A limfociták effektor funkcióinak szabályozása: Szteroid membránlipidek és hormonok szerepe

A limfociták effektor funkcióinak szabályozása: Szteroid membránlipidek és hormonok szerepe doktori értekezés

Készítette:

Espárné Schneider Andrea

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológia Doktori Iskola Immunológia Program

Programvezető:

Prof. Dr. Erdei Anna tanszékvezető egyetemi tanár PhD, DSc Témavezető:

Dr. Matkó János egyetemi tanár PhD, DSc

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Immunológiai Tanszék Budapest, 2014.

Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék……………………………………………………………………………5 1. Irodalmi áttekintés……………………………………………………………………..7 1.1.

Bevezetés……………………………………………………………………………7

1.2. A neuro-immuno-endokrin rendszerek hálózata……………………………………7 1.2.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengely…………………………………...9 1.2.2. Nemi dimorfizmus az autoimmunitás tükrében…………………………………...11 1.2.3. A terhesség és a mögötte húzódó hormonális változások hatása az immunrendszerre…………………………………………………………………..15 1.2.4. A női nemi ciklus és a menopauza immunológiai vonatkozásai…………………..15 1.3. Az ösztrogén receptorok és a hozzájuk kapcsolódó biológiai funkciók…………...17 1.3.1. Ösztrogén típusok………………………………………………………………….17 1.3.2. Klasszikus ösztrogén receptorok és a genomiális út................................................19 1.3.3. Membrán ösztrogén receptor és a nem-genomiális út……………………………..20 1.3.4. GPR30 - egy nemrégen leírt ösztrogén receptor…………………………………..24 1.3.5. A nemi hormonok biológiai aktivitását és hozzáférhetőségét meghatározó plazmafehérjék…………………………………………………………………….24 2. Célkitűzések…………………………………………………………………………...28 3. A kísérletek során alkalmazott anyagok és módszerek……………………………..30 3.1. Sejttípusok…………………………………………………………………………30 3.2. Tápoldatok, pufferek, oldatok……………………………………………………..30 3.3. Reagensek, festékek, ellenanyagok………………………………………………..31 3.4. Módszerek…………………………………………………………………………34 3.4.1. Lépsejtek és timociták izolálása, T- és B-sejtek szeparálása……………………..34 3.4.2. BSA jelölése FITC-cel……………………………………………………………34 3.4.3. E2-BSA-FITC és BSA-FITC ultraszűrése………………………………………..35 3.4.4. Áramlási citofluorimetriával végzett vizsgálatok………………………………....36 Plazmamembrán ösztrogénreceptorok detektálása E2-BSA-FITC-cel………....36 E2 ösztradiol és E2-BSA-FITC közötti kompetitív kötődési vizsgálat………….36 A plazmamembrán koleszterin depléciójának E2-BSA-FITC kötődésre kifejtett hatásának vizsgálata……………………………………………………………37 A plazmamembrán Brij98, gyenge nem-ionos detergenssel való kezelése……...37 A mER internalizációjának vizsgálata………………………………………….37 A mER reciklizációjának vizsgálata……………………………………………37 A klasszikus ERα és ERβ, valamint a GPR30 intracelluláris expressziós szintjének vizsgálata……………………………………………………………37 2

3.4.5. Konfokális mikroszkópiával végzett vizsgálatok………………………………….38 A mER plazmamembrán lipid raftokkal való kolokalizációjának vizsgálata…...38 Az E2-BSA-FITC-mER komplex internalizációt követő lokalizációjának meghatározása………………………………………………………………….39 A klasszikus ösztrogén receptorok és a GPR30 ösztrogén függő lokalizációjának vizsgálata………………………………………………………………………………..39 Fotohalványodási kinetika mérésen alapuló Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (pbFRET) módszer…………………………………………………...40 3.4.6. Plazmamembrán szeparátum készítése…………………………………………….40 3.4.7. Ösztrogén receptorok expressziójának vizsgálata sejtlizátumban és plazmamembrán szeparátumban Western-blot technikával………………………………………….41 3.4.8. Az ösztrogén sejtproliferációra kifejtett hatásának vizsgálata H3-timidin beépüléssel………………………………………………………………………... 42 3.4.9. Immunizálás FITC-KLH-val………………………………………………………42 3.4.10. Az ösztogén antigén specifikus immunválaszra kifejtett hatásának vizsgálata in vitro sejtkultúrában……………………………………………………………….42 3.4.11. Ellenanyag termelés vizsgálata ELISA módszerrel……………………………...43 3.4.12. Egér ivari ciklus szinkronizálása hormonoltással………………………………..43 3.4.13. Bélsár és szérum minták hormonszint meghatározása…………………………...43 3.4.14. Statisztikai analízis……………………………………………………………….45 4. Eredmények…………………………………………………………………………...45 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5.

4.6. 4.7. 4.8. 4.9.

Limfociták ösztrogén specifikus membrán receptort (mER) expresszálnak a sejtfelszínükön……………………………………………………………………..45 A mER differenciált expressziót mutat hím és nőstény C57BL6 egerekből származó limfociták sejtfelszínén…………………………………………………………….47 A klasszikus citoplazmatikus ER-eknek és a GPR30-nak van plazmamembrán asszociált formája is……………………………………………………………….47 Szteroidkötő doménnel/motívummal rendelkező fehérjék keresése adatbázisból és membrán lokalizációjuk hidropátiás plot analízise………………………………..51 A mER eltérő mértékben expresszálódik a különböző limfocita és timocita sejtpopulációk felszínén, azonban az ERα és ERβ expressziója gyakorlatilag sejtpopuláció-független, a GPR30 pedig csak T sejtekben kimutatható ki………..53 Az mER és a plazmamembránhoz kapcsolt intracelluláris receptorok nagy valószínűséggel közös lipid raft mikrodoménben lokalizálódnak………………...55 Az ismert ösztrogén receptorok expressziós mintázata és lokalizációja ösztrogén függést mutat………………………………………………………………………58 Internalizáció után az E2-BSA-FITC a lizoszómákba kerül………………………66 A mER (E2-BSA) és a citoplazmatikus ösztrogén receptorok (E2) által mediált folyamatok eltérő hatással vannak a limfocita proliferációra……………………...68 3

4.10. A mER (E2-BSA) által mediált jel elősegíti a T dependens IgG izotípusú ellenanyagok termelését…………………………………………………………...69 4.11. Limfoid sejtvonalon és primer sejteken is kimutatható az SHBG (szex hormon kötő globulin) kötődése, így valószínűleg közvetett módon mER-ként is funkcionálhat………………………………………………………………………70 5. Az eredmények megvitatása………………………………………………………….74 6. Összefoglalás…………………………………………………………………………..79 7. Summary………………………………………………………………………………80 Irodalomjegyzék……………………………………………………………………......81 Köszönetnyílvánítás………………………………………………………………….....92 Közlemények jegyzéke……………………………………………………………........93 Konferencia absztraktok, előadások……………………………………………………93

4

Rövidítésjegyzék ACTH

adrenocorticotropic hormone / mellékvesekéreg serkentő hormon

BSA

bovine serum albumin / szarvasmarha szérum albumin

Btk

Bruton's tyrosine kinase / bruton tirozin kináz

Con A

concanavalin A / konkavalin A növényi lektin

CRF

corticotropin-releasing factor / kortikotrop felszabadulást serkentő faktor

CTX-B

cholera toxin subunit B / kolera toxin B alegység

Ea

ellenanyag

E1

estrone / ösztron

EEA-1

early endosome antigen-1 / korai endoszóma antigén-1

E2

17β-estradiol (estrogen) / 17β-ösztradiol (ösztrogén)

E2-BSA

estrogen-bovine serum albumin conjugate / ösztogén-szarvasmarha szérum albumin konjugátum

E3

estriol / ösztriol

ERα

estrogen receptor α / ösztrogén receptor α

ERβ

estrogen receptor β / ösztrogén receptor β

FITC

fluorescein isothiocyanate / fluoreszcein izotiocianát

FRET

Förster resonance energy transfer / Förster-féle rezonancia energia transzfer

FSH

follicle-stimulating hormone / tüsző stimuláló hormon

GH

growth hormone / növekedési hormon

GnRH

gonadotropin-releasing hormone / gonadotropin felszabadulást serkentő hormon

HCG

human chorionic gonadotrophin / humán korion gonadotrop hormon

HPA

hypothalamic-pituitary-adrenal / hipotalamusz-hipofízis- mellékvese

HPG

hypothalamic-pituitary-gonadal / hipotalamusz- hipofízis- ivarmirigy

HRP

horseradish peroxidase / tormaperoxidáz

HRT

hormone replacement therapy / hormon pótló terápia

IDDM

insulin-dependent diabetes mellitus / inzulin függő diabétesz

IL

interleukin / interleukin 5

KLH

keyhole limpet hemocyanin / tengeri csigafajból származó hemocianin

LH

luteinizing hormone / luteinizáló hormon

LIF

leukemia inhibitory factor /leukémia inhibitor faktor

LPS

lipopolysaccharide / lipopoliszacharid

MBCD

methyl-β-cyclodextrin / metil-β-ciklodextrin

mER

membrane estrogen receptor/ plazmamembrán ösztrogén receptor

MG

myasthenia gravis / miasztémia grávisz

MS

multiple sclerosis /szklerózis multiplex

P4

progesterone / progeszteron

PE

phycoerythrin / fikoeritrin

PBMC

peripheral blood mononuclear cell / periféáris mononukleáris sejtek

PFA

paraformaldehyde / paraformaldehid

PMSG

pregnant mare serum gonadotropin / terhes kanca szérum gonadotropin

RA

rheumatoid artitis / sokizületi gulladás

RIA

radioimmunassay / radioaktív immunoassay

RMF

relative mean of fluorescence / relatív átlag fluoreszcencia

SD

standard deviation / szórás

SHBG

sex hormone-binding globulin / szex hormon kötő globulin

SLE

systemic lupus erythematosus / szisztémás lupusz eritematózusz

SS

Sjörgen's syndrome / Sjörgen szindróma

SSc

systemic sclerosis / szisztémás szklerózis

TGF-β

transforming growth factor-β / transzformáló növekedési faktor-β

TM

transmembrane / transzmembrán

TSH

thyroid-stimulating hormone / pajzsmirigy stimuláló hormon

6

1. Irodalmi áttekintés 1.1 Bevezetés A biológia

és

orvostudomány előrehaladtával

az

emberiség egyre

jobban

megismerhette a szervek/szervrendszerek működését és az egyes élettani folyamatok mindinkább feltáruló molekuláris részleteit. „Diabolus in singulis est ”- mondhatni, az „ördög a részletekben lakozik”. Az igazságért azonban néha érdemes visszatekinteni a nagyobb egységek felé. Példaként említve az immunfolyamatok szabályozását, amely az immun-, endokrin- és központi idegrendszerek egymással oda-vissza ható kapcsolatai révén sokkal komplexebb, mint gondolnánk. Ismert, hogy egyes autoimmun betegségek jelentős megoszlásbeli különbséget mutatnak a nemek között. Többek között ez hívta fel a figyelmet az ösztrogén (17ösztradiol, röviden E2) immunrendszerre gyakorolt esetleges hatására. Noha tényként kezelhetjük, hogy az ösztrogén aktuális mennyisége hatással van az immunrendszerre és befolyásolja az immunválasz kimenetelét, a hatásmechanizmus részletei még korántsem tisztázottak. Ám a tért hódító hormon tartalmú orvosságok, fogamzásgátlók és hormonpótló terápiák biztonságos alkalmazása érdekében elengedhetetlen ezen folyamatok részletes megismerése.

1.2. A neuro-immuno-endokrin rendszerek hálózata Mivel az immun- és a neuroendokrin rendszernek végső soron a szervezet belső homeosztázisának fenntartása a szerepe, így nem meglepő, hogy ez a két rendszer anatómiailag és funkcionálisan is szorosan összefonódott egymással [1, 2]. Az együttes evolúció eredményeként széleskörű azon szabályozó molekuláknak a száma -szteroidok, neuropeptidek, citokinek, neurotranszmitterek - amelyekre ezek a szervrendszerek válaszolni képesek. Ráadásul nem csak szintetizálják és felszabadítják az adott mediátorokat, hanem a megfelelő receptoraikkal mind ugyanúgy képesek fiziológiásan válaszolni rá (autokrin, parakrin és endokrin módon is); ezzel biztosítva a molekuláris alapjait egy kétirányúan szabályozott kapcsolatnak [1-3]. 7

Tehát nemcsak az immunrendszer által termelt citokinek vannak hatással az neuroendokrin rendszerre, hanem az is képes citokinek termelésén keresztül visszahatni az immunrendszerre. A hipotalamuszról és/vagy az elülső hipofízisről leírták, hogy többek között interleukin- (IL-)1, IL-2, IL-6, transzformáló növekedési faktor- (TGF-β), leukémia inhibitor faktor (LIF) termelésére képesek [1]. Mindemellett több mint 20 különböző neuroendokrin hormont (ACTH, TSH, GH, prolaktin, endorfin, trijód- tironin, HCG, CRH…stb.) mutattak ki limfocitákban, granulocitákban, hízósejtekben és monoctákban fehérje és/vagy mRNS szinten [1, 4, 5]. Számos vizsgálat bizonyítja, hogy az immunsejtek maguk is képesek többféle hormon termelésére, sőt azokat tárolják és szükség esetén a megfelelő célterületen felszabadítják. Leírták pl., hogy endorfintermelő immunsejtek szaporodnak fel a gyulladásos szövetben a fájdalom csökkentése érdekében [4]. Ezenfelül az ideg- és immunrendszer közötti kapcsolatrendszert tovább árnyalja, hogy az elsődleges és másodlagos nyirokszerveknek is van szimpatikus posztganglionáris beidegződése. Egyes szövettani eredmények alapján az immunsejtek (hízósejtek, makrofágok

és

T

sejtek)

közvetlen

kapcsolatba

is

kerülhetnek

a

perifériás

idegvégződésekkel [1]. A neuroendokrin- és az immunrendszer kétirányú kapcsolata során két fő szabályozási útvonalat kell megemlítenünk: a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese (HPA) és a hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengelyt [2]. A HPA tengely különböző stresszre adott válaszként aktiválódik (pl. fertőzés, gyulladás), amelynek hatására kortikotrop termelést serkentő faktor (CRF) szabadul fel a hipotalamuszból. A CRF stimulálja a hipofízis ACTH termelését, ami végső soron a mellékvesére hatva glükokortikoid hormonok felszabadulását indukálja [1, 2, 6]. A glükokortikoidok hatékony és széleskörű immunszupresszáló képességgel bírnak (gyulladáscsökkentő hatás, gyulladásos mediátorok felszabadulását gátolják) [1], illetve immunmodulátorként befolyásolják a Th1 és Th2 citokinek termelődését [6]. Összefoglalva tehát egy túl erősen aktíválódott immunrendszer potenciálisan veszélyforrást jelenthet a saját szervezet számára, amelynek fékentartására kialakult negatív szabályozó folyamatokban a neuroendokrin rendszer is részt vesz. Továbbá elmondható, hogy az immunrendszernek szüksége van a neuroendokrin rendszer segítségére, hogy eldöntse mi a legoptimálisabb válasz az adott helyzetben. Ennek a kommunikációnak a hiánya okozhat autoimmunitást, krónikus fertőzést vagy pl. szeptikus sokkot [1]. 8

Dolgozatomban az ösztrogén és immunrendszer kapcsolatával foglalkozom, ezért a következő alfejezetekben a HPG tengelyt és a hozzá kapcsolódó immuno-endokrin ismereteket a mutatom be részletesebben.

1.2.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengely Az ideg- és immunrendszer kapcsolatát a HPA tengely vonatkozásában régóta intenzíven vizsgálják és egyre több az olyan publikáció, amely a HPG tengely immunmoduláló hatására [7, 8]. A HPG tengely (1. ábra) már jól leírt funkciója az ivarmirigyek működésének - többek között pl. a női nemi ciklus és a reprodukció szabályozása [9]. A rendszer mozgatórugója a hipotalamusz epizódikus GnRH elválasztása. Ezek az időközönként felszabaduló GnRH hormon „impulzusok” a kiváltói az adenohipofízis follikulus stimuláló hormon (FSH) és luteinizáló hormon (LH) termelésének [10]. Férfiaknál hasonló módon történik a GnRH, LH és FSH termelődése, csak a pubertás után a szintjük viszonylag állandó és a nőkben ismertekhez képest teljesen más a szerepük (az LH tesztoszteron termelést indukál a here intestinális sejtjeiben, az FSH pedig a spermatogenezisben játszik fontos szerepet) [11, 12]. Nők esetében az FSH és LH szekréciója befolyásolja a tüszőérést, az ovulációt és a petefészek hormontermelését (ösztrogén, progeszteron). Ennek a két gonadotropinnak az egyenkénti időzített felszabadulása az alapja a petefészek ciklikus működésének [9, 10]. Az FSH és LH együttesen a tüszőérést és az ösztradiol szintézisét is szabályozza [10], míg az LH a luteinizált sejtek progeszteron elválasztását stimulálja [9]. Az E2 és a progeszteron közvetlenül hatnak a nemi szervekre, illetve az E2 közvetlen visszacsatolást jelent a gonadotrop sejtek felé is [9, 10].

9

1. ábra. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely női szervezeten belüli működésének sematikus ábrázolása [10]. A hipotalmuszból epizódikusan felszabaduló GnRH hatására az adenohipofízis FSH-t és LH-t termel, amelyek a petefészekre hatva szabályozzák annak ösztrogén (E2) és progeszteron (P4) termelését. A korai follikuláris szakaszban az E2 termelődés negatív-, a késői follikuláris szakaszban pedig pozitív visszacsatolást jelent az adenohipofízis működésére.

A női nemi ciklust két szakaszra oszthatjuk: 1. Follikuláris fázis: Ennek során az E2 szintje előbb lassú, majd gyors ütemben növekszik. A korai follikuláris fázis alatt az E2 szint negatív visszacsatoló hatása eredményeként az FSH szint csökken. A késői follikuláris fázisban az E2 már pozitív visszacsatolást jelent a gonadotrop sejtek felé, az FSH szint pedig ismét emelkedik, ill. a magas legalább 48-50 órán át fenntartott ösztrogén szintnek köszönhetően bekövetkezik egy LH csúcs is, amely kiváltja az ovulációt. 2. Luteális fázis: Ekkor a progeszteron szekréciója folyamatosan és tartósan emelkedik, az LH szint pedig csökken. A progeszteron legfontosabb szerepe, hogy a méhnyálkahártyát előkészíti a megtermékenyített petesejt befogadására, ill. biztosítja a terhesség kihordását. A petefészken belül a progeszteronnak pozitív visszacsatoló hatása van: a sárgatest sejtjeiben megindítja a saját receptorának expresszióját, így tovább fokozza annak progeszteron termelését. Ez alatt a szakasz alatt az E2 egy második emelkedést mutat. A follikuláris fázis elején a méhnyálkahártya menstruációs vérzés kíséretében lelökődik. Ezzel egyidőben megindul a méhnyálkahártya regenerációja, mely az ovuláció időpontjában éri el a maximális vastagságát. Ha nem következik be megtermékenyülés, akkor a luteális fázis során ismét elkezd visszafejlődni [9] (2. ábra). 10

2. ábra. A női nemi ciklus alatti hormonszekréció és az endometrium változásai [9]. A follikuláris szakasz során az E2 szintje előbb lassú, majd gyors ütemben emelkedik. A magas, legalább 48-50 órán át fenntartott E2 szintnek köszönhetően bekövetkezik egy LH csúcs is, amely kiváltja az ovulációt. A luteális szakasz során emelkedni kezd a P4, amely előkészíti a méhnyálkahártyát a megtermékenyített petesejt beágyazódásához. Ha nem történt megtermékenyítés, akkor a luteális szakasz folyamán elkezd visszafejlődni a méhnyálkahártya, majd menstruációs vérzés kíséretében lelökődik a follikuláris szakasz kezdetén, hogy utána ismét megújulhasson.

Az immunrendszer és a HPG tengely közötti kapcsolatot több okból is érdemes vizsgálni: 1. Egyre nő azoknak a száma, akik valamilyen szex szteroidot szednek (hormonpótló terápia v. orális fogamzásgátló formájában). 2. A GnRH agonistákat egyre szélesebb körben alkalmazzák különböző betegségekben (pl. prosztatarák, endometriózis, korai pubertás). 3. Az autoimmun betegségek mögötti nemi dimorfizmus okait nem sikerült még teljes részleteiben feltárni [7]. 1.2.2. Nemi dimorfizmus az autoimmunitás tükrében Ismert, hogy egyes autoimmun betegségek jelentős megoszlásbeli különbséget mutatnak a nemek között. Ilyen például a szklerózis multiplex (MS), szisztémás lupusz eritematózusz (SLE), rheumatoid artritisz (RA), miaszténia grávisz (MG); inzulin-függő diabétesz mellitusz (IDDM); ahol az érintettek 75-80%-a nő. Többek között ez hívta fel a 11

figyelmet az ösztrogén immunrendszerre gyakorolt esetleges hatására [13, 14], amely azóta már a legszélesebb körben vizsgált hormon lett az immunitás-autoimmunitás kérdéskörében [15]. Minden autoimmun betegség multifaktoriális (genetikai, epigenetikai és környezeti faktorok is hajlamosíthatnak) és egyik tényező sem elhanyagolható, vagy tehető kizárólagosan felelősnek a kórkép kialakulásában. Az autoimmun betegségek dominánsan női érintettségének magyarázatakor sok tanulmány a női és férfi nemi hormonok immunmoduláló hatására fókuszál; míg vannak munkacsoportok, akik inkább a genetikai hátteret, azon belül is az X kromoszómához köthető dóziskompenzáció hatását „okolják” a saját elleni tolerancia áttörésében (nők testi sejtjeiben az egyik X kromoszóma véletlenszerűen inaktiválódik). Ennek értelmében egy X kromoszómához kapcsolt mutáció a női sejtek 50%-ban jelenik meg, míg férfiaknál az összesben. Leírták, hogy az X kromoszómák körülbelül 10%-a elkerülheti az inaktiválódást, így bizonyos géntermékek overexpresszáltak lesznek, ennek lehet természetesen pozitív és negatív következménye is. Éppen ezért az autoimmun folyamatoknak fontos rizikótényezője lehet a nem megfelelő kromoszóma inaktiválódás is [15-18]. Ismert példák: Klineferter szindróma (XXY férfi) esetében megnő az SLE kialakulásának esélye, kb. akkora lesz mint nőknél [19]. Míg a Turner szindrómás nőknél (X0) kb. nulla az SLE kialakulásának esélye [20]. Továbbá az is köztudott,

hogy

számos

X

kromoszómához

kapcsolt

gén

befolyásolhatja

az

immunfolyamatokat (pl. Btk mutációja: agammaglobulinémia, IL-2R lánc mutációja: kombinált immundeficiencia, FOXP3 mutáció: immundiszreguláció) [15, 18]. Noha a fentiek alapján kitűnik, hogy a két nem immunitás hátterének különbözőségeit nemcsak a nemi hormonok, hanem a kromoszómális nemi háttér is befolyásolja, dolgozatomban a továbbiakban a szex szteroidokra szorítkozom. Ismert, hogy a nőknél a férfiakhoz képest erőteljesebb humorális és celluláris immunválasz tapasztalható, általában ellenállóbbak bizonyos fertőzésekkel szemben, de nagyobb is az esélyük az autoimmun betegségek kialakulására. Nőknek magasabb az abszolút CD4+ sejtszámuk és a keringő teljes ellenanyagszintjük. Erőteljesebb allograft kilökődést mutatnak és mérsékeltebb bennük a tumorok előfordulásának, ill. azok újbóli kialakulásának a lehetősége [16, 21-25]. Nőknél elsődlegesen a Th2-es immunválasz (ami a terhesség alatt még kifejezettebb), míg férfiaknál a Th1-es immundominancia figyelhető meg. Ez a reproduktív években jellemző különbség, a menopauza után eltűnik, amely 12

szintén a hormonális háttér immunmoduláló szerepére utal [15]. Általánosságban elmondható tehát, hogy a szteroid hormonok fontos szerepet játszanak az immunválasz szabályozásában. Az ösztrogén felerősíti a humorális immunválaszt, míg az androgének és a progeszteron természetes immunszuppresszorként hatnak [22, 23]. A klinikumból számos adat áll rendelkezésünkre az egyes betegségek és a szérum hormonkoncentrációjának kapcsolatáról (ld. 1. táblázat). Például autoimmun betegségben szenvedő férfiaknál az esetek döntő többségében kimutatható a szérum emelkedett ösztrogén és csökkent tesztoszteron szintje [24]. Az ösztrogén és androgén mellett az agyalapi mirigy által termelt prolaktin szérumszintjét szokták még vizsgálni, melynek feltehetően szerepe van a B sejtes tolerancia áttörésében és az autoreaktív antitestek képződésében [26].

13

Ösztrogén

SLE

SS

RA

SSc

MS

 Hatással van az autoreaktív B sejtek érésére és szelekciójára  Fokozza az antitest termelést  Férfiakban emelkedett a 16hydroxyestrone és estron szérum szint

 Ovarektomizált egerek hasonló tüneteket mutatnak  E2 szintézisre képtelen, aromatáz deficiens egerek destruktív B sejt infiltrációt mutatnak a nyálmirigyekben  Az emlőrák miatt műtőtt nők aromatáz inhibitort kapnak; ennek hatására bekövetkező E2 deplécióval egyidőben megfigyelhető az emelkedett antinukleáris ellenanyag termelés  Makrofág és fibroblaszt proliferációt indukál  RA-s férfiak és nők esetében is szignifikánsan magasabb a szinoviális folyadék E2 szintje

Androgének

Prolaktin

 Tesztoszteron szuppresszálja az anti dsDNS ellenanyagok termelését  SLE-s nőknek alacsonyabb az androgén szintje az egészségesekhez képest  SLE-s férfiaknak alacsonyabb a tesztoszteron szintje

 Hatással van az autoreaktív B sejtek érésére és szelekciójára  Fokozza az INFγ termelését  A betegek 22-33%-nak közepes v. súlyos hiperprolaktonémiája van  A betegek aktiválatlan PBMC-i több prolaktint termelnek, mint az egészségeseké

 Egér modellekben védő hatással bír

 RA-s férfiaknak alacsony a szérum tesztoszteron szintje

 Feltehetően fibroblaszt diszfunkciót okoz

 Az érintett férfiaknak magas az E2 szintje

 Az érintett férfiaknak alacsony a szérum tesztoszteron és magas az E2 szintje

 A szintje betegekben mindig szignifikánsan magasabb

 Szintje nem mutat korrelációt a kór lefolyásával és az alaptünetek súlyosságával, vagy az ea. mennyiségével  Szintje jól korrelál a belső szervek érintettségével  A súlyosabb tünetek magasabb prolaktin szinttel társulnak

 Betegség során vélhetően emelkedik a szintje

1. táblázat. Hormonális hatások és klinikai adatok autoimmun betegségekben [24]. SLE-szisztémás lupusz eritematózusz, SS-Sjörgen szindróma, RA- rheumatoid artritisz, SSc-szisztémás szklerózis, Msszklerózis multpilex (ea-ellenanyag).

14

1.2.3. A terhesség és a mögötte húzódó hormonális változások hatása az immunrendszerre Az ösztrogén immunmoduláló hatására vonatkozó

legszembetűnőbb adatokat

autoimmun betegségben szenvedő állapotos nőknél jegyezték fel. Az MS, és az RA tünetei csökkentek a terhesség során, míg szülés után visszaesés volt tapasztalható. Ezzel ellentétben az SLE tünetei romlottak vagy nem változtak az állapotosság alatt [13, 27]. A terhesség egy olyan sajátos megváltozott immun- és hormonális állapotot jelent a szervezet számára, ahol a fő cél a félig allogénnek számító magzat tolerálása [28]. Az az elképzelés már nem állja meg teljesen a helyét, amely szerint a terhesség egy olyan erősen szupresszív állapot, ahol az anya immunrendszere nem látja a magzatot [29-32]. A trofoblaszt sejtek ugyanis meghatározó szerepet játszanak a tolerancia kialakulásában. Ugyan nem expresszálnak klasszikus MHCI és MHCII molekulákat, amely segítségével meg tudják előzni az allogén kilökődési folyamatot, helyette azonban a nem-klasszikus MHCI b osztályba tartozó HLA-G, HLA-E és HLA-F fehérjéket expresszálnak, amelyek segítségével

immuntoleráns

hatásokat

indukálnak.

Emellett

a

placenta

hormontermelésének köszönhetően a szérum progeszteron szintje négyszer-hatszor magasabb, az ösztrogéné pedig akár nyolcszorosára is emelkedhet a nem-terhes állapothoz képest [33, 34]. Mindemellett a méhnyálkahártya és a méhlepény nagy mennyiségben termelnek olyan citokineket, amelyek az immunválaszt Th1-ről Th2 irány felé tolják. Ez vélhetően növelheti egyes fertőzések előfordulását, viszont a csökkent Th1-es citokin szintnek köszönhetően csökken a spontán abortusz és koraszülés esélye [35]. Ezeket átlátva érthetővé válik, hogy egy döntően Th1 irányultságú betegség miért javul; és egy döntően Th2 túlsúlyú betegség miért romlik a terhesség során. A hormonális folyamatok és részben az általuk módosult citokinháttér tehát együtt járulhatnak hozzá a fentebb említett autoimmun betegségekben bekövetkezett állapotváltozásokhoz [35]. 1.2.4. A női nemi ciklus és a menopauza immunológiai vonatkozásai Habár a terhesség során bekövetkező hormonális változások és az ahhoz kapcsolható immunológiai folyamatok széles körben vizsgáltak, sokkal kevesebbet tudunk a ciklus során bekövetkező változásokról. Ahogyan az 1.2.1. alfejezetben is írtam, a női nemi ciklust hagyományosan 2 fő részre lehet osztani: follikuláris és luteális szakaszra. Ennek 15

megfelelően egymást váltva van két hét, amikor az E2 és két hét, amikor a progeszteron a predomináns a belső környezetben [36]. A Th1/Th2 polarizációra vonatkozó adatok alapján az emelkedett E2 és progeszteron szint a Th2-es típusú immunválaszokhoz járul hozzá, míg az alacsony E2 és prolaktin szint a Th1-es típusú immunválaszoknak kedvez. A progeszteron feltehetően gátolja a Th1-es választ és felerősíti a Th2-es citokinek termelését. Ezért a korai follikuláris és az ovuláció utáni szakaszt Th1 dominancia; a késői follikuláris és a közép- valamint késői luteális szakaszt pedig Th2 dominancia jellemzi [36]. Természetesen az immunválasz számos stimuláló és gátló útvonalon keresztül szabályozott, ill. a hormonok is számos sejttípusra hathatnak egyidejűleg, ezért az előbb vázoltakat csak egy egyszerűsített sémának tekintsük. A cirkuláló hormonszint immunsejtekre kifejtett hatása az irodalmi adatok alapján nem mindig egyértelmű. Az már általánosan elfogadott, hogy a terhességi E2 szint (amely körülbelül a preovuláció előtti szintnek felel meg) meg tudja védeni a B sejteket az apoptózistól, ezzel felerősítve

az

autoreaktív

sejtek

túlélésének

az

esélyét

[37].

Hasonló

hormonkoncentrációhoz köthető jelenséget a női ciklus vonatkozásában nem sikerült eddig kimutatni, a keringő immunglobulin szintet is állandónak találták [36]. Felmérések alapján a menstruációs ciklus késői follikuláris fázisában megnő a CD4+ FoxP3+ Treg sejtek aránya [36, 38, 39], melyet egérmodellben exogén E2 adagolás hatására is megfigyeltek [38]. A luteális fázis teljes monocita száma szignifikánsan emelkedik a follikuláris fáziséhoz képest. A CD4+ T, B és NK sejtek száma pozitívan korrelál az LH hormon szintjével és negatívan az FSH-éval. A közép és késői luteális fázisban szignifikánsan megnő a CD4+ T sejtek száma, a középső luteális fázisra jellemző még az NK sejtek citotoxicitásának fokozódása is [36, 40]. Az életszínvonal növekedésével együtt kitolódott a várható élettartam is, ennek köszönhetően a nők ma már életük jelentős részét posztreproduktív állapotban töltik. Klinikai értelemben akkor beszélünk menopauzáról, ha az utolsó menstruációs ciklus után eltelt legalább egy vérzésmentes év. Ez általában 51 éves kor körül következik be, de megelőzi a klimaxként ismert úgynevezett perimenopauzális tünetegyüttes: a petefészek elégtelen hormonműködése miatt a menstruációs ciklus szabálytalanná válik, hőhullámok, magas vérnyomás, a szervezet anyagcseréje lelassul, vizelet inkontinencia panaszok, külső 16

nemi szervek elváltozásai/hüvely szárazság, csontritkulás, megnő egyes daganatos megbetegedéseknek a kialakulási esélye, fiatalkori hormonszinttel még egyensúlyban tartott betegségek újulhatnak ki (ízületi gyulladás, cukorbetegség, emésztési panaszok, immunrendszeri problémák) [41]. Ez a megváltozott hormonális háttérrel járó élettani állapot, ill. a tünetegyüttesek enyhítésére alkalmazott hormonpótló terápia (HRT) szintén számos példát szolgáltat az E2 immunmoduláló szerepéről. Ahogyan a terhesség immunológiai vonatkozásánál, úgy itt is a legtöbb adatot autoimmun betegségben érintett nők kórismerete alapján írták le. A HRT során az alkalmazott E2 nagyon alacsony szintű, 1/6-a fogamzásgátlókéban találhatóénak, és kb. 1/5-e a menstruációkor elérhető csúcsnak [27]. Ahogyan korábban említettem az autoimmun megbetegedések a fiatal nőket érintik. Ezen betegségek patofiziológiája összetett, és a nemi hormonoknak nagyon változatos az ebben betöltött szerepe. Nincs arra vonatkozó adat, hogy a HRT elősegítené az SLE kialakulását; de azoknál a nőknél, akiknél már kialakult, a HRT rontott a betegség állapotán. Ezzel szemben néhány tanulmány szerint az orális fogamzásgátló használata csökkentheti az RA kialakulását. Ettől függetlenül nem ajánlott megelőző vagy terapeutikus célzattal történő alkalmazásuk,

mivel

ezeknél

a

betegeknél

is

magasabb

a

kardiovaszkuláris

megbetegedések esélye, amelyet az exogén hormonbevitel csak tovább növelne [27].

1.3. Az ösztrogén receptorok és a hozzájuk kapcsolódó biológiai funkciók 1.3.1. Ösztrogén típusok Az ösztrogének a szteránvázas (szteroid) hormonok közé tartozó vegyületek. Az általános szerkezeti hasonlóságok ellenére mindegyik szteroid hormon osztálynak megvannak a jellegzetes strukturális sajátságai, amelyek az eltérő biológiai válaszokat eredményezik. E tekintetben az ösztrogénnek (C18 szteroid) jellemzően aromás A- gyűrűje van, a C3 pozícióban fenolos hidroxil csoporttal. Ez az, ami megkülönbözteti az többi négy szteroid osztálytól (androgének, progeszteron, glükokortikoidok és mineralokortikoidok) [42]. Három fő típust különíthetünk el (3. ábra A) - ösztron (E1), ösztradiol (E2), valamint ösztriol (E3) -, melyek a különböző életszakaszok során eltérő százalékos arányban fordulnak elő a szervezetben [43, 44].

17

3. ábra. Az ösztrogén típusok és a szteroid receptorok általános szerkezete. (A) A β-ösztradiol, ösztron és ösztriol a különböző életszakaszok során eltérő százalékos arányban fordul elő a szervezeten belül. Az α-ösztradiol funkcionálisan inaktív ösztrogén forma, a β-ösztradiollal ellentétben a két hidroxil csoport nem cisz, hanem tansz helyzetben található egymáshoz képest. (B) A szteroid receptorok három fő funkcionális doménből állnak: 1. variábilis N terminális domén, amely a transzaktivációt szabályozza; 2. egy cisztein gazdag régió, amely a DNS-hez való kötődésért felelős és a specifikus hormonhatást szabályozza; 3. egy C terminális domén, amely a hormont köti és irányítja a sejtmagi transzlokációt, továbbá a dimerizációért és a Hsp kötésért is felelős [45, 46].

Mivel az ösztradiol kb. nyolcvanszor hatékonyabban működik, mint az ösztriol, ezért ez a legnagyobb jelentőségű ösztrogén a fogamzóképes korban lévő nőknél [44]. Éppen emiatt az ösztrogén kutatások igen jelentős hányada az E2 ösztradiolra fókuszál. Az ösztradiol szerepét terhesség alatt az ösztriol veszi át (és ugyanekkor egy kizárólag ebben az állapotban termelődő ösztrogén is kimutatható: ez az ösztetrol), míg a menopauzán átesett nőkben az ösztron válik az elsődleges ösztrogénné. A három hormont elsősorban a petefészekben fejlődő tüszők, a sárgatest és a méhlepény termelik, de léteznek másodlagos ösztrogén források is, mint például a máj, a mellékvesék, a zsírsejtek és az emlők [43, 44]. 18

Ez utóbbiak a menopauzán átesett nőkben játsszák a fő szerepet az elsődleges forrás jelentős csökkenése miatt. Minden szteroid szintézisének kiindulópontja a koleszterin, amelyből több köztes vegyületen át, végső soron az aromatáz enzim közreműködésével, tesztoszteronból vagy androsztenedionból ösztrogén keletkezik [44]. Az ösztrogének viszonylag konzervatív vegyületnek számítanak, az evolúció egy korai pontján jelenhettek meg és azóta is megőrizték eredeti alapvázukat. A gerinces állatoktól kezdve (hím és nőstény) a rovarokon át, a növényekben (fitoösztrogének), valamint a gombákban (mikoösztrogének) is megtalálhatóak [47]. Eddigi ismereteink alapján a számos izoformától eltekintve csak kevés ösztrogén receptorként funkcionáló fehérjét azonosítottak. Feltehetően nem csak a ligandumok, hanem azok receptorai is konzervatív evolúciós utat jártak be (3. ábra B). 1.3.2. Klasszikus ösztrogén receptorok és a genomiális út Klasszikusan

a

szteroid

hormon

receptorok

(SR)

transzkripciós

faktorként

funkcionálnak. A hormon lipofíl természeténél fogva vélhetően egyszerű diffúzióval kerül a sejt belsejébe. Intracelluláris receptorához kötődve abban konformáció változást idéz elő, amely elősegíti az őt inaktív formában tartó citoplazmatikus chaperon fehérjéktől (pl. Hsp90, immunophilin) való elkülönülést, valamint a dimerizációt és a sejtmagi transzlokalizációhoz szükséges szekvenciák feltárulását [46, 48, 49]. Végezetül az adott célgének

promoterén

található

szteroid

kötő

válaszelemhez

kapcsolódva,

azok

expresszióját pozitívan vagy negatívan szabályozzák [46, 50]. Ezek a genomiális hatások a későbbiekben tárgyalt nem-genomiális hatásokhoz képest lassabbak, a géntranszkripciós változások csak órák vagy napok múlva figyelhetőek meg, valamint transzkripciót (aktinomicin D) és transzlációt gátló (cikloheximid) szerekre érzékenyek [46, 51]. A szteroid receptorok három fő funkcionális doménből állnak (3. ábra B) : 1. variábilis N terminális domén, amely a transzaktivációt szabályozza; 2. egy cisztein gazdag régió, amely a DNS-hez való kötődésért felelős és a specifikus hormonhatást szabályozza; 3. egy C terminális domén, amely a hormont köti és irányítja a sejtmagi transzlokációt, továbbá a dimerizációért és a Hsp kötésért is felelős [46]. A klasszikus ösztrogén receptoroknak két formája ismert, melyek külön kromoszómán kódoltak: ERα [52] és ERβ [53, 54]. Annak ellenére, hogy mindkét altípus nagyjából hasonló affinitással köti az E2-t, a ligandumkötő doménjük aminosav szekvenciája csak 19

56%-ban egyezik meg; ennek ellenére a DNS kötő doménjeikben nagyfokú szekvencia azonosságot mutatnak (97%) [55]. Különböző a szöveti megoszlásuk és eltérő a transzkripciót szabályozó képességük is, ezért feltehetően a különböző altípusok eltérő biológiai funkcióval rendelkeznek [55]. Ismert ugyanakkor az is, hogy a két receptor in vivo heterodimert is képezhet [56, 57]. Tovább árnyalja a rendszer összetettségét az is, hogy számos ERα és ERβ splice variánst karakterizáltak már, melyek szabályozó szerepe szintén eltérő lehet a többi ER változatétól [58-61]. Következzék egy-két kiragadott példa - a teljesség igénye nélkül - az immunrendszer vonatkozásában leírt genomiális E2 hatásokról: Sejtvonalon és primer sejteken is igazolták, hogy a JAK1, JAK2 és a CD3 láncának expressziója E2 függő, amelyet összefüggésbe hoztak az idősebb emberekben megfigyelhető csökkent T sejt proliferációs képességgel és csökkent IL-2 termeléssel. Posztmenopauzális nőkből izolált limfocitát E2-ben gazdag környezetben tenyésztve, a fentebb említett fehérjék újra a premenopauzális szintre jellemző magasabb szinten expresszálódtak [62]. Továbbá fokozott IL-4 termelést és emelkedett GATA-3, valamint csökkenő T-bet szintet is leírtak E2 hatására CD4+ sejteken [63]. Az ERα és az általa közvetített E2 jelek a megfelelő DC differenciálódáshoz is elengedhetetlenek, hiányukban csökkent lesz ezen sejtek MHCII és CD40 expressziója [64]. Az E2 kezelés szignifikánsan csökkenteni tudja a TNFα indukálta kaszpáz-3/7 aktivitást T sejtekben [65], illetve a Fas ligand gén promótere is E2 szabályozás alatt áll [66]. Azt is kimutatták, hogy egerekben az E2 kezelés hatására megváltozik a B sejt alpopulációk megoszlása, csökken a tranzícionális B sejtek száma, és megnő a marginális B sejteké. A kezelés hatására a Bcl-2 szintjében szignifikáns növekedés figyelhető meg pro/pre és éretlen csontvelői B sejteknél. A legjelentősebb szintemelkedés a T1 és germinális centrumban lévő B sejteknél figyelhető meg, pont azoknál az állomásoknál, melyek az autoreaktív sejtek negatív szelekciójáért felelősek [67]. A fenti példákból látszik, hogy az E2 a sejtek aktivációjára, túlélésére, differenciálódására kifejtett sokrétű hatása révén valóban fontos immunmoduláló szerepet tölthet be. 1.3.3. Membrán ösztrogén receptor és a nem-genomiális út Az előző fejezetben említett klasszikus úttal szemben a nem-genomiális úton másodperceken/perceken

belül

bekövetkező

jelátviteli

és

fiziológiás

változások 20

figyelhetőek meg a sejtben, amelyek transzkripciós és transzlációs inhibítorok jelenlétében is végbemennek [51, 68].

Az ellentmondásos és sokféle adat alapján valószínűsíthető, hogy a nem-genomiális hatások szövet és sejttípusonként jelentősen eltérőek lehetnek. Az első szteroid hormonok gyors hatásairól szóló nemzetközi találkozón (Mannheim, 1998) két fő csoportba sorolták a már leírt nem-genomiális válaszokat (4. ábra). Ezek alapján a hormon hathat direkt, vagy valamilyen agonista partnerrel együtt indirekt módon is. Specifikus hatásról beszélünk, amennyiben valamilyen receptor által közvetített jel valósul meg, és nem-specifikusról, ha receptortól függetlenül jön létre a nem-genomiális válasz [69].

A) Direkt

B) Indirekt

A szteroid egymaga hat

Valamilyen agonista partnerrel együtt hozza létre a gyors választ

1. Nemspecifikus Nem receptoron keresztül kifejtett hatás, pl. membrán fluiditás/ mikrodomének befolyásolása

2. Specifikus Szteroid receptor specifikus ligandumának megkötése során létrejövő válasz a.) Klasszikus magi szteroid receptor családhoz tartozó receptoron keresztül

b.) Nem klasszikus szteroid receptoron keresztül

4. ábra. A szteroidok nem-genomiális hatásának osztályozása [69]. A szteroid hormonok hathatnak direkt módon, vagy egy agonista partnerrel együtt indirekt módon is. Specifikus hatásról beszélünk, ha receptor által, és nem-specifikusról, ha receptortól függetlenül jön létre a nemgenomiális válasz.

Tehát a gyors hatások direkt szteroid-membrán interakciók eredményeként is bekövetkezhetnek, megváltoztatva a membrán fiziko-kémiai tulajdonságait, mint például a fluiditást és az ún. membrán nano/mikrodomének (lipid tutajok) szerkezetét. Willmer már 1961-ben felvetette, hogy a szteroidok beépülhetnek a sejtmembránok lipid kettősrétegébe, így befolyásolva annak fluiditását [68, 70]. Azóta már számos szövetben és sejtben igazolták, hogy a progeszteron és az ösztrogén mikromoláris koncentrációban hatással van a membránfluiditásra. Ezeket a nem-specifikus szteroid hatásokat azonban a fiziológiásnál 21

magasabb koncentrációknál tapasztalták, így az in vivo jelentőségük kérdéses [69]. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján T és B sejtekhez adott 100 nM E2 percek alatt jelentősen csökkentette a plazmamembrán fluiditását. Ez egyrészt jelezheti az ösztrogén lipid kettős réteggel való kölcsönhatását, másfelől a feltételezett membrán receptorhoz való kötődését is. Különböző sejteken leírták, hogy az E2 aktiválhatja a MAPK/ERK, a PI3K/AKT útvonalakat, ill. hatására felszaporodhatnak másodlagos hírvivő molekulák is (cAMP, Ca2+). Mivel az ER-nak nincs saját kináz aktivitása, ezért elengedhetetlen más jelátvivő molekulákkal való kapcsolata, amelyekkel feltehetően a membránban közösen úgynevezett szignaloszómát alkot [68, 71, 72]. Az E2 hatására fokozódó Erk és Akt foszforilációt munkacsoportunk is igazolta egér limfocitákon végzett vizsgálatokkal, továbbá intracelluláris Ca2+ emelkedését is ki tudtuk mutatni T sejtekben [25]. A gyors hatásokhoz transzmembrán receptort feltételezhetünk, vagy legalábbis membrán-asszociáltat. Az előbb említett jelátviteli utak hathatnak közvetlenül, kiváltva egy adott biológiai választ; vagy közvetett módon a klasszikus úton elinduló génexpressziót befolyásolva [68]. Így a hagyományos, genomiális út feltehetően a célsejt komplex funkciójának szabályozására alakult ki az evolúció során; míg a gyors nemgenomiális

út

lehetőséget

adhat

a

dinamikus

környezeti

változáshoz

való

alkalmazkodáshoz és a szabályozás finomhangolásához (5. ábra) [73]. Meg kell azonban jegyezni, hogy a gyors „nem-genomiális” út is feltehetően végső soron génexpressziós változásokhoz vezehet, akár a klasszikus ER-eken, vagy esetleg azoktól függeltenül hatva.

22

5. ábra. Az ösztrogén egyszerre hathat genomiálisan és nem-genomiálisan is. [69, 73]. A genomiális út során a klasszikus ER-ek E2 függő módon fehérje szintézist indukálnak. Ezzel szemben a nem-genomiális úton másodperceken-perceken belül bekövetkező változásokat detektálhatunk, amelyek feltehetően membrán receptoron keresztül valósulnak meg, és valószínűleg az E2 hatások finomhangolásában játszanak szerepet.

Az még kérdéses, hogy a citoszolikus/magi (ERα/β) és a membrán ösztrogén receptor (mER) megegyezik-e, vagy létezik valamilyen más fehérje, amely a membránban köti az ösztrogént. A legtöbb tanulmány az E2-t kötő membrán receptornak a klasszikus ER-t ill. annak

valamilyen

posztranszlációsan

módosult

formáját

feltételezi

(palmitoilált,

foszforilált), ami pont a módosulás miatt képes nem-genomiális szinten hatni, ill. a plazmamembránban elhelyezkedni [68, 69, 74-76]. Norman és mtsai. indítványozták az úgynevezett „több kötőhelyes receptor” (receptor ensemble) modellt, amely szerint a klasszikus ER-nek két különböző ligandumkötő zsebe van, és attól függően, hogy melyikbe illeszkedik a szteroid, aktiválódhat a genomiális vagy a gyors útvonal. Amikor membrán caveola [77, 78], vagy pányvázó (scaffolding) fehérjékhez kapcsolódik a szteroid receptor – membrán-asszociált forma -, akkor a molekulák közötti kölcsönhatásnak köszönhetően konformációja a ligandum alternatív zsebbe való illeszkedésének kedvez. Az alternatív zseb valószínűleg nem hozzáférhető, amikor a citoplazmában van az ER [68]. Az irodalmi adatok azonban inkább a palmitoilációval kapcsolatos elméletet támasztják alá.

23

1.3.4. GPR30 - egy nemrégen leírt ösztrogén receptor 2005-ben a 7 transzmembrán régióval rendelkező, G-fehérjéhez kapcsolt GPR30 (GPER1) receptort két egymástól független munkacsoport is ösztrogénkötő receptorként azonosította [79, 80]. Azonban a vele kapcsolatos megfigyelések eléggé ellentmondóak voltak. Revanker és munkatársai szerint a GPR30 kizárólagosan az endoplazmatikus retikulumban lokalizálódik [80], míg Thomas és munkatársai eredményei alapján egy kis frakciója a sejtfelszínen is kimutatható [79]. Az immunrendszer tekintetében még viszonylag kevésbé feltárt ennek a receptornak a szerepe. Éretlen humán hemopoetikus sejtekben (CD34+,CD38-) nem, azonban a CD34+ CD38+ sejtekben kimutatható a GPR30 mRNS-se. A csontvelői B sejtek közül csak a CD19+ IgM- sejtekben (pro és pre B) expresszálódik a GPR30. Továbbá perifériás B és T sejtekben, valamint a CD14+ monocitákban is kimutatták a GPR30 mRNS-ét. A CD15+ neutrofil és eozinofil granulocitákról nem mondható el ugyanez. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a GPR30-nak főként az adaptív immunrendszerben van szerepe, azon belül is részben a sejtek érési folyamataiban [81]. Egerekben ezidáig nem történt hasonló részletes expressziós vizsgálat. Állatmodellekben főleg az E2 tímusz atrophiában betöltött funkciójának megértése kapcsán került a figyelem középpontjába, ugyanis Wang és mtsai. leírták, hogy a GPR30-deficiens egerek részben védettek az E2 indukálta tímusz atrophiával szemben. Különböző KO egereken végzett kísérleteik alapján, az ERα-án keresztül közvetített jelek fejlődési blokkot indukálnak a korai timocita alakokban, míg a GPR30-on keresztül közvetített jelek apoptózist indukáltak a β lánc -/low dupla negatív (DN) timocitákban [82]. Azonban Wang eredményeit több hasonló témakörben dolgozó munkacsoport sem tudta megismételni [83, 84], míg mások teljesen ellentétes következtetésre jutottak: pl. Isensee és munkatársai szerint pl. a naív T sejtek apoptózisa GPR30-tól független [85]. 1.3.5. A nemi hormonok biológiai aktivitását és hozzáférhetőségét meghatározó plazmafehérjék Ez idáig a különböző sejttípusok szteroid felvételének vizsgálatakor a citoplazmatikus hormon receptorokra és azok plazmamembrán-asszociált formájának azonosítására 24

fókuszáltak, azonban nem elhanyagolható a szállítófehérjékre specifikus kötőhelyek kimutatása sem. Hiszen ha nem is közvetlenül, de indirekt módon azok is membrán ösztrogén receptorként funkcionálhatnak. Korábban úgy gondolták a szteroid hormonokról- így az ösztrogénről is, hogy egyszerűen a plazmamembránon átdiffundálva lépnek be a sejt belsejébe. Azonban a hidrofób tulajdonságait figyelembe véve nem meglepő, hogy a plazmában és az extracelluláris folyadékban csak 2-3% E2 kering szabadon, a többi pedig valamilyen hordozófehérjéhez kötötten található meg. Ezek a szállító fehérjék egyediek az egyes szteroid hormon családokban [86]. E2 esetében a szállítószerepet egyrészt a szex-szteroid kötő globulin (SHBG), másfelől az albumin látja el. Az albuminnak ugyan magasabb a plazma koncentrációja a SHBG-hoz képest, de kisebb affinitással és nem specifikusan köti a különböző szteroidokat; szerepe egész egyszerűen a lipofil molekulák szállításának és biológiai felezési idejük növelésének biztosítása. Ezzel szemben az SHBG specifikus szállítófehérjéje a biológiailag aktív ösztrogénnek és androgénnek; plazma koncentrációja nagyban meghatározza azok szervezeten belüli megoszlását és a célszervek, sejtek ösztogénhez való hozzáférhetőségét [86-88]. Az 1980-as évek elején még úgy vélték, hogy csak a szabadon keringő hormon hozzáférhető a sejtek számára, a hordozóhoz kötöttség lényege pedig a hormon biológiailag inaktív formában való tartása [88]. Ez az elképzelés azonban hamar megdőlt. A szabad hormon hipotézissel ellentétben a kötött hormon hipotézis szerint a szex szteroidok a különböző szövetek eltérő SHBG- és albuminkötő képességétől függően specifikusan amplifikálódhatnak; ill. a hordozóhoz kötöttség nagyban befolyásolja, hogy milyen sejt vagy szövet számára hozzáférhető az adott hormon. Limfoid szervek esetében valószínűsíthetően az SHBG lehet egy fontos E2 szállító fehérje [88]. Az SHBG allosztérikusan működik. Számos munkacsoport megerősítette, hogy csak a ligandumot nem kötő SHBG képes a membrán receptorához kötődni [89-91]. A szteroidok két különböző szintű szabályozást fejtenek ki a rendszerre (6. ábra): 1. Ha a SHBG-hoz kötődnek, akkor meggátolják annak a receptorhoz való kötődését. Ez a gátlás szigorúan a SHBG-szteroid aviditásra hat, és független a szteroid biológiai aktivitásától. 2. Ha a membránreceptor által kötött SHBG-hoz kötődik a szteroid, akkor különböző jelátviteli utak aktiválódását eredményezi, ez az ami tulajdonképpen a szteroid biológiai aktivitásától függ [90]. 25

6. ábra. Sematikus ábra az SHBG sejtfelszínen feltételezhetően betöltött hatásmechanizmusáról. Az SHBG közvetett módon vélhetően szintén membrán receptorként funkcionálhat, a sejtfelszínen lévő receptorához kötődve képes E2-t kötni. Azonban ha a keringésben már ligandummal telített, akkor elmarad a sejtfelszínhez való kötődése. Ennek a biológiai relevanciáját nem ismerjük limfocitákon. Mint ahogy az is kérdéses, hogy ezen mechanizmus hogyan lehet kapcsolatban a korábban leírt E2-mediált folyamatokkal.

Ezek alapján az SHBG-nek feltehetően kettős szerepe van: megfelelő/normál hormon szintnél hozzájárul a szex szteroid hatások felerősítéséhez, alacsony hormon szintnél pedig gátolja azok hozzáférhetőségét. Eddigi ismereteink szerint ez a terhesség és laktáció időszakában jelenthet előnyt a szervezetnek. Az emelkedett E2 szint mellett az SHBG maximalizálja annak hatását, ezáltal elősegítve a csontok tömegének, ill. a bél és vese kalcium szintjének megőrzését a laktáció periódusára. A szülés után a lecsökkent E2 szintet az SHBG tovább fogja korlátozni, ezáltal gátolja az E2 csontokra kifejtett hatását; végeredményben megtörténhet a maximális kalcium reszorpció a tejbe az újszülött számára [92]. Emberben sokáig a májat tartották fő SHBG forrásként számon [86], azonban más szövetekben is sikerült kimutatni funkcióképes mRNS-ét [91, 93]. Rágcsálókban eddigi tudásunk alapján a magzati máj szekretál SHBG-t, majd kifejlett egyedeknél a here és az ovárium veszi át ezt a szerepet [86]. SHBG kötőhelyet mutattak már ki különböző szövetekben (here, mellékhere, endometrium, MCF-7 emlőrákos sejtvonal). Elképzelhető, hogy ezek receptorként hatnak a szteroid hormon transzmembrán jelátvitelében; úgy hogy közben a hormonnak nem kell a sejtbe jutnia [86, 91, 94]. Másrészről az LDL-receptorcsaládba tartozó megalinról írták le, hogy képes a szex szteroid-SHBG komplex internalizációját közvetíteni. Az internelizáció 26

után a szállító fehérje a lizoszómában degradálódik, míg a felszabadult hormon specifikus válaszelemeihez kötődve gének átíródását indukálja [95]. Habár nem található az irodalomban arra vonatkozó adat, hogy az SHBG képes kötődni a különböző limfocita sejtpopulációkhoz és azokra hatással van, nem zárhatjuk ki ennek lehetőségét.

27

2. Célkitűzések 1) Munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy az E2-BSA (marha szérum albuminnal kovalensen konjugált, membrán impermeábilis E2) kötődik a limfociták membránjához és gyors, nem-genomiális hatásokat indukál bennük. Így elsődleges terveink között szerepelt ezen ligandum membrán receptorának/receptorainak karakterizálása, ill. a klasszikus receptorok esetleges membrán asszociált formájáinak kimutatása. 2) Adatbázisból terveztük a szex szteroidkötő doménnel/motívummal rendelkező fehérjék szűrését, majd ezek ösztrogénkötő képességének vizsgálatát, ill. pozitív eredmény esetén annak ellenőrzését, hogy valóban azon keresztül indul el a nem-genomiális válasz. Továbbá terveink között szerepelt az ismert ösztrogén receptorok hidrofobicitási tulajdonságainak elemzése, amely alapján következtethettünk azok esetleges transzmembrán lokalizációs képességére. 3) Vizsgálni kívántuk a mER működésének dinamikáját, hogy jobban megértsük a receptor funkcionális szerepét. Tanulmányozni kívántuk többek között a receptor internalizációs útvonalát és reciklizációját. Terveink között szerepelt továbbá a nőstény egerek ciklusának hormonkezeléssel történő szinkronizálása, majd annak tisztázása, hogy a változó hormonszint hatással van-e a különböző ösztrogén receptorok expressziós mintázatára. 4) Mivel irodalmi adatok alapján a sejtmembrán koleszterin tartalma limitálólag hat az eritrociták és mesterséges modell rendszerben a liposzómák passzív E2 „felvételére” is, ezért vizsgálni kívántuk, hogyan viszonyul a mER a plazmamembránban lévő, dominánsan koleszterinben gazdag lipid raftokhoz. 5) Mivel a különböző ösztrogén receptorok feltehetően eltérő jeleket közvetítenek a sejtek számára, így nagyban meghatározó lehet az egymáshoz viszonyított expressziós arányuk az egyes sejtpopulációkon belül. Ezért szerettük volna feltárni a citoplazmatikusés membrán receptorok fehérje szinten kimutatható expressziós mintázatát az egyes limfocita alpopulációkban, ill. a genomiális- és nem-genomiális utak közötti kapcsolat jobb megértése érdekében céljaink között szerepelt a mER-en keresztül közvetített E2 jel klasszikus receptorok celluláris eloszlására/lokalizációjára kifejtett hatásának vizsgálata is. 6) Eredményeink alapján az E2-BSA és az E2 ligand egyaránt fokozta az Akt és Erk foszforilációt, valamint a T sejtek intracelluláris Ca2+ szint emelkedését váltotta ki. Ezért további célunk volt jellemezni az E2 limfocita effektor funkcióra (pl. ellenanyagtermelés) valamint proliferációjukra gyakorolt hatásait is. Ezen vizsgálatok során elemezni kívántuk az esetleges különbségeket a mER által közvetített jelek, és az általános - minden receptort érintő - E2 hatások között. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján, egereken 28

különböző immunizálási sémákat alkalmazva, az ösztrogén fokozta a T-sejt függő immunválaszt, míg a T-sejt függetlenre nem volt hatással. Ezt a kérdést in vitro rendszerben is vizsgálni kívántuk, tisztázandó az E2 és E2-BSA ellenanyagtermelésben betöltött szerepét. 7) Végül vizsgálni kívántuk, hogy az SHBG-nek, mint hormon szállító fehérjének, ill. egyik lehetséges receptorának (a megalinnak) lehet-e közvetítő szerepe az E2 limfocitákra gyakorolt hatásában.

29

3. A kísérletek során alkalmazott anyagok és módszerek 3.1. Sejttípusok A20 egér eredetű, érett fenotípusú B-limfóma sejtvonal (TIB-208) IP12-7 egér Th hibridóma sejtvonal: humán influenza vírus (A/PR/8/34 - H1N1 szubtípus) hemagglutinin (HA) fehérje HA1-alegysége C-terminálisának 317-329 aminósavrégióját tartalmazó szintetikus peptiddel (HA317-329) előimmunizált, majd az A/PR/8/34 vírussal fertőzött BALB/c egérből kifejlesztett, Th1 effektor/memória fenotípussal jellemezhető CD4+ T-sejt-vonal. A hibridóma a VTGLRNIPSIQSR szekvenciájú szintetikus peptid I-Ed MHCII molekulával alkotott komplexét felismerő TCR-rel rendelkezik. C57BL6/J (Charles Rivers, Budapest) 6-8 hetes nőstény vagy hím egérből izolált lép eredetű B és T sejtek A sejtvonalakat 5% FBS tartalmazó RPMI-1640 tápoldatban, az egér eredetű limfocitákat fenolvörösmentes, 5% szteroidmentes FBS-t tartalmazó DMEM tápoldatban tenyésztettük 37 C ̊ -on CO2-termosztátban. Az ösztrogénnel végzett kísérletek előtt a sejteket és sejtvonalakat a fent említett szteroid mentes DMEM médiummal mostuk kétszer.

3.2. Tápoldatok, pufferek, oldatok Komplett RPMI tápfolyadék: RPMI-1640 (Sigma Aldrich) 2 mM L-glutaminnal, 2 mM Na-piruváttal, 50 µM 2--merkaptoetanollal, antibiotikumokkal (1% penicillin és sztreptomicin), 5% FBS-mal kiegészítve. Szteroid mentes DMEM tápfolyadék: DMEM (Sigma Aldrich) 2 mM L-glutaminnal, 2 mM Na-piruváttal, 50 µM 2--merkaptoetanollal, antibiotikumokkal (1% penicillin és sztreptomicin), 5% szteroidmentes (charcoal stripped) FBS-mal kiegészítve, fenolvörös nélkül. A fenolvörös gyenge ösztrogén hatással rendelkezik. A hőinaktivált, ’charcoalstripped’ FBS biztosítja a hormonok és növekedési faktorok alacsony szintjét. Erre a médiumra volt szükség a 17β-ösztradiol hatásait vizsgáló kísérletekben. Poly- L- lysin 0.1% w/v oldat (P8920, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 30

ACK (vörösvérsejt lízis puffer, pH 7,2- 7,4): 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA Fenolvörös mentes GKN (glukóz, KCl- és NaCl-tartalmú foszfátpuffer, pH 7.4): 8 g NaCl, 0.4 g KCl, 1.77 g Na2HPO4 x 2 H2O, 0.69 g Na2HPO4, 2g D-glükóz, 1000 ml ioncserélt vízben beoldva szteroidmentes FBS (LifeTechnologies-Gibco, Carlsbad, CA, USA) FACS-puffer: 0.5% FCS és 1 g/l Na-azid tartalmú PBS MACS-puffer: PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA lízis puffer: 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 50 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaF, 250 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mMNa-pirofoszfát, 10 % glicerin, 10 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml pepstatin, 5 µg/ml leupeptin és 0.2 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) (proteáz inhibitorok: Sigma-Aldrich) hipoozmotikus puffer plazmamembrán szeparátum készítéséhez: 10 mM HEPES, 42 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 mM NaF, 5 µg/ml leupepid, 10 µg/ml pepstatin, 10 µg/ml aprotinin, 0.2 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) PBS (Na- és K-tartalmú foszfátpuffer, pH 7.2): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 7.2 mM Na2HPO4, 1.3 mM KH2PO4 PFA: 3%-os paraformaldehid frissen oldva PBS-ben.

3.3. Reagensek, festékek, ellenanyagok Az 17β-ösztradiolt (E2), az E2-BSA-t (17β-ösztradiol 6-(O-karboximetil)-oxim–BSA, (szteroid:BSA~30:1) és FITC-tal konjugált változatát a Sigma-Aldrichtól szeretük be (St. Louis, MO, USA). Az E2-BSA és E2-BSA-FITC preparátumokban levő szabad ösztradiolt felhasználás előtt ultraszűréssel távolítottuk el [96]. A membrán impermeábilis E2 negatív kontrolljaként BSA-FITC-et használtunk kísérleteinkben, amit a gyártó protokollja szerint mi magunk állítottunk elő a Sigma-Aldrich-tól vásárolt BSA és FITC felhasználásával. A humán szérumból tisztított SHBG-t (szex hormon kötő globulin, 527-30) a Lee Biosolutions (St. Louis, MO, USA) -tól rendeltük.

31

A sejtszámoláshoz tripánkék vitális festéket használtunk (0.8 g beoldva 500 ml 145 mM NaCl-oldatban), amelyet a Sigma-Aldrich-től rendeltünk. Az áramlási citofluorimetriához és konfokális mikroszkópiához történő jelölések előtt a tanszéken tisztított egér FcγRII/III specifikus (monoklonális egér IgG2a, K9.361 klón) ellenanyagot használtunk az Fc receptorok blokkolásához. Az elsődleges ellenanyagok közül az anti-ERα-t (poliklonális nyúl IgG, sc-542, ERα CCC) és az anti-megalint (poliklonális nyúl IgG, sc-25470, a megalin 4411-4655 aminosavait ismeri fel) a Santa Cruz Biotechnology-tól (Heidelberg, Németország), az anti-ERβ-t (poliklonális nyúl IgG, SAB4500814) és az anti-SHBG-t (poliklonális nyúl IgG, az SHBG C terminálisának 103-402 aminosavait ismeri fel) a Sigma-Aldrichtól, az anti-GPR30-t (polilonális nyúl IgG, SP4675, a GPR30 harmadik extracelluláris doménjét ismeri el) pedig az Acris-tól (Herford, Németország) szereztük be. Az anti-CD24 (patkány IgG2bκ, ATCC TIB-125, M1/69.16.11. klón), az anti-Thy-1 (CD90 Alexa 647-tel konjugálva patkány IgG2cκ, G7.4 klón), az anti-CD19 (jelöletlen, vagy Alexa 647-tel konjugálva patkány IgG2aκ, ATCC HB-305, 1D3 klón), az anti-CD8 (patkány IgG2a, 53.6 klón), az anti-CD4 (patkány IgG2b, ATCC TIB-207, GK1.5 klón) egér ellenanyag klónok tanszékünkön megtalálhatóak, így magunk tisztítottuk hibridóma felülúszóból

proteinG-sepharose

(Thermo-Pierce,

Rockford,

IL

USA)

affinitás

kromatográfiával a gyártó protokollja szerint, ill. jelöltük egyes esetekben Alexa fluoroforral, szintén a gyártó protokollja szerint (Invitrogen- Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). A PE-nel konjugált anti-egér CD3-t (patkány IgG2bκ, 17A2 klón, 100205) és a PerCP/Cy5.5-tel konjugált anti-egér CD4-t (patkány IgG2aκ, RM4-5 klón, 10054), valamint a hozzájuk tartozó PE-nel konjugált patkány IgG2bκ (RTK4530 klón, 400608) és PerCP/Cy5.5-tel konjugált patkány IgG2aκ-t (R5K2758 klón, 400531) a Biolegendtől (London, UK) rendeltük. Az izotípus kontrollként használt nyúl anti-hörcsög IgG (H+L)-t (6211-01), valamint a másodlagos ellenanyagként használt kecske anti-nyúl IgG (H+L)-HRP-t, kecske antiegér IgM (H+L)-HRP-t és kecske anti-egér IgG (H+L)-HRP-t a Southern Biotechnology-tól szereztük be. Az Alexa Fluor 488 és -647 konjugált kecske anti-nyúl IgG (H+L) LifeTechnologies-Molecular Probes-tól rendeltük. Az Alexa Fluor 647-tel konjugált anti-patkány IgG2b (egér IgG1, MAR 4/4 klón), ill. az Alexa Fluor 647-tel 32

konjugált anti-patkány IgG2a (egér IgG2b, MAR1/8 klón) szintén a tanszékünkön került tisztításra hibridóma felülúszóból és lett fluoreszcensen megjelölve. A plazmamembránban található GM1-gangliozid (raft-marker lipid) jelöléséhez az Alexa Fluor 488, -555, -647 fluorofórral konjugált koleratoxin B-alegységét használtuk, amelyet a LifeTechnologies-Molecular Probes-tól szereztünk be. A sejtmagok megfestéséhez a Biostatustól (Leicestershire, UK) rendelhető DRAQ5 festéket használtuk. A MitoTracker Orange CMTMR mitokondrium markert, a LysoTracker Red DND-99 lizoszómális markert, valamint a BODIPY-brefeldinA558/567 endoplazmatikus retikulum markert a LifeTechnologies-Molecular Probes-tól szereztük be. Az anti- EEA-1 korai endoszóma antigén-1 specifikus (poliklonális kecske IgG, sc-6414, C-15 klón) ellenanyagot a Santa Cruz Biotechnology-tól rendeltük. A Western blot mérés során kontrollként használt ellenanyagok közül az anti-LAMP1 (poliklonális nyúl IgG, SAB3500285) endo-lizoszómára specifikus, a Sigma-Aldrich-től, az anti- NFκB p65-t (poliklonális nyúl IgG, sc-372) és az anti-SHP2-t (monoklonális egér IgG, sc-7384) a Santa Cruz Biotechnology-tól szerezük be. A sejtek aktiválásához használt LPS-t, ConA-t, és KLH-t a Sigma-Aldrichtől rendeltük. Az LPS-t és KLH-t a gyártó leírása szerint (Sigma-Aldrich) a laborban magunk jelöltük FITC-el. A komplett Freund adjuvánst (7023) a Chondrextől szereztük be. Az aktivált sejtek proliferációját az American Radiolabeled Chemicals-tól (St. Louis, MO, USA) kapható [H3] Timidin- nel (37MBq) vizsgáltuk. A plazmamembrán koleszterin tartalmát a CycloLab (Budapest, Magyarország) által forgalmazott

MBCD-vel

(Methyl-β-ciklodextrin)

vontuk

ki.

A

plazmamembrán

integritását a Sigma-Aldrichtől rendelt Brij 98, gyenge nem-ionos detergenssel bontottuk meg. A nőstény egerek ciklusának szinkronizálásához PMSG (terhes kanca szérum gonadotropin), valamint HCG (humán Chorionic gonadotropin) oltást alkalmaztunk, ezeket a hormonokat a Sigma-Aldrichtől szereztük be. A mER reciklizációjának vizsgálatakor a fehérjék lizoszómális degradációját klorokvin difoszfáttal, az aktin polimerizációját pedig Latrunculin B-vel, vagy Cytochalasin D-vel gátoltuk, amelyeket szintén a Sigma-Aldrichtől szereztük be.

33

3.4 . Módszerek 3.4.1. Lépsejtek és timociták izolálása, T és B sejt szeparálás A 6-8 hetes C57BL/6 nőstény vagy hím egerekből, cervikális diszlokációt követően eltávolítottuk a lépet, vagy a tímuszt. A lépsejteket és timocitákat fenolvörös mentes GKN oldatban mechanikai roncsolással nyertük ki. A vörösvérsejtek lízisét 5 ml ACK oldattal 1 percig történő kezeléssel értük el. A T sejteket negatív szelekción alapuló MACS mágneses gyöngy szeparáló kit-tel izoláltuk (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Németország) a használati útmutatónak megfelelően, negatív szelekciós eljárást alkalmazva. Röviden: a lépsejteket biotinnal konjugált kecske anti-egér IgM ellenanyaggal jelöltük telítési koncentráción MACS pufferben 30 percig, jégen. Ezután óvatosan mostuk MACS pufferrel, majd anti-biotinos mikrogyönygyökkel inkubáltuk 4 ̊C-on 15 percig. A soron következő mosási lépés után a MACS pufferben felvett sejteket LS típusú MACS oszlopra rétegeztük. A mágneshez nem kötődött sejtek átfolytak az oszlopon, az így kapott T sejtben gazdag frakciót ösztrogén mentes médiumban vettük fel. B sejtek szeparálásához szintén negatív szelekción alapuló kit-et használtunk (EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit, Stem Cell Technologies). A leírásnak megfelelően minden inkubáció 4 ̊C-on 15 percig történt. A negatív szelekciót szolgáló ellenanyag koktélt (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1), TER119 markerekre specifikus) követte a biotinnal konjugált második ellenanyag koktél, majd a mágneses nanoszemcséket tartalmazó oldatot adtuk hozzáadása a lépsejtszuszpenzióhoz. Végezetül a sejteket tartalmazó csövet egy mágnesbe helyeztük (EasySep) majd 5 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után a B sejteket egy határozott mozdulattal átöntöttük egy új csőbe. A szeparálás hatékonyságát áramlási citofluorimetriás méréssel ellenőriztük. 3.4.2. BSA jelölése FITC-cel 5 mg/ml koncentrációjú, PBS-ben feloldott BSA-t jelöltük FITC-el, 0.1 M bikarbonát pufferben (pH 8.3-9), úgy hogy 1 mg fehérjére kb. 100 µg festék jusson, majd 1 órát kevertettük szobahőmérsékleten. A kialakult BSA-FITC komlexektől a nem kötődött FITC-et Sephandex G25 oszlopon való átfolyatással különítettük el. Az egyes frakciók 34

koncentrációját és fehérje/festék arányát a NanoDrop ND-1000 spektrofotométer (NanoDrop Technologies) segítségével, a 280nm-en és 492nm-en lemért abszorpciós (A) értékekből számoltuk ki a következő képletek alapján, 1cm-es fényútra vonatkoztatva:

Ahol CF az adott festékre jellemző korrekciós faktor (FITC esetében 0.35), A279nm pedig a fehérje 1g/L-re vonatkoztatott optikai denzitása (BSA esetében 0,667).

Ahol az Mw a molekulatömege (BSA: 66,463 Da), az ɛ pedig a fluoreszens festék moláris extinkciós koeffíciense (FITC: 69000 M-1cm-1).

Emellett a gyári E2-BSA-FITC festék/fehérje arányát is meghatároztuk az ultraszűrés után (ld. 3.4.3. alfejezet), és mindig annak megfelelően választottuk ki, hogy melyik az ideális kontrollként használható BSA-FITC frakció. 3.4.3. E2-BSA-FITC és BSA-FITC ultraszűrése Ahol E2-BSA-FITC-et vagy BSA-FITC-et használtunk a vizsgálathoz, ott a mérést megelőzően meg kellett tisztítanunk az oldatainkat az esetlegesen szabaddá vált E2-től és FITC-től [97]. Ezt a BSA molekulasúlyának (66 kDa) megfelelően egy 10 kDa alatti molekulatömegű anyagokat átengedő Microcon cartridge (Amicon, Millipore, Billerica, MA, USA) ill. 13.000 g-vel 30 percig 4 ̊C-on végzett centrifugálás segítségével értük el [96]. A szűrést követően NanoDrop ND-1000 spektrofotométer segítségével határoztuk meg az oldatok fehérje koncentrációját; ill. a fehérje molekulákra jutó FITC festékmolekulák számát. Így biztosítottuk, hogy a két anyagnál eredményül kapott fluoreszcencia intenzitás értékek valóban összemérhetőek legyenek. 35

A marha szérum albuminnal kovalensen kapcsolt, így membrán impermeábilissá tett ösztrogén (E2-BSA-FITC) lehetővé teszi, hogy csak a sejtfelszíni ER-kat jelöljük [96]. Előzetes mérések során a kontrollként használt ösztrogénmentes BSA-FITC minden esetben csak minimális kötődést mutatott limfocitákon; így kizárható annak lehetősége, hogy a marha szérum albuminnal kapcsolt E2 jelölődést a BSA pozitív irányban befolyásolja. 3.4.4. Áramlási citofluorimetriával végzett vizsgálatok Az áramlási citometriás méréseket egy Ar+ lézerrel (488nm) és egy vörös dióda lézerrel (~635nm) felszerelt BD FACSCalibur (Becton-Dickinson, San José, CA, USA) készülékkel végeztük. A kísérletek során 106 sejt/minta volt a beállított sejtsűrűség, a jelölés PBS-ben történt, és 10.000 sejt került leszámolásra mintánként. Az Fc receptorokat a jelöléseket megelőzően 10 perces 20 µg/ml K9.361 monoklonális ellenanyaggal történő inkubálással blokkoltuk. Az adatgyűjtés CellQuest Pro szoftverrel (Becton-Dickinson), a kiértékelés FCS express (DeNovo) és FlowJo (Treestar) szoftverekkel történt. A relatív átlag fluoreszcencia értékeket (RMF) a specifikus jel átlag fluoreszcencia értékének és a kontroll átlag fluoreszcencia értékének hányadosából határoztuk meg, miután az autofluoreszcencia értékét kivontuk belőlük. A plazmamembrán ösztrogén receptorok jelölésekor a sejteket (lépsejtek, szeparált T és B sejtek, timociták) 1 mg/ml végkoncentrációban E2-BSA-FITC-cel, kontrollként BSAFITC-cel inkubáltuk 37 ̊C-os CO2 termosztátban 15 percig [96, 97]. Egyes mérések során a különböző sejtpopulációkat sejtfelszíni markerek alapján különítettük el, az általános FACS jelölési protokolt alkalmazva (elsődleges és másodlagos ellenanyagok esetében is 30 perc, jégen). A kompetitív kötődési vizsgálat során az E2-BSA-FITC és BSA-FITC jelölés előtt a sejteket 100 nM E2-vel, vagy annak megfelelő higítású oldószer kontrollal kezeltük elő 30 percig jégen. Azért jégen történt az ösztrogén adagolás, hogy a fiziológiás körülmények között membránban lezajló folyamatokat (pl. receptor internalizáció) kizárhassuk, ill. hogy nagyobb eséllyel biztosítsuk az E2 feltételezett membrán receptorához való kötődését az intracelluláris receptorokkal szemben. Majd a kezelést követően a sejteket mostuk (1200 rpm, 10 perc, 4 ̊C). 36

A plazmamembrán koleszterin depléciójához a sejteket 10 mM MBCD-vel kezeltük 37 ̊C-os CO2 termosztátban, 10 percig [98]. Majd a PBS-sel történő mosás után (1200 rpm, 10 perc, 4 ̊C) következett az E2-BSA-FITC-cel történő jelölés. Brij 98 gyenge nem ionos detergens 0.05% -os oldatával 10 percig 37 ̊C-os CO2termosztátban inkubáltuk a sejteket, hogy megbontsuk a membrán szerkezetét. Majd a kezelést követően a sejteket PBS-sel mostuk (1200 rpm, 10 perc, 4 ̊C). A mER internalizációjának vizsgálatához 15, 20, 25, 30, 45, 60 és 90 percig jelöltük a sejteket 1 mg/ml E2-BSA-FITC-el vagy 1 mg/ml BSA-FITC-el 37 ̊C-os CO2 termosztátban, majd kétszer mostuk. Az áramlási citometriás mérés előtt az adott mintasorokhoz 5 µg/ml tripánkék oldatot adtunk, hogy a FITC sejtfelszínről származó fluoreszcens jelét kioltsuk (ún. quenching technika). Így a sejtfelszínről és a sejt belsejéből származó E2-BSA-FITC jel összevetésével követni tudtuk az internalizáció folyamatát [99]. A mER reciklizációjának monitorozásához a sejteket először 1 mg/ml E2-BSA-val vagy 1 mg/ml BSA-val inkubáltuk 20 percig jégen; majd kétszer mostuk a mintákat, hogy a nem kötődött ösztrogén konjugátumokat biztosan eltávolítsuk a sejtszuszpenzióból. Ezután a sejtek visszakerültek a 37 ̊C-os CO2-termosztátba még 15, 45 vagy 75 percre. hogy a mER internalizálódni ill. reciklizálódni tudjon. Az inkubációs időket összegezve lettek előkezeletlen, ill. 15, 30, 60 és 90 perces E2-BSA-val vagy BSA-val kezelt sejtjeink. Végezetül az mER-t a már korábban említett E2-BSA-FITC jelöléssel tettük láthatóvá. A mER reciklizációjának gátlásához a fentebb leírt protokollt alkalmaztuk, csak 5 µM latrunculin B-t, 20 µM cytochalasin D-t, vagy 0.2 mM klorokvin difoszfátot adtunk a ligandummal együtt a sejtekhez. A latrunculin B és a cytochalasin D az aktin citoszkeletont átépülését blokkolja, a klorokvin difoszfát pedig az internalizálódott receptor-ligandum komplex lizoszómális degradációját akadályozza meg. A klasszikus ERα és ERβ, valamint a GPR30 intracelluláris vizsgálata során a sejteket először fixáltuk 250 µl 0.5% paraformaldehid (PFA) oldattal 10 percig szobahőmérsékleten, majd mosást követően 500 µl 0.1% szaponint és 1% BSA-t tartalmazó PBS oldatban permeabilizáltuk 10 percig szobahőmérsékleten. Innentől a 37

mosási lépések is ezzel a szaponinos oldattal történtek. 10 perces 20 µg/ml K9.361 monoklonális ellenanyaggal történő Fc receptor blokkolást követően a sejteket a fentebb említett szaponinos oldatba hígított 2 µg/ml nyúl poliklonális anti-ERα, anti-ERβ, vagy 10 µg/ml poliklonális nyúl anti-GPR30 ellenanyaggal jelöltük szobahőmérsékleten 30 percig. Mosás után a sejteket 2 µg/ml Alexa 488-tel konjugált anti-nyúl IgG ellenanyaggal inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. A jelölést követően a sejteket PBS-sel mostuk (1200 rpm, 10 perc, 4 ̊C). 3.4.5. Konfokális mikroszkópiával végzett vizsgálatok A fluoreszcens mikroszkópiás felvételek egy Ar+ lézerrel (488nm), egy zöld He-Ne (543nm) és egy vörös He-Ne (632nm) lézerrel felszerelt Olympus IX81 alapú FLUOView 500 lézerpásztázó konfokális mikroszkóppal (Olympus Europe, Hamburg, Germany) készültek. A fluoreszcens és DIC (differenciál interferencia kontraszt) képek 512x512 pixel képfelbontásban, 60x olajimmerziós objektívvel (N.A.:1.20) kerültek felvételre. A képfeldolgozást és kiértékelést a “Wright Cell Imaging Facitility” weboldaláról elérhető Image J szoftverrel (http://rsbweb.nih.gov/ij ;Wayne Rasband, NIH, Bethesda) végeztük. A mikroszkópiához használt üveglemezeket, ill. boroszilikát kamrákat (Nunc™ LabTek™ II Chamber Slide™ System, Thermo Fisher Scientific Inc, Dreieich, Németország) előzetesen 0.01%-os poly-L-lysine oldattal kezeltük szobahőmérsékleten 15 percig, majd az oldatot eltávolítva hagytuk azokat megszáradni.

Ezzel biztosítottuk a sejtek jobb

kitapadását, így a szekvenciális pásztázás során elkerülhető volt az elmozdulásuk. A mER plazmamembrán lipid raftokkal való kolokalizációjának vizsgálata során IP12-7 és A20 sejtvonalat, valamint lépből származó szeparált T- és B sejteket (5x105/minta) használtunk. Az 1 mg/ml E2-BSA-FITC-el és 1 mg/ml BSA-FITC-el 37 ̊C-os CO2termosztátban 15 percig történő inkubálás után mostuk a sejteket, majd a T sejtek esetében Alexa 647-tel konjugált anti-egér Thy-1-gyel, a B sejtek esetében anti-egér CD24-gyel és Alexa 647-tel jelölt anti-patkány IgG2b ellenanyaggal jelöltük a jellemzően GPIhorgonyzott membránfehérjéket. Ezt követően a GM1 és GM3 gangliozidokhoz kötődő, így szintén lipid raft markerként szolgáló 5 µl 40 µg/ml Alexa 555-el konjugált kolera toxin B algységgel (CTX-B) jelöltük a sejteket 10 percig, jégen. Mosást követően a 3%-os paraformaldehiddel fixáltuk a mintákat 20 percig jégen. Kiértékelés során az adott raft38

markerek és az E2-BSA-FITC kolokalizációjának mértékét mintánként legalább 150 sejtből határoztuk meg. A sejtek különböző Z síkjaiban az ún. ROI-ra (Region of Interest) számoltattuk a kiértékelő programmal a Pearson korrelációs koefficienst. Ez a +1 és -1 közé eső kolokalizációs index információt ad két változó (a kétféle színű fluoreszcens jel) nem véletlenszerű térbeli kapcsolatának erősségéről. A 0.2 értéket meghaladó koefficiens például már viszonylag jelentős kolokalizációt jelent két jelzett molekula között, raft markerekkel történő analízisnél pedig a 0.5 és annál magasabb koefficiens általában a konstitutíven raft-asszociált fehérjékre jellemző [100]. Az

E2-BSA-FITC-mER

komplex

internalizációt

követő

lokalizációjának

meghatározásához különböző sejtalkotókra specifikus festékeket használtunk. A 30 perces internalizációt követően anti-EEA1 ellenanyaggal jelöltük a korai endoszómákat (fixált/permeabilizált sejtek, 2 µg/ml, 30 min szobahőmérséklet). A 60 percig tartó internalizáció után LysoTracker Red 577/590-el (intakt sejtek, 75 nM, 30 perc, 37 ̊C) a lizoszómákat, BODIPY-Brefeldin A558/568- cal (fixált/permeabilizált sejtek, 100 nM, 30 perc, 37 ̊C) az endoplazmatikus retikulum/Golgi komplexet, MitoTracker A554/576-tal (intkat sejtek, 50 nM, 30 perc, 37 ̊C) a mitokondriumot, Draq5-al (intakt sejtek, 2.5 µM, 10 perc, 37 ̊C) pedig a sejtmagot jelöltük. A különböző markerekkel való jelölés előtt a sejteket 1 mg/ml E2-BSA-FITC-cel inkubáltuk elő (106/minta, 30 perc, 37 ̊C-os CO2termosztát). Membránjelölésként Alexa 555-el vagy Alexa 647-el konjugált kolera toxin B-t alkalmaztunk (40 µg/ml, 10 perc, jégen). A klasszikus ösztrogén receptorok és a GPR30 ösztrogén függő lokalizációjának vizsgálatához a lépsejteket (2x106) először 1 mg/ml E2-BSA-val vagy 100 nM E2-vel ill. ennek megfelelő hígítású kontrolljaikkal kezeltük elő 0, 15, 30, 45 vagy 60 percig 37 ̊C-os CO2-termosztátban. A membránt Alexa 555-el konjugált kolera toxin B-vel jelöltük (40 µg/ml, 10 perc, jégen) a sejtmagot pedig Draq5-el (2.5 µM, 10 perc, 37 ̊C). Ezt követően a sejteket 0.5% PFA-val fixáltuk (10 perc, szobahőmérséklet), majd mosást követően 0.1% szaponint

és

1%

BSA-t

tartalmazó PBS

oldattal permeabilizáltuk (10 perc,

szobahőmérsékleten). Innentől kezdve a mosási és jelölési lépések is ezzel a szaponinos oldattal történtek. A sejteket 2 µg/ml ERα, ERβ vagy 10 µg/ml GPR30 specifikus ellenanyaggal jelöltük az Fc receptorok blokkolását követően (30 perc, szobahőmérséklet). A mosási lépés után 2 µg/ml Alexa 488-al konjugált kecske anti-nyúl IgG másodlagos 39

ellenanyaggal inkubáltuk a sejteket 30 percig szobahőmérsékleten. PBS-sel történő mosást követően pedig vizsgáltuk a mintákat. A donor fotohalványodási FRET (pbFRET) méréshez a sejteket 1 mg/ml E2-BSAFITC-cel jelöltük (20 perc, jégen), majd a mosási lépést követően SHBG-re, vagy ERα-ra specifikus ellenanyagot alkalmaztunk, Alexa 555-tel konjugált másodlagos ellenanyaggal párosítva. Az anti-SHBG jelölés intakt sejtek sejtfelszínén történt, míg az anti-ERα-val a permeabilizált sejteket intracellulárisan jelöltük (a korábban leírtakkal megegyezően). A donort (FITC) 488nm-en maximális lézerintenzitással fotohalványítottuk, majd követtük az egyes sejtek fluoreszcencia intenzitásának változását (emisszós filter:515±1 nm, 60x objektív, 8x zoom). A mért fotohalványodási adatokhoz GraphPad Prism 4.00 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) program segítségével exponenciális függvényt illesztettünk, majd azokból meghatároztuk a fotohalványodási állandót (τ). Ha a donor és az akceptor (Alexa 555) molekulák 2-10 nm távolságban vannak egymástól, akkor azok között energiatranszfer tud fellépni (E). Az energiatranszfer hatásfokát a következő képlet alapján számítottuk [101].

Ahol a τD a csak donorral jelölt sejtek fotohalványodási állandóinak átlaga, a τDA pedig a donorral és akceptorral együttesen jelölt sejtek fotohalványodási állandóinak átlaga. 3.4.6. Plazmamembrán szeparátum készítése 5x107 sejt/ml koncentrációban proteáz inhibítorokat is tartalmazó hipoozmotikus pufferben 15 percig jégen inkubáltuk a lépsejteket. A sejtszuszpenziót ezt követően 5 percig jégen üveg homogenizátorral mechanikailag roncsoltuk, majd 400g-vel fugáltuk 4 ̊C-on,

5

percig

(Jouan

CR

312

Centrifuge).

Hogy

megszabaduljunk

a

sejtorganellumoktól, a továbbiakban a felülúszót 120.000g-vel 20 percig 4 ̊C-on ultracentrifugáltuk (Optima TL Ultracentrifuga, TLA 100.1 rögzített szögű rotor BeckmanCoulter), majd a pelletet lízis pufferben szuszpendáltuk fel. 60 perces jégen történő inkubációt követőn a lizátumot 15.000g-vel 4 ̊C 15 percig fugáltuk (B.Braun Sigma 2K15 Centrifuga), majd a felülúszót használtuk a további vizsgálatokhoz. 40

3.4.7. Ösztrogén receptorok expressziójának vizsgálata plazmamembrán szeparátumban Western blot technikával

sejtlizátumban

és

A különböző ösztrogén receptorok jelenlétének vizsgálata során a fentebb említett plazmamembrán szeparátumok mellett kontrollként teljes sejtlizátumokat is használtunk. Az ún. teljes sejtlizátum esetében a sejteket (5×106/ml) 100µl lízis pufferrel szolubilizáltuk, majd a 60 percig tartó jégen történő inkubálást követően 15.000g-vel, 15 percig, 4 ̊C-on centrifugáltuk. A membrán szeparátum és sejtlizátum felülúszóit is ötszörös koncentrációjú redukáló szerrel 95 ̊C-on 5 percig főztük. A mintákat 1mm-es 12% SDS-PAGE gélben futattuk. Az elektroforézist Bio-Rad márkájú Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) készülékben végeztük 130V feszültség mellett. Az elektroforézis során szétválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra (Bio-Rad) blottoltuk 25V feszültségen 30 percig BioRad Trans-Blot Semi Dry készülékben. A kiválasztott célfehérjék kimutatásához a membránokat adott specificitású elsődleges ellenanyaggal (anti-ERα, anti-ERβ, antiGPR30, anti-LAMP1 anti-NFκB, anti-SHP-2), illetve HRP-vel konjugált másodlagos ellenanyaggal inkubáltuk, majd Super Signal West Pico kemilumineszcens reagens (Thermo-Pierce) segítségével Kodak röntgenfilmen hívtuk elő. Az előhívás protokollja minden esetben ugyanaz volt: először a nitrocellulóz membrán szabadon maradt kötőhelyeit blokkoltuk 5%-os BSA-t tartalmazó mosópufferrel 1 órát szobahőmérsékleten billegőasztalon inkubálva. Ezután 3-4 alkalommal mosópufferrel leöblítettük a membránt, majd az előhívandó fehérjénkre specifikus 5% BSA-t és 0.05% NaN3-t tartalmazó mosópufferben hígított ellenanyaggal (1:1000) 4 ̊C-on egy egész estén keresztül (~16 óra) billegőasztalon inkubáltuk a membránokat. A mosást követően 5% BSA-t tartalmazó mosópufferben hígított (1:5000) HRP-vel konjugált anti-nyúl másodlagos ellenanyaggal szobahőmérsékleten, billegőasztalon 1 órát inkubáltuk a membránokat. Az újabb mosási lépéseket követően történt a kemilumineszcens reagens segítségével a fehérjék detektálása a gyártó (Millipore) által megadott protokoll szerint. A plazmamembrán szepratátumunk tisztaságát az anti-NFB és anti-LAMP1 (endolizoszóma marker) magi és citoplazmatikus elemeket jelölő ellenanyagok segítségével támasztottuk

alá.

Loading

kontrollnak

anti-SHP2

ellenanyagot

(mind

a

plazmamembránban, mind a citoszólban megtalálható) használtunk.

41

3.4.8. Az ösztrogén sejtproliferációra kifejtett hatásának vizsgálata [H3]-timidin beépüléssel A sejtproliferációs vizsgálatokhoz 96-lyukú, U-aljú sejttenyésztő lemezt (Corning) használtunk. 200 µl végkoncentrációjú ösztrogén mentes médiumban 106 lépsejtet aktiváltunk 1 µg/ml ConA-val (T sejt kultúra), vagy 5 µg/ml LPS-sel (B sejt kultúra). Emellett a sejtekhez adtunk még 100 nM E2-t (végig jelen volt a sejttenyésztő médiumban), vagy 100 nM E2-BSA (37 ̊C-on 1 óra E2-BSA-val történő inkubálást követően a sejtek ösztrogén mentes médiumban kerültek a sejttenyésztő lemezre) ill. a nekik megfelelő hígítású kontrollokat (etanol, BSA) alkalmaztuk. A sejtosztódást T sejt kultúra esetén a harmadik nap, B sejt kultúra esetén a negyedik nap utolsó 12 órája során bekövetkezett [H3]-timidin (40 Beq/ minta) beépülés alapján határoztuk

meg

folyadékszcintillációs β-számlálókészülék segítségével (Wallac 1409 Liquid Scintillation Counter) 3.4.9. Immunizálás FITC-KLH-val 6-8 hetes C57BL/6 hím egereket 200 µg FITC-KLH-val - T-dependens antigén oltottuk (fiziológiás sóoldatban hígítva), 1:1 arányban komplett Freund adjuvánssal keverve. Az állatok összesen 500 µl-nyi oltóanyagot kaptak elosztva a talppárnákba, faroktőbe és intraperitoneálisan egyszerre. Az egereket az oltást követő tizedik napon dolgoztuk fel. 3.4.10. Az ösztogén antigén specifikus immunválaszra kifejtett hatásának vizsgálata in vitro sejtkultúrában A FITC-KLH-val történő oltást követő tizedik napon az egerek lépét és lágyéki, valamint térdhajlati nyirokcsomóit eltávolítottuk, majd ezekből egy kevert kultúrát állítottunk elő. 200 µl végkoncentrációjú ösztrogén mentes médiumban 106 sejtet aktiváltunk 5 µg/ml FITC-KLH-val, ill. kontrollként 1 µg/ml FITC-LPS-sel, vagy aktiválószer nélkül tenyésztettük őket. 96-lyukú, U-aljú sejttenyésztő lemezt (Corning) használtunk. Emellett az ösztrogén hatások vizsgálatához a médiumhoz adtunk 100 nM E2-t, vagy 100 nM E2-BSA-t, ill. a nekik megfelelő higítású kontrollokat (etanol, BSA). A sejtkultúra összeállítását követő ötödik napon friss médiumot adtunk a sejtekhez aktivátorok nélkül, az addigi hormon koncentrációt továbbra is biztosítva. Majd az ezt követő harmadik napon felülúszót gyűjtöttünk ellenanyag meghatározás céljából. 42

3.4.11. Ellenanyag termelés vizsgálata ELISA módszerrel Az antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához az ELISA lemezeket 5 µg/ml FITCKLH-val fedtük be (egy éjszakán át történő inkubálás, 4 ̊C) majd háromszor mostuk 0.05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (PBS-T). Ezek után 50 µl felülúszót adva 1 órát inkubáltuk szobahőmérsékleten a lemezeket. Újabb 3 mosási lépést (PBS-T) követően pedig 1:2000 higításban alkalmazott HRP-konjugált anti-egér IgM-mel, ill. IgG-vel inkubáltuk további 1 órát szobahőmérsékleten. A mosási lépéseket követően (PBS-Tween) pedig H2O2 / TMB (tetramethylbenzidine) szubsztráttal tettük láthatóvá. A reakciót H2SO4gyel állítottuk le Az optikai denzitást 450 nm-en ELISA olvasóval mértük meg (Multiscan Ex., Thermo Electron Corporation). 3.4.12. Egér ivari ciklus szinkronizálása hormonoltással 6-8 hetes C57BL/6 nőstény egereket az első nap 100 µl 5 nemzetközi egység (NE) PMSG-vel (terhes kanca szérum gonadotropin), majd a harmadik napon az előzővel megegyező időpontban 100 µl 5 NE HCG-vel (humán korion gonadotrop hormon) oltottuk intraperitoneálisan [102]. A hormonok fiziológiás sóoldatban voltak oldva. A hormonkezelés hatására a negyedik napra az egerek egyszerre ovuláltak. Ezután 5 napon át napi 3 nőstény és kontrollként 3 hím egeret dolgoztunk fel az ösztrogén receptorok expressziós mintázatának vizsgálatához. Ezenkívül egyedenként szérummintát, ill. a közös hím és nőstény ketrecből 1-1g bélsár mintát gyűjtöttünk az ösztrogén (E2) és progeszteron (P4) szintjének meghatározásához. 3.4.13. Bélsár és szérum minták hormonszint meghatározása A bélsár E2 és P4 metabolitjainak meghatározásához először extrahálni kellett a benne lévő szteroidokat. Ehhez 0.500 g bélsarat 0.5 ml desztilált vízzel kevertünk össze egy vastag falú csőben, majd további 4 ml 80%-os metanolt adtunk hozzá. A lezárt csöveket Multi-Tube vortex-el 30 percig rázattuk. Ezt követően a mintákat centrifugáltuk (4 ̊C, 2215g, 30 perc) és a fagyasztóba tettük (-20 ̊C, 30 perc). A felső metanolos fázisból 1 ml-t kimérve végeztük el a hormon meghatározást RIA módszerrel [103]. Ezeket a méréseket Dr. Kulcsár Margit vezetésével a Szent István Egyetem Állatorvositudományi karának Szülészeti és Szaporodásbiológiai Tanszékén végezték számunkra. 43

3.4.14. Statisztikai analízis Két csoport közötti statisztikai különbségek vizsgálatához 2 mintás Student t-próbát alkalmaztuk; ha a varianciák eltérőnek bizonyultak, akkor Welch korrelációval egybekötve. Több normál eloszlású csoport közötti statisztikai elemzéshez One-way ANOVA tesztet alkalmaztunk. Az analíziseket GraphPad Prism programmal végeztük. p<0.05 (*) és p<0.01 (**) esetén a csoportok közötti különbséget szignifikánsnak tekintettük.

44

4. Eredmények 4.1. A limfociták membrán-asszociált ösztrogén receptort (mER) expresszálnak a sejtfelszínükön A mER vizsgálatához a szakirodalomban is széles körben alkalmazott membrán impermeábilis β-E2-BSA-FITC konjugátumot használtuk kísérleteink során [104]. Ahogy a 7. ábra B reprezentatív hisztogramján is látszik az E2-BSA-FITC 15 perces 37 ̊C-on történő inkubációt követően kötődött C57/BL6 egerekből izolált lépsejtek felszínéhez, míg a kontrollként használt BSA-FITC elhanyagolható háttérjelet adott; ezek alapján feltételezhetjük a mER jelenlétét limfocitákon.

7. ábra. Az egér lépsejtek plazmamembránjában megtalálható a membrán-asszociált ösztogén receptor (mER). (A) A totál lépsejtszuszpenzióból történő áramlási citofluorimetriás méréseink során az FSC SSC dot plot alapján különítettük el a limfocita sejtpopulációt. (B) Limfocitákon a mER jelenlétét az E2-BSA-FITC kötődésével (szagatott vonal) mutattuk ki, míg a negatív kontroll BSAFITC (folytonos vonal) csak kismértékű nem-specifikus kötődést mutatott az autofluoreszcenicához képest (szürke görbe). Egy reprezentatív hisztogram látható (független mérések száma N >5). (C) A kompetitív kötődési vizsgálat során a 100 nM E2 előkezelés csökkentette az E2-BSA-FITC kötődését. Az eredmények átlaga +/- szórás három független mérésből származik. A statisztikai elemzést Oneway ANOVA -teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01). RMF= E2-BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke/ BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke.

45

A mER ösztrogén specifikusságát kompetitív kötődési vizsgálattal támasztottuk alá, amely szerint a 100 nM E2-vel történő 30 perces jégen történő előinkubálás csökkenti az E2-BSA-FITC kötődését, míg az oldószer kontrollként használt etanolnak nincs szignifikáns hatása (7. ábra C). Egér lépből szeparált T és B sejteken végzett kísérletek alapján az α- és β-E2-BSAFITC kötődés dózis- és időfüggése szintén a kötődés specifikusságára és viszonylag gyors, receptor közvetített voltára utal. A β-ösztradiollal szemben az α-ösztradiolnak az irodalomban leírtak alapján nincsen kimondott ösztrogén aktivitása, az 5α-reduktáz enzim inhibítoraként működik, amely enzim a tesztoszteron dihidrotesztoszteronná való átalakításáért felelős. A két ösztrogén vegyület között csupán annyi az eltérés, hogy a szterán vázon belül található két hidroxil csoport cisz vagy transz helyzetben található [105]. Ugyan mindkét féle ösztradiol telítődő kötődést mutat limfocitákon (8. ábra), de biológiai aktivitásuknak megfelelően munkacsoportunk kizárólag a β-ösztradiollal tudott nem-genomiális hatásokat indukálni (Akt és Erk foszforiláció, valamint a T sejtek intracelluláris Ca2+ szint emelkedését), amely szintén ezen hatások E2 specifikusságára utal [25]. A dolgozat hátralevő részében ösztrogént említve mindig a β-ösztradiolra utalok.

8. ábra. A 17α- és 17β-E2-BSA-FITC is koncentráció függő telítődő kötődést mutatott T és B sejteken (15 min, 37 ̊C). Kontrollként a BSA-FITC kötődését is feltüntettük. Az eredmények átlaga +/szórás három független mérésből származik. RMF=E2-BSA-FITC átlag fluoreszcencia intenzitás értéke/BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke.

46

4.2. A mER differenciált expressziót mutat hím és nőstény C57BL6 egerekből származó limfociták sejtfelszínén Az E2-BSA-FITC kötődése alapján összehasonlítottuk a hím és nőstény egerek mER expresszióját. Eredményeink alapján mindkét nem limfocitái rendelkeznek membrán ösztrogén receptorral. A nőstény egerek esetében tapasztalható fokozottabb mértékű E2BSA-FITC jel arra enged következtetni, hogy magasabb a mER szintjük. Továbbá hímekkel ellentétben a nőstényekből származó limfociták mER expressziójának mértékében jóval nagyobb szórás tapasztalhattunk (9. ábra). Ez feltehetően az ivari ciklus során bekövetkező hormonális változásokkal magyarázható, amely során visszacsatolási szabályozási mechanizmus feltétlezehő. Mivel hímekre nem jellemző a ciklusos hormonális ingadozás, így érthető, hogy ott jóval egyenletesebb a receptor megjelenése. Ezért más munkacsoportokhoz hasonlóan a jobb reprodukálhatóság érdekében a továbbiakban hím egereken végeztük a vizsgálatainkat [106, 107]. (Az előzőekben bemutatott idő- és koncentráció függő kötődést, valamint az E2 indukálta nem-genomiális hatásokat mindkét nem limfocitáin kimutattuk).

9. ábra. A mER differenciált expressziót mutat hím és nőstény C57BL6 egerekből származó limfociták sejtfelszínén. A mER expressziójának mértékét az E2-BSA-FITC kötődése alapján 5-5 hím és nőstény egerekből származó limfocitákon határoztuk meg. RMF= E2-BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke/ BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke.

4.3 A klasszikus citoplazmatikus ER-oknak és a GPR30-nak van a plazmamembrán belső oldalához asszociált formája is Az ösztrogén limfocitákra gyakorolt gyors nem-genomiális hatásait plazmamembrán receptorán keresztül fejti ki, bár ezen receptor(ok) mibenléte még erősen vitatott. Többek között az ERα membrán-asszociált formáját, mint elképzelhető mER-t is leírták egyes munkacsoportok [104, 106]. 47

Nekünk áramlási citofluorimetriás (10. ábra) és konfokális mikroszkópiás (11. ábra B és C) elemzések során limfocitákon csak intracellulárisan sikerült kimutatni az ERα, ERβ és GPR30 jelenlétét. Ezek alapján az E2 membránkötő helye feltehetően nem azonos az ismert ösztrogén receptorokkal, hacsak azok egyes izotípusai nem képesek transzmembrán konformációt felvéve feltekeredni.

10. ábra. Az ismert ösztrogén receptorok a specifikus ellenanyagok segítségével csak intracellulárisan mutathatóak ki limfocitákon. (A) Egy-egy reprezentatív hisztogram arról, hogy az ERα, ERβ és GPR30 jelenlétét intakt és (B) fixált/permeabilizált limfocitákon is vizsgáltuk. Független mérések száma N >5.

A klasszikus ER-eket főként a citoplazmában, vagy a sejtmagban lokalizálva találtuk, azoban az intracelulláris jelöléseink során (11. ábra B) ill. gyenge nem-ionos detergenssel (Brij98) kezelve a sejteket (11. ábra C) egy-két esetben mindig megfigyelhettünk plazmamembrán asszociáltságra utaló jelet is.

48

11. ábra. A klasszikus ER-eknek van membrán asszociált formája is. (A) Intakt sejteken az ismert ösztrogén receptorokra specifikus ellenanyagok számára nincsen hozzáférhető epitóp. Egy reprezentatív konfokális mikroszkópiás kép anti-ERα jelölés esetén (piros: Alexa555-cholera toxin B, membrán jelölés; kék: Draq5, sejtmag). (B) A klasszikus ER-ek általában citoplazmatikus vagy sejtmagi lokalizációt mutatnak, ám néhány esetben az intracelluláris jelölés során plazmamembrán asszociált formára utaló képeket is sikerült rögzítenünk (piros: Alexa555-cholera toxin B, membrán jelölés; kék: Draq5, sejtmag, zöld: anti ERα, Fehér nyíl: feltételezett membrán asszociált forma). (C) Hasonlót figyeltünk meg gyenge nem ionos detergensel (0,05 % Brij98) való kezelés során (piros: Alexa-555 cholera toxin B, membrán jelölés, zöld: anti ERα, Fehér nyíl: feltételezett membrán asszociált forma).

Ezért lépsejtekből különböző centrifugálási lépésekkel plazmamembrán szeparátumot készítettünk és Western blot technika segítségével, specifikus ellenanyagokat használva vizsgáltuk a különböző ösztrogén receptorok jelenlétét. Alátámasztva a mikroszkópos megfigyeléseinket az ERα, ERβ és GPR30 is kimutatható volt mind sejtlizátumból, mind plazmamembrán szeparátumból (12. ábra). Tehát a klasszikus ösztrogén receptorok és a GPR30 is megtalálható a plazmamembrán belső oldalához asszociáltan is.

12. ábra. Az ERα, ERβ és GPR30 jelenlétét is ki tudtuk mutatni lépsejtekből készült plazmamembrán szeparátumból Western blot technika segítségével. A membrán szeparátumunk tisztaságának bizonyítása érdekében a blottunkat sejtmagi (anti-NFκB) és citolazmatikus (anti-LAMP-1, endolizoszómát jelöli) markerekre specifikus ellenanyagokkal is előhívtuk (PMplazmamembrán szeparátum, SL-sejt lizátum). Loading kontrollnak anti-SHP2 ellenanyagot használtunk. 3 független kísérlet reprezentatív képei láthatók.

Annak bizonyítására, hogy az ismert ösztrogén receptorok valóban intracellulárisan kapcsolódnak a plazmamembránhoz, és az általunk használt ellenanyagok nem konformációs okok miatt nem képesek detektálni azokat a sejtfelszínen, TMpred 49

programmal elemeztük a különböző ER-ek hidrofobicitási tulajdonságát (13. ábra) (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html). A program az aminosav szekvencia alapján az inside-out és outside-in orientációjú hélixek lehetőségét is figyelembe véve nagy biztonsággal képes megmondani, hogy az adott receptor vajon funkcionálhat-e integráns membránfehérjeként, vagy sem. Az egér ösztrogén receptorainak

aminosav

szekvenciáját

a

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein

adatbáisból kerestük ki. Az eredmények alapján az ERα és az ERβ nem rendelkezik egyetlen potenciális transzmembrán (TM) régióval sem. Ezzel szemben a tipikusan 7TM receptorként ismert GPR30 elemzése szépen hozta a várt tulajdonságot. Tehát egyedül a GPR30 esetében nem zárhatjuk ki azt a lehetőséget, hogy képes extracellulárisan E2 kötő receptorként is funkcionálni.

13. ábra. A hidrofobicitási elemzés alapján az ERα és ERβ nem lehet transzmembrán fehérje. A TMpred plot az ERα, ERβ és GPR30 aminosav szekvenciájából meghatározott hidrofobicitási értékeket mutatja. A 0 érték a plama membrán kettős lipid rétegét jelenti. Az 500-as feletti értéknél beszélhetünk arról, hogy a fehérje esetleg rendelkezik transzmembrán régióval. A tipikusan 7-TM receptorként ismert GPR30 elemzése a várt transzmembrán tulajdonságot mutatta.

50

4.4. Szteroidkötő doménnel/motívummal rendelkező fehérjék keresése adatbázisból Mivel a membrán ösztrogén receptor az eredményeink alapján feltehetően nem egyezik meg a már korábban leírt klasszikus intracelluláris E2 receptorokkal, ezért azonosítása továbbra is várat magára. Fehérje adatbázisokban (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; http://www.uniprot.org/uniprot) olyan ösztrogén (E2)-kötő motívummal rendelkező fehérjéket kerestünk, amelyek plazmamembrán lokalizáltságuknál fogva lehetséges membrán receptorként (mER) funkcionálhatnak. Ezen keresés során csak a már ismert klasszikus receptorokat (ERα, ERβ) és azok izoformáit, illetve működésükkel kapcsolatos fehérjéket - E2 szintézisért felelős enzimek, E2 szabályozása alatt álló fehérjék, ER transzkripcionális koaktivátorai/korepresszorai -, vagy még nem karakterizált ismeretlen fehérjéket; vagy a mER jelátvitelével kapcsolatba hozott fehérjék találtuk. Ezenfelül célül tűztük ki a klasszikus receptorok ligandumkötő zsebének megismerését irodalmi adatokból, és az aminosav szekvenciában esetlegesen homológ fehérjék keresését adatbázisból (http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi). Tudni kell, hogy a két ismert klasszikus ER külön kromoszómán kódolódik, és egymásnak nem izoformái. Míg a DNS kötő doménjükben 97%-os szekvencia azonossághoz mutatnak, addig a ligandumkötő zsebük aminosav szekvenciája csak 56%-osan egyezik meg. A ligandum kötő zseb jól meghatározott (ERα: 311-551 as.; ERβ 215-530 as.); ezen belül konkrétan ismertek azok az aminosavak, amelyek direkt kötik az E2-t, és más szteránvázas vegyületektől ilymódon meg tudják különböztetni azt (az „SNKGMEHLYSMKC” rövidebb szekvencia jól körülhatárolja a fent említett részt) [108, 109] (14. ábra). A két receptor teljes ligandumkötő zsebének szekvenciájával és rövidebb szakaszokkal is próbáltunk homológ elsődleges szerkezetű fehérjéket találni, de csak különböző fajok klaszikus ER-át kaptuk eredményül. Így számunkra is megerősítést nyert az a tény, mely szerint az ösztrogén specifikus fehérjéknek nem adható egy általános szekvencia; a szteroid kötő zseb feltehetően konvergens evolúció eredménye [42].

51

14. ábra. Az ERα (A) és ERβ (B) ligandum kötő zsebének aminosav szekvenciája. Színessel kerültek jelölésre az azonos aminosavak (piros: konzervált csoport, rózsaszín: kötőzseb kialakításában vesz részt, zöld: E2-höz kötődnek. (C) Tanenbaun és mtsai. alaján az E2 ERα kötőzsebébe való illeszkedése [108] (kék: direkt köt a hormonhoz, szaggatott vonal: van der Waals kapcsolat, zöld: konzervált csoportok).

52

4.5. A mER eltérő mértékben expresszálódik a különböző limfocita és timocita sejtpopulációk felszínén, azonban az ERα és ERβ expressziója gyakorlatilag sejtpopuláció-független, a GPR30 pedig csak T setjekben mutatható ki Mivel az E2-nek ugyanabban a sejtben egyszerre többféle receptora is van, ezért elkézelhető, hogy a különböző formák eltérő arányú megjelenése szabályozó szereppel bír az E2 immunmoduláló folyamataiban. Ezért vizsgáltuk az E2 receptorok expressziós mintázatának feltárását az egyes érett és éretlen limfocita alpopulációkban. Elsőként a mER expresszióját vizsgáltuk meg. Timociták esetében CD4- és CD8specifikus ellenanyagokkal különítettük el a különböző fejlődési stádiumban lévő sejteket. Eredményeink alapján a dupla pozitív (DP, CD4+CD8+), dupla negatív (DN, CD4-CD8-) és egyszeresen pozitív (SP) sejtek is expresszálják az E2-BSA-FITC kötőképességgel jellemezhető mER-t. Az egyes fejlődési stádiumok közötti mER expressziós szint a következő képpen arányul egymáshoz: DN> DP ~ CD8+> CD4+ (15. ábra A). Lépsejt szuszpenzió esetében CD3- és CD19-specifikus ellenanyagokkal különítettük el a T és B limfocitákat, ahol B sejtek esetében 2-3x magasabb mER szintet tudtunk detektálni (15. ábra B). Továbbá, az egyszeresen pozitív timocitáknál kimutatott mER arány volt megfigyelhető a lépből kinyert érett CD4+ helper és CD8+ citotoxikus T limfociták (15. ábra C) estében is. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy a különböző limfocita sejtpopulációknak eltérő az mER expressziós szinttel rendelkeznek, sőt a timocitákon belüli különbségeket elnézve feltételezhetjük, hogy ez akár a sejtek érési folyamatában is szerepet játszik valamilyen módon.

53

15. ábra. A mER eltérő mértékben expresszálódik a különböző limfocita és timocita sejtpopulációk felszínén. Az E2-BSA-FITC kötődése alapján elemeztük mER expresszióját. Egy-egy reprezentatív dot plotot, valamint 3 független mérés eredményének átlagát mutatjuk be, szórásként SEM van ábrázolva (A) CD4és CD8-specifikus ellenanyagok segítségével különítettük el a dupla pozitív (DP), dupla negatív (DN) és egyszeresen pozitív CD4, valamint CD8 timocita sejtpopulációkat. A statisztikai elemzést One-way ANOVA -teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01). (B) CD3- és CD19-specifikus ellenanyagok segítségével különítettük el a T és B limfocita populációkat, valamint a (C) CD3 és CD8 specifikus ellenanyagok segítségével különítettük el totál lépsejt szuszpenzóból a helper és citotoxikus T sejt populációkat. A statisztikai elemzést párosítatlan (2 mintás) T-teszttel, ahol szükséges volt Welch korrelációt is végezve számítottuk (*p<0.05; **p<0.01). RMF= E2-BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke/ BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke.

54

A klasszikus receptorok és a GPR30 expressziós mintázatát is összehasonlítottuk a kölünböző sejtpopulációkon belül. A mER-el ellentétben az ERα és ERβ nem mutatott szignifikáns különbséget sem a T, sem B sejtek (16. ábra A), sem a CD4+ Th és CD8+ Tc alpopulációk között (16. ábra B). GPR30 jelenlétét csak T sejteken belül tudtuk kimutatni. A CD8+ sejtek egy kicsivel magasabban expresszálták a GPR30-at a CD4+ sejtekhez képest, bár a különbséget nem találtuk szignifikánsnak (16. ábra B).

16 ábra. Az ERα és ERβ expressziója nem mutat lényeges különbséget az egyes sejtpopulációkban, azonban a GPR30 csak T sejtekben mutatható ki. (A) CD3- és CD19specifikus ellenanyagok segítségével különítettük el a T és B limfocita populációkat. Az ERα és ERβ expressziójában nem volt szignifikáns különbség T és B sejtek között, ezzel szemben a GPR30-at csak T sejtekben tudtuk kimutatni. (B) CD3 és CD8 specifikus ellenanyagok segítségével különítettük el a CD4+ Th és CD8+ Tc sejtpopulációkat. Az ERα és ERβ expressziójában nem volt szignifikáns különbség a Th és Tc sejtek között, ezzel szemben a CD8+ sejtek ugyan nem szignifikánsan, de némiképpen magasabb GPR30 expressziót mutattak. 3 független mérés eredményének átlagát mutatjuk be, szórásként SEM van ábrázolva.

4.6. Az mER és a plazmamembránhoz kapcsolt intracelluláris receptorok nagy valószínűséggel közös lipid raft mikrodoménben lokalizálódnak A lipid raftok olyan kisméretű glikoszfingolipidben, szfingomielinben és koleszterinben gazdag nano/mikrodomén struktúrák az eukarióta sejtek membránjában, amelyek fontos szerepet játszanak a molekuláris felismerésben, a megkötött molekula vagy patogén internalizációjában/endocitózisában közvetítésében.

Annak

és

köszönhetően

a

különböző

tudják a

jelek

jelátviteli

sejt

belsejébe

való

folyamatokat/aktivációt

szabályozni, hogy biztosítják az egymással reagáló fehérjék egymáshoz közel kerülését, vagy időleges kizáródását a raftokból [100].

55

17. ábra. A mER raft lokalizációt mutat. Reprezentatív konfokális mikroszkópiás kép az E2-BSAFITC sejtfelszíni kötődéséről (A) T (IP-12-7) és (B) B (A20) sejtvonalak esetében 1-1 alsó-, egyenlítői-, és felső fókuszsíkról készült kép. A BSA-FITC nem mutat kötődést (zöld: E2-BSA-FITC, piros: Alexa 555kolera toxin B, kék: IP-12-7 sejt esetén anti-Thy1, A20 sejt esetén anti-CD24). (C) A kolokalizáció mértékét a Pearson korrelációs koefficiens meghatározásával és statisztikai analízisével számszerűsítettünk. A kolokalizációs indexet legalább 150 ROI (Regions of Interest)/ minta számoltuk és az átlag ± SD-t ábrázoltuk. (D) 10 mM Methyl-β-cyclodextrin-t használtunk a limfocita plazmamembrán koleszterinjének kivonásához. A raftok integritásának megbontásával az E2-BSA-FITC kötőképessége is csökkent. Az eredmények átlaga három független mérésből származik, szórásként SD van ábrázolva. A statisztikai elemzést párosítatlan (2 mintás) T-teszttel végeztük (*p<0,05; **p<0,01). RMF= E2-BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke/ BSA-FITC átlag fluoreszcencia értéke

Mivel irodalmi adatok alapján a membrán koleszterin tartalma limitálólag hat az eritrociták, és mesterséges modell rendszerben a liposzómák passzív E2 „felvételére” is [110], ezért megvizsgáltuk hogyan viszonyul a mER a dominánsan koleszterinben gazdag lipid raftokhoz. Limfocitákon és sejtvonalakon (IP-12-7 T sejt, A20 B sejt) végzett konfokális mikroszkópiás vizsgálataink alapján a mER raft asszociált (17. ábra A és B, sárga foltok: E2-BSA-FITC és a raft markerek átfedő jele). A mintáinkat egyrészt fluoreszcens kolera toxin B-vel jelöltük, amely a GM1 és GM3 gangliozidokat ismeri fel a membránban, ill. GPI-horgonyzott fehérjékre specifikus ellenanyagokkal (anti-Thy1 T sejtek esetében és anti-CD24 B sejtek esetében), majd ezek E2-BSA-FITC-cel mutatott 56

kolokalizációját számszerűsítettük a Pearson korrelációs koefficiens meghatározásával. A gangliozidokról és a GPI horgonyzott membránfehérjékről már köztudott volt, hogy raft asszociáltak, az E2-BSA-FITC ezekkel mutatott erős kolokalizációt (17. ábra C). Ezt megerősítették azok a vizsgálataink, ahol metil-β-ciklodextrin előkezeléssel [98] kivontuk a koleszterint a limfocita sejtek plazmamembránjából. A lipid raftok integritását megbontva csökkent a kötődő E2-BSA-FITC mennyisége. Ezek alapján a mER-nek raft asszociáltan kell lennie, hogy kifejthesse ligandkötő képességét (17. ábra D). Egy elképzelhető funkcionális magyarázata a membrán-asszociált klasszikus ösztrogén receptoroknak az, hogy ily módon fizikai közelségbe kerülhetnek a sejt belsejébe jutó E2vel és ezáltal könyebben tudják megkötni a ligandumukat, amely folyamatban esetleg a mER-nek is szerepe van. Ezért megvizsgáltuk az mER és az intracelluláris ERα egymáshoz való helyzetét.

18. ábra. Az mER és az ERα nagy valószínűséggel közös mikrodoménben helyezkedik el. A csak donorral (E2-BSA-FITC), valamint a donorral és akceptorral (E2-BSA-FITC + anti-ERα-Alexa 555) együttesen jelölt sejtminták fotohalványodási időállandóit mutatja az oszlopdiagram. A pbFRET során fellépő energiatranszfer hatásfokát 8,7 % -nak találtuk (két független mérés eredményeiből számoltunk).

A FRET mérés során a sejt felszínéhez kötődő E2-BSA-FITC volt a donor és az Alexa 555 festékkel jelölt anti-ERα ellenanyag volt az akceptor. A FRET hatásfokát (E) az egyszeresen (csak donor) ill. a kétszeresen (donor + akceptor) jelzett sejteken a donor fluoreszcencia fotohalványítási kinetikájának mérésével határoztuk meg (ld. Módszerek) (18. ábra). Ugyan a 8.7% ± 2.4 nem számít túl magas hatékonyságú energia transzfernek, de szignifikánsnak vehetjük. Az eredmények alapján a fentebb említett receptoroknak vagy csak egy kis százaléka van tényleges közelségben egymáshoz, vagy a legtöbbjük nagyobb (de azért még mindig 10 nm-en belüli) távolságra helyezkedik el egymástól. Tehát a mER 57

és a membrán-asszociált intracelluláris receptorok feltehetően közös mikrodoménben lokalizálódnak. Mivel még nincsenek arra vonatkozó adatok, hogy limfociták esetében milyen módon kerül a hormon a sejt belsejébe, így elképzelhető, hogy a passzív E2 diffúzió mellett esetleg az mER-nek is van ligandum közvetítő szerepe. 4.7. Az ismert E2 receptorok expressziós mintázata és lokalizációja ösztrogén függést mutat Korábbi publikációnkban már leírtuk, hogy az E2-BSA-FITC idő és koncentráció függvényében telítődő kötődést mutat T és B limfocitákhoz is, amely egyértelműen bizonyítja a receptor-ligandum kölcsönhatás tényét. Az 1 mg/ml E2-BSA-FITC 10-15 percen belüli kötődése relatív gyors interakcióra utal [25]. Ezért a továbbiakban vizsgáltuk az mER dinamikáját. Konfokális mikroszkópiás képeink alapján ligandum kötés után a mER internalizálódik, 15 perc után főként a citoplazmában detektáltuk az E2-BSA-FITC jelet (19. ábra).

19. ábra. A mER ligandum kötés után gyorsan internalizálódik. Egy-egy reprezentatív konfokális mikroszkópos kép, amelyeken a metszésvonal mentén megjelenített fluoreszcencia értékekből is látszik, hogy az E2-BSA-FITC kötődését követően (0 min) 15 percen belül a sejt belseje kerül. (piros: Alexa 555-kolera toxin B, membrán jelölés, zöld: E2-BSA-FITC, Fehér: metszésvonal).

Ezt a tripán kékkel történő ún. „quenching” módszerrel is alátámasztottuk: az első 30 percben az E2-BSA-FITC jel főként a sejtfelszínről származik (20. ábra A) - ekkor a mintákhoz adott tripán kék még ki tudta oltani a FITC jelet. Érdekes módon 30 perc után megváltozik a kötődést mutató görbe lefutása: a kezdeti telítődő jelleg után élesen emelkedni kezd. Ez egyrészt adódhat abból, hogy intracellulárisan nincsen telítődés a sejtekben. Másfelől, mivel nemcsak a sejt belsejéből származó E2-BSA-FITC jel mutatja

58

ezt a meredek emelkedést, hanem a sejtfelszíni is; ezért elképzelhető, hogy az E2 jel hatására a mER egy „intracelluláris poolból” kerül a sejtfelszínre.

20. ábra. Az ösztrogén specifikus plazmamembrán receptor ligandum kötés hatására gyorsan internalizálódik, majd emelkedett mennyiségben reciklizál a sejtfelszínre. (A) A mER internalizációjának vizsgálatához a lépsejtekhez 1 mg/ml E2-BSA-FITC-cet vagy 1 mg/ml BSA-FITC-cet (negítv kontroll) adtunk a nulladik időpillanatban, majd áramlási citofluorimetria segítségével mértük a fluoreszcencia intenzitását a 15-90 perc közötti intervellumban. A mérés előtt 5 µg/ml tripán kékkel oltottuk ki egyes minták esetében a FITC sejtfelszíni jelét. (B) A mER reciklizációjának vizsgálatához a lépsejteket először 1 mg/ml E2-BSA-val előkezeltük (15 min, 37 ºC), majd mosással a nem kötődött ösztrogén konjugátumokat eltávolítottuk. Ezután a minták visszakerültek a CO 2 termosztátba adott ideig, hogy az mERnek tudjon internalizálódni, majd reciklizálódni. Végezetül a sejteket 1 mg/ml E2-BSA-FITC-cel vagy 1 mg/ml BSA-FITC-cel jelöltük, hogy követni tudjuk a mER jelenlétét a sejtfelszínen. 100%-nak a kezeletlen sejtek mER szintjét vettük. Az eredmény három független mérés átlagából ± SD került ábrázolásra.

A fentebb bemutatott eredmények igazolására megvizsgáltuk az E2-BSA kezelés hatását a mER szintre. A sejteket 15 percig E2-BSA-val inkubáltuk 37 ̊C-on CO2 termosztátban, majd a felesleges, még nem kötődött E2 konjugátumokat mosással eltávolítottuk. Ezt követően a mintákat adott ideig tovább inkubáltuk 37 ̊C-on, amely alatt a mER-nek volt ideje internalizálódni ill. reciklizálódni, végezetül a sejtfelszínen található receptorokat E2-BSA-FITC-cel tettük láthatóvá. A kapott eredmény megerősítette korábbi elképzelésünket. A 0 perces mintánál a lépsejtek alap mER szintjét detektáltuk. Ahhoz képest a 15-30 perc után ~20%-al lecsökkent E2-BSA-FITC jel egyrészt az E2-BSA-val való kompetíciójára, másrészt a receptor internalizációjára utal. 60 perc után újból magas mER szintet tudtunk detektálni, tehát a membrán ösztrogén receptor valóban gyorsan reciklizált a felszínre (20. ábra B). Sőt, mivel a kezdeti állapothoz képest ~15%-al emelkedett mER szintet tudtunk kimutatni 60 perc után; ezért valószínűsíthető, hogy az E2 jel hatására a mER egy intracelluláris poolból kerül a sejtfelszínre.

59

A következőkben arra voltunk kíváncsiak, hogy az mER-en keresztül közvetített E2 jel befolyásolja-e a klasszikus ER-ek (21. ábra A és B) ill. a GPR30 (21. ábra C) lokalizációját, ezáltal közvetett bizonyítékot szolgáltatva a genomiális és nem-genomiális út közötti kapcsolatra. A kísérlet során 100 nM E2, vagy 1 mg/ml E2-BSA hatását vizsgáltuk konfokális mikroszkópia segítségével. Ahogyan korábban már utaltam rá, az E2 az intracelluláris és a membrán ösztrogén receptorokon keresztül is képes hatást kifejteni, míg az E2-BSA kimondottan az mER-en keresztül közvetített E2 hatások vizsgálatára alkalmas [104].

21. ábra. Az mER-en közvetített jel hatására megnő az intracelluláris E2 receporok membrán lokalizáltsága. Egy- egy reprezentatív konfokális mikroszkópiás kép az ERα (A), ERβ (B) és GPR30 (C) plazmamembrán lokalizáltságáról, 60 perc E2-BSA előkezelés után. Emellett mutatjuk a sejtek adott metszésvonala mentén (fehér vonal) a kolera toxin B (piros) és ösztrogén receptor specifikus ellenanyagok (zöld) fluoreszcencia intenzitását. (D) Kezeletlen sejtekben a GPR30 kolokalizációt mutat a BrefeldinA endoplazmatikus retikulum markerrel. A sejt adott metszésvonala mentén (fehér vonal) a cholera toxin B (kék), GPR30 (zöld) és BrefeldinA (piros) fluoreszcencia intenzitása látható.

Eredményeink alapján az E2 és E2-BSA nem változtatta meg szignifikánsan az ERα lokalizációját (22. ábra A), habár a többi ösztrogén receptorhoz képest erőteljesebb kolokalizációt mutatott a plazmamembrán jelölésére használt CTX-B-vel (22. ábra D). Ezek alapján a sejtekben bizonyos mennyiségű ERα konstitutíven megtalálható membrán asszociáltan is. Azt mindenképpen meg kell jegyeznünk, hogy noha a különböző kezelések 60

Pearson korrelációs koefficienseinek átlaga alapján nem tapasztaltunk különbséget, az E2vel előinkubált sejtekhez tartozó oszlopdiagram heterogénebb eloszlást mutat a többihez képest. A sejtek egy csoportja magasabb kolokalizációs értékekkel rendelkezett; míg egy másik részénél az átlaghoz képest lecsökkent a membrán lokalizáltság. Mivel a permeábilis E2-vel nem tudjuk irányítani mely receptoron keresztül fejtse ki a hatást, elképzelhető, hogy ebben az esetben az mER és a klasszikus ERα egymással nem feltétlenül megeggyező hatása „mosta egybe” az átlagokat, de a különbözőség a heterogén eloszlásban még tetten érhető. Ezzel szemben az E2 szignifikánsan csökkentette, míg az E2-BSA szignifikánsan növelte az ERβ membrán lokalizáltságát (22. ábra B és E); utalva arra, hogy a mER-en keresztül közvetített E2 jel a membránhoz „hívja” az ERβ-t. Ez a folyamat feltehetően a már membránon átjutott E2 klasszikus receptorhoz való kötődését segíti elő. Míg az E2 hatására

lecsökkent

membrán

lokalizáltság

a

klasszikus

ösztrogén

receptorok

transzkripciós faktor aktivitására utal, azaz ligandum kötés után a sejtmagba kerülve adott gének átíródását szabályozzák [25, 46, 48, 49].

61

22. ábra. E2 stimulus hatására megváltozik az intracelluláris E2 receptorok lokalizációja. Lépsejteket 1 mg/ml E2-BSA-val, vagy 100 nM E2-vel, ill. azok kontrolljaival inkubáltuk (60 min, 37 ̊C), majd az ösztrogén receptorokat fluoreszcens ellenanyaggal jelöltük és konfokális mikroszkóp segítségével elemeztük. A (A) CTX és ERα, (B) ERβ vagy (C) GPR30 közötti kolokalizáció mértékét a Pearson korrelációs koefficiens intervallumaihoz tartozó sejtszámok segítségével oszlopdiagram formájában mutatjuk. Az eredmények két független mérés összegzéséből származnak. A kolokalizácóis indexeket legalább 150 sejt/ minta számoltuk, átlag ± SEM formában ábrázolva (D) az ERα, (E) ERβ és (F) GPR30 esetében. A magasabb korrelációs koefficiens emelkedett plazmamembrán lokalizáltságot jelent. A statisztikai elemzéseket One-way ANOVA -teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01).

62

GPR30 esetében mind az E2, mind az E2-BSA kezelés szignifikánsan megnövelte annak membrán lokalizáltságát (22. ábra C és F). Ezek alapján a sejtek hormon kitettsége vélhetően eltérő szabályozó szereppel bír a különböző ösztrogén receptorok számára. 2005-ben két egymástól független munkacsoport is ösztrogénkötő receptorként azonosította a GPR30-at [79, 80], de megfigyeléseik eléggé ellentmondóak voltak. Revanker és munkatársai szerint a GPR30 kizárólagosan az endoplazmatikus retikulumban lokalizálódik [80], míg Thomas és munkatársai eredményei alapján a GPR30 egy kis frakciója a sejtfelszínen is kimutatható volt [79]. Nekünk sikerült limfocitákon az endoplazmatikus retikulumban (21. ábra D) és a plazmamembránban lokalizáltan is kimutatnunk a GPR30-at.

Fontos eredmény továbbá, hogy a GPR30 intracelluláris

lokalizációja is erősen ösztrogén függő, noha alapexpressziója alapján feltehetően nem ez a receptor játssza a kulcsszerepet az E2 hatások közvetítésében limfocitákban. A 4.2. alfejezetben bemutatott eredmények alapján nőstény és hím egerek limfocitái is expresszálnak mER-t a sejtfelszínükön. Nőstények esetében a mérések döntő hányadában magasabb RMF értéket tapasztaltunk és az mER megjelenése nagyobb szórást mutatott a hímekhez képest (10. ábra). Ezt az ivari ciklus során bekövetkező hormonális változásokkal magyaráztuk. Ezt támasztják alá a fentebb bemutatott in vitro eredmények is, amelyek szerint az mER gyors ligandum függő internalizáción és reciklizáción képes keresztül menni. Ráadásul ösztrogén adagolása után magasabb mER szintet tudtunk detektálni a kiindulási állapothoz képest (20. ábra B). Ezek alapján feltehetően a ciklus során megemelkedő E2 szint mellett az mER expressziós szintje is magasabb. Ezért ezek után arra kerestük a választ, hogy a klasszikus receptorok (ERα/ β) és a GPR30 is hasonló dinamikus E2 kontroll alatt állnak-e. Ehhez először az irodalomban leírtak alapján PMSG és HCG oltásokkal szinkronizáltuk a nőstény egerek ivari ciklusát. Mivel a laboratóriumi egér ciklusa normális körülmények között 4-5 nap és a főemlősökkel ellentétben az endometrium megújulása nem jár vérzéssel, ezért a szinkronizálás sikerességének ellenőrzését bélsárból történő validált RIA hormonméréssel végeztük, [111]. Az ivari ciklusban négy fázis különíthető el: proösztrus, ösztrusz, metösztrusz és diösztrusz. Egereknél az ovulációt a cirkuláló E2 szintben bekövetkező csúcs előzi meg, emberhez hasonlóan. Ezzel szemben a P4 szintje a metösztrusz és diösztrusz alatt emelkedik, és a proösztrusz és ösztrusz között csökken [112]. A bélsár mintákból kimutatható hormonkoncentrációk kicsit késleltetve ugyan, de követik ezeket a 63

változásokat. Egerek esetében a hormonok béltraktuson való áthaladási ideje körübelül 910 óra [113]. Mivel a ciklus szinkronizálásához használt protokoll alapján a HCG oltás után az egerekben egyszerre indukálódott ovuláció, ezért nem meglepő, hogy az azt követő negyedik napon egy újabb E2 csúcsot tudtunk kimutatni a bélsár mintákból (23. ábra A). Ezek alapján sikeres volt a hormonkezelés. A ciklus szinkronizált nőstény egereink mellett kontrollként napi 2-3 kezeletlen hím egeret is megvizsgáltunk. A hímek bélsármintáiból ugyanúgy ki tudtunk mutatni E2-t és P4-et, azonban a várakozásoknak megfelelőan azok szintje az egymást követő napok során viszonylag állandónak volt mondható (23. ábra B). Az ösztrogén receptorok expressziós mintázatának vizsgálatához különböző sejtfelszíni markerekkel különítettük el az egyes limfocita alpopulációkat. Méréseinket áramlási citofluorimetriával végeztük öt napon át összesen napi 3 nőstény egeret feldolgozva. Két független kísérletsorozatot végeztünk. A CD4+ Th és CD8+ Tc sejtpopulciók, valamint a B sejtek is a második és negyedik nap között mutattak magasabb ERα és ERβ szintet, ilyenkor az első és ötödik naphoz képest többszörös expresszióbeli különbséget tapasztaltunk (23. ábra C). Ezek alapján az emelkedő E2 koncentráció pozitívan hat ezen receptorok megjelenésére. Ezzel szemben a GPR30 nem mutatott látványos expresszióbeli különbségeket a ciklus során, és úgy általánosságban is csekély mértékben volt jelen a sejtekben. Érdekes módon a CD4+ Th és CD8+ Tc sejtpopulcióknál az első és a második nap kaptunk magasabb értékeket, amikor az E2 szintje még alacsony volt. B sejtekről pedig továbbra is elmondható, hogy nem expresszálják a GPR30-at (23. ábra C). A hormonális eredményekkel összhangban, hím egerekben a különböző ösztrogén receptorok nem mutattak lényeges expresszióbeli eltérést az egyes napok között. Az ő esetükben sem tudtunk B sejteken GPR30 expressziót detektálni (23. ábra D).

64

23. ábra. Az ERα és ERβ expressziója követi a ciklus E2 szint változását. (A) Nőstény egerek ciklus szinkronizálása után az ösztrogén (E2) és progeszteron (P4) hormonszinteket bélsármintából mértük vissza RIA módszer segítségével. Az utolsó hormonoltást követően öt napon át minden nap 1g bélsarat gyűjtöttünk a közös ketrecekből. (1. nap: metösztrusz, 2. nap: diösztusz, 3. nap: proösztusz, 4. nap: ösztrusz, 5. nap: metösztrusz). (B) A kontrollként használt hím egerek bélsármintáiból is 5 egymást követő nap lemértük az ösztrogén (E2) és progeszteron (P4) hormonszinteket. (C) Az ERα és ERβ követi az E2 koncentráció változását. A hisztogramokon az adott napokon feldolgozott 6 nőstény (2 független kísérlet) RMF átlagai ± SD kerültek ábrázolásra. (D) A kontrollként használt hím egerek egymást követő öt nap lemért ERα, ERβ és GPR30 expresszióját állandónak mondhatjuk. A hisztogramokon az adott napokon feldolgozott 5-6 hím RMF átlagai ± SD van ábrázolva

65

4.8. Internalizáció után az E2-BSA-FITC a lizoszómákba kerül A továbbiakban megvizsgáltuk, hogy a ligandumot kötött mER a sejt belsejében hova kerül az internalizáció után. Az endoplazmatikus retikulum (Brefeldin A), a mitokondrium (MitoTracker) és a sejtmag (Draq5) markerei nem, azonban a korai endoszóma (EEA-1) és lizoszóma (LysoTracker) markerek erős kolokalizációt mutattak az E2-BSA-FITC-cel (24. ábra A és B). Eredményeink alapján a mER liganduma a lizoszómákba kerül. Ezért nagy valószínűséggel kizárhatjuk azt a korábban felvetett lehetőséget, hogy a mER ligandumközvetítő szereppel bírna az intracelluláris ösztrogén receptorok felé. Arra vonatkozóan nincsenek adataink, hogy az E2 a későbbi folyamatok során még fel tud-e szabadulni a lizoszómákból.

24. ábra. Internalizáció után az E2-BSA-FITC a lizoszómákba irányítódik. (A) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek az E2-BSA-FITC lokalizációjáról 30 perc 37ºC-on történő inkubáció után EEA-1 (korai endoszóma) esetén, ill. 60 perc 37ºC-on történő inkubáció után a többi marker esetén (DRAQ5-sejtmag, LysoTracker-lizoszóma, MitoTracker- mitokondrium, BrefeldinA-endoplazmatikus retikulum). Emellett a lépsejtek membránját Alexa 555- vagy Alexa 647 kolera toxin B-vel jelöltük a különböző sejtalkotókra specifikus markerekkel együtt. (N=3) (B) Az internalizálódott E2-BSAFITC/mER komplex egyedül a korai endoszómákkal (EEA-1) és a lizoszómával (LysoTracker) mutatott kolokalizációt. Az eredmények két független mérésből származnak, mintánként legalább 150 sejtből számolva (átlag ± SD).

66

Ezen adatok birtokában megismételtük a 20. ábrán B részében bemutatott mérésünket, csak a 20 perces jégen való inkubálás során lizoszómális gátlószert is alkalmaztunk az 1 mg/ml jelöletlen E2-BSA mellett, ill. amikor a nem kötődött ligandumot kimostuk a rendszerből és 60 perces CO2 termosztátban való inkubálás következett, akkor egyes mintáknál aktin polimerizációt gátló szereket adtunk a médiumhoz, vagy továbbra is a lizoszómális degradációt gátló szert. A korábban leírtaknak megfelelően 60 perc után a reciklizált mER szint +15%-al magasabb a kiindulási állapothoz képest. Ha 0.2 mM klorokvin difoszfáttal gátoltuk az internalizálódott mER lizoszómális degradációját, akkor ez +35%-ra ment fel. Fontos kiemelnünk, hogy a klorokvin difoszfát önmagában is képes min. +20%-al megnövelni a sejtfelszíni receptor szintet. Ezzel szemben a kétféle aktin polimerizációs gátlószer (20 µM latrunculin B, vagy 5 µM cytochalasin D) kb. 20%-al csökkentette az mER szintet az alkalmazott E2-BSA stimulus ellenére (25. ábra). Ezek alapján az internalizáció és a reciklizáció erősen aktin-függő folyamat, valamint a lizoszómákból az mER valószínűleg újra a sejtfelszínre kerül.

25. ábra. A mER internalizációja és reciklizációja aktívan irányított folyamat. A mER reciklizációja szignifikánsan blokkolható az aktin polimerációs folyamatok gátásával (latrunculin B, cytochalaisn D) ill. a klorokvin difoszfát, mint lizoszomotropik ágens a receptor lizoszómális degradációját gátolva képes megemelni a sejtfelszíni E2 receptor szintet. A kezeletlen, frissen izolált lépsejtek mER szintjét vettük 100%nak. Az eredmények 6 független mérés átlagaiból származnak, szórásként ± SD van ábrázolva.

67

4.9. A mER (E2-BSA) és a citoplazmatikus ösztrogén receptorok (E2) által mediált folyamatok eltérő hatással vannak a limfocita proliferációra Mivel még nem tudunk sokat a genomiális és nem-genomiális út kapcsolatáról, ezért arra voltunk kíváncsiak, hogy az E2 és E2-BSA milyen hatással van a lépsejtek aktivációjára in vitro rendszerben. Ahogyan már korábban is hangsúlyoztam, az E2-BSAval a mER-en keresztül közvetített hatásokat tudjuk modellezni, míg a β-E2-vel egyszerre az mER-en és az intracelluláris ER-eken keresztül közvetített jeleket indukálunk. Hím egerekből származó totál lépsejt szuszpenziót 100 nM E2-et tartalmazó médiumban tenyésztve azt tapasztaltuk, hogy az ösztrogén önmagában nem indukál proliferációt, míg poliklonális aktivációs szignállal együtt alkalmazva képes negatívan befolyásolni azt (26. ábra).

26. ábra. Az E2 negatívan befolyásolja a limfociták proliferációját. T sejtkultúra esetében (ConA aktiválás) a harmadik nap, B sejtkultúra esetében (LPS-aktiválás) a negyedik nap utolsó 12 órájában történt [H3] timidin beépülését mértük. Három független mérésből egy reprezentatív hisztogram, három párhuzamos minta átlaga ± SD van ábrázolva. A statisztikai elemzést párosítatlan (2 mintás) T-teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01).

Ezzel szemben, amikor a sejteket 1 órát előstimuláltuk 100 nM E2-BSA-val, majd hormonmentes médiumban tenyésztettük a megfelelő aktivációs szignálok mellett a mERen keresztül közvetített jel felerősítette a T (27. ábra A) és B (27. ábra B) sejtek aktivációját/proliferációját is. Ez is arra hívja fel a figyelmünket, hogy az ösztrogén által irányított szabályozási folyamatok sokkal összetettebbek, mint ahogyan eddig gondoltuk. Feltehetően a különböző ösztrogén receptorok eltérő jeleket közvetítenek a sejtek számára.

68

27. ábra. A mER-en keresztül közvetített ösztrogén hatás pozitívan befolyásolja a (A) T- és (B) Bsejtek proliferációját is (1 óra, 37 ̊C-on történő 100 nM E2-BSA előkezelés után a sejtek ösztrogén mentes médiumban voltak tenyésztve). Három független mérésből egy reprezentatív hisztogram, három párhuzamos minta átlaga ± SD van ábrázolva. T sejtkultúra esetében a harmadik nap, B sejtkultúra esetében a negyedik nap utolsó 12 órájában történt [H3] timidin beépülését mértük. A statisztikai elemzéseket One-way ANOVA -teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01).

4.10. A mER (E2-BSA) által mediált jel elősegíti a T dependens IgG izotípusú ellenanyagok termelését Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján elmondhatjuk, hogy az ösztrogén pozitívan képes befolyásolni a T dependens (TD) immunválaszt. FITC-KLH-val, mint TD antigénnel való immunizálás során nőstény egereknél az ovarektomizálást követő ösztrogén visszapótlása növelte a haptén specifikus IgM és IgG termelő sejtek számát [25]. Ezért a továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy az E2 ill. az E2-BSA hogyan képes befolyásolni in vitro rendszerben az ellenanyag termelést. Hím egereket FITC-KLH-val oltottuk, majd az immunizálást követő tizedik napon a lép és nyirokcsomókból származó sejteket újraaktiváltuk. Az aktivátorok mellett a sejtkultúrák 100 nM E2-t vagy 100 nM E2-BSA-t is tartalmaztak a tenyésztés során. Az aktiválatlan és kontrollként FITC-LPS-sel aktivált sejtkultúrák felülúszójában nem tudtunk az IgM és IgG ellenanyagok tekintetében különbséget kimutatni, azonban a FITC-KLH aktiválás mellett adott E2-BSA növelte az antigén specifikus IgG izotípusú ellenanyagok mennyiségét (28. ábra). Mivel E2-vel nem tapasztaltunk hasonlót, ezért ez az eredmény is a 4.13. alfejezetben leírtakat támasztja alá, amely szerint a mER pozitív szabályozó jeleket közvetít a sejt számára.

69

28. ábra. A mER (E2-BSA) által mediált jel elősegíti a T-dependens IgG izotípusú ellenanyagok termelését. A KLH-FITC-cel immunizált egerek lép és nyirokcsomóiból kevert sejtkultúrát létrehozva azokat újra aktiváltuk 5 µg/ml FITC-KLH-val, ill. kontrollként 1 µg/ml FITC-LPS-sel 100 nM E2 vagy 100 nM E2-BSA mellett, majd a felülúszók antigén specifikus IgM és IgG szintjét detektáltuk ELISA módszerrel. Három független mérésből a párhuzamos minták átlaga ± SD van ábrázolva. A statisztikai elemzéseket One-way ANOVA -teszttel végeztük (*p<0.05; **p<0.01).

4.11. Limfoid sejtvonalon és primer sejteken is kimutatható az SHBG (szex hormon kötő globulin) kötődése, így valószínűleg közvetett módon mER-ként is funkcionálhat Ahogyan az 1.3.4. alfejezetben utaltam rá, az E2 hidrofób tulajdonságából adódóan nagyrészt szállítófehérjékhez kötötten található meg a plazmában. Az ösztrogén sejtek számára való hozzáférhetőségét ily módon nagyban befolyásolja, hogy azok képesek-e kötni ezen hordozófehérjéket [87, 88, 95]. Mivel ezidáig limfocitákról nincsen arra vonatkoró adat, hogy a szex hormon kötő globulin esetleg szerepet játszhat az E2 közvetített folyamatokban, ezért elsőként arra voltunk kíváncsiak, hogy kimutatható-e az SHBG kötődése limfoid sejtvonalakon. Először külön hozzáadott fehérje nélkül vizsgáltuk az SHBG jelenlétét egy arra specifikus ellenanyaggal - feltételezve, hogy a médiumban lévő FCS SHBG-t is tartalmaz. Meg kell jegyezni, hogy az egér és a szarvasmarha SHBG 63,8%-os szekvencia azonosságot mutat, és a poliklonális anti-SHBG ellenananyag leírása szerint több faj SHBG-jét is képes felimerni. IP-12-7 sejtvonalon nem, míg A20 sejtvonalon ki tudtuk mutatni a sejtfelszínhez kötődött szállítófehérjét (29. ábra A). Annak ellenőrzésére, hogy az SHBG-specifikus ellenanyaggal valóban a fent említett SHBG-t detektáljuk Western blot technikával is megvizsgáltuk a sejteket. Eredményeink alapján a 47 kDa monomer és a 90 kDa dimer SHBG forma is jelen van A20 sejtekben. Az 55 kDa-nál kapott csík feltehetően a detektáló 70

anti-nyúl ellenanyag BCR nehézlánccal való keresztreakciójának az eredménye (29. ábra C). A következőkben a megalin expresszióját is megvizsgáltuk, mert irodalmi adatok alapján [95, 114] ehhez a fehérjéhez kötődik az SHBG a sejtek felszínén. A SHBG kötődési eredmények alapján vártnak megfelelően A20 sejtek feszínén ki tudtuk mutatni a megalin jelenlétét, míg IP-12-7 sejteken nem (29. ábra B). Primer sejtek esetében a megalin expressziójára vonatkozóan nem kaptunk konzekvens eredményeket, azonban az SHBG-t ugyan alacsony szinten, de mind T, mind B sejtek sejtfelszínén detektálni tudtuk (29. ábra D, intakt sejtek). Mivel irodalmi adatok alapján a megalin az SHBG internalizációját tudja közvetíteni [95], ezért megvizsgáltuk a fehérje intracelluláris jelenlétét is. Eredményeink alapján T és B sejtekben is a sejtfelszínen tapasztaltakhoz képest jelentősebb SHBG szintet detektáltunk (29. ábra D, permeabilizált sejtek).

29. ábra. Az SHBG jelenléte és a megalin expressziója primer sejteken és sejtvonalon. (A) Egy-egy reprezentatív hisztogram arról, hogy IP-12-7 T sejtvonal felszínén nem, de A20 B sejtvonal felszínén ki tudtuk mutatni az SHBG jelenlétét. (B) Az SHBG kötődési adatokkal összhangban csak A20 sejteken tapasztaltunk megalin expressziót. (C) Western blot technika segítségével igazoltuk, hogy a 47 kDa monomer és a 90 kDa dimer SHBG forma is jelen van az A20 sejteken (N=5). (D) A limfocitákat anti-CD19 ellenanyag segítségével T és B sejtekre különítve intakt és permeabilizált sejteken is megvizsgáltuk az SHBG jelenlétét. Egy-egy reprezentatív hisztogram (N=3)

71

Az SHBG-ről leírták, hogy allosztérikusan működő fehérje: csak a ligandumot nem kötött SHBG képes a membrán receptorához kötődni [89-91]. Ezért megvizsgáltuk, hogy a membrán-kötött SHBG funkcionálhat-e E2 kötő sejtfelszíni fehérjeként A20 sejtvonalon. Először konfokális mikroszkóppal megnéztük az E2-BSA-FITC és az SHBG, valamint az E2-BSA-FITC és a megalin egymáshoz való viszonyát. Mindkét párosítás esetében jelentős kolokalizációt tapasztaltunk (30. ábra). Ezért nem zárható ki, hogy az eddigiekben E2-BSA-FITC kötődéssel detektált mER esetleg részben a megalin-SHBG komlexet is jelenti B sejtek esetében.

30. ábra. Az SHBG és a megalin is kolokalizációt mutat az E2-BSA-FITC-cel. (A) Reprezentatív konfokális mikroszkópiás kép az E2-BSA-FITC és az SHBG valamint az (B) E2-BSA-FITC és a megalin sejtfelszíni jeléről. Mindkét esetben magas (0.43 feletti) kolokalizációt tapasztaltunk. (zöld: E2-BSA-FITC, piros: Alexa 647-el jelölt anti-SHBG v. anti- megalin ellenanyag).

Mivel a pixel szintű kolokalizáció még nem jelenti a két receptor asszociációját, csupán viszonylagos közelségét, ezért az előzőekben említett molekulapárok egymáshoz viszonyított kapcsolatának vizsgálatára a donor fluoreszcencia fotohalványításán alapuló FRET módszert (ld. Módszerek rész) alkalmaztuk. A mérés során az E2-BSA-FITC volt a donor, és az Alexa 555-el jelölt anti-SHBG ellenanyag pedig az akceptor (31. ábra). A fotohalványodási időállandókból számolt energia transzfer hatásfoka (E) 21±3.9%-nak adódott, amely a korábban bemutatott pozitív kolokalizációval összhangban erősen azt sugallja, hogy SHBG közvetetten E2-t kötő membránfehérjeként funkcionálhat limfociták esetében.

72

31. ábra. Az SHBG nagy valószínűséggel képes E2-BSA-FITC kötésre A csak donorral (E2-BSAFITC), valamint a donorral és akceptorral (E2-BSA-FITC + anti-SHBG-Alexa555) együttesen jelölt A20 sejtminták fotohalványodási időállandói. A pbFRET során fellépő energiatranszfer hatásfokát 21% -nak találtuk. Két független mérés eredménye.

73

5. Az eredmények megvitatása A szteroid hormon receptorokról nagy általánosságban elmondható, hogy az ún. genomiális-út keretein belül transzkripciós faktorként működnek, amely során különböző gének szabályozásában játszanak szerepet [46, 49, 50]. Mindemellett egyre több adat bizonyítja, hogy a szteroid hormonok - beleértve az általunk vizsgált E2-t is - különböző sejttípusokban képesek membrán receptor(ok)on keresztül gyors, nem-genomiális jeleket is közvetíteni. Míg a klasszikus ösztrogén receptorok (ERα, ERβ), vagy a nem klasszikusnak számító GPR30/GPER funkciója az endokrin- és idegrendszer sejtjein viszonylag jól karakterizált [49, 115, 116], addig a limfocitákon betöltött szerepük kevésbé ismert és ellentmondásos [25, 97, 106, 117]. Az mindenesetre már széles körben elfogadott tény, hogy az E2 fontos immunreguláló hatással bír autoimmun betegségekben (pl. SLE, RA) [22, 23]. Az ösztrogén által kifejtett hatások komplexitásához valószínűleg nagyban hozzájárul az a tény, hogy az ERα-nak és ERβ-nak több egymástól eltérő funkciójú splice variánsa is létezik [58, 60, 61]. Ami pedig a membrán ösztrogén receptort illeti, feltételezhetjük, hogy ezt a szerepet a klasszikus receptorok posztranszlációsan módosult formája tölti be [69, 7476]. Más munkacsoportokhoz hasonlóan mi sem tudtuk specifikus ellenanyagok segítségével kimutatni az ERα, ERβ és GPR30 jelenlétét intakt érett T és B limfociták sejtfelszínén [97, 106]. Mivel azonban a membrán impermeábilis E2-BSA képes limfocitákon nemgenomiális jeleket kiváltani [25, 117, 118], ezért mégis feltételezhetjük egy funkcionális mER jelenlétét. Pierdomininci és mtsai. azonosítani tudták az ERα 46kDa-os (ERα46) izoformáját humán leukociákon [106]. Egér limfociták plazmamembrán szeparátumából mi is ki tudtuk mutatni az ERα (66kDa, teljes hosszúságú izoforma), az ERβ (43kDa) és a GPR30 receptorokat. Az eredményeink határozottan arra utalnak, hogy a három féle intracellulárisan megtalálható ER plazmamembrán-asszociált formában is működhet egér és humán limfocita sejtekben, ahogyan azt már más sejttípusok esetében leírták [59, 76, 119-121]. Az aminosav szekvenciák alapján elemezve az egyes receptorok hidrofobicitási tulajdonságát azonban nem valószínű, hogy az ERα (66kDa) és az ERβ (43kDa) transzmembán receptorként funkcionálna az E2 extracelluláris megkötésében. Ezzel szemben a humán ERα 46kDa-os splice variánsáról (mERα46) kimutatták, hogy 74

transzmembrán fehérjeként a plazmamembránba képes integrálódni [122], így elméletben kötőhellyel szolgálhat a membrán impermeábilis E2-BSA ligand számára. Ennek bizonyítékaként azok a transzfektált endothél sejtek, amelyekben mutációval elrontották a receptor transzmembrán régióját valóban kevesebb E2-BSA megkötésére voltak képesek [122]. A limfocitákban csak kis mértékben expresszálódó tipikusan 7-TM régióval rendelkező GPR30-ról elképzelhető, hogy vezikuláris transzporttal az endoplazmatikus retikulumból a plazmamebránba kerül és így esetleg membrán receptorként is funkcionálhat, azonban alacsony expressziója nem predesztinálja erre a funkcióra. Persze továbbra sem zárhatjuk ki azt a lehetőséget, hogy egy eddig még azonosítatlan fehérje tölti be ténylegesen az mER szerepét. Persze továbbra sem zárhatjuk ki azt a lehetőséget, hogy egy még azonosítattlan fehérje tölti be ténylegesen az mER szerepét. Az ERα és ERβ plazmamembránhoz való asszociáltsága számos új funkcionális lehetőséget vet fel: 1. Elképzelhető, hogy az intracelluláris receptorok ligandum kötését segíti elő azáltal, hogy fizikai közelséget biztosít számukra a sejt belsejébe kerülő E2-höz. 2. Mivel a klasszikus ER-eknek nincsen saját kináz aktivitásuk, ezért fontos lehet más adaptor és jelátviteli molekulákkal való kapcsolatuk (pl. G-fehérjék, hősokk fehérje 90, caveolin-1, mátrix metaloproteinázok, tirozin kináz Shc é c-Src), amelyekkel esetleg E2specifikus szignaloszómát tudnak képezni és nem-genomiális jeleket közvetíteni [68, 71]. 3. A FRET eredményeink alapján az is elképzelhető, hogy a fentebb említett szignaloszómának extracellulárisan a mER is a része. A

plazmamembrán

asszociált

formához

elengedhetetlen

az

ER

reverzibilis

palmitoilációja [76, 120], ráadásul leírták, hogy az E2 hatással van erre a palmitolilációs folyamatra, ezáltal szabályozza pl. az ERα caveolákkal való interakcióját [69]. Ezzel szépen egybecsengenek a különböző ER formák szubcelluláris lokalizációjával kapcsolatos vizsgálati eredményeink, noha az egerek limfocitái nem expresszálnak caveolát, hanem helyette caveolin-1 negatív lipid raftok vannak szép számmal a plazmamembránjukban. Kísérleteink alapján a mER és a feltehetően palmitoilált klasszikus ösztrogén receptorok lényeges kolokalizációt mutattak a különböző lipid raft markerekkel. Mindezek mellett ráadásul a membrán impermeábilis E2-BSA ligand T és B sejtekhez való kötődése 75

nagyban függ a lipid raftok integritásától. Összhangban az általunk tapasztaltakkal, más sejttípusokon az ERα-ról és ERβ-ról is leírták, hogy lipid raftokkal és/ vagy caveolával asszociáltak, ill. hasonló lipid raft kontrollált jelátviteli szabályozást tapasztaltak [121, 123-125]. Ez további érdekes vizsgálati lehetőségeket vet fel, ugyanis autoimmun betegségben szenvedő pacienseken (SLE, RA) végzett tanulmányok szerint az érintettek limfocitái szignifikánsan magasabb plazmamembrán lipid raft mennyiséggel (koleszterin és szfingolipid) rendelkeztek az egészségesekhez képest [126]. Jelen dolgozat legérdekesebb eredménye kétséget kizáróan az ösztrogén-függő dinamikus receptor hálózat leírása. Azaz az a tény, hogy a különböző ER formák szubcelluláris lokalizációja erősen a mER-en keresztül közvetített jelektől függ. Mások hasonló szelektív, E2-függő ERβ- és nem ERα- transzlokációt figyeltek meg hippokampális sejtvonalakban és primer neuronokon is [127], amelyet a két receptorforma vélhetően eltérő scaffolding fehérjékkel való kapcsolatával magyaráztak. Bár bizonyíték egyelőre nincs rá, de limfociták esetében sem zárhatjuk ki ezt az elképzelést. Még mindig nagyon keveset tudni a keringő hormonkoncentráció immunsejtekre gyakorolt hatásáról, noha vannak publikációk arra vonatkozóan, hogy a menstruációs és a terhességi ösztrogén szint pozitívan korrelál a CD4+FoxP3+ Treg sejt számmal [36, 38], és a B sejtek túlélési arányával is [36, 37]. Megfigyeléseink alapján az E2-BSA-FITC kötődéssel meghatározott mER szint nőstény egerekben magasabb és jóval szélesebb skálán mozog a hímekéhez képest. A fenti eredményeket tekintve valószínűsíthető, hogy a membrán ösztrogén receptor sejfelszíni expressziója dinamikusan követi a ciklus hormonális változásait. Ezt a felvetést in vitro vizsgálataink is megerősítették, ahol az E2 pozitív visszacsatolási mechanizmus révén megemelte a sejtfelszíni mER szintet. Mindemellett leírtuk azt is, hogy az E2-BSA-mER komplex viszonylag gyorsan internalizálódik, ill. vélhetően egy intracelluláris pool-ból hamar reciklizál, ráadásul a kiindulási szinthez képest emelkedett mennyiségben. Mivel a mER-ligandum komplex internalizáció után az endo/lizoszómákba kerül; ezért valószínű, hogy ennek a folyamatnak nem a klasszikus receptorok számára közvetített ligandum transzfer a szerepe, hanem sokkal inkább a degradáció. Valamint a ciklus szinkronizált egér modellünk is hasonlóan pozitív korrelációt mutatott a napi E2 szint és az ERα és ERβ expressziója között T és B sejtek esetében is. Ezen eredmények alapján vélhetően a limfociták dinamikusan reagálnak

76

a hormonális változásokra, feltehetően az mER-en keresztül közvetített nem-genomiális jelek segítségével. Ugyan humán sejteken történtek már összehasonlító expressziós vizsgálatok a különböző ösztrogén receptorok tekintetében [106, 128, 129], egerekre vonatkozóan nincsenek ilyen részletes adataink; mER-ről ezidáig pedig egyik fajban sem történt a miénkhez hasonló leírás. Ezen adatok ismerete azonban nagyon fontos, mert valószínűsíthető, hogy az egyes receptorok időbeni megjelenése a különböző sejttípusokon fontos immunreguláló szereppel bírhat. Az E2 közvetített celluláris folyamatok jobb megértése érdekében sokkal több figyelmet kell fordítanunk az mER funkciójára is, hiszen a különböző típusú ösztrogén receptorok pontos szabályozó szerepe még nagyjából felderítetlen az immunrendszer vonatkozásában. Azt már tudjuk, hogy a 17β-ösztradiol és az E2-BSA is képes sejtvonalon és primer lépsejtekben is olyan jelátviteli molekulák aktivációját kiváltani, mint pl. az ERK1/2, Akt vagy az NFκB [22, 25]. Más sejttípusokon közölt adatokkal egybecsengően [106, 130] mi is úgy találtuk, hogy az E2-BSA serkenti, míg az E2 csökkenti a sejtek proliferációját. Eredményeink alapján az mER önmagában pozitív jelet közvetít a limfociták számára, míg ha a többi receptor is érintett a ligandum kötésben, akkor a különböző hatások valamilyen módon összevonódnak és megváltozik a sejtes válasz végső kimenete. Az általunk bemutatott adatok, összhangban más sejteken végzett vizsgálatokkal [49, 122, 124] azt sugallják, hogy limfocita sejtekben az ösztrogénnek egy rendkívül összetett receptor hálózata van, amelyben legalább három gén termékei különböző formákban vesznek részt. Azok tényleges expressziós aránya és szubcelluláris lokalizációja eltérő immunválaszokat eredményezhet. Ezen kívűl egy koncentráció-függő szabályozó mechanizmus is elképzelhető [131, 132]. Feltételezésünk szerint alacsony keringő E2koncentráció mellett elsőnek a mER-ek fognak telítődni, így ilyen körülmények mellett inkább a nem-genomiális jelek dominálnak. Ezzel szemben magas keringő E2 szint mellett a genomiális válaszok fognak dominálni. Ily módon a körülményektől függően ugyanaz a ligandum kiválthat negatív és pozitív jeleket is ugyanazon a sejten. A genomiális út vélhetően komplex sejtfunkciókat irányít (sejt aktiváció/proliferáció, citokin és ellenanyag termelés), míg az mER közvetített nem-genomiális jelek feltehetően lehetőséget adnak a sejt számára, hogy a hormonális változásokra reagálva finomhangolja a szabályozást (32. ábra). Ha figyelembe vesszük, hogy a fentebb vázolt E2-receptor hálózat milyen összetett, 77

akkor nem is olyan meglepő, hogy számos E2 hatással kapcsolatos alapkérdés még mindig megválaszolatlan, vagy igencsak ellentmondás. Ráadásul a komplex E2-receptor hálózat mellett a szex hormon kötő globulin (SHBG), mint E2 szállító fehérje, ill. receptorának (megalin) szerepét sem hagyhatjuk figyelmen kívül [86], hiszen sejtvonalon kapott eredményeink alapján úgy tűnik, annak is szerepe lehet az E2 limfocitákra gyakorolt hatásmechanizmusában. Ezzel kapcsolatban azonban még további vizsgálatokra lenne szükség primer sejteken is.

32. ábra. Sematikus ábra a limfocitákban található dinamikus ösztrogén receptor hálózatról. Az E2 predominánsan a koleszterinben, szfingomielinben és gangliozidokban gazdag lipid raftok területén lép a sejt belsejébe. A mER is főleg ezeken a membrán mikrodomén helyeken lokalizálódik, sőt a ligandum kötő képessége is nagyban a koleszterin stabilizáló hatásától függ. A genomiális-út keretein belül az ERα és ERβ transzkripció faktorként funkcionálnak, és különböző fehérjék szintézisét szabályozzák. Mindemellett a mER lehetőséget biztosít a sejt számára, hogy dinamikusan reagálni tudjon a környezet hormonális változásaihoz, az ún. gyors, nem-genomiális jelátviteli utak aktiválása révén. Fontos kiemelni, hogy a mER-en közvetített jelek hatásal vannak a klasszikus receptorok plazmamembránban való lokalizációjáért, vélhetően ez könnyití meg a membránon átjutó E2 megkötését. Másfelől a mER-E2 komplex a sejtfelszínről a lizoszómákba kerülve degradálódik. A különböző ösztrogén receptor formák és azok eltérő sejten belüli lokalizációjának köszönhetően egy komplex receptorhálózat működik a sejtekben. Vélhetően a kétféle útvonal ezen a receptorhálózaton keresztül „kommunikál” egymással, és így tudják biztosítani a limfocita funkciók finomhangolását. Ez az E2-függő ER transzlokáció vélhetően pozitív visszacsatolási mechanizmust jelent a sejt számára, és általa tudja felerősíteni a hormonális hatásokat.

78

Összefoglalás Összegzésül elmondhatjuk, hogy az ösztrogénnek egy komplex, dinamikus receptor hálózatát mutattuk ki limfocitákban; amelyben a három ismert receptor gén családnak (ERα, ERβ, GPR30) több különböző citoplazmatikus, vagy membrán-asszociált (módosított) formája vesz részt. Ezek a receptorok egyaránt hathatnak transzkripciós faktorokként a sejtmagba kerülve, ill. plazmamembrán lipid raftokhoz asszociáltan feltehetően gyors ösztrogén indukálta jeleket is közvetíthetnek. Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a különböző ösztrogén receptorok lokalizációja erősen függ a mER-en keresztül közvetített E2 jeltől, ez egy közvetett bizonyíték a genomiális és nem-genomiális út közötti kapcsolatra. Feltehetően a fent említett receptor formák eltérő jeleket közvetítenek a sejtek számára; amely az E2-mediálta sejtszíntű expressziójuktól és sejten belüli lokalizációjuktól függően kölönböző módokon valósulhat meg. Tehát az E2 limfocita funkciókra gyakorolt szabályozó szerepe sokkal összetettebb, mint ahogyan ezt eddig gondoltuk. Ennek a komplex E2-receptor hálózatnak és funkcionális szerepének, valamint az SHBG és annak receptorának - mint új, potenciális E2 jel közvetítőnek részletesebb feltárása segíthet minket olyan mechanizmusok mélyebb megértésében, mint pl. hogy az E2 miért jelent egyes autoimmun betegségekben rizikófaktort. A további vizsgálatok hozzájárulhatnak olyan biztonságosabb orális fogamzásgátlók és hormonpótló terápiák kidolgozásához, ahol kevésbé kellene tartani az immunrendszer „kisiklásától”.

79

Summary In conclusion, we show here that estrogen has a complex, dynamic receptor network in lymphocytes consisting of several cytoplasmic or plasma membrane-associated (modified) forms of three receptor gene families, ERα, ERβ and GPER. These receptors can either translocate to the nucleus and act as transcription regulators or translocate to plasma membrane compartments, preferentially to lipid rafts, in lymphocytes and mediate rapid E2-signals. Our results suggest that the subcellular localization of ERs and GPER (GPR30) strongly depends on E2 signals through the mER, providing an evidence for the linkage between the genomial and the non-genomial pathways. The estrogen-driven regulation of lymphocyte functions is much more complex than we have thought up to now. Presumably the above mentioned receptor forms mediate different signals to the cells depending on their actual, cell- and estrogen level-dependent expression and subcellular localization. Exploring the functional details of this complex E2-receptor network, complemented with a new potential inward E2-shuttling pathway mediated by SHBG and its receptor, may help us to deeper understanding the mechanisms making estrogen a risk factor in various autoimmune diseases and can also help to work out safe strategies for using oral contraceptives and hormonal replacement therapies without ’malfunctions’ in the immune system.

80

Irodalomjegyzék 1.

Petrovsky, N. (2001) Towards a unified model of neuroendocrine-immune interaction. Immunol Cell Biol 79, 350-7.

2.

Chesnokova, V. and Melmed, S. (2002) Minireview: Neuro-immuno-endocrine modulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis by gp130 signaling molecules. Endocrinology 143, 1571-4.

3.

Shepherd, A. J., Downing, J. E., Miyan, J. A. (2005) Without nerves, immunology remains incomplete -in vivo veritas. Immunology 116, 145-63.

4.

Csaba, G. (2011) [The immuno-endocrine system. A new endocrine theory: the problem of the packed transport]. Orv Hetil 152, 777-84.

5.

Csaba, G. and Pallinger, E. (2007) In vitro effect of hormones on the hormone content of rat peritoneal and thymic cells. Is there an endocrine network inside the immune system? Inflamm Res 56, 447-51.

6.

Webster, J. I., Tonelli, L., Sternberg, E. M. (2002) Neuroendocrine regulation of immunity. Annu Rev Immunol 20, 125-63.

7.

Tanriverdi, F., Silveira, L. F., MacColl, G. S., Bouloux, P. M. (2003) The hypothalamic-pituitary-gonadal axis: immune function and autoimmunity. J Endocrinol 176, 293-304.

8.

Morale, M. C., Gallo, F., Tirolo, C., L'Episcopo, F., Gennuso, F., Testa, N., Caniglia, S., Spina-Purrello, V., Avola, R., Scoto, G. M., Marchetti, B. (2003) The reproductive system at the neuroendocrine-immune interface: focus on LHRH, estrogens and growth factors in LHRH neuron-glial interactions. Domest Anim Endocrinol 25, 21-46.

9.

Owen, J. A., Jr. (1975) Physiology of the menstrual cycle. Am J Clin Nutr 28, 3338.

10.

Attila, F. (2003) Az orvosi élettan tankönyve. Medicina Könyvkiadó, Budapest.

11.

Meethal, S. V., Liu, T., Chan, H. W., Ginsburg, E., Wilson, A. C., Gray, D. N., Bowen, R. L., Vonderhaar, B. K., Atwood, C. S. (2009) Identification of a regulatory loop for the synthesis of neurosteroids: a steroidogenic acute regulatory protein-dependent mechanism involving hypothalamic-pituitary-gonadal axis receptors. J Neurochem 110, 1014-27.

12.

Veldhuis, J. D., Keenan, D. M., Liu, P. Y., Iranmanesh, A., Takahashi, P. Y., Nehra, A. X. (2009) The aging male hypothalamic-pituitary-gonadal axis: pulsatility and feedback. Mol Cell Endocrinol 299, 14-22.

13.

Whitacre, C. C. (2001) Sex differences in autoimmune disease. Nat Immunol 2, 777-80. 81

14.

Khan, D., Dai, R., Karpuzoglu, E., Ahmed, S. A. (2010) Estrogen increases, whereas IL-27 and IFN-gamma decrease, splenocyte IL-17 production in WT mice. Eur J Immunol 40, 2549-56.

15.

Pennell, L. M., Galligan, C. L., Fish, E. N. (2012) Sex affects immunity. J Autoimmun 38, J282-91.

16.

Lee, T. P. and Chiang, B. L. (2012) Sex differences in spontaneous versus induced animal models of autoimmunity. Autoimmun Rev 11, A422-9.

17.

Geurs, T. L., Hill, E. B., Lippold, D. M., French, A. R. (2012) Sex differences in murine susceptibility to systemic viral infections. J Autoimmun 38, J245-53.

18.

Bianchi, I., Lleo, A., Gershwin, M. E., Invernizzi, P. (2012) The X chromosome and immune associated genes. J Autoimmun 38, J187-92.

19.

Dillon, S. P., Kurien, B. T., Li, S., Bruner, G. R., Kaufman, K. M., Harley, J. B., Gaffney, P. M., Wallace, D. J., Weisman, M. H., Scofield, R. H. (2012) Sex chromosome aneuploidies among men with systemic lupus erythematosus. J Autoimmun 38, J129-34.

20.

Lleo, A., Moroni, L., Caliari, L., Invernizzi, P. (2012) Autoimmunity and Turner's syndrome. Autoimmun Rev 11, A538-43.

21.

Bouman, A., Heineman, M. J., Faas, M. M. (2005) Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 11, 411-23.

22.

Cutolo, M., Sulli, A., Capellino, S., Villaggio, B., Montagna, P., Seriolo, B., Straub, R. H. (2004) Sex hormones influence on the immune system: basic and clinical aspects in autoimmunity. Lupus 13, 635-8.

23.

Cutolo, M., Capellino, S., Sulli, A., Serioli, B., Secchi, M. E., Villaggio, B., Straub, R. H. (2006) Estrogens and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci 1089, 538-47.

24.

Quintero, O. L., Amador-Patarroyo, M. J., Montoya-Ortiz, G., Rojas-Villarraga, A., Anaya, J. M. (2012) Autoimmune disease and gender: plausible mechanisms for the female predominance of autoimmunity. J Autoimmun 38, J109-19.

25.

Adori, M., Kiss, E., Barad, Z., Barabas, K., Kiszely, E., Schneider, A., Kovesdi, D., Sziksz, E., Abraham, I. M., Matko, J., Sarmay, G. (2010) Estrogen augments the T cell-dependent but not the T-independent immune response. Cell Mol Life Sci 67, 1661-74.

26.

Shelly, S., Boaz, M., Orbach, H. (2012) Prolactin and autoimmunity. Autoimmun Rev 11, A465-70.

27.

Lateef, A. and Petri, M. (2012) Hormone replacement and contraceptive therapy in autoimmune diseases. J Autoimmun 38, J170-6.

82

28.

Amin, S., Peterson, E. J., Reed, A. M., Mueller, D. L. (2011) Pregnancy and rheumatoid arthritis: insights into the immunology of fetal tolerance and control of autoimmunity. Curr Rheumatol Rep 13, 449-55.

29.

Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. (2011) Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci 1221, 80-7.

30.

Baranao, R. I. (2011) [Immunology of pregnancy]. Invest Clin 52, 175-94.

31.

Poole, J. A. and Claman, H. N. (2004) Immunology of pregnancy. Implications for the mother. Clin Rev Allergy Immunol 26, 161-70.

32.

Zenclussen, A. C., Schumacher, A., Zenclussen, M. L., Wafula, P., Volk, H. D. (2007) Immunology of pregnancy: cellular mechanisms allowing fetal survival within the maternal uterus. Expert Rev Mol Med 9, 1-14.

33.

Zen, M., Ghirardello, A., Iaccarino, L., Tonon, M., Campana, C., Arienti, S., Rampudda, M., Canova, M., Doria, A. (2010) Hormones, immune response, and pregnancy in healthy women and SLE patients. Swiss Med Wkly 140, 187-201.

34.

Doria, A., Iaccarino, L., Arienti, S., Ghirardello, A., Zampieri, S., Rampudda, M. E., Cutolo, M., Tincani, A., Todesco, S. (2006) Th2 immune deviation induced by pregnancy: the two faces of autoimmune rheumatic diseases. Reprod Toxicol 22, 234-41.

35.

Weetman, A. P. (1999) The immunology of pregnancy. Thyroid 9, 643-6.

36.

Oertelt-Prigione, S. (2012) Immunology and the menstrual cycle. Autoimmun Rev 11, A486-92.

37.

Peeva, E., Venkatesh, J., Diamond, B. (2005) Tamoxifen blocks estrogen-induced B cell maturation but not survival. J Immunol 175, 1415-23.

38.

Weinberg, A., Enomoto, L., Marcus, R., Canniff, J. (2011) Effect of menstrual cycle variation in female sex hormones on cellular immunity and regulation. J Reprod Immunol 89, 70-7.

39.

Arruvito, L., Sanz, M., Banham, A. H., Fainboim, L. (2007) Expansion of CD4+CD25+and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. J Immunol 178, 2572-8.

40.

Lee, S., Kim, J., Jang, B., Hur, S., Jung, U., Kil, K., Na, B., Lee, M., Choi, Y., Fukui, A., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. Y. (2010) Fluctuation of peripheral blood T, B, and NK cells during a menstrual cycle of normal healthy women. J Immunol 185, 756-62.

41.

Wu, J. M., Zelinski, M. B., Ingram, D. K., Ottinger, M. A. (2005) Ovarian aging and menopause: current theories, hypotheses, and research models. Exp Biol Med (Maywood) 230, 818-28. 83

42.

Nahoum, V., Gangloff, A., Shi, R., Lin, S. X. (2003) How estrogen-specific proteins discriminate estrogens from androgens: a common steroid binding site architecture. FASEB J 17, 1334-6.

43.

Szreder, T. and Zwierzchowski, L. (2007) Estrogen receptors and their genes-potential markers of functional and production traits of farm animals. Mol Biol Rep 34, 207-11.

44.

Nelson, L. R. and Bulun, S. E. (2001) Estrogen production and action. J Am Acad Dermatol 45, S116-24.

45.

Heuvel, J. P. V., http://nrresource.org.

46.

Beato, M. and Klug, J. (2000) Steroid hormone receptors: an update. Hum Reprod Update 6, 225-36.

47.

Ryan, K. J. (1982) Biochemistry of aromatase: significance to female reproductive physiology. Cancer Res 42, 3342s-3344s.

48.

Pratt, W. B. and Toft, D. O. (1997) Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr Rev 18, 306-60.

49.

DeFranco, D. B. and Csermely, P. (2000) Steroid receptor and molecular chaperone encounters in the nucleus. Sci STKE 2000, pe1.

50.

Valentine, J. E., Kalkhoven, E., White, R., Hoare, S., Parker, M. G. (2000) Mutations in the estrogen receptor ligand binding domain discriminate between hormone-dependent transactivation and transrepression. J Biol Chem 275, 25322-9.

51.

Simoncini, T. and Genazzani, A. R. (2003) Non-genomic actions of sex steroid hormones. Eur J Endocrinol 148, 281-92.

52.

Walter, P., Green, S., Greene, G., Krust, A., Bornert, J. M., Jeltsch, J. M., Staub, A., Jensen, E., Scrace, G., Waterfield, M., et al. (1985) Cloning of the human estrogen receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 7889-93.

53.

Kuiper, G. G., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Nilsson, S., Gustafsson, J. A. (1996) Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5925-30.

54.

Mosselman, S., Polman, J., Dijkema, R. (1996) ER beta: identification and characterization of a novel human estrogen receptor. FEBS Lett 392, 49-53.

55.

Sun, J., Baudry, J., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. (2003) Molecular basis for the subtype discrimination of the estrogen receptor-betaselective ligand, diarylpropionitrile. Mol Endocrinol 17, 247-58.

56.

Cowley, S. M., Hoare, S., Mosselman, S., Parker, M. G. (1997) Estrogen receptors alpha and beta form heterodimers on DNA. J Biol Chem 272, 19858-62. 84

57.

Pettersson, K., Grandien, K., Kuiper, G. G., Gustafsson, J. A. (1997) Mouse estrogen receptor beta forms estrogen response element-binding heterodimers with estrogen receptor alpha. Mol Endocrinol 11, 1486-96.

58.

Lu, B., Leygue, E., Dotzlaw, H., Murphy, L. J., Murphy, L. C. (2000) Functional characteristics of a novel murine estrogen receptor-beta isoform, estrogen receptorbeta 2. J Mol Endocrinol 25, 229-42.

59.

Mott, N. N. and Pak, T. R. (2012) Characterisation of human oestrogen receptor beta (ERbeta) splice variants in neuronal cells. J Neuroendocrinol 24, 1311-21.

60.

Chaudhri, R. A., Olivares-Navarrete, R., Cuenca, N., Hadadi, A., Boyan, B. D., Schwartz, Z. (2012) Membrane estrogen signaling enhances tumorigenesis and metastatic potential of breast cancer cells via estrogen receptor-alpha36 (ERalpha36). J Biol Chem 287, 7169-81.

61.

Dey, P., Jonsson, P., Hartman, J., Williams, C., Strom, A., Gustafsson, J. A. (2012) Estrogen receptors beta1 and beta2 have opposing roles in regulating proliferation and bone metastasis genes in the prostate cancer cell line PC3. Mol Endocrinol 26, 1991-2003.

62.

Ku, L. T., Gercel-Taylor, C., Nakajima, S. T., Taylor, D. D. (2009) Alterations of T cell activation signalling and cytokine production by postmenopausal estrogen levels. Immun Ageing 6, 1.

63.

Lambert, K. C., Curran, E. M., Judy, B. M., Milligan, G. N., Lubahn, D. B., Estes, D. M. (2005) Estrogen receptor alpha (ERalpha) deficiency in macrophages results in increased stimulation of CD4+ T cells while 17beta-estradiol acts through ERalpha to increase IL-4 and GATA-3 expression in CD4+ T cells independent of antigen presentation. J Immunol 175, 5716-23.

64.

Douin-Echinard, V., Laffont, S., Seillet, C., Delpy, L., Krust, A., Chambon, P., Gourdy, P., Arnal, J. F., Guery, J. C. (2008) Estrogen receptor alpha, but not beta, is required for optimal dendritic cell differentiation and [corrected] CD40-induced cytokine production. J Immunol 180, 3661-9.

65.

Takao, T., Kumagai, C., Hisakawa, N., Matsumoto, R., Hashimoto, K. (2005) Effect of 17beta-estradiol on tumor necrosis factor-alpha-induced cytotoxicity in the human peripheral T lymphocytes. J Endocrinol 184, 191-7.

66.

Zhang, J., Chen, X., Zhang, S., Zhou, G., Xia, X., Lu, L. (2009) Effects of transdermal estrogen therapy on expressions of estrogen receptors and Tlymphocyte apoptosis in surgically menopausal women. Cell Mol Immunol 6, 27783.

67.

Grimaldi, C. M., Cleary, J., Dagtas, A. S., Moussai, D., Diamond, B. (2002) Estrogen alters thresholds for B cell apoptosis and activation. J Clin Invest 109, 1625-33. 85

68.

Norman, A. W., Mizwicki, M. T., Norman, D. P. (2004) Steroid-hormone rapid actions, membrane receptors and a conformational ensemble model. Nat Rev Drug Discov 3, 27-41.

69.

Falkenstein, E., Tillmann, H. C., Christ, M., Feuring, M., Wehling, M. (2000) Multiple actions of steroid hormones--a focus on rapid, nongenomic effects. Pharmacol Rev 52, 513-56.

70.

Whiting, K. P., Restall, C. J., Brain, P. F. (2000) Steroid hormone-induced effects on membrane fluidity and their potential roles in non-genomic mechanisms. Life Sci 67, 743-57.

71.

Moriarty, K., Kim, K. H., Bender, J. R. (2006) Minireview: estrogen receptormediated rapid signaling. Endocrinology 147, 5557-63.

72.

Matsuda, K., Sakamoto, H., Mori, H., Hosokawa, K., Kawamura, A., Itose, M., Nishi, M., Prossnitz, E. R., Kawata, M. (2008) Expression and intracellular distribution of the G protein-coupled receptor 30 in rat hippocampal formation. Neurosci Lett 441, 94-9.

73.

Levin, E. R. (2005) Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen. Mol Endocrinol 19, 1951-9.

74.

Pedram, A., Razandi, M., Sainson, R. C., Kim, J. K., Hughes, C. C., Levin, E. R. (2007) A conserved mechanism for steroid receptor translocation to the plasma membrane. J Biol Chem 282, 22278-88.

75.

Pedram, A., Razandi, M., Levin, E. R. (2006) Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane. Mol Endocrinol 20, 1996-2009.

76.

Acconcia, F., Ascenzi, P., Bocedi, A., Spisni, E., Tomasi, V., Trentalance, A., Visca, P., Marino, M. (2005) Palmitoylation-dependent estrogen receptor alpha membrane localization: regulation by 17beta-estradiol. Mol Biol Cell 16, 231-7.

77.

Chambliss, K. L., Yuhanna, I. S., Anderson, R. G., Mendelsohn, M. E., Shaul, P. W. (2002) ERbeta has nongenomic action in caveolae. Mol Endocrinol 16, 938-46.

78.

Boulware, M. I., Kordasiewicz, H., Mermelstein, P. G. (2007) Caveolin proteins are essential for distinct effects of membrane estrogen receptors in neurons. J Neurosci 27, 9941-50.

79.

Thomas, P., Pang, Y., Filardo, E. J., Dong, J. (2005) Identity of an estrogen membrane receptor coupled to a G protein in human breast cancer cells. Endocrinology 146, 624-32.

80.

Revankar, C. M., Cimino, D. F., Sklar, L. A., Arterburn, J. B., Prossnitz, E. R. (2005) A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling. Science 307, 1625-30.

86

81.

Olde, B. and Leeb-Lundberg, L. M. (2009) GPR30/GPER1: searching for a role in estrogen physiology. Trends Endocrinol Metab 20, 409-16.

82.

Wang, C., Dehghani, B., Magrisso, I. J., Rick, E. A., Bonhomme, E., Cody, D. B., Elenich, L. A., Subramanian, S., Murphy, S. J., Kelly, M. J., Rosenbaum, J. S., Vandenbark, A. A., Offner, H. (2008) GPR30 contributes to estrogen-induced thymic atrophy. Mol Endocrinol 22, 636-48.

83.

Windahl, S. H., Andersson, N., Chagin, A. S., Martensson, U. E., Carlsten, H., Olde, B., Swanson, C., Moverare-Skrtic, S., Savendahl, L., Lagerquist, M. K., Leeb-Lundberg, L. M., Ohlsson, C. (2009) The role of the G protein-coupled receptor GPR30 in the effects of estrogen in ovariectomized mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 296, E490-6.

84.

Otto, C., Rohde-Schulz, B., Schwarz, G., Fuchs, I., Klewer, M., Brittain, D., Langer, G., Bader, B., Prelle, K., Nubbemeyer, R., Fritzemeier, K. H. (2008) G protein-coupled receptor 30 localizes to the endoplasmic reticulum and is not activated by estradiol. Endocrinology 149, 4846-56.

85.

Isensee, J., Meoli, L., Zazzu, V., Nabzdyk, C., Witt, H., Soewarto, D., Effertz, K., Fuchs, H., Gailus-Durner, V., Busch, D., Adler, T., de Angelis, M. H., Irgang, M., Otto, C., Noppinger, P. R. (2009) Expression pattern of G protein-coupled receptor 30 in LacZ reporter mice. Endocrinology 150, 1722-30.

86.

Willnow, T. E. and Nykjaer, A. (2010) Cellular uptake of steroid carrier proteins-mechanisms and implications. Mol Cell Endocrinol 316, 93-102.

87.

Hammond, G. L. (2011) Diverse roles for sex hormone-binding globulin in reproduction. Biol Reprod 85, 431-41.

88.

Pardridge, W. M. (1988) Selective delivery of sex steroid hormones to tissues in vivo by albumin and by sex hormone-binding globulin. Ann N Y Acad Sci 538, 173-92.

89.

Hammond, G. L. (1995) Potential functions of plasma steroid-binding proteins. Trends Endocrinol Metab 6, 298-304.

90.

Rosner, W., Hryb, D. J., Khan, M. S., Nakhla, A. M., Romas, N. A. (1992) Sex hormone-binding globulin. Binding to cell membranes and generation of a second messenger. J Androl 13, 101-6.

91.

Rosner, W., Hryb, D. J., Kahn, S. M., Nakhla, A. M., Romas, N. A. (2010) Interactions of sex hormone-binding globulin with target cells. Mol Cell Endocrinol 316, 79-85.

92.

Khosla, S. (2006) Editorial: Sex hormone binding globulin: inhibitor or facilitator (or both) of sex steroid action? J Clin Endocrinol Metab 91, 4764-6.

93.

Kahn, S. M., Hryb, D. J., Nakhla, A. M., Romas, N. A., Rosner, W. (2002) Sex hormone-binding globulin is synthesized in target cells. J Endocrinol 175, 113-20. 87

94.

Fortunati, N., Fissore, F., Fazzari, A., Piovano, F., Catalano, M. G., Becchis, M., Berta, L., Frairia, R. (1999) Estradiol induction of cAMP in breast cancer cells is mediated by foetal calf serum (FCS) and sex hormone-binding globulin (SHBG). J Steroid Biochem Mol Biol 70, 73-80.

95.

Hammes, A., Andreassen, T. K., Spoelgen, R., Raila, J., Hubner, N., Schulz, H., Metzger, J., Schweigert, F. J., Luppa, P. B., Nykjaer, A., Willnow, T. E. (2005) Role of endocytosis in cellular uptake of sex steroids. Cell 122, 751-62.

96.

Stevis, P. E., Deecher, D. C., Suhadolnik, L., Mallis, L. M., Frail, D. E. (1999) Differential effects of estradiol and estradiol-BSA conjugates. Endocrinology 140, 5455-8.

97.

Benten, W. P., Stephan, C., Wunderlich, F. (2002) B cells express intracellular but not surface receptors for testosterone and estradiol. Steroids 67, 647-54.

98.

Gombos, I., Bacso, Z., Detre, C., Nagy, H., Goda, K., Andrasfalvy, M., Szabo, G., Matko, J. (2004) Cholesterol sensitivity of detergent resistance: a rapid flow cytometric test for detecting constitutive or induced raft association of membrane proteins. Cytometry A 61, 117-26.

99.

Nuutila, J. and Lilius, E. M. (2005) Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A 65, 93-102.

100.

Kiss, E., Nagy, P., Balogh, A., Szollosi, J., Matko, J. (2008) Cytometry of raft and caveola membrane microdomains: from flow and imaging techniques to high throughput screening assays. Cytometry A 73, 599-614.

101.

Szentesi, G., Vereb, G., Horvath, G., Bodnar, A., Fabian, A., Matko, J., Gaspar, R., Damjanovich, S., Matyus, L., Jenei, A. (2005) Computer program for analyzing donor photobleaching FRET image series. Cytometry A 67, 119-28.

102.

Luo, C., Zuniga, J., Edison, E., Palla, S., Dong, W., Parker-Thornburg, J. (2011) Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J Am Assoc Lab Anim Sci 50, 471-8.

103.

Kulcsar, M., Danko, G., Magdy, H. G., Reiczigel, J., Forgach, T., Prohaczik, A., Delavaud, C., Magyar, K., Chilliard, Y., Solti, L., Huszenicza, G. (2006) Pregnancy stage and number of fetuses may influence maternal plasma leptin in ewes. Acta Vet Hung 54, 221-34.

104.

Kelly, M. J. and Levin, E. R. (2001) Rapid actions of plasma membrane estrogen receptors. Trends Endocrinol Metab 12, 152-6.

105.

Mutschler Ernst; Gerd Geisslinger, H. K. K., Monika Schäfer-Korting (2001) Arzneimittelwirkungen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft 453.

106.

Pierdominici, M., Maselli, A., Colasanti, T., Giammarioli, A. M., Delunardo, F., Vacirca, D., Sanchez, M., Giovannetti, A., Malorni, W., Ortona, E. (2010) Estrogen 88

receptor profiles in human peripheral blood lymphocytes. Immunol Lett 132, 7985. 107.

Zoller, A. L. and Kersh, G. J. (2006) Estrogen induces thymic atrophy by eliminating early thymic progenitors and inhibiting proliferation of beta-selected thymocytes. J Immunol 176, 7371-8.

108.

Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. (1998) Crystallographic comparison of the estrogen and progesterone receptor's ligand binding domains. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5998-6003.

109.

Ekena, K., Weis, K. E., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. (1996) Identification of amino acids in the hormone binding domain of the human estrogen receptor important in estrogen binding. J Biol Chem 271, 20053-9.

110.

Jacobsohn, M. K., Bauder, S., Pine, S. R., Jacobsohn, G. M. (1994) Cholesterol limits estrogen uptake by liposomes and erythrocyte membranes. Biochim Biophys Acta 1195, 131-40.

111.

Muir, C., Spironello-Vella, E., Pisani, N., deCatanzaro, D. (2001) Enzyme immunoassay of 17 beta-estradiol, estrone conjugates, and testosterone in urinary and fecal samples from male and female mice. Horm Metab Res 33, 653-8.

112.

Wood, G. A., Fata, J. E., Watson, K. L., Khokha, R. (2007) Circulating hormones and estrous stage predict cellular and stromal remodeling in murine uterus. Reproduction 133, 1035-44.

113.

Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. (2003) Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol 130, 267-78.

114.

Christensen, E. I. and Birn, H. (2002) Megalin and cubilin: multifunctional endocytic receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 256-66.

115.

Hammes, S. R. and Levin, E. R. (2007) Extranuclear steroid receptors: nature and actions. Endocr Rev 28, 726-41.

116.

Hirahara, Y., Matsuda, K., Gao, W., Arvanitis, D. N., Kawata, M., Boggs, J. M. (2009) The localization and non-genomic function of the membrane-associated estrogen receptor in oligodendrocytes. Glia 57, 153-65.

117.

Benten, W. P., Lieberherr, M., Giese, G., Wunderlich, F. (1998) Estradiol binding to cell surface raises cytosolic free calcium in T cells. FEBS Lett 422, 349-53.

118.

Guo, Z., Krucken, J., Benten, W. P., Wunderlich, F. (2002) Estradiol-induced nongenomic calcium signaling regulates genotropic signaling in macrophages. J Biol Chem 277, 7044-50.

89

119.

Tabatadze, N., Smejkalova, T., Woolley, C. S. (2013) Distribution and posttranslational modification of synaptic ERalpha in the adult female rat hippocampus. Endocrinology 154, 819-30.

120.

La Rosa, P., Pesiri, V., Leclercq, G., Marino, M., Acconcia, F. (2012) Palmitoylation regulates 17beta-estradiol-induced estrogen receptor-alpha degradation and transcriptional activity. Mol Endocrinol 26, 762-74.

121.

Reineri, S., Bertoni, A., Sanna, E., Baldassarri, S., Sarasso, C., Zanfa, M., Canobbio, I., Torti, M., Sinigaglia, F. (2007) Membrane lipid rafts coordinate estrogen-dependent signaling in human platelets. Biochim Biophys Acta 1773, 2738.

122.

Kim, K. H., Toomre, D., Bender, J. R. (2011) Splice isoform estrogen receptors as integral transmembrane proteins. Mol Biol Cell 22, 4415-23.

123.

Kim, H. P., Lee, J. Y., Jeong, J. K., Bae, S. W., Lee, H. K., Jo, I. (1999) Nongenomic stimulation of nitric oxide release by estrogen is mediated by estrogen receptor alpha localized in caveolae. Biochem Biophys Res Commun 263, 257-62.

124.

Chambliss, K. L., Yuhanna, I. S., Mineo, C., Liu, P., German, Z., Sherman, T. S., Mendelsohn, M. E., Anderson, R. G., Shaul, P. W. (2000) Estrogen receptor alpha and endothelial nitric oxide synthase are organized into a functional signaling module in caveolae. Circ Res 87, E44-52.

125.

Marquez, D. C., Chen, H. W., Curran, E. M., Welshons, W. V., Pietras, R. J. (2006) Estrogen receptors in membrane lipid rafts and signal transduction in breast cancer. Mol Cell Endocrinol 246, 91-100.

126.

Kabouridis, P. S. and Jury, E. C. (2008) Lipid rafts and T-lymphocyte function: implications for autoimmunity. FEBS Lett 582, 3711-8.

127.

Sheldahl, L. C., Shapiro, R. A., Bryant, D. N., Koerner, I. P., Dorsa, D. M. (2008) Estrogen induces rapid translocation of estrogen receptor beta, but not estrogen receptor alpha, to the neuronal plasma membrane. Neuroscience 153, 751-61.

128.

Igarashi, H., Kouro, T., Yokota, T., Comp, P. C., Kincade, P. W. (2001) Age and stage dependency of estrogen receptor expression by lymphocyte precursors. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 15131-6.

129.

Phiel, K. L., Henderson, R. A., Adelman, S. J., Elloso, M. M. (2005) Differential estrogen receptor gene expression in human peripheral blood mononuclear cell populations. Immunol Lett 97, 107-13.

130.

Tan, Z., Zhou, L. J., Li, Y., Cui, Y. H., Xiang, Q. L., Lin, G. P., Wang, T. H. (2012) E(2)-BSA activates caveolin-1 via PI(3)K/ERK1/2 and lysosomal degradation pathway and contributes to EPC proliferation. Int J Cardiol 158, 46-53.

131.

Chandrasekharan, S., Kandasamy, K. K., Dayalan, P., Ramamurthy, V. (2013) Estrogen induced concentration dependent differential gene expression in human 90

breast cancer (MCF7) cells: role of transcription factors. Biochem Biophys Res Commun 437, 475-81. 132.

Priyanka, H. P., Krishnan, H. C., Singh, R. V., Hima, L., Thyagarajan, S. (2013) Estrogen modulates in vitro T cell responses in a concentration- and receptordependent manner: effects on intracellular molecular targets and antioxidant enzymes. Mol Immunol 56, 328-39.

91

Köszönetnyilvánítás:

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Erdei Annának, hogy lehetővé tette számomra a tanszéken folyó kutatómunkába való bekapcsolódást. Külön köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Matkó Jánosnak a számtalan kísérleti módszer megismertetéséért, valamint amiért PhD-s hallgatóként tovább folytathattam a szakdolgozóként elkezdett, számomra rendkívül érdekes témát. Köszönöm Dr. László Glóriának a véghajrában nyújtott támogatását és hasznos tanácsait, valamint Dr. Balogh Andreának a dogozat alapos átolvasását. Köszönöm a tanszék valamennyi dolgozójának segítőkészségét és a tanszékre jellemző remek légkört, melyben dolgozhattam. Köszöntettel tartozom továbbá Schuszter Kittinek és Kárpáti Évinek, amiért jó csapatmunka alakulhatott ki közöttünk, és a folyton érdeklődő kérdéseiktől én magam is jobbá válhattam. Köszönöm Dr. Kulcsár Margitnak, hogy lehetővé tette a hormonminták lemérését. Külön köszönöm Családomnak és Férjemnek, hogy céljaim elérésében feltétel nélkül, rengeteg türelemmel és szeretettel segítettek.

92

Saját közlemények jegyzéke: Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: 1.

Mónika Ádori*, Endre Kiss*, Zsuzsanna Barad, Klaudia Barabás, Edda Kiszely, Andrea Schneider, Erna Sziksz, Dorottya Kövesdi, István M. Ábrahám, János Matkó, Gabriella Sármay. Estrogen augments the T-cell-dependent but not the Tindependent immune response in vivo and induces rapid non-classical effects on B- and T-Cells Mol Life Sci, (2010) 67:1661–1674 impakt faktor: 7,047

2. Andrea E. Schneider, Éva Kárpáti, Kitti Schuszter, Eszter A. Tóth, Endre Kiss, Margit Kulcsár, Glória László, Janos Matko. A dynamic network of estrogen receptors in murine lymphocytes: fine-tuning the immune response Journal of Leukocyte Biology (2014, in press) impakt faktor: 4,568 Egyéb közlemények: 1.

Máté Maus, David Medgyesi, Endre Kiss, Andrea E. Schneider, Ágnes Enyedi, Nóra Szilágyi, János Matkó, Gabriella Sárma. B cell receptor-induced Ca2+-mobilization mediates F-actin rearrangements and is indispensable for adhesion and spreading of B lymphocytes Journal of Leukocyte Biology (2013) Apr. 93(4):537-47. impakt faktor:4,568

Konferencia absztraktok és előadások: E. Kiss, M. Ádori, Zs. Barad, K. Barabás, E. Kiszely, A. Schneider, D. Kövesdi, I. Ábrahám2,4, G. Sármay1,3, J. Matkó:„Estrogen regulates T-dependent humoral immune response and exerts rapid, non-genomic effects on B- and T lymphocytes.” 15th Symposium on Signals and Signal Processing in the Immune System (Balatonöszöd, 2009) Schneider Andrea, Kiss Endre, Ádori Mónika, Ábrahám István, Matkó János Funkcionális membrán ösztrogén receptor Limfocitákon, 39. Magyar Immunológiai Társaság vándorgyűlése, 2010. november 3-5., Szeged Schneider Andrea, Kiss Endre, Ádori Mónika, Ábrahám István, Matkó János Funkcionális membrán ösztrogén receptor Limfocitákon, „Universitates Nostrea- Scientia Nostra”, az ELTE fenállásának 375. évfordulója alkalmából az Eötvös Loránd Tudományegyetem és a Semmelweis Egyetem közös ünnepi ülése, 2010 november 18., Budapest Sármay Gabriella, Ádori Mónika, Kiss Endre, Barad Zsuzsanna, Barabás Klaudia, Kiszely Edda, Schneider Andrea, Sziksz Erna, Kövesdi Dorotty, Ábrahám István, Matkó János Az 93

ösztrogén fokozza a T-sejt függő, de nem befolyásolja a T-independens immunválaszt, és gyors nem-genomiális változásokat vált ki T- és Bsejtekben, Magyar Farmakológiai Anatómus Mikrocirkulációs Élettani Társaságok Közös Tudományos Konferenciája, 2011. június 8-11., Pécs Andrea Schneider, Kitti Schuszter, Endre Kiss, Glória László, János Matkó Membrane estrogen receptor(s) on lymphocytes: Who are they and can they regulate the immune responses? Immun-related Phatologies: Understanding Leukocyte Signaling and Emerging therapies (1st IMPULSE), 2011. szeptember 3-6., Visegrád Schneider Andrea, Schuszter Kitti, László Glória, Matkó János, Az ösztrogén szex hormon, mint immunmoduláns: funkcionális membrán receptor limfocitákon Centrumban a tudás, TÁMOP konferencia az Eötvös Loránd Tudományegyetemen, 2011. november 24., Budapest E. Schneider Andrea, Schuszter Kitti, László Glória, Matkó János, Limfociták membrán ösztrogén receptora: kapcsolat a genomiális és nem-genomiális útvonalak között, 41. Magyar Immunológiai Társaság vándorgyűlése, 2012. október 17-19., Debrecen Andrea E. Schneider, Éva Kárpáti, Kitti Schuszter, Glória László, János Matkó, Membrane estrogen receptor(s) on lymphocytes: The linkage between the genomial and non genomial pathway, Immun-related Phatologies: Understanding Leukocyte Signaling and Emerging therapies (2nd IMPULSE), 2013. augusztrus 31- szeptember 3, Mátraháza

94