Infectieuze oorzaken van neonatale sterfte bij pups:

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2010 - 2011

Infectieuze oorzaken van neonatale sterfte bij pups: een literatuurstudie en case bespreking

door

Valérie MONSTREY

Promotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Case report in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Voorwoord Graag zou ik enkele mensen willen bedanken die mij hebben gelopen bij het tot stand komen van deze masterproef. Vooreerst wil ik mijn promotor professor Ann Van Soom bedanken voor haar begeleiding en verbeteringen. Daarnaast ben ik dierenarts Ina Frix ook dankbaar dat ik met mijn vragen omtrent de case bespreking bij haar terecht kon. Als dierenarts van de kennel waarover mijn case gaat, kon ze mij helpen de anamnese aan te vullen. Ten slotte wil ik ook nog mijn familie bedanken omdat zij onrechtstreeks hulp hebben geboden door mij te steunen.

Inhoudsopgave Samenvatting I.

Inleiding

II. Literatuurstudie 1. Virale oorzaken 1.1 Caniene Herpes virus 1.2 Caniene Minute virus of Caniene Parvovirus type 1 1.3 Caniene Parvovirus type 2 1.4 Caniene Distemper virus of Hondenziekte 2. Bacteriële oorzaken 2.1 Escherichia Coli 2.2 Streptococcus canis 2.3 Staphylococcus intermedius 2.4 Campylobacter spp. 2.5 Brucella canis 3. Parasitaire oorzaken 3.1 Toxocara canis 3.2 Giardia duodenalis 3.3 Coccidiose 3.3.1

Cystoïsospora

3.3.2

Toxoplasmose

3.3.3

Neosporose

III. Case bespreking en discussie IV. Literatuurlijst

Samenvatting Deze masterproef beschrijft de pathogenese, diagnostiek en behandeling van de verschillende infectieuze oorzaken van neonatale sterfte bij pups. Hierbij wordt een onderverdeling gemaakt tussen virale, bacteriële en parasitaire oorzaken. Tevens wordt een case besproken over puppysterfte bij een kennel van Deense doggen. Tijdens de neonatale periode zijn de pups nog zeer vatbaar zijn voor infecties. Vooral gedurende de eerste levensweek kan neonatale sterfte optreden ten gevolge van infectieuze aandoeningen. De pups kunnen zowel in de uterus, tijdens de passage doorheen het geboortekanaal als post- partum geïnfecteerd worden. Tijdens deze periode kan een goede opvolging en tijdige interventie de morbiditeit en mortaliteit bij pups doen afnemen. De eerste belangrijke preventieve maatregel is het behoud van strikte hygiëne. Dit betreft onder andere het apart huisvesten van een drachtige teef gedurende de laatste weken dracht en het apart huisvesten van de puppies tot ze hun laatste vaccinatie hebben gekregen. Tegen bepaalde infectieuze aandoeningen (onder andere het Caniene Parvovirus en Caniene Distemper virus) moet er gevaccineerd worden. Ook is het van belang de pups vanaf een leeftijd van drie weken te ontwormen omdat parasitaire infestaties de intestinale barrière kunnen aantasten. Wat betreft de diagnostiek is het nuttig de gestorven pups zo snel mogelijk (gekoeld) op te sturen naar laboratoria voor autopsie en kiem- isolatie. Indien de neonati nog leven, maar ernstig ziek zijn, moeten ze volledig klinisch onderzocht worden. Hierbij is een faeces- en bloedonderzoek onontbeerlijk. Ook moet er gedacht worden aan een faeces- en bloedonderzoek bij de teef, evenals het nemen van een vaginale swab. Indien in een kennel opeenvolgende problemen optreden bij drachtige teven, moet de dekreu tevens getest worden.

I. Inleiding De neonatale periode omvat de eerste twee tot drie weken na de geboorte. Neonatale sterfte vindt voornamelijk plaats gedurende de eerste levensweek (Carmichael, 2004). Hiervan sterft wellicht 20% ten gevolge van een infectie (McCandlish, 1999). Tijdens deze periode zijn pups nog niet in staat hun eigen thermoregulatie te regelen, waardoor hun immuniteit ook onderdrukt zal worden. Een onderdrukt immuunsysteem maakt de pups gedurende hun eerste levensweken nog zeer vatbaar voor infectieuze aandoeningen (Davidson, 2003). Neonatale sterfte kan zowel veroorzaakt worden door nietinfectieuze (afwijkingen aan teef of foet, hormonale stoornissen, omgevingsomstandigheden, …) als door infectieuze oorzaken. De infectieuze oorzaken van neonatale sterfte kunnen onderverdeeld worden in virale, bacteriële en parasitaire pathogenen. Hierbij zijn Herpesvirose en Parvovirose de belangrijkste virale aandoeningen. Bacterieel zijn vooral Escherichia Coli, Streptococcus canis en Staphylococcus intermedius van belang. Toxocara canis, Giardia duodenalis en coccidiose zijn parasieten die bij neonati sterfte kunnen veroorzaken. Indien de dracht echter voortijdig wordt afgebroken, spreekt men, afhankelijk van het stadium waarop dit is opgetreden, van (Johnston et al., 2001): -

embryonale sterfte en resorptie (tem dag 30 na ovulatie)

-

abortus van een levende of dode foetus (tussen dag 35-63 na ovulatie)

-

doodgeboren pups (tussen dag 58-63; in tegenstelling tot abortus, zijn de pups hier reeds volgroeid)

-

foetale dood, mummuficatie en retentie van de pup (tot na het normale tijdstip van de partus)

Door de teef goed op te volgen in de perinatale periode (laatste twee weken van de dracht tot en met het spenen), kan het mortaliteitspercentage in de neonatale periode afnemen. Echter, op deze manier kunnen bepaalde factoren geëlimineerd worden die bijdragen tot neonatale sterfte of ziekte. Niet alleen parasitisme en infectieuze aandoeningen, maar ook dystocie, slechte conditie van de teef prepartus, congenitale misvormingen, genetische defecten, slechte omgevingsomstandigheden en slechte voeding zijn een aantal voorbeelden die kunnen gepaard gaan met nefaste gevolgen. Het is aldus van belang dat de teef gedurende de laatste weken dracht in een omgeving (met werpkist) moet gehuisvest worden waarbij de blootstelling aan pathogenen beperkt wordt. Zodra de pups geboren zijn, moeten ze zo snel mogelijk voldoende colostrum opnemen om hun passieve immuniteit op te bouwen, want slechts 5-10% van de antistoffen wordt via de placenta doorgegeven. Intestinale absorptie van IgG vindt plaats de eerste 24u tot 72u na de partus (Davidson, 2003). Indien de pups onvoldoende colostrum opnemen, wegens agalactie of een onvoldoende zuigreflex, moeten de pups serum (bij voorkeur van hun eigen moeder) toegediend krijgen. Wanneer zwakke pups onvoldoende energie hebben om te zuigen, kan een 5% glucose injectie hypoglycemie voorkomen (Indrebo et al., 2007). De navel moet ook direct na de geboorte voldoende ontsmet worden met jood omdat deze een ingangsweg kan vormen voor bacteriën (Davidson, 2003). Tijdens de eerste levensweek is het belangrijk om het gewicht van de puppies dagelijks op te volgen. Zo kan gecontroleerd worden of de puppies effectief in gewicht toenemen (Indrebo et al., 2007). Vanaf een leeftijd van 3 weken moeten pups ontwormd worden. Dit kan aangevuld worden met een faeces

2

onderzoek om de efficaciteit van de toegediende anthelmintica na te gaan. Vanaf een leeftijd van 6 weken moeten de pups regelmatig bij een dierenarts langsgaan voor hun vaccinaties en een volledig klinisch onderzoek. De pups kunnen gevaccineerd worden tegen het Caniene Parvovirus, Caniene Distemper virus, kennelhoest, infectieuze caniene hepatitis en rabiës. Boostervaccinaties zijn nodig op 9 en 12 weken (Hoskins, 1999). Doordat de algemene toestand van geïnfecteerde neonati ( wegens immunosuppressie) snel achteruit gaat en sterfte vaak optreedt zodra klinische symptomen worden waargenomen, spreekt men ook van het “fading puppy syndrome” (Johnston et al., 2001). De klinische symptomen van vele neonatale aandoeningen zijn vaak zeer gelijkaardig en vaag: rusteloosheid, janken, hypothermie, diarree en ademhalingsproblemen. Wanneer geen specifieke diagnose kan gesteld worden, wordt de term “fading puppy syndrome” vaak aangewend (Indrebo et al., 2007).

3

II. Literatuurstudie 1. Virale oorzaken 1.1 Caniene Herpesvirus (CHV-1) Abortus of neonatale stefte kan optreden wanneer een teef tijdens de laatste drie weken van haar dracht blootgesteld wordt aan het Caniene Herpesvirus (Poulet et al., 2001). Het verloop van een CHV-1 infectie hangt af van drie belangrijke factoren: leeftijd, lichaamstemperatuur en immuunstatus (Poulet en Dubourget, 1993). Het virus zou verder ook een rol spelen bij vruchtbaarheidsproblemen. Een infectie verloopt bij de teef zelf meestal asymptomatisch. Een milde rinofaryngitis of lesies ter hoogte van de genitaliën kunnen voorkomen. Bij een goede immuunrespons kan dergelijke infectie overwonnen worden of blijft het virus latent aanwezig (Van Gucht et al., 2001). In deze laatste situatie kan het virus gereactiveerd worden in een periode met verlaagde immuunrespons (stresstoestanden, immunosuppressieve therapie) (Poulet en Dubourget, 1993). Echter, volgens Carmichael en (1990a) zouden problemen met CHV-1 slechts éénmaal voorkomen omdat de teef zichzelf zal beschermen door een opgebouwde immuniteit. Transmissie naar de pups kan plaatsvinden via contact met vaginale secreties tijdens de partus of via contact met oronasale secreties afkomstig van de teef of andere geïnfecteerde pups (Van Gucht et al., 2001; Poulet et al., 2001). Aangetaste pups sterven meestal binnen de twee tot drie weken na de geboorte. Plotse sterfte kan voorafgegaan worden door volgende symptomen: anorexie, sufheid, continu schreeuwen, abdominale pijn, grijsgele tot groene faeces die waterig kan worden, subcutaan oedeem, erytheem van de liesstreek, dyspnee, tenslotte ook fietsbewegingen en opisthotonus (Cornwell en Wright, 1969). Meestal treedt sterfte op binnen de 24 tot 48 uur na het begin van deze klinische symptomen. Wanneer pups ouder dan 3 of 4 weken blootgesteld worden aan het virus, vertonen ze milde symptomen tot een asymptomatische infectie. Zij vormen een reservoir voor de nog niet aangetaste pups en moeten dus hiervan gescheiden worden. Bij de pups die een gegeneraliseerde infectie overleven, kunnen later centrale zenuwstoornissen optreden zoals blindheid of doofheid (Davidson, 2003). Pups zijn niet in staat hun thermoregulatie te regelen tot ze vier weken oud zijn. Het is bijgevolg belangrijk dat de pups in een verwarmde ruimte zitten met een gemiddelde temperatuur van 27-32°C. De gebrekkige thermoregulatie bij neonati uit zich door een lage en onstabiele lichaamstemperatuur, alsook het onvermogen tot koortsreactie. Deze gevoeligheid voor hypothermie zal de immuniteit negatief beïnvloeden. Een onderdrukte immuniteit bij een lichaamstemperatuur lager dan 37,5°C en het feit dat het CHV-1 optimaal vermeerdert bij een temperatuur van 35-36 °C, verklaart de verhoogde gevoeligheid van neonati voor een gegeneraliseerde infectie (Carmichael, 1970; Van Gucht et al., 2001; Davidson, 2003). Indien een CHV- 1 infectie wordt vermoed, kan een definitieve diagnose uitsluitend gesteld worden via virus- isolatie uit de gestorven pups. Hiertoe dienen longen, milt en nieren van pasgestorven pups gekoeld opgestuurd te worden naar een virologisch laboratorium. Virale antigenen kunnen vervolgens opgespoord worden via polymerase chain reaction (PCR) of immunofluorescentie. Autopsie van de gestorven pups kan echter ook een waarschijnlijkheidsdiagnose opleveren. Op autopsie zijn

4

multifocale subcapsulaire petechiën ter hoogte van die nieren pathognomisch voor een CHV-1 infectie (Van Gught et al., 2001; Davidson, 2003). (zie figuur 1)

Figuur 1. Nier van een pup geïnoculeerd met CHV. De hemorrhagisches zones bestaan uit necrotische foci met erythrocyten (Carmichael en Greene , 1990).

Als preventieve therapie kan men een hyperimmuun serum toedienen aan pups en is het belangrijk een voldoende hoge omgevingstemperatuur te voorzien. Ook kunnen de teven gevaccineerd worden 10 dagen na de dekking. Via het colostrum zullen de pups passieve immuniteit kunnen opbouwen aan de hand van neutraliserende antistoffen. Via de placenta verkrijgen de pups slechts 5 tot 10% van hun antistoffen. Aangezien de titer van deze antistoffen in het colostrum snel daalt, is een booster vaccinatie noodzakelijk 10 dagen voor de partus om een optimale bescherming te bekomen (Carmichael en Greene, 1990; Poulet et al., 2001; Van Gucht et al., 2001). Maternale antistoffen beschermen pups echter niet tegen infectie, maar enkel tegen ziekte (Van Gucht et al., 2001). Preventie houdt ook in dat de drachtige teef de laatste 3 weken van haar dracht en de eerste 3 weken post partum (samen met haar pups) geïsoleerd wordt. Behandeling van aangetaste pups bestaat uit een ondersteunende therapie, maar geeft weinig resultaten omdat de ziekte zeer snel evolueert (Carmichael en Greene, 1990).

1.2 Caniene Minute virus (CMV) of Caniene Parvovirus type 1 (CPV-1) Er kunnen twee types parvovirussen onderscheiden worden die infectieus zijn voor de hond: het Caniene Parvovirus- 1 (of minute virus) en het Caniene Parvovirus- 2. Beide types zijn antigenetisch verschillend en het CPV-1 is ook minder pathogeen. Zijn pathogeniciteit voor honden was vroeger echter nog onzeker. Het virus kan namelijk teruggevonden worden in de faeces van zowel gezonde honden als diegenen die last hebben van milde diarree. Tot heden zijn er ook nog maar een beperkt aantal cases van CPV-1 gerapporteerd (Harrison et al., 1992; Carmichael et al.,1994; Carmichael, 2004). In 1988 is een experimenteel onderzoek uitgevoerd waarbij honden een subklinische infectie

5

vertoonden. Desondanks waren er wel bewijzen dat het virus zich vermenigvuldigde in de darmen en lymfoïde organen en hiermee schade teweeg bracht aan de weefsels. Uit verder onderzoek in 1991 is gebleken dat bij drachtige teven het CPV-1 doorheen de placenta kan migreren en pathogeen is voor foetussen en neonati (Macartney et al., 1988; Carmichael et al., 1991). Vooral wanneer een teef geïnfecteerd wordt tussen dag 20 en dag 35 van haar dracht, resulteert dit in foetale resorptie of in neonatale sterfte (vanaf 1 tot 3 weken post partum). Pups kunnen zowel transplacentair of langs oronasale weg geïnfecteerd geraken. Geïnfecteerde pups kunnen acuut sterven, voorafgegaan door hevige diarree en/of respiratoire problemen. De pathogeniciteit van CPV-1 kan echter sterk variëren tussen verschillende individuen. Indien de pups het toch overleven, dan vertonen ze nog enkele dagen vage klachten zoals anorexie, verminderde eetlust, diarree of milde respiratoire problemen (Carmichael et al., 1991). De diagnose kan gesteld worden op een aantal manieren. In laboratoria kan aan de hand van specifieke antistoffen en een welbepaalde cellijn WRCC (Walter Reed Canin Cell line 3873D) het virus geïsoleerd worden uit faeces. Vervolgens kan het virus geïdentificeerd via immunofluorescentie (Carmichael, 2004). Autopsie of histopathologisch onderzoek zijn ook mogelijke diagnostische technieken. Macroscopisch zijn mogelijke letsels: enteritis met depletie van de Peyerse platen, pneumonie en myocarditis. Histopathologisch kunnen intranucleaire inclusies opgemerkt worden in de epitheliale cellen van de villi van de dunne darm of in de bronchiale epitheelcellen. Tevens is er, beperkt tot het duodenum en het jejunum, hyperplasie en single-cell necrose van de epitheliale cellen van de crypten aanwezig (Harrison et al., 1992; Carmichael et al., 1994; Järplid, 1996).

1.3 Caniene Parvovirus type 2 (CPV-2) Het CPV-2 werd voor het eerst ontdekt eind jaren ’70. Sindsdien heeft het virus zich meermaals gemuteerd en bestaan er enkele subtypes: CPV-2a en CPV-2b. Het CPV-2 is een belangrijke oorzaak van ziekte of sterfte bij pups jonger dan zes maanden (McCaw en Hoskins, 2006). Volwassen honden bouwen voldoende immuniteit op via vaccinaties of na een natuurlijke infectie waardoor CPV-2 infecties bij hen veelal subklinisch verlopen. Maternale antistoffen worden via het colostrum doorgegeven aan de pups. Op deze manier bouwen de pups een passieve immuniteit. Hoge titers van deze antistoffen interfereren met de opbouw van actieve immuniteit tot een zeker leeftijd. Maternale antistoffen hebben een halfwaardetijd van zo’n 10 dagen waardoor hun titer zal afnemen naarmate de pups ouder worden. Hierbij is er ook sprake van een periode waarbij de titer voldoende hoog is om te interfereren met de immuunrespons op vaccins, maar te laag is om een CPV-2 infectie te voorkomen (Pollock en Carmichael, 1982; Smith-Carr et al., 1997). Predisponerende factoren voor een parvovirus-infectie bij pups zijn: een verminderde immuniteit, gastro-intestinale parasieten (zij tasten de intestinale barrière aan), een stressvolle omgeving, onhygiënische omstandigheden en een hoge bezettingsdichtheid. Bovendien zijn Rottweilers, Dobberman pinschers en Labarador Retrievers meer gepredisponeerd voor het ontwikkelen van een

6

CPV-2 enteritis (Smith-Carr et al., 1997). Een CPV-2 infectie is echter zelden de oorzaak van neonatale sterfte (Davidson, 2003). Een klinische CPV-2 infectie kan zich in pups manifesteren onder twee vormen: (1) acute stefte ten gevolge van myocarditis bij pups van drie tot acht weken oud, en (2) braken met erge (voornamelijk hemorrhagische) diaree, koorts en leukopenie in pups vanaf acht weken oud. Het parvovirus heeft delende cellen nodig om zich te kunnen vermenigvuldigen. Daarom zal het virus in pups jonger dan acht weken zich voornamelijk ter hoogte van het myocard manifesteren. In pups ouder dan acht weken zal het virus zich vermenigvuldigen in lymfoïde weefsels, hematopoiëtische weefsels en intestinale epitheelcellen van de crypten, met leukopenie en enteritis tot gevolg (Lenghaus et al., 1982; Johnston et al., 2001). Honden geraken geïnfecteerd via directe weg (fecaal-oraal) of via indirecte weg (vectoren: mens, insecten, rodentia, chirurgische instrumenten) (Hoskins, 1997; SmithCarr et al., 1997). Het parvovirus is zeer resistent aan omgevingsomstandigheden. Drie tot tien dagen na de infectie zullen symptomen zich ontwikkelen. In hun faeces zullen dan via PCR ook hoge DNA-titers van het CPV-2 teruggevonden worden. Deze titers dalen echter reeds tien tot elf dagen na de infectie (Smith-Carr et al., 1997; Decaro et al., 2007). Uit een studie van Decaro N. et al. (2007) bleek dat er in de faeces van geïnfecteerde honden hogere CVP-2 DNA-titers zitten dan in de lymfoïde organen. De diagnose kan ook gesteld worden via autopsie of serologisch onderzoek. Een CPV-2 infectie triggert zowel een lokale als een systemische immuunrespons. Echter, enkel de systemische respons geeft bescherming omdat deze de virale migratie doorheen de darmwand verhindert (Smith-Carr et al., 1997). Bij pups die een infectie overleven, zal de opgebouwde immuniteit hen minimaal twee jaar beschermen (Hoskins, 1997). De teef en haar pups kunnen preventief gevaccineerd worden. Eenzelfde vaccin kan het dier beschermen tegen de verschillende subtypes (CPV-2,CPV-2a,CPV-2b). Bij het opstellen van een vaccinatieprotocol voor pups moet rekening gehouden worden met interferentie met de maternale antistoffen. Er wordt aangeraden dat zij gevaccineerd worden (meestal met een gecombineerd vaccin) elke twee tot drie weken vanaf een leeftijd van 6 à 8 weken tot een leeftijd van 16 à 18 weken. Nadien volgt een jaarlijkse booster vaccinatie, hoewel er nog enige controversie bestaat over de efficiëntie hiervan. Voor gepredisponeerde rassen wordt aangeraden om de pups te vaccineren tot ze 20 weken oud zijn. Voor deze rassen raadt men verder ook aan om tweemaal per jaar te hervaccineren of twee tot drie weken alvorens blootstelling aan een hoge infectiedruk (hondenshows, kennels,… ). Normaal zal vier tot vijf dagen na de vaccinatie een immuunrespons optreden. Het is moeilijk te voorspellen op welke leeftijd de passieve immuniteit niet meer interfereert met de vaccinatie. Hiervoor moeten antistoffen titers bepaald worden alvorens te vaccineren (Pollock en Carmichael, 1982; Smith-Carr et al., 1997).

1.4 Caniene Distemper virus (CDV) of Hondenziekte Het CDV komt wereldwijd voor bij veel gastheren van alle leeftijden. Pups zullen voornamelijk geïnfecteerd geraken wanneer ze hun maternale immuniteit verliezen. Afhankelijk van het stadium van de dracht, zal een CDV infectie aanleiding geven tot abortus, doodgeboorte of geboorte van zwakke 7

pups. Pups die transplacentaire infectie overleven, zullen neurologische verschijnselen vertonen gedurende de eerste 4 tot 6 weken na de geboorte (Greene et al., 1990; Appel, 1999). Het CDV is echter zelden de oorzaak van een transplacentaire infectie (Sherding, 1994). Het virus kan geïsoleerd worden uit alle lichaamssecreties en zal bijgevolg ook horizontaal kunnen worden overgedragen (Greene en Appel, 1990; Sherding, 1994). Horizontale transmissie vindt voornamelijk plaats via inhalatie waarna het virus zich repliceert in de macrofagen van het respiratoir stelstel. Eerst verspreidt het virus zich via deze macrofagen naar de lymfeknopen en zal nadien alle lymfoïde organen aantasten. Tijdens deze viremie, 2 tot 6 dagen na de infectie, zal de lichaamstemperatuur beginnen stijgen en ontstaat leukopenie (Greene en Appel, 1990; Appel, 1999). Deze leukopenie is het gevolg van een virale destructie van de T- en B- lymfocyten (Krakowka et al., 1980; Appel, 1999). Vanaf dag acht of negen van de infectie zullen de geïnfecteerde macrofagen en lymfocyten het virus verder vervoeren richting de epitheelcellen van het gastro-intestinaal kanaal, het respiratoir stelsel, het urinair stelsel en het centrale zenuwstelsel. Of deze viremie optreedt, zal echter afhangen van de humorale en celgemedieerde immuniteit van de hond. Indien de hond beschikt over adequate antistoffen titers, kan het immuunsysteem na 2 tot 3 weken de infectie overwonnen hebben. In andere gevallen zal er (sub)acute ziekte ontstaan zijn (Greene en Appel, 1990; Appel, 1999). De symptomen die hierop volgen, kunnen sterk variëren en zijn in 50% tot 70% van de gevallen subklinisch tot mild. Wanneer het immuunsysteem de infectie heeft overwonnen, zal het virus zich toch nog kunnen persisteren ter hoogte van het centrale zenuwstelsel, de ogen en de zoolkussens. Dit geeft later aanleiding tot centrale zenuwstoornissen en digitale hyperkeratose (harde zoolkussen) (Greene en Appel., 1990; Appel, 1999). (zie figuur 2)

Figuur 2. Digitale hyperkeratose (“hard pads”) (McCandlish, 1999).

Het optreden van klinische symptomen zal afhangen van de virulentie van het virus, de omgevingsomstandigheden, de leeftijd van de gastheer en zijn immuunstatus (Greene en Appel, 1990). Milde symptomen omvatten lusteloosheid, verminderde eetlust, koorts en sereuze oog- en neusvloei die progressief kan verergeren tot hoesten en dyspnee. Een systemische distemper infectie kan optreden in (1) honden met een inadequate immuunrespons, (2) pups die niet meer over hun maternale immuniteit beschikken en nog niet gevaccineerd zijn en (3) pups die onvoldoende

8

maternale antistoffen ontvangen hebben van de moeder. Hierbij zal er eerst een sereuze tot mucopurulente conjunctivitis optreden die overgaat in een droge hoest en vervolgens productief wordt. Verder ziet men ook depressie, anorexie, braken en diarree die kan leiden tot dehydratatie (Greene en Appel, 1990). Het optreden van neurale symptomen zal afhangen van welk deel van de hersenen aangetast wordt. Bij acute fatale infecties zal meestal de grijze massa van het centrale zenuwstelsel aangetast zijn met neuronale destructie tot gevolg. Dit veroorzaakt aanvallen, myoclonieën, hyperesthesie en depressie. Het is ook mogelijk dat deze dieren binnen de drie weken terug hersteld zijn. Wanneer de ziekte eerder trager op gang komt, zal de witte massa van het centraal zenuwstelsel aangetast zijn met demyelinisatie tot gevolg. Dit veroorzaakt ataxie, parese, paralyse en spiertremoren. Hierbij kan er na 2 - 3 maand enerzijds sterfte of anderzijds volledig herstel optreden (Appel, 1999). Wanneer pups geïnfecteerd worden met CDV alvorens hun permanente tanden erupteren, kan dit het email beschadigen. Hypoplasie van het tandglazuur kan als een pathognomisch kenmerk beschouwd worden voor een CDV-infectie (Greene en Appel, 1990). Higgins et al. hebben in 1981 beschreven dat een experimentele infectie bij neonati cardio-mypothie veroorzaakte. Curatieve therapie omvat een vloeistoftherapie, het herstellen van de electrolyten-balans en een antibioticatherapie tegen secundaire bacteriële infecties (Appel, 1999). Preventieve vaccinatie wordt bij pups uitgevoerd vanaf een leeftijd van 6 tot 8 weken om interferentie met maternale antistoffen te vermijden. Bijkomend moeten er nog twee boostervaccinaties gegeven worden met een interval van 3 tot 4 weken. Jaarlijkse boostervaccinaties worden aangeraden (Greene en Appel, 1990; Appel, 1999).

2. Bacteriële oorzaken Septicemie of een lokale bacteriële infectie, zoals enteritis of pneumonie, is de meest voorkomende oorzaak van neonatale stefte (McCandlish, 1999). Neonatale septicemie kan een snelle dood tot gevolg hebben die al dan niet is voorafgegaan door symptomen. Er kan hier ook gesproken worden van

het

“fading

puppy

syndrome”.

Pups

kunnen

onder

verschillende

omstandigheden

gepredisponeerd zijn voor septicemie, zoals: endometritis of metritis in de teef, dystocie, een gecontamineerde omgeving, stress, onvoldoende opname van colostrum, een laag geboortegewicht en hypothermie (Johnston, 2001; Davidson, 2003). Transmissie kan zowel oronasaal, via de navel of via huidwondjes plaatsvinden (McCandlish, 1999; Davidson, 2003). Sommige bacteriën zijn voor adulten niet pathogeen en maken deel uit van hun intestinale of vaginale flora, maar zullen bij neonati wel gepaard gaan met ziekte of sterfte. De teef vormt aldus een belangrijke bron van besmetting. De belangrijkste bacteriële infecties worden teweeggebracht door Escherichia Coli, Streptococcus canis en Staphylococcus intermedius (McCandlish, 1999). De symptomen die bij dergelijke geïnfecteerde pups voorkomen, kunnen sterk variëren. Gewichtsverlies kan waargenomen worden in een vroeg stadium van de ziekte. Later zal de pup ook niet meer in staat zijn om te zuigen aan de tepels van de moeder en vertonen ze cyanose, hematurie, diarree en huilen ze frequent. Tegen het einde toe kunnen ook centrale zenuwstoornissen optreden (McCandlisch, 1999; Johnston, 2001). Zodra een septicemie wordt vermoed, moet onmiddellijk ingegrepen worden. Een antibiotica- therapie moet

9

worden opgestart alvorens het etiologisch agens gediagnosticeerd is. Hierbij gebruikt men breedspectrum antibiotica die veilig zijn voor de pups, zoals cephalosporines. Zodra het etiologisch agens gekend is, kan overgeschakeld worden naar een antibiotica met een beperkt spectrum. Verder is het belangrijk om te rehydrateren met voldoende vloeistof, zuurstof te voorzien om hypoxemie te vermijden, de lichaamstemperatuur op peil te houden, glucose toe te dienen indien het dier hypoglycemisch is en plasma of serum toe te dienen om de immuniteit te versterken. Indien de pup niet of onvoldoende wilt eten, is het noodzakelijk om een voedingssonde aan te brengen (McCandlish, 1999; Johnston, 2001; Davidson, 2003).

2.1 Escherichia Coli (E. Coli) Neonati zullen voornamelijk geïnfecteerd geraken gedurende hun eerste levensweek. Pas na twee weken is er sprake van een volledige resistentie tegenover blootstelling aan de E. Coli bacterie. Pasgeboren pups zijn voornamelijk gevoelig aan een E. Coli septicemie vanwege de intestinale permeabiliteit die de eerste 24u tot 72u aanhoudt. Deze permeabiliteit maakt het in eerste instantie mogelijk om proteïnes te absorberen na opname van colostrum. De bacterie slaagt er echter ook in om mee geabsorbeerd te worden tot 47u tot 72u na de geboorte. Indien de pups worden blootgesteld aan E. Coli alvorens ze voldoende colostrum hebben opgenomen, stijgt de predispositie voor een septicemie. Geïnfecteerde pups vertonen een acute depressie, zwakte, hypothermie, cyanose en centrale zenuwstoornissen voorafgaand aan sterfte. Wanneer pups pas na een aantal weken geïnfecteerd geraken, vertonen ze een persisterende diarree met daarmee gepaard gaande gewichtsverlies en dehydratatie. De diagnose van een septicemie kan gesteld worden aan de hand van bacteriële culturen (van het bloed of bij gestorven pups van organen) of histologisch onderzoek (Greene, 1990).

2.2 Streptococcus canis Streptococci kunnen onderverdeeld worden in verschillende species. Afhankelijk van de species zal ook hun gastheer en hun pathogeniciteit verschillen. Streptococcus canis is een beta- hemolytische streptococcus en zal ook deel uitmaken van de microbiële flora van onder andere de mondholte, de huid, het genitaal stelsel en het gastro- intestinaal stelsel. De teef vormt dus een belangrijke bron van infectie (Greene, 1999). Neonatale pups worden geïnfecteerd met Streptococcus canis per os of via inhalatie (tijdens de partus) of via de navel. Vervolgens treedt een septicemie op met acute sterfte tot gevolg of lokaliseert de bacterie zich in bepaalde organen waarbij ook poly- artritis kan gezien worden (Pasmans, 2008). Predisponerende factoren zijn stress, hypothermie, onvoldoende desinfectie van de navel en onvoldoende colostrum opname (Greene, 1999). De diagnose kan gesteld worden na kiemisolatie uit aangetaste organen. Aangezien de kiem altijd teruggevonden kan worden in het gastrointestinaal stelsel zal mestonderzoek niets opleveren. Wanneer op gestorven pups de diagnose van een S. canis- septicemie is vastgesteld, worden de overige pups van het nest best behandeld met

10

penicilline of ampicilline. Het is aangewezen de teef bij een volgende dracht rond de partus tevens met penicililine of ampicilline te behandelen (Pasmans, 2008).

2.3 Staphylococcus intermedius Staphylococci worden voornamelijk geassocieerd met de epidermis en muceuze membranen. Zij coloniseren het intacte epitheel zonder verdere schade of ziekte te veroorzaken. Deze bacteriën zijn echter wel opportunistische pathogenen. Wanneer bij subklinische dragers het epitheel beschadigd is (door bijvoorbeeld trauma of een andere infectie) dan kunnen Staphylococci

hier invaderen.

Staphylococcus intermedius is één van de meest pathogene species en zal dan ook de meest voorkomende oorzaak zijn van pyodermie of otitis externa. Staphylococcus intermedius heeft als voorkeursplaatsen het preputium, de vagina, de mondholte, de pharynx, de vacht en de anus (Cox en Hoskins, 1990). In 2002 is een studie uitgevoerd naar de manier waarop pups gekoloniseerd worden met pathogene staphylococci. Direct na de partus zou de teef haar pups kunnen besmetten wanneer ze het amnion-vlies en de navelstreng met haar tanden doorscheurt alsook tijdens het schoon likken en zogen van haar pups (Saijoonmaa- Koulumies en Lloyd, 2002).

2.4 Campylobacter spp. Campylobacter jejuni is de campylobacter species die het meeste geassocieerd wordt met honden (alsook katten, mensen, wild) die last hebben van diarrree. Deze species wordt echter voornamelijk teruggevonden in kennels (of catteries) en minder bij privaat gehouden huisdieren. Campylobacter jejuni wordt ook voornamelijk geïsoleerd uit puppies (en kittens) en occassioneel bij adulten. Een infectie zal via oro- fecale route plaatsvinden of na het consumeren van gecontamineerd vlees of gecontamineerde melk. De ernst van de klinische symptomen hangt af van de ontwikkelde immuniteit en de besmettingsgraad. Ten gevolge van de onvoldoende ontwikkelde immuniteit bij puppies zal, in tegenstelling tot adulten, een infectie gepaard gaan met ziekte. Deze ziekte uit zich in een muceuze, waterige diarree (eventueel met gal vermengd) die 5 tot 15 dagen aanhoudt, braken, partiële anorexie en koorts. Het is ook belangrijk te weten dat dergelijke pups een besmettingsbron kunnen vormen voor de mens (Fox, 1990).

2.5 Brucella canis Honden geraken geïnfecteerd met Brucella canis nadat deze doorheen de mucosae is gepenetreerd. Urine, sperma, vaginale uitvloei of geaborteerd materiaal zijn de voornaamste besmettingsbronnen. Brucella canis organismes zullen zich eerst manifesteren ter hoogte van de lymfeknopen en via de bloedbaan verder verspreiden naar bepaalde doelwitorganen, waaronder de milt en het geslachtsstelsel. Wanneer drachtige teven geïnfecteerd geraken, zullen zij hun pups in utero infecteren (Carmichael en Greene, 1990b; Hollett, 2006). Het colostrum van geïnfecteerde drachtige 11

teven bevat lage concentraties van de organismes en er is nog enige discussie of transmissie via deze weg van belang is (Carmichael en Greene, 1990b; Hollett, 2006). De klinische symptomen kunnen variëren van zeer mild tot het optreden van een systemische infectie. Meestal treden er slechts vage symptomen op, zoals een slechte vacht, verminderde levenslust, gewichtsverlies en lymfadenopathie. Er kunnen ook klachten optreden die betrekking hebben op het genitaal stelsel. Wanneer drachtige teven tussen dag 45 en dag 59 van de dracht geïnfecteerd worden, zullen zij meestal aborteren. Volgend op deze abortus is er een bruin-grijze vaginale uitvloei die 1 tot 6 weken kan aanhouden. Hoewel abortus het belangrijkste symptoom is dat geassocieerd wordt met brucellose, kan de teef ook geïnfecteerde levende of dode pups werpen. Het is mogelijk dat in één nest zowel levende als dode pups geworpen worden. Levende pups zullen meestal sterven binnen een paar uur tot enkele dagen. Zij die toch overleven of als neonati geïnfecteerd worden, vertonen een gegeneraliseerde perifere lymfadenopathie tot zij seksuele maturiteit hebben bereikt. Deze puppies vertonen vaak ook een persisterende hyperglobulinemie en eventueel voorbijgaande koorts en leukocytose. Daarnaast kan brucellose bij adulten ook gepaard gaan met infertiliteit. Bij geïnfecteerde reuen kan ook nog epididymitis en orchitis optreden waarbij het scrotum pijnlijk en vergroot is (Carmichael en Greene, 1990b; Hollett, 2006). Een definitieve diagnose kan gesteld worden aan de hand van kiemisolatie uit het bloed, de vaginale uitvloei of aangetast weefsel. Vals negatieve resultaten zijn echter wel mogelijk. Serologisch onderzoek geeft geen definitieve diagnose omdat deze vals positieve resultaten kan geven (Van Soom et al., 2002; Hollett, 2006). Deze intracellulaire bacterie is moeilijk te behandelen met antibiotica. Wellicht kan een combinatietherapie van meerdere antibiotica een gunstig effect

hebben, maar meestal treedt er

relapse op. Daarom wordt aangeraden om geïnfecteerde dieren te euthanaseren (Carmichael en Greene, 1990b). Preventief kan men verdere verspreiding voorkomen door een aantal maatregelen in acht te nemen. Het geaborteerde materiaal moet verwijderd worden (met handschoenen) en de ruimte moet goed gedesinfecteerd worden. In kennels is het ook verstandig om nieuwkomers een maand te isoleren en te testen op brucellose. Brucella canis is tevens van zoönotisch belang. Er zijn hier echter nog maar een beperkt aantal feiten over beschreven en een immunocompetente persoon zal resistent zijn. Toch is het belangrijk om hier steeds met handschoenen te werken en moet contact met de vaginale uitvloei vermeden worden, aangezien deze een hoge concentratie bacteriële kolonies bevat (Hollett, 2006).

12

3. Parasitaire oorzaken 3.1 Toxocara canis Toxocara canis is een nematode die in de dunne darm van de hond leeft en zich voedt met dunne darm- inhoud. Toxocara canis is de meest voorkomende wormsoort bij honden en is ook een belangrijke zoönose. Vooral kinderen zullen accidentieel geïnfecteerde eitjes inslikken door gecontamineerde handen of materiaal in hun mond te steken (Barr, 1997). De hoge prevalentie is voornamelijk van belang bij puppies. Deze prevalentie is te verklaren door de vele mogelijke infectiewegen, de hoge eiproductie door de vrouwelijke wormen en de hoge resistentie van de eitjes die meerdere jaren infectieus kunnen blijven in de buitenwereld (Claerebout en Vercruysse, 2005). De hond kan zich met Toxocara canis besmetten via vier mogelijke infectiewegen (zie figuur 1): (1) prenataal via de placenta, (2) via de moedermelk, (3) via orale opname van de infectieuze eitjes, (4) via opname van besmette prooidieren (paratenische gastheren). (zie figuur 3) De belangrijkste besmettingsweg is deze via de placenta. Vanaf dag 42 van de dracht kunnen somatische larven geactiveerd worden onder invloed van hormonale veranderingen. Een aantal van deze larven migreert doorheen de placenta naar de lever van de foetus. Na de geboorte migreren de larven verder naar de longen waarna ze opgehoest worden in de trachea en vervolgens ingeslikt worden. In de dunne darm zullen de larven verder ontwikkelen tot een volwassen stadium (tracheale migratie). Vanaf een leeftijd van twee weken (zolang is de prepatente periode) kunnen pups eitjes uitscheiden via de faeces en zo een bron van besmetting vormen voor hun moeder en andere pups (Burke en Robinson, 1985; Barr, 1997; Rochette, 1999a). In een besmette drachtige teef zullen een aantal van de geactiveerde larven ook richting de melkklieren migreren waardoor de pups nog 2 tot 6 weken via de melk besmet kunnen worden. Deze infectieweg heeft echter weinig belang (Claerebout en Vercruysse, 2005). De tweede belangrijkste infectieweg is deze via orale opname van infectieuze eieren. Bij jonge honden ondergaan de larven een tracheale migratie om tenslotte in de dunne darm terecht te komen en zich daar verder te ontwikkelen. Pups ontwikkelen vanaf hun eerste of tweede levensmaand echter een leeftijdsresistentie die na zes maanden volledig is. Dit houdt in dat steeds minder larven in staat zijn de longblaasjes binnen te dringen naarmate de pups ouder worden. Deze levensresistentie zou zich mogelijk ontwikkelen door het ontstaan van verworven immuniteit. Bij volwassen honden zullen de larven zich in spieren en organen gaan inkapselen en in een rustfase gaan (somatische migratie) (Rochette, 1999a; Claerebout en Vercruysse, 2005). De ernst van de klinische symptomen zal afhangen van de leeftijd van de gastheer, het aantal wormen, de lokalisatie van de wormen en hun ontwikkelingsstadium (Rochette, 1999a; Claerebout en Vercruysse, 2005). Een erge infestatie van de longen kan bij pasgeboren pups pneumonie en sterfte 48u tot 72u na de geboorte veroorzaken. Wanneer pups de eerste fase van een zware besmetting overleven, ondergaan de larven een tracheale migratie met gastro- intestinale stoornissen tot gevolg. Symptomen ontstaan meestal pas vanaf de tweede of derde levensweek. Enkele belangrijke symptomen zijn: vermagering, buikpijn, een gezwollen abdomen (wormbuikje), intermitterende diarree dikwijls afwisselend met obstipatie, braken en eventueel sterfte. Zware infecties hebben bij pups ernstige gevolgen maar komen zelden voor. Een lichte tot matige besmetting komt frequenter voor en 13

de symptomen zijn hierbij minder uitgesproken: een gezwollen abdomen, intermitterende diarree en een lichte groeivertraging. Volwassen honden vertonen meestal geen symptomen (Barr, 1997; Rochette, 1999a; Claerebout en Vercruysse, 2005). Een diagnose kan gesteld worden na het aantonen van eitjes in de faeces met behulp van een sedimentatie- flottatie methode (Claerebout en Vercruysse, 2005). De teef en haar pups vormen een grote bron van besmetting. Transmissie van de teef naar de pups of via een gecontamineerde omgeving kan beperkt worden door alle honden preventief te ontwormen en hygiënische maatregelen te treffen. Pups kunnen met fenbendazole ontwormd worden vanaf twee weken. Deze behandeling wordt elke twee weken herhaald tot ze 8 weken oud zijn. Nadien volstaat een ontworming elke twee tot drie maanden. Drachtige teven worden best ontwormd tijdens hun oestrus alvorens de dekking, 10 dagen voor en 10 dagen na de partus (Rochette, 1999a; Barr, 1997).

Figuur 3. Levenscyclus van Toxocara canis (Barr, 1997).

3.2 Giardia duodenalis Giardia spp. zijn flagellaten die wereldwijd voorkomen met een ruim spectrum aan gastheren. Giardia duodenalis (Giardia lamlia, Giardia duodenalis) komt specifiek voor bij zoogdieren waaronder ook de mens. Giardia infecties komen vooral voor bij puppies en de prevalentie is het hoogst in kennels (McLaughlin, 2008). Transmissie vindt plaats na een directe opname van cysten of indirect via met faeces besmet water of voedsel. Na vertering komen een aantal trofozoieten vrij uit de cysten onder invloed van maagzuur en pancreasenzymen. Deze kunnen zich voortbewegen aan de hand van flagellen en hechten zich vast aan het epitheel van de darmwand. Vervolgens zullen ze zich verder vermenigvuldigen door tweedeling. De delende trofozoieten gaan zich inkapselen naarmate ze verder opschuiven in de darmen. De uitgescheiden cysten zijn onmiddellijk infectieus en kunnen buiten de gastheer nog lange tijd overleven in koude, vochtige omstandigheden zoals in koud water (Koene en Houwers, 1999;

14

McLaughlin, 2008). Besmette dieren kunnen cysten intermitterend uitscheiden gedurende een 4- 5 tal weken tot zelfs 7 maanden (Claerebout en Vercruysse, 2005). De meeste infecties verlopen symptoomloos, maar jonge honden zullen vooral een klinische infectie ondergaan. Giardiosis wordt vaak geassocieerd met een intermitterende dunne darm diarree. Deze diarree is vaak zelflimiterend, maar kan ook chronisch worden met veel slijm en bloed of eventueel tenesmus. Hevige diarree kan gepaard gaan met anorexie, lethargie en dehydratatie. De diarree is te wijten aan maldigestie en malabsorptie, wellicht te verklaren door interferentie met verteringsenzymen en atrofie van de microvilli (Koene en Houwers, 1999; McLaughlin, 2008). Een combinatie van verschillende diagnostische technieken wordt aangeraden om vals negatieve resultaten te vermijden (McLaughlin, 2008): -

uitstrijkje van verse faeces: deze techniek kan trofozoieten aantonen (druppelvormig uitzicht met 8 flagellen en 2 kernen), een lugol- kleuring kan uitgevoerd worden voor een betere identificatie

-

sedimentatie- flotatie methode: deze techniek kan cysten aantonen, een lugol- kleuring kan uitgevoerd worden voor een betere identificatie

-

ELISA- test (SNAP- test): deze test toont Giardia- antigenen aan in de faeces

Negatieve resultaten sluit een Giardia- infectie niet uit. Doordat er vaak sprake is van een intermitterende uitscheiding, wordt aangeraden gedurende drie opeenvolgende dagen faeces onderzoek uit te voeren (Koene en Houwers, 1999). Een therapie met metronidazol of benzimidazolen kan aangewend worden. Echter, vaak hervallen de dieren. Ook de omgeving moet gereinigd en gedesinfecteerd worden (Koene en Houwers, 1999; Claerebout en Vercruysse, 2005).

3.3 Coccidiose Coccidiën zijn intracellulaire parasieten die in het darmkanaal worden aangetroffen. Er bestaan verschillende coccidiën die de hond kunnen infecteren: Cystoïsospora, Sarcocystis, Cryptosporidium, Neospora, Hammonda, Toxoplasma en Caryospora (Junker en Houwers, 2000). Alle coccidiën hebben een aseksuele en een seksuele cyclus. Oöcysten worden ongesporuleerd mee uitgescheiden met de faeces en deze zijn zeer resistent in de buitenwereld. Ze worden pas infectieus na sporulatie onder de juiste omstandigheden. Na blootstelling aan warmte (20- 37 °C) en vocht sporuleren de oöcysten tot twee sporocysten (Dubey en Greene, 1990). Infectie vindt plaats na opname van infectieuze gesporuleerde oöcysten uit de omgeving of na opname van besmet vlees of knaagdieren. Zij kunnen als tussengastheer functioneren na opname van sporocysten. De sporocysten gaan zich hier encysteren in extra- intestinale weefsels (Junker en Houwers, 2000). Elke sporocyst bevat vier sporozoïeten die vrijkomen na vertering in de eindgastheer onder invloed van warmte en gal. Deze sporozïeten gaan het epitheel van de dunne en/ of dikke darm invaderen en zich intracellulair aseksueel vermenigvuldigen tot multinucleaire schizonten. Dit proces wordt ook schizogonie genoemd. Uit de schizonten komen merozoïeten vrij wanneer de gastheercel barst en zij zullen opnieuw de darmepitheelcellen invaderen. Deze eerste generatie merozoïeten herhaalt de aseksuele 15

cyclus met vorming van een tweede generatie schizonten of start een seksuele cyclus na vorming van micro- (mannelijke) en macro- (vrouwelijke) gameten. Hoeveel keer de schizogonie zich herhaalt hangt af van de parasiet. Wanneer een microgameet een macrogameet bevrucht, wordt een zygote gevormd. Na vorming van een dikke celwand spreekt met van een oöcyste. Deze verlaat de gastheercel en wordt uitgescheiden met de faeces (Dubey en Greene, 1990; Junker en Houwers, 2000).

3.3.1 Cystoïsospora Meestal verloopt een infectie met coccidiën symptoomloos, maar er bestaan volgens Junker en Houwers (2000) toch al een aantal gevallen met Cystoïsospora waarbij diarree en neonatale sterfte is gediagnosticeerd. Klinische infecties zijn ook beschreven bij zieke of immunosuppressieve (stress) dieren. Zo zijn de dracht en zoogperiode een stressgevoelige periode waarin de geëncysteerde sporocysten terug richting de darm migreren en symptomen veroorzaken (Dubey en Greene, 1990).. De ernst van de symptomen zou afhangen van de infectiedruk en daarmee ook de mate van beschadiging van het darmepitheel. Naast diarree en eventueel neonatale sterfte, kan ook anorexie, koliek, braken en dehydratatie waargenomen worden (Junker en Houwers, 2000). Volwassen honden tonen zelden klinische symptomen en zijn bijgevolg subklinische dragers verantwoordelijk voor verdere verspreiding van de parasiet (Rochette, 1999b). Een diagnose kan gesteld worden na het aantonen van oöcysten in de faeces met behulp van de flotatietechniek. Bij voorkeur werkt men met een verzamelmonster omdat oöcysten intermitterend wordt uitgescheiden. Wanneer oöcysten worden aangetroffen in faeces van pups uit kennels, kan met grote zekerheid gedacht worden aan Cystoïsospora. In andere gevallen moet rekening gehouden worden met het feit dat de oöcysten ook een secundair probleem kunnen zijn (Dubey en Greene, 1990). Preventief is het belangrijk een strikte hygiëne na te streven waarbij faeces dagelijks moet verwijderd worden en de omgeving gedesinfecteerd wordt. Op deze manier kan verhinderd worden dat drink- en eetbakken gecontamineerd geraken. Tevens moet het voederen van rauw vlees en contact met tussengastheren vermeden worden (Kirkpatrick en Dubey, 1987; Dubey en Greene, 1990). Klinisch zieke pups en moederdieren kunnen behandeld worden coccidiostatica. Sulfonamiden krijgen de voorkeur, eventueel in combinatie met trimethoprim (Dubey en Greene, 1990).

3.3.2 Toxoplasmose Toxoplasma gondii is een obligate intracellulaire coccidia met de kat en andere Felidae als eindgastheer. De hond en de mens zijn één van de vele tussengastheren. In de hond treedt Toxoplasmosis slechts zelden op en is deze van weinig belang (Rochette, 1999c). Besmetting vindt bij de hond voornamelijk plaats na opname van oöcysten (sporozïeten) via voedsel of water dat gecontamineerd is met kattenfaeces of na opname van weefselcysten (bradyzoïeten) via geïnfecteerde tussengastheren. Ook transplacentaire transmissie (met tachyzoïeten) vindt plaats bij 16

teven die tijdens hun dracht besmet zijn. Katten gaan zich meestal besmetten na opname van een met weefselcysten geïnfecteerde tussengastheer (Dubey et al., 1990; Davidson, 2000). Mensen kunnen zich besmetten na opname van gecontamineerd water, groenten en fruit of rauwe vis en vlees (Dobbs et al., 2008). (zie figuur 4) Er zijn drie infectieuze stadia te onderscheiden: sporozoïeten, tachyzoïeten en bradyzoïeten. Bradyzoïeten kunnen na vertering vrijkomen uit de weefselcysten en de darmwand binnendringen. Na aseksuele en seksuele cycli zullen oöcysten uitgescheiden worden in de faeces en onder invloed van vocht en lucht gaan sporuleren. T. gondii vertoont naast deze entero- endotheliale levenscyclus, die enkel in de eindgastheer (kat) plaatsvindt, ook een extra- intestinale levenscyclus die in alle gastheren kan plaatsvinden (Dubey et al., 1990). Deze extra- intestinale cyclus zal optreden zowel na opname van weefselcysten als na opname van oöcysten. Na vertering in de dunne darm zullen sporozoïeten vrijkomen uit de oöcysten en in de darmepitheelcellen binnendringen. Daar zullen via aseksuele tweedeling tachyzoïeten gevormd worden. Deze tachyzoïeten zullen via bloedcellen of het lymfestelsel verspreid worden naar extra- intestinale organen zoals het centraal zenuwstelsel, spieren en intestinale organen. Zij zullen daar nieuwe cellen gaan infectecteren en zich intracellulair vermenigvuldigen (Dubey et al., 1990; Davidson, 2000). Wanneer een gastheercel barst, zullen ze weer nieuwe cellen gaan infecteren. Na enige tijd zullen de tachyzoïeten encysteren tot intracellulaire weefselcysten (Davidson, 2000). In deze weefselcysten zitten talrijke bradyzoïeten die structurele gelijkenissen vertonen met de tachyzoïeten (Dubey et al., 1990). Deze bradyzoïeten verkeren meestal in een ruststadium en blijven wellicht levenslang aanwezig (Davidson, 2000). Doordat in de hond, als tussengastheer, T. gondii enkel een aseksuele extra- intestinale cyclus ondergaat, zal hij zelf geen oöcysten uitscheiden. Bijgevolg vormt de hond geen bron van besmetting voor de mens (Rochette, 1999c). Er is nog maar weinig gekend over congenitale transmissie bij hond en kat. Wanneer een drachtige teef tijdens haar dracht geïnfecteerd geraakt, kan dit placentitis tot gevolg hebben, gevolgd door een verspreiding van tachyzoïeten naar de foetus (Dubey et al., 1990). De klinische symptomen variëren naargelang de lokalisatie van de parasiet en de teweeggebrachte beschadiging. Maar ook immunosuppressie, leeftijd en geslacht spelen een rol ( Dubey et al., 1990). Zo zullen klinische symptomen vrijwel uitsluitend optreden in jongen honden of honden met Caniene distemper infectie (Rochette, 1999c). De eerste klachten zijn wellicht te wijten aan necrose van de darm en de geassocieerde lymfoïde organen ten gevolge van intracellulaire vermenigvuldiging van Toxoplasma. De ziekte kan zich op verschillende manieren manifesteren. Bij jonge honden (< 1 jaar) is meestal een gegeneraliseerde infectie aanwezig met dyspnee, diarree, braken, koorts en tonsillitis. Deze vorm is meestal fataal binnen een week. Postnatale toxoplasmose zou minder ernstige gevolgen hebben dan prenatale toxoplasmose. Jonge pups kunnen ook een progressieve parese van de achterhand vertonen. Neuromusculaire of neurologische klachten komen het meest voor bij adulte honden en kunnen gelijkenissen vertonen met een Neospora caninum infectie (Dubey et al., 1990).

17

Figuur 4. Levenscyclus van Toxoplasma gondii (Dubey et al., 1990).

Een diagnose kan gesteld worden door het aantonen van T. gondii antigenen uit serologisch onderzoek of het aantonen van tachyzoïeten na bioptname. Bij deze laatste methode is een immunohistochemische kleuring nodig om het onderscheid te kunnen maken tussen Neospora en Toxoplasma (Dubey et al., 1990; Claerebout en Vercruysse, 2005; Dobbs et al., 2008). Een therapie zal enkel ingesteld worden bij erg klinisch aangetaste dieren, maar die zal niet altijd doeltreffend zijn. Spiramycine, clindamycine of een combinatie van sulfamiden en pyrimethamine zijn mogelijk therapieën (Dubey et al., 1990; Rochette, 1999c). Preventie van toxoplasmose begint bij het reduceren van feliene infecties. Katten moeten bij voorkeur commerciële voeding krijgen. Indien vlees gevoederd wordt, moet dit altijd voldoende gebakken zijn. Transmissie naar de mens kan beperkt worden door dagelijks faeces te verwijderen en de kattenbak grondig te reinigen met handschoenen. Zwangere vrouwen moet elk contact met kattenfaeces echter vermijden (Dubey et al., 1990; Dobbs et al., 2008).

3.3.3 Neosporose Neospora caninum is een intracellulaire parasiet met voornamelijk herbivore tussengastheren (maar de hond is ook mogelijk) en een carnivore eindgastheer. Tussengastheren zijn onder andere runderen en paarden (Kramer et al., 2000). Vooral honden jonger dan zes maanden zullen klinisch geïnfecteerd worden met als gevolg een progressieve paralyse en zelfs sterfte (Dubey et al., 1990; Ruehlmann et al., 1995). Deze pups zullen in de meeste gevallen congenitaal geïnfecteerd zijn (Dubey et al., 1990; Van Ham et al., 1995). Tussengastheren besmetten zich na opname van oöcysten, uitgescheiden in hondenfaeces.

De hond besmet zich door het eten van geïnfecteerde weefsels van een

tussengastheer of via een transplacentaire infectie (zie figuur 5). Een (subklinisch) geïnfecteerde teef

18

kan haar foeti gedurende meerdere worpen tachyzoïeten via de placenta op de vrucht overdragen (Kramer et al., 2000). De cyclus van Neospora caninum is niet goed gekend. Men kan twee stadia onderscheiden: tacyzoïeten en bradyzoïeten. Tachyzoïeten kunnen teruggevonden worden in verschillende lichaamscellen. Zij vernietigen de cellen door deze te gaan penetreren en zich intracellulair te vermenigvuldigen. Weefselcysten (bradyzoïeten) daarentegen, komen enkel in het centraal of perifeer zenuwstelsel

voor.

Deze

cysten

kunnen

levenslang

in

de

gastheer

persisteren

en

bij

immunosuppressie weer actief worden waarna bradyzoïeten uit de cyste gaan breken en zich transformeren tot tachyzoïeten (Dubey et al., 1990; Dubey, 1999a: Kramer et al., 2000). N. caninum kan sterfte veroorzaken bij honden van elke leeftijd, maar vooral pups zullen klinisch geïnfecteerd worden (Ruehlmann et al., 1995). N. caninum kan de oorzaak zijn van abortus, neonatale sterfte als ook de geboorte van zwakke pups. Pups en jongen honden (< 1 jaar) vertonen vooral neuromusculaire symptomen met paralyse, spieratrofie en stijfheid van de achterpoten. Deze paralyse kan verder evolueren tot een rigide spiercontractuur en verder naar craniaal uitbreiden met cervicale zwakte, dysphagie en zelfs sterfte tot gevolg (Dubey, 1990; Kramer et al., 2000). Sommige pups met achterhandsparalyse kunnen echter nog enkele maanden overleven (Dubey en Lindsay, 1990). Volwassen honden zijn zelden aangetast waarbij de symptomen afhankelijk zijn van de aangetaste organen (Dubey, 1990; Van Ham et al., 1996): neurologische verschijnselen, polymyositis, myocarditis, pneumonie, dermatitis (Kramer et al., 2000). Neospora caninum kan wel eens verward kan worden met Toxoplasma gondii. Hoewel beide parasieten structureel en antigenetisch gelijkaardig zijn, zijn er in de literatuur enkele fundamentele verschillen beschreven. Ten eerste zal neuromusculaire paralysis meer uitgesproken zijn bij N. caninum dan bij T. gondii. Ten tweede zal T. gondii bijna altijd secundair optreden bij een immunosuppresieve ziekte zoals Caniene distemper, terwijl N. canis steeds een primair pathogeen is (Ruehlmann et al., 1995). Ten derde wordt Neospora niet als humaan pathogeen beschouwd, terwijl T. gondii wel van zoönotisch belang is (Dubey, 1999a). Neurologische verschijnselen bij pups zijn indicatief voor neosporosis, zeker wanneer meerdere pups van eenzelfde nestje zijn aangetast (Kramer et al., 2000). Een diagnose kan gesteld worden na het aantonen van een hoge antistoffen-titer in het serum (immunofluorescentie) of in het cerebrospinaal vocht of het aantonen van tachyzoïeten in verschillende weefsels na bioptname (Dubey en Lindsay, 1990; Dubey, 1999b, Kramer et al., 2000). Een immunohistochemische kleuring is noodzakelijk om een onderscheid te maken tussen de tachyzoïeten van N. caninum en T. gondii. Een bloedonderzoek en electromyelografie (EMG) kunnen de diagnose verder ondersteunen. Bij een N. caninum infectie kan creatinine-kinase gestegen zijn (ten gevolge van polymyositis) en de leverenzymes verhoogd zijn (ten gevolge van leverschade) (Ruehlmann et al., 1995; Kramer et al., 2000). Postmortaal kunnen de parasieten ook aangetroffen worden in verschillende lesies (Dubey en Lindsay, 1990). Bij klinisch aangetaste dieren kan een therapie gestart worden met sulfonamides, pyrimethamine of clindamycine. Deze therapie kent een wisselend succes (Dubey en Lindsay, 1990). Er bestaat echter nog geen medicatie die werkt tegen weefselcysten en die aldus transmissie van teef op haar pups zou

19

voorkomen (Dubey, 1999b). Preventief is het weer belangrijk om strikte hygiëne na te streven. Tevens wordt er aangeraden niet verder te fokken met besmette teven (Kramer et al., 2000).

Figuur 5. Levenscyclus van Neospora caninum (Dubey, 1999a).

20

III. Case bespreking en discussie Anamnese In juni 2010 werd de faculteit diergeneeskunde in Merelbeke gecontacteerd om advies te verkrijgen in verband met een probleem van puppysterfte in een kennel van Deense doggen. Een jaar geleden had de kennel ook problemen met meerdere teven die te vroeg bevielen en kleine nesten hadden of dode pups (doodgeboren of sterfte na enkele dagen). De doodgeboortes gingen gepaard met een stinkende donkerbruine vaginale uitvloeiing bij de teef. Er werd één van de doodgeboren pups voor autopsie naar Pathologie gebracht. Hieruit bleken slechts enkele E. Coli kolonies aanwezig te zijn in de longen, milt en femur. Virologisch en verder bacteriologisch onderzoek gaf negatieve resultaten. Van drie teven en de dekreu werd ook bloed genomen ter onderzoek van Brucella en Herpes. Deze bloeduitslagen waren negatief. Dit jaar heeft een eerste teef op 30 dagen dracht geaborteerd waarna ze ziek is geworden en geen eetlust meer had. Een therapie met enrofloxacine (Xeden®) gaf verbetering. Een tweede teef is na een volledige drachtperiode via keizersnede bevallen van 1 gezonde pup (deze teef had slechts één baarmoederhoorn). Bij een derde teef werd op 49 dagen dracht een groene, slijmerige uitvloei waargenomen. De teef had geen koorts en haar eetlust was normaal. Via echo werd vastgesteld dat de pups nog leefden (hartslag). Er werd een vaginale swab genomen voor een cultuur en bloed genomen voor verder onderzoek (Brucella, Herpes,

Toxoplasma,

Neospora,

progesteron).

Uit

het

bloedonderzoek

bleek

de

progesteronconcentratie te laag te zijn en werd de teef op een therapie met Provera® 5 mg gezet (1,5 tablet/ dag). Een dag later kreeg de teef koorts (40,5°C), had ze geen eetlust meer en was ze suf. Via echo werd opgemerkt dat de meest caudaal gelegen puppy gestorven is. Weer een dag later werd de dode pup op natuurlijke wijze uitgedreven. Tot en met dag 56 werd Provera ® toegediend en drie dagen later is de teef bevallen van het volledige nest. De teef werd onmiddellijk op antibiotica gezet en is na de partus niet ziek geworden. Uit de resultaten van het labo (vaginale swab) bleken er enkel een aantal Streptococcen en Staphyloccen aanwezig te zijn. In de kennel was ook nog een vierde teef drachtig die vorig jaar twee weken te vroeg bevallen was met 10 dode, rotte pups. Dit jaar heeft deze teef op dag 42 of 43 van de dracht 1 dode pup geaborteerd. Op dag 41 was een therapie met Provera® gestart tot en met dag 59. Op dag 62 is de teef bevallen van twee dode en zes gezonde pups. In november is een andere drachtige teef bevallen van 20 pups, waarvan 10 levende en 10 dode. Slechts 1 pup heeft het overleefd en de 9 andere zijn gestorven op een leeftijd van 3- 4 weken.

Probleemlijst -

abortus

-

doodgeboren pups

-

neonatale sterfte

-

kleinere nesten

-

stinkende vaginale uitvloei en zieke teef

-

laag progesterongehalte 21

Differentiaal diagnose Aangezien de klachten bij opeenvolgende gevallen zijn opgetreden, zijn niet- infectieuze oorzaken zoals

afwijkingen

aan

de

foetus

of

moeder

wellicht

onwaarschijnlijk.

Onhygiënische

omgevingsomstandigheden kunnen echter wel predisponerend werken voor infectieuze aandoeningen ( zie tabel 1).

Tabel 1. Infectieuze oorzaken van abortus of puppysterfte en hun mogelijke gevolgen Infectieus

Abortus

agens Herpes virus

Doodgeboren

Neonatale

Kleinere

Vaginale

Zieke

pups

sterfte

nesten

uitvloei

teef

X

X

X

Parvovirus type 2

X

X

Distemper virus

X

Minute virus

X

Brucella canis

X

X

X

X

X X

X

E. Coli

X

X

X

X

Streptococcus canis

X

X

X

Campylobacter

X

X

Staphylococcus intermedius Neospora canis

X X

X

X

gondii

X

X

Toxocara canis

X

X

Toxoplasma

Giardia duodenalis

X

Cystoïsospora

X

Voor wat betreft de virale aandoeningen, zijn Herpesvirus en Parvovirus de belangrijkste oorzaken van neonatale sterfte. Herpesvirus kan bij een geïnfecteerde teef ook vruchtbaarheidsproblemen en eventueel klinische symptomen veroorzaken. Een infectie met Caniene Distemper virus kan mogelijk ook ziekte veroorzaken bij immunosuppressieve adulten. Brucella canis is het enige agens dat alle symptomen kan verklaren, maar tot op heden is het in België nog niet gediagnosticeerd. Brucella veroorzaakt voornamelijk abortus en minder frequent neonatale sterfte of doodgeboortes. Na deze abortus treedt een bruin-grijze vaginale uitvloei op die tot 6 weken kan aanhouden. De ernst van de symptomen kan bij adulten sterk variëren, onder andere infertiliteit kan optreden. Een geïnfecteerde reu kan prostatitis en orchitis vertonen en de infectie venerisch

22

overdragen. De belangrijkste bacteriële infecties worden teweeggebracht door E. Coli, Streptococcus canis en Staphylococcus canis. E. Coli en Staphylococcus canis veroorzaken wellicht geen abortus of vruchtbaarheidsproblemen. Streptococcus canis kan wel een zeldzame oorzaak zijn van abortus, doodgeboortes of infertiliteit. Campylobacter wordt vooral geïsoleerd bij pups (in kennels) die last hebben van een muceuze, waterige diarree. Geïnfecteerde adulten vertonen meestal geen klinische symptomen wegens een goed opgebouwde immuniteit. Bij infecties met Neospora caninum en Toxopasma gondii, kan de vraag gesteld worden of er contact met of opname van besmette tussengastheren mogelijk is. Beide parasieten kunnen gelijkaardige neurologische symptomen bij (jonge) honden veroorzaken. Toxoplasmose zou slechts sporadisch optreden bij de hond. Toxocara canis is zelden de oorzaak van acute sterfte gedurende de eerste dagen post- partum. Deze infectie komt meestal voor onder de vorm van een matige infestatie waarbij gastro- intestinale stoornissen optreden na een aantal weken. Een infectie met Giardia duodenalis verloopt meestal symptoomloos bij adulten, maar kan bij jonge honden dunne darm diarree veroorzaken. Er zijn nog maar een aantal gevallen beschreven van een klinische ziekte veroorzaakt door Cystoïsospora. Naast bovenstaande klinische symptomen, werd er bij een teef ook een te laag progesterongehalte gemeten. Een daling in de progesteronconcentratie kan zowel de oorzaak als een gevolg zijn van abortus (Van Soom et al., 2002). Wellicht kan bij deze teef de daling verklaard worden doordat er reeds een pup gestorven was.

Diagnostisch plan Virale of bacteriële oorzaken kunnen gediagnosticeerd worden na kiemisolatie uit aangetaste weefsels, zoals tijden de autopsie van de dode pup. Er is toen vastgesteld dat er enkele E. Coli kolonies aanwezig waren in de long, milt en femur. De lever is getest op de aanwezigheid van Herpes of Brucella canis, omdat deze sterk gezwollen en gestuwd was met een multifocaal fibrinebeleg (multifocale necrotiserende hepatitis). Deze resultaten waren echter negatief. De reu is via bloedonderzoek negatief getest op Brucella canis en Herpes en hij vertoonde verder geen klinische symptomen (bijvoorbeeld een gezwollen en pijnlijke scrotum). Dit jaar is er bij één van de teven een vaginale swab genomen en een bloedonderzoek uitgevoerd. In deze vaginale swab werden Staphylococcen en Streptococcen teruggevonden. Aangezien een teef altijd drager is van dergelijke kiemen, is een oorzakelijk verband moeilijk aan te tonen. Via bloedonderzoek wilde men de progesteronconcentratie meten en nagaan of er een infectie was met Brucella canis, Herpes, Toxoplasma gondii of Neospora caninum. Deze testten allemaal negatief, maar de progesteronconcentratie was wel te laag. Zoals hoger vermeld, zal deze daling waarschijnlijk een gevolg zijn van abortus en geen oorzaak. Er is geen verder onderzoek uitgevoerd wegens kostenbesparing voor de eigenaars. Andere suggesties voor diagnostisch onderzoek zijn: -

een autopsie laten uitvoeren op gestorven pups gevolgd door verder onderzoek van aangetaste weefsels (Herpes, Caniene Parvovirus type 2, Brucella canis, Toxoplasma, Neospora, E. Coli, Streptococcen, Staphylococcen) 23

-

faeces- onderzoek bij pups en teef (Caniene Parvovirus type 2, Giardia, Toxocara)

-

serologisch onderzoek naar Caniene Parvovirus type 2

-

de vaginale uitvloei laten onderzoeken op Brucella canis

In het laatste nestje is er een faeces- onderzoek gebeurd op de pups (dit was het enige nestje dat diarree vertoonde) en het Caniene Parvovirus type 2 zou hier de oorzaak geweest zijn van sterfte op 3-4 weken leeftijd.

Therapeutisch plan Nadat de diagnose gesteld werd, is de hele kennel ontsmet met CID 20. Dit is een krachtig ontsmettingsmiddel met een breed werkingsspectrum en is opgebouwd uit 5 componenten (quaternair ammonium, glutaaraldehyde, glyoxal, formaldehyde en isopropanol). Ook zijn er enkele maanden geen bevallingen meer gepland. Het plan is om iedere teef juist voor de dekking of juist na de dekking te vaccineren met een extra vaccin tegen het Caniene Parvovirus. Hierdoor zal de teef meer antistoffen aanmaken die ze vervolgens via het colostrum zal doorgeven aan haar pups. Dit helpt de pups een betere passieve immuniteit op te bouwen. Zodra de pups 6 weken zijn, moeten ze gevaccineerd worden. Een vaccinatie tegen parvovirose moet herhaald worden op 9 en 12 weken. Hierna volgt een jaarlijkse boostervaccinatie. Sinds de kennel ontsmet wordt met CID 20 en een extra vaccin tegen parvo wordt toegediend, zijn er geen problemen meer opgetreden in de kennel. In december 2010 is een teef via keizersnede bevallen van een nestje van 11 gezonde pups. De fokker heeft bij deze teef nog wel op eigen initiatief Provera® toegediend van dag 30 tot en met dag 63.

Discussie Bij de laatste gevallen van puppysterfte werd aangetoond dat parvovirus de oorzaak was. Het is echter onduidelijk of parvovirose ook de oorzaak was van abortus, doodgeboorte en neonatale sterfte die vorig jaar plaats vond. Er werd toen namelijk niet op het Caniene Parvovirus getest en de teven werden wel jaarlijks gevaccineerd met een gecombineerd levend verzwakt vaccin (Nobivac® dhppi) en een vaccin tegen leptospirose (Nobivac® lepto). Dit gecombineerd vaccin beschermt de teef tegen hondenziekte, Caniene adenovirus type 2, Caniene Parvovirus en kennelhoest. Om te verzekeren dat de pups voldoende passieve immuniteit opbouwen, zullen de teven in de toekomst een extra vaccin krijgen tegen parvovirose voor of na de dekking. Voor de opbouw van een passieve immuniteit is niet alleen de titer antistoffen in het colostrum van belang, maar ook de hoeveelheid colostrum die is opgenomen de eerste 72u na de dracht (Davidson, 2003). Deze maternale antistoffen hebben bij pups een halfwaardetijd van 10 dagen waarna de interferentie met vaccins zal afnemen. In vele gevallen zal deze interferentie ook een oorzaak zijn van het doorbreken van een infectie met het Caniene Parvovirus. Er is echter een periode waarbij de titer antistoffen in pups (passieve immuniteit) nog dermate hoog is dat het interfereert met de opbouw van actieve immuniteit, maar toch te laag is om 24

bescherming te bieden tegen een infectie. Gedurende deze periode zijn de pups dus zeer kwetsbaar (Pollock en Carmichael, 1982; Smith-Carr et al., 1997). Vaccinatie kan uitgevoerd worden met een geïnactiveerd, levend verzwakt of subunit vaccin. De sterkste immuunrespons treedt op bij een levend verzwakt vaccin (Hoskins, 1997; Smith-Carr et al., 1997). Naast een aanpassing in het vaccinatie schema, moet er ook aandacht geschonken worden aan mogelijk predisponerende factoren voor een parvovirus-infectie bij pups. Een infectie met gastro-intestinale parasieten (zij tasten de intestinale barrière

aan),

een

stressvolle

omgeving,

onhygiënische

omstandigheden

en

een

hoge

bezettingsdichtheid moeten vermeden worden. Drachtige teven kunnen best afzonderlijk in hygiënische ruimten geplaatst worden en puppies mogen pas aan het einde van hun serie vaccinaties blootgesteld worden aan andere honden (Smith-Carr et al., 1997) Omdat er bij een teef een te laag progesterongehalte werd vastgesteld, werd bij haar een therapie opgestart met Provera®. Deze therapie wordt best gestopt op dag 58- 60 van de dracht. Indien een infectie aanwezig is, moet de therapie onmiddellijk stopgezet worden en moeten de (rotte) pups er zo snel mogelijk uitgehaald worden. Deze maatregel is niet uitgevoerd bij deze geaborteerde teef uit de kennel. Ondanks de therapie is verder gezet, is de dode pup enkele dagen later toch uitgedreven en is de teef rond dag 60 van haar overige pups bevallen. Indien een teef in het verleden reeds te vroeg bevallen is, mag Provera® niet preventief gegeven worden. Dit kan namelijk negatieve gevolgen hebben voor de geslachtsdifferentiatie als het tijdens de eerste helft van de dracht wordt gegeven. Het progesterongehalte

moet

bijgevolg

steeds

eerst

gemeten

worden.

Na

ovulatie

is

het

progesterongehalte hoger dan 5- 8 ng/mL en dit zal verder stijgen tot 10 ng/mL gedurende een aantal weken. Nadien zal de concentratie langzaam aan dalen. Dit verloop is zowel bij drachtige als nietdrachtige (metoestrus) teven waar te nemen. Bij drachtige teven zal twee dagen voor de partus een abrupte daling optreden. Hierbij zal een progesterongehalte van meer dan 3 ng/mL dalen tot minder dan 1 ng/mL (Johnson, 2008). Indien de progesteronconcentratie reeds lager is dan 3 ng/mL alvorens dag 58- 60 van de dracht bereikt is, kan een supplementatie worden opgestart. De concentratie wordt nadien wekelijks opgevolgd.

25

IV. Literatuurlijst 1. Appel M.J.G., Summers B.A. (1999). Canine Distemper: Current Status. In: Recent advances in canine infectious diseases. Internetreferentie: http:// www.ivis.org 2. Barr F. (1997). Toxocara canis. Journal of small animal practice, 38, 531- 538. 3. Burke T.M., Robinson E.L. (1985). Prenatal and lactational transmission of Toxocara canis and Ancylostoma caninum: experimental infection of the bitch before pregnancy. International journal for parasitology, 15, 71-75. 4. Carmichael L.E., Greene C.E. (1990a). Canine herpesvirus infection. In: Greene C.E., Infectious diseases in the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 252-258. 5. Carmichael L.E., Greene C.E. (1990b). Canine Brucellosis. In: Greene C.E., Infectious diseases in the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 573- 584. 6. Carmichael L.E., Schlafer D.H., Hashimoto A. (1991). Pathogenicity of minute virus of canines (MCV) for the canine fetus. Cornell Veterinarian, 81, 151-171. 7. Carmichael L.E., Schlafer D.H., Hashimoto A. (1994). Minute virus of canines (MCV, canine parvovirus type-1): pathogenicity for pups and seroprevalence estimate. Journal of veterinary diagnostic investigation, 6, 165-174. 8. Carmichael L.E. (2004). Neonatal Viral Infections of Pups: Canine Herpesvirus and Minute Virus of Canines (Canine Parvovirus-1). In: Recent advances in canine infectious diseases. Internetreferentie: http://www.ivis.org 9. Claerebout E., Vercruysse J. (2005). Toxocara canis/ Coccidiosis/ Giardiosis. In: Parasitaire ziekten bij huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 2-10/ 29-37/ 38-40. 10. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1969). Neonatal canine herpesvirus infection: a review of present knowledge. Veterinary Record, 84, iss. 1, 2-6. 11. Cox H.U., Hoskins J.D. (1990). Staphylococcal infections. In: Greene C.E., Infectious diseases in the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 611- 613. 12. Davidson A.P. (2003). Approaches to Reducing Neonatal Mortality in Dogs. In: Recent Advances in Small Animal Reproduction. Internetreferentie: http://www.ivis.org 13. Davidson M.G. (2000). Toxoplasmosis. Veterinary Clinics of North America- Small Animal Practice, 30, iss. 5, 1051- 1060. 14. Decaro N., Martella V., Elia G., Desario C., Campolo M., Lorusso E., Colaianni M.L., Lorusso A., Buonavoglia C. (2007). Tissue distribution of the antigenic variants of canine parvovirus type 2 in dogs. Veterinary Microbiology,121 ,iss. 1-2, 39-44. 15. Dobbs K., Dabritz H., Conrad P. (2008). Parasites 101 - Toxoplasmosis, cats and human health. Veterinary forum, 25, No. 10, 32- 34. 16. Dubey J.P., Greene C.E. (1990). Enteric coccidioisis. In: Greene C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 835- 846. 17. Dubey J.P., Greene C.E., Lappin M.R. (1990). Toxoplasmosis and neosporosis. In: Greene C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 818834.

26

18. Dubey J.P., Lindsay D.S. (1990). A review of Neospora caninum and neosporosis. Veterinary parasitology, 67, 1-59. 19. Dubey J.P. (1999a). Neosporosis: the first decade of research. International Journal for Parasitology, 29 , 1485- 1488. 20. Dubey J.P. (1999b). Recent advances in Neospora and neosporosis. Veterinary parasitology, 84, 349- 367. 21. Fox, J.G. (1990). Enteric and other bacterial infections. In: Greene C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 538- 557. 22. Greene C.E. (1990). Gastrointestinal and intra- abdominal infections. In: Green C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 125- 145. 23. Greene C.E., Appel M.J. (1990). Canine Distemper. In: Green C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders company, Philadelphia, 226-241. 24. Greene C.E. (1999). Streptococcal and other gram- positive bacterial infections. In: Greene C.E., Infectious diseases of the dog and cat, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 599610. 25. Harrison L.R., Styer E.L., Pursell A.R., Carmichael L.E., Nietfeld J.C. (1992). Fatal disease in nursing puppies associated with minute virus of canines. Journal of veterinary diagnostic investigation, 4, 19-22. 26. Higgins R.J., Krakowka S., Metzler A.E., Koestner A. (1981). Canine distemper virus – associated cardiac necrosis in the dog. Veterinary pathology, 18, iss. 4, 472-486. 27. Hollett R.B. (2006). Canine brucellosies: Outbreaks and compliance. Theriogenology 66, 575– 587. 28. Hoskins J.D. (1997). Update on canine paroviral enteritis. Veterinary Medicine, 92, iss. 8, 694709. 29. Hoskins J.D. (1999). Pediatric health care and management. Veterinary clinics of NorthAmerica: Small animal practice , 29, iss. 4, 837- 848. 30. Indrebo A., Trangerud C., Moe L. (2007). Canine neonatal mortality in four large breeds. Conference Information: Perinatal death in domestic animals: 20th Symposium of the Nordic Committee for Veterinary Scientific Cooperation. Reykjavik, Iceland. Acta Veterinaria Scandinavica, 49, suppl. 1, S 2. 31. Järplid B., Johansson H., Carmichael L.E. (1996). A fatal case of pup infection with minute virus of canines (MVC). Journal of veterinary diagnostic investigation, 8, 484-487. 32. Johnson C.A. (2008). Pregnancy management in the bitch. Theriogenology, 70, 1412-1417. 33. Johnston S.D., Root Kustritz M.V., Olson P.N.S. (2001). Chapter 8: The neonate, from birth to weaning. In: Canine and feline theriogenology, Saunders, Philadelphia, 157-167. 34. Kirkpatrick C.E., Dubey J.P. (1987). Enteric coccidial infections. Isospora, Sarcocystis, Cryptosporidium, Besnoitia and Hammondia. Veterinary Clinics of North America - Small Animal Practice, 17, iss. 6, 1405- 1420. 35. Koene M.G.J., Houwers D.J. (1999). Giardia, een potentiële diarreeverwekker. Tijdschrift voor diergeneeskunde, 124, 310- 312.

27

36. Krakowka S., Higgins R.J., Koestner A. (1980). Canine distemper virus: review of structural and functional modulations in lymphoid tissues. American journal of veterinary research, 41, iss. 2, 284-292. 37. Kramer A.M.H., Wouda W., Kooistra H.S. (2000). Klinische neosporose bij de hond: literatuuronderzoek. Tijdschrift voor diergeneeskunde, 125, 609- 613. 38. Lenghaus C., Studdert M.J. (1982). Generalized parvovirus disease in neonatal pups. Journal of the American veterinary medical association,181, iss. 1, 41-45. 39. Macartney L., Parrish C.E., Binn L.N., et al. (1988). Characterization of minute virus of canines (MCV) and its pathogenicity for pups. Cornell Veterinarian, 78, 131-145. 40. McCandlish I.A.P. (1999). Specific infections of the dog. In: Dunn J. (editor), Textbook of small animal medicine. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 921- 958. 41. McCaw D.L. , Hoskins J.D. (2006). Canine viral enteritis. In: Greene C.E., Infectious diseases of the dog and cat, third edition, Saunders Elsevier, St. Louis, 63-73. 42. McLaughlin W. (2008). Giardia Infection: Diagnosis, Treatment, and Prevention. Veterinary technician, 29, iss. 3, 168-172. 43. Pasmans F. (2008), Algemene bacteriële en mycotische aandoeningen. In: Bacteriële en mycotische ziekten bij de hond en kat. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 106- 107. 44. Pollock R.V.H., Carmichael L.E. (1982). Maternally derived immunity to canine parvovirus infection: transfer, decline, and interference with vaccination. Journal of the American veterinary medical association, 180, iss. 1, 37-42. 45. Poulet H., Dubourget P. (1993). L’herpèsvirose canine. Le Point Vétérinaire 25, 69-75. 46. Poulet H., Guigal P.M., Soulier M., Leroy V., Fayet G., Minke J., Chappuis Merial G. (2001). Protection of puppies against canine herpesvirus by vaccination of the dams. Veterinary Record, 148, 691-695. 47. Rochette F. (1999a). Endoparasites: worms - Toxocara canis. Dog parasites and their control. Janssen Animal Health B.V.B.A., 111-125. 48. Rochette F. (1999b). Endoparasites: protozoa – Isospora (= Cystoisospora). Dog parasites and their control. Janssen Animal Health B.V.B.A., 211-212. 49. Rochette F. (1999c). Endoparasites: protozoa – Toxoplasma gondii. Dog parasites and their control. Janssen Animal Health B.V.B.A., 218-223. 50. Ruehlmann D., Podell M., Oglesbee M., Dubey J.P. (1995). Canine Neosporosis: A case report and literature review. Journal of the American animal hospital association, 31, 174- 182. 51. Saijonmaa- Koulumies L.E., Lloyd D.H. (2002). Colonization of neonatal puppies by Staphylococcus intermedius. Veterinary dermatology, 13, 123- 130. 52. Sherding R.G. (1994). Canine Distemper. In: Manual of small animal practice. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 107-109. 53. Smith-Carr S., Macintire D.K., Swango L.J. (1997). Canine Parvovirus. Part I. Pathogenesis and vaccination. Compendium on continuing education for the practicing veterinarian, 19, iss. 2, 125-133.

28

54. Van Gught S., Nauwynck H., Pensaert M. (2001). Caniene herpesvirus infecties. Vlaams diergeneeskundig tijdschrift, 70, 197-203. 55. Van Ham L.M.L., Thoonen H., Barber J.S., Trees A.J., Polis I., De Cock H., Hoorens J.K. (1996). Neospora caninum infection in the dog: typical and atypical cases. Vlaams Diergeneeksundig Tijdschrift, 65, 326- 335. 56. Van Soom A., Rijsselaere T., Van den Broeck W., de Kruif A. (2002). Abortus bij de teef. Vlaams diergeneeskundig tijdschrift, 71, 326- 333.

29

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2010-2011

Sperma-onderzoek bij de reu: een literatuurstudie en case bespreking

door

Valérie MONSTREY

Promotor: Dr. Tom Rijsselaere Co- promotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Case report in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Voorwoord Graag zou ik een aantal mensen willen bedanken die mij hebben geholpen bij het tot stand brengen van deze masterproef. Op de eerste plaats wil ik mijn promotor dierenarts Tom Rijsselaere bedanken voor de verbeteringen, opmerkingen en hulp die hij mij geboden heeft. Ook mijn familie verdient een dankwoordje voor het nalezen van mijn masterproef ter controle van taalfouten.

Inhoudsopgave Samenvatting I. Inleiding II. Literatuurstudie 1. De sperma-afname 2. Het sperma-onderzoek 2.1 Macroscopisch onderzoek 2.1.1

Kleur

2.1.2

Bijmengingen

2.1.3

Volume

2.1.4

Homogeniteit

2.2 Microscopisch onderzoek 2.2.1

Motiliteit

2.2.2

Concentratie en het aantal spermatozoa in het ejaculaat

2.2.3

Morfologie

2.2.4

De membraanintegriteit 2.2.4.1 Vitale kleuringen 2.2.4.2 Hypo-osmotische zwellingstest (HOST) 2.2.4.3 Fluorescente kleuringen

2.2.5

Cytologie

2.3 De pH van het ejaculaat 2.4 Bacteriologie en cultuur 2.5 Computer geassisteerde sperma-analyse (CASA) 2.5.1 Motiliteit 2.5.2 Morfologie en morfometrie 2.5.3 Concentratie 3. Interpretatie van de spermakwaliteit III. Case bespreking en discussie IV. Literatuurlijst V.

Bijlage

Samenvatting Deze masterproef beschrijft de verschillende aspecten van een sperma-onderzoek. Hierbij wordt aandacht besteed aan zowel de verschillende onderzoekstechnieken, als aan de verschillende parameters die geanalyseerd worden. De spermakwaliteit wordt beoordeeld aan de hand van een sperma-onderzoek, aangevuld met een lichamelijk onderzoek en een grondige anamnese. Sperma-afname vindt voornamelijk plaats via manuele stimulatie, idealiter in de aanwezigheid van een loopse teef. Het ejaculaat bij de reu bestaat uit drie fracties waaronder enkel de tweede (spermarijke) fractie zal onderzocht worden op bepaalde criteria: kleur, volume, bijmeningen, homogeniteit, (progressieve) motiliteit, concentratie, morfologie en membraanintegriteit. Aanvullend kunnen ook een bacteriologisch cultuur en cytologisch onderzoek worden uitgevoerd en kan de pH bepaald worden. Het spermastaal moet zo zorgvuldig mogelijk gehanteerd worden om artefacten (veranderingen in de morfologie en motiliteit) te vermijden. Ook moet een staal steeds onmiddellijk onderzocht worden. Hoe langer men wacht, hoe meer dode zaadcellen aanwezig zullen zijn en de motiliteit zal dalen. De temperatuur van het gebruikte materiaal (draagglaasjes, dekglaasjes) moet tot 37°C worden opgewarmd en proper zijn. Sperma-onderzoek kan op een subjectieve manier plaatsvinden via macroscopische en microscopische analyses. Echter, de laatste jaren is er ook meer interesse voor het gebruik van computer geassisteerde spermaanalyse (CASA) systemen. Deze geven een objectieve en zeer gedetailleerde analyse van individuele zaadcellen. De resultaten van een sperma-onderzoek moeten tenslotte in een gestandaardiseerd evaluatieformulier ingevuld worden.

Kernwoorden: reu, sperma-afname, sperma-onderzoek, CASA, spermakwaliteit

I. Inleiding Een sperma-afname en -onderzoek zal plaatsvinden om de kwaliteit van een spermastaal en de vruchtbaarheid van een reu te bepalen. Dergelijk onderzoek vindt onder andere plaats bij kunstmatige inseminatie, bij het invriezen van een spermastaal, als onderdeel van een sperma-attest of wanneer men voor de fok een subfertiele reu wil gebruiken of een reu die reeds enige jaren uit de fok is gehouden (Kutzler, 2005). Tevens kan een analyse van het sperma uitgevoerd worden om op zoek te gaan naar pathologische aandoeningen wanneer de reu klachten vertoont van hematurie, abnormale uitvloei uit het preputium of bloed in het ejaculaat (Kutzler, 2005; Martinez, 2004). Hierbij wordt voornamelijk de derde fractie van het ejaculaat (het prostaatvocht) geanalyseerd (Kutzler, 2005). Om de spermakwaliteit te evalueren, dient de spermarijke tweede fractie van het ejaculaat onderzocht te worden. De spermakwaliteit kan onder andere beïnvloed worden door de leeftijd, de grootte van de reu en de dekfrequentie. Een maximale dekfrequentie van driemaal per week wordt aangeraden om het aantal geloosde zaadcellen optimaal te houden (Hendrikse, 1984). Wanneer de fertiliteit in vraag wordt gesteld, is het ook belangrijk na te gaan of een volledige ejaculatie plaatsvindt (alkalische fosfatase > 5000 U/liter in de eerste en tweede fractie van het ejaculaat) (Johnston, 1997; Kutzler, 2005). Zowel bij vers als diepgevroren sperma kunnen een aantal parameters bepaald worden. Diepgevroren sperma zal onderzocht worden om de schade door het invriesproces aan de cellen in te schatten, terwijl vers sperma onderzocht wordt om de testiculaire en epidydimale functie te evalueren (Martinez, 2004). Alvorens sperma-afname uit te voeren, moet een grondige anamnese zijn afgenomen en moet de hond klinisch onderzocht zijn. Hierbij moet zeker ook gevraagd worden naar de medische voorgeschiedenis van de afgelopen zes maanden. Op klinisch onderzoek moeten het scrotum, de testis, de penis en het preputium geïnspecteerd en gepalpeerd worden. Ook moet de prostaat via rectaal onderzoek gepalpeerd worden (Threlfall, 2003; Freshman, 2002). Bij voorkeur wordt sperma afgenomen na 4 tot 5 dagen van seksuele rust. Wanneer meer dan 10 dagen gewacht wordt, zal er een grotere kans zijn op morfologische abnormaliteiten en een verminderde motiliteit omdat dan de spermacellen reeds verouderd zijn en het debris is toegenomen (Johnston et al., 2001). In deze masterproef wordt eerst besproken hoe een sperma-afname verloopt bij de reu. Vervolgens wordt ingegaan op de verschillende parameters die bij een sperma-onderzoek beoordeeld worden. Ook zullen de verschillende onderzoekstechnieken besproken worden. Standaard wordt het spermastaal zowel macroscopisch als microscopisch onderzocht. Aanvullend kan nog onderzoek gedaan worden naar pH, cytologie, cultuur, fluorescentie, enz… Omdat deze technieken een zekere subjectiviteit met zich meebrengen, worden ook enkele meer objectieve onderzoekstechnieken zoals computer geassisteerde sperma-analyses (CASA) en fluorescente kleuringstechnieken besproken.

2

II. Literatuurstudie 1. De sperma-afname Sperma-afname van een reu kan via manuele stimulatie, een kunstvagina, electro-ejaculatie of zelfs via farmacologische methoden (xylazine en imipramine). Er is nog maar weinig onderzoek uitgevoerd naar farmacologisch-geïnduceerde ejaculaties bij de hond (Kutzler, 2005). De meest toegepaste techniek is de manuele stimulatie, idealiter is er daarbij ook een loopse teef aanwezig. Het is belangrijk dat het verzamelen van sperma in een rustige ruimte gebeurt met zo weinig mogelijk mensen, aldus worden storende factoren vermeden (Hendrikse, 1984; Kutzler, 2005; Farstad, 2006). Bij manuele stimulatie kan tevens gebruik gemaakt worden van een loops teefje om de reu te stimuleren (Farstad, 2006). Indien de teef niet in oestrus verkeert, kan een oestrusgeur wel geïmiteerd worden met behulp van een vaginale swab. Dit is een swab die in het verleden van een loopse teef is afgenomen en ingevroren. Er is ook reeds succes bereikt via het gebruik van een chemisch feromoon (methyl p-hydroxybenzoaat) dat met een swab wordt aangebracht aan de vulva en de staart van een teef (Freshman, 2002). De reu wordt toegelaten de teef te bestijgeren (Farstad, 2006). De erectie kan worden opgewekt door de bulbus glandis (caudaal deel van de glans) doorheen het preputium te masseren. Zodra deze bulbus begint te zwellen, wordt het preputium naar achter geschoven tot over de bulbus waadoor de penis wordt uitgeschacht (Figuur 1). Nadien wordt de penis verder gestimuleerd door contracties uit te oefenen op de penis waarbij vaginale contracties (tijdens een natuurlijke dekking) worden nagebootst (Hendrikse, 1984). Indien de bulbus reeds te gezwollen is om het preputium erover te schuiven, moet de stimulatie onderbroken worden tot de zwelling gereduceerd is. Dit zal slechts enkele minuten duren en het maken van een korte wandeling of het geven van voedsel kunnen hierbij helpen (Kutzler, 2005).

Figuur 1. Sperma-afname bij de reu: het preputium is tot achter de bulbus glandis geschoven en met de hand wordt een constante druk uitgeoefend door de penis tussen duim en wijsvinger vast te grijpen (Uit: Kutzler, 2005).

3

Zodra de erectie voltooid is, is het mogelijk dat de reu een poot opheft over de arm van de persoon die de sperma-afname uitvoert. Deze persoon trekt vervolgens de penis naar caudaal en onderhoudt ondertussen ook de druk op de bulbus (Figuur 2). De penis kan 180° gedraaid worden aangezien de penis in deze regio zeer elastisch is en dit bij een natuurlijke dekking ook plaatsvindt (Kutzler, 2005; Farstad, 2006). Is de erectie voltooid en de reu voldoende gestimuleerd, dan zal de ejaculatie vrij snel volgen waarbij tevens dekbewegingen kunnen gemaakt worden (Hendrikse, 1984; Kutzler, 2005). Nadat het ejaculaat is opgevangen, wordt de penis losgelaten en moet de reu geobserveerd worden tot de penis weer volledig is ingeschacht. Dit proces kan bij sommige honden versneld worden door het maken van een korte wandeling in afwezigheid van de (loopse) teef. Soms is het mogelijk dat er haren vast komen te zitten tussen de penis en het preputium of dat het distale deel van het preputium mee naar binnen rolt. Om dit te vermijden kan een (niet spermicide) glijmiddel worden aangebracht rond de opening van het preputium (Freshman, 2002; Kutzler, 2005).

Figuur 2. Bij deze reu is de erectie voltooid en de penis is 180° gedraaid naar caudaal (Uit: Kutzler, 2005).

Het sperma wordt meestal opgevangen in een trechter of in de cylinder van een spuit, een petrischaaltje of een plastieken potje (Hendrikse, 1984; Kutzler, 2005). Het ejaculaat van de reu bestaat uit drie fracties (Hendrikse, 1984; Johnston, 2001; Root Kustritz, 2007): -

Eerste fractie (prostaat vocht): waterhelder, bevat slechts enkele tot geen spermatozoa, 0,5 tot 5 ml volume, lozingstijd ligt meestal tussen 30 en 50 seconden.

-

Tweede fractie (spermarijk): afkomstig van de epididymis en testis, melk- tot roomachtig, bevat vrijwel alle zaadcellen, 0,1 tot 5 ml volume, lozingstijd meestal ongeveer 1 minuut.

-

Derde fractie (prostaat vocht): waterhelder, bevat slechts enkele tot geen spermatozoa, volume van enkele tot 20 à 30 ml, lozingstijden variëren van enkele minuten tot 30 minuten.

Voor sperma-analyse zal enkel de spermarijke tweede fractie opgevangen worden. Zodra het ejaculaat helder van kleur wordt, kan worden aangenomen dat de volledige spermarijke fractie is opgevangen (Feldman en Nelson, 2004). De derde fractie wordt slechts (apart) opgevangen indien specifieke onderzoeken nodig zijn (zoals bacteriologisch onderzoek voor de diagnose van prostatitis).

4

Nadat het ejaculaat is opgevangen, moet het staal best op kamertemperatuur of 37°C gehouden worden. Spermatozoa van de reu zijn echter minder koudegevoelig dan bijvoorbeeld varkenssperma (Kutzler, 2005). De recipiënten en draagglaasjes (voor microscopisch onderzoek) moeten verwarmd zijn alvorens contact te maken met het sperma (Feldman en Nelson, 2004). Bij bovenstaande manuele stimulatie kunnen al dan niet handschoenen gebruikt worden. Volgens Althouse et al. (1991) treedt een verminderde motiliteit van de spermacellen op zodra er gedurende 1 minuut contact wordt gemaakt tussen sperma en latex handschoenen. Echter, Freshman (2002) meldt dat dit wellicht geen probleem zal vormen indien de techniek voor sperma-afname correct is uitgevoerd.

2. Het sperma-onderzoek Het sperma-onderzoek moet voorafgegaan worden door een grondige anamnese en klinisch onderzoek (Freshman, 2002). Om een standaard sperma-onderzoek uit te voeren, moet volgend materiaal voorzien worden: een microscoop, draag- en dekglaasjes, pipetten om enkele druppels sperma over te kunnen brengen, 1 ml spuiten of tubes om een geringe hoeveelheid sperma van het staal eventueel te gebruiken voor bacteriologie (en antibiogram), een pH teststrip, eosine-nigrosine kleuring, een verdunner en een telkamer (Johnston, 1991). De resultaten van het volledige sperma-onderzoek moet ingevuld worden op een evaluatieformulier (Bijlage 1). Op deze manier kunnen alle gegevens bijgehouden worden en kunnen veranderingen in de spermakwaliteit worden opgevolgd (Johnston, 1991).

2.1 Macroscopisch onderzoek 2.1.1 Kleur Hoewel de evaluatie van kleur subjectief is, geeft het toch enige indicatie of extra testen moeten uitgevoerd worden (Root Kustritz, 2007). De kleur van een spermastaal (tweede fractie) is normaal melkachtig tot crèmekleurig, afhankelijk van de densiteit van het ejaculaat (Farstad, 2006). Een helder staal bevat allicht geen spermatozoa. Stalen die echter een normaal uitzicht hebben, moeten ook altijd microscopisch onderzocht worden aangezien dergelijke stalen (zelden) ook azoöspermisch kunnen zijn (Root Kustritz, 2007).

2.1.2 Bijmengingen Een gele, groene, rode of bruine kleur van het sperma wijst op een bijmenging. De aanwezigheid van bijmengingen is steeds pathologisch. Een gele kleur wijst op contaminatie met urine of ontstekingscellen (pus). Een groene kleur, al dan niet met klonters, wijst op de aanwezigheid van ontstekingscellen (pus) en een infectie van het geslachtstelsel. Bijmenging met vers bloed veroorzaakt een rode kleur, terwijl bijmenging met gehemolyseerd bloed een bruine kleur veroorzaakt. De meest voorkomende oorzaken van hemospermie zijn prostaatproblemen of trauma van de penis (eventueel

5

tijdens sperma-afname). Dergelijke bijmengingen (urine, bloed, pus) kunnen de concentratie, motiliteit en viabiliteit van de spermacellen beïnvloeden (Feldman en Nelson, 2004; Farstad, 2006; Root Kustritz, 2007).

2.1.3 Volume Het volume van het volledige ejaculaat (de drie fracties) kan variëren van 2,5 tot > 80 ml. De manier van het verzamelen, het libido en de grootte van de reu spelen hierbij een belangrijke rol (Johnson, 2001; Gradil et al., 2006). Voor sperma-onderzoek wordt enkel de tweede fractie opgevangen, het volume zal hierbij vooral afhangen van de hoeveelheid prostaatvocht die mee is opgevangen (Martinez, 2004). De spermarijke fractie omvat meestal 0,1 tot 5 ml, terwijl het volume prostaatvocht zeer sterk kan variëren (Root Kustritz, 2007). Er bestaat een negatieve correlatie tussen het volume sperma en de concentratie (aantal zaadcellen per ml). Daarom is het beter om het aantal zaadcellen per ejaculaat te vermelden om een idee te krijgen van de kwaliteit (Hendrikse, 1984).

2.1.4 Homogeniteit De reu heeft, zoals de stier en de ram, normaal een homogeen ejaculaat. Bij andere diersoorten, zoals de hengst en de beer, kan een gel-achtige fractie in het ejaculaat aanwezig zijn (de Kruif et al., 2009)

2.2 Microscopisch onderzoek Sperma moet zo snel mogelijk na de afname onderzocht worden. Zo niet, dan zal het aantal dode zaadcellen toenemen en de motiliteit afnemen (Feldman en Nelson, 2004).

2.2.1 Motiliteit De motiliteit is de eerste parameter die na sperma-afname beoordeeld wordt. Normaal zullen spermatozoa hun motiliteit gedurende meerdere uren bewaren, maar bij een slechte kwaliteit zal deze snel dalen (Larsen, 1980). Het licht van de microscoop kan het sperma ook zodanig opwarmen dat de motiliteit achteruit gaat (Johnston, 2001). De motiliteit is de meest gebruikte indicator voor de spermakwaliteit aangezien het de structurele en functionele capaciteiten van spermatozoa weergeeft (Martinez, 2004). Het percentage progressieve motiliteit zal dan ook positief gecorreleerd zijn met het percentage morfologisch normale zaadcellen (Ellington et al., 1993). Een daling van de progressieve motiliteit zal voornamelijk gepaard gaan met een toename van secundaire morfologische afwijkingen (Threlfall, 2003). Een druppel sperma wordt op een warm draagglaasje aangebracht dat vervolgens met een warm dekglaasje wordt afgedekt. (Johnston, 2001). Met een 100x vergroting wordt het percentage motiele en progressief motiele spermacellen beoordeeld. De totale motiliteit dient meer dan 80% te bedragen (Van Soom, 2010). Normale zaadcellen bewegen zich zeer snel voort (in 2-3 seconden steken ze het microscopisch veld over) in een voorwaartse richting. Indien zij in een cirkelvorm roteren, kan dit wijzen op een abnormale morfologie (Olson, 1992; Threlfall, 2003). De progressieve motiliteit (het

6

aantal zaadcellen die zich voorwaarts bewegen) moet bij fertiele reuen schommelen tussen 70 à 90% in onverdund, vers sperma. Indien het sperma staal ingevroren is geweest, zal dit lager liggen. Er is echter een minimum van 50% vereist om dergelijk sperma voor kunstmatige inseminatie te gebruiken (Johnston, 1991; Farstad, 2006). De progressieve motiliteit zal hoger zijn in stalen die afgenomen werden na 5 dagen seksuele rust, in vergelijking met stalen genomen na 1 dag seksuele rust (Johnston, 2001). Een daling van de progressieve motiliteit kan een niet-specifieke indicatie zijn van een infectie ter hoogte van het geslachtstelsel (Johnston, 1991). Wanneer een groot aantal zaadcellen niet motiel of dood zijn, moet een tweede staal onderzocht worden alvorens sub- of infertiliteit te diagnosticeren (Feldman en Nelson, 2004). Bij de interpretatie van de motiliteit moet rekening gehouden worden of de techniek van sperma-afname nauwkeurig is uitgevoerd. Contact met latex handschoenen zou de motiliteit echter kunnen doen afnemen. Daarentegen hebben vinyl handschoenen hierop slechts een minimale invloed (Althouse et al., 1991). Indien het sperma te geconcentreerd is om de motiliteit duidelijk te evalueren, kan een druppel isotone verdunning gebruikt worden om de zaadcellen van elkaar te scheiden (Johnston, 1991). Tegelijkertijd moet het spermastaal ook op agglutinatie gecontroleerd worden. Agglutinatie betekent dat de motiele zaadcellen aan elkaar kleven met hun kop, staart of middenstuk (Olson, 1992). Computer geassisteerde sperma-analyse (CASA) systemen kunnen ook gebruikt worden om de motiliteit te beoordelen (zie 2.5). Dergelijke systemen geven objectievere informatie dan een subjectief microscopisch onderzoek, maar ze worden in de praktijk nog niet door alle dierenartsen aangewend (Root Kustritz, 2007).

2.2.2 Concentratie en het aantal spermatozoa in het ejaculaat De concentratie (aantal zaadcellen per ml) kan geteld worden aan de hand van een telkamer die onder een microscoop bekeken wordt. Aange5n het volume omgekeerd evenredig is met de concentratie, is het echter efficiënter te spreken over het aantal zaadcellen per ejaculaat (Farstad, 2006). Om de concentratie te kunnen bepalen, is een telkamer nodig zoals een Neubauer hemacytometer (Figuur 3) of een Bürkerse telkamer. Bij het gebruik van een Bürkerse telkamer wordt meestal een 40voudige verdunning gemaakt van het spermastaal (de Kruif et al., 2009). Bij het gebruik van een Neubauer hemacytometer wordt 20 µl van het spermastaal met 2 ml verdunner gemengd (Johnston, 2001; Feldman en Nelson, 2004). De randen van een dekglaasje worden bevochtigd en aangebracht op de telkamer. Deze randen worden goed aangeduwd tot er (Newtonse) ringen zichtbaar zijn. Het verdunde sperma wordt vervolgens onder het dekglaasje in beide kamers van de telkamer aangebracht. Dit sperma zal zich onder het dekglaasje verspreiden door middel van de capillariteit (WHO, 1999; Johnston, 2001; Feldman en Nelson, 2004). Bij het gebruik van de Bürkerse telkamer wordt het aantal spermacellen in 40 kleine vierkantjes geteld (inhoud van één vierkantje= 1/4000 mm³). De microscoop wordt hierbij ingesteld op een 20x vergroting. Enkel de spermacellen binnen het vierkantje en ook deze op twee op voorhand geselecteerde zijden worden geteld. Vervolgens wordt dit aantal vermenigvuldigd met 100 om het aantal zaadcellen per mm³ of per µl te verkrijgen. Om het aantal zaadcellen per ml te verkrijgen, moet het aantal zaadcellen per µl vermenigvuldigd worden met

7

de verdunningsfactor (meestal 40) en factor 1000 (de Kruif et al., 2009). Bij het gebruik van een Neubauer hemacytometer kan het aantal spermatozoa op twee manieren geteld worden (Root Kustritz, 2007). Onder de microscoop is te zien dat de telkamer bestaat uit 9 grote vierkanten die verder zijn onderverdeeld in 25 kleine vierkanten van 1 mm (Johnston, 2001). Bij een eerste techniek worden in beide kamers van de hemacytometer de spermatozoa geteld in het centrale vierkant van de 9 grote vierkanten (met een 10x vergroting vult 1 vierkant het gezichtsveld). Het gemiddelde van de twee aantallen geeft de concentratie weer, uitgedrukt in miljoenen spermatozoa per milliliter (Johnston, 2001; Freshman, 2002; Root Kustritz, 2007). Bij een tweede techniek wordt het aantal spermatozoa in 3 van de 9 grote vierkanten geteld. Het bekomen aantal spermatozoa (S) wordt vermenigvuldigd met 3 (3S). Hiervan wordt 10% berekend (3S x 0,1) dat bij het totaal wordt opgeteld (3S + [3S x 0,1]). Tenslotte wordt dit eindgetal nog eens gedeeld door 10 en dit geeft de concentratie zaadcellen weer, uitgedrukt in miljoenen per milliliter. De concentratie in het ejaculaat kan variëren van 4 miljoen tot 400 miljoen zaadcellen/ml (Johnston, 2001; Threlfall, 2003).

Figuur 3. Het gebruik van een hemacytometer voor de bepaling van de concentratie spermatozoa in het ejaculaat. Wanneer spermatozoa zich op de rand van een (groot) vierkant bevinden, worden slechts deze geteld aan de rechter zijde of de bodem van het vierkant (Uit: Threlfall, 2003).

Het aantal zaadcellen per ejaculaat zal berekend worden door het aantal zaadcellen per milliliter te vermenigvuldigen met het volume sperma dat is opgevangen (Olson, 1992; Freshman, 2002; Feldman en Nelson, 2004). Het aantal spermacellen in een ejaculaat kan variëren tussen 200 miljoen en meer dan een biljoen (Feldman en Nelson, 2004). De leeftijd van de reu, de frequentie van ejaculatie en eventueel het seizoen kunnen een invloed hebben op de hoeveelheid spermacellen per ejaculaat (Freshman, 2002). Bij jonge, oude en honden die het resultaat zijn van inteelt wordt een verminderde concentratie vastgesteld (Wildt et al., 1982). Het aantal spermacellen in het ejaculaat zal tevens variëren tussen de verschillende rassen, aangezien de spermaproductie ook afhangt van de testikelgrootte (Olar et al., 1983). Onvoldoende spermacellen in het ejaculaat (oligo- of azoöspermie) kunnen wijzen op een obstructie of aplasie van de epididymis, een dysfunctie van de testikels of een onvolledige ejaculatie. Dit laatste kan optreden ten gevolge van onvoldoende seksuele stimulatie (onder andere bij afwezigheid van een teaser teef), stress en pijn (Martinez, 2004). Een onderscheid kan gemaakt worden door het bepalen van de concentratie alkalische fosfatase (ALP) in het sperma. Alkalische fosfatase wordt

8

geproduceerd door de epidydimis en de concentratie in normale spermastalen liggen tussen 5000 en 40.000 U/l. Indien de concentratie ALP < 5000 U/l is, wijst dit op een (bilaterale) obstructie van de epididymis of een onvolledige ejaculatie (Johnston, 1991).

2.2.3 Morfologie De vorm van de spermatozoa is een belangrijke parameter, want deze beïnvloedt de motiliteit (Threlfall, 2003). Bij fertiele reuen moet 70-80% van de spermatozoa in het ejaculaat morfologisch normaal en levensvatbaar zijn (Johnston, 1991). De morfologie kan onderzocht worden aan de hand van kleuringen of fasecontrast microscopie. Normale spermatozoa hebben een acrosoom (kapvormige structuur), een kop, een nek, een middenstuk en een staart (Figuur 4). De acrosomale kap bedekt grotendeels de kop en het middenstuk moet ongeveer 1,5 keer groter zijn dan de kop (Feldman en Nelson, 2004). Om de morfologie van zaadcellen te bestuderen, kunnen verschillende kleuringen worden aangewend zoals eosine-nigrosine, Giemsa-Wright en Spermac®. Zodra een gekleurd draagglaasje droog is, moet het met immersie-olie microscopisch onderzocht worden (1000x vergroting) (Johnston, 1991; Johnston, 2001). De eosine-nigrosine kleuring wordt vaak aangewend en zal zaadcellen aflijnen in plaats van ze rechtstreeks te kleuren (Feldman en Nelson, 2004). Eerst wordt een druppel sperma op een draagglaasje aangebracht en nadien een druppel eosine-nigrosine. Vervolgens wordt met een tweede draagglaasje de twee druppels gemengd en daarna uitgestreken onder een hoek van 45°. De suspensie die nu op het tweede draagglaasje aanwezig is, zal ook nog eens worden uitgestreken over een derde draagglaasje (cfr. bloeduitstrijkjes) (Johnston, 2001; Threlfall, 2003). Een andere kleuringtechniek is de Giemsa-Wright kleuring (Diff-Quick), deze gaat het acrosoom echter niet kleuren. Nadat een druppel sperma op een draagglaasje is opgedroogd, wordt deze met drie verschillende oplossingen gekleurd: hetzij door het preparaat gedurende 5 minuten in elke oplossing te onderdompelen, hetzij door het preparaat enkele malen te dippen in de oplossingen (in de eerste twee oplossingen 7 tot 10 keer en in de derde oplossing 10 tot 15 keer) (Johnston, 1991; Johnston, 2001). Spermac® is een kleuring waarbij de morfologie van het acrosoom duidelijk kan bestudeerd worden, maar het geeft echter geen differentiatie tussen levende en dode spermatozoa. Deze kleuring kan aangewend worden op verdund sperma, er treedt namelijk geen interferentie op met de bestanddelen van een verdunner (eidooier, serum of melk). Na deze kleuring ziet de nucleus rood; het acrosoom, het middenstuk en de staart groen; het midden van het acrosoom licht groen (Oettlé en Soley, 1988; Oettlé, 1995). Een nadeel van bovenstaande kleuringtechnieken is dat ze mogelijks zelf abnormaliteiten bij de spermatozoa kunnen induceren (Martinez, 2004).

9

Figuur 4. Normale spermacel bij de hond (Uit: Feldman en Nelson, 2004).

De morfologie kan echter ook bestudeerd worden via fasecontrast microscopie, zonder voorafgaande kleuring. Hierbij wordt een druppel vers sperma op een draagglaasje aangebracht en bedekt met een dekglaasje zodat het sperma zich zal verspreiden tot een film. Vervolgens wordt dit met een fasecontrastmicroscoop onderzocht (Feldman en Nelson, 2004). Er worden 100 levende zaadcellen geteld die op basis van hun morfologie onderverdeeld worden in verschillende categorieën: normaal, primaire abnormaliteiten, secundaire abnormaliteiten (Figuur 5 a/b en figuur 6 a/b). Een onderverdeling in kleine defecten (niet geassocieerd met fertiliteit) en grote defecten (negatieve correlatie met fertiliteit) is ook mogelijk (Oettlé en Soley, 1988). Defecten aan de aanhechting van het middenstuk, proximale cytoplasmadruppels en microcefale spermatozoa zijn geassocieerd met infertiliteit (Johnston, 2001). Primaire abnormaliteiten ontstaan tijdens de spermatogenese in de testis: abnormale spermakop, krom middenstuk, dubbele koppen, dubbele staarten. Secundaire abnormaliteiten ontstaan tijdens de rijping in de epidydimis, zoals proximale en distale cytoplasmadruppels. Tertiare defecten zijn artefacten die aanwezig zijn tijdens het maken van het preparaat. Primaire abnormaliteiten zouden een slechtere prognose hebben dan secundaire abnormaliteiten (Oettlé en Soley, 1988; Johnston, 1991; Threlfall, 2003). Normale sperma stalen vertonen < 10% primaire abnormaliteiten en < 20% secundaire abnormaliteiten. Zoals hoger vermeld, moet het aantal morfologisch normale spermatozoa minimum 80% zijn (Feldman en Nelson, 2004). Bij de telling van abnormale spermatozoa mogen de losse staarten niet meegeteld worden, echter wel de losse koppen (Feldman en Nelson, 2004). Deze verschillende abnormaliteiten kunnen veroorzaakt worden door: hittestress ten gevolge van een lokale ontstekingsreactie of hyperthermie, infecties van het geslachtsstelsel, een verminderde secretie van het luteïniserend hormoon en testosteron, stress (verhoogde secretie van corticosteroïden) (Martinez, 2004).

10

a)

b)

Figuur 5 a) normaal sperma, 5 b) gekrulde staarten. Diff- Quick kleuring (Uit: Gradil et al., 2006).

a)

b)

Figuur 6 a) normaal sperma, 6 b) krom middenstuk. Fasecontrast (Uit: Gradil et al., 2006).

Er bestaan ook CASA systemen die het percentage morfologisch normale zaadcellen bij hondensperma kunnen bepalen (zie 2.5). Echter, uit een onderzoek is gebleken dat er een sterke correlatie is tussen een subjectieve evaluatie en CASA systemen (Rijsselaere et al., 2004).

2.2.4 De membraanintegriteit De membraanintegriteit is van belang voor de fertilisatie capaciteit van de spermatozoa (Rijsselaere et al., 2005).

2.2.4.1 Vitale kleuringen Vroeger werd een eosine-nigrosine kleuring gebruikt om na te gaan of de membranen intact zijn. Het grote probleem met deze techniek is dat sommige spermatozoa slechts deels aankleuren, wat de interpretatie bemoeilijkt (Rijsselaere et al., 2005). Ook zal deze kleuring niet geschikt zijn voor sperma dat ingevroren geweest is, er treedt namelijk interferentie op met bestanddelen van een verdunner (glycerol, eidooier) (Martinez, 2004). Betere alternatieven om de membraanintegriteit te evalueren zijn een hypo-osmotische zwellingstest of fluorescente kleuringen. Microscopisch wordt eerst een levend/dood verhouding opgesteld en van de levende zaadcellen wordt vervolgens de morfologie bepaald. Na kleuring met eosine-nigrosine zullen levende spermatozoa met intacte plasma membranen wit zijn, terwijl spermatozoa met beschadigde plasma membranen eosine opnemen en rood aankleuren (Martinez, 2004) (Figuur 7). Deze spermatozoa hebben aldus een beschadigde membraan, zijn niet-functioneel of dood (Root Kustritz, 2007). Er moeten minimaal 90% levende zaadcellen aanwezig zijn in het sperma van een fertiele reu (Van Soom, 2010).

11

Figuur 7. Levende en dode zaadcel. Eosine-nigrosine kleuring (Uit: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/ reprod/semeneval/morph.html).

2.2.4.2 Hypo-osmotische zwellingstest (HOS-test) Bij deze test worden de spermatozoa onderworpen aan een hypo-osmotisch milieu (fructose, sucrose of natrium citraat). Normaal is watertransport doorheen de membraan mogelijk waarbij de staart van de spermatozoa gaat opzwellen (krulling van de staart). Indien dit niet plaatsvindt, is de membraan niet meer intact. Volgens Kumi-Diaka (1993) is bij de reu de hypo-osmotische zwelling positief gecorreleerd met de spermamotiliteit, daarentegen tonen England en Plummer (1993) echter helemaal geen verband aan. Alvorens deze test uit te voeren, moet het percentage gekrulde staarten berekend worden. Door dit initiële aantal af te trekken van het percentage gekrulde staarten bekomen na de HOS-test, krijgen we het werkelijke aantal spermatozoa met intacte membranen (WHO, 1999).

2.2.4.3 Fluorescente kleuringen Fluorescente kleuringen kunnen worden aangewend om meerdere karakteristieken te evalueren: membraanintegriteit, acrosomale reactie, capacitatie, mitochrondriale functie, aantal levende en dode cellen en DNA-integriteit (Martinez, 2004). In combinatie met deze kleuringen kan er gebruik gemaakt worden van een fluorescente microscoop of flowcytometrie. Flowcytometrie biedt het voordeel dat meerdere karakteristieken tegelijkertijd objectief kunnen beoordeeld worden waardoor duizenden cellen in enkele seconden worden geanalyseerd. Fluorescentie microscopie is subjectiever en vraagt meer tijd omdat er telkens maar een beperkt aantal cellen kan geëvalueerd worden (Peña, 1998). De membraanintegriteit kan beoordeeld worden met carboxyfluoresceïne diacetaat (CFDA) in combinatie met propidium jood (PI). CFDA is een niet fluorescent bestanddeel dat na penetratie doorheen het membraan

zal

worden

omgezet

tot

carboxyfluoresceïne

door

intracellulaire

esterases.

Carboxyfluoresceïne is een sterk fluorescente, groene fluorofoor die niet meer doorheen het membraan kan penetreren en dus intracellulair aanwezig blijft in spermatozoa met intacte membranen. Het rode fluorescente PI kleurt het DNA van cellen die dood zijn of beschadigde membranen hebben. Met deze fluorescente kleuring kunnen drie populaties cellen onderscheiden worden (Peña, 1998): -

spermacellen met een intacte membraan kleuren groen

-

spermatozoa met beschadigde plasma membranen maar met intacte acrosomen, hebben rode nucleï en groene acrosomen

-

dode of gedegenereerde spermatozoa vertonen rode nucleï

12

Er zijn meerdere voordelen bij het gebruik van fluorescente kleuringtechnieken: een groot aantal spermatozoa wordt op een korte tijd geanalyseerd, er treedt geen interferentie op met vetpartikels, glycerol of eidooier (waardoor deze techniek ideaal is voor sperma dat ingevroren is geweest) en er wordt een duidelijke differentiatie gemaakt tussen levende, dode en stervende spermatozoa (eosinenigrosine maakt enkel onderscheid tussen levend en dood) (Rijsselaere et al., 2005).

2.2.5 Cytologie Het is belangrijk na te gaan of er celtypes aanwezig zijn in het ejaculaat die een negatieve impact kunnen hebben op de spermatozoa. Abnormale cellen in het ejaculaat zijn epitheliale cellen van de prostaat of urethra, rode bloedcellen en ontstekingscellen. Van deze cellen moet er dan ook een kwantitatieve analyse gebeuren (Threlfall, 2003; Root Kustritz, 2007). Cytologie wordt het best uitgevoerd op een (onverdund) gecentrifugeerd staal zodat van het sediment een uitstrijkje kan gemaakt worden (Stockner en Bardwick, 1991). Deze uitstrijkjes kunnen vervolgens gekleurd worden met een Giemsa-Wright kleuring. Het is normaal dat bij cytologisch onderzoek enkele witte bloedcellen, bacteriën en epitheliale cellen terug te vinden zijn ten gevolge van urethrale contaminatie van het ejaculaat (Feldman en Nelson, 2004). Bij een fertiele reu mogen er maximum 2000 witte bloedcellen/µl of 2 tot 4 witte bloedcellen in het gezichtsveld van de microscoop (maximale vergroting) aanwezig zijn in de eerste en twee fractie van het ejaculaat. Voor wat betreft de epitheliale cellen, mogen maximum 10 tot 20 cellen aanwezig zijn per gezichtsveld (Stockner en Bardwick, 1991). Hoge concentraties neutrofielen en intracellulaire bacteriën wijzen op een infectie, maar hun afwezigheid geeft echter geen klinische betekenis. Wanneer hoge concentraties rode bloedcellen in het ejaculaat worden aangetroffen, kan dit wijzen op een prostaat aandoening of een bloeding van de penis of preputium. (Feldman en Nelson, 2004).

2.3 De pH van het ejaculaat Bij een routine onderzoek wordt soms ook de pH van het ejaculaat bepaald. Deze zal verschillend zijn voor de drie fracties. Omdat het niet altijd mogelijk is deze fracties volledig van elkaar te scheiden, zal de pH van elke fractie ook niet steeds nauwkeurig te bepalen zijn (Hendrikse, 1984). De pH-bepaling wordt uitgevoerd met behulp van een pH teststrip waarop een druppel sperma van de tweede (en derde) fractie wordt aangebracht (Freshman, 2002). De pH-waarde van hondensperma kan tussen 6,3 en 6,7 variëren, maar hierover bestaat nog enige controverse (Johnston, 1991). Een afwijkende pH kan optreden bij een bacteriële infectie of een ontsteking van de testis, epididymis of prostaat. De pHbepaling kan ook helpen bij de selectie van een antibioticum. Honden met een zuur sperma zouden namelijk beter reageren op basische antibiotica (Johnston, 1991; Freshman, 2002).

2.4 Bacteriologie en cultuur Wanneer ontstekingscellen worden aangetroffen op cytologie van het sperma of er een vermoeden is van een bacteriële orchitis, epididymitis of prostatitis moet een bacteriologisch cultuur uitgevoerd worden. Om contaminatie van het spermastaal te beperken, moeten specifieke maatregelen

13

gehandhaafd worden alvorens sperma op te vangen (Feldman en Nelson, 2004): de hond moet bij voorkeur reeds geürineerd hebben, preputiale uitvloei moet verwijderd worden, het preputium en de penis moeten gereinigd worden met steriele sponzen. De eerste fractie en enkele druppels van de tweede fractie worden nog niet opgevangen. Nadien wordt de rest van het ejaculaat opgevangen met steriel materiaal. Aangezien sperma niet steriel is en contact maakt met mucosa van de penis en preputium, kan een positieve bacteriële cultuur ook optreden bij normale honden (Feldman en Nelson, 2004). In de meeste gevallen zullen de geïsoleerde organismes deel uit maken van de normale flora van de urethra, met uitzondering van Brucella canis. De urethrale flora bestaat onder andere uit Staphylococcus sp., Streptococcus sp., E. Coli, Pseudomonas sp. en mycoplasma (Johnston, 1991). Mycoplasma zal echter pas problemen veroorzaken wanneer het in grote hoeveelheden aanwezig is. Kwantitatieve culturen en cytologie kunnen hulp bieden bij de differentiatie tussen een contaminatie of een ernstige infectie. Eventueel kan ook een cultuur genomen worden van de distale urethra om de verschillende flora te vergelijken. Een infectie wordt vermoed bij >10.000 kolonie-vormende eenheden (CFU/ml), bij de groei van één type organisme en bij de aanwezigheid van ontstekingscellen op cytologie. Omdat de meeste infecties van het geslachtstelsel veroorzaakt worden door aërobe bacteriën, moet ook altijd een aërobe cultuur aangevraagd worden (Feldman en Nelson, 2004).

2.5 Computer geassisteerde sperma-analyse (CASA) Een beoordeling van de spermakwaliteit gebeurde vroeger uitsluitend op basis van microscopische technieken zoals motiliteit, concentratie en morfologische abnormaliteiten. Het gebruik van subjectieve lichtmicroscopie zorgt tevens voor veel variatie tussen verschillende laboratoria in de interpretatie van eenzelfde spermastaal (Iguer-Ouada, 2001a en 2001b; Rijsselaere, 2004). Als oplossing voor deze variaties en subjectiviteit heeft Günzel-Apel et al. in 1993 voor het eerst het gebruik van CASA systemen beschreven bij de hond. Bij de mens werden deze systemen al reeds gebruikt in vruchtbaarheidscentra om de spermakwaliteit te evalueren. Zowel in de humane als in de diergeneeskunde is het nog onduidelijk in hoeverre de spermakwaliteit een accurate beoordeling geeft van de in vivo fertiliteit (Iguer-Ouada, 2001a). Computer geassisteerde sperma-analyse systemen evalueren spermatozoa individueel en geven objectieve, gedetailleerde informatie over verschillende parameters. Deze systemen geven gedetailleerde informatie die nooit verkregen zou kunnen worden met de conventionele lichtmicroscoop (Rijsselaere et al., 2005). Vóór het gebruik van CASA systemen moeten enkele technische parameters gestandaardiseerd worden aangezien zij in sterke mate de resultaten kunnen beïnvloeden. Een aantal voorbeelden hiervan zijn: de temperatuur, het type verdunner, het interval tussen staalname en analyse, het type telkamer, de manier waarop het spermastaal voorbereid wordt voor CASA (Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et al., 2005). Pas wanneer deze parameters gestandaardiseerd zijn, zullen de CASA systemen een grote precisie en herhaalbaarheid kunnen vertonen (Rijsselaere et al., 2004). Naast de nood voor standaardisatie en optimalisatie is de hoge kostprijs ook een reden waarom CASA systemen nog niet zo vaak in de praktijk worden aangewend door dierenartsen (Verstegen, 2002).

14

2.5.1 Motiliteit De Hamilton-Thorne analyser is een CASA systeem dat door Iguer-Ouada en Verstegen (2001 a en b) onderzocht en gevalideerd werd voor sperma-onderzoek bij de reu. Bij CASA kunnen meerdere parameters van de motiliteit bepaald worden: totale en progressieve motiliteit, trage, middelmatig snel, snel bewegende spermatozoa, de lineariteit van de beweging, de amplitude van de laterale verplaatsing die de spermakop maakt bij elke beweging en de snelheid (Iguer-Ouada, 2001a; Verstegen, 2002). Uit studies is gebleken dat er weinig variatie is met de resultaten gevonden via lichtmicroscopisch onderzoek. Er bestaat dus een goede correlatie tussen de subjectieve en objectieve technieken om spermamotilteit te evalueren. Ondanks deze goede correlatie zullen subjectieve technieken echter onderhevig zijn aan vele factoren waarbij onder andere de ervaring van de onderzoeker een groot deel uitmaakt (Verstegen, 2002). Er bestaan ook semi-geautomatiseerde systemen die financieel voordeliger zijn en zowel vers als ingevroren sperma kunnen analyseren, onder andere de Sperm Quality Analyzer (SQA). Deze detecteert fluctuaties in de optische densiteit aan de hand van een lichtstraal die doorheen het spermastaal passeert. De SQA converteert vervolgens deze informatie tot een kwantitatieve parameter, namelijk de spermamotiliteit index (SMI). De SMI zou de kwaliteit van het spermastaal weergeven, rekening houdend met de concentratie, progressieve motiliteit en het percentage spermatozoa met een normale morfologie (Iguer-Ouada en Verstegen, 2001b)

2.5.2 Morfologie en morfometrie Met deze CASA systemen kan ook de morfologie en morfometrie van het spermastaal beoordeeld worden. Deze geautomatiseerde sperma morfometrische analyses (ASMA) detecteren subtiele veranderingen in de morfologie en morfometrie die niet gezien kunnen worden door middel van lichtmicroscopie. Er is nog maar weinig informatie gekend over het gebruik van ASMA systemen bij honden (Dahlbom et al., 1996; Rijsselaere et al., 2004). Een voorbeeld van dergelijk systeem is een Hamilton-Thorne (HTR) analyser waarin Oval Head Morhpology software (Metrix) is geïmplementeerd. Dit geeft zeer gedetailleerde informatie over de kop van spermatozoa (lengte, breedte, oppervlakte…), de lengte en afwijkingen van de staart (gebogen, gekruld, afwezig). Ook hier is er uit onderzoek gebleken dat er een goede correlatie bestaat tussen lichtmicroscopie en de HTR-Metrix (Rijsselaere et al., 2005).

2.5.3 Concentratie Een accurate beoordeling van de concentratie door middel van CASA systemen gaat nog frequent gepaard met problemen. Er is namelijk sprake van een overschatting van de concentratie (Verstegen et al., 2002). In een studie van Iguer-Ouada en Verstegen (2001a) werd de berekende concentratie vergeleken tussen CASA systemen en microsopisch onderzoek. Hieruit bleek dat CASA de concentratie 1,7 keer heeft overschat. Deze overschatting zou te wijten zijn aan de vele botsingen die spermacellen met elkaar maken en zo een vertekend beeld geven. Dit probleem kan opgelost worden door het staal te verdunnen met een 9% NaCl-oplossing. Echter, dit geeft niet altijd goede resultaten.

15

Zo is er sprake van een toegenomen variatie in de resultaten en een daling van de accuraatheid bij een spermaconcentratie lager dan 20 à 50 miljoen/ml. Tevens zou een verdunning de motiliteit kunnen beïnvloeden waardoor het dus aangeraden is de motiliteit eerst te bepalen op een niet verdund staal (Verstegen et al., 2002). Zolang de technologie van CASA nog niet verder ontwikkeld is, moet de berekende concentratie (voornamelijk bij een concentratie < 20 à 50 miljoen/ml) steeds manueel gecheckt worden (IguerOuada en Verstegen, 2001a).

3. Interpretatie van de spermakwaliteit Om een idee te krijgen over de fertiliteit van een reu is niet alleen een sperma-onderzoek noodzakelijk, maar ook een grondige anamnese (ziekte, trauma, medicatie, vorige nesten) en een klinisch onderzoek (Larsen, 1980). Na het sperma-onderzoek zal geen enkele parameter op zichzelf een accurate beoordeling kunnen geven van de in vivo fertiliteit. De parameters die wellicht de grootste invloed hebben op de fertiliteit zijn het totaal aantal zaadcellen in het ejaculaat, de progressieve motiliteit en de morfologie. Wanneer de minimale vereisten voor deze parameters overschreden zijn, kan aangenomen worden dat de reu fertiel is. Echter, dit geeft slechts een indicatie en geen definitief uitsluitsel. Omgekeerd zullen reuen ook niet noodzakelijk subfertiel zijn indien de minimale vereisten niet bereikt zijn (Feldman en Nelson, 2004). Er is namelijk gebleken dat reuen met een progressieve motiliteit < 10%, een normale morfologie < 9% en minder dan 36 miljoen zaadcellen in het ejaculaat toch fertiel kunnen zijn (England, 1989). Herhaaldelijke azoöspermie (geen sperma in het ejaculaat) of necrospermie (dood sperma in het ejaculaat) zijn de enige kenmerken die een diagnose kunnen geven van infertiliteit bij de reu. Hiervoor is het noodzakelijk de reu gedurende 6 maanden op te volgen aangezien één sperma-onderzoek geen definitieve conclusie geeft over de spermatogenese. Tevens zal ook de alkalische fosfatase bepaald moeten worden (Johnston, 2001; Feldman en Nelson, 2004).

16

III. Case bespreking en discussie Anamnese Op 11 april 2008 is de eigenaar van een Duitse Herder naar de dienst voortplanting, verloskunde en bedrijfsdiergeneeskunde gekomen op de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke om een spermaonderzoek uit te laten voeren van zijn reu. De Duitse Herder is een intacte reu van 1 jaar en 6 maand oud (geboortedatum: 20 october 2006) en weegt 32kg. Hij heet Bardy de l’Alda en zijn identificatienummer is 2FAJ681 (tatoeage). De reu heeft een medische voorgeschiedenis. Hij heeft in september 2007 en april 2008 een injectie gekregen met Laurabolin®. Dit is een androgeen steroïde (nandrolone laureaat) dat kan toegediend worden bij chronische nierinsufficiëntie, maar ook om spiermassa op te bouwen. In het verleden heeft de reu reeds drie teven telkens tweemaal gedekt. Daarvan is slechts één teef drachtig geworden van 5 pups en op 15 mei 2007 bevallen. De twee andere teven zijn in januari 2008 gedekt. Bij de laatste teef heeft geen koppeling plaatsgevonden. De cyclus van de teven is telkens door de eigenaar opgevolgd aan de hand van progesteron bepaling. Er is reeds sperma-onderzoek uitgevoerd bij de eigen dierenarts. De morfologie, motiliteit en concentratie vertoonde echter geen afwijkingen.

Diagnostisch plan Diezelfde dag is op de dienst voortplanting, verloskunde en bedrijfsdiergeneeskunde sperma afgenomen (met een niet-loopse teef). Op klinisch onderzoek waren er geen afwijkingen van geslachtsorganen op te merken. Bij de sperma-afname zijn enkele druppels voorvocht opgevangen en is de collectie stopgezet zodra prostaatvocht (derde fractie) werd geëjaculeerd. Het totaal opgevangen volume was 3 ml en was grijswit van uitzicht. Vervolgens is het microscopisch sperma-onderzoek uitgevoerd met volgende resultaten: -

Motiliteit (CASA)  totale motiliteit= 65%  progressieve motilieit= 55%

-

Morfologie (eosine- nigrosine)  levend/ dood verhouding= 95/5  % normale zaadcellen= 30  % abnormale kop= 2  % abnormale staart= 42  % proximale protoplasmadruppel= 4 

-

% distale protoplasmadruppel= 22

Concentratie (Bürkerse telkamer)  500 miljoen zaadcellen/ml  1500 miljoen zaadcellen/ejaculaat

17

-

Acrosoom reactie (Fluorescente PSA- kleuring)  84% vertoont een intacte acrosoom  16% vertoont een beschadigd of gereageerd acrosoom

Discussie Uit de resultaten van het sperma-onderzoek van Bardy de l’Alda kan geconcludeerd worden dat het percentage normale zaadcellen veel te laag is en de motiliteit van de zaadcellen ook wat te laag is (Tabel 1 en 2). Het percentage normale zaadcellen is namelijk 30% in plaats van normaal 70-80% bij fertiele reuen (Johnston, 2001). De levend/dood verhouding ligt echter wel binnen de normen (het aantal levende zaadcellen moet hoger zijn dan 90%) (Van Soom, 2010). Wat betreft de morfologisch abnormale zaadcellen, lijkt het percentage secundaire abnormaliteiten boven de norm te liggen (> 20%) met 22% zaadcellen die een distale protoplasmadruppel hebben (Feldman en Nelson, 2004). Zowel het percentage totale motiliteit als progressieve motiliteit ligt wat te laag (respectievelijk 65% in plaats van minimaal 80% en 55% in plaats van minimaal 70%) (Johnston, 2001; Van Soom, 2010). De concentratie zaadcellen is wel goed (Johnston, 2001; Threlfall, 2003; Feldman en Nelson, 2004). Ook blijkt uit de fluorescente kleuring dat het merendeel van de zaadcellen een intacte acrosoom hebben en aldus nog in staat zijn tot acrosoomreactie in de vrouwelijke genitaaltractus (Rijsselaere et al., 2005).

Tabel 1. Spermakwaliteitsparameters bij een normale reu.

Parameter

Normaalwaarde

Eerste fractie

0,5 - 5 ml, waterhelder

Tweede fractie

0,1 - 5 ml, melk- tot roomachtig

Derde fractie

20 - 30 ml, waterhelder

Totaal ejaculaat volume

2,5 tot > 80 ml

Percentage totale motilitiet

70 - 80%

Percentage progressieve motiliteit

70 - 90%

Totaal aantal spermatozoa in het ejaculaat

minimum 200 miljoen

Spermaconcentratie

4 tot 400 miljoen spermatozoa/ml

Percentage normale morfologie

minimum 80%

pH

6,3 - 6,7

Aantal WBC/hpf

2 tot 4 WBC/hpf

Aantal epitheliale cellen/hpf

10 tot 20 epitheliale cellen/hpf

Aantal bacteriën/ml

< 10.000 bacteriën/ml

18

Het is belangrijk dat de waargenomen resultaten geëvalueerd worden in hun context. Een verminderde spermakwaliteit kan bijvoorbeeld gezien worden bij oudere reuen of bij honden die enige tijd niet meer geëjaculeerd hebben. In deze case hebben we echter te maken met een jonge hond waarvan het sperma nog van goede kwaliteit zou moeten zijn. Bij afwijkingen in het sperma-onderzoek moet ook rekening gehouden worden of de sperma-afname correct is uitgevoerd en het staal nadien voorzichtig gehanteerd is (Root Kustritz, 2007). Wellicht zijn de afwijkingen in deze case te wijten aan de Laurabolin® injecties. Het actieve bestanddeel van Laurabolin® is het anabole steroïde nandrolone laureaat, wat een synthetisch testosteronpreparaat is. Deze veroorzaakt een negatieve feedback op de hypothalamus-hypofyse as en zal zo de secretie van het luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) onderdrukken (Karbalay-Doust et al., 2007). Er is ook sprake dat anabole steroïden lokaal ter hoogte van de testis een suppressief effect zouden uitoefenen op androgenen (Clark et al., 1997). Er zal minder testosteron geproduceerd worden met als gevolg testikel-atrofie en een verstoorde spermatogenese. Dit laatste zal leiden tot een daling van de spermaconcentratie en -motiliteit en aldus een verminderde spermakwaliteit (Clark et al., 1997; Karbalay-Doust et al., 2007). Er heerst nog enige controverse over het feit of het onderdrukkend effect van anabole steroïden reversiebel is. Uit een studie op mannelijke ratten bleek dat de spermakwaliteit verbeterde 14 weken na een injectie met nandrolone. Ondanks het feit dat de spermaconcentratie en -motiliteit wel stegen, bereikten ze niet de normaalwaarden (Karbalay-Doust et al., 2007). Als therapie wordt bij deze reu bijgevolg aangeraden om met de Laurabolin® injecties te stoppen. Aanvullend is ook aangeraden om bij toekomstige dekkingen (of kunstmatige inseminaties) 1 of 2 extra dekkingen (of inseminaties) uit te voeren ter compensatie van de verminderde spermakwaliteit. Tabel 2. Vergelijking spermakwaliteitsparameters van Bardy de l’Alda met de normaalwaarden.

Parameter

Normaalwaarde

Bardy de l’Alda

Volume tweede fractie

0,1 - 5 ml

3 ml

Percentage totale motiliteit

70 - 80%

65%

Percentage progressieve motiliteit

70 - 90%

55%

Totaal aantal spermatozoa in het

minimum 200 miljoen

1500 miljoen

ejaculaat 4 tot 400 miljoen Spermaconcentratie

spermatozoa/ml

500 miljoen/ml

Percentage normale morfologie

minimum 80%

30%

19

IV. Literatuurlijst 1) Althouse G.C., Ko J.C.H., Hopkins S.M., Evans L.E. (1991). Effect of latex and vinyl examinations gloves on canine spermatozoa motility. Journal of American Veterinary Medical Association, 199, 227- 229. 2) Clark A.S., Harrold E.V., Fast A.S. (1997). Anabolic-androgenic steroid on the sexual behavior of intact male rats. Horm. Behav., 31, 35-46. 3) Dahlbom M., Andersson M., Vierula M., Alanko M. (1996). Morphometry of normal and teratozoospermic

canine

sperm

heads

using

an

image

analyzer:

work

in

progress.

Theriogenology, 48, iss 4, 687-698. 4) De Kruif A., Van Soom A., Maes D. (2009). Voortplanting bij het mannelijk dier en KI: het spermaonderzoek. In: Voortplanting van de huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 141-153. 5) Ellington J., Scarlett J., Meyers-Wallen V., et al. (1993). Computer-assisted sperm analysis of canine spermatozoa motility measurements. Theriogenology, 40, 725-733. 6) England G.C.W. (1989). Seminal characteristics and fertility in the dog. Veterinary Record, 125, iss. 15, 399. 7) England G.C.W., Plummer J.M. (1993). Hypo-osmotic swelling of dog spermatozoa. J. Reprod. Fertil. Suppl. 47, 261-270. 8) Farstad W. (2006). Mating and artificial insemination in the dog. In: Simpson G.M., Manual of Small animal Reproduction and Neonatology, British Small Animal Veterinary Association, chapter 9, 95-103. 9) Feldman E.C., Nelson R.W. (2004). Clinical and diagnostic evaluation of the male reproductive tract. Canine and feline endocrinology and reproduction, third edition, Saunders, chapter 27, 930952. 10) Freshman J.L. (2002). Semen collection and evaluation. Clinical techniques in Small Animal Practice, 117, no. 3, 104-107. 11) Gradil C.M., Yeager A., Concannon P.W. (2006). Assessment of Reproductive Problems in the Male Dog. In: Concannon P.W., England G., Verstegen III J., Linde-Forsberg C. (editors). Recent Advances in Small Animal Reproduction, International Veterinary Information Service, Ithaca NY. Internetreferentie: http://www.ivis.org 12) Günzel-Apel A.R., Gunther C., Terhaer P., Bader H. (1993). Computer-assisted analysis of motility, velocity and linearity of dog spermatozoa. J. Reprod. Fertil., 47 (suppl.), 271-278. 13) Hendrikse J. (1984). Een literatuuroverzicht van het verzamelen en beoordelen van reuesperma. Tijdschr. Diergeneesk., 109, deel 5, 175-179. 14) Iguer-Ouada M., Verstegen J.P. (2001a). Evaluation of het “Hamilton Thorn computer-based automated system” for dog semen analyses. Theriogenology, 55, 733-749. 15) Iguer-Ouada M., Verstegen J.P. (2001b). Validation of the sperm quality analyzer (SQA) for dog sperm analysis. Theriogenology, 55, 1143- 1158. 16) Johnston S.D. (1991). Performing a complete canine semen evaluation in a small animal hospital. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 21, no. 3, 545-551.

20

17) Johnston S.D. (1997). Physiology of spermatogenesis in the dog: An historical and clinical perspective. In: Proceedings of Canine Male Reproduction Symposium. Montreal, Canada, American college of Theriogenology and Society for Theriogenology, 19-35. 18) Johnston S.D., Kustritz M.V.R., Olson P.N.S. (2001). Semen collection, evaluation and preservation. In: Canine and feline theriogenology. Philadephia, W.B. Saunders, 287-306. 19) Karbalay-Doust S., Noorafshan A., Ardekani F.M., Mirkhani H. (2007). The reversibility of sperm quality after discontinuing nandrolone decanoate in adult male rats. Asian Journal of Andrology, 9, iss 2, 235-239. 20) Kumi-Diaka J. (1993). Subjecting canine semen to the hypo-osmotic test. Theriogenology 39, 1279-1289. 21) Kutzler M.A. (2005). Semen collection in the dog. Theriogenology, 64, 747-754. 22) Larsen R.E. (1980). Infertility in the male dog. In: Morrow D.A., Current Veterinary Therapy in theriogenology: diagnosis, treatment and prevention of reproductive diseases in animals. W.B. Saunders Company, 646- 651. 23) Martinez A.I.P. (2004). Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science, 82-83, 209-224. 24) Oettlé E.E., Soley J.T. (1988). Sperm abnormalities in the dog: a light and electron microscopic study. Vet. Met. Rev., 59, 28-70. 25) Oettlé E.E. (1995). Sperm abnormalities and fertility in the dog. In: Bonagura J.D., Kirk R.W. (editors): Kirk’s current veterinary therapy XII. Philadephia. W.B. Saunders Company, 1060. 26) Olar T.T., Amann R.P., Pickett B.W. (1983). Relationship among testicular size, daily production and output of spermatozoa, and extragonadal spermatozoa reserves of the dog. Biology of Reproduction 29, 1114-1120. 27) Olson P.N. (1992). Collection and evaluation of canine semen. Kirk’s current veterinary therapy XI: Small animal practice. W.B. Saunders company, 938-943. 28) Peña A.I., Quintela L.A., Herradón P.G. (1998). Viability assessment of dog spermatozoa using flow cytometry. Theriogenology, 50, 1211- 1220. 29) Rijsselaere T., Van Soom A., Hoflack G., Maes D., de Kruif A. (2004). Automated sperm morphometrie and morfologie analysis of canine semen by the Hamilton-Thorne analyser. Theriogenology, 62, 1292-1306. 30) Rijsselaere T., Van Soom A., Tanghe S., et al. (2005). New techniques for the assessment of canine semen quality: a review. Theriogenology, 64, 706-719. 31) Root Kustritz M.V. (2007). The value of canine semen evaluation for practitioners. Theriogenology, 68, 329-337. 32) Stockner P.K en Bardwick C. (1991). The relationship of semen parameters to fertility in the dog. Canine practice, 16, 15-23. 33) Threlfall W.R. (2003). Semen collection and evaluation. In: Root Kustritz M.V. (editor): The practical veterinarian: small animal theriogenology. St. Louis, Butterworth-Heineman, 97-123. 34) Van Soom A. (2010). Fysiologie van de reu. In: Aanvullingen in de voorplanting en verloskunde van gezelschapsdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, hoofdstuk 8, pagina 13.

21

35) Verstegen J., Iguer-Ouada M., Onclin K. (2002). Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 57, 148-179. 36) Wildt D.E., Baas E.J., Chakraborty P.K., Wolfe T.L., Stewart A.P. (1982). Influence of inbreeding on reproductive performance, ejaculate quality and testicular volume in the dog. Theriogenology 17, 445-452. 37) World Health Organization (WHO) (1999). WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm- cervical mucus interaction. New York: Cambridge University Press.

22

V. Bijlage Bijlage 1. Voorbeeld van een spermaverslag bij de hond (Uit: Feldman en Nelson, 2004).