Dr. Magyar Ildikó
Botrítiszes borok készítésének mikrobiológiája
A Tokaji Aszú készitése vá logatá s
Dr. Magyar Ildikó BCE Borászati Tanszék
é p bogyó
aszú bogyó
szõ lõ feldolgozá s
híres botrítiszes borok: Tokaji Aszú Aszú Sauternes and Barsac Coteaux du Layon (Loire) Trockenbeerenauslese
musttisztitá s
aszúsodott fürt
tá rolá s
Esszencia
zú zá s (feltá rá s)
erjedő must erjeszté s
szá raz ú jbor
extrakció
újbor
é rlelés,stabilizá lás Tokaji bor
Furmint Hárslevelű Muskotály
Az aszúkészítést befolyásoló mikrobás folyamatok
1. Aszúsodás folyamata a tőkén 2. Aszúbogyó szedése, szállítása, tárolása 3. Aszúkészítés 4. Erjesztés 5. Érlelés 6. Palackozás
Borászati mikrobiológia
ú jraerjeszté s
fahordós é rlelés
Tokaji Aszú
1. Az aszúsodás mikrobiológiai folyamatai
pré selé s
1.1. A Botrytis cinerea szerepe – – –
bogyóhéj enzimes és mechnanikai feltárása kémiai átalakulások a mustban a társult mikroflóra összetételének módosítása
1. 2. A társult mikroflóra szerepe – – –
Penészgombák (Penicillium, Aspergillus, Mucor sp.) Élesztőgombák (C. pulcherrima, C. stellata) Savképző baktériumok(tejsav- és ecetsavbaktériumok)
1
Dr. Magyar Ildikó
A Botrytis cinerea szerepe
Botrytis cinerea
A botrítiszes fertőzés folyamata
Nemesrothadás : a Botrytis cinerea penészgomba anyagcsere tevékenységének és a szőlő tőkén való töppedésének együttes eredménye
Process of invasion
Borászati mikrobiológia
(Bene-Magyar, 1999)
1. A bogyóhéj enzimes és mechnanikai feltárása
Csökken – termésmennyiség – a bogyó víztartalma – glükóz-frukróz arány – borkősav, almasav – pektin – asszimilálható N – szőlő fajtajelleg
Növekszik – cukorkoncentráció – ásványi anyagok – glicerin – glükonsav (e.baktériumok) – (ecetsav - e.baktériumok) – citromsav, galakturonsav, nyálkasav – botrítiszes poliszacharidok (glükán) – botrítiszes aromaanyagok – lakkáz enzim
2
Dr. Magyar Ildikó
Tokaji esszenciák fontosabb kémiai paraméterei különböző évjáratokban (Mád) Paraméter sűrűség redukáló cukor..g/l glükóz …g/l fruktóz ..g/l G:F arány glicerin ..g/l titrálható sav ..g/l illósav ..g/l borkősav ..g/l almasav ..g/l glükonsav ..g/l citromsav ..g/l tejsav ..g/l pH
1993 1.295 686 340 343 0.99 24.3 16.5 4.83 5.77 3.20 0.11 0.08 3.18
1999 575 261 302 0.86 29.5 21.8 1.11 7.74 12.5 5.04 0.69 0.89 3.1
2000 1.287 708 335 382 0.88 30.7 14.7 0.49 4.44 7.42 3.88 0.99 3.14
Az élesztőflóra összetétele az aszúbogyó felületén, tőkéről vett mintákban (Bene, 2000) Év fajta 1998 Furmint Furmint Furmint Furmint Hárslevelű Hárslevelű 1999 Furmint Muscat Vegyes Furmint 2000 Hárslevelű Furmint Hárslevelű Hárslevelű
Borászati mikrobiológia
domináns élesztő egyéb izolált élesztőfajok sejtszáma faja 5.30 Hanseniaspora Rhodotorula sp. guillermondii 4.60 nem azonosított 4.60 Rhodotorula sp. C.pulcherrima, C.apicola 5.70 Candida pulcherrima Hanseniaspora uvarum 5.48 Candida stellata C.pulcherrima, C.paludigena, H.uvarum 6.00 nem azonosított Zygosacch. sp., C.cantarelli, C.multigemmis, Kluyv.lactis 3.90 Cryptococcus Cryptococcus macerans, albidus Sporidiobolus pararoseus 4.30 Sporidiobolus C.pulcherrima, Arxula terrestris, pararoseus Cr.macerans 5.78 Candida pulcherrima H’spora uvarum, C. stellata, Sympodiomycopsis sp. 4.48 Candida pulcherrima 3.70 Nem azonosított 5.30 Candida pulcherrima Candida stellata 5.00 Hanseniaspora Rhodotorula sp., Candida sp., Sporidiobolus uvarum sp., Candida dendrica 4.00 Candida stellata Candida pulcherrima
Taxonomic composition of the yeast biota of aszú grapes in four years. (Tokaj 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003) Number of different strains taken from 63 grape samples Genera/species
In grape samples from the vineyard n
In grape samples from the winery n
Total isolates
Candida pulcherrima
15
21
32
Candida zemplinina / stellataa
8
22
30
Candida sp.*
7
10
17
Candida
28
51
79
Hanseniaspora
11
11
22
Kluyveromyces
1
4
6
Brettanomyces
1
4
5
Zygosaccharomyces
1
4
5
Torulaspora
0
4
4
Pichia
1
1
2
Aerobic Basidiomycetes sps.**
20
9
29
Not identified
9
19
28
Total
71
107
178
*Candida catenulata, bombicola, paludigena, sake, apicola, cantarellii, dendrica, floricola, multigemmis **Sporidiobolus, Rhodotorula, Trichosporon, Arxula, Sympodiomycopsis, Cryptococcu sps.
3
Dr. Magyar Ildikó
Candida stellata
Candida zemplinina
1. Az aszúsodás mikrobiológiai folyamatai
1.2. A társult mikroflóra szerepe
Penészgombák – – – –
Élesztőgombák –
C. zemplinina: újabban leírt faj (Sipicki, 2002)
C. pulcherrima, C. zemplinina (C.stellata?), aerob fajok
Csak molekuláris vizsgálatokkal különíthetők el egymástól
Valószínűleg a korábbi C. stellata izolátumok nagyrésze C. zemplinina
2. Mikrobás folyamatok az aszúbogyó szedése, szállítása, tárolása során
kellemetlen íz és illatanyagok oxidáz és hidroláz enzimek patulin, ochratoxin - nem vagy csak nyomokban mutatható ki! antibiotikumok?
Ecetsavbaktériumok –
ecetsav, glükonsav, keto-glükonsav
Az élesztőflóra összetétele az aszúbogyó felületén, üzemből vett mintákban (2-4 hét tárolás után) C. stellata= C. zemplinina Év
Szőlőfajta
1998 Furmint Vegyes Muscat
Domináns sejtszáma (Log sejt/ g bogyó) 5.78 6.00 6.30
élesztő nemzetsége / faja
Egyéb élesztőfajok
Vegyes
5.30
Furmint
5.00
Candida stellata P.angusta, Kluyv.thermotolerans Hanseniaspora occidentalis C.stellata, C.pulcherrima Candida floricola C.pulcherrima, Rhodotorula sp., H'spora uvarum, C. sake Zygosaccharomyces rouxii Rhodotorula sp., Brettanomyces bruxellensis, H'spora uvarum Brettanomyces bruxellensis Kluyveromyces lactis
Furmint Furmint Vegyes
4.00 2.85 2.70 3.78 6.30
Candida stellata Candida stellata Non-identified Torulaspora sp. Candida stellata
2000 Vegyes Vegyes Furmint Vegyes
2,54 3,70 5,51 5,38
Cryptococcus sp. Nem azonosított Candida pulcherrima Candida stellata
Vegyes Vegyes Furmint Vegyes
5,93 4,65 7,38 4,85
Candida Candida Candida Candida
1999 Muscat
Borászati mikrobiológia
aldehidek, ketosavak, észterek ???
stellata stellata stellata catenulata
Zygosaccharomyces sp. C. stellata, C. pulcherrima T’spora delbrueckii, Zyg.rouxii
Hanseniaspora uvarum,Candida sp. Sporidiobolus sp., C. paludigena, C. catenulata Candida sake
4
Dr. Magyar Ildikó
3. Az élesztőflóra változása az aszúkészítés (áztatás) során
4. Az aszúerjesztés mikrobiológiája
Aszúkészítés fázisai, 1999. Mád
Aszúkészítés fázisai, 1996. Mád
8
8 7 6 5 4 3 2 1
7
Lg N
6
Lg N
5 4
–
3 2
aszúbogyó
áztatóbor
–
nyers aszú
aszúbogyó
áztatóbor
nyers aszú
Összes élesztő C.stellata C. vini Zyg. rouxii T'spora delbrueckii Pichia sp. N.A.
(Sárospatak, 1996)
9
3 1
7
Alko hol V /V %
13 11
Áztatás 1. Must 2. Újbor 3. Óbor
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Idő (hét)
alkohol 7,7 8,2 7,8
Milyen előnyökkel és korlátokkal jár helyi szelektált élesztőtörzsek alkalmazása starterkultúraként? Melyek az aszúerjesztés optimális feltételei (hőmérséklet, edényzet, tápanyagellátás, erjedés megszakítása stb.)?
A természetes élesztőpopulációk változása tokaji aszú spontán erjedése során, 12 oC-on Kezdeti alkoholtartalom: 6,8 V/V %, cukortartalom 235 g/l
A spontán erjedés lefutása különböző módon extrahált aszúborban 1. Erjedő musttal 7 5
erjesztésében, érzékszervi és analitikai minőségében?
1
Összes élesztő C.stallata Candida sp. Zyg. rouxii T'spora delbrueckii Zygosacch.bailii Saccharomyces
lg sejt/ml
Milyen élesztőfajok vesznek részt az aszú spontán erjedésében? Van-e különbség a helyi pincészetek élesztő biótájában? Mi a szerepe a helyi vadélesztőknek az aszúborok
(Kardos, 1998.)
cukor 240 247 223
o
12 C Ref % - - -
Log N 8
S. cerevisiae
28
C.stellata
5
26
T.delbrueckii
4
24
7
3. Óborral
5
11
3
9
1
7 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18
Idő (hét)
Borászati mikrobiológia
6
7 5 3 1
13 11 9 7 0
2
4
6
A lk o h o l V /V %
7
lg s e jt/m l
13
Alkohol V/V%
lg sejt/m l
2. Száraz újborral
8 10 12 14 16 18
Total yeast
30
3 22
2
Zyg.bailii Pichia sp. Candida sp.
1
20 0
50
100
Extract
idő (nap)
Idő (hét) Összes élesztő
nem-Saccharomyces
Candida stellata
alkohol
5
Dr. Magyar Ildikó
Dynamics of fermentation in Aszú wine performed by 15 oC S.cerevisiae strains S. bayanus/uvarum strains
A Candida stellata szerepe az aszúerjesztésben A, az erjedés kinetikájára
Brix
B, az aszú érzékszervi minőségére
(cukorfogyás)
SB 20/1.13
SB I/O/1
SC 34/1.03
28 SB I/1/8
SC RA100 SC PM321
26
S.c.
SB I/2/7 26
SC UVA PM
SB I/5/1M
SC I/1/7
24
24
SC I/2/D
26 24 22 20 0
10
20
30
40
20
22
SC I/10/3M SC I/9/z1
SB I/8/2LM 22
SB I/10/6M SB I/2/z2
SC I/3/4 20
15
SC I/3/5
20
SB CBS 380 SB I/3/BI
18
SB I/5/2
SC I/0/z3
10
SC II/0/o7
18
SC II/4/z1
SB I/8/13
SC II/6/z2
5 16
idő (nap)
SB I/8/11M
SC I/3/A Ref%
25
Ref%
28
b írála t i á tlag p o nt
30
SB I/2/12
SC I/O/A
30
Ref %
SB I/O/C
SC 11/1.24 28
C.stellata + S.c.
SB RA3106
30
SC RA4106
(7 bíráló x 3 párhuzamos erjesztés) C.stellata
SB 34/1.01
S. bayanus strains
S.cerevisiae strains
30
SC IV/6/z2
16
SB I/10/1
SC IV/8/z2
0 C.stellata
C.stellata+S.c.
S.c.
base wine
SC Actiflor 14 0
2
4
6
8
10
12
SB II/2/z9a SB IV/0/z4
14 0
14
2
4
6
8
10
12
14
time (wee ks)
time (weeks)
Borászati Tanszék Magyar Ildikó
Byproducts of fermentation
Borászati mikrobiológia
CZ PM602
CST 20/1.12
ACTIFLOR
SC II/4/z1
SC IV/6/z2
SC I/3/4
C.stellata C.zemplinina
SC I/0/z 3
SC I/2/D
SC I/10/3M
SC I/O/A
SC 4106
SB II/2/z 9a
SB CBS 395
SB I/3/BI
SB I/8/13
SC 34/1.03
S.cerevisiae
SB I/2/z2
CZ PM602
CST 20/1.12
ACTIFLOR
SC II/4/z1
*Yields of glycerol on fermented sugar
SC IV/6/z2
SC I/3/4
SC I/0/z3
SC I/2/D
SC I/10/3M
SC I/O/A
SC 4106
SC 34/1.03
SB II/2/z9a
SB CBS 395
SB I/3/BI
SB I/8/13
SB I/2/z2
SB 1/8/2LM
SB I/2/7
SB I/5/1M
SB I/O/1
SB TK 01
0
SB 34/1.01
20
SB 1/8/2LM
40
SB I/2/7
60
SB I/5/1M
80
SB I/O /1
100
SB TK 01
120
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
S.bayanus
SB 34/1.01
S.cerevisiae
S.bayanus mg glycerol / 1 g sugar
C.stellata C.zemplinina
mg acetic acid / 1 g sugar
Volatile acid production* Glycerol production*
*Yields of acetic acid on fermented sugar
6
Dr. Magyar Ildikó
Környezeti té tényező nyezők hatá hatása az élesztő lesztők egyes erjedé erjedési termé termékeire C.stellata C.zemplinina
S.cerevisiae
Kísérleti körülmények –
Modell oldat cukortartalom:
180 és 260 g/l tartalom: 3 v/v % glicerin tartalom: 10 g/l alkohol
CZ PM602
CST 20/1.12
ACTIFLOR
SC II/4/z1
SC IV/6/z2
SC I/3/4
SC I/0/z3
SC I/2/D
SC I/10/3M
SC I/O/A
SC 4106
SC 34/1.03
SB II/2/z9a
SB CBS 395
SB I/3/BI
SB I/8/13
SB I/2/z2
SB 1/8/2LM
SB I/2/7
SB I/5/1M
SB I/O/1
– SB TK 01
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
SB 34/1.01
G/F
Glucose-fructose ratio S.bayanus
Hőmérséklet: 12 oC és 18 oC
Élesztőtörzsek PM321
RA100 UVAFERM PM
PM404
A cukorkoncentráció és hőmérséklet hatása Sacch. cerevisiae törzsek illósav termelésére modell oldatban (kezdeti alkoholtartalom 3 v/v%)
A cukorkoncentráció és hőmérséklet hatása Sacch. cerevisiae törzsek illósav termelésére modell oldatban (kezdeti alkoholtratalom: 6 v/v%) Illósavtartalom alakulása a 15˙C-os erjesztés után
o
Illósav 18 C
1,2
1,2
1
1
0,8
0,8
0,6 0,4
260 g/l cukor
"A" oldat 21˙C
"B" oldat 15˙C
"B" oldat 21˙C
1,2
1,2
g/l
180 g/l cukor
"A" oldat 15˙C
1
1
0,8
0,8
0,6
0,6
g/l
260 g/l cukor
g/l
g/l
180 g/l cukor
Illósavtartalom alakulása a 21˙C-os erjesztés után
o
Illósav, 12 C
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,4
0,2
0,2
0 0
0 Kontroll
Borászati mikrobiológia
RA100
PM321
PM404
UVA PM
0
RA100 Kontroll
RA100
PM321
PM404
UVA PM
PM321
PM404 élesztőtörzs
UVA PM
Contr.
RA100
PM321
PM404
UVA PM
Contr.
élesztőtörzs
7
Dr. Magyar Ildikó
Az aszúerjesztés mikrobiológiája Következtetések
Spontán erjedésnél a C.stellata általában végig jelentős sejtszámban kimutatható. A mérhető alkoholképződéskor már Sacch. cerevisiae törzsek dominálnak az aszúborokban. Az aszúborok erjesztésében a Sacch. cerevisiae több fiziológiai változata, ezen belül is több törzs játszik szerepet egy boron belül is. A S. cerevisiae mellett gyakori a S. uvarum (S. bayanus) előfordulása is! A domináns Saccharomyces törzsek pincészetenként különbözõek.
Szelektált helyi Saccharomyces törzsekkel végzett beoltással az erjedés lényegesen gyorsítható, és a természetes populáció is visszaszorul, de teljesen nem eliminálható.
A S. uvarum törzsek erjesztőképessége lényegesen gyengébb a S. cerevisiaenél. Önmagában ez a faj starterkultúraként nem biztonságos, de kevert kultúrában jó eredményt ad.
A S. uvarum több glicerint és több magasabbrendű alkoholt képez. Ecetsav képzése fajon belül változó, de sok törzs nagyon kevés ecetsavat termel.
Azonos körülmények között a szelektált helyi Sacch. cerevisie törzsek erjedési melléktermékeiben általában csak kis különbségek detektálhatók. A legnagyobb változékonyságot az acetaldehid termelésben találtuk..
A vadélesztők közül a C. zemplinina, Zyg. rouxii és Torulaspora delbrueckii az aszúbor összetételét –gyenge erjesztőképességük miatt – alig befolyásolták.
Az aszúborok kémiai összetételét döntően a Sacch. cerevisiae törzsek alakítják ki. A S.cerevisiae és a S. uvarum együttesen kedvező összetételű bort eredményez.
A C.zemplinina törzsek fajlagos aldehid- és illósav termelése hasonló, fajlagos glicerin termelése magasabb, mint a Saccharomyces törzseké, de gyengébb cukorfelhasználásuk miatt a bor összetételét kevésbé módosítják.
20 oC-on mind a spontán, mind a fajélesztős erjesztés ideje harmadára-negyedére csökken a 12 oC-os erjesztéshez képest, de ez az érzékszervi minőség szempontjából általában kedvezőtlen.
A vizsgált vadélesztők erősen fruktofilek, a glükóz-fruktóz arányt nagymértékben növelik a borban!
Az aszúborok minősége szempontjából a mérsékelt sebességű, egyenletes erjedés kívánatos
A vadélesztők minőségbefolyásoló szerepe csekély - ezért sem szaporításukra, sem visszaszorításukra nem kell célzottan törekedni.
Az erjedési melléktermékek képződését a cukortartalom erősen, a hőmérséklet csak kismértékben befolyásolja.
Magasabb hőmérsékleten a cukortartalom hatása tovább erősödik, és a törzsek közötti különbségek is fokozódnak.
Borászati mikrobiológia
8
Dr. Magyar Ildikó
4. Érlelés mikrobiológiája
Az erjedés leállítása a kívánt cukortartalomnál gyakran technológiai beavartkozást igényel – hűtés, kénezés-szűrés (cross-flow) Az aszúborok érlelés közbeni utóerjedése káros Az ecetsavbaktériumok visszaszorítása kiemelten fontos (hordókezelés, töltögetés, szabad kénessav szint) A tejsavbaktériumos romlás nem tipikus probléma
5. Palackozás mikrobiológiája
Magas cukortartalom – viszonylag alacsony alkohol tartalommal párosul Tartósítószert (K-szorbátot) a legtöbb termelő nem alkalmaz A különösen veszélyes Zygosaccharomyces bailii előfordulása már az erjedés során is jelentős- üzemi mikrobiota része! Gyakorlatilag steril töltést kell megvalósítani!! – –
Borászati mikrobiológia
Cladosporium cellare
A bor érlelésében nincs közvetlen szerepe Egyéb penészeket és baktériumokat visszaszorítja - tiszta pincelevegő A légtér páratartalmát szabályozza Sajátos hangulati eleme a hegyaljai pincéknek
Ajánlott irodalom: Magyar I. (2011) Botrytized wines. In: Jackson, R. ed: Speciality Wines. Advances in Food and Nutrition Research, Vol. 63. 147-206 p.
Hidegsteril töltés (mambránszűréssel) – elterjedt Melegsteril palackozás – nagyon biztonságos, de minőségi okból visszaszorult
9
