DIARREE BIJ PUPS, DETECTIE VAN INFECTIEUZE AGENTIA, MET DE NADRUK OP CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2010 – 2011

DIARREE BIJ PUPS, DETECTIE VAN INFECTIEUZE AGENTIA, MET DE NADRUK OP CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

door

Iris BOSSCHEM

Promotor: Prof. Dr. Koen Chiers

Onderzoek in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Voorwoord Het schrijven van deze Masterproef vormde voor mij een hele uitdaging. Het is dan ook een project dat me bijna een jaar bezig heeft gehouden. Vorig jaar kende ik wetenschappelijke technieken zoals de polymerase kettingreactie (PCR), de sedimentatie-flotatie methode, de hemagglutinatie test,.. enkel uit de theorie. Door dit onderzoek heb ik veel ervaring gekregen, doordat ik de kans kreeg deze technieken zelf uit te voeren.

Graag wil ik van deze pagina gebruik maken om enkele mensen te bedanken. Op de eerste plaats gaat mijn dank uit naar mijn promotor Prof. Dr. Koen Chiers, voor de kans die hij me geboden heeft om kennis te maken met de boeiende wereld van de bacteriologie, parasitologie en virologie. Binnen de verschillende vakgroepen zou ik ook graag enkele mensen bedanken. De meeste tijd van mijn onderzoek heb ik doorgebracht in het labo van bacteriologie, waar doctoraatstudente Leen Timbermont de tijd genomen heeft om mij alle technieken aan te leren en mij bij te staan met informatie. Bij de vakgroep virologie gaat mijn dank uit naar laborante Lieve Sys en doctoraatstudent Sébastiaan Theuns die mij bijgestaan hebben om mij alles aan te leren. De aangename en creatieve sfeer die er hing, werkte aanstekelijk. Ook zou ik graag Nathalie De Wilde willen bedanken om mij de techniek van sedimentatie - flotatie aan te leren op de vakgroep parasitologie.

De lay-out van tekst zoals die nu voorligt, zou niet mogelijk zijn zonder de suggesties van mijn vader. Ook wil ik graag mijn medestudenten bedanken om mijn thesis te lezen en hier hun mening over te geven.

Ik zou ook graag de kennels en fokkerijen bedanken die wilden meewerken aan dit onderzoek. Voor de privacy worden de namen van de bedrijven niet bekend gemaakt.

Tenslotte zou ik ook graag mijn ouders willen bedanken om mij de kans te geven, deze studie te volgen en in mij te geloven.

INHOUDSOPGAVE Samenvatting........................................................................................................................................... 1 1.

Inleiding ........................................................................................................................................... 2

2.

LITERATUURSTUDIE ......................................................................................................................... 3 2.1

Meest voorkomende niet - bacteriële oorzaken van diarree bij pups .................................... 3

2.1.1

Voeding............................................................................................................................ 4

2.1.2

Virale infecties ................................................................................................................. 4

2.1.2.1

Parvovirus .................................................................................................................... 5

2.1.2.2

Coronavirus.................................................................................................................. 7

2.1.2.3

Rotavirus ...................................................................................................................... 9

2.1.3 2.1.3.1

Algemene kenmerken ............................................................................................... 10

2.1.3.2

De cyclus van Toxocara canis .................................................................................... 10

2.1.3.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 10

2.1.4

Coccidiose ...................................................................................................................... 11

2.1.4.1

Algemeen................................................................................................................... 11

2.1.4.2

Pathogenese en symptomen ..................................................................................... 11

2.1.4.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 12

2.1.5

Giardia ........................................................................................................................... 12

2.1.5.1

Algemene kenmerken ............................................................................................... 12

2.1.5.2

Pathogenese .............................................................................................................. 12

2.1.5.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 13

2.1.6

2.2

Spoelwormen ................................................................................................................ 10

Voedingsallergie / voedselovergevoeligheid................................................................. 13

2.1.6.1

Algemeen................................................................................................................... 13

2.1.6.2

Oorzaken ................................................................................................................... 14

2.1.6.3

Symptomen ............................................................................................................... 14

2.1.6.4

Belang en prevalentie ................................................................................................ 14

Bacteriële oorzaken of complicaties bij puppy diarree ......................................................... 15

2.2.1

Inleiding ......................................................................................................................... 15

2.2.2

Clostridium spp. ............................................................................................................. 15

2.2.2.1

Clostridium perfringens ............................................................................................. 15

2.2.2.2

Clostridium difficile .................................................................................................... 19

2.2.3 2.2.3.1

Algemeen................................................................................................................... 20

2.2.3.2

Klinische betekenis .................................................................................................... 20

2.2.3.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 20

2.2.4

Salmonella sp................................................................................................................. 20

2.2.4.1

Algemeen................................................................................................................... 20

2.2.4.2

Klinische betekenis .................................................................................................... 21

2.2.4.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 21

2.2.5

2.3

Campylobacter spp. ....................................................................................................... 20

Escherichia coli .............................................................................................................. 21

2.2.5.1

Algemeen................................................................................................................... 21

2.2.5.2

Klinische betekenis .................................................................................................... 21

2.2.5.3

Belang en prevalentie ................................................................................................ 22

Diagnostische mogelijkheden voor infectieuze diarree ........................................................ 22

2.3.1

Virussen ......................................................................................................................... 22

2.3.2

Parasieten ...................................................................................................................... 23

2.3.3

Bacteriën ....................................................................................................................... 24

3.

Doelstellingen ................................................................................................................................ 25

4.

Onderzoek ..................................................................................................................................... 26 4.1

Materiaal en methoden ........................................................................................................ 26

4.1.1

STAALNAME................................................................................................................... 26

4.1.2

BACTERIOLOGIE ............................................................................................................. 27

4.1.2.1

Isolatie en titratie van Clostridium perfringens ......................................................... 27

4.1.2.2

PCR voor identificatie en toxinetypering van C. perfringens .................................... 28

4.1.3

Parasitologie .................................................................................................................. 30

4.1.4

VIROLOGIE ..................................................................................................................... 32

4.2

4.1.4.1

Virusisolatie ............................................................................................................... 32

4.1.4.2

Hemagglutinatie test (HA) ......................................................................................... 33

4.1.4.3

Immunofluorescentie ................................................................................................ 34

Resultaten.............................................................................................................................. 37

4.2.1

Bacteriologie .................................................................................................................. 37

4.2.1.1

Isolatie C. perfringens ................................................................................................ 37

4.2.1.2

Kwantificatie .............................................................................................................. 37

4.2.1.3

Polymerase chain reaction ........................................................................................ 37

4.2.2

Parasitologie .................................................................................................................. 40

4.2.3

Virologie ........................................................................................................................ 40

5.

Discussie ........................................................................................................................................ 42

6.

Referentielijst ................................................................................................................................ 44

BIJLAGE I Protocol virusisolatie ............................................................................................................. 48 BIJLAGE II Protocol hemagglutinatie ..................................................................................................... 51 BIJLAGE III Protocol Immunofluorescentie ............................................................................................ 52

SAMENVATTING Diarree is een frequent voorkomend probleem bij gespeende pups. Niet alleen valt de maternale immuniteit weg na het spenen, ook zullen ze door stress vatbaarder zijn voor alle soorten infecties. De diarree kan verschillende oorzaken hebben. In deze literatuurstudie bespreken we zowel de virologische, bacteriologische als parasitologische oorzaken en diarree die veroorzaakt wordt door een verkeerde voeding of voedingsallergie. Het doel van dit onderzoek is, om na te gaan of Clostridium perfringens, op zichzelf, in staat is om diarree te veroorzaken bij pups. Hiervoor namen we 48 meststalen van pups, afkomstig van kennels, tussen 6 en 12 weken oud, met diarree en die nog niet behandeld werden met antibiotica. De meststalen waren afkomstig uit 7 verschillende kennels en uit 48 verschillende nesten. Er werd getracht om C. perfringens te isoleren, en met behulp van PCR de toxines te identificeren, dat deze laatste produceert. Er werd ook onderzocht of er nog andere of complicerende oorzaken waren van de diarree. Deze studie heeft uitgewezen dat C. perfringens een groot aandeel heeft in puppy diarree. Er werd evenwel geen associatie gevonden met andere oorzaken. Vrijwel allen produceerden enkel het alfa toxine en waren dus van het type A. C. perfringens type A is het meest voorkomende type, en is een pathogeen dat meer en meer gezien wordt in gastro – intestinale uitbraken.

ABSTRACT Diarrhea is frequently found in puppies in the post weaning period. Not only do they lose their maternal immunity, but because of stress, they will be more susceptible to all sorts of infections. The diarrhea can have multiple causes. In this study, there will be a review about the most common causes, of diarrhea in puppies. There will be a discussion about the bacterial, viral and parasitological causes and diarrhea caused by food or food-allergy. The aim of this research is, to verify if Clostridium perfringens alone, is capable to cause diarrhea in puppies. The 48 fecal samples were taken from puppies, originated from kennels, and were aged between 6 and 12 weeks. They were not treated with antibiotics yet. The fecal samples were originated from 7 different kennels and 48 different litters. The aim was to isolate C. perfringens, and then to identify the toxins with PCR. With the help of other tests, the other causes of diarrhea were excluded. This study proved that C. perfringens should be considered of causal significance when investigating diarrhea in puppies. There was no association found between the different causes. Almost all samples produced the alfa-toxine and were type A. C. perfringens type A is the most common type, and is a pathogen found to be increasingly present in gastro-intestinal outbreaks.

1. INLEIDING Diarree bij pups is een frequent voorkomend probleem dat in veel gevallen levensbedreigend kan zijn door de dehydratatie die hierbij optreedt. De diarree kan verschillende oorzaken hebben. In deze studie wordt voornamelijk ingegaan op de bacteriële complicaties, en dan specifiek door Clostridium perfringens, bij puppy diarree. De klinische betekenis van enteropathogene bacteriën die diarree veroorzaken bij honden, wordt overschaduwd door de aanwezigheid van diezelfde organismen in de normale intestinale flora. Zich enkel baseren op de resultaten van de fecale cultuur alleen, is problematisch aangezien Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter spp., Salmonella sp. en pathogene en niet-pathogene Escherichia coli frequent worden geïsoleerd uit de mest van gezonde honden. Daarentegen, kan een bacteriële isolatie cultuur evenwel bruikbaar zijn na opzuiveren, voor het toepassen van moleculaire technieken, zoals PCR, voor de detectie van specifieke toxine genen of moleculaire typering van geïsoleerde stammen om klonen vast te stellen. De poging om bacteriële diarree te karakteriseren op basis van de anatomische lokalisatie is eveneens ontmoedigend, omdat de meeste van voorgenoemde bacteriën geassocieerd zijn met zowel dikke als dunne darm diarree. Dit onderzoek bestaat uit twee delen. In het eerste deel, de literatuurstudie, gaan we na wat er reeds bekend is over de oorzaken, de prevalentie en het belang van diarree bij pups. We gaan meer in detail in op het belang van Clostridium perfringens. Het tweede deel, is de beschrijving van het onderzoek zelf. We gaan na of Clostridium perfringens op zich, in staat is om diarree te veroorzaken bij pups. Er wordt onderzocht welke de eventuele andere of complicerende oorzaken (virologisch en parasitologisch) kunnen zijn van de diarree. In een laatste fase zal met behulp van PCR gekeken worden welke toxines de geïsoleerde Clostridium perfringens produceren.

2

2. LITERATUURSTUDIE 2.1 MEEST VOORKOMENDE NIET - BACTERIËLE OORZAKEN VAN DIARREE BIJ PUPS De periode na het spenen is kritiek voor pups. Niet alleen valt na het spenen de maternale immuniteit weg maar ook zullen worminfecties, vaccinaties, verandering van omgeving, etc… aanleiding geven tot stress. Stress verlaagt op zijn beurt de immuniteit en verhoogt de metabolisatie snelheid waardoor diarree kan ontstaan. Men spreekt van diarree wanneer de ontlasting meer vloeibaar is dan normaal, en vaak is ook de frequentie van defaeceren hoger dan normaal. Wij zullen ons hier beperken tot de acute diarree. Wanneer de diarree langer duurt dan zeven dagen spreken we van chronische diarree. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen dunne darm diarree en dikke darm diarree. Bij dikke darm diarree is de frequentie van defaeceren sterk toegenomen en is er vaak sprake van persen. Per keer worden meestal kleine hoeveelheden faeces geproduceerd, soms met slijm en bloed. Bij dunne darm diarree wordt er doorgaans minder vaak gedefaeceerd en per keer grote hoeveelheden zonder dat de hond erg perst. Hieronder volgt een beknopte opsomming van de verschillende oorzaken van diarree bij pups.

3

2.1.1 Voeding Een kwalitatief goed voeder is zeer belangrijk voor de spijsvertering van de hond. Vaak is de prijs een doorslaggevend argument in de keuze van een voeder en helaas wordt er dan niet op de kwaliteit gelet. Nu is lang niet elke hond even gevoelig voor een kwalitatief minder goed voeder. Een kwalitatief goed voeder is duurder dan een doorsnee voeder. Ten eerste is de kwaliteit van de gebruikte eiwitten en de verteerbaarheid van het voeder veel beter dan die van een goedkoper voeder. Deze betere verteerbaarheid uit zich in minder en goed gevormde ontlasting. Ook de vacht zal meer glanzen en de typische hondenlucht zal verminderen. Ten tweede kan door het gebruik van vaste leveranciers een constante hoge kwaliteit gegarandeerd worden. Bij goedkoper voerder wisselt de eiwitbron per charge. Dat houdt in dat de samenstelling van het voer per zak kan verschillen. Hierdoor kan diarree ontstaan als er een nieuwe zak hondenvoer gegeven wordt (Twomey et al., 2003). Ook het abrupt wisselen van voeder kan overgeven en diarree tot gevolg hebben. Het is daarom verstandig om een verandering van voeder altijd geleidelijk door te voeren. Tot slot is er niet altijd controle over wat de hond allemaal binnenkrijgt. Honden lopen tijdens het uitlaten de kans om iets op te eten wat slecht kan vallen. Ook als gevolg van deze onbedoelde tussendoortjes kunnen diarree en overgeven ontstaan (Twomey et al., 2003).

2.1.2 Virale infecties Een tweede veelvoorkomende oorzaak van diarree is darmontsteking ten gevolge van een virusinfectie. Dit blijft meestal niet beperkt tot één hond. Vaak is de infectie zo besmettelijk dat meerdere honden tegelijkertijd diarree hebben. Bij deze vorm van diarree hebben de honden meestal koorts. Een normale lichaamstemperatuur ligt bij honden tussen de 38 en 39°C. Bij honden met een virale diarree zien we meestal een lichaamstemperatuur boven 39,5°C. De honden zijn aldus ook slomer en de diarree gaat ook vaak gepaard met braken. Bij ernstige gevallen kan er bloed aanwezig zijn in het braaksel. Hieronder volgt een korte bespreking van de verschillende, belangrijkste virussen die diarree bij pups kunnen veroorzaken. De aanwezigheid van deze virussen werd ook onderzocht in het kader van het onderzoek.

4

2.1.2.1 Parvovirus 2.1.2.1.1 Algemene kenmerken Canine parvovirose is één van de meest significante infecties in kennels, hoofdzakelijk omwille van de hoge besmettelijkheid en de mogelijkheid van het virus om lang te overleven in de omgeving (Miller et al., 2009). Het parvovirus behoort tot de familie van de parvoviridae. Deze virussen zijn typisch lineair, nietgesegmenteerd, met een gemiddelde genoom grootte van 5000 nucleotiden. Ze behoren tot de kleinste virussen gevonden in de natuur (hiervan is ook de naam afgeleid, aangezien parvo Latijns is voor klein). Er werden zelfs enkele gevonden die slechts 23 nm groot waren.

Figuur 1 Electronen mciroscopisch beeld van parvovirussen (uit Wrong, 1997)

Veel zoogdierspecies hebben een stam van parvovirus specifiek voor die species. Parvovirussen zijn zeer specifiek wat betreft de taxonomie van het dier dat ze zullen infecteren, hoewel dit eerder een flexibele karakteristiek is. Alle stammen van canine parvovirussen zullen aanslaan in honden, wolven en vossen, maar slechts enkele zullen katten infecteren (Fenner et al., 1993).

2.1.2.1.2 Evolutie van het virus De ziekte veroorzaakt door het parvovirus CPV2 is een relatief nieuwe ziekte. Het werd voor het eerst ontdekt in 1978 en verspreidde zich wereldwijd in enkele jaren (Carmichael et al., 2005). Het virus is zeer vergelijkbaar met het feliene panleukopenie virus (dewelke ook een parvovirus is). Ze zijn 98% identiek en verschillen alleen in 2 aminozuren in het virale kapsied proteïne VP2 (Carter et al., 2006). Vroeger nam men aan dat het feliene panleukopenie muteerde in het CPV2. Het is mogelijk dat het CPV2 een mutant is van een ongeïdentificeerd parvovirus (vergelijkbaar met het felien parvovirus) van een wilde carnivoor. Later werden deze ingedeeld in 2 subtypes, CPV2a en CPV2b, respectievelijk in 1979 en 1984 (Shackelton et al., 2005). Een derde type, CPV2c werd ontdekt in Italië, Vietnam en Spanje (Decaro et al., 2006).

5

Het CPV2 blijft evolueren en het succes van de nieuwe stammen hangt af van de uitbreiding van het aantal gastheren die kunnen geïnfecteerd worden en de verbeterde binding aan de receptor, de canine transferrine receptor (Truyen et al., 2006). Daarentegen evolueert het feliene panleukopenie virus enkel door middel van genetische drift (Horiuchi et al., 1998). Vroeger werd gedacht dat het virus geen kruisspecifieke infecties kon veroorzaken. Studies in Vietnam hebben evenwel aangetoond dat het CPV2 een kleine antigenische shift en natuurlijke mutaties kan ondergaan om kat-achtigen te infecteren (Ikeda et al., 2000).

2.1.2.1.3 Belang Canine parvovirose komt meer voor bij honden in kennels dan bij honden die als huisdier gehouden worden, aangezien deze laatste meestal gevaccineerd zijn. Ook de predisponerende factoren voor de infectie spelen hierin een rol. Deze zijn het ontbreken van een beschermende immuniteit (zowel door het interfereren van maternale antistoffen met de vaccinatie of een niet-gevaccineerd dier), de aanwezigheid van een parasitaire infestatie, overbezetting en een niet-hygiënische, stresserende omgeving. Overbezetting en een niet-hygiënische omgeving verergeren niet de ernst van de ziekte maar verhogen het risico op blootstelling aan het virus (Miller et al., 2009). Alhoewel de prognose goed is wanneer tijdig een adequate behandeling wordt ingesteld, is voor de meeste kennels isolatie en behandeling geen optie door gebrek aan adequate isolatieruimte en financiële middelen (Miller et al., 2009).

2.1.2.1.4 Pathogenese Er bestaan twee vormen van een CPV2 infectie: intestinaal en cardiaal. Pups zijn het meest vatbaar voor infectie, nagenoeg meer dan 80% van de volwassen honden vertonen geen symptomen (Ettinger et al., 1995). Bij ernstige ziekte kunnen de honden sterven binnen 48 tot 72 uren wanneer er geen behandeling met vloeistoffen en antibiotica werd ingesteld. Bij de meer voorkomende, minder ernstige vorm, hebben we te maken met een sterftepercentage van 10% (Carter et al., 2006). Samen met de leeftijd en het ras, zullen factoren zoals een stresserende omgeving, samengaande infecties met bacteriën, parasieten en het canien coronavirus, de risico’s op een ernstige infectie toenemen (Nelson et al., 1998). Honden die geïnfecteerd worden met het parvovirus zullen eerder sterven door de dehydratatie die het veroorzaakt of door de secundaire bacteriële infectie dan door het virus zelf. De intestinale vorm ontstaat als volgt. Honden kunnen geïnfecteerd worden door oraal contact met het CPV2 in de faeces, geïnfecteerde bodem of door levenloze meststofdragers die eveneens het virus dragen. Na inslikken zal het virus vermenigvuldigen in het lymfoïde weefsel in de keel en zal

6

vervolgens spreiden naar de bloedstroom. Van daaruit zal het virus de sneldelende cellen aanvallen. Met deze laatste bedoelen we vooral de cellen in de lymfeknopen, de intestinale crypten en het beenmerg. Er is depletie van lymfocyten in de lymfeknopen en necrose en destructie van de intestinale crypten (Lobetti et al., 2003). Anaerobe bacteriën die normaal aanwezig zijn in de darmen kunnen nu de bloedstroom bereiken, een proces dat gekend is als translocatie en dat sepsis kan veroorzaken. De meest voorkomende bacteriën die betrokken zijn bij ernstige gevallen zijn Clostridia, Campylobacter en Salmonella species. Dit kan leiden tot een syndroom dat Systemic inflammatory response syndrome (SIRS) genoemd wordt. SIRS veroorzaakt een brede waaier aan complicaties waaronder hypercoagulabiliteit van het bloed, endotoxemie en het acute respiratory distress syndrome (ARDS). Bacteriële myocarditis werd ook gemeld, secundair aan sepsis (Silverstein et al., 2003). Na drie à vier dagen volgend op de infectie, wordt het virus uitgescheiden in de faeces voor een periode van drie weken. De hond kan optreden als asymptomatische drager en het virus intermitterend uitscheiden (Ettinger et al., 1995). Het virus is meestal dodelijker wanneer de gastheer tegelijkertijd een infestatie met wormen doormaakt of andere intestinale parasieten (Scarth, 2006).

2.1.2.1.5 Symptomen Honden die parvo ontwikkelen, beginnen symptomen te vertonen binnen 5 tot 10 dagen. De symptomen zijn voornamelijk lethargie, braken, koorts en diarree, die meestal bloederig is. De diarree en braken resulteren in dehydratatie en secundaire infecties. Door de dehydratatie kan de elektrolyten balans van de hond grondig verstoord worden. Bloed en proteïnen lekken in de darmen waardoor er anemie en proteïnemie ontstaat. Er kan ook endotoxemie ontstaan. De honden hebben een specifieke geur in de latere fasen van de infectie. Het aantal witte bloedcellen daalt verder en zorgt ervoor dat de hond nog meer verzwakt. Al deze factoren kunnen leiden tot shock en sterfte. Het eerste teken van CPV is lethargie. Hierna volgen symptomen zoals verlies van eetlust, diarree en braken (Ettinger et al., 1995).

2.1.2.2 Coronavirus 2.1.2.2.1 Algemene kenmerken Het canien coronavirus is eveneens een enterisch virus dat van belang is bij pups. Verschillende stammen van het canien coronavirus werden reeds geïsoleerd uit honden met diarree (Miller et al., 2009). Coronavirussen zijn behoren tot de subfamilie van de Coronavirinae in de familie van de Coronaviridae. Deze virussen bezitten een envelop, een positief enkelstrengig RNA genoom en een

7

helicale symmetrie. De genoomgrootte van coronavirussen varieert van 16 tot 31 kilobasen, een extraordinaire grootte voor een RNA virus (Li et al., 2005).

Figuur 2 Een negatief contrast transmissie elektronen microscopisch beeld van een coronavirus (uit Stockman et al., 2006).

2.1.2.2.2 Pathogenese Het virus invadeert en vermenigvuldigt in de villi van de dunne darmen. Intestinale ziekten kunnen gerelateerd zijn aan virus-geïnduceerde apoptose (geprogrammeerde celdood) van cellen van de epitheliale mucosa van de dunne darm (Ruggieri et al., 2007). De incubatieperiode bedraagt slechts één tot drie dagen. De ziekte is zeer besmettelijk en wordt verspreid via de faeces van geïnfecteerde honden, die gewoonlijk het virus zes tot negen dagen uitscheiden maar soms tot zes maand volgend op de infectie (Pratelli et al., 2005). De symptomen zijn diarree, braken en anorexie. De diagnose wordt gesteld door detectie van viruspartikels in de faeces.

2.1.2.2.3 Belang en prevalentie Het virus kan langer infectieus blijven bij vriestemperaturen, maar zal in tegenstelling tot het parvovirus snel geïnactiveerd worden door de meeste detergenten en desinfectantia (Miller et al., 2009). Het echte belang van de infectie is nog niet echt gekend, maar co-infecties met het parvovirus zouden de morbiditeit snel doen toenemen. Alhoewel een infectie meestal mild en sublethaal zou zijn bij pups jonger dan 12 weken, zijn er studies die rapporteren dat het virus meer virulent zou zijn dan dat eerst werd aangenomen (Evermann et al., 2005).

8

Het canien coronavirus is relevant voor kennels om dat het zeer besmettelijk is en zich snel kan verspreiden doorheen groepen gevoelige dieren. De klinische tekenen zijn bij de meeste volwassen honden minimaal, maar zeer jonge pups vormen hierop een uitzondering. Neonatale pups zijn meestal ernstiger geïnfecteerd dan gespeende en volwassen honden (Miller et al., 2009). In een studie, uitgevoerd bij kennelhonden, werd het canien coronavirus geïsoleerd bij 59,3% van de honden zonder diarree en bij 73,3% van de honden met diarree. Er werd aldus geen significante associatie waargenomen tussen de aanwezigheid van het virus en diarree (Sokolow et al., 2005).

2.1.2.3 Rotavirus 2.1.2.3.1 Algemene kenmerken Het dubbelstrengig, wielvormig rotavirus, lid van de reovirus familie, veroorzaakt ontsteking van de dunne darmen en in ernstige gevallen, een dysfunctie van de intestinale wanden (Fulton et al., 1981).

Figuur 3 Elektronen microscopisch beeld van rotavirussen (uit Smith, 2006)

2.1.2.3.2 Pathogenese Het rotavirus wordt voornamelijk overgedragen door contact met gecontamineerd fecaal materiaal. Honden met een onvoldoende ontwikkeld of zwak immuunsysteem en degene die leven in een stresserende omgeving lopen meer risico op een infectie (Fulton et al., 1981).

2.1.2.3.3 Belang en prevalentie Het is één van de meest voorkomend oorzaken van diarree en gastro-intestinale problemen bij honden. Alhoewel de ziekte kan voorkomen bij honden van alle leeftijden, zijn pups meer vatbaar voor rotavirus infecties, voornamelijk deze jonger dan 12 weken oud (Fulton et al., 1981).

9

2.1.3 Spoelwormen 2.1.3.1 Algemene kenmerken De meest voorkomende parasitaire wormen bij onze katten en honden, zijn respectievelijk Toxocara cati en Toxocara canis. Het grootste gedeelte van de levenscyclus van deze spoelwormen speelt zich af in het lichaam van het dier, en dan vooral in de dunne darm, de longen en de lever. Alleen de volwassen wormen komen af en toe naar buiten, via de ontlasting of via het braaksel. Deze wormen hebben een roze of gele kleur en zijn bij de hond 9 tot 17 cm groot. De wormeitjes daarentegen zijn microscopisch klein en dus niet met het blote oog te zien, terwijl ze wel in grote aantallen aanwezig kunnen zijn. De meeste jonge honden komen al besmet met de spoelwormlarven ter wereld en zullen dus al ze niet ontwormd worden, hun hele leven besmet blijven (Kerr Muir et al.,1994).

2.1.3.2 De cyclus van Toxocara canis Jonge dieren besmetten zich op een geheel andere wijze dan de volwassen dieren. Wanneer bij de hond het moederdier drachtig wordt, gaan onder invloed van de hormonen, de zogenaamde rustende larven die aanwezig zijn in het spier -, vet - en andere weefsels, weer actief worden. Ze komen terecht in de bloedbaan en via de placenta komen ze in het bloed van de pup en van daar in de darm. Bij de hond zullen de larven zich na de geboorte verplaatsen naar het melkklierweefsel en via de melk in de jongen terechtkomen. Op deze wijze worden de jonge dieren al heel snel voor of na de geboorte besmet. Daarnaast kunnen ze ook nog besmet worden via de eitjes in de ontlasting van het moederdier (Kerr Muir et al., 1994).

2.1.3.3 Belang en prevalentie Bij de volwassen dieren merk je meestal heel weinig van een spoelworminfectie. Ze vormen echter wel een bron van infectie die gevaarlijk is voor hun omgeving. Honden kunnen andere dieren besmetten alsook de mens. Dit gaat echter vaak onopgemerkt voorbij. Soms kunnen griepachtige verschijnselen ontstaan met algemeen ziek zijn, koorts en leverproblemen. De eitjes met de larve erin kunnen door de mens worden opgenomen en de larve kan vrijkomen in de darm. Van daaruit migreren ze via de bloedbaan naar een aantal organen zoals lever, longen, hersenen en ogen. Daar kapselen ze zich in en kunnen ontstekingsreacties veroorzaken. Bij jonge dieren zijn de verschijnselen veel duidelijker merkbaar. Bij een ernstige besmetting sterven de pups direct na de geboorte. Volgende symptomen kunnen voorkomen: hoesten, diarree, uitbraken van de spoelwormen, bloedarmoede, algemene zwakte , de typische “wormbuikjes”, doffe vacht en anorexie. Ze produceren enorme hoeveelheden wormeitjes waarmee ze de ouderdieren en ook de mensen in hun omgeving kunnen besmetten.

10

Voor zowel de honden als voor de eigenaar is het wormvrij houden van dieren van groot belang. Aangezien de larvale stadia over het algemeen minder gevoelig zijn voor de meeste wormmiddelen, zal regelmatig ontwormen noodzakelijk zijn om de volwassen wormen te doden. Wanneer na een ontworming veel volwassen spoelwormen afkomen, kan men er zeker van zijn dat er nog larvale stadia in het lichaam aanwezig zijn. Ook niet alle volwassen wormen zullen tegelijkertijd gedood worden. Als er na een ontworming veel volwassen wormen afkomen, moet in elk geval na drie à vier weken de kuur herhaald worden (Kerr Muir et al., 1994). De prevalentie van Toxocara canis bij honden in kennels, was in een studie 14,5%. Wanneer de data onderzocht werden op leeftijd, werd gevonden dat 30% van de meststalen positief voor Toxocara canis afkomstig waren van honden jonger dan 6 maanden (Miller et al., 2009).

2.1.4 Coccidiose 2.1.4.1 Algemeen Coccidiose bij honden werd beschreven als een zelflimiterende ziekte van weinig belang door sommige dierenartsen, terwijl anderen menen dat de ziekte zowel subklinisch als ernstig klinische ziekte kan veroorzaken (Olson et al., 1985). Diarree veroorzaakt door coccidiën komt regelmatig voor, vooral rond de speenperiode. De ziekte kan een grote verscheidenheid aan dieren infecteren, waaronder runderen, schapen, geiten, kippen, kalkoenen, katten en honden. Het komt vrij frequent voor bij kittens en puppies. Coccidiose wordt veroorzaakt door protozoa genaamd coccidia. Er zijn vele soorten coccidia, en elk is besmettelijk voor de verschillende dieren. De soorten coccidia die we het meest zien bij honden zijn Isospora canis en I. ohioensis (Olson et al., 1995).

2.1.4.2 Pathogenese en symptomen Het voornaamste symptoom van de ziekte is diarree. Een hond met coccidiose kan lichte tot ernstige diarree met eventuele bloed- en/of slijmbijmenging krijgen. In ernstige gevallen zien we braken, anorexie en dehydratatie. De besmetting kan fataal aflopen. Pups zijn niet besmet bij de geboorte. Besmetting gebeurt wanneer een pup in contact komt met de uitwerpselen van het moederdier kort na de geboorte. Als het moederdier coccidia cysten in haar ontlasting heeft, bestaat de mogelijkheid dat de jonge dieren deze inslikken. De incubatieperiode bedraagt minimum 13 dagen, daarom zijn de besmette dieren minstens twee weken oud. De meeste pups worden besmet door hun moeders, maar velen worden ook besmet door contact met andere dieren. Stress, bijvoorbeeld verandering van omgeving, is ook een belangrijke trigger in het ontstaan van coccidiose (Olson et al., 1985).

11

2.1.4.3 Belang en prevalentie Coccidiose is het meest ernstig bij zeer jonge of verzwakte dieren. In feite treft de ziekte het meest pups die jonger zijn dan zes maanden. Volwassen dieren kunnen drager zijn en andere dieren besmetten, maar vertonen zelf geen symptomen. Echter volwassen dieren met een onderdrukt immuunsysteem zijn vatbaar voor de ziekte. De ziekte zou bij pups bloederige diarree, anemie en zelden dood veroorzaken. De levenscyclus en pathogeniciteit van I. canis en I. ohioensis is gelijkaardig. De pathogeniciteit onder natuurlijke omstandigheden is nog onbekend maar onder experimentele omstandigheden veroorzaakten noch I. canis noch I. ohioensis dysenterie of diarree in parasieten-vrije honden die werden geïnfecteerd met 100 000 oöcysten. Er werd gesuggereerd dat enkel klinische ziekte optrad wanneer een zéér groot aantal oöcysten werden opgenomen door niet immune honden (Olson et al., 1985).

2.1.5 Giardia 2.1.5.1 Algemene kenmerken Giardia lamblia (Giardia Duodenalis, Giardia Intestinalis) is een ééncellige protozoaire darmparasiet die verantwoordelijk is voor het ziektebeeld giardiasis. Het koloniseert en reproduceert in de dunne darmen van meerdere vertebraten (Wright et al., 2011).

Figuur 4 Giardia (uit Weese, 2009)

2.1.5.2 Pathogenese De levenscyclus van Giardia is vrij eenvoudig en omvat twee ontwikkelingsstadia : het cyste stadium (de overlevingsvorm buiten de gastheer) en het vegetatieve stadium of trofozoiet en dit is het stadium binnen de gastheer. De cysten worden door de nieuwe gastheer oraal opgenomen. Via de maag komen de cysten in de dunne darm terecht alwaar deze openbarst met als resultaat dat de trofozoiet vrijkomt. De parasiet

12

kan zich terplekke vermeerderen door tweedeling maar zich ook weer omvormen tot cyste, die via de ontlasting uitgescheiden wordt. De trofozoïet kan alleen voorkomen in een, voor de parasiet, gunstige omgeving (de darmen). Buiten het lichaam hebben trofozoïeten een geringe levensduur. Het infectieuze stadium van Giardia is de cyste. De cysten van Giardia lamblia komen via de faecoorale route het lichaam binnen. Onder invloed van het zure milieu en andere factoren in de maag wordt het excysteringsproces in gang gezet, waarbij de cysten excysteren en er twee trofozoïeten vrijkomen. Dit proces vindt meestal plaats in het duodenum (dunne darm). De ontstane trofozoïeten migreren daarna verder het duodenum en jejunum in. De trofozoïet is de vegetatieve vorm en vermenigvuldigd zich ongeslachtelijk in het duodenum door middel van tweedeling. In het duodenum hechten de trofozoïeten zich aan de darmmucosa met hun zuignappen en veroorzaken daar symptomen zoals vettige, stinkende diarree en malabsorptie. Onder invloed van galzouten kan een gedeelte van de trofozoïeten weer differentiëren tot cysten. Door dit encysteringsproces verliest het organisme zijn bewegelijkheid en worden de nieuw gevormde cysten uitgescheiden met de faeces. Ook trofozoïeten kunnen uitgescheiden worden met de faeces door de peristaltische bewegingen van de darm. Buiten het lichaam vormen de cysten weer een potentiële infectiebron voor een nieuwe gastheer en daarmee is de cyclus gesloten. De incubatietijd van Giardia lamblia ligt tussen de 12 en 20 dagen (Wright et al., 2011).

2.1.5.3 Belang en prevalentie Bij veel dieren zal een infestatie geen klinische gevolgen hebben, men spreekt dan van asymptomatisch dragerschap. Het zijn meestal de jonge honden die symptomen vertonen. Er werd reeds een studie uitgevoerd waarbij meststalen verzameld werden van 117 gezonde pups (79 van eigenaars en 38 van een fokkerij) en geanalyseerd voor Giardia. Giardia cysten of trofozoieten werden in 35,9% van de messtalen gevonden (Hahn et al., 1988).

2.1.6 Voedingsallergie / voedselovergevoeligheid 2.1.6.1 Algemeen We spreken van een voedselallergie of voedselovergevoeligheid als de reactie van de hond daadwerkelijk gepaard gaat met allergische verschijnselen. In alle overige gevallen is er sprake van een voedselintolerantie. Bij deze laatste groep horen bijvoorbeeld de intolerantie voor lactose wegens gebrek aan het enzym lactase of de voedselvergiftiging waarbij het toxine uit het voedsel verantwoordelijk is voor de klachten (Rosser et al., 1993).

13

2.1.6.2 Oorzaken De allergie richt zich meestal op een eiwit, soms ook op koolhydraten. Bekende allergenen zijn rundvlees, paardenvlees, melk, kip en ei . Bekende allergenen van plantaardige oorsprong zijn onder andere maïs, tarwe en soja. Melkproducten kunnen na gemiddeld 4,1 dagen een allergische reactie opwekken, granen na gemiddeld 8,3 dagen. De voedselallergie van een hond beperkt zich meestal maar tot één allergeen (Rosser et al., 1993).

2.1.6.3 Symptomen Het belangrijkste symptoom van een voedselallergie bij de hond is een matige, nietseizoensgebonden, jeuk. Ook huidveranderingen kunnen optreden, op de buik en in de oksels vind men dan rode pukkeltjes en roodheid van de huid. Soms zijn de symptomen subtieler, verhoogde schilfering (seborrhoe), (enkelzijdige) oorontsteking en in 15% van de gevallen ook klachten van het maag-darmkanaal. Hierbij moet men denken aan braken na het eten en -/- of diarree. Ook dikke darmontstekingen (colitis) kunnen als oorzaak een voedselallergie hebben. Ook een toegenomen frequentie van ontlasten kan een symptoom zijn van voedselallergie. Het vervelende is dat de symptomen niet specifiek zijn. De jeuk, huidveranderingen en het likken zien we ook bij inademingsallergie (atopie) bij de hond (Rosser et al., 1993).

2.1.6.4 Belang en prevalentie Het optreden van de klachten vindt meestal plaats voordat het eerste levensjaar is verstreken, sommige auteurs spreken zelfs van voor de leeftijd van 6 maanden. Daarnaast zijn oude honden boven de zeven jaar ook duidelijk meer vertegenwoordigd in de statistieken (Ermel et al., 1997).

14

2.2 BACTERIËLE OORZAKEN OF COMPLICATIES BIJ PUPPY DIARREE 2.2.1 Inleiding Om zeker te zijn van het belang van Campylobacter spp., C. difficile, C. perfringens en Salmonella sp. als oorzaken van bacteriële gastro-enteritis bij honden, werd er reeds een studie uitgevoerd. In deze studie werden twee groepen dieren prospectief bestudeerd. De eerste groep bestond uit 77 puppies uit 14 nesten, waarbij een fecale cultuur elke week werd uitgevoerd, tien weken lang en gestart vanaf de geboorte. De tweede groep bestond uit een kennel-populatie waarbij van elke hond een cultuur werd genomen bij binnenkomst, en erna elke 2 maand . De incidentie van Campylobacter spp. was 32 en 31 per 100 hond-maanden bij de observatie van gezonde pups en gezonde volwassen honden respectivelijk, 46 en 0 voor C. difficile; 51 en 36 voor C. perfringens en 6,5 en 1.3 voor Salmonella. De incidentie van Campylobacter spp. bij pups piekte op een leeftijd van 8 weken. Deze incidentie (43 per 100 hond-maanden) was hoger bij pups die opgegroeid waren bij oudere honden dan pups die geen contact hadden gehad met andere honden (0 per 100 hond-maanden). Toxigene stammen van C. difficile werden gevonden in 61,5% van de meststalen van de gezonde neonatale honden.

In geen van de gevallen van niet-waterige en niet-inflammatoire diarree die

werden geobserveerd, waren geassocieerd met de bestudeerde pathogenen. Verder werden kolonisatie met Campylobacter spp. of Salmonella sp. nooit geassocieerd met episodes van diarree. Er konden dus geen conclusies getrokken worden over de rol van bacteriële pathogenen als oorzaak van de waterige of inflammatoire diarree, die niet geobserveerd werden in deze studie (Buogo et al., 1995).

2.2.2 Clostridium spp. Hieronder zullen we enkel Clostridium perfringens en Clostridum difficile bespreken aangezien enkel deze van belang zijn als veroorzakers van diarree bij pups.

2.2.2.1 Clostridium perfringens 2.2.2.1.1 Algemene kenmerken Clostridium perfringens is een gram-positieve, anaerobe staafvormige bacterie, die onder andere (gas) gangreen, necrotische enteritis en voedselvergiftigingen kan veroorzaken. Sporen worden zelden gezien aangezien het sporulatieproces een pH van 7,5 nodig heeft. Morfologisch zijn de Clostridium-species zeer polymorf: meestal korte, dikke staven tot lange filamenteuze vormen, recht of gebogen.

15

Figuur 5 Gram – kleuring van Clostridium perfringens (uit Todar, 2011)

In de natuur komen ze zeer verspreid voor in de grond, stof en water en behoren bij mens en dier tot de normale bewoners van het darmkanaal. Hoewel ze anaeroob zijn is de gevoeligheid voor zuurstof zeer verschillend. Ze kunnen als zeer kleine kolonies op een anaeroob geïncubeerde bloedplaat groeien.

Figuur 6 Kolonies van Clostridium perfringens op een anaeroob geïncubeerde bloedplaat (Dept. of Vet. Microbiology, 2000)

De kolonie morfologie kan variëren, soms binnen dezelfde cultuur. De kolonies hebben een kleine tot medium grootte en zijn typisch grijs tot grijs-geel en translucent. Sommige kolonies zijn glad en scherp afgelijnd, terwijl andere ruw zijn met een plat en onregelmatig oppervlak.

16

De kolonies worden omgeven door een dubbele zone van hemolyse, dewelke bestaat uit een binnenste heldere zone en een buitenste wazige zone. Clostridium perfringens is niet-proteolytisch en wordt niet geassocieerd met een specifieke geur. Ze groeien het best wanneer ze anaeroob geïncubeerd worden bij een temperatuur van 37°C. 7

9

Wanneer we anaeroob incuberen bij 37°C en het aantal kolonies is meer dan 10 – 10 dan kan dit mogelijks pathogeen zijn (dit wil zeggen 100 kolonies uit 1 µl entoog na 100 keer verdunnen).

2.2.2.1.2 Klinische betekenis Hoewel een aantal infecties een exogene oorsprong hebben, komen de endogene het meest voor. Ziektebeelden als gasgangreen na traumatische wonden, tetanus, botulisme en voedselvergiftiging zijn exogene infecties. Endogene infecties komen voor onder bepaalde voorwaarden: na een operatie, bij stoornissen van de bloedsomloop, obstructie, behandeling met immunosuppressieve middelen of chemotherapeutica. Na gebruik van antibiotica kan pseudomembraneuze colitis ontstaan door overmatige aanwezigheid van toxinevormende Clostridium difficile (Weese et al., 2011).

2.2.2.1.3 Biochemische eigenschappen Clostridium-species vormen geen katalase. De katalasetest is nuttig om aerotolerante Clostridia van Bacillus-soorten te onderscheiden. Clostridium-species zetten veel suikers om en sommige soorten breken eiwit af. Voor de identificatie van Clostridium onderzoekt men eveneens de vorming van lecithinase en lipase. De pathogene Clostridium-species vormen krachtige exotoxinen, waaraan ze hun pathogene betekenis te danken hebben. Andere virulentie-factoren zijn sporen, collagenasen en proteasen (Weese et al., 2011).

2.2.2.1.3.1

Toxines

C. perfringens invadeert niet in gezonde cellen maar produceert zoals hierboven reeds vermeldt, een intimiderend arsenaal aan toxines en enzymes die verantwoordelijk zijn voor de geassocieerde lesies en symptomen (Petit et al., 1999). De Clostridium perfringens toxines zijn geklasseerd in de major toxines, een enterotoxine en de minor toxines. Individuele stammen produceren slechts een deel van dit toxine repertoire en de mogelijkheid van C. perfringens om ziekte te veroorzaken is hoofdzakelijk beschreven aan de productie van 4 major toxines, een enterotoxine en 9 minor proteïne toxines (Hatheway et al., 1990).



De major toxines

De major toxines zijn het alfa, beta, epsilon en iota toxine, allen potentieel lethaal, afhankelijk van de gastheer. De bacterie is geklasseerd in 5 types (A tot E) afhankelijk van de verschillende combinaties van de productie van de vier major toxines, zoals getoond in tabel 1 (Songer et al., 1996).

17

Tabel 1: Toxines gebruikt voor de typering van C. perfringens (naar Petit et al., 1999)

A B C D E Gen locatie

Alfa toxine + + + + + Plc chromosoom

Beta toxine + + Cpb1 plasmide

Iota toxine + + Etc plasmide

Epsilon toxine + Iap, ibp plasmide

Clostridum perfringens toxine genen zijn gelokaliseerd op het chromosoom of op de plasmiden. Het alfa toxine gen is gelokaliseerd in een zeer stabiele regio op het C. perfringens chromosoom (dicht bij de origin of replication) en dit is waarom alle Clostridium-stammen dit gen dragen en waarom het geproduceerd wordt in gevarieerde hoeveelheden door alle isolaten (Canard et al., 1989). Clostridium perfringens phospholipase C (alfa toxine) is een Zn²+ metalloenzyme dat zowel lecithine en sfingomyeline degradeert. Het promoot membraandesorganisatie die resulteert in lyse of andere vormen van cytotoxiciteit. Het alfa toxine vertoont plaatjes aggregatie, hemolytische, necrotische en vasculaire permeabilisatie activiteiten (Songer et al., 1996). Er werd aangetoond dat gemuteerde stammen niet in staat zijn om het alfa toxine te produceren en aldus ziekte te veroorzaken in muizen (Awad et al., 1995). Het beta toxine is een protease gevoelig, poriën vormend toxine. Het vormt poriën door de formatie 2+

van toxine multimeren in de celmembraan, resulterend in Ca , Na

2+

-

+

en Cl influx en K efflux vanuit de

cellen (Steinthorsdottir et al., 2000). Het epsilon toxine werkt in, door vorming van grote membraan poriën door oligomerisatie in een heptameer die resulteert in kalium en vloeistof lekkage uit de cellen, wat leidt tot verlies van cel viabiliteit. (Petit et al., 1999). Het beta en epsilon toxine hebben een sleutelrol in enterotoxemie bij kalveren, lammeren, biggen en geiten. De meeste dieren van gedomesticeerd vee in ontwikkelde landen zijn geïmmuniseerd tegen ziektes met toxoïd vaccins. Iota toxine is een tweedelig toxine, dat bestaat uit twee onafhankelijke componenten, het enzymatisch deel (Ia) en het bindend deel (Ib). Ia is een ADP - ribosyltransferase dat actine modifieert. Dit toxine is het enige toxine dat intracellulair werkt. Alle andere toxines werken in op de celmembraan, wat leidt tot membraandisruptie of poriënvorming. (Rood et al., 1991).



Het enterotoxine

Het enterotoxine is de oorzaak van voedselvergiftiging bij mensen. In tegenstelling tot de andere toxines, wordt het enterotoxine niet gesecreteerd maar wordt geproduceerd tijdens de sporulatie (Adak et al., 2002). Het werkt in op de epitheliale “tight junction” proteïnes en induceert lekkage van

18

water en ionen door vorming van poriën of kanalen in plasma membranen van gastheercellen (McClane et al., 2001).



De minor toxines

Alle andere toxines behoren tot de groep van de minor toxines. Het teta toxine, alsook gekend als het teta hemolysine, perfringolysine O, of het thiol-geactiveerd cytolysine is gelokaliseerd op het chromosoom en wordt geproduceerd door alle vijf de toxinetypes van Clostridium perfringens (Rood et al., 1991). Het teta toxine is een lid van de cholesterol - bindende toxine familie en veroorzaakt complete hemolyse van rode bloedcellen door vorming van oligomeren, dewelke poriën vormen doorheen de celmembraan (Petit et al., 1999). Een meer recent ontdekt toxine is het beta2 toxine, een poriën vormend toxine dat geassocieerd wordt met enteritis in neonatale biggen (Gilbert et al., 1997). Ander gekende toxines geproduceerd door C. perfringens zijn: delta toxine, een hemolysine, een kappa toxine, een collagenase, lambda toxine, een caseïnase, mu toxine, een hyaluronidase, nu toxine, een nuclease een neuraminidase of sialidase, een N-acetylneuraminezuur glycohydrolase, en de gamma en eta toxines, dewelke hun functie ongekend is (Hatheway et al., 1990). De relevantie van ziekte van de meeste van deze minor toxines is niet volledig gekend. De verschillende toxine types van C. perfringens zijn geassocieerd met specifieke ziektes bij dieren en mensen, wat aantoont dat variaties in toxine productie de virulentie eigenschappen van C. perfringens isolaten beïnvloedt. Dit verklaart ook de pathogene verscheidenheid van C. perfringens die zowel enterische als histotoxische infecties veroorzaakt

en heeft een ziekte spectrum van lage

incidentie/hoge mortaliteit tot hoge incidentie/lage mortaliteit. De pathogenese van C. perfringens in verschillende ziekten is nog onvolledig opgelicht en waarschijnlijk zijn er nog veel potentiële toxines ongeïdentificeerd.

2.2.2.2 Clostridium difficile 2.2.2.2.1 Algemene kenmerken Clostridium difficile is een gram-positieve, anaerobe, sporevormende, staafvormige bacterie, eveneens behorende tot het geslacht Clostridium, die geassocieerd wordt met enterocolitis. Net als Clostridium perfringens produceert C. diffcile toxines: type A, dewelke een enterotoxine is en B, dat een cytotoxine is (Struble et al., 1994).

2.2.2.2.2 Klinische betekenis Toxine A veroorzaakt hemorrhagische vloeistof accumulatie en loslating van de epitheliale cellen. Toxine B werkt synergistisch met toxine A na beschadiging van het epitheel door dit toxine. Als resultaat is

er

een extravasatie

van plasmaproteïnen en een alteratie van

water-

en

elektrolytentransport. Het gevolg hiervan is een waterige diarree. Er werd geconcludeerd in een studie dat C. difficile niet in sterke mate geassocieerd werd met klinische symptomen: 9,3% van de honden met diarree en 2.7% van de honden zonder diarree waren

19

positief voor het organisme. De studie onderzocht evenwel niet of de isolaten van C. difficile de genen van het toxine A of B bevatten (Struble et al., 1994).

2.2.2.2.3 Belang en prevalentie In een studie werd de prevalentie van C. difficile nagegaan (Perrin et al., 2010) en werden meststalen van in totaal 70 puppies, uit 14 nesten en de moederdieren onderzocht voor C. difficile gedurende de eerste 10 weken na de geboorte. Gedurende de studie, werden in 94,4% van de puppies en 42,9% van de moederdieren tenminste één maal C. difficile terug gevonden. Er werd berekend dat 58% van de puppies het toxigene C. difficile ten minste één maal in hun mest hadden gedurende de survey. In slechts 1,4% van de meststalen van de gezonde honden werd C. difficile gevonden. Dit was de controle groep met honden van 3 maanden oud. Er kon niet aangetoond worden dat er pathogeniteit was van C. difficile voor neonatale honden (Perrin et al., 2010).

2.2.3 Campylobacter spp. 2.2.3.1 Algemeen Campylobacter jejuni is een gram-negatieve, dunne, staafvormige bacterie die gekromd en beweeglijk is. Het is een micro-aerofiel organisme, dit houdt in dat het organisme een lage hoeveelheid zuurstof nodig heeft. Het is relatief fragiel organisme dat gevoelig is voor stress van buitenaf (Willard et al., 1987).

2.2.3.2 Klinische betekenis Campylobacteriose is één van de grootste oorzaken van gastro-enteritis bij de mens en sommige studies hebben uitgewezen dat de hond een bron van infectie kan zijn. Alhoewel maar een klein deel van de gedomesticeerde honden drager zijn van C. jejuni, zouden geïnfecteerde honden steeds beschouwd moeten worden als een zoönotisch risico voor de mens, vooral wanneer de honden afkomstig zijn van kennels of fokkerijen waar de prevalenties hoger zijn (Willard et al., 1987).

2.2.3.3 Belang en prevalentie Campylobacter prevalenties werden gerapporteerd van 1,6% tot 34% onder gezonde volwassen honden, en tot 53% onder volwassen honden met diarree, 5% tot 39% onder gezonde pups en tot 75% bij pups met diarree (Willard et al., 1987).

2.2.4 Salmonella sp. 2.2.4.1 Algemeen Salmonella is een geslacht van gram-negatieve, staafvormige bacteriën die onderdeel zijn van de natuurlijke flora van pluimvee, varkens, runderen, reptielen en huisdieren. Het geslacht Salmonella

20

bestaat eigenlijk uit één enkele soort, Salmonella enterica. Deze soort heeft zo'n 1500 verschillende serotypen. Daarom wordt veelal het serotype als naam gebruikt. Normaal gezien zijn het alleen volwassen honden die Salmonellose kunnen krijgen. Een uitzondering hierop zijn de honden die rauwe voeding krijgen. Een recente studie over rauwe voeding heeft uitgewezen dat 80% van de voedingsstalen Salmonella bevatte en dat 30% van de honden in de studie Salmonella bacteriën uitscheiden in hun faeces. Volwassen honden zijn vaak asymptomatisch maar elk geïnfecteerd dier of persoon zal voor tenminste 6 weken het organisme uitscheiden, en zullen aldus optreden als bron van infectie voor dieren en mensen. Salmonella organismen zijn moeilijk te verwijderen uit de omgeving en kunnen hierin gemakkelijk 3 maanden overleven (Cantor et al., 1997).

2.2.4.2 Klinische betekenis Salmononella sp. kan de oorzaak zijn van enteritis en diarree bij honden, maar kan ook geïsoleerd worden uit faeces van klinisch gezonde honden. Dit kan verwarring brengen bij de interpretatie van de significantie van Salmonella isolatie. Een aantal studies hebben onderzocht wat de prevalentie is van Salmonella uitscheiding bij gezonde, asymptomatische honden (Cantor et al., 1997).

2.2.4.3 Belang en prevalentie Honden vertonen 53 serotypes van Salmonella. Multipele simultane infecties met 2 tot 4 serotypes werden geobserveerd. De prevalentie van canine Salmonellose is ongeveer 27%. S. typhimurium en S. anatum zijn de meest voorkomende etiologische agentia. Honden ondergaan voornamelijk een subklinische infectie met Salmonella (Morse et al., 1976).

2.2.5 Escherichia coli 2.2.5.1 Algemeen Escherichia

coli

is

een

gram-negatieve

staafvormige

bacterie

die

een

belangrijk

deel

vertegenwoordigt van de facultatieve anaerobe bacteriën, die behoren tot de normale intestinale flora. Alhoewel de meeste E. coli bacteriën niet-pathogeen zijn, worden sommige stammen geassocieerd met een brede waaier aan intestinale ziekten bij zowel mensen als dieren (Broes et al., 1988).

2.2.5.2 Klinische betekenis Escherichia coli is een belangrijke oorzaak van diarree bij pups. Op basis van de virulentiefactoren wordt er een indeling gemaakt in 4 klassen. De enterotoxigene E. coli (ETEC), de enteroinvasieve E. coli (EIEC), de entereopathogene E. coli (EPEC) en de enterohemorrhagische E. coli (EHEC).

De EPEC en EHEC soorten omvatten de E. coli stammen dewelke geen enterotoxines produceren en dewelke niet invasief zijn, maar wel intestinale infectie en diarree veroorzaken door ongekende

21

mechanismen. De E. coli stammen kunnen 1 of meerdere cytotoxines produceren, alhoewel, de eventuele rol van deze toxines is nog niet echt aangetoond. Ze koloniseren de darmen en hechten zich vast aan de enterocyten, wat resulteert in een karakteristieke vernietiging van de microvilli. Het zijn de stammen die behoren tot de klassieke EPEC serotypes die reeds geïsoleerd zijn uit honden met diarree (Levine et al., 1988).

2.2.5.3 Belang en prevalentie In een studie werd aangetoond dat de meeste honden die geïnfecteerd waren met enterische colibacillose afkomstig waren van kennels en pet shops, met een leeftijd tussen 1,5 en 3 maanden. Co-infecties met andere pathogenen werd gerapporteerd in 8 van de 13 gevallen. Deze studie toonde aan dat Escherschia coli moet beschouwd worden als een belangrijke oorzaak van bacteriële diarree bij honden, en dan vooral bij pups (Drolet et al., 1994)

2.3 DIAGNOSTISCHE MOGELIJKHEDEN VOOR INFECTIEUZE DIARREE 2.3.1 Virussen Over het algemeen kunnen diagnostische testen onderverdeeld worden in 3 categorieën: directe detectie, virus isolatie en serologie. Bij directe detectie, wordt het staal direct onderzocht op de aanwezigheid van viruspartikels, virale antigenen, of virale nucleïnezuren. Bij indirecte detectie wordt het virus in een celcultuur, eieren of dieren ingebracht om het te laten groeien, dit is virus isolatie. Een serologische diagnose kan gemaakt worden door de detectie van IgM. De overgrote meerderheid van virale infecties kan gediagnosticeerd worden door serologie (Wrong, 1997). Directe detectie kan gebeuren door elektronen microscopie, histologische preparaten bekijken onder een licht microscoop (onder andere inclusie lichaampjes), moleculaire technieken voor de directe detectie van virale genomen en antigen detectie immunofluorescentie (Wrong, 1997). Indirecte detectie kan gebeuren door celculturen. Virussen groeien niet direct op voedingsbodems, zij hebben cellen nodig waarin zij zich kunnen vermenigvuldigen. Daartoe worden in cultuurflessen cellen gekweekt van menselijke of dierlijke herkomst totdat een cellaag ontstaat, die een enkele cel dun is. Deze cultuurflessen worden bewaard totdat patiëntmateriaal voor onderzoek wordt aangeboden, dat op de cellaag wordt gebracht. De gekweekte cellen worden dagelijks met een microscoop bekeken. Als het patiëntmateriaal virus bevat zal na enkele dagen incubatie de cellaag veranderen: het cytopathologisch of cytopathogeen effect (CPE). De manier waarop dit gebeurt is per virussoort anders, zodat de eerste waarneming al een deel van de conclusie biedt. De definitieve naamgeving gebeurt door serologie, onder meer met fluorescentie of neutralisatie. Fluorescentie berust op het aankleuren van de aangetaste cellen met tegen het virus gerichte antistoffen die gekoppeld zijn aan een fluorescerende stof. Onder het fluorescentiemicroscoop kleuren de aangetaste cellen aan, indien de juiste antistof is gekozen. Neutralisatie berust op het feit dat virusgroei, bij overenting van de

22

virusstam geremd wordt door specifieke antistoffen; groeit de stam niet in de met antistof bewerkte cellaag en wel in de onvoorbereide cellaag, dan is de virussoort herkend en kan de uitslag worden afgegeven. De diagnose van CPV kan ook gesteld worden door de detectie van CPV2 in de faeces door ofwel een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test, een hemagglutinatie test of door electronenmicroscopie. ELISA is een immunochemische reactie en alle immunochemische bepalingen zijn gebaseerd op hetzelfde principe, de specifieke binding tussen antigeen en antistof. Door het aantonen daarvan in het bloed, serum of andere lichaamsvloeistof van een mens of een dier is het mogelijk bij te dragen aan de diagnose van een infectieziekte of een auto-immuunziekte. Het opsporen gebeurt door binding van de eiwitten met antilichamen die gelabeld zijn. Dit wil zeggen dat ze chemisch gekoppeld worden aan een enzym zoals peroxidase dat via een of meer tussenstappen een kleurstof doet ontstaan. Hoe meer van de te detecteren stof aanwezig was, hoe meer enzymwerking gebonden wordt en hoe meer kleurstof er uiteindelijk ontstaat (Silverstein et al, 2003). PCR kan ook gebruikt worden voor de diagnose van CPV2, en kan in een latere fase van de ziekte gebruikt worden wanneer er minder virus wordt uitgescheiden in de faeces (Silverstein et al., 2003). Voor de diagnose van CPV in de praktijk bestaat er ook een Snap-test, die parvo kan vaststellen, mogelijks zelf nog voor de klinische symptomen verschijnen. Deze test detecteert een oppervlakte proteïne antigeen van CPV (en eveneens intacte virus partikels) die worden uitgescheiden in de mest van geïnfecteerde honden. Een nadeel is evenwel dat er voldoende viruspartikels aanwezig moeten zijn (H. Nauwynck, persoonlijke mededeling, 2011). Er treden ook zowel vals positieve als vals negatieve resultaten op, en de testresultaten zouden geïnterpreteerd moeten worden samengaand met de anamnese, klinische symptomen en een bloeduitstrijkje. Vals negatieve resultaten kunnen voorkomen door de relatief korte tijd van virusuitscheiding (Barr and Bowman, 2006). De periode van virusuitscheiding in de faeces is kort, en CPV is zelden detecteerbaar 10 tot 12 dagen na de infectie, wat samengaat met 5 tot 7 dagen van klinische ziekte (Greene, 2006).

2.3.2 Parasieten Voor de detectie van oöcysten van Isospora canis en Toxocara canis in de mest van honden, wordt de sedimentatie-flotatie techniek gebruikt. De voordelen van deze techniek zijn dat de eieren van de meest voorkomende helminthen en oöcysten van coccidiën hiermee ontdekt kunnen worden, de oplossingen zijn goedkoop en er is weinig debris, die het zicht op de oöcysten verhinderd. De nadelen zijn evenwel dat deze techniek niet bruikbaar is voor het opsporen van eieren van trematoden en lintwormen, cysten van Giardia worden erdoor vervormd en het is niet bruikbaar bij vette meststalen.

23

Een infectie met Giardia lamblia wordt in de kliniek meestal vastgesteld, door middel van microscopie of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). De gevoeligheid van microscopie wanneer een enkelvoudig monster wordt onderzocht, ligt relatief laag (50 - 70%), dit is voornamelijk te wijten aan de intermitterende uitstoot van cysten. De gevoeligheid is te verhogen door monsters op meerdere tijdstippen af te nemen, te concentreren en te fixeren. Wanneer monsters worden gefixeerd, kunnen zowel trofozoïeten, als cysten worden aangetoond. De ELISA is gevoeliger dan de microscopie (+/- 98% bij enkelvoudige beoordeling), maar optimale resultaten worden behaald wanneer deze technieken gecombineerd worden. Hierbij worden twee gefixeerde faecesmonsters, afgenomen op verschillende dagen, microscopisch onderzocht en een monster wordt met behulp van ELISA getest. Voor de diagnose van Giardia in de praktijk is eveneens een Snap-test beschikbaar. De test haalt die gemiste gevallen van Giadiosis er tot drie keer zo veel meer uit dan traditionele methodes (Dryden et al., 2006)

2.3.3 Bacteriën Bacteriën kunnen op een voedingsmedium in een petrischaal aangebracht worden, waarna deze wordt geïncubeerd (op geschikte temperatuur, vaak 37°C). Na een of meer dagen groeien de microorganismen, die verder kunnen worden gedetermineerd (onderwerpen aan testen). Van de bacteriën kunnen dan vaak resistentiespectra worden bepaald, waardoor bekend wordt voor welke antibiotica zij gevoelig zijn. De verschillende micro-organismen groeien op verschillende voedingsbodems. Er moet aldus ook gelet worden op het milieu waarin het kan groeien. Zoals de aan- of afwezigheid van zuurstof, de optimale temperatuur, de pH etc. Enkele voorbeelden hiervan zijn: een verhittingsstap tussen de 80 en 100°C doodt alle vegetatieve cellen maar niet de endosporen. Een hoge incubatietemperatuur: enterobacteriën afkomstig van mens of dier groeien nog bij 42°C, de meeste andere enterobacteriën niet meer. Een anaëroob milieu wordt onder andere gebruikt voor de kweek van Clostridium-species. Een lage pH kan gebruikt worden voor de selectie van schimmels, gisten en melkzuurbacteriën . In de meeste gevallen wordt er selectief gekweekt en worden aldus niet alle levende microorganismen bepaald, maar alleen degene die een betekenis hebben voor de diagnose of de kwaliteit (veiligheid) van een product. Dit gebeurt onder andere voor Salmonella. De Gram-kleuring is een methode om bacteriën te kleuren, om ze onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken en als hulpmiddel bij het herkennen van soorten. De bacteriën vallen uiteen in 2 groepen, degene die rood kleuren (gram-negatieven) en degene die blauwpaars aankleuren (gram-positieven). De bacteriën worden eerst gekleurd met een kristalviolet-jodium complex, daarna ontkleurd met alcohol en vervolgens nagekleurd met waterige fuchsine. Bij Gram-positieve bacteriën wordt het

24

kristalviolet-jodium complex niet weggewassen door de alcohol; deze cellen kleuren blauwpaars. Gram-negatieve cellen verliezen de eerste kleurstof weer door het alcoholbad; door de nakleuring met fuchsine kleuren ze daarna rood. Van belang is wel, dat voor de Gram-kleuring enkel bacteriën worden gebruikt uit een 24 uur oude cultuur, omdat in oudere culturen Gram-variabiliteit kan optreden. Het verschil tussen Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën wordt veroorzaakt door een verschil in de structuur van de celwand: Gram-positieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag welke ondoordringbaar is voor het alcoholmengsel, waardoor deze niet worden ontkleurd. Gram-negatieve cellen hebben buiten het cytoplasmamembraan een heel dunne peptidoglycaanlaag (Jawetz et al., 2010).

3. DOELSTELLINGEN Het algemene doel van dit onderzoek is, om na te gaan in hoeverre Clostridium perfringens geassocieerd is met diarree bij pups. Meer specifiek wensten we na te gaan of Clostridium perfringens een rol kan spelen als primaire of als secundaire pathogeen. Om dit na te gaan werden stalen van gezonde pups en pups met diarree onderzocht op de aanwezigheid van meest courante infectieuze agentia die diarree kunnen veroorzaken. Een tweede specifieke doelstelling was het bepalen van de hoeveelheid C. perfringens en het toxine type die uit de stalen geïsoleerd werden.

25

4. ONDERZOEK 4.1 MATERIAAL EN METHODEN 4.1.1 STAALNAME De meststalen zijn afkomstig uit 7 verschillende kennels en uit 48 verschillende nesten. Tussen de 48 stalen zitten ook 6 meststalen met een vaste consistentie, die zullen dienen als controle. De distributie van de meststalen wordt weergegeven in tabel 2. Er werd 5 tot 10 gram faeces verzameld in plastieken potjes die luchtdicht werden afgesloten. Deze werden koel bewaard en getransporteerd naar het labo van Bacteriologie, waar de stalen onmiddellijk geënt werden voor Clostridium perfringens. Voor bacteriologie was er ongeveer 2 gram nodig, voor parasitologie ongeveer 4 gram en voor virologie was 1,5 gram voldoende. De stalen voor parasitologie werden maximum 2 dagen bewaard bij 4°C. Ze werden evenwel niet ingevroren omdat dit destructie van de oöcysten geeft. Voor virologie werden ze bewaard bij – 20°C. Tabel 2 Beschrijving van de karakteristieken van de verschillende meststalen Kennel Kennel 1

Kennel 2

Kennel 3

Kennel 4

Kennel 5

Staal 1

Ras Cocker Spaniël

Leeftijd 9 weken

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Maltezer Beagle Beagle Maltezer Schotse Terriër Yorkshire Terriër Yorkshire Terriër Yorkshire Terriër West-Higland White Terriër West-Higland White Terriër West-Higland White Terriër Dwergpincher

6 weken 7 weken 7 weken 6 weken 9 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 8 weken

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Maltezer Windhond Dwergpincher Maltezer Pekinees Berner Sennen Berner Sennen Berner Sennen Berner Sennen Berner Sennen Berner Sennen Yorkshire Terriër West-Higland White Terriër West-Higland White Terriër West-Higland White Terriër Yorkshire Terriër Yorkshire Terriër

12 weken 12 weken 12 weken 12 weken 12 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 10 weken 6 weken 6 weken 6 weken 6 weken 6 weken 6 weken

26

Type diarree Slappe mest (zonder bloed of slijm) Idem Idem Idem Idem Idem Geen diarree Geen diarree Geen diarree Geen diarree Geen diarree Geen diarree Slappe mest (zonder bloed of slijm) Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem

Kennel 6

Kennel 7

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

Maltezer Cocker Spaniël Cocker Spaniël Malterzer Jack Russel Border Collie Border Collie Jack Russel Jack Russel Dwergpincher Dwergpincher Border Colli Cocker Spaniël Pit bull Chihuahua Chihuahua Chihuahua Cocker Spaniël

10 weken 10 weken 10 weken 8 weken 8 weken 9 weken 9 weken 8 weken 8 weken 10 weken 10 weken 9 weken 10 weken 10 weken 8 weken 8 weken 8 weken 10 weken

Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem

4.1.2 BACTERIOLOGIE 4.1.2.1 Isolatie en titratie van Clostridium perfringens 4.1.2.1.1 Bereiden van voedingsbodem voor isolatie Er werd 31,2 gram Columbia blood agar base (CM0331) opgelost in 800 ml gedestilleerd water. Dit mengsel werd opgewarmd tot het doorzichtig is. Vervolgens werd het geheel geautoclaveerd. Na autoclaveren werd het mengsel weer opgewarmd tot het vloeibaar en doorzichtig was. De fles werd afgekoeld tot ongeveer 36°C. Vervolgens werd er 5% (40 ml) schapenbloed en een specifiek supplement voor Clostridium perfringens (SR0093E) toegevoegd. Dit supplement bestond uit 6,0 mg kanamycine sulfaat en 15,000 IU Polymyxine B sulfaat. Er werd 30 ml mengsel in vierkante platen en 15 ml in de ronde platen gegoten. De platen werden gedroogd en vervolgens bewaard bij 4°C.

4.1.2.1.2 Titreren en stalen op plaat zetten Er werd ongeveer 3 gram van het meststaal opgelost in phosphate buffered saline (PBS) (NaCl, KH2PO4, K2HPO4, gedestilleerd water, pH = 7,3). PBS is een buffer-oplossing, die frequent gebruikt wordt in biologisch onderzoek omwille van de isotoniciteit en doordat het niet toxisch is voor cellen. Er werd een homogene oplossing gemaakt met de vortex (30 seconden). Hiervan werden tienvoudige verdunningen (tot 1/1.000.000) gemaakt in een 96 well plaat. Vervolgens werden de verdunningen op een vierkante bloedplaat geënt: met behulp van een pipet werd zesmaal een druppel van 50 µl per verdunning op plaat geënt. Na opdrogen van de druppels, werden de platen omgekeerd in de anaerobe kast (37°C) gezet. Na 24 uren werden de kolonies geteld en kon berekend worden hoeveel kolonies er aanwezig waren per ml. Hiervoor werd de volgende formule gebruikt: #CFU/g faeces = aantal kolonies x 50 µl / 6 x omgekeerde van de verdunning.

27

Vervolgens werden de kolonies overgeënt op ronde platen om ze op te zuiveren. Vijf isolaten per staal werden bijgehouden. Er werd terug anaeroob gëincubeerd bij 37°C. De volgende dag werden ze opgezuiverd en nogmaals geïncubeerd anaeroob bij 37°C. Wanneer de kolonies zuiver waren, werd een alkalisch extract (DNA) gemaakt en werden er enkele kolonies in LYM milieu bewaard.

4.1.2.2 PCR voor identificatie en toxinetypering van C. perfringens 4.1.2.2.1 Alkalisch extract De lysebuffer voor het alkalisch extract werd als volgt gemaakt: er werd 2,5 ml SDS 10% gemengd met 5ml NaOH 1 N en 92,5 ml Aqua destillata (AD). Dit werd bij kamertemperatuur bewaard. Vervolgens werd er 20 µl lysebuffer in genummerde epjes gedaan en er werd één kolonie ingebracht met een entoogje. De epjes werden verwarmd bij 95°C, 5 minuten op een heatblock. Hierna werd er kort gecentrifugeerd. Dan werd er 180 µl HPLC-water toegevoegd en 5 minuten gecentrifugeerd bij 13000 rpm. De epjes werden bewaard bij - 20°C.

4.1.2.2.2 Lyophilisatie milieu Het lyophilisatie mileu (LYM milieu) is een medium dat wordt gebruikt om de kiemen te bewaren. Het werd gemaakt door 6 gram glucose en 20 ml BHI filteren doorheen Milipore filter. Hierbij werd 60 ml paardenserum gevoegd. Er werd 200 µl LYM in een epje gedaan en hier werden enkele kolonies ingebracht met een entoogje. De epjes werden eveneens bewaard bij – 20°C.

4.1.2.2.3 Polymerase chain reaction (PCR) en gelelektroforese 4.1.2.2.3.1

Inleiding

De polymerase chain reactie of de polymerase kettingreactie is een wetenschappelijke techniek in de moleculaire biologie om één enkel of meerdere kopieën van een stuk DNA van verschillende grootte te vermeerderen, en om op die manier duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald stuk DNA te verkrijgen. We gebruiken hier deze reactie om, gebaseerd op welgekende primerparen de verschillende genen die coderen voor de types toxines geproduceerd door Clostridium perfringens te identificeren. De reactie bestaat uit drie fasen: 

Denaturatie (bij 94°C): gedurende deze fase wordt al het DNA dat als dimeer in de oplossing aanwezig is, gesplitst door een verhoogde temperatuur: de dubbele helix valt uit elkaar.

28



Hybridisatie of annealing (bij 55°C): het enkelstrengig DNA (templaat) krijgt bij lage temperatuur even de tijd om met de snel mobiele primers in de oplossing te hybridiseren. Het krijgt niet genoeg tijd om de denaturatie ongedaan te maken.



Extensie(bij 72°C): toevoeging van nucleotiden door het polymerase aan de primers met vorming van een stuk complementair DNA. Na de derde stap bevat de oplossing twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door de stappen een aantal malen (bijvoorbeeld 30) te herhalen, krijgt men een exponentiële groei van de hoeveelheid gewenst DNA, gelegen tussen 2 specifieke primers.

4.1.2.2.3.2

Stalen voorbereiden voor PCR

De identificatie van het type toxine van de C. perfringens isolaten gebeurde door middel van een multiplex PCR. Met dit type PCR kunnen de verschillende major toxines bepaald worden.

De

referentiestammen gebruikt als positieve controle waren C. perfringens ATCC 3624 (toxine type A, a toxine positief), NCTC 3110 (toxine type B, alfa -, beta - en iota toxine positief), NCTC 3180 (toxine type C, alfa - en beta toxine positief), NCTC 8503 (toxine type D, alfa - and iota toxine positief) en past inst 106156 (toxine type E, alfa - en epsilon - toxine positief). DNA extractie werd gedaan zoals hierboven beschreven. De PCR-test werd uitgevoerd met behulp van de GeneAmp. Een PCR - staal bestond uit 19 µl mix (die bestaat uit 750 µl Qiagen Mastermix en 1µM van elke primer: alfa forward, alfa reverse, beta forward, beta reverse, epsilon,forward, epsilon reverse, iota forward, iota reverse en 435 µl AD) en 1 µl DNA (alkalisch extract). De negatieve controle bestond uit 19 µl mix en 1 µl HPLC water. Het PCR-programma bestond uit 5’ denaturatie bij 94 °C, 30 cycli van 1’ denaturatie bij ’94°C, 1’ annealing bij 55°C en 1’ extensie bij 72°C, gevolgd door een finale extensie van 3’ bij 72 °C. Na afloop werden de stalen gekoeld tot 15 °C.

29

Tabel 3

Primer sequenties en geamplificeerde fragment grootte (naar Gholamiandekhordi et al.,

2005) Toxines

Gen

Primer sequentie (5’ – 3’)

Fragment grootte (bp)

Alfa – toxine

Cpa

GTTGTAAGCGCAGGACATGTTAAG

402

CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC Beta – toxine

Cpb

ACTAATACAGACAGATCATTCAACC

236

TTAGGAGCAGTTAGAAACTACAGAC Epsilon – toxine

Etx

ACTGCAACTACTACTCATACTGTG

541

CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCC Iota - toxine

iA

GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC

317

GGTATATCCTCCACGCATATAGTC

4.1.2.2.3.3

Detectie van de bekomen banden na PCR

De bekomen DNA fragmenten werden gescheiden en gevisualiseerd door middel van gelelecroforese en gelred (Biotium) respectievelijk. De electroforese gel werd als volgt gemaakt. Er werd 3 gram agarose afgewogen voor 200 ml buffer (5 ml glycerol, 4 ml water, 1 ml 100 mM cresolrood) en dit mengsel werd opgekookt op in de microgolf. Een tray werd afgeplakt met plakband en er werden kammetjes geplaatst. Als de agarose goed opgekookt was, werd er gelred toegevoegd (400 µl) en werd de gel voorzichtig uitgegoten in de tray. Wanneer de gel gestold was, werd de plakband eraf getrokken en werden de kammetjes er loodrecht uit de gel genomen. De tray werd in de gelelectroforesebak gelegd. De gel moet volledig onder de buffer staan. . Vervolgens werden de stalen klaargemaakt om ze op gel te zetten. In een 96-well plaat werd er telkens 3 µl staalbuffer + 5 µl staal ingebracht. namen altijd 4 µl ladder (GeneRuler 100 bp Plus) mee De stalen werden geladen zonder de bodem aan te raken. Tenslotte werd de bak aangesloten op het electroforese toestel (75’ bij 170V).

4.1.3 Parasitologie De sedimentatie - flotatie techniek werd gebruikt om oöcysten van Toxocara canis en Isospora canis op te sporen in het meststaal.

30

Er werd 4 à 5 gram faeces van het meststaal genomen, hieraan werd water toegevoegd en gemengd. Dit mengsel werd 3 maal met een theezeef gezeefd en dit extract bleef 30 minuten staan. Het supernatans werd afgegoten en het sediment werd overgebracht in een proefbuis. Dit werd aan 3000 toeren per minuut gecentrifugeerd. Vervolgens werd er sucrose toegevoegd en werd het sediment los gemaakt. Er werd opnieuw gecentrifugeerd, nu 5 minuten aan 1500 toeren per minuut. Vervolgens werd er weer sucrose toegevoegd tot de vloeistof bol stond. Hier bovenop werd een dekglaasje gelegd dat vervolgens op een draagglaasje werd gelegd. Het preparaat werd onder de microscoop bekeken, bij een vergroting van 100x.

Figuur 6 Oöcyste van Toxocara canis ( uit Fox, 2011)

Figuur 7 Oöcyste van Isospora canis. De oöcyste is gesporuleerd en heeft meestal volgende afmetingen: 30 µm x 38 µm (Dierenkliniek Causus, 2011)

31

4.1.4 VIROLOGIE 4.1.4.1 Virusisolatie Voor de isolatie van virussen werden de volgende cellijnen gebruikt. De A72 cellen zijn fibroblastachtige cellen die gevoelig zijn voor het canine coronavirus, canine adenovirus type 1 en 2, canine herpesvirus, canine parainfluenza en canine parvovirus. De MA104 cellen zijn gevoelig voor het rotavirus (Zie ook bijlage I) Het cultuurmedium (MEM + glutamax (Gibco, Invitrogen), 1% Penicilline/Streptomycine, 0,5% Gentamycine, 5% Foetaal Kalf Serum (voor A72 cellen 10%) en 0,294% Tryptose Fosfaat Bouillon (niet voor A72) werd afgegoten en de wasvloeistof (witte PBS en 1 % Penicilline/Streptomycine) werd op de cellen gebracht. Na afgieten werd de splitsvloeistof (Witte PBS, 1% Pencilline/Streptomycine, 1%Versene, 10% Trypsine (op het laatst toevoegen) (A72: 2% trypsine) op de cellen gebracht. Na splisten werd de celsuspensie overgebracht in een 50 ml centrifugeerbuis met 1 ml Foetaal Kalf Serum. De suspensie werd 10 minuten afgedraaid bij 12000 rpm. Het supernatans werd afgenomen en geresuspendeerd in 5 ml medium. Vervolgens werden de cellen geteld en werd de concentratie van de celsuspensie gecorrigeerd naar 300 000 cellen/ml (1ml per well). Er werden 377 cellen geteld en dit werd vermenigvuldigd met 300 000 = 11 310 000 cellen/ml. Hieruit bleek een verdunningsfactor van 113,1. Er was 150 ml nodig om terug te planten => 150/113,1 = 1,3 ml celsuspensie in 150 ml medium. De cellen werden geplant en geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2. Er werd een 20% suspensie mest gemaakt in een transportmedium(rode PBS + 10% FKS + 10% Penicilline/Streptomycine + 5% Gentamycine + 0,1% Fungizone). Aan 1,5 gram mest werd 6 ml transportmedium toegevoegd. Dit mengsel werd 20 minuten gevortext aan 3000 rpm. Er werd 500 µl supernatans afgenomen en 500 µl FKS aan toegevoegd in een eppendorf. Dan gebeurde de inoculatie van A72 (parvo)-cellen, die 1 dag geplant waren aan 100 000 cellen/ml in een 24 well plaat. Inoculatie van de A72 (corona)-cellen, die 2 dagen waren geplant aan 300 000 cellen/ ml in 24 well plaat. Inoculatie van de MA104 (rota)-cellen, die 2 dagen waren geplant aan 300 000 cellen/ml in 24 well plaat. Vervolgens werd er iedere dag het cytopathogeen effect (CPE) afgelezen. Na 4 dagen of wanneer CPE werd waargenomen, werd een eerste subpassage gemaakt. Het supernatans werd verzameld voor hemagglutinatie. De cellen werden op inserts (ronde dekglaasjes) gefixeerd met methanol bij -20°C voor de immunofluorescentie. De subpassage werd geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Iedere dag werd het CPE afgelezen en na 4 dagen of na het optreden van het cytopathogeen effect werd een tweede subpassage gemaakt, werd

32

opnieuw het supernatans verzameld voor hemagglutinatie en werden de cellen op inserts gefixeerd voor immunofluorescentie.

4.1.4.2 Hemagglutinatie test (HA) De hemagglutinatie test is een methode voor de kwantificering van virussen of bacteriën door de hemagglutinatie. Het is een gemakkelijke, eenvoudige en snelle methode die kan worden toegepast op een groot aantal stalen. Sommige virussen (onder andere rota- en parvovirus, het coronavirus minder) en bacteriën hebben op hun oppervlak eiwitten die in staat zijn om te agglutineren aan (vasthouden aan) menselijke of dierlijke rode bloedcellen (RBC) en binden aan N-acetylneuraminezuur. Aangezien elk van de agglutinerende moleculen hechten aan meerdere RBC, zullen deze een rooster-structuur vormen. De hemagglutinatie test van een virus,is in tegenstelling tot andere vormen van virus kwantificering zoals een plaque assay of 50% Tissue Culture infectieuze dosis, veiliger omdat er geen virus replicatie is nodig in deze test. Deze test werd uitgevoerd in een microtitterplaat met V-bodem (zie ook bijlage II). Er werd 0,05 ml virussuspensie (supernatans van de cellen, in eerste well) en 0,05 ml witte PBS (pH = 5,9) in well 1 tot 4 gedaan en zo uit verdund. Vervolgens werden er 0,05 ml varkens rode bloedcellen (0,05%) toegevoegd. Er werd even geschud. De rode bloedcellen kregen de kans om uit te zakken bij 4°C overnacht. Als de bodem bedekt is, is de test positief. Als de rode bloedcellen uitgezakt zijn in een punt is de test negatief.

Figuur 8 Resultaten van een hemagglutinatie test. Well 1 tot 3 zijn positieve stalen, well 4 tot 7 zijn negatieve stalen (Desario et al., 2005)

33

4.1.4.3 Immunofluorescentie Fluorescentiemicroscopie is een techniek die in biologisch en medisch onderzoek wordt gebruikt waarbij fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt, die oplichten als ze worden bestraald met licht van een kortere golflengte. De meeste vormen van fluorescentiemicroscopie maken gebruik van sera van kunstmatig geproduceerde antistoffen waarop een fluorescerende kleurstof wordt gekoppeld. De methode wordt dan ook wel immunofluorescentie-, ofwel IF-microscopie genoemd. Deze zijn afkomstig van bijvoorbeeld muizen of ratten, en zijn specifiek gericht tegen een bepaald, bekend eiwit. Als het serum wordt toegevoegd aan een weefsel, zullen de antistoffen binden aan het doeleiwit. Nietgebonden antistoffen worden weggewassen. Er worden polyklonale en monoklonale sera onderscheiden. Monoklonale antistoffen zijn allemaal precies identiek (omdat ze afkomstig zijn van 1 unieke kloon van afweercellen), terwijl polyklonale antistoffen verschillende onderdelen van het eiwit kunnen herkennen. De IF voor detectie van virale antigenen in celculturen werd als volgt uitgevoerd (zie ook bijlage III). Bij iedere passage werden de cellen op een insert geplant. De cellen werden na 4 dagen 3 maal gewassen met rode PBS. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met methanol (500 µl, -20°C, 20 minuten) en bewaard bij 20°C tot de kleuring werd uitgevoerd. De methanol werd verwijderd en gedroogd tot het volledig verdampt was. Als eerste werden de primaire antistoffen toegevoegd. Een lijst met de gebruikte antistoffen wordt gegeven in tabel 4. Tabel 4 Gebruikte primaire antistoffen Corona

Parvo

Rota

Anti – FIP 791146 (kat) Abcam

Mouse + Parvo (IgG2) Ab 7669

Sheep + Rota Abcam

(1/5000)

Abcam

(1/600)

(1/180) 20 µl Antistof (1/10)

56 µl Antistof

17 µl Antistof

9980 µl rode PBS

9944 µl rode PBS

9983 µl rode PBS

Er werd 1 uur geïncubeerd bij 37°C en opnieuw gewassen met rode PBS. Ten tweede werden de secundaire antistoffen toegevoegd, deze worden weergegeven in tabel 5.

34

Tabel 5 Gebruikte secundaire antistoffen Corona

Parvo

Rota

Goat + cat FITC F4262 Abcam

Goat + Mouse FITC Abcam

Rabbit + Sheep FITC Abcam

(1/200)

(1/200)

(1/200)

50 µl Antistof

50 µl Antistof

50 µl Antistof

9950 µl rode PBS

9950 µl rode PBS

9950 µl rode PBS

Er werd nogmaals geïncubeerd bij 37°C en opnieuw gewassen met rode PBS. Als laatste werd Hoechst (1/100, 100 µl Hoechst en 9900 µl rode PBS) toegevoegd. Hoechst is een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om DNA te merken voor fluorescentie microscopie. De inserts werden gemonteerd op een draagglaasje met glycerol DABCO. De

preparaten

werden

onderzocht

met

een

fluorescentiemicroscoop

(Leica)

met

een

excitatiegolflengte van 485 nm en de excitatiegolflengte van 525 nm. De gebruikte kleuring is een FITC-kleuring. Bij een positief resultaat zullen de aangetaste cellen groen fluoresceren. Bij het coronavirus zullen de aangetaste cellen langwerpig zijn (zie figuur 9). Bij het rota- en parvovirus zullen de aangetaste cellen meer afgerond en verder van elkaar verspreid liggen (zie figuur 10 en 11). Bij een negatief resultaat zullen de cellen niet oplichten.

Figuur 9 Positieve controle voor coronavirus.

35

Figuur 10 Positieve controle voor parvovirus

Figuur 11 Positieve controle voor rotavirus

36

4.2 RESULTATEN 4.2.1 Bacteriologie 4.2.1.1 Isolatie C. perfringens Van de 48 pups waarvan een meststaal werd genomen, waren er 42 met diarree en 6 zonder diarree. Uit 3 van de 6 stalen van pups zonder diarree werd geen C. perfringens geïsoleerd. Uit alle 42 stalen van pups met diarree werd wel C. perfringens geïsoleerd.

4.2.1.2 Kwantificatie Er werd berekend hoeveel kolonies van C. perfringens aanwezig waren per ml faeces. Het aantal 7

kolonies van meststalen afkomstig van pups met diarree was gemiddeld 2,3 x 10 CFU/ml faeces en 4

van pups zonder diarree gemiddeld 2,8 x 10 CFU/ml faeces. Tabel 6 Resultaten kwantificering C. perfringens Pup

Kennel 1

Kennel 2

nummer

Kennel 3

Kennel 4

Kennel 5

Kennel 6

Kennel 7

(Geen diaree) 7

5,0 x 10

2

7

-

8

1,67 x 10

3,33 x 10

-

5,0 x10

6

-

2,5 x 10

6

1

2,50 x 10

2

2,58 x 10

3

1,08 x 10

4

2,5 x 10

5

3,58 x 10

6

3,33 x 10

8,33 x 10

7

-

-

8 9 10 11 12 Gemiddelde

6

-

2

6

1,6 x 10

1,8 x 10

7

1,2 x 10

7

5,81 x 10

8,3 x 10

7

5,0 x 10

6

4,9 x 10

2,3 x 10

8

2,0 x 10

6

1,6 x 10

2,6 x 10

8

7,47 x 10

1,42 x 10

1,8 x 10

5

-

-

6 4

4 5 6

-

4

2,8 x 10

-

1,5 x 10

6

1,03 x10

8

6

5,3 x 10

6

3

1,7 x 10

7

3

1,4 x 10

5

6

6

7,2 x 10

6

4,15 x 10

6

3,57 x 10

7

5,2 x 10

5

-

2,3 x 10

7

-

1,5 x 10

6

-

1,6 x 10

6

-

3,3 x 10

2

-

-

2,2 x 10

3,33 x 10

-

-

3

4

-

-

-

7

1,4 x 10

-

-

-

6

-

-

-

2,8 x 10

5

-

-

7

7,0 x 10

-

-

2,5 x 10

3,58 x10

3

-

7,47 x 10

-

5,8 x 10

6

-

6,0 x 10

6

5,4 x 10

4,1 x 10

6

6

4.2.1.3 Polymerase chain reaction In onderstaande tabel werd samengevat welke stalen onderzocht werden met behulp van PCR. Van elk staal werd 1 of meerdere isolaten genomen. Uit meststalen 7, 10 en 11 werd geen C. perfringens geïsoleerd, dus deze werden uiteraard niet onderzocht met PCR. Alle isolaten bleken het C. perfringens toxine type A te zijn, en droegen het gen voor het alfa toxine (cpa) maar geen genen die codeerden voor het beta, iota of epsilon toxine.

37

Tabel 7 Informatie PCR - stalen Staal PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Isolaat ATCC3624 NCTC3110 NCTC3180 NCTC8503 Past inst 106156 1A 2A 3A 4A 5B 6B 8B 8C 9A 9B 12A 12B 13A 14A 15A

Staal PCR 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Isolaat 16A 17A 18A 19A 20A 21A 22A 23A 24A 24C 25A 26A 27A 28A 28B 29A 29B 30A 30C 31A

Staal PCR 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61

Isolaat 32A 33A 34A 35A 36A 37A 38A 39A 40A 41A 42A 42B 42E 45A 45B 46A 46E 48A 48B 48E Negatieve controle

Hieronder worden de resultaten van de PCR weergegeven Er werd een digitale foto genomen die bekeken werd met het computerprogramma Liscap.

Figuur 12 PCR voor de detectie van het alfatoxine gen. De witte pijl duidt het niveau van het alfa toxine aan. De letter M staat voor de ladder. Stalen 1 tot 5 zijn de positieve controles (A tot E). Stalen 6 tot 11 zijn afkomstig van pups met diarree en produceren het alfatoxine gen. Stalen 12 tot 17 zijn afkomstig van pups zonder diarree. PCR -stalen 12, 14, 15, 16 en 17 waren afkomstig van pups zonder diarree en bleken dus geen C. perfringens te zijn. Staal 18 is afkomstig van een pup met diarree.

38

Figuur 13 PCR voor de detectie van het alfatoxine gen. Stalen 19 tot 36 waren afkomstig van pups met diarree.

Figuur 14 PCR voor de detectie van hat alfatoxine gen. Stalen 37 tot 54 waren afkomstig van pups met diarree.

Figuur 15 PCR voor de detectie van het alfatoxine gen. Stalen 55 tot 60 waren eveneens afkomstig van pups met diarree. Staal 61 is een negatieve controle.

39

4.2.2 Parasitologie Van de 24 meststalen, die getest werden met de sedimentatie-flotatie techniek, bleken 6 (36, 37, 42, 44, 46 en 48) stalen positief te zijn voor Isospora canis. Er werden geen oöcysten gevonden van Toxocara canis. Giardia werd in dit onderzoek niet bepaald omwille van de beperkte hoeveelheid materiaal en de kostprijs. Giardia is evenwel een belangrijke oorzaak van diarree bij pups.

4.2.3 Virologie In een eerste fase werd het licht cytopathogeen effect bekeken. Een aantal stalen waren hiervoor positief, maar dit was geen typisch beeld, en kan dus eventueel te wijten zijn aan toxiciteit van de mest. Bij de eerste passage werden geen veranderingen waargenomen aan de morfologie van de cellen. De resultaten van de tweede en derde passage worden weergegeven in tabel 8. Er werd steeds een onverdunde en een 10

-1

verdunning gemaakt. Een positief resultaat komt overeen met

afgeronde cellen. De negatieve resultaten van de derde passage zijn voornamelijk te wijten aan het geringe aantal cellen die aanwezig waren. Bij de hemagglutinatie test bleek 1 staal bij de derde passage onverdund (45) positief. Immunofluorescentie moest hier aantonen of dit significant was. Van de 21 stalen die getest werden met behulp van immuno - fluorescentie, op de aanwezigheid van het rota- , corona- en parvovirus, bleek geen enkel staal positief te zijn. Tabel 8 Samenvatting resultaten virologie Stalen

Cytopathogeen effect (CPE) Tweede passage

19

Positief (onverdund +

Hemagglutinatie

Rota -, Corona ,Parvovirus

Derde passage Negatief

Negatief

Negatief

eerste verdunning) 20

Positief (onverdund)

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

21

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

22

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

23

Positief (onverdund +

Negatief

Negatief

Negatief

eerste verdunning) 24

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

26

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

27

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

35

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

36

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

37

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

38

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

40

40

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

41

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

42

Negatief

Negatief

Negatief

Negatief

43

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

44

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

45

Negatief

Negatief

Positief

Negatief

46

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

47

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

48

Positief (onverdund)

Negatief

Negatief

Negatief

Tabel 9 Samenvatting van de resultaten Kennel

Diarree

Bacteriologie C. perfringens 6/6

1

Diarree

2

3/6

3

Geen diarree Diarree

4

Diarree

6/6

5

Diarree

6/6

6

Diarree

12/12

7

Diarree

6/6

6/6

Bacteriologie Gemiddelde # CFU/ml faeces 6 3,33 x 10 - 1,08 x 8 7 10 (2,8 x 10 ) 2 8,33 x 10 - 1,67 x 5 4 10 (2,8 x 10 ) 4 3,3 x 10 - 3,58 x 6 6 10 (1,5 x 10 ) 5 1,8 x 10 - 2,6 x 8 8 10 (1,03 x 10 ) 4 7,47 x 10 - 1,2 x 7 6 10 (4,1 x 10 ) 2 3,3 x 10 - 2,3 x 7 6 10 (6,0 x 10 ) 6 3,66 x 10 - 3,22 x 8 6 10 (5,4 x 10 )

Bacteriologie PCR

Virologie

Parasitologie

Alfa toxine

-

-

1/3 Alfa toxine Alfa toxine

-

-

-

-

Alfa toxine

0/6 positief 0/2 positief 0/7 positief 0/6 positief

-

Alfa toxine Alfa toxine Alfa toxine

1/6 positief voor I. canis 2/12 positief voor I.canis 3/6 positief voor I. canis

Uit de 48 meststalen die verzameld werden, hadden 42 pups diarree en 6 pups geen diarree. Uit alle meststalen van pups met diarree werd C. perfringens geïsoleerd. Uit enkel 3 van de 6 stalen van pups zonder diarree werd C. perfringens geïsoleerd. Uit de kwantificatie bleek dat het gemiddeld aantal kolonies van pups met diarree 2,3 x 10

7

CFU/ml

4

faeces was en van pups zonder diarree 2,8 x 10 CFU/ml. Uit de PCR bleek dat bij alle pups met diarree, het geïsoleerde C. perfringens van het type A was. Bij pups zonder diarree waarbij C. perfringens werd geïsoleerd was maar 1 staal van het type A. Bij virologie bleek dat alle 21 onderzocht stalen negatief waren voor corona- ,rota- en parvovirus. Een oorzaak hiervan kan ook de intermitterende uitscheiding zijn. Van de 24 onderzocht stalen voor parasitologie, bleken 6 stalen positief voor Isospora canis, geen stalen waren positief voor Toxocara canis.

41

5. DISCUSSIE De literatuurstudie heeft uitgewezen dat diarree een frequent voorkomend probleem is bij honden, en zeker bij pups. De oorzaken van deze diarree zijn zeer uiteenlopend en co-infecties treden veelvuldig op. Verder zijn er nog maar weinig studies uitgevoerd naar het voorkomen van Clostridium perfringens als oorzaak van diarree bij pups. C. perfringens wordt frequent geassocieerd met diarree en sterfte bij andere dieren. Het toxine type A werd onder andere geassocieerd met necrotische enteritis bij pluimvee, milde necrotische enteritis bij biggen, intestinale clostridiose bij paarden en necrotische enteritis bij pluimvee. Het toxine type B werd geassocieerd met enteritis bij verscheidene diersoorten, dysenterie bij neonatale lammeren, chronische enteritis bij oudere lammeren, hemorrhagische enteritis bij kalveren en veulens en enterotoxemie bij schapen, geiten en cavia’s. Toxine type C werd gevonden bij entereotoxemie bij varkens, lammeren, kalveren, geiten en pluimvee. Toxine type D werd reeds gevonden bij “pulpy kidney disease” bij lammeren en kalveren en bij enterocolitis bij geiten en vee. Toxine type E werd reeds gevonden bij enteritis bij honden, vee en varkens, enterotoxemie bij kalveren, cavia’s en konijnen) en dysenterie bij lammeren (Hatheway et al., 1990). Stammen van het toxine type B tot E zijn altijd geassocieerd met ziekte, wat aantoont dat deze virulente pathogenen zijn. Type A stammen zijn ook geassocieerd met ziekte maar kan evenzeer deel zijn van de normale flora in de intestinale tractus van zowel mensen als dieren. De pathogenese van C. perfringens in verschillende ziekten is nog onvolledig opgelicht en waarschijnlijk zijn er nog veel potentiële toxines ongeïdentificeerd (Hatheway et al., 1990). Deze studie heeft uitgewezen dat Clostridium perfringens een groot aandeel heeft in puppy diarree. Er werd evenwel geen associatie gevonden met andere oorzaken. Vrijwel allen produceerden enkel het alfa toxine en waren dus van het type A. Clostridium perfringens type A is het meest voorkomende type en is een pathogeen dat meer en meer gezien wordt in gastro – intestinale uitbraken. Het maakt echter ook deel uit van de normale flora bij mens en dier, en kan dus evengoed een contaminant zijn. Wijzigingen in het dieet of een parasitaire infestatie kunnen een goed groeimilieu veroorzaken, wat resulteert in overgroei en productie van potente toxines. De negatieve resultaten van de virologische testen kunnen te wijten zijn aan het feit dat de stalen genomen werden van dieren met diarree, maar zonder echte tekenen van ziekte. Het kan ook zijn dat we te maken hadden met intermitterende uitscheiders. Oöcysten van Isospora canis worden frequent terug gevonden in diarree bij pups. Het zijn evenwel enkel grote aantallen die ziekte en sterfte veroorzaken. Dat de pups eveneens negatief waren voor Toxocara canis kan het gevolg zijn van een ontworming die ze hadden gekregen op 2, 4, 6 en 8 weken. Giardia werd in onderzoek niet bepaald omwille van de kostprijs en de beperkte hoeveelheid materiaal. Het is evenwel een belangrijke oorzaak van diarree bij pups.

42

De diagnose van diarree door deze enteropathogenen bij honden zou moeten gemaakt worden, op basis van een combinatie van parameters zoals het signalement en predisponerende factoren, klinische symptomen, serologische testen voor toxines, fecale cultuur en de ploymerase kettingreactie (PCR). Zich enkel baseren op de resultaten van de fecale cultuur alleen, is problematisch aangezien Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter spp. en pathogene en niet – pathogene Escherichia coli frequent worden geïsoleerd uit de mest van gezonde honden. Daarentegen, cultuur kan evenwel bruikbaar zijn na opzuiveren, voor het toepassen van moleculaire technieken, zoals PCR, voor de detectie van specifieke toxine genen of moleculaire typering van geïsoleerde stammen om klonen vast te stellen. Verder is er een zeer grote interesse in het gebruik van de micro-array technologie voor de simultane detectie van duizenden genen van target DNA sequenties. Deze techniek wordt reeds gebruikt bij de studie van de humane oncogenese. Met de zogenaamde micro-array techniek is het mogelijk geworden om van ieder gen een specifiek stukje op een klein glaasje te printen. Ieder gen dat door een specifieke tumor tot expressie wordt gebracht, hecht zich aan de plaats op de micro-array waar het corresponderende gen zich bevindt. Dit patroon wordt dan weer afgelezen met behulp van een laser en bepaalt in welke mate een gen aanstaat dan wel uitstaat (upregulatie versus down-regulatie). Met behulp van deze techniek kan dit voor duizenden genen tegelijk bepaald worden en dit geeft een compleet en gedetailleerd beeld van het complexe proces van oncogenese, oftewel het ontstaan van kanker. Dit krachtig instrument kan eveneens gebruikt worden voor de detectie van specifieke pathogene bacteriële stammen in fecale meststalen van honden in de toekomst.

Er zullen evenwel in nog meerdere studies moeten uitgevoerd worden, om het belang van C. perfringens bij puppydiarree, verder te onderzoeken.

43

6. REFERENTIELIJST Awad Miilena M., Bryant Amy E., Stevens Dennis L., Rood Julian I. (1995) Virulence studies on chromosomal α-toxin and Θ-toxin mutants constructed by allelic exchange provide genetic evidence for the essential role of α-toxin in Clostridium perfringens-mediated gas gangrene. Barr SC and Bowman DD (2006) The 5 – minute Veterinary Consult Clinical Companion: Canine and feline infectious diseases and parasitology. Broes A., Drolet R.,Jacques M., Fairbrother J M and Johnson W M (1988) Natural Infection with an Attaching and Effacing Escherichia coli in a Diarrheic Puppy. Buogo C, Burnens AP, Perrin J, Nicolet J. (1995) Presence of Campylobacter spp., Clostridium difficile, C. perfringens and salmonellae in litters of puppies and in adult dogs in a shelter. Canard B, Cole S T (1989) Genome organization of the anaerobic pathogen Clostridium perfringens. Cantor Glenn H., Nelson Stuart, Vanek Jr., Jerome A., Evermann James F.,. Eriks Inge S, Basaraba Randall J., Besser Thomas E. (1997) Salmonella shedding in racing sled dogs. Carmichael L (2005). "An annotated historical account of canine parvovirus". J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 52 (7-8): 303–11. Carter, G.R.; Wise, D.J. (2006). "Parvoviridae". A Concise Review of Veterinary Virology. Decaro N, Martella V, Desario C, Bellacicco A, Camero M, Manna L, d'Aloja D, Buonavoglia C (2006). "First detection of canine parvovirus type 2c in pups with haemorrhagic enteritis in Spain". J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 53 (10): 468–72. Dept. of Vet. Microbiology, KVL, Denmark, (2000) Clostridium perfringens. Internetreferentie: http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=10 (geconsulteerd op 24 april 2011) Desario C, Decaro N, Campolo M, Cavalli A, Cirone F, Elia G, Martella V, Lorusso E, Camero M, Buonavoglia C. Canine parvovirus infection: Which diagnostic test for virus? Journal of Virological Methods. 2005. 126: 179-185. Dierenkliniek Causus (2011)Endo – parasieten bij hond.Internetreferentie:http://www.causus.be/vrij.cfm?Id=73 (geconsulteerd op 24 april)

de

Drolet R, Fairbrother J M, Harel J, Hélie P (1994) Attaching and effacing end enterotoxigenic Escherichia coli associated with Enteric Colibacillosis in the dog. Dryden M. W., Payne P. A., Smith V (2006) Accurate Diagnosis of Giardia spp and Proper Fecal Examination Procedures. Egeler R. Maarten (2004) Naar de toppen van de kindere hemato – oncologie. Ermel RW, Kock M, Griffey SM… - Laboratory animal …, 1997 -The atopic dog: a model for food allergy. Ettinger, Stephen J.;Feldman, Edward C. (1995). Textbook of Veterinary Internal Medicine (4th ed.). W.B. Saunders Company.

44

Evermann JF, Abott JR, Han S. (2005) Canine coronavirus associated with puppy mortality without evidence of concurrent canine parvovirus infection. J. Vet Diag Invest 17:610-4 Fenner, Frank J.; Gibbs, E. Paul J.; Murphy, Frederick A.; Rott, Rudolph; Studdert, Michael J.; White, David O. (1993). Veterinary Virology (2nd ed.). Academic Press, Inc. Fox Carl J (2011) Toxocara canis egg. Internetreferentie: http://instruction.cvhs.okstate.edu/jcfox/htdocs/clinpara/lst31_40.htm (geconsulteerd op 24 april 2011) Fulton RW, Johnson CA, Pearson NJ, Woode GN (1981) Isolation of a rotavirus from a newborn dog with diarrhea. Gholamiandekhordi Ahmad, R. Ducatelle Richard, Heyndrickx Marc, Haesebrouck Freddy, Van Immerseel Filip (2005) Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status. Gilbert M., Jolivet – Reynaud C., Popoff MR (1997) Beta2 toxin, a novel toxin produced by Clostridium perfringens. Green CE (2006) Canine viral enteritis. Hahn NE, Glaser CA, Hird DW, Hirsh DC (1988) Prevalence of Giardia in the feces of pups. Hatheway C L (1990) Toxigenic clostridia. Horiuchi M, Yamaguchi Y, Gojobori T, Mochizuki M, Nagasawa H, Toyoda Y, Ishiguro N, Shinagawa M (1998). "Differences in the evolutionary pattern of feline panleukopenia virus and canine parvovirus". Virology 249 (2): 440–52 Ikeda, Y; Mochizuki M, Naito R, Nakamura K, Miyazawa T, Mikami T, Takahashi E. (2000-12-05). "Predominance of canine parvovirus (CPV) in unvaccinated cat populations and emergence of new antigenic types of CPVs in cats.". Virology 278 (1): 13–9. Jawetz, Melnick, Adelberg (2010) Review of Medical Microbiology,25th ed;: Lange, LA 1984, p 137 Kerr Muir M G (1994) Toxocara canis and human health. Levine MM. (1987) Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroadherent. J Infect Dis ; 155:377-389. Li F, Li W, Farzan M, Harrison SC (September 2005). "Structure of SARS coronavirus spike receptorbinding domain complexed with receptor".

Lobetti, Remo (2003). "Canine Parvovirus and Distemper". Proceedings of the 28th World Congress of the World Small Animal Veterinary Association. Mc Clane Bruce A. (2001) The complex interactions between Clostridium perfringens enterotoxine and the epithelial tight junctions. Miller Lila and Hurley Kate (2009) Infectious disease management in animal shelters. Morse E V, Duncan M A, Estep D A, Riggs W A and Blackburn B O (1976) Canine salmonellosis: A review and report of dog to child transmission of Salmonella enteritidis.

45

Nelson, Richard W.;Couto, C. Guillermo (1998). Small Animal Internal Medicine (2nd ed.). Mosby Olson M. E (1985) Coccidiosis Caused by Isospora ohioensis-like Organisms in Three Dogs. Perrin J ,Buogo C., Gallusser A, Burnens A P, Nicolet J. (2010) Intestinal Carriage of Clostridium difficile in Neonate Dogs. Petit L, Gilbert M, Popoff M R (1999) Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Pratelli Annamaria, Decaro Nicola, Tinelli Antonella, Martella Vito, Elia Gabriella, Tempesta Maria, Cirone Francesco, and Buonavoglia Canio (2004) Two Genotypes of Canine Coronavirus Simultaneously Detected in the Fecal Samples of Dogs with Diarrhea.

Prittie, Jennifer (September 2004). "Canine Parvoviral Enteritis: A Review of Diagnosis, Management, and Prevention". J Vet Emerg Crit Care. 14 (3): 167–176. doi:10.1111/j.1534-6935.2004.04020 Rood J I, Cole S T (1991) Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens. Rosser EJ Jr - Journal of the American Veterinary Medical …, (1993) Diagnosis of food allergy in dogs. Ruggieri A., Trani L. D, Gatto D., M. Franco, E. Vignolo, B. Bedini, G. Elia and C. (2007) Canine coronavirus induces apoptosis in cultured cells. Silverstein, Deborah C. (2003). "Intensive Care Treatment of Severe Parvovirus Enteritis". International Veterinary Emergency and Critical Care Symposium 2003. Scarth Linda Loos (2006) The Merck Veterinary Manual "Canine Parvovirus". Shackelton LA, Parrish CR, Truyen U, Holmes EC. (2005). "High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2): 379–384. Smith Tara C. (2006) Two potential rotavirus vaccines tested. Internetreferentie: http://aetiology.blogspot.com/2006/01/two-potential-rotavirus-vaccines.html (geconsulteerd op 24 april 2011) Sokolow SH, Rand C (2005) Epidemiologic evaluation of diarrhea is dogs in animal shelters. 66(6):1018-24 Songer J G (1996) Clostridial enteric diseases of domestic animals. Steinthorsdottir Valgerdur, Halldórsson Haraldur and Andresson OÂlafur S (2000) Clostridium perfringens beta-toxin forms multimeric transmembrane pores in human endothelial cells. Stockman LJ, Bellamy R, Garner P (2006) SARS: Systematic review of treatment effects. PLoS Med 3(9): e343. Internetreferentie: http://www.sciencedaily.com/releases/2006/09/060915204224.htm (geconsulteerd op 24 april 2011) Struble Andrea L, Yajarayma J. Tang, Philip H. Kass, Paul H. Gumerlock, Bruce R. Madewell, Joseph Silva, Jr (1994) Fecal shedding of Clostridium difficile in dogs: a period prevalence survey in a veterinary medical teaching hospital. Todar Kenneth (2011) The Normal Bacterial Flora of Humans. Internetreferentie: http://www.textbookofbacteriology.net/normalflora.html (geconsulteerd op 24 april 2011)

46

Truyen U (2006). "Evolution of canine parvovirus--a need for new vaccines?". Vet. Microbiol. 117 (1): 9–13 Twomey LN, Pluske JR, Rowe JB, Choct M (2003) The effects of increasing levels of soluble nonstarch polysaccharides and inclusion of feed enzymes in dog diets on faecal quality and digestibility. Weese Scott (2009) Are all giardia created alike? Internetreferentie: http://www.wormsandgermsblog.com/tags/giardia/ (geconsulteerd op 17 april 2011) 1

Weese J. Scott, DVM, DVSc, DipACVIM , Fulford Martha B. BSc, BEd, MA, MD (2011) Companion Animal Zoonoses. Willard MD, Sugarman B, Walker RD (1987). Gastrointestinal zoonoses. Vet Clin North Am Small Anim Pract ; 17:145–78. Wright Ian (2011) The role of parasites is puppy diarrhea: the usual suspects. Wrong Derek (1997) Parvovirus. Internetreferentie: http://virology-online.com/viruses/Parvoviruses.htm (geconsulteerd op 23 februari 2011)

47

BIJLAGE I PROTOCOL VIRUSISOLATIE 1. Materiaal 





Cultuurmedium -

MEM (minimum essential medium) + glutamax

-

1% Penicilline/Streptomycine

-

0,5% Gentamycine

-

5% Foetaal Kalf Serum (A72: 10%)

-

0,294% Tryptose Fosfaat Bouillon (niet voor A72)

Wasvloeistof -

Witte PBS

-

1% Penicilline/Streptomycine

Splitsvloeistof -

Witte PBS

-

1% Pencilline/Streptomycine

-

1%Versene

-

10% Trypsine (op het laatst toevoegen) (A72: 2% trypsine)

Altijd warm was- en splitsvloeistof opbrengen! 

4 centrifugeerbuizen (50ml)



2 niet steriele epjes



Trypaanblauw



Foetaal kalf serum



Cultuurfles + platen om cellen te planten

2. Methoden -

Afgieten Cultuurmedium

-

Wasvloeistof op cellen brengen (37°C, 10 minuten, stop dicht)  5 ml fles = 5 ml wasvloeistof  25 ml fles = 20 ml wasvloeistof  50 ml fles = 30 ml wasvloeistof

-

Splitsvloeistof op cellen brengen (37°C, 10 minuten maximum, stop dicht)  5 ml fles = 5 ml splitsvloeistof  25 ml fles = 20 ml splitsvloeistof  50 ml fles = 30 ml splitsvloeistof

-

Celsuspensie na splitsen overbrengen in 50 ml centrifugeerbuis met 2 ml Foetaal Kalf Serum

-

Suspensie afdraaien bij 1200 rpm 10 minuten

-

Supernatans afnemen en pellet resuspenderen in 5 ml medium

-

Cellen tellen

48

 100 µl celsuspensie + 900 µl medium in een niet steriel epje (1/10)(vortex)  Neem 400 µl van de 1/10 oplossing en voeg hierbij 200 µl trypaanblauw (vortex)  Burkerse telkamer: aantal cellen geteld x 30 000 = aantal cellen/ml 

Concentratie van celsuspensie corrigeren naar x aantal cellen/ml  Volgende concentraties nodig voor te planten: In een 24 well plaat op inserts: 300 000 cellen/ml -> 1 ml / well



377 cellen geteld x 30 000 = 11 310 000 cellen/ml. Hieruit blijkt een verdunningsfactor van 113,1. Er is 150 ml nodig om terug te planten => 150/113,1 = 1,3 ml celsuspensie in 150 ml medium.



Cellen planten incuberen bij 37°C, 5% CO2, stop lichtjes losdraaien.

Een 20% suspensie mest in transportmedium maken. Aan 1,5 gram mest 6 ml transportmedium toevoegen. Dit laatste bestaat uit PBS + 10% FKS + 10% Penicilline/Streptomycine + 5% Gentamycine + 0,1% Fungizone. We vortexen dit mengsel 20 minuten aan 3000 rpm. Vervolgens 500 µl supernatans nemen en hieraan 500 µl FKS toevoegen in een eppendorf. 1. Inoculatie A72 (parvo)-cellen 1 dag geplant à 100 000 cellen/ml in 24 well plaat. 

Cellen wassen met 1 ml PBS + 1% Penicilline/Streptomycine



1 well inoculeren met 200 µl overdund



1 well inoculeren met 200 µl 1/10 verdund (20 µl supernatans + 180 µl medium A72)



1 uur incubatie



Supernatans afzuigen



Cellen wassen met 1ml PBS + 1% Penicilline/Streptomycine



1 ml medium per well toevoegen

2. Inoculatie A72 (corona)-cellen 2 dagen geplant à 300 000 cellen/ ml in 24 well plaat. 

Inoculatie idem

3. Inoculatie MA104 (rota)-cellen 2 dagen geplant à 300 000 cellen/ml à 300 000 ml in 24 well plaat. 

Supernatans voorbehandelen met 0,05% trypsine Trypsine 10X verdunnen -> hiervan 5µl per ml supernatans (1,65 µl + 330 µl supernatans)



Cellen wassen met 1ml PBS + 1% Penicilline/Streptomycine



1 well inoculeren met 200 µl onverdund



1 well inoculeren met 200 µl 1/10 verdund



1 uur incubatie

49



Supernatans afzuigen



Cellen wassen met 1 ml PBS + 1% Penicilline/Streptomycine



1 ml medium per well toevoegen

Medium A72 (D)MEM + 5% FKS + 1% Penicilline/Streptomycine + 0,5% Gentamycine + 0,1% Fungizone Medium MA104 MEM + 10% TFB + 1% Penicilline/Streptomycine + 0,5% Gentamycine + 4µl trypsine per 100 ml medium + 0,1% Fungizone -

Vervolgens iedere dag CPE aflezen

-

Na 4 dagen of CPE 

Eerste subpassage maken -

Cellen splitsen en ¼ uitverdelen

-

Vb. Celpellet oplossen in 4 ml => 1 ml planten/well



Supernatans verzamelen voor hemagglutinatie



Cellen op inserts fixeren met methanol bij -20°C voor immunofluorescentie

-

Subpassage incuberen bij 37°C en 5% CO2

-

Iedere dag CPE aflezen

-

Na 4 dagen of CPE: 

Tweede subpassage maken



Supernatans verzamelen voor HA



Cellen op inserts fixeren voor immunofluorescentie

-

Iedere dag CPE aflezen

-

Na 4 dagen of CPE 

Supernatans verzamelen voor HA



Cellen op inserts fixeren voor immunofluorescentie

50

BIJLAGE II PROTOCOL HEMAGGLUTINATIE -

-

Varkens RBC 

Varkens RBC 3 keer wassen met witte PBS (pH=7,3)



10% suspensie maken van RBC in witte PBS (pH=6,8)



0,5% suspensie maken van rode PBS is witte PBS (PBS=6,8) o

1 ml van 10% varkens RBC stock

o

10 ml witte PBS (pH=6,8)

o

0,1 ml foetaal kalf serum

Uitvoeren test 

In V-plaat



0,05 ml virussuspensie (supernatans van cellen) (in eerste well)



0,05 ml witte PBS ph=5,9 (in well 1 tot 4) o

Uitverdunnen 1 =>4



0,05 ml varkensRBC (0,05%)



Schudden



Laten uitzakken bij 4°C gedurende enkele uren/overnacht o

Als bodem bedekt is: positief

o

Als RBC uitgezakt in punt: negatief

51

BIJLAGE III PROTOCOL IMMUNOFLUORESCENTIE -

Bij iedere passage cellen op insert planten

-

Cellen na 4 dagen 3 maal wassen met rode PBS

-

Cellen fixeren met methanol (500 µl, -20°C, 20 minuten)

-

Bewaren bij -20°C tot uitvoeren kleuring

-

Afnemen methanol + drogen tot volledig verdampt

-

Primaire antistoffen toevoegen

-

1 uur incuberen bij 37°C

-

Wassen 3 maal 5 minuten

-

Secundaire antistoffen toevoegen

-

1 uur incuberen 37°C

-

Wassen 3 maal 5 minuten

-

Hoechst (1/100) 

100 µl Hoechst



9900 µl rode PBS

-

10 minuten op kamertemperatuur laten staan

-

Wassen 3 maal 5 minuten

-

1 maal wassen met up

-

Monteren op een draagglaasje met glycerol DABCO

52