankreas yang diikuti dengan peningkatan ekspresi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS). Labu siam merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki potensi sebagai obat herbal antidiabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perasan buah labu siam terhadap ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit hasil induksi Multiple Low Doze Streptozotocin (MLD-STZ). Dua puluh empat ekor mencit berumur 8 minggu, berat 20±2 g dibagi menjadi 6 perlakuan dan 4 ulangan. Kelompok mencit kontrol (tanpa induksi MLD-STZ), kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ tanpa diberi perasan buah labu siam, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dengan dosis 121 mg/20 gBB, 242 mg/20 gBB, 363 mg/20 gBB, dan 484 mg/20 gBB. Mencit diabetes diperoleh dengan menginjeksikan MLD-STZ secara intraperitoneal selama 10 hari berturut-turut. Perasan buah labu siam diberikan secara oral selama 14 hari. Ekspresi iNOS diamati menggunakan teknik imunohistokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perasan buah labu siam memiliki kecenderungan untuk menurunkan ekspresi iNOS pada sel beta pankreas, namun tidak signifikan. Kata kunci: diabetes melitus, perasan buah labu siam, inducible nitric oxide synthase (iNOS), streptozotocin, mencit (Mus musculus). ABSTRAK: Diabetes Mellitus (DM) characterized by increasing blood glucosa levels (hyperglicemia) due insulin deficiency, decreased sensitivity insulin in tissue or both. Indicator of diabetes such as pancreatic beta cell damage, followed by increased of inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) expression. Chayote is one of the plants that have potential as a herbal medicine of antidiabetic. The aims of the study is determine the effect of the chayote fruit juice in iNOS expression in pancreatic beta cells mice induced by Multiple Low Doze Streptozotocin (MLD-STZ). Chayote fruit juice dose 121, 242, 363, and 484 mg/20 gBW by oral administration for 14 consecutive days. The result showed that chayote fruit juice has no effect againts of iNOS expression in pancreatic beta cells, however have tendency to decrease of iNOS expression in pancreatic beta cells. Kata kunci: diabetes mellitus, chayote fruit juice, inducible nitric oxide synthase (iNOS), streptozotocin, mice (Mus musculus).
Diabetes Melitus (DM) adalah penyakit yang ditandai dengan meningkatnya kadar glukosa darah di atas batas normal (hiperglikemia) akibat berkurangnya sekresi insulin, resistensi insulin atau keduanya (American Diabetes Assosiation, 2004). World Health Organization (WHO) menggolongkan penyakit DM sebagai penyakit kronik yang umum hampir terjadi di setiap negara dan selalu mengalami peningkatan setiap tahun (Whiting et al., 2011; Canadian Diabetes Assosiation, 2013). Indonesia menempati urutan ke 4 dunia dengan jumlah penderita diabetes sebesar 8,4 juta pada tahun 2000 dan diperkirakan meningkat pada tahun 2030 sebesar 21,3 juta (Wild et al., 2014). Dua tipe utama DM yaitu DM tipe 1 dan DM tipe 2. Diabetes tipe 1 disebabkan berkurangnya sekresi insulin akibat kerusakan sel beta pankreas yang didasari oleh proses autoimun (Whiting et al., 2011). Nugroho (2006) menjelaskan bahwa kerusakan sel beta pankreas dapat disebabkan oleh infeksi virus, pemberian senyawa toksin, diabetagonik (streptozotocin, aloksan), atau secara genetik. Diabetes tipe 2 merupakan diabetes yang disebabkan oleh resistensi insulin yaitu turunnya kemampuan insulin untuk merangsang pengambilan glukosa oleh jaringan perifer (Ndraha, 2014). Pengobatan oral dengan berbagai macam obat sintetis dapat diandalkan untuk penderita DM (Bastaki, 2005). Cara ini dapat menimbulkan efek samping jika digunakan dalam jangka waktu panjang yaitu dapat menyebabkan kerusakan organ lainnya. Back to nature merupakan alternatif yang dapat dikembangkan dengan memanfaatkan senyawa bioaktif dalam tumbuhan. Labu siam merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki potensi sebagai obat antidiabetes. Penelitian Maity et al. (2013) pemberian ekstrak etanol buah Sechium edule secara signifikan dapat menurunkan kadar glukosa darah pada tikus diabetes yang diinduksi aloksan. Aini et al. (2014) menyatakan bahwa ekstrak etanol labu siam memiliki aktivitas antioksidan, serta memiliki kandungan total fenol sebesar 0,78%. Mukminin (2016) menjelaskan bahwa perasan buah labu siam dapat menurunkan kadar glukosa darah mencit hasil induksi STZ. Penelitian tersebut juga menjelaskan bahwa perasan buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat, dengan IC50 34,35567 µg/ml, serta terdeteksi mengandung senyawa polifenol dan flavonoid. Penelitian bertujuan untuk mengeksplor potensi perasan buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) terhadap ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit hasil induksi Multiple Low Dose Streptozotocin (MLD-STZ). METODE Penelitian yang akan dilakukan ini merupakan penelitian eksperimental. Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari enam perlakuan dan empat ulangan. Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2015 sampai Mei 2016. Penelitian dilakukan di pemeliharaan hewan coba Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang, Laboratorium Biosciense Universitas Brawijaya.
Persiapan Hewan Uji Sebanyak 24 ekor mencit (Mus musculus) jantan galur Balb/c dalam keadaan sehat, berat 20±2 gram, umur 8-10 minggu. Mencit terlebih dahulu diaklimatisasi selama satu minggu, diberi pakan pellet susu A, dan diberi air minum secara ad libitum. Persiapan Pembuatan Perasan Buah Labu Siam Buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) yang digunakan yaitu yang muda (siap panen). Pembuatan perasan buah labu siam dilakukan dengan cara buah dikupas kulitnya dan diambil daging buahnya, kemudian ditimbang, dipotong-potong dan diparut kemudian disaring dengan kertas saring. Preparasi Mencit DM Mencit DM diperoleh dengan cara injeksi MLD-STZ dosis 20 mg/kgBB secara intraperitoneal selama 10 hari berturut-turut. Mencit dikatakan DM jika kadar glukosa darah puasa melebihi 126 mg/dl. Perlakuan Hewan Uji Hewan uji dibagi menjadi 6 kelompok, masing-masing kelompok 6 ulangan. Kelompok mencit sehat (tanpa injeksi MLD-STZ), kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ tanpa diberi perasan buah labu siam, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 121 mg/20 gBB, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 242 mg/20 gBB, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 363 mg/20 gBB, dan kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 484 mg/20 gBB. Pemberian perasan buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) dilakukan secara oral. Kadar glukosa darah mencit diukur sebelum perlakuan pada hari kelima dan kesepuluh menggunakan glukometer. Mencit diberi perlakuan selama 14 hari setelah mencit mengalami DM. Glukosa darah mencit diukur kembali pada hari kelimabelas dari awal pemberian perlakuan. Pada akhir perlakuan/hari kelimabelas mencit didislokasi dan dibedah untuk diambil organ pankreas. Selanjutnya, pankreas dibuat preparat dan dilakukan pewarnaan imunohistokimia untuk mengamati ekspresi iNOS. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) sel beta pankreas mencit hasil induksi STZ diamati pada jaringan pankreas dengan teknik immunohistokimia, yang ditunjukkan dengan warna kecoklatan. Hasil pengamatan ekspresi iNOS sel beta pankreas seperti pada Gambar 1.
A
B
C
D
E
F
Gambar 1. Distribusi iNOS Sel Beta Pankreas Mencit metode imunohistokimia perbesaran 400x ( : sel beta yang mengekspresikan iNOS, : sel beta yang tidak mengekspresikan iNOS) Keterangan:
A = Sel beta pankreas mencit kontrol (tanpa STZ) B = Sel beta pankreas mencit diabetes (Pemberian MLD-STZ) C = Sel beta pankreas mencit perlakuan 1 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah labu siam dosis 121 mg/20gBB) D = Sel beta pankreas mencit perlakuan 2 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah labu siam dosis 242 mg/20gBB) E = Sel beta pankreas mencit perlakuan 3 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah labu siam dosis 363 mg/20gBB) F = Sel beta pankreas mencit perlakuan 4 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah labu siam dosis 484 mg/20gBB)
Jumlah sel beta yang mengekspresikan iNOS pada mencit hasil induksi MLD-STZ menunjukkan peningkatan dibandingkan dengan mencit kontrol. Sel beta pankreas mencit yang tidak diinduksi MLD-STZ (kontrol) menunjukkan warna coklat dalam jumlah sedikit, sedangkan warna coklat semakin bertambah pada sel beta pankreas mencit yang diinduksi MLD-STZ. Sel beta pankreas mencit yang telah diberi perasan buah labu siam dengan variasi dosis menunjukkan warna coklat semakin berkurang. Presentase ekspresi iNOS diperoleh dengan cara menghitung jumlah sel beta yang berwarna coklat dibandingkan dengan jumlah keseluruhan sel beta pada 3 bidang pandang. Rerata presentase ekspresi iNOS disajikan dalam bentuk diagram batang (Gambar 2.).
Gambar 2. Diagram Batang Rerata presentase Ekspresi iNOS Sel Beta Pankreas Mencit Setelah Pemberian Perasan Buah Labu Siam
Diagram tersebut menunjukkan bahwa rerata persentase ekspresi iNOS pada mencit hasil induksi STZ lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (tanpa pemberian STZ). Mencit hasil induksi STZ yang telah diberi perasan buah labu siam pada dosis 121 mg/20 gBB, 242 mg/20 gBB, 363 mg/20 gBB, dan 484 mg/20 gBB menunjukkan penurunan ekspresi iNOS pada sel beta pankreas dibandingkan dengan mencit yang tidak diberi perasan buah labu siam. Pemberian perasan buah labu siam dengan dosis 121 mg/20 gBB mampu menurunkan ekspresi iNOS sel beta pankreas mendekati mencit kontrol. Hasil analisis Anova menunjukkan nilai F sebesar 2,232 > 2,77 (Ftabel) dengan signifikasi 0,096 (p>0,05). Hasil tersebut menunjukkan bahwa pemberian perasan buah labu siam tidak berpengaruh secara signifikan terhadap penurunan ekspresi iNOS sel beta pulau langerhans pankreas mencit hasil induksi STZ, sehingga tidak dilakukan uji lanjut.
Pembahasan Hasil penelitian menunjukkan rerata presentase ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit yang diinduksi STZ lebih tinggi dibandingkan ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit kontrol. Peningkatan ekspresi iNOS pada mencit yang diinduksi STZ disebabkan STZ memicu pembentukan radikal bebas yang dapat menginduksi sintesis iNOS. Lenzen (2008) menjelaskan bahwa STZ merupakan penyumbang radikal bebas yang dapat merusak biomakromolekul seperti lipid, fosfolipid, dan karbohidrat serta DNA yang berada di dalam inti sel. Streptozotocin dapat masuk sel beta pankreas melalui transporter glukosa 2 (GLUT 2) karena struktur kimianya mirip dengan glukosa. Peningkatan ekspresi iNOS sel beta pankreas dapat dikaitkan dengan adanya peningkatan radikal bebas yang dapat memicu respon imun. Reuter (2010) menyatakan bahwa stres oksidatif dapat mengaktifkan beberapa faktor transkripsi, diantaranya Nuclear Factor Kappa B (NFkB). Aktivasi faktor transkripsi tersebut dapat memicu ekspresi beberapa gen berbeda seperti growth factors, sitokin, kemokin, dan molekul anti inflamasi. Nuclear Factor Kappa B dalam bentuk tidak aktif di sitosol berikatan dengan Inhibitor Kappa B (IkB) membentuk kompleks IkB-NFkB. Stres oksidatif akan mendegradasi IkB-NFkB, akibatnya NFkB bebas ditransfer ke nukleus dan dapat menginduksi ekspresi iNOS (Aktan, 2003). Kleinert et al. (2003) menjelaskan bahwa sitokin seperti interferon-γ (IFNγ), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF- α) juga dapat menginduksi iNOS. Sitokin akan melakukan respon imun dengan mengaktifkan iNOS dan membentuk NO dalam jumlah banyak pada tingkat transkripsi melalui aktivasi faktor transkripsi NFkB (Aktan, 2003). Keterkaitan antara kerusakan sel beta pankreas akibat induksi STZ dengan meningkatnya ekspresi iNOS dapat digambarkan pada Gambar 3.
Gambar 3. Keterkaitan Kerusakan Sel Beta Pankreas Mencit akibat Induksi STZ dengan Peningkatan iNOS serta Mekanisme Perbaikan Sel Beta Pankreas oleh Rutin ( : meningkatkan; : menghambat)
Nilai rerata presentase ekspresi iNOS mencit hasil induksi STZ setelah pemberian perasan buah labu siam menunjukkan adanya penurunan, pada dosis 121 mg/20 gBB penurunan hampir mendekati mencit kontrol. Efek penurunan ekspresi iNOS dapat disebabkan adanya kandungan senyawa aktif pada buah labu siam. Kandungan tersebut dapat berperan sebagai antioksidan yang mampu melawan radikal bebas sehingga mengurangi ekspresi iNOS. Penelitian sebelumnya oleh Mukminin (2016) menunjukkan perasan buah labu siam mengandung peonidin yang termasuk senyawa polifenol dan rutin yang termasuk senyawa flavonoid serta memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dengan IC50 sebesar 34,35567 µg/mL. Aktivitas antioksidan yang tinggi ini dapat dikaitkan dengan struktur kimia flavonoid dan polifenol yang memiliki banyak gugus hidroksil (OH). Saxena et al. (2012) menjelaskan bahwa flavonoid dan polifenol memiliki karakteristik struktur kimia dengan cincin aromatik dan banyak gugus fenol (OH). Senyawa tersebut dapat melawan kerusakan oksidatif pada penyakit degeneratif seperti diabetes, inflamasi dan kanker. Polifenol dapat mengurangi ekspresi iNOS dan pelepasan NO melalui penghambatan aktivasi faktor transkripsi (Vauzour et al., 2010). Rutin sebagai senyawa golongan flavonoid memiliki kemampuan sebagai antioksidan untuk melindungi sel dari pengaruh ROS seperti superoksida, radikal peroksil, radikal hidroksil dan peroksinitrit (Gupta et al., 2014). Penelitian sebelumnya oleh Korkmaz dan Kolanyaka (2013) menyebutkan bahwa rutin dapat menghambat aktivitas iNOS pada ginjal tikus yang mengalami iskemia. Aktivitas antioksidan rutin dapat dikaitkan dengan struktur fenol yang dimiliki rutin. Senyawa fenol (sistem aromatik dan gugus –OH) serta ikatan rangkap terkonjugasi merupakan struktur yang diperlukan dalam menangkal radikal bebas. Gugus OH yang banyak pada rutin memungkinkan rutin dapat mendonorkan atom hidrogen ke radikal bebas. Gugus hidrogen dari senyawa flavonoid dapat berikatan dengan radikal bebas dan mengubah radikal bebas yang reaktif menjadi lebih stabil. Transfer atom hidrogen dapat mengurangi dan mencegah pembentukan radikal bebas, akibatnya aktivasi faktor transkripsi NFkB dapat ditekan (Aulanni’am et al.,2012; Gulcin, 2012) Kim et al. (2013) menjelaskan bahwa rutin dapat menghambat aktivasi NF-kB dan Activator Protein 1 (AP-1). Penghambatan aktivasi NFkB ini dapat menghambat ekspresi gen iNOS dan gen sitokin, sehingga ekspresi iNOS juga akan berkurang dan sel dapat mengalami perbaikan. Rutin memperlihatkan aktivitas antidiabetik melalui penghambatan sitokin inflamasi (IL-6 dan TNF-α), meningkatkan antioksidan, dan profil plasma lipid (Niture et al., 2014).
SIMPULAN Perasan buah labu siam memiliki kecenderungan untuk menurunkan ekspresi iNOS sel beta pankreas mencit hasil induksi MLD-STZ, namun secara statistik tidak signifikan.
DAFTAR RUJUKAN Aini, K., Betty, L. & Balqis. 2014. Skrining Fitokimia dan Penentuan Aktivitas Antioksidan Serta Kandungan Total Fenol Ekstrak Buah Labu Siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.). Prosiding Seminar dan Workshop Nasional Biologi/IPA dan Pembelajarannya. 1004-1009. Malang: FMIPA UM. Aktan, F. 2004. iNOS-Mediated Nitric Oxide Production and Its Regulation. Life Sciences, 75: 639-653. American Diabetes Association. 2004. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 27: 6-10. Aulanni’am, A., Roosdiana & Rahmah, N.L. 2012. The Potency of Sargassum duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Sciences, 6: 144-154. Bastaki, S. 2005. Diabetes Mellitus and its Treatment. International Journal Diabetes & Metabolism, 13: 111-134. Canadian Diabetes Association. 2013. Reducing the Risk of Developing Diabetes. Canadian Journal of Diabetes, 37: S16-S17. Dewi, D.R., Aulanni’am & Roosdiana, A. 2013. Studi Pemberian Ekstrak Rumput Laut Coklat (Sargassum prismaticum) terhadap Kadar MDA dan Histologi Jaringan Pankreas pada Tikus (Rattus norvegicus) Diabetes Melitus Tipe 1 Hasil Induksi MLD-STZ (Multiple Low Dose-Streptozotocin). Kimia Student Journal, 2 (1): 351-357. Gulcin, I. 2012. Antioxidanr Activity of Food Constituents: an Overview. Archieves of Toxicology, 86: 345-391. Gupta, N., Cahuhan, R.S. & Pradhan. 2014. Rutin: A Bioactive Flavonoid. Handbook of Medical Plants and Their Bioactive Compounds, 51-57. Kim, J.H., Kim, B.B., Lee, K.W., & Kang, N.J. 2013. Protective Effect of Rutin againts Ultraviolet B-induced Cyclooxygenase-2 Expression in Mouse Epidermal Cells. Food Scence and Biotechnol, 22(5): 1429-1434. Kleinert, H., Schwarz, P.M., Förstermann, U. 2003. Regulation of the Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase. Biological Chemistry, 384: 1343-1364. Korkmaz, A. & Kolankaya, D. 2013. Inhibiting Inducible Nitric Oxide Synthase with Rutin Reduces Renal Ischemia/Reperfusion Injury. Journal of the Canadian Chiropractic, 56 (1): 6-14. Lenzen, S. 2008. The Mechanisms of Alloxan and Streptozotocin-Induced Diabetes. Diabetagonia, 51 (2) :216-226. Maity, S., Firdous, S.M. & Debnath, R. 2013. Evaluation of Antidiabetic Activity of Ethanolic Extract of Sechium edule Fruits in Alloxan-Induced Diabetes
Rats. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 2(5): 36123621. Mukminin, L.H. 2016. Identifikasi Senyawa Bioaktif dan Uji Antioksidan Perasan Labu Siam (Sechium edule (Jacq). Sw.) untuk Terapi Mencit Balb/C Diabetes Hasil Induksi Streptozotocin. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Ndraha, S. 2014. Diabetes Melitus Tipe 2 dan Tatalaksana Terkini. Medicinus, 27(2): 9-16. Niture, N.T., Ansari, A.A., & Naik S.R. 2014. Anti-hyperglycemic Activity of Rutin in Streptozotocin-induced Diabetic Rats: An Effect Mediated through Cytokines, Antioxidants and Lipid Biomarkers. Indian Journal of Experimental Biology, 52: 720-727 Nugroho, A.E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Mellitus: Patologi dan Mekanisme Aksi Diabetagonik. Biodiversitas, 7(4): 378-382. Reuter, S., Gupta, S.C., Chateurvedi, M.M., & Aggarwal, B.B. 2010. Oxidative Stress, Inflamation, and Cancer: How are they Linked?. Free Radic Biol Med, 49 (11): 1603-1616. Saxena,M., Saxena, J. & Pradhan, A. 2012. Flavonoids and Phenolic Acids as Antioxidants in Plants and Human Health. International Journal Pharmacheutical Sciences Review and Research, 16(2): 130-134. Vauzour, D., Mateos, A.R., Corona, G., Concha, M.J.O., & Spencer, J.P.E. 2010. Polyphenols and Human Health: Prevention of Disease and Mechanisms of Action. Nutrients, 2: 1106-1131. Whiting, D.R., Guariguata, L., Weil, C., & Shaw, J. 2011. IDF Diabetes Atlas: Global Estimates of the Prevalence of Diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Research and Clinical Practice, 94: 311-321. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., & King, H. 2004. Global Prevalence of Diabetes: Estimates for year 2000 and Projections for 2030. Journal Diabetes Care, 27 (5): 47-53.
