BIOLOGISCHE BREINKLEURPLAAT

BIOLOGISCHE BREINKLEURPLAAT Biologen kunnen met genetisehe modifieatie proefdieren ontwerpen waarin ze vrijwel elke eel die ze in het lichaam willen onderzoeken een kleur kunnen geven. Deze revolutie begon met de transparante worm C. Elegans, waarin onderzoekers bepaalde eeltypen lieten oplichten. In 2007 bereikten biologen van de Amerikaanse Harvard University een mijlpaal: ze demonstreerden een muis, waarvan elke herseneel in kleur van de andere vah te onderseheiden. Dit jaar werd de Nobelprijs Chemie uitgereikt aan Osamu Shimomura, Martin Chalfie en Roger Tsien, de drie wetensehap-

pers die met een kwaleiwit de basis legden voor deze naturalistisehe revolutie. Het kwaleiwit, het groen fluoreseerende proteine GFP, is een tot een soort bierglas opgerold geheel van 238 aminozuren, dat groen oplieht in zonlicht, geel onder een gloeilamp en blauw onder uv-licht. Op positie 65-67 zitten drie aminozuren die bij aanwezigheid van zuurstofen een laserpuls een flits geven. Inmiddels hebben genetici een heel kleurenpalet van varianten gebouwd. In de muis van de Harvard University, Brainbow genaamd, maken aile herseneellen drie

ANTONIE VAN LEEUWENHOEK ZAG

fen door de computer uit opnamen met een elektronenmicroscoop gegenereerd 3D-beeld van een ribosoom (links) wordt vertaald in complete met rontgen bepaalde eiwitstructuren (rechts).

24

350

JAAR

geleden als eerste de krioelende nieuwe wereld van microscopische 'beestkens en diertjes'. Vorige eeuw was het Frits Zernike die met de fasecontrastmicroscoop voor het eerst organellen binnen een levende cel, zoals mitochondria, centriolen, membranen en lysosomen, ontwaarde. Naar verwachting heeft Nederland straks opnieliw een primeur als de biomoleculaire nanomachines in een cel zijn te zien. Afgelopen najaar maakte profdr. Peter Peters van het Nederlands Kanker Instituut (NKI) met de elektronenmicroscoop Titan de eerste, nog wat vage driedimensionale beelden van een ribosoom in een cel. Het ribosoom is de fabriek waar geneninstructies ingaan en aan elkaar geklonken eiwitten uitkomen. Met computers en bekende eiwitstructuren uit databanken is de dichtheidsverdeling vertaaldin een complete molecuuladas van de eiwitfabriek. 'Pakweg honderd van dit soort nanomachines vormen de werkeenheden in een cel,! vertelt Peters. 'Wij willen die voor het eerst in 3D in een cel tonen.' Naast de eiwitfabriek heeft een cel bijvoorbeeld ook een schoonmaakmachine, een celdelingsinstallatie en een DNA-reparatieapparaat. Het leven krioelt niet meer op Peters' beelden; het zijn

30 JANUARI2009-0E INGENIEUR-2

verstilde opnamen van compleet ingevroren klonten macromoleculen. 'Een ingevroren spermacel is later gewoon weer voor bevruchting gebruiken. Dat geldt echter niet voor de tot nu gebruikte samples onder de elektronenmicroscoop. Ze zijn door eiwitcoalescentie een soort gebakken eieren geworden, die nauwelijks meer lijken op iets levends.' Microscopie heeft het al een eeuw aan de stok met beperkingen die de natuur stelt. Het kleinst zichtbare detail in een microscoop is even groot als de helft van de gol£lengte van de gebruikte straling, de zogeheten diffractielimiet. Maar hoe kleiner de gol£lengte, hoe hoger de energie. Dus hoe meer ruimtelijk detail, hoe energierijker de benodigde straling moet zijn en hoe groter de schade aan de cel is. Bovendien zijn microscopische opnamen met deeltjesbundels alleen in vacuiimkamers te maken, terwijl het leven zich van nature afspeelt in een natte omgeving. Vroeger dehydrateerden microscopisten cellen eerst, maar in de Titan van de Eindhovense microscopenbouwer FEI Company is het mogelijk ingevroren 'nat' leven te gebruiken, dat veel natuurgetrouwer is. Chemicus dr. Nico Sommerdijk van de TU Eindhoven, die met de Titan onderzoek doet, toont een plaatje van een gedehydrateerd en van een ingevroren blaasje. Op het eerste is de blaaswand een grijzige veeg, op de tweede een keurig geordend lijntjespatroon van macromoleculen. 'De details waar het om draait, blijven ingevroren veel beter behouden', geeft Sommerdijk aan. In die details schuilt vaak het kenmerkende van het leven. Met natte samples is de elektronenmicroscoop, die vanwege de ontwaterde monsters al een beetje door biologen en medici was afgeschreven, weer helemaal terug. Een speciale robot van de academische spin-off Maastricht Instruments maakt in hoog tempo het ene na het andere monster voor de Titan. Eiwitten, polymeren ofweefsels, opgelost in een £linterdun laagje water dat hangt in de gaten van een koolstofmembraan, worden met temperatuurwisselingen van 10 000 °C per seconde ingevroren, door ze bloot te stellen aan koud vloeibaar ethaan. Het invriezen gaat zo snel dat watermoleculen zich

Dossier

MICROSCOPIE verschillende fluorescerende eiwitten aan, maar elke cel in verschillende hoeveelheden. Net als bij televisie ontstaat zo uit drie grondkleuren een palet van kleuren. Volgroeid hersenweefsel kunnen biologen in plakjes snijden en onder de microscoop leggen. Ook kunnen ze, met behulp van endoscopie, zelfs meekijken naar cellen in een levende muis. Het kwaleiwit is ook als label aan eiwitten te hangen. Door de goede variant te kiezen bepaalt een microscopist met welke kleur

laserlicht hij een eiwit aanslaat en in welke kleur het eiwit fluoresceert. Microscopist Kees Jalink PhD bij het Nederlands Kanker Instituut (NKI) bestudeert hiermee in levende kankercellen eiwitinteracties. Hij toont plaatjesvan twee voetjes onderaan zo'n cel. 'Kijk, je ziet het voetje bewegen: En dit', hij drukt op een paar toetsen van zijn toetsenbord, 'verklaart waarom.' In de voetjes is een rode kleur zichtbaar. 'Oat is het bewijs dat de beweging het gevolg is van twee cruciale in

elkaar grijpende eiwitten. Oit zijn de kankercellen die weg kunnen lopen. Het zijn de agressieve, die zorgen voor uitzaaiingen.' Jalink heeft de twee eiwitten apart gelabeld, zodat de inhoud van het ene 'bierglas' over· gaat in het andere als de eiwitten in elkaar grijpen. De rode flits is het bewijs dat het overgieten is gelukt. Met een speciale witIichtlaser van Leica kan Jalink in acht kleuren zijn cellen beschijnen en tegelijk wisselwerkingen van acht eiwitten volgen.

www.mcb.harvard.edu nobelprize.org/nobeLprizes/chemistry/ lau reates/2008

vervolgens met een CCD-camera wordt opgevangen. De biomoleculaire structuren in het monster werpen daar hun schaduw op. Een mechanisch systeem draait het plaa* onder honderd verschillende hoeken. Uit deze serie opnamen berekent een computer een driedimensionale dichtheidsverdeling, waarbij een paar helder zichtbare verspreide goudkorreltjes als markeerpaaltjes dienstdoen..

niet kunnen ordenen in een kristal om ijs te vorrnen. Er ontstaat een laagje amorf waterijs, vergelijkbaar met glas, dat maar 100 nm dun is. Dat is genoeg voor de Titan, die een speciale cryogene vacuiimkamer heeft waar het flinterdunne ijslaagje op ongeveer -170 °C wordt gehouden. Vervolgens stuurt de microscoop een zachte monochrome bundel elektronen door het monster, die

DATABANKEN Met de elektronenmicroscoop wil Peters van het NKI de nanomachines, die uit weI duizenden atomen kunnen bestaan, onderzoeken, zoals een ingenieur een auto of scooter aan een inspectie onderwerpt. 'We zijn er bijna en we kunnen er in Nederland als eerste zijri, stelt hij. De klein'De details ste details op de eerste beelden zijn nu 4 nm ingevroren groot. Als ze een afmebehouden' ting hebben van I nm, dan kunnen de onderzoekers de rest erbij zoeken in biochemische databanken. Veel eiwitstructuren zijn namelijk al met rontgenkristallografie tot op atomen bepaald. 'We noemen I nm het functionele oplossend vermogen.' De onderzoekers kunnen met deze inforrnatie complete 3D-moleculenatlassen maken. Het streven is de nanomachines in de ingevroren cellen ook in verschillende bedrijfstoestanden te bewonderen. En in met medicijnen behandelde ingevroren cellen moet te zien zijn welk effect het medicijn op de machine heeft. Jarenlang experimenteren met gezuiverde eiwitten in de reageerbuis heeft een schat aan data opgeleverd. Hun genen, gerelateerde ziektes met bijbehorende medicijnen, en compleet opgehelderde biochemische routes zijn beschikbaar. 'Het hele complex van met elkaar in wisselwerking staande eiwitten 30 JANUARI 2009'OE INGENIEUR'2

blijven veel beter

25

DE 10NENBRON VAN DE ORION Fabrikanten moeten het oplossend vermogen van hun microscopen blijven verbeteren om de wet van Moore bij te kunnen benen. Die wet stelt dat de dikte van lijntjes op chips elke twee jaar halveert. De microscopen moeten chipfabrikanten artefacten op hun chips kunnen laten zien. Inmiddels kunnen de'betere microscopen al bijna atoomatlassen maken van chips. Emile van Veldhoven, microscopist bij TNO, geeft

een rondleiding door een futuristisch complex met clean rooms en lithografische apparaten, het Nano· LabNL in Delft. 'De bouwers zijn bezig de druk in de clean room afte stellen,' zegt hij, terwijl hij met moeite de steeds weer openwaaiende deur dicht duwt. Het lab in opbouw herberg! inmiddels de nieuwste microscoop van earl Zeiss, de Orion. Het is een complex apparaat, met slangen, pompen en een regelsysteem, zo groot als een kast. 'Deze vrijdag

toonde earl Zeiss aan dat de microscoop een ruimte· lijk oplossend vermogen haalt van 0,25 nm, de groot· te van een cesiumatoom. Een oppervlak is dus in potentie nagenoeg atoom voor atoom te scannen.' In de Orion bevindt zich een ionenbron, een puntje van drie atomen, die heliumgas bij extreem lage drukken van een miljoenste torr kan ioniseren. Twee elektroden versnellen de heliumionen en leiden de bundel puntje voor puntje over een chip. Bij elke pixel worden de elektronen gemeten die de bundel vrijmaakt, maar ook de energie van de heliumionen die terugbotsen. Uit het aantal en de snelheid van de heliumionen is afte leiden van welk element het atoom is.

Opname met een fluoreseentiemieroseoop van een stukje huid van een levende muis dat 100 bij 100 IJm' meet, met van linksboven afdode huid op 5IJm diep, levende eellen (blauw) op 10 en 20 IJm, en vezels van het bindweefsel (paars) op een diepte van 30, 40 en 50 IJm. De grote, ronde structuren zijn haatjollikels.

zien wij straks terug als een functionele machine in de cel. We vervullen zo een brugfunctie tussen de modellen op grond van reageerbuisonderzoek en wat er werkelijk in de cel gebeurt', aldus Peters. Een eerste prangend vraagstuk dat Peters wi! oplossen, is met welke apparaten virulente tuberculosebacillen uit de blaasjes in de cel- de zogeheten fagosomen - kruipen om in de celvloeistofte komen. NKI-onderzoekers toonden onlangs het bestaan van deze apparaten aan. Terwijl bijna eenderde van de wereldbevolking met latente tbc besmet is, zijn het de actieve bacillen die dagelijks vijfduizend doden maken. Tot nu toe waren biologen ervan overtuigd dat de actieve bacillen niet uit de fagosomen klommen, maar uitrnuntten om er lang in te overleven. Daarop zijn de geneesmiddelen ook afgestemd. De hoop is dat er nieuwe medicijnen mogelijk zijn die zich richten tegen de 'uitklimapparaten'.

LASER Niet iedereen is overtuigd van Peters' aanpak. Zo wijst lichtrnicroscopist prof.dr. Hans Gerritsen van de Universiteit Utrecht erop dat de ingevroren nanomachines misschien weI intact zijn, maar niet meer werken. Ruimtelijk detail is weI belangrijk maar nanomachines kenmerken zich doordat ze in de tijd veranderen. 'Het klinkt veelbelovend, maar vooralsnog hebben cryogene microscopen nog geen levensraadsel opgelost. Straks beschikken we over snapshots van nanomachines in een paar bedrijfstoestanden. Het leven is echter een dynamisch proces. Die hele dynamica speelt zich niet af in een vacuiimkamer. ' 26

30 JANUARI20090DE INGENIEURo2

In de biologie is een naturalistische revolutie gaande (zie het kader 'Biologische breinkleurplaaf). Biologen komen weer tot nieuwe ontdekkingen door levende weefsels met lasers te volgen, maar nu tot op de cel of zelfs het eiwit nauwkeurig. Verschillende onderzoeksgroepen over de hele wereld bouwen handige draagbare lichtmicroscopen, die in 10 seen biopsie van de huid kunnen doen, zonder dat de chirurg daarvoor nog hoeft te snijden. Die lichtrnicroscopen werken niet meer als vergrootglazen die kijken naar de reflecties van licht, maar scannen pixel voor pixellaag na laag met laserpulsjes af en detecteren waar biomoleculen zitten die fluoresceren. Die pulsjes duren soms slechts femtoseconden (I fm = IO- I5 S), maar hebben in die korte tijd hoge vermogens en een supersmal kleurenspectrum. De beste detectoren zijn in staat negen van de tien ingevangen fotonen waar te nemen. Gerritsen toont microscopische opnamen van huidweefsel, waarop tot ongeveer a,S mm diep alle cellagen, haarfollikels, verstevigend collageen en tumorcellen zijn te zien. 'Kijk,' zegt hij, 'dit is ziek weefsel. Het collageen is kapot. De normale morfologie is verstoord en de kans op tumoren is hier groot. Toen we dit zagen, dachten we dat het huidweefsel van een proefdier met een kunstrnatig opgewekt tumor was. Het bleek de huid van een vrouw te zijn die te vaak onder de zonnebank lag.' Zijn microscoop maakt gebruik van twee korte, vlak na elkaar verzonden, zachte laserpulsjes die in dezelfde pixel worden gefocusseerd. 'Een molecuul aanslaan om die te laten fluoresceren, kan zowel met een hard blauw foton als met twee zachte rode, die samen dezelfde energie als het harde hebben. Het grote voordeel va,n zachte fotonen is dat er alleen een signaal komt uit de focus, waar voldoende energie is voor fluorescentie. Ook beschadigen de zachte fotonen niets.' Zijn opnamen hoeft Gerritsen niet te kleuren: hij kijkt naar de natuurlijke fluorescentie van eiwitten, zoals collageen, elastine, keratine of flavine. Er bestaan ook mobiele microscopen die zich niet beperken tot de van nature fluorescerende eiwitten. Prof. Sunney Xie, lichtrnicroscopist van de Amerikaanse Harvard University,

Dossier

MICROSCOPIE 'Hier gaat het ons om', geeft Van Veldhoven aan. Hij toont een uiterst scherpe opname van een ASML-chip, waarop geet$le lijnen zichtbaar zijn van 45 nm breed. De opname telt duizend bij duizend pixels met een hoge scherptediepte van een gebiedje dat een lichtmicroscoop als klein$le $lip zou waarnemen. 'De ruwheid van de randen van de lijntjes en artefacten, waar lijntjes elkaar via uitlopers raken, is duidelijk te zien.'

Bundels van zware deeltjes, zoals heliumionen, hebben bij dezelfde hoeveelheid kinetische energie een kortere golflengte dan lichte deeltjes als elektronen en kunnen dus meer detail zien. Omdat de heliumbundel in tegen$lelling tot een elektronenbundel geen wisselwerking aangaat met elektronenwolken in de sample. laagjes, levert hij ook opnamen met een hogere scherptediepte. www.smt.zeiss.comforion

detector detector-

-.III.....~III!II!!. diafragma

onscherpe lichtbundel gefocusseerde lichtbundel

kleurgevoelige spiegel

laserbron

excitatiebundel brondiafragma

objectief

li!\iI'----

scherpstelvlak

waardoor ook duizend keer zo vaak is in te zoomen, tot aan het atoom toe. Dit leidt tot de paradox dat lichtmicroscopisDe met een CARS-microscoop gemaakte ajbeelding toont dat Omega-3 zich anders dan verzadigd vet ten weliswaar vrijwel elk eiwit met een nestelt in de Iysosomen van de longkankercel (rechts) en niet verspreid in de celvloeistofblijft (links). kleur zichtbaar kunnen maken, maar hierbij alleen vlekjes zien die reusachtig groter zijn dan het eiheeft een scannende lichtmicroscoop gebouwd, de zogeheten wit zelf. Elektronenmicroscopisten kunnen heel veel relevante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering-microscoop (CARS), details tonen als ze elektronen maar genoeg kilo-elektrovolts die met een combinatie van gestimuleerde excitatie en emissie de eigentrillingen van biomoleculen scant. Hiermee toonmeegegeven. Ze zien hun monsters echter verdwijnen als ze de Xie al aan waarom onverzadigde vetzuren in visolie gezond de energie te hoog afstellen. Daarbij geven de lichte elemenzijn: ze zorgen dat triglyceriden, die anders in de celvloeistof ten waaruit biomoleculen bestaan, in vergelijking met metaverblijven, zich nestelen in de lysosomen. Onlangs bedacht len nauwelijks signaal onder elektronenbundels. Toch willen de Nederlandse microscopisten met hele zwakXie een techniek die de signaal-ruisverhouding van de microke monochromatische elektronenbundels in de Titan de data scoop nog duizend keer kan opschroeven door slim te scannen met een infrarood FM-signaal en het AM-signaal dat ontboven tafel halen waarmee uiteindelijk moleculenatlassen zijn staat door resonanties, te detecteren. te maken, in 3D, in 'water' en zelfs in de eel. Het aantal elekMaar hoe kort, krachtig en spectraal smallaserpulsjes ook tronen waarmee ze het cryomonster beschieten is per opperzijn, het focus sen ervan in stippen die kleiner zijn dan honvlaktescan nog maar een elektron per honderdste vierkante derden nanometers, blijkt niet mogelijk. De diffractielimiet nanometer. Vooralsnog ontkomen ze niet aan een fors stuk interpretatie. Sommerdijk van de TU Eindhoven toont de cover wordt bepaald door de golflengte van licht. Pixels van elektrovan het toonaangevende chernische tijdschrift Angewandte nenmicroscopen zijn hierdoor al snel duizend keer kleiner, Chemie. 'Hier zie je een microscopische opname MICROSCOOP DETECTIE CELTOESTAND SCHADE RESOLUTIE van een aggregaat van pak2nm ingevroren eel elektronenbundels cryogene schaduw van weg 250 nm groot in een elektronenbundel (bij lichte atomen) slaan moleculen los, transmissie natte omgeving.' De afbeelelektronen verwarmen ijslaag ding lijkt niet op de tekeschaduw Iichtbundel, 300 nm fasecontrast levende eel nauwelijks ningen van moleculen die omzetting faseverschil (afhankelijk van kleur) in intensiteitsverschil iedereen uit het scheikundeboek kent. Het is een confocale fluorescentie van 300 nm levend weefsel verblekinglionisatie molecuul biomolecuul soort vertakte boomstronk, (afhankelijk van kleur) fluorescentie met knotten en wilgen en levend weefsel verhitting bij Coherent Anti-Stokes specifieke moleculaire 10 11m wormachtige aanhangsels, Raman Scattering trilling na getriggerde (afhankelijk aantal te hoge intensiteit omdat het oplossend verinfraroodpulsen trillende moleculen) (CARS) mogen van 2 nm te laag is Stimulated Emission fluorescentie van 45 nm dode eel verblekinglionisatie om atomen te zien. 'Het (vooralsnog) en verhitting molecuul in Depletion (STED) verkleind gebied menselijke oog is de beste sensor voor grijswaarden. heliumion losgeslagen 20-30 nm te sterke bundels dode elektronen na gedehydrateerde slaan moleculen los Uit deze microscopische ioninslag eel opname kunnen we de ver30 JANUARI 2009-0E INGENIEUR-2

fen confocale microscoop kan een driedimensionaal beeld van een monster maken door al het licht dat niet afkomstig is uit het scherpstelvlak met het microdiafragma weg te jilteren.

27

SUPERRESOLUTIE DOOR FOTONROOF Bij het Duitse Max-Planck-Institut fiir biophysikalische Chemie is een Iichtmicroscoop gebouwd die kan inzoomen op nanomachines en in de toekomst in potentie ook in levende cellen: de Stimulated Emission Depletion-microscoop (STED). Lenzenfabrikant Leica biedt deze techniek als extra faciliteit aan op een standaard confocale microscoop. De Duitse fysici braken met de microscoop door de diffractielimiet dankzij een nieuwe toepassing van een oud door Einstein ontdekt ver· schijnsel: gestimuleerde emissie. Een foton kan het foton van een aangeslagen atoom meeroven en het atoom in zijn grondtoestand achterlaten. Daarvoor moet het foton dezelfde energie hebben als het energieverschil tussen de aangeslagen en de grondtoestand. De onderzoekers, onder leiding van fysicus prof. Stefan Hell, omzeilen de diffractielimiet door fotonen weg te roven van aangeslagen f1uore·

scerende eiwitten aan de rand van een pixel. Het enige f1uorescerende Iicht dat een detector meet, komt dan uit een kleiner meetgebied. Het roofpulsje, dat meteen na het meetpulsje voigt, heeft de vorm van een donut, met een intensiteit van nul in het midden. Door gebruik te maken van het kleine verschil in frequentie van absorptie- en emissiefotonen voorkomen de fysici dat het roofpulsje nieuwe eiwitten aanslaat. Hell heeft theoretisch aangetoond dat hij het meetvolume zo klein kan maken als hij wil. Maar het leven betaalt de prijs voor het detail, want bij de vereiste lichtintensiteiten gaan de eiwitten kapot. Het Duitse oplossend vermogen van 45 nm ligt nog maar een factor tien boven dat van de elektronenmicroscoop, terwijl dat vroeger al snel honderd was. 'Hell stuit vooralsnog op praktische bezwaren', zegt prof.dr. Hans Gerritsen, Iichtmicroscopist van de Universiteit

takkingen binnen het aggregaat goed afleiden. Dit is onze interpretatie,' zegt hij, terwijl hij een keurig driedimensionaal plaa* van het cluster laat zien. Zelfs de opname met lage resolutie bevat al cruciale informatie. Sommerdijks vertakte boom bewijst dat een omgewisseld peptide het complete aggregeren van macromoleculen drastisch kan veranderen. 'Je moet dus tot op een peptide nauwkeurig duiden om vormen te begrijpen.'

Maar inmiddels heeft Peters een nieuw Nationaal Centrum voor Elektronenmicroscopie op de lijst voor grote onderzoeksinvesteringen gekregen. Het wachten is nu alleen nog op een ministeriele handtekening. Als de universiteiten tot overeenstemming komen waar het lab wordt gevestigd, zal het gebouw er over twee jaar staan. Drie Titans moeten daar de Nederlandse levenswetenschappen en biotechnologie in een stroomversnelling gaan brengen. Twee van de microscopen zijn bedoeld voor metingen aan biomoleculen, eiwitten, polymeren en nanomachines, de derde voor het opschroeven van het oplossend vermogen, zodat FEI Company zijn voorsprong kan vergroten. De rnicroscopisten zijn ervan overtuigd dat het trucje van Nobelprijswinnaar Zemike - fasecontrast - ook Sommerdijks boom en Peters rots kan omtoveren in scherpe plaatjes die beginnen te lijken op de theoretische modellen. Zemikes faseplaat, die tegenwoordig in vrijwel elke lichtrnicroscoop zit ingebouwd, zorgde ervoor dat biologen plotseling in een levende cel de organellen zagen zitten. De faseplaat voor elektronen een MEMS-chip - moet nu nanomachines en eiwitten tonen. Een tweede ingreep is de vervanging van de detector. De CCDcamera, die juist bij de gebruikte golflengte van de elektronenbundel een relatieflage efficientie heeft, wordt vervangen door een CMOS-camera, die een hogere signaal-ruisverhouding moet kunnen leveren. Het is de bedoeling dat biologen in het Nationale Centrum voor Elektronenmicroscopie daarmee aminozuren op ingevroren eiwitten zien zitten (oplossend

APPARATENBOUWER Peters van het NKI heeft geprobeerd de levende eiwitfabriek in een cel waar te nemen met een elektronenmicroscoop. Hij overtuigde enkele jaren geleden de Lochemse apparatenbouwer Simco, de wereldleider in apparaten met statische elektriciteit om bijvoorbeeld afValzakken 'Het menselijk oog is snel op te rollen, zijn jaarlijkse subsidiebijdrage aan het kankeronderzoek te vervangen door de beste sensor voor mankracht. Het bedrijf ontwikkelde een techgrijswaarden' niek om cryocoupes van roo bij roo nm groot uit de microtoom - een apparaat dat flinterdunne laagjes snijdt van enkele tientallen nanometers dik - elektrisch te hechten aan het koolstofplaatje dat in de Titan kan. En inderdaad, met de zwakke bundel kon Peters de eiwitfabrieken zien zitten. Het eerste beeld heeft een oplossend AJbee/dingen van vermogen van 4 nm en lijkt meer op een soort amorfe grillige een in water opge/ost rots dan op het efficiente macromoleculaire complex dat theopolymeer, dat door retici tot op het atoom nauwkeurig op de computer tekenden.

wateraantrekkende en -afstotende zijgroepen een complexe driedimensionale structuur vormt. AJbee/ding a is gemaakt met de conventionele contrastmiddeltechniek, b met de cryo-e/ektronenmicroscoop. AJbee/ding c toont een serie dwarsdoorsnedes, waaruit met computerana/yse een driedimensionale vorm dis gemaakt. AJbee/ding e ten s/otte toont de gestileerde structuur waarin de vertakkingen (bij de pij/en) en krommingen goed zijn te zien. 28

30 JANUARI 2009 00E INGENlEUR02

Utrecht. 'Om het meetvolume in de richting van de laserbundel te verkleinen moeten er twee lasers tegenover elkaar worden geplaatst en uitgelijnd, wat een standaard microscopist niet kan. Het allergrootste knelpunt is dat de microscoop zijn superresolutie verliest bij eiwitten gelabeld met GFP. Juist dat eiwit gebruiken biologen massaal in proefdieren en celkweken. Het eiwit steekt fotofysisch anders in elkaar dan gebruikelijke fluore· scente stoffen.' www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/ STED.htm

II I 8

o detector 6

~

o

o

excitatielaser uitdooflaser fasefilter objectief

8

9

0

(1) excitatiespot

8 9

o

uitdoofbundel combinatie van beide resulterende fluorescentiespot

De groene /aserpu/s (635 nm) exciteert hetJ1uorescerende eiwit, direct daarna vo/gen twee paarsgewijze rode bunde/s (725850 nm) die de excitatie aan de rand van de spot ongedaan maken. De detector ziet daardoor aileen het kleinere binnenste gedeelte van aanges/agen spot.

vermogen: 0,1 nm) en alfahelixen op ingevroren nanomachines (oplossend vermogen: I nm). 'Met de nieuwe faseplaat en detector wordt de rekenkracht van de computer voor de analyse van aile fase- en amplitudedata de zwakste schakel.' Toch lijkt het erop dat zelfs de ailerbeste 3D-plaatjes van nanomachines uit de elektronenmicroscoop naast de allernauwkeurigste laserregistraties van dynamische processen in levende systemen moeten worden gelegd om levensraadselen op te lossen. Xie van de Harvard University, die zich richt op de dynamica en vorige maand uit handen van Nobelprijswinnaar Theodor Hansch een van de belangrijkste prijzen in de optica ontving, stelt aan lichtrnicroscopie inmiddels de norm dat een apart biomolecuul in een levende cel moet zijn te traceren en met I nm oplossend vermogen en een precisie van milliseconden in zijn acti:viteit te volgen. Die nauwkeurigheid is te verkrijgen door met behulp van heel veel fluorescente fotonen van het molecuul de exacte positie te bepalen.

LACTOSE Een dynamisch detail kan bij wijze van spreken alleiden tot grootse evolutionaire omwentelingen. Zo bewees Xie vorige maand dat een sporadisch afWijkende trilling van een enkel biomolecuul een belangrijke sleutel is in de oplossing van het raadsel hoe zoogdieren hun jong met eigen melk kunnen voeden dat vol melksuiker lactose zit. De darmbacterie E-coli komt met vele biljoenen voor in de darmen van elk warmbloedig dier. Van nature zorgt een klem op DNA ervoor dat de bacterie glucose prefereert en geen energie verspilt aan vertering van lactose. Als er in een kolonie van de darmbacterie la.ctoseconsumenten zitten, zijn dat als het ware op hoI geslagen bacterien, waarbij de klem niet, zoals gebruikelijk met een, maar met twee pootjes tegelijk is losgeschoten. Dat is een omissie van de genregulatie, een foutje in de machinerie. Xie toonde met een combinatie van lasermicroscopische technieken met milliseconderesolutie aan dat dit 'foutje' er ook voor zorgt dat alle bacterien op hoI slaan bij hoge lactoseconcentraties, zoals die voorkomen wanneer melk in de darmen komt. Een 'schitterend ongeluk' kan zo de basis zijn voor een gunstige darmflora voor melk. Zelfs de milliseconde is veel te lang, als het gaat om een detail dat misschien van belang kan zijn geweest bij de opkomst van de bladgroenkorrel, toonden biorysici van de Vrije Universiteit in Amsterdam met lasertechnieken aan. Ze ontdekten een cruciale vormverandering in een biljoenste seconde - mil-

fen Jasecontrastmicroscoop versterkt het contrast door de Jase van de Iichtbunde/ te manipuleren. Het /icht van de bron komt via een ringsp/eet op het voorwerp. fen dee/ van het /icht wordt daardoor verstrooid, waarbij ook de Jase verandert. De objectieJlensJocusseert dit verstrooide licht op het bee/dv/ak. DeJasering heeft daarop s/echts een gering effect. Anders is dat voor het niet verstrooide /icht. Aileen het dee/ dat op de afbee/ding terechtkomt, passeert de Jasering, waardoor het weer precies dezelfde Jase heeft a/s het verstrooide licht en beide e/kaar versterken.

~~- beeldvlak

verstrooid licht achtergrondlicht faseplaat

.

{

objectief

jard keel' zo kort als de milliseconde van Xie - bij de inslag van een enkel foton op nanomachines die in plantencellen bladgroenkorrels ringspleet aanmaken (de zogeheten prolichtbron tochlorophyllide oxidoreductasen). De machine houdt na de fotoninslag maar liefst negentien uur lang deze vorm vast. Alleen in deze vorm is hij in staat onder invloed van licht chlororyl aan te maken. Maar over welke vormverandering in de machine nu precies optreedt, kunnen de laserdeskundigen alleen speculeren, want ze kunnen het eiwitapparaat niet in 3D waarnemen. Misschien kan die vorm in de toekomst weI in het Nederlandse elektronenlaboratorium worden achterhaald. Terwijllasers steeds betel' in staat zijn dynamische veranderingen in de tijd te achterhalen, blijven energierijke elektronenbundels nodig om de ruimtelijke details van die veranderingen waar te nemen. En pas met beide technieken lijkt het leven zich echt goed te laten begrijpen.•

www.fei.com/products/families/titan.family/titan.krios.aspx Uitleg van FEI Company over de nieuwste generatie van de cryogene elektronenmicroscoop Titan. bernstein.harvard.edu/research/cars.html De CARS-microscoop van de Amerikaanse Harvard University. 30 JANUARI 2009.0E INGENIEUR·2

29