PENGARUH TERAPI YOGHURT SUSU KAMBING TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA (MDA) DAN EKSPRESI TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF-α) ORGAN HATI HEWAN MODEL TIKUS (Rattus norvegicus) HIPERKOLESTEROLEMIA Therapeutic Effect of Goat Milk Yogurt on Malondialdehyde (MDA) Levels and Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) Expression in Liver of Hypercholesterolemic Animal Model Rattus norvegicus
Anggun S. Larasathi*, Chanif Mahdi, Masdiana C. Padaga Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya *
[email protected]
ABSTRAK Pola makan dengan diet tinggi lemak dapat menyebabkan hiperkolesterolemia, yaitu suatu keadaan dimana kadar kolesterol dalam darah melebihi batas normal. Angka kejadian hiperkolesterolemia cukup tinggi dan dapat menyebabkan penyakit jantung koroner. Yoghurt susu kambing mengandung bakteri asam laktat, biopeptida, antioksidan, dan vitamin yang dapat menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh terapi yoghurt susu kambing terhadap kadar Malondialdehida (MDA) dan ekspresi Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) pada organ hepar tikus (Rattus norvegicus) hiperkolesterolemia. Penelitian ini menggunakan 20 ekor tikus umur 10-12 minggu yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu kelompok kontrol, hiperkolesterolemia, hiperkolesterolemia dan terapi dosis 300, 600, dan 900 mg/kg BB. Pembuatan hewan model hiperkolesterolemia dengan pemberian kuning telur puyuh rebus, minyak babi, dan asam kholat selama 14 hari dan terapi yoghurt susu kambing diberikan selama 28 hari. Kadar MDA diamati dengan metode Thiobarbituric Acid Reactivity Test (TBA-RT) dan ekspresi TNF-α dengan metode imunohistokimia dengan menggunakan software Axio Vision. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan SPSS versi 16.0 dengan analisis ragam One Way Analisis Of Variance (ANOVA) dan dilakukan analisis lebih lanjut dengan uji Tukey (p<0,01). Hasil One Way ANOVA kadar MDA dan ekspresi TNF-α pada tikus perlakuan menunjukkan adanya perbedaan yang sangat nyata (p<0,01). Terapi yoghurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB dan 600 mg/kg BB mempunyai potensi menurunkan kadar MDA dan ekspresi TNF-α organ hati hewan model tikus hiperkolesterolemia. Terapi yoghurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis yang paling potensial dalam menurunkan kadar MDA (58,81%) dan menurunkan ekspresi TNF-α (83,88%) organ hati hewan model tikus hiperkolesterolemia. Kesimpulan dari penelitian ini, yoghurt susu kambing dapat dijadikan salah satu alternatif pengobatan hiperkolesterolemia. Kata kunci : Hiperkolesterolemia, Yoghurt susu kambing, MDA, TNF-α, Hati
1
ABSTRACT The habitual of consuming fatty foods triggers hypercholesterolemia which is characterized by increasing of cholesterol level in the blood higher than the limit. The prevalence of hypercholesterolemia is enormous and possible cause of death. The aim of this research was to study therapeutic effect of goat milk yogurt on the Malondialdehyde (MDA) levels and TNF-α expression in hypercholesterolemic rat’s liver. This research used male rats, age of 10-12 weeks which was divided into five groups; control, hypercholestrolemia, hypercholesterolemia with goat milk yogurt therapy dose of 300, 600, and 900 mg/kg BW. The hypercholesterolemic rats was prepared by administered the egg yolk of boiled quail, lard, and cholic acid for 14 days. The goat milk yogurt therapy was conducted for 28 days by force feeding method. MDA level was measured using the Thiobarbituric Acid Reactivity Test (TBA-RT) methode and TNF-α expression was observed using immunohistochemistry. Data was analysed by SPSS 16.0 version using one way Analysis of Variance (ANOVA), continued by Tukey test (p<0.01). The result of One Way ANOVA showed that the average of MDA level and TNF-α expression from each group was high significantly different (p<0.01). The goat milk yogurt therapy dose of 300 mg/kg BW and 600 mg/kg BW had a potensial to decrease MDA level and TNF-α expression in liver of hypercholesterolemic animal model. The goat milk yogurt therapy dose of 900 mg/kg BW is the most effective dose in decreasing MDA level (58.81%) and TNF-α expression (83.88%) in liver of hypercholesterolemic animal model. It could be concluded, the goat milk yogurt therapy could be used as alternative therapy for hypercholesterolemia. Keywords: Hypercholesterolemia, Goat Milk Yogurt, MDA, TNF-α, Liver PENDAHULUAN Penyakit kardiovaskular terutama penyakit jantung koroner menempati urutan pertama penyebab kematian di dunia. Menurut WHO (2011), kasus penyakit kardiovaskular adalah sebesar 17 juta dengan 7,3 juta merupakan kasus penyakit jantung koroner yang disebabkan oleh hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia adalah suatu keadaan yang ditandai dengan peningkatan kadar kolesterol total dalam darah yaitu ≥ 200 mg/dl pada manusia (Anwar, 2004). Hiperkolesterolemia mengakibatkan adanya akumulasi trigliserida, kolesterol, dan asam lemak di dalam sel hati. Sel-sel hati yang penuh dengan lemak mengakibatkan gangguan fungsi hati khususnya dalam hal menyaring dan membersihkan aliran darah sehingga aliran darah menjadi penuh dengan lemak. Tubuh akan berusaha untuk menyeimbangkan kadar kolesterol dalam darah dengan cara sintesis asam empedu
ketika tubuh dalam kondisi hiperkolesterolemia. Asam empedu yang disintesis oleh hati berbanding lurus dengan jumlah radikal bebas yang dihasilkan sebagai hasil sampingan (Wresdiyati dkk, 2006). Radikal bebas yang terbentuk akan menimbulkan peroksidasi lipid pada jaringan hati dengan salah satu indikator berupa malondialdehida (MDA) (Luczaj dan Elzbieta, 2003). Penelitian-penelitian sebelumnya melaporkan bahwa peningkatan konsentrasi lipid peroksidasi terdapat pada hewan coba model hiperkolesterolemia. Peroksidasi lipid dalam jumlah yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan membran sel (Tombilangi, 2004). Radikal bebas menyebabkan peradangan pada jaringan hidup yang memiliki vaskularisasi. Perlekatan Low Density Lipoprotein (LDL) teroksidasi pada makrofag akan menyebabkan 2
peningkatan ekspresi Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α). Diet tinggi kolesterol juga dapat menyebabkan peningkatan TNF-α pada pasien obesitas (Bastard et al., 2006). Obat-obat antikolesterol seperti statin telah banyak dikembangkan untuk menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Penggunaan statin untuk jangka panjang akan mengakibatkan efek samping berupa gangguan hati dan ginjal. Susu banyak digunakan sebagai yoghurt dengan penambahan bakteri probiotik untuk meningkatkan manfaat terapeutik. Susu kambing tidak mengandung aglutinin dan memiliki kadar laktosa yang lebih rendah jika dibandingkan dengan susu sapi sehingga lebih mudah dicerna (Setiawan dan Tanius, 2002). Probiotik di dalam tubuh dapat mereduksi konsentrasi kolesterol serum (Kartini, 2002). Lactobacillus sp sebagai bakteri probiotik mampu mengikat kolesterol di dalam saluran pencernaan dan dibuang bersama feses. Yoghurt memiliki antioksidan untuk menangkal radikal bebas serta antiinflamasi untuk mengurangi jumlah sitokin proinflamasi. Asam organik sebagai produk utama fermentasi dari laktat mampu menurunkan kolesterol, diantaranya asam glukorat, asam laktat, asam glukonat, asam folat, dan asam ferolat. Oleh karena itu, penelitian dilakukan untuk mengetahui pengaruh terapi yoghurt susu kambing sebagai bahan terapi hiperkolesterolemia berdasarkan kadar MDA dan ekspresi TNF-α pada organ hati tikus (Rattus norvegicus) yang diberi diet hiperkolesterol.
kelompok perlakuan terdiri dari empat ekor tikus sebagai ulangan. Hewan coba menggunakan hewan coba tikus (Rattus norvegicus) yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dengan umur 10-12 minggu dan berat badan sekitar 150 gram. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini mendapatkan persetujuan laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya, No: 217-KEP-UB. Pembuatan Diet Hiperkolesterol Metode pakan diet hiperkolesterol (Gani dkk., 2013 ), pakan diet hiperkolesterol terdiri dari asam kholat 0,1%, minyak babi 10%, dan kuning telur puyuh rebus segar 5%. Semua bahan dicampur lalu diencerkan dengan akuades sampai volume 2 ml. Pakan diet hiperkolesterol diberikan setiap hari selama 14 hari dengan metode force feeding sebesar 3,02gr/2ml. Setelah itu, tikus diberi minum dan pakan standar. Pakan yang diberikan sebanyak 20 g/ekor/hari. Komposisi bahan pakan hiperkolesterol dalam 20 gram pakan dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Komposisi bahan pakan hiperkolesterol dalam 20 gram pakan Bahan Jumlah Jumlah Kandungan Bahan (%) (gram) Asam 0,1 0,02 kholat Minyak 10 2 babi Kuning 5 1 telur puyuh
MATERI DAN METODE Pembuatan Starter Yoghurt Susu Kambing Susu kambing 100 ml dituangkan ke dalam erlenmeyer 250 ml steril lalu ditutup dengan aluminium foil. Susu dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit, kemudian didinginkan hingga suhu turun sampai 40oC-45oC. Starter ditimbang sebanyak 0,5 gram lalu dicampur sedikit dengan susu kambing dan dihomogenkan.
Preparasi Hewan Coba Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol (A), kelompok hiperkolesterolemia (B), hiperkolesterolemia dan terapi yoghurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB (C), dosis 600 mg/kg BB (D), dan dosis 900 mg/kg BB (E). Masing-masing 3
Inokulasi starter selanjutnya dilakukan ke dalam susu kambing 100 ml (w/v). Inkubasi dilakukan pada suhu 40oC-45oC selama 4-8 jam dan sampai pH rata-rata yoghurt sekitar 4,00-4,5 (Posecion et al., 2005).
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimun dan hasil absorbansi MDA larutan baku dan dibuat kurva. Pengukuran Kadar MDA Tikus dipreparasi terlebih dahulu dengan cara cervical dislocation. Tikus diposisikan pada papan bedah menggunakan pins. Tikus dibedah mulai dari bagian perut lalu organ hati diambil dan dipisahkan. Organ hati dibersihkan dari lemak-lemak yang masih menempel dan dicuci dengan NaCl-fisiologis 0,9%, kemudian dimasukkan dalam larutan Phospate Buffer Saline-azida (PBS-azida). Organ hati ditimbang seberat 1 gram lalu digerus hingga halus dengan mortar dingin kemudian ditambahkan 1 ml NaCl-Fis 0,9% dan dilakukan homogenasi. Homogenat diambil dan dipindahkan ke tabung microtube. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan diambil supernatannya. Supernatan sebanyak 100 μL dimasukkan ke dalam microtube baru lalu ditambah 550 μl akuades dan dihomogenkan. Setelah itu, 100 μl TCA 100% dimasukkan dan dihomogenkan. Larutan ditambahkan 100 μL HCL 1 N dan Na-Thio 1 % sebanyak 100 μL dan dihomogenkan kembali. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 500 rpm selama 10 menit dan supernatannya diambil. Setelah itu, dipanaskan selama 30 menit dalam suhu 1000C. Supernatan diambil kemudian dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum.
Pembuatan Yoghurt Susu Kambing Susu kambing 485 ml dituangkan ke dalam botol tutup berulir 1000 ml lalu ditutup dengan aluminium foil. Susu dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5 menit kemudian didinginkan hingga suhu susu turun sampai 40oC-45oC. Inokulasi starter dengan kosentrasi 3% ke dalam susu kambing 485 ml (v/v) lalu dihomogenkan secara perlahan. Inkubasi dilakukan pada suhu 40oC-45oC selama 48 jam dan sampai pH rata-rata yoghurt sekitar 4,5-5 (Posecion et al., 2005). Yoghurt susu kambing dijadikan kering beku dan disimpan pada suhu 4-5oC. Pemberian Terapi Yoghurt Susu Kambing Terapi yoghurt susu kambing diberikan setelah tikus diinduksi diet hiperkolesterolemia selama 14 hari. Kelompok tikus yang diberikan terapi yaitu kelompok C, D, dan E dengan dosis berturut-tutut sebesar 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB. Terapi diberikan secara per oral dengan sonde lambung sebanyak 1,5 ml selama 28 hari. Pembuatan Kurva Baku MDA Larutan stok kit standar MDA dengan konsentrasi sebesar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 mg/mL diambil masing-masing 100 μL. Larutan dimasukkan ke tabung reaksi yang berbeda dan ditambahkan 550 μL akuades dan 100 μL TCA 100% lalu dihomogenkan degan vortex. Larutan ditambahkan 250 μL HCl 1N dan 100 μL Na-Thio 1% ke dalam tabung dan dihomogenkan. Sentrifugasi pada kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Setelah itu, dipanaskan selama 30 menit dalam suhu 1000C. Larutan didiamkan pada suhu ruang lalu supernatan diambil dan larutan standar kemudian dibaca
Pengamatan Ekspresi TNF-α Organ hati dibersihkan dari lemaklemak yang masih menempel dan dicuci dengan NaCl-fisiologis 0,9%, kemudian organ hati dimasukkan ke dalam larutan Paraformaldehyde (PFA). Organ hati selanjutnya dijadikan preparat untuk imunohistokimia dengan cara fiksasi, dehidrasi, clearing, embedding, dan section. Tahap awal imunohistokimia adalah tahap deparafinisasi yaitu, preparat 4
direndam dalam larutan xylol, alkohol 100%, 95%, 90%, 80%, dan 70%. Preparat dicuci dalam PBS pH 7,4 dan direndam 3% hidrogen peroksida (H2O2). BSA 2% kemudian diberikan dilanjutkan dengan pemberian antibodi primer, anti-rat TNF-α dan didiamkan selama 24 jam. Preparat selanjutnya ditambahkan antibodi sekunder, anti rabbit labelled biotin selama satu jam, SA-HRP selama 45 menit, dan kromogen DAB (3,3diaminobenzidine tetrahydrochloride) selama 10-20 menit. Counter staining dengan pewarna Major hematoxylin dilakukan lalu dicuci dengan akuades. Mounting dilakukan dengan entellan dan hasil akhir diamati dibawah mikroskop. Pengamatan tumor necrosis factor (TNF-α) dalam jaringan akan tampak dengan warna cokelat yang menunjukkan adanya ikatan kompleks antigen-antibodi. Keberadaan TNF-α pada hati dianalisis secara semi kuantitatif dengan cara membandingkan distribusi TNF-α pada kontrol dengan perlakuan pada perbesaran rendah (400x) menggunakan software Axio Vision.
Tabel 2. Rata-rata kadar MDA hati pada kelompok perlakuan Rata-rata Penurunan Kelompok kadar MDA (%) (μg/ml) A 2,44 ± 0,24a 100 B 6,07 ± 0,56c 0 b C 4,79 ± 0,36 21,09 D 3,33 ± 0,59a 44,43 E 2,50 ± 0,51a 58,81 Keterangan : Perbedaan notasi a, b dan c menunjukkan perbedaan yang sangat signifikan (p<0,01) antara kelompok perlakuan. Hasil ANOVA kadar MDA pada tikus perlakuan menunjukkan adanya perbedaan yang sangat nyata (p<0,01). Pada Tabel 2 diketahui bahwa kelompok tikus kontrol (A) memiliki rata-rata kadar MDA hati paling rendah yaitu 2,44 ± 0,24 μg/ml sedangkan kelompok tikus hiperkolesterolemia (B) memiliki rata-rata kadar MDA hati paling tinggi yaitu 6,07 ± 0,56 μg/ml. Pemberian terapi yoghurt susu kambing dengan dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan 900 mg, kg BB dapat menurunkan kadar MDA tikus hiperkolesterolemia berturut-turut 21,09%; 44,43%; dan 58,81%. Tikus kelompok A memiliki kadar MDA terendah karena hanya diberikan pakan normal sehingga kadar kolesterol dalam darah masih di dalam batas normal yaitu 10-54 mg/dl. Kolesterol akan memicu terbentuknya radikal bebas, namun jumlah radikal bebas pada tikus kelompok A tidak melebihi jumlah antioksidan yang terdapat dalam tubuh sehingga antioksidan mampu menangkap radikal bebas yang ada dan menghambat terjadinya peroksidasi lipid. Pada tikus kelompok B memiliki kadar MDA tertinggi karena tikus diberi diet hiperkolesterol dengan kandungan kolesterol 240,50 mg yang menyebabkan kadar kolesterol berbeda sangat nyata dengan kondisi normal sehingga tubuh akan berusaha menyeimbangkan kadar kolesterol dengan sintesa asam empedu. Efek samping sintesa asam empedu berupa
Analisa Data Data yang diperoleh dari hasil pengukuran kadar MDA dan ekspresi TNF-α organ hati dianalisis dengan suatu program SPSS versi 16.0 dengan melakukan uji analisis varian (ANOVA) dan dilakuan analisis lebih lanjut dengan uji Tukey (p<0,01), apabila terdapat perbedaan yang sangat nyata. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Terapi Yoghurt Susu Kambing Terhadap Kadar Malondialdehida (MDA) Organ Hati Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Rata-rata hasil kadar MDA hati pada kelompok perlakuan (Tabel 2) menunjukkan adanya perbedaan sangat nyata antar perlakuan (p<0,01).
5
radikal bebas yang memicu terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid akan membentuk MDA sebagai hasil metabolit reaktif, biomarker untuk menilai stres oksidatif. Jumlah kolesterol yang semakin banyak di dalam tubuh akan meningkatkan sintesa asam empedu sehingga semakin banyak radikal bebas yang dihasilkan. Peningkatan radikal bebas akan mengakibatkan semakin banyak MDA yang dihasilkan dari proses peroksidasi lipid. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian yang dilakukan Fki et al., (2005) bahwa pada kelompok tikus yang diberi pakan diet kaya kolesterol terjadi peningkatan jumlah malondialdehida (MDA) hati dibandingkan dengan kelompok normal. Kadar MDA pada tikus kelompok D dan E tidak berbeda sangat nyata dengan tikus kontrol sedangkan tikus kelompok C berbeda sangat nyata dengan tikus kontrol. Tikus kelompok C memberikan pengaruh yang sangat nyata yaitu kadar MDA tikus kelompok C tidak bisa dikatakan sama dengan tikus normal. Pada tikus kelompok C menunjukkan bahwa lipid pada tikus kelompok C tinggi sehingga lipid akan berikatan dengan radikal bebas atau disebut peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid pada tikus kelompok C dapat dikatakan lebih tinggi dibandingkan dengan tikus kelompok D dan E sehingga kadar MDA yang dihasilkan lebih banyak dan berbahaya bagi tubuh karena sifatnya yang toksik. Kadar MDA tikus kelompok C berbeda sangat nyata dengan tikus kontrol karena dosis pemberian yang lebih rendah sehingga memiliki daya antioksidan dan pengaruh bakteri asam laktat yang lebih kecil dibandingkan tikus kelompok D dan E. Pemberian yoghurt susu kambing dapat memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap tikus hiperkolesterolemia. Yoghurt susu kambing mengandung senyawa antioksidan yang dapat menangkap radikal bebas yang dihasilkan sebagai efek samping sintesa asam empedu. Antioksidan berfungsi sebagai
penangkap radikal bebas dan menghambat proses peroksidasi lipid sehingga dapat membantu menurunkan kadar radikal bebas yang tinggi akibat pemberian diet hiperkolesterol. Proses penghambatan peroksidasi lipid dengan cara menangkap radikal bebas dan mendonorkan atom hidrogen sehingga terbentuk senyawa yang lebih stabil yang mampu menghentikan reaksi berantai peroksidasi lipid. Susu mempunyai kandungan biopeptida aktif yang dapat dihasilkan melalui hidrolisa oleh enzim pencernaan dan proses enzimatik oleh mikroorganisme. Bakteri asam laktat pada yoghurt dapat memfermentasi susu sehingga menghasilkan biopeptida aktif, seperti laktoferin. Laktoferin mampu memperbaiki kerusakan sel karena menghambat produksi ROS pada membran sel dan bekerja dengan vitamin E dalam membatasi oksidasi lipid membran oleh ROS. Laktoferin menurut Guillen (2013) merupakan extracelullar iron binding. Iron intraseluler disebut heme dan disimpan dalam bentuk ferritin, ekstraseluler terikat oleh protein transferin atau laktoferin. Iron yang tidak terikat akan mengkatalis produksi ROS, maka melalui biopeptida laktoferin besi ekstraseluler akan diikat sehingga pembentukan ROS terhambat. Yoghurt juga mengandung bakteri asam laktat yang mempunyai enzim Bile Salt Hydrolase (BSH) sehingga mampu mendekonjugasi garam empedu sehingga menghasilkan garam empedu bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Garam empedu yang kembali ke hati menjadi berkurang sehingga tubuh akan menggunakan kolesterol sebagai prekursor untuk menyeimbangkan jumlah garam empedu sehingga terjadi penurunan jumlah kolesterol. Penurunan kadar kolesterol mengakibatkan penurunan jumlah lipid yang yang terpapar radikal bebas berkurang sehingga proses peroksidasi lipid berkurang disertai dengan penurunan jumah kadar MDA pada organ hati hewan model tikus (Rattus norvegicus) hiperkolesterolemia. 6
empedu. Radikal bebas selain dapat berikatan dengan lipid yang mengakibatkan peningkatan kadar MDA, juga akan mengganggu proses transkripsi nuclear factor kappa beta (NF-kB) pada sel hepatosit. Pengaktifan NF-kB akan mensekresikan sitokin proinflamasi seperti TNF-α. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian yang dilakukan Lakhanpal (2007) bahwa peningkatan lemak viseral akan meningkatkan ekspresi TNF-α. Ekspresi TNF-α pada tikus kelompok C berbeda sangat nyata dengan tikus kontrol, kelompok D tidak berbeda sangat nyata dengan kelompok C dan tikus kontrol, sedangkan kelompok E tidak berbeda sangat nyata dengan tikus kontrol. Tikus kelompok C memberikan pengaruh yang sangat nyata dan menunjukkan bahwa lipid pada tikus kelompok C tinggi sehingga tubuh akan berusaha menyeimbangkan kadar lipid yang tinggi dengan sintesa empedu. Sintesa empedu akan menghasilkan radikal bebas sebagai efek samping sehingga terjadi stres oksidatif. Antioksidan dalam tubuh tidak mampu menangkap radikal bebas yang terbentuk karena jumlahnya yang banyak sehingga radikal bebas akan mengganggu proses transkripsi dengan mengaktifkan NF-kB yang diketahui sebagai faktor transkripsi dalam menginduksi regulasi berbagai gen dalam respon inflamasi dan proliferasi sel, kemudian NF-kB akan meregulasi berbagai mediator inflamasi seperti regulasi TNF-α. Ekspresi TNF-α pada tikus kelompok E tidak mempunyai perbedaan yang sangat nyata dengan tikus kontrol karena mengandung senyawa imunostimulator dan antiinflamasi yang paling banyak dibanding dosis lainnya. Ekspresi TNF-α yang ditandai dengan warna cokelat dikarenakan adanya pengikatan kompleks antigen-antibodi yang dikenali SA-HRP yang mengikat H2O2 sehingga teroksidasi menjadi O2 dan H2O lalu O2 akan berikatan dengan substrat kromagen DAB sehingga memunculkan warna cokelat. Ekspresi TNF-α bisa dilihat pada Gambar 1.
Pengaruh Terapi Yoghurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) Organ Hati Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Rata-rata ekspresi TNF-α hati pada kelompok perlakuan (Tabel 3) menunjukkan adanya perbedaan sangat nyata antar perlakuan (p<0,01). Tabel 3. Rata-rata ekspresi TNF-α organ hati pada kelompok perlakuan Rata-rata Penurunan ekspresi Kelompok (%) TNF-α A 1,40 ± 0,70a 100 c B 15,14 ± 3,49 0 C 8,20 ± 1,58b 45,83 D 4,26 ± 1,90ab 71,86 E 2,44 ± 0,99a 83,88 Keterangan : Perbedaan notasi a, b dan c menunjukkan perbedaan yang sangat signifikan (p<0,01) antara kelompok perlakuan. Hasil ANOVA ekspresi TNF-α pada tikus perlakuan menunjukkan adanya perbedaan yang sangat nyata (p<0,01). Data pada Tabel 3 menunjukkan bahwa ekspresi TNF-α organ hati pada kelompok sehat (A) adalah 1,40 ± 0,70 dan kelompok hiperkolesterolemia (B) memiliki ekspresi TNF-α organ hati paling tinggi yaitu 15,14 ± 3,49. Pemberian terapi yoghurt susu kambing dengan dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan ekspresi TNF-α tikus hiperkolesterolemia berturut-turut 45,83%; 71,86%; dan 83,88%. Ekspresi TNF-α pada tikus kelompok A mempunyai ekspresi terendah karena kadar kolesterol di dalam darah masih dalam batas normal sehingga radikal bebas yang dihasilkan masih bisa ditangkap oleh antioksidan di dalam tubuh. Peningkatan ekspresi TNF-α pada kondisi hiperkolesterolemia dikarenakan pemberian diet hiperkolesterol dapat meningkatkan kadar kolesterol. Peningkatan kadar kolesterol berbanding lurus dengan jumlah radikal bebas yang dihasilkan dari sintesa asam 7
VC
VC
VC
VC
VC
Gambar 1. Ekspresi Tumor Necrosis Faktor Alpha (TNF-α) pada organ hati (400x) Ekspresi TNF-α pada tikus kelompok A mempunyai intensitas yang rendah (1,40 ± 0,70), sedangkan pada kelompok B terlihat intensitas yang paling tinggi (15,14 ± 3,49). Ekspresi TNF-α banyak terdapat di sekitar vena centralis karena vena centralis merupakan
pembuluh darah yang membawa darah dari seluruh tubuh ke hati sehingga lipid banyak terakumulasi di sekitar vena centralis. Lipid akan menginduksi munculnya radikal bebas sehingga radikal bebas akan mengganggu faktor transkripsi NF-Kb yang akan mensekresikan sitokin 8
proinflamasi yaitu TNF-α. Tikus kelompok C,D, dan E menunjukkan adanya penurunan intensitas ekspresi TNF-α berturut-turut yaitu 8,20 ± 1,58; 4,26 ± 1,90; dan 2,44 ± 0,99. Pemberian terapi yoghurt susu kambing memiliki pengaruh yang sangat nyata terhadap ekspresi TNF-α organ hati tikus hiperkolesterolemia. Yoghurt mempunyai kandungan probiotik yang dapat merangsang sistem kekebalan tubuh, baik melalui sistem kekebalan innate maupun adaptif. Probiotik mampu menurunkan sitokin proinflamasi TNF-α melalui peranan NF-kB yang merupakan faktor transkripsi yang berperan dalam merangsang dan mengkoordinasi respon imun innate dan adaptif. Mekanisme penurunan aktivasi NF-kB tersebut, antara lain dengan menghambat translokasi NF-kB ke dalam nucleus, menghambat fosforilasi Ik-B, menghambat aktivasi gen yang mengkode transaktifasi NF-kB dan degradasi Ik-B, ataupun melalui hambatan proses degradasi Ik-B oleh proteasome. Penurunan aktivasi NF-kB mengakibatkan turunnya signaling NF-kB pada sel imun sehingga meregulasi turunnya TNF-α. Pengaruh biopeptida pada yoghurt terhadap sistem imun antara lain menginduksi aktivitas sistem imun seluler dan aktivitas antiinflamasi. Laktoferin menghambat produksi sitokin proinflamasi lokal hasil produk makrofag diantaranya IL-1, TNF-α, IL-6, dan iNOS. Mekanisme laktoferin dalam menurunkan TNF-α adalah meningkatkan regulasi sel Tregulator yang berfungsi dalam menghambat sel T-helper dalam memproduksi sitokin proinflamasi yang berlebih (Wang dan Baker, 2007). Sel T yang teraktivasi akan berkembang menjadi sel T helper 1 yang mensekresi sitokin proinflamasi seperti TNF-α, IL-1, IL-2, IFN-γ dan sel T helper 2 yang dapat mensekresi sitokin antiinflamasi seperti IL-10, IL-5, IL-4 sehingga dapat melepaskan spektrum sitokin yang mengaktifkan sel T lainnya pada respon seluler serta membantu sel B
berdiferensiasi menjadi sel plasma. Probiotik juga mampu menstimulasi produksi sitokin dengan menekan proliferasi dari sel T helper 1 sehingga sel T helper 2 (CD4+) akan melepaskan sitokin IL-10 yang merupakan sitokin antiinflamasi dengan menghambat aktivitas sel T helper 1 (CD4+) yaitu TNFα oleh IL-10, peningkatan kadar IL-10 dapat mencegah kerusakan jaringan pada hati. KESIMPULAN Yoghurt susu kambing dapat menurunkan kadar MDA dan menurunkan ekspresi TNF-α organ hati hewan model tikus hiperkolesterolemia. Pemberian terapi yoghurt susu kambing dengan dosis 600 mg/kg BB sudah mampu memberikan efek terapi terbaik dalam menurunkan kadar MDA dan terapi dosis 900 mg/kg BB memberikan efek terapi terbaik dalam menurunkan ekspresi TNF-α organ hati hewan model tikus hiperkolesterolemia. UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada: 1. Staff Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya, Malang. 2. Staff Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. 3. Staff Laboratorium Biokimia, Universitas Brawijaya, Malang. 4. Staff Laboratorium Fisiologi Hewan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang. 5. Staff Poliklinik Universitas Brawijaya, Malang. DAFTAR PUSTAKA Anwar, 2004. Dislipidemia Sebagai Faktor Risiko Penyakit Jantung Koroner. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
9
Bastard, J.P., Maachi, M., Lagathu , C., Kim, M.J., Caron, M., Vidal, H., Capeau, J.,dan Feve, B. 2006. Recent Advances in the Relationship Between Obesity, Inflamation, and Insulin Resistance. Eur Cytokin Netw. Mar, 17(1):4-12. PubMed US National Library of Medicine.
Lakhanpal P and Rai KD. Quercetin : a versatile flavonoid. Int J. Med. 2007;2(2).:http://www.geocities.co m/agnihotrimed.htm. Diakses pada tanggal 4 Mei 2014. Luczaj, W., and E. Skrzydlewska. 2003. DNA Damage Caused By Lipid Proxidation Products. Cell Mol. Biol. Lett, 8:391-413.
Evans, M.D. dan Cooke, M.S. 2006. Lipid and Protein Mediated Oxidative Damage to DNA. In: Singh, K.S., editor. Oxidative Stress, Disease and Cancer. Singapura: Mainland Press. p. 201-220.
Posecion, N.C., Crowe, N.L., Robinson, A.R., Asiedu, S.K. 2005. The Development Of A Goat’s Milk Yogurt. Journal of the science of Food and Agriculture, 85(11): 1909-1913.
Fki, I., M. Bouaziz, Z. Sahnoun and S. Sayadi. 2005. Hypocholesterolemic Effects on Phenolic-rich Extract of Chemlali Olive Cultivar in Rats Fed a Cholesterol-rich Diet. J Bioorganic & Medic Chem, 13: 5362-5370.
Setiawan, T. dan A.Tanius. 2005. Beternak Kambing Perah Peranakan Ettawa. Jakarta: Penebar Swadaya. Tombilangi AK. 2004. Khasiat Ekstrak Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) Terhadap Kadar Lipid Peroksida Darah Kelinci yang Hiperlipidemia. [Skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB.
Gani, N., I. Lidya dan P. Mariska. 2013. Profil Lipida Plasma Tikus Wistar yang Hiperkolesterolemia pada Pemberian Gedi Merah (Abelmoschus manihot L.). http://ejournal.unsrat.ac.id/index.ph p/jmou. Manado. Jurusan Kimia FMIPA Unsrat. Diakses pada tanggal 18 Oktober 2013.
Valko, M., et al. 2006. Free Radical, Metal And Antioxidant In Oxidative Stress Inducced Cancer. J ChemBioI, Rusia, 160:1-40.
Guillen, C., I.B. McInnes, H. Kruger, dan J.H. Brock. 2013. Iron, Lactoferrin and Iron Regulatory Protein Activity in the Synovium; Relative Importance of Iron Loading and the Inflammatory Response. Autoimmunity 57: 309 – 314.
Wang, S.H., dan Baker J.R. 2007. The role of apoptosis in thyroid autoimmunity. Thyroid 17(10) :975-9. Wresdiyati T, Astawan M, Hastanti LY. 2006. Profil Imunohistokimia Superoksida Dismutase (SOD) Pada Jaringan Hati Tikus Dengan Kondisi Hiperkolesterolemia. J Hayati 13: 85-89.
Kartini T.A. 2002. Potensi Probiotik Lactobacillus acidophilus dan Mikroflora Kefir Sebagai Antihiperkolesterolemia. [Skripsi]. Bogor: Jurusan Ilmu Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. 10
