Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem DIPLOMAMUNKA. Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Készítette: Nagy Nikolett. Budapest 2007

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

DIPLOMAMUNKA

Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Készítette: Nagy Nikolett

Budapest

2007.

1

Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás

3

Rövidítések jegyzéke

4

1. Célkitűzések

5

2. Irodalmi áttekintés 2. 1

A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája

2. 2

A dUTPáz, mint ígéretes célpont

2.2.1 A dUTPáz szerepe az élő szervezetben 2.2.2

A dUTPáz mint új gyógyszeripari célmolekula

6 9 9 13

2. 3

A dUTPáz szerkezete és reakciómechanizmusa

15

2.4

Európai Uniós pályázati stratégia

20

2.4.1 Szűrővizsgálati lehetőségek

21

A röntgendiffrakció alapjai, interferencia, rácssíkok és Bragg-egyenlet 23

3. Anyagok és kísérleti módszerek 3.1 A Mycobacterium tuberculosis dUTPázának klónozása

25

3.2 A fehérje expressziója és feltárása

26

3.3 Fehérje tisztítási lépések 3.3.1

Ioncserélő folyadékkromatográfia

27

3.3.2

Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel (FPLC)

28

3.4 Fehérje vizsgálati módszerek 3.4.1

Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE) 29

3.4.2

Fehérjekoncentráció meghatározása

31

3.4.3

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia

33

3.4.4

Enzimaktivitás mérése

34

3.4.5

Limitált tripszinolízis

35

3.5 Kristályosítási kísérlet 3.5.1

Szerkezetvizsgálat röntgendiffrakciós módszerrel

37

4. Eredmények és kiértékelésük 4.1

A fehérje előállítása

39

2

4.2

Enzimaktivitás mérése

42

4.3

Szubsztát analóg gátlás

44

4.4

A szubsztrát analóg kötődésének spektroszkópiai vizsgálata

46

4.5

Limitált tripszinolízis kísérletek

50

Tömegspektrometria vizsgálat

54

4.5.1 4.6

Kristályosítási kísérlet

55

5. Eredmények összefoglalása

59

Irodalomjegyzék

60

3

Köszönetnyilvánítás Elsőként szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy kutatócsoportjában dolgozhassam, megismertetett a téma alapjaival és irányította a munkámat. Köszönöm Dr. Barabás Orsolyának, hogy segítségemre volt a kristályosítási kísérletben és megtanította mind a gyakorlati, mind pedig az elméleti fehérje krisztallográfiai alapokat. Továbbá szeretném megköszönni Takács Enikőnek, hogy a klónozási munkálatokban és az egyéb felmerülő problémák megoldásában a segítségemre volt. Köszönöm Klement Évának és Dr. Medzihradszky Katalinnak, a szegedi Proteomikai Laboratórium kutatóinak a tömegspektrometria elemzést. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Harmat Veronikának, aki az ELTE Elméleti Fizika Tanszékén a röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatban nyújtott segítséget. Köszönöm Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Végül köszönöm az egész kutatócsoportnak, hogy munkám során támogattak, mindvégig a segítségemre voltak és, hogy a felmerülő problémákkal mindig fordulhattam hozzájuk.

4

Rövidítések jegyzéke

ATP-áz BSA CD dNTP DTT dTTP dUDP dUMP dUPNPP dUTP dUTPáz EGTA FPLC HEPES hP IPTG IPP IPP M. tub. MESG MESG PEG MMEE PNP PNP NaPi oP/tP PEG PMSF SDS TES TRIS

adenozin trifoszfatáz Bovine Serum Albumin (marhaszérum albumin) cirkuláris dikroizmus dezoxinukleotid-trifoszfát ditio-treitol dezoxitimidin-trifoszfát dezoxiuridin-difoszfát dezoxiuridin-monofoszfát α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát dezoxiuridin-trifoszfát (dezoxiuridin-trifoszfát)-nukleotid hidroláz etilénglikol-bisz-(b-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraecetsav Fast Protein Liquid Chromatography (gyors fehérje folyadékkromatográfia) N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etán-szulfonsav) hexagonális primitív izopropil-tio-galaktozid inorganikus pirofoszfatáz inorganikus pirofoszfatáz Mycobacterium tuberculosis 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid polietilén-glikol monometil-éter purin-nukleozid foszforiláz purin-nukleozid foszforiláz nátrium-foszfát puffer ortorombos primitív/ tetragonális primitív polietilén-glikol fenil-metil-szulfonil-fluorid nátrium-dodecil szulfát N-trisz(hidroximetil)metil-2-amino-etán-szulfonsav trisz-(hidroximetil)-aminometán

5

1. Célkitűzések

Munkám során sikerült bekapcsolódnom egy Európai Uniós pályázati munkába, melyben az MTA Enzimológiai Intézetén kívül még hat intézmény vesz részt. A pályázat két évre szól és célja a Mycobactérium tuberculosis dUTPáz enzimének karakterizálása és olyan szűrőmódszerek kidolgozása, melyek közepes illetve nagy áteresztő képességűek, így segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk szűrni az M. tub. dUTPáz enzime ellen ható lehetséges antagonistákat. A lehetséges molekulák szerkezetét a SZTAKI és az ELTE Számítógéptudományi Tanszékének informatikusai tervezik meg, számítógépes modellezés segítségével. Ebben a modellezési munkában a kiindulási adatbázis felöleli mindazokat a hatóanyag molekulákat, melyeket a gyógyászatban napjainkban használnak. A pályázathoz kapcsolódva, TDK munkám célkitűzései a következők voltak: 1. alcél A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz enzim génjének klónozása és a fehérje expresszáltatása. 2. alcél Az M. tub. dUTPáz enzim enzimológiai és fehérjeszerkezeti karakterizálása. 3. alcél Nagy áteresztő képességű és gyors szűrőmódszerek kidolgozása, az M. tub. dUTPáz enzim antagonistákkal alkotott komplexeivel szemben. 4. alcél Az M. tub. dUTPáz kristályosítása a nagyfelbontású háromdimenziós térszerkezet meghatározása céljából.

6

2. Irodalmi áttekintés

2.1 A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája

Számos sikeres terápia ellenére, a bakteriális és vírusos járványok még mindig nagy egészségügyi kockázatot jelentenek az emberiségre nézve. A mutáns mikrobák folyamatos jelenlétének következtében azok a gyógyszerek, amelyek hosszú ideig hatékonynak bizonyultak, hatásosságukat nézve nem tartósak. Valójában az antibakteriális és antivirális hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerek használata egy meglehetősen szelektív környezetet idéz elő, mely a baktériumtörzseket hirtelen és gyors evolúcióra ösztönzi. Így az egyes baktériumok képesek a jelenleg használt gyógyszerek jelenlétében is életképesek maradni. Ebből kifolyólag egyszerű belátni, hogy újfajta hatóanyagokra van szükség. A mikrobák mutációra való hajlamának kijátszásához összetett gyógymódokra van szükség. Ideális esetben e gyógymódok eltérő hatásmechanizmussal rendelkeznek, és hatékonyságuk egyértelműen és gyorsan összehasonlítható. Mindez lehetővé tenné, hogy a lehetséges molekuláris célpontok között valódi választási lehetőség álljon fel. A kisszámú molekuláris célpontra való összpontosítás helyett - amely a mikrobák gyors evolúcióját és ez által a célpontok mutációját váltja ki -, eredményesebbnek gondoljuk azt, ha kombinált terápiával egyszerre több célpontot támadunk. A nagy áteresztő képességű vizsgálat hatásos lehet meglehetősen eltérő célpontok esetén is. Ez a megközelítés jelentősen megnöveli a fehérje célpont molekulák számát. A célpont azonosítás nagy kihívása a mai molekuláris biológiának, genetikának és enzimológiának. Kutatási tervünk legfontosabb célja az, hogy új utat kínáljunk a célpontok azonosítását illetően, valamint potenciális ellenszereket keressünk. Ebben a munkában több tudományág is összekapcsolódik: a számítástechnika, a bioinformatika, a biofizika, a fizikaikémia, valamint molekuláris biológiai módszerek. A kutatás egyik alcélja az, hogy néhány ezer fehérjét egyszerre tudjunk vizsgálni nagy felbontó képességű fehérjeszerkezeti információk hozzáférhetővé tételével. Jelen esetben az M. tub. dUTPázán keresztül végezzük a kísérleteket.

7

A Mycobacterium tuberculosis- a tuberculosis nevű betegség kórokozó ágenseegy Gram-pozitív baktérium, amely a fejlett és fejlődő országokban egyaránt súlyos egészségügyi problémát jelent. A fertőzést hordozó betegek jó néhány évig vagy akár évtizedig is lappangási állapotban vannak. Ez megkönnyíti a betegség légutakon keresztül való terjedését, hiszen ezek a páciensek már bármerre utazhatnak a világban. Az első terápia elég gyakran sikeresnek ígérkezik, mert a fő tüneteket gyorsan megszünteti. Ahhoz azonban, hogy teljesen kipusztuljon a baktérium a beteg szervezetéből, egy jóval hosszabb szisztematikus gyógyszeres kezelésre van szükség. Különösen nem optimális körülmények között élő emberek esetén gyakori, hogy nem tartják be a szigorú gyógyszeres kezelést és ez multirezisztens törzsek kialakulásához vezet, amelyeket nehezebb elpusztítani. A betegség légutakon keresztül terjed így elég könnyen fertőzödhetnek meg nagy populációk még akkor is, ha csak egy hordozó személlyel állnak szorosabb kapcsolatban (pl.: iskolákban, börtönökben, kollégiumokban és a hadseregnél). Nem véletlen, hogy számos országban hosszú ideig kötelező volt a tüdőbaj (Mycobacterium tuberculosis-al való fertőzöttség) szűrése. Az ötvenes években a modern antibiotikumos kezeléseknek köszönhetően jelentősen visszaesett a betegek száma. A baktériumot azonban nem sikerült teljesen kipusztítani és kontroll rendszerek hiányában a betegek száma újból elkezdett növekedni. Az előrejelzések szerint az elkövetkező évtizedben akár 200 millió ember is megbetegedhet (WHO). A fertőző betegségek között a tuberculosis az AIDS után a leghalálosabb betegség és körülbelül 2 millió áldozatot követel évente. A nem megfelelő gyógyszeres kezelésnek köszönhetően a multi-rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsek könnyebben fejlődnek, mivel az M. tub. fő DNS polimeráza olyan enzim, ami a DNS-hibákat jól tolerálja, így elősegíti a mutációkat. Ez az enzim fontos szerepet játszik a baktérium gyors evolúciójában és segítségével a vírus képes megduplázni a mutáns DNS másolatokat, különböző bázispárosodásokon és egyéb hibákon keresztül (1,2). Ezekből az okokból kifolyólag a baktériumnak kiemelkedően nagy a mutációra való hajlama. A Mycobacterium tuberculosis genomját napjainkra szekvenálták és leközölték (3). A genom 4000 gént tartalmaz és ezek nagy része csak a Mycobacteriumra jellemző. Néhány Mycobacterium tuberculosis fehérjét nagy felbontó képességű szerkezeti vizsgálatnak vetettek alá és jelenleg 72 darab különböző háromdimenziós fehérje szerkezet érhető el a fehérje adatbankból. Ezek nagy többsége enzim fehérje. Ha ezt összehasonlítjuk a meglehetősen 8

csekély számú TB elleni gyógyszerrel, amelyeket jelenleg a gyógyászatban használnak (mindössze 4 darab), akkor megállapíthatjuk, hogy a lehetséges és elérhető célpontok száma jóval több is lehetne. A Mycobacterium tuberculosis elleni gyógyszeres kezelések esetén a legnagyobbb problémát az jelenti, hogy a baktérium rendkívül szívós (4). Ez a sajátság gyakran lappangásban jelentkezik olyan egyéb tünetekkel egybekötve, amelyek kapcsolatba hozhatóak az aktív vírussal. A betegek a látens időszakban hordozzák a betegséget és ebből kifolyólag járványtani kockázatot jelentenek. Annak érdekében, hogy sikeresen kipusztítsák a baktériumot a fertőzött személyből a hosszabb és összetettebb gyógyszeres kezelés elengedhetetlen. Napjainkban a következő négy gyógyszert alkalmazzák a tuberculosis elleni kezelésekben; streptomycin, rifampicin, isoniacid és pyrazinamid. A streptomycin a bakteriális riboszómát támadja meg (5). Kötőhelye a riboszómális alegységek határfelületén található.

A rifampicin szintén elterjedt a tuberculosis elleni

gyógyászatban. A legtöbb rezisztens mutáns esetén a mutáció az RNS-polimeráz béta alegységét érinti (6). Az izoniacid támadási pontja az enoil-reduktáz enzim, amelynek a mikolsav bioszintézisében van szerepe. A mikolsav származékok a Mycobacterium sejtfal szintéziséért felelősek (7). Az izoniacid rezisztencia hátterében a kataláz-peroxidáz inaktivációja áll. A kataláz-peroxidáz felelős az izoniacid előanyagának biológiailag aktív anyaggá való átalakításáért (8). A kataláz-peroxidáz hiánya együtt jár egy emelkedett alkilhidroxi-peroxidáz termeléssel. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitás a kataláz-peroxidáz hiányában védelmet nyújt az antioxidánsok ellen. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitásért felelős enzimek szintén újszerű célpontok lehetnek az új Mycobacterium elleni ellenszerek kifejlesztésében (9). A pyrazinamid, ami szintén egy prodrog az izoniacidhoz hasonlóan, in vivo célpontját eddig még nem sikerült azonosítani de számos, az emberiséget sújtó betegség esetén figyelemre méltó hatékonysággal alkalmazzák. A pyrazinamid elleni rezisztenciáért legfőképpen a pncA gén mutációja felelős. Ez a gén egy olyan fehérjét kódol, amelynek pyrazinamidáz aktivitása van. A pyrazinamidáz enzim alakítja át a prodrog pyrazinamidot az aktív hatóanyaggá (10),(11). A meglévő gyógyszerekkel kapcsolatos problémák tehát elég sokrétűek. Először is egyik sem képviseli a legújabb kutatási eredményeket. Továbbá, olyan mutáns törzsek jelennek meg, amelyek rezisztensek néhány vagy akár valamennyi meglévő gyógyszerre. Másodsorban ezeknek, a gyógyszereknek a használata egyfajta átfogó ismeretet és orvosi rutint igényel. A kezelést nem könnyű követni fertőzött populációban főleg abban az esetben, ha a betegek nem értik meg, hogy a gyógyszereket akkor is szedni kell, ha már a közérzetük 9

javuló tendenciát mutat. Harmadszor ezek a meglehetősen hosszú és komplex gyógyszeres terápiák nagyon drágák. Negyedszer különböző mellékhatások is jelentkezhetnek, (a közepes rizikófaktorúaktól a magasig, mint például a májgyulladás) legfőképpen érzékeny betegek esetén, akik legyengült immunrendszerrel rendelkeznek és/vagy nincsenek optimális tápláltsági állapotban. Végül ötödször a gyógyszeres kezelést hetenkénti vérvétellel és májfunkció vizsgálattal kéne összekötni, ám ezek a tesztek költségesek és az aktív együttműködés az orvos és a páciens között elengedhetetlen. Mindezen okokból az újszerű gyógyszeres kezelések rendkívüli jelentőséggel bírnak (12). Az a tény, hogy az utóbbi 30 évben nem fejlesztettek ki új gyógyszereket ezen a területen alátámasztja az újító kutatások rendkívüli fontosságát.

2.2 A dUTPáz, mint ígéretes célpont 2.2.1 A dUTPáz szerepe az élő szervezetekben A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dUTPáz) enzim a dUTP hidrolízisét katalizálja dUMP-vé és inorganikus pirofoszfáttá az alábbi reakció alapján: dUTP → dUMP + PPi A reakcióban a dUTPáz enzim kofaktora a Mg2+ ion (13) (14). A reakció a nagy energiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dUTP szintet, miközben termeli a dUMP metabolitot, ami a dTTP bioszintézisének alapvető prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dUTPáz így működésével szabályozza a dUTP/dTTP szintet, alacsonyan tartva a dUTP koncentrációját a sejtben. A DNS replikáció hűségének megőrzéséhez elengedhetetlen a nukleotidok megfelelő arányának és koncentrációjának szabályozása, ezért a dUTPáz élettani szerepe kiemelkedően fontos és nélkülözhetetlen (15). A DNS-polimeráz adeninnel szemben azonos valószínűséggel épít be uracilt és timint, mivel a két bázis közti különbséget -a metilcsoport meglétét, illetve hiányát- nem érzékeli. Ezért a dUTPáz enzim hiányában kialakuló magas dUTP koncentráció uracilbeépülést eredményez a DNS-be.

10

A DNS szekvenciában számos környezeti hatásváltozást, mutációt eredményezhet. A mutációk kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellenőrzésére és javítására van szükség. Erre a DNS-ben több javítómechanizmus is kialakult (pl.: a timidin dimerek kivágása, a nem komplementer bázispárok kivágása, stb), melyek a már bekövetkezett módosítást észlelik és kijavítják, de megelőzni nem képesek. Így a DNS-ben megjelenő uracilt a sejtek hibaként érzékelik, és a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus segítségével távolítják el. Ez a gyakori hiba kétféle folyamat eredményeként jelenhet meg a DNS-ben (16): a már említett magas dUTP koncentráció miatti timin helyére történő beépülés, valamint a citozin spontán, oxidatív dezaminálása révén (17,18). A citozinból képződő uracil (1. ábra) káros, mivel a következő replikáció alkalmával guanin helyett adeninel alkot bázispárt és így örökletes pontmutáció jelenik meg a genetikai anyagban. Mivel a sejt nem tudja, hogy a DNS-be beépült uracil ártalmatlan (timin helyettes), vagy mutagén (citozinból képződött) (19), (20,21), ezért minden uracil eltávolítása szükséges a genetikai információ megőrzéséhez.

H

N

N H

C N

C

C C

N

C N

O N C

C C

C N

H

oxidatív

C1'

dezaminálás

H

O H

C N

C C

C N

H C1'

O

O

H N

H

H

H

uracil

citozin

H

C1'

guanin

CH3 H N H

C N C1'

C C

N C N

O

H

H

N C

C N

C C

C N

H C1'

O H

adenin

timin (5-metil-uracil)

1.ábra Watson-Crick bázispárosodás Fent: a citozin oxidatív dezaminálása uracillá, így guaninnal szemben mutagén uracil lesz a bázispár másik tagja. Lent: az adeninnel szemben nem változik a bázispár, itt a timint helyettesítő uracil nem mutagén.

11

Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dNTP szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie, amit a dUTPáz enzim kétfelől is biztosít. A dUTPáz enzim hiányában, az osztódó sejtben a magas dUTP/dTTP arány jelentős uracil tartalmú DNS szintézisét okozza. Ez aktiválja az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmust. A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dUTP/dTTP arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS-polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így megnövekedett uracil tartalom felerősíti a hiábavaló javítómechanizmust (hiperaktív működés), és kettősszál törésekhez, kromoszóma fragmentálódáshoz, majd a sejt halálához vezet (15,22). Ezt a jelenséget más néven timinmentes sejthalálnak nevezik (2. ábra) (22).

dUMP

dTTP

dUTPáz dUTP

A dUTPáz jelenléte kontrollálja a sejtbeli dUTP szintet, és termeli a dTTP szintézisének prekurzorát

Magas sejtbeli szint DNS polimeráz U

U U

U U

Uracil (U) tartalmú DNS Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus

A dUTPáz hiánya a DNS fragmentálódásá hoz és a sejt halálához vezet

S DN kettősszál törés Kromoszóma fragmentáció

SEJTHALÁL 2. ábra A dUTPáz szerepe a dTTP bioszintézisében és a DNS uracil mentességének biztosításában.

12

2.2.2 A dUTPáz, mint új gyógyszeripari célmolekula

A dUTPáz jelenléte, aktív DNS szintézist folytató sejtekben a legfontosabb (23) (24). Ennek megfelelően az enzim jelenléte és aktivitása a sejt ciklusától és a szövet fejlődési állapotától függő módon szabályozódik (25) (26). A dUTPáz specifikus gátlásával várhatóan sejthalál indukálható, amellyel terápiás hatást érhetnek el a rákos, vagy egyes bakteriális és vírusos, fertőző megbetegedések esetén. Ezt a hipotézist igazolták baktérium sejtekben, ahol a dUTPáz gén null mutációja letálisnak bizonyult. A rákellenes terápiák során széles körben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős, enzimeket gátló gyógyszereket, mivel a rákos sejtek már a kialakulásukat is nagyrészt annak köszönhetik, hogy bennük az apoptózis útvonalak jelentős része gátolt (27). Ezek közül is a legismertebb a timidilát szintetázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát- reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, amelyek jelentős mértékben növelik a sejtben található dUTP/dTTP szintet (2. ábra) (28). Ez a hatás az aktív DNS-szintézist folytató - például tumoros, illetve vírus által fertőzött - sejtek esetében timinmentes sejthalálhoz vezet. Megfigyelték, hogy az említett gyógyszerek használatakor rezisztencia alakulhat ki, amit összefüggésbe hoztak a kezelt sejtvonalakban kimutatható erősen megnövekedett dUTPáz aktivitással. Kimutatták, hogy a dUTPáz-szint genetikai manipulálással előidézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracil rezisztenciát vált ki (29) (30); valamint a dUTPáz hiánya érzékenyebbé teszi a sejteket a timidilát szintázt gátló szerekre (31). A legújabb eredmények szerint a dUTPáz, a multidrog rezisztencia kialakulásában is szerepet játszhat (32). A dUTPáz antagonizmus esetleges kemoterápiás hatására utal az a tény is, hogy szubsztrát analóg inhibitorok humán rákos sejtvonalakon ugyancsak szelektív gátló hatással rendelkeznek, in vitro (33). A legfrissebb irodalomban közölt adatok szerint a timin mentes sejthalál útvonal független a p53 fehérjétől (30), (34), így az apoptózis e formáját indukáló szerek p53 mutáns sejtekben is a gyógyulás reményével kecsegtetnek.

13

A dTTP bioszintézis első lépését gátló dUTPáz antagonista hatékony alternatívát nyújhat a p53 funkció vesztett, valamint a fluorodezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetében is.

3. ábra Kapcsolat a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dUTPáz enzimek által katalizált reakciók között. A rákellenes terápiák során széleskörben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős enzimeket, gátló gyógyszereket. Ezek közül is a legismertebbek a timidilát szintázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, melyek jelentős mértékben növelik a sejtbeli dUTP/dTTP szintet.

Vírussal fertőzött sejteknél elsősorban a már differenciált sejtekben van szükség dUTPázra. A vírussal fertőzött gazdasejt nyugvó állapotban nem, vagy csak kis mennyiségben tudja saját dUTPázát termelni, így DNS-ének replikációjához a vírus kénytelen a saját genomjában kódolt enzimre hagyatkozni. Kimutatták, hogy a retrovirális dUTPáz gének nullmutációja csökkenti a vírusok fertőző- és szaporodó képességét nem osztódó sejtekben és szövetekben (35). A dUTPáz antagonisták felhasználása a vírusos fertőzések kezelésében is számos új eredményt hozhat. A dUTPáz tehát fontos célpont a kemoterápiás gyógyszertervezések számára is, ezért az enzim minél pontosabb strukturális és funkcionális megismerése nagy jelentőséggel bír. A

14

különböző kísérleti

modell fajok dUTPázának

karakterizálása,

az aktív

centrum

feltérképezése, az enzim expresszióját szabályozó mechanizmusok és kölcsönható fehérjepartnerek megismerése mind hozzásegítenek a későbbi terápiás alkalmazásokhoz.

2.3 A dUTPáz szerkezete és reakciómechanizmusa Negyedleges

szerkezetük

alapján

a

dUTPáz

enzim

homotrimer

formája

a

legáltalánosabb, megtalálható a prokariotákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban (36,37) (5. ábra). Minden dUTPáz enzimben öt konzervált szekvencia motívum található, melyek az aktív centrumban, vagy annak közelében helyezkednek el. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezetek igen különböző fajokból származnak, hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és a magas szubsztrát-specifitásban (38).

Monomer B

Monomer C

Monomer A 4. ábra A trimer dUTPáz szerkezete. Az aktív centrum felépítésében mindhárom fehérjealegység részt vesz. Ezekből két alegység szerepe a szerkezeti ábrán is megfigyelhető. A harmadik alegység a nyíl irányába mutató C-terminális szegmenssel járul hozzá az aktív centrumhoz. Ez a szegmens a legtöbb kristályszerkezetben flexibilitása miatt nem lokalizálódott. Az aktív helyekhez koordinálódó, α,β-imino dUTP molekulák pálcika modellje atomtípus szerint van színezve (C: szürke, N: kék, O: piros, P: narancssárga). A három fehérje alegység szalagmodellben ábrázolt peptidláncai különböző színekben láthatók.

15

Az E. coli dUTPáz háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfia segítségével határozták meg. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (38,39). A különböző enzimek alegységeit alkotó peptid láncok hosszúsága különböző lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. Annak ellenére, hogy a különböző organizmusokból származó dUTPázok között a korlátozott szekvencia azonosság a jellemző, mégis minden igazoltan dUTPáz aktivitással rendelkező és dUDP hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható az öt konzervált szekvencia motívum (38). A dUTPázok túlnyomó többsége homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szerveződés viszonylag ritka az enzimek körében. További érdekessége a szerkezetnek, hogy három szimmetrikus aktív hely található benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz (4. ábra). A fehérje alegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas ún. „lekváros tekercs” (jelly roll) β-hordó, melyben az egyes szálakat β-kanyarok kötik össze. Ebben a szerveződésben az egyik β-szál a szomszédos alegységből származik, így a negyedleges és harmadlagos szerkezet nehezen választható el (5. ábra).

5. ábra A lekvárostekercs szerveződés ideális esetben (A) és dUTPázoknál (B).A: a β-szálak összerendeződése ideális esetben, B: a β-szálak kapcsolódása dUTPázoknál.

Az aktív centrumok a kristályszerkezetek alapján az alegységeket elválasztó felszíni mélyedésben találhatók, kialakításukban a három alegység a következő módon vesz részt; (4. ábra): Az egyik fehérjealegység a 3. szekvencia motívumból származik (6. ábra, a kék Tyr82), az a torzult antiparalell β-hajtű, ami az uracil koordinálásáért felelős. Az uracil 16

beékelődik a β-hajtűbe és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelelően hidrogén-hidakkal kapcsolódik a főlánc-atomokhoz. Ez a bázis felismerési mechanizmus rendkívül specifikus (40).

Asp26 Arg62

Gln108

Asp79

Arg130

Tyr82

Phe135

6. ábra Az α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát szubsztrátanalóg kötődése a dUTPáz aktív centrumában. A három alegység polipeptidláncát a zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A centrumba kötődő, α,β-iminodezoxiuridin-trifoszfát molekulát pálcika modell mutatja (atom szerinti színezés: C: szürke; N: kék; O: piros; P: narancs). A Mg2+ kofaktor -ami a három foszfát csoportot koordinálja-lila van színnel jelölve.

A másik fehérjealegység α-hélix régiójának arginin és szerin aminosav oldalláncai, hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát α-foszfát csoportjának oxigénjével (6. ábra, 2. konzervált szekvenciamotívum, sárga Arg62). A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját. Ez a C-terminális (kar) régió - ami minden alegységből kilógva a másik alegységhez nyúlik át - a legtöbb kristályszerkezetben nem látszik, mivel az enzim ezen része flexibilis, és ezért nem lokalizálható. Itt helyezkedik el az 5. szekvencia motívum (6.ábra, zöld alegység) A jelenlegi irodalmi adatok szerint ez a szegmens a β- és γ-foszfát csoportok pontos koordinálásában és az α-β foszfátkötés hasításában játszik valamilyen, részleteiben egyelőre ismeretlen szerepet (40,41).

17

Az enzim katalitikus mechanizmusáról szolgáltatnak fontos információt a 2004-ben közölt kristályszerkezeti elemzések (42) (8. ábra). Ezekben a szerkezetekben azonosítható volt az a vízmolekula, amely a reakció indításáért felelős nukleofil támadásban vesz részt. Ezt a vízmolekulát (melyet 8. ábrán „nucleophilic water” elnevezéssel, és 336-os sorszámmal van jelölve), egy szigorúan konzervált aszpartát oldallánc koordinálja (Asp83 a 8. ábrán). A reakció sematikus lejátszódását szemléltei a 7. ábra Mg2+ +

Mg2+

+ 2H+

E

Apo-enzim

E-S

Nukleofil támadás

E-P

Reakció termékek

7. ábra. A dUTPáz hidrolízise A felső sorban a szubsztrát átalakulása látható, az alsó sor részábrái a fehérje fontos katalitikus csoportjait mutatják. Színek: a három alegység sárga, zöld és kék színnel van jelölve, a katalitikus csoportok és a ligandum atomok szerinti színezéssel van feltüntetve. Az atomok színkódja: C- fekete, P-narancs, O-piros, N-kék, Mg-lila.

18

8. ábra Az M. tub. dUTPáz katalitikus mechanizmusa kristályszerkezeti eredmény alapján. (a)-Az aktív centrum sztereo ábrázolása. Az α,β-imino dUTP atomok színei a megfelelő atomok színei szerint vannak jelölve (C-fehér, O-piros, N-kék, P-sárga). Az aminósavak a konzervált motívum szerint vannak színezve. 1. számú motívum- kék, 2. számú motívum- zöld, 3. számú motívum- sárga, 4. számú motívumnarancssárga és az 5. számú motívum- piros. Az aktív helyet a három alegység együtt alkotja. Az 1, 2 és 4-es motívum kialakításában az A alegység működik közre, a 3. motívum felépítésében a B alegység, az 5. motívumban a C alegység. (b)-Elektronsűrűségi térkép a ligand, Mg2*, és a koordinált víz molekulákra. (c)-A dUTPáz reakció mechanizmusának sematikus ábrája. Az α-foszforatomon a nukleofil támadást indító 336. sorszámú vízmolekula oxigén atomjáról sematikus nyíl indul ki.

19

2.4 Az Európai Uniós pályázat stratégiája

Ebben a fejezetben vázlatosan mutatom be a TDK dolgozatom alapját nyújtó EU pályázatot, és utalok a kapcsolódási pontokra. A projekt legfontosabb célja egy olyan protokoll kifejlesztése, melynek segítségével lehetőség nyílik újszerű gyógyszer kötő helyek és gyógyszer-fehérje komplexek azonosítására a Mycobacterium tuberculosis fehérjéken keresztül. Jelenlegi tudásunk az emberi genomról és fehérjeállományról lehetővé teszi az új kutatásokat a gyógyszerkutatásban, melyben kombinatorikán alapuló adat-keresők vannak a segítségünkre. Ezeket, a felfedező technikákat gyakran nagy átbocsátó képességű módszerekként emlegetik. Ám kizárólag ezeknek, a kísérleteknek (megfelelően szilárd biológiai háttér nélkül) a lefolytatása alkalmatlan a gyógyszerkutatáshoz. Az EU pályázatban egy olyan eljárást szeretnénk kifejleszteni, melynek két fő összetevője van. 1. Egy olyan módszer kidolgozása, melynek középpontjában egy algoritmikus megoldás áll. Ez képes arra, hogy feltérképezze a fehérje felületén lévő bemélyedéseket (lehetséges kötőhelyeket) a fehérje háromdimenziós képének segítségével. A legújabb adatokra és információkra támaszkodva, nagy áteresztő képességű módszert használunk, amely páronként végzi a vizsgálatot. A két legfontosabb fázisban várunk ellenszer-fehérje párokat; az érdes felületű első fázisban (Silico 1) és a még durvább második fázisban, a dokkoló mérésben (Silico 2). Ezt a programot a pályázat matematikus és informatikus résztvevői (ELTE, SZTAKI) hajtják végre.

2. Egy szerkezeti és molekuláris biológiai eljárás kidolgozása, annak érdekében, hogy kikísérletezzük a legjobban egymásba illő gyógyszer-fehérje párokat. Az eljárásban variáljuk a közepes és alacsony áteresztő képességű módszereket. Minden javasolt fehérjéhez körülbelül 1000 javasolt antagonista van. Ezekre a párokra, az Enzimológiai Intézet enzimológiai és funkcionális szűrővizsgálatokat tervez és hajt végre.

20

2.5 Szűrővizsgálati lehetőségek

-Enzimaktivitás mérése dUTPáz esetén (α, β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát-tal és nélkül) -Fehérje konformáció változás mérése (pl.: cirkuláris dikroizmus spektroszkópia révén) -Kompetitív gátló szerek alkalmazása dUTPáz esetén (α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát és antagonista) -A legjobb antagonista-enzim párokra: nagy felbontású szerkezet vizsgálat, kristályosítás, röntgen diffrakciós vizsgálat

Enzimaktivitás mérés A folyamatos mérésekhez multi-küvettás spektrofotométert alkalmazunk, spektrális jelek hiányában az enzim reakciókat páronként futtatjuk. Az enzim reakciók többsége lényegében vagy proton veszteséggel, vagy kibocsátással jár. Ezért ha enyhén pufferolt indikátoros próbát alkalmazunk, akkor a változásokat nagyon érzékeny módszerekkel is követni tudjuk. Ha az egyes gyógyszerek erős bázisos vagy savas karakterűnek bizonyulnak, akkor a só formájuk indikátor alapú enzim vizsgálatokhoz használható fel. Körültekintően megtervezett, kikísérletezett és nagy áteresztő képességű tesztek segítségével a Mycobacterium tuberculosis aktív fehérjéi elérhetővé válnak a lehetséges gátló szerek tesztelésére. Ahhoz, hogy a nagy áteresztő képességű tesztek eredményeit megerősítsük, a kiválasztott összetevők különálló tesztelésre kerülnek, az izolált fehérjéket, már korábban kikísérletezett tesztek segítségével vizsgáljuk. Jelenleg 72 nem homológ fehérje háromdimenziós szerkezete érhető el a Fehérje adat bankból (Protein Data Bank). A legtöbb (59 darab) ezek közül enzim, néhány ilyen enzimfehérje esetén korábbi tanulmányok

alapján

valószínűsíthető,

hogy

ezek

támadása

hatékony,

újféle

gyógyszermolekulák kifejlesztéséhez vezethet. (EMBL Hamburg, Combinature Biopharm AG, Berlin). Ezek közé tartozik a dUTPáz enzim is.

21

Fehérje konformáció változás mérése Spektrális módszereket használunk, annak érdekében, hogy feltárjuk a legjellemzőbb konformációs változásokat, amelyeket olyan gyógyszer bekötődések okoznak, melyek a fehérje funkcióban jelentős perturbációs változást okoznak. Különböző egymást kiegészítő spektroszkópiai technikák szimultán használata szükséges egy eredményes és pontos szerkezeti kép elérése érdekében. Jelenlegi tervünk szerint csak a legjobban összeillő fehérjeantagonista párokat fogjuk letesztelni, részletes konformációs analízis segítségével. Eredményeink az utóbbi komplexek oldatfázisban való jellemzéséhez vezetnek majd és szükséges lesz egy kiegészítő röntgen szerkezeti vizsgálat is, amit kristályfázisban végzünk.

Cirkuláris dikroizmus A CD mérés segítségével detektálni tudjuk a fehérjében végbemenő konformációs változásokat, amelyeket az adott ellenszerek idéznek elő. Ez a technika nagyon érzékeny a fehérjék konformációs változásaira, amelyet vagy kis ligand molekulák, vagy akár az oldat mikrokörnyezete is kiválthat (43). Megjegyzés: Fluoreszcens spektoszkópiát a dUTPáz célfehérje esetén azért nem alkalmazunk, mert a fehérjénk tirozin és nem triptofán tartalmú és a tirozin nem mutat fluoreszcenciát.

Kompetitív gátlószerek alkalmazása Ezzel a módszerrel azt tudjuk követni, hogy egy feltételezett, vizsgálandó antagonista molekula kompetitív módon gátolja-e a dUTPáz enzim működését. A kompetitív gátlás itt arra utal, hogy az adott antagonista valószínűleg, bár nem egyértelműen, az enzim aktív centrumába kötődik, a szubsztrátot onnan kiszorítva. A kompetitív gátlási kísérletekben tehát az antagonista kötődése mellett a kötődés módjáról is további felvilágosítást nyerhetünk.

22

Szerkezetvizsgálat kristályfázisban A kristályosítási kísérletek során olyan fehérje- ellenanyag párokat használunk fel, amelyeknek legjelentősebb a biológiai hatásuk. Az egyetlen, ámde legnagyobb probléma ebben az esetben az, hogy néhány komplex nem kristályosodik jól. Ezért szükséges, hogy az azonosított célfehérjék esetében minél több olyan körülményt azonosítsunk, melyben a fehérje jól kristályosodik. Ezáltal nő az esélye annak, hogy legalább valamely azonosított körülményben a fehérje-antagonista komplex is vizsgálható lesz. A röntgendiffrakció alapjai; interferencia, rácssíkok és a Bragg-egyenlet A röntgendiffrakció felfedezése (1912) a huszadik század egyik legjelentősebb tudományos eredményének tekinthető. Max von Laue arra következtetett, hogy a röntgensugarak a kristályokon áthaladva valószínűleg diffrakciót szenvednek, mivel a hullámhosszuk összemérhető a rácssíkok közötti távolsággal. A vízen keltett hullámvonulat elhajlását már korábban is megfigyelték, ha a hullámtérbe a hullámhossz méretéhez hasonló akadályokat v. réseket helyeztek. A nem prizmát tartalmazó fotométerek diszperziós egysége (ami a fehér fényt komponenseire bontja) egy reflexiós rács (régebben egy karcolatokat tartalmazó üvegrács), ami szintén diffrakciós ill. reflexiós elven működik. A diffrakció, azaz az elektromágneses hullámok elhajlásának jelensége itt a következő módon értelmezhető: a röntgensugarak elsősorban az atomok elektronjaival lépnek kölcsönhatásba. Szemléletesen, a sugárzásból több-kevesebb foton ütközik az elektronokkal, és eltérülnek az eredeti irányuktól csakúgy, mint ahogy biliárdgolyók lökik szét egymást. Az eredmény az, hogy az atom elektronfelhője mintegy másodlagos sugárforrásként viselkedik, a tér minden irányába sugározza a röntgenfotonokat. Ezt a jelenséget nevezzük röntgenszórásnak. Ha a röntgensugarak nem veszítenek energiájukból, a folyamat ún. Thompson v. rugalmas szórás (elastic scattering). Az is lehetséges, hogy a sugarak rugalmatlanul szóródnak (Compton v. inelastic scattering), ekkor energiájuk egy részét az elektron fel is veszi. A diffrakciós kísérletekben csak a rugalmas szórást vizsgáljuk. A sok-sok atom által szórt röntgenhullámok egymással gyengítő vagy erősítő interferenciába lépnek, és a hullámtér egy adott helyén a sugárzás intenzitását az összes elemi hullám szuperpozíciója határozza meg. Ha az atomok szabályos elrendeződésűek, és az ismétlődő egységek távolsága azonos

nagyságrendben

van

a

hullámhosszal,

mint

a

kristályokban,

az

erősítő

interferenciá(k)nak megfelelő sugárzást úgy észleljük, mintha a beeső sugár adott szöggel (v. 23

szögekkel) való elhajlást (diffrakciót) szenvedett volna. A kristályokon létrejövő diffrakciós kép legkorábbi elemzésében a kristály rácssíkjait tükröknek tekintették a kristályt, pedig egymástól ’d’ távolságra lévő, visszaverő síkok együtteseként fogták fel. E modell alapján meghatározhatjuk, hogy milyen szöget kell bezárnia a kristálysíkoknak a beeső röntgensugarakkal ahhoz, hogy erősítő interferencia jöjjön létre. A modell alapján, bár az elhajlást már másként magyarázzuk, még ma is reflexiónak nevezzük az erősítő interferencia révén keletkezett diffrakciós sugarat, ill. a röntgendiffraktogramokon megjelenő csúcsokat. A két sugár közti útkülönbség, egyszerű geometriai megfontolások alapján 2dsinθ. Sokféle θ szögnél igaz, hogy az útkülönbség nem a hullámhossz egész számú többszöröse, ezért a hullámok gyengítő interferenciát mutatnak. Ha azonban az útkülönbség a hullámhossz egész számú többszöröse, azaz nλ, akkor a visszavert hullámok fázisban vannak, erősítő interferenciába lépnek egymással. Mindebből következik, hogy olyankor fogunk reflexiót észlelni, amikor a θ szög eleget tesz az: nλ= 2d sin θ

(44)

Bragg-egyenletnek. Az n = 1 esetben ún. elsőrendű reflexiót kapunk, ez a legnagyobb intenzitású. Az n = 2, 3,… egész számoknak megfelelő reflexiókat rendre másodrendű, harmadrendű, stb. reflexióknak nevezzük, ezek 2,3, stb. hullámhossznyi útkülönbségeknek felelnek meg. A Bragg-egyenlet a röntgenkrisztallográfia alapvető összefüggése, a rácssíkok közötti távolságokat határozhatjuk meg vele; ha a vizsgált reflexióhoz tartozó θ szög ismert (ezt mérjük), akkor d az egyenletből kiszámolható.

24

3. Anyagok és módszerek 3.1 A Mycobacterium tuberculosis dUTP-ázának klónozása A dUTPáz fehérjét kódoló 0.47 kb nagyságú génszakaszt a Mycobacterium tuberculosis H37Rv jelölésű genomiális DNS-éből szaporítottam fel PCR technika segítségével a következő oligonukleotid primerek felhasználásával. A forward primer szekvenciája, reverz

5’-GGGAATTCCATATGTCGACCACTCTGGCGATCGTCCGC-3’, a primer

szekvenciája,

pedig

5’-

CGCGGATCCTCACAAACTCGCATGTCCGCCGGAGGA-3’ volt. Az aláhúzott szakaszok az NdeI és BamHI restrikciós enzimek hasító helyeit jelölik az adott sorrendben, míg dőlt betűvel az emésztést segítő szekvenciákat emeltem ki. A felszaporított dUTPáz génszakaszt NdeI és BamHI enzimekkel emésztettem. A pET3a plazmidot (Novagen), amibe a mi génünket klónozni akartam, kétféle módon emésztettem. Ez a vektor tartalmaz egy ampicillin antibiotikum rezisztenciát kódoló génszakaszt, melynek közepén van egy PstI restrikciós enzim hasító hely. Az egyik emésztő elegyben (I. emésztés) BamHI és PstI enzimekkel, a másikban (II. emésztés) NdeI és PstI enzimekkel vágtam el a plazmidot. Az emésztés lejátszódását agaróz gélen ellenőriztem, majd gélből kivágtam és eluáltam a megfelelő fragmenseket. Az I. emésztőelegyben ez a kisebb fragmenst jelentette, míg a II. emésztő elegyben a hosszabb DNS fragmenst. Ezek után a három DNS szakaszt összeligáltam, majd ezt a plazmidot BL21 E. coli törzsbe transzformáltam fehérje termeléséhez.

25

9. ábra A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz klónozási sémája. A színes téglalapok a jelölt restrikciós enzimek vágóhelyeit azonosítják.

3.2 A fehérje expressziója és feltárása Az M. tub. dUTPáz gént tartalmazó pET plazmiddal E. coli BL21 sejteket transzformáltam. Ampicillin alkalmazásával biztosítottam, hogy csak a plazmidot felvett sejtek szaporodjanak. A sejtek növekedését 500 ml Luria-Bertani tápoldatban az exponenciális növekedési szakasz eléréséig követtem. A növekedést a turbiditás mérésével (600 nm-n mért abszorbancia) követtem. Az exponenciális növekedés elérésekor a sejtkultúrát 0,5 mM izo-propil-tio-galaktozid hozzáadásával indukáltam, majd 4 óráig tovább növesztettem. A sejteket lecentrifugáltam, majd lízis pufferben feltártam. A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket – főleg a dUTPázt – sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és ellenőrizhetetlenül rongálják a fehérjéket, ezért

26

szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonilfluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket – pl. tripszin, kimotripszin- specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) is adagolunk a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy a DTT maga oxidálódik. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT)– lévén bomlékonyak – mindig frissen adjuk a pufferhez. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután lecentrifugáljuk az elegyet. A dUTPáz a felülúszóban található számos más fehérjével együtt.

3.3 Fehérje tisztítási lépések 3.3.1 Ioncserélő folyadékkromatográfia Ioncserés folyadékkromatográfiánál az álló fázis felületén állandó értékű töltés van. Attól függően, hogy az álló fázis pozitív vagy negatív töltésű, anion- vagy kation cserélőről beszélünk. Az ioncserélők váza szerves polimer vagy módosított szilikagél. A pH változtatásával az áramló fázis komponenseinek visszatartását befolyásoló molekuláris kölcsönhatásokat változtathatjuk meg. Egyes gyantáknál nagy pH értéken az ioncserés jelleg és a töltet apoláris része használható fel elválasztásra, míg kis pH értéken a szulfonsav csoport H-híd képzésre való hajlama, az akril és fenil rész apoláris jellege használható elemzési feladatokban. Az ioncserélő folyadékkromatográfiában az eluens puffertartalmú víz-só-szerves oldószer-elegy. A puffer pH-val a vegyület disszociációfokát, a só koncentrációval az ellenion mennyiségét, a szerves oldószerrel a vegyület oldhatóságát tudjuk a mozgófázisban befolyásolni. A dUTPáz ioncserélő kromatográfiás elválasztását Gradifrac készüléken Q-Sepharose anioncserélő gyantán (Pharmacia Biotech Fast Flow, 80 ml-es oszloptérfogat) végeztem. A készülék programozható. Az általam megadható paraméterek: az eluens áramlási sebessége, a gradiens „B” időtartama és jellege, a frakciók szedése, valamint az egyes frakciók térfogata. A műszerbe épített 280 nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta

27

átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. A fehérje oldat felvitele előtt az oszlopot „A” pufferrel egyensúlyba hoztam. Az „A” puffer összetétele : 25 mM nátrium-foszfát (pH=7.5), 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF. Miután egyensúlyba hoztam az oszlopot „A” pufferrel, és felvittem rá a sejtextrakt dUTPázt is tartalmazó felülúszóját, először „A” pufferrel mostam, míg az oldatban lévő fehérjék egy része (melyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódott. Az áteső frakció után 1 ml/min áramlási sebesség mellett 300 ml „A” és 300ml „B” pufferből kevert lineáris gradiens során eluáltam az oszlopon megkötődött fehérjéket. A gradiens 600 perces időtartama alatt 3 ml-enként frakciókat szedtem. A „B” puffer összetétele: 25 mM nátrium-foszfát (pH=7.5), 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 M NaCl. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoztak a gyantán megkötődött fehérjék. A dUTPáz 20-45 % B puffernél egy éles és magas csúcsot adott.

3.3.2 Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel (FPLC) A gélszűréses kromatográfiát gyakran alkalmazzuk makromolekulák tisztításakor. Ilyenkor a molekulák eltérő méretét és alakját használjuk ki az elválasztáshoz. A molekulaszűrő gél alapanyaga erősen hidrofil (10-300 μm szemcseméretű), oldhatatlan, keresztkötésekkel háromdimenziós hálózattá alakított dextrán poliszacharid. A háló belsejének mérete keresztkötésekkel szabályozható. Így elérhető, hogy a kis molekulájú anyagok számára mind a poliszacharid gél belseje, mind a külső tér elfoglalható, a nagy molekulájú anyagok viszont nem férnek be a gél belső járataiba. Az elválasztás az oszlopon teljes, az eluátumban külön kapjuk meg a fehérjét és a tőle elkülönített kis molekulájú anyagot. A módszer során számolni kell a fehérje hígulásával. A módszer előnye, hogy a módszer több feladat megoldására is felhasználható: makromolekulák sómentesítése, molekulatömeg becslés, molekulatömeg szerinti elválasztás, egyensúlyi konstans meghatározására. A gélszűrést FPLC készülékkel (Pharmacia) végeztem. Az FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) technika a hagyományos folyadék kromatográfia és a HPLC között foglal helyet mind műszerezettség, mind hatékonyság tekintetében, ahol a kromatográfia megnövelt nyomáson (1.5- 4.5 MPa) történik. Töltetként Superdex 200-as oszlopot használtam, az oszloptérfogat 120 ml volt. A készülék itt is programozható, az általam megadott paraméterek 28

az eluens áramlási sebessége (0. 5 ml/min), a papír sebessége (1 mm/min) és a nyomás (max 3 MPa). Az elválasztáshoz használt gélszűrő puffer összetétele: 25 mM NaPi (pH=7.5), 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 0,1 mM PMSF. A DTT-t és a PMSF-et mindig frissen kell az oldathoz adni, mivel bomlékonyak. A puffereket használat előtt 0.2 mikronos sterilszűrő membránon szűrtem, hogy az esetleges szennyeződések ne tömítsék el a készüléket. Az oszlopot először egyensúlyba hoztam a gélszűrő pufferrel, majd az ultraszűréssel koncentrált dUTPáz oldatból injektáltam 500 μl-t az oszlopra. A frakciókat a rekorder rajzát figyelve manuálisan gyűjtöttem kémcsövekbe (így később be lehetett azonosítani, hogy a fehérje melyik csúcsban jött le az oszlopról).

3.4 Fehérjevizsgálati módszerek

3.4.1 Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE) A fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmazott gyakori módszer az elektroforézis. Adott pH-n a különböző fehérjék meghatározott számú pozitív vagy negatív töltést viselnek. Vizes oldatban egyenáram alá helyezve a molekulák adott irányban kezdenek el vándorolni a töltésüknek megfelelően. Az egyes fehérjék különböző sebességgel mozognak relatív töltésük miatt, e miatt a különbség miatt lehet elválasztani egymástól őket. Az akrilamid gyökös polimerizációra képes vizes oldatban megfelelő katalizátorok jelenlétében. A reakció során nagy molsúlyú lineáris polimer, poliakrilamid keletkezik. Ha megfelelő keresztkötő ágenst alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között „hidak” képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Ebben a gélben vándoroltatjuk a fehérjéket az elektroforézis során. A gél molekula szűrőként viselkedik, benne a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól. Ha az elektroforézist nem denaturáló közegben végezzük, alacsony hőmérsékleten, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók. Az

SDS-PAGE

poliakrilamid

(sodium-dodecil-szulfátos-poliakril-amid-gélelktroforézis)

gélelektroforézis

fehérjék

alegységszerkezetének,

a

molekulatömeg-

eloszlásuknak vizsgálatára felhasznált változata. Az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy erősen

29

anionos detergens. A fehérje mintákat SDS-sel és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezelve, magas hőmérsékleten radikális konformáció változások következnek be. A fehérjék közti kölcsönhatások megszűnnek, az alegység szerkezet felbomlik és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS „kitekeri” a fehérjéket apoláros részével azok belső, hidrofób magját fellazítva. Mivel az SDS anionos detergens, a fehérjéket negatív töltéssel látja el, a fehérje saját töltését maszkírozza, így az SDS- fehérje komplexek töltés/tömeg aránya állandó lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéssűrűségétől. A kötődött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. Ez a módszer kiválóan alkalmas preparált, illetve tisztított fehérje minták tisztaságának ellenőrzésére. Gélelektroforézissel beazonosíthatóak a dUTPázt tartalmazó frakciók, és azok tisztasága az enzimre nézve. SDS-PAGE esetén két különböző koncentrációjú gélt alkalmaznak. A futtató (más néven elválasztó) gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid tartalma a futtató gélnél jóval alacsonyabb, annyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérje ionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a pH 6.5- 6.8 között van. Ilyen pH- n a fehérje elektroforetikus mobilitása lecsökken, így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. A fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A futtató, vagy más néven elválasztó gélben a helyzet megváltozik. Mivel az elválasztó gél pH-ja 8.8- 9 között van, a mobilitás megnövekedik. Így a töltéshiányból eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző fajlagos töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon. 12%-os poliakrilamid gél készítése: az elválasztó gél oldatát (0.05 ml 10%-os SDS, 1.25 ml elválasztó puffer, 1.5 ml 40%-os akrilamid, 0,04 ml 40%-os N, N’-metilén-biszakrilamid, 50 µl 10%-os APS, 10 µl TEMED két üveglap közé öntöttem álló helyzetben. Az elválasztó gél polimerizációja után rárétegeztem a tömörítő gél oldatát (0.025 ml 10%-os SDS, 0.625 ml tömörítő puffer, 0.25 ml 40%-os akrilamid, 25 µl 10%-os APS, 5 µl TEMED. Ebbe fésűt helyeztem, így képezve a mintafelvitel számára a „zsebeket” a tömörítő gélben. Gélelektroforézis: a gél megszilárdulása után a gélt a futtató kádba tettem és a fésűt óvatosan kihúztam. A futtatókádat futtató pufferrel töltöttem fel. A mintákhoz velük azonos mennyiségű mintakoktélt adtam (3,55 ml desztillált víz; 1,25 ml, 0,5 M Tris-HCl pH=6.8; 2,5 30

ml glicerin; 2,0 ml 10 % SDS; 0,2 ml 0,5 % brómfenolkék; 350 mM DTT-t kell belerakni) aminek feladata, hogy denaturálja a mintát, kitekerje a fehérjét, valamint tartalmaz egy kék festéket, aminek segítségével nyomon lehet követni a futást a gélen. A mintakoktél glicerin tartalma a minta sűrűségét növeli, a könnyebb ülepedés érdekében. Forralás után bepipettáztam a gélen levő zsebekbe, a puffer alá rétegezve. Bekapcsoltam a tápegységet figyelve a polaritásra. 200 V-tal, 30 percig elektrolizáltam a mintákat, majd a gélt desztillált vízben áztattam, majd Bio-Safe Coomassie-val festettem meg. Festési eljárás: A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kell tenni. Erre számos vegyület ismert, melyek nagy hatékonysággal kötődnek a fehérjékhez. Ezek használatakor a cél az összes fehérje kimutatása a gélben. Leggyakrabban a Coomassie Brilliant Blue-t használják, segítségével a gél keresztmetszetétől és az adott fehérje speciális festődési tulajdonságaitól függően akár már 1 µg fehérje is jól detektálható.

3.4.2 Fehérje koncentráció meghatározása A fehérjék mennyiségi meghatározására sokféle módszert alkalmaznak; Biuret, Lowry, Folin-Ciocalteau, abszorbanciás mérések a Lambert-Beer törvény alkalmazásán alapulva, Bradford, én az utóbbi kettőt alkalmaztam: 1. Tiszta fehérje oldatok spektrumából (280 nm-en van az elnyelés) az abszorpciós koefficiens ismeretében számolható a fehérjekoncentráció. 2. Fehérje elegyek összfehérje koncentrációját, illetve az abszorbciós koefficiens hiányában tiszta fehérje oldat koncentrációját meg lehet határozni többek között a Bradford módszerrel. Koncentráció meghatározás Bradford referencia alapján A Bradford módszer színváltozáson alapul. A méréshez Bradford Coomassie-reagenst használtam, amely a fehérjék peptid kötésével reagálva kék színű terméket hoz létre. A keletkező szín intenzitása, abszorbanciája 595 nm-en detektálható. A méréseket egyutas spektrofotométerrel végeztem (JASCO-550 UV/VIS Spektrofotometer-en). Kalibrációs oldatsorozatot készítettem marha szérum albumim (BSA) oldatból. 5 mg/ml koncentrációjú törzsoldatból indultam ki, melyhez különböző mennyiségű desztillált vizet 31

adva készítettem el a kalibrációs oldatsorozatot. Az ismeretlen koncentrációjú oldatból is készítettem higítási sort. A vak minta albumin helyett desztilláltvizet tartalmazott. Minden higításhoz, és a vakhoz is ¼ térfogatnyi Bradford reagenst adtam, majd Vortexen összerázattam. A mérés során a műszert minden küvettára külön lenulláztam. Minden higításra kiszámoltam a ΔA-t úgy, hogy a mért A-ból levontam a vak oldat abszorbanciáját. Az ismert koncentrációjú BSA oldattal végzett mérések alapján kalibrációs egyenest készítettem és meghatároztam az egyenes egyenletét (8. ábra). Így az ismeretlen koncentrációjú oldat esetében kapott ΔA-kból számolható a kalibráció során meghatározott egyenlet szerint (1-es egyenlet) a higítások koncentrációja. A higításokból visszaszámoltam az eredeti oldat koncentrációját, majd a kapott eredményeket átlagoltam.

A = 0,04219 + 0,07242 ⋅ C

[1]

0,5

0,4

∆A

0,3

0,2

0,1

0,0 0

1

2

3

4

5

koncentáció (µ g/ml)

10. ábra Kalibrációs egyenes a Bradford referenciaméréshez

32

6

3.4.3 Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia

A CD spektroszkópia nagyon hatékony módot kínál királis molekulák térszerkezetének vizsgálatához. Alapja, hogy az optikailag aktív anyagok a jobb ill. a bal irányban cirkulárisan polarizált fénnyel különböző módon lépnek kölcsönhatásba. A lineárisan polarizált fény két, ellentétes irányú cirkulárisan polarizált komponensre bontható. Így az optikailag aktív anyagon átbocsátott lineárisan polarizált fény, annak komponenseire vett moláris abszorpciós koefficiensek különbözősége miatt, elliptikusan polarizálttá válik, és a törésmutatók különbözősége miatt a polarizáció iránya az eredetihez képest meghatározott szöggel elfordul. Tehát kétféle jelenségről is szó van: az optikai rotációs diszperzió (ORD) és a cirkuláris dikroizmus (CD) együtt jelentkezik. A CD spektrométerrel a ∆A-t azaz a balra és jobbra cirkulárisan polarizált fénykomponensek abszorpciójának különbségét, vagy az ezzel arányos ellipticitást (Θ) mérjük. A kettő közti összefüggés: Θ=2,303(Ab-Aj)/4

[2]

A CD mérőszáma lehet a ∆ε, vagy az ezzel arányos moláris ellipticitás[θ]: [θ]= 3300* ∆ε

[3]

Mint köztudott a fehérjéket felépítő aminosavak - a glicin kivételével – királisak, míg a fehérjék kromofor csoportjai – a peptidkötések és az aromás oldalláncok – egyaránt akirálisak. Adódik azonban kiralitás az önmagukban akirális kromoforok molekulán belüli aszimmetrikus környezetéből, és ilyenkor is fellép a cirkuláris dikroizmus jelensége. Ezért a fehérjemolekuláknak van CD spektrumuk. A fehérjék ismétlődő kromoforja, az amid csoport, aminek távoli UV tartományban van jellemző elnyelése (230-210 nm és 190-200 nm), ezért 250 nm alatt a CD spektrumot az amidcsoportok határozzák meg. A fehérjék távoli UV tartományban felvett CD spektruma alkalmas a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, β-szál, specifikus β-kanyarok), illetve a rendezetlen szerkezet (random coil) arányának becslésére. Közeli UV-ban az aromás oldalláncú aminosavaknak van jellemző elnyelése 280 nm körül, ill. a diszulfid hidaknak 250-260 nm-nél .

33

A mérés során alkalmazott eszközök és körülmények: A méréseket JASCO 720 spektropolariméterben, 1 illetve 10 mm-es küvettákban, 25 oC-on végeztem. A távoli UV tartományban (200-250 nm) 1mm-es úthosszú küvettát, míg a közeli UV tartományban (250-380 nm) 10 mm úthosszú küvettát használtam. A differencia spektrumok számításához a fehérje és ligandum elegyében mért spektrumból levontam a külön meghatározott fehérje spektrumot és a külön meghatározott ligand spektrumot (lásd. a kísérletek értékelésénél).

3.4.4 Enzimaktivitás mérése

A kinetikai vizsgálatokban a dUTPáz által katalizált dUTP → dUMP + PPi reakció lefolyását spekrofotometriásan követhetjük. Egyrészt, a reakció során protonok is szabadulnak fel, és ezek mennyisége egyenesen arányos a képződő termék (dUMP) mennyiségével. Az aktivitásméréshez használt elegy összetétele: 1mM TES/HCl, pH=7.5, 150mM KCl, 40µM fenolvörös sav-bázis indikátor. Az elegy tehát csak gyengén pufferolt (alacsony a pufferként használt TES és fenolvörös koncentrációja). Így a dUTP hidrolíziséből felszabaduló protonok a közeget mérhető mértékben savanyítják. A pH változást az indikátor színváltozásán keresztül követjük, 559nm-en mérve az oldat abszorbanciáját. A méréseket JASCO-V550 spektrofotométeren, 10mm-es küvettákban, 25oC-on végeztem, 1 µM enzim koncentrációt és 40 µM dUTP koncentrációt használva. A reakciót a dUTP hozzáadásával indítottam (megfelelő mennyiségű dUTP oldatot adagoltam az 1 mM-os törzsoldatból). A kezdeti reakciósebességet a mérési görbe első 10 másodpercére illesztett egyenes iránytangenséből határoztam meg. Másrészt, az enzimreakció más enzimekhez való kapcsolása szintén módot nyújthat arra, hogy spektrofotometriával követhető jelet kapjunk. Az irodalmi adatok szerint a pirofoszfát terméket két további enzim felhasználásával egy nukleozid származékra vihetjük át (45) A kapcsolt reakció sémáját mutatja a következő (11.) abra:

PPi

IPP

2 Pi

(inorganikus pirofoszfatáz)

34

PNP Pi +

MESG

(purin-nukleozid foszforiláz)

RP + MES

ribóz-1-foszfát

11. abra

A reakció előnye a proton-detektáláshoz képest az, hogy nagyobb érzékenységet tesz lehetővé, és alacsonyabb kiindulási dUTP szubsztrátkoncentráció mellett is alkalmazható, továbbá, pufferolt közegben történik, így stabilabb alapvonalat ad. Hátránya, hogy két további segédenzim meglétét igényli, és szükség van a MESG molekulára is. A kapcsolt enzimreakciókban mindig biztosítani kell, hogy az általunk vizsgálni kívánt enzim legyen a sebességmeghatározó. Ehhez a segédenzimeket megfelelő feleslegben kell használni. Ezen körülményeket beállítva, az alábbi összetételű elegyben mérhető a dUTPáz reakció: -dUTP - 5 µM (ennek hozzádásaval indítjuk a reakciót) - MESG - 100 µM -dUTPáz -150 nM -pirofoszfatáz - 5 U/ml -purin nukleozid foszforiláz - 5U/ml -puffer: 20 mM TRIS HCl, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH=7,5 A MESG  MES átalakulás során a módosított purin elnyelése 360 nm-en nagymértékben megnő (az extinkciós koefficiensek különbsége 11000 M-1cm-1), ezt a változást detektáljuk.

3.4.5 Limitált tripszinolízis A fehérje konformációjának detektálása céljából limitált emésztést alkalmaztam. Tripszin enzimet adtam a fehérje oldathoz. Ez az enzim bázikus oldalláncok (Lys, Arg) utáni peptidkötéseket képes elhasítani. A peptidkötések a fehérje feltételezett szerkezetében különböző módon érhetőek el, mert a flexibilis szegmensekben a peptidek könnyebben emészthetőek az apoláros magban lévőknél. Gyakran előfordul, hogy ligand kötés hatására a

35

fehérje konformációja megváltozik, így a flexibilis részek rendezettebbé válnak. Ezeken a helyeken a tripszin már nem képes az emésztésre. Kísérleteinkben a dUTP-ázhoz különböző tömegarányban adtuk a tripszint. A próbamérésekből kiderült, hogy az 1:200-hoz tömegarány (dUTPáz:tripszin tömegarány) a legmegfelelőbb. A várt feltételezésnek megfelelően bebizonyosodott, hogy az α,β-imino- dezoxiuridin-trifoszfát hatására megváltozik a fehérje emészthetősége, mégpedig kevésbé

lesz

emészthető,

az

α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát

védő

hatása

miatt.

Kísérleteimben a 3,97 mg/ml-es dUTPáz oldatomat 0,2 mg/ml-re hígítottam. A tripszin törzsoldatot liofilizált enzim pufferben való feloldásával készítettem, ennek koncentrációja 1 mg/ml volt. A tripszinolízis kísérleteket a következő pufferben végeztem: 20 mM nátriumfoszfát, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 (pH=7,5), α, β –imino dUTP távollétében illetve, 150 μM α, β –imino dUTP jelenlétében. A tripszinolízis során adott időpontokban 16 µl mintát vettem az elegyből. A kivett mintákhoz, 4 µl 1 mM-os PMSF oldatot adtam, amely úgy gátolja a tripszint, hogy az aktív centrumbeli Ser oldallánchoz köt. A mintákban megmértem az enzim aktivitását, illetve SDS-PAGE gélelektroforézissel vizsgáltam az emésztés előrehaladását.

36

12. ábra. A dUTP és az α, β-imino-dUTP szerkezeti képlete Ahogy az ábrán is látszik az O helyett NH található az α, β-imino-dUTP-ben, ennek tulajdonítható a csökkent reaktivitás. Mivel azonban egy izosztérikus ligandról van szó, ezért ugyanolyan módon kötődik az enzimhez, mint a szubsztrát dUTP (ezért kitűnő szubsztrátanalóg).

3.5 Kristályosítási kísérlet 3.5.1 Szerkezetvizsgálat röntgendiffrakciós módszerrel A röntgensugárzás és röntgensugárforrások A röntgensugarak elektromágneses hullámok, jellemző foton energiájuk 100 eV–100 keV, így az elektromágneses színképen az UV- és a γ-sugarak régiója között helyezkednek el. Diffrakciós vizsgálatokhoz csak a rövid hullámhossztartományba eső sugárzást alkalmazzuk (ún. „kemény” sugárzás, hard X-ray), amely hullámhossza a 100 pm-es (100 pm = 1 Å) tartományba esik csakúgy, mint a legtöbb kristályos anyag rácsállandója, így megfelelő a kristályokon

való elhajlási (diffrakciós)

jelenségek

előidézésére.

A nagyenergiájú

röntgensugarak képesek „mélyen” (több mikrométer, de akár több száz mikrométer vastagságban is) behatolni az anyagba, így a röntgenfotoelektron spektroszkópia módszerétől eltérően, nemcsak a felület közeli 1-2 nm-es rétegre, hanem a tömbfázisra is jellemző információt hordoz. (Természetesen a két módszer egészen más anyagi tulajdonságokról nyújt információt!). A röntgensugárzást leginkább ún. röntgencsövekkel vagy ún. szinkrotron tárológyűrűvel állítják elő. Egy röntgencsőben (az elsődleges röntgenforrás a „közönséges” laboratóriumi műszerekben) röntgensugárzás keletkezik, ha egy fókuszált elektronsugár, melyet nagy feszültséggel gyorsítunk fel, bombáz egy álló v. forgó anódot (target). Amint az elektronok ütköznek az anód atomjaival és lelassulnak, energiájuk csökken, amit egy folytonos spektrumú röntgensugárzás formájában emittálnak ezt fékezési röntgensugárzásnak nevezték el („Bremsstahlung”). A nagyenergiájú elektronok az atomok legbelső, lezárt héjairól ki is lökhetnek elektronokat (ionizáció). Pl. egy elektronnyaláb, melyet 30 kV feszültséggel gyorsítottunk fel, ha becsapódik egy réz lemezbe (anódba), az ütköző elektronok elegendő energiával rendelkeznek ahhoz, hogy ionizálják néhány Cu atom 1s (azaz K-héjon levő) elektronját. A külső pályák egyik elektronja (2p vagy 3p) szinte azonnal elfoglalja a számára energetikailag

37

kedvezőbb (kisebb energiájú) atomi pályát, és az átmenetben felszabaduló energia röntgensugárzás formájában jelentkezik. Mivel az atomi pályák energiái kvantáltak, az átmenetekhez tartozó energiák is kvantáltak, így monokromatikus (valójában közel monokromatikus) röntgensugárzást kapunk. A réz esetében a 2p →1s átmenet, melyet Kα-nak neveznek, 1,54 Å hullámhosszú, míg a 3p →1s (Kβ) átmenetnek megfelelő hullámhossz 1.39 Å. A Kα átmenet jóval gyakrabban fordul elő. Valójában a Kα átmenet egy dublettet eredményez (Kα1 és Kα2) a 2p elektronok két lehetséges spinállapota miatt. Fehérjekristályok vizsgálatánál a röntgen diffrakció elemzéssel a fehérje háromdimenziós térszerkezetét tudjuk meghatározni, ami elengedhetetlen a fehérje szerkezetének és működésének megértéséhez. Ezért az M. tub. dUTPáz fehérjével kristályosítási kísérleteket végeztem, és a kristályokat röntgen diffrakcióval vizsgáltuk. Az adatokat Rigaku R-Axis IIC imaging plate detektorral gyűjtöttük, egy Rigaku röntgen generátoron. Az adatkészletet az XDS programmal értékeltük ki. A szerkezet megoldása molekuláris helyettesítéssel történt. Ehhez a MOLREP szoftvert (46), modellként pedig az 1MQ7 szerkezetet használtuk. A szerkezet finomításához a CCP4 programcsomagot és a Refmac szoftvert alkalmaztuk (44).

4. Eredmények és értékelés 4.1 A fehérje előállítása A Mycobacterium tuberculosis dUTPázának génjét az EU pályázat egyik kollaboráló partnerétől kaptuk. A klónozást az anyagok és módszerekben leírt módon végeztük el. A 13. 14.és 15.ábrák a fehérje expressziójának és tisztításának lépéseit mutatják.

38

1

2

1

2

3

66 45 36 29 24 20,1 14,2

13. ábra A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz expressziója E. coli sejtben (SDS-PAGE gél képe). A gélen látható minták sorrendje a következő: 1: sejtextrakt IPTG hozzáadása után., 2. sejtextrakt IPTG hozzáadása előtt, 3. molekuláris marker. A nyíl az M. tub. dUTPáz várt pozícióját jelöli. A marker melletti számértékek pedig az egyes kalibráló fehérjék molekula tömegét jelölik kDa-ban.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

66 45 36 29 24 20,1 14,2 14. ábra Az ioncserélő kromatográfia eredménye. A gélen látható minták felsorolása: 1, E. coli sejtszuszpenzió feltárása utáni csapadék, 2, E. coli sejtszuszpenzió feltárása utáni felülúszó, 3, ioncserélő oszlopon A kiindulási pufferben áteső frakció, 4, ioncserélő oszlopon 5. frakció, 5, ioncserélő oszlopon 8. frakció, 6, ioncserélő oszlopon 10. frakció, 7, ioncserélő oszlopon 32. frakció, 8, ioncserélő oszlopon 34. frakció, 9, ioncserélő oszlopon 35. frakció, 10. molekulaméret sztenderd, a megfelelő molekulatömegek kDa-ban szerepelnek. A nyíl az M. tub. dUTPáz várt pozíciójat jelöli.

39

A kísérlet értékelése: Várakozásunkkal ellentétben, már az áteső frakcióban megjelent jelentős mennyiségű M. tub. dUTPáz. Ennek valószínű magyarázata az lehet, hogy az oszlop kapacitása nem volt elegendő, így nem tudta a fehérje teljes mennyiségét megkötni. A továbbiakban az átesőben megjelent frakciót is, és a 34. frakciót is gélszűréssel tisztítottam (14 ábra). 1

2

3

4

5

6

7

66 45 36 29 24 20,1 14,2

15 ábra A gélszűrés/FPLC eredménye (SDS-PAGE gél képe) A gélen látható minták felsorolása: 1, molekuláris marker, 2, M. tub. dUTPázt tartalmazó referencia, 3, FPLC után kapott 2. frakció, 4, FPLC után kapott 3. frakció, 5, FPLC után kapott 4. frakció, 6, FPLC után kapott 5. frakció, 7, FPLC után kapott 6. frakció. A marker melletti számértékek az egyes fehérjék molekulatömegét adják meg, kDa-ban.

Az expresszió és a tisztítás értékelése A gélképről jól kivehető, hogy az 5. és 6. számú frakciók tartalmazták a fehérjénket, így ezekkel dolgoztam tovább. A gélszűréssel sikerült SDS-PAGE gélen látható módon legalább 95%-os tisztaságú fehérjét előállítani. 500 ml sejtből, kb. 16 mg tiszta fehérjét sikerült kinyerni, amely SDS-PAGE-n kb. 90%os tisztaságot mutat. Ez a termelés jónak számít, az irodalomban eddig csak egy hasonló

40

eljárást közöltek, ahol a fehérjét affinitás-jelölő kovalens módosítással állították elő (His-tag: hat hisztidin oldalláncal módosított verzió). Az affinitás jelölőket azért alkalmazzák, mert ezzel megkönnyítik a tisztítási eljárásokat, azonban az nem zárható ki, hogy ilyen módon a natív fehérje funkcióját jelentős mértékben módosítják. Ezért fontos eredmény, hogy sikerült ilyen kovalens módosítás nélküli, a natívval teljes mértékben megegyező szekvenciájú fehérjét előállítanunk. 4. 2 Enzimaktivitás mérése A katalizált enzimreakciót követve, több kísérletes körülmény mellett meghatároztam az M. tub. dUTPáz kcat értékét (1. táblázat). Enzim koncentráció [µM] 1,2 1,2 2,4 2,4 12 12 24 24

Mg2+ koncentráció [mM] 1 1 1 1 -

dUTP koncentráció [µM] 40 40 40 40 40 40 40 40

kcat [1/s]

0,3 0,3 0,15 0,15 0,3 0,3 0,15 0,15

1. táblázat Az M. tub. dUTPáz enzim kinetikai analízise. A táblázatban szereplő aktivitás értékeket az anyagok és módszerek fejezetben leírtak alapján határoztam meg.

A kísérlet értékelése A magnézium ion jelenléte, más dUTPázokhoz hasonlóan segíti az enzim katalitikus funkcióját, ugyanakkor a kinetikai mérésekben meghatározott kcat értékek jóval alacsonyabb enzimaktivitást jeleznek, mint amit más forrásokból származó dUTPázoknál tapasztaltak. Máshol; a kcat=8-15 1/s, itt kcat=0,3 1/s (2. táblázat). Enzim forrás E. coli humán ecetmuslica Mason-Pfizer majomvírus (retrovírus) M. tub.

kcat [1/s] 10-15 8-10 7-10 1-2 0,3

2.táblázat

41

kcat értéke több dUTPázra 1997 Proteins, 2004, J. Biol. Chem., 2003, J. Biol. Chem

Mi okozhatja az M. tub. dUTPáz alacsony katalitikus aktivitását? 1. Lehetséges, hogy az enzimpreparátum nincs optimális konformációban, a tisztítás során részlegesen kitekeredett, tönkrement. Ez ellen szól: -nincs kicsapódás a tisztítás és a mérés során (kitekeredett fehérjék gyakran kicsapódnak) -a tisztítás gyors volt (2-3 nap), ezalatt az idő alatt nem jellemző a fehérjékre, hogy kitekerednek A fehérjekonformáció további analízise céljából megvizsgáljuk majd a szubsztrátanalóg ligandum aktív centrumba való kötődését. 2. Nem zárható ki az sem, hogy a M. tub. dUTPáz valóban inherensen alacsonyabb kcat értékkel rendelkezik, mint a többi fajból származó enzim. Feltételezhető, hogy alacsony kcat érték mellett is el tudja látni fehérje funkcióját, ha koncentrációja elég nagy, illetve, ha a sejtben más faktorok ezt lehetővé teszik. Az alacsony aktivitásnak esetleges fehérjeszerkezti oka lehet, hogy az M. tub. dUTPáz aminosav szekvenciájában egy minden más dUTPáz esetében Phe aminosav His-re cserélődött. A Phe His pozíció a dUTPáz 5. konzervált szekvencia motívumában található, az aktív centrumon belül. A Phe His csere az oldalláncok jelentősen eltérő jellege miatt okozhatja az aktivitás változását. Ezt a lehetőséget pontmutációval tudjuk majd esetleg megvizsgálni, a His-t Phe-re cserélve.

42

A következőkben megvizsgáltam az M. tub. dUTPáz szubsztráttelítési görbéjét (14. ábra).

kezdeti sebesség [delta A/min*10

-4

]

15

10

5

0 0

20

40

60

80

100

120

dUTP [mikroM]

16.abra. Az M. tub. dUTPáz által katalizált reakció kezdeti sebességének változása a kiindulási szubsztrát koncentráció függvényében.

A kísérlet értékelése: A 14. ábrán látható, hogy a használt kísérleti módszerrel a KM értéket nem tudtuk pontosan meghatározni, mivel a kísérleti körülmények között még értékelhető jelhez tartozó legalacsonyabb dUTP kiindulási szubsztrát koncentráció mellett sem csökkent a kezdeti sebesség értéke, tehát már ez a koncentráció is telítette az enzimet. Ezért a KM-re csak egy felső korlátot tudunk megállapítani, ennek alapján KM ≤ 5 µM.

4. 3 Szubsztrát analóg gátlás

43

Az irodalmi forrásokból ismert (13), hogy a dUTP szubsztráttal izosztérikus; α, β-iminodUTP (lásd. korábban) hatékony kompetitív gátlószere, mind a bakteriális E. coli, mind az ecetmuslica dUTPáznak. Megvizsgáltam, hogy az M. tub. dUTPáz esetén is használható-e az α, β-imino-dUTP, mint erős gátlószer (3. táblázat).

α,β-imino dUTP [mikroM]

kezdeti sebesség [delta A /min] x 104 10 107,53 20 104,65 40 102,12 60 100,29 80 97,9 100 88,7 125 93,98 150 88,67 200 81,03 300 59,69 400 60,58 500 47,9 600 62,22

kezdeti sebesség [delta A/min]

3.táblázat Az enzim aktivitásának változása a α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát koncentráció függvényében.

120 100 80 60 40 20 0 0

100

200

300

400

500

600

700

alfa, béta-imino dUTP [mikroM]

17. ábra Az enzim aktivitásának változása az α,β-imino dUTP koncentráció függvényében.

A kísérlet értékelés

44

A diagramból is kitűnik, hogy nagy mértékű gátlás tapasztalható. A kvantitatív értékelést nem a kinetikai módon, hanem spektroszkópiával próbáljuk meg elvégezni, mivel annak anyagigénye jelentősen kisebb.

4. 4 A szubsztrátanalóg kötődésének spektroszkópiai vizsgálata Korábbi eredmények mutatták (47), hogy a dUTPáz ligandkötése CD spektroszkópiával jól követhető. Mind a távoli, mind pedig a közeli UV tartományban végeztem méréseket.

Eredmények: Távoli UV CD spektrum: 5

50 µ M α , β -imino-dUTP

Ellipticitás (mdeg)

0 -5 -10 -15

40 µ M MTDUT -20

40 µ M MTDUT+50 µ M α , β -imino-dUTP

-25 200

210

220

230

240

250

Hullámhossz (nm)

18.ábra A szubsztrátanalóg α, β-imino-dUTP kötődése az M. tub. dUTPázhoz szignifikáns spektroszkópiai jelet indukál a távoli UV tartományban, mert CD spektrumban az α, β-imino-dUTP hozzáadására jelentős mértékű csökkenés látható.

A kísérlet értékelése A távoli UV CD tartományban mért spektrális jel arra utal, hogy a ligand kötődése olyan konformáció változást idézett elő, ami a negatív CD jel további erősödéséhez vezetett. A negatív tartományú CD jel erősödése azt mutatja, hogy az enzim-ligand komplexben a fehérje szerkezete némiképp rendezettebbé vált. Ezt a változást a ligand kötődése idézte elő, ezért feltételezhető, hogy ligand-indukált hatásról van szó.

45

Közeli UV CD spektrum:

5

dUTPáz komplex ligandum összeg

4

Ellipticitás, mdeg

3 2 1 0 -1 -2 260

280

300

320

Hullámhossz, nm

19. ábra. A szubsztrátanalóg α, β-imino-dUTP kötődése az M. tub. dUTPázhoz sziginifikáns spektroszkópiai jelet indukál a közeli UV tartományban mért CD spektrumban.

A kísérlet értékelése Mind a távoli, mind pedig a közeli UV tartományban jól követhető CD spektrális jelet indukált a ligandum kötődése. A továbbiakban a közeli UV CD tartományban tapasztalható spektrális jelet, titrálási kísérletben vizsgáltam.

46

A ligandum hozzáadásával nyert differencia spektrumokat a 20. ábra mutatja.:

10 µM ligandum 20 µM ligandum 30 µM ligandum 40 µM ligandum 50 µM ligandum 60 µM ligandum 70 µM ligandum 90 µM ligandum 110 µM ligandum

5,0 4,5 4,0

delta theta [ mdeg ]

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 260

280

300

320

340

hullámhossz [ nm ]

20. ábra. Az M. tub. dUTPáz enzim és az α, β-imino-dUTP komplexálódása során indukált cirkuláris dikroizmus diffrencia spektrumok, a közeli UV tartományban mérve. A fehérje oldathoz növekvő koncentrációjú nukleotid ligandumot adtunk, és az egyes komplexekben, a módszerekben leírtak szerint számítottam a differencia spektrumot. A színkódot az ábra szövegdoboza mutatja.

A kísérlet értékelése Növekvő mennyiségű ligandum a differencia spektrumok egyértelmű fokozatos erősödéséhez vezetett.

47

A differencia spektrumokban 273,4 nm-nél mutatkozó csúcs és a 281,4 nm-nél mutatkozó váll CD értékeit a ligandum koncentráció függvényében mutatja a 21.ábra:

273,4 nm-en mért adatok

differenciálos ellipticitás, mdeg

3,0

2,5

281,4 nm-en mért adatok 2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

α , β -imino-dUTP koncentráció, mikroM

21. ábra Az α, β-imino-dUTP koncentációjának változása a differenciális ellipticitás függvényében két különböző hullámhosszon ( 273,4 és 281,4 nm-en).

A titrálási kísérlet értékelése A ligand indukált spektrális jel, telítődést mutat, ami a komplexálódásra utal. A disszociációs állandót az alábbi képlet alapján határoztam meg:

Θ=[( k/2 )×( cαβ-imino dUTP + E + Kd – (( cαβ-imino dUTP + E + Kd )2 – 4×cαβ-imino dUTP×E ) 0,5 )], [5] ahol;

E – enzimkoncentráció k – moláris differenciális ellipticitás Kd – disszociációs állandó C α β-imino dUTP – szusztrátanalóg koncentráció 48

Θ – mért differenciális ellipticitás A meghatározott disszociációs állandó 1 µM, a hibát jellemző khi2 a két görbe esetén 0,02 illetve 0,018 volt. Ez azt mutatja, hogy az M. tub. dUTPáz a többi dUTPáz fehérjéhez hasonló erőséggel köti a szubsztrátanalógot, így kizárhatjuk, hogy a fehérjekonformáció károsodott volna. Tehát a kinetikai kísérletekben meghatározott kcat az M. tub. dUTPáz enzim valós, inherensen csökkent aktivitását mutatta. 4.5 Limitált tripszinolízis kísérletek A CD spketroszkópiával látható ligand-indukált konformáció változás helyének pontos lokalizációja érdekében emésztési kísérleteket folytattam. Kiindulási elvem az volt, hogy nyomon kövessem a fehérje egyes szegmenseinek mozgékonyságát, emésztő enzimnek való kitettségét, és a mozgékonyság változását a ligand-enzim komplexben. Limitált emésztési kísérleteket gyakran alkalmaznak ilyen célokra. Az emésztési képből következtethetünk, hogy szignifikáns konformációváltozás ment-e végbe a ligandkötődés hatására. Az emésztett fragmensek pontos azonosításával lehetővé válik a konformációváltozás helyének meghatározása a fehérjén belül. A dUTPáz enzim esetében korábban végeztek már hasonló kísérleteket (13),(48,49). Ezekben az esetekben az eredmények arra utalnak, hogy a fehérje Cterminális 10-15 aminósavból álló szegmense viszonylag gyorsan leemésztődik, a fehérje többi részében található petidkötések bontásához azonban, jóval hosszabb reakció idő szükséges. Így valóban megvalósulhat a jól kontrollálható limitált emésztés. Ezen eredményekből kiindulva először megvizsgáltam, hogy milyen tripszin koncentráció mellett érdemes elvégezni a kísérleteket. A tripszin koncentráció az első kísérleteimben a dUTPáz fehérje koncentrációjának tizede volt (mg/ml mértékegységben számolva, mivel az emésztési kísérletekben általában tömegarányokban adják meg az emésztő enzim és a szubsztrát fehérje koncentrációját). A tripszinolízis előrehaladását az enzimaktivitás mérésével, valamint gélelektroforézissel követtem. 1:10 arányú emésztéssel a fehérje aktivitása 20 perc alatt már gyakarolatilag mérhetetlenné vált. Ezért a további kísérletkeben 1:100 ill. 1:200 tripszin:dUTPáz arányt használtam. Az 1:200 tripszin:dUTPáz arány bizonyult leginkább kezelehetőnek. A 4. táblázat mutatja be az enzimaktivitás csökkenését az 1:200 arányú emésztés során.

IDŐ [min]

kezdeti sebesség [delta A /min] x 104

49

0 10 20 30 40 50 60

10,21 4,78 2,60 2,43 1,87 1,36 0,79

4. tábláza Az enzim aktivitásának változása a tripszinolízis során.

Az α,β-imino dUTP ligand jelenlétében az emésztés hatékonysága (az előző táblázattal összevetve) szignifikánsan csökkent, ahogy az alábbi táblázat mutatja:

IDŐ [min] 0 10 20 30 40 50 60

kezdeti sebesség [delta A /min] x 104 11,84 10,70 9,77 9,60 9,48 9,11 8,84

5. táblázat Az enzim aktivitásának változása a tripszinolízis során a szubsztrátanalóg jelenlétében.

A mért értékeket diagramban ábrázolva a 22. ábra mutatja: 100

α , β -imino-dUTP jelenlétében

enzimaktivitás, %

80

60

40

α , β -imino-dUTP nélkül

20

0 0

10

20

30

40

50

60

idõ, perc

22. ábra Az M. tub. dUTPáz enzim aktivitásának változása a triptikus emésztés során az idő függvényében, α, β-iminodUTP jelenlétében és nélkül.

50

A kísérlet értékelése: Megállapítható, hogy egyrészt a tripszin 60 perces emésztése a kísérleti körülmények között a ligandum távollétében az enzimaktivitás 90%-os csökkenését okozza. Másrészt az α, β-imino-dUTP ligand jelentős védőhatást fejt ki, ami arra utal, hogy itt is észlelhető a ligand kötődése által okozott konformáció változás, amire a CD spektroszkópiás kísérlet már utalt. Az emésztési időgörbéket egyszerű exponenciális elméleti egyenlettel illesztettem. Az illesztés kielégítőnek bizonyult, ami azt jelenti, hogy az emésztés során feltételezhetjük, hogy a tripszin a dUTPáz enzimet egy adott peptidkötésnél hasítja. Az is elképzelhető, hogy több peptidkötés hasad, hozzávetőlegesen azonos kinetikával. Ennek eldöntésére az emésztési reakciók termékeit SDS-PAGE gélelektroforézissel vizsgáltam (23. és 24. ábrák).

A gélek eredményei a következők lettek: 1. gél: 1

2

3

4

5

6

7

8

66 45 36 29 24 20,1 14,2

23. ábra A dUTPáz enzim tripszinolízise α, β-imino dUTP távollétében (SDS-PAGE gél képe). nyil A gélen látható minták sorrendje a következő; 1-es: 60 perces emésztés után, 2-es: 50 perces emésztés után, 3as-40 perces emésztés után, 4-es: 30 perces emésztés után, 5-ös: 20 perces emésztés után, 6-os: 10 perces emésztés után, 7-es: emésztés 0. percében, 8-as: fehérje marker.

51

2. gél:

1

2

3

4

5

6

7

8 66 45 36 29 24 20,1 14,2

24. ábra Az α, β-imino dUTP védőhatásának vizsgálata (SDS-PAGE gél képe). A gélen látható minták sorrendje a következő; 1-es: 60 perces emésztés után, 2-es: 50 perces emésztés után, 3as-40 perces emésztés után, 4-es: 30 perces emésztés után, 5-ös: 20 perces emésztés után, 6-os: 10 perces emésztés után, 7-es: emésztés 0. percében, 8-as: fehérje marker. A fekete nyíl a fehérjét (felső gélcsík), a piros nyíl pedig az emésztett fragmenst (alsó gélcsík) jelöli.

A kísérlet értékelése: A gélek eredményei arra utalnak, hogy valóban egy peptidkötés hasadt el a kiindulási natív fehérjéből egy annál kb. 1-1.5 kDa molekulatömeggel kisebb méretű szegmens keletkezett a tripszinolízis során. A lehasadt 1-1.5 kDa molekulatömegű peptid a gélen nem látható, valószínűleg kifutott a gélből, amely nagyobb méretű fehérjék elválasztását teszi lehetővé. A natív szerkezetűnél 1-1.5 kDa-al kisebb tömegű egység látható a gélen, ami azt jelenti, hogy vagy az N, vagy a C-terminális részről hasadt le egy kis peptid.

52

A tripszinel hasított szegmens pontos azonosítására tömegspekrometriai módszert alkalmazunk. Az emésztett fehérjefragmenst tartalamzó csíkot a gélből kivágtam és 40 µl tömény ecetsavat adtam hozzá. Az így előkészített mintákat a Szegedi Biológiai Központ Proteomika laboratóriumában tömegspektrometria vizsgálatnak vetették alá. Az emésztés nélküli tisztított fehérjéből is elküldtünk egy-egy gélcsíkot azonosítás céljából. A szekvencia vizsgálatával is nagy valószínűséggel azonosíthatjuk a

tripszinolízis

helyét. Fehérje szekvencia (R, K vastag betűvel jelölve, a triptikus hasítási helyeket mutatják, mert a tripszin, Lys(K) és Arg(R) után hasít):

1 MSTTLAIVRL DPGLPLPSRA HDGDAGVDLY SAEDVELAPG RRALVRTGVA VAVPFGMVGL 61 VHPRSGLATR VGLSIVNSPG TIDAGYRGEI KVALINLDPA APIVVHRGDR IAQLLVQRVE 121 LVELVEVSSF DEAGLASTSR GDGGHGSSGG HASL 25. ábra Az M. tub. dUTPáz aminosavszekvenciája (egybetűs kódokkal, vastagon szedve a lehetséges triptikus hasítási helyek).

4.5.1 Tömegspektrometria vizsgálat A tömegspektrometriai vizsgálathoz a beérkezett gélcsíkokat tripszines totálemésztésnek vetették alá. Az így keletkezett peptid elegyet a laboratórium szokásos vizsgálati módszerével analizálták. Mindkét gélcsík emésztése megerősítette (92%-os és 100%-os tömegtalálattal), hogy a mintában a Mycobacterium tuberculosis dUTPáz található. A gélcsíkok emésztésével kapott szekvencia-lefedettséget a vastagon szedett részek jelölik: Felső gélcsík (valószínűleg a natív fehérje, lásd. 23. ábra): MSTTLAIVRL

DPGLPLPSRA

HDGDAGVDLY

SAEDVELAPG

RRALVRTGVA

IAQLLVQRVE

LVELVEVSSF

VAVPFGMVGL VHPRSGLATR VGLSIVNSPG TIDAGYRGEI

KVALINLDPA

APIVVHRGDR

DEAGLASTSR GDGGHGSSGG HASL

Alsó gélcsík (limitált emésztés során megjelenő fragmens, lásd. 23. ábra): MSTTLAIVRL

DPGLPLPSRA

HDGDAGVDLY

VAVPFGMVGL VHPRSGLATR VGLSIVNSPG

53

SAEDVELAPG

RRALVRTGVA

TIDAGYRGEI

KVALINLDPA

APIVVHRGDR

IAQLLVQRVE

LVELVEVSSF

DEAGLASTSR GDGGHGSSGG HASL

A gélben emésztéssel kapott eredményekkel összhangban van az oldat minta intakt tömegmérése: Oldatban MH+=15674 tömegértéknél detektáltunk egy kis intenzitású csúcsot, ami az első Met aminósav lehasadását figyelembe véve a teljes fehérjének felel meg: a [2-154] szakaszon, a várt MH+=15672, eltérés +0.0069%. Emellett közepesen intenzív csúcsot detektáltunk MH+=14491 tömegértéknél, ami a triptikus hasítást és a tömegmérés pontosságát tekintve a [2-140] szakaszon, a várt MH+=14495, eltérés -0.033%. Sikerült azonosítani a tripszin hasítási helyét. Várakozásunknak megfelelően, a hasítási hely a C-terminális végről visszafelé az első argininnél található, hasonlóan sok más dUTPázhoz, amely egy szigorúan konzervált pozíció. A C-terminális régió tehát flexibilis, és az α,β-imino dUTP kötődésének hatására rendezettebbé válik.

4.6 Kristályosítási kísérlet Az Európai Uniós pályázat célul tűzi ki az ígéretes fehérje-antagonista komplexek nagyfelbontású szerkezetvizsgálatát. Ennek első lépése, hogy laboratóriumunkban képesek legyünk az M. tub. dUTPáz fehérjéből diffraktáló egykristályokat előállítani. Ezért a jelen dolgozatban ligandként az α,β-imino dUTP nukleotidot használva, számos kristályosítási körülményt próbáltam ki. Egyrészt általánosan alkalmazott körülményeket ( Sigma kit Basic screen, Hampton 2), másrészt az irodalmi adatok [48] finomhangolása révén (PEG puffer töménységének és a pH változtatásával) még néhány másik körülményt alkalmaztam. A legelterjedtebb és általam is alkalmazott kristályosító technika, a függőcsepp módszer, a gőzdiffúzió jelenségén alapul. Egy légmentesen lezárt körülbelül 2 ml térfogatú térrész tartalmaz egy 2-10 µl térfogatú fehérjetartalmú cseppet, amely a légtéren át érintkezik, 1 ml kristályosító oldattal (25. ábra). A cseppet úgy álltíjuk össze, hogy egy térfogat fehérjoldathoz egy térfogat

kristályosító oldatot adunk. Ezután a cellát lezárjuk a cseppet tartalmazó

lemezkét a cella fölött rögzítjük, vakuumzsír szigetelést alkalmazva. Állás közben a két oldat feletti parciális gőznyomások minden komponensre kiegyenlítődnek, a csepp fehérjére nézve lassan töményedik. E technika előnye, hogy kíméletes a fehérjével, kevés anyag

54

felhasználásával teszi lehetővé nagy számú körülmény kipróbálását és az optimális körülmény megtalálását, és könnyű az így növesztett kristályok felszerelése is.

26. ábra A függőcsepp módszer. A cseppben és a kristályosító oldatban lévő kicsapószer koncentráció a gőztéren át kiegyenlítődik, a csepp fehérjére nézve lassan betöményedik.

A kísérlet értékelése: Nagy számú kezdeti körülményben, jól diffraktálható kristályokat nyertünk (6. táblázat).

55

6. táblázat

jel I/4

Kristályosítási körülmények összetétel 2.0M (NH4)2SO4, Tris 8.5

kristály

szerkezet hexagonális prizmák és kockák

I/38

1.4M Na-citr, Hepes 7.5

hexagonális lemezek és piramisok

I/39

2.0M (NH4)2SO4, Hepes 7.5, 2% PEG 400

hexagonális prizmák és kockák

II/23

1.6M (NH4)2SO4, MES 6.5, 10% Dioxán

Ikerkristályok, háromszög alapú prizmák

II/32

1.6M hexagonális (NH4)2SO4, lemezek és Hepes 7.5, 0.1M kockák NaCl

Felbontás (Angström)

kristályrendszer

Elemi cella méretei (a,c Angströmben)

2.3

hP

54.1, 82.8

2.1

hP

54.3, 82.9

1.9-2.0

hP

55.6, 72.0

>1.6

hP

54.5, 82.1

fotó

56

II/42

1.5M (NH4)2SO4, Tris 8.5, 12% glicerol

hexagonális prizmák

>1.5

hP

54.7, 83.2

II/26

30% PEG MME 5000, MES 6.5, 0.2M (NH4)2SO4

tollak

2.3

hP

55.4, 71.9

irodalmi

20% PEG 4000, lemezek Tris 8.5

1.8-2.0

oP/tP

54.7, 57.1, 108.7

irodalmi

20% PEG 4000, tűk Tris 8.5, 0.2M NaCl

2.5

oP/tP

55, 108.6

irodalmi

30% PEG 4000, hexagonális Tris 8.5, 0.2M prizmák és NaCl kockák

2.2

hP

54.6, 83.2

Jelmagyarázat: Az első oszlop a kristályosítási körülmények forrását jelöli. A római egyes a Sigma Basic Kit-et, a római kettes pedig a Hampton 2-őt, az irodalmi pedig a korábban már említett, irodalomból vett körülményeket takarja. Az utolsó oszlopban, azokban az esetekben ahol b nem egyenlő a-val, vagyis az alap nem négyzet ott b is fel van tüntetve.

57

5. Eredmények összefoglalása Munkám célja a Mycobactérium tuberculosis dUTPáz enzimének karakterizálása és kristályosítása volt, valamint olyan szűrőmódszerek kidolgozása, melyek közepes illetve nagy áteresztő képességűek, így segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk szűrni a TBC dUTPáz-a ellen ható lehetséges antagonistákat. Az eredmények a következők: 1. Sikerült klónozni a dUTPáz enzim génjét, a fehérje expressziója jónak (500 mg sejtből 16 mg tiszta fehérje) mondható. 2. A fehérje katalitikus aktivitása a többi forrásból származó dUTPáz enzimhez képest alacsony ( 0,15 [1/s] ) , de Mg ion jelenlétében az aktivitás nő ( 0,3 [1/s] ). 3. A ligandindukált konformáció változás CD spektroszkópiával kimutatható. 4. Limitált tripszinolízissel azonosítottam az α, β-imino dUTP ligand által védett peptidkötést az enzimen belül. 5. Az enzimaktivitás mérése, valamint a limitált tripszinolízis módszere, nagyszámú antagonista szűrésére alkalmazható. Mindkét esetben hozzávetőlegesen naponta 10 antagonista vizsgálható. 6. Kilenc, részben különböző kicsapó ágens mellett, jól diffraktáló fehérje kristályokat nyertem. A számos különböző körülmény rendkívül ígéretesnek bizonyult, mivel valószínűsíthető, hogy ezek közül egy vagy több az antagonistákkal együtt kristályosítandó fehérje esetében is célravezető lesz.

Irodalom 1. 2.

Boshoff, H. I., Reed, M. B., Barry, C. E., 3rd, and Mizrahi, V. (2003) Cell 113(2), 183-193 Friedberg, E. C., and Fischhaber, P. L. (2003) Cell 113(2), 139-140 58

3.

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

Cole, S. T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S. V., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, C. E., 3rd, Tekaia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Moule, S., Murphy, L., Oliver, K., Osborne, J., Quail, M. A., Rajandream, M. A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, J. E., Taylor, K., Whitehead, S., and Barrell, B. G. (1998) Nature 393(6685), 537-544 Kana, B. D., and Mizrahi, V. (2004) Tuberculosis (Edinb) 84(1-2), 63-75 Ruiz, P., Rodriguez-Cano, F., Zerolo, F. J., and Casal, M. (2002) Microb Drug Resist 8(2), 147-149 Wu, X., Zhang, J., Zhuang, Y., Zhang, X., Li, G., and He, X. (1999) Chin Med J (Engl) 112(6), 524-528 Schroeder, E. K., de Souza, N., Santos, D. S., Blanchard, J. S., and Basso, L. A. (2002) Curr Pharm Biotechnol 3(3), 197-225 Slayden, R. A., and Barry, C. E., 3rd. (2000) Microbes Infect 2(6), 659-669 Nunn, C. M., Djordjevic, S., Hillas, P. J., Nishida, C. R., and Ortiz de Montellano, P. R. (2002) J Biol Chem 277(22), 20033-20040 Zhang, Y., Wade, M. M., Scorpio, A., Zhang, H., and Sun, Z. (2003) J Antimicrob Chemother 52(5), 790-795 Cheng, S. J., Thibert, L., Sanchez, T., Heifets, L., and Zhang, Y. (2000) Antimicrob Agents Chemother 44(3), 528-532 Mitchison, D. A. (2004) Front Biosci 9, 1059-1072 Vertessy, B. G., Larsson, G., Persson, T., Bergman, A. C., Persson, R., and Nyman, P. O. (1998) FEBS Lett. 421(1), 83-88 Mustafi, D., Bekesi, A., Vertessy, B. G., and Makinen, M. W. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100(10), 5670-5675 Pearl, L. H., and Savva, R. (1996) Nat Struct Biol 3(6), 485-487 Lindahl, T. (1993) Nature 362(6422), 709-715 Tye, B. K., and Lehman, I. R. (1977) J Mol Biol 117(2), 293-306 Mosbaugh, D. W., and Bennett, S. E. (1994) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 48, 315-370 Blount, B. C., Mack, M. M., Wehr, C. M., MacGregor, J. T., Hiatt, R. A., Wang, G., Wickramasinghe, S. N., Everson, R. B., and Ames, B. N. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94(7), 3290-3295 Vassylyev, D. G., and Morikawa, K. (1996) Structure 4(12), 1381-1385 Goulian, M., Bleile, B., and Tseng, B. Y. (1980) Proc Natl Acad Sci U S A 77(4), 1956-1960 Traut, T. W. (1994) Mol Cell Biochem 140(1), 1-22 Gadsden, M. H., McIntosh, E. M., Game, J. C., Wilson, P. J., and Haynes, R. H. (1993) Embo J 12(11), 4425-4431 el-Hajj, H. H., Zhang, H., and Weiss, B. (1988) J Bacteriol 170(3), 1069-1075 Bekesi, A., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyas, E., Pongracz, V., Kovari, J., Nagy, A. O., Erdei, A., Medzihradszky, K. F., and Vertessy, B. G. (2004) J Biol Chem 279(21), 22362-22370 Ladner, R. D., and Caradonna, S. J. (1997) J Biol Chem 272(30), 19072-19080 Igney, F. H., and Krammer, P. H. (2002) Nat Rev Cancer 2(4), 277-288 Moertel, C. G. (1994) N Engl J Med 330(16), 1136-1142 Canman, C. E., Radany, E. H., Parsels, L. A., Davis, M. A., Lawrence, T. S., and Maybaum, J. (1994) Cancer Res 54(9), 2296-2298

59

30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49.

Pugacheva, E. N., Ivanov, A. V., Kravchenko, J. E., Kopnin, B. P., Levine, A. J., and Chumakov, P. M. (2002) Oncogene 21(30), 4595-4600 Koehler, S. E., and Ladner, R. D. (2004) Mol Pharmacol 66(3), 620-626 Chano, T., Mori, K., Scotlandi, K., Benini, S., Lapucci, C., Manara, M. C., Serra, M., Picci, P., Okabe, H., and Baldini, N. (2004) Oncol Rep 11(6), 1257-1263 Zalud, P., Wachs, W. O., Nyman, P. O., and Zeppezauer, M. M. (1994) Adv Exp Med Biol 370, 135-138 Munoz-Pinedo, C., Oliver, F. J., and Lopez-Rivas, A. (2001) Biochem J 353(Pt 1), 101-108 Lerner, D. L., Wagaman, P. C., Phillips, T. R., Prospero-Garcia, O., Henriksen, S. J., Fox, H. S., Bloom, F. E., and Elder, J. H. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92(16), 7480-7484 Larsson, G., Svensson, L. A., and Nyman, P. O. (1996) Nat Struct Biol 3(6), 532-538 Prasad, G. S., Stura, E. A., McRee, D. E., Laco, G. S., Hasselkus-Light, C., Elder, J. H., and Stout, C. D. (1996) Protein Sci 5(12), 2429-2437 McGeoch, D. J. (1990) Nucleic Acids Res 18(14), 4105-4110 Cedergren-Zeppezauer, E. S., Larsson, G., Nyman, P. O., Dauter, Z., and Wilson, K. S. (1992) Nature 355(6362), 740-743 Mol, C. D., Harris, J. M., McIntosh, E. M., and Tainer, J. A. (1996) Structure 4(9), 1077-1092 Vertessy, B. G., Kovács, J., Löw, P., Lehotzky, A., Molnár, A., Orosz, F., and Ovádi, J. (1997) Biochemistry 36(8), 2051-2062 Barabas, O., Pongracz, V., Kovari, J., Wilmanns, M., and Vertessy, B. G. (2004) J Biol Chem 279(41), 42907-42915 Bloemendal, M., and Johnson, W. C., Jr. (1995) Pharm Biotechnol 7, 65-100 CCP4. (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-763 Webb, M. R. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(11), 4884-4887 Vagin, A., and Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Crystallogr. 30, 1022-1025 Vertessy, B. G., Orosz, F., Kovács, J., and Ovádi, J. (1997) J Biol Chem 272(41), 25542-25546 Vertessy, B. G. (1997) Proteins 28(4), 568-579 Nord, J., Kiefer, M., Adolph, H. W., Zeppezauer, M. M., and Nyman, P. O. (2000) FEBS Lett 472(2-3), 312-316.

60

61