Kálcium transzportfolyamatok vizsgálata vérlemezkékben genetikailag módosított egérmodellek felhasználásával. A "store operated calcium entry" (SOCE) szabályozása és szerepe Doktori tézisek Dr. Varga-Szabó Dávid Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskolája
Témavezető: Dr. Enyedi Ágnes, Ph.D. Opponensek: Dr. Várnai Péter, Ph.D. Dr. Zádor Ernő, Ph.D. Bizottsági tagok: Elnök: Prof. Dr. Enyedi Péter, az MTA doktora Tagok: Dr. Horváth Béla, Ph.D. Dr. Jemnitz Katalin, Ph.D. Budapest 2009
Bevezetés Az érsérülés esetén fellépő vérlemezke aktiváció és aggregáció nélkülözhetetlen a vérzés megállításához, másrészt viszont beteg erekben – mint például atherosclerosis esetén – ugyanez a folyamat a patológiás thrombus képződésben is szerepet játszik. Ezért a vérlemezke aktiváció szigorúan szabályozott folyamat, hogy egyfelől elégséges legyen az érsérülés elzárásához, másrészt viszont ne vezessen nemkívánatos érelzáródáshoz. Az extracelluláris mátrixfehérjék széles skálája – főként kollagének és a von Willebrand faktor – valamint különböző a vérlemezkékből felszabaduló vagy a felszínükön termelt oldékony agonisták válthatnak ki thrombocyta aktivációt, ezáltal elősegítve azok stabil kitapadását az érfalhoz illetve a növekvő thrombushoz. Ezek az agonisták különböző jelátviteli utakat aktiválnak, melyek legtöbbjének közös végső lépése az intracelluláris kalcium koncentráció ([Ca2+]i) megemelkedése. A kalcium szinte minden sejtben nélkülözhetetlen másodlagos hírvivő
molekula,
folyamatokat
mely
szabályoz,
olyan
alapvető
mint
a
sejtműködési
sejtdifferenciálódás,
sejtosztódás vagy a géntranszkripció. A [Ca2+]i megemelkedése
a thrombocyták aktiválódásában is alapvető, hiszen gátlása – különböző
intra-
és
extracelluláris
kalcium
chelátorok
segítségével – a folyamat sérülését eredményezi. Annak ellenére, hogy a kalcium ilyen fontos szerepet tölt be a vérlemezke-funkcióban,
a
thrombocyták
kalcium
homeostasisának szabályozása alig ismert. A sejten belüli kalciumszint emelkedésének két fő forrása van: a sejtben tárolt kalcium felszabadulása és a kalcium beáramlás a sejten kívüli térből. Az intracelluláris kalcium felszabadulása egy viszonylag jól ismert folyamat eredménye. A vérlemezkék sejtfelszíni receptorainak aktiválódása különböző foszfolipáz C (PLC) izoformákat aktivál, melyek a foszfoinozitid-4,5-biszfoszfátot (PIP2) inozitol-1,4,5-trifoszfáttá (IP3) és diacil-glicerollá (DAG) bontják. Az IP3 aztán felszabadítja a kalciumot az intracelluláris
raktárakból,
míg
a
DAG
a
kalcium
beáramlásának szabályozásában vesz részt. Szemben a kalcium felszabadulással, kevésbé jól ismert a kalcium beáramlás folyamata a sejtmembránon keresztül. Nonexcitabilis sejtekben, amilyenek a vérlemezkék is, a kalcium beáramlás fő útja az úgynevezett store-operated calcium entry (SOCE). Ez nem más, mint a raktárakból történő kalcium felszabadulása következtében zajló kalcium beáramlás az
extracelluláris térből. Az intenzív kutatás ellenére a SOCE-ban szerepet
játszó
molekulák
azonosítása
és
a
folyamat
vérlemezke funkcióban betöltött jelentőségének meghatározása várat magára. Egészen mostanáig az úgynevezett „de novo konformációs kapcsolás” modell próbálta leírni a thrombocyta SOCE molekuláris
mechanizmusát.
Ez
az
elmélet
egy
hat
transzmembrán doménnel rendelkező fehérjét – a kanonikus transient receptor potential channel 1 (TRPC1)-et – tekintette a fő SOC csatornának a vérlemezkék felszínén. A csatorna nyitásának
hátterében
pedig
a
TRPC1
fehérjének
az
endoplazmatikus retikulum (ER) 2-es típusú IP3-receptorával való de novo kapcsolódását hangsúlyozta, mint központi mechanizmust. Az irodalom ugyanakkor igencsak ellentmondásos ezt az elméletet illetően. Már a TRPC1 fehérje subcelluláris lokalizációjáról is eltérő közlemények léteznek. Ahhoz, hogy TRPC1 a fő SOC csatorna szerepét betölthesse, a fehérjének a sejtmembránban publikáció
is
kell arról
expresszálódnia, számol
be,
hogy
ugyanakkor TRPC1
több főként
intracelluláris membránokban található meg. Továbbá a „de novo konformációs kapcsolás” modell elsősorban olyan in vitro kísérleteken alapul, melyek során egy TRPC1 ellenes antitest a
SOCE
csökkenését
eredményezte
vérlemezkékben,
bár
ugyanez az antitest mások munkája során még a TRPC1 fehérje felismerésére sem volt képes. Végül léteznek közlemények, melyekben az anti-TRPC1 kezelés semmilyen hatással nem volt a vérlemezke SOCE-ra. 2005-ben illetve 2006-ban a „stromal interaction molecule 1” (STIM1) és az Orai1 fehérjét azonosították, mint a SOCE folyamatának
konzervált
komponensei
Drosophila
S2
sejtekben és T sejtvonalakban. A STIM1 egy I típusú transzmembrán fehérje, melyről kimutatták, hogy az ER membránjában ülő Ca2+ érzékelő szerepét tölti be. A raktárak kiürülése esetén sejtmembrán közeli pontokba rendeződik, úgy szabályozza a SOCE-t. Az Orai1 fehérjét pedig olyan csatornaként azonosították, mely a SOC csatornák minden tulajdonságával rendelkezik. Célkitűzés Mint korábban említettem, általános hit, hogy a Ca2+ beáramlás központi szerepet tölt be a vérlemezke aktivációban, bár ennek pontosan
körülírt
bizonyítéka
hiányzik.
A
„de
novo
konformációs kapcsolás” modell és a TRPC1 fehérje vérlemezkékben betöltött szerepének előzőekben részletezett
ellentmondásos volta, valamint a Ca2+ beáramlás folyamatában újonnan felfedezett molekulák leírása ösztönzött a vérlemezke SOCE részletes vizsgálatára. PhD munkám során célul tűztem ki a STIM1, TRPC1 és Orai1 fehérje thrombocyta Ca2+ homeostasisban betöltött lehetséges szerepének felderítését. További célom volt ezeknek a fehérjéknek és magának a SOCE folyamatának in vitro vérlemezke funkcióban és in vivo thrombus képződésben betöltött szerepének vizsgálata. Módszerek Fenti
célkitűzéseim
megvalósításához
laborunkban
genetikailag módosított „knock-out” egereket, és ahol szükség volt rá csontvelő kimérákat, készítettünk, majd in vitro és in vivo
kísérletekkel
vizsgáltam
ezen
egerek
vérlemezke
funkcióját.
In vitro kísérletek: Áramlási cytometriás és aggregometriás mérésekkel elsőként a vérlemezkék morfológiáját, sejtfelszíni receptormegoszlását, valamint
a
„knock-out”
thrombocyták
alakváltoztatásra,
integrin aktivációra, granulumaik exocytósisára és stabil aggregációra való képességét vizsgáltam. A sejten belüli Ca2+ raktárak töltöttségének és a Ca2+ beáramlásának megítélésre intracelluláris Ca2+ méréseket végeztem. Végül a „knock-out” thrombocyták magas nyíróerőket generáló áramlási viszonyok közötti
thrombusformáló
képességét
áramlási
kamrában
tanulmányoztam.
In vivo kísérletek: Két különböző artériás trombózis modellt – egy a kis mesenteriális artériák kémiai sérülését előidéző és egy az abdominális
aortát
mechanikusan
károsító
–
és
egy
kollagén/epinephrin indukálta pulmonaris embólia modellt használtam annak megítélésére, hogy a STIM1, TRPC1 illetve Orai1 fehérje hogyan és milyen mértékben befolyásolja thrombusok képződését in vivo. Továbbá a Würzburgi Egyetem Neurológiai Klinikájával közös kollaborációban vizsgáltuk a vérlemezke SOCE ischemiás stroke kialakulására kifejtett hatását egy tranziens arteria cerebria media elzáródás modellen. Eredmények
PhD munkám során kimutattam, hogy 1. bár a STIM1 és Orai1 hiányos egerek súlyosan betegek, a megakaryopoiesis és vérlemezke termelés érintetlen ezekben az egerekben. 2. a STIM1 illetve Orai1 fehérje hiánya a SOCE és a különböző vérlemezke agonisták által kiváltott Ca2+ válasz drámai csökkenését eredményezi. 3. továbbá a STIM1 fehérje hiánya nem csak a vérlemezke SOCE amplitúdóját csökkenti, hanem a sejten belüli Ca2+ raktárak töltöttségét is. 4. a Stim1-/- és Orai1-/- vérlemezkék PLCγ2 keresztül történő aktivációja szelektíven károsodott, míg a G-fehérje kapcsolt receptor (GPCR) / PLCß jelátviteli út érintetlen maradt. 5. a STIM1 és az Orai1 fehérje hiánya alig befolyásolja a vérlemezkék aggregációs képességét áramlási körülmények hiányában, míg az áramlási viszonyok közötti thrombus képződés súlyosan károsodott. 6. az in vivo stabil thrombus képződés mind STIM1, mind Orai1 hiányos vérlemezkék esetén defektív, ám ez a defektus kifejezettebb STIM1 hiánya esetén. 7. a Stim1-/- és Orai1-/- csontvelő kimérák védettek az ischemiás stroke kialakulása ellen egy tranziens arteria cerebri
media elzáródás modellben, anélkül, hogy a vérzési idő komolyan megnyúlt volna ezekben az állatokban. 8. TRPC1 nem játszik szignifikáns szerepet a vérlemezke SOCE-ben. Következtetések A „store-operated calcium entry” létezése vérlemezkékben több mint egy évtizeden át jól ismert volt, de a háttérben meghúzódó fehérjék és mechanizmusok, valamint a folyamat vérlemezke funkcióban betöltött szerepe kérdéses maradt. Fenti eredmények alapján megállapítható, hogy mind STIM1, mind Orai1
nélkülözhetetlen
komponensei 2+
vérlemezkékben. STIM1 az ER Ca
a
SOCE-nek
szenzor szerepét tölti be,
és szabályozza Orai1, a sejtmembrán fő SOC csatornájának működését. A minden fontos vérlemezke aktiváló agonista esetében súlyosan csökkent Ca2+ válasz egyértelműen mutatja, hogy a vérlemzkék aktivációja során észlelt Ca2+ szintemelkedés fő komponense a SOCE. Míg a folyamat nélkülözhetőnek tűnik a megakaryocyta érés és vérlemezke termelés szempontjából, a SOCE
nélkülözhetetlen
a
PLCγ2
útján
történő
teljes
thrombocyta aktivációhoz. Az ok, amiért funkcionális SOCE
jelenléte elengedhetetlen a PLCγ2 jelátviteli út működéséhez és nem az a vérlemezkék PLCß útján történő aktivációjához, jelenleg nem ismert. A PLCγ2 aktiváció PLCß aktivációhoz képest lassabb kinetikája szerepelhet a lehetséges okok között, ám ennek további vizsgálata szükséges. A PhD munkámban mutatom, hogy a közel teljesen normális in vitro thrombocyta aktiváció ellenére a vérlemezke SOCE különösen fontos az aggregációhoz és thrombus képződéshez áramlási körülmények között, amilyeneket in vivo is találunk. A stabil thrombus képződés súlyosabban károsodott STIM1 hiánya esetén, mint Orai1 hiányában valószínűleg azért, mert a Stim1-/- vérlemezkékben nem csak a SOCE csökkent, hanem a sejten belüli Ca2+ raktárak töltöttsége is. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy STIM1 nem csak a Ca2+ beáramlását irányítja, hanem az intracelluláris Ca2+ raktárak töltését is méghozzá a SOCE-től függetlenül. Végezetül az ischemiás stroke vizsgálatára végzett kísérleteink arra utalnak, hogy a vérlemezke SOCE egy klinikailag igen fontos betegségben is komoly jelentősséggel bír. A tény pedig, hogy mind a STIM1-, mind pedig az Orai1-hiányos csontvelő kimérák védettek ischemiás cerebrovasculáris történésekkel szemben komoly vérzési kockázat nélkül, arra enged következtetni, hogy ezek a fehérjék – illetve a vérlemezke
SOCE folyamata – ígéretes terápiás és prevenciós lehetőséget jelenthetnek
az
ischemiás
cardio-
és
cerebrovasculáris
megbetegedésekben. Saját publikációk jegyzéke
A disszertációhoz kapcsolódó közlemények: Braun A, Varga-Szabo D (joint first), Kleinschnitz C, Pleines I, Bender M, Austinat M, Bosl M, Stoll G, Nieswandt B. Orai1 (CRACM1) is the platelet SOC channel and essential for pathological thrombus formation. Blood Prepublished online Oct 2, 2008; DOI:10.1182/blood-2008-07-171611 Varga-Szabo D, Braun A, Kleinschnitz C, Bender M, Pleines I, Pham M, Renné T, Stoll G, Nieswandt B. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 2008 Jul 7;205(7):158391. Varga-Szabo D, Authi K, Braun A, Bender M, Ambily A, Gudermann T, Dietrich A, Nieswandt B. Store-operated Ca2+ entry in platelets occurs independently of transient receptor
potential (TRP) C1. Pflugers Arch - Eur J Physiol. [Epub ahead of print] DOI:10.1007/s00424-008-0531-4 Grosse J, Braun A, Varga-Szabo D, Beyersdorf N, Schneider B, Zeitlmann L, Hanke P, Schropp P, Mühlstedt S, Zorn C, Huber M, Schmittwolf C, Jagla W, Yu P, Kerkau T, Schulze H, Nehls M, Nieswandt B. An EF hand mutation in Stim1 causes premature platelet activation and bleeding in mice. J Clin Invest. 2007 Nov;117(11):3540-50.
Egyéb közlemények: Braun A, Gessner JE, Varga-Szabo D, Syed SN, Konrad S, Stegner D, Vogtle T, Schmidt RE, Nieswandt B. STIM1 is essential for Fc{gamma} receptor activation and autoimmune inflammation. Blood Prepublished online Oct 2, 2008; DOI: 10.1182/blood-2008-05-158477 Pleines I, Elvers M, Strehl A, Pozgajova M, Varga-Szabo D, May F, Chrostek-Grashoff A, Brakebusch C, Nieswandt B. Rac1 is essential for phospholipase C-gamma2 activation in platelets. Pflugers Arch - Eur J Physiol. [Epub ahead of print] DOI: 10.1007/s00424-008-0573-7
Varga-Szabo D, Pleines I, Nieswandt B. Cell Adhesion Mechanisms in Platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Mar;28(3):403-12. Nieswandt B, Moser M, Pleines I, Varga-Szabo D, Monkley S, Critchley D, Fässler R. Loss of talin1 in platelets abrogates integrin
activation,
platelet
aggregation,
and
thrombus
formation in vitro and in vivo. J Exp Med. 2007 Dec 24;204(13):3113-8. Rabie T, Varga-Szabo D, Bender M, Pozgaj R, Lanza F, Saito T, Watson SP, Nieswandt B. Diverging signaling events control the pathway of GPVI down-regulation in vivo. Blood. 2007 Jul 15;110(2):529-35. Epub 2007 Mar 20. Schulte V, Reusch HP, Pozgajová M, Varga-Szabo D, Gachet C, Nieswandt B. Two-phase antithrombotic protection after anti-glycoprotein VI treatment in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 Jul;26(7):1640-7. Molnar BA, Varga-Szabo D, Kaliszky P. Failure of diagnosing pancreatic tumors in the course of laparoscopic
cholecystectomy: surgical lessons. Orv Hetil. 2005 Dec 11;146(50):2541-5. [Hungarian]
