Aplikace mikroorganismů v biotechnologii

12.10.2016

Aplikace mikroorganismů v biotechnologii

Mgr. Ing. Marta Greplová Ph.D. CRH, Oddělení molekulární biologie

Klasické - mají základ v empirii a používají se od počátku lidské společností při výrobě různých potravin (kvašené okurky a zeli, mléčné výrobky) a nápojů (víno, pivo). Moderní - postupně zaváděny od druhé poloviny 20. století nejen jako důsledek pokroku biologie, biochemie, chemie, genetiky, ale i rozvoje technických oborů (nové objevy v elektronice, informatice a inženýrství, miniaturizace technických součástek, konstrukce mikroanalytických přístrojů).

“bíos” + “techné” + “lógos” život + dovednost/umění + slovo/rozum

výroby různých produktů, využívající živé Jakakoliv Postupy technologie, která využívá biologické systémy, organismy a poznatky o jejich metabolismu živé organismy nebo jejich části k určité výrobě nebo • Zemědělství • Průmysl jejich• přeměně či jinému specifickému použití. Potravinářství • Energetika

(Definice OSN v dohodě biologické diverzitě, 1993) • o Medicína

• Ochrana životního prostředí

ČERVENÁ (medicína a farmacie) ZELENÁ (technologie aplikované v zemědělství) MODRÁ (průzkum a využití mořských živočichů) BÍLÁ (průmyslová výroba chemických látek) ŠEDÁ (životní prostředí - environmentální)

1

12.10.2016

Historie biotechnologie Starověk / středověk: nevědomé využití mikroorganismů 6000 BC

Sumerové - výroba piva zkvašováním cukru

5000 BC

Babyloňané - výrobu kyseliny octové z ethanolu

4000 BC

1590 Zacharias Janssen - první pevné mikroskopy, dvoučočkové

Egypťané – kvasinky pro fermentaci chlebového těsta Číňané – konzervace mléka kvašením, výroba sýrů, vína a octa

1276 AD

Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií

Irsko - první palírna whisky (oficiálně 1608 – dekret Jamese I)

15.století technologie kvašeného zelí a jogurtu

V minulosti byly biotechnologie spíše uměním (řemeslem) než aplikací vědeckých poznatků, příkladem čehož je výroba vína, piva či sýrů. Výrobní postupy těchto procesů byly velmi dobře zvládnuty a bylo dosaženo vysoké reprodukovatelnosti bez znalosti molekulárních mechanismů.

Hlavní Mezníky oblasti vědy,použití které ovlivnily biotechnologie rozvoj biotechnologií posledních let 1855 objevena bakterie Escherichia coli – později hlavní výzkumný a produkční nástroj v biotechnologiích 1863 Mendelovy poznatky (křížení hrachu)

1675 Antonie Philips van Leeuwenhoek jako první pozoroval bakterie (povlak ze zubů) a ve vodě prvoky „animalcules“ 1697 Georg Ernst Stahl studium fermentačních procesů („Zymotechnia Fundamentalis“) 1830 objeveny proteiny 1833 izolovány první enzymy

Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií 19. století - mohutný rozvoj evropského pivovarství 1816 - Stavovská inženýrská škola v Praze 1872 - Pivovarská škola ve Weihenstephanu 1883 - Výzkumný a vzdělávací pivovarský institut v Berlíně

položily základy klasické genetiky 1857 Louis Pasteur – potvrzena úloha bakterií při kvašení

Na přelomu 19. a 20. století dochází v průmyslových biotechnologických procesech k odklonu od původně dominantního pivovarství.

Objevil mikroorganismy ve vzduchu,

Biotechnologie se stávají alternativou chemických výrob – organické kyseliny

příčiny, podstatu kvašení, hniloby a nemoci,

(mléčná, citrónová, máselná). Jsou zakládány sbírky čistých mikrobních kultur

sterilizace teplem (pasterizace), očkování proti vzteklině a Bacillus anthracis

1877 Robert Heinrich Herman Koch - techniky izolace, fixace a barvení bakterií, nové způsoby pěstování čistých bakteriálních

(1884 – Praha, 1906 – Dánsko ad.). 1914 smíšená mikrobní populace („aktivovaný kal“) byla použita pro čištění odpadních vod v Manchestru (Anglie)

kultur, objevil původce cholery, tuberkulózy a anthraxu.

2

12.10.2016

Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií 1928 Alexander Fleming - penicilin, první antibiotikum vhodné pro lidi V následujících desetiletích paralelně s objevy v biologických disciplínách probíhá významný rozvoj technických řešení biotechnologických procesů.

Hlavní obory přispívající k rozvoji biotechnologie Mikrobiologie – zvláště fyziologie a genetika mikroorganismů Molekulární genetika – zejména metody genové manipulace

Genetika vyšších organismů – zejména somatická genetika Bioinženýrství – hlavně zdokonalování technické stránky fermentačních výrob, vývoj bioreaktorů pro enzymové technologie a speciálních technik pro kultivaci živočišných a rostlinných buněk Procesní inženýrství – zvláště automatizace biotechnologických výrob

1942 Norman Heatley, Howard Florey - průmyslová produkce penicilinu 1944 Selman Abraham Waksman - streptomycin, účinný proti tuberkulóze 1953 časopis „Nature“ publikoval práci Watsona a Cricka popisující dvoušroubovicovou strukturu DNA

Interdisciplinární povaha biotechnologií

Biochemie a fyzikální chemie separačních procesů Analytická chemie – aplikace speciálních metod pro analýzu biologických materiálů

Konstrukce výrobních zařízení pro biotechnologie včetně měřící techniky a čidel

Hlavní oblasti použití biotechnologie posledních let ZEMĚDĚLSTVÍ výroba enzymů, doplňků krmiv, ochucovadel, aminokyselin, nových typů krmných antibiotik, zvyšování odolnosti kulturních rostlin, zavádění nových typů kultivarů a kulturních plodin, genetické „dopování“ rostlin s cílem snížit nebo úplně odstranit potřebu jejich hnojení, produkce nových typů biopesticidů a rostlinných vakcín, diagnostika rostlinných chorob POTRAVINÁŘSKÝ PRŮMYSL tradiční bioprocesy – pivovarství, vinařství, drožďárenství, sýrařské technologie, výroba široké škály potravinářských produktů (pečivo, sýry a další mléčné výrobky, konzervované potraviny), nápojů (pivo, víno, destiláty) a aditiv CHEMICKÝ PRŮMYSL výroba alkoholů, organických kyselin, aminokyselin, nukleotidů, degradabilních polymerů, provádění náročných kroků organických syntéz a přeměn labilních meziproduktů, výroba opticky aktivních látek pomocí enzymové katalýzy MEDICÍNA A FARMACEUTICKÝ PRŮMYSL produkce monoklonálních protilátek, očkovacích látek (vakcín), interferonů, peptidových hormonů, bílkovin se specifickými účinky, purifikovaných genů, nových typů antibiotik, zefektivnění výroby vitamínů a léčiv

3

12.10.2016

Hlavní oblasti použití biotechnologie posledních let OCHRANA ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ zpracování a recyklace městských, průmyslových a zemědělských odpadů; biologické čistírny odpadních vod; kompostování; produkce bioplynu; kontrola znečištění; odstranění toxických látek z životního prostředí OSTATNÍ PRŮMYSL získávání kovů z důlních odpadů a z chudých rud; zpracování lignocelulosových odpadů za vzniku nových chemických surovin, energetického etanolu, metanu a vodíku (“zelená energie”) GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ do jednoho organizmu cíleně vnáší určitý gen či geny jiného organizmu. GMO se dnes ve velké míře využívají v • medicíně (výroba insulinu a dalších hormonů) • potravinářství (například rekombinantní chymosin pro výrobu sýrů) • zemědělství (rostliny cukrové třtiny tolerantní k mrazu; salátová zelenina nemající tendenci ke hnědnutí; sója odolná k herbicidům; banány obsahující dávky vakcín pro děti; ovoce a zelenina s vyšším obsahem vitamínů; pomalu zrající broskve a rajčata; dlouho kvetoucí květiny, modré růže ap.; skot odolávající vyšším teplotám, nedostatku vody, odolný vůči masařkám ap.)

Biotechnologicky proces Typické produkty: •

buněčná biomasa, kvasnice, proteiny

•

produkty buněčného metabolismu (primární a sekundární)  anaerobní (alkoholy, kyseliny, CO2…)  aerobní (kyselina citronová, glutamát, laktáty, antibiotika…)

•

produkty enzymatické katalýzy

SUBSTRÁT

1. fáze = „upstream processing“ 2. fáze = biologický proces

PRODUKT

3. fáze = „downstream processing“

Výhody

Nevýhody

nižší energetická náročnost

sterilní podmínky

neagresivní prostředí

vyšší nároky na kontrolu

levné suroviny (odpady)

problémy se zajištěním biomasy

řešení problematiky odpadů,

(skladování)

výživy a péče o zdraví lidí

náročnější izolace (práce ve

vysoká selektivita

větším zředění)

Suroviny: fytomasa (obnovitelné zdroje)-melasa, syrovátka, sulfitové výluhy, sláma, plevy, řepné řízky, bagasa (často odpadní látky)

4

12.10.2016

Biologicky proces Povrchová kultivace používají se podlouhlé perforované nádoby s polotuhým médiem (v 1-10 cm vrstvě), které se po zaočkování umístí v místnosti s kontrolovanou teplotou a vlhkostí nebo kultivace probíhá v pomalu se otáčejících bubnech s kontrolovanou teplotou a vlhkostí (výroba plísňových enzymů) médium se připravuje smícháním otrub s vodou a přídavnými živinami; po sterilizaci se přenese do nádob není možné zabránit sekundární kontaminaci - očkují se vysoké dávky inokula, aby nedošlo k přerůstání kontaminující mikroflórou max. enzymová aktivita po 24 - 72 h kultivace snadné čištění enzymových preparátů a vyšší výtěžnost časově náročné bez míchání

Biologicky proces Submerzní kultivace růst mikroorganismů v třepaných baňkách nebo bioreaktorech volně v médiu sterilní podmínky medium je trvale promíchávané a provzdušňované možnost přesné regulace a kontroly celého procesu mikroorganismy mnohem efektivněji využívají živiny a intenzivněji se množí v průmyslových aplikacích se využívají fermentory (bioreaktory) o různém objemu 0,5l –100000 m3, využívá se 80 % objemu doba fermentace 12 –140 h v závislosti na organismu a produktu

potřeba hodně prostoru

Růst biomasy – růstová křivka

Růst biomasy – růstová křivka

vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase růst buněčné kultury prochází několika fázemi:  Lag-fáze – počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení.  Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření.  Stacionární fáze (plató)– rychlost růstu populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média.  Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením pH (následkem zvýšení koncentrace CO2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.

5

12.10.2016

Fermentace Kvašení (fermentace) je přeměna látky za účasti enzymů mikroorganismů, při němž probíhají v důsledku metabolické aktivity mikroorganismů chemické přeměny organických látek, obvykle sacharidů a vznikají látky energeticky chudší nebo se nové látky

Optimalizace bioprocesu Hlavní faktory, které určují kvalitativní a kvantitativní výsledky bioprocesu:

syntetizují. V potravinářství tento termín označuje procesy, jichž

 konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene

se zúčastní mikroorganismy (např. kvašení piva, vína, těsta).

 optimalizace složení média  výběr typu kultivace

Kvašení anaerobní probíhá bez přítomnosti kyslíku, například kvašení alkoholické, máselné, mléčné. Kvašení aerobní probíhá za přítomnosti kyslíku, například kvašení

 podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií  optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání…)

octové, citrónové.

Kultivační medium

Kultivační medium Návrh složení média

je nutné pro růst a metabolismus mikroorganismů

je nutno znát biochemii kultivace – vliv na metabolismus a fyziologii

tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování

buněčné populace

mikroorganismů (růst, metabolismus, fyziologie)

účel kultivace –> složení média

ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby a složení produktu musí obsahovat dostatečné množství živin

cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu), stálost jeho složení formulace média - kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a dostupností složek média

živiny – růst buněk, získání energie pro syntézu produktu

chemické složení média – určí se ze složení biomasy a produktu,

a zachování buněčné integrity

výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů je potřeba brát v úvahu také bezpečnost a zdravotní nezávaznost elementární složení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P)

6

12.10.2016

Kultivační medium

Kultivační medium zdroj energie hlavní anorganické ionty (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-) stopové prvky (Mn, Co, Ni, Cu, Fe, Zn) aminokyseliny (kyselina L-glutamová)

Syntetické

Komplexní

pufrující složku (CO32-/HCO3-, HPO42-/H2PO4-, TRIS, HEPES )

definované složení

organický zdroj živin

mastné kyseliny a lipidy

-

minerální soli

-

hydrolyzáty proteinů (peptony)

-

čisté esenciální složky

-

extrakty masa, kvasnic

-

zdroj uhlíku a energie

vitamíny a jiné složky různých enzymů specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové faktory) antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) nebo inhibitory acidobazický indikátor (fenolová červeň) sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) odpěňovací prostředky – povrchové napětí

Kultivační medium

Kultivační medium Zdroje dusíku

Zdroje uhlíku pro mikroorganismus jsou obvykle také hlavním zdrojem energie sacharidy: sacharosa, glukosa, fruktosa, laktosa, surový řepný cukr,

amonné soli: síran amonný (NH4)2SO4 rozpustný ve vodě, levný chlorid amonný NH4Cl fosforečnan amonný (NH4)3PO4

škrob, celulosa

amoniak: také pro úpravu pH fermentačního média

komplexní substráty (sacharidická média): melasa, sladká syrovátka,

močovina (NH4)2CO

celulózové substráty, sulfitové výluhy

čisté aminokyseliny: často se používají také jako růstové látky

rostlinné oleje a živočišné tuky: sójový, slunečnicový, palmový, řepkový,

komplexní zdroje: kukuřičný výluh – odpad při výrobě kukuřičného škrobu

bavlníkový, sádlo, rybí tuk

šroty a mouky – odpady při výrobě olejů

petrochemické zdroje: uhlovodíky z ropy (C10-C20 alkany), syntetické

sušená syrovátka

alkoholy, organické kyseliny

peptony kvasničný extrakt

7

12.10.2016

Kvasničný extrakt

Kultivační medium

Produkovaný z odpadu pekárenských a pivovarských kvasinek; jiným zdrojem je

Kluyveromyces marxianus kultivovaná na syrovátce nebo Candida utilis na etanolu, případně odpady ze zpracování dřeva a papíru.

Zdroje fosforu Fosfor - klíčový prvek v energetickém metabolismu a je tímto limitující pro růst fosforečnany: fosforečnan amonný (NH4)3PO4 (také zdroj dusíku) komplexní zdroje: kukuřičný výluh mouky a šroty (arašídové, sójové) masové, masokostní a rybí moučky

Stopové prvky anorganické soli (především sírany a chloridy) – laboratorní podmínky kukuřičný výluh, sójová a arašídová mouka, řepná melasa, syrovátka - průmysl

Kultivační medium

Bioreaktory Pojmy „fermentor“ a „bioreaktor“

Pěnění je typickým průvodním jevem většiny průmyslových fermentačních půd s vysokou koncentrací substrátů. struktura pěny je ovlivněna řadou faktorů (pH, teplota, viskozita, míchání…) každý použitý substrát určitým způsobem ovlivňuje tvorbu pěny nadměrné pěnění - ztráty v objemu kultury, možnost kontaminace odpěňovací prostředky (přírodní rostlinné nebo živočišné a syntetické) často zároveň slouží i jako zdroj uhlíku

jsou synonyma pro totožná zařízení, která jsou považována za srdce výrobní linky biotechnologického procesu. Probíhá v nich růst buněk a tvorba produktů, nebo konverze substrátu na jeden či více produktů, přičemž proces je katalyzován buď

obecně by pro ně mělo platit, aby působily již v nízké koncentraci a

volnými buňkami, nebo buňkami

dlouhodobě, aby nebyly toxické vůči danému mikroorganismu

vázanými na nosič, nebo jedním či

používají se přírodní oleje a tuky, vyšší alkoholy, deriváty sorbitanu,

více enzymy vázanými na nosič.

polyethery a silikony různého složení

8

12.10.2016

Výběr bioreaktoru

Parametry bioreaktoru  Biologické vlastnosti = velikost mikroorganismů a jejich morfologie (vláknité,

Musí odpovídat především biologickým vlastnostem kultivovaných mikroorganismů nebo buněk. Kromě toho je ale třeba respektovat i chemické, fyzikální ale i technologické parametry.

jednobuněčné, plovoucí, přisedlé…) a také citlivost vůči střižným sílám  Charakter substrátu = pevný, polotekutý, kapalný, plynný  Provzdušňování = povrchově nebo submerzně  Sterilizace = nutno vždy odstranit ostatní mikroorganismy  Velikost kultivačního zařízení = přechod v rozsahu jednoho objemového řádu  Nároky na energie, cena zařízení a jeho provozu

Materiály vhodné pro konstrukci fermentorů odolné vůči korozi – nesmí uvolňovat do média kovy netoxické vůči populaci buněk schopné sterilizace parou o vysokém tlaku odolné vůči deformaci – míchadla, vstupní porty transparentní materiály (sklo)

Bioreaktory - typy

Bioreaktory Základní částí: přívod a odvod média přívod inokula míchací zařízení s motorem ventil na přívod vzduchu zařízení na odběr vzorků vyhřívání

dle fází jednofázové (kapalný substrát s rozpuštěným enzymem) dvoufázové (kapalina x částice / kapalina x mikroorganismy) třífázové (plyn x kapalina x mikroorganismy) čtyřfázové (tuhý substrát x plyn x kapalina x mikroorganismy) dle způsobu vedení fermentace

teploměr, tlakoměr

„batch“ (vsádková, diskontinuální) - jedno naplnění

měřící a regulační články pH,

kontinuální (průtoková) - průběžné doplňování živin a odběr

koncentrace O2, antifoam

produktu v průběhu fermentace

peristaltické pumpy

"fed-batch„ (semikontinuální, přítoková, příkrmová) - s postupným

řídící jednotka

přidáváním živin

9

12.10.2016

„Batch“ fermentace nejjednodušší technologická varianta fermentace všechny živiny se přidávají před začátkem procesu konstantní objem po celou dobu fermentace zpomalení růstu po vyčerpání živin možná inhibice růstu toxickými látkami ukončení kultivace po zpomalení růstu kultury nebo poklesu koncentrace produktu

„Fed-batch“ fermentace začátek procesu je stejný počáteční koncentrace substrátu je nízká dokrmování - periodické přidávání živin (postupně nebo konstantní rychlostí) zvýšení produkce biomasy a výtěžku produkt zůstává v reaktoru až do konce procesu možná inhibice růstu toxickými látkami

Kontinuální fermentace nepřetržitý pomalý přítok živin do systému za současného nepřetržitého odebírání kultivačního media, čímž je zajištěn dostatek živin po celou dobu kultivace a zároveň se naředí i případné toxické metabolity prodloužení exponenciální fáze růstu kultury buňky jsou udržovaný v trvalé aktivním

Kontinuální fermentace Růst mikroorganismů v logaritmické fázi: 𝑑𝑋 = 𝜇𝑋 𝑑𝑡

𝜇 – rychlostní konstanta, tzv. specifická růstová rychlost 𝑋 – koncentrace mikroorganismů

Rychlost množení mikroorganismů při kontinuální fermentaci: 𝑑𝑋 = 𝜇𝑋 − 𝐷𝑋 = 0 𝑑𝑡

𝐷=

𝐹 𝑉

𝐷 – zřeďovací rychlost 𝐹 – rychlost průtoku prostředí 𝑉 – jednotka objemu

fyziologickém stavu provádí se v režimu turbidostat, chemostat nebo auxostat několik týdnů až měsíců vyšší riziko kontaminace

Závislost specifické růstové rychlostí na rychlost zřeďovací: 𝑫 >𝝁

kultura se vyplavuje

𝑫 <𝝁

kultura přerůstá

𝑫 =𝝁

rovnovážný stav

10

12.10.2016

Kontinuální fermentace

Kontinuální fermentace

Turbidostat dodáváme nadbytek živin a kultura roste maximální rychlostí zřeďovací rychlost mírně kolísá kolem hodnoty maximální specifické růstové rychlostí náročný na řízení (nutno průběžně sledovat počet buněk)

Chemostat rychlost růstu je limitována koncentrací jedné živiny zřeďovací rychlost je menší než maximální specifická růstová rychlostí po určité době se ustaví rovnovážný stav a v prostředí je určitá koncentrace buněk samoregulační schopnost kontinuální kultury

Auxostat konstantní parametr spjatý s růstem (pH-auxostat, pO2-stat, CO2-stat)

Bioreaktory - typy dle technického provedení

Bioreaktory - typy dle aktivní biologické složky

otevřené (volně otevřené prostředí)

enzymové (mohou být volné nebo imobilizované, tedy uchycenné)

uzavřené (kontrolované uzavřené prostředí)

virální (např. produkce vakcín)

membránové (část prostoru oddělena pomoci membrány)

mikrobní (volné, imobilizované)

fotobioreaktor (organismy vyžadující světlo) dle způsobu míchaní

buněčné (rostlinné či živočišné kultury dle objemu

nemíchané

laboratorní (do cca 30 l)

mechanicky míchané (mechanické míchadlo, rotační pohyb reaktoru)

čtvrtprovozní (30 až 100 l)

hydraulicky míchané (míchání proudem kapaliny)

poloprovozní (100 až 5000 l)

pneumaticky míchané (probublávané)

provozní (nad 5 m3)

11

12.10.2016

Bioreaktory - typy dle aerace aerobní (za přístupu kyslíku) mikroaerobní (minimální přístup kyslíku) anaerobní (přístup kyslíku je zamezen) dle typu sterilizace nesterilizovatelné autoklávovatelný (skleněná nádoba)

in-situ sterilizovatelný (nerezová nádoba, sterilizace parou) dle tvaru válcové s kulatým dnem cirkulační věžové

Hlavní typy průmyslových bioreaktoru

Základní typy míchadel Turbinové míchadla

Míchací tank (Stirred tank) mechanické míchadlo (lopatkový rotor) zajišťuje homogenní distribuci

Vysoké střižné síly způsobují dispergací vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená.

tepla, živin a kyslíku (dispergace bublin aeračního plynu) nárazové kryty napomáhají míchání díky nárůstu víření, zabraňují tvorbě středového víru a eliminují „mrtvý objem“

Vrtulové míchadla Vyznačují se vysokou čerpací kapacitou, menšími střižnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense

více než 70 % průmyslového použití přísná kontrola jednoduché čištění omezená velikost

a) vrtulové b) turbinové s narážkami c) turbinové bez narážek

12

12.10.2016

Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Vířivý reaktor (air lift reactor)

Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Reaktor s pevnými nosiči (packed bed reactor)

vysoký reaktor míchaný pouze vzduchem a rozděleny na 2 častí pomocí

buňky mikroorganismů jsou imobilizované na velkých částicích a umístěné

sací trubky (vnitřní provzdušňovaný region a vnější neprovzdušňovaný)

v koloně, kde se pak přidávají živiny

gradient hustoty vyvolává neustálou cirkulací

průtok se mění během procesu kvůli postupné změně pórovitosti nosiče

omezená střižná síla

kvůli postupnému stlačování

jednoduchý design a údržba

nosiče může doházet k poklesu

malá spotřeba energii

tlaku napřič koloně

větší spotřeba vzduchu a vyšší tlak

obtížné čištění a výměna

používaný pro čištění odpadních vod, savčí

mikroorganismů

tkáňové kultury, biologické procesy

malá spotřeba energii

(biokatalýza), farmaceutický průmysl

vysoký výtěžek používaný hlavně pro čištění odpadních vod

Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Membránový reaktor zařízení kombinující proces bioreakce a membránové separace do jednoho celku kultivace tkáňových kultur,

Sterilizace Sterilita = nepřítomnost živých mikroorganismů Sterilizace média, bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí,

ventily, filtry, senzory, vzduch, vzorkovač, atd.)

kmenových buněk, čištění

nasycenou párou 121-141ºC, 0.2 MPa

odpadních vod

horkým vzduchem 150-180ºC chemický – etanol, chlornan sodný, fenol, β-propiolakton, formaldehyd UV, X-rays, β-zaření ultrafiltrace – plyny, roztoky velké reaktory „in situ“ (SIP), malé v autoklávu

13

12.10.2016

Kultivační podmínky Úzký rozsah podmínek, za kterých mikrobiální procesy probíhají

Reaktory jsou vybaveny senzory a zařízeními pro měření a řízení základních procesních parametrů.

Teplota optimální růstová teplota kmene, obvykle 10 - 40°C urychluje řadu metabolických reakcí ale při vyšších teplotách – rychlejší denaturace bílkovin a dezaktivace enzymů (využití při sterilizaci) lze využit pro změny rychlostí růstu a produkce teplo je generované samotnou metabolickou aktivitou a také mícháním

Kultivační podmínky pH optimální růstové pH kmene, většina mikroorganismu pH 4-8 růst mikroorganismů velmi citlivý na hodnotu pH (enzymová aktivita závisí na pH) s hodnotou pH souvisí i odolnost vůči vyšším teplotám – čím vyšší odchylka od ideálního pH, tím nižší odolnost vůči vysokým teplotám lze omezit kontaminaci vliv složení média indikátor metabolismu regulace – automatizované dávkování H+ a OH- (NaOH, KOH, NH3, H3PO4, H2SO4) (kaskáda)

regulace teploty díky cirkulaci vody v dvojitém plášti nebo pomocí elektrický ohřívané dečky

Kultivační podmínky Aerace

Příprava inokula převedení zakonzervované buněčné kultury ve stavu

podle metabolizmu produkce

klidu do živného média do produktivního stavu růstu a

sterilní vzduch je dodávány pod tlakem ze spodu fermentační nádoby

množení

důležitá je koncentrace rozpuštěného kyslíku (DO - dissolved oxygen):  otáčky míchadla

zabránit možnostem kontaminace média

 průtok vzduchu

několik tisíc buněk → několik set litrů kultury

 tlak

transfer do produkční nádoby se provádí na konci

rychlost rozpouštění kyslíku zaleží na velikosti bublin vzduchu velikost vzduchové bubliny zaleží na průměru přívodové trubičky

exponenciální fáze růstu

limitace kyslíkem v různých fázích

inokulum se do kultivační nádoby obvykle dodává v

řízení dostupnosti energie

množství okolo 1- 5 % objemu

změny metabolismu

14

12.10.2016

Scale-up

15