Szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás technikákkal

Szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás technikákkal

Bagócsi Boglárka

Kémia Doktori Program Programvezető: Prof. Dr. Inzelt György

Témavezető: Egyetemi konzulens:

Ferencziné Dr. Fodor Katalin (Richter Gedeon Nyrt.) Horváthné Dr. Otta Klára (ELTE TTK)

Richter Gedeon Nyrt. Budapest, 2007

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönöm Társaságunk és a Minőségirányítási Igazgatóság vezetőségének a lehetőséget, hogy munkahelyemen, a Richter Gedeon Nyrt. Minőségellenőrző laboratóriumában elvégezhettem doktori munkámat. Hálásan köszönöm témavezetőmnek Ferencziné Dr. Fodor Katalinnak munkám irányítását, ösztönzését. Köszönöm konzulensemnek Horváthné Dr. Otta Klárának dolgozatommal kapcsolatos hasznos észrevételeit, tanácsait és segítségét. Köszönöm Mahó Sándornak a Richter Gedeon Nyrt. Szteroid szintetikus laboratórium vezetőjének a munkámhoz szükséges vegyületek biztosítását, értékes szakmai tanácsait. Köszönöm Laukó Annának a Kémia VI., és Németh Sándornak a Biokémia II. üzemellenőrző laboratóriumok vezetőinek a szteroidszintézissel kapcsolatos munkáknál nyújtott segítségüket, a HPLC és gázkromatográfiás mérések végzését. Köszönöm Dr. Végh Zoltánnak szakmai tanácsait, a rétegkromatográfiás fotók, videofelvételek elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Görög Sándor professzor úrnak a dolgozatommal kapcsolatos kritikai megjegyzéseit, hasznos tanácsait. Külön köszönettel tartozom Katona Mihályné és Tóth Gábor munkatársaimnak a gyakorlati munka elvégzésében nyújtott segítségükért.

2

TARTALOMJEGYZÉK

Gyakran használt rövidítések................................................................................................. 5 1. BEVEZETÉS – CÉLOK ................................................................................................... 6 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................................. 7 2.1. A szteroid hormonok .................................................................................................. 7 2.1.1. A norszteroid-szintézis......................................................................................... 8 2.2. Vizsgálati lehetőségek .............................................................................................. 11 2.2.1. Általánosan használt technikák ......................................................................... 11 2.2.2. A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) szerepe a szteroidok tisztaságvizsgálatában................................................................................................. 12 2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások ......................................... 15 3. KÍSÉRLETI RÉSZ .......................................................................................................... 17 3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek ............................................................................ 17 3.2. Módszerleírások ....................................................................................................... 17 3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek.................................................. 17 3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek ....................... 18 3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek ...................... 20 4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS ..................................................................................... 25 4.1. Vizsgált szteroidok ................................................................................................... 25 4.1.1. Nandrolon.......................................................................................................... 26 4.1.2. Dienoléter .......................................................................................................... 27 4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát................................................................................ 29 4.1.4. Molon................................................................................................................. 32 4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények ................................................. 36 4.2. Előhívások ................................................................................................................ 38 4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok..................................... 40 4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek ............................................. 43 4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák ................................... 48 4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése ...................................................................... 57 4.3. Teljesítményjellemzők ............................................................................................. 60 3

4.3.1. Etinil-ösztradiol ................................................................................................. 61 4.3.2. Noretiszteron ..................................................................................................... 67 4.3.3. Nandrolon.......................................................................................................... 73 4.3.4. Gesztodén .......................................................................................................... 79 4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye .......................... 83 4.4. Szűrővizsgálatok....................................................................................................... 85 4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre ..................................................... 86 4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre ................................................................... 87 4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál .................................................. 93 5. ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................ 95 6. SUMMARY .................................................................................................................... 96 7. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................. 97

4

Gyakran használt rövidítések

VRK

vékonyrétegkromatográfia

OPLC

túlnyomásos rétegkromatográfia

HPLC

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

GC

gázkromatográfia

UV

ultraibolya

NMR

mágneses magrezonancia spektroszkópia

FID

lángionizációs detektor

HPTLC

nagyhatékonyságú vékonyrétegkromatográfia

RF

retardációs faktor

RRF

relatív retardációs faktor

Rt

retenciós idő

RRt

relatív retenciós idő

Rs

csúcsfelbontás

H

elméleti tányérmagasság

N

elméleti tányérszám

5

1. BEVEZETÉS – CÉLOK

A

Richter

Gedeon

Nyrt.

hagyományos

termékpalettáján

a

szteroidok

vegyületcsoportja igen fontos szerepet játszik. Felhasználják fogamzásgátló, hormonpótló készítményekben, de alapanyag formában is exportálják ezeket a vegyületeket. A szteroidokon belül különös fontosságúak a norszteroidok, amelyeken az alapváznál eggyel kevesebb metil-csoport van. Ezeket soklépéses szintézissel állítják elő: azonos kiindulási anyagokból; a technológiai folyamat elágazásával különböző termékek keletkeznek. Így a közös kiindulási anyagok folytán ezeknek a szteroidoknak a szennyezés-profilja összefügg. Munkám célja a szteroid totálszintézis fontosabb vegyületeinek (melyek ismertebb termékei a nandrolon-dekanoát, noretiszteron, allilösztrenol) részletes tanulmányozása az alábbi szempontok szerint: - Az egyes technológiai lépések követésével a közös szennyezések és prekurzoraik felderítése a különböző szteroidokban, analógiák keresése. - Olyan tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozása, amelyek lehetővé teszik az UVelnyelést nem mutató szteroid-szennyezők kimutatását, amelyek az UV-detektálást alkalmazó HPLC-módszerrel észrevétlenek maradnak. A planár-kromatográfiás módszerek (VRK, OPLC) speciális előhívó reagensek alkalmazásával ezt lehetővé teszik. - Olyan gyors ellenőrző módszerek kidolgozása, amelyek alkalmasak a reakcióelegyek és köztitermékek vizsgálatára is.

6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A szteroid hormonok A hormonok speciális felépítésű anyagok, amelyek a vér útján jutnak el a rájuk specifikusan érzékeny sejtekhez, ill. szövetekhez, ahol már igen alacsony koncentrációban kifejtik hatásukat. Kémiai felépítésük alapján három csoportba oszthatók: - szteroid hormonok, - peptid hormonok, - fenolszármazékok. Az egyes szerkezeti csoportokon belül hatásuk szerint további csoportosítás lehetséges. Részletesebben a szteroid hormonokkal foglalkozom, amelyek a szteránvázas vegyületek közé tartoznak (1. ábra), ezek szubsztituált és általában részben telítetlen származékaik. 12 11 1 2 3

10

A 4

8

17

D

C

9

B 5

13

14

16

15

7 6

1. ábra. A szteránváz A szteroid hormonok lehetnek nemi hormonok és mellékvesekéreg-hormonok vagy kortikoszteroidok. A nemi hormonok között megkülönböztetünk férfi nemi hormonokat, ezeket hívjuk androgéneknek, ill. női nemi hormonokat, amelyek az ösztrogének vagy tüszőhormonok és a gesztagének vagy sárgatest-hormonok. Az androgénekre jellemző alapváz a C19-es androsztán-váz (2. ábra). Képviselőjük az androszteron és a tesztoszteron. A másodlagos férfi nemi jelleg kialakításában van szerepük. Androgén aktivitásuk mellett anabolikus hatásuk is van, vagyis elősegítik a fehérjék tárolását, megtartását, ezáltal gyorsítják a szövetképződést, növekedést, elősegítik a regenerációt. Az androgén és az anabolikus hatás között azonban nincs párhuzam. A vázon végzett megfelelő szerkezeti változtatásokkal elő lehet állítani olyan szteroidokat, amelyeknek vagy az androgén vagy az anabolikus hatásuk dominál. Utóbbiakat anabolikus szteroidoknak nevezzük, egyik legismertebb képviselőjük a nandrolon-dekanoát.

7

21 18

18

18

20

19

19

HO

androsztán (C19)

ösztrán (C18)

pregnán (C21)

2. ábra. Férfi, ill. női nemi hormonok alapvázai Az ösztrán alapvázzal (C18) rendelkező vegyületek közül az ösztrogének vázában az A-gyűrű aromás szerkezetű. Ide tartozik az ösztron, az ösztradiol és az ösztriol. Ezek a hormonok a pete érését és az ovulációt segítik, leghatásosabb közülük az ösztradiol. A gesztagéneknek, amelyeket más néven terhességi hormonoknak nevezünk, mert a peteérést és az ovulációt gátolják, C21-es pregnán alapvázuk van, képviselőjük a progeszteron. Ovulációgátló hatásuk miatt a születésszabályozásban van szerepük; rendkívül intenzív hatású mesterséges gesztagéneket is előállítottak és használnak a fogamzásgátló készítményekben, mint például a noretiszteront. A mellékvesekéreg hormonjai, a kortikoszteroidok között megkülönböztetjük a szénhidrátanyagcserét szabályozó glükokortikoszteroidokat, mint például a kortizon és a hidrokortizon, ill. a mineralokortikoszteroidokat, amelyek a só- és vízháztartást szabályozzák. A kortikoszteroidok között is léteznek mesterséges származékok, főleg gyulladásgátló és antireumás szerek [1-4]. 2.1.1. A norszteroid-szintézis A szteroid hormonok előállítására több lehetőség van. Az ún. félszintézisek során növényi vagy állati eredetű szteroidokat alakítanak át más szteroidokká. Például dioszgeninből vagy koleszterinből kiindulva tesztoszteron, ösztradiol vagy progeszteron előállítása válik lehetővé. Másik lehetőség a totálszintézis. Az első anabolikus androgén szteroid hormon, a 19-nortesztoszteron (nandrolon) teljesen szintetikus előállítása először 1950-ben vált lehetővé a Birch-redukció segítségével [5]. Ezután számos norszteroid totálszintézisét valósították meg. Ennek egyik példája Torgov nevéhez fűződik, aki ösztron előállítását írta le metoxi-tetralonból kiinduló teljes szintézissel [6]. A Gyár az 1950-es évek végén kezdte el a szintetikus szteroidelőállítási eljárások kidolgozását [7]. A szteroid hormonok totálszintézisének kiindulási anyaga a β-naftol. A többlépcsős szintézisút kezdeti reakcióit követően a keletkezett molekulát metil-, ill. etil-

8

ciklopentándionnal kondenzálják. A metil-ciklopentándion az ún. metilsor vegyületeinek kiindulási anyaga, amelyek a szteroidváz (1. ábra) 13-as szénatomján metil-csoportot tartalmaznak, míg az etil-ciklopentándion az ún. etilsor kiindulási anyaga, a 13-as szénen etil-csoportot tartalmazó szteroidoké. A szintézis során a β-naftolból hidrogénezéssel, metilezéssel, oxidációval és Grignard-reakcióval létrehozott vinil-karbinolt reagáltatják a ciklopentándionnal, amely egy báziskatalizálta reakció, a hidroxi-csoporthoz képest allil-helyzetben kapcsolódik a ciklopentándion molekula, közben enolizáció játszódik le. Metil-szekodion keletkezik, amelyből további reakciókkal ösztradiol-metil-acetátot, Birch-redukcióval és savas hidrolízissel pedig 19-nortesztoszteront, más néven nandrolont kapunk. A 3. ábrán a szteroidok totálszintézisének doktori munkámban vizsgált ágát mutatom be vázlatosan.

9

β-naftol

∫∫

vinil-karbinol + metil-ciklopentándion ∫∫

etinilösztradiol

∫∫

ösztradiol17-acetát

ÖDME-acetát

∫∫

ösztradiol

nordion

nandrolondekanoát

noretiszteron

allilösztrenol

: elágazási pont ____ : végtermék

∫∫

nesztoron

∫∫

etinodioldiacetát

∫∫

∫∫

nandrolon

noretiszteronacetát

3. ábra. A norszteroid-totálszintézis „metilsorának” vázlata [8]

10

A technológiai folyamat elágazásaival különböző termékek keletkeznek, amelyek szennyezésprofilja a közös kiindulási anyagok miatt összefügg. 2.2. Vizsgálati lehetőségek 2.2.1. Általánosan használt technikák Szteroidok tisztaságvizsgálatára többféle kromatográfiás módszert használnak [9]. A hatóanyagok, végtermékek minőségének ellenőrzésére a hagyományos vékonyrétegkromatográfiás (VRK) módszerek visszaszorulóban vannak a pontosabb, kvantitatív eredményeket biztosító nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerekkel szemben. A

gyártásközi

ellenőrző

laboratóriumokban

intermedierek

vizsgálatára,

reakciókövetésre még ma is használják a VRK-módszereket, ugyanakkor HPLC és gázkromatográfiás (GC) módszerek, ill. speciális esetekben egyéb – pl. spektrofotometriás – módszerek is használatosak. A VRK-módszerek előnye abban rejlik, hogy egyszerűek, olcsók és gyorsak. Több minta egyidejű, standard melletti analízisét is lehetővé teszik, komplex, ill. nyers minták előkészítés nélkül, vagy minimális mintaelőkészítéssel azonnal felvihetők a szorbensre. A minta valamennyi detektálható komponense egyidejűleg megjeleníthető a rétegen, a starton maradó és a frontba kerülő anyagok is detektálhatók, szemben az oszlopos technikákkal. Egyszerűen alkalmazható sokféle előhívási technika, amelyekkel a szorbensre felvitt anyag különböző komponensei láthatóvá tehetők, detektálhatók. Lehetőség van kvantitatív denzitometriás értékelésre, valamint félkvantitaív vizuális értékelésre [10-13]. Hátrány azonban, hogy a VRK-módszerek nem teljesen automatizálhatók. Az egyes lépések, mint mintafelvitel, kifejlesztés, előhívás, detektálás automatizálhatók, de a lépések között manuális beavatkozásra van szükség. Másik hátrány, hogy a VRK nyitott rendszer, a környezeti tényezők jelentős hatást gyakorolnak az elválasztásra. Pl. a legelterjedtebben használt normál fázisú szilikagél rétegek esetében a levegő változó nedvességtartalma okozhat problémát. A mobil fázis áramlási sebességét a kapilláris erők határozzák meg (kivéve a kényszeráramlásos VRK technikákat, pl. OPLC), melyeket szintén több tényező befolyásol. Ezen okok kedvezőtlenül hatnak a kromatogramok reprodukálhatóságára. Ennek javítására Reich dolgozatában találunk javaslatokat [14]. A gyógyszeranyagok vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával több összefoglaló közlemény foglalkozik [1518]. 11

A szteroidok esetében normál- (TLC) vagy finomszemcsés (HPTLC) szilikagél állófázisok használatosak. Az előhívási technikák közül gyakori a kénsavas etanolos bepermetezés vagy a reagensoldatba történő bemerítés és az azt követő néhány perces 100120 °C-on történő hevítés. Ilyenkor 366 nm-es ultraibolya (UV) fénnyel besugározva különböző színnel, intenzíven fluoreszkáló foltok jelennek meg. A HPLC-módszerek előnye a zárt rendszerből és az eluens egyenletes áramlási sebességéből adódóan a reprodukálhatóság és az automatizálhatóság; pontos, kvantitatív eredmények kaphatók velük [19]. A technika hatékonysága, az elméleti tányérszám itt jóval nagyobb, mint a VRK-nál. A hagyományos HPLC hátránya ugyanakkor a hosszú analízisidő, a nagy oldószerigény és költség. A kromatográfiás oszlop kondícionálásához szükséges időt és oldószert is figyelembe kell vennünk. A végtermékekre használt rutinanalitikai méréseknél ugyanis még nem használják széles körben a monolit oszlopokat [19], vagy a rendkívül kis szemcseméretű töltettel rendelkező rövid oszlopokat [19], amelyek jelentős mértékben meggyorsítják az analízist. Komplex minták (pl. gyógyszerkészítmények, reakcióelegyek) előkészítés nélkül általában nem vizsgálhatók. A gyógyszeriparban általánosan használt UV-detektorral ellátott HPLC készülékek pedig a csekély UV-elnyelést mutató komponensek kimutatására nem alkalmasak. Tisztaságvizsgálatra ritkábban használják a GC-technikát [20]. Ez a módszer kvantitatív, gyors, tömegarányos analitikai jelet ad és tömegspektrometriás (MS) detektálással ismeretlen csúcsok azonosítását is lehetővé teszi. Hátránya, hogy a hőérzékeny és a kevésbé illékony komponensek nem vagy nem pontosan mérhetők. A 3keto-Δ4 szerkezetű szteroidok például kisebb hőbomlást szenvednek az injektorban [21]. A gyártásközi ellenőrzéseknél UV spektrofotometriás módszert is használnak reakciókövetésre. 2.2.2.

A

túlnyomásos

rétegkromatográfia

(OPLC)

szerepe

a

szteroidok

tisztaságvizsgálatában A kényszeráramlásos rétegkromatográfiás technikák közé tartozik a túlnyomásos rétegkromatográfia – OPLC (Over-Pressured Layer Chromatography, vagy Optimum Performance Laminar Chromatography) – egy síkelrendezésű folyadékkromatográfiás módszer, amely ötvözi magában a VRK és a HPLC előnyeit [22-26].

12

Az OPLC kamrában a szorbensréteget egy rugalmas fóliával nyomás alatt letakarjuk, így gyakorlatilag nincs gőztér. Az eluenst a szorbensrétegbe nyomás alatt, mikropumpával juttatjuk el. Az OPLC alkalmas on-line, illetve off-line mintafelvitelre, elválasztásra és detektálásra és ezek kombinációira (részleges off-line módszerek). Az on-line módban az oldott anyagokat az elfolyó eluensben detektáljuk egy átfolyócellás detektor segítségével. Az off-line módban a kromatográfiás folyamat valamennyi lépése (mintafelvitel, elválasztás, értékelés) egymást követően külön-külön valósul meg. Az OPLC rendszerekben az eluens összetételének változtatása jó lehetőséget biztosít speciális elválasztási módszerek alkalmazására, mint az izokratikus, a gradiens és a lépcsős gradiens módszer. A technika előnye, hogy az eluens összetételének változtatása egyszerűen és gyorsan elvégezhető, a rendszer nem igényel több órán át tartó kondícionálást. A hagyományos rétegkromatográfiában az eluens a kapilláris erők révén vándorol az álló rétegben, míg a lineáris OPLC esetében pumparendszer segítségével biztosítja az eluensfront állandó sebességét a szorbensben. A normál kamrában végzett futtatás esetében az eluens frontjának sebessége folyamatosan csökken, emiatt a kromatografált anyagok foltjainak szétterülése az idő előrehaladtával egyre jelentősebbé válik. Az α front vándorlását a következő függvénnyel jellemezhetjük: z f2 = k ⋅ t ahol zf

(2.1)

az α front távolsága, t a kifejlesztési idő és k egy állandó, mely az

elválasztás körülményeitől függ. A lineáris kifejlesztésű túlnyomásos futtatás (OPLC) esetében a front vándorlása a következő lineáris függvénnyel írható le: zi = ui ⋅ t

(2.2)

ahol zi az i-edik komponens, vagy az eluensfront távolsága, ui az i-edik komponens, vagy az eluensfront áramlási sebessége és t a kifejlesztési idő.

13

4. ábra. Az eluensfront vándorlásának időfüggése hagyományos VRK és OPLC esetében [27] 1-hagyományos kifejlesztés, 2-lineáris OPLC kifejlesztés, 3-lineáris OPLC kifejlesztés gyors szakasz beiktatásával, 4-a mintafelvitel javasolt helye

A 4. ábra szemlélteti a hagyományos vékonyrétegkromatográfia eluensfrontjának vándorlási sebességére jellemző négyzetes, valamint a lineáris kifejlesztésű OPLC esetében a lineáris összefüggést [28]. OPLC esetében – hasonlóan a HPLC-hez – az eluens optimált, állandó áramlási sebessége miatt a foltok terülése jóval kisebb, mint a normálkamrában, így a HPLC-hez hasonló hatékonyságú elválasztást érhetünk el. Az OPLC technika előnyei közé tartozik, hogy a gőztér kizárásával a környezeti tényezők jóval kevésbé befolyásolják a kromatográfiás kifejlesztést, mint a hagyományos VRK esetében. Az eluensfront állandó sebességének biztosítása szintén az eredmények jobb reprodukálhatóságának kedvez. A szorbensre felvitt mintából kedvező esetben gyors előfuttatással eliminálni lehet a futtatást zavaró komponenseket, ezzel kiváltva az időigényes mintatisztítási lépéseket. A finomszemcsés réteglapokon a kényszeráramlásos technikával biztosított állandó áramlási sebesség lehetővé teszi a hosszabb kifejlesztési távolságot. Hagyományos kamrás kifejlesztés esetében legfeljebb 7 cm a futási távolság finomszemcsés szorbensen. OPLCvel a réteglap teljes hossza (20 cm) kihasználható, túlfuttatásra is van lehetőség. Ugyanakkor a foltkiszélesedés jóval kisebb mértékű, ezáltal hatékonyabb elválasztásra van lehetőség.

14

A Richter Gedeon Nyrt.-ben az OPLC-módszereknek komoly hagyományuk van. Az első kísérleti körkörös készüléket itt használták először digitálisz-glikozidok vizsgálatára az 1980-as években [29]. Több hatóanyag, valamint készítmény esetében validált OPLC-módszerekkel végzik a rutinanalitikai munkában a minősítéshez szükséges tisztaságvizsgálatot [30-35], ezen kívül a tisztításvalidálásban is alkalmazzák [36]. 2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások A szennyezéseket különféleképpen csoportosíthatjuk. Vannak szerves, és szervetlen szennyezések, valamint oldószermaradékok. Ezek meghatározására különféle vizsgálati technikák és módszerek léteznek. Munkám során a szerves szennyezések, ezen belül rokonvegyületek

elválasztásával

foglalkoztam.

A

hatóanyagra

jellemző

szerves

szennyezések között beszélhetünk a gyártás kiindulási anyagáról, a gyártásból eredő melléktermékekről, intermedierekről, bomlástermékekről, különféle reagensekről, vagy katalizátorokról [37]. A gyártónak a törzskönyvi beadványában fel kell sorolnia a hatóanyagában ténylegesen meglévő és elméletileg lehetséges szennyezéseket. Ez utóbbiak azok, amelyek a gyártás, tisztítás, vagy tárolás során keletkezhetnek [38-39]. Ezek vizsgálatára szigorú szabályozás van érvényben a gyógyszeriparban. Általában különféle kromatográfiás technikákat ajánlanak az egyes szennyezések és a főkomponens egymástól való elválasztására. Egy hatóanyagban megengedhető maximális szennyezettség a nemzetközi harmonizációs irányelvek alapján a hatóanyag napi dózisától függ. Amennyiben a napi dózis 2 g-nál nem nagyobb, akkor a legújabb ajánlások szerint az ismeretlen szennyezések a hatóanyag-végtermékben nem haladhatják meg a 0,10%-ot. Minden szennyezést, ami meghaladja ezt a mennyiséget, azonosítani kell. Ezt a pontosságot biztosítani képes technikák szükségesek a rutinanalitikai vizsgálatokhoz. A gyártásközi ellenőrzések során viszont ilyen pontosságot még nem várnak el. Ott az analitikai munkák során a gyorsaság az egyik legfontosabb szempont, valamint természetesen az, hogy a kérdéses komponensek elválasztása megfelelő legyen [40]. Az Amerikai és Európai Gyógyszerkönyv egyaránt általános fejezeteiben tárgyalja a

szokásos

szennyezésekre

vonatkozó

információkat

[41-42].

Az

Amerikai

Gyógyszerkönyv VRK vizsgálatot javasol, ha az egyedi cikkely nem ír elő másik tisztaságvizsgálati módszert, ilyenkor az általános fejezetben megadott maximum 2,0% összes, és maximum 0,1% ismeretlen szennyezés jelenléte van megengedve a hatóanyagban.

15

Az Európai Gyógyszerkönyv ezzel szemben a megnevezett analitikai módszerrel detektálható szennyezésekre vonatkozóan adja meg a követelményeket. Több cikkelyben fel is sorolják a lehetséges szennyezéseket. Egyes gyártók anyagában olyan – egyébként ismert – szennyezés is keletkezik, amely nem szerepel a cikkelyben és így maximum 0,10% a rá vonatkozó követelmény. A végtermékek minőségét befolyásolja az intermedierek minősége, a reakció lejátszódásának mértéke. Ezeket a gyártásközi ellenőrző laboratóriumokban ellenőrzik, ahol a gyors és megbízható módszerek alkalmazása elengedhetetlen.

16

3. KÍSÉRLETI RÉSZ 3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek A méréseim során használt vegyszerek analitikai tisztaságúak (p.a.) voltak, melyeket a Merck Kft.-től szereztünk be (E. Merck, Darmstadt, Germany). A normál kamrás és az OPLC futtatásokhoz alufólia hordozóra felvitt normálszemcsés (Merck 5554) és finomszemcsés (Merck 5548) szilikagél szorbenst (20x20 cm Kieselgel 60 F254) használtam. Az OPLC futtatásokat P-OPLC BS 50 rétegkromatográffal végeztem (OPLC-NIT Ltd., Budapest, Hungary). Az OPLC futtatáshoz szükséges rétegszélezést az OPLC-NIT Ltd. végezte. Minden esetben 300 μl kiindulási gyors eluenstérfogatot és 50 bar külső nyomást alkalmaztam. Az OPLC-futtatások esetében használt kloroformot – mind eluensként, mind mintaoldószerként használva – a következő eljárással mentesítettem az etanoltól: 100 ml kloroformot 3 x 20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal rázótölcsérben kiráztam, majd a kloroformos fázist nátrium-szulfáton szárítottam. A szorbensek előhívó reagenssel való bepermetezésére motoros, Merck gyártmányú permetezőt használtam (Merck Art.No. 1.08540). A hevítésüket pedig Camag sütőlapon (TLC Plate Heater III) (Camag, Muttenz, Switzerland) végeztem. A kromatogramok dokumentálására Camag VideoStore 2 készüléket használtam, a videodenzitometriás értékelésre pedig a Camag VideoScan szoftvert. 3.2. Módszerleírások 3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek A szteroid-eleggyel végzett előhívási kísérletekhez a vizsgált szteroidok 0,02%-os koncentrációjú kloroformos oldatát használtam modellelegyként, amelyből 5–5 μl-t vittem fel finomszemcsés szilikagél szorbensre (Merck 5548) 5 mm-es sávokban. P-OPLC BS 50 típusú túlnyomásos rétegkromatográffal végeztem a kromatográfiás kifejlesztéseket. Eluensként ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) arányú elegyét használtam, amely a modellelegy valamennyi komponensére megfelelő elválást adott. A külső ún. párnanyomás 50 bar volt, 400 μl/min eluensáramlási sebességgel, 300 μl gyors kiindulási és 4200 μl kifejlesztési eluenstérfogattal dolgoztam. Videodokumentációs rendszerként a Camag VideoStore 2 berendezését használtam. A 366 nm-es fényben rögzített képek esetében UV-2A, valamint CC-30Y jelzésű színszűrőt

17

használtam. A videodenzitometriás értékeléshez a VideoScan szoftver nyújtott segítséget, amelynek beépített szűrői közül a zöldet használtam. A különböző előhívó reagensekkel végzett kimutatási határ vizsgálatokhoz különböző koncentrációjú oldatokból 2-5 μl térfogatból vittem fel a szorbensre 0,1 μg és 0,0075 μg tartományban különböző mennyiségű anyagot. 3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek Dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién) VRK Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554) Futtató: ciklohexán – aceton 7+3 (V/V) Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm (Desaga GmbH., Heidelberg, Germany) Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland Futási távolság: 14 cm Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2 percig (Camag TLC Plate Heater III), 366 nm-es ultraibolya fényben értékelve. OPLC Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Futtató: ciklohexán – butil-acetát – etil-acetát 8+1+1 (V/V) Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2 percig, 366 nm-es UV-fényben értékelve Ösztradiol-metiléter-acetát (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát) OPLC Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Futtató: toluol – kloroform – ciklohexán – butil-acetát 55+3+40+2 (V/V) Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: 4000 – 8000 μl Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel

18

Előhívás, értékelés: 254 nm-en, majd 10%-os kénsavas etanolos bepermetezést és 120°C-on 2 percig történő hevítést követően 366 nm-es UV- és látható fehér fényben értékelve GC Készülék: Focus gázkromatográf (Thermo Separation Products, San Jose, CA, USA) Oszlop: Restek Rtx-5 30 m x 0,25 mm x 0,5 μm fused silica (Restek Corporation, Bellefonte, PA, USA), 240°C Injektor és detektor hőmérséklet: 280°C Detektor: lángionizációs (FID) Vivőgáz: hélium Áramlási sebesség: 20 cm/sec Split-arány: 1:50 Oldószer: diklórmetán – metanol 1+1 (V/V) Injektált térfogat: 1 μl Molon (metil-szeko-olon) OPLC Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Futtató: toluol – etil-acetát – butil-acetát 8+1+1 (V/V) Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Előhívás, értékelés: 366 nm-es ultraibolya fényben az anyag saját fluoreszcenciáját vizsgálva, majd 10% kénsavas etanollal való bepermetezést és 120°C-on 2 percig való hevítést követően, 366 nm-es fényben HPLC 1. Shimadzu LC-2010A típusú folyadékkromatográfon (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan) Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm (SGE Analytical Science, Melbourne, Australia) Eluens: metanol – víz – ecetsav 70+30+0,3 (V/V) Áramlási sebesség: 1 ml/min Injektálási térfogat: 10 μl

19

Detektálás: λ=265 nm HPLC 2. Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm Eluens: metanol – víz – ecetsav 40+60+0,3 (V/V) Áramlási sebesség: 1 ml/min Hőmérséklet: 35°C Injektálási térfogat: 10 μl Detektálás: λ=265 nm 3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek Etinil-ösztradiol (19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trién-20-in-3,17-diol) VRK Mintaoldószer: kloroform – metanol 9+1 (V/V) Felvitt oldattérfogat: 1-5 μl Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554) Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Futtató: toluol – etanol 9+1 (V/V) Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm Futási távolság: 15 cm Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan OPLC Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 1-5 μl Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) Eluens áramlási sebesség: 300 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: 7000 μl Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan HPLC

20

Hewlett Packard 1100 típusú készüléken (Hewlett Packard Gmbh. Waldbronn, Germany) Oszlop: Symmetry C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 25 °C-ra termosztálva (Waters Corporation, Milford, MA, USA) Eluens: víz – acetonitril – metanol 50+30+20 (V/V) Mintaoldószer: az eluens, koncentráció: 3 mg/ml Áramlási sebesség: 1 ml/min Injektálási térfogat: 30 μl Analízisidő: 40 min Detektálás: λ=280 nm Noretiszteron (17β-hidroxi-19-nor-17α-pregn-4-én-20-in-3-on) VRK Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554) Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel Futtató: kloroform – aceton 9+1 (V/V) Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm Futási távolság: 15 cm Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan OPLC Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Futtató:

1. n-hexán 2. butil-acetát – kloroform 85+15 (V/V)

Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat:

1. 4000 μl és megállás nélkül: 2. 4000 μl

21

Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan HPLC Spectra Focus típusú folyadékkromatográfon (Thermo Separation Products, San Jose, CA, USA) Oszlop: Hypersil 120 ODS 3 μm, 125 x 4 mm (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) Eluens:

A, acetonitril – víz 5+95 (V/V) B, acetonitril – víz 95+5 (V/V) hatlépcsős gradiens program

Mintaoldószer: acetonitril – víz 4+6 (V/V) Áramlási sebesség: 1,0 ml/min Injektálási térfogat: 25 μl Analízisidő: 60 + 10 min Detektálás: λ=242 nm Nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on) VRK Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554) Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel Futtató: n-hexán – etil-acetát 1+2 (V/V) Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm Futási távolság: 15 cm Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan OPLC Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 1 – 2,5 μl Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel

22

Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 50+25+25 (V/V) Eluens áramlási sebessége: 300 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: többszörös kifejlesztés, közben 5 – 5 perc szárítás szobahőmérsékletű levegőárammal 1. 2000 μl 2. 3000 μl 3. 4000 μl Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan HPLC Hewlett Packard 1100 típusú folyadékkromatográf (Hewlett Packard Gmbh. Waldbronn, Germany) Oszlop: Eclipse XDB C18 150 x 3.0 mm, 3.5 μm (Agilent Tecnologies, Waldbronn, Germany) Eluens:

gradiens program idő (min)

víz (%)

acetonitril (%)

metanol (%)

0

75

10

15

40

59

26

15

80

4

56

40

81

75

10

15

90

75

10

15

Mintaoldószer: acetonitril – víz 1+8 (V/V) Áramlási sebesség: 0,5 ml/min Injektálási térfogat: 15 μl Analízisidő: 90 min Detektálás: λ1=210 és λ2=225 nm GC Carlo Erba Mega II. készüléken (Carlo Erba, Milan, Italy) Oszlop: Supelco 30 m x 0,25 mm x 1,0 μm film MDN-5S (Supelco, Bellefonte, PA, USA), 270°C Injektor és detektor hőmérséklet: 300°C Detektor: lángionizációs (FID) Vivőgáz: hélium

23

Áramlási sebesség: 20 cm/sec Split-arány: 1:50 Oldószer: kloroform – metanol 1+1 (V/V) Injektált térfogat: 1 μl Gesztodén (13-etil-17-hidroxi-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dién-20-in-3-on) OPLC Mintaoldószer: kloroform Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548) Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min Kifejlesztési eluenstérfogat: 6500 μl Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan HPLC Shimadzu LC20A típusú folyadékkromatográf (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan) Oszlop: YMC-ODS-AQ C18 250x4.6 mm, 5μm (YMC Co., Kyoto, Japan) Oszloptermosztálás: 30°C Eluens: gradiens program A-komponens: acetonitril – víz 30+70 (V/V) B-komponens: acetonitril – víz 95+5 (V/V) A-komponens

B-komponens

(%)

(%)

0

85

15

60

45

55

61

85

15

68

85

15

Idő (min)

Áramlási sebesség: 1,0 ml/min Injektálási térfogat: 20 μl Analízisidő: 68 min Detektálás: λ=210 nm

24

4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS 4.1. Vizsgált szteroidok A szteroidváz sajátos szerkezetéből adódóan a különböző intermediereknél és végtermékeknél találkozhatunk tipikus szennyezésekkel (5. ábra). A 3-keto-Δ4 szerkezetű szteroidok esetében (R1: =O) általánosan jellemző az izoméria miatt melléktermékként kialakuló Δ5(10)-származék, amelyben a 4-5 helyzetű szénatomok közötti kettős kötés az 510 pozícióba kerül. Ez a szennyezés a főkomponensnél általában kevésbé poláris tulajdonságú, ezért szilikagél szorbensen végezve az elválasztást 1,0-nál nagyobb relatív RF-értéken helyezkedik el a főkomponenshez viszonyítva. Szintén gyakori a telített Agyűrűvel rendelkező komponens, az 5α-4,5-dihidro-származék, amelynek igen csekély az UV-elnyelése, ezért a gyógyszeriparban jellemzően használt UV-detektorral ellátott HPLC-készülékekkel nem vagy csak igen alacsony érzékenységgel detektálható. Gyakori még a 8-as és 14-es szénatomok között kialakuló kettős kötésű származék (Δ8(14)), amelynek UV-elnyelése a több kettős kötés miatt jelentős. Ezen lehetséges szennyezések szerkezete egymástól és a főkomponenstől csak kis mértékben különbözik. Elválasztásuk kritikus lehet. Bomlástermékként leggyakrabban 6-os α- és β-helyzetű hidroxi-származék (R2: -OH), ill. 6-keto-származék (R2: =O) keletkezhet. Ezek a főkomponensnél polárisabb szennyezésekként általában erősebben kötődnek az állófázishoz, a főkomponensnél alacsonyabb RF-értékük van. 12 11 1 2 3

R1

C 10

A 4

9

B 5

6

8

R3

CH3 13 14

R4

17

D

16

15

7

R2

5. ábra. A szteroidváz Az eddigiekben említetteken kívül természetesen az egyes anyagokra jellemző egyedi szennyezésekkel is találkozhatunk. Az allilösztrenol nem a 3-keto szerkezetű szteroidok közé tartozik (R1: -H), ezért a jellemző bomlástermékei nem a 6-os-, hanem a 3-as helyzetben szubsztituált származékok (R1: -OH vagy =O, R2: -H).

25

Az 1. táblázat ismert szennyezésprofillal rendelkező szteroid hatóanyagok néhány jellegzetes szennyezését foglalja össze. 1. táblázat. Szteroid hatóanyagok jellegzetes szennyezései 6-OH

6-keto

tájékoztató relatív RF0,0 – 0,3 0,4 – 0,8 értékek * Etinil-ösztradiol + + Noretiszteron + + Allilösztrenol 3-OH 3-keto * az adott főkomponensre vonatkoztatva

Δ8(14)

Δ5(10)

4,5-dihidro

0,9 – 1,2

1,3 – 1,5

1,0 – 1,6

Δ9(11) +

-

+

A szteroidok szintézisében igyekeztem megtalálni azokat a reakciókat, amelyek során a jellemző analóg szennyezések keletkeznek. A szintézisút elágazásainál találhatunk ún. kulcsintermediereket, amelyek több végtermék előállításának is intermedierjei. Az egyik ilyen anyag a nandrolon, belőle állítják elő a nandrolon-dekanoátot, az allilösztrenolt, a noretiszteront és ennek származékait. 4.1.1. Nandrolon A nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on) tipikus szennyezéseiről Görög és munkatársai számoltak be [43-44]. Vizsgálatára többféle kromatográfiás módszert használtunk. Ezekről a módszerekről a teljesítményjellemzők összehasonlításával foglalkozó fejezetben számolok be részletesen. A fent felsoroltakon kívül jellemző szennyezése az ösztradiol-metiléter, amelynek A-gyűrűje az ösztradiolhoz hasonlóan aromás szerkezetű. Lehetséges szennyezése még a dienoléter, amely a nandrolon szintézisének utolsó intermedierje, önmagában is egy kulcsintermedier. A dienoléter szintézisekor keletkező, vagy már meglévő enoléter típusú szennyezések a dienoléterrel együtt a savas hidrolízis hatására átalakulnak 3-keto szerkezetű vegyületté. Vagyis a nandrolon szennyezéseinek prekurzorait megtaláljuk a dienoléter szennyezései között (ld. 6. ábra).

26

CH3 OH

CH3 OH H

H3C

H

H+

H

H

H

H H

O

O

dienoléter 3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién

nandrolon 17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on CH3 OH

CH3 OH H

H3C

H H

O

H

H

H+

H

H O

H

telített dienoléter 3-metoxi-17β-hidroxi-ösztr-2-én

H

H

telített nandrolon 17β-hidroxi-ösztrán-3-on CH3 OH

CH3 OH H

H+ H3C

H

H O

O

Δ8(14)-nandrolon Δ8(14)-dienoléter 3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5,8(14)-trién 17β-hidroxi-ösztra-4,8(14)-dién 6. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei 4.1.2. Dienoléter A dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién) vizsgálatára szintén több kromatográfiás módszert használtunk [45]. A VRK módszerrel csak az utolsó intermedier mennyiségét lehet ellenőrizni (7. ábra). GC-vel az enoléter-szerkezetű komponensek csak savas hidrolízist követően, 3-keto-formában mérhetőek. A technikára jellemző magas hőmérsékletű mérési körülmények között a nandrolon kismértékű bomlása következik be (8. ábra) [44]. Az általam kidolgozott OPLC-eljárással viszont a dienoléter minden ismert szennyezése szelektíven értékelhető (7. ábra).

27

VRK

12 1

OPLC

2 3

4 5 6

7

8 9 10 13

1

2 3

4

5 6 7 8

9 10 11 12

Felvitel: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0,2 μg ösztradiol-metiléter 0,2 μg telített dienoléter 0,2 μg Δ8(14)-dienoléter 0,2 μg telített dimetilketál 0,2 μg dienoléter 0,2 μg összes szennyezés 25 μg krist. dienoléter és 0,1 μg összes szennyezés 25 μg krist. dienoléter 50 μg krist. dienoléter 25 μg nyers dienoléter 50 μg nyers dienoléter oldószer

7. ábra. A dienoléter VRK- és OPLC-módszerrel a specifikusság ellenőrzésére készített kromatogramja

28

mVolt

1 2 3 4 5 6 7

7

13

4

bomlástermékek

12 11

3-dezoxo-nandrolon 5α-4,5-dihidro-nandrolon nandrolon Δ5-izomer nandrolon Δ5(10)-izomer Δ8(14)-nandrolon ösztradiol-metiléter nandrolon

3

10 9 8

6

2

1

5

7 6 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

min

8. ábra. A dienoléter nandrolonná történt átalakítás után készített GC kromatogramja A dienoléter savas hidrolízisekor az ösztradiol-metiléter nem alakul át, változatlan formában és mennyiségben találjuk meg a nandrolonban. Ez a vegyület a szintézis előző lépéséből ered az ösztradiol-metiléter-acetáton végrehajtott Birch-redukcióból. Ekkor cseppfolyós ammóniás közegben fém nátriummal végzik a redukálást, közben az aromás A-gyűrű

változatlan

formában

marad

és

különböző

mértékben

redukálódott

melléktermékek keletkeznek [43]. 4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát Az ösztradiol-metiléter-acetátot (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát, ÖDME-acetát) egy olyan 4-lépéses szintézissel állítják elő molonból (metil-szeko-olonból), amelyben a köztes intermediereket nem izolálják. A szintézis lépései: acilezés, gyűrűzárás, katalitikus, valamint ionos redukció (9. ábra).

29

O

HO

O

CH3

H3 C

CH3

O

O CH3

H3C O H3C

→

acilezés O

→

gyűrűzárás

O H3C

H3C

O

O

molon metil-szeko-olon

1

2

O

O

CH3

CH3

O CH3

redukció

O CH3

redukció

→

→

H H3C

O

3

H H H3C

H

O

ÖDME-acetát

9. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát előállításának lépései A reakció lépéseit GC-vel és OPLC-vel követtük nyomon. A 9. ábrán 2-vel és 3mal jelölt intermedierek, valamint az ÖDME-acetát csak egy-egy kettős kötés meglétében különböznek egymástól. GC-vel a 2-es és 3-as intermedierek nem váltak el egymástól (10. ábra). OPLC-vel viszont legnehezebbnek az ÖDME-acetát és a 3-as intermedier elválasztása bizonyult. Ezt finomszemcsés (HPTLC) szilikagél szorbensen, jelentős túlfuttatás segítségével sikerült megoldani. Az RF-értékük azonban még így is meglehetősen közelinek bizonyult, eltérő UV-elnyelésük miatt 254 nm-en és kénsavas előhívást követően látható fényben különböző színük miatt mégis jól elkülöníthetők és értékelhetők (11. és 13. ábra). A 2-es és 3-as intermedierek eltérő hullámhosszon mutatott maximális UV-elnyelése miatt lehetőség van a 3-as intermedier spektrofotometriás értékelésére is pl. 325 nm-en, ahol a 2-es intermediernek már nincs UV-elnyelése (12. ábra). A reakció során melléktermékként Δ8(14)-ÖDME-acetát keletkezik, amely GC-vel jól értékelhető. OPLC-vel az elválása a 3-as intermediertől nem tökéletes, de mennyisége vizuálisan becsülhető az eltérő mértékű UV-elnyelés miatt (13. ábra). A 3-as intermedier főbb szennyezéseit különböző módszerekkel mérve és értékelve a 2. táblázatban tüntettem fel az eredményeket.

30

2-es, 3-as intermedier

Δ8(14)-ÖDMEacetát

10. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát GC kromatogramja

UV366

UV366, kénsavas előhívás után

2. intermedier

Δ8(14)-származék

3. intermedier

2. intermedier 3. intermedier

a

b c

d

e

f

g

h

i

j

a

b c

d

e

f

g h

i

j

Felvitel: a-d e-f g-j

1,0 – 0,1 μg 2. intermedier 10 és 5 μg 3. intermedier 0,1 – 1,0 μg Δ8(14)-származék

11. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek

31

12. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjeinek UV-spektruma 2. táblázat. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjének és Δ8(14)-származékának különböző technikákkal mért mennyisége OPLC

GC

2. intermedier

5,5%

nem válik el

Δ8(14)-származék

4,0%

4,5%

UVspektrofotometria λ=325 nm 4,2% szelektíven nem mérhető

4.1.4. Molon

A molon (metil-szeko-olon) → ÖDME-acetát átalakítások redukciós lépésénél a reakció előrehaladását követtük GC-vel és OPLC-vel [46]. Az előhívást követő 366 nm-es értékeléssel az ÖDME-acetát szennyezés foltjai értékelhetők. A reakció időbeli követésekor összevetettük a kétféle kromatogramon a növekvő, ill. csökkenő csúcsokat / foltokat (13. ábra). A szorbensen levő anyag egyes foltjairól reflexiós UV-spektrumot vettünk fel. Az OPLC kromatogramokon látható X-jelű szennyezést a GC-vel kapott csúcsok között is megtaláltuk (14. ábra) [46]. A tömegspektrometriás azonosítás szerint az ÖDMEacetáthoz hasonlóan 328-as molekulatömegű anyagról van szó [47]. Végül mágneses

32

magrezonancia spektroszkópiával (NMR) sikerült ténylegesen azonosítani, eszerint ez a szennyezés a 8β,9α térszerkezetű ÖDME-acetát 8β,9β-izomerje [48]. UV254

előhívás után UV366

ÖDMEacetát

ÖDME-acetát

3. intermedier

1 2

3 4

1

2

3 4

látható fényben

Δ8(14)-ÖDMEacetát

3. intermedier

5 6 7

és

3. intermedier

X

5

6

ÖDMEacetát

Δ8(14)ÖDME-

7

1

2

3 4

X

5

6

7

Felvitel: 1 2 3 4 5 6 7

25 μg 3. intermedier reakcióelegy 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 0 min. 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 10 min. 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 20 min. 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 30 min. 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 70 min. 25 μg ÖDME-acetát

13. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek

33

0 min 94.95

3. intermedier

123.8

ÖDME-acetát

75.98

98.8

57.0

73.8

mVolt

ÖDME-acetát

mVolt

Δ8(14)-ÖDMEacetát

48.8

8(14)

Δ -ÖDMEacetát

38.02

10 min

3. intermedier

X X

19.05

0.07 0.0

23.7

-1.3 3.0

6.0 min

9.0

12.0

15.0

0.0

3.0

6.0

min 9.0

12.0

15.0

14. ábra. A molon → ÖDME-acetát átalakítás gázkromatogramjai A többlépcsős szintézis kiindulási anyaga a molon, amit fermentációs úton állítanak elő metil-szekodionból. A molont HPLC-vel és OPLC-vel vizsgáltuk. A gázkromatográfia során hő hatására bomlás történik, ezért ezzel a módszerrel nem mérhető (15. ábra) [44].

molon

hőbomlás terméke

15. ábra. A molon gázkromatogramja

34

OPLC-vel különböző minőségű molon tételeket vizsgáltam (16. ábra). A tételek HPLC-vel történő vizsgálatakor az OPLC kromatogramokon látható egyik jelentős szennyezést (X-szennyezést) nem tudtuk detektálni. A HPLC-módszer kismértékű módosításával a szennyezés elválasztása sikerült. A 16. ábrán szereplő „b”-jelű minta régi és új HPLC-módszerrel készített kromatogramja látható a 17. ábrán. kénsavas előhívás után 366 nm

X a

b c

d e

f

g

h

i

16. ábra. Különböző minőségű molon tételek OPLC kromatogramja

1. „régi” módszer

35

2. „új” módszer X-szennyezés

17. ábra. A „b”-jelű molon minta régi és új HPLC kromatogramja A molon rendkívül érzékenynek bizonyult a savnyomokra, azonnali bomlása követezik be sav hatására. Ilyenkor közvetlenül a főfolt alatti, a molonra egyébként is jellemző szennyezés keletkezik (X), amelyet NMR-rel azonosítottak. A molonban 9-11 helyzetű kettős kötés a bomlástermékben 8-9 helyzetbe került [48]. Az OPLC és HPLC-módszerek együttes alkalmazása lehetővé tette egy addig ismeretlen szennyezés azonosítását, valamint keletkezési körülményeinek felderítését. 4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények

A végtermékekben is megtalálható szennyezések nagy része a Birch-redukcióból és az azt követő savas hidrolízisből származik. Ekkor keletkeznek a különböző mértékben redukált származékok és melléktermékek. Az 1. táblázatot kiegészítve az intermedierekben is megtalálható tipikus szennyezésekkel, a következő eredményre jutottam:

36

3. táblázat. Szteroid hatóanyagok és intermedierek jellegzetes szennyezései tájékoztató relatív RFértékek* Etinil-ösztradiol Noretiszteron Allilösztrenol

6-OH

6-keto

Δ8(14)

Δ5(10)

4,5-dihidro

0,0 – 0,3

0,4 – 0,8

0,9 – 1,2

1,3 – 1,5

1,0 – 1,6

+ + Δ9(11) + + + 3-OH 3-keto + általam kimutatott komponensek ÖDME-acetát + Dienoléter ** ** + Nandrolon + ** + + Nandrolon-dekanoát + + + + * az adott főkomponensre vonatkoztatva ** standard anyag nem állt rendelkezésre az azonosításhoz, RRF alapján azonosítva

+ + + + +

37

4.2. Előhívások A vékonyrétegkromatogramok értékelésére számos lehetőség van. Amennyiben színtelen anyagokat vizsgálunk, UV-fényben vizuálisan ellenőrizhetjük a mérendő anyag UV-elnyelését, ill. saját fluoreszcenciáját 254, ill. 366 nm-en. A legelterjedtebben használt szilikagél szorbensek fluoreszcens adalékot tartalmaznak, így a rövid hullámhosszú, nagy energiájú ultraibolya fény (254 nm) hatására zöldes színnel fluoreszkáló háttéren az UVelnyelést mutató vizsgálandó anyag gyengíti a fluoreszcenciát és sötét foltként jelentkezik. Amennyiben a mérendő minta nem mutat UV-elnyelést, kémiai reakciókkal segítik elő a foltok megjelenését. Szteroidok esetében leggyakrabban savas előhívó reagenseket használnak, amelyeket bepermetezéssel vagy bemerítéssel juttatnak a réteglapra. A reakció lejátszódásának meggyorsításához szükséges lehet a réteglap bizonyos ideig történő melegítése. A használt reagenstől függően látható fényben vagy hosszú hullámhosszú (366 nm) UV-fényben értékeljük a kromatogramot. Gyakori savas előhívó reagens a kénsavas etanol, amelynek segítségével 366 nm-en különböző színnel fluoreszkáló foltokat kapunk. Az egyes komponensekre vagy tipikus szerkezetekre utaló színek a minőségi meghatározásban, azonosításban jelentenek segítséget. Bepermetezéses előhívó technika esetén a vékonyrétegkromatográfiás foltok egyenletes megjelenítéséhez a reagensoldatot apró cseppekben, aeroszol formában juttatjuk a réteglapra speciális geometria szerint (Waldi-elrendezés) [49]. A reagens homogén eloszlása következtében kisebb a zaj, ezáltal jobb kimutatási határ válik lehetővé. A bepermetezést, bemerítést követő melegítési időt nem mindig definiálják pontosan, gyakran „amíg a foltok megjelennek” utasítás szerepel a módszerleírásokban. Szteroidok tisztaságvizsgálatára a gyógyszerkönyvek általában 10-20%-os kénsavas etanolos oldatot javasolnak [50-51], amennyiben nem tartalmaz ettől eltérő utasítást az adott anyagra vonatkozó cikkely. Azonossági vizsgálathoz 2-20%-os kénsavas etanollal történő bepermetezés az előírás. A bepermetezést követő melegítési hőmérsékletet és időt is definiálják, ez általában 100-120°C-on 5-15 perc melegítést jelent. Az Európai Gyógyszerkönyv a noretiszteron VRK tisztaságvizsgálatához 20%-os kénsavas etanolt ír elő majd 100-105°C-on 5 perces melegítést [52]. Az Amerikai Gyógyszerkönyv pedig 30%-os kénsavas metanolt, valamint 100°C-on 5 percig való melegítést ír elő [53].

38

Ugyanakkor gyártásközi ellenőrzésnél vagy intermedier-vizsgálatnál a Richter Gedeon Nyrt. üzemi laboratóriumaiban gyakran alkalmaznak 50%-os kénsavas etanolos reagenst is előhívószerként. Ez kevésbé egyenletes reagenseloszlást eredményez, kedvezőtlenül hat az egyes foltok kimutathatóságára. Zarzycki és munkatársai koleszterinre és rokonvegyületeire a gyógyszerkönyvi foszformolibdénsavas előhívást optimalizálták. Kísérleteik alapján szilikagél szorbensen 50-60°C-on 20 percig történő melegítés adott maximális intenzitást [54]. Kísérleteim során néhány szteroid alapanyag modellelegye esetében vizsgáltam meg az optimális előhívási körülményeket. Különböző előhívó reagenseket használtam, különböző ideig és különböző hőmérsékleteken végeztem a bepermetezést követő melegítést. A modellelegy valamennyi szteroidja az ún. metilsor anyagai közül került ki. Kiválasztásuknál figyelembe vettem, hogy legyen eltérő a mozgékonyságuk az elválasztás és

a

jobb

összehasonlíthatóság

érdekében,

valamint

legyenek

közös

oldatból

kromatografálhatók. Vannak közöttük azonos váz mellett a C17-es oldalláncban eltérő szerkezetűek, vagy az A-gyűrűben és a C3-as szubsztituensében eltérő szerkezetűek. A következő hét szteroid alapanyagot tanulmányoztam: nandrolon, noretiszteron, etinilösztradiol, noretiszteron-acetát, dienoléter, noretiszteron-önantát és nandrolon-dekanoát. A szerkezeti képleteik a 19. ábrán láthatók.

39

H3C

H3C

OH C

OH

CH

H3C

O

HO

Dienoléter

Etinil-ösztradiol O

O

C H3C

OH C

O

CH3

H3C O

CH

C

O

Noretiszteron

C H3C O

CH

C

(CH2)5

CH3

CH

O

Noretiszteron-acetát

Noretiszteron-önantát O

H3C

O

OH

H3C

O

C (CH2)8

CH3

O

Nandrolon-dekanoát

Nandrolon

19. ábra. Az előhívási modellelegyben levő szteroidok szerkezeti képletei 4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok

Három

különböző

minőségű

előhívó

reagenst

használtam:

kénsavas,

foszformolibdénsavas és foszforsavas etanolos oldatokat. Összehasonlítottam a különböző reagensek azonos – 10%-os – koncentrációjú oldatával kapott eredményeket, valamint a legelterjedtebben használt kénsavas reagens különböző koncentrációjú – 10%, 30% és 50%-os – oldatával kapott eredményeket. A bepermetezést követő melegítést szabályozható hőmérsékletű kalibrált kerámialapon végeztem a 10%-os kénsavas reagens esetében 60, 80, 100, 120 és 140 °C-on, 2, 5, 10, 20 valamint 30 percen át. A foszforsavas, a foszformolibdénsavas, a 30% és az 50%-os kénsavas reagens esetében 80, 100, 120 és 140°C-on 2, 5, 10 és 20 percig végeztem a hevítést. Az így előhívott kromatogramok képét videodokumentációs rendszer segítségével rögzítettem, majd a VideoScan szoftver segítségével videodenzitogramokat készítettem. A kapott csúcsterületeket szintvonalas grafikonokon ábrázoltam a hőmérséklet és az idő függvényében.

40

A

20-24.

ábrákon

bemutatásra

kerülő,

különböző

reagenssel

előhívott

kromatogramok videofelvételei a jobb összehasonlíthatóság kedvéért valamennyi esetben 120 °C-on 2 percen át történő melegítés után készültek. Mellettük ugyanezen kromatogramok videodenzitogramjai következnek.

1

5

7

7 6

3

2

4 6

5 4 3 2 1

RF

20.

ábra.

10%

kénsavas

etanollal

előhívott

kromatogram

videofelvétele

és

videodenzitogramja

3

7

5

6 5

2

4

3 2

1

4

6 7

1

RF

21. ábra. 10% foszforsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és videodenzitogramja

41

1

2

3

4

5 6

7 6 5

7

4 3 2 1

RF

22. ábra. 10% foszformolibdénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és videodenzitogramja

3

5

1

7 6 5

7

4

4 6

2

3 2 1

RF

23.

ábra.

30%

kénsavas

etanollal

előhívott

kromatogram

videofelvétele

és

videodenzitogramja

42

3 7 6

5

1

5 4

7 3

4

2

2

6

1

RF

24.

ábra.

50%

kénsavas

etanollal

előhívott

kromatogram

videofelvétele

és

videodenzitogramja 4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek

A 4-8. táblázatokban szerepelnek az egyes szteroidokhoz tartozó csúcsterületek értékei.

43

4. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől 10% kénsavas etanollal való előhívás után

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc

60°C 0 0 640 1030 15300

80°C 1370 9630 14000 19800 10700

100°C 19100 20600 12100 10900 7950

120°C 34200 24800 4760 0 0

140°C 6800 5920 2280 -* -*

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc

570 4420 6740 7860 6930

6040 8360 8750 8220 2720

9480 7420 2140 1200 0

14600 6750 0 0 0

0 0 0 -* -*

16900 6880 0 0 0

1390 1260 0 -* -*

24100 7820 0 0 0

0 0 0 -* -*

48900 26800 9760 5420 1800

14700 14100 5550 -* -*

21000 4440 0 0 0

0 0 0 -* -*

60800 33800 5760 3880 1120

9552 11100 1090 -* -*

Nandrolon

Noretiszteron

Etinil-ösztradiol

2 perc 2280 36900 37200 5 perc 14900 34300 29100 10 perc 21900 29400 10800 20 perc 19000 29000 10900 30 perc 17200 13500 2710 Noretiszteron-acetát 2 perc 3280 8940 18400 5 perc 8200 12700 17100 10 perc 9440 15400 1910 20 perc 9220 17800 3790 30 perc 8900 6600 0 Dienoléter 2 perc 2170 11400 30000 5 perc 3200 16600 29200 10 perc 6480 20400 12800 20 perc 6360 26100 16400 30 perc 7550 18100 12200 Noretiszteron-önantát 2 perc 620 8500 18300 5 perc 4580 11600 14000 10 perc 8180 15400 1930 20 perc 7380 17500 3570 30 perc 7510 6640 0 Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 680 7920 5 perc 0 1500 18800 10 perc 0 4330 17600 20 perc 0 9320 21100 30 perc 0 11600 12600 * értékelhetetlen eredmények a magas hevítési hőmérséklet miatt

44

5. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől 10% foszforsavas etanollal való előhívás után

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

80°C 0 0 0 0

100°C 0 0 940 2070

120°C 800 1600 2110 2990

140°C 1690 4330 4710 5810

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

2620 13400 15100 13400

15300 10900 8470 8200

10900 6830 7630 4670

6930 5210 2660 1030

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-acetát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Dienoléter 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-önantát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Nandrolon-dekanoát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

5490 36700 37200 31200

39800 36100 25400 17400

34000 18000 13800 7130

22100 7230 2100 0

7450 18300 12400 10400

12600 10200 9140 9750

11300 10300 10100 6840

10200 7270 5450 2610

3470 12300 21800 22700

15700 28200 32500 32400

29900 32300 28400 20200

32300 24600 14300 6590

5160 9980 6600 5540

7680 6420 5510 5850

7610 6500 6930 5030

6720 4730 2720 720

0 0 0 0

0 0 0 0

0 850 1200 1640

0 1770 3060 3150

Nandrolon

Noretiszteron

Etinil-ösztradiol

45

6. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől 10% foszformolibdénsavas etanollal való előhívás után

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

80°C 640 2610 3090 5740

100°C 4250 8600 4550 7250

120°C 9320 7200 5060 4340

140°C 8990 6450 3550 2720

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

2860 7120 6240 9820

9390 11400 6100 6980

9580 8770 5300 5220

8840 5870 5140 3920

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-acetát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Dienoléter 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-önantát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Nandrolon-dekanoát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

7580 12130 7650 12660

12400 13600 7970 9410

10900 10700 5400 5980

8780 6080 5180 4290

3680 7610 6680 9480

9530 11700 8540 8150

12500 11300 8110 7830

11000 9320 5980 3330

5290 7810 8040 9780

9550 11700 8240 8130

12700 11500 9330 8240

11900 9580 5370 4020

2520 5450 5670 8060

7110 8080 6120 6560

9570 7730 6670 6360

8490 6480 4810 4970

0 1240 1240 2070

1490 2400 2590 3310

3210 2870 2400 3390

2820 3720 3000 2160

Nandrolon

Noretiszteron

Etinil-ösztradiol

46

7. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől 30% kénsavas etanollal való előhívás után

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

80°C 1260 6210 12900 14100

100°C 10500 9750 10600 7700

120°C 8860 5690 3200 1480

140°C 6880 0 0 0

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

4130 3670 5030 5140

2530 1110 0 0

640 0 0 0

0 0 0 0

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-acetát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Dienoléter 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-önantát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Nandrolon-dekanoát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

43600 34700 34000 26000

26000 18600 6450 4760

10700 1810 0 0

2170 0 0 0

5380 5990 8060 3820

4370 2810 1160 0

1770 0 0 0

0 0 0 0

8930 12000 11400 13800

14800 15400 11100 9210

13900 8810 3610 0

8400 0 0 0

4580 5220 6460 2650

3010 2020 0 0

1070 0 0 0

0 0 0 0

0 1810 3440 7460

4820 5820 6970 5340

6590 3680 780 0

2280 0 0 0

Nandrolon

Noretiszteron

Etinil-ösztradiol

47

8. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől 50% kénsavas etanollal való előhívás után

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

80°C 1880 3410 6020 10900

100°C 8380 12400 16100 13400

120°C 9840 6910 3420 0

140°C 5370 0 0 0

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

2070 1850 2420 1820

2610 1910 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-acetát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Dienoléter 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Noretiszteron-önantát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc Nandrolon-dekanoát 2 perc 5 perc 10 perc 20 perc

34600 25500 25700 25700

32000 18200 6430 4930

13500 7560 1340 0

2280 0 0 0

3610 2960 4870 5050

8250 3660 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

9000 10500 14000 20600

20600 20200 12900 10300

13800 11800 6550 0

7030 0 0 0

2730 2190 2310 3340

2870 2320 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

720 2430 3030 9480

6680 11900 10100 5190

5330 2910 2560 0

1500 0 0 0

Nandrolon

Noretiszteron

Etinil-ösztradiol

4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák

A 24-31. ábrák a vizsgált szteroidok jelintenzitásait mutatja szintvonalas grafikonokon. Először a különböző minőségű, de azonos koncentrációjú reagenssel előhívott kromatogramokról nyert adatokat hasonlítom össze (25-28. ábra), majd a különböző koncentrációjú kénsavas reagenssel kapottakat (29-32. ábra).

48

Nandrolon

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

30

10% foszformolibdénsavas EtOH

20

20

3,5E4

6000

3,15E4 2,8E4

1,4E4 1,05E4

10

3000

10

2400 1800

7000

7000 6000

2000

90

100

110

120

130

1000 0

0

0

80

3000

0

0 70

4000

5

600,0

0

60

5000

10

1200

5

3500

5

8000

3600

idő (min)

idő (min)

1,75E4

15

4200

2,1E4

15

9000

4800

15

2,45E4

20

10000

5400

idő (min)

25

140

80

90

100

o

110

120

130

80

140

90

100

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

110

120

130

140

o

o

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron

30

10% foszformolibdénsavas EtOH

20

20

1,6E4 1,44E4

6400 4800

10

8000

10

6400 4800

3200 1600

5

5

1600

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

8000 7000

10

6000 5000 4000

5

3000 2000

0

0

0

60

9000

3200

0

0

10000

9600

idő (min)

idő (min)

8000

15

1,12E4

9600

15

1,1E4

1,28E4

15

1,12E4

20

1,2E4

1,44E4

1,28E4

idő (min)

25

1,6E4

80

90

100

110

120

130

140

80

90

o

hőmérséklet ( C)

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

25. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

49

Etinil-ösztradiol

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

10% foszformolibdénsavas EtOH

30

20

20

4E4

25

4E4

3,6E4

1,4E4

3,6E4 3,2E4

15

1,2E4

10

2E4

10

1,6E4 1,2E4

8000

10000

6000

90

100

110

120

130

5000 4000

0 80

7000

0

0 70

8000

5

4000

0

60

9000

10

8000

5

4000

5

1,1E4

idő (min)

1,6E4

1,2E4

2,4E4

idő (min)

idő (min)

2E4

15

2,8E4

2,4E4

15

1,3E4

3,2E4

2,8E4

20

0

80

140

90

100

110

120

130

140

80

90

100

o

o

hőmérséklet ( C)

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron-acetát

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

10% foszformolibdénsavas EtOH

30

20

20

2,6E4

25

2E4

2,34E4

1,3E4

1,82E4 2,08E4

15

1,04E4 7800

10

1,1E4

10

9200 7400

5200 2600

5

5

3800

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

8000 7000 6000 5000

5

4000

2000

0 60

9000

10

5600

0

0

10000

1,28E4

idő (min)

idő (min)

15

1,1E4

1,46E4

1,56E4 1,3E4

15

idő (min)

20

1,2E4

1,64E4

1,82E4

3000

0

80

90

100

110

120 o

hőmérséklet ( C)

130

140

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

26. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

50

Dienoléter

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

10% foszformolibdénsavas EtOH

30

20

20

5E4

25

3,5E4

4,5E4

1,3E4

3,15E4 4E4

15

1,5E4

10

1,75E4

10

1,4E4 1,05E4

10000

9400

5

5800

90

100

110

120

130

4900 4000

0 80

6700

0

0 70

7600

5

3500

0

60

8500

10

7000

5000

5

1,03E4

idő (min)

2E4

1,12E4

2,1E4

idő (min)

idő (min)

15

15

2,45E4

3E4 2,5E4

1,21E4

2,8E4

3,5E4

20

0

80

140

90

100

110

120

130

140

80

90

100

o

o

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron-önantát

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

10% foszformolibdénsavas EtOH

30

20

20

2,2E4

25

10000

1,98E4

10000

9000 1,76E4

15

6600

10

5000

10

4000 3000

4400 2200

5

1000

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

6000 5200 4400 3600

5

2800

0

0 60

6800

10

2000

5

0

0

7600

idő (min)

8800

8400

6000

idő (min)

idő (min)

1,1E4

15

7000

1,32E4

15

9200

8000

1,54E4

20

2000

0

80

90

100

110

120 o

hőmérséklet ( C)

130

140

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

27. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása 51

Nandrolon-dekanoát

10% H2SO4/EtOH

10% H3PO4/EtOH

10% foszformolibdénsavas EtOH

30

20

20

7E4

25

3500

6,3E4

4000

3150 5,6E4

15

2,1E4

10

1750

10

1400 1050

1,4E4 7000

5

2800 2400

idő (min)

2,8E4

5

350,0

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

1600 1200 800,0

5

400,0

0

0 60

2000

10

700,0

0

0

3200

2100

idő (min)

idő (min)

15

15

2450

4,2E4 3,5E4

3600

2800

4,9E4

20

0

0

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

28. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

52

Nandrolon

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

30

20 3,5E4

1,6E4

3,15E4

1,44E4

2,8E4 2,45E4

1,12E4

2,1E4

9600

1,75E4

15

1,4E4 1,05E4

10

8000

10

6400 4800

7000

1,62E4

15

1,26E4 1,08E4

90

100

110

120

130

5400 3600 1800 0

0

0

80

7200

0

0 70

9000

10

5

1600

0

60

1,44E4

3200

5

3500

5

1,8E4

1,28E4

15

idő (min)

20

20

idő (min)

25

idő (min)

50% H2SO4/EtOH

140

80

90

100

o

110

120

130

80

140

90

100

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

110

120

130

140

o

o

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron

50% H2SO4/EtOH

20

30 1,6E4

16 14

4800

10

3200 1600

5

idő (min)

idő (min)

6400

15

3850

12

9600

15

2520

4400

1,12E4

8000

2800

4950

1,28E4

20

20

5500

18

1,44E4

2240 1960

3300 2750

10

2200

8

1650

6

1680

idő (min)

25

1400

10

1120 840,0

1100 550,0

4

0

560,0

5

280,0

0

0

2 0

0

0 60

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

80

90

100

110

120 o

hőmérséklet ( C)

130

140

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

29. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása 53

Etinil-ösztradiol

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

30

20 4E4

4,5E4

3,6E4

4,05E4

3,2E4 2,8E4

3,15E4

2,4E4

2,7E4

2E4

15

1,6E4 1,2E4

10

2,25E4

10

1,8E4 1,35E4

8000

3,15E4

15

2,45E4 2,1E4

90

100

110

120

130

1,05E4 7000 3500 0

0

0 80

1,4E4

0

0 70

1,75E4

10

5

4500

0

60

2,8E4

9000

5

4000

5

3,5E4

3,6E4

15

idő (min)

20

20

idő (min)

25

idő (min)

50% H2SO4/EtOH

140

80

90

100

o

110

120

130

80

140

90

100

hőmérséklet ( C)

110

120

130

140

o

o

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron-acetát

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

30

20 2,6E4

9000

2,34E4

8100

2,08E4 1,82E4

6300

1,56E4

5400

1,3E4

15

1,04E4 7800

10

4500

10

3600 2700

5200 2600

5

900,0

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

7200 6300 5400 4500

10

3600 2700 1800

5

900,0

0

0

0

0 60

8100

15

1800

5

0

0

9000

7200

15

idő (min)

20

20

idő (min)

25

idő (min)

50% H2SO4/EtOH

80

90

100

110

120 o

hőmérséklet ( C)

130

140

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

30. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

54

Dienoléter

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

30

20 5E4

1,6E4

4,5E4

1,44E4

4E4 3,5E4

1,12E4

3E4

9600

2,5E4

15

2E4 1,5E4

10

8000

10

6400 4800

10000

1,98E4

15

5

1,54E4 1,32E4

90

100

110

120

130

6600 4400 2200 0

0

0 80

8800

0

0 70

1,1E4

10

5

1600

0

60

1,76E4

3200

5000

5

2,2E4

1,28E4

15

idő (min)

20

20

idő (min)

25

idő (min)

50% H2SO4/EtOH

140

80

90

o

100

110

120

130

80

140

90

100

hőmérséklet ( C)

110

120

130

140

o

o

hőmérséklet ( C)

hőmérséklet ( C)

Noretiszteron-önantát

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

50% H2SO4/EtOH

30

20

2,2E4

20 7000

1,98E4

15

1,54E4

20

8800 6600

10

5

3500

10

2800 2100

5

700,0

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

1750 1400 1050 700,0

5

350,0

0

0 60

2100

10

1400

0

0

2450

4200

4400 2200

2800

4900

idő (min)

idő (min)

1,1E4

3150

15

5600

1,32E4

15

3500

6300

1,76E4

idő (min)

25

0

0 80

90

100

110

120 o

hőmérséklet ( C)

130

140

80

90

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

31. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása 55

Nandrolon-dekanoát

10% H2SO4/EtOH

30% H2SO4/EtOH

50% H2SO4/EtOH

30

20

7E4

20 8000

6,3E4

15

4,9E4

20

2,8E4 2,1E4

10

7000

4000

10

3200 2400

5

800,0

70

80

90

100

110 o

hőmérséklet ( C)

120

130

140

6000 4800 3600 2400

5

1200

0

0 60

7200

10

1600

0

0

8400

4800

1,4E4

5

9600

5600

idő (min)

idő (min)

15

1,08E4

15

6400

4,2E4 3,5E4

1,2E4

7200

5,6E4

idő (min)

25

0

0 80

90

100

110

120

130

140

80

90

o

hőmérséklet ( C)

100

110

120

130

140

o

hőmérséklet ( C)

32. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

56

4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése Kénsavas reagens használata megkönnyíti a 366 nm-es UV-fényben történő

vizuális értékelést az egyes szteroidokra jellemző színnel fluoreszkáló foltok miatt. A legtöbb vizsgált anyag esetében 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult megfelelőnek. Az etinil-ösztradiol azonban ilyen magas hőmérsékleten már megégett, 80100°C-on 2-5 percig tartva kaptam a maximális csúcsterületeket. Több anyag esetében is kedvezőnek bizonyult az alacsonyabb hőmérsékleten (80-100°C) hosszabb ideig (10-20 perc) történő melegítés. A foltok intenzitása így ugyan valamivel kisebb, mint a maximális intenzitást mutató 120°C-nál, de ez bizonyult a robosztusabb előhívási módnak. A nandrolon és a nandrolon-dekanoát esetében azonban az alacsonyabb hőmérséklet nem volt kedvező. Az elvégzendő feladattól függően rutin eljárásokhoz a megbízható teljesítményű, robosztusabb 80°C-on 10-20 percen át tartó melegítést javaslom. Nagyobb érzékenységet kívánó egyedi esetekben pedig a 120°C 2 perces kombinációt. Foszforsavas reagens használatakor szintén eltérő színnel fluoreszkáló foltokat

kaptam, azonban a színek kevésbé jellemzőek, mint a kénsavas reagens esetében. Ebben az esetben az értékelést az könnyíti meg, hogy sokkal egyenletesebb a réteglapok háttere, kevésbé zajos videodenzitogramokat kaptam. Itt nagyobb eltérést tapasztaltam az egyes szteroidok esetében. A legalacsonyabb hőmérséklet (80°C) a noretiszteron származékainak kedvezett (-acetátnak és -önantátnak), míg magának a noretiszteronnak kissé magasabb hőfok a kedvező (100°C). Az etinil-ösztradiol esetében 100°C-on 2-5 percig történő melegítés az optimális. A nandrolon és a nandrolon-dekanoát pedig 140°C-on 10-20 perc után jelent meg maximális intenzitással. A dienoléter esetében közel azonos területeket kaptam 140°C 2 perc, 120°C 5 perc és 100°C 15-20 perc kombinációkban. A nandrolon és származéka kivételével a foszforsavas előhívásnál még jelentősebb az a tendencia, hogy az alacsonyabb hőmérséklet és a hosszabb melegítési idő is ugyanolyan kedvező lehet, mint a magasabb hőmérsékleten rövidebb ideig történő melegítés. Foszformolibdénsavas reagens használatakor látható fehér fényben történik az

értékelés. Ilyenkor a sárgás hátterű réteglapokon kékes színnel jelennek meg a foltok. Valamennyi szteroid azonos színnel jelenik meg, amely a minőségi értékelésben nem jelent kiegészítő információt, azonban a vizuális becslést és a videodenzitometriát megkönnyíti, hiszen a foltok csupán méretükben és intenzitásukban különböznek egymástól. A kénsavas reagenshez hasonlóan itt is a 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult ideálisnak leggyakrabban. Az etinil-ösztradiol esetében ezúttal is ennél alacsonyabb hőmérséklet volt

57

a kedvező (100°C 5 perc). A nandrolon és származéka pedig magasabb hőmérsékleten (140°C-on) mutatott maximális intenzitást, akárcsak a foszforsavas reagens használatakor. Ennek az előhívószernek a használata kívánja a legnagyobb gyakorlatot, bepermetezés közben ugyanis könnyen megfolyhat a szorbensen, ezáltal a foltok is elmozdulnak. Nehezebb

egyenletesen

és

reprodukálhatóan

bepermetezni

a

szorbenst

a

foszformolibdénsavas előhívóval, mint a többi reagenssel. A 30%, ill. az 50%-os kénsavas előhívó reagensek használatakor általános tapasztalat, hogy kevésbé egyenletesen vihetők fel a szorbensre a nagyobb viszkozitású oldatokból. Az alacsonyabb hőmérséklet több esetben bizonyult kedvezőbbnek, mint a 10%-os kénsavas reagensnél. A két legmagasabb hőmérsékletet (120-140°C-ot) igénylő szteroid – a nandrolon és a nandrolon-dekanoát – esetében is elegendő a 100°C-on hosszabb ideig történő melegítés. A három különböző minőségű, de azonos koncentrációjú előhívó reagens esetében 120°C 2 perc kombináció bizonyult az általánosan használható előhívási körüménynek a vizsgált szteroidokra. Nem minden esetben kaptam itt a legintenzívebb foltokat, azonban a nandrolon-dekanoát kivételével valamennyi anyag detektálható volt ilyen körülmények között. Ennek pontosítására meghatároztam a kimutatási határokat. Csökkenő mennyiségű anyagot vittem fel a szorbensre és a még legkisebb látható mennyiséget fogadtam el kimutatási határként. Ebben az esetben is a szteroidok közös oldataiból

dolgoztam.

A

kromatográfiás

kifejlesztést

követően

a

szorbenseket

bepermeteztem egy-egy előhívó reagenssel és 120°-on 2 percig történő melegítést követően ellenőriztem az egyes szteroidokra jellemző kimutatási határ-értékeket, amelyeket a 9. táblázatban foglaltam össze.

58

9. táblázat. Különböző szteroidok kimutatási határ-értékei eltérő minőségű reagenssel történő előhívást követően 10% kénsavas etanol

10% foszforsavas etanol

0,0075 μg

0,075 μg

10% foszformolibdénsavas etanol 0,0075 μg

Noretiszteron

0,01 μg

0,01 μg

0,0075 μg

Etinil-ösztradiol Noretiszteronacetát Dienoléter Noretiszteronönantát Nandrolondekanoát

0,01 μg

0,025 μg

0,075 μg

0,025 μg

0,025 μg

0,01 μg

0,01 μg

0,025 μg

0,025 μg

0,025 μg

0,025 μg

0,025 μg

0,01 μg

> 0,1 μg

0,075 μg

Nandrolon

A kénsavas és a foszformolibdénsavas előhívó reagens használata érzékenyebb kimutatást tett lehetővé, mint a foszforsavasé. A várakozásoknak megfelelően a nandrolondekanoát, amely foszforsavas előhívással csak 140 °C-os hőmérsékletnél jelent meg, a kimutatási határ vizsgálatának hőmérsékletén nem volt kimutatható a vizsgált mennyiségek egyikében sem. Összegzésként elmondható, hogy a 10%-os kénsavas és foszformolibdénsavas előhívás általánosságban azonos érzékenységűnek bizonyult a vizsgált szteroidokra. Szerkezeti sajátosságok miatt adódtak különbségek. Amíg a kénsavas előhívásnál jellemző színük miatt könnyebb az egyes komponensek azonosítása, addig a foszformolibdénsavas reagensnél a mennyiségi értékelés egyszerűbb. A savas előhívások optimális körülményei kis mértékben változnak az anyagtípustól függően. A planárkromatográfiás eljárások optimalizálásakor ezért nem csak az eluens összetételét, hanem az előhívási körülményeket is optimalizálni kell.

59

4.3. Teljesítményjellemzők Több szteroid anyag esetében különböző kromatográfiás rendszerek teljesítményét hasonlítottam

össze.

A

vizsgált

anyagokra

meglévő

hagyományosan

VRK

tisztaságvizsgálati módszerek mellett a nagyobb pontosságú meghatározásokat lehetővé tevő OPLC és HPLC módszerek elválasztóképességét (Rs), elméleti tányérszámát (N), valamint elméleti tányérmagasság-értékeit (H) vizsgáltam. Azokban az esetekben, amikor gradiens programmal végzett elválasztásról volt szó, csak az elválasztóképességet számoltam ki. VRK és OPLC esetében a következő számolási képleteket alkalmaztam: RF ,app = RRF =

zx:

z layer

zx z ref

(4.1) (4.2)

16( z x ) 2 N= w2

(4.3)

w2 H= 16 z x

(4.4)

Rs =

ahol

zx

2( z x 2 − z x1 ) w1 + w2

(4.5)

a komponens migrációs távolsága a felviteli helytől mérve

zlayer: a felvitel helye és az eluenskivezető csatorna közötti távolság zref:

a referencia anyag migrációs távolsága a felviteli helytől mérve

N:

elméleti tányérszám

w:

a csúcs alapvonalszélessége

H:

elméleti tányérmagasság

Rs:

csúcsfelbontás

HPLC esetében használt számolási képletek [55]: N = 5 ,545 H=

L N

Rt2

ω2

(4.6) (4.7)

60

Rs = 1,18 ahol

Rt 2 − Rt 1 ω 2 + ω1

Rt:

retenciós idő

ω:

a csúcs félértékszélessége

L:

oszlophossz

(4.8)

Az összehasonlítás alapját képező szteroidok az ún. „metilsor” anyagai közül kerültek ki: noretiszteron, etinil-ösztradiol és nandrolon, a gesztodén azonban az „etilsorba” tartozik. A különböző módszerekkel végzett vizsgálatok kísérleti körülményei a 3. fejezetben találhatók. 4.3.1. Etinil-ösztradiol

Az etinil-ösztradiol esetében az Európai és az Angol Gyógyszerkönyv 2000-ig VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő, amelynek szelektivitása és pontossága elmarad a kívánt szinttől (34-35. ábra). A lehetséges egyedi szennyezések közül az ösztronra (33. ábra), mint utolsó intermedierre állapítottak meg limitet. Az Európai Gyógyszerkönyvhöz 2000-ben készült kiegészítés már HPLC tisztaságvizsgálati módszert írt elő, ezt az Angol Gyógyszerkönyv is átvette, majd 2002-től szigorították a limiteket, amelyek jelenleg is érvényesek.

Az

Amerikai

Gyógyszerkönyv

nem

írja

elő

az

etinil-ösztradiol

tisztaságvizsgálatát. Laboratóriumunkban kidolgozásra és validálásra került egy OPLC módszer, amely lehetővé teszi az etinil-ösztradiol szennyezéseinek egymástól és a főkomponenstől való szelektív elválasztását (36-37. ábra). Ugyanakkor egy HPLC módszer is kidolgozásra került, amely a Gyár hivatalos előírása szerint az etinil-ösztradiol tisztaságvizsgálatára jelenleg is alkalmazott módszer (38. ábra). Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot, a kapott kromatogramokat ábrázoltam, a számolt teljesítményjellemzőket táblázatokban tüntettem fel (10-12. táblázat) [56-57]. Valamennyi esetben egységes számozással jelöltem a különböző vegyületeket.

61

CH3 OH

CH3 OH

CH H

CH H

H

H HO

H

H

OH

HO

6β-hidroxi-etinil-ösztradiol

etinil-ösztradiol CH3 OH

CH3 OH

CH

CH

H

H

H

H

H

H

HO

HO

OH

O

6α-hidroxi-etinil-ösztradiol

6-keto-etinil-ösztradiol

CH3 OH

CH3

OH CH

H H

H H

H

O H

HO

HO

ösztradiol

16-keto-etinil-ösztradiol

CH CH3

OH

CH3 OH

CH

H

H

H

H

H

HO

HO

Δ9(11)-etinil-ösztradiol

17-epi-etinil-ösztradiol CH3 O H H

ösztron

H

HO

33. ábra. Az etinil-ösztradiol és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

62

Felvitelek: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a b

0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 0,5 μg ösztradiol 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 0,5 μg ösztron 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD + 2 3 5 8 9 1 4 a b 7 6 + 0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden szennyezésből

34. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített fotó

RF

35. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram 10. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők 1 2 4 3,5,6, 7 8 9

6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol ösztradiol 6-keto-EÖD, 16-keto-EÖD, Δ9(11)-EÖD, EÖD 17-epi-etinil-ösztradiol Ösztron

RF 0,24 0,26 0,36

RRF 0,57 0,62 0,86

N 1024 1079 2535

H (μm) 70,3 72,3 42,2

Rs 0,65 3,22

0,42

1,00

940

134,5

1,56

0,46 0,50

1,10 1,19

2330 2742

57,0 52,5

0,45 1,02

H = 71,5 μm

63

Felvitelek: 0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 0,5 μg ösztradiol 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 0,5 μg ösztron 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD + 0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden szennyezésből

1 2 3 4 5 6 7 8 9 a b

2 1 3 5 b 7 a 8 6

9 4

36. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített fotó

RF

37. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram 11. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők

1 2 3 4 5 6 7 8 9

6β-hidroxi-etinilösztradiol 6α-hidroxi-etinilösztradiol 6-keto-etinil-ösztradiol Ösztradiol 16-keto-etinil-ösztradiol Δ9(11)-etinil-ösztradiol etinil-ösztradiol 17-epi-etinil-ösztradiol Ösztron

RF,app

RRF

N

H (μm)

0.03

0.05

64

62.5

0.05

0.09

154

50.4

1.67

0.22 0.36 0.42 0.53 0.58 0.67 0.72

0.38 0.62 0.72 0.91 1.00 1.16 1.24

784 4807 3782 5929 9773 10050 11664

40.2 10.8 16.3 13.0 8.9 10.0 9.3

6.79 5.47 2.71 3.88 2.53 3.67 1.94

Rs

H = 24,6 μm

64

VWD1 A, Wavelength=280 nm (EED0128\037-0901.D) mAU

40

2

9

8 26.219

20.580

18.516

14.905

7

17.226

4.737

10

3

4

9.173

20

5

7.302

5.385

1

16.072

6

4.549

30

0 0

5

10

15

20

25

30

35

min

38. ábra. Az etinil-ösztradiol HPLC kromatogramja 12. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők

2 1 3 5 4 6 7 9 8

6α-hidroxi-etinilösztradiol 6β-hidroxi-etinilösztradiol 6-keto-etinil-ösztradiol 16-keto-etinil-ösztradiol ösztradiol Δ9(11)-etinil-ösztradiol etinil-ösztradiol Ösztron 17-epi-etinil-ösztradiol

ω [min]

Rt [min]

N

H [μm]

Rs

0,1133

4,544

8919

28,0

-

0,1222

5,379

10744

23,3

4,18

0,1731 0,1879 0,2768 0,3025 0,3384 0,3644 0,4602

7,288 9,151 14,878 16,033 18,472 20,531 26,149

9829 13152 16020 15577 16522 17602 17903

25,4 19,0 15,6 16,0 15,1 14,2 14,0

7,63 6,09 14,54 2,35 4,49 3,46 8,04

H = 19,0 μm

A 39. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges analízisidőt a különböző módszerek esetében. Mindegyik módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás történt.

A számolásnál

figyelembe

vettem

valamennyi

szükséges

standard

és

rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást. Az OPLC és a VRK-módszer esetében egy szorbensen 3 tétel párhuzamos mintái vizsgálhatók a standard anyagok mellett egyidejűleg. Sávos mintafelvitellel egy 20x20 cmes méretű réteglapra körülbelül 12 minta vihető fel. Egy kromatogram OPLC-vel történő

65

kifejlesztéséhez szükséges idő 30 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a HPLC-hez 400-600 perc volt a vizsgálandó tételek számának függvényében.

600

500

idő (min)

400 TLC 300

OPLC HPLC

200

100

0 1

2

3

vizsgált tételek

39.

ábra.

Az

etinil-ösztradiol

VRK,

OPLC,

ill.

HPLC

technikával

végzett

tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében Értékelés A három különböző kromatográfiás módszer közül egyedül a VRK nem bizonyult minden szennyezésre specifikusnak. Az egyes komponensek elválasztása a HPLC-nél bizonyult a legjobbnak, de OPLC-vel is 1,5 feletti Rs-értéket kaptam minden egyes vizsgált anyagpárra. Ezzel a két módszerrel specifikusan értékelhetők az etinil-ösztradiol lehetséges szennyezései. Az OPLC módszer vizuális becslésen alapuló félkvantitatív módszer, a HPLC pedig kvantitatív eredményeket szolgáltat, ezért a pontosság tekintetében különbség van a két módszer között. A tányérmagassági értékekből látható, hogy hatékonyságában az OPLC és a HPLC módszer összemérhető, a VRK azonban elmarad ettől a szinttől. A tányérmagasság átlagértékére ( H ) HPLC-nél 19 μm-t, OPLC-nél 25 μm-t kaptam, míg VRK-nál 72 μm-t, ez megfelel az irodalomban található adatoknak [13]. A módszerek időigényében jelentős különbség van. Míg a VRK és OPLC kromatogramok kifejlesztéséhez szükséges idő nem több, mint egy óra, addig a HPLC-nél három tétel vizsgálata esetén már 10 óra a szükséges idő. Az etinil-ösztradiol alapanyag tisztaságvizsgálatára az OPLC és HPLC módszer egyaránt alkalmas. OPLC-vel gyors limit-tesztet, HPLC-vel nagy pontosságot igénylő vizsgálatokat végezhetünk.

66

4.3.2. Noretiszteron

A noretiszteron esetében mind az Európai, mind az Amerikai Gyógyszerkönyv VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő (41-42. ábra). Laboratóriumunkban kidolgoztunk és validáltunk egy félkvantitatív OPLC tisztaságvizsgálati módszert, amelyet azóta a hatóanyag minőségének ellenőrzésére használunk (43-44. ábra) [58]. Egy HPLC módszer is kidolgozásra került (45. ábra). Mind az OPLC, mind a HPLC módszerrel specifikusan vizsgálhatók a noretiszteron szennyezései, amelyek a 40. ábrán láthatók. A Norcolut tabletta tisztaságvizsgálatához, amelynek hatóanyaga a noretiszteron, adaptáltuk az OPLC módszert [59]. A továbbiakban a készítmény minőségellenőrzésére ezt a módszert használjuk. 2006-ban lépett életbe az Európai Gyógyszerkönyvben egy új HPLC-módszer az alapanyag tisztaságának ellenőrzésére [60].

67

OH C

H3C OH C

H3C

CH

H

H

H

H

H

H O

H

H

CH

OH

O

6β-hidroxi-noretiszteron

noretiszteron H3 C

OH C

CH

OH C

H3C

H

H

CH

H

OH H

H

H

H

O

O

OH

6α-hidroxi-noretiszteron H3 C

10β-hidroxi-noretiszteron H3C

O

OH C

CH

H

H H

H

H H

H

H

O

O

O 4

Δ -nordion

6-keto-noretiszteron H3C

C

CH OH

H

H H

H

O

17-epi-noretiszteron 40. ábra. A noretiszteron és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

68

Felvitelek: 1 2 3 4 5 6 7 a b c d

0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg Δ4-nordion 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 50 μg noretiszteron 0,5 μg 17-epi-noretiszteron placebo 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és 0,5-0,5 μg a szennyezésekből 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából

4 7 5 3 2 1 a b c d 6

41. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta VRK kromatogramjáról készített felvétel

1-3 5 6-7 4

42. ábra. A noretiszteron VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram Mindhárom

tisztaságvizsgálati

technikával

elvégezve

a

specifikusságvizsgálatot,

táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (13-15. táblázat). 13. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők 1 2 3 5 6 7 4

6β-hidroxi-noretiszteron 6α-hidroxi-noretiszteron 10β-hidroxi-noretiszteron 6-keto-noretiszteron Noretiszteron 17-epi-noretiszteron Δ4-nordion

RRF 0,19 0,19 0,19 0,81 1,00 1,00 1,28

Rs 0,0 0,0 4,73 1,33 0,0 1,64

H (μm) 344 344 344 91 69 69 106 H = 195 μm

69

Felvitelek: 1 2 3 4 5 6 7 a b c d e

0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 0,5 μg Δ4-nordion 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 50 μg noretiszteron 0,5 μg 17-epi-noretiszteron placebo 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és 0,5-0,5 μg a szennyezésekből 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából 50 μg noretiszteron

4 7 5 3 2 1 a b c d e

43. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta OPLC kromatogramjáról készített felvétel

3 1 2

4 5

6

7

44. ábra. A noretiszteron OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram 14. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők 1 2 3 4 5 6 7

6β-hidroxi-noretiszteron 6α-hidroxi-noretiszteron 10β-hidroxi-noretiszteron Δ4-nordion 6-keto-noretiszteron Noretiszteron 17-epi-noretiszteron

RRF 0.32 0.36 0.47 0.72 0.83 1.00 1.13

Rs 0.48 2.69 6.58 2.00 2.87 3.12

H (μm) 55 44 45 14 37 18 14 H = 32 μm

70

HPLC

2 1 3

6 5

7

4

45. ábra. A noretiszteron HPLC kromatogramja 15. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők 2 1 3 5 4 6 7

6α-hidroxi-noretiszteron 6β-hidroxi-noretiszteron 10β-hidroxi-noretiszteron 6-keto-noretiszteron Δ4-nordion Noretiszteron 17-epi-noretiszteron

RRt 0.20 0.22 0.30 0.73 0.92 1.00 1.45

Rs 1.84 5.63 23.27 6.94 2.98 16.25

Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben nem adtam meg. A 46. ábrán mutatom be a noretiszteron tisztaságvizsgálatához szükséges analízisidő alakulását különböző módszerekkel végezve az elemzést. A VRK és OPLC esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás történt.

A számolásnál

figyelembe

vettem

valamennyi

szükséges

standard

és

rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.

71

1200

idő (min)

1000 800 TLC

600

OPLC 400

HPLC

200 0 1

2

3

vizsgált tételek

46.

ábra.

A

noretiszteron

VRK,

OPLC,

ill.

HPLC

technikával

végzett

tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében Az OPLC-módszerhez szükséges idő 30-40 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a HPLC-hez 600-1200 perc volt az analízisidő a vizsgálandó tételek számának függvényében. Értékelés A VRK módszer szelektivitása nem megfelelő a noretiszteron hatóanyag és a Norcolut tabletta tisztaságának vizsgálatára. A fotódokumentációs rendszer a kékes színű foltokat kis mértékben torzítja, intenzívebbnek tűnnek a foltok a videofelvételen vizuális becsléssel, mint a kromatogramon. Ennek következtében – jóllehet vizuálisan elkülöníthetők egymástól a 6-hidroxi-noretiszteron szennyezések az OPLC módszerrel készített kromatogramon – videodenzitometriás értékeléssel Rs=0,5-ös csúcsfelbontás értéket kaptunk. A HPLC módszerrel valamennyi komponenspár esetében megfelelő – 1,5-nél nagyobb – elválasztást tapasztaltunk. A két utóbbi módszer különböző értékelési módját figyelembe véve a szelektivitásuk megfelelőnek mondható. Hatékonyság tekintetében az OPLC és a HPLC módszer összemérhető. Az átlagos tányérmagasság OPLC-nél 32 μm, a VRK-módszer a 195 μm-es átlagos tányérmagassági értékkel jóval kevésbé hatékony. A módszerek időigényét figyelembe véve VRK-val körülbelül egy óra alatt elkészíthetjük a kromatogramot, OPLC-vel ennél is kevesebb időre (20 perc) van szükség, azonban HPLC-vel 10-20 órára is szükség van az eredményhez.

72

A gyors limit tesztnek tekinthető OPLC módszernél valamennyi komponens mennyisége megbecsülhető vizuálisan, a kvantitatív HPLC módszer pedig pontos meghatározást tesz lehetővé. 4.3.3. Nandrolon

Több

szteroid

hatóanyag

szintézisénél

is

kulcsintermedier

a

nandrolon.

Tisztaságvizsgálatára többféle módszer is használható [44]. Lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képleteit a 47. ábrán mutatom be. OH CH3

OH CH3

H H

H

H

H H

H

H

O H

O

5α-4,5-dihidro-nandrolon

nandrolon OH

OH CH3

CH3

H

H H

H

H

O

O 8(14)

5(10)

nandrolon-Δ

Δ

-izomer

-nandrolon OH CH3

OH CH3

H

H

H H

H H3C

H

O

H

O

OH

6β-hidroxi-nandrolon

dienoléter

OH CH3 H H H3C

H

O

ösztradiol-metiléter 47. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei A nandrolon tisztaságvizsgálatának egyik lehetősége egy VRK-módszer, amely azonban nem minden szennyezésre specifikus (48-49. ábra). Az általam kidolgozott OPLCmódszerrel valamennyi szennyezés szelektíven értékelhető (50-51. ábra).

73

Egy HPLC tisztaságvizsgálati módszer is kidolgozásra került. A szennyezések eltérő UVelnyelése miatt két hullámhosszon történik az értékelés, 210 és 225 nm-en. A 4,5-dihidronandrolon azonban UV-detektorral nem mutatható ki (52. ábra). Mindhárom

tisztaságvizsgálati

technikával

elvégezve

a

specifikusságvizsgálatot,

táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (16-18. táblázat). Felvitelek: 2 3 4 5 6 7 a b 1 c

0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 0,2 μg Δ8(14)-nandrolon 0,2 μg dienoléter 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 0,2 μg ösztradiol-metiléter 0,2 – 0,2 μg nandrolon és minden szennyezés 50 μg nandrolon és 0,2 μg minden szennyezés 50 μg nandrolon oldószer

2 3 4 5 6 7 a b 1 c

48. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített felvétel

RF

49. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram 16. táblázat. A VRK módszer teljesítményjellemzői RF

RRF

Rs

6β-hidroxi-nandrolon

0,10

0,36

-

1, 4

Nandrolon, Δ8(14)-nandrolon

0,28

1,00

2,3

2, 3

4,5-dihidro-nandrolon, Δ5(10)-izomer

0,37

1,32

1,0

5, 7

dienoléter, ösztradiol-metiléter

0,47

1,68

1,1

6

74

Felvitelek: 2 3 4 5 6 7 a b c d

0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon 0,2 μg dienoléter 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 0,2 μg ösztradiol-metiléter 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon és 0,2-0,2 μg nandrolon és összes egyéb szennyezés 25 μg nandrolon, 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon és 0,2-0,2 μg összes egyéb szennyezés 25 μg nandrolon 50 μg nandrolon

2 3 4 5 6 7 a

b c d

50. ábra. A nandrolon OPLC kromatogramjáról készített felvétel

RF

51. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram 17. táblázat. Az OPLC-módszer teljesítményjellemzői RF

RRF

Rs

6

6β-hidroxi-nandrolon

0,04

0,15

-

1

Nandrolon

0,27

1,00

8,7

8(14)

4

Δ

-nandrolon

0,33

1,22

2,2

2

4,5-dihidro-nandrolon

0,43

1,59

5,2

3

Δ5(10)-izomer

0,46

1,70

0,8

7

ösztradiol-metiléter

0,63

2,33

5,8

5

dienoléter

0,72

2,67

1,5

75

λ = 210 nm *DAD1 A, Sig=210,8 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D) mAU 120

63.370

7

100

80

60

5 68.571

20

3

1 41.732

16.855

6

50.550

40

38.849

4

0

-20 0

10

20

30

40

50

60

70

80

min

70

80

min

λ = 225 nm *DAD1 B, Sig=225,16 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D) mAU 120

100

80

63.370

1

38.849

16.855

40

7

4

6

41.732

60

5

50.550

68.571

3 20

0

-20 0

10

20

30

40

50

60

52. ábra. A nandrolon HPLC kromatogramja 210 és 225 nm-en 18. táblázat. A HPLC módszer teljesítményjellemzői 225 nm-en értékelve Rt (perc)

RRt

Rs

6

6β-hidroxi-nandrolon

16,9

0,40

-

4

Δ8(14)-nandrolon

38,8

0,93

54,1

1

Nandrolon

41,7

1,00

6,1

3

Δ5(10)-izomer

50,5

1,21

15,0

7

ösztradiol-metiléter

63,4

1,52

25,9

5

Dienoléter

68,6

1,64

11,8

76

Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért tányérmagassági értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg. A nandrolon tisztaságának mérésére gázkromatográfiás módszerrel is van lehetőség [44]. A 4,5-dihidro-nandrolon pontosan mérhető ezzel a technikával, azonban maga a nandrolon kismértékű bomlást szenved az injektorban és Δ5(10)-izomer keletkezik. Az 53. ábrán mutatom be a GC kromatogramot, amelyen az egyes csúcsok számozása megegyezik az előző nandrolon kromatogramokon látható számozással. 2

7

3 4

5

1

6

53. ábra. A nandrolon gázkromatogramja [44] Az 54. ábrán mutatom be a különböző technikákkal végzett vizsgálatok analízisidejének alakulását a vizsgált tételek számának függvényében. Valamennyi módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés készült. A számolásnál figyelembe vettem a szükséges standard és rendszerelkalmassági felviteleket, illetve injektálásokat. 77

Az OPLC és VRK módszerek esetében a kromatogram kifejlesztésének időigénye általában 30-60 perc volt, a GC-módszernél 200-250 perc, azonban a HPLC-módszernél 1200 percig tartott három tétel vizsgálata. 1200 1000

idő (min)

800 TLC 600

OPLC HPLC

400

GC

200 0 1

2

3

vizsgált tételek

54.

ábra.

A

nandrolon

VRK,

OPLC,

HPLC

és

GC

technikával

végzett

tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében Értékelés A nandrolon tisztaságvizsgálatára a VRK módszer szelektivitása nem megfelelő. Az OPLC módszer esetében a 4,5-dihidro-nandrolon és a nandrolon-Δ5(10)-izomer esetében a csúcsfelbontás nem éri el az 1,5-ös értéket, azonban kénsavas előhívás után eltérő színnel fluoreszkálnak 366 nm-es fénnyel megvilágítva, így vizuálisan értékelhetők. A HPLC módszernél a 4,5-dihidro-nandrolon szennyezés, amely a nandrolon egyik fő szennyezése, nem mérhető, mert nem mutat UV-elnyelést. A többi lehetséges szennyezés pedig 2 hullámhosszon mérendő a pontos mennyiségi értékelés érdekében. A GC-módszerrel a 4,5dihidro-nandrolon pontosan mérhető, azonban a főkomponens az injektorban kis mértékben bomlik a nandrolon Δ5(10)-izomerjére. Valamennyi szennyezés egyidejű értékeléséhez a félkvantitatív OPLC módszer bizonyult alkalmasnak. A HPLC módszer a 4,5-dihidro-nandrolon kivételével, amely nem mérhető UV-detektálással, a szennyezések pontos kvantitatív meghatározását tette lehetővé. Az időigény szempontjából a VRK és OPLC-módszerekkel végzett vizsgálathoz körülbelül egy órára volt szükség, a HPLC tisztaságvizsgálathoz azonban 15-20 óra kellett.

78

4.3.4. Gesztodén

Az ún. „etilsor” anyagai közül a gesztodén különböző vizsgálati módszereire végeztünk összehasonlítást. A gesztodén nem szerepel az Amerikai és az Európai Gyógyszerkönyvben. A gesztodén és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei az 55. ábrán láthatók. Hivatalos tisztaságvizsgálati módszere OPLC technikával történik (56-57. ábra). A folyamatosan bevezetésre kerülő hatósági szabályozás miatt a tisztaságvizsgálati követelmények egyre szigorúbbá válnak [38-40]. Az elvárt pontosságot a vizuális értékelésű OPLC-módszer nem tudja kellő biztonsággal teljesíteni, ezért kidolgoztak egy HPLC-tisztaságvizsgálati módszert (58. ábra) [61]. Jelenleg mindkét módszer érvényben van. A következőkben az elválasztóképességüket hasonlítom össze [62].

79

H3C

H3C

OH

H

H H

H

CH

H

H H

O

H

O

Δ6-gesztodén

gesztodén H3C

H3C

OH

H

OH

CH

H

H

CH

H H

H

O

H

HO OH

O

6β-OH-gesztodén

H3C

aromás 6-keto-gesztodén H3C

OH

H

OH

CH

CH

H

H

H

O

OH

CH

H

O

O

H

O CH3

O

15α-acetoxi-levonorgesztrel

gesztodén ketál izomerek H3C

H O

OH

CH

H

H

O

H

H

CH3

5-metoxi-gesztodén 55. ábra. A gesztodén és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

80

Felvitelek: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,2 μg Δ6-gesztodén 0,2 μg gesztodén ketál izomerek 0,2 μg 5-metoxi-gesztodén 0,2 μg 15α-acetoxi-levonorgesztrel 0,2 μg aromás 6-keto-gesztodén 0,2 μg 6β-hidroxi-gesztodén 0,2-0,2 μg gesztodén és összes szennyezése 100 μg gesztodén és 0,2 μg összes szennyezése 100 μg gesztodén oldószervak 1 2

3 4 5 6 7 8 9 10

56. ábra. A gesztodén OPLC kromatogramjáról készített felvétel

9

3

1 6

4

2

5

RF

57. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram

81

mAbs

9 5 6 3

1

minta + standardelegy

2a 2b

4

minta oldószer standard-elegy

58. ábra. A gesztodén HPLC kromatogramja [62] 19.

táblázat.

A

gesztodén

OPLC

és

HPLC

tisztaságvizsgálati

módszer

elválasztóképességének összehasonlítása OPLC RF

HPLC Rs

Rs

0,05 6β-OH-gesztodén

6β-OH-gesztodén

6

0,17 15α-acetoxi-levonorg.

2,3

18,4

aromás 6-keto-gesztodén

5

0,22 aromás 6-keto-gesztodén

2,8

15,8

15α-acetoxi-levonorg.

4

0,37 Δ6-gesztodén

3,7

11,2

6,7-didehidro-gesztodén

1

0,41 Gesztodén

1,4

4,8

Gesztodén

9

0,59 5-metoxi-gesztodén

5,1

12,7

5-metoxi-gesztodén

3

0,75 gesztodén ketál 1.

4,2

28,6

gesztodén ketál 1.

2a

0,80 gesztodén ketál 2.

1,3

2,4

gesztodén ketál 2.

2b

Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg.

82

Az 59. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges analízisidőt a kétféle módszerhez. Az OPLC esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés – azaz két minta – készült. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és

idő (min)

rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

OPLC HPLC

1

2

3

vizsgált tételek

59. ábra. A gesztodén OPLC és HPLC technikával végzett tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében Míg OPLC-vel 30-40 perc a kromatogram elkészítésének ideje, addig HPLC-vel egyetlen injektálás analízisideje 68 perc, három tétel vizsgálatához szükséges idő 950 perc. Értékelés Mindkét módszer megfelelő szelektivitást mutat. A HPLC-módszerrel pontosabb értékelés válik lehetővé. Azonban ebben az esetben csak 210 nm-en történő detektálással lehet valamennyi ismert szennyezést kimutatni. A HPLC-módszer időigénye körülbelül húszszorosa az OPLC-módszerének. A gyors, közelítő eredményekhez célszerű az OPLC-módszert használni. 4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye

Mind a négy vizsgált szteroid esetében levonhatjuk azt a következtetést, hogy a VRK módszerek nem kellően szelektívek az adott anyag és lehetséges szennyezéseinek elválasztására. Az OPLC és a HPLC módszerek szelektivitás tekintetében alkalmasnak bizonyultak.

83

Hatékonyságukat összehasonlítva a VRK-módszereknél általában 100 μm körüli átlagos tányérmagasság-értéket kaptam. Ezzel szemben a másik két módszerrel összemérhető értékeket kaptam: OPLC-vel 20-40 μm, míg HPLC-vel 10-30 μm volt az átlagos tányérmagasság az etinil-ösztradiol esetében, ahol izokratikus körülmények között történt a meghatározás. A többi esetben a HPLC-módszernél gradiens programmal történt az elválasztás, ezért nem adtam meg tányérmagasság értékeket. Az elválasztás hatékonysága a VRK-módszernél bizonyult a legkevésbé kedvezőnek, az OPLC és a HPLC esetében pedig hasonló volt. Az időigény tekintetében az OPLC-módszerek nem haladták meg a 30-40 percet, a VRKmódszerek körülbelül egy órát igényeltek. A HPLC-módszerek esetében a kromatogramok elkészítésének ideje általában 10-20-szor tovább tartott, mint az OPLC-nél. Gyors, limit tesztnek megfelelő eredményt kaphatunk OPLC-módszerekkel az egyes szennyezések mennyiségére. HPLC-vel pedig – bár jóval hosszabb idő alatt – pontos, kvantitatív meghatározás válik lehetővé.

84

4.4. Szűrővizsgálatok Új vegyületek vizsgálatakor célszerű először VRK-technikával „feltérképezni” a lehetséges szennyezéseket, mivel ezzel a módszerrel valamennyi komponens a szorbensen marad és detektálható. A technika kisebb hatékonysága és elválasztóképessége miatt azonban elképzelhető, hogy a felviteli helyen marad a komponensek egy része, vagy nem válnak el egymástól, ill. a főfolttól. A polaritás függvényében sávokra bonthatjuk a kromatogramot és ezeket a különböző polaritású sávokat a nagyobb hatékonyságú és elválasztóképességű OPLC-technikával tovább bonthatjuk. A rétegkromatográfiás módszerek specifikusságát növelheti a különböző előhívószerek alkalmazhatósága. HPLCvel pedig további komponenseket választhatunk el. A háromféle technika kiegészíti egymást eltérő szelektivitásuk és detektálási lehetőségeik miatt. Az OPLC-technika gyorsasága, nagy hatékonysága és jó elválasztóképessége miatt különösen

alkalmas

szűrővizsgálatokra,

vagy

előfuttatások

végzésére

a

HPLC

tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozásánál. Az eluensek összeállításához az oldószerek széles választéka áll rendelkezésre, hiszen az off-line detektálás következtében a közeli UV-tartományban elnyelő oldószerek is használhatók. Általánosan elmondható, hogy egy új szteroid anyagot célszerű különböző, széles polaritási tartományt átfogó futtató elegyekkel megvizsgálni, hogy valamennyi szennyezését detektálni tudjuk. Az eluenskomponensek megválasztásánál azonban ügyelnünk kell arra, hogy a kívánt eluenserősséget olyan komponensek elegyítésével érjük el, amelyek együttes használata nem okoz frontképződést. A norszteroidok vizsgálatánál ciklohexánt, illetve toluolt észterekkel és / vagy kloroformmal kevertem. Észterként leggyakrabban etil-, ill. butil-acetátot alkalmaztam. Apoláris komponensek szilikagél szorbensen történő elválasztására alkalmas elegyek: ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V) ciklohexán – butil-acetát – kloroform 90+12+2 (V/V) ciklohexán – butil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) Poláris komponensek elválasztására alkalmas eluenselegyek: toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V) ciklohexán – etil-acetát – kloroform 2+2+1 (V/V) ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)

85

Amennyiben meggyőződtünk róla, hogy nincs irreverzibilis adszorbció, élhetünk a többszörös kifejlesztés lehetőségével [63]. A többszörös kifejlesztésnél a foltok tömörödnek, ez megkönnyíti az értékelést. Túlfuttatást is alkalmazhatunk, ha már meggyőződtünk arról, hogy nincs olyan apoláris komponens, amely „lefutna” a szorbensről. 4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre

A szteroid-szennyezőket sorbaállíthatjuk polaritásuk függvényében. Ekkor a szteroidváz különböző szubsztituenseit kell elsősorban figyelembe venni. A leginkább poláris szubsztituensek a hidroxi- valamint a keto-csoportok. Kisebb polaritást adnak a molekulának az éterkötésben résztvevő oxigének, valamint az észterkötést tartalmazó csoportok. Legkevésbé polárisak az oxigént nem tartalmazó szubsztituensek. Gyakran azonos konstitúció mellett térszerkezetbeli különbség van a szennyezésmolekulák között. A szteroidvázhoz 17-es pozícióban kapcsolódó hidroxi-csoport és etinilcsoport esetében az etinil-csoport jellemzően α-helyzetű. Az epimer párja, a β-helyzetű etinil-csoport általában kevésbé poláris. A norszteroidok tipikus szennyezéseinek polaritási sora: 6β-OH > 6α-OH > 10-OH > 6-keto > Δ8(14) ≥ Δ9(11) ≥ Δ6 ≥ főkomponens RRF*:

0,0-0,3

0,2-0,5

0,8-1,0

1,0

főkomponens > 17-epi > telített A-gyűrűs származék > Δ5 > Δ5(10) > biszetinil** > dezoxo** RRF*:

1,0

1,0-1,2

1,1-1,6

5,0-7,0

* az adott főkomponensre vonatkoztatva ** az „etilsor” anyagaira jellemző szennyezések A szennyezések azonosítását segítheti, hogy savas előhívás után különböző színnel fluoreszkáló foltokként jelennek meg a szorbensen 366 nm-es fénnyel megvilágítva. A szteroidvázon többlet hidroxi-csoportot tartalmazó komponensek kénsavas előhívást követően élénk kék színűek. Ha az adott szennyező-molekulák további kettős kötést tartalmaznak (Δ8(14)-származékok) gyakran intenzív zöldes színnel fluoreszkálnak.

86

4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre

Különböző szteroid végtermékek elválasztására (60. ábra) alkalmaztam az eltérő erősségű eluenseket OPLC-technikával. A végtermékek kiválasztása a gyártóhely alapján történt. A cél olyan szűrőrendszer kidolgozása volt, amelynek segítségével az egy üzemben gyártott szteroidok esetleges keresztszennyezései gyorsan kimutathatók és azonosításuk egyszerűbbé válik. Az így szerzett tapasztalatok azonban felhasználhatók a hasonló szerkezetű új szteroid molekulák vizsgálatánál is. Az összesen húsz hatóanyagot egymás mellett, azonos szorbensen kromatografáltam az előzőekben ismertetett különböző erősségű eluensekkel.

O CH3

H3C

OH CH2

CH3

OH

H2C

CH

O

CH3

O

a, allilösztrenol

b, dezogesztrel

c, drospirenon

O

CH3

OH

CH3

O CH3

CH3

O

CH

CH3 NH

CH3 CH3

H CH3

CH O

O

H3C

HO

d, etinil-ösztradiol

O

e, etinodiol-diacetát

N H

f, finaszterid

O

H3C

OH

H3C

OH

CH3 O

O

O

g, gesztodén

O

h, levonorgesztrel

H3C

O

O

O CH2

H3C

CH3

j, nesztoron

i, nandrolon-dekanoát

CH3 OH

OH

CH

CH

HON

O

CH3

CH

CH

CH3

(CH2)8

k, 17-dezacetil-norgesztimét

O

l, noretiszteron 87

O

O

CH3 O

H3C

CH3

O

H3C

CH3

CH

CH

CH

HON

O

m, noretiszteron-acetát

O

n, norgesztimét CH3

OH

o, d,l-norgesztrel

OH

CH3 OH

CH3

CH3 O O

HO

p, oxandrolon

q, ösztradiol

O H3C

CH3

N+

H3C

O CH3 N

CH3

N

Br-

CH3

N+ CH3 Br-

O H3C

O

r, pipekurónium bromid O

O (CH2)4 CH3

O HO

CH3

O CH3

O OH

CH3

CH3 O H3C

O

s, prednizolon-21-kapronát

S O

t, spironolakton

60. ábra. A szűrővizsgálatoknál vizsgált szteroidok szerkezeti képletei A felvitel minden esetben a 60. ábrán szereplő betűjelzés szerint ABC-sorrendben történt, valamennyi komponensből 5-5 μg került a szorbensre és a kifejlesztési eluenstérfogat 4200 μl volt. A különböző erősségű futtatókkal végzett kísérletek kromatogramjait mutatom be a következő ábrákon (61-64. ábra).

88

61. ábra.

62. ábra.

254 nm

kénsavas előhívás után 366nm

a b cd ef gh i jk lmnopq rs t

a b cd ef gh i jk lmnopqr s t

Közepes erősségű futtató (1.) használata szteroidok elválasztására toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V)

254 nm

kénsavas előhívás után 366nm

a b cd ef gh i jk lmnopqr s t

a b cd ef g hi jkl mnopq rs t

Közepes erősségű futtató (2.) használata szteroidok elválasztására ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) 254 nm

a bcd ef gh ij k lmnopqr s t

63. ábra.

kénsavas előhívás után 366nm

a bc d efg h ij k lmnopq rs t

Nagy polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)

89

kénsavas előhívás után 366nm

254 nm

a bcd ef gh i j k lmnopq rst

a b cd ef gh i jk lmnopq rs t

64. ábra.

Kis polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V)

254 nm-es fényben, és kénsavas előhívást követően 366 nm-es fénnyel megvilágítva végeztem az értékelést. A finaszterid és a pipekurónium-bromid sajátos szerkezetük miatt ezzel a módszerrel nem voltak detektálhatók, más előhívási technikát kell használni az értékelésükhöz. Erre a célra a Dragendorff-reagenssel történő előhívás a megfelelő. A kapott kromatogramok alapján a vizsgált szteroidokat négy csoportba soroltam: 1. apoláris:

allilösztrenol, dezogesztrel, etinodiol-diacetát

2. közepesen poláris:

nandrolon-dekanoát, noretiszteron-acetát, etinil-ösztradiol, norgesztrel, levonorgesztrel, gesztodén

3. poláris:

norgesztimét,

noretiszteron,

17-dezacetil-norgesztimét,

ösztradiol, nesztoron 4. erősen poláris:

drospirenon,

oxandrolon,

finaszterid,

prednizolon-21-

kapronát, spironolakton, pipekurónium-bromid Az egyes szteroidok azonosításához nyújt segítséget a 20. táblázat, amelyben a különböző detektálási lehetőségeket, a kénsavas, ill. a Dragendorff-oldattal való előhívás utáni jellemző színeket tüntettem fel.

90

20. táblázat. A szűrővizsgálatba bevont szteroidok kromatográfiás és detektálási tulajdonságai polaritási csoport 1. 1. 1. 2. 2. 2. 2. 2. 3. 3. 3. 3. 3. 4. 4. 4. 4. 4. 4.

vizsgált szteroid

UV254

kénsavas előhívás után 366 nm

+ + +

sárgás kékesszürke sárgás

detektálhatóság (és szín) -

+

halványkék

+ (narancs)

+

piros

+ (rózsaszín)

+

piros

+ (rózsaszín)

+ + + + +

narancs kék szürkéssárga piros sárgás

+ (rózsaszín) + (narancs) + (kék) + (sötétbarna)

+

szürkéssárga

+ (narancs)

+ ++

halványzöld sárga

+ (narancs) + (narancs)

+

szürkéskék

(+) (narancs)

+ (+)

halványkék kékesszürke

(+) (narancs) + (narancs)

-

-

+ (narancs)

detektálhatóság b, dezogesztrel a, allilösztrenol e, etinodiol-diacetát i, nandrolon+ dekanoát m, noretiszteron+ acetát o, norgesztrel, + h, levonorgesztrel d, etinil-ösztradiol (+) g, gesztodén + n, norgesztimét + l, noretiszteron + j, nesztoron + k, 17-dezacetil+ norgesztimét q, ösztradiol (+) f, finaszterid (+) t, spironolakton + s, prednizolon-21+ kapronát p, oxandrolon c, drospirenon + r, pipekurónium bromid nem detektálható (+) rosszul detektálható + detektálható ++ intenzív jelet ad

Dragendorff

szín

A szteroid-hatóanyagok azonosítása a 65. ábrán látható folyamattal valósítható meg. Az ábrán aláhúzással jelölt végtermékek már elkülöníthetők egymástól, azonban azonosításukhoz még standard anyag mellett is el kell végezni az utolsó futtatást.

91

Közepes polaritású 1. futtató UV254, kénsavas előhívás UV366

UV254: + UV366: -

UV254: UV366: +

allilösztrenol, dezogesztrel, etinodiol-diacetát, oxandrolon

Dragendorff: +

finaszterid RF=0,03

oxandrolon RF=0,09

nem

UV254: UV366: -

UV254: + UV366: +

Dragendorff: + igen nandrolon-dekanoát RF=0,50 noretiszteron-acetát RF=0,34

RF >0,3 pipekurónium-bromid RF=0,00

nem

RF >0,6

igen

RF >0,6

Poláris futtató

UV254: (+) UV366: +

nem igen etinodiol-diacetát RF=0,32 allilösztrenol RF=0,49 dezogesztrel RF=0,51

etinil-ösztradiol RF=0,70

Apoláris futtató nem

RF >0,4 igen

drospirenon RF=0,06

UV254: (+) UV366: +

UV254: + UV366: +

spironolakton RF=0,11 prednizolon-21-kapronát RF=0,16 nesztoron RF=0,18 noretiszteron RF=0,30

Kettős foltot ad?

igen

norgesztimét RF, syn=0,43 és RF, anti=0,53 17-dezacetil-norgesztimét RF, syn=0,36 és RF, anti=0,54

nem Közepes polaritású 2. futtató

ösztradiol RF=0,18 gesztodén RF=0,28 (levo)norgesztrel RF=0,32

65. ábra. Folyamatábra a vizsgált 20 szteroid azonosításához 92

4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál

Abban az esetben, ha a szteroid hatóanyagot nem keresztszennyezésként keressük, hanem azt a készüléktisztításnál mint egykomponensű szennyezőt kell kimutatnunk, alkalmas lehet az elővizsgálatra a futtatás nélküli foltvizsgálat. A különböző előhívási és detektálási eljárásokkal kapott jellegzetes színű foltok segítik a gyors azonosítást. A 66. ábrán mutatom be az így kapott „kromatogramokat”. A felviteli sorrend jelzése megfelel a 60. ábrán szereplő betűjelzésnek. Előhívás: Dragendorff-reagenssel Detektálás: látható, fehér fényben

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

l

m

n

o

p

q

r

s

t

Előhívás: kénsavas reagenssel, 120°C, 2 min Detektálás: 366 nm-en

Előhívás: Detektálás: 254 nm-en

a

b

c

d

e

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

f

g

h

i

j

k

l

m

n

o

k

l

m

n

o

p

q

r

s

t

p

q

r

s

t

66. ábra. Foltvizsgálat különböző detektálással A futtatás nélküli felvitelek esetén kimutatási határ vizsgálatot végeztem a húsz vizsgált szteroidra. Valamennyi szteroidból tíz különböző mennyiséget vittem fel a szorbensre a 0,5 ng – 10 μg tartományban. Kimutatási határként a legkisebb, vizuálisan detektálható mennyiséget fogadtam el. A finaszterid és a pipekurónium-bromid esetében

93

Dragendorff-reagenssel hívtam elő a különböző mennyiségű anyagot a szorbensen, a többi esetben 10% kénsavas etanolt alkalmaztam előhívószerként. A megállapított kimutatási határértékeket a 21. táblázatban foglaltam össze. 21. táblázat. Kimutatási határértékek futtatás nélküli foltvizsgálatnál jelölés anyag neve a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t n. d. *

Allilösztrenol Dezogesztrel Drospirenon Etinil-ösztradiol Etinodiol-diacetát Finaszterid Gesztodén Levonorgesztrel Nandrolon-dekanoát Nesztoron 17-dezacetil-norgesztimét Noretiszteron Noretiszteron-acetát Norgesztimét Norgesztrel Oxandrolon Ösztradiol Pipekurónium-bromid Prednizolon-21-kapronát Spironolakton nem detektálható mérés nélkül

előhívás előtt, UV254 n. d. n. d. 10 ng 100 ng n. d. 100 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 50 ng 50 ng 10 ng 10 ng n. d. 100 ng n. d. 100 ng 10 ng

kénsavas előhívással, UV366 5 ng 1 ng 1 ng 1 ng 1 ng n. d. 1 ng 1 ng 5 ng 1 ng 5 ng 5 ng 5 ng 5 ng 5 ng 5 ng 1 ng n. d. 5 ng 0,5 ng

Dragendorffreagenssel, 4200 K * * * * * 50 ng * * * * * * * * * * * 10 ng * *

A kimutatási határértékek kénsavas előhívással leggyakrabban 1 – 5 ng-nak bizonyultak. A spironolakton esetében azonban még ennél kisebb mennyiség is detektálható volt a szorbensen. A Dragendorff-reagenssel előhívott vegyületekre viszont magasabb volt a kimutatási határérték (10-50 ng). Fentiek alapján megállapítottam, hogy a „pontkromatogram” rendkívül érzékeny kimutatást tesz lehetővé, ezért alkalmas készüléktisztítás utáni ellenőrző vizsgálatra.

94

5. ÖSSZEFOGLALÁS

Munkám során a norszteroid-szintézis „metilsorában” keletkező intermedierek szennyezésprofiljának felderítésével foglalkoztam. Gyors tisztaságvizsgálati eljárásokat dolgoztam ki túlnyomásos rétegkromatográfiás módszerrel a nandrolon, a dienoléter, az ösztradiol-metiléter-acetát

és

a

molon

(metil-szeko-olon)

vizsgálatára.

A

fenti

intermedierek esetében értékeltem a más kromatográfiás technikával kapott eredményeket is. A nandrolon két fő szennyezését – az 5α-4,5-dihidro-nandrolont és a nandrolon Δ5(10)izomert – csak OPLC-vel sikerült kimutatni egymás mellett. Ez a két közeli szerkezetű

molekula VRK-val nem válaszható el egymástól, ultraibolya detektálású HPLC-vel az 5α4,5-dihidro-nandrolon nem mutatható ki, GC-vel megfelelően elválaszthatók, de a

főkomponens a vizsgálat során Δ5(10)-izomerre bomlik, így az eredmény nem megbízható. A dienoléter esetében az általam kidolgozott OPLC-eljárással minden ismert szennyezés szelektíven értékelhető, az ösztradiol-metiléter-acetátnál pedig a módszerek kombinációja vezetett eredményre. A molon esetében OPLC-vel elválasztottam a fő szennyezést a főkomponenstől, tisztáztam a főszennyezés keletkezési körülményeit, és elősegítettem annak azonosítását. Optimalizáltam és összehasonlítottam a szteroidoknál leggyakrabban használt savas előhívó módszereket. Különböző előhívó reagensek esetében a rövid ideig magasabb hőmérsékleten történő előhívás érzékenyebb, míg az alacsonyabb hőmérsékleten hosszabb ideig történő hevítés stabilabb, robosztusabb előhívást eredményez. Különböző szteroid alapanyagokra kifejlesztett VRK, OPLC és HPLC tisztaságvizsgálati

módszerek

teljesítőképességét

vizsgáltam

és

hasonlítottam

össze.

Megállapítottam, hogy az OPLC és a HPLC módszer hatékonysága közeli, a VRK ettől messze elmaradt. A szteroidsor tipikus szennyezéseire polaritási sort állítottam fel. Az egy üzem által gyártott szteroidokra olyan szűrővizsgálatot dolgoztam ki, amely lehetővé teszi az esetleges keresztszennyezések gyors vizsgálatát és azonosítását az adott vegyületcsoportra. Kifejlesztés nélküli pont-vizsgálati módszert dolgoztam ki, amely alkalmas lehet a készüléktisztítás során a mosás hatékonyságának ellenőrzésére. Munkám tapasztalatai alapján a gyógyszeranalitikában a rétegkromatográfiás technika, elsősorban az OPLC, a hatóságok által javasolt és elvárt HPLC módszer mellett a jövőben is jól használható szteroidok tisztaságvizsgálatára, előzetes vizsgálatként, új anyagok

szennyezésprofiljának

felderítésére

és

igazolására,

valamint

gyors

szűrővizsgálatok elvégzésére.

95

6. SUMMARY

Elucidation of impurity profiles of intermediates originated in the „methyl line” of the norsteroid synthesis was the object of my study. I have worked out rapid purity test procedures by overpressured thin layer chromatographic method for examining nandrolone, dienolether, estradiol methylether acetate and molone (methyl-seco-olone). In the case

of the above intermediates I have evaluated the results obtained with other chromatographic techniques, too. Simultaneous detection of 5α-4,5-dihydro-nandrolone and nandrolone Δ5(10)-isomer, the two main impurities of nandrolone, was successful only by

OPLC. These two molecules of similar structure cannot be separated from each other by TLC, 5α-4,5-dihydro-nandrolone cannot be determined by HPLC with UV detection, GC can separate them adequately but the principal component decomposes to Δ5(10)-isomer during the examination, thus the result is not reliable. Concerning dienolether the OPLC procedure worked out by me each known impurity can be evaluated selectively, and regarding estradiol methylether acetate the combination of the methods was successful. In the case of molone I have separated the main impurity from the principal component by OPLC, I have

cleared up the arising conditions of the main impurity and promoted its identification. I have optimized and compared the most often used acidic visualisation methods for steroids. Visualisation at higher temperatures lasting for shorter periods is more sensitive however heating for longer periods at lower temperatures results a more stable, robust visualisation comparing the different visualizing reagents. I have studied and compared the efficiencies of TLC, OPLC and HPLC purity test methods developed for different steroid active substances. I have established that the efficacies of OPLC and HPLC methods are similar, that of TLC has been far inferior. I have constructed a polarity line for the typical impurities of the steroid line. I have worked out a screening test for the steroids manufactured by the same plant which enables rapid examinations and identifications of the possible cross contaminants for the given compound group. I have worked out a point examination method without development which can be suitable for checking the effectiveness of the washing during the cleaning of the equipment. On the basis of my working experiences the thin layer chromatographic techniques, first of all the OPLC, besides the HPLC method proposed and expected by the authorities, can also be used well in the future for the purity tests of steroids in the pharmaceutical analysis as preliminary test, detecting and proving the impurity profiles of new substances, as well as performing rapid screening tests.

96

7. IRODALOMJEGYZÉK

1

S. Görög and Gy. Szász, Analysis of steroid hormone drugs, Akadémiai Kiadó,

Budapest (1978) p.p. 48-61 2

Knoll J., Gyógyszertan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1987) 599-630

3

Donáth T., Anatómia – élettan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1996) 245-246

4

Kajtár M., Természetes szénvegyületek kémiája (Szerves kémia – III), Budapest,

ELTE egyetemi jegyzet, évszám nélkül 5

A.J. Birch and S.M. Mukherji, J. Chem. Soc., (1949) 2351; (1950) 867

6

Ananchenko, S.N.; Torgov, I.V., Tetrahedron 18 (1963) 1335

7

Csontos J., Fekete Gy, Kováts T., Lőw M., Pillich L., Takács I., A Richter Gedeon

Rt. 100 éves története, Medicina Könyvkiadó (2001) 8

Mahó S., személyes közlés, 2003.

9

S. Görög, Analytical Sci. 20 (2004) 767-782

10

Tyihák E., A rétegkromatográfia zsebkönyve, Műszaki könyvkiadó, Budapest

(1979) 11

J. Sherma, B. Fried (eds.), Handbook of Thin-Layer Chromatography 3rd ed.,

Marcel Dekker Inc., New York – Basel – Hong Kong (2003) 12

P. D. Sethi, High Performance Thin-Layer Chromatography. Quantitative Analysis

of Pharmaceutical Formulations, CBS, New Delhi (1996) 13

C. F. Poole, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 963-984

14

E. Reich, A: Schibli, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 438-443

15

K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, in: S. Görög (ed.), Identification and Determination of

Impurities in Drugs, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands (2000) p.p. 146-182 16

K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, in: Sz. Nyiredy (ed.), Planar

Chromatography – A Retrospective View for the Third Millennium, Springer, Hungary (2001) p.p. 585-607 17

Sz. Nyiredy, K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, G. Szepesi, in: J. Sherma, B. Fried (eds.),

Handbook of Thin-Layer Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York (2003) p.p. 807-863 18

K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 778-789

19

Fekete J., Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft.,

Budapest 2006 20

Balla J., A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., 1997 97

21

F. Dravetz, E. Francsics-Czinege, P. Horváth, 8th Int. Meeting Recent

Developments in Pharmaceutical Analysis (RDPA ’99), 29th June-3rd July, 1999, Rome 22

E. Tyihák, E. Mincsovics, H. Kalász, J. Chromatogr., 174 (1979) 75-81

23

E. Mincsovics, E. Tyihák, H. Kalász, J. Chromatogr., 191 (1980) 293-300

24

E. Mincsovics, M. Garami, L. Kecskés, B. Tapa, Z. Végh, Gy. Kátay, E. Tyihák, J.

AOAC Int. 82 (1999) 587-598 25

E. Tyihák, E. Mincsovics, in: Sz. Nyiredy (Editor), Planar Chromatography – A

Retrospective View for the Third Millenium, Springer, Budapest, Hungary (2001) 137-176 26

Sz. Nyiredy, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 985-

27

E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Handbook of Thin Layer

Chromatography Chapter 7 Marcel Dekker, NewYork, 1996 28

E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Overpressured Layer

Chromatography, in: J. Sherma, B. Fried (eds), Handbook of Thin-LayerChromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York, USA (2003) 175-205 29

Tyihák E., személyes közlés

30

K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, J. Planar Chromatogr. 6 (1993) 256-258

31

A. Nagy-Turák, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 8 (1995) 188-

191 32

K. Ferenczi-Fodor, S. Mahó, S. Pap-Sziklay, I. Török, L. Borka, Pharmeuropa Vol. 9 No. 4 (1997)

33

Z. Szikszay, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11 (1998) 428-432

34

A. Wiszkidenszky, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11

(1998) 463-466 35

A. Kassai, A. Szécsi, A. Koppány, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar

Chromatogr. 13 (2000) 30-32 36

Z. Katona, L. Vincze, Z. Végh, Á. Trompler, K. Ferenczi-Fodor, J. Pharm. Biomed.

Anal. 22 (2000) 349-353 37

S. Görög Anal. Bioanal. Chem. 377 (2003) 852-862

38

ICH guideline Q3A(R), Impurities Testing Guideline: Impurities in New Drug Substances, CPMP/ICH/2737/99

39

ICH guideline Q3B(R), Impurities in New Drug Products, CPMP/ICH/2738/99

98

40

ICH guideline Q6A, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances, CPMP/ICH/367/96 corr

41

The United States Pharmacopeia, 30th ed., <466> Ordinary Impurities, p. 170, USP Convention, Rockville, MD 20852, USA

42

European Pharmacopeia 5th ed., 07/2006:2034 Substances for Pharmaceutical Use, p. 4151, Council of Europe, Strasbourg, France

43

S. Görög, M. Babják, G. Balogh, J. Brlik, F. Dravecz, M. Gazdag, P. Horváth, A. Laukó, K. Varga, J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) 511-525

44

B. Bagócsi, D. Fábián, A. Laukó, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor,

J. Planar Chromatogr. 15 (2002) 252-257 45

B. Bagócsi, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.), Proc. Int.

Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2004, Visegrád, Hungary, May 2004, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 215-219 46

B. Bagócsi, A. Laukó, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),

Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2003, Budapest, Hungary, June 2003, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 185189 47

Dravecz F., személyes közlés, 2003

48

Szántay Cs., személyes közlés, 2003

49

Stahl E., Thin-Layer Chromatography - A Laboratory Handbook, 2nd ed., George

Allen & Unwin Ltd., London, Springer-Verlag, Berlin, (1969) 50

The United States Pharmacopeia, 30th ed. <466> Ordinary Impurities, Key for Visualization Techniques (5) Acid spray, p. 170, USP Convention, Rockville, MD 20852, USA

51

European Pharmacopeia 5th ed., 4.1.1. Reagents, Sulphuric acid, alcoholic solution of, 1086803, 04/2006:40101, p. 3805, Council of Europe, Strasbourg, France

52

European Pharmacopeia 5th ed., General Monographs 01/2005:0234 Norethisterone, p. 2116, Council of Europe, Strasbourg, France

53

The United States Pharmacopeia, 29th ed. Monographs Norethindrone, USP Convention, Rockville, MD 20852, USA, p. 1552

54

P. K. Zarzycki, M. A. Bartoszuk, A. I. Radziwon, J. Planar Chromatogr., 19 (2006)

52-57

99

55

European Pharmacopoeia 5th ed. 2.2.46. Chromatographic separation techniques, Council of Europe, Strasbourg, France (2005) 69-73

56

Bagócsi B., Magyar Kémikusok Egyesülete – Fiatal Kémikusok Előadóülése, 1999.

nov. 23. Budapest 57

B. Bagócsi, D. Fábián, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, 11th Int.

Symp. Pharm. Biomed. Anal., 14-18 May 2000, Basel, Switzerland, Abstracts, P019 58

B. Bagócsi, G. Rippel, Z. Végh, S. Mahó, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),

Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2000, Lillafüred, Hungary, June 2000, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp.151-156 59

B. Bagócsi, G. Rippel, M. Mezei, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 16

(2003) 359-362 60

European Pharmacopoeia 5.5, General Monographs 04/2006:0234 Norethisterone, p. 4278, Council of Europe, Strasbourg, France

61

Kozma J. személyes közlés, 2006.

62

Kozma J., Bagócsi B., Ferencziné Fodor K., Elválasztástechnikai Ankét 2006,

Budapest 63

K. Ferenczi-Fodor, A. Laukó, A. Wiszkidenszky, Z. Végh, K. Újszászy, J. Planar

Chromatogr. 12 (1999) 30-37

100