Návod k použití. Devyser Resolution 13 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution XY v2 Kat. No.: 8-A012.2-XY. For in vitro Diagnostic Use

Devyser Resolution 21 v2 Kat. No.: 8-A012.2-21 Devyser Resolution 18 v2 Kat. No.: 8-A012.2-18 Devyser Resolution 13 v2 Kat. No.: 8-A012.2-13 Devyser Resolution XY v2 Kat. No.: 8-A012.2-XY For in vitro Diagnostic Use

Návod k použití

Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.

© Devyser AB 2014

Stránka 1 z 32

Obsah Obsah 1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2 Použití Obsah soupravy Postup Princip metody 2. Upozornění 3. Symboly použité na štítcích 4. Požadovaný materiál 4.1 Součástí kitu Konfigurace Složky Devyser Resolution 21 v2 Složky Devyser Resolution 18 v2 Složky Devyser Resolution 13 v2 Složky Devyser Resolution XY v2 4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií Extrakce DNA Amplifikace Detekce Size Standard 4.3 Souprava pro barevnou kalibraci 5. Skladování a nakládání se soupravou 6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky Postup a skladování Kontroly 7. Návod k použití 7.1 Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA Přidání vzorku Amplifikace 7.3 Detekce Příprava vzorků Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu Příprava přístroje Run Modules 8. Výsledky a analýza


© Devyser AB 2014

2 4 4 4 4 4 6 7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 10 11 11 11 11 12 12 12 12 12 13 14 14 14 14 14 16 Stránka 2 z 32

Principy QF-PCR Marker pro X chromozóm Nepolymorfní markery Pseudoautozomální XY markery Přehled markerů Devyser Resolution v2 Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2 Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2 Přehled markerů Devyser Resolution XY v2 Provádění analýzy Poměrová kritéria (Ratio Criteria – RC) Markery se dvěma píky Markery se třemi píky Výškový poměr Interpretace výsledků Troubleshooting Artefakty PCR Elektroforetické artefakty 9. Klinická studie Devyser Resolution v2 (8-A012.2) Sensitivita Specificita Opakovatelnost 10. Limitace použití 11. Reference 12. Upozornění zákazníkům 13. Kontaktní informace


© Devyser AB 2014

16 18 19 19 20 20 21 21 22 22 22 22 22 22 23 24 25 27 27 27 27 28 29 30 31 32

Stránka 3 z 32

1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2 Použití

Souprava Devyser Resolution v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 21. Souprava Devyser Resolution 18 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 18. Souprava Devyser Resolution 13 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 13. Souprava Devyser Resolution XY v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů X a Y. Obsah soupravy

Souprava Devyser Resolution v2 obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace genetických markerů. Postup

DNA extrakce: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51104) pro extrakci DNA z lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51304) pro extrakci DNA z biopsií choriových klků. Amplifikace: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s využitím PCR cycleru ABI GeneAmp® System 9700. Detekce: Genetické analyzátory Applied Biosystems (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730) a MegaBACE podporující detekci Dye-Set DEV-5. Princip metody

Kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR) zahrnující amplifikaci, detekci a analýzu krátkých opakujících se sekvencí (STR) a konzervativních sekvencí. Pro amplifikaci chromozom specifických sekvencí se používají fluorescenčně značené primery, takže počet kopií každé sekvence odpovídá počtu příslušných chromozomů. Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického analyzátoru. Relativní množství každé alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. Normální diploidní vzorek obsahuje příspěvek obou somatických chromozomů. Dvě alely chromozom specifické STR sekvence jsou detekovány jako dva píky v poměru 1:1, pokud je marker heterozygotní a jako jeden pík, pokud je marker homozygotní. Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.

© Devyser AB 2014

Stránka 4 z 32

Detekce další alely prostřednictvím tří píků v poměru 1:1:1 nebo jako dva píky v poměru 2:1 resp. 1:2 znamená přítomnost další STR sekvence, která může znamenat přítomnost dalšího chromozomu, jako je tomu u trizomie.


© Devyser AB 2014

Stránka 5 z 32

2. Upozornění A.

Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady byly ověřeny pomocí PCR celkový reakční objem 25 µl.Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. B.

Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry. C.

Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže. D.

Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou. E.

Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky. F.

Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci.Příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové.Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. G.

Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem. H.

Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce.


© Devyser AB 2014

Stránka 6 z 32

3. Symboly použité na štítcích Šarže

Exspirace

Výrobce

Počet testů

In vitro diagnostický medicínský prostředek

Skladujte při teplotě nižší nebo rovné

Katalogové číslo


© Devyser AB 2014

Stránka 7 z 32

4. Požadovaný materiál 4.1 Součástí kitu Konfigurace

Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady obsahují reagencie pro analýzu 25 vzorků každého. Složky Devyser Resolution 21 v2

Barva víčka Oranžová Žlutá

Barva Zkumavky Čirá Hnědavá

Štítek PCR Activator Resolution 21 v2

Katal.č. 4-A018 4-A180

Obsah soupravy 1 1


Katal.č. 4-A018 4-A179

Obsah soupravy 1 1


Katal.č. 4-A018 4-A178

Obsah soupravy 1 1

Štítek PCR Activator Resolution XY v2

Katal.č. 4-A018 4-A181

Obsah soupravy 1 1

Složky Devyser Resolution 18 v2

Barva víčka Oranžová Bílá


Složky Devyser Resolution 13 v2

Barva víčka Oranžová Oranžová


Složky Devyser Resolution XY v2

Barva víčka Oranžová Red


4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií

· Plast pro termocykler · Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. · Nepudrované chirurgické rukavice Extrakce DNA

· Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy. · Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry.


© Devyser AB 2014

Stránka 8 z 32

Amplifikace

· Thermocycler: ABI GeneAmp® PCR System 9700 v módu 9600.Pro použití jiných PCR thermocyclerů je nutno použít ramping: ohřev 0,8°C/s, chlazení 1,6°C/s. · Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. Detekce

· Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730) · Metodika je validovaná na polymerech: POP-4 a POP-7 · Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu · 1x Genetic Analyzer Buffer · Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. Size Standard

560 SIZER ORANGE (Devyser cat.# 8-A402) nebo GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Life Technologies cat.# 4366589)

4.3 Souprava pro barevnou kalibraci ABI 3100, 3130, 3730: Použijte kit DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) jako “Any5Dye” dye set. ABI 3500: Použijte DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) a vytvořte DEV-5 dye set. ABI 310 Matrix file generation: Použijte DEV-5 Dye Set SingleCap kit (Devyser cat# 8-A400). Zvolte soubor modulu “GS STR POP4 (1 mL) G5.md5”


© Devyser AB 2014

Stránka 9 z 32

5. Skladování a nakládání se soupravou A.

Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 °C. B.

Smíchané reakční mixy (připravené přidáním Resolution 21, 18, 13 a XY v2 Mix do PCR Activator) je možné skladovat při +2 to +8 °C po dobu 7 dní nebo při méně než -18 °C po dobu 90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. C.

Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR. D.

Nemíchejte reagencie z různých šarží.


© Devyser AB 2014

Stránka 10 z 32

6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky

Souprava Devyser Resolution v2 je určena pro použití s lidskou genomovou DNA izolované z plné krve, amniové tekutiny a choriové tkáně. Postup a skladování

Dle pokynů výrobce. Kontroly

Je doporučeno používat vhodné kontroly v každém runu jako například zdravou DNA a negativní kontrolu (bez DNA).


© Devyser AB 2014

Stránka 11 z 32

7. Návod k použití 7.1 Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 Smíchané master mixy (Mix + activator) je vhodné připravit před použitím a celý process dokončit v jednom dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy den následující. Aktivované reakční směsi se připraví přidáním každého z rezoluce 21, 18, 13 a XY v2 směsi oddělit zkumavky PCR aktivátoru. Devyser Resolution v2 byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µL. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Ujistěte se, že je Resolution Mix kompletně rozmražen. 1. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte. 2. Přidat 500 ul každého z Resolution v2 směsi na samostatné trubky PCR Activator. 3. Opatrně promíchejte reakční master mix několikerým nasátím pipetou od spodu zkumavky. 4. Vortexujte reakční master mix a lehce centrifugujte. 5. Napipetujte 20 µL smíchaného master mixu do PCR zkumavek. 6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte. 7. Pokračujte ke kroku 7.2 Smíchaný reakční master mix je stabilní při +2-8 °C po dobu 7 dní a při méně než -18 °C po dobu 90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování.

7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA

Dle pokynů výrobce. Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2.Doporučená koncentrace DNA pro analýzu soupravou Devyser Complete v2 je 2 až 30 ng/PCR reakci(0,4- 6 ng genomové DNA/µL vzorku). Přidání vzorku

Vzorky a kontroly by měl být přidán na vyhrazeném místě odděleném od přípravy reagencie, amplifikační a detekční oblasti.


© Devyser AB 2014

Stránka 12 z 32

1. Přidejte 5 µL vzorku (0,4 - 6 ng genomové DNA/µL vzorek) do každé PCR zkumavky se smíchaným reakčním master mixem(z kroku 7.1) 2. Zkumavky uzavřete a krátce stočte. Amplifikace

Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler. Pro ABI GeneAmp® System 9700 nastavte “ramp speed” na “9600 mode”. Pro použití jiných PCR termocyklerů použijte tento ramping: ohřev 0,8 °C/s, chlazení 1,6 °C/s. Amplifikační prostor: Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace o programování termocykleru): 95 °C 15 min 94 °C 30 sec; 58 °C 1 min 30 sec; 72 °C 1 min 30 sec for 27 cycles 72 °C 30 min 4 °C FOREVER

1. Nastavte reakční objem 25 µL. 2. Spusťte amplifikaci (délka cca 3 hodiny). 3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Odstředivka krátce sbírat obsah. Opatrně sejměte víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem.Amplifikovaný materiál nepřenášejte do předamplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a detekčním prostoru.


© Devyser AB 2014

Stránka 13 z 32

7.3 Detekce Příprava vzorků

Řiďte se manuály pro příslušný analyzátor ABI ohledně údržby a nastavení přístroje. Před spuštěním analýzy soupravou Devyser Resolution v2, přístroj musí být kalibrován na dye set DEV-5.Detaily v sekci 4.3. Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu

1. Připravte nanášecí směs smícháním 2 µL velikostního standardu (560 SIZER ORANGE) s 100 µL Hi-DiTM Formamidu (směs stačí pro 6 jamek/zkumavek). 2. Vortexujte 15 s. 3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru. 4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/zkumavky s ELFO nanášecí směsí. 5. Uzavřete destičku/zkumavky. Příprava přístroje

Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením: l l l

Sample ID Dye Set: Any5Dye/DEV-5 Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje.

Run Modules

Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a injekční doby. ABI 310(Běh s modulem souboru "GS STR POP4 (1 ml) G5.md5") Run Parameters POP-4 Capillary length 47 cm Run temperature 60 ˚C Injection voltage 15 kV Injection time 5 - 15 s Run voltage 15 kV Run time 40 min


© Devyser AB 2014

Stránka 14 z 32

ABI 3100/3130 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time

POP-4/POP-7 36 cm 60 ˚C 1,5 kV 20 s 15 kV 1500 s

ABI 3500 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time

POP-7 50 cm 60 ˚C 1,6 kV 15 s 19,5 kV 1500 s


© Devyser AB 2014

Stránka 15 z 32

8. Výsledky a analýza Doporučené postupy pro diagnostiku aneuploidií pomocí QF-PCR byly stanoveny sdružením Clinical Molecular Genetics Society (UK) a Association for Clinical Cytogenetics (UK) a jsou dostupné na: http://www.cmgs.org.uk Principy QF-PCR

Chromozom–specifické krátké opakované DNA sekvence (small tandem repeats – STR) jsou amplifikovány PCR. Vizualizací fluorescenčně značených primerů můžeme kvantifikovat PCR produkty. Kvantifikace se provádí výpočtem plochy píku příslušné STR pomocí automatického DNA sekvenátoru. STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují čtveřice nukleotidů v každé alele. DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí) pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu (viz obr. 8.1).STR marker, které jsou heterozygotní jsou považovány za informativní. Obr. 8.1. Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1)

DNA amplifikované z trizomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou (obr 8.2), nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu než druhý pík (viz obr. 8.3.).


© Devyser AB 2014

Stránka 16 z 32

Obr. 8.2. Trizomický marker (poměr ploch 1:1:1)

Obr. 8.3. Trizomický marker (poměr ploch 2:1 a 1:2)

Přítomnost jen jednohu píku znamená homozygozitu (všechny alely mají stejnou délku) a jsou považovány za neinformativní. Jedinci, kteří jsou homozygotní nebo monosomický pro specifický STR marker mají jen jeden pík (obr. 8.4.).


© Devyser AB 2014

Stránka 17 z 32

Obr. 8.4. Homozygotní/monozomní marker

Marker pro X chromozóm

Markery T1 a T3 jsou nepolymorfní marker chromozómu X a mohou být použity pro určení počtu chromozómů X u monozomií chromozomu X. Markery X chromozómu jsou v sekvencích na chromozómu X a na autozomálních chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů. Amplifikované markery jsou separovány podle délky. Markery X chromozómu jsou v sekvencích na chromozómu X a na autozomálních chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů. Amplifikované markery jsou separovány podle délky. U zdravé ženy je poměr markerů 1:1


© Devyser AB 2014

Stránka 18 z 32

Obrázek 8.5. Markery T1, T2 a T3 u zdravé ženy (poměr 1:1).

Obrázek 8.6. Markery T1, T2 a T3 u muž ženy.

Nepolymorfní markery

Markery AMELXY a SRY jsou umístěny v nepolymorfních sekvencích na chromozómu X (AMELX) a chromozómu Y (AMELY a SRY) a jsou použity pro detekci přítomnosti Y chromozómu. AMELXY může být použit k určení relativního počtu chromozómů X a Y. Pseudoautozomální XY markery

Markery XY2 a XY3 jsou polymorfní STR marker jsou umístěny na obou X a Y chromozómech. Marker ZFYX je ne-polymorfní marker (není to STR marker), který je přítomen na obou chromozómech X i Y. Tyto markery, pokud jsou informativní, mohou být použity pro určení celkového počtu pohlavních chromozómů.Není možné určit, která alela je na X nebo na Y chromozómu.


© Devyser AB 2014

Stránka 19 z 32

Přehled markerů Devyser Resolution v2

ID

Pozice1

Markeru

Velikost markeru (bp)2

21A 21B 21C 21D 21H 21I 21J 21K 21M

21q21.3 21q21.1 21q22.3 21q22.13 21q21.3 21q21.1 21q22.2 21q21.2 21q22.11

D21S1435 D21S11 D21S1411 D21S1444 D21S1442 D21S1437 D21S2055 D21S1409 D21S1280

150 - 208 215 - 290 245 - 345 440 - 495 362 - 420 105 - 152 385 - 488 160 - 220 290 - 390

Barva fluoroforu Modrá Modrá Žlutá Žlutá Red Žlutá Modrá Zelená Zelená

1. UCSC 2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy.

Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2

ID

Pozice1

Markeru


18A 18B 18C 18D 18G 18I 18J 18M 18P

18p11.31 18q12.3 18q12.3 18q22.1 18q11.2 18q21.31 18p11.31 18p11.32 18q22.1

D18S391 D18S978 D18S535 D18S386 D18S1002 D18S858 D18S976 GATA178F11 D18S1364

190 - 230 195 - 230 300 - 350 338 - 430 325 - 380 360 - 418 440 - 495 347 - 410 130 - 205

Barva fluoroforu Modrá Žlutá Žlutá Zelená Modrá Žlutá Žlutá Red Zelená



© Devyser AB 2014

Stránka 20 z 32

Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2

ID

Pozice1

Markeru


13A 13B 13C 13D 13E 13F 13G 13I 13K

13q12.12 13q21.32 - q21.33 13q31.3 13q13.3 13q22.1 13q12.2 13q14.11 13q.31.1 13q21.1

D13S742 D13S634 D13S628 D13S305 D13S800 D13S252 D13S325 D13S317 D13S1492

224 - 334 365 - 435 420 - 475 435 - 505 180 - 230 255 - 320 312 - 417 155 - 212 100 - 175

Barva fluoroforu Zelená Modrá Žlutá Zelená Žlutá Modrá Žlutá Zelená červený


Přehled markerů Devyser Resolution XY v2

ID

Pozice1

Markeru

AMELXY SRY ZFYX sY625 T1 T2 T3 X1 X2 X3 X4 X5 X8 X9 X10 XY2 XY3

Xp22.2 / Yp11.2 Yp11.31 Yp11.31 / Xp22.11 Yq11.21 7q34 / Xq13 Xq23 / 2p23.3 3p24.2 / Xq21.1 Xq26.2 Xq13.1 Xq26.2-26.3 Xq21.33 Xq25 - 26.1 Xq21.31 Xq27.1-q27.2 Xp22.32 Xq21.31 / Yp11.31 Xp22.33 / Yp11.32

AMELX / AMELY SRY ZFY / ZFX sY625 DXS1187 DXS981 XHPRT DXS6809 DXS6854 DXS6803 DXS2390 DXS6807 DXYS267 DXYS218


© Devyser AB 2014

Barva fluoroforu X = 104, Y = 110 (+/- 2bp) Zelená 235 (+/- 2bp) Modrá 156 -167 Žlutá 254 (+/- 2bp) Zelená 7 = 180 / X = 200 (+/- 2 bp) Zelená X= 118 / 2 = 121 (+/- 2 bp) Žlutá 3 = 137 X = 141 (+/- 2bp) červený 120 - 172 Zelená 262 - 300 Zelená 265 - 308 Žlutá 292 - 342 Modrá 392 - 430 Zelená 100 - 140 Modrá 312 - 357 červený 242 - 286 Modrá 175 - 217 Modrá 215 - 260 červený Velikost markeru (bp)2

Stránka 21 z 32


Provádění analýzy

Při provádění manuální analýzy identifikujete píky markerů v elektroforetogramu podle specifických velikostních rozpětí markerů uvedených v seznamu markerů. Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Analýza heterozygótních marker s dvěma píky se provádí kalkulací poměru pík1/pík2. Pík1 je plocha píku kratšího fragmentu, pík2 je plocha píku delšího fragmentu. Viz níže – poměrová kritéria pro interpretaci. Pro marker se třemi píky se poměr počítá z plochy od nejmenšího píku, tj. pík1/pík2/pík3. Homozygotní markery se označují jako neinformativní.

Poměrová kritéria (Ratio Criteria – RC) RC 1 je použit pro píky se vzdáleností <24bp RC 2 je použit pro píky se vzdáleností ˃24bp Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp, protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel. Markery se dvěma píky

Ratio RC 1 RC 2

1:2 <0,65 <0,65

Neprůkazný 0,65-0,74 0,65-0,74

1:1 0,75-1,44 0,75-1,54

Neprůkazný 1,45-1,75 1,55-1,75

2:1 >1,75 >1,75

Markery se třemi píky

Poměr RC 1 RC 2

Neprůkazný <0,74 <0,74

1:1:1 0,75-1,44 0,75-1,54

Neprůkazný >1,45 >1,55

Výškový poměr

Výškový poměr lze použít, když je poměr ploch hodnocen jako "inconclusive" (neprůkazný). Použijí se stejná poměrová kritéria, jako pro výpočet poměrů ploch.

Interpretace výsledků K interpretaci výsledku jako normálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva informativní markery daného chromozómu a ostatní markery musí být neinformativní. Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.

© Devyser AB 2014

Stránka 22 z 32

K interpertaci výsledku jako abnormálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva markery informativní jako abnormální a ostatní markery musí být neinformativní. Normální alelický pattern: Markerů se dvěma píky obdobné plochy/výšky, jejichž poměr je hodnocen 1:1. Abnormaníl alelický pattern: a) Markerů se dvěma píky odlišné plochy/výšky, jejichž poměr je hodnocen 2:1 nebo 1:2. b) Markery se třemi píky se stejnými nebo podobnými poměry výšky/plochy, jejichž poměr je hodnocen 1:1:1 Monosomy X pattern is determined by: a) All X and XY markers showing homozygous allelic pattern. b) Pokud píky AMELY a SRY nejsou detekovány. c) Marker T1 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 2:1. d) Marker T2 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 1:2. e) Marker T3 showing two peaks of differing height/area and the peak ratio is classified as 2:1. Můžou se objevit píky markerů s délkou mimo dané rozpětí, tyto v rámci systému Devyser Resolution v2 nehodnotíme. Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp, protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel. Troubleshooting

Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin: » Chromozomální mosaicismus » Copy number variation (CNV) » Microvarianty způsobené specifickými opakováními mutací » Částečná chromozomální trizomie » Stutter pík převyšuje, nebo překrývá specifický alelický pík. » Překryv barevného signálu mezi kanály » Elektroforetické spiky » Asymetrická amplifikace » Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony » Polymorfismus v oblasti nasedání primeru » Somatická microsatelitní mutace » DNA koncentrace je příliš vysoká, nebo příliš nízká. » DNA použitá v PCR je degradovaná. » Submicroskopická duplikace/delece některého z markerů » Velikost alela je rozdíl větší než 40 bp způsobuje šikmé poměry alel.


© Devyser AB 2014

Stránka 23 z 32

Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence AMELY kvůli mutaci v místě nasedání primeru. Ve vyjímečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence marker T1 kvůli poměr zkreslen kvůli mutaci v místě nasedání primeru. Pokud je získán normální I abnormální výsledek pro jeden chromozóm, je doporučeno použít jinou metodiku pro určení příčiny chyby. Počet variací (CNVs) byl pozorován u markerů 13A, 13B, 13C, 13D, 18B, 18C, 18D-1, 18D-2, 21B, 21C, 21G, X2, X3, XY3, AMELXY, ZFYX a T1. Pokud je elektroferogram nízké kvality, data není možné vyhodnotit.PCR produkt můžeme opakovaně nanést do analyzátoru a analyzovat znovu. Artefakty PCR

Stutter píky (obr. 8.7) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Stutter píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů.Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku. Obr. 8.7. Stutter pík je označen šipkou.

-A píky (obr. 8.8) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík). –A píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů.


© Devyser AB 2014

Stránka 24 z 32

Obr. 8.8. –A a +A píky jsou vyznačeny šipkami.

Elektroforetické artefakty

Během detekce může dojít k přesahu signálu mezi jednotlivými detekčními kanály (Obr 8.9). Crosstalk se jeví jako stejně vysoké vrcholy v sousedních barevných kanálech a měla by být vyloučena z analýzy. Obr 8.9. Pík přesahující ze green do blue kanálu je označen šipkou.

Dye blobs se mohou objevit v rozsahu analýzy (obr. 8.10). Obecně platí, že barva dye blobs se objeví jako široký pík bez definovaného vrcholu jedné barvy a vyskytují se v datech relativně brzy na začátku.


© Devyser AB 2014

Stránka 25 z 32

Obr 8.10. Dye blob je označen šipkou.


© Devyser AB 2014

Stránka 26 z 32

9. Klinická studie Pro testování kitu Devyser Resolution v2 bylo analyzováno 257 vzorků. Všechny výsledky analýzy kitem Devyser Resolution v2 byly porovnány s daty z karyotypování nebo QF-PCR analýzy. Z analyzovaných 257 vzorků bylo 225 normálních/zdravých a 30 mělo aneuploidii alespoň u jednoho z testovaných chromozomů. 255 vzorků mělo analyzovatelný výsledek a všechny se plně shodovaly s výsledky karyotypování. Tabulka 1. Výsledky testování 276 vzorků. Výsledek Normální Trisomie 13 Trisomie 18 Trisomie 21 Triploid 45, X 47, XXY 47, XYY 48, XXXX Výrazná kontaminace mateřskými buňkami Kontaminace dalších genotypem Neinformativní Celkem

Devyser Resolution v2 225 2 5 8 6 3 4 1 1 1 1 0 257

Předchozí testování* 225 2 5 8 6 3 4 1 1 1 1 0 257

*) karyotypování a/nebo QF-PCR analýza

Devyser Resolution v2 (8-A012.2) Sensitivita

Definice: Podíl (%) pacientů s dobře definovanou chromozomální aberací ve zkušební hodnotě v rámci definované rozhodovací meze. Výsledek: >97% sensitivita Specificita

Definice: Podíl (%) pacientů bez dobře definované chromozomální aberací a jejichž výsledky byly negativní ve zkušební hodnotě v rámci definované rozhodovací meze. Výsledek: >99% specifita


© Devyser AB 2014

Stránka 27 z 32

Opakovatelnost

Definice: Stupeň (%) shody mezi měřeními provedenými na stejných vzorcích za rozdílních měnících se podmínek. Experimentální design: Normalní mužský vzorek (46, XY) byl amplifikován 102-krát při šesti různých podmínkách a prováděných různými operatory na různých PCR cyclerech a genetických analyzátorech. Všech 102 replikátů vyšlo stejně. Výsledek: >99% opakovatelnost


© Devyser AB 2014

Stránka 28 z 32

10. Limitace použití A.

Používat tento product smí jen osoba vyškolená v technikách PCR a kapilární elektroforézy. B.

Souprava Devyser Resolution v2 byla validována na použití s termocycylerem ABI Thermal Cycler GeneAmp® 9700. Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace soupravy Devyser Resolution v2 pro tento cykler. C.

Souprava Devyser Resolution v2 je validována s izolačními soupravami QIAamp DNA Blood Mini Kit pro extrakci DNA z plné lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit pro extrakci DNA z biopsií choriových klků.Analýza s dalšími matricemi a izolačními soupravami nebyla validována a může způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. D.

Souprava Devyser Resolution v2 je určena pouze pro detekci specifických chromozomálních aneuploidií dle návodu k použití. Souprava nebyla testována pro detekci strukturálních změn, mozaiky ani abnormalit v jiných, než uvedených chromozomech. Výsledky obdržené použitím soupravy Devyser Resolution v2 mohou být aplikovány pouze na tkáně nebo specifické vzorky. Kontaminace mateřskými buňkami neo u placentálního masaicismu může způsobit nesrovnalosti mezi výsledky získanými soupravou Devyser Resolution v2 a jinými technikami.


© Devyser AB 2014

Stránka 29 z 32

11. Reference PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS AND CLINICAL MOLECULAR GENETICS. QF-PCR FOR THE DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY BEST PRACTICE GUIDELINES (2012), v3.01, January 2012.


© Devyser AB 2014

Stránka 30 z 32

12. Upozornění zákazníkům Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser Resolution v2 musí být interpretovány s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta.Devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí. LIZ® a GeneAmp® jsou registrovanými obchodními známkami společnosti Life Technologies Corporation. GeneScanTM, POP-4TM, POP-7TM a Hi-DiTM jsou ochrannými známkami společnosti Life Technologies Corporation. Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným třetí stranou.


© Devyser AB 2014

Stránka 31 z 32

13. Kontaktní informace Devyser AB Instrumentvägen 19 SE-126 53 Hägersten SWEDEN Phone: +46-8-562 15 850 Homepage: www.devyser.com Technická podpora Phone: +46-8-562 15 850 E-mail: [email protected]


© Devyser AB 2014

Stránka 32 z 32

Návod k použití. Devyser Resolution 13 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution XY v2 Kat. No.: 8-A012.2-XY. For in vitro Diagnostic Use

Recommend Documents