Devyser AZF. Návod k použití

Devyser AZF Kat.č. 8-A019

Pro in vitro diagnostiku

Návod k použití

Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 © Devyser AB 2009-2012

Strana 1 z 20


Strana 2 z 20

Obsah

Strana

1. Seznámení se systémem Devyser AZF

4

2. Upozornění

5

3. Symboly použité na štítcích

6

4. Požadovaný materiál

7

4.1 Obsaženo v soupravě

7

4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě

8

5. Skladování a nakládání se soupravou

9

6. Požadavky na vzorek

9

7. Návod k použití

10

7.1 Postup zpracování Devyser AZF kit (Art # 8-A019)

10

7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR

11

7.3 Detekce

13

8. Výsledky a analýza

15

9. Limitace požití

19

10. Reference

20

11. Upozornění zákazníkům

20

12. Kontaktní informace

20


Strana 3 z 20

1. Seznámení se systémem Devyser AZF Použití

Souprava Devyser AZF je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu mikrodelecí v oblastech AZFa, AZFb a AZFc chromozomu Y.

Obsah soupravy Postup

Souprava Devyser AZF obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace genetických markerů. DNA extrakce - Souprava Devyser AZF byla validována s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51104) pro extrakci DNA z lidské plné krve. Amplifikace - Souprava Devyser AZF byl validován s použitím přístrojů ABI GeneAmp® Systém 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler a MJ Research/Bio-Rad PTC200 s alpha termoblokem pro 96 jamek. Detekce Genetické analyzátory Applied Biosystems (ABI PRISM® 310, 3100, 3130, 3500, 3730) podporující detekci 6-FAM. MegaBACE systémy podporující detekci 6-FAM.

Princip metody

Diagnostické testování pomocí soupravy Devyser® AZF je založeno na PCR amplifikaci STS (sekvenčně specifická místa) oblastí chromozomu Y AZFa, AZFb a AZFc . Úspěšná amplifikace STS markerů indikuje jejich přítomnost, zatímco absence PCR amplikonů znamená jejich deleci. Primery pro celkem 14 markerů jsou namíchány do jediné multiplex PCR reakce. V soupravě jsou přítomny všechny lokusy doporučené EAA (Evropská andrologická akademie) a EMQN (Evropská skupina pro monitoring kvality). Geny ZFX/ZFY jsou použity jako interní kontroly pro PCR amplifikaci, jelikož tyto primery amplifikují specifické fragmeny jak na chromozomu Y (ZFY), tak na chromozomu X (ZFX). Gen SRY je přítomen v testu jako kontrola testis determinujícího faktoru na krátkém raménku chromozomu Y a přítomnosti Yspecifických sekvencí, pokud chybí gen ZFY.


Strana 4 z 20

2. Upozornění A.

Devyser AZF byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µL. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům.

B.

Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry.

C.

Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže.

D.

Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou.

E.

Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky.

F.

Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci. Příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory.

G.

Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem.

H.

Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce.


Strana 5 z 20

3. Symboly použité na štítcích

Šarže

Exspirace

Výrobce

Počet testů

In vitro diagnostický medicínský prostředek

Skladujte při teplotě nižší nebo rovné


Strana 6 z 20

4. Požadovaný materiál 4.1 Obsaženo v soupravě Konfigurace

Devyser AZF obsahuje reagencie pro analýzu maximálně 25 vzorků.

Složky Barva víčka

Barva Zkumavky

Štítek

Katal.č.

Obsah soupravy

Oranžová

Čirá

PCR Activator

4-A018

1x25 testů

Bílá

Hnědavá

Devyser AZF Mix

4-A020

1x25 testů


Strana 7 z 20

4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií

Extrakce DNA

  

Plast pro termocykler



Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry.

 Amplifikace

  

Detekce

Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 500 µL. Nepudrované chirurgické rukavice

Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 5 μL*. Termocykler: ABI GeneAmp® PCR System 9600/9700/2720 nebo Eppendorf Mastercycler nebo MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha blokem. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry.



Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM® 310, 3100, 3130, 3500, 3730).  Metodika je validovaná na polymerech: POP-4, POP-6 a POP-7 Devyser, Size Standard Devyser Dye-Set DEV-5: 560 SIZER ORANGE (Devyser cat.# 8-A402). ABI Prism Size Standard Gene-Scan-500: Dye Set D: Gene-Scan-500 ROX Size Standard (ABI cat.#401734/#4310366). Dye Set G5: Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (ABI cat.#4322682). MegaBACE Size Standard: MegaBACE ET 550-R Size standard

  


Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu (ABI kat.č.4311320). 1x Genetic Analyzer Buffer Pipeta nebo dispenzor a špičkami s filtry pro 1,5 μL, 15 μL.

Strana 8 z 20

Detekce

Souprava pro barevnou kalibraci: ABI 3100, 3730: Pro kalibraci použijte kit DEV-5 Dye Set MultiCap (Devyser cat# 8-A401) v nastavení „Any5Dye“. ABI 3500: Použijte DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) Tvorba matrice u ABI 310: Použijte kit DEV-5 Dye Set SingleCap (Devyser cat# 8-A400). Nastavte modul file na “GS STR POP4 (1 mL) G5.md5” ABI 310/3100/3130/3500/3730: Dye Set D: DS-30 or DS-31 Dye Set G5: DS-33 MegaBACE: 6-FAM značka pro detekci AZF ROX pro detekci velikostního standardu

5. Skladování a nakládání se soupravou A.

Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 oC.

B.

Reakční Master Mix (připravený přídavkem Devyser AZF Mix do PCR Activator) můžete uchovat při +2 až +8ºC minimálně 7 dná a při –18ºC minimálně 90 dní. Vyvarujte se opakovaného zmražování a rozmražování.

C.

Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR.

D.

Nemíchejte reagencie z různých šarží.

6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky

Souprava Devyser AZF je určena pro analýzu lidské genomické DNA.

Postup a skladování

Dle pokynů výrobce.

Kontroly

Doporučuje se použít v pro každou analýzu vhodné kontroly, jako DNA zdravého muže, DNA zdravé ženy a negativní kontrolu (bez DNA), (viz část 8).


Strana 9 z 20

7. Návod k použití Počet vzorků v běhu

Souprava Devyser AZF obsahuje reagencie pro analýzu maximálně 25 vzorků. Doporučuje se aktivovaný reakční mix ihned po namíchání rozdělit do alikvotů. Před rozplněním do zkumavek mix řádně promíchejte (viz sekce 7.1). Rozplňte po 20 μl a uložte při teplotě nižší, než – 18ºC. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování.

7.1 Postup zpracování Devyser AZF kit (Art # 8-A019) Reakční master mixy připravte ještě před přípravou vzorků, pokud provedete celou metodu v jediném dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy den následující. Reakční Master Mix se připraví přidáním příslušného Devyser AZF PCR Mixu k PCR Activator Devyser AZF byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µL. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Ze soupravy potřebujete PCR Activator, Devyser AZF Mix.

Prostor pro přípravu reagencií: 1. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte ! . 2. Opatrně přidejte do zkumavky s PCR Activatorem 500 μl Devyser AZF Mixu. POZNÁMKA!>

3. Opatrně manuálně promíchejte pipetováním 300 – 500 μl několikrát ode dna zkumavky. 4. Zvortexujte zkumavky s reakčním Master Mixem a krátce stočte. Samotné vortexování nestačí. 5. Napipetujte po 20 µL reakčního master mixu do PCR zkumavek, příp. PCR stripu nebo destičky. 6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte. Reakční Master Mix může být uchováván při +2 až +8°C nejméně 7 dní a při méně než –18 C nejméně 90 dní. Vyvarujte se opakovanému zmražování a rozmražování.


Strana 10 z 20

7.2. Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA

Dle návodu výrobce. DNA koncentrace a její čistota jsou důležité faktory pro úspěšné testování pomocí soupravy Devyser AZF. DNA musí být zbavena kontaminujících proteinů a solí. Špatná kvalita DNA může způsobit zvýšené pozadí, nebo chybu amplifikace. Přidání příliš mnoho nebo příliš málo DNA do PCR reakce může způsobit chybu amplifikace. Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser AZF. Pro doporučené podmínky PCR a nastavení analýzy je vhodné používat koncentraci DNA mezi 100 a 200 ng / PCR reakci.

Přidání vzorku

V prostoru odděleném od prostor pro přípravu reagencií a amplifikaci a detekci. 1. 1. Přidejte 5 μl klinického vzorku (20 – 40 ng genomické DNA/ μl) do příslušné PCR zkumavky s reakčním master mixem (z kroku 7.1) 2. Zavřete zkumavky a krátce je stočte.

Amplifikace

Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler. » Pro Eppendorf Mastercycler použijte mód “CNTRL TUBE” » Pro GeneAmp® System 9700 nastavte “ramp speed” na “9600 mode”. » Pro MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha blokem použijte funkci “Calculated vial temperature” a ramping mode (rychlost vyhřívání) “MAX”. Amplifikační prostor: Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace o programování termocykleru): 95°C 15 min 94°C 30 sec; 62°C 90 sec; 72°C 90 sec for 21 cycles 72°C 30 min 4°C FOREVER


Strana 11 z 20

7.2. Příprava vzorků a amplifikace PCR (pokrač.) Amplifikace (pokrač.) Prvotní denaturace 95°C 15 min

Cyklování

Finální extenze

94°C 30 sec

72°C

72°C

90 sec

30 min

62°C 90 sec Teplota prostředí 21 Cykly

4°C 

1. Nastavte reakční objem 25 µL. 2. Spusťte amplifikaci (délka cca 2 hodiny). 3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Opatrně sejměte víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem. Amplifikovaný materiál nepřenášejte do před amplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a detekčním prostoru.


Strana 12 z 20

7.3. Detekce Příprava vzorků

Pro obsluhu genetického analyzátoru postupujte podle příslušného manuálu ABI. Před použitím soupravy Devyser AZF musí mít analyzátor spektrální kalibraci pro detekci FAM s použitím příslušného polymeru. Příprava vzorků pro ABI 310/ 3100/ 3130/ 3500/ 3730 1. Připravte zaváděcí směs smícháním 3 μl velikostního standardu a 100 μl Hi-Di Formamid. Mix vystačí pro 6 zkumavek (resp. jamek). 2. Vortexujte 15 s. 3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru. 4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/ zkumavky s ELFO nanášecí směsí. 5. Uzavřete destičku/zkumavky .

Příprava přístroje

Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením: » Sample ID. » Size standard » Dye Set: DEV-5/Any5, D nebo G5. » Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje.


Strana 13 z 20

Run Modules ABI 310 Run Parameters Capillary length

POP-4 (ABI310) 47 cm

Run temperature

60

Injection voltage

8

Injection time

2

Run voltage Run time

15 30 min

ABI 3100/3130 Run Parameters Capillary length

POP-4

POP-7

36 cm

36 cm

Run temperature

60

60

Injection voltage

1,5

1,5

Injection time

10

10

Run voltage

15

15

1800 s

1800 s

Run time

ABI 3500 Run Parameters Capillary length

POP-7 50 cm

Run temperature

60 ˚C

Injection voltage

1,6 kV

Injection time

8s

Run voltage

19,5 kV

Run time

1500 s

Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a injekční doby.


Strana 14 z 20

8. Výsledky a analýza Princip detekce Chromozom specifické markery známé, jako STS jsou amplifikovány pomocí PCR. Použitím fluorescenčně značených primerů se za pomocí genetického analyzátoru a příslušného software provede vizualizace a identifikace PCR produktů. Analýza dat Píky v elektroforetogramu se identifikují dle velikostí specifických markerů, jak jsou znázorněny v přehledu markerů (str. 16). Přítomnost STS fragmentu závisí na přítomnosti nedeletovaného STS markeru ve vzorku. Absence STS markeru souvisí s deletovaným STS markerem. Kritéria fluorescence Přijatelný rozsah pro výšku píku marker je 200 rel. fluorescenčních jednotek a vice. Pokud jsou píky příliš vysoké (označené off scale), je vhodné vzorek analyzovat znovu s nižším injekčním časem (injection time) a nebo napětím (injection voltage). Než začnete analyzovat klinické vzorky, přesvědčete se, že vyhovují parametry kontrolních vzorků. Negativní kontrola V rozsahu 100 – 500 bp se nesmějí objevit žádné specifické píky. Kontrolní DNA zdravého muže Počet a velikost píků je obsažena v přehledu markerů (str. 16). Všechny píky uvedené v přehledu musí být přítomny (viz obr. 1). Kontrolní DNA zdravé ženy Má se objevit pouze jediný pík markeru ZFX (viz obr. 2). Klinické vzorky Určete přítomnost nebo nepřítomnost jednotlivých specifických píků. Všechny delece by měly navazovat. Pokud chybí jednotlivé píky bez vzájemné návaznosti, nejedná se o deleci, pouze o chybějící píky. Markery sY254 a sY255 STS markery sY254 a sY255 jsou přítomny na chromozomu Y vždy nejméně po 4 kopiích . V mužské DNA s intaktním lokusem STS mají oba markery píky, jejichž výška přesahuje všechny ostatní píky.


Strana 15 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Přehled markerů Devyser AZF

STS marker

Lokus

Pozice v mapě (str. 17)

Velikost markeru * (±2,5 bp)

sY255**

DAZ1-4

13

123 bp

sY131

DYS222

10

169 bp

sY90

DYS278

8

175 bp

sY81

DYS271

3

208 bp

sY625

G65849

5

254 bp

sY127**

DYS218

9

273 bp

sY157

DYS240

14

290 bp

sY134**

DYS224

11

304 bp

sY86**

DYS148

4

318 bp

sY84**

DYS273

6

329 bp

sY254**

DAZ1-4

12

376 bp

M259

DDX3Y

7

396 bp

ZFY/ZFX

ZFY / ZFX

2

432/433 bp

sY14 (SRY)

SRY

1

464 bp

*Na základě pozorovaných velikostí markerů pomocí ABI3130 a POP7. **Základní sada STS primerů dle předpisů EAA/EMQN (Ref 1).


Strana 16 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Schematický přehled pozic markerů na chromozomu Y.

Mapa

STS

Lokus

1

sY14

SRY

Oblast

Yp11.3 2

ZFY

ZFY

3

sY81

DYS271

4

sY86

DYS148

5

sY625

G65849

6

sY84

DYS273

7

M259

DDX3Y

8

sY90

DYS278

9

sY127

DYS218

10

sY131

DYS222

11

sY134

DYS224

12

sY254

DAZ1-4

13

sY255

DAZ1-4

14

sY157

DYS240

Yq11.21

AZFa


Yq11.221

AZFb

AZFc

Strana 17 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Obr. 1. Typický výsledek z DNA zdravého muže. Jsou přítomny všechny STS markery.

Obr. 2. Typický výsledek z DNA zdravé ženy. Všechny STS markery chromozomu Y chybějí, jediný lokus ZFX je přítomen.

Obr. 3. Typický výsledek z DNA muže postiženého delecemi Y. Markery sY255, sY157 a sY254 chybějí, což odpovídá deleci oblasti AZFc


Strana 18 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Pokud chybí jediný STS marker, doporučuje se doplnit výsledek dodatečným testováním. Pokud má elektroforetogram špatnou kvalitu (abnormální velikosti píků, elfo spiky a rozmazané píky), měl by být vzorek nanesen znovu s použitím čerstvých reagencií pro elektroforézu (polymer, pufr atd) Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin: » » » » »

Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony Polymorfismus v oblasti nasedání primeru DNA concentration used is too high or too low DNA použitá v PCR je degradovaná Elektroforetické spiky

9. Limitace použití A.

Použití soupravy je omezeno pro osoby vyškolené v PCR metodách.

B.

Souprava Devyser AZF byla validována na cyklerech ABI GeneAmp® 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler a MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovou alpha blokem. Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace soupravy Devyser AZF pro tento cykler.

C.

Souprava Devyser AZF byla validována spolu s extrakcí z lidské plné krve pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini. Analýza s dalšími matricemi a izolačními soupravami nebyla validována a může způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky.

D.

Devyser AZF používejte pouze pro detekci delecí specifických STS markerů chromozomu Y dle návodu k použití. Test nebyl validován pro detekci strukturálních přeskupení a abnormalit v žádném dalším chromozomu. Výsledky získané pomocí Devyser AZF můžou být použity pouze pro konkrétní testovanou tkáň nebo vzorek.


Strana 19 z 20

10. Reference 1.

Simoni M, Bakker E, Krausz C. International Journal of Andrology, 27:240-249 (2004). EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of ychromosomal microdeletions. State of the art 2004.

11. Upozornění zákazníkům Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser AZF musí být interpretovány s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta. Devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí. Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným třetí stranou.

12. Kontaktní informace Devyser AB Instrumentvägen 19 SE-126 53 Hägersten SWEDEN Phone: +46-8-562 15 850 Homepage: www.devyser.com Technická podpora Phone: +46-8-562 15 850 E-mail: [email protected]


Strana 20 z 20

Devyser AZF. Návod k použití

Recommend Documents