PŘENOS KYSLÍKU V BIOTECHNOLOGII Při aerobních procesech katalyzovaných buňkami nebo enzymy je nutné zabezpečit dostatečný přívod kyslíku do fermentačního média reaktoru (fermentoru). U některých organismů i krátkodobá limitace metabolismu kyslíkem může způsobit nevratné změny v respiračním systému. Vždy dochází ke snížení rychlosti růstu a tvorby produktů. Limitace kyslíkem má proto negativní nejen biochemické, ale i ekonomické dopady. Požadovaná koncentrace kyslíku v růstovém nebo produkčním médiu se dosahuje vhodným vzdušněním a mícháním. Ukazatel účinnosti systému vzdušnění a míchání je jedním z nejdůležitějších parametrů fermentačního zařízení. Jeho určení a další využití v biochemii je náplní této práce. Úvod Limitace metabolismu kyslíkem Důvody limitace respirace a růstu buněk kyslíkem (analogicky u enzymů) vyplývají z následujících vztahů. Při aplikaci kinetiky Michaelise a Mentenové platí: QO2 = QO2, m c/(Km + c)
(1)
QO2 specifická rychlost spotřeby kyslíku (QO2,m je maximální hodnota) Km Michaelisova konstanta pro kyslík (v případě celých buněk jde o zdánlivou hodnotu) c koncentrace kyslíku v kapalném médiu Podle Monodova vztahu pro podmínky růstu mikroorganismů platí: =
m
c/(KS + c)
(2)
specifická růstová rychlost ( m je maximální hodnota) KS saturační konstanta pro kyslík Byly pozorovány i odchylky od těchto kinetik. Vliv koncentrace kyslíku na metabolismus růstových kultur mikroorganismů souvisí dále se vztahem rychlosti respirace a růstu mikroorganismů: Q = (1/YX/O) (dX/dt) + mO2X
(3)
po zanedbání mO2 a úpravě (dX/dt = X): QO2 = /YX/O Q celková rychlost spotřeby kyslíku YX/O výtěžek biomasy na kyslík X koncentrace biomasy t čas
(4)
2
mO2 specifická rychlost spotřeby kyslíku související s procesy nespojenými s růstem (udržovací koeficient) Ze vztahů (3) a (4) lze experimentálně určit YX/O, případně mO2. Uvedené vztahy demonstrují úzkou souvislost mezi koncentrací kyslíku a respirační, příp. růstovou, aktivitou mikroorganismů. Koncentrace kyslíku ve fermentačním médiu by měla být udržována nad jeho limitující koncentrací (oblast Km, resp. KS). Někdy se tato hodnota vyjadřuje jako dolní kritická koncentrace kyslíku. Zbytečně vysoká koncentrace kyslíku naproti tomu vyžaduje zvýšené vdušnění a míchání, což se projeví zvýšenými náklady na energii. Objemový koeficient přestupu kyslíku (kLa) Pro rychlost přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze lze odvodit následující vztah: dc/dt = kLa(cs-c)
(5)
c okamžitá koncentrace kyslíku v kapalině cs nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku v kapalině kLa objemový koeficient přestupu kyslíku kLa představuje součin koeficientu přestupu kyslíku z fázového rozhraní do kapalné fáze (kL) a specifického povrchu mezifázového rozhraní (a). Je konstantní pouze pro dané podmínky aerace. Hodnota kLa je ukazatelem účinnosti aeračního systému a důležitým parametrem pro přenos výsledků do většího měřítka. Své uplatnění má i v dlouhodobém sledování respirační aktivity organismů. Je-li v systému kultura respirujících mikrooorganismů (příp. jiných aerobních organismů nebo se studují enzymové systémy a neuvažujeme-li v případě buněk o diskutabilním přestupu kyslíku z plynné fáze přímo do buňky, ale pouze o přestupu v kapalině rozpuštěného kyslíku do buňky), rovnice (5) má tvar: dc/dt = kLa(cs - c) - Q Po úpravě c' = cs - Q/kLa
(6) (7)
kde c' je koncentrace kyslíku za podmínky dc/dt = 0, výsledek rovnováhy mezi rychlostí spotřeby kyslíku kulturou a rychlostí jeho dodávky z plynné fáze do kultury, rovnice (6) přejde na tvar: dc/dt = kLa(c' - c)
(8)
po integraci (v hranicích 0 - t, c0 - c): c = c' - (c' - c0)exp(-kLa.t)
(9)
Vztah (9) vyjadřuje časový průběh koncentrace kyslíku v provzdušňované kultuře (před dosažením rovnovážné koncentrace kyslíku c').
3
Určení kLa Z více možností zde uvedeme tři často používané způsoby, které budou předmětem experimentální práce. 1. Vytěsňovací metoda V kapalině bez respirujících organismů se vytěsní kyslík inertním plynem a po té se za definovaných podmínek aerace registruje sycení média kyslíkem. Po integraci rovnice (5) (v hranicích 0 - t, c0 - c) platí: ln(cs - c) = ln(cs - c0) - kLa.t
(10)
kLa představuje směrnici experimentální závislosti ln(cs - c) = f(t). Za přítomnosti respirujících organismů lze určit kLa vytěsňovací metodou po inaktivaci organismu (Q = 0), což však neodpovídá přirozeným fyziologickým podmínkám. 2. Dynamická metoda Tato metoda určuje kLa i cs v reálných kultivačních či produkčních podmínkách s respirujícím organismem. Je založena na vyhodnocení změn koncentrací kyslíku v kapalném médiu po přerušení a opětném spuštění přívodu vzduchu. Typický záznam těchto změn je na obr. 1. Z lineárního poklesu c v čase po zastavení přívodu vzduchu se určí Q (Q = -dc/dt). Po spuštění přívodu vzduchu podle rovnice (6) platí: c = (-1/kLa)(dc/dt + Q) + cs
(11)
Po určení průběhu dc/dt ve vázi vzdušnění se získá kLa i cs z lineární závislosti (11). 3. Rovnovážná metoda kLa se určí za podmínek ustáleného stavu, kdy dc/dt = 0. Z rovnice (6) plyne: kLa = Q /(cs - c')
(12)
c' je ustálená koncentrace kyslíku, viz obr. 1 a vztah (7). Výpočet je jednodušší než v případě dynamické metody, při nižší intenzitě aerace však navodění ustáleného stavu může trvat delší dobu. Q lze opět změřit v uzavřeném systému, na rozdíl od dynamické metody musí být známa hodnota cs. Při porovnávání aerační účinnosti různých fermentačních zařízení a pro optimalizaci míchání a vzdušnění je výhodné určení kLa vytěsňovací metodou. Pro určení kLa v reálných kultivačních nebo produkčních podmínkách je vhodnější dynamická nebo rovnovážná metoda. Měření respirační aktivity v otevřeném systému
4
Při znalosti kLa a cs je možné v otevřeném (vzdušněném) systému dlouhodobě sledovat respirační aktivitu organismů. Ze vztahu (6) plyne: Q = kLa(cs - c) - dc/dt v rovnovážném stavu: Q = kLa(cs - c')
(13) (14) Cíl práce
Stanovení objemového koeficientu přestupu kyslíku jako indikátoru účinnosti aerace; využití v měření rychlosti respirace. Vybavení Kyslíková elektroda, amperometrický detektor, zapisovač, termostat, magneticky míchaná termostatovaná měřící nádobka v horní části uzavíratelná zábrusem s kapilárou, v dolní části nádobky je připevněna kyslíková elektroda, tlaková nádoba s dusíkem, kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Pracovní postup Kalibrace kyslíkové elektrody Nulová hodnota se nastaví pomocí roztoku siřičitanu sodného, nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku pomocí destilované vody. V měřící nádobce s kyslíkovou elektrodou se aeruje destilovaná voda, po ustálení záznamu koncentrace kyslíku se nastaví její tabelovaná hodnota pro danou teplotu a atmosferický tlak. Určení kLa vytěsňovací metodou Destilovaná voda v otevřené měřící nádobce se zbaví kyslíku probubláváním dusíkem. Pracovní objem kapaliny je dán maximálním objemem nádobky vymezeným zábrusovou zátkou. Jakmile se koncentrace kyslíku blíží k nule, přeruší se přívod dusíku a za daných podmínek aerace (konstantní objem a otáčky míchadla, teplota 26 oC) se voda sytí vzdušným kyslíkem. Na zapisovači získáme záznam odpovídající rovnici (5). cs se odečte po ustálení nasycené (rovnovážné) koncentrace kyslíku ve vodě. Z rovnice (10) určíme kLa lineární regresí. Určení kLa dynamickou metodou 0,2 g pekařského droždí se rozsuspenduje v 50 ml vytemperované destilované vody a suspenze se přenese do měřící nádobky (teplota 26 oC). Po uzavření nádobky zábrusem (za nepřítomnosti vzduchových bublin) se zapne míchání a registruje lineární pokles koncentrace kyslíku v čase (při konstantní rychlosti spotřeby kyslíku). Q je dáno směrnicí této lineární závislosti. U koncentrace kyslíku rovnající se asi 1/4 cs se otevře měřící nádobka a registruje se závislost odpovídající rovnici (6), resp. (9) (za stejných podmínek aerace jako u vytěsňovací metody). V aerační fázi se určí průběh dc/dt a ze závislosti c = f(dc/dt + Q) se podle rovnice (11) určí kLa a cs lineární regresí.
5
Výpočet dc/dt Derivaci lze určit různými způsoby, zde se aplikuje numerická derivace po vyrovnání daného úseku křivky polynomem 2. stupně. Z pěti bodů se vypočte derivace v prostředním bodě, potom se přidává postupně další bod na křivce a výpočet opakuje (za použití počítače), viz obr. 2. Určení kLa rovnovážnou metodou Po experimentu s dynamickou metodou vyčkáme ustáleného stavu a odečteme c'. Pro případnou změnu rychlosti respirace opět změříme Q po uzavření nádobky zábrusem. kLa určíme z rovnice (12). Závěr Z naměřených hodnot se porovnají rozdíly kLa určených v destilované vodě a suspenzi mikroorganismů. Vyhodnotíme respirační aktivitu mikrobiální kultury na základě měření v otevřeném systému (rovnice (13) a (14)).
C I aerace vypnuta
II
III
aerace zapnuta
t Obr. 1. Časový průběh koncentrace kyslíku ve fermentoru s organismy nebo enzymy spotřebovávajícími kyslík. Fáze I: Q = -dc/dt, fázi II popisují vztahy (6) a (9), ve fázi III c = c' (rovnovážný stav, vztah (7) a (14)).
6
C c+2 c+1 c0 c-1
c-2
t
t
Obr.2. Schematické znázornění výpočtu numerické derivace v bodě c0 závislosti koncentrace kyslíku na čase u dynamické metody určení kLa. dc0/dt = (-2c-2 - c-1 + c+1 + 2c+2)/10. t
