10.11.2016
APLIKACE MIKROORGANISMŮ V BIOTECHNOLOGII
Biotechnologické aplikace v průmyslů papíru a celulosy
Aplikace mikroorganismů v dřevařském a průmyslu
Buněčná stěna přítomnost buněčné stěny je jednou z charakteristik odlišujících rostlinnou buňku od živočišné sestává ze čtyř skupin polymerů: celulosy, pektinu, hemicelulosy a proteinů
Buněčná stěna v rostlinných buňkách byly zjištěny dvě vrstvy BS: střední lamela a primární stěna střední lamela - složená hlavně z pektinových látek - nachází se mezi primárními stěnami přilehlých buněk
stavbu buněčné stěny rostlinných buněk určuje celulosa celulosová kostra je prostoupena matrix necelulosních molekul, hemicelulosy (zesíťující glykany) a pektinových látek důležitou složkou je glykoprotein označovaný jako extenzin ve stěnách mnoha buněk se vyskytuje lignin a tukové látky – kutin, suberin a vosky
proces lignifikace BS začíná právě ve střední lamele a pokračuje na primární, případně sekundární stěně primární stěna je složena hlavně z celulosy, hemicelulos, pektinových látek (důležité pro plasticitu BS) a glykoproteinu u některých buněk se v průběhu vývoje vytváří i sekundární BS (většinou po ukončení růstu buňky, kdy primární stěna není schopna dalšího plošného růstu)
BS mohou být inkrustovány anorg. látkami, např. SiO2 nebo CaCO3
sekundární BS - obsahuje hlavně celulosu a lignin, pektinové látky a glykoprotein zde chybějí (neelastická!)
Dřevo
Celulosa nejrozšířenější organická sloučenina na Zemi, ročně jí biosyntézou
Hlavní složky dřeva: celulosa hemicelulosy
holocelulosa
lignin voda v různém množství (podle ročního období, stupně vyschnutí dřeva) doprovodné složky: o další organické látky (1–3%, u tropických dřevin až 15%): terpeny, tuky, vosky, pektiny, třísloviny (jen u listnatých stromů), steroly, pryskyřice o anorganické látky (0,1–0,5%, u tropických dřevin až 5%) – po spálení tvoří popel
vzniká asi 1011 tun pro většinu obratlovců je nestravitelná, protože nevytvářejí enzymy, které ji štěpí, přežvýkavci však mají v trávicím ústrojí mikroorganismy, které ji umějí rozkládat je nerozpustná ve vodě, zředěných kyselinách, zásadách a většině rozpouštědel rozpouští se v koncentrovaných kyselinách (podle koncentrace nebo teploty - hydrolýza na rozpustné fragmenty s kratším řetězcem) v roztocích hydroxidů je bobtnání intenzivnější než ve vodě a v kyselých roztocích při vyšších teplotách dochází k hydrolýze, případně oxidaci
1
10.11.2016
Celulosa
Hemicelulosa
vysokomolekulární lineární polymer D-glukosových jednotek vázaných glykosidovými vazbami β-1,4; každá z vázaných jednotek v řetězci je otočena vzhledem k předchozí a v této poloze je udržována intramolekulárními vodíkovými vazbami; polymerace - až 15 000 makromolekuly celulosy vzájemně reagují prostřednictvím vodíkových vazeb a tvoří ve stěnách rostlinných buněk více či méně uspořádané trojrozměrné struktury - celulosová vlákna/mikrofibrily (10-20nm) uspořádané oblasti mikrofibril s vysokým počtem intermolekulárních vazeb je krystalické, méně uspořádané oblasti jsou amorfní
společný název pro strukturní necelulosové polysacharidy buněčných rostlin, které vyplňují prostory mezi celulosovými vlákny heteroglukany • xyloglukany – β-D-1,4-glukan s jednotkami D-xylopyranosy v postranních řetězcích, které jsou vázány na glukosu α-1,6glykosidovými vazbami; větší část je složkou nerozpustné vlákniny • β-glukany - řetězec složen z 2–3 jednotek β-D-glukosy spojených vazbami (1→4) s jednotkou vázanou vazbou (1→3); jsou částečně rozpustnou, částečně nerozpustnou vlákninou potravy heteroxylany - hlavní řetězec heteroxylanů je tvořen D-xylanopyranosovými jednotkami vzájemně vázanými vazbami (1→4); xylosa bývá substituována arabinofuranosou nebo acetylovaná
Pektiny skupina značně polydisperzních, komplexních a kyselých polysacharidů o proměnném složení vznikají a ukládají se hlavně v raných stádiích růstu, kdy se zvětšuje plocha BS lineární řetězec složen z 25 – 100 jednotek D-galakturonové kyseliny (do různého stupně esterifikovány methanolem nebo acetylovany) spojených vazbami α-1,4 - polygalakturonová kyselina nerozpustné ve vodě a ve většině organických rozpouštědel rozpustnost ve vodě klesá s rostoucí molekulovou hmotností a stupněm esterifikace karboxylových skupin protopektiny - nerozpustné nativní pektiny BS asociované s celulosou
Lignin postrádá pravidelnou strukturu a opakující se jednotky kopolymer fenylpropanových jednotek - monolignolů, kterými jsou podle druhu rostlin 4-kumarylalkohol, ferulylalkohol (neboli koniferylalkohol) a sinapylalkohol - nepravidelně vázány do trojrozměrných struktur etherovými vazbami nebo vazbami mezi dvěma atomy uhlíku druhá nejčastější organická sloučenina na Zemi – 25 % rostlinné biomasy tepelně málo stálý, jeho rozklad začíná už při cca. 140°C - hnědnutí dřeva odolný vůči mikrobiálnímu rozkladu a oxidaci lignocelulosová hmota - řetězce celulosy, které jsou síťovány ligninem
Produkce papíru - enzymy rozvlákňování (pulping) - je nutné mechanický nebo chemický oddělit
Lipasy smola („pitch“) – hydrofobní látky, např. triglyceridy a vosky, které
jednotlivá vlákna celulosy rozpuštěním ligninu - dřevní buničina - dále se
způsobují technické problémy, zvláště při mechanickém rozvlákňování –
vaří v sulfidu sodném (vymytí většinu ligninu)
usazují se na zařízeni, narušují vodíkové vazby mezí vlákny (slabší papír),
„biorozvlákňování“ (biopulping) – předošetření dřevěných odřezků houbami způsobujícími bílou hnilobu - snižují obsah ligninu bez ovlivnění obsahu celulosy - šetří se energie (30-40%) a zároveň zlepšuje vazba vláken dobré výsledky použitím: Phanerochaete chrysosporium, Ceriporiopsis
subvermispora, Phlebiopsis gigantea přesný mechanismus není
snižují kvalitu papíru (tmavé skvrny), větší usazeniny mohou způsobovat trhaní papíru v papírenském stroji Ophiostoma piliferum (Cartapip, aplikace na čerstvé odřezky) rozkládá smolu a zabraňuje růstu jiných mikroorganismů na odřezkách, redukuje barevné změny, snižuje riziko tvorby pigmentu, ztrátu výnosu buničiny a oslabení vlákniny mikrobiální lipasy – odstraňují smolu,
dosud známý (asi tvorba pórů
zlepšují barvu a pevnost papíru;
v buněčné stěně – usnadnění
použiti od 90-tých let;
penetrace pomoci chemikálii)
2
10.11.2016
Lipasy
Lipasy
lipasa – triacylglycerolacylhydrolasa (EC 3.1.1.3) – hydrolytický enzym štěpící triacylglyceroly s mastnými kyselinami o řetězci delším než 12 C produkce: Pseudomonas, Mucor, Geotrichum, Rhizopus, P. chrysogenum,
B. subtilis, A. oryzae, P. roqueforti a Candida sp. (C. rugosa, C. antarctica a C. parapsilosis) Candida rugosa (GRAS) – hydrolyzuje 90% dřevních triglyceridů; maximální výtěžek produkce lipasy: • submersní „fed-batch“ fermentace s kyselinou olejovou a sacharosou, zdroj dusíku – pepton nebo YE (také stopové prvky!), pH 6.2 (NH4OH), teplota 30°C, DO 30% • SSF ta tuhém oleji s přídavkem disacharidu (nejlépe maltosy), teplota 28°C, 48h - levnější • arabská guma jako emulgátor – lepší růst a zvýšení výtěžku
Imobilizace enzymů imobilizace zvyšuje enzymovou stabilitu a aktivitu (hyper-aktivace lipasy) enzymové procesy mohou být prováděny kontinuálně a opakovaně 1) fyzikální adsorpce 2) kovalentní imobilizace 3) zabudování enzymů do struktury (bio)polymerního gelu (polyakrylamid, alginát) nebo polopropustné membrány (dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltrační membrány - umístění enzymu do fyzikálně odděleného prostředí, enzym v nativním stavu) 4) imobilizace na magnetické nosiče 5) zesítěné enzymové krystaly a agregáty (příprava krystalů enzymů,
Celulolytické enzymy celulosa je štěpena komplexem extracelulárních celulolytických enzymů, které v přírodě rozkládají odumřelé rostliny jsou produkovány širokým množstvím bakterií, plísní a hub, které mohou být aerobní, anaerobní, mesofilní nebo termofilní představují složitý enzymový systém katalyzující hydrolýzu nativní celulosy (jsou odpovědné za degradaci celulosy a hemicelulosy) celá řada mikroorganismů je vybavena jen nekompletním celulasovým systémem tvoří komplex čtyř enzymů složený z endo-1,4-β-D-glukanasy, exo-1,4-βD-glukanas a β-glukosidasy, které působí synergicky
následné zesítění glutaraldehydem) 6) zabudování enzymů do nanopórů vhodných nosičů
Celulolytické enzymy Endoglukanasa náhodně hydrolyzuje vnitřní β-1,4-D-glykosidové vazby celulosového řetězce vznikají glukooligosacharidy Exoglukanasy celobiohydrolasa – štěpí volné konce molekul celulosy; degraduje vazby β1,4 od redukujícího nebo neredukujícího konce řetězce; vznikají oligosacharidy a celobiosa glukohydrolasa – odštěpuje glukosové jednotky z neredukujícího konce řetězce -glukosidasa (celobiasa) hydrolyzuje celobiosu, vyšší oligosacharidy hydrolyzuje na β-D-glukosu
Celulolytické enzymy producenti celulolytických enzymů: Clostridium, Cellulomonas, Trichoderma,
Thermomonospora, Humicola, Penicillium, Aspergillus, Bacilli, Pseudomonads, Actinomucor, Streptomyces celulolytické mikroorganismy degradují uhlovodíky a nejsou schopny používat proteiny nebo lipidy jako energetické zdroje pro svůj růst různé druhy hub mohou metabolizovat celulosu jako energetický zdroj, ale pouze pár kmenů je schopných vylučovat komplex celulolytických enzymů, který má praktické využití v enzymatické hydrolýze celulosy komerčně využívané pro získávání celulas jsou především: T. reesei, Humicola
insolens, Aspergillus niger, Acremonium cellulolyticus, Bacillus sp. termostabilní celulasy (stabilní při nadstandardních podmínkách - kyselé nebo zásadité pH a teploty nad 90°C) - Sporotrichum thermophile,
Thermoacus aurantiacus, Chaetomium thermophile, Microbispora bispora
3
10.11.2016
Celulolytické enzymy
Celulolytické enzymy
Trichoderma reesei - roste na levném ligninocelulosovém odpadů (Accellerase 1000)
Použiti:
substrát – např. cukrovková drť, sběrový papír, vrbové dřevo ošetřené
v zemědělství - pro zlepšení růstu plodin a pro odstraňování chorob
parou; “batch” fermentace, teplota 30°C, pH 4.8, 4-6 dni substrát - pšeničná sláma, SSF, vlhkost 80%, teplota 30°C
Použiti:
rostlin (schopny rozkládat buněčnou stěnu patogenů), usnadňují klíčení semen, zvyšují růstovou rychlost rostlin (rostliny dříve kvetou, mají pozitivní vliv na kořenový systém a zvyšují výtěžnost pěstovaných plodin) papírenský průmysl - rozvlákňování surového dřeva; výroba lepenky a
potravinářský průmysl (výroba piva a
jemného papíru; usnadňuje odvodňování buničiny a tím zvyšuje rychlost
vína, ovocných nápojů, olivového oleje,
papírenského stroje (snižuje obsah jemných částic a fibrilaci celulosy);
zlepšení kvality těsta v pekařství)
odbarvování papírového odpadu (spolu s xylanasami a amylasami) -
textilní průmysl (výroba látek pro
eliminace používání alkalických látek zlepšujících zářivost barev na
džínové oděvy, „stonewashed jeans“,
papíře, zamezení žloutnutí papírů, zjednodušení procesu a snížení
odstraňují vlákna z povrchu a zjemňují)
znečištění životního prostředí
Xylanasy
Xylanasy
xylanasa (E.C 3.2.1.8) - degraduje β-1, 4-xylan štěpením β-1, 4 glykosidické vazby za vzniku xylosy –> degraduje hemicelulosy produkce: Aspergillus, Trichoderma, Streptomyces, Phanerochaetes,
Chytridiomycetes, Ruminococcus, Fibrobacteres, Clostridia a Bacillus Geobacillus thermoleovorans, Streptomyces sp. S27, Actinomadura sp. Cpt20
Bacillus firmus a Saccharopolyspora pathunthaniensis S582 - 65-90°C používané v bělení buničiny od 80-tých let - spotřeba chemikálii snížena o 10 - 20% při současném zlepšení kvality výrobků; běžně se provádí jako časný krok v bělicím postupu - degradace méně než 10% xylanu
Mannanasy Endo-β-1,4-mannanasa (EC.3.2.1.78) - náhodně hydrolyzuje hlavní řetěz heteromannanu (hlavní hemicelulosa měkkého dřeva) používané pro rozvlákňování měkkého dřeva, bělení buničiny, biokonverzi odpadní biomasy na zkvasitelné cukry, zpracování instantní kávy (snižuje viskozitu kávového extraktu), čiření ovocných šťáv produkce: submerzní fermentace - Aspergillus niger, Trichoderma reesei,
Sclerotium rolfsii, Trichosporonoides oedocephalis - substráty: odtučněná kopra, zemědělský odpad (otruby pšeničné a rýžové; bramborové, ananasové či pomerančové slupky) SSF - Aspergillus ochraceus, Penicillium fellutanum, Mucor rouxii,
Lakasy lakasa (EC 1.10.3.2) - oxidasa, která katalyzuje redukci kyslíku na vodu je široce rozšířena ve vláknitých houbách (označované jako dřevodegradující vláknité houby): Trametes versicolor, T. villosa, T. gallica,
Pleurotus ostreatus, Cerrena maxima, Phlebia radiata, Theiophora terrestis, Lentinus tigrinus, Pycnoporus cinnabarinus, Neurospora crassa také saprofytická askomyceta v kompostech jako Myceliophthora
thermophila, Aspergillus, Curvularia, Penicillium a Chaetomium thermophile nebo houby tvořící ektomykorhízu Cantharellus cibarius, Lactarius piperatus a Russula delica ve vláknitých houbách je lakasa extracelulární enzym při kultivaci může být produkce lakasy zvýšena přidáním různých
a Rhizopus oligosporus – substráty: domové odpady z kávy, kopra,
aromatických sloučenin, kovových iontů nebo některých xenobiotik s
vylisovaná cukrová třtina
nízkou molekulární hmotností do média
4
10.11.2016
Lakasy bakteriální producenti: Bacillus subtilis, E. coli, Mycobacterium
tuberculosis, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces griseus, Marinomonas mediterranea a Yersinia pestis bakteriální lakasy jsou odlišné od lakas přítomných u Askomycet a Basidiomycet - jsou intracelulární, velmi aktivní a mnohem více stabilní při vysokých teplotách, při vysokém pH i při vysoké koncentraci chloridových iontů a iontů mědi v potravinářství použití lakasy umožňuje např. zvýšení produktivity, efektivity a kvality potravinářských výrobků lakasa reaguje s různými druhy textilních barviv a degraduje je, může docházet k spojovacím reakcím a tvorbě sraženin barviv, které jdou lépe odstranit; bělení bavlněných tkanin
Lakasy v papírenském průmyslu slouží k částečné degradaci ligninu při výrobě papíru - oxidace fenolových hydroxylových skupin ligninu lakasou vede ke vzniku fenoxyradikálů, které se mohou spontánně přeskupit a vést k rozštěpení alkylových postranních řetězců polymeru - šetrnější k životnímu prostředí (běžně se používá alkalická extrakce, chlor, kyselina chlorná, ClO2 a kyslíkaté chemické oxidanty jako peroxid vodíku, kyslík nebo ozon) může být součástí biorekognikační vrstvy při konstrukci biosenzorů, které mohou být využity k detekci fenolových sloučenin, kyslíku, azidu, kyseliny askorbové, morfinu, kodeinu a různých flavonoidů reaguje s mnoha látkami - výhodná v bioremediaci životního prostředí v přípravě polymerů i pro výrobu aldehydů oxidací alkoholů
Amylasy
Amylasy
zajišťují štěpení škrobu na jednodušší sacharidy izolované z rostlin (ječmen, rýže), zvířat nebo mikroorganismů
Použití:
bakteriální α-amylasa (E.C.3.2.1.1) - náhodně útočí na α-1,4-glykosidové
v papírenství – modifikace škrobu pro nátěry (viskozita přírodního škrobu
vazby (specificita závisí na zdroji enzymů) - kategorie „ztekucovácí“ Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis a B. amylolique-
faciens , Pyrococcus furiosus – termofilní α-amylasa (100-110ºC) Chromohalobacter sp., Halobacillus sp., Haloarcula hispanica, Halomonas
meridiana a B. dipsosauri - halofilní α-amylasa fungální α-amylasa: Penicillium fellutanum, P. chrysogenum, P. brunneum,
P. expansum, Aspergillus oryzae, A. awamori, A. fumigatus, A. niger produkce hlavně jako SSF (Bacillus sp., plísně); substrát – pšeničné otruby, bananový odpad, cukry; optimální teplota ok 45ºC (Bacillus sp.) až
je příliš vysoká pro nátěr) - ochrana papíru proti mechanickému poškození během zpracování a také zlepšení kvality papíru (pevnost, hladkost) v potravinářství – produkce glukosových a fruktosových sirupu, zlepšování kvality těsta v pekařství, výroba piva v produkci detergentů - hlavně na mytí nádobí (štěpí škrobové jídlo na dextriny rozpustné ve vodě) v textilním průmyslu – odstraňování škrobového povlaku (posílení vlákna) v produkci lihu
95-100ºC (Pyrococcus); pH 5-7; vlhkost 60-85%; 48-96h
Produkce bioethanolu z lignocelulosy biopaliva druhé generace - jako surovinu využívají zemědělské
Produkce bioethanolu z lignocelulosy obvykle sestává z několika navazujících kroků, v nichž dojde nejprve k
energetické plodiny či odpady na bázi celulosy a lignocelulosy (dřevo a
mechanickému a poté fyzikálně-chemickému narušení struktury, přičemž
dřevní štěpky, piliny, odpadní papír, obilná a kukuřičná sláma, kukuřičné
dochází k hydrolýze, případně i destrukci hemicelulosy, zvýšení obsahu
oklasky, energetické plodiny a komunální odpad) zdroje jsou obnovitelné, cena je v porovnání se zemědělskými surovinami velmi nízká
amorfní celulosy a uvolnění ligninu předúprava pomocí: kyselé nebo alkalické hydrolýzy, parní explozi, explozi za přítomnosti amoniaku nebo oxidu siřičitého, ozonolýzy – proces je komplikovaný a nákladný ale také nezbytný upravený materiál je nutné podrobit enzymové hydrolýze pomocí celulolytických preparátů – komerčně dostupné nebo produkce vlastních na částečně předupravené fytomase po dodání nezbytných živin -> směs oligosacharidů, disacharidů, hexos a pentos
5
10.11.2016
Produkce bioethanolu z lignocelulosy
Produkce bioethanolu z lignocelulosy Metody produkce:
Mikroorganismy produkující ethanol
SHF (separate hydrolysis and fermentation) – klasická • do média je zaočkováno inokulum a v bioreaktoru proběhne fermentace • S. cerevisiae a Z. mobilis neumí utilizovat pentosy část zdroje uhlíku a energie zůstává nevyužita snížená výtěžnosti procesu
SHF proces
• E. coli, Klebsiella oxycota, Candida shehatae nebo Pichia stipitis nedosahují takové produkce etanolu, aby mohly být použity jako průmysloví producenti • použití směsné kultury nebo příprava rekombinantních kmenů
Produkce bioethanolu z lignocelulosy
Produkce bioethanolu z lignocelulosy
Metody produkce: SSF (simultaneous saccharification and fermentation) • enzymová hydrolýza probíhá současně s procesem fermentace - kratší dobu v jednom bioreaktoru • omezené riziko inhibice enzymové aktivity
SSF proces
vznikající glukosou - ihned po uvolnění spotřebována • rychlejší a úplnější konverze celulosy – použití nižších dávek enzymů • teplotní optima sacharifikace a fermentace se podstatně liší (45–50°C a 30°C) – kompromis nebo termofilní kmeny: K. marxianus, Candida
acidothermophilum, Fabospora fragilis nebo Clostridium thermocellum • mikroorganismy ani enzymy nelze po fermentaci recyklovat
6
