ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NETROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.)
SKRIPSI
Oleh: Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025
BAGIAN PERIODONSIA FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS JEMBER 2012
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................
i
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................
ii
HALAMAN MOTTO .................................................................................
iii
HALAMAN PERNYATAAN .....................................................................
iv
HALAMAN PEMBIMBINGAN ................................................................
v
HALAMAN PENGESAHAN .....................................................................
vi
RINGKASAN ..............................................................................................
vii
PRAKATA ...................................................................................................
ix
DAFTAR ISI ...............................................................................................
xi
DAFTAR TABEL .......................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................
xvi
BAB 1. PENDAHULUAN ..........................................................................
1
1.1 Latar Belakang ..........................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah.....................................................................
3
1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................
3
1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................
3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................
5
2.1 Indeks Adhesi ............................................................................
5
2.2 Porphyromonas gingivalis .........................................................
6
2.2.1 Klasifikasi ..........................................................................
6
2.2.2 Karakteristik .......................................................................
7
2.2.3 Metabolisme .......................................................................
7
2.2.4 Mekanisme Perlekatan pada Inang.....................................
8
2.2.5 Peran dalam Patogenesis Penyakit Periodontal xi
(Indirect) ...........................................................................
9
2.3 Netrofil .....................................................................................
11
2.3.1 Morfologi Netrofil............................................................
11
2.3.2 Membran Sel Netrofil ........................................................
12
2.3.3 Mekanisme Netrofil dalam Pertahanan Tubuh ..................
13
2.4 Rosella (Hibiscus sabdariffa L.)................................................
17
2.4.1 Klasifikasi Rosella .............................................................
17
2.4.2 Morfologi Rosella ..............................................................
18
2.4.3 Kandungan dan Manfaat Rosella .......................................
19
2.5 Hipotesis .....................................................................................
22
BAB 3. METODE PENELITIAN ..............................................................
23
3.1 Jenis Penelitian ..........................................................................
23
3.2 Rancangan Penelitian ...............................................................
23
3.3 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................
23
3.4 Variabel Penelitian ....................................................................
23
3.4.1 Variabel Bebas ...................................................................
23
3.4.1.1 Definisi Operasional................................................
23
3.4.2 Variabel Terikat .................................................................
24
3.4.2.1 Definisi Operasional................................................
24
3.4.3 Variabel Terkendali ............................................................
24
3.5 Alat dan Bahan ..........................................................................
25
3.5.1 Alat .....................................................................................
25
3.5.2 Bahan .................................................................................
26
3.6 Prosedur Penelitian ...................................................................
26
3.6.1 Tahap Persiapan .................................................................
26
3.6.2 Pelaksanaan Penelitian .......................................................
28
3.7 Analisis Data ..............................................................................
30
3.8 Alur Penelitian...........................................................................
31
xii
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................
32
4.1 Hasil Penelitian ..........................................................................
32
4.1.1 Hasil Isolasi Netrofil dan Subkultur P. gingivalis .............
32
4.1.2 Hasil Uji Adhesi .................................................................
33
4.1.3 Hasil Analisis Data .............................................................
35
4.2 Pembahasan ...............................................................................
37
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................
42
5.1 Kesimpulan ................................................................................
42
5.2 Saran ..........................................................................................
42
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
43
LAMPIRAN .................................................................................................
48
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman 2.1
Kandungan kelopak kering bunga Rosella dalam 100 g ...................
4.1
Rata-rata adhesi P. gingivalis pada netrofil antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ......................................
4.2
21
34
Ringkasan hasil Uji lanjut Post Hoc LSD Adhesi P. gingivalis pada netrofil ...............................................................................................
xiv
36
DAFTAR GAMBAR
Halaman 2.1
Porphyromonas gingivalis ..................................................................
7
2.2
Gambaran mikroskopis netrofil..........................................................
12
2.3
Opsonisasi ..........................................................................................
15
2.4
Tanaman Rosella (Hibiscus sabdariffa L.).........................................
18
4.1
Preparat Hasil Isolasi Netrofil ............................................................
32
4.2
Sediaan P. gingivalis .........................................................................
33
4.3
Netrofil diinkubasi RPMI (kelompok kontrol) menunjukkan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah banyak sehingga akan menyebabkan netrofil lisis (panah merah). Pembesaran 1000x .............................................................................
4.4
34
Netrofil diinkubasi ekstrak Rosella 50% (kelompok perlakuan 1) menunjukkan penurunan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dengan jumlah rata-rata 5 bakteri/ sel ................................................
4.5
35
Netrofil diinkubasi ekstrak Rosella 100% (kelompok perlakuan 2) menunjukkan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah sedikit dengan jumlah rata-rata 3 bakteri/ sel (pembesaran 1000x) .....................................................
35
4.6
Diagram batang rata-rata adhesi P. gingivalis pada netrofil .............
37
4.7
Hasil uji viabilitas netrofil.................................................................
39
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman A.
Hasil Perhitungan Rata-Rata Adhesi P.gingivalis Pada Netrofil ......
48
B.
Analisis Data Penelitian ....................................................................
52
B.1
Deskriptif Data Penelitian .................................................................
52
B.2
Uji Normalitas ...................................................................................
52
B.3
Uji Homogenitas ...............................................................................
53
B.4
Uji One Way Anova ...........................................................................
53
B.5
Uji Lanjut LSD ..................................................................................
54
C.
Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kelopak Rosella ......................
55
C.1
Alat Pembuatan Ekstrak Rosella .......................................................
55
C.2
Bahan Pembuatan Ekstrak Rosella....................................................
56
D.
Alat dan Bahan Subkultur P. gingivalis ............................................
57
D.1
Alat Subkultur P. gingivalis ..............................................................
57
D.2
Bahan Subkultur P. gingivalis ..........................................................
58
E.
Alat dan Bahan Penelitian Uji Adhesi ..............................................
59
E.1
Alat Penelitian Uji Adhesi ................................................................
59
E.2
Bahan Penelitian Uji Adhesi .............................................................
62
xvi
1
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Tahap awal dari respon inflamasi terhadap infeksi bakteri adalah proses
adhesi berupa perlekatan dan penjangkaran bakteri pada sel-sel inflamatori netrofil. Selama fase perlekatan, terjadi sentuhan kuat dengan bakteri. Sentuhan ini dapat terjadi secara langsung antara bakteri dengan netrofil melalui proses tanpa dorongan, dalam hal ini perlekatan sangat tergantung dari sifat-sifat permukaan bakteri yang akan difagositosis, misalnya hidrofobisitas (Bellanti, 1993). Hal ini menyebabkan bakteri dapat melekat pada netrofil melalui interaksi hidrofobik, yaitu interaksi antara partikel hidrofob pada membran bakteri dan membran netrofil (BSN Medical, Tanpa Tahun). Pada keadaan lain, proses perlekatan ini dapat dipermudah oleh proses opsonisasi yaitu proses pelapisan partikel antigen oleh antibodi yang terdapat di dalam serum darah, sehingga menyebabkan bakteri dapat melekat dengan mudah pada reseptornya yang terdapat di membran netrofil (Robbins dan Kumar, 1995; Susanti dan Rahayuningsih, 2003). Salah satu bakteri penyebab inflamasi di jaringan periodontal adalah Porphyromonas gingivalis. Porphyromonas gingivalis adalah bakteri anaerob gram negatif. Bakteri ini merupakan salah satu bakteri yang paling sering ditemui pada kasus periodontitis kronis. Analisis genom menunjukkan bahwa P. gingivalis dapat memetabolisme asam amino dan menghasilkan sejumlah metabolit atau produk akhir yang bersifat racun terhadap jaringan gingiva pada manusia (MicrobeWiki, 2008). Perusakan jaringan akibat produk akhir ini akan menimbulkan reaksi inflamasi yang pada awalnya diperankan oleh sel inflamatori netrofil. Netrofil adalah lekosit granular matur polimorfonuklear, memiliki daya lekat dengan kompleks imun, dan kemampuan fagositosis (Dorland, 2002). Netrofil berperan penting pada respon radang akut, beberapa jam setelah dimulai radang akut,
2
terjadi peningkatan jumlah netrofil dalam darah. Hal ini disebabkan karena adanya mediator keradangan seperti histamin, bradikinin, serotonin, prostaglandin, beberapa produk sistem komplemen dan produk reaksi pembuluh darah yang memasuki aliran darah kemudian ditranspor di sumsum tulang guna menggerakkan netrofil-netrofil ke dalam sirkulasi untuk segera menuju daerah radang (Guyton dan Hall, 2007). Netrofil ini berfungsi untuk menjaga imunitas tubuh terhadap infeksi dengan cara kemotaksis (pelepasan lekosit dari aliran darah menuju tempat infeksi), fagositosis (proses penghilangan benda asing seperti bakteri), dan penghancuran agen infeksi. Netrofil dengan proses kemotaksis akan bermigrasi untuk berfungsi sebagai fagosit yang mengontrol kontaminasi lokal dan mencegah infeksi (Rasuna, 2010). Faktor-faktor kemotaksis dapat endogen berasal dari protein plasma, maupun eksogen misalnya dari produk bakteri (Robbins dan Kumar, 1995). Sebuah netrofil biasanya dapat memfagositosis 3 sampai 20 bakteri sebelum sel itu menjadi inaktif dan lisis. Setelah itu akan terjadi akumulasi dari netrofil mati, makrofag mati, jaringan nekrotik, dan cairan jaringan yang akan membentuk pus pada jaringan yang meradang (Guyton dan Hall, 2007). Perusakan netrofil juga menyebabkan terjadinya pelepasan mediator inflamasi serta enzim proteolitik, pepsin, dan cathepsin, yang mengakibatkan lisisnya jaringan (Grossman, 1995). Berdasarkan uraian di atas, P. gingivalis dapat melekat pada netrofil melalui reseptor yang terdapat pada membran netrofil. Selain itu melalui interaksi hidrofobik antara partikel hidrofob pada membran P. gingivalis dan membran netrofil (BSN Medical, Tanpa Tahun). Setelah melekat, netrofil akan membentuk pseudopodia yang dijulurkan di sekitar bakteri, mengelilingi bakteri dan berfusi membentuk vesikel / vakuola fagosom. Porphyromonas gingivalis yang berada dalam fagosom selanjutnya dibunuh oleh mekanisme bakterisidal (Ferencik et al. dalam Susanti dan Rahayuningsih, 2003). Proses ini mengakibatkan terjadinya respon inflamasi berupa bengkak, rasa sakit, kemerahan, panas, dan apabila respon berlangsung terusmenerus, bisa berlanjut hingga terjadinya penurunan fungsi jaringan periodontal.
3
Sehingga inflamasi harus dikontrol, salah satunya dapat melalui pengendalian aktifitas netrofil. Banyak penelitian yang telah membuktikan bahwa ekstrak kelopak bunga Rosella bersifat sebagai anti inflamasi untuk mencegah peradangan dan mengurangi rasa nyeri pada saat infeksi terjadi. Khasiat yang terdapat dalam kelopak bunga Rosella ini tidak terlepas dari kandungan senyawa aktif di dalamnya. Penelitian membuktikan bahwa kelopak bunga Rosella mengandung berbagai macam zat aktif yang salah satunya adalah antosianin. Antosianin merupakan derifat flavonoid yang telah diteliti memiliki efek antioksidan yang kuat dan antiinflamasi (Galvano et al., 2007; Rossi et al., 2003; dan Adhikari et al., 2005). Flavonoid juga mampu menghambat perlekatan bakteri dengan cara mengikat protein permukaan bakteri dan menurunkan hidrofobisitas reseptor pada membran sel fagosit (Hamsafir,2010; Septiana et al., 2006). Oleh karena itu patut diduga bahwa, kandungan flavonoid pada kelopak bunga Rosella dapat menurunkan daya adhesi P. gingivalis pada membran netrofil.
1.2
Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas maka timbul permasalahan yaitu apakah
pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi P. gingivalis pada netrofil?
1.3
Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah menganalisis pemberian ekstrak kelopak bunga
Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P. gingivalis pada netrofil.
1.4
Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat diantaranya :
4
a.
Sebagai tambahan informasi kepada masyarakat mengenai efektifitas ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap terhadap indeks adhesi P. gingivalis pada sel netrofil.
b.
Sebagai acuan penelitian lebih lanjut, terutama berkaitan dengan penyakit yang diakibatkan keradangan.
c.
Sebagai
tambahan
informasi
kepada
masyarakat
tanaman Rosella sebagai bahan obat tradisional
mengenai
manfaat
5
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Indeks Adhesi Kata adhesi berasal dari bahasa latin adhaere yang berarti melekat. Secara
terminologi adhesi berarti gaya tarik menarik atau daya mengumpul antara molekulmolekul dari zat-zat yang tidak sejenis. Gaya ini menyebabkan antara zat yang satu dengan yang lain dapat menempel dengan baik karena molekulnya saling tarik menarik atau merekat, atau juga bisa dikatakan bahwa adhesi adalah perlekatan antara dua zat yang memiliki perbedaan jenis dan struktur (Amanda, 2010). Proses adhesi adalah merupakan tahap awal infeksi bakteri yang berperan dalam kolonisasinya pada permukaan sel inang. Adhesi bakteri pada permukaan sel memperpendek
jarak
antara
bakteri
dengan
permukaan
tubuh
sehingga
mempermudah toksin atau metabolit lain yang dihasilkan bakteri untuk melekat pada reseptornya di permukaan sel inang. Dalam proses adhesi dikenal dua bentuk yaitu (a) adhesi yang bersifat nonspesifik dan (b) adhesi yang bersifat spesifik. Pada adhesi yang nonspesifik, perlekatan tidak melibatkan peran reseptor permukaan. Proses adhesi disebabkan karena adanya sifat hidrofobisitas agen dan perbedaan muatan listrik permukaan bakteri dengan permukaan sel inang sehingga perlekatan umumnya tidak kuat dan bersifat ireversibel. Sedangkan pada adhesi spesifik, perlekatan diperantarai oleh reseptor permukaan sel inang yang mampu berikatan dengan antigen permukaan bakteri (Wibawan et al.,1992; Shuter et al., 1996) . Kemampuan bakteri untuk adhesi pada sel inang juga tergantung struktur atau molekul yang dapat menempel atau adhesi yang disebut adhesin, yang memungkinkan organisme tersebut menempel pada reseptor yang terdapat pada sel inang (Jacques dan Paradis, 1998). Pada interaksi hidrofobik terjadi perlekatan antara partikel hidrofobik (menolak air) pada membran sel bakteri dengan membran sel inang, saat mengalami kontak dengan lingkungan yang aqueous. Perlekatan bakteri dengan sel jaringan melalui interaksi
6
hidrofobik adalah langkah pertama terjadinya infeksi (BSN Medical, Tanpa Tahun). Menurut Wizemann, Adomoum, dan Langermann (dalam Wijayanti, 2008) mencegah penempelan atau adhesi bakteri pada reseptor yang terdapat pada sel inang dan kolonisasi mungkin merupakan kiat yang paling efektif dalam mencegah terjadinya infeksi. Pada penelitian Wahyudi (2007) tentang adhesi dan aktifitas fagositosis sel polimorfonuklear terhadap Staphylococcus aureus asal susu sapi perah dan manusia yang bersifat multiresisten terhadap antibiotik, disebutkan bahwa indeks adhesi dan fagositosis dari sel netrofil dapat ditentukan dengan menghitung jumlah bakteri yang menempel dan yang difagosit oleh setiap sel netrofil dari 10 sel netrofil pada setiap preparat apus, dengan menggunakan mikroskop. Berdasarkan penelitian tersebut maka dapat disimpulkan bahwa indeks adhesi adalah banyaknya bakteri yang melekat pada sel inang persatuan jumlah sel inang (Santosaningsih, 2004).
2.2
Porphyromonas gingivalis
2.2.1
Klasifikasi Secara
taksonomi,
P.gingivalis
(MicrobeWiki, 2010): Kingdom
: Bacteria
Superphylum : Bactroidetes/ Chlorobi group Phylum
: Bacteroidetes
Class
: Bacteroides
Ordo
: Bacteriodales
Family
: Porphyromonadaceae
Genus
: Porphyromonas
Species
: Porphyromonas gingivalis
diklasifikasikan
sebagai
berikut
7
2.2.2
Karakteristik Karakter P. gingivalis adalah memiliki bercak hitam, pleomorphic terutama
berbentuk batang pendek, non-motil, gram negatif, non-fermentasi, tidak membentuk spora, obligat anaerob, asaccharolytic, dapat tumbuh optimum pada suhu 36,8- 39oC dengan pH antara 7.5-8.0 (Iriano, 2008). Gambaran mikroskopis P. gingivalis dapat dilihat pada gambar 2.1.
Gambar 2.1 Porphyromonas gingivalis (MicrobeWiki, 2010)
2.2.3
Metabolisme Porphyromonas gingivalis membutuhkan hemin, hasil akhir metabolik darah
sebagai sumber zat besi, serta peptida untuk pertumbuhan. Bakteri akan mengikat hemin pada permukaan sel dan mentransportasikan seluruh molekulnya ke dalam sel dengan dengan mekanisme yang membutuhkan suatu energi. Untuk memenuhi kebutuhan ini, bakteri menghasilkan tiga hemaglutinin yang berpartisipasi dalam interaksi perlekatan dengan inang dan lima proteinase yang berkontribusi untuk menginaktifkan molekul efektor pada respon imun dan juga berperan dalam destruksi jaringan (Iriano, 2008).
8
2.2.4
Mekanisme Perlekatan pada Inang Porphyromonas
gingivalis
membutuhkan
bakteri
pendahulu
beserta
produknya yang terdapat dalam plak seperti Streptococcus, untuk menciptakan kondisi lingkungan yang adekuat dan memfasilitasi kolonisasi P. gingivalis, melalui penyediaan area perlekatan antar spesies dan substrat untuk pertumbuhan, serta penurunan tekanan oksigen hingga level yang rendah yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pertahanannya sebagai bakteri anaerob (Richard dan Howard 1998). Perlekatan P. gingivalis dibantu berbagai faktor virulensi yang berhubungan dengan destruksi jaringan dan mekanisme pertahanan terhadap inang, yang meliputi : 1) Fimbriae sebagai perantara utama dalam perlekatan bakteri ke substrat yang tersedia, selain itu juga memiliki sifat kemotaktik dan induksi sitokin yang juga terlibat dalam patogenesis (Iriano, 2008). Fimbriae pada permukaan sel bakteri sering disebut sebagai hidrofobin yang bertanggung jawab terhadap interaksi bakteri dengan sel hospes. Bakteri yang mempunyai protein dengan sifat hidrofob lebih mudah difagosit oleh sel-sel polimorfonuklear lekosit (Khusnan dan Salasia, 2006). 2) Protease, terutama arginin-spesifik, yang disebut gingipain, dapat mendegradasi molekul inang seperti imunoglobulin, komplemen, protein sekuester hemin, hemolisin, kolagenase, dan protein jaringan ikat inang, serta berperan dalam jalur tidak langsung untuk mrnghancurkan dengan mendegradasi inhibitor yang dihasilkan sel inang untuk mengatur protease sel inang yang terlibat dalam inflamasi. 3) Hemaglutinin akan menginisiasi kolonisasi dengan cara memperantarai pengikatan bakteri dengan reseptor (biasanya oligosakarida) pada sel manusia, karena bakteri ini membutuhkan hemin untuk pertumbuhan, maka ikatannya dengan eritrosit sel tubuh manusia juga memberikan fungsi nutrisi (Iriano, 2008). Hemaglutinin dan fimbriae mempunyai arti sebagai adhesin untuk perlekatan bakteri gram negatif pada sel hospes (Khusnan dan Salasia, 2006).
9
4) Kapsular polisakarida yang menghambat fagositosis oleh sel imun inang serta berperan penting dalam perlekatan sel (Iriano, 2008). Untuk memudahkan bakteri berpenetrasi ke jaringan dan mengganggu aktivitas sel tubuh, maka bakteri menghasilkan produk akhir metabolik meliputi butirat dan propionat yang memiliki berat molekul rendah (MicrobeWiki, 2010). Mekanisme perlawanan bakteri terhadap sel inang, yaitu dihasilkannya asam suksinat yang akan menghambat kemotaksis netrofil, dengan cara menurunkan pH intrasel pada netrofil serta menghambat pergerakan respon PMN terhadap peptide kemotaktik dengan cara mendepolarisasi membran PMN (Richard dan Howard, 1998).
2.2.5
Peran Dalam Patogenesis Penyakit Periodontal (Indirect) Periodontitis adalah suatu penyakit keradangan pada jaringan penyangga gigi
yang disebabkan oleh mikroorganisme tertentu sehingga mengakibatkan kerusakan yang progresif pada ligamen periodontal dan tulang alveolar ditandai dengan terbentuknya poket, resesi, atau kedua-duanya. Kerusakan ini dapat disebabkan oleh toksin yang diproduksi oleh bakteri maupun oleh aktifitas sel-sel dan mediator proinflamatori yang berlebihan. Komponen struktur bakteri dapat merangsang perkembangan reaksi kekebalan host yang tidak hanya mampu melindungi inang terhadap infeksi tetapi juga menyebabkan kerusakan jaringan periodontal parah. Salah satu penyebab dari terjadinya periodontitis kronis adalah P. gingivalis (Carranza et al ., 2006). Komponen dinding sel dari P. gingivalis, seperti lipopolisakarida (LPS), dapat merangsang pelepasan sitokin pro-inflamasi (IL-1b, IL-6, CXCL8 atau IL-8, TNF-a), prostaglandin, oksida nitrat, dan radikal bebas. Zat-zat kimia tersebut adalah mediator peradangan dan kebanyakan dari mereka dapat merangsang resorpsi tulang. LPS dan mediator inflamasi juga memiliki efek langsung terhadap aktifitas osteoblas, yaitu menyebabkan penurunan jumlah sel osteoblas fungsional. Hasil dari aktifitas ini
10
adalah terjadinya kehilangan perlekatan, termasuk tulang dan jaringan ikat periodontal. Selain itu, radikal bebas seperti superoksida dan peroksida hidrogen, bersama
pelepasan
enzim
lisosomal
oleh
lekosit
polimorfonuklear,
dapat
menimbulkan kerusakan matriks ekstraseluler jaringan ikat, serta menyebabkan pembentukan pus yang terkait dengan abses (Siquera dan Rocas, 2007). LPS juga dapat mengaktivasi komplemen jalur alternatif tanpa adanya antibodi. Hasil aktivasi ini adalah C3b yang mempunyai efek opsonisasi (Baratawidjaja, 1996). Setelah bakteri melekat pada netrofil, maka netrofil akan menonjolkan pseudopodia ke semua jurusan di sekeliling partikel. Pseudopodia bertemu satu sama lain pada sisi yang berlawanan dan bergabung. Hal ini menciptakan ruangan tertutup yang berisi partikel yang sudah difagositosis. Segera setelah partikel asing difagositosis, lisosom dan granula sitoplasmik lainnya segera datang untuk bersentuhan dengan gelembung fagositik, dan membrannya bergabung dengan membran pada gelembung, selanjutnya mengeluarkan banyak enzim pencernaan dan bahan bakterisidal ke dalam gelembung untuk membunuh bakteri (Guyton dan Hall, 2007). Aktifitas fagositosis netrofil juga dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas Reactive Oxygen Species (ROS). Hal ini berhubungan dengan peningkatan konsumsi oksigen pada saat fagositosis dan merangsang aktifitas Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH) yang mempengaruhi terbentuknya radikal superoksid O2. ROS dapat menyebabkan kerusakan dengan berbagai mekasisme, yaitu : a.
Melalui proses peroksidasi lipid yang terjadi apabila radikal bebas berdekatan dengan membrane fosfolipid sehingga akan menyerang rantai lipid tersebut dan mengambil electron lipid yang mengakibatkan kerusakan sel.
b.
Merusak deoxyribonucleic acid (DNA) dengan memutuskan rantai basis hidrosil.
c.
Merusak protein pada proteoglycan dan gingival hyaluronic acid yang diketahui dapat membantu proses penyembuhan gingivitis.
11
d.
Merangsang proses inflamasi dengan mengeluarkan proinflamatori sitokin dari monosit dan makrofag sehingga akan menstimulasi inflamasi secara terus menerus yang akan menyebabkan inflamasi periodontal (Shafie, 2011).
2.3
Netrofil
2.3.1
Morfologi Netrofil Pada manusia granulasit dalam sirkulasi terdiri dari tiga macam sel yang
secara morfologis dapat dibedakan ikut terlibat dalam banyak reaksi-reaksi imunologik di jaringan. Sel-sel ini termasuk netrofil, eosinofil, dan basofil, dari ketiga sel ini hanya netrofil yang terutama berperan dalam fagositik, sedang eosinofil hanya sedikit sekali (Bellanti, 1993). Lekosit netrofil atau polimorfonuklear (PMN) dalam keadaan normal berjumlah 60-70 persen dari jumlah seluruh eukosit di dalam arah perifer orang dewasa. Netrofil adalah garis pertahanan pertama tubuh terhadap invasi oleh bakteri,sangat fagositik dan sangat aktif. Tidak seperti makrofag, netrofil adalah sel terminal dan diferensiasi myeloid dan tidak membelah. Sesudah periode pendek (sekitar 12 jam) PMN masuk ke dalam jaringan, dimana mereka menyelesaikan jangka hidupnya dalam beberapa hari. Secara normal sel-sel ini tidak pernah kembali dari jaringan ke dalam darah (Bellanti, 1993) Granulosit (lekosit polimorfonuklear atau netrofil) mengandung sedikitnya dua tipe granula : (1) Azurofil atau granula primer dan (2) granula sekunder atau spesifik (Jawetz, 2005). Granula primer (azurofil) berdiameter 0,4 mikron (µ) yang tampak pada awal dan berciri serupa dengan lisosom jaringan lain (Bellanti, 1993). Granula primer ini mengandung lisozim, enzim hidrolitik lain dan beberapa protein kationik serta defensin, suatu antimikroba. Granula sekunder atau spesifik mengandung laktoferin dan beberapa enzim termasuk kolagenase. Kedua jenis granula ini penting dalam penghancuran benda-benda yang ditelan dan dalam pembunuhan mikroorganisme. Produksi dan pelepasan granulosit diduga dibawah
12
pengendalian faktor seluler humoral (Jawetz dkk, 2005). Gambaran mikroskopik netrofil dapat dilihat pada gambar 2.2.
Gambar 2.2 Gambaran mikroskopis netrofil (Vachani, 2006)
2.3.2
Membran Sel Netrofil Membran sel (disebut juga membran pasma), yang menyelubungi sel adalah
suatu struktur yang elastik, fleksibel, tipis dengan ketebalan hanya 7,5 sampai 10 nanometer.
Membran
sel
berfungsi
sebagai
barier
semipermeabel
yang
memungkinkan molekul yang berukuran kecil dapat keluar masuk ke dalam sel. Hasil pengamatan mikroskop elektron terhadap membran sel menunjukkan bahwa memberan sel merupakan lipid bilayer (disebut sebagai fluid-mosaic model). Molekul penyusun utama adalah fosfolipid, yang terdiri dari bagian kepala yang polar (hidrofilik) dan dua ekor nonpolar (hidrofobik). Fosfolipid ini tersusun atas bagian nonpolar membentuk daerah hidrofobik yang diapit oleh daerah kepela yang pada bagian dalam dan luar membran. Perkiraan komposisi membran sel adalah: protein 55%, fosfolipid 25%, kolesterol 13%, lipid lain 4%, dan karbohidrat 3% (Guyton dan Hall, 2007). Protein pada membran sel sebagian besar tersusun atas glikoprotein. Terdapat dua jenis protein membran yaitu : protein integral yang menembus membran sepenuhnya dan protein perifer yang hanya melekat pada satu sisi atau permukaan
13
membran dan tidak menembus membran sepenuhnya. Protein integral memiliki banyak fungsi, salah satunya adalah sebagai reseptor. Interaksi reseptor dengan molekul tertentu (ligan) spesifik yang menempel pada reseptor, mengakibatkan perubahan bentuk reseptor. Hal tersebut selanjutnya mengaktivasi bagian dalam protein integral atau menginduksi terjadinya interaksi antara reseptor dan protein yang terdapat dalam sitoplasma, yang berperan sebagai second messenger. Oleh karena itu sinyal dapat diteruskan dari bagian luar reseptor ke dalam sel. Dalam hal ini protein integral yang tersebar di membran sel berfungsi sebagai sarana penyampaian informasi mengenai lingkungan di luar ke dalam sel. Pada netrofil reseptor ini berupa resepor Fc ( FcR) dan reseptor C3b (C3bR) yang berinteraksi dengan sebuah antibody yang diangkut darah yaitu IgG dan sebuah komponen komplemen dari plasma darah yaitu C3b, yang melekat pada permukaan bakteri pada proses opsonisasi. Hal ini menyebabkan bakteri bisa menempel pada membran netrofil (Guyton dan Hall, 2007).
2.3.3
Mekanisme Netrofil dalam Pertahanan Tubuh Netrofil merupakan sel pertahanan tubuh non spesifik yang pertama kali
mengatasi adanya antigen dengan memfagosit antigen tersebut. Netrofil dapat menyerang dan menghancurkan bakteri, bahkan di dalam sirkulasi darah. Netrofil berperan penting pada respon radang akut, dimana terjadi perubahan-perubahan vaskuler dan eksudasi. Beberapa jam setelah dimulai radang akut, terjadi peningkatan jumlah netrofil dalam darah, kadang-kadang sampai empat hingga lima kali lipat dari jumlah normal. Hal ini disebabkan karena adanya mediator keradangan seperti histamin, bradikinin, serotonin, prostaglandin, beberapa produk sistem komplemen dan produk reaksi pembuluh darah yang memasuki aliran darah kemudian ditranspor di sumsum tulang guna menggerakkan netrofil-netrofil ke dalam sirkulasi untuk segera menuju daerah radang (Guyton dan Hall, 2007). Netrofil akan bereaksi terhadap inflamasi dengan berakumulasi mendekati sel
14
endotel dinding venula. Proses ini disebut marginasi. Akumulasi dan penempelan netrofil pada permukaan endotel terjadi karena adanya molekul adhesi yang dilepaskan endotel akibat pengaruh IL-1 yang diproduksi netrofil. Molekul adhesi tersebut antara lain P-selektin dan intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) (Firman, 2007). Selain itu adhesi netrofil pada sel endotel juga memakai protein adhesif spesifik yakni integrin yang terletak pada permukaan netrofil, dan juga dengan menggunakan protein reseptor spesifik dalam sel endotel tersebut. Integrin ini juga akan menentukan interaksi spesifik netrofil dengan berbagai sel dan komponen jaringan (Tihnulat, 2009). Setelah netrofil mengadakan kemotaksis dan berada di lokasi di mana bakteri tersebut berada, akan terjadi perlekatan antara bakteri dengan netrofil. Meskipun sel-sel fagosit memiliki kemampuan intrinsik untuk mengikat bakteri secara langsung dan tanpa didahului oleh suatu proses pengenalan yang khas, tetapi perlekatan tersebut akan dipermudah bila bakteri diliputi oleh oposonin yang terdapat dalam serum (Robbins dan Kumar, 1995). Setelah proses opsonisasi, opsonin yang mengikat bakteri mudah melekat pada reseptornya
di membran
netrofil (Susanti dan
Rahayuningsih, 2003). Hal tersebut dimungkinkan oleh adanya reseptor untuk C3b dan fraksi Fc dari immunoglobulin pada permukaan fagosit (gambar 2.3) (Baratawidjaja, 1996). Sewaktu mendekati suatu partikel untuk difagositosis, mula-mula netrofil melekatkan diri pada partikel kemudian menonjolkan pseudopodia ke semua jurusan di sekeliling partikel. Pseudopodia bertemu satu sama lain pada sisi yang berlawanan dan bergabung. Hal ini menciptakan ruangan tertutup yang berisi partikel yang sudah difagositosis. Kemudian ruangan ini berinvaginasi ke dalam rongga sitoplasma dan melepaskan diri dari membran sel bagian luar untuk membentuk gelembung fagositik yang mengapung dengan bebas (juga disebut fagosom) di dalam sitoplasma. Segera setelah partikel asing difagositosis, lisosom dan granula sitoplasmik lainnya segera datang untuk bersentuhan dengan gelembung fagositik, dan membrannya bergabung dengan membran pada gelembung, selanjutnya mengeluarkan banyak enzim
15
pencernaan dan bahan bakterisidal ke dalam gelembung. Jadi, gelembung fagositik sekarang menjadi gelembung pencerna , dan segera dimulailah proses pencernaan bakteri yang sudah difagositosis (Guyton dan Hall, 2007).
Keterangan : 1. Fagosit mempunyai kemampuan intrinsik untuk mengikat mikroorganisme secara langsung 2. Ikatan tersebut lebih mudah bila bakteri mengaktifkan komplemen C3b 3. Bakteri yang tidak mengaktifkan komplemen, dapat diikat fagosit dengan bantuan antibody yang berfungsi sebagai jembatan yang mengikatkan bakteri dengan reseptor Fc pada fagosit. 4. Bila ada antibody bersama C3b, ikatan menjadi lebih mudah lagi terjadi.
Gambar 2.3. Opsonisasi (Baratawidjaja, 1996)
Selain mencerna bakteri yang dicerna di dalam fagosom, netrofil juga mengandung bahan bakterisidal yang membunuh sebagian besar bakteri, bahkan bila enzim lisosomal gagal mencerna bakteri tersebut. Banyak efek pembunuhan merupakan hasil dari beberapa bahan pengoksidasi kuat yang dibentuk oleh enzim dalam membrane fagosom, atau oleh organel khusus yang disebut peroksisom. Bahan pengoksidasi ini ialah sejumlah besar superoksida (O2-), hidrogen peroksida (H2O2),
16
dan ion-ion hidroksil (OH-), semuanya bersifat mematikan bagi sebagian besar bakteri, bahkan bila bahan pengoksidasi itu jumlahnya sedikit. Selain itu, salah satu enzim lisosom, yaitu mieloperoksidase, mengatalisis reaksi antara H2O2 dan ion klorida untuk membentuk hipoklorit, yang secara luas bersifat bakterisid. Ketika proses radang akut dapat ditekan, proses ini akan berakhir dengan terjadinya apoptosis dari sel netrofil yang masih hidup, yaitu suatu proses yang merupakan regulasi dari bunuh diri sel. Selanjutnya netrofil yang melakukan apoptosis akan terisolasi dari daerah infeksi. Berbeda dengan kematian sel netrofil akibat produk bakteri (kematian degeneratif atau nekrosis), apoptosis memiliki karakteristik, seperti sel menyusut, mengendap, kondensasi kromatin, dan kondensasi intranukleosomal DNA (Firman, 2007). Apoptosis akan melimitasi resiko kerusakan jaringan dengan melepaskan oksigen reaktif dan meningkatkan perbaikan terhadap repon infeksi. Selain itu campuran jaringan nekrotik, netrofil mati, makrofag mati, dan cairan jaringan yang terdapat dalam pus pada daerah yang meradang secara bertahap akan mengalami autolysis dalam waktu beberapa hari, dan kemudian produk akhirnya akan diabsorpsi ke dalam jaringan sekitar dan cairan limfe sehingga sebagian besar tanda kerusakan akan hilang (Firman, 2007). Granula lisosom yang terdapat dalam netrofil juga mengandung mediator inflamasi. Mediator ini dilepaskan setelah kematian sel oleh karena peluruhan selama pembentukan vakuola fagosit atau oleh fagositosis yang terjalang karena ukurannya besar dan permukaan yang tidak dapat dicerna. Perusakan netrofil ini juga menyebabkan pelepasan enzim proteolitik, pepsin, dan cathepsin, dengan akibat lisis jaringan (Grossman, 1995). Kalikrein yang dilepaskan dari lisosom menyebabkan pembentukan bradikinin. Netrofil juga merupakan sumber fosfolipase yang diperlukan untuk sintesis asam arakidonat (Robbins dan Kumar, 1995). Selain itu metabolit oksigen reaktif yang dibentuk dalam sel fagosit saat fagositosis juga berperan sebagai mediator inflamasi. Metabolit oksigen reaktif ini dapat luruh memasuki lingkungan ekstrasel. Diduga bahwa radikal-radikal bebas yang sangat
17
toksik meningkatkan permeabilitas vascular dengan cara merusak endotel kapiler. Selain itu, ion-ion superoksida dan hidroksil juga dapat menyebabkan peroksidase asam arakidonat tanpa enzim (Robbins dan Kumar, 1995). Keberhasilan proses fagositosis dipengaruhi oleh faktor netrofil,
faktor
bakteri yang difagosit dan faktor lingkungan. Faktor netrofil antara lain umur sel, energi yang tersedia, integritas komponen seluler serta faktor kemotaktik. Faktor bakteri yang difagosit meliputi susunan dinding bakteri, kapsul, toksin dan sifat permukaan bakteri. Faktor lingkungan yang mempengaruhi proses fagositosis adalah temperatur, pH, osmolaritas, komposisi
ionik
dan tegangan
antar permukaan
(Susanti dan Rahayuningsih, 2003).
2.4
Rosella (Hibiscus sabdariffa L.)
2.4.1
Klasifikasi Rosella Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) merupakan tanaman herbarium dengan
tatanan taksonomi sebagai berikut (Mahadevan et al ., 2009) : Klasifikasi
: Plantae
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Tracheobionta
Division
: Magnoliophyta
Subdivisi
: Angiospermae
Class
: Magnoliopsida
Subclass
: Dilleniidae
Ordo
: Malvales
Family
: Malvaceae
Genus
: Hibiscus L.
Species
: Hibiscus sabdariffa L
18
2.4.2
Morfologi Rosella Bunga tanaman Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) memiliki struktur yang sama
dengan bunga tanaman herbarium lainnya. Bunga berukuran besar dengan warna merah sampai kuning dan semakin gelap di tengah bunga. Struktur morfologi bunga Rosella antara lain (Mahadevan et al ., 2009) : 1)
tangkai bunga (pediselus),
2)
epycalyx,
3)
kelopak bunga (calyx),
4)
mahkota bunga (corola),
5)
tangkai putik (androgynophorum),
6)
benang sari (stamen) dan
7)
putik (gynensium).
Gambar 2.4 Tanaman Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) (Sumber : Mukhtar,2010)
Rosella termasuk dalam keluarga Malvaceae yaitu tumbuhan semak tegak yang kebanyakan bercabang, memiliki bunga dan batang yang sewarna dan biasanya mencolok, memiliki daun berwarna hijau gelap sampai dengan merah dan memiliki kulit dan batang yang berserat kuat (gambar 2.4). Bunga berwarna merah sampai dengan kuning dengan warna gelap ditengahnya, dengan jumlah kelopak antara 3–7 buah. Bunga Rosella memiliki putik sekaligus serbuk sari sehingga tidak memerlukan bunga lain untuk bereproduksi (Mahadevan et al ., 2009).
19
Tinggi tanaman Rosella mencapai 0,5-2,4 m. Bunga Rosella merupakan bunga tunggal tidak lengkap (bunga bertangkai) dengan tipe daun bunga majemuk menyirip gasal berseling dan warna bunga dewasa bervariasi dari hijau tua sampai merah kekuningan. Batang tanaman bulat, berserat dan bercabang. Tanaman Rosella memiliki akar tunggal yang cukup dalam. Buah tanaman Rosella berwarna hijau tua dan mampu mencapai diameter 5,3 cm dan panjang 5 cm (Mahadevan et al ., 2009). Kelopak bunga Rosella adalah bagian tanaman yang dapat diproses menjadi produk pangan. Kelopak bunga Rosella berwarna merah tua, tebal, dan berair. Kelopak bunga Rosella merah yang rasanya sangat masam ini biasanya diproses menjadi jeli, saus, teh, sirup, selai, puding, dan manisan. Bahan penting yang terkandung dalam kelopak bunga Rosella adalah gossypetin, anthocyanin, dan glucide hibiscin. Selain itu kelopak bunga Rosella juga mengandung asam organik, polisakarida,
dan
flavonoid
yang
bermanfaat
mencegah
penyakit
kanker,
mengendalikan tekanan darah, melancarkan peredaran darah, dan melancarkan buang air besar. Secara tradisional tanaman ini banyak dimanfaatkan untuk mengatasi batuk, lesu, demam dan gusi berdarah. Ekstrak kuncup bunga Rosella juga dipercaya mampu bekerja sebagai penahan kekejangan (antispasmodik), anticacing (antihelmintik), antibakteri, antiseptik, penyejuk (astringent), dan menurunkan kadar penyerapan alkohol (Faridasari dan Mulyantini, 2009).
2.4.3
Kandungan dan Manfaat Rosella Kelopak kering Rosella terdiri dari alkaloid, b-sitosterol, antosianin, asam
sitrat,sianidin-3-rutinose, delfinidin, galactosa , pectin, asam protosateochuis, kuersetin, asam stearis, dan lilin. Rosella diketahui memiliki kandungan senyawa fenolik yang berfungsi sebagai antioksidan sebanyak 23,10 mg dalam setiap gram bobot kering kelopak Rosella. Kelopaknya juga kaya akan asam dan pectin. Analisis fitokimia pada kelopaknya menunjukkan bahwa terdapat protein dan mineral seperti besi, fosfor, kalsium, magnesium, aluminium, mangan, sodium, potasium, kalsium
20
sitrat, vitamin C, gossypetin, dan hibiscin chlorideare. Bijinya mengandung protein, lemak, serat, mineral (fosfor, magnesium, kalsium, lysine , tryptophan, nitrogen, asam lemak, selulosa, pentosan, dan zat tepung, steroid tokoferol (Mahadevan et al ., 2009). Kelopak keringnya juga mengandung flavonoid (gossypetine, hibiscetine, dan sabdaretine). Penelitian secara in vivo maupun in vitro menunjukkan bahwa flavonoid memiliki aktivitas biologis maupun farmakologis, antara lain bersifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antikarsinogen, antioksidan, dan melindungi pembuluh darah (Sabir, 2003). Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom (Bryan dan Wilson dalam Sabir, 2003). Sifat antiinflamasi dari flavonoid telah terbukti baik secara in vitro maupun in vivo. Mekanisme flavonoid yaitu menghambat pelepasan asam arakidonat dan sekresi enzim lisosom dari sel netrofil dan sel endotelial dan menghambat fase proliferasi dan fase eksudasi dari proses inflamasi. Konsentrasi tinggi dari beberapa senyawa flavonoid dapat menghambat pelepasan asam arakidonat dan sekresi enzim lisosom dari membran dengan jalan memblok jalur siklooksigenase dan fosfolipase A2. Sedangkan pada konsentrasi rendah hanya memblok jalur sikloogsigenase. Terhambatnya pelepasan asam arakidonat dari sel inflamasi akan menyebabkan kurang tersedianya substrat arakidonat bagi jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin, prostasiklin, endoperoksida, dan tromboksan di satu sisi dan asam hidroperoksida, asam hidroksieikostrenoat, dan leukotrin di sisi lainnya (Sabir, 2003). Kandungan gizi kelopak bunga kering tiap 100 gram dapat dilihat pada tabel 2.1.
21
Tabel 2.1 Kandungan kelopak kering bunga Rosella dalam 100 g Kandungan Air Protein Lemak Serat Abu Kalsium Fosforus Zat Besi Karotena Thiamin Riboflavin Niacin Asam Askorbik Lic Acid Fruktosa Sukrosa Tiamin Vitamin C
Jumlah 9.2 g 1.14 g 2.61 g 12.0 g 6.90 g 1.263 mg 273.2 mg 8.98 mg 0.029 mg 0.117 m 0.277 mg 3.765 mg 6.7 mg
Sumber: Info Fisioterapi (2011)
Flavonoid mampu menghambat perlekatan bakteri dengan cara mengikat protein permukaan bakteri dan menurunkan hidrofobisitas pada membran sel fagosit (Hamsafir, 2010). Bakteri yang mengandung lebih banyak protein dengan komposisi sedemikian rupa, sehingga bersifat hidrofob mempunyai kemampuan melekat lebih banyak pada sel-sel hospes dan mudah difagosit oleh sel-sel polimorfonukler lekosit (Khusnan dan Salasia, 2006). Pada P. gingivalis, fimbriae bersifat hidrofob dapat lebih mudah melekat pada membran sel fagosit yang juga cenderung hidrofob melalui interaksi hidrofobik. Flavonoid dapat menurunkan hidrofobisitas tersebut, sehingga menghambat perlekatan P. gingivalis dengan sel fagosit. Kelopak bunga Rosella juga mengandung senyawa lain yang juga bersifat antioksidan kuat seperti vitamin C. Beberapa studi mengungkapkan antioksidan terbukti berperan dalam menghambat adhesi sel lekosit dengan cara menghambat pelepasan dari ICAM-1 pada sel endotel. Antioksidan ini juga dapat menghambat ekspresi integrin 1 dan 2 pada lekosit dan menghambat perlekatannya pada endotel
22
dan sel lain. Studi in vivo pada manusia memperlihatkan korelasi terbalik antara kadar antioksidan dengan ekspresi integrin pada sel fagosit (Sukandar, 2006). Kelopak bunga Rosella dapat terekstraksi dengan baik bila menggunakan metode ekstraksi maserasi menggunakan pelarut etanol pada kondisi optimum 96% (Siregar dan Nurlela, 2011). Pemilihan pelarut disesuaikan dengan sifat kepolaran suatu zat. Sifat kepolaran pelarut berpengaruh pada konsentrasi zat aktif yang terekstrak. Semakin polar pelarut maka konsentrasi zat aktif yang didapatkan semakin tinggi dan sebaliknya. Pelarut etanol bersifat polar, relatif aman, serta dapat melarutkan berbagai senyawa yang sukar larut dalam air. Senyawa flavonoid yang terkandung dalam kelopak bunga Rosella bersifat polar. Selain itu senyawa thiamin, riboflavin, niacin, dan asam askorbik dalam kelopak bunga Rosella juga merupakan senyawa yang bersifat polar. Sehingga penggunaan etanol sebagai pelarut efektif dalam menarik dan melarutkan komponen zat aktif dalam kelopak bunga Rosella kering (Hasibuan et al, 2010 ).
2.5
Hipotesis Pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi P.
gingivalis pada netrofil.
23
BAB 3. METODE PENELITIAN
3.1
Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental in vitro, yaitu
penelitian dengan pemberian perlakuan terhadap variabel yang diteliti dan dilakukan di laboratorium.
3.2
Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini yaitu post test only control group design yaitu
dilakukan pengukuran terhadap variabel yang diteliti setelah diberikan perlakuan, kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol
3.3
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Bagian Mikrobiologi dan
Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jember. Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus 2011.
3.4
Variabel Penelitian
3.4.1
Variabel Bebas : Ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50%, dan 100%
3.4.1.1 Definisi Operasional Ekstrak kelopak bunga Rosella adalah ekstrak dengan konsistensi pekat yang merupakan hasil ekstraksi dari kelopak kering bunga Rosella yang telah banyak dijual di pasaran (merek “Bunga Rosella Mesir de Carcade”). Pelarut yang digunakan untuk
24
ekstraksi adalah etanol 97% dengan menggunakan suhu ruangan. Untuk konsentrasi 50% dibuat dengan cara mengambil 1 ml sediaan 100% dicampur dengan 1 ml aquadest steril.
3.4.2 Variabel Terikat : Variabel terikat pada penelitian ini adalah indeks adhesi P. gingivalis pada netrofil.
3.4.2.1 Definisi Operasional Indeks adhesi yaitu banyaknya bakteri yang melekat pada suatu sel dihitung sampai satuan sel dan dibuat rata-ratanya. Pada penelitian ini digunakan penghitungan indeks adhesi yaitu banyaknya P. gingivalis yang melekat pada netrofil. Parameter yang digunakan yaitu indeks adhesi diukur dengan menghitung jumlah rata-rata bakteri yang menempel per netrofil, hingga 100 netrofil (Yanuhar, Tanpa Tahun).
3.4.3
Variabel Terkendali
a.
Konsentrasi P. gingivalis Porphyromonas gingivalis yang digunakan dalam penelitian ini adalah
P.gingivalis (ATCC 33277) yang diperoleh dari The American Type Culture Collection (ATCC). Konsentrasi yang digunakan adalah 3x106 sel/ml. b.
Konsentrasi netrofil Isolat netrofil diambil dari darah vena perifer orang sehat (tidak memiliki
kelainan sistemik). Isolasi netrofil dilakukan dengan teknik gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation. Konsentrasi netrofil dihitung dengan Haemocytometer yaitu 51,1 %.
25
3.5
Alat dan Bahan
3.5.1
Alat
1.
Petridish
2.
Tabung reaksi (Pyrex, Japan)
3.
Becker glass (Pyrex, Japan)
4.
Tabung elenmeyer (Pyrex, Japan)
5.
Centrifuge (Hettich, Germany)
6.
Timbangan (Cento-gram® balance)
7.
Laminar flow (tipe HF-100, Korea)
8.
Inkubator (WTC Binder, Germany)
9.
Desicator (Kartell, Italy)
10.
Blue/ yellow tip
11.
Autoclave (Memmert, Germany)
12.
Torniquet
13.
Syringe 10 ml
14.
Kaca obyek
15.
Coverglass
16.
Mikroskop
17.
Rak objek glass
18.
Haemocytometer
19.
Inkubator (WTC Binder, Germany)
20.
Vortex
21.
Pipet mikro
22.
Rotary evaporator
23.
Tabung Falcon
26
3.5.2
Bahan
1.
Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) dengan medium kulturnya yaitu medium Brain Heart Infusion (BHI) yang diperkaya dengan hemin dan vitamin K1
2.
Aquadest steril
3.
Darah vena perifer
4.
Heparin
5.
Ficoll Hystopaque 1077
6.
Etanol (Merck)
7.
Kelopak bunga Rosella kering (Bunga Rosella Mesir de Carcade)
8.
Alkohol
9.
Minyak emersi
10.
Dextran
11.
Hank’s Balance Salt Solution (HBSS)
12.
Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)
13.
Metanol absolut
3.6
Prosedur Penelitian
3.6.1 Tahap Persiapan a)
Semua alat yang digunakan dalam penelitian ini dibersihkan dan disterilkan terlebih dahulu dalam oven selama 15 menit dengan suhu 1000C.
b)
Membuat ekstrak kelopak bunga Rosella (Wijayanti, 2011) Kelopak bunga Rosella yang digunakan adalah kelopak bunga Rosella kering dalam kemasan yang telah banyak dijual pasaran merek “Bunga Rosella Mesir de Carcade”. Ekstrak kelopak bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) diperoleh dengan memblender kelopak bunga Rosella kering sehingga menjadi bubuk yang halus, ditimbang sebanyak 350 gram menggunakan neraca timbang kemudian dimaserasi dalam larutan etanol 1200 ml selama
27
±24 jam. Kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator sehingga didapatkan sediaan pekat (konsentrasi 100%). Sedangkan untuk membuat sediaan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dibuat dengan cara mengambil 1 ml sediaan 100% dicampur dengan 1 ml aquadest steril. c)
Kultur P. gingivalis Porphyromonas gingivalis dikultur dalam medium BHI yang diperkaya dengan vitamin K1 dan hemin, kemudian dikultur pada atmosfir anaerob (menggunakan desicator) selama 3x24 jam. Konsentrasi P. gingivalis dibuat menjadi 3x106 sel/ml.
d)
Isolasi netrofil (Susilawati, 2008)
1.
Sebelum dilakukan pengambilan darah, pasien diinstruksikan untuk mengisi informed concern.
2.
Darah diambil dari vena periferial orang sehat sebanyak 9 cc kemudian dicampur dengan antikoagulan (heparin).
3.
Konsentrasi netrofil dihitung dengan menggunakan haemocytometer.
4.
9 cc darah (heparinized wholeblood) dibagi menjadi 3 tabung.
5.
Disentrifus 650 rpm selama 10 menit hingga terbentuk dua lapisan, yaitu sel darah dan serum.
6.
Serum diambil dengan menggunakan pipet mikro, menyisakan sel darah pada tabung falcon.
7.
Diencerkan dengan 6 cc HBSS.
8.
Dilakukan pipetting, kemudian divortex agar campuran sel darah dan HBSS homogen.
9.
Isolasi netrofil dilakukan dengan teknik gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation.
10.
Sebanyak 9 cc darah yang mengandung antikoagulan dialirkan melalui dinding tabung yang telah berisi 3 cc larutan Ficoll sehingga sel-sel darah yang mempunyai gradien lebih tinggi dari Ficoll akan turun ke bawah.
28
11.
Tabung ditutup dan disentrifus selama 30 menit, 1350 rpm pada suhu kamar sehingga terbentuk empat lapisan berturut-turut dari bawah ke atas adalah eritrosit dan granulosit, cairan Ficoll , limfosit dan cairan plasma.
12.
Cairan plasma, limfosit, dan Ficoll Hypaque Gradient dibuang dengan menggunakan pipet mikro.
13.
Lapisan terbawah yang mengandung netrofil diresuspensi dengan 6 cc HBSS
14.
Menyiapkan dextran 6% sebanyak 1 cc dalam tabung falcon lain.
15.
Darah yang sudah diresuspensi dialirkan ke dalam tabung berisi dextran dan dilakukan pipetting.
16.
Dicampurkan dan kemudian didiamkan selama 90 menit.
17.
Supranatan mengandung netrofil diaspirasi.
18.
Ditambahkan HBSS sebanyak 1-2cc, divortex, dan disentrifugasi 1700 rpm selama 10 menit (dilakukan sebanyak 2 kali).
19.
Lapisan paling atas dibuang dengan menggunakan pipet mikro.
20.
Resuspensi dengan RPMI sampai 500 µl.
21.
Dilakukan pembuatan hapusan dan pewarnaan.
3.6.2
Pelaksanaan Penelitian
a)
Perlakuan Uji Indeks Adhesi
1.
6 coverslip yang telah disterilkan dalam laminar flow diletakkan dalam 6 petridish kecil.
2.
Netrofil kemudian ditapiskan pada masing masing coverslip masing-masing 50 µl kemudian diinkubasi selama 15 menit, 370C dan 5% CO2.
3.
Dilakukan pengecekan di bawah mikroskop inverted.
4.
Jika konsentrasi netrofil terlalu padat, dilakukan pencucian kembali dengan RPMI sampai didapatkan konsentrasi yang tidak terlalu padat dan menyebar
5.
Ditambahkan 1000 µl RPMI, kemudian pipetting.
6.
Diinkubasi selama 15 menit.
29
7.
Ekstrak kelopak bunga Rosella diberikan terhadap 4 dari 6 petridish sebanyak masing-masing 50 μl. Dua petridish diberikan ekstrak dengan kosentrasi 50%, serta dua plastic chamber selanjutnya diberikan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Untuk petridish dua sisanya diberi 50 μl RPMI yang berfungsi sebagai kontrol.
8.
Dilakukan pipetting sampai benar-benar homogen.
9.
Diinkubasi dengan shaker incubator selama 16 jam, 370C dan 5% CO2.
10.
Medium inkubasi dibuang, dan dicuci dengan 500 µl RPMI.
11.
Dicek dibawah mikroskop inverted.
12.
Secara perlahan, pada chamber 1-6 masing-masing ditambahkan suspensi P. gingivalis 200µl , diinkubasikan selama 3 jam dalam suhu 370C, 5% CO2.
13.
Diamati perubahan dan perkembangan yang terjadi selama setiap jam.
14.
Di akhir pengamatan dilakukan pencucian dengan HBSS.
15.
Difiksasi dengan menggunakan metanol absolut selama kurang lebih 1 menit, dan dicuci dengan menggunakan aquadest steril.
16.
Pewarnaan Giemsa.
17.
Hasil preparat yang sudah dicat dengan pewarnaan Giemsa, diamati dengan mikroskop inverted, terlebih dahulu mengamati jumlah P. gingivalis yang menempel pada netrofil pada perlakuan kontrol.
18.
Kemudian dilanjutkan dengan mengamati indeks adhesi dengan konsentrasi yang berturut- turut, mulai dari 50% sampai 100%.
b)
Perhitungan Indeks Adhesi
1.
Melakukan perhitungan dengan cara menghitung jumlah P. gingivalis yang menempel per netrofil sampai jumlah netrofil keseluruhan per satu lapang pandang, dengan dua kali pengulangan, berturut-turut mulai dari konsentrasi 50% hingga 100%
2.
Indeks adhesi dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Yanuhar, Tanpa Tahun) :
30
Indeks adhesi
=
Jumlah P. gingivalis yang melekat per netrofil Jumlah netrofil keseluruhan
3.7
Analisis Data Analisis data didahului dengan uji normalitas dan homogenitas untuk
mengetahui bahwa data terdistribusi normal dan homogen sebagai prasyarat dalam pengujian statistik parametrik. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah distribusi data yang ada pada masing-masing variabel mengikuti kurva distribusi normal atau tidak. Uji normalitas data dilakukan dengan menggunakan KolmogorovSmirnov Test dengan p=0,05. Uji selanjutnya adalah uji homogenitas data menggunakan Levene Test dengan p=0,05. Selanjutnya data hasil penelitian dilakukan uji parametrik dengan One Way Anova untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok, kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk mengetahui besarnya perbedaan antar kelompok.
31
3.8
Alur Penelitian Darah vena peripheral manusia + antikoagulan (heparinized whole blood)
Isolasi netrofil
kontrol Netrofil + RPMI
P1 Netrofil+ Rosella 50%
P2 Netrofil + Rosella 100%
ditambahkan suspensi P.gingivalis
Diamati perkembangan setiap jam
Diinkubasikan dalam 370C, 5% CO2, selama 3 jam
sel dicuci dengan HBSS
difiksasi dan dicat pewarnaan Giemsa
Diamati dengan mikroskop inverted
Dihitung jumlah adhesi bakteri P. gingivalis pada netrofil per satuan sel, hingga 100 sel netrofil
Analisis Data
32
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Penelitian
4.1.1
Hasil Isolasi Netrofil dan Subkultur P. gingivalis Penelitian telah dilakukan pada bulan Agustus 2011 di Bagian Biomedik
Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Penelitian ini menggunakan sampel berupa isolat netrofil yang diisolasi dari darah orang sehat yaitu yang tidak memiliki kelainan sistemik (Gambar 4.1). Untuk gambar hasil subkultur P. gingivalis dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Gambar 4.1 Preparat hasil isolasi netrofil. Menunjukkan netrofil yang berwarna pink keunguan (Pengecatan Giemsa, pembesaran 400x), tampak bentukan polimorfonuklear, yaitu nukleus yang memiliki lobus-lobus), sehingga nukleus tampak lebih dari satu.
33
Gambar 4.2 Sediaan P. gingivalis, terlihat berwarna merah muda pada pemeriksaan mikroskopik sesuai dengan sifat bakteri, yaitu gram negatif berbentuk kokobasil (Pengecatan Gram, pembesaran 1000x).
4.1.2
Hasil Uji Adhesi Hasil penelitian adhesi P. gingivalis pada netrofil yang diinkubasi oleh
ekstrak kelopak bunga Rosella menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol (diinkubasi RPMI) adhesi P. gingivalis lebih tinggi daripada kelompok perlakuan 1 (diinkubasi ekstrak Rosella 50%) dan kelompok perlakuan 2 (diinkubasi esktrak Rosella 100%). Sedangkan rata-rata jumlah adhesi P.gingivalis pada netrofil kelompok perlakuan 2 lebih sedikit daripada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1, seperti dilihat pada Tabel 4.1 dan Gambar 4.6. Hal ini menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol.
34
Tabel 4.1. Rata- rata adhesi P.gingivalis kelompok perlakuan
pada netrofil antara kelompok kontrol dan
Adhesi P.gingivalis Pada Netrofil
X ± SD
Kelompok kontrol (+ RPMI )
Kelompok perlakuan 1 (+ekstrak Rosella 50%)
Kelompok perlakuan 2 (+ekstrak Rosella 100%)
8,29 ± 1.59
5,54 ± 1.00
3,40 ± 1.03
Secara mikroskopis, gambaran adhesi P.gingivalis terhada netrofil pada ketiga kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut. Pada kelompok kontrol (Gambar 4.4) adhesi P.gingivalis tampak sangat tinggi. Sehingga akan menyebabkan netrofil mengalami lisis. Sedangkan pada kelompok perlakuan 1 (Gambar 4.5) dan kelompok perlakuan 2 (Gambar 4.6) terjadi penurunan adhesi bakteri pada netrofil.
Gambar 4.3 Netrofil diinkubasi RPMI (kelompok kontrol) menunjukkan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah banyak sehingga akan menyebabkan netrofil lisis (panah merah). Pembesaran 1000x
35
Gambar 4.4 Netrofil diinkubasi ekstrak Rosella 50% (kelompok perlakuan 1) menunjukkan penurunan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dengan rata- rata 5 bakteri/ sel (pembesaran 1000x)
Gambar 4.5 Netrofil diinkubasi ekstrak Rosella 100% (kelompok perlakuan 2) menunjukkan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah sedikit dengan jumlah rata-rata ± 3 bakteri/sel (pembesaran 1000x)
4.1.3
Hasil Analisis Data Hasil uji normalitas didapatkan nilai signifikasi adalah 0.093 (p< 0,05)
sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa data pada penelitian terdistribusi normal.
36
Hasil uji homogenitas diketahui bahwa nilai signifikansinya sebesar 0,076 (p>0,05), maka dapat dikatakan bahwa data tersebut adalah homogen. Penggunaan uji parametrik dapat dilakukan setelah data tersebut memiliki distribusi normal dan homogen. Pada penelitian ini digunakan uji One Way Anova untuk mengetahui apakah pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella berpengaruh terhadap penurunan adhesi P. gingivalis pada netrofil . Tingkat kepercayaan yang digunakan adalah 95% (p<0,05). Berdasarkan hasil uji One Way Anova didapatkan bahwa rata-rata jumlah adhesi P. gingivalis pada netrofil kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2 adalah berbeda secara signifikan dengan nilai signifikansi 0,000 (p<0,05). Selanjutnya untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna, maka dilakukan uji lanjut Post Hoc LSD dengan tingkat kemaknaan 95% (p<0,05). Hasil uji lanjut LSD dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 4.2 Ringkasan hasil uji lanjut Post Hoc LSD rata-rata adhesi P.gingivalis pada netrofil Kelompok Kontrol Rosella 50% Rosella 100%
Rata-rata adhesi P.gingivalis pada netrofil (X ± SD) 8.29 ±1.59 5.54 ± 1.00 -
8.29 ±1.59 3.40 ± 1.03
5.54 ± 1.00 3.40 ± 1.03
P = 0.000*
P= 0.000*
P= 0.000*
Keterangan : * = Ada perbedaan yang bermakna (p<0,05)
37
Adhesi P. gingivalis Pada Netrofil
10
8.29
* *
8 Rata-rata adhesi P.gingivalis
*
5.54
6
3.40
4 2 0 Kelompok Kontrol
Kelompok Perlakuan 1
Kelompok Perlakuan 2
Gambar 4.6 Diagram Batang Rata-Rata Adhesi P. gingivalis Pada Netrofil Keterangan : Kelompok kontrol : tidak diinkubasi ekstrak kelopak Rosella Kelompok Perlakuan 1 : diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 50% Kelompok Perlakuan 2 : diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 100% Tanda (*) : Terdapat perbedaan yang signifikan (p< 0.05)
Berdasarkan data pada tabel 4.2 menunjukkan hasil uji Post Hoc LSD adhesi P. gingivalis pada netrofil antar kelompok perlakuan menunjukkan signifikansi 0.000 (p< 0,05) artinya terdapat perbedaan yang signifikan rata-rata adhesi P. gingivalis pada tiap kelompok penelitian. Hal ini menunjukkan adanya penurunan adhesi P.gingivalis pada netrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella.
4.2
Pembahasan Data indeks adhesi keseluruhan yang didapatkan sebanyak 600 data netrofil.
Terdiri dari 200 netrofil kelompok kontrol, 200 netrofil kelompok perlakuan 1, dan 200 netrofil kelompok perlakuan 2. Analisa data dilakukan pada 450 data netrofil dari
38
600 data yang terdiri dari kelompok kontrol sebanyak 150 sel, kelompok perlakuan 1 sebanyak 150 sel, dan kelompok perlakuan 2 sebanyak 150 sel. Data indeks adhesi yang terlalu menyimpang (± 25%) dari total data tidak digunakan dalam analisa. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kualitas data yang memadai (quality control). Seleksi data dilakukan berdasarkan modus (frekuensi data yang paling sering muncul). Sebagai contoh, pada kelompok kontrol, data modus yang didapatkan yaitu antara 7-11 P. gingivalis yang menempel/ sel, pada kelompok perlakuan 1 antara 4-7 P. gingivalis/ sel, sedangkan pada kelompok perlakuan 2 modus yang didapatkan adalah antara 2-5 P. gingivalis/ sel. Hasil penelitian menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi P.gingivalis pada netrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. Pada kelompok kontrol (netrofil diinkubasi RPMI) indeks adhesi P.gingivalis terhadap netrofil sangat tinggi. Netrofil yang memfagosit banyak bakteri akan mengalami nekrosis dan menyebabkan tumpahnya cairan intrasel ke lingkungan ekstrasel. Pada kelompok perlakuan 1 (netrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 50%), dan kelompok perlakuan 2 (netrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 100%) terjadi penurunan indeks adhesi dari P.gingivalis, serta netrofil mayoritas dalam keadaan masih utuh. Indeks adhesi yang paling rendah tampak pada kelompok dengan inkubasi ekstrak konsentrasi 100%. Pada penelitian kali ini perlu ditekankan bahwa konsentrasi ekstrak kelopak bunga Rosella yang diberikan pada kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2, yaitu masing-masing 50% dan 100% adalah konsentrasi saat pemberian pertama kali pada petridish Sedangkan konsentrasi final setelah dilakukan penambahan media dan suspensi P.gingivalis, didapatkan konsentrasi ± 3,12% untuk kelompok perlakuan 1, dan ± 6,25% untuk kelompok perlakuan 2. Konsentrasi ekstrak Rosella ini diketahui masih terlalu tinggi, karena menyebabkan warna netrofil menjadi terlalu merah dan inti menjadi tidak tampak. Namun, konsentrasi Rosella yang tinggi ini terbukti tidak berpengaruh terhadap aktifitas netrofil. Hal ini diketahui berdasarkan uji viabilitas
39
yang dilakukan. Netrofil tetap hidup (viable) walau telah diinkubasi ekstrak Rosella konsentrasi 50% dan 100% (Gambar 4.7).
(a)
(b)
Gambar 4.7 Hasil uji viabilitas netrofil. Tampak netrofil (tanda panah) yang diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 50% (a) dan konsetrasi 100% (b) tetap dalam keadaan hidup (tampak bening)
Mekanisme ekstrak kelopak bunga Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P.gingivalis pada netrofil diduga melalui kandungan flavonoid maupun Vitamin C yang cukup tinggi di didalamnya. Kandungan penting yang terdapat pada kelopak bunga Rosella adalah pigmen antosianin yang membentuk flavonoid yang juga berperan sebagai antioksidan. Flavonoid rosela terdiri dari flavonols dan pigmen antosianin. Pigmen antosianin ini yang membentuk warna ungu kemerahan di kelopak bunga Rosella. Semakin pekat warna kemerahan pada bunga Rosella, maka semakin tinggi pula kandungan antosianin di dalamnya (Usman,2010). Kelopak bunga Rosella yang dikeringkan lalu diencerkan dalam 300 ml air maka akan terkandung dalam larutan itu 51% antosianin (Muardi,2009). Kandungan flavonoid yang tinggi inilah yang diduga mampu menghambat perlekatan bakteri (Hamsafir, 2010). Hal tersebut telah dapat dibuktikan melalui penelitian ini yaitu adhesi P. gingivalis pada netrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella tampak menurun dibandingkan pada netrofil yang tidak diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella.
40
Porphyromonas gingivalis adalah bakteri utama penyebab periodontitis kronis. Kandungan LPS pada dinding sel bakteri ini merangsang produksi derivat enzim dari host, sitokin, dan pergerakan mediator inflamasi termasuk netrofil, yang menyebabkan kerusakan jaringan pendukung. Reaksi inflamasi ini sebenarnya diaktifkan untuk menahan penyebaran proses penyakit, akan tetapi selain efek yang menguntungkan ini, proses inflamasi juga memiliki komponen yang merusak. Oleh karena itu, perawatan ditujukan untuk meningkatkan aspek inflamasi yang menguntungkan dan menekan atau mengandalikan proses inflamasi yang merusak (Gaw,2002). Kandungan flavonoid dalam ektrak kelopak bunga Rosella memiliki efek antiinflamasi dengan cara mengikat protein dan menurunkan hidrofobisitas pada membran sel inang dan bakteri (Hamsafir, 2010). Porphyromonas gingivalis memiliki fimbriae dan hemaglutinin yang berfungsi sebagai hidrofobin yang bertanggung jawab terhadap interaksi bakteri dengan protein pada membran netrofil yang relatif hidrofob melalui interaksi hidrofobik. Flavonoid dalam ekstrak Rosella dapat menurunkan hidrofobisitas tersebut, sehingga menurunkan adhesi P. gingivalis pada netrofil. Selain itu, kandungan antosianin dan vitamin C sebagai antioksidan yang cukup tinggi pada ekstrak Rosella terbukti berperan dalam menghambat adhesi lekosit dengan cara menghambat pelepasan dari ICAM-1 pada sel endotel. Antioksidan ini juga dapat menghambat ekspresi protein adhesi yaitu integrin 1 dan 2 pada lekosit dan menghambat perlekatannya pada endotel dan sel lain (Khusnan dan Salasia, 2006; Sukandar, 2006). Diduga mekanisme ini juga dapat menghambat adhesi P.gingivalis pada netrofil. Pada beberapa penelitian secara in vivo maupun in vitro
menunjukkan
bahwa
flavonoid
memiliki
aktivitas
biologis
maupun
farmakologis, antara lain bersifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antikarsinogen, antioksidan, dan melindungi pembuluh darah (Sabir, 2003). Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom (Bryan dan Wilson dalam Sabir, 2003). Mekanisme lainnya yaitu flavonoid bersifat
41
antibakteri karena flavonoid melepaskan energi transduksi terhadap membran sitoplasma bakteri dan menghambat motilitas dari bakteri (Mirzoeva et al .,1997). Berdasarkan hasil penelitian yang didapatkan, kandungan flavonoid dalam kelopak bunga Rosella memiliki banyak manfaat dalam bidang kedokteran gigi terutama pada bidang Periodontologi yaitu Rosella dapat dimanfaatkan dan dikembangkan sebagai alternatif obat antiinflamasi topikal atau obat kumur yang sekaligus berperan sebagai antibiotik untuk penderita periodontitis. Dengan demikian diharapkan pertumbuhan P. gingivalis dapat ditekan dengan mekanisme bakterisidal, namun kerusakan jaringan yang terjadi akibat proses inflamasi bisa lebih terkendali, melalui pengendalian aktifitas netrofil. Penggunaan bahan yang memiliki efek antiinflamasi dan antibakteri sekaligus dalam satu formulasi efektif dalam mempercepat proses penyembuhan luka. Hal ini disebabkan karena sifat antiinflamasi dapat meringankan proses fagositosis dan bahan yang memiliki sifat anti bakteri dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga dapat meminimalisir infeksi sekunder yang menghambat penyembuhan luka (Robbins & Kumar, 1995).
42
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat ditarik
kesimpulan bahwa pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi Porphyromonas gingivalis pada netrofil.
5.2
Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efek ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap respon netrofil terhadap mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efektifitas ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap respon netrofil terhadap mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut dengan metode pengekstrakan kering. 3. Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut mengenai aplikasi ekstrak kelopak bunga Rosella sebagai obat topikal dan obat kumur pada penderita penyakit periodontal. 4. Perlu dilakukan perbaikan untuk penelitian lebih lanjut tentang penggunaan konsentrasi suspensi P.gingivalis dan juga kemungkinan efek sitotoksik ekstrak Rosella konsentrasi tinggi terhadap jaringan.
43
DAFTAR PUSTAKA
Adhikari, Francis, Schutzki, Chandra, dan Nair. 2005. Quantification and characterisation of cyclo-oxygenase and lipid peroxidation inhibitory anthocyanins in fruits of Amelanchier. Phytochem Anal. Vol.16(3): 80-175 Amanda, L. 2010. Sistem Adhesi Kedokteran www.repository.usu.ac.id. [28 April 2011].
Gigi.
[online].
Baratawidjaja, K.G. 1996. Imunologi Dasar. Edisi ketiga. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Hal:9-47 Bellanti, JA. 1993. Imunologi III. Terjemahan oleh A. Samik Wahab. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Hal:18-39 BSN Medical. Tanpa Tahun. Cutimed Sorbact. [online]. http://www.cutimedsorbact.com/Indonesia/faq.htm [ 18 Mei 2011] Carranza, Newman, Takei, dan Klokkevold. 2006. Clinical Periodontoligy. 10th edition. Philadelphia: WB Saunders. Hal: 132 Dorland. 2002. Kamus Kedokteran Edisi 29. Jakarta : EGC. Hal: 37 Faridasari, R.D., dan Mulyantini, S. 2009. Pengeringan Kelopak Bunga Rosella Menggunakan Tray Dryer. Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro. Firman,B. 2007. “Perbandingan Pengaruh Sevofluran dan Isofluran Terhadap Jumlah Neutrofil Polimorfonuklear Darah Tepi”. Tesis. Semarang: Program Pasca Sarjana Magister Ilmu Biomedik dan Pendidikan Dokter Spesialis I Anestesiologi Universitas Diponegoro.
Galvano, Fauci, Vitaglione, Fogliano, Vanella dan Felgines. 2007. Bioavailability, antioxidant and biological properties of the natural free-radical scavengers cyanidin and related glycosides. Ann Ist Super Sanit. Vol. 43 (4): 382-393
44
Gaw, Mc. 2002. Periodontal Disease and Preterm Delivery of Low Birth Weight Infants. J Can Dent Assoc. Vol. 68(3): 165-9 Grossman IL, Oliet S, Rio CED. 1995. Ilmu Endodontik dalam Praktik. Ed.11. Jakarta : EGC.Hal: 128 Guyton, A. C., dan Hall, J.E. 2007. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 11. Cetakan I. Terjemahan Irawan S, K. A. Tragedi,dan A. Santos. 1997. Jakarta : EGC. Hal: 452-457 Hamsafir, E. 2010. Teh Dapat Menghambat Pembentukan Karies Gigi. [serial online].http://www.infogigi.com/kesehatan-gigi/teh-dapat-menghambatpembentukan-karies-gigi.html. [1 Juni 2011] Hasibuan, S., Mardiah, dan Saptuti. 2010. Aplikasi Pewarna Alami Antosianin Dari Kelopak Rosela Pada Produk Yoghurt Dalam Rangka Penganekaragaman Produk Pangan Fungsional. Bogor: Fakultas Agribisnis dan Teknologi Pangan Universitas Djuanda Info
Fisioterapi. 2011. Kandungan dan Manfaat Rosella. [online]. http://www.infofisioterapi.com/kandungan-dan-manfaat-rosella.html [13 Februari 2011]
Iriano, A. 2008. ”Efek Antibakteri Aloe Vera Terhadap Porphyromonas gingivalis In Vitro (Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Infundasi)”. Tidak Diterbitkan. Skripsi. Jakarta: Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia. Jacques, M dan Paradis, S.E. 2006. Adhesin–receptor interactions in Pasteurellaceae. [serial online]. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.15746976.1998.tb00360.x/abstract. [20 Juli 2011] Jawetz, Melnick, dan Adelberg, 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: EGC. Hal: 92 Khusnan & Salasia, S. I. 2006. Adesi Pada Sel Epitel, Aglutinasi Eritrosit Terhadap Staphylococcus aureus: Kajian Hidrofobisitas In Vitro. J. Sain Vet. Vol. 24(1): 102-109 Mahadevan, N., Shivali and Pradeep kamboj.. 2009. Hibiscus sabdariffa Linn. –An overview. Natural product Radiance. Vol. 8 (1): 77-83.
45
MicrobeWiki. 2008. [Online] Porphyromonas.http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Porphyromonas.[ 27 April 2011 ] Mirzoeva OK, Grishanin RN, Calder PC .1997. Antimicrobial action of propolis and some of its components: the effects on growth membrane potential and motility of bacteria. Microbiol Res. Vol.152 (3): 239-246. Muardi, D. 2009. Rosella, Cantik Penuh Manfaat. [serial online]. http://www.ummionline.com/artikel-19-rosella-cantik-penuh-manfaat.html. [11 Januari 2012]
Mukhtar, T. 2010. Manfaat Teh Rosella. [online]. http://tehape09usk.blogspot.com/2010/11/manfaat-teh-rosela.html. [27 April 2011] Richard, JL., dan Howard, FJ. 1998. Life Below The Gum Line : Pathogenic Mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol Miol Biol Rev. Vol.62 (4) : 1244-1263 Rossi, Serraino , Dugo , Di Paola, Mondello ,Genovese, Morabito, Sautebin , Caputi , Cuzzocrea . 2003. Protective effects of anthocyanins from blackberry in a rat model of acute lung inflammation. Free Radic Res. Vol.37 (8):891-900. Robbins, S.L., dan Kumar, V. 1995. Buku ajar patologi I (4th ed.) (Staf pengajar laboratorium patologi anatomik FK UI, penerjemah). Jakarta: EGC. Hal: 191244 Sabir,A. 2003. Pemanfaatan flavonoid di Bidang Kedokteran Gigi. Maj.KG Dental Journal Edisi Khusus Temu Ilmiah Nasional III. Vol.38 (3):135-141 Santosaningsih, D. 2004. “Peranan Protein Fimbriae dan Lipopolisakarida Terhadap Perlekatan Bakteri Enterohemorrhagic Escherichia Coli (EHEC) O157 Pada Enterosit Kelinci Secara Invitro : Penelitian Eksperimental Laboratoris”. Tesis. Surabaya: Program Pascasarjana Universitas Airlangga Septiana, Dwiyanti, Muchtadi, Zakaria. 2006. Penghambatan Oksidasi LDL dan Akumulasi Kolesterol Pada Makrofag oleh Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. Vol.XVII (3) : 221226
46
Shafie, F. M. 2011.”Hubungan Radikal Bebas dan Antioksidan Terhadap Penyakit Periodontal”. Skripsi. Medan: Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatra Utara. Shuter, J., Hatcher, V.B., Lowy, F.D., 1996. Staphylococcus aureus binding to human nasal mucin. Infect Immun. Vol.64(1): 310-318 Siqueira, J. F & Rocas, I. N. 2007. Bacterial Pathogenesis and Mediators in Apical Periodontitis. Brazillian Dental Journal. Vol. 18(4) Siregar, Y. D & Nurlela. 2011. Ekstraksi dan Uji Stabilitas Warna Alami dari Bunga Kembang Sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L.) dan Bunga Rosela (Hibiscus sabdariffa L.). Valensi. Vol. 2(3): 459-467 Sukandar, E. 2006. Stress Oksidatif Sebagai Faktor Resiko Penyakit Kardiovaskular Pada Penyakit Ginjal Kronis Tahap 1 sampai 4. Majalah Farmacia. Vol. 6(1): 64 Susanti, R., & Rahayuningsih, M. 2003. Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Sapi di Jawa Tengah dengan Teknik Acridine Orange Fluorescence. Berkas Penelitian Hayati Susilawati, IDA. 2008. ”Induksi Porphyromonas gingivalis terhadap Aktivitas Kolagenolisis Netrofil pada Kolagen Tipe IV (Studi in vitro Mekanisme Kolagenolisis Plak Aterosklerotik”. Disertasi. Malang: Program Doktor Ilmu Kedokteran Universitas Brawijaya Tihnulat, A.N. 2009. ”Efek Bawang Putih (Allium sativatum) dan Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.) Terhadap Jumlah Neutrofil Pada Tikus Yang Diberi Suplemen Kuning Telur”. Skripsi. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Usman, D. 2010. ”Karakteristik Dan Aktivitas Antioksidan Bunga Rosella Kering (Hibiscus sabdariffa L.)”. Skripsi. Surabaya: Fakultas Teknologi Industri Universitas Pembangunan Nasional ”Veteran” Jawa Timur. Vachani, C. 2006. Neutropenia. [online]. http://www.oncolink.org/coping/article.cfm?c=5&s=22&ss=167&id=968 [27 April 2011]
47
Wahyudi. 2007. Adesi dan Aktifitas Fagositosis Sel Polimorfonuklear Terhadap Staphylococcus aureus Asal Susu Sapi Perah dan Manusia yang Bersifat Multiresisten Terhadap Antibiotik. [online]. http://yudhiekh.web.ugm.ac.id/?p=7 [27 April 2011]
Wibawan, Lammer, Lautrou, Warsa. 1992 Serotyping and Further Characterization of Group B Streptococcal Isolates From Indonesia. Zentralbl Bakteriol. Vol.277(2): 260-266 . Wijayanti, D.A. 2011. “Efektifitas Ekstrak Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa) Terhadap Penurunan Jumlah Sel Polymorfonuclear Neutrofil (PMN) Pada Periodontitis Eksperimental Tikus Wistar”. Skripsi. Jember: Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember Wijayanti, P.J. 2008. “Karakterisasi Protein Adhesin OMP (Outer Membran Protein) 66,29 kDa Aeromonas salmonicida Terhadap Sel Epitel Usus Ikan Mas (cyprinus carpio l)”. Skripsi. Malang : Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya. Yanuhar, U. Tanpa Tahun. Analisis Protein Adhesin Bakteri Pseudomonas aeruginosa Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio). Jurnal Penelitian Perikanan Universitas Brawijaya. Vol. III : 36-41
48
LAMPIRAN
Lampiran A. Hasil Perhitungan Rata-Rata Adhesi P. gingivalis pada Neutrofil
NO
KONTROL
PERLAKUAN 1 (50%)
PERLAKUAN 2 (100%)
1
2
1
2
1
2
1
7
12
6
6
3
3
2
10
6
5
8
4
2
3
6
11
5
5
4
5
4
9
8
7
7
2
5
5
6
6
8
8
1
2
6
7
10
4
4
3
4
7
8
12
9
7
4
2
8
5
7
8
5
3
3
9
5
7
6
7
5
5
10
10
11
7
7
5
5
11
11
10
8
6
3
5
12
6
13
5
9
3
3
13
7
13
5
4
3
4
14
8
6
6
4
5
4
15
7
7
5
5
5
2
16
8
10
7
5
7
5
17
9
8
6
6
4
4
18
6
8
5
4
2
4
19
9
11
8
9
2
4
20
8
10
4
6
3
5
21
8
9
7
7
1
2
22
5
10
9
8
2
4
23
11
12
7
5
5
4
24
7
5
6
7
2
7
49
25
7
9
5
5
4
2
26
6
11
7
4
3
2
27
7
10
6
9
4
3
28
8
10
6
8
5
6
29
5
8
4
5
4
4
30
7
13
7
6
5
5
31
7
7
5
9
5
4
32
6
11
7
7
2
3
33
10
10
8
6
6
3
34
6
10
6
8
3
5
35
8
8
8
4
1
4
36
9
12
9
3
3
2
37
7
10
5
4
2
7
38
9
10
10
6
3
4
39
7
8
7
6
1
6
40
5
8
5
5
6
3
41
12
10
6
7
3
6
42
7
13
6
4
1
4
43
5
14
6
4
3
1
44
7
8
5
7
4
1
45
9
7
4
7
5
5
46
11
8
6
6
3
4
47
9
12
4
4
1
4
48
9
7
6
4
3
1
49
5
6
6
7
3
4
50
14
9
4
4
2
3
51
9
9
5
6
5
7
52
5
8
6
6
3
6
53
10
9
8
7
4
3
54
6
10
5
8
2
6
50
55
7
8
8
6
4
5
56
11
13
8
8
4
3
57
9
8
6
5
2
4
58
9
12
6
6
2
3
59
11
10
6
5
6
4
60
12
8
8
5
4
3
61
7
8
7
5
3
2
62
12
10
7
8
6
5
63
8
7
4
6
2
0
64
8
7
9
4
2
3
65
9
9
7
4
4
5
66
8
6
7
6
5
4
67
6
7
5
8
4
5
68
5
10
7
5
4
5
69
5
12
7
6
5
3
70
12
6
6
3
3
3
71
12
11
5
6
3
2
72
10
8
5
5
2
4
73
12
6
4
6
3
3
74
13
9
8
4
3
4
75
14
10
5
6
1
4
76
14
11
6
3
2
1
77
13
7
6
3
3
3
78
10
6
4
4
2
7
79
14
8
5
6
4
1
80
7
7
6
7
2
4
81
9
8
8
5
3
3
82
13
5
6
5
0
3
83
8
11
6
7
3
5
84
10
13
6
5
2
3
51
85
9
7
5
5
3
4
86
7
7
4
5
3
4
87
6
9
4
6
3
4
88
7
9
5
7
3
4
89
10
9
6
5
1
4
90
4
5
4
6
3
6
91
6
11
6
5
3
4
92
6
11
5
8
3
3
93
4
12
5
6
2
2
94
4
5
5
4
4
2
95
12
10
5
7
2
5
96
6
7
7
5
4
4
97
6
10
6
7
4
3
98
5
9
8
4
3
2
99
8
7
7
7
4
5
100
6
6
5
3
5
total
819
6 902
rata-rata = 8,29
611 579 rata-rata = 5,54
321 376 rata-rata = 3,40
52
Lampiran B. Analisis Data Penelitian
B1. Deskriptif Data Penelitian
Descriptives jumlah 95% Confidence Interval for Mean
N
Mean
Std.
Std.
Lower
Upper
Deviation
Error
Bound
Bound
Minimum Maximum
KONTROL
150
8.2933
1.59927
.13058
8.0353
8.5514
6.00
11.00
ROSELLA
150
5.5467
1.00727
.08224
5.3842
5.7092
4.00
7.00
150
3.4067
1.03039
.08413
3.2404
3.5729
2.00
5.00
450
5.7489
2.35522
.11103
5.5307
5.9671
2.00
11.00
50% ROSELLA 100% Total
B2. Uji Normalitas
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test kelompok N Normal Parameters
a,,b
Most Extreme Differences
Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)
Jumlah
450
450
Mean
2.0000
5.9600
Std. Deviation
.81923
2.65431
Absolute
.222
.101
Positive
.222
.101
Negative
-.222
-.092
2.722
1.239
.000
.093
53
a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
B3. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances Jumlah Levene Statistic 2.618
df1
df2 2
Sig. 147
.076
B4. Uji One Way Anova ANOVA jumlah Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
1800.164
2
900.082
690.460
447
1.545
2490.624
449
F 582.708
Sig. .000
54
B5. Uji Lanjut LSD
Multiple Comparisons jumlah LSD 95% Confidence Interval
Mean (I) kelompok
(J) kelompok
KONTROL
ROSELLA 50%
2.74667
*
.14351
.000
2.4646
3.0287
ROSELLA 100%
4.88667
*
.14351
.000
4.6046
5.1687
-2.74667
*
.14351
.000
-3.0287
-2.4646
2.14000
*
.14351
.000
1.8580
2.4220
-4.88667
*
.14351
.000
-5.1687
-4.6046
-2.14000
*
.14351
.000
-2.4220
-1.8580
ROSELLA 50% KONTROL ROSELLA 100% ROSELLA 100% KONTROL ROSELLA 50%
Difference (I-J) Std. Error
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Sig.
Lower Bound Upper Bound
55
Lampiran C. Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kelopak Rosella
C.1
Alat Pembuatan Ekstrak Rosella
A
D
Keterangan : A. Oven B. Blender C. Shaker Bath D. Vakum Penyaring E. Rotary Evaporator
B
E
C
56
C.2
Bahan Pembuatan Ekstrak Rosella
A
B
Keterangan : A. Kelopak bunga Rosella kering (merek “Bunga Rosella Mesir de Carcade”) B. Etanol 97%
57
Lampiran D. Alat dan Bahan Subkultur P. gingivalis
D.1
Alat Subkultur P. gingivalis
A
B
C
E
D
F
Keterangan : A. Neraca timbangan
E. Petridish
B. Tabung Erlenmeyer
F. Desicator
C. Kompor listrik
G. Densicheck
D. Autoclave
G
58
D.2
Bahan Subkultur P. gingivalis
A
D
B
C
E
Keterangan : A. Brain Heart Infusion – Agar (BHI- A) B. Yeast extract C. Vitamin K1 D. Hemin Chloride E. Aquadest steril F. Brain Heart Infusion – Broth (BHI-B)
F
59
Lampiran E. Alat dan Bahan Penelitian Uji Adhesi
E.1
Alat Penelitian Uji Indeks Adhesi
A
C
D
Keterangan : A. Oven B. Laminar flow C. Tourniquet D. Syringe E. Haemocytometer
B
E
60
F
G
H
Keterangan : F. Tabung Falcon G. Centrifuge H. Pipet Mikro I. Vortex
I
61
J
L
Keterangan : J. Coverslip K. Petridish kecil L. Shaker Incubator M. Mikroskop Inverted
K
M
62
D.2
Bahan Penelitian Uji Indeks Adhesi
A
B
E
C
F
Keterangan : A. Darah vena perifer B. Tabung Heparin C. Hank’s Balance Salt Solution (HBSS) D. Ficoll Hystopaque-1077 E. Dextran F. Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) G. Ekstrak kelopak bunga Rosella
D
G
63
H
K
Keterangan : H. Aquadest steril I. Suspensi P. gingivalis J. CO2 K. Metanol Absolut L. Cat Giemsa
I
L
J
ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NETROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.)
SKRIPSI
Diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan Program Studi Kedokteran Gigi (S1) dan mencapai gelar Sarjana Kedokteran Gigi
Oleh: Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025
BAGIAN PERIODONSIA FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS JEMBER 2012
PERSEMBAHAN
Skripsi ini saya persembahkan untuk:
1. Allah SWT . Pemilik segala makhluk. Segala puji tercurah padaMu. Terimakasih atas rahmat yang Engkau limpahkan selama ini, atas pertolongan dan perlindungan dalam setiap langkah, Engkaulah penuntunku dan tidak ada satupun kemudahan apabila bukan atas kehendakMu. 2. Kedua orangtuaku, Ayahanda Ir. Redy Tri Santoso, MT., dan Ibunda Nunuk Dyah Prihartini. 3. Kakak-kakakku, dr. Erdy Kuswandana, dan dr. Galih Manggala Mahardika 4. Almamater Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Semoga skripsi ini bermanfaat khususnya di bidang Periodonsia.
MOTTO
Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antaramu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. Dan Allah Maha Mengetahui apa yang kamu kerjakan (terjemahan Surat Al-Mujaadilah ayat 11)*)
Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai (dari sesuatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain dan hanya kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap (terjemahan Surat Al-Insyirah 94:5-8)*)
*)
Departemen Agama Republik Indonesia. 2005. AL-JUMANATUL ’ALI Al-Quran dan
Terjemahannya. Bandung: CV. Penerbit J-ART
PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: nama : Lila Cita Pratiwi NIM
: 081610101025
menyatakan dengan sesungguhnya bahwa karya tulis ilmiah yang berjudul ”Adhesi Porphyromonas gingivalis Pada Netrofil Yang Diinkubasi Ekstrak Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.)” adalah benar-benar hasil karya sendiri, kecuali kutipan yang saya sebutkan sumbernya dan belum pernah diajukan pada institusi manapun, dan bukan karya jiplakan. Saya bertanggung jawab atas keabsahan dan kebenaran isinya sesuai dengan sikap ilmiah yang harus dijunjung tinggi. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya, tanpa adanya tekanan dan paksaan dari pihak manapun serta bersedia mendapat sanksi akademik jika ternyata di kemudian hari pernyataan ini tidak benar.
Jember, 9 Februari 2012 Yang menyatakan,
Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025
SKRIPSI
ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NETROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.)
Oleh: Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025
Pembimbing:
Dosen Pembimbing Utama
: Dr. drg. IDA Susilawati, M.Kes.
Dosen Pembimbing Anggota
: drg. Desi Sandra Sari, MD.Sc
PENGESAHAN Skripsi berjudul ”Adhesi Porphyromonas gingivalis Pada Netrofil Yang Diinkubasi Ekstrak Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.)” telah diuji dan disahkan pada: hari, tanggal
: Kamis, 9 Februari 2012
tempat
: Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
Tim Penguji Ketua
Dr. drg. IDA Susilawati, M.Kes NIP 196109031986022001
Anggota I,
Anggota II,
drg. Desi Sandra Sari, MD.Sc NIP 197512152003122005
drg. Melok Aris. W, M.Kes. Sp.Perio. NIP. 197104092005012002
Mengesahkan, Dekan,
drg. Hj. Herniyati, M. Kes NIP : 195909061985032001
RINGKASAN
Adhesi Porphyromonas gingivalis Pada Netrofil Yang Diinkubasi Ekstrak Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.); Lila Cita Pratiwi, 081610101025; 2012: 42 halaman; Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Tahap awal dari respon inflamasi terhadap infeksi bakteri adalah proses adhesi berupa perlekatan bakteri pada sel-sel inflamatori netrofil. Salah satu bakteri yang banyak ditemukan pada kasus periodontitis kronis adalah Porphyromonas gingivalis. Bakteri ini dapat menghasilkan produk metabolit yang bersifat racun terhadap jaringan gingiva pada manusia sehingga menimbulkan reaksi inflamasi yang pada awalnya diperankan oleh netrofil. Netrofil dapat memfagositosis 3 sampai 20 bakteri sebelum sel itu menjadi inaktif dan lisis. Perusakan netrofil menyebabkan terjadinya pelepasan mediator inflamasi serta enzim-enzim yang mengakibatkan lisisnya jaringan. Apabila respon berlangsung terus-menerus, bisa berlanjut hingga terjadi penurunan fungsi jaringan periodontal. Oleh karena itu inflamasi harus dikontrol, salah satunya dapat melalui pengendalian aktifitas netrofil. Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) telah diketahui memiliki banyak manfaat untuk kesehatan. Kandungan flavonoid dalam Rosella diketahui memiliki efek antiinflamasi. Oleh karena itu patut diduga Rosella dapat dimanfaatkan untuk menghambat aktifitas netrofil pada infeksi P.gingivalis, salah satunya diduga melalui cara inhibisi adhesi P. gingivalis pada netrofil. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P. gingivalis pada netrofil. Penelitian ini merupakan eksperimental laboratoris in vitro. Rancangan penelitian menggunakan post test only control group design. Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 di Laboratorium Biomedik Bagian Mikrobiologi dan Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Jember. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jember. Ekstrak kelopak bunga Rosella didapatkan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 97%. Kultur P. gingivalis dilakukan dalam medium Brain Heart Infusion (BHI) yang diperkaya dengan vitamin K1 dan hemin, pada atmosfir anaerob selama 3x24 jam. Isolasi netrofil dilakukan
dengan
teknik
gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation. Uji indeks adhesi dilakukan pada isolat netrofil yang diinkubasi dengan ekstrak kelopak bunga Rosella dengan perbandingan 20:1. Penelitian dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu kelompok netrofil yang diinkubasi ekstrak Rosella 50%, kelompok netrofil yang diinkubasi ekstrak Rosella 100%, dan kelompok kontrol adalah netrofil yang diinkubasi dengan larutan Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Kemudian ketiga kelompok dipapar dengan P.gingivalis. Perhitungan indeks adhesi dilakukan dengan cara menghitung P. gingivalis yang menempel per netrofil sampai 100 netrofil dengan dua kali pengulangan. Hasil penelitian menunjukkan netrofil yang diinkubasi ekstrak Rosella, secara signifikan (p< 0.05) mengadhesi P. gingivalis lebih sedikit dibandingkan dengan netrofil yang tidak diinkubasi ekstrak Rosella. Netrofil yang diinkubasi ekstrak Rosella konsentrasi 100% mengadhesi P. gingivalis dengan jumlah paling sedikit dibandingkan dengan netrofil yang diinkubasi ekstrak Rosella 50% dan kontrol. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi P. gingivalis pada netrofil. Perlu penelitian lebih lanjut tentang efek ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap respon netrofil pada mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut. Dalam bidang Periodontologi perlu adanya penelitian mengenai aplikasi ekstrak kelopak bunga Rosella sebagai obat topikal dan obat kumur pada penderita penyakit periodontal. Selain itu diperlukan pula perbaikan pada penelitian lebih lanjut tentang konsentrasi suspensi P.gingivalis dan juga kemungkinan efek sitotoksik ekstrak Rosella konsentrasi tinggi terhadap jaringan.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Adhesi Porphyromonas gingivalis Pada Netrofil Yang Diinkubasi Ekstrak Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menyelesaikan pendidikan strata satu (S1) pada Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan terimakasih kepada: 1. drg. Hj. Herniyati, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember 2. drg. R. Rahardyan Parnaadji, M.Kes., Sp.Prost., selaku Pembantu Dekan I Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember; 3. drg. Agus Sumono, M.Kes., selaku Pembantu Dekan II Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember; 4. drg. Happy Harmono, M.Kes., selaku Pembantu Dekan III Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember; 5. Dr. drg. IDA Susilawati, M.Kes., selaku Dosen Pembimbing Utama, dan yang menyertakan penulis dalam proyek RISBIN IPTEKDOK, atas waktu yang telah diluangkan dalam memberikan bimbingan, saran, fasilitas, dan motivasi dengan penuh kesabaran sehingga skripsi ini dapat terselesaikan; 6. drg. Desi Sandra Sari, MD. Sc., selaku Dosen Pembimbing Anggota yang telah memberikan bimbingan, saran dan motivasi dengan penuh kesabaran sehingga skripsi ini dapat terselesaikan; 7. drg. Melok Aris Wahyukundari, M.Kes.,Sp.Perio., selaku Sekretaris Penguji yang telah memberikan saran demi kesempurnaan skripsi ini; 8. drg. Muhammad Nurul Amin, M.Kes., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah memberikan nasihat dan motivasi selama penulis menjadi mahasiswa;
9. Ayahanda Ir. Redy Tri Santoso, MT., dan Ibunda Nunuk Dyah Prihartini tercinta, terimakasih untuk kasih sayang tanpa batas, semangat yang tak pernah henti, doa, serta semua yang Ayahanda dan Ibunda berikan demi kelancaran pendidikanku; 10. Kedua kakak laki-lakiku dr. Erdy dan dr. Galih, terimakasih untuk semangat dan keceriaan di rumah yang selalu kalian berikan; 11. Nugroho Ardyta Kusuma, terimakasih untuk waktu yang selalu kamu luangkan hanya untuk mendengar keluh kesah, memberikan semangat, doa, dan motivasi setiap saat; 12. Sahabat-sahabatku Arum dan Amel, kehadiran kalian bertanggung jawab atas semua keceriaan dan tawa dimanapun kita berada. Terimakasih untuk semangatnya; 13. Novema Yolanda, sebagai partner penelitian dan teman seperjuangan, terimakasih untuk bantuan, dan semangatnya; 14. Teman-teman kelompok KKT desa Mojomulyo, Timpugyo, Ayung, Arum, Rere, Ratih, Novema, Wiwik, Laura, Fuad, Farid, Jefri, dan Armando, terimakasih untuk doa dan semangatnya; 15. Teman-teman, kakak-kakak, serta adik-adik kos biru; 16. Seluruh staf, pengajar, dan karyawan FKG Universitas Jember; 17. Semua pihak yang terlibat baik langsung maupun tidak langsung yang membantu dalam penyelesaian skripsi ini. Penulis menyadari masih ada ketidaksempurnaan dan kekurangan dalam penulisan skripsi ini, untuk itu kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan selanjutnya. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat. Amin.
Jember, 9 Februari 2012
Penulis
