A β-amyloid progresszió hatása a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra - a szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepe Doktori (Ph.D.) értekezés
Völgyi Katalin Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológia Doktori Iskola, Molekuláris sejt- és neurobiológiai doktori program
A Doktori iskola vezetője: Dr. Erdei Anna Programvezető: Dr. Sass Miklós Témavezető: Dr. Juhász Gábor
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Proteomikai Laboratórium Budapest 2015
Rövi dítésjegyzék ...................................................................................................................................................................... 4 1. B EVEZET ÉS ....................................................................................................................................................................... 6 1.1. A neurodegeneratí v betegségek .............................................................................................................................. 7 1.2. Az Alzhei mer-kór patomechanizmusa ................................................................................................................. 9 1.3. Az Alzhei mer-kór altí pusai.................................................................................................................................... 11 1.4. Az APP hasítási folyamata: az Aβ és más hasítási termékek képződése................................................... 13 1.5. A β-amyl oi d aggregációja ...................................................................................................................................... 16 1.6. Az Alzheimer-kór kutatásában használt emlős modelleken elért legfőbb eredmények és felhasználhatóságuk a gyógyszerkutatás ban ............................................................................................................ 17 1.6.1. Spontán modellek ................................................................................................................................................17 1.6.2. Farmakológ iai, kémiai és lézió-indukált rágcsáló modellek........................................................................18 1.6.3. A z Aβ-kezelt rágcsáló modellek.......................................................................................................................19 1.6.4. Transzgenikus rágcsáló modellek.....................................................................................................................22 1.6.4.1. Transzgenikus egér modellek....................................................................................................................22 1.6.4.2. Transzgenikus patkány modellek .............................................................................................................26 1.7. Az Alzhei mer-kór hi potézisei ................................................................................................................................ 28 1.8. A mi tokondriumok ál tal ános jellemzése ............................................................................................................ 29 1.8.1. A mitokondriu mok felép ítése ............................................................................................................................29 1.8.2. A mitokondriális genom.....................................................................................................................................30 1.8.3. A mitokondriális proteom ..................................................................................................................................31 1.9. A β-amyl oi d által okozott mitokondriális el változások .................................................................................. 33 1.9.1. A β -amylo id mitokondriális lo kalizációja és legfőbb fehérjeinterakció i...................................................33 1.9.2. A mitokondriális energiametabolizmus Alzheimer -kórban .........................................................................34 1.9.3. A mitokondriális o xidatív stressz Alzheimer-kórban....................................................................................36 1.9.4. Csökkent mitokondriális dinamika és transzport Alzheimer-kórban .........................................................37 1.9.4.1. M itokondriális dinamika ............................................................................................................................37 1.9.4.2. M itokondriális transzport...........................................................................................................................40 1.9.6. A szinaptikus mitokondriu mok érintettsége Alzheimer-kórban..................................................................43 1.10. A mitokondriumok proteomikai kutatása Alzhei mer-kórban .................................................................. 45 2. CÉLKIT ŰZ ÉS EK ............................................................................................................................................................ 46 3. ANYAGOK, MÓDS ZEREK ......................................................................................................................................... 48 3.1. Kül önböző Aβ aggregátumok fiziológiai hatásának összehasonlítása ....................................................... 48 3.1.1. Ho mogén aggregáltsági fokú amylo id oldatok előállítása ...........................................................................48 3.1.2. A z aggregációs fok ellenőrzése a kísérletben alkalmazott oldatokban ......................................................49 3.1.2.1. Ato merő mikroszkópia (A FM) .................................................................................................................49 3.1.2.2. Thioflavin-T fluoreszcencia ......................................................................................................................49 3.1.3. Patkány hippocampális populációs tüzelésének vizsgálata..........................................................................50 3.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra, a szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepe .................................................................................................... 52 3.2.1. A mitokondriális kísérletekben felhasznált állat modellek ...........................................................................52 3.2.1.1. Balb/c egérmodell .......................................................................................................................................52 3.2.1.2. APP/PS1 egérmodell ..................................................................................................................................52 3.2.2. A β -amylo id progresszió kimutatása 3, 6, illetve 9 hónapos egéragyban..................................................52 3.2.3. Szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriu mo k izolálása.........................................................................53 3.2.4. A mitokondriu m minták t isztaságának ellenőrzése .......................................................................................54 3.2.4.1. Elektron mikroszkópia ................................................................................................................................54 3.2.4.2. Fluoreszcencia akt ivált sejt analízis és szortolás (FA CS) ....................................................................55
2
3.2.5. Proteo mikai analízis kétdimen ziós differenciál gélelektroforézissel (2D-DIGE) ....................................55 3.2.6. Preparatív kétdimen ziós gélelekt roforézis ......................................................................................................58 3.2.7. Fehérjeazonosítás tömegspektrometriával (nanoUHPLC-MS/MS) ...........................................................58 3.2.8. Funkcionális csoportosítás .................................................................................................................................59 3.2.9. A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása Western blot technikával (WB) ......................................60 3.2.10. A Sucla2, Idh3a és C1qbp fehérjék lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata ..........................61 3.2.11. A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációjának immun-elektron mikroszkópiai v izsgálata......................62 3.2.12. Az APP/PS1 – B6 modellek összehasonlítása során kapott mitokondriális fehérjeváltozások bioinformat ikai analízise ...............................................................................................................................................63 3.2.13. A mitokondriális oxigénfogyasztás összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban .................................64 3.2.14. A mitokondriális H2 O2 termelés összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban ......................................64 4. EREDMÉNYEK ............................................................................................................................................................... 65 4.1. A kül önböző Aβ aggregátumok sejtek excitabilitására gyakorolt fiziológiai hatásának eredményei 65 4.1.1. A z Aβ oldatok in vitro karakterizálása ............................................................................................................65 4.1.2. Elektrofizio lógiai ered mények ..........................................................................................................................66 4.2. A szinaptikus én nem szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának eredményei 68 4.2.1. A mitokondriu m preparátu mok t isztaságának igazolása elektron mikroszkópiával .................................68 4.2.3. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriu mo k közötti fehérjekülönbségek ....................................70 4.2.4. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása ..............................................................................................74 4.2.5. A szignifikánsan megváltozott fehérjék validálása .......................................................................................77 4.3. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt hatásának eredményei ......................................................................................................................................................................... 80 4.3.1. A z Aβ plakkok eloszlása ....................................................................................................................................80 4.2.2. A mitokondriu m minták o xigén fogyasztásának összehasonlítása .............................................................81 4.2.3. A mitokondriu m minták H2 O2 termelődésének összehasonlítása ...............................................................81 4.2.5. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása ..............................................................................................89 4.2.7. A z APP/PS1 és B6 egerek kö zötti mitokondriális fehérjeválto zások bioinformatikai analízise ...........92 4.2.8. A Htra2 és Ethe1 fehérjeválto zások validálása Western blottal..................................................................94 5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA ............................................................................................................................ 95 5.1. A szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepének molekuláris hátterének vizsgálata - a szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlítása........................................... 95 5.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra – 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának és oxidatív metabolizmusának összehasonlítása. ........................................................................................................................102 6. KONKLÚZIÓ..................................................................................................................................................................109 Irodalomjegyzék ..................................................................................................................................................................112 Összefoglalás.........................................................................................................................................................................134 Summary ...............................................................................................................................................................................135 Köszönetnyil vánítás............................................................................................................................................................136 Publikációs lista ...................................................................................................................................................................137
3
Rövidítésjegyzék Aβ:
β-amyloid
ABAD
Aß kötő alkohol dehidrogenáz (Aß-binding alcohol dehydrogenase)
AICD:
APP intracelluláris domén
AK:
Alzheimer-kór
ALS:
amiotrófiás laterálszklerózis
APP:
amyloid prekurzor protein
BACE:
β-szekretáz, β-site APP-cleaving enzyme
CK:
citrát-kör / citromsav-ciklus / trikarbonsav-ciklus
CTFα:
APP C-terminális fragmens
CTFβ:
membrán-kötött C-terminális fragmens
CypD:
ciklofilin D (cyclophilin D)
Drp1:
dinaminszerű protein 1 (dynamin-related protein 1)
Ethe1:
perszulfid
dioxigenáz Ethe1
(persulfide dioxygenase ETHE1, ethylmalonic
encephalopathy protein 1, hepatoma subtracted clone one protein, sulfur dioxygenase ETHE1) ER:
endoplazmatikus retikulum
ETL:
elektrontranszportlánc
FDG-PET:
fluor-18-dezoxi- glükóz pozitronemissziós tomográfia
Fis1
mitokondriális fission 1 fehérje (mitochondrial fission 1 protein)
HK:
Huntington-kór
Htra2
szerin proteáz Htra2 (serine protease HTRA2)
iAβ:
intracelluláris β-amyloid
αKGDH:
α-ketoglutarát dehidrogenáz komplex
MAM:
mitokondrium asszociált ER membrán
Sod2:
Mn szuperoxid dizmutáz / szuperoxid dizmutáz 2
MAPK:
mitogén-aktivált protein kináz
MCI:
enyhe kognitív zavar (mild cognitive impairment)
MDH:
malát dehidrogenáz komplex
Mfn1
mitofuzin-1
Mfn2
mitofuzin-2
mMP:
mitokondriális membrán potenciál
MRI:
mágneses rezonancia képalkotás (magnetic resonance imaging)
4
mtDNS:
mitokondriális DNS
NFK:
neurofibrilláris köteg (neurofibrillar tangle)
nsMito:
nem-szinaptikus mitokondrium
Opa1:
optikus atrófia fehérje 1
PAM:
prekurzor fehérje transzlokáz asszociált motorfehérje (preprotein translocaseassociated motor)
PDH:
piruvát dehidrogenáz komplex
PK:
Parkinson-kór
PreP
preszekvencia proteáz
PS1:
preszenilin 1
PS2:
preszenilin 2
ROS:
oxigén eredetű szabadgyökök, reaktív oxigén fajták (reactive oxygen species)
sAPPα:
szolubilis α APP fragmens
sAPPβ:
szolubilis β APP fragmens
ς1R:
ς-1 receptor
SDH:
szukcinát dehidrogenáz
sMito:
szinaptikus mitokondrium
SPECT:
egyfotonos emissziós computer tomográfia (single photon emission computed tomography)
Snca:
α-szinuklein (α-synuclein)
TIM:
belső membrán transzlokációs komplex (translocase of the inner membrane)
TOM:
külső membrán transzlokáz (translocase of the outer membrane)
UPR:
hibás konformációjú fehérje válasz (unfolded protein response)
Vdac1:
feszültségfüggő anion csatorna 1 (voltage-dependent anion channel 1)
5
1. BEVEZETÉS Az
(AK)
Alzheimer-kór
egy
progresszív
neurodegeneratív
betegség,
mely
kialakulásának első lépései ismeretlenek, a kórképek megjelenésekor a betegség már előrehaladott állapotú. Az AK-t megelőző állapot az ún. enyhe kognitív zavar (mild cognitive impairment, MCI) nehezen definiálható és nem mindig vezet AK-hoz. Az AK tünetei a kor előrehaladtával kialakuló
spontán öregedési demencia felgyorsulásának
emberben az AK és a demencia határai összemosódnak.
is tekinthetőek,
Mindezek miatt szükség lenne
nagyon korai, még a tünetek megjelenése előtt kimutatható, diagnosztikus értékű markerek illetve terápiás molekuláris célpontok feltárására. Kutatási munkánk ebbe a trendbe csatolható be.
Az AK
első
diagnosztizálható
tünete
a fluor-18-dezoxi-glükóz pozitronemissziós
tomográfia (FDG-PET) képalkotó eljárással mért anyagcsere csökkenés az agyban (Mosconi és
mtsai.,
2007).
Ebből
kiindulva
a
neurodegeneratív
betegségekben
bekövetkező
mitokondriális anyagcsere változások megismerésére számos kutatás irányul (Moreira és mtsai., 2010; Reddy és Reddy, 2011). Az eddigi AK modellek kísérleti eredményei (Eckert és mtsai., 2008; Chou és mtsai., 2011), illetve a humán AK adatok egyértelműen igazolják, hogy a mitokondriális anyagcsere, a mitokondriumokban folyó oxigén eredetű szabadgyök (ROS) képződés
jelentősen
megváltozik
AK
során,
ami
a
mitokondriumok
molekuláris
átalakulásához vezethet (Chen és Yan, 2007). Ismertek olyan mitokondriális fehérjék is, melyekhez az AK-ra jellemző kóros konformációjú β-amyloid (Aβ) fehérje nagy affinitással kötődik (Olah és mtsai., 2011; Pagani és mtsai., 2011), így közvetlenül befolyásolja azokat. Az AK korai szakaszának lehetséges molekuláris mechanizmusára tehát egyre elfogadottabb elmélet az AK mitokondriális hipotézise (Swerdlow és mtsai., 2004). A mitokondriumok molekuláris felépítése függ a környezetüktől illetve a sejten belüli pozíciójuktól (Johnson és mtsai., 2007). A különbségek oka a különböző sejtrégiók eltérő metabolikus igénye. Az idegrendszerben energetikailag kitüntetetten magas anyagcsere igényű a szinapszis, amit jelez az a tény, hogy a szinaptikus régióban nagy számban találhatóak mitokondriumok igen kis térfogatban. A szinaptikus mitokondriumok neurodegeneratív és pszichiátriai betegségekben való
érintettsége
(Vos és mtsai., 2010) indokolttá teszi a részletesebb molekuláris
megismerésükre irányuló kutatásokat. AK-ban a szinapszisok száma csökken és kimutathatók a szinaptikus működés zavarai (Marcello és mtsai., 2012). A tanulási zavarok egyfelől a kevesebb szinapszisnak, másfelől a szinaptikus plaszticitás csökkenésének tudhatóak be (Selkoe,
2008).
A
dolgozat
munkahipotézisének
alapja
tehát,
hogy
a
szinaptikus
mitokondriumokban nagyon korai, akár funkcionálisan kompenzált változások alakulhatnak
6
ki az AK-t megelőző MCI kezdeti fázisában molekuláris szinten. A változások oka az Aβ nagy affinitású kötődése a szinapszis egyes fehérjéihez, melynek hatására bekövetkező expressziós változásoknak a szinaptikus proteomban meg kell jelenniük. Feltételezzük, hogy a proteomikai változások funkcionális következménnyel járhatnak, továbbá kialakulásuk időben változó lehet, hiszen a korai hibákat a mitokondriális protein szintézis kompenzálni próbálja. Úgy gondoljuk, hogy mivel a szinaptikus elektrogenezis energetikai kiszolgálása elsőbbséget élvez a szinaptikus régió metabolikus szabályozásában, a kezdeti, talán még megfordítható változások között értékes terápiás célpontok lehetnek. A kísérleti munkánkat erre a gondolatra építettük fel.
1.1. A neurodegeneratív betegségek A korai tünetek halálos
kimenetelű
megjelenésétől fokozatosan súlyosbodó, végül elkerülhetetlenül
neurodegeneratív
betegségektől
emberek
milliói
szenvednek.
Megjelenésük általában az élet késői szakaszaira tehető, így a napjainkban tapasztalható átlagéletkor-növekedés a betegségben érintett emberek számának gyors növekedését vetíti előre. A neurodegeneratív betegségek letalitása jelenleg magasabb, mint a legtöbb daganatos betegségé. A betegek ápolása hatalmas pszichés, testi és anyagi terhet jelent a társadalom számára (Thompson és mtsai., 2007). Neurodegeneratív betegségeknek összefoglaló néven azokat a kórképeket nevezzük, melyekben az elsődleges patológiás elváltozás a központi idegrendszer specifikus területein az idegsejtek előrehaladott, a fiziológiás mértéket jóval meghaladó szelektív pusztulása. Klinikai és neuropatológiai szempontból igen heterogén betegségcsoport, mely sok esetben kevert tüneteket mutat. A rendellenes fehérjefeltekeredés a legtöbb neurodegeneratív betegség velejárója, ilyenek az AK, Parkinson-kór (PK), Huntington-kór (HK), Lewy-testes demencia, Pick demencia, az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), prion betegségek (Creutzfeldt-Jacob demencia
emberben,
„scrapie”
bárányban
és
a
szivacsos
agysorvadás
marhában),
frontotemporális demencia és Pick-betegség. Molekuláris szinten valamennyi kórkép hátterében az áll, hogy a sejtek fiziológiás funkciójú fehérjéinek natív konformációja megváltozik, mely változás következményeként aggregációra fokozottan hajlamos, részlegesen vagy teljesen proteáz rezisztens, patológiás hatású peptidek halmozódnak fel (Kovács, 2014). Ezeket a betegségeket gyűjtőnéven fehérjekonformációs
betegségeknek
nevezzük.
7
A
fehérjeaggregáció
következtében
extracelluláris plakkok (AK), intracelluláris lerakódások (AK, PK, Lewy-testes demencia) vagy akár intranukleáris aggregátumok is kialakulhatnak. A neurodegeneratív betegségek osztályozása leginkább fehérje-alapú. Az 1. táblázat a sporadikus
neurodegeneratív
betegségek
osztályozását,
és
a
hátterében
álló
hibás
konformációjú fehérjéket mutatja be (Völgyi és mtsai., 2015a). NEURODEGENERATÍV BETEGSÉG
FEHÉRJE-AGGREGÁTUM β-amiloid (plakkok) tau (neurofibrilláris kötegek)
1. Alzheimer-kór, AK
α-szinuklein TDP-43
2. Parkinson-kór, PK
α-szinuklein / ubikvitin
5. Huntington-kór, HK
poli-glutamin / ubikvitin
3. Lewy-testes demencia
α-szinuklein
8. Amiotróf laterál szklerózis, ALS
ubikvitin
6. Prion-betegség (Creutzfeld-Jacob kór)
prion protein
4. Frontotemporális demencia (FTDP-17)
tau (Pick-testek)
7. Pick-betegség
tau (Pick-testek)
1. táblázat A
konformációs
neurodegeneratív
betegségek és
a
betegség
hátterében
álló
kóros
fehérjeaggregátumok (Völgyi és mtsai., 2015a).
A neurodegeneratív betegségekre jellemző hibás konformációjú fehérjék gyakran átfednek (Sambamurti és mtsai., 2011). Habár az AK és PK klinikai és patológiai szempontból jól elkülöníthető, számos közös mechanizmus jellemzi őket (Xie és mtsai., 2014). Az AK-os betegek 50-60%-ban kóros konformációjú α-szinuklein (Snca) is kimutatható az agyban, habár az α-szinuklein aggregátumokból stabilizálódó Lewy-test zárványok a PK és a Lewy-testes demencia legfőbb patológiai elváltozásai (Kim és mtsai., 2014). Másrészről számos adat igazolja, hogy az AK patológiájának több aspektusa megfigyelhető PK-os és Lewy-testes demenciában szenvedő betegekben is (Irwin és mtsai., 2013). A Lewy-testes demencia az AK és PK közötti átmenetet mutató betegség, melyet klinikai képalkató eljárások eredményei és neurokémiai adatok igazolnak (Schade és mtsai., 2014). A hibásan feltekeredő fehérjék kialakulása és felhalmozódása igazolja, hogy az endoplazmatikus jelentős
szerepet
feltekeredés
és
retikulum (ER) játszanak
a
által meghatározott fehérjefeltekeredés és neurodegeneratív
az ER-stressz tehát
szoros
betegségek
összefüggésben
patológiájában. állnak.
kontrollálás A
hibás
A leggyakoribb
neurodegeneratív betegségeket (AK, PK, HK, ALS, prion betegségek) az ER-stressz és a
8
szerkezet nélküli, vagy hibásan feltekeredett fehérje-válasz (”Unfolded Protein Response” (UPR)) alapján kategorizálják (Kim és mtsai., 2008). Az UPR az ER-nek egy adaptív stressz válasza, amit az ER-ben hibásan feltekeredett fehérjék felhalmozódása vált ki. Az UPR egy túlélési válasz, mely során a sejt megpróbálja csökkenteni az ER lumenében található rosszul feltekeredett fehérjék mennyiségét a fehérjeszintézis blokkolásával, illetve a hősokk-fehérjék (dajkafehérjék, chaperonok) expressziójának fokozásával. Az ER funkciózavar vizsgálata AK-ban (Li és mtsai., 2015) és más neurodegeneratív betegségekben
intenzíven kutatott
terület (Roussel és mtsai., 2013; Hetz és mtsai., 2014). A neurodegeneratív betegségekre jellemző,
ER-stresszel és fehérjeaggregátumok
felhalmozódásával együtt járó, legfőbb korai elváltozás a mitokondriális zavar (Reddy és mtsai., 2011), ami az AK kutatás napjaink egyik legígéretesebb területe (Selfridge és mtsai., 2013; Picone és mtsai., 2014).
1.2. Az Alzheimer-kór patomechanizmusa
1. ábra Alois Alzheimer (A) és Auguste Deter nevű betegében megfigyelt amyloid plakkok (B, C) és neurofibrilláris kötegek (D) (Bielschowsky-féle ezüstözés). A plakkok a cortex felső rétegeire jellemzőek (B) (http://ibro.info/wp-content/uploads/2012/12/Alzheimer-Alois-2003.pdf).
Az AK súlyos memóriazavarokkal járó neurodegeneratív kórkép, melyet elsőként Alois Alzheimer (1864-1915) írt le 1907-ben "Über eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde" címmel, melynek 1995-ben megjelent angol fordítása is (Alzheimer és mtsai., 1995). A német ideggyógyász a betegség kognitív tüneteit Auguste Deter nevű 51 éves nőbetegén tapasztalta meg, akit feledékenység, tájékozódási zavarok, hangulatingadozások és hallucinációk jellemeztek. Alzheimer, bár a beteget meggyógyítani nem tudta, fokozatosan súlyosbodó állapotát haláláig (1906) nyomon követte. Post mortem vizsgálatai alapján egyenletes
agyi atrófiát
állapított
meg.
Bielschowsky
ezüstözést
alkalmazva
fokozott
sejtpusztulást, az idegsejteken belül neurofibrilláris kötegek felgyülemlését és egy speciális
9
anyag (későbbi amyloid plakkok) extracelluláris lerakódását figyelte meg a cortexben. Mindezek alapján a kórképet egy új betegségnek tekintette, amit később róla nevezték el Alzheimer-kórnak (1. ábra). Az AK a konformációs neurodegeneratív betegségek leggyakoribb formája, a betegek száma a kor előrehaladtával öt évenként megduplázódik. Az Egészségügyi Világszervezet népbetegséggé nyilvánította, a fejlett nyugati országokban a 65 év feletti lakosság több mint 10%-át, a 85 éven túliak több mint 40%-át érinti. 2012-es adat szerint világszerte ~45 millió ember, Magyarországon pedig körülbelül 150.000 ember szenved AK-ban. Sajnos pontos adatok azonban nincsenek, mivel rengeteg lehet a diagnosztizálatlan beteg. Az AK korlátozza a betegeket a mindennapi tevékenységeik elvégzésében, továbbá számos kognitív zavarral jár, mint a memóriavesztés, beszédzavar, vizuális diszfunkció, személyiség és hangulatváltozások (apátia, agitáció, szorongás és depresszió) (Mega és mtsai., 1996). Az AK-os betegek agyában felgyülemlő
hidrofób
aggregátumok
kialakításában
különböző
polipeptidek
és fehérjék
vesznek részt, ilyenek az Aβ fehérje 1-40, 1-42, 4-40, 3-42 és 4-42 formái, gyakran az αszinuklein és hiperfoszforilált tau-fehérjék. Az Aß peptid az amiloid prekurzor fehérje (APP) hibás hasításának terméke. Neuropatológiailag az AK-t a hiperfoszforilált tau fehérjéből álló intracelluláris neurofibrilláris kötegek (NFK), extracelluláris Aβ-plakkok, intracelluláris Aß oligomerek, cerebrovaszkuláris elváltozások, asztrocita és mikroglia aktiváció, szinapszis és idegsejt pusztulás a szeptum, bazális előagy és mediális temporális lebeny területén (hippocampus, entorhinális kéreg és amygdala) jellemzik (Mattson, 2004) (2. ábra). Több mint 100 év intenzív kutatás után az AK oka máig feltáratlan, továbbá nincs hatékony gyógymód a kezelésére. Az AK etiológiájának kutatása számos hipotézist vetett fel az idők során (ld. 1.6. fejezet), azonban máig nem tudják megválaszolni az összes kérdést a kórkép
kialakulását
illetően.
Az
AK-os
betegek
36%-át
napjainkban
is
tévesen
diagnosztizálják, pontos diagnózist csak a post mortem mintákon elvégzett vizsgálatok adnak. A
neurodegeneratív
betegségek
kezelése
legtöbbször
az
ismeretlen
kórfejlődésének
köszönhetően megoldatlan. A diagnózis túlságosan későn történik, amikor az elpusztult sejtek nagy száma miatt a folyamat már visszafordíthatatlan. Jelenleg csak olyan terápia áll rendelkezésünkre, amely a kórlefolyás lassításával, a tünetek enyhítésével, megjelenésük késleltetésével javíthatja az érintett emberek életminőségét, de megoldást nem nyújt a betegségek okozati kezelésére. Az AK korai diagnózisa tehát az idegrendszeri kutatás fontos kihívása. A gyógyszerfejlesztési törekvések legfőképpen az extracelluláris Aβ-t és Aβplakkokat
célozták
meg.
Később
azonban
egyre
nagyobb
figyelmet
fordítottak
idegsejtekben felgyülemlő intracelluláris Aβ (iAβ) formára is (LaFerla és mtsai., 2007).
10
az
2. ábra Az Alzheimer-kór neuropatológiai elváltozásai: hiperfoszforilált tau fehérjéből álló intracelluláris neurofibrilláris kötegek (NFK), extracelluláris Aß-plakkok, intracelluláris Aß oligomerek, cerebrovaszkuláris elváltozások, asztrocita és mikroglia aktiváció, s zinapszis és idegsejt pusztulás (Mucke, 2009).
1.3. Az Alzheimer-kór altípusai Jelen tudásunk szerint az AK egy heterogén, multifaktoriális betegség széles klinikai spektrummal (Lam és mtsai., 2013), tehát nem releváns az „Alzheimer-kórról”, mint egységes, prediktálható lefolyású betegségről beszélni (Jellinger és mtsai., 2015). Az AK sokkal inkább egy olyan szindróma, ami különböző klinikai formákkal rendelkezik. A neurofiziológiai és PET adatok illetve az AK patológiája alátámasztja az elképzelést, miszerint jól elkülöníthető altípusai vannak a betegségnek (Friedland és mtsai., 1988; Fisher és mtsai., 1997; Janocko és mtsai., 2012). Az AK két fő formája a korai jelentkezésű, familiáris forma és a késői (65 éves kor feletti) sporadikus forma. Az AK-os betegek kevesebb, mint 5%-át érinti a familiáris típus, melynek hátterében az APP és γ-szekretáz komplex (preszenilin 1 és 2) öröklött mutációi állnak (Chavez-Gutierrez és mtsai., 2012). Teljes genom asszociációs vizsgálatok (Genome wide association studies, GWAS) kimutatták, hogy a familiáris AK patofiziológiájában számos más gén és génkombináció is szerepet játszik (pl. apolipoproteinE ε4 allél (ApoEε4), PICALM, BIN1, ABCA7, SORL1…).
11
További osztályozás alapján az AK felosztható a klinikai elváltozások szerint is. PET hipometabolizmus vizsgálatok, nyelv és vizuoperceptív elváltozások és neuropszichológiai vizsgálatok alapján a következő altípusokat állapították meg (Lam és mtsai., 2013): 1) Általános AK: késői AK szindróma amnéziás tünetekkel és főként hippocampális és temporális-parietális atrófiával 2) Temporális (enyhén amnéziás) AK, lassú hanyatlással (3/A ábra) 3) Progresszív afázia bal oldali (nyelvi) formája, súlyosabb memória zavarok nélkül (3/B ábra) 4) Jobb oldali (vizuoperceptív) AK (3/C ábra) 5) Frontális (executive) AK (3/D ábra)
3. ábra Az Alzheimer-kór különböző klinikai altípusainak MRI (bal oldal) és SPECT (jobb oldal) felvételei. A: temporális altípus: erőteljes hippocampális atrófia (fehér nyilak) és meziotemporális hipoperfúzió (piros nyilak) a hippocampus szintjén készült koronális felvételen (lent), míg a bazális ganglionok szintjén készült axiális T1 MRI és SPECT felvételen nincs elváltozás (fent); B: nyelvi (bal oldali) altípus: erőteljes bal parietális atrófia és oldalsó kamra tágulat (fehér nyíl), valamint parietális hipoperfúzió (piros nyíl) a bazális ganglionok szintjén készült felvételen; C: jobb oldali (vizuoperceptív) altípus: jobb oldali temporális és parietális atrófia (fehér nyíl), oldalsó kamra tágulat (bal) és hipoperfúzió (jobb) a középagy szintjén készült felvételen (fent), ami kevésbé kifejezett a bazális ganglionok szintjén (lent); D: frontális (executive) altípus: frontális atrófia (bal) és hipoperfúzió (jobb) a bazális ganglio nok szintjén készült felvételen (Lam és mtsai., 2013).
12
Az AK összes altípusának általános patológiai jellemzői az extracelluláris Aβ-plakkok és intracelluláris NFK-ek jelenléte. Az AK progresszió mértékének karakterizálására tehát az NFK akkumulációt („Braak tangle stages”) (Braak és mtsai., 1995) és Aβ lerakódást (Thal és mtsai., 2002; Thal és mtsai., 2015) használják. A tau hiperfoszforiláció és Aβ aggregáció szinergista módon hatnak az AK-os agyban (Nisbet és mtsai., 2015). Habár tény, hogy az Aβ önmagában nem váltja ki az AK-t és léteznek tünetmentes, lokális Aβ-plakk felhalmozódást mutató betegek is (Sambamurti és mtsai., 2011; Jellinger és mtsai., 2012), az Aβ-nak számos toxikus formája ismert. Az APP hasítási folyamata tehát egy kulcsfontosságú tényező az AK patomechanizmusában.
1.4. Az APP hasítási folyamata: az Aβ és más hasítási termékek képződése Az APP az idegsejtekben fiziológiásan előforduló transzmembrán glikoprotein, amely egy kisméretű intracelluláris C-terminális, egy nagyméretű extracelluláris N-terminális és egy transzmembrán doménnel rendelkezik (Reinhard és mtsai., 2005). Az APP-nek 8 izoformája ismert (695-770 aminosavas izoformák), melyek közül a 695 aminosavas izoforma nagy mennyiségben expresszálódik a központi idegrendszerben. Az APP overexpresszió vizsgálata során kiderült, hogy az APP pozitívan hat a sejtek túlélésére és növekedésére (Thinakaran és mtsai., 2008), továbbá indukálja a neurit arborizációt szöveti sérülés során (Leyssen és mtsai., 2005), valamint jelentős szerepet játszik a szinapszis fenntartásában és kialakításában (Roch és mtsai., 1994; Turner és mtsai., 2003). A központi idegrendszert ért traumák hatására az APP és ennek hibás hasítási terméke az Aβ fokozatosan növekvő mértékben képződik. Az Aβ képződés folyamatának vizsgálata az AK kutatásának egyik központi kérdése (Takami és mtsai., 2009; Xu, 2009; Sambamurti és mtsai., 2011). Az APP fehérje legfőbb hasítását az α, β és γ-szekretázok végzik, azonban mára már számos APP-t hasító enzimet írtak le (cink metallopreoteinázok: TACE/ADAM17, ADAM9, ADAM10, MDC-9, aszpartil proteáz: β-szekretáz (BACE)) (Allinson és mtsai., 2003). Az APP-nek két lebontási útvonala ismert: a 90%-ban bekövetkező fiziológiás / nemamyloidogén útvonal és a maradék 10%-ot érintő alternatív / amyloidogén útvonal (Zheng és mtsai., 2006). A fiziológiás útvonal során az α-szekretáz hasítása által az APP-ből vízoldható, nem toxikus peptidek sokasága képződik (szolubilis α APP (sAPPα) és APP C-terminális fragmens (CTFα)), melyek normál körülmények között nem mutatnak aggregációs hajlamot. A CTFα
13
peptidfragmens a γ-szekretáz által hasad tovább a p3 (3 kDa-os fragmens) és az APP intracelluláris domén (AICD) fragmensekre.
A γ-szekretáz egy nagy molekulatömegű
fehérjekomplex, ami többek között a preszenilinből (1 és 2), a preszenilin enhancerből (PEN2), nikasztrinból és az Aph1-ből áll (Iwatsubo, 2004), azonban az alegységek listája fokozatosan bővül az új molekulák azonosításával (Addya és mtsai., 1997; Chen és mtsai., 2006) (4. ábra). Az amyloidogén útvonal során azonban az APP-t először a BACE hasítja, melynek következtében szolubilis β APP fragmens (sAPPβ) képződik. A BACE egy transzmembrán aszpartil-proteáz, melyet a neuronok nagy mennyiségben expresszálnak (Hussain és mtsai., 1999; Sinha és mtsai., 1999). A megmaradt membrán-kötött C-terminális fragmens (CTFβ) a membránon belül hasad tovább a γ-szekretáz által, ami az AICD és az Aβ 40 vagy 42 aminosavas (Aβ1-40 , Aβ1-42 ) formáinak képződéséhez vezet. Az Aβ1-42 a γ-szekretáz és a βszekretáz hatására keletkezik az APP-ből oly módon, hogy 14 aminosavnyi rész a fehérje transzmembrán doménjéből, 28 aminosavnyi pedig az extracelluláris (N-terminális) részéből hasítódik ki. Az Aβ1-42 erősen hidrofób, aggregációra hajlamos szerkezetű proteinfragmens, amely extracellulárisan szenilis plakkokká aggregálódik (4. ábra). Sejttenyészeten végzett kísérletekben kimutatták, hogy az Aβ által formált oligomerek toxikus hatással bírnak (Walsh és mtsai., 2004). Máig nem tisztázott azonban, hogy melyik a leginkább toxikus oligomer forma (dimer, trimer, tetramer, dodekamer). Az Aβ akkumuláció jelentős
patológiai folyamat
az AK-ban,
továbbá
az Aβ
degradáció
és
lebontás
kulcsfontosságúak az AK progressziójában (Baranello és mtsai., 2015). Az APP szubcelluláris lokalizációja és hasítási folyamata nem teljesen tisztázott. Az APP mind a plazmamembránban, mind az intracelluláris organellumok (Golgi készülékben, ER, endoszóma, lizoszóma, mitokondrium) membránjában jelen levő fehérje (LaFerla és mtsai., 2007). Kimutatták továbbá, hogy a nem-amyloidogén hasítási útvonal többnyire a plazmamembránban
lokalizálódik,
míg
az amyloidogén
útvonal inkább
intracellulárisan
jellemző (Lammich és mtsai., 1999). Az APP bioszintézisét követően glikozilálódik az ER-ben, majd transzportálódik a Golgi-készülékbe,
ahol O-és N-glikozilálódik, foszforilálódik és szulfonálódik a tirozin
oldalláncokon (Lai és mtsai., 1995). In vitro munkák alapján elmondható, hogy az APP-k csupán ~10%-a helyeződik ki a plazmamembránba, a többi intracellulárisan a Golgiban és transz-Golgi hálózatban marad. A plazmamembránba épülő APP képes endocitózissal internalizálódni a sejtbe (a “YENPTY” motívum jelenlétében), majd elérni az endoszómát (Perez
és
mtsai.,
1999).
Számos
szubcelluláris
14
kompartment
(transz-Golgi
hálózat,
lizoszómák, ER, mitokondrium) szerepet játszik az APP intracelluláris hasításában. Újabb kutatások szerint az APP retromer transzportálódik a korai endoszómából a transz-Golgi hálózatba, ami jelentős az APP amyloidogén hasítási útvonalában (Choy és mtsai., 2012). Az APP a Golgiból gyorsan a lizoszómába transzportálódik, ahol kihasad belőle az Aβ (Choy és mtsai., 2012). Számos tanulmány igazolja az α- és ß-szekretázok jelenlétét az ER-ben, lehetővé téve az APP ER-ben történő hasítási folyamatát (Chyung és mtsai., 1997; Shin és mtsai., 2005). Újabban kimutatták, hogy az APP, a preszenilin 1 és 2 (PS1, PS2) jelentős felhalmozódást mutatnak a mitokondrium-asszociált ER membránban (MAM), továbbá azt is, hogy a MAM régió mérete és a γ-szekretáz aktivitás megnő AK-ban (Area-Gomez és mtsai., 2012). Feltételezik tehát, hogy a MAM egy kitüntetett szubcelluláris régiója az APP amyloidogén hasítási folyamatának és az Aß képződésnek (Vetrivel és Thinakaran, 2010; Placido és mtsai., 2014).
4. ábra Az amyloid prekurzor fehérje (APP) amyloidogén és nem amyloidogén/fiziológiás hasítási útvonala. Az APP-t sematikus rajz ábrázolja (nem méretarányos). EC: extracelluláris, TM: transzmembrán, IC: intracelluláris domén, APPsα és β: szolubilis α és β APP, CTFα és β: APP C-terminális fragmens α és β, AICD: APP intracelluláris domén, p3: 3 kDa-os fragmens. A β-amyloid (Aβ) domént bordó szín jelöli (Zheng és mtsai., 2006).
15
1.5. A β-amyloid aggregációja Az Alzheimer kóros betegek agyában a peptidek másodlagos szerkezete megváltozik, és a kórosan feltekeredett peptidek aggregációs hajlama megnő. Az Aβ magas koncentrációt elérve
folyamatosan
aggregátumok
a
aggregálódik,
sejtfelülethez
a
keletkező
kötődve
aggregátumok
sejtelhalást
okozhatnak,
toxikusak. ami
az
A
toxikus
idegszövet
pusztulásához vezet. Az Aβ keletkezésekor rendkívül „ragadós” felszínnel rendelkezik, amelynek
köszönhetően gyorsan oligomerizálódik, és szinte bármilyen membránfehérjén
képes megtapadni (Verdier és mtsai., 2004). Irodalmi adatokból ismert, hogy az Aβ aggregátum preferáltan kötődik olyan sejtek membránjához, melyek nagyméretűek és nagy felületű membránjukban sok proteint expresszálnak. Ilyen sejtek az emlősök agyában a preoptikus area nagy kolinerg sejtjei, a kérgi piramissejtek, valamint a hippokampális piramissejtek.
Az APP-ből lehasadó amyloid monomerből egy hosszú oligomerizációs
folyamaton keresztül alakul ki a β-redő szerkezet (Nandi, 1996; Mager és mtsai., 2002; Stine és mtsai., 2003), lerakódásuk az Alzheimer kóros betegek agyának limbikus és asszociatív kérgi részére jellemző (Glenner és mtsai., 1984; Masters és mtsai., 1985).
5. ábra Aβ-oldatok aggregációjának vizsgálata dinamikus fényszórással (DLS). Az ábra jól mutatja az aggregátumok különböző időben mért eloszlási profilját, mely Gauss eloszlást követ (bal oldal), valamint az oligomerek képződésének kinetikáját (jobb oldal) (d H : oligomerek átlagmérete; 24, 60, 190: az Aβ-oldatok aggregációjának ideje órában) (Penke Botond, Szeged – személyes közlés).
Az aggregáció egy folytonosan előrehaladó folyamat, melynek mértéke függ a kezdeti amyloid koncentrációtól, hőmérséklettől, szennyeződésektől, stb. (Finder és mtsai., 2007; Frieden, 2007).
A fehérjék
aggregációja többlépcsős,
16
összetett folyamat, egy adott
időpillanatban egyszerre többféle amyloid forma van jelen, így nehéz eldönteni, hogy a tapasztalt
hatás
pontosan
mely formának
tulajdonítható.
Az aggregátumok
dinamikus
fényszórással (DLS) történő vizsgálata egyértelműen mutatja, hogy az oldatok Gauss eloszlási profillal rendelkeznek (5. ábra). Az oligomerek átlagmérete (dH) az idő függvényében monoton módon növekszik. A DLS-mérés látszólagos részecskeméretet határoz meg, feltételezve, hogy a vizsgált részecskék gömb alakúak. Elnyújtott aggregátumok, vékony, hosszú amyloid szálak esetében ezért nehéz a tényleges dimenziók megállapítása. Az előkísérleteink során is alkalmazott atomerő mikroszkópia módszere alkalmasabb az Aβ oldatok karakterizálására, pontosabb képet kapunk a különböző oldatok összetevőinek méreteloszlásáról és morfológiájáról.
1.6. Az Alzheimer-kór kutatásában használt emlős modelleken elért legfőbb eredmények és felhasználhatóságuk a gyógyszerkutatásban A humán AK-os minták hozzáférhetőségének limitációja miatt, illetve a betegség korai fázisát tükröző humán agyminták hiánya következtében a korai AK diagnosztizálására szolgáló
biomarkerek
kiválasztása
az
AK
kutatása korai
állatmodelleken molekuláris
lehetséges.
mechanizmusának
A
megfelelő
kutatásában
állatmodell tehát
egy
kulcsfontosságú tényező. A következőkben az AK kutatásában leggyakrabban használt emlős modellek kerülnek bemutatásra spontán, farmakológiai, kémiai és lézió-indukált, Aβ-kezelt és transzgenikus alkalmazott
csoportok Aβ-kezelt
alapján. és
A dolgozatban bemutatásra kerülő
APP/PS1
modelleken
elért
kísérletek
eredményekről
során
részletesebben
olvashatunk.
1.6.1. Spontán modellek Néhány faj, mint a kutya (Cummings és mtsai., 1996; Rofina és mtsai., 2006), macska (Head és mtsai., 2005; Gunn-Moore és mtsai., 2006), medve (Cork és mtsai., 1988; Uchida és mtsai., 1995), kecske, bárány (Braak és mtsai., 1994), borz (Roertgen és mtsai., 1996), valamint számos főemlős (Bons és mtsai., 1994; Gearing és mtsai., 1997) spontán amyloidózist illetve ritkább esetben taupátiát mutat. Ezek a hisztopatológiai elváltozások ráadásul kognitív zavarokkal is társulnak (Gunn-Moore és mtsai., 2006; Rofina és mtsai.,
17
2006). Ezeknek az állatoknak a felhasználása kísérleti célokra azonban hozzáférhetőségi, gazdasági és etikai okokból erősen korlátozott. Mindezek ellenére a kutya kimondottan alkalmas modell a humán öregedés, a neurodegeneráció és az AK vizsgálatára (Sarasa és mtsai., 2009), mivel filogenetikailag közelebb állnak az emberhez mint a rágcsálók, barázdált agyuk van, továbbá viselkedésbeli, hisztopatológiai és molekuláris szinten is hasonlóságot mutatnak a klinikai AK-val. A kutya Aβ1–42 fehérje aminosav szekvenciája azonos a humán homológgal,
míg például a
rágcsálókban megtalálható Aβ1–42 három aminosavval eltér tőle. A kutyákban megjelenő kognitív tünetek magába foglalják a normál öregedés, az enyhe mentális zavar (mild cognitive impairment, MCI) és a korai/közép AK-ban megjelenő elváltozásokat. Ezen hasonlóságok következtében
a
kutyákat
gyakran
használják
preklinikai fázisban
lévő
gyógyszerek
tesztelésére. A kutyák továbbá ideálisak hosszútávú, krónikus kísérletekhez is, mint például antioxidáns diéta vagy Aβ immunoterápia vizsgálatára (Cotman és mtsai., 2008). Az idős patkányok nem mutatnak spontán AK-szerű hisztopatológiai elváltozásokat, így nem használhatóak ezen változásokat megcélzó gyógyszermolekulák fejlesztésére sem. Felhasználhatóak
viszont
az AK-ra jellemző
neurokémiai és morfológiai elváltozások
tanulmányozására, melyek megjelennek az öregedéshez kötődő kognitív elváltozások és viselkedésbeli változások szintjén az állatokban (Erickson és mtsai., 2003). A természetes öregedéssel járó elváltozások fokozottan fordulnak elő az öregedésgyorsított, SAM egerekben („senescence-accelerated mouse”, SAM), amit fenotípus alapján szelektáltak ki az AKR/J egerekből. A SAM törzseket számos öregedéssel együtt járó betegség vizsgálatára használják. A SAMP8 altörzs igen jelentős a demenciával kapcsolatos kutatásokban, mivel Aβ akkumulációval együtt járó korfüggő tanulási és memóriazavart mutat (Yagi és mtsai., 1988).
1.6.2. Farmakológiai, kémiai és lézió-indukált rágcsáló modellek A neurotranszmitter rendszerekben bekövetkező zavar jelentős szerepet játszik az AKra jellemző kognitív és viselkedési tünetek patofiziológiájának kialakulásában. A legtöbb ilyen jellegű állatmodell az AK egyik legrégebbi, kolinerg hipotézisének tanulmányozására alkalmas (Francis és mtsai., 1999). A bazális előagyi Meynert magokban található kolinerg idegsejtek, melyek axonjai elsődlegesen a neocortexbe vetülnek, az AK korai szakaszában degenerálódnak (Davies és mtsai., 1976; Whitehouse és mtsai., 1981). A kolinerg rendszerben illetve a kognitív tünetekben bekövetkező defektusok és az AK neuropatológiája közti
18
korrelációt számos munka igazolja (Martin és mtsai., 1987; Bierer és mtsai., 1995; Dournaud és mtsai., 1995). A legáltalánosabban használt farmakológiai AK modell a szkopolamin-indukált amnézia modell (Sunderland és mtsai., 1986; Preston és mtsai., 1989), ami alkalmas a kolinerg rendszer szerepének vizsgálatára a kognícióban, továbbá a kolinomimetikumokkal történő
tüneti kezelés hatékonyságának
vizsgálatára,
mint az acetilkolinészteráz gátlók
(Ahmed és mtsai., 2009; Wong és mtsai., 2010) vagy a muszkarin 1-es receptor agonisták (Malviya és mtsai., 2008). Az AK kolinerg hipotézisének vizsgálatára számos léziós modellt fejlesztettek ki. A lézió történhet fokálisan neurotoxinok által, elektrolitikusan vagy mechanikai roncsolás útján (Toledano és mtsai., 2004), továbbá érintheti a legfőbb kolinerg központokat vagy általánosan a kolinerg neuronokat is (Contestabile, 2011). Ezek a modellek alkalmasak a kolinerg beidegzésű területek vizsgálatára a kognitív zavarral járó betegségekben. Az AK-val társuló memóriaproblémák
szintén
reprodukálhatók
tanulás
és
memóriaspecifikus
agyterületek
léziójával, mint a hippocampus vagy a striatális és corticális régiók (Gray és mtsai., 1983; Glenn és mtsai., 2003; Sloan és mtsai., 2006; Castane és mtsai., 2010). Ezek a modellek leginkább
a memóriaproblémák
idegi hátterének megértésében hasznosak, a betegség
progressziójának tanulmányozására azonban nem alkalmasak. A különböző kémiai szerek által indukált modellek kizárólag egy adott, AK-ban jelentős patofiziológiai útvonal tanulmányozására szolgálnak. Ezek a modellek alkalmasak például az agyi gyulladás vagy az elégtelen glükóz/energia metabolizmus vizsgálatára neurodegeneráció során. Az agyi gyulladás kiváltható különböző endotoxinok infúziójával, ilyenek
pl.
a lipopoliszacharid
(LPS) (Hauss-Wegrzyniak
és mtsai., 1998) vagy a
proinflammatórikus citokinek (Wenk és mtsai., 2003). Az agyi metabolizmus elégtelen működése a mitokondriális metabolikus útvonalak (Szabados és mtsai., 2004), illetve az idegi inzulin szignáltraszdukciós útvonalak gátlásán keresztül vizsgálható (Ishrat és mtsai., 2009).
1.6.3. Az Aβ-kezelt rágcsáló modellek Az AK amyloid-kaszkád hipotézise szerint mind a familiáris, mind a sporadikus AK típusban az Aβ akkumulációja és aggregációja a betegség patogenezisének fő okozója, a további,
betegségre
jellemző
termelés/lebomlás-egyensúly
elváltozások
felborulásának
(NFK-ek
kialakulása,
következménye.
Újabban
gyulladás) ez
az
az
Aβ
elmélet
kiegészült annyival, hogy az AK patogenezisében leginkább toxikus formák a szolubilis Aβ
19
oligomerek, melyek képesek gátolni az LTP-t, ami memóriaromláshoz vezet (Gong és mtsai., 2003; Lacor és mtsai., 2004; Walsh és mtsai., 2007). Az AK-ban végbemenő Aβ akkumuláció jól modellezhető az Aβ patkány agyba történő intracerebrális vagy intracerebroventrikuláris infúziójával. Az Aβ hatás vizsgálható akutan, egyszeri, sztereotaxisba befogott állat agyába történő injektálással (Harkány és mtsai., 1998) vagy krónikusan, ismételt kezelésekkel, beépített kanül (Yamada és mtsai., 2005), ozmotikus mini-pumpa (Nakamura és mtsai., 2001; Olariu és mtsai., 2002), mikro-infúziós pumpa (Nag és mtsai., 1999), vagy mikrodialízis (Harkány és mtsai., 2000) segítségével. Az Aβ direkt intracerebrális injekciója tanulási és memóriadeficitet okoz, továbbá AK-ra jellemző viselkedésbeli elváltozásokhoz, gyulladáshoz és mikroglia aktivációhoz, oxidatív stresszhez és sejtpusztuláshoz vezethet (Frautschy és mtsai., 1996; Harkány és mtsai., 1998; Weldon és mtsai., 1998; Sipos és mtsai., 2007). Az Aβ kezelés memóriafolyamatokra gyakorolt fiziológiai hatásának vizsgálatára rendkívül elterjedt
az LTP
(„long-term potentiation”)
vizsgálata.
A perforáns pálya
ingerlésére elvezethető populációs kisülési válasz és mezőpotenciál gyors ingersorozat utáni megnövekedése (LTP) a szinaptikus plaszticitás és a memória folyamatok elfogadott és intenzíven tanulmányozott modellje. Az Aβ oligomerek gátolják a szinaptikus hatékonyságot (Wang és mtsai., 2009), továbbá számos kutatási eredmény szerint az Aβ oligomerek gátló hatással vannak az LTP-re (Walsh és mtsai., 2002; Rowan és mtsai., 2004; Chang és mtsai., 2006; Townsend és mtsai., 2006; Klyubin és mtsai., 2008; Shankar és mtsai., 2008), a toxikus hatással bíró oligomer formát illetően azonban megoszlanak a vélemények. Az agykamrába injektált, aggregálódott humán Aβ oligomer oldat gátolja a hippocampusban az LTP fenntartását patkányban in vivo (Rowan és mtsai., 2003), továbbá Walsh és munkatársai kizárhatónak tekintik, hogy az LTP in vivo blokkolásában bármilyen szerepet játszanának a monomer, vagy természetes fibrilláris formájukban jelen lévő humán Aβ formák (Walsh és mtsai., 2002). Towsend eredményei szerint az Aβ trimerek a legfőbb LTP-gátlók (Townsend és mtsai., 2006), míg későbbi kutatások alapján már a dimerek bizonyultak a szinaptikus plaszticitást leginkább károsító amyloid formáknak (Klyubin és mtsai., 2008). A kicsiny, protofibrilláris állapotú Aβ az Nmetil-D-aszpartát (NMDA) receptorokhoz kötődik elsősorban, míg a nagyobb méretű fibrillumok szelektíven modulálják a nem-NMDA glutamát receptorok működését (Ye és mtsai., 2004). Tanzi és munkatársai kidolgoztak egy feltételezett szignalizációs útvonalat, amin keresztül az Aβ hathat az NMDA receptorra (Tanzi, 2005). Az amyloid LTP-re kifejtett hatásáról az eddig felsoroltakkal ellentmondó eredmények is ismertek korábbi kísérletek
20
szerint: gyrus dentatusban Aβ kezelés vizsgálata során az LTP serkentését írták le in vitro, amit az NMDA receptorok megnövekedett működésével magyaráztak (Wu és mtsai., 1995). Későbbi in vitro kísérletek eredményei szerint azonban az Aβ oligomerek gátló hatással vannak az LTP-re, mivel a mikroglia sejtekhez kötődve egy “stressz-kaszkádot” indítanak el, ami blokkolja az LTP-t serkentő szignál útvonalat (Rowan és mtsai., 2004). Az Aβ iontoforézissel való bejuttatásakor az NMDA válaszok szignifikánsan és irreverzibilisen megnövekedtek az extracelluláris „single-unit” felvételek során in vivo (Molnár és mtsai., 2004).
2008-as
koncentrációban
eredmények jelentősen
alapján
megnövelik
az Aβ monomerek az
LTP-t,
míg
és oligomerek nanomólos
pikomólos
koncentrációban
lecsökkentették a szinaptikus potenciált (Puzzo és mtsai., 2008). A szinaptikus rést sejtkapcsoló- extracelluláris mátrix molekulák, illetve a receptorok és ioncsatornák extracelluláris láncai töltik ki, melyek erősen akadályozva az oldalirányú diffúziót,
befolyásolják
a
neurotranszmisszió
hatékonyságát,
és
mintegy
„gélszűrőként”
viselkedve méret szerint szelektálhatnak a különböző méretű amyloid aggregátumok között. A kisméretű szolubilis oligomerek a szinaptikus résbe jutva képesek közvetlen befolyásolni a szinaptikus plaszticitást, míg a nagyobbak kizáródnak, és az extracelluláris térben fejtik ki degeneratív hatásukat. Az oligomerek szinaptikus transzmisszióra gyakorolt hatását az LTP vizsgálata során kapott eredmények is alátámasztják (Selkoe, 2008). Az Aβ aggregátum formák a sejtfelszíni proteinekhez kötődve direkt módon, vagy a tau-fehérje
hiperfoszforillációja
kapcsán
kialakuló
axondegeneráción
keresztül fejtik
ki
citotoxikus hatásukat (Hardy és mtsai., 2002). Az Aβ oligomerek agyszövetbe való injektálása során számos citotoxikus és immunológiai reakciót váltanak ki: az axonlefutások nyomvonalának
eltorzítását,
dendritarborizáció
zsugorodását,
mikroglia-aktivációt,
reaktív
szuperoxid gyökök felszabadulását eredményezik, végül sejthalált okoznak (Walsh és Selkoe, 2004). A pikomólos koncentrációjú Aβ hatása a szinaptikus plaszticitásra és memóriára megemelkedett
transzmitter
felszabadulással jár,
melyben
az α7
nikotinos
acetilkolin
receptorok játszanak szerepet (Puzzo és mtsai., 2008). Szintén pikomólos koncentrációjú kis Aβ oligomerek azonban szinapszisvesztést indukálnak (Shankar, 2007). A kísérletekben alkalmazott oldatok kémiai karaktere nem ismert. A különböző méretű oligomereknek hatása tehát egy nyitott kérdés, aminek legfőbb oka az aggregáció fokának bizonytalan és nehéz mérése in vivo. Felmerül tehát, hogy a különböző Aβ aggregátumok eltérő fiziológiai hatással bírhatnak a sejtek aktivitására, melyet előkísérleteink során vizsgáltunk meg.
21
1.6.4. Transzgenikus rágcsáló modellek 1.6.4.1. Transzgenikus egér modellek Az AK-ban előforduló génmutációkat hordozó transzgenikus egértörzsek kifejlesztése nagy áttörés volt az AK modern kutatásában. A következőkben, a terjedelmi korlátok végett csak a legnépszerűbb, legtöbbet kutatott transzgenikus egérmodellek előnyeit és korlátait szeretném bemutatni, legnagyobb hangsúlyt fektetve a doktori munkám során alkalmazott APP/PS1 egértörzs bemutatására. A jelenleg forgalomban lévő transzgenikus egérmodellek teljesebb
körű
leírása
a
következő
weboldalon
érhető
el:
http://www.alzforum.org/res/com/tra/.
Amyloid-modellek Az AK-t modellező
transzgenikus egértörzs tanulmányozása az 1990-es évek
közepétől vette kezdetét az Indiana mutációt (V717F: Val717 → Phe) hordozó PDAPP modell kifejlesztésével (Games és mtsai., 1995) amit a rákövetkező években a Swedish (K670N/M671L: Lys670 → Asn és Met671 → Leu) mutációt hordozó Tg2576 (Hsiao és mtsai., 1996) és az APP23 (Sturchler-Pierrat és mtsai., 1997) egérmodellek követtek. Az APP23 modell ugyanazt a mutáns amyloid fehérjét expresszálja, mint a Tg2576 modell, csak míg az utóbbi virális promóterrel (HCMV) rendelkezik, addig ebben rágcsáló Thy-1 promóter irányítja az expressziót. Mindhárom említett modell fokozott Aβ-akkumulációt, cerebrális amyloid angiopátiát, asztrocita és mikroglia aktivációt, hippokampális atrófiát, szinaptikus és neurotranszmitter
elváltozásokat,
kognitív
és
viselkedésbeli
AK
tüneteket
produkál,
alátámasztva az AK amyloid-kaszkád hipotézisét (Brendza és mtsai., 2003; Van Dam és mtsai., 2005; Deacon és mtsai., 2009). Ezek a transzgenikus noninvazív modellek alkalmasak különböző gyógyszerjelölt molekulák tesztelésére, lehetséges biomarkerek kutatására. A familiáris AK-ra jellemző preszenilin gén mutáció felfedezésével indokolt volt a preszenilin 1 és 2 (PS1, PS2) transzgenikus állatok kifejlesztése is. A PS1 vagy PS2 mutáció hatására a γ-szekretáz specificitása megváltozik, így az Aβ1-42 /Aβ1-40 -es amyloid formák képződésének aránya eltolódik a 42 aminosavas forma képződése felé (Borchelt és mtsai., 1996). A megnövekedett Aβ1–42/Aβ1–40 arány ellenére ezekben az állatokban nem találhatóak plakk-képződésre utaló nyomok, valamint csupán enyhe kognitív és viselkedésbeli tüneteket mutatnak.
22
Az APP/PS1 modell preszenilin
A
modellek
továbbfejlesztéséből kidolgozott
APP/PS1
kétszeresen
transzgenikus egérben a korábban leírt Swedish (APP695swe) és PS1-dE9 mutációkat kombinálták (Kurt és mtsai., 2001; Radde és mtsai., 2006), így ezek az állatok növekvő Aβ1– 42/Aβ1–40 arányú amyloid képződéssel és felgyorsult Aβ-patológiával rendelkeznek az egyszeres APP állatokhoz képest, igazolva a preszenilin módosító hatását. Az Aβ toxicitással együtt járó patológiai elváltozásokat intenzív gliózis (Malm és mtsai., 2007; Yan és mtsai., 2009; Jardanhazi-Kurutz és mtsai., 2011), disztrófiás serkentő szinaptikus boutonok és tau pozitív neuritek megjelenése kíséri. További AK-ra jellemző elváltozás a kor előrehaladásával megjelenő neuropatológiai tünetek, illetve az egész agyat érintő atrófia (Delatour és mtsai., 2006; Wirths és mtsai., 2006). A korábban említett modellekhez hasonlóan általános nagymértékű
sejtpusztulás
idegsejtpopulációk
nem
működésének
figyelhető zavara.
meg,
csak
kisebb,
AK-ban
A katekolaminerg neuronok
is
érintett
száma a locus
coeruleusban csökkenést mutat a korral (O'Neil és mtsai., 2007), ami alátámasztja a jelentőségét a kóros elváltozásokban (Jardanhazi-Kurutz és mtsai., 2011; Rey és mtsai., 2012; Hammerschmidt és mtsai., 2013). Számos interneuron illetve Ca2+-kötő fehérje szintje szintén csökkenést mutat a hippocampusban (Popovic és mtsai., 2008; Takahashi és mtsai., 2010). Egy
új
képalkotó
eljárással az APP/PS1
felhalmozódással együtt
járó
egerek
különböző
agyrégióiban
az Aβ
bilaterális funkcionális konnektivitás-csökkenést detektáltak
(Bero és mtsai., 2012). A rövidtávú memória sérülése az állatokban – hasonlóan az AK-ban szenvedő betegekhez – a kórkép korai fázisában jelenik meg (Huntley és mtsai., 2010; Lagadec és mtsai., 2012). További nem-kognitív tünetek - mint a napi ciklus zavara, a motoros funkciózavar, depresszió valamint a szorongás - szintén előfordulnak az APP/PS1 modellben (Pugh és mtsai., 2007). Ismert humán adat, hogy a nők körében körülbelül kétszer annyi a regisztrált Alzheimer-kóros betegek száma, mint a férfiaknál. Nemek közötti különbség az APP/PS1 egerekben is megjelenik, ahol nőstényekben korábban figyelhetőek meg az Aβ lerakódások, mint a hímekben (Wang és mtsai., 2003). Az egyik fő különbség a humán patológiától az APP23 törzshöz hasonlóan a foszforilált tau késői megjelenése, a hiperfoszforilált tau alacsony szintje, továbbá az NFK képződés hiánya (Kurt és mtsai., 2003). Felmerült, hogy a tau patológia hiánya okozhatja a limitált sejtpusztulást és az alac.sonyabb mértékű amyloidogén hasítását az APP-nek, hasonlóan az eddig említett törzsekhez és a humán kórképhez (Leroy és mtsai., 2012). Az amyloidogén hasításért felelős BACE gén kiütése esetén javult az APP/PS1 egerek
23
memóriafunkciója, a Tg2576 törzshöz hasonlóan (Ohno és mtsai., 2004). Az Aβ lerakódás mértéke
szignifikánsan
korrelál a
glükóz-transzporter-1
szintjével és
a
hippocampus
atrófiájával (Hooijmans és mtsai., 2007). Az Aβ lerakódás és a korai patológiai események között kétirányú kapcsolat lehet: az Aβ akkumuláció elégtelen lizoszómális proteolízishez, axonális transzporthoz és csökkent agyi konnektivitáshoz vezet, melyek tovább növelik az APP amyloidogén hasításának mértékét (Bero és mtsai., 2012; Torres és mtsai., 2012). A többi AK modellhez hasonlóan az amyloid progressziója erősen korrelál az idegi gyulladás fokozódásával az APP/PS1 egerekben is (Biscaro és mtsai., 2012). Számos komplement fehérje expresszálódik AK-os agyban (Walker és mtsai., 1992). A C1q komplement fehérje deléciója csökkentette a patológiás elváltozások mértékét APP/PS1 egerekben (Fonseca és mtsai., 2004), ami a C1q fehérje kóros szerepére utal. A fokozott mikroglia aktiváció és a csökkent mitokondriális aktivitás által okozott oxidatív stressz (Trushina és mtsai., 2012) hozzájárul a csökkent idegsejtképződés és kognitív képességek megjelenéséhez (Choudhry és mtsai., 2012; Hamilton és mtsai., 2012). A glia-aktivációt jelentősen szabályozza a noradrenalin (NA), így a noradrenerg idegsejtek szelektív hiánya a locus coeruleusban szintén hozzájárulhat a betegség progressziójához, amit a locus coeruleus idegsejtek
hiánya
esetén
tapasztalt,
súlyosbodó
AK-szerű
tünetek
is alátámasztanak
(Hammerschmidt és mtsai., 2013). A környezeti faktorok hatását szintén tanulmányozták ebben a modellben: alumínium terhelés hatására felgyorsult a kognitív hanyatlás (Zhang és mtsai., 2012), a fizikai gyakorlatok viszont megelőzték a memóriazavarok kialakulását (Liu és mtsai., 2011), a humán (Roach és mtsai., 2011) és Tg2576 egérnél tapasztaltakhoz hasonlóan (Parachikova és mtsai., 2008). Általánosan elmondható, hogy az AK-os beteg esetében alkalmazott kezelések hatékonyak voltak az APP/PS1 egerekben is: az NMDA receptor antagonista memantin javította a speciális memóriát (Minkeviciene és mtsai., 2004) és csökkentette az Aβ-szintet in vivo és idegsejtkultúrában is (Alley és mtsai., 2010). Az acetilkolin-észteráz aktivitás gátlása az egyik legfőbb terápiás megközelítés az AK kezelésére. Az APP/PS1 egerekben az IQM622 acetilkolin-észeráz inhibitor csökkentette az Aβ lerakódást és neuroprotektíven hatott az idegsejtekre (Antequera és mtsai., 2012). Végül a csökkent vas-homeosztázis szintén jelentős szereppel bír az AK patogenezisében. A desferrioxamine nevű vaskelátor lelassítja a betegség progresszióját humán agyban (McLachlan és mtsai., 1993) és APP/PS1 egerekben is (Guo és mtsai., 2013a). Figyelemreméltó továbbá az eredmények listája a különböző stratégiákról, melyek
hatékonyan lassítják
a patológiai elváltozások
progresszióját vagy javítják a
regenerálódás mértékét az APP/PS1 egerekben: többek között az őssejt terápia (Lee és mtsai.,
24
2012), kalória csökkentés (Mouton és mtsai., 2009), a retinsavas kezelés (Ding és mtsai., 2008), fluparoxan α2-adrenoreceptor antagonista (Scullion és mtsai., 2011) vagy a BDA-140 kalpain inhibitoros kezelés (Trinchese és mtsai., 2008; Liu és mtsai., 2011).
Tau-modellek Az előző fejezetben említett transzgenikus egerek közös vonása, hogy nincs bennük NFK-képződés. A (mutáns) humán tau egerekben, illetve APP/tau egerekben az Aβ lerakódás tovább fokozódik, továbbá NFK-szerű képződés is tapasztalható (Gotz és mtsai., 2004; Ribe és mtsai., 2005), ugyanakkor az Aβ-plakkok és NFK-k nem mutatnak kolokalizációt. A tau patológia további tanulmányozására ma már számos tau-KO és egyszeres transzgenikus tau modell áll rendelkezésünkre. A tau-KO egerek fizikailag egészségesek, szaporodásra képesek, nem mutatnak idegrendszeri elváltozásokat, ami arra utal, hogy a tau hiánya kompenzálható más mikrotubulus-asszociált fehérjék által. A frontotemporális demenciában (FTDP-17) megjelenő tau mutáció felfedezésével számos új tau-modellt fejlesztettek ki, melyek számos fenotípust hordoznak. A legjelentősebb elváltozás a motoros deficit, a memóriazavar illetve fokozott neurofibrilláris és gliofibrilláris köteg megjelenése (Gotz és mtsai., 2007).
Amyloid-tau kombinált modellek A 3xTg a két transzgén konstrukciót (mutáns APP és tau) homozigóta mutáns PS1 egér egysejtes embriójába injektálták, elkerülve az APP és tau gének szegregációját a későbbi generációknál (Oddo és mtsai., 2003). Ezekben a 3xTg egekben az Aβ plakkok az NFK patológia előtt alakulnak ki, továbbá gyulladási folyamatok, szinaptikus funkciózavar és kognitív romlás is megfigyelhető bennük (Sy és mtsai., 2011). 2006-ban kifejlesztettek egy 5 különböző mutációt hordozó, 5xTg egértörzset a késői tünetek
hatékonyabb
tanulmányozása
céljából.
Az
5xTg
Alzheimer
modell az Aβ
overexpressziót biztosító Swedish (K670N/M671L), az APP amyloidogén hasítási útvonalát tovább fokozó Florida (I716V) és London (V717I), valamint a PS1 (M146 L + L286V) mutációkat hordozza (Oakley és mtsai., 2006). Ebben az egértörzsben az Aβ akkumuláció már 1,5 hónapos korban megjelenik, jóval megelőzve a többi egértörzsben leírtakat, azonban a törzs gyakorlati terápiás kutatásokban való alkalmasságáról még csak keveset tudunk. Eddigi bíztató eredmények, hogy a BACE1 aktivitás csökkentés, az icariin gyógynövény illetve a DCP-LA foszfokináz-C ε-specifikus aktivátor javította a szinaptikus plaszticitást és
25
csökkentette az Aβ által okozott hisztológiai elváltozások mértékét az 5xTg egerekben (Kimura és mtsai., 2010; Urano és mtsai., 2010; Hongpaisan és mtsai., 2011). 1.6.4.2. Transzgenikus patkány modellek Plakk nélküli amyloid modellek A kétezres évek elejétől kezdve az AK-ban érintett géneket kifejező transzgenikus patkányok is egyre jobban elterjedtek. Ezek a modellek fenotípusukat tekintve nagy heterogenitást mutatnak. Az első AK modellezésére kifejlesztett transzgenikus patkányban iAβ felhalmozódást, továbbá szinaptikus funkciózavart írtak le, amyloid plakkok megjelenése nélkül. Az első transzgenikus patkány modellek még nem mutatták az AK-ra jellemző klasszikus patológiai elváltozásokat (Echeverria és mtsai., 2004), amit a mérsékelt APP kifejeződés okozhat. Az UKUR25 és UKUR28 patkánytörzsek azonban jelentős intracelluláris Aβ felhalmozódást mutatnak a hippocampus és a neocortex piramissejtjeiben. Az iAβ felgyülemlése befolyásolja a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) szignalizációt (Echeverria és mtsai., 2005), fokozza a tau foszforilációt, gátolja a tanulási folyamatokat (Echeverria és mtsai., 2004), továbbá megváltoztatja a hippokampális proteomot (Vercauteren és mtsai., 2004). Ezek a modellek tehát alátámasztják a nézetet, miszerint a kognitív hanyatlás nem az Aβ plakkokkal, hanem a kis, Aβ oligomerekkel áll összefüggésben. A TgAPPswe patkányban szintén nem detektálhatóak extracelluláris plakkok vagy NFK-ek 18 hónapos korig (Ruiz-Opazo és mtsai., 2004; Agca és mtsai., 2009). Ezek az állatok közepes APP mRNS szint növekedést mutatnak, továbbá az UKUR25 állatokkal szemben jobban teljesítenek a viselkedési tesztekben, amit a genetikai hátterük különbözősége okozhat. Mivel az APP695 izoformát tipikusan az idegsejtek expresszálják az agyban, továbbá AK-os betegekben igazolták az APP695 transzkriptomok vesztését, indokolt volt a hAPP695 overexpresszáló patkánymodell kifejlesztése (Gong és mtsai., 2006). Később azonban in vivo és in vitro kísérletek is igazolták, hogy a hAPP751 overexpresszáló törzs patológiája jobban hasonlít az AK kórképéhez. Az APP21 és APP31 beltenyésztett törzsekben tovább növelték az APP expresszióját, melyet hAPP695-t hordozó rekombináns lentivírus Swedish és Indiana mutációt hordozó zigótába történő injektálásával állítottak elő (Agca és mtsai., 2008). A magas APP szint ellenére azonban ezekre az állatokra se jellemző amyloid-plakk kifejeződés.
26
A Swedish mutációt tartalmazó hAPP695-t expresszáló Tg6590 patkánytörzs iAβ akkumulációt mutat a cortex, hippocampus és cerebellum idegsejtjeiben, továbbá ezekben az állatokban memóriahanyatlás is detektálható (Kloskowska és mtsai., 2010). Az eddig említett patkánytörzsekről tehát összességében elmondható,
hogy a
szolubilis Aβ forma hatásának vizsgálatára alkalmasak, azonban az AK késői fázisára jellemző Aβ plakkok egyáltalán nem jellemzőek rájuk. Plakkot kifejező amyloid modellek Az első plakkot kifejező transzgenikus patkány modell a homozigóta kétszeresen transzgenikus
Tg487/Tg1116
törzs,
ami expresszálja a Swedish és Swedish/London
mutációkat hordozó hAPP695 gént. Ezek az állatok csak 17-18 hónapos korukban mutatnak Aβ-plakk
felhalmozódást,
melynek
megjelenése
a
preszenilin
gén
mutációjának
hozzáadásával 9 hónapos korra rövidült a PSAPP (Tg478/Tg1116/Tg11587) patkányokban (Liu és mtsai., 2008). A McGill-R-Thy1-APP egyszeresen transzgenikus patkány modell kiterjedt AK-szerű patológiával rendelkezik
a
Swedish
és
Indiana
mutációkat
hordozó
hAPP751
gén
mutációjának hatására (Leon és mtsai., 2010). Ez a modell az említett génmutáció hatására képes APP expresszióra az AK-ban érintett agyterületeken cerebelláris és perifériás szöveti expresszió nélkül, így genetikailag a legkevésbé „agresszív” modellnek tekinthető a kétszeres vagy többszörös transzgenikus modellekhez viszonyítva. Nemrégiben kifejlesztettek TgF344-AD kétszeresen transzgenikus patkánytörzset is, ami a Swedish mutációt hordozó hAPP695-öt és a PS1ΔE9 géneket expresszálja (Cohen és mtsai., 2013). A TgF344-AD patkányok korfüggő cerebrális amyloidózist mutatnak, ami megelőzi a taupátia, gliózis, apoptotózis és kognitív tünetek megjelenését.
Tau modellek A patkányok az emberhez hasonlóan 6 tau izoformát fejeznek ki, így indokoltnak bizonyult
a
már
korábban
említett
tau egérmodellek
mellett tau patológiát mutató
patkánytörzsek létrehozása is (Cente és mtsai., 2006; Zilka és mtsai., 2006; Hrnkova és mtsai., 2007; Koson és mtsai., 2008). Az tau egérmodellekhez hasonlóan ezek a törzsek is kiválóan alkalmasak a tau hiperfoszforiláció és az NFK-képződés hatásának vizsgálatára.
27
1.7. Az Alzheimer-kór hipotézisei Az AK kutatásának túlnyomó része a már korábban említett kolinerg (Cummings és mtsai., 1998; Francis és mtsai., 1999), vaszkuláris (de la Torre., 2010), tau (Fladby és mtsai., 1999; Small és mtsai., 2008), prion (Lacor és mtsai., 2007), amyloid-kaszkád (Hardy és mtsai., 1991) és mitokondriális kaszkád (Swerdlow és mtsai., 2004) hipotézisek köré csoportosul, melyek közül terjedelmi korlátok miatt az utóbbi kettő, doktori témám alapját képező elmélettel szeretnék a következőkben részletesen foglalkozni. Az amyloid-kaszkád hipotézis az egyik leginkább elfogadott gondolkodásmód a betegség etiológiáját illetően (Hardy és mtsai., 1991). E szerint az Aβ kóros felgyülemlése jelentős biokémiai, hisztológiai és klinikai változásokat generál az AK-os betegekben. Ez az elmélet az idők során tovább fejlődött, és világossá vált, hogy az Aβ formájának, aggregáltsági fokának (Orbán és mtsai., 2010) és koncentrációjának (Puzzo és mtsai., 2008) kulcsfontosságú szerepe van. Beigazolódott, hogy nem az extracelluláris Aβ lerakódások, hanem
a
szolubilis
Aβ1-42
oligomer
a
leginkább
toxikus,
betegség
kialakításában
legjelentősebb amyloid forma (Gong és mtsai., 2003; Lacor és mtsai., 2004; Walsh és mtsai., 2007). Az amyloid-kaszkád hipotézis azután alakult ki, miután a familiáris autoszómális domináns AK-ban leírták elsőként az APP, majd később a preszenilin 1 és 2 gének mutációit. Az autoszómás domináns AK-ban ezeknek a fehérjéknek a mutációja eltolja az APP hasítás folyamatát az Aβ1-42 képződés irányába. Tulajdonképpen ezt a hipotézist extrapolálták a sporadikus AK-ra is. A sporadikus AK-ban azonban nincs APP vagy PS mutáció, így a fokozott Aβ1-42 képződés oka számos, napjainkban is kutatott egyéb korai mechanizmusra vezethető vissza. Swerdlow és Kan tanulmánya szerint a mitokondriális hipotézis magyarázza legjobban a késői, sporadikus AK kialakulását (Swerdlow és mtsai., 2004), amit későbbi munkák is megerősítettek (Manczak és mtsai., 2006; Swerdlow és mtsai., 2009). A hipotézis szerint a sporadikus
AK-ban
a
mitokondriális
elváltozások
az első
események,
melyek
Aβ
lerakódáshoz, szinaptikus degenerációhoz és NFK kialakuláshoz vezetnek. A fő különbség a sporadikus és a familiáris AK között az, hogy az utóbbinál az Aβ-t valószínűsítik az első patológiai eseménynek, ami másodlagosan mitokondriális funkciózavarokhoz vezet (amyloidkaszkád hipotézis). Számos in vitro és in vivo és humán adat igazolja, hogy a mitokondriális elváltozások általánosan jellemzőek az AK-ra, kísérleti munkám is a mitokondriális hipotézis köré épül.
Mivel ez egy rendkívül intenzíven kutatott terület, a következőkben a
28
mitokondriumok általános jellemzésére, majd a legfőbb AK mitokondriális elváltozásával foglalkozó kutatási eredmények bemutatására fókuszálok dolgozatomban.
1.8. A mitokondriumok általános jellemzése A mitokondriumok anyai ágon öröklődő sejtorganellumok, melyek szinte minden sejt számára alapvető fontosságúak a fiziológiás működéshez. Számuk, alakjuk és méretük fajonként és sejttípusonként eltérő lehet a sejtek differenciáltsága és energiaszükségletének függvényében.
A
mitokondriumok
az
sejtek
eukarióta
energiatermelő
központjának
tekinthetők, egyik legfőbb feladatuk az oxidatív foszforiláció során végbemenő ATPszintézis. Alapvető funkcióik közé tartozik továbbá a Ca2+-homeosztázis fenntartása, a szinaptikus transzmisszió és plaszticitás biztosítása, az oxidatív metabolizmus valamint az apoptotikus folyamatok szabályozása (Li és mtsai., 2004b; Hollenbeck, 2005; Kann és mtsai., 2007).
1.8.1. A mitokondriumok felépítése A mitokondriumokat a sima felületű külső (KMM), illetve a mély redőket képző belső mitokondriális
membrán
(BMM)
veszi
körül.
A
KMM
fehérje:lipid
aránya
a
plazmamembránéhoz hasonlóan 1:1. Nagy mennyiségben tartalmazza a nagyméretű hidrofil csatornákat formáló 1-es típusú feszültségfüggő anion csatornát (Vdac1), vagy más néven porin fehérjét, mely következtében ~5 kDa molekulatömegig rendkívül permeábilis a citoszol molekulái számára (Colombini, 2004). A BMM 75%-ban fehérjéket tartalmaz, melyek között kiemelt fontossággal bírnak az elektrontranszportlánc (ETL) fehérjekomplexei. Speciális, erősen szigetelő lipid komponense a kardiolipin, ami biztosítja a membrán átjárhatatlanságát a kis molekulák, illetve ionok számára. A BMM által alkotott mitokondriumok hossztengelyére merőleges redők (kriszták), illetve rendezetlen lefutású csövek (tubulusok) nagy mértékben megnövelik
a
membrán
felszínét,
melynek
mérete
arányos
az oxidatív
foszforiláció
intenzitásával. A két membrán közötti ~10 nm széles intermembrán tér (IMT) összefügg a redők által határolt térrel. Itt találhatóak olyan jelentős apoptotikus faktorok, mint a citrokróm c vagy a szerin proteáz Htra2 (Htra2). A BMM által határolt mitokondriális mátrixban található a mitokondriális fehérjék közel kétharmada (melyek közül kulcsfontosságúak a citrát-kör (CK) és a zsírsav-oxidáció enzimkomplexei), továbbá a mitokondriális genom (ld.
29
1.7.3. fejezet) és fehérjeszintetizáló rendszer (cirkuláris mitokondriális DNS (mtDNS) több kópiában és a mitokondriális (70S) riboszómák). A KMM és BMM bizonyos transzlokáló fehérjéi egymáshoz kapcsolódva összefüggő csatornákat alkotnak, melyek lehetővé teszik a nukleáris DNS (nDNS) által kódolt, citoplazmában szintetizálódott mitokondriális fehérjék importját (ld. 1.8.4. fejezet) (Picard és mtsai., 2011).
1.8.2. A mitokondriális genom
6. ábra A humán mitokondriális genom felépítése (fent), és az általa kódolt elektrontranszportlánc fehérjék (lent) (kék: nDNS által kódolt alegységek, kivéve a DHOD enzimet; tovább i színek: mtDNS által kódolt alegységek). Rövidítések: Komplex I alegységek (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 és 6), komplex III citokróm b alegysége (Cyt b), komplex IV citokróm c oxidáz alegységek (COX I, II és III), komplex V alegységek (A6, A8, F0 proton transzportáló alegység, F1 katalitikus alegység), rRNS-ek (12S és 16S), tRNS-ek (egybetűs kódok), nehézlánc replikációs origó (HC) és promóter (HSP), könnyűlánc replikációs origó (OL) és promóter (LSP), ubikinon (koenzim Q, CoQ), citokróm c (Cyt c), dihidroorát dehidrogenáz (DHOD) (Schon és mtsai., 2012).
30
A humán mitokondriális genomot 37 génből álló cirkuláris, kétszálú mitokondriális DNS (mtDNS) alkotja, mely akár többezres kópiaszámban is megtalálható a sejtekben. A 37 mitokondriális gén 7 különböző komplex I alegységet (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 és 6), egy komplex III alegységet (citokróm b (Cyt b)), három komplex IV alegységet (citokróm c oxidáz) I, II és III)), két komplex V alegységet (A6 és A8), két rRNS-t (12S és 16S) valamint 22 tRNS-t (egybetűs kódok) kódol (6. ábra). Elmondható tehát, hogy a mtDNS által kódolt összesen 13 fehérje mind az oxidatív foszforilációs rendszer, azaz az ETL eleme, melynek további több mint 50 alegységét a nDNS kódolja (Anderson és mtsai., 1981). A komplex I (NADH dehidrogenáz-CoQ
reduktáz),
II
(szukcinát
dehidrogenáz),
III
(ubikinon-citokróm
c
oxidoreduktáz) és IV (citokróm c oxidáz) ETL fehérjék végzik a NADH és FADH2-től származó protonok pumpálását a mátrixból a belső mitokondriális membránon keresztül az intermembrán térbe, ezáltal biztosítva a proton gradiens kialakulását. Ezzel egyidőben az elektronok oxigénhez való transzportja révén víz keletkezik. A proton gradiens által kialakított mitokondriális membránpotenciál (Δψm) ATP szintézisre fordítódik a komplex V (ATP
szintetáz)
által,
miközben az a belső
membránon keresztül ellenkező
irányú
protontranszportot hajt végre (6. ábra). A komplex I, III, IV és V ETL alkotók mind mtDNS, mind nukleáris DNS (nDNS) által kódolt alegységeket tartalmaznak, míg a komplex II (ami egyben CK
komponens is) kizárólag nDNS által kódolt alegységekből áll. Fontos
megjegyezni, hogy az ubikinon (CoQ) a komplex I mellett a dihidroorotát dehidrogenáz pirimidin szintézisért felelős enzimtől is kap elektronokat (Schon és mtsai., 2012).
1.8.3. A mitokondriális proteom A mitokondriális fehérjék többsége a már említett nDNS által kódolt és a citoszolikus riboszómákon
szintetizálódik,
majd
egy
rendkívül
összetett,
szigorúan
szabályozott
transzportrendszeren keresztül jut a végső rendeltetési helyére. Legfontosabb útvonalait a 7. ábra
szemlélteti.
A prekurzor fehérjék
elsőként a külső mitokondriális membránban
lokalizálódó traszlokációs komplex (TOM, translocase of the outer membrane) Tom40 transzlokátorán
haladnak
keresztül
(7.
ábra/1),
majd
különböző
szétválogató
fehérjekomplexek felé mehetnek tovább (2). A preszekvenciát hordozó mátrixfehérjék a BMM-ban lokalizált TIM23
belső
transzlokációs komplex (translocase of the inner
membrane, TIM) és a hozzá asszociált PAM nevű motorfehérje (preprotein translocaseassociated motor) által jutnak a mitokondriális mátrixba, ahol az MPP (mitochondrial
31
processing peptidase) nevű proteáz hasítja le az N-teminális szignálszekvenciát (3). A fehérjék egy része laterálisan szabadul fel a TIM23 komplexből a BMM lipid fázisába (4). Az IMT
fehérjék
importját
és
feltekeredését a mitokondriális IMT-ben lokalizált MIA
(mitochondrial intermembrane space assembly) apparátus irányítja (5). A Tim9-Tim10 chaperon komplex biztosítja a hidrofób prekurzor fehérjék IMT-en keresztül történő transzportját a SAM (sorting and assembly machinery) komplexbe, majd onnan a már β-redős szerkezetű fehérjék a külső (6), vagy a TIM22 csatornáján keresztül a belső mitokondriális membránba jutnak (7). Az α-helikális KMM fehérjék nem használják a Tom40 csatornát, helyette a Mim1 (mitochondrial import 1) nevű fehérjén át jutnak a rendeltetési helyükre (8). A mitokondriális mátrix riboszómáin szintetizálódó ETL fehérjealegységek az OXA (oxidase assembly) komplexen keresztül jutnak a végső helyükre (9) (áttekintő összefoglalók: (Chacinska és mtsai., 2009; Schmidt és mtsai., 2010)).
7. ábra A mitokondriális fehérjetranszport legfőbb útvonalai a mátrix fehérjék (1, 2, 3), belső membrán fehérjék (1, 2, 4), intermembrán fehérjék (1, 2, 5), β-redős külső (1, 2, 6) illetve belső membrán fehérjék (1, 2, 7), αhelikális külső membrán fehérjék (1, 8) illetve mitokondriális riboszómákon szintetizálódott fe hérjék (9) esetében. Rövidítések: TOM: translocase of the outer membrane, TIM23, 22: translocases of the inner membrane, PAM: preprotein translocase-associated motor, MPP: mitochondrial processing peptidase, MIA: mitochondrial intermembrane space assembly, SAM: sorting and assembly machinery, Tim9-10: chaperone complex (Schmidt és mtsai., 2010).
32
1.9. A β-amyloid által okozott mitokondriális elváltozások 1.9.1. A β-amyloid mitokondriális lokalizációja és legfőbb fehérjeinterakciói Számos adat igazolja az Aβ és az APP mitokondriális jelenlétét jóval az amyloid plakkok megjelenése előtt (Takahashi és mtsai., 2002; Caspersen és mtsai., 2005; Manczak és mtsai., 2006; Pagani és Eckert, 2011). Az APP felgyülemlik a mitokondriális import csatornákban,
továbbá
komplexet
alkot
a
Tom40
és
TIM23
fehérjékkel
(Anandatheerthavarada és mtsai., 2003). A csatornákban felgyülemlett APP gátolja a sejtmagban kódolt mitokondriális fehérjetranszportot. A citokróm c-oxidáz IV-es és Vb alegységek transzportjának gátlása csökkent citokróm oxidáz aktivitást és fokozott ROS termelést eredményez (Devi és mtsai., 2006). A mitokondriális intermembrán térben lokalizálódó Htra2 direkt hasítja az APP-t in vitro és in vivo, ami elhárítja az APP felhalmozódás következtében kialakuló mitokondriális funkciózavart. A Htra2 aktivitásának szabályozása tehát egy lehetséges terápiás célpont lehet Alzheimer-kórban (Park és mtsai., 2006). A proteáz aktivitása mellett a Htra2 képes késleltetni az Aβ1-42 intracelluláris aggregációját (Kooistra és mtsai., 2009). A mitokondriumban felhalmozódott Aβ származhat az ER/Golgi rendszerből, de közvetlenül a mitokondriális membránban lokalizálódó APP-ből is (Caspersen és mtsai., 2005). Az Aβ számos mitokondriális fehérjéhez képes kötődni (Keil és mtsai., 2006; Pagani és mtsai., 2011; Pavlov és mtsai., 2011). Microarray módszerrel több mint 2000 Aβ oligomer kötőpartnert írtak le, köztük számos mitokondriális fehérjével, mint pl. a Prdx5, Hspd1, Aco2, Atp5a1, Atp5h és Gpam (Olah és mtsai., 2011). Az
Aβ
intramitokondriális
kötő
alkohol
kapcsolódása
dehidrogenáz
(ABAD)
Alzheimer-kórban
és
Aβ
emelkedett
fehérjék ROS
közvetlen képződést,
mitokondriális funkciózavart és sejthalált vált ki, alátámasztva Aβ mitokondriumra gyakorolt toxikus hatását (Lustbader és mtsai., 2004). Az ABAD-Aβ interakció gátlása in vitro és in vivo védelmet nyújt a mitokondriális funkciózavarokkal szemben, továbbá javítja a tanulási és memória folyamatokat transzgenikus APP mutáns egérben (Yao és mtsai., 2011). Egyes szintetizált ABAD inhibitorok jó gyógyszerjelölt tulajdonsággal rendelkeznek, mivel képesek átjutni a vér-agy gáton (Kooistra és mtsai., 2009; Vangavaragu és mtsai., 2014). Az ABADAβ interakció befolyásolása tehát egy lehetséges irány lehet az AK elleni terápiában. A ciklofilin D fehérje (CypD), a belső membránban lokalizálódó Vdac1 és a külső membránban
elhelyezkedő
adenozin
nukleotid
33
transzlokáz
(ANT)
a
mitokondriális
permeábilitási tranzíciós pórus (mPTP) komponensei. Az Aβ kötődik a CypD-hez, ami fokozza a szabadgyök termelést, szinaptikus funkcióvesztést indukál, továbbá fokozza a mPTP nyitódását ami apoptózishoz vezet. A CypD hiány védelmet nyújt az idegsejtek számára az Aβ- és oxidatív stressz-indukált sejthalállal szemben, továbbá javítja a tanulás és memória folyamatokat és szinaptikus funkciót Alzheimer-kór transzgenikus egérmodellben (Du és mtsai., 2008; Du és mtsai., 2011). A
mitokondriális
mátrixban
lokalizálódó
preszekvencia
proteáz
(PreP)
a
preszekvenciák illetve szerkezet nélküli fehérjék lebontásáért felel, mint például az Aβ (Pinho és mtsai., 2014). A PreP jelentős szerepet játszik az intracelluláris Aβ eltávolításában. A PreP csökkent
szintet
illetve
aktivitást
mutat
Alzheimer-kóros
agyban
illetve transzgenikus
egérmodellekben (Falkevall és mtsai., 2006). Kis benzimidazol származékok aktiválják a PreP-t, mely szintén egy ígéretes irány lehet az Alzheimer-kór kezelésére (Vangavaragu és mtsai.,
2014).
Az Alzheimer-kórban felgyülemlő
Aβ és hiperfoszforilált tau fehérjék
kötődnek a Vdac1-hez, gátolva azok működését (Manczak és Reddy, 2012). Összességében elmondható, hogy az Aβ számos mitokondriális fehérjével képes interakcióba lépni, ami az energiametabolizmusban, oxidatív anyagcserében és mitokondriális dinamikában olyan zavarokat indukál, ami végső soron az idegsejtek degenerációjához vezet. A következő fejezetekben az Aβ által okozott mitokondriális zavarok mechanizmusa kerül részletes bemutatásra.
1.9.2. A mitokondriális energiametabolizmus Alzheimer-kórban Az energiametabolizmus a mitokondriumok egyik legjelentősebb funkciója minden sejttípusban, különösen a rendkívül magas energiaszükségletű idegsejtekben (Raichle, 2010). Az agyi metabolizmus csökkenése korrelál az AK-ban bekövetkező klinikai tünetekkel. Az Aβ hatása az agyi energiatermelés folyamatára már évtizedek óta ismert (Gibson és mtsai., 1998), a részletes molekuláris háttere azonban napjainkig intenzíven kutatott terület. A mitokondriális funkciózavarok az egyik lehetséges kiváltói az AK-ra jellemző, csökkent energiatermelésnek. Számos kutatás igazolta, hogy AK során a mitokondriális ETL és CK működése súlyos zavart szenved (Hroudova és mtsai., 2014). A mitokondriális ETL és CK a glükóz lebontás két szabályozott folyamata, ami biztosítja a proton gradiens kialakulását a mitokondriális belső membránon keresztül, ami az ATP termeléshez szükséges.
34
A citokróm oxidáz az ETL végső enzime (IV-es komplex), mely a citokróm-c-ről kapja elekronjait. Parker és munkatársai írták le elsőként a IV-es komplex csökkent aktivitását Alzheimer-kóros betegek vérében, amit később számos kutatás megerősített (Parker és mtsai., 1990; Cardoso és mtsai., 2004a). A citokróm oxidáz aktivitás csökkenését MCI-ben is kimutatták, melyet az Alzheimer-kór korai stádiumának tartanak (Reddy és Reddy, 2011). Az APP transzgénikus egérben a citokróm oxidáz gének expressziója emelkedett szintet mutat 2 hónapos korban (Reddy és mtsai., 2004). Az Aβ1-42 peptid kötődik a citokróm oxidáz 1-es alegységéhez, ami magyarázhatja a IV-es komplex enzimaktivitás csökkenését és ennek következtében kialakuló metabolikus zavart AK-ban (Hernandez-Zimbron és mtsai., 2012). Az Aβ gátolja az I-es komplexet, melynek hatására a ROS szint megemelkedik (Bobba és mtsai., 2013). A mitokondriális mátrixban lokalizált piruvát dehidrogenáz (PDH) és α-ketoglutarát dehidrogenáz komplexek (αKGDH) a CK fontos sebesség meghatározó („rate-limiting”) enzimjei,
melyek
terápiás
célpontok
lehetnek
az
öregedéssel járó
neurodegeneratív
betegségekben (Gibson és mtsai., 2005; Stacpoole, 2012). A PDH és αKGDH komplexek aktivitásának csökkenését leírták AK-os post mortem mintákban (Bubber és mtsai., 2005), továbbá a PDH aktivitásának és fehérjeszintjének csökkenését is igazolták 3 hónapos 3x transzgenikus AK egérmodellben is (Yao és mtsai., 2009). Az αKGDH komplex gátlásával megnövekedett az amyloid plakkok és NFK-ek mennyisége, az Aβ oligomerek szintje és felgyorsult a tanulási és memóriafolyamatok romlása Tg 19959 egérben (Dumont és mtsai., 2009). A CK enzimjeinek aktivitásával foglalkozó átfogó tanulmány igazolta bizonyos CK enzimkomplexek aktivitásának csökkenését (PDH, αKGDH és ICDH), illetve növekedését (szukcinát dehidrogenáz (SDH) és malát dehidrogenáz (MDH)), míg egyes enzimek aktivitása nem mutatott változást (akonitáz) (Bubber és mtsai., 2005). Az Aβ kötődése a glükóz metabolizmus sebesség meghatározó enzimjeihez nemcsak csökkent ATP termeléshez, hanem a glükóz metabolitok elégtelen oxidatív lebontásához vezet,
valamint
a
toxikus
reaktív
metabolitok
zavarok kialakulását idézheti elő.
35
felgyülemlésével további mitokondriális
1.9.3. A mitokondriális oxidatív stressz Alzheimer-kórban A reaktív szabadgyökök a metabolikus folyamatok természetes résztvevői, melynek legfőbb forrásai a mitokondriumok. Az oxidatív stressz kialakulása a ROS termelés és eltávolítás közti egyensúly felborulásának
következménye.
Számos krónikus betegségre
jellemző az emelkedett ROS szint, ilyenek a mitokondriális (Enns és mtsai., 2012) és neurodegeneratív betegségek (Jomova és mtsai., 2010). A mitokondriális funkciózavarok és az oxidatív stressz alapvető szerepet játszanak az AK és más neurodegeneratív betegségek patogenezisében (Moreira és mtsai., 2006) továbbá az MCI-ben (Torres és mtsai., 2011). Mitokondriális sérülést és fokozott oxidatív metabolizmust mind az idegsejtekben, mind az asztrocitákban kimutattak, igazolva, hogy mindkét sejttípus zavart szenved az oxidatív stressz hatására AK-ban (Abramov és mtsai., 2004; Zhu és mtsai., 2006). Az oxidatív stressz perifériás markerei szintén emelkedett szintet mutatnak AK-ban, tehát a patológiás zavar nem korlátozódik az agy területére (Ghanbari és mtsai., 2004; Lopez és mtsai., 2013). A fiziológiás ROS képződés legfőbb helyszíne a legtöbb sejttípusban a mitokondriális ETL, így a mitokondriumok rendkívül érzékenyek az oxidatív stresszre (Venditti és mtsai., 2013). A mitokondriális Aβ korrelál a csökkent mitokondriális metabolizmussal és megnövekedett ROS képződéssel (Manczak és mtsai., 2006; Zhu és mtsai., 2006), továbbá károsítja a mitokondriális lipidek és fehérjék szerkezetét (Rodrigues és mtsai., 2001), gátolja a mitokondriális légzést a kulcsenzimek aktivitásának gátlásán keresztül, ami megnövekedett membrán permeabilitáshoz és citokróm-c felszabaduláshoz vezet (Casley és mtsai., 2002). Számos
tanulmány
igazolja
a
mitokondriális membránban lokalizálódó
mitokondriális ATP
fehérjék
oxidációját AK-ban.
szintetáz α-lánc és a Vdac1
A
fehérjék
oxidációját kimutatták a hippocampus régióban AK modellben, melyek csökkent aktivitásuk révén szerepet játszhatnak a neurodegeneráció folyamatában (Sergeant és mtsai., 2003; Sultana és mtsai., 2006). A mitokondriumok fiziológiás körülmények között hatékony antioxidatív rendszerrel rendelkeznek, mely védelmet nyújt a ROS toxikus hatásaival szemben. A mangán szuperoxid dizmutáz (Sod2 vagy MnSod) az egyik legfőbb antioxidáns enzim, ami védi a mitokondriumot a szuperoxid támadásokkal szemben. Transzgénikus APP mutáns egérben a mitokondriális Sod2 antioxidatív enzim hiány következtében jelentősen megnő az Aβ szint és az Aβ-plakk lerakódás az agyban (Li és mtsai., 2004a) . Kettős homozigóta APP-PS1 knock-in egérmodellben kimutatták a Sod2 a Aβ által okozott nitrációját és inaktivációját (Anantharaman és mtsai., 2006). A Sod2 csökkent aktivitása további ROS szint növekedéshez vezet és funkcionálisan károsítja a mitokondriumokat, ami a
36
mitokondriális membránpotenciál elvesztéséhez, emelkedett kaszpáz aktivitáshoz és végül apoptózishoz vezet. A
glutation
(GSH)
jelentős
szintén
komponense
a mitokondriális antioxidatív
rendszernek. A GSH szintézis kizárólag a citoszolban történik, azonban a fehérje zömében az intracelluláris organellumokban (ER, MT, sejtmag) lokalizálódik biztosítva az organellum specifikus funkciókat és a sejt túlélési folyamatát (Mari és mtsai., 2013). A mitokondriális GSH
hiányos
APP/PS1
SREBP-2
overexpresszáló
egérben
megnövekedett
mértékű
szinaptikus funkciózavart, sejtpusztulást és memóriahanyatlást figyeltek meg (Barbero-Camps és mtsai., 2013). A Tg2576 transzgenikus egérmodellben megnövekedett lipid peroxidáció megelőzi az amyloid plakkok kialakulását, ami az agyi oxidatív károsodásának Aβ lerakódás előtti megjelenésére utal (Pratico és mtsai., 2001). Magzati tengerimalac idegsejtekben a hidrogén-peroxid kezelés megnövelte az intracelluláris Aβ szintet, ami apoptozishoz vezetett (Ohyagi és mtsai., 2000).
Az oxidatív stressz által aktivált szignalizációs útvonalak képesek
befolyásolni az APP hasítási folyamatait, illetve a tau poszttranszlációs módosításait. Az oxidatív stressz megnöveli a β-szekretáz expresszióját a cJun N-terminális kináz, és a p38 MAPK szignalizációs molekulákon keresztül (Tamagno és mtsai., 2005). Számos adat alátámasztja a mitokondriális DNS (mtDNS) szerepét is az AK-ban kialakuló mitokondriális funkciózavarokban. Az emelkedett ROS szint következtében kialakuló enzimoxidáció és az Aβ akkumuláció következtében kialakuló mtDNS oxidáció csökkenti a mitokondriális energiatermelés mértékét (Swerdlow, 2011).
1.9.4. Csökkent mitokondriális dinamika és transzport Alzheimer-kórban 1.9.4.1. Mitokondriális dinamika A
mitokondriumok
mobilis
és
dinamikus organellumok,
melyek
méretüket és
alakjukat változtatva folytonos fragmentáción és fúzión mennek keresztül az axonális transzport során (Van Der Bliek és mtsai., 2013). A mitokondriumok ún. "mitokondriális hálózatot” alkotnak a nagy metabolikus aktivitású sejtekben, melyek bizonyos körülmények hatására fragmentálódnak. Fiziológiás körülmények között a mitokondriális osztódás és a fúzió folyamata egyensúlyban vannak. A mitokondriumok túlzott fragmentációja általánosan jellemző a neurodegeneratív betegségekben, mint az AK (Knott és mtsai., 2008), melyben a mitokondriumok
túlzott fragmentációja következtében megnő
mértéke és a ROS termelődés fokozódik (Reddy, 2008).
37
az oxidatív metabolizmus
A
mitokondriumok
szerkezeti,
morfológiai és dinamikai elváltozásait kimutatták
human post mortem agymintákban, transzgenikus AK-os egérmodellben és mutáns, AK-ban érintett génnel transzfektált idegsejtekben is (Cardoso és mtsai., 2004b). Részletes morfometriai vizsgálatok igazolták, hogy AK-os agyban a mitokondriális kriszták jelentős mértékben sérülnek (Hirai és mtsai., 2001), továbbá megváltozik a mitokondriumok mérete is (Wang és mtsai., 2008). Különböző transzgenikus familiáris AK egérmodellekben csökkent mitokondriális vándorlást és duzzadt mitokondriális morfológiát írtak le. Ezen felül kimutatták a szinaptikus mitokondriumok szétesését és csökkent energiatermelését
jóval a
memóriazavarok
és amyloid
lerakódások
megjelenése előtt
(Trushina és mtsai., 2012). Sporadikus AK-os betegek fibroblasztjában a mitokondriumok hosszú, elnyújtott morfológiát mutatnak, melyek sokszorosan összekapcsolódva hálózatot alakítanak ki (Wang és mtsai., 2008). A mitokondrális fúzió és “osztódás” folyamata máig nem teljesen ismert (8. ábra). A mitokondriális fúzió megindításában jelentős szerepet játszó fehérjék a mitofuzinok (Mfn1, Mfn2), melyek transzmembrán régióik segítségével a mitokondrium külső membránjában rögzülnek, homo- vagy heterodimereket alkotva. A mitokondriális fúzió során a mitofuzinok HR doménjeiken (heptad repeat) keresztül kapcsolódnak össze. A HR domének egymás mellé rendeződve
képesek
arra,
hogy
a mitofuzin GTP-áz doménjének
közreműködésével
felszabaduló energiát a membránok közelítésére fordítsák.
8. ábra A mitokondriális fúzió és osztódás folyamatában szerepet játszó fehérjék vázlatos felépítése. (Mfn1: mitofuzin-1, Mfn2: mitofuzin-2, OPA-1: optikus atrófia fehérje 1, Drp1: dinaminszerű protein 1, Fis1: mitokondriális fission 1 fehérje) (Chan, 2012) .
38
A dynamin homológ Opa1 (optikus atrófia fehérje 1) elengedhetetlen a mitokondriális membránok közötti kapcsolat kialakításában (Chan, 2012). A mitokondriális osztódásban központi szerepet
játszó
fehérje a GTPáz aktivitással rendelkező
citoszolikus Drp1
(dinaminszerű protein 1). A Drp1 a dynaminhoz hasonló szerkezettel rendelkezik, és nagy mennyiségben expresszálódik mitokondriális
membránhoz
a idegrendszerben. kötődik,
mely
Az osztódás kezdetekor a Drp1 a
folyamatot
a
különböző
poszttranszlációs
módosítások szabályozzák, mint például a foszforiláció (Chan, 2012). Egy 2015-ös munkában kimutatták, hogy a glikogén szintetáz kináz 3β-szabályozott Drp1 foszforiláció gátlása neuroprotektív hatással bír AK-os egér illetve sejtmodellekben (Yan és mtsai., 2015). A Drp1 membránhoz való kötődését külső mitokondriális fehérjék biztosítják (ilyen például a Fission 1 (Fis1) fehérje). Számos irodalmi adat igazolja, hogy AK-ban a mitokondriális fúzió illetve „osztódás” zavart szenved (Wang és mtsai., 2009; Manczak és mtsai., 2011). Az Aβ-ből származó diffúzibilis
ligandum
(ADDL)
kezelés
megrövidült,
fragmentált
mitokondriumokat
eredményez elsődleges hippokampális neuronokban, továbbá változást okoz a fúzióban és osztódásban szerepet játszó fehérjék szintjén is (Wang és mtsai., 2009). Immunoblot analízisek igazolták, hogy a Drp1 képes interakcióba lépni az Aβ monomer, illetve oligomer formáival AK-os betegekben, továbbá az AK progresszióval nő az interakciók száma. Ezen abnormális interakciók gátlása lehetséges terápiás célpont lehet a mitokondriális fragmentáció gátlására, az idegi és szinaptikus sérülések megelőzésére, továbbá a kognitív tünetek csökkentésére AK-ban (Manczak és mtsai., 2011). APP transzgenikus egér elsődleges neuronokban és Aβ kezelt egér neuroblasztóma sejtekben a Drp1 és Fis1 mRNS szintje megnő, míg az Mfn1, Mfn2 és Opa1 csökkent mRNS szintet mutat (Manczak és mtsai., 2010). Mutáns APP-t expresszáló és Aβ-t termelő human neuroblasztóma sejtekben (M17) a mitokondriumok
fragmentált
morfológiát
mutatnak,
továbbá
a
mitokondriális
fúzióban
szerepet játszó fehérjék szintje lecsökken. Az Mfn2 génkiütött egerek mitokondriumai szintén fragmentálódtak (Chen és mtsai., 2007). Oxidatív stressz hatására az Mfn2 expressziója megnő enyhe kognitív zavarban (MCI: Mild cognitive impairment), továbbá az oxidatív stressz gátlásával javulnak az MCI-ben érintett mitokondriális funkciók (Gan és mtsai., 2014). Az oxidatív stressz által aktivált extracelluláris szignál-regulált kináz (ERK) hozzájárul az MCI-ben zajló mitokondriális dinamikai zavarokhoz (Gan és mtsai., 2014). Ezen eredmények alapján tehát megállapítható, hogy a mitokondriális Aβ által okozott csökkent mitokondriális fúzió mitokondriális és az AK-ban érintett idegsejtek funkcionális zavarához vezet. Az Mdivi (Cassidy-Stone és mtsai., 2008), P110 (Qi és mtsai., 2013) Drp1
39
inhibitor komponensek és a Dynasore (Macia és mtsai., 2006) dynamin inhibitor lehetséges terápiás célpontok lehetnek a neurodegeneratív betegségek kezelésében.
1.9.4.2. Mitokondriális transzport A mitokondriális transzport kétirányú folyamat, amit számos motorfehérje biztosít (Hollenbeck, 1996; Hollenbeck és Saxton, 2005). A mitokondriumok képesek gyorsan transzportálódni az idegsejteken belül a magas energiaszükségletű helyekre (Hollenbeck, 1996; Macaskill és Kittler, 2010). A mitokondriális transzport kulcsfontosságú a szinapszis és a dendrittüskék fejlődésében, stabilitásában és funkciójában (Li és mtsai., 2004b; Mattson és mtsai., 2008). A mitokondriális transzport sérülése számos neurodegeneratív betegségre jellemző, ilyenek a Huntington-kór (Shirendeb és mtsai., 2011), Parkinson-kór (Sterky és mtsai., 2011), ALS (De Vos és mtsai., 2007) és AK (Wang és mtsai., 2008). A mitokondriumok anterográd transzportjáért a kinezin (Zinsmaier és mtsai., 2009), míg a retrográd transzportjáért a dinein motorfehérjék felelősek (Pilling és mtsai., 2006), (Hollenbeck, 1996). Ismertek továbbá olyan adaptor fehérjék (Miro, Milton, syntabulin..), melyek fontos szerepet játszanak a mitokondriumok kinezinekhez való kötésében (Liu és Hajnoczky,
Az
2009).
transzportmechanizmusok juttatására,
illetve
a
idegsejtek alakultak
ki
célterületen
való
komplex az
egyes megfelelő
felépítésének régiókban
köszönhetően a
energiaellátás
speciális
mitokondriumok és
célba
Ca 2+-homeosztázis
biztosítására. A 9. ábra a preszinaptikus, axonális és dentrittüskében zajló mitokondriális transzportot mutatja be (Sheng és Cai, 2012). A sejttesttől a disztális axonig, illetve dendritig tartó
mitokondriális
transzport
jelentősen
függ
a
mikrotubulusok
polaritásától
és
organizációjától. Az axonális mikrotubulusok pozitív vége disztálisan, míg negatív vége proximálisan, azaz a sejttest felé helyezkedik el (9/A ábra). A mitokondriumok dokkolása biztosítja a mitokondriumok megfelelő eloszlását a sejttest és axon mentén (9/A). A dentrittüskékben
a
mikrotubulusok
vegyes
irányultságúak,
így
a
kinezin
és
dinein
motorfehérjék képesek proximális és disztális irányba is transzportálni a mitokondriumokat a mikrotubulusok polaritásától függően (9/B ábra). A dendrittüskékben és a preszinaptikus végződésben az aktin formálja a fő citoszkeletális rendszert, továbbá a miozin motorfehérje biztosítja a rövidtávú transzportot (9/B, C ábra). A statikus és dinamikus mitokondriális készlet között biztosított egyfajta átjárás, ami a mikrotubulushoz dokkoló szintafilin receptor vagy az aktin kihorgonyzó rendszerének dinamikus interakciói révén valósul meg (9/C ábra). A Ranvier-féle befűződések területén magas a Na+-csatornák és a Na+/K+ ATP-ázok
40
denzitása,
ami biztosítja a gyors ingerületvezetést (9/D ábra). A kinezin és dinein
motorfehérjék biztosítják az anterográd és retrográd mitokondriális transzportot a befűződés felé. A mobilis mitokondriumok a befűződésnél mozdulatlanná válnak, és biztosítják a megfelelő energiaellátást a Na+-csatornáknak és Na+/K+ ATP-ázoknak.
9. ábra A mitokondriális transzportmechanizmus az idegsejtek különböző régióiban. A: Anterográd illetve retrográd axonális mitokondrium transzport illetve dokkolás. B: Változó polaritású mikrotubulusok a dentrittüskében. B-C: Miozin motorfehérje által biztosított rövidtávú transzport a preszinaptikus végződésben és dendrittüskében. C: A statikus és dinamikus mitokondriális készlet közötti átjárás. D: mitokondriális transzport a Ranvier-féle befűződés területén (Sheng és Cai, 2012).
A mitokondriális transzport tehát alapvető fontosságú az idegsejtek működésében, elégtelen működése számos neurodegeneratív betegségre jellemző. Az Aβ fehérje gátolja a mitokondriális transzportot hippocampális idegsejtekben (Calkins és mtsai., 2011). A mitokondriumok
mennyisége, hossza illetve anterográd transzportjuk mértéke jelentősen
lecsökken alacsony koncentrációjú, 200 nM-os Aβ oligomerrel kezelt idegsejtekben is (Du és mtsai., 2010), míg 20 μM-os koncentrációban kizárólag az anterográd transzport érintette (Calkins és Reddy, 2011). A mitokondriális transzport csökkenését transzgenikus AK egérmodellekben (Pigino és mtsai., 2003; Du és mtsai., 2010; Calkins és Reddy, 2011) és Aβ kezelt sejtkultúrákban is kimutatták (Rui és mtsai., 2006). A ciklofilin D fehérje a mPTP tagja. A mPTP egy Ca2+ számára szabadon átjárható, mindkét mitokondriális membránt átérő csatorna, melynek nyitásakor a mitokondriumba jutó proapoptotikus faktorok beindítják az apoptózis mitokondriális útvonalát. A CypD megvonás
41
védelmet nyújt az Aβ mitokondriális motilitást és dinamikát károsító hatásával szemben (Guo és mtsai., 2013b). A mitokondriumok
mennyiségének
drasztikus csökkenése, illetve transzportjának
alulműködése magyarázhatja a nagymértékű szinaptikus degenerációt AK-ban, mivel nagy mennyiségű megfelelő
aktív ATP
mitokondrium ellátásához.
szükséges
Mindezek
a
magas
alapján
energiaigényű
elmondható,
szinaptikus
hogy
a
régió
mitokondriális
transzportfolyamatok kulcsfontosságúak az AK patogenezisében.
1.9.5. A mitokondriumok kitüntetett szerepe a szinapszisban Az idegi szinapszisok a sejttesttől funkcionálisan és metabolikusan erősen elkülönült sejtkompartmentumok
(Kittel és mtsai., 2006).
A szinapszis térfogatra vonatkoztatott
energiafelhasználása rendkívül magas, ami biztosítja a membránpotenciál fenntartását (Meir és mtsai., 1999), a megfelelő neurotranszmissziót (Billups és mtsai., 2002) és lokális fehérjeszintézist (Gardiol és mtsai., 2001; Villanueva és mtsai., 2001; Sutton és mtsai., 2006). A szinapszis metabolikus szükségletének biztosítása céljából a szinapszist gliális végződések veszik körül (Wyss és mtsai., 2011). A szinapszis intenzív és dinamikus ATP termelését, az intenzív
oxigén
transzportot
és
specifikus
metabolikus
folyamatait
a
szinaptikus
mitokondriumok határozzák meg (Ames, 2000; Erecinska és mtsai., 2004; Kann és mtsai., 2007).
A
preszinaptikus
végződésekben
és
periszinaptikus
gliatalpakban
található
transzporterek és enzimek lehetővé teszik a glutamát és GABA neurotranszmitterek gliális felvételét és cserébe a szinapszis folyamatos glutamin ellátásának biztosítását az asztrociták által (Schousboe és mtsai., 2013; Tani és mtsai., 2014). A szinaptikus mitokondriumok neurotranszmisszióban betöltött specifikus szerepe alapján feltételezhető a szinaptikus és sejttestekben lokalizálódó mitokondriumok jelentős különbözősége. A hatalmas jelentősége ellenére a szinaptikus mitokondriumok fehérjekészletéről meglehetősen keveset tudunk. A szinaptikus mitokondriális proteomot a magi genom által kódolt
mitokondriális
intramitokondriális preszinaptikus
fehérjék
transzportja,
a
mitokondriális
határozza
meg
(Chacinska
fehérjeszintézis
idegvégződésben
a
mitokondriális
génexpresszió és
fehérjeszintézis
mtsai., mellett
és
az
2009).
A
egy
lokális
citoszolikus fehérjeszintetizáló rendszer is létezik, ami az mRNS transzport által fenntartott szinaptikus mRNS populációk átíródásáért felel (Hollenbeck és mtsai., 2005; Wang és mtsai., 2009; Hirokawa és mtsai., 2010; MacAskill és mtsai., 2010). A szinaptikus mRNS készlet transzlációja kulcsfontosságú tényező a szinaptikus mitokondriumok működésében (Gioio és
42
mtsai., 2001; Giuditta és mtsai., 2002; Hillefors és mtsai., 2007; Kaplan és mtsai., 2009). A szinapszisokban
zajló
proteinszintézis,
és
a
keletkezett
fehérjék
szinaptikus
mitokondriumokba történő transzportja alapján felmerül, hogy a szinaptikus mitokondriumok egy sajátos, specifikus proteinkészlettel rendelkeznek. Az azonban, hogy a szinaptikus mitokondriális fehérjék milyen szinapszisra specifikus metabolikus funkcióval rendelkeznek, nem ismert. Mindezek alapján szükség lenne egy átfogó szinaptikus mitokondriális proteomikai analízisre a szinaptikus működés fiziológiás és patológiás működésének megértéséhez. A szinaptikus mitokondriális proteom tanulmányozásához elengedhetetlen egy alaposan validált, tiszta szinaptikus mitokondrium preparátum előállítása, és elválasztása az összes többi, sejttestekben lokalizált mitokondrium frakciótól.
Az egyik
ilyen első
kísérleti munka
bemutatása a doktori disszertáció részét képezi (ld. 4.2. fejezet).
1.9.6. A szinaptikus mitokondriumok érintettsége Alzheimer-kórban A
neurodegeneratív
és
pszichiátriai
betegségeket
a
szinapszisok
fokozott
sérülékenysége és funkcionális elváltozása jellemzi, amiben az sMito-knak nagy jelentőséget tulajdonítanak (Leenders és mtsai., 1986; Kudin és mtsai., 2002; Mosconi és mtsai., 2005; Mattson és mtsai., 2008; Hattingen és mtsai., 2009). Du és munkatársai igazolták, hogy a szinaptikus mitokondriumokban nagyobb mennyiségben és előbb halmozódik fel az Aβ1-40 és Aβ1-42 formája a nem-szinaptikus mitokondriumokhoz képest (Du és mtsai., 2010), jóval megelőzve az extracelluláris plakkok kialakulását (10. ábra). Aβ25–35 kezelt patkány szinaptoszómákban megváltozik a szinaptoszómák szerkezete, az sMito-k megduzzadnak és lecsökken a szinaptikus vezikulák száma (Mungarro-Menchaca és mtsai., 2002). Aβ1–40 kezelés hatására a C57B egerekből izolált szinaptoszómákban lokalizált mitokondriumokban csökkent a membránpotenciál, megemelkedett a mitokondriális Ca2+-szint és a szabadgyök képződés (Keller és mtsai., 2000). Az sMito-kban magasabb a CypD szintje, így érzékenyebbek a Ca2+-inzultusra (Brown és mtsai., 2006; Naga és mtsai., 2007). A sMito-k hosszú életűek, azonban sérülékenyebbek a fehérjeaggregátumok hatásaira, mint a nem szinaptikusak. Aβ hatására csökken a mitokondriális légzés, a citokróm-c oxidáz aktivitás, nő az oxidatív stressz mértéke, a mPTP nyitás valószínűsége és a CypD és ABAD fehérjék expressziója (Du és mtsai., 2010). A mitokondriális funkciózavar az AK-os agy különböző régióiban nem egyenletes. A hippocampális és corticális mitokondriumok érintettebbek a káros hatásokkal szemben, mint a striatum és amygdala régiók 12 hónapos APP/PS1 és
43
APPsw egérmodellekben (Dragicevic és mtsai., 2010). Az sMito-k energiatermelésének zavara korrelál a kardiolipin profil változással 3x transzgenikus egérmodellben (MonteiroCardoso és mtsai., 2014). Jól látható tehát, hogy a sMito-k károsodása az AK progressziójának korai elváltozása, és jelentős szerepet játszik az Aβ mediált mitokondriális és idegsejtes toxikus hatásokban.
10. ábra Az Aβ fokozott felgyülemlése Tg mAPP egér szinaptikus mitokondriumában. Korfüggő Aβ 1-40 és Aβ1-42 felhalmozódás a szinaptikus (sMito) és nem-szinaptikus mitokondriumokban (nsMito) 4 és 12 hónapos kontroll (Ctr) és APP transzgenikus (Tg mAPP) egerekben (A és B). Az Aβ szint összehasonlítása sMito és nsMito között 4 hónapos TgmAPP egerekben (C). Immunarany elektronmikroszkópos képek specifikus Aβ 1-42 primer és aranyszemcse-konjugált (18 nm) szekunderrel, melyek jól szemléltetik az Aβ intramitokondriális felhalmozódását (fekete pontok) 12 hónapos Tg mAPP egerekben. A nyilak a mitokondriumokat, a csillagok a szinapszist jelölik (Mérce = 200 nm.) (Du és mtsai., 2010).
44
1.10. A mitokondriumok proteomikai kutatása Alzheimer-kórban A
proteomika
a
sejtek,
szövetek
és a szervezet fehérjeállomány (proteom)
vizsgálatával foglalkozik, melynek célja a sejtfolyamatok, valamint az ismeretlen betegség mechanizmusok
megértése,
különböző
fehérjék
funkcionális
meghatározása,
biomarker-
kutatás és gyógyszerfejlesztés (Wilkins, 2009). A fehérjeszintézist a transzláción felül a transzkripció, a degradációs, akkumulációs és transzlokációs folyamatok is befolyásolják. A gének száma az alternatív promóter, illetve splicing következtében jelentősen különbözik a fehérjék számától. A fehérjék a különböző intracelluláris folyamatok során poszt-transzlációs módosulásokon
mennek
keresztül,
melyek
tovább
növelik
a fehérjék
heterogenitását
(Harrison és mtsai., 2002). A korai, diagnosztikus értékű biomarkerek kutatása elengedhetetlen fontosságú a neurodegeneratív betegségek
kimutatása,
progressziójának követése, illetve a megfelelő
kezelési stratégiák kidolgozása érdekében. Az utóbbi évek humán agyi, cerebrospinális folyadék, illetve plazma proteomikai kutatásai jelentősen megnövelték a biomarker jelöltek találati hatékonyságát, azonban a neurodegeneratív betegségek kialakulásának megértéséhez a korai, tünetmentes humán minták hiánya miatt állatmodellek szükségesek. A teljes agyszöveti proteomikai vizsgálatok során a mintában jelen levő fehérje komponensek mennyisége széles tartományban mozog, így gyakran a nagy mennyiségben jelen levő fehérjék elfedik az alacsony kópiaszámban jelen levő fehérjéket. A nagy áteresztő képességű proteomikai technikák szubcelluláris frakcionálási módszerekkel való kombinálása azonban lehetővé tette az organellum-szintű proteomikai vizsgálatokat (Gatto és mtsai., 2010), így a kis mennyiségben jelen levő kulcsfontosságú szabályozó fehérjék vizsgálata is elérhetővé vált (Huber és mtsai., 2003). A már korábban részletesen bemutatott, AK-ra jellemző szinaptikus funkcióvesztés, továbbá
a
szinaptikus
mitokondriumok
fokozott
érintettsége
jól tanulmányozható
az
agyszövetből előállítható szinaptoszóma preparátumokon. A szinaptoszóma az agyszövet homogenizálása és gradiens centrifugálása során előállított, idegsejtek végződését tartalmazó frakció,
ami a szinaptikus mitokondriumokat és vezikulákat tartalmazó
végződésekből,
preszinaptikus
valamint a posztszinaptikus membránból és denzitásból áll (Hebb és
Whittaker, 1958; Gray és Whittaker, 1962). A szinaptoszóma preparátum roncsolásával felszabadíthatóak és tovább tisztíthatók a szinaptikus mitokondriumok (Gillardon és mtsai., 2007; Du és mtsai., 2010), melyek részletes proteomikai jellemzése, valamint AK-ban való érintettségük a doktori értekezés fő témáját alkotják.
45
2. CÉLKITŰZÉSEK Mint ahogy a bevezetőben bemutatásra került, az AK molekuláris és celluláris mechanizmusa igen összetett, a rendelkezésre álló több mint százezer irodalom alapján annyira szerteágazó, hogy a disszertáció keretei között teljességre törekedni lehetetlen. Elsőként ezért összegeznénk, hogy a kísérleti munka során milyen AK kutatási eredmények és hipotézisek alapján alakítottuk ki saját munkahipotézisünket: A. Az AK nem egy homogén betegség, inkább egy számos altípussal rendelkező betegségcsoport,
melyek
közös jellemzője az amyloid felhalmozódással és tau
hiperfoszforilációval járó demencia. B. Az AK molekulárisan hamarabb indul, mint ahogy a tünetek jelentkeznek a tanulás vagy a térbeli tájékozódás szintjén. Maga a kezdeti molekuláris mechanizmus ismeretlen és feltehetőleg heterogén az AK egyes altípusa iban. C. Az Aβ leginkább toxikus formáját nem a plakkok, hanem a szolubilis oligomerek jelentik, melyek különböző aggregációs formái eltérő fiziológiai hatással bírhatnak, amit előkísérleteink során igazoltunk in vivo. D. Az AK-ban megfigyelhető neuronális funkcionális deficit már jóval az extracelluláris Aβ aggregátumok felhalmozódása előtt, az intracelluláris Aβ hatására elkezdődik. E. Az intracelluláris Aβ egyik fontos támadáspontja a mitokondriális anyagcsere, de a pontos
mitokondriális
molekuláris
mechanizmus
feltáratlan,
gyakran
egymásnak
ellentmondó eredményekkel. F. Az idegrendszeri elváltozások szempontjából a szinaptikus mitokondriumok szerepe speciális, mivel a szinaptikus potenciálra és a neurotranszmisszióra kifejtett direkt hatása miatt a szinaptikus átvitel hatékonyságát közvetlenül képes befolyásolni. G. A mitokondriális korai változások és az Aβ felhalmozódás előrehaladtával végbemenő további
molekuláris
átrendeződések
megismerése
csak
„unbiased”
stratégiával
lehetséges, mert a mitokondrium molekuláris összetétele az AK-ban nagyon komplex módon sérül. H. A korai változások megismerésére irányuló kutatást csak állatmodelleken lehet végezni, mivel a magatartási tünetek megjelenése előtti, korai stádiumú AK-os betegekből agyminta nem áll rendelkezésre még familiáris AK esetében sem. I. A betegség csak bizonyos aspektusaival rendelkező állatmodellekből kulcsfontosságú az Aβ progresszió vizsgálatára megfelelő állatmodell kiválasztása, amin lehetséges korai molekuláris változásokat kimutatni és reprodukálni.
46
Mindezek
alapján
a
kialakult
munkahipotézisünkre
támaszkodva
egy
átfogó
mitokondriális AK mechanizmus kutatást indítottunk el, mely során az alábbi kérdéseket céloztuk meg: I.
A
szinaptikus
vizsgálata
-
mitokondriumok a
szinaptikus
és
kitüntetett
szerepének
nem-szinaptikus
molekuláris
mitokondriumok
hátterének proteomikai
összehasonlítása. Ennek érdekében célunk volt:
Tiszta, metabolikusan aktív szinaptikus, és nem-szinaptikus mitokondrium preparátumok előállítása Balb/c egerek agyszövetéből.
A preparátumok tisztaságának ellenőrzése.
A
szinaptikus
és
nem-szinaptikus
mitokondriumok
fehérjekészletének
összehasonlítása.
II.
A kapott fehérjekülönbségek funkcionális csoportosítása.
A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása független módszerekkel.
Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra – 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának és oxidatív metabolizmusának összehasonlítása. Ennek érdekében célunk volt:
Tiszta, metabolikusan aktív szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium preparátum előállítása 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek agyszövetéből.
3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának összehasonlítása
a
szinaptikus,
illetve
nem-szinaptikus
mitokondriumok
szintjén.
3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális oxidatív metabolizmusának
összehasonlítása
különböző
szubsztrátok
hatására
a
szinaptikus, illetve nem-szinaptikus mitokondriumok szintjén.
A kapott fehérjekülönbségek funkcionális csoportosítása.
A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása független módszerrel.
A
mitokondriális
fehérjeváltozások
elemzése.
47
közötti kapcsolatok
bioinformatikai
3. ANYAGOK, MÓDSZEREK A kísérletek során felhasznált állatokat 12 órás fény-sötét ciklusban tartottuk (fényben 8.00-20.00-ig tartózkodtak) 22 ± 2 ºC-os légkondícionált szobában, biztosítottuk a megfelelő folyadék
és
táplálékbevitelt,
továbbá
törekedtünk
a
felhasznált
állatok
számának
minimalizálására. A kísérletek során az Európai Közösségek Tanácsa 86/609/EEC direktívában, illetve az 1998. évi XXVIII az állatok védelméről és kíméletéről szóló törvényben, a 243/1998 az állatkísérletek végzéséről szóló kormányrendeletben és az egyetemi állatvédelmi előírásokban foglaltak szerint jártunk el, továbbá mindent elkövettünk az állatok szenvedésének és számának csökkentése érdekében.
3.1. Különböző Aβ aggregátumok fiziológiai hatásának összehasonlítása Az Aβ elektrofiziológiai hatásának vizsgálatát Dr. Orbán Gergely kollégámmal közösen végeztem. Az eredmények részletes megvitatása a „Különböző oligomerizációs fokú β-amyloid aggregátumok hatása a neuronális excitabilitásra, az Alzheimer-kór, az epilepszia és a gyulladási reakciók komplex, szinergikus mechanizmusa” című doktori dolgozata tárgyát alkotja. Dolgozatom a közösen végzett módszerek és eredmények rövid bemutatását tartalmazza, ami fontos fiziológiai előzménye az értekezésem fő témáját adó proteomikai vizsgálatoknak. 3.1.1. Homogén aggregáltsági fokú amyloid oldatok előállítása A kísérletekhez az Aβ peptid 42 aminosav hosszúságú formáját használtuk, melyet Dr. Penke Botond (SZTE, Orvosi Vegytani Intézet) bocsátott rendelkezésünkre. A szilárd fázisú peptidszintézissel előállított Aβ1-42 peptidet (Zarandi és mtsai., 2007) először 100 %-os hexafluoro-izopropanolban (HFIP) oldottuk fel (6 óra oldódási idő). A módszer előnye egyrészt, hogy a feloldás során az esetleges Aβ aggregátumok disszociálnak, és így monomer oldatot tudunk előállítani, másrészt az, hogy amennyiben a minta tartalmaz sót, az rosszul oldódik és kicsapódik HFIP-ben, így szűréssel vagy centrifugálással megszabadulhatunk tőle. Ennek érdekében a mintákat asztali Eppendorf centrifugában 10.000 g-n 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszóval dolgoztunk tovább. A HFIP-ben oldott Aβ1-42 mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, liofilizáltuk, majd további felhasználásig -80°C-on
48
tároltuk. Az aggregátumok előállításához a liofilizált mintákat mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) oldottuk fel, majd szobahőmérsékleten 0, 24, illetve 72 órát inkubáltuk.
3.1.2. Az aggregációs fok ellenőrzése a kísérletben alkalmazott oldatokban 3.1.2.1. Atomerő mikroszkópia (AFM) Az ACSF-ben oldott 0, 24, illetve 72 órás amyloid aggregátumok méretét és alakját atomerő mikroszkópia (atomic force microscope, AFM) segítségével határoztuk meg. A mérések a Semmelweis Egyetem Biofizika és Sugárbiológiai Intézetében történtek Dr. Kellermayer Miklós, Dr. Murvay Ünige és Dr. Kardos József közreműködésével. A módszer, amely akár néhány Å mérettartomány felbontásra is képes, alkalmas volt arra, hogy képet kapjunk az aggregátumok méret szerinti eloszlásáról. Munkánk során egy Molecular Force Probe 3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) típusú műszert használtunk „tapping” módban. „Tapping” módban a tűt rezgetjük, így az csak az idő kis részében érintkezik a mintával, azt kevésbé károsítja, és kisebb a pásztázás közben fellépő ellenállás is. A mért eredmény ábrázolásánál egy színskála segítségével tesszük érzékelhetővé a harmadik dimenziót, ami lehet a „z” magasság, de lehet a visszacsatolási áram, vagy a rezgő piezo-kristály és a rezgő lapka közötti fáziskülönbség, esetleg ezek kombinációja. A mérésekhez a 0, 24, illetve 72 órás mintákat ~500-szorosára hígítottuk vízben, a vékony csillámlemez (mica) felszínére felvittük, majd 2 perces inkubálás után desztillált vízzel leöblítettük. A mintát 0,5-1 Hz-en szkenneltük végig. A képeket 200 egyedi aggregátum magasságának lemérésével értékeltük ki MFP-3D szoftver segítségével (Asylum Research, Santa Barbara, CA). A nagyobb objektumokat, melyek különböző aggregátumok összetapadásából keletkezhettek, nem vettük bele az analízisbe.
3.1.2.2. Thioflavin-T fluoreszcencia A
thioflavin-T
(ThT,
Sigma-Aldrich Co.,
Budapest,
Magyarország) fokozottan
kötődik az Aβ fibrillumokhoz, míg a monomerekhez, illetve egyéb aggregátumokhoz kisebb mértékben (Naiki, 1989). Az Aβ fibrillumok jelenlétét ThT fluoreszcenciával vizsgáltuk a mintáinkban. A mérések során 3 μl Aβ mintát (0, 24, 72h) 1 ml 5 µM ThT oldattal kevertük össze 50 mM glicinben és 100 mM NaCl-ban (pH 8,5). A ThT fluoreszcencia intenzitását 485
49
nm-en monitoroztuk
445
nm gerjesztőfénnyel 25°C-on Fluromax segítségével (SPEX
Industries, Edison, NJ, USA). A gerjesztő és emissziós rést 5 illetve 10 nm-re állítottuk be.
3.1.3. Patkány hippocampális populációs tüzelésének vizsgálata Vizsgálataink
során patkány hippocampusban regisztrálható
pop-spike amplitúdó
változását (Andersen és mtsai., 1971), illetve az fEPSP meredekségét vizsgáltuk kontroll (ACSF-vel kezelt), és különböző aggregáltságú amyloid oldatok beadása után akut illetve krónikus állatokon. A kísérleteket körülbelül 250 g-os hím Sprague-Dawley (SPRD) patkányokon végeztük (Charles River Laboratories, Hungary). Az akut kísérletekben (n = 20) a kísérleti állatokat intraperitoneálisan uretánnal altattuk, 1 g/testtömeg kg dózissal (Sigma-Aldrich Co., Budapest, Hungary). Az Aβ hatás altatás
során
kialakult
módosulásának
kiküszöbölésére
méréseinket
szabadon
mozgó
állatokon is elvégeztük. 15 állatba az akut mérésekkel megegyező koordinátákkal ültettünk be elektródokat, mely során 0,6%-os halotánt használtunk az altatáshoz (Narcotane, Lecive, Prague, Czech Republic). Ezeken az állatokon egy hét regenerációs idő után végeztünk méréseket. Az állatok hőmérsékletét kisállati műtétekhez gyártott fűtőtesttel tartottuk állandó szinten (TMP-5b, SuperTech Inc, Pécs, Magyarország). A populációs tüzelés kiváltását a perforáns pálya (AP:-8,3 L:4,8 DV:3,4) bipoláris elektróddal (California Fine Wire, stainless steel 316LVM, NY Bond, bifilar) történő ingerlésével végeztük Supertech BioStim stimulátorral (11/B ábra). Percenként ingereltünk, az ingerszélesség 0,1 ms-os volt. Az ingererősséget minden kísérlet során egyedileg határoztuk meg úgy, hogy a regisztrátumon a pop-spike amplitúdója a maximális amplitúdó ~50%-a volt (11/A ábra). Mind az akut, mind a szabadon mozgó kísérletet Nihon-Kohden EEG készülékkel (Tokyo, Japan, időállandó: 5.0 s, mintavételezés: 0-10 kHz, érzékenység: 300 μV/mm), CED 1401 A/D konverter (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK) segítségével és Signal 1.9 szoftverrel regisztráltuk. A regisztráló elektródot a ventrális hippocampus gyrus dentatus hilus régiójába (AP:-4,8 L:4,5 DV:4,5) juttattuk be (11/B ábra). A bipoláris elektród két aktív felszínének távolsága 0,6-0,8 mm volt. Az elektródok pontos helyzetét Paxinos és Watson sztereotaxis koordinátái alapján határoztuk meg (Paxinos és Watson, 1982). Az elektród helyes pozícióját a válasz alakjával és nagyságával ellenőriztük. Az amyloidot illetve ACSF-et egy fém csőbe (kanülbe) illesztett „fused silica” kapillárison keresztül adtuk be (Fused Silica Capillary TSP075150) (11/B ábra). A kapilláris
50
hegye ~0,5 mm-re volt a regisztráló bipoláris elektród fölött. Az amyloid oldat koncentrációja 200 μM volt, az oldatból 1 µl–t injektáltunk a dorzális hippocampusba (KD Scientific pumpa). A beadás sebessége 0,033 µl/perc volt, a hirtelen megnövekedett nyomás- illetve térfogatváltozásból adódó műtermék elkerülése érdekében. A helyes koncentrációt egy kísérletsorozat során állítottuk be. Az amyloid oldatok aggregációs fokát az előkísérletek (n=10) eredményei, illetve az irodalmi adatok alapján határoztuk meg. Minden kísérlet elején 30 perces kontroll felvételt készítettünk, ami az adott kísérlet „alapvonalául” szolgált. Az első 30 percben regisztrált kiváltott válaszok átlaga adta az adott kísérlet
„kontroll” populációs
tüzelését
és
mezőpotenciálját,
mely
amplitúdójának
és
meredekségének százalékában fejeztük ki a kapott értékeket. A különböző minták beinjektálása a 30 perces kontroll felvétel után történt. 1 µl amyloidot adtunk be 30 perc alatt. A beadás megkezdésétől számítva 100 percig regisztráltuk az oldatok hatását. Minden közölt amplitúdó érték 10 regisztrátumon mért amplitúdó átlaga. Az adatok kiértékelése Origin 7.0 szoftverrel történt.
11. ábra Hippocampus gyrus dentatus régiójából elvezetett populációs tüzelés regisztrátuma a vizsgált paraméterek feltüntetésével (A). Az ingerlő, regisztráló és amyloid beadórendszer sztereotaxikus műtéti elrendezése (B). A regisztrátumon kékkel jelöltük a populációs tüzelés amplitúdóját, pirossal a mezőpotenciál (fEPSP) meredekségét. A beépítés során készült felvételen jól látszódnak a kisagyba épített földelés céljára szolgáló csavarelektródok, a perforáns pályába épített bipoláris ingerlő elektród, valamint a gyrus dentatusba épített kanüllel kombinált elvezető elektród.
51
3.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra, a szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepe 3.2.1. A mitokondriális kísérletekben felhasznált állatmodellek 3.2.1.1. Balb/c egérmodell A
szinaptikus
összehasonlításához
és
(n=12),
nem-szinaptikus elektronmikroszkópos
mitokondriumok (n=5)
és
fehérjekészletének
fénymikroszkópos
(n=4)
vizsgálatokhoz 3 hónapos Balb/c egereket használtunk (n=12). 3.2.1.2. APP/PS1 egérmodell Az
Aβ
akkumuláció
hatásának
proteomikai
(n=36),
funkcionális
(n=30)
és
fénymikroszkópos (n=12) vizsgálatához 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és C57BL/6 (B6) kontrol egereket használtunk fel. Az APP/PS1 kétszeresen transzgenikus modell előnye a többi APP modellel szemben, hogy növekvő Aβ1–42 /Aβ1–40 arányú amyloid képződéssel és felgyorsult Aβ-patológiával rendelkeznek, valamint a tau patológia hiányának következtében alkalmasak
az
Aβ
progresszió
hatásának
kizárólagos
vizsgálatára,
így
a
kapott
fehérjeváltozások egyértelműbb értelmezésére. A korcsoportok kiválasztása során célom volt 3 jól definiált, viselkedési és szövettani elváltozások szintjén elkülöníthető időpontot választani. Az APP/PS1 állatok teljesítése fokozatosan romlik 3-12 hónapos korig Morris water maze viselkedési tesztben (Gimbel és mtsai., 2010). Három hónapos korban az állatok tehát még nem mutatnak se viselkedési, se szövettani elváltozást. Hat hónapos korban már megjelennek az első Aβ plakkok a cerebrális cortexben, míg 9 hónapos korban kiterjedt plakk felhalmozódást írtak le a hippocampus és a cerebrális cortex területén (Jankowsky és mtsai., 2004).
3.2.2. A β-amyloid progresszió kimutatása 3, 6, illetve 9 hónapos egéragyban Az összes mikroszkópos munkában felhasznált anyag Sigma-Aldrich termék. A mikroszkópos
vizsgálatokra
12
egeret használtunk
fel (2
állat/csoport).
Az agyakat
transzkardiálisan perfundáltuk fiziológiás sóoldattal, majd 4%-os formaldehid, 0.05%-os glutáraldehid és 0,2%-os szaturált pikrinsavat tartalmazó 0,1M-os foszfát pufferrel (pH 7,4, PB) 25 percig. Ezt követően az agyakat a koponyában hagytuk másnap reggelig.
52
A dorzális hippocampust tartalmazó blokkokból 50 µm-es metszeteket készítettünk VT 1000S (Leica) vibratómmal és 0,05% nátrium-azidos 0,1M PB-ben tároltuk. A metszeteket 0,1M-os nátrium-kakodiláttal mostuk és redukált ozmiummal utófixáltuk (0,5% ozmium tetroxid, 0,75% kálium hexaciano-ferrát 0,1M nátrium-kakodilátban) 60 percig, “en bloc” festettük félig telített vizes uranil acetáttal, dehidráltuk és Durcupan gyantába ágyaztuk (Fluka). A metszeteket Cc1 kamerával felszerelt Zeiss AxioImager Z1 mikroszkóppal (Zeiss) vizsgáltuk és fényképeztük. Az elektronmikroszkópos munkához a fedőlemezt eltávolítottuk, a szomatoszenzoros kéreg és dorzális hippocampus egy kis darabját újra ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket (70 nm) 300 mesh hálóméretű réz mikrorostélyra (grid-re) helyeztük és uranil acetáttal 5 percig, majd ólom-citráttal 30 másodpercig kezeltük. A metszeteket JEOL JEM 1011 elektron mikroszkóppal (JEOL) vizsgáltuk. A képeket Olympus Morada 11 megapixel kamerával (Olympus)
és
iTEM
szoftverrel
rögzítettük
(Olympus).
A
β-amyloid
progresszió
kimutatásához végzett mikroszkópos munkák Kis Viktor közreműködésével történtek (ELTE, Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék).
3.2.3. Szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok izolálása A metabolikusan aktív szinaptikus (sMito) illetve nem-szinaptikus mitokondriumok (nsMito) izolálását már korábban leírt protokollok (Gillardon és mtsai., 2007; Du és mtsai., 2010) módosításával végeztük
(Völgyi és mtsai.,
2015b) (12. ábra). Az egereket
(n=6/csoport) dekapitáltuk, az agyakat eltávolítottuk, ACSF-ben mostuk, majd azonnal szárazjégben lefagyasztottuk, elkerülve az agyi proteomban bekövetkező változásokat. Az agyszövetet (200 mg / állat) 700 µl jéghideg izolációs pufferben (225 mM mannitol, 75 mM szaharóz, 20 mM HEPES-KOH pH=7.2, 1 mM EGTA, proteáz és foszfatáz inhibitor koktélok (Sigma-Aldrich)) homogenizáltuk előre lehűtött Dounce homogenizálóval (Kontes Glass Co.; 8 strokes Large Clearance + 8 strokes Small Clearance). Minden lépést 4°C-on jégen, illetve jéghideg oldatokkal végeztünk. A kapott homogenizátumokat lecentrifugáltuk (1300 g, 5 perc). A felülúszókat összegyűjtöttük (1 ml), majd azonos mennyiségű (1 ml) 30%-os Percoll oldattal kiegészítettük. A kapott 15%-os mintákat lépcsős Percoll gradiensre vittük fel (2 ml 40%, 24% és 15% Percoll oldat az alsó, középső és felső réteg), majd ismét lecentrifugáltuk (34,000 g, 8 perc). A centrifugálást követően a 15 és 24%-os réteg közötti határfelületnél összegyűlt sMito („band 2”), illetve a 24 és 40%-os réteg közötti határfelületnél („band 3”) összegyűlt nsMito frakciókat 2 ml-es fecskendőre helyezett szűk ámérőjű tűvel (26 gauge)
53
nyertük ki. A mintákat ezt követően ugyanazzal a fecskendőtű használatával nagy sebességgel egy másik
centrifugacsőbe juttattuk, ötszörösére higítottuk, majd ismét lecentrifugáltuk
(34,000 g, 8 perc). Ahogy a szinaptoszómák nagy sebességgel keresztül haladtak a szűk átmérőjű tűn, mechanikailag roncsolódtak, a szinapszis-specifikus struktúrák szétestek, a szinapszisban lokalizált mitokondriumok szabaddá váltak. Mivel a mitokondriumok átmérője és térfogata a szinapszisénál jóval kisebb, a mechanikai roncsolás következtében integritásuk és metabolikus aktivitásuk nem károsodott. A centrifugálást követően mindkét mitokondrium populáció leülepedett, míg a szinaptikus törmelékek a felülúszóban maradtak. Az sMito-okat illetve nsMito-okat tartalmazó laza csapadékokat kinyertük és tovább tisztítottuk izolációs pufferben való feloldást követő centrifugálással (8000 g, 15 perc). A proteomikai munkákhoz a kapott sMito és nsMito mintákat jéghideg acetonban precipitáltuk másnap reggelig.
12. ábra A szinaptikus (sMito), illetve nem-szinaptikus mitokondriumok (nsMito) izolálásának főbb lépései.
3.2.4. A mitokondrium minták tisztaságának ellenőrzése 3.2.4.1. Elektronmikros zkópia Az sMito, illetve nsMito csapadékokat 2% formaldehid és 0,5% glutáraldehid tartalmú 0,1M-os nátrium-kakodilát oldatban fixáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. A minták utófixálása 0,5%-os ozmium tetroxiddal és 0,75%-os kálium hexacianoferráttal történt 45 percen át. Ezt követően az en bloc festés félig telített vizes uranil acetáttal, a dehidrálás és beágyazás LR White gyantában történt. Az ultravékony (70 nm) metszeteket a már korábbi elektronmikroszkópos
vizsgálatokkal
megegyezően,
JEOL
JEM
1011
elektron
mikroszkóppal, és Olympus Morada 11 megapixel kamrával és iTEM szoftverrel végeztük. Az elektronmikroszkópiai vizsgálatok Kis Viktor közreműködésével történtek. A kapott képek kvantálásához 25-25 sMito és nsMito felvételt készítettünk a preparátumokról (5 kép /
54
preparátum). Az összesített mitokondriális területet az összes jelölt terület (mitokondrium, törmelék és szennyeződés) százalékában adtuk meg Image J szoftver segítségével (NIH, Bethesda).
3.2.4.2. Fluoreszcencia aktivált sejt analízis és szortolás (FACS) A agyi mitokondrium minták (ugyanazok a minták, melyeket a szinaptikus és nemszinaptikus
mitokondriális
2D-DIGE
összehasonlításánál használtunk)
kettős
jelöléséhez
NAO (nonyl acridine orange) és DiIC1 (1,1′,3,3,3′,3′-hexamethylindodicarbo - cyanine iodide; Life Technologies) festékeket használtunk. A NAO festéket (Ex 488 nm, Em 525 nm) a mitokondriális belső membránban felhalmozódó kardiolipin szelektív jelölésére (Petit és mtsai., 1994), a membránpotenciál szenzitív DiIC1-et (Ex 635 nm, Em 660 nm) a mitokondriumok integritásának és metabolikus aktivitásának ellenőrzésére használtunk. A NAO (100 nM) és DiIC1 (10 nM) festékek hozzáadását követően a mintákat fénytől védve jégen inkubáltuk 30 percig. Negatív kontrollként jelöletlen, azonos körülmények között tárolt mintákat használtunk. A festékek koncentrációját irodalmi adatok alapján határoztuk meg (Mattiasson és mtsai., 2003),
elkerülve az aspecifikus jelölődés veszélyét.
A
mintavételezéshez FACS Aria III (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) műszert használtunk. A fluoreszcens festékeket 488 nm-en Argon, 635 nm-en piros dióda lézerrel gerjesztettük. fluoreszcens
A kiértékeléshez FACS Diva szoftvert használtunk. A NAO jelölődés emisszióját
502-es
felüláteresztő
filterrel szűrtük
és
530/30
sávszűrővel
detektáltuk. A DiIC1 fluoreszcens jelét 660/20-as sávszűrővel vizsgáltuk. Mintánként 50.000 eseményt regisztráltunk és Flow Jo 7.6.1. szoftverrel analizáltuk (Ashland, OR, USA). A FACS Aria III műszeres mérések Dr. Matkó János és Tóth Eszter közreműködésével történtek (ELTE, Immunológiai Tanszék).
3.2.5. Proteomikai analízis kétdimenziós differenciál gélelektroforézissel (2D-DIGE) A 2D-DIGE analízist az összes kísérleti összeállításban (2. táblázat) egységesen, a már korábban publikált protokoll alapján végeztem (Szegő és mtsai., 2010; Györffy és mtsai., 2013). A mérések során GE Healthcare Little Chalfont, UK eszközöket, vegyszereket és szoftvert használtam. A minták jelölése 2D-DIGE „Saturation Labeling” módszerrel történt. Az acetonnal precipitált mitokondrium mintákat lízis pufferben reszuszpendáltuk (lízis puffer összetétele: 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris, 5 mM magnézium-
55
acetát). A minták pH-ját 8,0-ra állítottuk be, koncentrációjukat 2D-Quant Kittel határoztuk meg.
Az 5µg fehérjemennyiségű mitokondrium minták jelölésére CyDye DIGE Fluor
Saturation Labeling Kit-et használtunk a gyártó utasításait követve. A „Saturation Labeling” (vagy más néven „Full stain”) előnye, hogy két különböző fluoreszcens festékkel (Cy3 és Cy5) jelölt mintát tudunk ugyanazon a gélen elválasztani (13. ábra). Az egyik minta mindig a belső
standard
(„pool”),
mely az összes vizsgált mintát ugyanolyan koncentrációban
tartalmazza. A másik minta az általunk összehasonlítani kívánt csoportok mintáinak egyike (az 1. kísérleti elrendezésben pl. az sMito vagy az nsMito). Mivel a belső standard mintával egyszerre csak egy minta futtatható egy gélen, a 12 minta (6-6 csoportonként) elválasztása két sorozatban történik (mivel egy futtató tankba egyszerre 6 gél tehető). A kísérlet során esetlegesen előforduló belső hibák lecsökkentése végett a két futási sorozatban variáltuk az összehasonlítandó csoportok mintáit (az 1. kísérletben tehát: 3sMito és 3 nsMito futott együtt) (Marouga és mtsai., 2005).
1. kísérlet
2. kísérlet
3. kísérlet
4. kísérlet
5. kísérlet
6. kísérlet
7. kísérlet
cél sMito és nsMito fehérjekészletének összehasonlítása 3 hónapos APP/PS1 és B6 sMito fehérjekészletének összehasonlítása 3 hónapos APP/PS1 és B6 nsMito fehérjekészletének összehasonlítása 6 hónapos APP/PS1 és B6 sMito fehérjekészletének összehasonlítása 6 hónapos APP/PS1 és B6 nsMito fehérjekészletének összehasonlítása 9 hónapos APP/PS1 és B6 sMito fehérjekészletének összehasonlítása 9 hónapos APP/PS1 és B6 nsMito fehérjekészletének összehasonlítása
modell
csoportok jelölés minta (db) gél (db) sMito Cy5 6 Balb/c nsMito Cy5 6 12 "pool" Cy3 12 APP/PS1 sMito Cy5 6 3 hónapos B6 sMito Cy5 6 APP/PS1 12 B6 "pool" Cy3 12 3 hónapos APP/PS1 B6 6 hónapos APP/PS1 B6 6 hónapos APP/PS1 B6 9 hónapos APP/PS1 B6 9 hónapos APP/PS1 B6
APP/PS1 nsMito B6 nsMito
Cy5 Cy5
6 6
"pool"
Cy3
12
APP/PS1 sMito B6 sMito
Cy5 Cy5
6 6
"pool"
Cy3
12
APP/PS1 nsMito B6 nsMito
Cy5 Cy5
6 6
"pool"
Cy3
12
APP/PS1 sMito B6 sMito
Cy5 Cy5
6 6
"pool"
Cy3
12
APP/PS1 nsMito B6 nsMito
Cy5 Cy5
6 6
"pool"
Cy3
12
12
12
12
12
12
2. táblázat 2D-DIGE-val végzett proteomikai analízisek listája. (sMito: szinaptikus mitokondrium; nsMito: nem-szinaptikus mitokondrium; Balb/c, APP/PS1, B6: egértörzsek; Cy5: CyDye 5 fluoreszcens festék; Cy3: CyDye 3 fluoreszcens festék; pool: az összehasonlítandó csoportokba tartozó minták mindegyikét egyenlő mennyiségben tartalmazó köztes standard).
56
Az első dimenzióban zajló izoelektromos fókuszáláshoz 24 cm-es IPG strippet (pH 3– 10 NL (nem lineáris)) használtunk. Az elválasztás 24 órán át Ettan IPGphor készülékben a következő protokoll alapján történt: 30 V / 3 órás lépés, 500 V / 5 órás gradiens, 1000 V / 6 órás gradiens, 8000 V / 3 órás gradiens, 8000 V / 6 órás step mód. A fókuszált fehérjéket ekvilibráló oldatban redukáltuk 20 percig (ekvilibráló oldat összetétele: 6 M urea, 50 mM Tris (pH 8,8), 30% (v/v) glicerin, 2% (w/v) nátrium dodecil szulfát (SDS), brómfenol kék és 1% (w/v) merkaptoetanol). Ezt követően az IPG stripeket 10%-os 24x20 cm-es saját öntésű poliakrilamid
gélekre
helyeztük
(gél összetétele: 10%
akrilamid,
0,3% N,N-metilén-
biszakrilamid, 1,5 M Tris, 0,1% SDS, 0,1% TEMED, 0,05% ammóniumperszulfát, pH 8,8), 0,5%-os agarózzal rögzítettük, majd SDS-PAGE elválasztást végeztünk “Ettan DALT Six System” rendszerben. A futtatáshoz SDS-glicin-Tris puffert használtunk (1% SDS, 14,4% glicin, 3% Tris). A molekulatömeg szerinti elválasztás a következő protokoll alapján történt: 1 óra – 2 W/gél, 3 óra – 12 W/gél.
Az elválasztás végén a géleket TyphoonTRIO+ szkennerrel
detektáltuk a megfelelő lézer és szűrő beállításokat alkalmazva (Cy3: 548/560 nm, Cy5: 641/660
nm abszorpciós/emissziós maximum). A gélképeket ImageQuant TL szoftver
segítségével tettük láthatóvá.
13. ábra A 2D-DIGE munkafolyamat fő lépései Full stain fluoreszcens jelölés alkalmazásával (1-4).
A fehérjekülönbségek analízisére DeCyderTM 2D szoftver 7.0 Differential In-gel Analysis (DIA) és Biological Variation Analysis (BVA) modulokat használtunk. A DIA modul segítségével határoztuk meg az azonos gélen futtatott mintákban található (egyedi
57
minta és belső standard) fehérje foltok intenzitásainak hányadosait. A BVA modulban a különböző gélek egymásnak megfeleltethető foltjait párosítottuk, a fehérje foltok fluoreszcens intenzitását
a
minden
gélen
jelen
levő
megfelelő
köztes
standard
minta
értékeire
normalizáltuk. A szignifikáns fehérje mennyiség különbségeket független Student t-próbával határoztuk meg minden egyes fehérje foltra.
3.2.6. Preparatív kétdimenziós gélelektroforézis A
szignifikáns
változást
mutató
fehérjefoltokban
levő
fehérjék
azonosítására
preparatív 2D gélelektroforézist végeztünk, összesen 800 µg fehérje / gél felhasználásával. A második dimenziós elválasztást követően a géleket metanol és foszforsav tartalmú oldatban fixáltuk (60 perc). Az elválasztott fehérjefoltokat Colloidal Coomassie Blue G-250 (Merck, Darmstadt, Germany) festékkel tettük láthatóvá (0,05% G-250, 1% H3 PO 4 , 8% (NH4 )2 SO4 , 20% metanol). A festék eltávolítása 0,1 M Tris-oldattal (3 perc, pH 6,5), majd 25%-os metanol-oldattal történt (1 perc). A géleket a fehérjefoltok kiszedéséig 20%-os (NH4 )2 SO4 oldatban tároltuk.
3.2.7. Fehérjeazonosítás tömegspektrometriával (nanoUHPLC-MS/MS) A fehérjék tripszines emésztése a gyártó utasításai illetve egy már korábban publikált protokoll alapján történt (Ghafari és mtsai., 2014). A szignifikáns változást mutató fehérje foltokat pipettaheggyel vágtuk ki a Coomassie-val festett preparatív gélből, majd ddH2 O illetve ddH2 O/acetonitril 1:1 (v/v) pufferben feséktelenítettük a mintákat (2x15 perc). A folyadék eltávolítása után annyi acetonitrilt adtunk a mintákhoz, hogy a géldarabokat éppen ellepje, majd miután a géldarabok összeestek, eltávolítottuk az acetonitrilt. Ezt követően 100 mM-os ammónium-trikarbonáttal rehidráltuk (5 perc), majd azonos mennyiségű acetonitril hozzáadásával inkubáltuk a mintákat (15 perc), végül vákuumcentrifugával szárítottuk be a géldarabokat 51 °C-on. Ezt követően a mintákat tripszinoldattal rehidráltuk (Promega ), majd inkubáltuk 45 percig. A tripszinoldat eltávolítását követően másnapig emésztőpufferben inkubáltuk a mintákat 37 °C-on. Másnap a peptid extrakcióhoz annyi 50mM ammóniumtrikarbonátot adtunk a mintákhoz, hogy a géldarabokat ellepje, majd 15 perces inkubálás következett. Azonos mennyiségű acetonitril hozzáadásával a mintákat tovább inkubáltuk (15 perc), majd még kétszer megismételtük az extrakciót 1 % hangyasav/acetonitril 1:1 (v/v) oldatban. A minták beszárítását követően a peptideket 30 µl 0,1%-os hangyasavban vettük fel.
58
A megemésztett fehérjék azonosítását Waters NanoAcquity UPLC rendszerrel kapcsolt Micromass Q-TOF premier tömegspektrométerrel végeztük. A mintákat egyenként (5 µl-t) injektálva vittük fel az előoszlopra, majd “A” eluenssel 10 µl/perces áramlási sebességgel mostuk (3 perc). Az “A” mobil fázis 0,1%-os hangyasav/víz, a “B” mobil fázis 0,1%-os hangyasav/acetonitril volt 350 nl/perc áramlási sebességgel, Waters BEH130 C-18 75 µm x 250 mm-es oszlopon, 1,7 µm-es szemcseméretű C-18-as töltettel. A lineáris gradiens 3-10%-os (0-1 perc), 10-30%-os (1-20 perc), 30-100%-os (20-21 perc), 100% (1 perc), majd végül 3%-OS “B” eluens volt (1 perc). Az oszlop újra ekvilibrálása a kezdeti körülmények között zajlott (22 perc). Az elválasztás 45 °C-on történt. A tömegspektrométert DDA módban lockmass korrekcióval használtuk, 30 ppm névleges tömegpontossággal. A méréseket pozitív ion módban végeztük 1 Hz-es adatrögzitéssel, 400-1990-ig terjedő tömeg/töltés (m/z) tartományban
MS,
valamint
50-1990-ig
terjedő
MS/MS
beállításokkal.
A ionforrás
hőmérséklete 85°C volt, porlasztógázként nitrogént használtunk (0,5 bár). A kapilláris és belépő rés feszültségét 3,3 kV illetve 26 V-ra állítottuk. A megemésztett fehérjék azonosítása Gulyássy Péter (MTA, MS Proteomika Kutatócsoport) és Dr. Szabó Zoltán (SZTE, Orvosi Vegytani Intézet) közreműködésével történt. Az adatokat WATERS Proteinlynx GlobalServer 2.4 szoftver segítségével dolgoztuk fel. A fehérjeazonosításhoz Mascot 2.2 (Matrix Science, London, UK) szoftvert használtunk, a keresést Swissprot adatbázison, tripszines emésztési specificitást megkövetelve végeztük. A keresés során 0,15 Da fragmens és 30 ppm anyaion tömegtoleranciával dolgoztunk. A metionin oxidációja volt a megadott variábilis módosítás. Az MS/MS alapú peptid és fehérje adatok validálására Scaffold (version Scaffold 3.62, Proteome Software Inc., Portland, OR) programot használtunk. Az azonosított fehérjét akkor fogadtuk el, ha a találati valószínűsége 95% fölötti volt és legalább 2 peptiddel azonosítottuk. A fehérjék valószínűségét Protein Prophet algoritmussal határoztuk meg.
3.2.8. Funkcionális csoportosítás A
szignifikánsan
megváltozott
fehérjéket
UniProt
(http://www.uniprot.org/)
és
GeneOntology (http://geneontology.org/) adatbázisok alapján csoportosítottuk. A fehérjék csoportosítása
a
legrelevánsabb
sejtes
funkcióik
alapján
történt.
Az
APP/PS1-B6
összehasonlítás során kapott fehérjeváltozásokat az irodalom alapján ismert humán AK-os mintákban leírt változásokkal is összevetettük (3. táblázat).
59
3.2.9. A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása Western blot technikával (WB) A WB mérésekhez ugyanazokat a mintákat használtuk, mint a 2D-DIGE módszer során. A mintákat kétszeres koncentrált pufferben vettük fel (8% SDS, 3% ditiotreitol (DTT), 24% glicerol, 0.2% brómfenol kék, 100 mM Tris-HCl, pH 6,8), majd Tricines-SDSpoliakrilamid
gél elektroforézissel választottuk
el 4%-os
koncentráló,
illetve 15%-os
elválasztó poliakrilamid gélen. Az elválasztást követően a fehérjéket HybondTM-LFP PVDF (GE Healthcare) membránra vittük át. A membránokat 5% BSA tartalmú Tween 20/Tris pufferben (TBS-T) blokkoltuk 60 percig, majd TBS-T-ben mostuk 4x5 percig. A Sucla2, Idh3a, C1qbp és Sod2 fehérjék validálása Az sMito – nsMito összehasonlítás során az sMitoban felgyülemlő fehérjék közül a Sucla2 és C1qbp, az nsMitoban felgyülemlő fehérjék közül az Idh3a és Sod2 fehérjéket validáltuk. A membránokat a következő elsődleges antitestekben inkubáltuk: nyúl anti-Sucla2 (1:2500 hígításban, 12627-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA), nyúl anti Idh3a (1:2500 hígítás; 15909-1-AP; Proteintech), nyúl anti-C1qbp (1:1000 hígítás, sc-48795; Santa Cruz Biotechnology) és nyúl anti-Sod2 (1:1000 hígítás; ab68155; Abcam). A Htra2 és Ethe1 fehérjék validálása Az
APP/PS1
és
B6
sMito
összehasonlításban
a
legjelentősebb,
mindhárom
korcsoportban megjelenő változást a szinaptikus mitokondriumokban megváltozó Htra2 és Ethe1 adta, mely változásokat WB technikával is megerősítettünk. A membránokat a következő elsődleges antitestekben inkubáltuk: nyúl anti-Htra2 poliklonális antitest (15775-1AP, Proteintech) 1:1000-es hígításban, nyúl anti-Ethe1 poliklonális antitest (ab154041; Abcam) 1:500-as hígításban. A membránokat 4x5 percig mostuk TBS-T-ben, majd ECL Plex CyDye konjugált antinyúl IgG másodlagos antitestet használtunk (GE Healthcare). Ismételt TBS-T-s mosást követően Tris pufferes mosás következett, majd a membránokon jelenlévő specifikus fehérjéket
TyphoonTRIO+
szkennerrel tettük
láthatóvá.
A
fluoreszcens
intenzitásokat
ImageQuant TL szoftverrel kvantáltuk. A blottolást követően a PVDF membránokat 0,1%-os Coomassie R-250 festékben inkubáltuk 1 percig (oldószer: 50% metanol), majd 40% metanol és 10% ecetsav tartalmú oldatban festéktelenítettük 4x5 percig, majd végül dH2 O-ban 5 percig. Az egyes fehérjecsíkok denzitás értékeit a felvitt minta összfehérje mennyiségére normáltuk. Ez a normálási módszer alkalmas az olyan minták kiértékelésére, melyeknél az általános loading kontrollként alkalmazott fehérjék (Actb, Vdac1) nincsenek jelen vagy
60
változnak (Eaton és mtsai., 2013). A fehérjeintenzitások közti különbségek statisztikai analíziséhez Student t-próbát végeztünk.
3.2.10. A Sucla2, Idh3a és C1qbp fehérjék lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata Az sMito – nsMito összehasonlítás során az sMitoban felgyülemlő fehérjék közül a Sucla2
és
C1qbp,
az nsMitoban
felgyülemlő
fehérjék
közül az Idh3a
fehérjéket
immunhisztokémiával is vizsgáltuk. Az immunfestéshez a három hónapos Balb/c egereket (n=4) túlaltattuk, majd transzkardiálisan perfundáltuk 25 ml fiziológiás sóoldattal, majd 70 ml 4%-os paraformaldehiddel (oldószer: 0,1M foszfát puffer, pH=7,4). Az agyakat eltávolítottuk és 4%-os paraformaldehidben poszt-fixáltuk 24 órán keresztül, majd 20% szaharózt tartalmazó foszfát pufferbe tettük két napra. Az agymintákból 40 μm vastagságú koronális metszetsorozatot készítettünk szánkamikrotóm segítségével. Az agymetszeteken a Sucla2 és Idh3a fehérjékre dupla fluoreszcens immunjelölést, a C1qbp fehérjére DAB-os immunjelölést alkalmaztunk.
Az
immunfestés
összes
lépése
rázóinkubábor
használatával
történt
szobahőmérsékleten. Az immunfestéshez az agyszeleteket elsőként 0,1M-os foszfát pufferben (PB) átmostuk (3x10 perc), majd előkezeltük 0,5% triton és 0,05% nátrium-azid tartalmú 3%os marha szérum albumin (BSA) (oldószer: foszfát puffer) oldatban (60 perc) az aspecifikus kötőfelszínek lefedése érdekében, majd 15 perces 3%-os H2 O2 -os kezelést végeztünk az endogén peroxidázok leblokkolása céljából. (A PB-s mosási lépéseket minden további lépés között elvégeztük, melyet külön nem tüntetek fel). Ezt követően a dupla fluoreszcens immunjelöléshez a metszeteket anti-Sucla2 (1:200 hígítás) illetve anti-Idh3a (1:40 hígítás) elsődleges antitestekben inkubáltuk másnapig (a Sucla2 és Idh3a antitestek megegyeztek a WB során használt antitestekkel). Másnap biotinilált, kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitestben (1:1000 hígítás; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) inkubáltuk tovább a metszeteket (120 perc), majd FITC (fluoreszcens izotiocianát)-tiramidos hívás következett: elsőként avidin-biotin peroxidáz komplexben (1:500 higítás, ABC-komplex, Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) inkubáltuk a metszeteket 60 percig, majd 0.003% hidrogén-peroxidot
tartalmazó FITC-
tiramidos erősítéssel tettük láthatóvá a jelet (hívás ideje: 6 perc, higítás: 1:8000, 50mM Trizma pufferben, pH=8,0). A szinaptofizines (Syn) dupla jelöléshez a metszeteket anti-Syn antitestben (1:1000 higítás, DAKO, Ely, UK) inkubáltuk tovább két napig, majd szamárban termeltetett Alexa 594 anti-egér IgG másodlagos antitesttel (1:500, Molecular Probes,
61
Eugene, OR, USA) tettük láthatóvá (120 perc). Végül a metszeteket pozitívan töltött, nemzselatinozott tárgylemezre húztuk fel (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), majd a jel kifakulását meggátoló színtartó médiummal fedtük le (Prolong Antifade Kit, Molecular Probes). A metszeteket Bio Radiance 2100 Laser Scanning System Nikon Eclipse E800 konfokális mikroszkóppal vizsgáluk és fotóztuk le. A dupla immunjelölésű képeket Image J szoftverrel (NIH, Bethesda) analizáltuk. Kvantifikáláshoz a (Sucla2/Idh3a - Syn dupla jelölés) / (összes Syn jelölés) százalékos arányát adtuk meg 10-10 különböző képen, ami a Sucla2-, illetve Idh3a-pozitív mitokondriumot tartalmazó preszinaptikus végződések arányáról ad információt. A kolokalizációk számának összehasonlításához Student t-tesztet végeztünk. A DAB-os egyszeres immunjelöléshez a metszeteket nyúlban termeltetett anti-C1qbp (sc-48795, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) antitestben (1:50-es hígítás) inkubáltuk másnapig, majd biotinilált kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitestben inkubáltuk tovább a metszeteket a kettős jelölésnél alkalmazott módon. Ezt követően avidin-biotin peroxidáz komplexes (ABC-komplex, 1:500 higítás, Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) kezelés következett 1 órán keresztül, majd a peroxidáz reakció kimutatásához a metszeteket 0,3 mg/ml 3,3’-diaminobenzidint (DAB), 1 mg/ml nikkel-ammónium-szulfátot és 15 μl 30 %-os H2 O 2 -t tartalmazó hívó oldatba helyeztük (hívás ideje: 4 perc, 0,05M-os TRIS pufferben). Végül a metszeteket zselatinos tárgylemezre húztuk fel és DPX médiummal fedtük le (Sigma, St. Louis, MO).
3.2.11. A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációjának immun-elektronmikroszkópiai vizsgálata Szövetpreparálás és alacsony hőmérsékletű beágyazás elektronmikroszkópiai immunjelölésre Két Balb/c egeret túlaltattunk dietil éterrel majd transzkardiálisan perfundáltuk fiziológiás sóoldattal 30 percig, majd 4% formaldehid, 0.05% glutáraldehid és 0.2% pikrinsav tartalmú fixáló oldattal 60 percig (oldószer: 0.1M foszfát-puffer, pH=7.4). A perfúzió után a cerebellum és a dorzális hippocampus területéből kivágott blokkokat 0.1M-os foszfát pufferrel többször átmostuk. A szabad aldehidek a foszfát pufferben oldott 50-50 mM ammónium-kloriddal és glicinnel elreagáltak. A blokkokat ezt követően 0.05M-os malát pufferben mostuk háromszor (pH=5,5), majd 180 percig sötétben poszt-fixáltuk 1%-os uranil acetátban (oldószer: 0.05M-os malát puffer). A poszt-fixálás után ismételt háromszori malát pufferes mosás következett, majd a blokkokat dehidráltuk felszálló alkoholsorban. A mintákat
62
ezt követően átitattuk LR White gyantával (12 óra, -20∘C), majd 2% benzoil peroxid katalizátort tartalmazó LR White gyantával (3 óra, -20∘C). A polimerizációt házilag készített UV kamrában végeztük két DL-103 2x6W UV lámpa használatával (60 perc, -20∘C). Beágyazás utáni immuncitokémia A beágyazás utáni immunarany jelölés 400 mesh hálóméretű nikkel mikrorostélyra helyezett ultravékony metszeteken (80 nm) történt. Az összes immunreakció parafilmmel bevont 96 lyukú plate-en történt szobahőmérsékleten. A metszeteket a reagenscseppekbe helyeztük, így mindkét oldaluk átjárhatóvá vált az immunreagensek számára. A jelölés során 0.9% nátrium-klorid tartalmú 0,05M-os Tris puffert (TBS, pH=7,5) használtunk. A következő lépések szerint dolgoztunk: 5% hidrogén-peroxidos kezelés (2 perc), mosás kétszeresen desztilált vízben (biDV, 3x5 perc), 0,05M TBS-ben oldott 0,3% nátrium borohidrid és 50mM glicin oldatos kezelés (10 perc), mosás TBS-ben (3x5 perc), 10% normál kecske szérumot (normal goat serum, NGS) és 1% BSA-t tartalmazó TBS-es kezelés (30 perc), 0,05% nátriumazidot tartalmazó NGS-TBS-ben oldott nyúl anti-Idh3a antitest (1:15 higítás) vagy nyúl antiSucla2 antitest (1:25) kezelés (12 óra), mosás 2% NGS-TBS-ben (4x5 perc), 6, illetve 10 nmes aranyszemcse-konjugált kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitest kezelés (1:50 higítás, oldószer: 1% BSA-t tartalmazó TBS, 12 óra), mosás TBS-ben (3x5 perc), 2% glutáraldehid tartalmú TBS kezelés (10 perc), mosás biDV-ben, szárítás levegőn, festés 1% uranil acetát tartalmú 50%-os metanolban (30 perc) majd ólom-citrátban (30 másodperc), szárítás levegőn. Az immun-elektronmikroszkópiai vizsgálatok Kis Viktor közreműködésével történtek.
3.2.12. Az APP/PS1 – B6 modellek összehasonlítása során kapott mitokondriális fehérjeváltozások bioinformatikai analízise A
szignifikáns
mitokondriális
fehérjeváltozások
közti
kapcsolatokat
Ariadne
Genomics Pathway Studio® 9.0 szoftverrel (ResNet 9.0, 2010Q4, Ariadne Genomics, Inc, Rockville, MD, USA) elemeztük. Az összes APP/PS1 modellben szignifikánsan megváltozott mitokondriális fehérjére elvégeztük a “közös regulátor” és “közös célpont” analízist (az összes 3, 6 és 9 hónapos sMito és nsMito fehérjékre). A kapott regulátor és célpont fehérjék közül további analízisre azokat a fehérjéket választottuk ki, melyek minimum 7 kapcsolattal rendelkeznek az általunk meghatározott szignifikánsan változó mitokondriális fehérjékkel.
63
3.2.13. A mitokondriális oxigénfogyasztás összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban A
mitokondriális
oxigénfogyasztást
Clark-típusú
oxigén
elektróddal
vizsgálatuk
Oxigráf-2K magas felbontású respirációs rendszerben (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria). A mérések 37˚C-on, 2 ml-es kevertetett kamrákban történtek. Az oxigén szenzorokat levegővel
telített
oxigénmentes
médiumban
kalibráltuk.
Az
oxigén
fluxust
az
oxigénkoncentráció negatív, idő szerinti deriváltjaként számítottuk ki, (-dcO 2 /dt). Az oxigén felhasználás mérésekhez a szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium preparátumokat 0,025 mg/ml-es végkoncentrációban használtuk, melyet 2D-Quant Kittel határoztuk meg. A méréseket 3, 6, illetve 9 hónapos B6 és APP/PS1 egerek teljes agyszövetéből preparált mitokondrium mintákban végeztük (n=6-6). A mitokondrium mintákat glutamáttal és maláttal (5-5 mM) vagy szukcináttal (5 mM) energetizáltuk. Az oxigénfelvételt 10 µM, 20 µM és 2 mM adenozin difoszfát (ADP) és 2 µM karboxiatraktilozid (CAT) specifikus adeninenukleotid transzlokáz gátló hozzáadásával végeztük.
3.2.14. A mitokondriális H2 O2 termelés összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban A
peroxid-szint
Scientific) történő Red/UltraRed
mérés Amplex UltraRed
fluoreszcens festékkel (ThermoFisher
H2 O2 detektáláson alapul. Tormaperoxidáz jelenlétében az Amplex
reagens a H2 O 2 -dal reakcióba lép
1:1
sztöchiometriával,
ami erősen
fluoreszcens rezorufint képződésével jár. A peroxid szint mérésekben felhasznált sMito és nsMito
preparátumok
megegyeztek
a
mitokondriális
oxigénfogyasztás
vizsgálatokban
alkalmazott csoportokkal (3, 6, illetve 9 hónapos B6, illetve APP/PS1 egerek). A 0,025 mg/ml-es mitokondrium mintákat 5 mM glutamát + malátot vagy 5 mM szukcinátot tartalmazó standard médiumban inkubáltuk, majd hozzáadtuk a tormaperoxidáz (5U / 2 ml) és Amplex UltraRed (2 μm) reagenseket. A H2 O2 képződést 37°C-on PTI Deltascan (Photon Technology International; Lawrenceville, NJ) fluoreszcens spekrofotométerrel detektáltuk. A H2 O 2 termelődést 2 mM ADP, 1 µM rotenone (komplex I inhibitor) és 250 µM trifluorokarbonilcianid
fenilhidrazon
(FCCP)
(elektrontranszport szétkapcsoló) hozzáadása
mellett követtük. A gerjesztési hullámhossz 550 nm volt, a fluorenszens emissziót 585 nm-en detektáltuk. Minden mérés végén különböző mennyiségű H2 O2 oldatok hozzáadásával kalibrációs görbét vettünk fel. Az eredményeket relatív H2 O2 szint értékekben adtuk meg (a kontroll/B6
egerek
kísérleti eredményeinek
százalékában).
A szignifikáns különbségek
megállapításához Student t-próbát végeztünk (p<0,05). Az oxigénfogyasztás és H2 O 2 szint mérések Dr. Tretter László (SOTE, Orvosi Biokémiai Intézet) közreműködésével történtek.
64
4. EREDMÉNYEK 4.1. A különböző Aβ aggregátumok sejtek excitabilitására gyakorolt fiziológiai hatásának eredményei 4.1.1. Az Aβ oldatok in vitro karakterizálása A monomer Aβ1-42 fehérjét mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) oldott formában használtuk fel az in vivo kísérletekhez. A különböző aggregátum típusok előállításához az amyloid oldatokat szobahőmérsékleten inkubáltuk 0, 24, illetve 72 órán keresztül. Az Aβ különböző méretű és morfológiájú aggregátumokat formál egy adott oldatban, így az Aβ oldatok karakterizálása nehézkes. Az aggregátumok
méretét
és
alakját
AFM
segítségével határoztuk
meg.
A
csillámlemez felszínén mért magasságértéke az aggregátumnak arányos az aggregátum vastagságával, átmérőjével. A 14. ábra az aggregátumok méret szerinti eloszlását mutatja meg a 0, 24, illetve 72 órás mintákban. A 0 órás oldat jól láthatóan többnyire ~ 0.5 nm-es magasságú monomereket tartalmaz. Az 0 órás Aβ oldat komponensei nagy affinitással kötődnek a csillámlemez felszínéhez és egymáshoz az AFM minták preparálása során (14/C ábra). A 24 órás inkubációnál döntően ~1-1,5 nm magasságú kis oligomereket és aspecifikus aggregátumokat láthatunk, illetve kevesebb ~2-3 nm magas, nagyobb aggregátumot (14/D ábra). A háttérben a csillámlemez felszíne tisztább, mint a 0 órás minta esetében, ami a monomerek lecsökkent mennyiségét mutatja. A 72 órás mintában a kisebb oligomerek száma lecsökkent, 2-4 nm magasságú nagyobb aggregátumok figyelhetőek meg (14/E ábra). A méreteloszlást mutató grafikon alapján látszik, hogy a különböző aggregáltsági fokú oldatok monomer oldatból történő előállítása lehetséges. A 2-3 nm magasságú oligomer méret megegyezik
Stine
és mtsai által 2003-ban publikált, PB-ben történő oligomerizációs
eredményével (Stine és mtsai., 2003). Ezt a magasság tartományt protofibrillumnak is karakterizálták, azonban a mi mintánkban az aggregátum szférikusnak vagy rövidebbnek tűnik (<20-30 nm). A 72 órás oldat lokális maximum ~1, 2.4 és 3 nm magas volt a mennyiségi eloszlás vizsgálata során (14/A ábra), ami az oldatban található különböző oligomer
formák
jelenlétére
utal,
azonban
meg
kell
jegyeznünk,
hogy
a
pontos
oligomerizációs fok nem mérhető AFM-mel. A thioflavin-T (ThT) fokozott intenzitással kötődik az Aβ fibrillumokhoz, míg a monomerekhez, illetve egyéb aggregátumokhoz alacsonyabb mértékben (Naiki és mtsai., 1989). Az Aβ fibrillumok jelenlétét ThT fluoreszcenciával vizsgáltuk a mintáinkban. A 0 órás
65
mintában alacsony a ThT fluoreszcencia, amiből arra következtethetünk, hogy a mintában többnyire monomerek vannak jelen. A 24 órás, illetve a 72 órás mintában szignifikánsan magasabbak a fluoreszcencia intenzitás értékek. A minták ThT fluoreszcencia intenzitása tehát az inkubációs idővel növekszik, ami alátámasztja az aggregáció előrehaladását (14/B ábra).
14. ábra A. Összetevők méret szerinti mennyiségi eloszlása (0, 24, 72h-s Aβ); B: Thioflavin-T fluoreszcencia intenzitás (0, 24, 72h-s Aβ) ; C-E: AFM felvételek (0, 24, 72 órás Aβ) (Orbán és mtsai., 2010).
4.1.2. Elektrofiziológiai eredmények Az urethánnal altatott állatokban a tisztán amyloid monomereket tartalmazó oldat (0 órás Aβ1-42 , 1 μl, 200 μM) hatására a hippocampális populációs tüzelés vizsgálatakor nem kaptunk szignifikáns változást. A 24 órán át szobahőmérsékleten aggregáltatott amyloid minta (24 órás Aβ1-42 ) növelte, míg a 72 órán át aggregáltatott amyloid oldat (72 órás Aβ 1-42 ) csökkentette a populációs tüzelés amplitúdóját az ACSF-vel kezelt kontroll csoporthoz képest. Az idegsejtek excitabilitására gyakorolt szignifikáns hatást 40 perccel az injektálást követően tudtunk regisztrálni (15/A. ábra). Szabadonmozgó állatokban a 24 és 72 órás Aβ1-42 oldatok hatása még kifejezettebb volt. Az idegsejtek excitabilitására gyakorolt hatás már az injektálás megkezdésétől kezdve megfigyelhető volt, szignifikáns különbséget 30 perccel az Aβ injektálást követően mutatott (15/B. ábra). A kísérlet során végigkövettük a különböző oldatok hatását az excitatórikus posztszinaptikus potenciál meredekségére (pEPSP), változást azonban nem tapasztaltunk egyik aggregátum esetében sem (15/C, D).
66
15. ábra Altatott (A, C) illetve szabadon mozgó (B, D) kísérletek populációs tüzelés amplitúdójának és fEPSP meredekségének változása (Orbán és mtsai., 2010).
Eredményeink feltárták, hogy a különböző aggregáltsági fokú amyloid oligomer oldatok ellentétes hatással bírnak a sejtek excitabilitására in vivo. Az Aβ-infúziós modellek előnye tehát, hogy míg a transzgenikus modellekben az APP overexpresszió hatására nem csak az Aβ1–40 és/vagy Aβ1–42 akkumulálódik, hanem a többi APP fragmens is (melyek neuroprotektív vagy neurotoxikus hatással rendelkezhetnek), addig az infúziós modellekkel a különböző formájú Aβ kezelések kizárólagos hatását hasonlíthatjuk össze (ld. fentebb). Másrészről viszont nem modellezik az öregedéssel együtt járó AK progressziót, továbbá az Aβ kezelés hatására jóval magasabb Aβ-koncentráció alakul ki lokálisan az agyban, mint az AK-os betegek agyában vagy a gerincvelői folyadékukban (Vickers és mtsai., 2000). Az invazív Aβ-infúzió hatására ráadásul elkerülhetetlen az agyszövet sérülése, ami gyulladást indukál, így részletes molekuláris vizsgálatokra kevésbé alkalmas. A további, dolgozatom fő témáját
alkotó
proteomikai
Aβ-hatás
vizsgálatainknál
transzgenikus egérmodellt alkalmaztunk (ld. 4.3. fejezet).
67
ebből
kifolyólag
non-invazív,
4.2. A szinaptikus én nem szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának eredményei 4.2.1. A mitokondrium preparátumok tisztaságának igazolása elektronmikroszkópiával Az elektronmikroszkópos képek alapján az sMito és nsMito preparátumok is tiszta mitokondrium frakciókat tartalmaznak. A mitokondriumok morfológiája mindkét esetben megőrződött, a mitokondriális membránok, illetve a mátrix jól láthatóak (16. ábra). A mitokondriumok összterületének aránya az összes struktúra területének arányában 92,9 ± 0,6% volt az sMito és 97,7 ± 0,25% (n=25-25 kép) az nsMito preparátumokban.
16.
ábra
A
mitokondrium
preparátumok
validálása
elektronmikroszkópiával.
Reprezentatív
elektronmikroszkópos képek a nem-szinaptikus (A1-3) és szinaptikus (B1-3) mitokondrium mintákról. Jól látható, hogy a preparátumok szinte teljes egészét mitokondriumok alkotják. A mitokondriumok százaléka (mitokondriumok összterülete / összes struktúra területe (mitokondrium + azonosíthatatlan törmelékek, szennyeződések)) a szinaptikus (C) és nem-szinaptikus (D) mintákban. (Mércék = 1 µm az A1 és B1, 0.5 µm az A2 és B2, továbbá 0,25 µm az A3 és B3) (Völgyi és mtsai., 2015b).
68
4.2.2. A mitokondrium preparátumok tisztaságának igazolása FACS technikával A Balb/c sMito és nsMito mintákból (n=6-6) 50.000 eseményt analizáltunk FACS Diva és Flow Jo 7.6.1. szoftverek segítségével. A tisztaság ellenőrzésére minden sMito és nsMito preparátumot NAO és DIIC1 festékekkel jelöltünk. Minden preparátum több mint 95%-ban NAO-ra és több mint 92%-ban DiIC1-re pozitív volt a jelöletlen kontrollhoz képest (17. ábra).
17. ábra A szinaptikus (A, B1, B2, D and F) és nem-szinaptikus (C and E) mitokondrium minták reprezentatív FACS analízise (NAO: a mitokondrium belső membránjában felhalmozódó kardiolipint jelölő festék, DiIC1: mitokondriális membrán potenciál szenzitív festék). Az FSC (forward scatter) / SSC (side scatter) dot plot ábra (A) a mitokondrium partikulumok kapuzási stratégiáit jelentik, ami minden minta esetében ugyanaz volt. Jelöletlen (B1) és NAO és DiIC1 festékekkel kétszeresen jelölt (B2) minták reprezentatív dot plot ábrája. A kvadráns analízis a minta homogenitását/tisztaságát mutatja. A NAO pozitív (C, D), illetve DiIC1 pozitív (E, F) partikulumok leválogatása szintén szelektív és homogén festődést mutat mind a szinaptikus (D, F), mind a nemszinaptikus mitokondriumok esetében (C, E) (Völgyi és mtsai., 2015b).
69
4.2.3. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közötti fehérjekülönbségek Spotszám Génnév citromsav-ciklus 115 Aco2 116 Aco2 119 Aco2 251 Dlat
Azonosító Fehérje név (Uniprot)
AR
p érték
lokalizáció (Uniprot)
Q99KI0 Q99KI0 Q99KI0 Q91VD9
-1,57 -1,79 -2,08 -1,64
5,78E-03 1,89E-03 9,16E-04 7,12E-07
mitokondrium, sejtmag mitokondrium, sejtmag mitokondrium, sejtmag mitokondriális mátrix
-1,76
3,12E-07 mitokondriális mátrix
-1,66
1,73E-04 mitokondriális mátrix
-1,57
1,01E-07 mitokondriális mátrix
-1,55
1,83E-03 mitokondriális mátrix
-1,71
7,36E-08 mitokondriális mátrix
-1,71
3,04E-06 mitokondrium
2,24
5,00E-04 mitokondriális mátrix
-1,93
8,53E-07 mitokondrium
-2,28
2,63E-08 mitokondrium
-1,75
2,03E-03 mitokondrium
-1,76
1,29E-05 mitokondrium
-1,29 -1,56 -1,76
2,04E-04 mitokondrium 4,80E-03 mitokondrium 8,31E-06 mitokondriális mátrix
-1,58
8,68E-06 mitokondriális mátrix
2,70
1,01E-07 mitokondrium
2,99
1,87E-08 mitokondrium
2,32
2,28E-06 mitokondrium
-1,59 -1,42 -1,59 -1,68 -1,59 2,64 2,64 2,41 2,60 -1,38 -1,56 -1,70 -1,69 -1,63 -1,45 -1,46
2,62E-03 1,27E-04 7,62E-06 2,69E-05 2,21E-04 1,13E-06 6,57E-07 3,79E-08 8,83E-09 3,04E-03 4,20E-05 6,39E-04 4,18E-06 3,55E-05 8,94E-03 2,06E-05
Aconitate hydratase, mitochondrial Aconitate hydratase, mitochondrial Aconitate hydratase, mitochondrial Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 254 Dlat Q99MR8 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 257 Dlat Q8BMS1 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 258 Dlat Q64521 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 428 Pdhx P38647 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial 433 Pdhx Q64521 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial 478 Dlst P38647 Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, 568 Pdha1 P38647 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial 729 Idh3a P38647 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 734 Idh3a Q64521 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 735 Idh3a P38647 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 747 Idh3a P38647 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 782 Mdh1 P14152 Malate dehydrogenase, cytoplasmic 802 Mdh1 P14152 Malate dehydrogenase, cytoplasmic 840 Pdhb Q64521 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial 841 Pdhb P63017 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial 1691 Sucla2 P38647 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial 1692 Sucla2 P38647 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial 1693 Sucla2 Q8BMF4 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial protein transzport és feltekeredés 178 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial 183 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial 184 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial 188 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial 192 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial 206 Hspa8 Q9CZ13 Heat shock cognate 71 kDa protein 210 Hspa8 Q9CZ13 Heat shock cognate 71 kDa protein 213 Hspa8 Q9D0K2 Heat shock cognate 71 kDa protein 216 Hspa8 P30275 Heat shock cognate 71 kDa protein 331 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 335 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 336 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 339 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 345 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 382 Cct2 P80314 T-complex protein 1 subunit beta 387 Cct2 P80314 T-complex protein 1 subunit beta
(folytatódik)
70
mitokondrium mitokondrium, sejtmag mitokondrium, sejtmag mitokondrium, sejtmag mitokondrium, sejtmag citoplazma citoplazma citoplazma citoplazma mitokondriális mátrix mitokondriális mátrix mitokondriális mátrix mitokondriális mátrix mitokondriális mátrix citoplazma citoplazma
Spotszám Génnév Azonosító Fehérje név (Uniprot) elektrontranszport-lánc 127 Ndufs1 Q8BMF4 NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit, mitochondrial 368 Dld O08749 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial 507 Uqcrc1 P63260 Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial
AR
p érték
-1,54
519
Uqcrc1 Q9CZ13
Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial
-1,26
525
Uqcrc1 Q9CZ13
Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial
1,37
1347
Ndufs8 P63038
1580
Cyb5a
Q9D0K2
NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8, 2,88 mitochondrial Cytochrome b5 1,50
7,81E-05 mitokondriális belső membrán 6,75E-05 mitochondrion matrix 1,34E-02 mitokondriális belső membrán 5,39E-03 mitokondriális belső membrán 1,06E-02 mitokondriális belső membrán 6,29E-08 mitokondrium
1582 1663
Fdx1l Cox5a
Q99MN9 P80314
Adrenodoxin-like protein, mitochondrial Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial
1,98 -1,36
8,10E-08 mitokondrium 1,76E-04 mitokondriális belső membrán
ATP metabolizmus 374 Pccb P62874 494 Atp5b P56480
Propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial ATP synthase subunit beta, mitochondrial
-2,13 2,82
495
Atp5b
ATP synthase subunit beta, mitochondrial
2,58
515
Atp5a1 Q03265
ATP synthase subunit alpha, mitochondrial
2,16
1354 1386
Ak1 Atp5h
Q9R0Y5 Q9DCX2
Adenylate kinase isoenzyme 1 ATP synthase subunit d, mitochondrial
1,64 -1,32
1694 553
Ckb Ckmt1
Q9WUK2 Creatine kinase B-type P18760 Creatine kinase U-type, mitochondrial
-1,61 -1,34
560
Ckmt1
P08228
Creatine kinase U-type, mitochondrial
-1,56
6,83E-06 mitokondriális mátrix 7,10E-05 mitokondriális belső membrán 3,86E-07 mitokondriális belső membrán 1,82E-05 mitokondriális belső membrán 2,96E-05 citoplazma 4,10E-04 mitokondriális belső membrán 2,87E-05 mitokondrium, citoplazma 2,40E-03 mitokondriális belső membrán 4,56E-04 mitokondriális belső membrán
Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Peroxiredoxin-5, mitochondrial
-1,849 -1,4796 -1,66 3,08
P56480
oxidatív stressz és apoptózis 1370 Sod2 P09671 1372 Sod2 P09671 1377 Sod2 P09671 1484 Prdx5 Q9R063 1522 1686
Sod1 C1qbp
P08228
-2,11 -1,20
-1,85 -1,26 2,90 3,12 3,15 3,10 1,60
5,39E-03 8,63E-09 1,70E-07 1,01E-07 1,00E-08 3,47E-06
1,75 3,70
590 Actg1 P63260 609 Actg1 P63260 iontranszport 393 Atp6v1b2Q60930 402 Atp6v1b2Q60932 910 Vdac2 Q9WUK2
Actin, cytoplasmic 2 Actin, cytoplasmic 2
1,39 3,02
V-type proton ATPase subunit B, brain isoform V-type proton ATPase subunit B, brain isoform Voltage-dependent anion-selective channel protein 2
2,07 2,83
929
Vdac2
Q60930
Voltage-dependent anion-selective channel protein 2
-1,58
941
Vdac1
Q60932
Voltage-dependent anion-selective channel protein 1
-1,59
967
Vdac2
Q60930
Voltage-dependent anion-selective channel protein 2
-1,51
71
1,37E-03 mitokondrium, ER, membrán
mitokondrium mitokondrium mitokondrium mitokondrium, citoplazma, peroxiszóma 1,56E-08 citoplazma, sejtmag 3,95E-10 mitokondrium, citoplazma, membrán, 5,01E-03 mitokondrium
Superoxide dismutase [Cu-Zn] Complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial 1700 Htra2 Q9JIY5 Serine protease HTRA2, mitochondrial citoszkeleton organizáció és sejtmozgás 843 Capza2 Q9Z2I9 F-actin-capping protein subunit alpha-2 1494 Cfl1 Q04447 Cofilin-1 1690 Dpysl2 O08553 Dihydropyrimidinase-related protein 2 276 Dpysl2 Q9D6R2 Dihydropyrimidinase-related protein 2 280 Dpysl2 P14152 Dihydropyrimidinase-related protein 2 927 Mpst Q9JIY5 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase
(folytatódik)
lokalizáció (Uniprot)
2,19
5,23E-07 0,003439 0,000102 2,57E-09
citoplazma, membrán citoplazma mitokondrium, citoplazma mitokondrium, citoplazma mitokondrium, citoplazma mitokondrium, citoplazma, szinapszis 4,78E-02 citoplazma 5,02E-07 citoplazma 3,20E-06 membrán 2,03E-08 membrán 6,03E-05 mitokondiális külső membrán 8,60E-06 mitokondiális külső membrán 1,31E-05 mitokondiális külső membrán, membrán 8,42E-04 mitokondiális külső membrán
Spotszám Génnév Azonosító Fehérje név (Uniprot) glükóz metabolizmus 168 Gpd2 Q64521 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, mitochondrial
AR
p érték
-1,39
181
Gpd2
Q64521
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, mitochondrial
-1,48
195
Gpd2
Q64521
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, mitochondrial
-1,57
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
-1,77
1,71E-02 mitokondriális belső membrán 8,17E-05 mitokondriális belső membrán 2,77E-04 mitokondriális belső membrán 3,25E-03 citoplazma, sejtmag
Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial
-1,97 -1,50 -1,75
2,03E-04 mitokondriális mátrix 9,49E-05 mitokondriális mátrix 2,49E-06 mitokondriális mátrix
Alpha-synuclein Alpha-synuclein Alpha-synuclein
2,90 2,16 2,58
2,88E-05 citoplazma, mitokondrium 1,15E-07 citoplazma, mitokondrium 4,08E-07 citoplazma, mitokondrium
Methylcrotonoyl-CoA carboxylase subunit alpha, mitochondrial Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase [acylating], mitochondrial
-1,53 -2,06
1,32E-02 mitokondriális belső membrán és mátrix 1,51E-05 mitokondrium
Trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial Trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial
-1,67 -1,77
2,18E-02 mitokondriális mátrix 3,98E-03 mitokondriális mátrix
Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1, mitochondrial Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1, mitochondrial
-2,13
6,83E-06 mitokondriális mátrix
-2,06
1,51E-05 mitokondriális mátrix
laktát metabolizmus 803 Ldhb Q9CPW2
L-lactate dehydrogenase B chain
1,75
9,74E-05 mitokondrium, citoplazma
806
L-lactate dehydrogenase B chain
2,49
1,39E-04 mitokondrium, citoplazma
Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1
-1,36
3,55E-05 -
-1,53
1,96E-04 -
Polymerase delta-interacting protein 2
-1,77
3,25E-03 mitokondrium, sejtmag
Proteasome subunit alpha type-1
-1,47
7,31E-04 citoplazma, sejtmag
Eukaryotic translation initiation factor 4H
-1,90
1,49E-08 citoplazma
Prohibitin
-1,41
3,73E-04 mitokondriális belső membrán, sejtmag, membrán
glutation metabolizmus 1332 Gstp1 P19157
Glutathione S-transferase P 1
2,37
6,95E-06 mitokondrium, citoplazma, sejtmag
nukleotid metabolizmus 1523 Nme1 P15532
Nucleoside diphosphate kinase A
2,49
2,84E-08 citoplazma, sejtmag
792 Gapdh P16858 alkohol metabolizmus 418 Aldh2 P19157 419 Aldh2 Q8K3J1 430 Aldh2 Q9R0Y5 szinaptikus transzmisszió 1543 Snca O55042 1544 Snca O55042 1547 Snca O55042 aminosav metabolizmus 162 Mccc1 O08749 384
Aldh6a1 Q9D0K2
lipid metabolizmus 166 Hadha P80314 170 Hadha Q8BMS1 ketontest metabolizmus 374 Oxct1 P14152 384
Oxct1
Ldhb
P16125
P12787
szignáltranszdukció 829 Gnb1 O08553 837
Gnb1
Q9Z2I9
mitokondriális morfogenezis 792 Poldip2 P56395 protein degradáció 959 Psma1 Q9R1P4 fehérjeszintézis 968 Eif4h Q9WUK2 transzkripció szabályozás 1070 Phb P67778
lokalizáció (Uniprot)
3. táblázat A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közötti fehérje különbségek funkcionális osztályozása. A piros (növekvő) és kék (csökkenő) színgradiensek a szinaptikus mitokondriumban lokalizálódó fehérjék arányát érzékeltetik a nem-szinaptikus mitokondriumhoz viszonyítva. (AR: „average ratio”, a fehérjék változásának mértéke) (Völgyi és mtsai., 2015b).
72
Összesen ~1200-1300 értékelhető fehérjefoltot detektáltunk minden egyes 2D-DIGE gélen, melyek közül 103 szignifikánsan különbözött a Balb/c egér agyi sMito és nsMito mintákban. A 18. ábrán látható reprezentatív 2D-DIGE gélkép a szignifikáns fehérje foltokat (p<0.05) szemlélteti. Az sMito mintákban 36 fehérjefolt intenzitása szignifikánsan magasabb, míg 67 fehérjefolté szignifikánsan alacsonyabb volt az nsMito mintákhoz viszonyítva. A fluoreszcencia intenzitások
változásának
mértéke („fold
change”) -2,28 – 3,70-szeres
tartományba esett (19. ábra), ahol a negatív értékek a csökkent, a pozitívak a növekvő fehérjemennyiségeket jelzik az sMitokban, az nsMitohoz képest. Harminckét több mint ±2szeres fehérjeváltozást kaptunk.
18. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közti 103 szignifikáns fehérjefolt változás 2D-DIGE reprezentatív gélképe. Minden azonosított fehérjét jelöltünk. A piros körök az emelkedett, a kék körök a csökkent fehérjeszinteket jelzik az agyi szinaptikus mitokondriumokban a nem-szinaptikus mitokondriumokhoz viszonyítva. A fehérjefoltok számát feltűntettük a gélképen, melyek MS-azonosításának eredményei megtalálhatóak a 3. táblázatban (Völgyi és mtsai., 2015b).
73
Az összes szignifikáns változást mutató fehérjefolt fehérjéit azonosítottuk, mely során 56 különböző fehérjét írtunk le (3. táblázat). Néhány esetben egy fehérjefolt több fehérjét is tartalmazott, továbbá voltak fehérjék, melyeket több fehérjefoltban is megtaláltunk. Ezek a gél alapú proteomika jellemző sajátságai, ami különböző fehérjék azonos pozíciójából, illetve egyazon fehérje különböző poszttranszlációs módosításaiból ered. A fehérjék MS/MS alapú adatait Scaffold szoftver (Scaffold_3_05_00 verzió, Proteome Software Inc, Portland, OR) segítségével validáltuk. Az azonosított fehérjéket és peptideket akkor fogadtuk el, ha a találati valószínűségük több, mint 99.0% volt, továbbá minimum 2 peptidjét azonosítottuk. A fehérjék mennyiségét a felvett MS/MS spektrumok számával, a szekvencia lefedettséggel és az egyedi peptidek számával jellemeztük. Amennyiben egy foltban több fehérjét is azonosítottunk, a legnagyobb mennyiségben jelen levő fehérjét vizsgáltuk tovább a funkcionális csoportosításban.
4.2.4. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása Az sMito és nsMito közti fehérjeváltozások funkcionális csoportosítását követően elmondható, hogy a kapott fehérjék a CK (n=9), fehérje transzport és feltekeredés (n=4), ETL (n=7),
ATP
metabolizmus (n=7),
oxidatív stressz és apoptózis (n=5),
citoszkeleton
organizáció és sejtmotilitás (n=5), iontranszport (n=3), glükóz metabolizmus (n=2), alkohol metabolizmus (n=1), szinaptikus transzmisszió (n=1), aminosav metabolizmus (n=2), lipid metabolizmus
(n=1),
ketontest
metabolizmus
(n=1),
laktát
metabolizmus
(n=1),
szignáltranszdukció (n=1), mitokondriális morfogenezis (n=1), fehérje degradáció (n=1), protein szintézis (n=1), transzkripciós regulátorok (n=1), glutation metabolizmus (n=1) és nukleotid metabolizmus (n=1) folyamatait érintik. A fehérjeváltozások mértéke (19. ábra), funkcionális csoportosítása (20. ábra) és lokalizációja összefoglalva az 3. táblázatban látható. Az sMitoban magasabb, illetve alacsonyabb szintet mutató fehérjéket külön-külön is csoportosítottuk. Azok a fehérjék, melyek az sMitoban mutattak magasabb szintet, a szinaptikus
transzmisszió,
laktát
metabolizmus,
glutation
metabolizmus
és
nukleotid
metabolizmus folyamatában játszanak szerepet (21. ábra). Ezzel szemben, az sMitoban alacsonyabb metabolizmus,
mennyiségben
jelenlevő
foszforiláció,
fehérjék
szignál
a
glükóz,
transzdukció,
alkohol,
lipid
mitokondriális
és
ketontest
morfogenezis,
fehérjeszintézis és traszkripció folyamataiban játszanak szerepet (22. ábra). A további funkcionális csoportok mind sMito, mind nsMitora jellemző fehérjéket tartalmazott.
74
A piruvát dehidrogenáz komplex 3 alegysége például alacsonyabb, 1 alegysége magasabb szintet mutatott az sMitoban. Más, CK-ben részt vevő enzimek (n=5) szintén alacsonyabb szintet mutattak, kivéve az ATP-képző beta alegységét a szukcinil-koenzim-A ligáznak (Sucla2), aminek a szintje a szinaptikus mitokondriumokban volt magasabb.
19. ábra Az azonosított szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális fehérjefolt különbségek változásának mértéke (Völgyi és mtsai., 2015b).
20. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális fehérjekülönbségek funkcionális eloszlása (Völgyi és mtsai., 2015b).
75
21. ábra A szinaptikus mitokondriumokban fehérjeszint növekedést mutató fehérjék funkcionális eloszlása (Völgyi és mtsai., 2015b).
22. ábra A szinaptikus mitokondriumokban fehérjeszint csökkenést mutató fehérjék funkcionális eloszlása (Völgyi és mtsai., 2015b).
76
4.2.5. A szignifikánsan megváltozott fehérjék validálása A CK jelentős fehérjéi közül a sMito-ban feldúsuló Sucla2 és az nsMito-ban feldúsuló Idh3a fehérjéket, az oxidatív stresszre adott válaszban jelentős szereppel bíró fehérjék közül az sMito-ban feldúsuló C1qbp-t és a nsMito-ban feldúsuló Sod2-t választottuk ki további, Western blottal történő validálásra. Az Idh3a, Sucla2, C1qbp és Sod2 fehérjék Western blot analízise A Western blot analízis a 2D-DIGE munka során használt 6 sMito és 6nsMito mintákból történt (23. ábra). A Sucla2, C1qbp és Sod2 fehérjék egy-egy helyen mutattak immunreaktivitást, míg az Idh3a fehérje esetében dupla sávban kaptunk jelet. A két immunreaktív
jel
hasonlóan
változott,
valószínűleg
az
Idh3a
fehérje
különböző
poszttranszlációs módosulásai, így a denzitometriás kiértékelés során együtt vizsgáltuk őket. A Sucla2 (3,43 ± 0,52-szeres változás) és a C1qbp (1,52 ± 0,21-szeres változás) szintje szignifikáns növekedés (p<0,001 a Sucla2 és p<0,01 a C1qbp esetében), míg az Idh3a (0,49 ± 0,10-szeres változás) és Sod2 (0,50 ± 0,05-szoros változás) szignifikáns csökkenést mutattak az sMito-ban (p < 0,01 az Idh3a és p < 0,001 a Sod2 esetében).
23. ábra A Sucla2, Idh3a, C1qbp és Sod2 fehérjeváltozások Western blot analízissel történő validálása. Immunpozitív fehérjecsíkok 50, 40, 33 és 25 kDa-nál voltak az említett fehérjék gélképein (A). A 4 fehérje denzitometriás analízise (B-E). Az Idh3a esetében mindkét csíkot figyelembe vettük az analízis során. A Sucla2 (B) és C1qbp (D) szignifikáns növekedést, míg az Idh3a (C) és Sod2 (E) szignifikáns csökkenést mutatott a szinaptikus mitokondriumokban, a nem szinaptikus mitokondriumokhoz képest. (***: p < 0,001) (Völgyi és mtsai., 2015b).
77
A Sucla2 és Idh3a fehérjék szinaptikus lokalizációjának immunhisztokémiai és immunelektronmikroszkópiai analízise Mivel a Sucla2 és Idh3a fehérjéket több különböző fehérjefoltból sikerül kimutatni, továbbá kizárólag mitokondriális lokalizációval rendelkeznek, ezeket a fehérjéket vizsgáltuk tovább immunhisztokémiai és immun-elektronmikroszkópiai módszerekkel.
24. ábra A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációja a preszinaptikus idegvégződésekben (A, B). A nagy nagyítású konfokális képek a hippocampus CA1-es piramidális sejtrétegéből készültek. A kettős jelölés szinaptofizin preszinaptikus marker (piros) és Sucla2 vagy Idh3a (zöld) antitestekkel készült. A Sucla2 és Idh3a immunreaktivitások jelen vannak a sejttestben (zöld) és a szinaptikus végződésekben (sárga) egyaránt, eloszlásuk mitokondriális lokalizációt mutat, a szinaptofizin kizárólag az idegsejtvégződéseket jelöli (piros). Számos preszinaptikus végződés Sucla2-vel vagy Idh3a-val szintén jelölődött, melyek közül néhányat fehér nyíllal jelöltünk. A beillesztett képek immunogold pozitív (fekete nyilak) szinaptikus mitokondriumokat jelölnek (a nyílfejek a szinaptikus membránok találkozási régióját mutatják) az elektronmikroszkópos felvételen. Látható, hogy a dupla pozitív szinaptikus végződések száma a Sucla2 esetében magasabb volt, mint az Idh3a esetében. A szinaptofizin immunreaktív végződések 78,4%-a mutat kolokalizációt a Sucla2-vel, míg csak 32,9%-a az Idh3aval (C), ami szignifikáns különbséget jelent (***: p < 0,001). Mérce = 50 µm (Völgyi és mtsai., 2015b).
A Sucla2 immunreaktivitás az agy teljes területén megfigyelhető volt. A sejttestek, illetve az idegsejt végződések is immunpozitívak voltak, míg a sejtmagok nem mutattak immunreaktivitást. mitokondriumhoz
A
Sucla2
hasonlító
jelet
immunreaktivitás adott.
A
a
jelölt
sejttesteken sejtek
belül
denzitása
elnyújtott, tipikusan
a
szürkeállományban volt magas, továbbá a teljes agy területén az idegsejtek mutattak immunreaktivitást. A Sucla2 és szinaptofizin kettős jelölése alapján elmondható, hogy a Sucla2 jelen van a preszinaptikus végződésekben. A hippocampus CA1 régiójában 78,4% volt a Sucla2 és szinaptofizin (Syn) dupla-pozitív preszinaptikus régió aránya az összes preszinapszishoz
78
képest (24/A ábra).
A Sucla2-pozitív mitokondriumok lokalizációját a preszinaptikus
végződésben elektronmikroszkópiával is megerősítettük (24/A ábra). Az Idh3a jelölési mintázata hasonló volt a Sucla2 fehérjéhez, azzal a különbséggel, hogy több sejttest és kevesebb szinaptikus végződés mutatott Idh3a-immunreaktivitást. Habár a hippocampus CA1 régiójában a neuronok sejttestjei hasonló intenzitású immunreaktivitást mutattak Sucla2-re és Idh3a-ra, a Syn-pozitív végződések 32,9%-a volt Idh3a pozitív (24/B ábra). Összegezve
tehát,
a
Sucla2-Syn
dupla
jelölésű
preszinaptikus
régiók
száma
szignifikánsan magasabb volt, mint az Idh3a-Syn immunreaktivitást mutatóké (p<0,001).
A C1qbp fehérje mitokondriális és szinaptikus lokalizációjának immunhisztokémiai analízise
25. ábra A C1qbp fehérje mitokondriális és szinaptikus lokalizációja a cortexben. A C1qbp immunreaktivitás a sejttestekben és a nyúlványokban is megfigyelhető (A). A nagyobb nagyítású felvételen látható sejttestekben (fekete nyíl) a C1qbp jelölés mitokondriumokra jellemző szemcsés eloszlást mutat (B). Ugyanezen a felvételen szinaptikus végződésekre utaló immunreaktív jelek is megfigyelhetőek (piros nyílvég). Mérce = 100 µm (A), 20 µm (B).
A
C1qbp
immunreaktivitás
jelenléte
a
corticális
sejtek
különböző
régióiban
megfigyelhető volt. A szinaptikus mitokondriumokban való feldúsulásával összhangban a fehérje a nyúlványokban és rostvégződésekben is lokalizálódott (25/A ábra). Nagyobb nagyításon történő mikroszkópos vizsgálattal megfigyelhető volt a C1qbp mitokondriumokra jellemző szemcsés lokalizációja a sejttestekben, valamint a szinaptikus végződésekre utaló immunreaktív jelek is láthatóak voltak (25/B ábra).
79
4.3. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt hatásának eredményei 4.3.1. Az Aβ plakkok eloszlása Az eredményeink igazolták, hogy a 3 hónapos APP/PS1 egerek agyszövetében még nincsenek Aβ plakkok (26/E ábra). Az Aβ plakkok megjelenését a 6 hónapos APP/PS1 egerek cerebrális cortexében és hippocampusában detektáltuk (26/F ábra), míg a plakkok fokozott elterjedése a 9 hónapos állatok agyára volt jellemző (26/G ábra). A B6 kontroll egerek a kor előrehaladtával egyáltalán nem mutattak Aβ-plakk felhalmozódást (26/A, B, C ábra). Adataink tehát reprodukálják az irodalomban már közölt,
Aβ-plakk kialakulásának
időzítését az APP/PS1 egerekben (Jankowsky és mtsai., 2004). Az Aβ-plakkot nagyobb nagyításban is vizsgáltuk fény (26/D ábra), illetve elektronmikroszkópos szinten (1/H ábra).
26. ábra A 3, 6, illetve 9 hónapos B6 kontroll (A, B, C) és APP/PS1 transzgenikus egér hippocampus és corticális agyrégiók (E, F, G) reprezentatív fénymikroszkópos képe. A fehér nyilak a redukált ozmiummal jelölt amyloid plakkokat jelzik, melyek 6 hónapos korban már megjelennek, 9 hónapos korban pedig nagymértékben elterjednek az APP/PS1 egerek említett régióiban. Az amyloid plakk nagyobb nagyítású fénymikroszkópos (D), illetve kis nagyítású elektronmikroszkópos képe (H). Mérce: A-C, E-G – 500 µm, D, H - 20 µm (CA1: cornu ammonis 1, DG: gyrus dentatus, cc: corpus callosum).
80
4.2.2. A mitokondrium minták oxigén fogyasztásának összehasonlítása Amikor a mitokondriális légzést glutamát és malát tartalmú médiumban vizsgáljuk, az elektronok a NADH-ról (nikotinamid adenine dinukleotid hidrid) a komplex I-en (NADHkoenzim Q reduktáz vagy NADH dehidrogenáz) keresztül lépnek az ETL-ba. Abban az esetben, ha az energetizáló szubsztrát a szukcinát, az elektronok a szukcinát-dehidrogenázról érkeznek a komplex I-re és redukálják a koenzim Q-t (ubikinon, CoQ). A 3, 6, illetve 9 hónapos egér sMito és nsMito oxigén fogyasztás vizsgálata során nem volt se a glutamát és malát (27/A ábra), se a szukcinát esetében (27/B ábra) szignifikáns különbség az APP/PS1és B6 egerek között. Eredményeink alapján elmondható, hogy mind az sMito, mind az nsMito mintánk metabolikusan aktív, intakt mitokondriumokat tartalmaz, továbbá a mitokondriális légzés nem sérül az Aβ felhalmozódásával egyik mitokondrium populáció esetében sem.
27. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium reprezentatív oxigén fogyasztási regisztrátuma glutamát és malát (A) vagy szukcinát (B) szubsztrátok esetében. A B6, illetve APP/PS1 állatok mitokondriális oxigén fogyasztása nem mutatott szignifikáns különbséget (ADP: adenozin difoszfát; CAT: karboxiatraktilozid).
4.2.3. A mitokondrium minták H2 O2 termelődésének összehasonlítása Az izolált sMito és nsMito H2 O2 termelését Amplex UltraRed fluoreszcens esszével detektáltuk
glutamát és malát (28/A ábra) vagy szukcinát energetizáló szubsztrátok
hozzáadásával (28/B ábra). A mitokondrium minták a 3 hónapos APP/PS1 egerekben nem mutattak szignifikáns változást a H2 O2 termelésben (29/A ábra). A H2 O2 szint szignifikánsan megnövekedett a 6 hónapos sMito mintákban, mind a szukcinát, mind a glutamát és malát szubsztráttal történő energetizálás esetén. A szukcinát
81
szubsztrát alkalmazása esetén közvetlenül a szukcinát kezelés után 122,43 ± 5,97 %, ADP hozzáadását követően 122,45 ± 5,33 %, rotenone hozzáadását követően 132,81 ± 6,38 %, FCCP hozzáadását követően 123,43 ± 6,44 % szignifikánsan növekvő értékeket kaptunk a B6 kontroll állatok százalékában. A glutamát és malát tartalmú médium esetében közvetlenül a glutamát-malát kezelés után 123,73 ± 5,61 %, ADP hozzáadását követően 112,69 ± 3,09 %, rotenone hozzáadását követően 142,58 ± 6,96 %, FCCP hozzáadását követően 139,06 ± 9,25 % szignifikánsan növekvő értékeket kaptunk a B6 kontroll állatok százalékában (29/B ábra). A 6 hónapos nsMito mintákban ezzel szemben nem volt szignifikáns változás. A legnagyobb változás a H2 O2 termelésben a 6 hónapos sMito mintákban a komplex I rotenonnal történő gátlását követően volt tapasztalható. A 9 hónapos APP/PS1 egerekben a szukcinát kezelés után detektálható volt szignifikáns növekedés mind az sMito (120,25 ± 6,37 %), mind az nsMito (130.14 ± 6.81 %) minták esetében (29/C ábra). Ez a növekedés a további kezelések során azonban nem maradt fenn. Szintén szignifikáns növekedés volt tapasztalható az sMito mintákban a glutamát és malát szubsztrát tartalmú médiumok esetében közvetlen a rotenone és FCCP kezelések után (glutamát és malát tartalmú médium esetében rotenon kezelést követően 127,92 ± 7,22 %, FCCP kezelést követően 154,00 ± 7,95 %), az nsMito mintákban azonban ilyen jellegű változás nem volt detektálható (29/C ábra).
28. ábra A mitokondriális H2 O2 termelés reprezentatív görbéje glutamát és malát (A) vagy szukcinát szubsztrátok esetében (B). (mit: mitokondrium, rot: rotenon, succ: szukcinát, g/m: glutamát és malát, FCCP: trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon, cal: kalibráció; a nyilak a különböző kezelések beadási időpontjait jelölik).
82
29. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok H2 O2 termelése 3(a), 6(b) és 9 hónapos APP/PS1 egerekben (c). Az APP/PS1 egerek H2 O2 szintjét a kontrollok átlagának százalékában adtuk meg (rot: rotenon, succ: szukcinát, g/m: glutamát és malát, FCCP: trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon, ADP: adenozin difoszfát).
83
4.2.4. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata az sMito és nsMito proteomjára
30. ábra Reprezentatív
2D-DIGE gélképek a
szinaptikus
(A) és
nem-szinaptikus
mitokondriumok
fehérjekészletéről (E), a B6 és APP/PS1 egerek közötti szignifikáns fehérjeváltozások lokalizációinak feltűntetésével. A fehérjeváltozások mértéke a szinaptikus mitokondriumokban 3 (B), 6 (C) és 9 hónapos egerekben (D), továbbá a nem-szinaptikus mitokondriumokban 3 (F), 6 (G) és 9 hónapos egerek (H) szintjén. Az összes meghatározott fehérjét bekarikáztuk. Rózsaszín, türkiz és sárga színek jelzik a 3, 6, illetve 9 hónapos korcsoportok szignifikáns fehérjeváltozásait.
84
Azonosító Génnév
Fehérje név (Uniprot)
3nsm 6nsm 9nsm 3sm
Citromsav-ciklus (mitokondriális mátrix) Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase Q8BMF4 Dlat component of pyruvate dehydrogenase complex P35486
Pdha1
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha somatic form
Q9D051
Pdhb
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta
Q8BKZ9
Pdhx
9sm
1.17
-1.23
1.24
1.21
-1.13
1.29
-1.34
Pyruvate dehydrogenase protein X component
6sm
1.18
1.27
-1.12
1.15
Humán Alzheimer-kóros agy
Csökkent PDH aktivitás (1, 2) Csökkent PDH aktivitás (1, 2)
1.56
Csökkent PDH aktivitás (1, 2) 1.31
-1.27
Csökkent PDH aktivitás (1, 2)
-1.31 Q9D2G2
Dlst
Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial
Q99KI0
Aco2
Aconitate hydratase
Q9D6R2
Idh3a
Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha
O08749
Dld
Dihydrolipoyl dehydrogenase (KGDHC E1 component)
Q05BC6
Sucla2
Succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta
P97807
Fh
Fumarate hydratase
P08249
Mdh2
Malate dehydrogenase
Csökkent PDH aktivitás (1, 2)
-1.25 -1.21
1.40 1.39
-1.19 -1.21 -1.22 -1.22
-1.69
-1.19
-1.26
1.33
-1.22
-1.26
1.18 1.15 -1.62
-1.42 -1.40 -1.20
-1.31
1.23 1.31 1.36 1.41 1.41
Csökkent Aco2 aktivitás (3); Csökkent Aco2 szint a substantia nigra-ban, Emelkedett szint a cortexben (4) Csökkent ICDH aktivitás (1, 5, 6)
1.44
Csökkent KGDHC aktivitás (1, 6, 7) -1.18 -1.25 -1.10 1.22 1.11 1.20
nincs humán adat -1.29
1.72
Csökkent Fh aktivitás a frontális cortexben (2)
-1.25 Emelkedett Mdh2 aktivitás (1, 6)
Elektrontranszport-lánc (belső mitokondriális membrán) Q9D6J6
Ndufv2
NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 2
Q91VD9
Ndufs1
NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit
Q8K3J1
Ndufs8
NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8
Q7TMF3
Ndufa12
NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 12
-1.29
1.16
1.18
-1.38 1.23
-1.28
1.50
Csökkent Ndufs1 szint a parietális cortexben (8)
1.28 1.33
Csökkent Komplex I szint (9)
1.77
-1.20 Csökkent Komplex I szint (9)
-1.13 -1.18 1.23 1.35
-1.18 Csökkent Ndufv2 szint a temporális és occipitális cortexben (8)
1.16
1.11 nincs humán adat
Uqcrc1
Cytochrome b-c1 complex subunit 1
Q9CR68
Uqcrfs1
Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial
P99028
Uqcrh
Cytochrome b-c1 complex subunit 6
1.21
nincs humán adat
P12787
Cox5a
Cytochrome c oxidase subunit 5A
1.19
Csökkent citokróm c oxidáz aktivitás (10, 11, 12)
Q03265
Atp5a1
ATP synthase subunit alpha
Q9CZ13
nincs humán adat
-1.14
1.15
1.38
-1.14
1.32 -1.21 P56480
Atp5b
ATP synthase subunit beta
Q9DCX2
Atp5h
ATP synthase subunit d
Q9DB20
Atp5o
ATP synthase subunit O
P67778
Phb
Prohibitin
Q9DCW4
Etfb
Electron transfer flavoprotein subunit beta
Q8K1Z0
Coq9
Ubiquinone biosynthesis protein COQ9
1.10
Csökkent ATP szintáz aktivitás az I/II-es Braak stádiumokban (13); Atp5a1 korrelál az NFK degenerációval (14)
1.22
-1.26 -1.17
1.10
1.10
-1.14
-1.17 1.14
Emelkedett Atp5h szint, ha a Komplex I gátolt (15)
-1.16
Csökkent ATP szintáz aktivitás az I/II-es Braak stádiumokban (13)
-1.17
-1.36 1.13
Csökkent Atp5b mRNA szint a cortexben (14)
-1.16
-1.12
-1.13
-1.18
nincs humán adat
-1.19 nincs humán adat -1.24
(folytatódik)
85
nincs humán adat
Azonosító Génnév
Fehérje név (Uniprot)
3nsm 6nsm 9nsm 3sm
6sm
9sm
Humán Alzheimer-kóros agy
Oxidatív stressz és apoptózis (mitokondriális mátrix, intermembrán tér, citoplazma) Q9DCM0
Ethe1
Persulfide dioxygenase ETHE1
P08228
Sod1
Superoxide dismutase [Cu-Zn]
P09671
Sod2
Superoxide dismutase [Mn]
Q61171
Prdx2
Peroxiredoxin-2
P20108
Prdx3
Thioredoxin-dependent peroxide reductase
-1.38 -1.25 1.17 1.12
1.78
-1.13 nincs humán adat Emelkedett plazma Sod1 szint (13)
1.36
-1.19
-1.11
1.11 Emelkedett plazma Sod2 szint (16) 1.19 Emelkdett Prdx2 szint (8)
1.10 -1.20 -1.18
1.31 1.17 1.38 -1.10
P99029
Prdx5
Peroxiredoxin-5
O08709
Prdx6
Peroxiredoxin-6
Q9JIY5
Htra2
Serine protease HTRA2
Q60932
Vdac1
Voltage-dependent anion-selective channel protein 1
-1.56 -1.09
Q60930
Vdac2
Voltage-dependent anion-selective channel protein 2
1.14
1.24
-1.29
1.19 1.24
-1.18
1.14 -1.27 -1.20
Csökkent Prdx3 szint (8, 17) nincs humán adat
-1,18 Emelkedett Prdx6 szint az -1.14 asztocitákban (18) -1.41 1.21 1.52
1.80
-1.42 Emelkedett Htra2 aktivitás (19)
1.34 -1.26
Csökkent Vdac1 szint a cortexben (20) Emelkedett Vdac2 szint a temporális cortexben (21)
Fehérjetranszport (külső/belső mitokondriális membrán) Q9CZW5
Tomm70a Mitochondrial import receptor subunit TOM70
Q9D880
Timm50
Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM50
1.48 Aβ transzport a TOM 1.39 komplexen keresztül (22, 23) -1.34
Aβ transzport a TIM23 komplexen keresztül (23)
-1.18
Mitokondriális fehérjeszintézis és feltekeredés (mitokondriális mátrix) P63038
Hspd1
60 kDa heat shock protein
1.20
1.40 1.27 1.18
1.25 Emelkedett Hspd1 szint, ha a 1.19 Komplex I gátolt (15)
P38647
Hspa9
Stress-70 protein
1.23
1.39 Csökkent mRNS szint (24)
Q8BFR5
Tufm
Elongation factor Tu
Q3UGW4
Clpp
ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit
-1.18
HNE-módosított Tufm MCI-s agyban (25)
1.25
nincs humán adat
-1.19
Glikolízis, glükoneogenezis (mitokondriális mátrix) Q64521
Gpd2
Glycerol 3 phosphate dehydrogenase (mátrix)
-1.26 1.20 1.23
nincs humán adat
P17751
Tpi1
Triosephosphate isomerase
-1.22
Aβ indukált Tpi nitrotirozinálás (26)
-1.12
Emelkedett Ak szint (27)
Nukleotid metabolizmus (mitokondrium) Q9WUR9
Ak4
Adenylate kinase isoenzyme 4 (mátrix)
1.16
P15532
Nme4
Nucleoside diphosphate kinase (intermembrán tér)
-1.27
P30275
Ckmt1
Creatine kinase U-type (belső mitokondriális mátrix)
Q8K4Z3
Apoa1bp
NAD(P)H-hydrate epimerase (Apolipoprotein A-I-binding protein)
Ketontest metabolizmus (mitokondriális mátrix) Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A Oxct1 transferase 1
Q9D0K2
Q8QZT1
Acat1
Csökkent Nme4 aktivitás (28) Csökkent Ckmt1 a substantia nigrában és a cortexben (4)
-1.15
nincs humán adat
-1.16
-1.30
1.29
Emelkedett Oxct szint (29)
Acetyl CoA acetyltransferase
1.32
1.17 nincs humán adat
Lipid metabolizmus (mitokondriális mátrix) -1.30 Q8BH95
Echs1
Enoyl-CoA hydratase
Q8BMS1
Hadha
Trifunctional enzyme subunit alpha
-1.15
-1.19
-1.14 nincs humán adat
-1.15 -1.22
1.26 1.35
Csökkent Hadha szint (30)
Aminosav metabolizmus (mitokondriális mátrix) Q8QZS1
Hibch
3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase
Q9CWS0
Ddah1
N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1
nincs humán adat
-1.18 -1.25
(folytatódik)
86
Oxidatívan módosult Ddah1 familiális AK-ban (31)
Azonosító Génnév
Fehérje név (Uniprot)
3nsm 6nsm 9nsm 3sm
6sm
9sm
Humán Alzheimer-kóros agy
Laktát metabolizmus (mitokondrium, citoplazma) P16125
Ldhb
L-lactate dehydrogenase B chain
-1.42
Csökkent Ldhb szint a cortexben és a hippocampusban (4)
-1.49
Gstp1 gén polimorfizmus befolyásolja az AK kialakulásának valószínűségét (32)
Glutation metabolizmus (mitokondrium, citoplazma) P19157
Gstp1
Glutathione S-transferase P 1
Szinaptikus transzmisszió (mitokondrium, szinapszis)
O55042
Snca
Alpha-synuclein
-1.24
Emelkedett Snca szint az amygdalában, a limbikus területeken és a gyrus temporalis inferiorban (33, 34, 35)
-1.15
Csökkent Pebp mRNA szint a hippocampusban (36)
Szignáltranszdukció (mitokondrium, szinapszis) O55042
Pebp1
Phosphatidylethanolamine-binding protein 1
-2.29
Egyéb (mitokondrium, citoplazma) Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domainChchd3 containing protein 3
D3Z0L4
Q9D172
D10Jhu81e
ES1 protein homolog
nincs humán adat
-1.17 -2.04
1.47
-1.40
nincs humán adat
4. táblázat Az APP/PS1 és B6 egerek közötti szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális szignifikáns fehérjeváltozások funkcionális csoportok szerint (p<0,05). A piros színgradiens a növekvő, a kék a csökkenő fehérjeszint változást jelenti az APP/PS1 egerekben (a számok a változás mértékét mutatják, AR=average ratio). A piros szöveg a növekvő, a kék a csökkenő fehérjeszinteket jelzi Alzheimer-kóros betegek agyában vagy plazmájában (sm: szinaptikus mitokondrium, nsm: nem-szinaptikus mitokondrium, 3, 6, 9: az állatok kora hónapban). A zöld színnel kiemelt fehérjéket Aβ oligomer kötőpartnerként is ismerjük. A sárga színnel kiemelt fehérjék a legnagyobb mennyiségi változást mutató eredmények.
A táblázatban szereplő referenciák: 1-(Bubber és mtsai., 2005), 2-(Sorbi és mtsai., 1983), 3-(Raukas és mtsai., 2012), 4-(Zahid és mtsai., 2014), 5-(Shiozaki és mtsai., 2004), 6-(Perry és mtsai., 1980), 7-(Gibson és mtsai., 1998), 8-(Kim és mtsai., 2001), 9-(George és mtsai., 2010), 10-(Maurer és mtsai., 2000), 11-(Mancuso és mtsai., 2003), 12-(Parker és mtsai., 1994), 13-(Terni és mtsai., 2010), 14-(Chandrasekaran és mtsai., 1997), 15-(Burte és mtsai., 2011), 16-(Doecke és mtsai., 2012), 17-(Krapfenbauer és mtsai., 2003), 18-(Power és mtsai., 2008), 19(Westerlund és mtsai., 2011), 20-(Melanson és mtsai., 2006), 21-(Yoo és mtsai., 2001), 22-(Pinho és mtsai., 2014), 23-(Hansson Petersen és mtsai., 2008), 24-(Silva és mtsai., 2014), 25-(Reed és mtsai., 2008), 26-(Guix és mtsai., 2009), 27-(Park és mtsai., 2012), 28-(Kim és mtsai., 2002), 29-(Schonberger és mtsai., 2001), 30-(Choi és mtsai., 2014), 31-(Butterfield és mtsai., 2006), 32-(Singh és mtsai., 2014), 33-(Hamilton, 2000), 34-(Marui és mtsai., 2000), 35-(Larson és mtsai., 2012), 36-(Maki és mtsai., 2002).
87
Összesen ~1200-1300 fehérjefoltot detektáltunk minden egyes 2D-DIGE gélen (full stain jelölés) mind az sMito, mind az nsMito minták esetében a 3, 6 illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 állatok összehasonlításában (6x12 gél). Összesen 43 különböző nsMito fehérje (3 hónapos nsMito: 21; 6 hónapos nsMito: 30; 9 hónapos nsMito: 25) és 42 különböző sMito fehérje (3 hónapos sMito: 24; 6 hónapos sMito: 19; 9 hónapos sMito: 19) mutatott szignifikáns különbséget az APP/PS1 és B6 egerek között, nagyobb mint 1,1-szeres fehérjeszint változás értékkel (a különböző csoportok között voltak közös fehérjék). A reprezentatív 2D-DIGE gélképeken jól láthatóak a szignifikáns intenzitáskülönbséget mutató sMito (30/A ábra) és nsMito (30/E ábra) fehérjefoltok. A fehérjefoltok intenzitáskülönbségei a B6 és APP/PS1 egerek között az sMito minták esetében -1,41-től 1,80-szoros értékig (30/BD ábra), az nsMito minták esetében -2,29-től 1,52-szeres értékig terjednek (30/F-H ábra). A szignifikánsan változást (p<0,05, DeCyderTM 2D 7.0 szoftver BVA modulja által kalkulált Student
t-próba)
mutató
fehérjefoltokban
található
fehérjéket LC/MS-MS
azonosítottuk, melyekben összesen 60 különböző fehérjét detektáltunk (4. táblázat).
88
módszerrel
4.2.5. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása
(ábraaláírás a következő oldalon)
89
31. ábra A mitokondriális lokalizációja a megváltozott szinaptikus (a) és nem-szinaptikus (b) mitokondriális fehérjéknek 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 egerekben. A zöld, citrom és narancssárga hátterek az egerek 3, 6 illetve 9 hónapos korcsoportjait jelzi (Glc: glükóz, Lac: laktát). Az ábrán használt rövidítések (Uniprot adatbázis alapján): Protein transzport - TOM: translocase of the outer membrane, Tim23: translocase of the inner membrane subunit 23, MIA: mitochondrial intermembrane space assembly, SAM: sorting and assembly machinery, Tim22: translocase of the inner membrane subunit 22; Protein szintézis és feltekeredés - Hsp70: 70 kDa heat shock protein, Hsp60: 60 kDa heat shock protein, EFTu: Elongation factor Tu; Nukleotid metabolizmus - AK4: adenylate kinase 4, NDK: nucleoside diphosphate kinase, U-MtCK: ubiquitous mitochondrial creatine kinase Elektron transzport lánc - I: Complex I, II: Complex II, III: Complex III, Cytc: cytochrome complex, IV: Complex IV, V: Complex V; Trikarbonsav ciklus - CS: citrate synthase, ACO: aconitase, ICDH: isocitrate dehydrogenase, aKG: alpha-ketoglutarate, aKGDH: alpha-ketoglutarate dehydrogenase, Succ-CoA: SuccinylCoA, AcAc: acetoacetate, AcAc-CoA: acetoacetyl-CoA, SCOT: Succinyl-CoA:3-ketoacid CoA transferase, Succ: succinate, FH: fumarate hydratese, MDH: Malate dehydrogenase, OAA: Oxaloacetic acid; Ketontest metabolizmus
- ACAT: acetyl-CoA acetyltransferase; Zsírsav metabolizmus - ACADH: Acyl-CoA
dehydrogenase, ECAH: enoyl-CoA hydratase, HADH: hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, KCAT: 3ketoacyl-CoA transferase; Apoptózis - Htra2: Serine protease HTRA2, Smac: second mitochondria-derived activator of caspases, Oxidatív stressz - MnSOD: manganese superoxide dismutase, PRX3: peroxiredoxin 3, PRX5: peroxiredoxin 5, ETHE1: Persulfide dioxygenase ETHE1; Ion transport - ANT: adenine nucleotide translocase.
32. ábra Az APP/PS1 és B6 egerek közötti fehérjekülönbségek funkcionális eloszlása. (A funkcionális csoportosítás során a 3, 6 és 9 hónapos korban megváltozott fehérjék összességét használtuk fel).
90
Az APP/PS1 és B6 egerek közti fehérjeváltozások funkcionális csoportosítását követően elmondható, hogy a kapott fehérjék a CK (n=11), ETL (n=15), oxidatív stressz és apoptózis (n=10), protein transzport (n=2), mitokondriális protein szintézis és feltekeredés (n=4),
glikolízis
metabolizmus
és
glükoneogenezis
(n=2),
lipid
(n=2),
metabolizmus
nukleotid
(n=2),
metabolizmus
(n=4),
ketontest
metabolizmus (n=2),
aminosav
laktát
metabolizmus (n=1), glutation metabolizmus (n=1), szinaptikus transzmisszió (n=1), szignál transzdukció (n=1) és más, ismeretlen (n=2) folyamatokban vesznek részt (4. táblázat). A fehérjeváltozások funkcionális eloszlását a 32. ábra szemlélteti. A szignifikáns változást mutató szinaptikus (31/A ábra) és nem-szinaptikus (31/B ábra)
fehérjéket
intramitokondriális
lokalizációjuk
és
a
mitokondriális
biokémiai
folyamatokban való részvételük alapján is ábrázoltuk mindhárom vizsgált korcsoportban. Az ábrán zöld színnel a 3, citromsárgával a 6, narancssárgával a 9 hónapos korcsoportban kapott fehérjeváltozásokat jelöltük. Az ETC fehérjéi változtak meg a legnagyobb mennyiségben. Az ETC fehérjék közül a komplex I NADH dehidrogezáz [ubikinon] flavoprotein 2 (Ndufv2) (1,50-szeres) és NADH dehidrogenáz [ubikinon] vas-kén protein 8 (Ndufs8) (1,77-szeres) fehérjék mutatták a legnagyobb mértékű változást 6 hónapos sMito mintákban (4. táblázat). Összességében az ETC fehérjéi növekvő és csökkenő fehérjeváltozást is mutattak az APP/PS1 álltok különböző korcsoportjaiban. A TCA fehérjeváltozásai nagy része csökkenő fehérjeszintet mutattak az APP/PS1 egerek 3 hónapos korcsoportjában, mind az sMito (31/A ábra), mind az nsMito (31/B ábra) szintjén. Érdekes módon, 6 hónapos korban a fehérjeváltozások nagy része ellenkező irányú, növekvő fehérjeszint változást mutatott, ami egy kompenzatórikus mechanizmus eredménye lehet. A késői, 9 hónapos korosztályban a TCA fehérjék közel egyforma mértékben mutattak csökkenő és növekvő változást. A változó fehérjék közül a piruvát dehidrogenáz E1 komponens alfa alegység – szomatikus forma (Pdha1) (1,56-szoros) és malát dehidrogenáz (Mdh2)
(1,72-szeres)
mutatták
a
legnagyobb
változásokat.
Mindkét
fehérje
szintje
megnövekedett 6 hónapos korban az sMito mintában (31. ábra). A Htra2 és Ethe1 fehérjék mutatták a legnagyobb változásokat az oxidatív stressz és apoptózis folyamatában. Ezek a fehérjék hasonló dinamikával (↓↑↓ fehérjeszinttel) változtak az Aβ akkumuláció előrehaladásával a szinaptikus mitokondriumokban. A 3 hónapos csökkenő, illetve 6 hónapos korban való fehérjeszint növekedésüket WB technikával is validáltuk (34. ábra).
91
4.2.7.
Az
APP/PS1
és
B6
egerek
közötti
mitokondriális
bioinformatikai analízise
(ábraaláírás a következő oldalon)
92
fehérjeváltozások
33. ábra A mitokondriális fehérjeváltozások közös regulátor (a) és célpont analízise (b). A kék élek a közös regulátorok/célpontok és az általunk leírt mitokondriális fehérjeváltozások közti kapcsolatokat jelzik. Sárgával a mitokondriális
fehérjéket
jelöltük,
melyek
szignifikánsan
megváltoztak
az
APP/PS1
–
B6 egerek
összehasonlításában (a fehérjék teljes neve a 4. táblázatban található). Az ábrán használt rövidítések (Uniprot adatbázis alapján): NFE2L2: nuclear factor erythroid 2-related factor 2, IL1B: interleukin-1 beta, MAPK1: mitogen-activated protein kinase 1, TNF: tumor necrosis factor, AKT1: RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, APP: amyloid beta A4 protein, AGT: angiotensinogen, TGFB1: transforming growth factor beta -1, MYC: myc proto-oncogene protein, INS: insulin, PPARGC1A: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, SP1: transcription factor Sp1, TP53: cellular tumor antigen p53, HSPA1A: heat shock 70 kDa protein 1A/1B, PPARA: peroxisome proliferator-activated receptor alpha, TXN: thioredoxin, MAPK8: mitogen -activated protein kinase 8, CASP9: caspase-9, CYCS: cytochrome-c, MAPK14: mitogen-activated protein kinase 14, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, CASP3: caspase-3, BCL2: apoptosis regulator Bcl-2.
Összesen 17 közös regulátor fehérjét találtunk az analízis során. Az Uniprot és Gene Ontology adatbázisok alapján a közös regulátorok jelentős citokinek (n=3), protein kinázok (n=3), transzkripciós faktorok (n=3), aktivátorok (n=3), hormonok (n=2), inhibitorok (n=2) és chaperon / hősokk fehérje (n=1). A szabályozó fehérjék közül a legtöbb kapcsolattal az Sp1 transzkripciós factor (Sp1), az inzulin (Ins), angiotenzinogén (Agt) és tumor nekrózis faktor alfa (Tnf) rendelkeztek, ami sorban 9, 10, 10 és 14 reguláló kapcsolatot jelent az APP/PS1 állatokban megváltozott mitokondriális fehérjékkel (33/A ábra). A közös célpont analízis során 10 különböző célpont célpont fehérjét találtunk. Az Uniprot és Gene Ontology adatbázisok alapján a közös célpont fehérjék protein kinázok (n=3), kaszpázok (n=2), anti-apoptotikus fehérjék (n=2), citokin (n=1), oxidoreduktáz (n=1) és elektron transzporter (n=1) (33/B ábra). A célpont fehérjék közül a legmagasabb számú kapcsolattal a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh), az apoptózis regulator Bcl-2 (oxidoreduktáz Bcl-2) és az anti-apoptotikus fehérje Cycs (citokróm c) elektron transzporter voltak, ami sorban 9, 10, illetve 11 kapcsolatot jelent.
93
4.2.8. A Htra2 és Ethe1 fehérjeváltozások validálása Western blottal A WB analízisekhez a 3, 6 és 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek szinaptikus mitokondriális mintáit használtuk fel, melyek megegyeztek a 2D-DIGE munkák során vizsgált mintákkal (n=6/csoport). Az Ethe1 fehérje szintje a 3 (0,74 ± 0,08-szoros változás, p<0,001) és 9 hónapos korban (0,68 ± 0,05-szörös változás, p<0,001) szignifikáns csökkenést, míg 6 hónapos korban (1,51 ± 0,16-szoros változás, p<0,001) szignifikáns növekedést mutatott az APP/PS1 állatok szinaptikus mitokondriumában. Hasonló dinamikát mutatva a Htra2 fehérje szintje a 3 (0,68 ± 0,08-szoros változás, p<0,01) és 9 hónapos korban (0,70 ± 0,06-szoros változás, p<0,001) szignifikáns csökkenést, míg 6 hónapos korban (1,28 ± 0,07szeres változás, p<0,001) szignifikáns növekedést mutatott az APP/PS1 állatok szinaptikus mitokondriumában. A kapott fehérjeváltozások tehát megerősítették a 2D-DIGE analízis eredményeit (34. ábra).
34. ábra Az Ethe1 és Htra2 fehérjék szinaptikus mitokondriális változásának Western blot analízise 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 egerekben. Az oszlopdiagrammok az Ethe1 és Htra2 fehérjék denzitometriás analízisének eredményeit mutatják (n=6-6). Az Ethe1 és Htra2 fehérjék szintje szignifikáns csökkenést mutatott a 3 és 9, míg szignifikáns növekedést a 6 hónapos szinaptikus mitokondriumokban APP/PS1 egerekben. A diagramok alatt az immunpozitív jelek reprezentatív gélképe látható (Student’s t-teszt,**: p < 0,01, ***: p < 0,001).
94
5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA 5.1. A szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepének molekuláris hátterének vizsgálata
-
a
szinaptikus
és
nem-szinaptikus
mitokondriumok
proteomikai
összehasonlítása Az sMito és nsMito közötti számos fehérjeszint különbség alapján elmondhatjuk, hogy a két mitokondrium populácó molekuláris összetétele különbözik. A következőkben elsőként az
„unbiased”
megközelítésű
proteomikai
vizsgálat
sajátságai,
majd
a
szinaptikus
mitokondriumok sajátos proteomjának és lehetséges funkcionális specialitásainak legfőbb jellemzői kerülnek megvitatásra. Módszertani megvitatás Az sMito proteomikai vizsgálat kulcsa az sMito preparátum nagyfokú tisztasága. Számos
különböző
gradiens
és
differenciál centrifugálási protokoll létezik,
amivel a
mitokondrium frakciót lehet feldúsítani az agyszövetből (ilyenek a szaharóz, Ficoll, Percoll denzitás gradiens centrifugálások). Szintén többféle olyan módszer is elérhető, amivel a szinaptoszómákat fel lehet tárni a szinaptikus mitokondriumok kinyerése céljából (nitrogénbomba, ozmotikus sokk, digitoninos kezelés) (Brown és mtsai., 2004; Brown és mtsai., 2006; Kristian, 2010). Az említett módszerek azonban rendkívül heterogén mitokondrium frakciót eredményeznek (Sims és Anderson, 2008). Munkák során kidolgoztunk egy módosított Percoll gradiens centrifugálási eljárást amivel egyazon agymintából sMito és nsMito frakciók állíthatók elő nagyfokú tisztasággal (Dunkley és mtsai., 1986; Davey és mtsai., 1997; Gillardon és mtsai., 2007). A minták tisztaságát elektronmikroszkóppal és FACS-szal is igazoltuk, melyek az elérhető módszerek közül a legprecízebb és legmegbízhatóbb validálást teszik lehetővé. Az
elektronmikroszkópos
eredményeink
alapján
elmondható,
hogy
az sMito
morfológiája megegyezett az nsMito-éval, tehát a szinaptoszóma feltárása közben intakt maradt. A FACS eljárás során több mint 92%-ban mitokondriumra specifikus NAO és membránpotenciál szenzitív DiIC1
dupla pozitív partikulumokat mutattunk ki mindkét
frakcióból. A preparálási eljárásunk tehát nemcsak magas tisztaságú, hanem metabolikusan aktív mitokondrium frakciókat eredményezett, hiszen a membránpotenciál szenzitív festék csak az intakt, működő organellumok esetében ad jelet. Ez a proteomikai munkákhoz elengedhetetlen szempont,
hiszen a sérült mitokondriumok esetében a megnövekedett
proteolitikus aktivitás okozhat fehérjekülönbségeket.
95
A mitokondrium frakciók tisztasága alapján alkalmasnak véltük az sMito és nsMito mintákat egy „unbiased” proteomikai munka elvégzéséhez. Ezt a megállapításunk tovább erősítette, hogy az azonosított fehérjéink jelentős része az Uniprot és GeneOntology adatbázisok szerint mitokondriális lokalizációval rendelkezik. Az
eredmények
tisztaságának össze.
ellenére
Az sMito
régióiból
értelmezésénél heterogén
elengedhetetlen
összetételű
megjegyezni,
mitokondrium
preparátum mitokondriumai különböző
származnak
(pl.
glutamáterg
és
GABAerg
hogy
populációkat
a
minták
hasonlítottunk
típusú idegsejtek szinaptikus szinapszis),
melyek
különböző
molekuláris sajátságokkal rendelkezhetnek (Mckenna és mtsai., 2000). A szinaptoszóma preparátum továbbá a szinaptikus régióhoz szorosan kapcsolódó gliavégződéseket is tartalmazhatja,
aminek
következtében
az sMito
preparátumban
előfordulhatnak
gliális
mitokondriumok is. Az nsMito preparátum szintén nem csak az idegsejtek, hanem a gliasejtek szómájából kinyert mitokondriumokat is tartalmazza. A mintáknak ez a fajta heterogenitása elfedhet bizonyos fehérjeváltozásokat, azonban az ennek ellenére detektált fehérjemennyiségi különbségek mindenképpen a sMito-k sajátságainak tekinthetőek. A fehérjeváltozások validálására a jelentős változást mutató Sucla2 és Idh3a fehérjéket két független módszerrel is megvizsgáltuk. Mindkét fehérje a CK-be tartozó enzim, melyeket több különböző fehérjefoltból is azonosítottunk a proteomikai munka során, továbbá minden egyes módosulatuk azonos irányú fehérjeszint változást mutatott. A Sucla2 fehérje nagyobb mennyiségben, míg az Idh3a fehérje alacsonyabb mennyiségben volt jelen az sMito-ban a nsMito-hoz képest.
Ezen fehérjék
változását Western blot vizsgálatok
denzitometriás analízise során is megerősítettük, ahol hasonló irányú és mértékű változást kaptunk.
Immunhisztokémiai vizsgálatokkal megállapítottuk,
hogy a Sucla2
és Idh3a
immunjelölések valóban csak mitokondriális lokalizációt mutatnak, továbbá a hippocampus CA1
régiójának
konfokális
mikroszkópos
analízisével
igazoltuk,
hogy
a
Sucla2
immunreaktív preszinaptikus végződések száma szignifikánsan magasabb, mint az Idh3a pozitívaké. A sejttestben detektált immunreaktivitása az antitesteknek nem különbözött. Habár a látszólagos immunreaktivitást nehezen lehet korreláltatni a fehérjemennyiségi értékekkel, adataink szerint a CA1 régió preszinaptikus végződéseiben a Sucla2 mennyisége magasabb, mint az Idh3a fehérje szintje, ami erősíti a proteomikai és Western blot analízissel kapott eredményeinket.
96
A megváltozott mennyiségű szinaptikus mitokondriális fehérjék és lehetséges funkciói Az sMito-k lokális ATP termelése kritikus fontosságú a szinaptikus régió egyenlőtlen ioneloszlásának
biztosításában,
mivel
az
ehhez
szükséges
aktív
ionpumpák
ATP-áz
aktivitással rendelkeznek. A kémiai szinapszisok nagy mennyiségben tartalmaznak sMito-kat (Palay, 1956; King, 1988), továbbá a szinaptikus mitokondriumok által szabályozott ATP szint biztosítja a szinaptikus transzmissziót és megfelelő felépítést is (Ly és mtsai., 2006). A piruvát dehidrogenáz alegységeinek csökkent szintje arra utal, hogy kevesebb piruvát lép be a CK-be a szinapszisban, mint más sejtrégiókban. Ezt a gondolatmenetet tovább erősíti az, hogy a CK kezdeti lépéseit biztosító enzimek, az akonitáz (Aco2) és az Idh3a szintén csökkent mennyiséget mutatnak. Ez különösen érdekes, mivel az idegsejtek mitokondriumaira magas piruvátfogyasztás jellemző. Már nagyon régóta ismert tény, hogy a glükóz foszforilációs enzimei zömében az asztrocitákban expresszálódnak (Magistretti és Pellerin, 1999; Barros és Deitmer, 2010) és az idegsejtek által felhasznált piruvát és laktátot a környező asztrociták biztosítják (Magistretti és mtsai., 1994; Allen és mtsai., 2005; Wyss és mtsai., 2011). Ezen felül az asztrociták további CK köztes termékkel is ellátják az idegsejteket, mint például a citrát, alfa-ketoglutarát és szukcinát (Sonnewald és mtsai., 1994), továbbá jelentősek az idegsejtek CK-ének kiegészítésében, melyben hiányzik a piruvát dekarboxiláz (Shank és Campbell, 1984; Hassel, 2000). Mindemellett a legerősebb, gliasejtekből a preszinaptikus végződésekbe irányuló transzport a glutamin transzport, amit a neuronok a glutamát és GABA neurotranszmitterek előállítására használnak fel (Schousboe és mtsai., 2013; Tani és mtsai., 2014). A glutamint továbbá mint energiaforrás is felhasználja a preszinapszis, ahogy belép a CK-be mint α-ketoglutarát (Tiwari és mtsai., 2013), ily módon fokozódik a glutamin - α-ketoglutarát átalakulás az sMito-ban (35. ábra). A megnövekedett szintű Sucla2 az sMito-ban hozzájárulhat az extra alfa-ketoglutarát szukcináttá majd később oxálacetáttá való átalakulásához. A megnövekedett mennyiségű oxálacetát azonban nem képes a következő ciklusba belépni a preszinaptikus régióban, mivel eredményeink alapján a szinaptikus mitokondriumokban csökkent mennyiségben található a piruvát
dehidrogenáz.
Az
oxálacetát
képes
alfa-ketoglutaráttá
aminotranszferáz enzim segítségével (Toney, 2014),
alakulni az aszpartát
ami ismerten nagy mennyiségben
található a preszinaptikus végződésekben (Yudkoff és mtsai., 1994) (35. ábra). Ez a modell egybevág azzal a megállapítással, hogy nem a glikolízis, hanem az oxidatív foszforiláció az a folyamat, ami az agyi információfeldolgozás szinaptikus mechanizmusát energetizálja (Hall és mtsai., 2012).
97
35. ábra A preszinaptikus végződés és egy közeli asztrocita végződés legfőbb metabolikus interakciói. A glikolízis többlépcsős folyamata során a glükóz piruváttá alakul, majd vagy laktáttá redukálódik a szinaptikus mitokondriumokban emelkedett szintet mutató (piros nyíl) laktát dehidrogenáz (LDH) segítségével, vagy acetilkoenzim A-vá (acetil-KoA) oxidálódik a szinaptikus mitokondriumban csökkent szintet mutató (kék nyíl) piruvát dehidrogenáz komplex (PDH) által, ami ezt követően oxidálódik a citrát -körben. A citrát kör kezdeti enzimjei (akonitáz - ACO, izocitrát dehidrogenáz - ICDH) szintén csökkent szintet mutatnak a szinaptikus mitokondriumokban (kék nyíl). Az asztrocitákban a piruvát átalakulásának egy harmadik lehetősége, hogy oxálacetáttá karboxilálódik a piruvát karboxiláz segítségével (PC). A glutamáterg szinapszisban a glutamát (GLU) neurotranszmitterként felszabadul, a környező asztrocitákba jut, az asztrocitákban glutaminná amidálódik (GLN) a glutamin szintetáz által (GS), végül visszajut az idegsejtekbe újrafelhasználásra (ez az ún. glutamát-glutamin ciklus). Az idegsejtekben a GLN GLU-tá alakul a mitokondriális foszfát-aktivált glutamináz által (PAG). A GABAerg szinapszisban hasonló folyamat zajlódik le a környező asztrocitákban, azonban a GABA szénlánca képes belépni a citrát-körbe, majd egy kétlépéses folyamattal szukcináttá alakul a GABAtranszamináz (GABA-T) és a szukcinát szemialdehid dehidrogenáz (SSADH) által. A GABA -T által katalizált reakció α-ketoglutarátból (α-KG) GLU képződéséhez vezet, ami a GLN és a GABA szintézis alapanyaga (az az ún. GABA shunt az asztrocitákban). A GABAerg idegsejtekben a GABA GLU-ból szintetizálódik a glutamát dekarboxiláz segítségével (GAD). Készült: (Dadsetan és mtsai., 2011; Schousboe és mtsai., 2013; Toney, 2014) irodalmi adatok és saját eredményeink alapján.
98
A fő nehézség, amivel ennek a sérült, gliális eredetű glutamin által vezérelt szinaptikus CK-nek meg kell birkózni, a keletkezett ammónia eltávolítása (Hertz és Kala, 2007; Cooper, 2012). Ennek a leghatékonyabb módja a piruvát alaninná való átalakítása, majd az alanin asztrocitákba való transzportálása (Dadsetan és mtsai., 2011) (35. ábra). A
proteomikai
analízis
során
igazoltuk
az
L-laktát
dehidrogenáz
(Ldhb)
megemelkedett szintjét a szinaptikus mitokondriumokban, ami felveti a laktát dehidrogenáz emelkedett aktivitását a szinapszisban (megjegyzendő, hogy a fehérje mennyiségi növekedése és aktivitásának fokozódása nem feltétlenül jár együtt, ezért ez a felvetés igazolásra vár a jövőben). A laktát dehidrogenáz aktivitásának fokozódása azonban indokolt lenne az asztrocitákból érkező laktát piruváttá való átalakításának katalizálásában. A
fentebb
eltávolítása
említett felhasználása
céljából egybevág
a
a piruvátnak
máskülönben
az ammónia szinapszisból való
ellentmondónak
tűnő
eredményeinkkel,
miszerint a Ldhb szintje megnőtt, míg a piruvát dehidrogenáz szintje lecsökkent a szinaptikus mitokondriumokban. Az sMito glutamin és részben CK preferenciája szintén egybevág az általunk kapott csökkent szinaptikus mitokondriális szintet mutató glükóz, alkohol, aminosav és ketontest metabolizmusban résztvevő fehérjékkel. Néhány, oxidatív stresszben jelentős szerepet játszó fehérje csökkent szintet mutatott az sMito-ban, beleértve a mitokondriális szuperoxid dizmutázt (Sod2), ami az sMito-k csökkent védekező képességére utal a reaktív szabadgyökökkel szemben (ROS). A mitokondriális mátrixban lokalizálódó
Sod2 az egyik legfőbb antioxidáns enzim, ami
eltávolítja a ROS-t (főként a szuperoxidokat),
és védelmet nyújt a mitokondriális
károsodásokkal szemben (Miao és St Clair, 2009). A Sod2 hiányos egerek hamar meghalnak a
születést
követően,
azonban
Sod2/kataláz
mimetikummal
való
kezelés
hatására
meghosszabítható az életük, és csökkenhetőek a oxidatív-stresszel kapcsolatos patológiai elváltozások (Melov és mtsai., 2001). A Western blottal is megerősített csökkent szinaptikus mitokondriális Sod2 szint, melyet 3 különböző fehérjefoltból is kimutattunk, az sMito-k oxidatív stresszel szembeni fokozottabb érzékenységére utal. Lehetséges, hogy az sMito-k feláldozzák védelmi rendszerük egy részét az oxidatív stresszel szemben, hogy megfelelő ATP
termelésre
legyenek
képesek
ebben
a
specifikus
morfológiai és metabolikus
környezetben, és ne váljanak még sérülékenyebbé. A komplement komponens 1Q alegység kötő fehérje (C1qbp) mutatta a legnagyobb mennyiségű fehérjeszintet az összes sMito fehérje közül, ami 3,7-szeres növekedést jelent az sMito-ban az nsMito-hoz képest. A C1qbp fehérjét eredetileg plazmamembrán receptorként írták le, ami képes a C1q megkötésére a sejtek felszínén (Ghebrehiwet és mtsai., 2001).
99
Később kimutatták számos szubcelluláris kompartmentumban (Ghebrehiwet és mtsai., 2001; Sunayama és mtsai., 2004; Sengupta és mtsai., 2005).. McGee és munkatársai igazolták, hogy a C1qbp szolubilis fehérje a mitokondriális mátrixban lokalizálódik, továbbá egy új komponense a mPTP-nek, melynek nyitási mechanizmusa jelentős lépés a mitokondriális apoptotikus
útvonal
immunhisztokémiailag szinaptikus
folyamatában megerősítettük
végződésekben
is
(Mcgee a C1qbp
kimutattuk
és
Baines,
2011).
Munkánk
mitokondriális lokalizációját,
jelenlétét,
során
valamint a
mennyiségi eloszlásának
szövettani
vizsgálata a különböző mitokondrium populációk között azonban még további vizsgálatokat igényel. Irodalmi adatok alapján a C1qbp fehérje overexpressziója növeli a mitokondriális ROS
képződést,
csökkenti
a
mitokondriális
membránpotenciált,
ami
citokróm-c
felszabaduláshoz és végül sejthalálhoz vezet (Chowdhury és mtsai., 2008). Az sMito-ban megnövekedett C1qbp
expresszió
tehát arra enged következtetni, hogy az sMito-k
érzékenyebbek a mitokondriális ROS termelés és oxidatív stressz indukált sejthalállal szemben. A citoszkeleton organizációban, sejtmotilitásban, ion transzportban és szinaptikus transzmisszióban
szerepet
játszó
megváltozott
fehérjék
legtöbbször
nem kizárólag
a
mitokondriumban lokalizálódnak. Például az α-szinuklein (Snca) fehérjét, amit több mint kétszeres mennyiségben mutattunk ki az sMito-ban az nsMito-hoz képest, három különböző proteinfoltban is detektáltuk. A 14 kDa molekulatömegű Snca az agyban rendkívül nagy mennyiségben van jelen, mennyisége a citoszolikus fehérjék ~1%-át teszi ki (Iwai és mtsai., 1995). Az Snca a neurodegeneratív betegségekben és szinukleopátiákban jelentős szerepet játszó fehérje (Ma és mtsai., 2003), így diagnosztikai szempontból is rendkívül kutatott. A preszinaptikus
végződésekben
mennyiségben
írták
le
más
és
a
neuronális
szubcelluláris
sejtmagban
organellumokhoz
szignifikánsan képest,
nagyobb
azonban
a
sejtorganellumok között a mitokondriumban dúsul fel legnagyobb mennyiségben (Li és mtsai., 2007; Zhang és mtsai., 2008). Az oxidatív stressz egy jelentős tényező lehet az Snca intramitokondriális transzportjának kiváltásában (Cole és mtsai., 2008), ami lehetséges oka lehet az általunk meghatározott, emelkedett szinaptikus mitokondriális Snca szintnek. Az Snca lokalizálódhat a külső
mitokondriális membránban,
az intermembrán térben,
a
krisztákban és a mitokondriális mátrixban is (Zhang és mtsai., 2008). Az Snca hiányos egerek lipidanyagcsere-zavarral és csökkent ETL működéssel rendelkeznek (Ellis és mtsai., 2005), továbbá az Snca mutációja mitokondriális morfológiai és funkcionális változásokkal jár együtt (Martin és mtsai., 2006). Mindezek alapján elmondható, hogy a megnövekedett Snca
100
szint
az sMito-ban
hozzájárulhat
az ETL
stabilitásának
és az sMito
felépítésének
megőrzéséhez. A szinaptikus mitokondriumra jellemző fehérjék lehetséges forrásai A sMito-ok messze helyezkednek el a szinapszishoz tartozó sejttesttől. A szinaptikus végződést az axonális transzporton keresztül érik el (Macaskill és Kittler, 2010), melynek ismert részletei a bevezető 1.8.4.2.-es alfejezetében kerültek bemutatásra. A kapott sMito-ra jellemző fehérjekészlet többféle módon alakulhat ki: a mitokondriális proteom változhat a sejttesten belül, az axonális transzport során, illetve a szinaptikus végződésekben is. A mitokondriális fehérjék legnagyobb része a citoszolikus riboszómákon szintetizálódik, majd az intramitokondriális transzportmechanizmusok
révén jut a végső rendeltetési helyére
(részletesebben ld. bevezető 1.7. alfejezet). A fehérjék kisebb hányada mitokondriális DNS által kódolt,
melyek
megváltozott
mitokondriális
mechanizmusok
expresszióját intramitokondriális körülmények határozzák meg. A
együttese
fehérjeváltozásokat.
A
génátírás,
illetve
a
mitokondriális
eredményezheti tehát
az általunk
transzlokázok
katalizált
által
fehérjetranszport
kapott sMito-ra jellemző mitokondriális
fehérjeimport
mechanizmust a mitokondriális membránpotenciál (mMP), az ATP termelés, illetve a redox reakciók nagy mértékben befolyásolják. A fehérjeimportban jelentős szerepet játszanak a molekuláris chaperonok és fehérje összeszerelő komplexek, melyek direkt interakcióba lépnek az érkező fehérjékkel, biztosítva megfelelő szerkezetüket és végső rendeltetési helyük elérését (Chacinska és mtsai., 2009).
101
5.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra – 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának és oxidatív metabolizmusának összehasonlítása. Eredményeink az sMito és nsMito fehérjehálózatának APP és Aβ progresszió hatására bekövetkező változását tárták fel különböző korú és APP/PS1 egerekben. Összesen 60 különböző APP/PS1 és B6 egerek közötti szignifikáns változást mutató fehérjét írtunk le a proteomikai analízis során (4. táblázat). A szignifikáns változást mutató fehérjék többsége az energia metabolizmus (ETL és CK), oxidatív stresszválasz és apoptózis folyamataiban vesz részt (32. ábra). A megváltozott mitokondriális (sMito és nsMito változások együtt) fehérjék közös regulátor és célpont vizsgálata alapján elmondhatjuk, hogy a regulátor és célpont fehérjék zöme gyulladási és apoptotikus folyamatokban szerepet játszó molekula (33. ábra). A bioinformatikai analízis során megállapítottuk, hogy a Tnf-α citokin rendelkezik a legtöbb kapcsolattal az APP/PS1 egerekben megváltozott mitokondriális fehérjékkel. A Tnfα-t továbbá nem csak közös regulátorként, hanem közös célpontként is leírtuk, tehát kapcsolata az említett mitokondriális fehérjékkel kétirányú. Mindezek alapján feltételezhető a Tnf-α szerepe az Aβ hatására megváltozó mitokondriális fehérjék szabályozásában AK-ban. A Tnf-α egy proinflammatorikus citokin, ami a gyulladási folyamatok egyik fő iniciátora az agyban, továbbá szerepet játszik a neurotoxicitásban, a sejthalálban és az idegsejtek funkcionális elváltozásaiban (Feldmann és Maini, 2003). A Tnf-α az „extrinsic”/külső apoptotikus útvonal egyik iniciátora, mely a TNFR1 (Tnf receptor 1) halálreceptorhoz való kötődésen keresztül hat. A TNFR1 aktivációja a TRADD-RIP-TRAF2 (TNFR halál domén – receptor interakciós protein – TNF asszociált faktor 2) komplex kialakulását idézi elő, ami az NF-κB (nukleáris faktor-κB) sejt-túlélési útvonalat vagy a JNK (c-Jun-N-terminális kináz) apoptotikus útvonalat aktiválja. A RIP fehérje aktiválja a prokaszpáz 2-t és hasítja a BID fehérjét (BCL2 (B-sejt limfóma-2)-inerakciás agonista). A TRADD-FAD-FLICE (TNFR halál domén – FAS asszociált halál domén – FADD szerű interleukin-1 β) komplex aktiválja a prokaszpáz 8-at, ami apoptózist indukál a kaszpáz 3-on keresztül vagy a BID tBID-dé (trunkált/csonkolt BID) való hasításán át (37. ábra). Számos irodalmi adat igazolja a Tnf-α szerepét humán AK-ban. Kimutatták, hogy az Aβ serkenti a Tnf-α szekrécióját (Klegeris és mtsai., 1997; Combs és mtsai., 2001) és más gyulladási faktorok felszabadulását az agyban (Rosenberg, 2005; Ralay Ranaivo és mtsai., 2006). Az Aβ továbbá gyulladást indukál az idegszövetben, ami a neurodegeneráció folyamatának egyik korai lépése (Craft és mtsai.,
102
2006). Az eddig említett eredményekkel összhangban áll az AK-os betegek cerebrospinális folyadékjában mért 25-szörösére növekedett Tnf-α szint (Tarkowski és mtsai., 2003). A Tnf-α szint tehát jól korrelál az AK klinikai progressziójával (Tarkowski és mtsai., 2003). A Tnf-α szignalizáció gátlása lassítja az Aβ-hoz köthető patológiai elváltozások megjelenését, a kognitív hanyatlást továbbá a AK-ra jellemző fokozott idegsejtpusztulást (Mcalpine és mtsai., 2009).
Alzheimer-kóros betegeken végzett anti-Tnf terápia hatékony volt a kognitív
képességek javításában (Tobinick és mtsai., 2006; Tweedie és mtsai., 2007; Tobinick, 2009). Eredményeink
alapján
elmondható,
hogy
a
fehérjeváltozások korai megjelenéséhez, továbbá
Tnf-α
hozzájárulhat
a
mitokondriális
felmerül a Tnf-α, mint korai indikátor
lehetősége az Aβ felhalmozódásának kezdeti fázisában. Utóbbi felvetés további vizsgálatához AK-os betegek Tnf-α szintjének noninvazív vizsgálatára lenne szükség. Az APP/PS1 egerek fehérjeváltozásainak funkcionális elemzése alapján elmondhatjuk, hogy a Htra2 és Ethe1 oxidatív stresszben és apoptózisban szerepet játszó fehérjék szintje a kor előrehaladtával jellegzetes dinamikát mutat a B6 egerekhez képest (3 hónapos korban:↓, 6 hónapos korban:↑, 9 hónapos korban:↓), így felmerül, hogy alkalmasak lehetnek az AK progressziójának követésére. Ezen felül jelentős változást tapasztaltunk az apoptózisban szintén jelentős szabályozó funkcióval rendelkező, AK-hoz köthető Pebp1 illetve Vdac1 fehérjéknél is. A továbbiakban ezen fehérjék AK-hoz, illetve a Tnf-α közös regulátorfehérjéhez köthető szabályozási mechanizmusai kerülnek bemutatásra. A szerin proteáz Htra2 fehérje a HtrA (high-temperature requirement) oligomer szerin proteázok fehérjecsaládjának tagja, mely többek között a mitokondriális funkciók ellátásában, az autofágiában és apoptózis intrinsic/mitokondriális útvonalában vesz részt. Az apoptózis mitokondriális útvonalát különböző iniciátorok válthatják ki. A mitokondriális membrán permeabilizációját a BH3 domént tartalmazó, „BH3-only” proteinek idézik elő, melyek megkötik és serkentik a BAX fehérjéket (B-sejt limfóma 2-asszociált fehérje X) a BCL2 fehérjék gátlásán keresztül, lehetővé téve ezáltal a BAX fehérjék transzlokációját, továbbá számos apoptotikus faktor, mint a Htra2 fehérje felszabadulását (Benn és Woolf, 2004). A Htra2 felszabadulása DNS fragmentációhoz, majd végül apoptózishoz vezet (36. ábra). Számos tanulmány igazolja, hogy a Htra2 fehérje jelentős szerepet játszik a PK-ban (Strauss és mtsai., 2005; Plun-Favreau és mtsai., 2007), az AK-ban betöltött szerepe azonban nem tisztázott. A Htra2 enzimatikus aktivitása fokozódik AK-os betegek frontális cortexében (Moreira és mtsai., 2007), továbbá mennyisége jelentősen megnő a cerebrális cortexben és hippocampusban, valamint kimutatható a plakkok és NFK-ek területén is (Kawamoto és mtsai., 2010). A Htra2 közvetlenül hasítja az APP-t (Anandatheerthavarada és mtsai., 2003;
103
Park
és mtsai., 2006), továbbá közvetlenül kötődik az Aβ-hoz hozzájárulva annak
proapoptotikus aktivitásához (Park és mtsai., 2004). Az APP Htra2 általi hasítása az egészséges agy fiziológiás folyamata (Park és mtsai., 2006). A mitokondriális Htra2 képes kötődni a PS1-hez (Gray és mtsai., 2000; Martins és mtsai., 2002; Gupta és mtsai., 2004; Kuninaka és mtsai., 2007; Behbahani és mtsai., 2010), továbbá a PS1-ből származó peptidfragmens a Htra2 PDZ doménjéhez kötődve serkenti annak apoptózis inhibitor fehérjékre (IAP) irányuló proteolitikus aktivitását, ami Htra2-függő apoptózist indukál (Gupta és mtsai., 2004) (36. ábra). Elképzelhető tehát, hogy a Htra2 fehérjeszint emelkedése növeli a Htra2-mediált APP
hasítási útvonal arányát az amyloidogén hasítással szemben, ami
lelassíthatja az Aβ felhalmozódását a 6 hónapos APP/PS1 egerekben. Ez alapján a Htra2 átmenetileg képes védelmet nyújtani a további Aβ felhalmozódással szemben a 6 hónapos állatokban. Eredményeink alapján a másik Aβ felhalmozódás követésére alkalmas molekulajelölt a perszulfid dioxigenáz Ethe1 fehérje. Az Ethe1 fehérje (alternatív nemzetközi nevei: ethylmalonic encephalopathy protein 1, hepatoma subtracted clone one protein (HSCO), sulfur dioxygenase ETHE1) jelentős szerepet játszik a hidrogén szulfidok katabolizmusában. Az Ethe1 egy anti-apoptotikus fehérje, ami a hiszton deacetilázzal való specifikus kötődése révén növeli annak p53-ra irányuló aktivitását, ezáltal gátolva az apoptózist (Higashitsuji és mtsai., 2007). Az Ethe1 gátolja az NF-κB szignalizációt a RelA megkötésén keresztül, ami fokozza annak sejtmagból a citoplazmába irányuló exportját, továbbá a kaszpáz-9 gátlásán keresztül is kifejti antiapoptotikus hatását (Higashitsuji és mtsai., 2002) (36. ábra). Az Ethe1 hiánya halálos kimenetelű szulfid toxicitást okoz etil-malonát enkefalopátia során, ami egy autoszómális recesszív, gyógyíthatatlan, halálos kimenetelű betegség (Tiranti és mtsai., 2009). Az Aβ felhalmozódás patomechanimzusában még nem írták le az Ethe1 lehetséges szerepét. Az adatalapú munkahipotézisünk szerint a megemelkedett Ethe1 szint a 6 hónapos állatok szinaptikus mitokondriumában megelőzheti az Aβ által kiváltott apoptotikus folyamatokat, ami az Aβ felhalmozódás egyfajta kompenzáló mechanizmusa lehet. A foszfatidiletanolamin-kötő fehérje (phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (Pebp1) / Raf kinase inhibitor protein (RKIP)) egy multifunkcionális fehérje, ami a hippokampális
kolinerg
neurostimuláló
fehérje
(hippocampal cholinergic neurostimulating
peptide, HCNP) prekurzora is egyben. Számos tanulmány igazolta, hogy a Pebp1 kiterjedt szabályozási funkcióval rendelkező sejtszignalizációs molekula. Ismert továbbá, hogy a Pebp1
gátolja
a
Ras/Raf-1/MEK/ERK
MAPK
szignalizációs
útvonalat
a
Raf-1
foszforilációjának és aktivációjának gátlásán keresztül (Fougner és mtsai., 2008), a Tnf-α által
104
36. ábra Az apoptózis Tnf-α által szabályozott külső (extrinsic) és az Aβ hatására jelentős változást mutató mitokondriális apoptotikus faktorok (Htra2, Pebp1, Ethe1 és Vdac1) által szabályozott belső (intrinsic) útvonalainak lehetséges kapcsolódása. Az ábrán használt rövidítések: Aβ: β-amyloid, AIP: ASK1-kötő protein 1, ASK1: apoptózis-szignál-reguláló kináz-1, BID: BCL2 (B-sejt limfóma-2)-inerakciás agonista, tBID: trunkált (csonkolt) BID, BAX: B-sejt limfóma 2–asszociált fehérje X, pJNK: foszfo-JUN N-terminális kináz, AP1: aktivátor protein-1, c-jun: c-Jun-N-terminális kináz, CypD: ciklofilin-D, Ethe1: perszulfid dioxigenáz Ethe1, FAD: FAS asszociált halál domén, FLICE: FADD szerű interleukin -1 β, Htra2: szerin proteáz Htra2, NIK: NFκB-indukált kináz, IKK: IkappaB kináz, IκB: NF-κB inhibitoros alegység, IAP: apoptózis inhibitor fehérjék családja, Pebp1: foszfatidiletanolamin-kötő fehérje, PS1: preszenilin-1, RIP: receptor interakciós protein, TNFR1: Tnf receptor 1, TRADD: TNFR halál domén, TRAF: TNF asszociált faktor 2, Vdac1: feszültség-függő anion-szelektív csatorna-1. Készült: (Purves és Mcmahan, 1972; Shimizu és mtsai., 2000; Yeung és mtsai., 2001; Higashitsuji és mtsai., 2002; Gupta és mtsai., 2004) irodalmi adatok és saját eredményeink alapján.
105
aktivált NF-κB útvonalat az NF-κB-indukált kináz (NIK) és IkappaB kináz (IKK) enzimek gátlásán keresztül (Yeung és mtsai., 2001) (36. ábra). A Pebp1 fehérje AK-ban betöltött szerepét számos tanulmány alátámasztja, mRNS szintje csökken sporadikus AK-ban szenvedő betegek hippocampusának CA1 régiójában. Mivel a HCNP fehérje köztudottan aktiválja a kolinerg aciltranszferázt az idegsejtekben, AK-os betegekben kimutatott alacsony expressziós szintje magyarázhatja a kolinerg neuronok leszabályozódását, ami memóriazavarokhoz vezet AK-ban (Maki és mtsai., 2002). A Pebp1 fehérjeszintje Tg2576 egerek hippocampusában szintén szignifikáns csökkenést mutatott az Aβ progresszió hatására (George és mtsai., 2006). Munkánkban a Pebp1 fehérje szintje jelentős csökkenést mutatott 9 hónapos APP/PS1 egerek nsMito-ában, amikor az Aβ plakk felhalmozódás már rendkívül előrahaladott az agyban. 3 hónapos korú APP/PS1 állatok sMito-ában, ahol még nem mutatható ki Aβ-plakk lerakódás, minimális fehérjeszint csökkenést tapasztaltunk. Adataink tovább erősítik a Pebp1 AK-ban való jelentőségét, valamint alátámasztják a Tnf-α szabályozó szerepét az Aβ-által érintett mitokondriális fehérjékre. A már korábban említett feszültség-függő anion-szelektív csatorna-1 (Vdac1) számos metabolit (pl. befolyásolja
a
ATP/ADP) transzportját biztosító mitokondriumok
metabolikus
pórusformáló fehérje, ami erőteljesen
működését.
A
Bcl-2
fehérjecsalád
Bax
proapoptotikus tagja olyan pórus formálására képes közösen a Vdac1 fehérjével, melynek áteresztőképessége jóval meghaladja a Vdac1 csatornáét (Shimizu és mtsai., 2000), így az IMT-ben lokalizált apoptotikus faktorok felszabadulásának mértéke megnő (36. ábra). Ezzel szemben a Bid proapoptoikus fehérje a Vdac1 csatorna záródását idézi elő, ami gátolja a mitokondrium megfelelő
működését (Rostovtseva és mtsai., 2004). A Vdac1 szintje
szignifikáns csökkenést mutat a temporális és frontális cortexben, valamint a talamuszban AK-os betegek post mortem agymintájában (Yoo és mtsai., 2001). Más kísérletek emelkedett Vdac1 szintet mutattak az említett humán agyrégiókban, illetve APP transzgenikus egerek cortexében. Kimutatták továbbá, hogy a Vdac1 közvetlenül kötődik az Aβ és foszforilált tau fehérjékhez AK-os post mortem agyban, illetve különböző AK egérmodellekben, ami blokkolja
a
mitokondriális
fehérjetranszportot,
permeabilitási
pórust
(MPT),
gátolja
a
mitokondriális
továbbá oxidatív foszforilációt okozva mitokondriális funkciózavarhoz
vezet az idegsejtekben (Cuadrado-Tejedor és mtsai., 2011; Manczak és Reddy, 2012; Reddy, 2013).
A
Vdac1
szintén
overexpresszálódik
a
hippocampusban
Aβ-overexpresszáló
egérmodellben. A szolubilis Aβ oligomerek továbbá serkentőleg hatnak a Vdac1-re humán neuroblasztóma sejtvonalban (Cuadrado-Tejedor és mtsai., 2011). A csökkent Vdac1 expresszió előnyös lehet a szinaptikus aktivitás szempontjából, javíthatja a funkcióját továbbá
106
védelmet nyújthat az AK-hoz kötődő gének toxikus hatásával szemben, mint amilyen az APP, Tau, PS1, PS2 és BACE1 (Manczak és mtsai., 2013). Detergens-rezisztens membránfrakcióban a Vdac1 kötődik a γ-szekretázhoz, ami befolyásolja az Aβ termelődést, és ami alapján felmerül, hogy a hozzájuk kötődő molekulák lehetséges terápiás célpontok lehetnek AK-ban (Hur és mtsai., 2012). Eredményeink alapján a Vdac1 szintje lecsökken 6 hónapos APP/PS1 egerek szinaptikus mitokondriumában, ami javíthatja a szinaptikus funkciót, míg 9 hónapos
korra
ugyanitt
megnövekszik
a
szintje,
ami
a
szinapszisvesztéssel
és
memóriahanyatlással korrelál. A nem-szinaptikus mitokondriális Vdac1 szintje a különböző fehérjefoltokban ellentétes irányú változást mutat. Munkánk során a mitokondriális funkciót is teszteltük ugyanazokon az állatokon, melyekből a proteomikai vizsgálatot is végeztük. A mitokondriális oxidatív metabolizmus ismerten eltolódik a ROS-képződés irányába az öregedéssel és a neurodegeneratív betegségek során, ezért vizsgáltuk a mitokondrium preparátumokban a H2 O2 termelődés mértékét (Rao és Balachandran, 2002; Emerit és mtsai., 2004; Lin és Beal, 2006; Shibata és Kobayashi, 2008). Az ETL, mint ahogy a bevezető 1.8.3. alfejezetében is olvashattuk, a legfőbb intracelluláris ROS legfőbb forrása (Boveris és mtsai., 1972). Az ETL enzim komplexek aktivitása leszabályozódik AK-os betegek agyában (Kish és mtsai., 1992; Mutisya és mtsai., 1994; Kim és mtsai., 2001). Az izolált agyi mitokondriumokban a komplex I és III a legfőbb ROS képző helyek (Votyakova és Reynolds, 2001), de más ETL enzimek és CK dehidrogenázok szintén hozzájárulnak
a
metabolizmusban
H2 O2 szerepet
képződéshez játszó
(Adam-Vizi
fehérjekülönbségek
és
Tretter,
ellenére
a
2013).
Az
mitokondriális
oxidatív H2 O 2
termelésben nem tapasztaltunk változást a 3 hónapos egerekben (29/A ábra). Ez valószínűleg a
fehérjeváltozások
funkcionális
kompenzációjának
eredménye,
ami
megnehezíti
a
metabolikus diagnózist az AK-nak ebben a korai fázisában. Ezzel szemben, 6 hónapos korban emelkedett ROS-szintet tapasztaltunk az APP/PS1 egerek sMito-ában (29/B ábra), amikor az amyloid plakkok már megjelennek a hippocampusban és a cerebrális cortexben (26/F ábra). Alátámasztva az adatokat (ld. bevezető), miszerint az sMito-ok érzékenyebbek az Aβ toxikus hatásaival szemben (Du és mtsai., 2010), az nsMito-okban nem tapasztaltunk növekedést a ROS termelődésben 6 hónapos APP/PS1 egerekben (29/B ábra). Néhány komplex I alegység fehérjeszintje enyhébb, ellenkező irányú változást mutatott az nsMito-okban az sMito-okhoz képest, ami magyarázhatja az állandó ROS szintet. Rendkívül kiterjedt amyloid plakk lerakódás figyelhető meg a 9 hónapos APP/PS1 egerek corticális és hippokampális agyterületén (26/G ábra), a ROS termelésben azonban nem tapasztaltunk további növekedést (29/C ábra). Néhány hősokk fehérje szintje (Hspd1 és Hspa9) emelkedett szintet mutatott a 9
107
hónapos állatok mindkét mitokondrium populációjában, ami összefügghet a megnövekedett ER-stressz, a fokozott mértékű hibás fehérjefeltekeredés és a növekvő mennyiségű sérült fehérjék eliminációjának folyamatával. Az AK kutatásának egyik legfőbb célja napjainkban a korai biomarker keresés, ami alapján a betegségre hajlamos rizikócsoportokat lehet kijelölni egy lehetséges AK kezelés kidolgozása érdekében. Eredményeink olyan korai mitokondriális fehérjeváltozásokat írnak le, melyek megelőzik az AK-ra jellemző memóriazavarok megjelenését 3 hónapos APP/PS1 egerekben. Az eredményeink transzlálhatóságát illetően fontos megemlíteni, hogy a 60 különböző mitokondriális fehérjeváltozás közül 46 fehérje ismerten érintett a humán AK késői fázisában (4. táblázat / humán AK-os minta), továbbá 11 fehérjét már korábban leírtak, mint humán Aβ oligomer kötőpartnert (4. táblázat / zöld jelölés) (Olah és mtsai., 2011), ami jelentős szereppel bírhat az Aβ által okozott patológiás elváltozásokban. Fontos megjegyeznünk, hogy a korai mitokondriális marker fehérjék a humán agyi biopszia lehetőségének hiányában közvetlenül nem használhatóak, mérésükre nem-invazív eljárásokat kell kidolgozni.
Felmerül a képalkotó eljárásokkal vizsgálható metabolikus
termékeken keresztüli monitorozás, vagyis az FDG-PET további finomítása a citrát-kör metabolitjainak irányába. Első lépés azonban a fehérjeszintű korai változások részletes feltérképezése.
108
6. KONKLÚZIÓ I. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának vizsgálatából levonható legfőbb következtetések: Munkánk során kidolgoztunk egy módosított Percoll gradiens centrifugálási eljárást, amivel egyazon agymintából metabolikusan aktív sMito és nsMito frakciók állíthatók elő 90% fölötti tisztasággal, amit elektronmikroszkóppal és FACS-szal is igazoltunk. Az azonosított -2,28 – 3,70-szeres tartományba eső, 56 különböző fehérjeváltozás közül 22 szignifikánsan magasabb és 34 szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű fehérjét azonosítottunk az sMito-okban az nsMito-okhoz képest. Mindezek alapján elmondható, hogy a különböző mitokondrium populációkat specifikus fehérjeösszetétel jellemzi, továbbá valószínűsíthető, hogy a mitokondriális proteom dinamikája a szinaptikus funkciókban kulcsfontosságú tényező. A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a szinaptikus transzmisszió, valamint a laktát, glutation és nukleotid metabolizmus folyamataiban résztvevő fehérjék az sMito-okban dúsultak fel. Ezzel szemben a glükóz, alkohol, aminosav,
lipid
és
ketonmetabolizmus,
szignáltranszdukció,
morfogenezis,
fehérjeszintézis, fehérje degradáció és transzkripció folyamataiban szerepet játszó fehérjék nsMito-okra voltak jellemzőek. A további funkcionális csoportok mind sMito, mind nsMito-ra jellemző fehérjéket tartalmaztak. A Sod2 és C1qbp oxidatív stresszben szerepet játszó fehérjekülönbségeket, valamint az Idh3a és Sucla2 citrát-körben szerepet játszó fehérjekülönbséget Western blottal, illetve utóbbi kettőt immunhisztokémiával is igazoltuk. Eredményeink alapján a szinapszis energiaellátását szolgáló citrát-kör jelentősen különbözik a kétféle mitokondrium populációban, továbbá az sMito-ok fokozottabb érzékenységet mutatnak az oxidatív stresszre. Az sMito-okban feldúsult, energiametabolizmusban szerepet játszó fehérjék elemzése alapján a szinaptikus régiót alkotó idegsejtvégződések és az azokhoz szorosan kapcsolódó gliavégtalpak között kialakuló glutamin-glutamát ciklus alapvető fontosságú lehet az sMito-ok energiatermelését biztosító szubsztrátok ellátásában. Az sMito egyedi fehérjeösszetétele az alapkutatáson felül terápiás szempontból is jelentős lehet, hiszen specifikus jelölésük a bennük nagy mennyiségben megtalálható fehérjék révén (mint a C1qbp) lehetséges, ami az sMito-okra irányuló célzott gyógyszerfejlesztésben nagy jelentőséggel bírhat.
109
II. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt hatásának vizsgálatából levonható legfőbb eredmények és következtetések: A proteomikai analízis során 42 különböző, -1,41 – 1,80-szoros tartományba eső szinaptikus mitokondriális fehérjéváltozást, valamint 43 különböző, -2,29 – 1,52-szeres tartományba eső nem-szinaptikus mitokondriális fehérjeváltozást azonosítottunk, melyek az APP túltermelés és Aβ felgyülemlés mitokondriális folyamatokra gyakorolt hatását tükrözik. Vizsgálataink alapján elmondható, hogy az Aβ felhalmozódás eltérő és korfüggő hatást gyakorol az sMito-kban és a sejttestekben lokalizált nsMito-kban APP/PS1 transzgenikus egérmodellben. Mindkét mitokondrium populációban a viselkedési elváltozások és amyloid plakkok megjelenése előtti, az eddigi adatokkal összevetve az eddig ismert legkorábbi fehérjeváltozásokat írtunk le a 3 hónapos APP/PS1 egerekben, amikor a hidrogénperoxid
képződésben
nem
tapasztaltunk
változást.
Ez
utóbbi
jelenség
a
fehérjeváltozások funkcionális kompenzálódásának eredeménye lehet. Ezzel szemben a 6 hónapos APP/PS1 egerekben az sMito-okat fokozottabb mértékben érintő, emelkedett hidrogén-peroxid termelést detektáltunk, melynek mértéke 9 hónapos korra kevésbé volt jelentős. A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a fehérjék többsége az energiametabolizmus,
oxidatív stressz és apoptózis folyamataihoz
kapcsolódik. A Western blottal is igazolt Htra2 és Ethe1 apoptotikus fehérjék szintje a kor előrehaladtával jellegzetes dinamikát mutat (↓↑↓) az APP/PS1 egerek sMito-ában, ugyanez a jelenség figyelhető meg a jelenleg ismeretlen funkciójú ES1 fehérjénél is a nsMito-okban. Mindezek alapján felmerül, hogy az említett fehérjék alkalmasak lehetnek az Aβ progresszió okozta mitokondriális fehérjehálózat-változás különböző fázisainak indexálására. A bioinformatikai vizsgálatok során végzett közös célpont és regulátor analízis alapján megállapítottuk, hogy a Tnf-α fontos szereppel bír az Aβ hatására megváltozott szintű mitokondriális
fehérjék
bioinformatikai elemzések
szabályozásában. felvetik
A
a Htra2,
leírt Ethe1
proteomikai
változások
és
és Tnf-α korai, non-invazív
vizsgálatának fontosságát humán perifériás mintákban (pl. vérszérum), ami lehetővé teheti bizonyos
korai biomarkerek
azonosítását,
hajlamosabb rizikócsoportok kijelölésére.
110
melyek
segíthetnek
az AK-ra
A Tnf-α által indukált külső, valamint az Aβ hatására jelentős változást mutató Htra2, Ethe1,
Pebp1
és Vdac1
által befolyásolt mitokondriális apoptotikus útvonalak
kapcsololatai felvetik az Aβ hatásának jelentőségét az NFκB szignalizáció, illetve a kaszpáz-kaszkád útvonalakra. Adataink korábbi, humán AK-os post mortem agyminták vizsgálatából származó proteomikai eredményeket is alátámasztanak, amellett, hogy korábban le nem írt fehérjeváltozásokat is tartalmaznak. Eredményeink tehát egy új kutatási irányt nyitnak az Aβ hatására bekövetkező korai mitokondriális elváltozások feltárásában, ami az AK tünetmentes, korai fázisának megértésében jelentős előrelépés lehet. Adataink felvetik a 3 hónaposnál fiatalabb állatok mitokondriális fehérjeváltozásainak részletesebb kutatásának lehetőségét, és amelyet különböző állatmodellek összevetésével tervezünk vizsgálni a jövőben.
111
Irodalomjegyzék Abramov, A. Y., Canevari, L., Duchen, M. R. (2004). "Beta -amyloid peptides induce mitochondrial dysfunction and oxidative stress in astrocytes and death of neurons through activation of NADPH oxidase." J Neurosci 24(2): 565-575. Adam-Vizi, V., Tretter, L. (2013). "The role of mitochondrial dehydrogenases in the generation of oxidative stress." Neurochem Int 62(5): 757-763. Addya, S., Anandatheerthavarada, H. K., Biswas, G., Bhagwat, S. V., Mullick, J., Avadhani, N. G. (1997). "Targeting of NH2-terminal-processed microsomal protein to mitochondria: a novel pathway for the biogenesis of hepatic mitochondrial P450MT2." J Cell Biol 139(3): 589 -599. Agca, C., Fritz, J. J., Walker, L. C., Levey, A. I., Chan, A. W., Lah, J. J., Agca, Y. (2008). "Development of transgenic rats producing human beta-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically." BMC Neurosci 9: 28. Agca, C., Seye, C., Kashuba Benson, C. M., Rikka, S., Chan, A. W., Weisman, G. A., Agca, Y. (2009). "Development of a novel transgenic rat overexpressing the P2Y(2) nucleotide receptor using a lentiviral vector." J Vasc Res 46(5): 447-458. Ahmed, T., Gilani, A. H. (2009). "Inhibitory effect of curc uminoids on acetylcholinesterase activity and attenuation of scopolamine-induced amnesia may explain medicinal use of turmeric in Alzheimer's disease." Pharmacol Biochem Behav 91(4): 554-559. Allen, N. J., Karadottir, R., Attwell, D. (2005). "A preferential role for glycolysis in preventing the anoxic depolarization of rat hippocampal area CA1 pyramidal cells." J Neurosci 25(4): 848 -859. Alley, G. M., Bailey, J. A., Chen, D., Ray, B., Puli, L. K., Tanila, H., Banerjee, P. K., Lahiri, D. K. (2010). "Memantin e lowers amyloid-beta peptide levels in neuronal cultures and in APP/PS1 transgenic mice." J Neurosci Res 88(1): 143-154. Allinson, T. M., Parkin, E. T., Turner, A. J., Hooper, N. M. (2003). "ADAMs family members as amyloid precursor protein alpha-secretases." J Neurosci Res 74(3): 342-352. Alzheimer, A., Stelzmann, R. A., Schnitzlein, H. N., Murtagh, F. R. (1995). "An English translation of Alzheimer's 1907 paper, "Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde"." Clin Anat 8(6): 429-431. Ames, A., 3rd (2000). "CNS energy metabolism as related to function." Brain Res Brain Res Rev 34(1 -2): 42-68. Anandatheerthavarada, H. K., Biswas, G., Robin, M. A., Avadhani, N. G. (2003). "Mitochondrial targeting and a novel transmembrane arrest of Alzheimer's amyloid precursor protein impairs mitochondrial function in neuronal cells." J Cell Biol 161(1): 41-54. Anantharaman, M., Tangpong, J., Keller, J. N., Murphy, M. P., Markesbery, W. R., Kiningham, K. K., St Clair, D. K. (2006). "Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease." Am J Pathol 168(5): 1608-1618. Andersen, P., Bliss, T. V., Skrede, K. K. (1971). "Unit analysis of hippocampal polulation spikes." Exp Brain Res 13(2): 208-221. Anderson, S., Bankier, A. T., Barrell, B. G., de Bruijn, M. H., Coulson, A. R., Drouin, J., Eperon, I. C., Nierlich, D. P., Roe, B. A., Sanger, F., Schreier, P. H., Smith, A. J., Staden, R., Young, I. G. (1981). "Sequence and organization of the human mitochondrial genome." Nature 290(5806): 457 -465. Andreyev, A. Y., Kushnareva, Y. E., Starkov, A. A. (2005). "Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species." Biochemistry (Mosc) 70(2): 200-214. Antequera, D., Bolos, M., Spuch, C., Pascual, C., Ferrer, I., Fernandez-Bachiller, M. I., Rodriguez-Franco, M. I., Carro, E. (2012). "Effects of a tacrine-8-hydroxyquinoline hybrid (IQM-622) on Abeta accumulation and cell death: involvement in hippocampal neuronal loss in Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 46(3): 682-691. Area-Gomez, E., Del Carmen Lara Castillo, M., Tambini, M. D., Guardia -Laguarta, C., de Groof, A. J., Madra, M., Ikenouchi, J., Umeda, M., Bird, T. D., Sturley, S. L., Schon, E. A. (2012). "Upregulated function of mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease." EMBO J 31(21): 4106 -4123. Baranello, R. J., Bharani, K. L., Padmaraju, V., Chopra, N., Lahiri, D. K., Greig, N. H., Pappolla, M. A., Sambamurti, K. (2015). "Amyloid-beta protein clearance and degradation (ABCD) pathways and their role in Alzheimer's disease." Curr Alzheimer Res 12(1): 32-46. Barbero-Camps, E., Fernandez, A., Martinez, L., Fernandez-Checa, J. C., Colell, A. (2013). "APP/PS1 mice overexpressing SREBP-2 exhibit combined Abeta accumulation and tau pathology underlying Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 22(17): 3460-3476.
112
Barrett, E. F. (2001). "Contrasting contributions of endoplasmic reticulum and mitochondria to Ca(2)+ handling in neurons." J Gen Physi ol 118(1): 79-82. Barros, L. F., Deitmer, J. W. (2010). "Glucose and lactate supply to the synapse." Brain Res Rev 63(1 -2): 149-159. Behbahani, H., Pavlov, P. F., Wiehager, B., Nishimura, T., Winblad, B., Ankarcrona, M. (2010). "Association of Omi/HtrA2 with gamma-secretase in mitochondria." Neurochem Int 57(6): 668-675. Benn, S. C., Woolf, C. J. (2004). "Adult neuron survival strategies --slamming on the brakes." Nat Rev Neurosci 5(9): 686-700. Bero, A. W., Bauer, A. Q., Stewart, F. R., White, B. R., Cirrito, J. R., Raichle, M. E., Culver, J. P., Holtzman, D. M. (2012). "Bidirectional relationship between functional connectivity and amyloid -beta deposition in mouse brain." J Neurosci 32(13): 4334-4340. Bierer, L. M., Haroutunian, V., Gabriel, S., Knott, P. J., Carlin, L. S., Purohit, D. P., Perl, D. P., Schmeidler, J., Kanof, P., Davis, K. L. (1995). "Neurochemical correlates of dementia severity in Alzheimer's disease: relative importance of the cholinergic deficits." J Neurochem 64(2): 749-760. Billups, B., Forsythe, I. D. (2002). "Presynaptic mitochondrial calcium sequestration influences transmission at mammalian central synapses." J Neurosci 22(14): 5840-5847. Biscaro, B., Lindvall, O., Tesco, G., Ekdahl, C. T., Nitsch, R. M. (2012). "Inhibition of microglial activation protects hippocampal neurogenesis and improves cognitive deficits in a transgenic mouse model for Alzheimer's disease." Neurodegener Dis 9(4): 187-198. Bobba, A., Amadoro, G., Valenti, D., Corsetti, V., Lassandro, R., Atlante, A. (2013). "Mitochondrial respiratory chain Complexes I and IV are impaired by beta -amyloid via direct interaction and through Complex I dependent ROS production, respectively." Mitochondrion 13(4): 298 -311. Bons, N., Mestre, N., Ritchie, K., Petter, A., Podlisny, M., Selkoe, D. (1994). "Identification of amyloid beta protein in the brain of the small, short-lived lemurian primate Microcebus murinus." Neurobiol Aging 15(2): 215-220. Borchelt, D. R., Thinakaran, G., Eckman, C. B., Lee, M. K., Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C. M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H. H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A. I., Gandy, S. E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Price, D. L., Younkin, S. G., Sisodia, S. S. (1996). "Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo." Neuron 17(5): 1005 -1013. Boveris, A., Oshino, N., Chance, B. (1972). "The cellular production of hydrogen peroxide." Biochem J 128(3): 617-630. Braak, H., Braak, E. (1995). "Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes." Neurobiol Aging 16(3): 271-278; discussion 278-284. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. (1994). "Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat." Neurosci Lett 171(1-2): 1-4. Brendza, R. P., O'Brien, C., Simmons, K., McKeel, D. W., Bales, K. R., Paul, S. M., Olney, J. W., Sanes, J. R., Holtzman, D. M. (2003). "PDAPP; YFP double transgenic mice: a tool to study amy loid-beta associated changes in axonal, dendritic, and synaptic structures." J Comp Neurol 456(4): 375 -383. Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. (2004). "Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria." J Neurosci Methods 137(2): 299-303. Brown, M. R., Sullivan, P. G., Geddes, J. W. (2006). "Synaptic mitochondria are more susceptible to Ca2+overload than nonsynaptic mitochondria." J Biol Chem 281(17): 116 58-11668. Bubber, P., Haroutunian, V., Fisch, G., Blass, J. P., Gibson, G. E. (2005). "Mitochondrial abnormalities in Alzheimer brain: mechanistic implications." Ann Neurol 57(5): 695 -703. Burte, F., De Girolamo, L. A., Hargreaves, A. J., Billett, E. E. (2011). "Alterations in the mitochondrial proteome of neuroblastoma cells in response to complex 1 inhibition." J Proteome Res 10(4): 1974 -1986. Butterfield, D. A., Gnjec, A., Poon, H. F., Castegna, A., Pierce, W. M., Klein, J. B., Martins, R. N. (2006). "Redox proteomics identification of oxidatively modified brain proteins in inherited Alzheimer's disease: an initial assessment." J Alzheimers Dis 10(4): 391-397. Calkins, M. J., Reddy, P. H. (2011). "Amyloid beta impairs mitochondrial anterograde transport a nd degenerates synapses in Alzheimer's disease neurons." Biochim Biophys Acta 1812(4): 507 -513. Cardoso, S. M., Proenca, M. T., Santos, S., Santana, I., Oliveira, C. R. (2004a). "Cytochrome c oxidase is decreased in Alzheimer's disease platelets." Neurobiol Aging 25(1): 105-110. Cardoso, S. M., Santana, I., Swerdlow, R. H., Oliveira, C. R. (2004b). "Mitochondria dysfunction of Alzheimer's disease cybrids enhances Abeta toxicity." J Neurochem 89(6): 1417 -1426.
113
Casley, C. S., Canevari, L., Land, J. M., Clark, J. B., Sharpe, M. A. (2002). "Beta-amyloid inhibits integrated mitochondrial respiration and key enzyme activities." J Neurochem 80(1): 91-100. Caspersen, C., Wang, N., Yao, J., Sosunov, A., Chen, X., Lustbader, J. W., Xu, H. W., Stern, D., McKhann, G., Yan, S. D. (2005). "Mitochondrial Abeta: a potential focal point for neuronal metabolic dysfunction in Alzheimer's disease." FASEB J 19(14): 2040-2041. Cassidy-Stone, A., Chipuk, J. E., Ingerman, E., Song, C., Yoo, C., Kuwana, T., Kurth, M. J., Shaw, J. T., Hinshaw, J. E., Green, D. R., Nunnari, J. (2008). "Chemical inhibition of the mitochondrial division dynamin reveals its role in Bax/Bak-dependent mitochondrial outer membrane permeabilization." Dev Cell 14(2): 193 204. Castane, A., Theobald, D. E., Robbi ns, T. W. (2010). "Selective lesions of the dorsomedial striatum impair serial spatial reversal learning in rats." Behav Brain Res 210(1): 74 -83. Cente, M., Filipcik, P., Pevalova, M., Novak, M. (2006). "Expression of a truncated tau protein induces oxidat ive stress in a rodent model of tauopathy." Eur J Neurosci 24(4): 1085-1090. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. (2009). "Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms." Cell 138(4): 628-644. Chan, D. C. (2012). "Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health." Annu Rev Genet 46: 265-287. Chang, E. H., Savage, M. J., Flood, D. G., Thomas, J. M., Levy, R. B., Mahadomrongkul, V., Shirao, T., Aoki, C., Huerta, P. T. (2006). "AMPA receptor downscaling at the onset of Alzheimer's disease pathology in double knockin mice." Proc Natl Acad Sci U S A 103(9): 3410 -3415. Chandrasekaran, K., Hatanpaa, K., Rapoport, S. I., Brady, D. R. (1997). "Decreased expression of nuclear and mitochondrial DNA-encoded genes of oxidative phosphorylation in association neocortex in Alzheimer disease." Brain Res Mol Brain Res 44(1): 99-104. Chavez-Gutierrez, L., Bammens, L., Benilova, I., Vandersteen, A., Benurwar, M., Borgers, M., Lismont, S., Zhou, L., Van Cleynenbreugel, S., Esselmann, H., Wiltfang, J., Serneels, L., Karran, E., Gijsen, H., Schymkowitz, J., Rousseau, F., Broersen, K., De Strooper, B. (2012). "The mechanism of gamma -Secretase dysfunction in familial Alzheimer disease." EMBO J 31(10): 2261 -2274. Chen, F., Hasegawa, H., Schmitt-Ulms, G., Kawarai, T., Bohm, C., Katayama, T., Gu, Y., Sanjo, N., Glista, M., Rogaeva, E., Wakutani, Y., Pardossi -Piquard, R., Ruan, X., Tandon, A., Checler, F., Marambaud, P., Hansen, K., Westaway, D., St George-Hyslop, P., Fraser, P. (2006). "TMP21 is a presenilin complex component that modulates gamma -secretase but not epsilon-secretase activity." Nature 440(7088): 1208-1212. Chen, H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. (2007). "Mitochondrial fusion protects against neurod egeneration in the cerebellum." Cell 130(3): 548-562. Chen, J. X., Yan, S. D. (2007). "Amyloid-beta-induced mitochondrial dysfunction." J Alzheimers Dis 12(2): 177 184. Choi, J., Ravipati, A., Nimmagadda, V., Schubert, M., Castellani, R. J., Russell, J. W. (2014). "Potential roles of PINK1 for increased PGC-1alpha-mediated mitochondrial fatty acid oxidation and their associations with Alzheimer disease and diabetes." Mitochondrion 18: 41 -48. Chou, J. L., Shenoy, D. V., Thomas, N., Choudhary, P. K., Laferla, F. M., Goodman, S. R., Breen, G. A. (2011). "Early dysregulation of the mitochondrial proteome in a mouse model of Alzheimer's disease." J Proteomics 74(4): 466-479. Choudhry, F., Howlett, D. R., Richardson, J. C., Francis, P. T., Williams, R. J. (2012). "Pro-oxidant diet enhances beta/gamma secretase-mediated APP processing in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging 33(5): 960-968. Chowdhury, A. R., Ghosh, I., Datta, K. (2008). "Excessive reactive oxygen species induces apoptosis in fibroblasts: role of mitochondrially accumulated hyaluronic acid binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR)." Exp Cell Res 314(3): 651-667. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. (2012). "Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans -Golgi network." Proc Natl Acad Sci U S A 109(30): E2077-2082. Chyung, A. S., Greenberg, B. D., Cook, D. G., Doms, R. W., Lee, V. M. (1997). "Novel beta -secretase cleavage of beta-amyloid precursor protein in the endoplasmic reticulum/intermediate compartment of NT2N cells." J Cell Biol 138(3): 671-680. Cohen, R. M., Rezai-Zadeh, K., Weitz, T. M., Rentsendorj, A., Gate, D., Spivak, I., Bholat, Y., Vasilevko, V., Glabe, C. G., Breunig, J. J., Rakic, P., Davtyan, H., Agadjanyan, M. G., Kepe, V., Barrio, J. R., Bannykh, S., Szekely, C. A., Pechnick, R. N., Town, T. (2013). "A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau
114
pathology, behavioral impairment, oligomeric abeta, and frank neuronal loss." J Neurosci 33(15): 6245-6256. Cole, N. B., Dieuliis, D., Leo, P., Mitchell, D. C., Nussbaum, R. L. (2008). "Mitochondrial translocation of alpha synuclein is promoted by intracellular acidification." Exp Cell Res 314(10): 2076 -2089. Colombini, M. (2004). "VDAC: the channel at the interface between mitochondria and the cytosol." Mol Cell Biochem 256-257(1-2): 107-115. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. (2001). "beta -Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFalpha-dependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosis." J Neurosci 21(4): 1179-1188. Contestabile, A. (2011). "The history of the cholinergic hypothesis." Behav Brain Res 221(2): 334 -340. Cooper, A. J. (2012). "The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in cerebral ammonia homeostasis." Neurochem Res 37(11): 2439-2455. Cork, L. C., Powers, R. E., Selkoe, D. J., Davies, P., Geyer, J. J., Price, D. L. (1988). "Neurofibrillary tangles and senile plaques in aged bears." J Neuropathol Exp Neurol 47(6): 629 -641. Cotman, C. W., Head, E. (2008). "The canine (dog) model of human aging and dis ease: dietary, environmental and immunotherapy approaches." J Alzheimers Dis 15(4): 685 -707. Craft, J. M., Watterson, D. M., Van Eldik, L. J. (2006). "Human amyloid beta -induced neuroinflammation is an early event in neurodegeneration." Glia 53(5): 484-490. Cuadrado-Tejedor, M., Vilarino, M., Cabodevilla, F., Del Rio, J., Frechilla, D., Perez-Mediavilla, A. (2011). "Enhanced expression of the voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) in Alzheimer's disease transgenic mice: an insight into the pathogenic effects of amyloid-beta." J Alzheimers Dis 23(2): 195206. Cummings, J. L., Back, C. (1998). "The cholinergic hypothesis of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease." Am J Geriatr Psychiatry 6(2 Suppl 1): S64-78. Cummings, B. J., Head, E., Ruehl, W., Milgram, N. W., Cotman, C. W. (1996). "The canine as an animal model of human aging and dementia." Neurobiol Aging 17(2): 259-268. Dadsetan, S., Bak, L. K., Sorensen, M., Keiding, S., Vilstrup, H., Ott, P., Leke, R., Schousboe, A., Waagepetersen, H. S. (2011). "Inhibition of glutamine synthesis induces glutamate dehydrogenase-dependent ammonia fixation into alanine in co-cultures of astrocytes and neurons." Neurochem Int 59(4): 482 488. Davey, G. P., Canevari, L., Clark, J. B. (1997). "Threshold effects in synaptosomal and nonsynaptic mitochondria from hippocampal CA1 and paramedian neocortex brain regions." J Neurochem 69(6): 2564 -2570. Davies, P., Maloney, A. J. (1976). "Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease." Lancet 2(8000): 1403. de la Torre, J. C. (2010). "The vascular hypothesis of Alzheimer's disease: bench to bedside and beyond." Neurodegener Dis 7(1-3): 116-121. De Vos, K. J., Chapman, A. L., Tennant, M. E., Manser, C., Tudor, E. L., Lau, K. F., Brownlees, J., Ackerley, S., Shaw, P. J., McLoughlin, D. M., Shaw, C. E., Leigh, P. N., Miller, C. C., Grierson, A. J. (2007). "Familial amyotrophic lateral sclerosis -linked SOD1 mutants perturb fast axonal transport to reduce axonal mitochondria content." Hum Mol Genet 16(22): 2720-2728. Deacon, R. M., Koros, E., Bornemann, K. D., Rawlins, J. N. (2009). "Aged Tg2576 mice are impaired on social memory and open field habituation tests." Behav Brain Res 197(2): 466 -468. Delatour, B., Guegan, M., Volk, A., Dhenain, M. (2006). "In vivo MRI and histological evaluation of brain atrophy in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging 27(6): 835-847. Devi, L., Prabhu, B. M., Galati, D. F., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. (2006). "Accumulation of amyloid precursor protein in the mitochondrial import channels of human Alzheimer's disease brain is associated with mitochondrial dysfunction." J Neurosci 26(35): 9057 -9068. Ding, Y., Qiao, A., Wang, Z., Goodwin, J. S., Lee, E. S., Block, M. L., Allsbrook, M., McDonald, M. P., Fan, G. H. (2008). "Retinoic acid attenuates beta -amyloid deposition and rescues memory deficits in an Alzheimer's disease transgenic mouse model." J Neurosci 28(45): 11622 -11634. Doecke, J. D., Laws, S. M., Faux, N. G., Wilson, W., Burnham, S. C., Lam, C. P., Mondal , A., Bedo, J., Bush, A. I., Brown, B., De Ruyck, K., Ellis, K. A., Fowler, C., Gupta, V. B., Head, R., Macaulay, S. L., Pertile, K., Rowe, C. C., Rembach, A., Rodrigues, M., Rumble, R., Szoeke, C., Taddei, K., Taddei, T., Trounson, B., Ames, D., Masters, C. L., Martins, R. N. (2012). "Blood-based protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer disease." Arch Neurol 69(10): 1318-1325. Dournaud, P., Delaere, P., Hauw, J. J., Epelbaum, J. (1995). "Differential correlation between neurochemical deficits, neuropathology, and cognitive status in Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 16(5): 817 -823.
115
Dragicevic, N., Mamcarz, M., Zhu, Y., Buzzeo, R., Tan, J., Arendash, G. W., Bradshaw, P. C. (2010). "Mitochondrial amyloid-beta levels are associated with the extent of mitochondrial dysfunction in different brain regions and the degree of cognitive impairment in Alzheimer's transgenic mice." J Alzheimers Dis 20 Suppl 2: S535-550. Du, H., Guo, L., Fang, F., Chen, D., Sosunov, A. A., McKhann, G. M., Yan, Y., Wang, C., Zhan g, H., Molkentin, J. D., Gunn-Moore, F. J., Vonsattel, J. P., Arancio, O., Chen, J. X., Yan, S. D. (2008). "Cyclophilin D deficiency attenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memory in Alzheimer's disease." Nat Med 14(10): 1097-1105. Du, H., Guo, L., Yan, S., Sosunov, A. A., McKhann, G. M., Yan, S. S. (2010). "Early deficits in synaptic mitochondria in an Alzheimer's disease mouse model." Proc Natl Acad Sci U S A 107(43): 18670 -18675. Du, H., Guo, L., Zhang, W., Rydzews ka, M., Yan, S. (2011). "Cyclophilin D deficiency improves mitochondrial function and learning/memory in aging Alzheimer disease mouse model." Neurobiol Aging 32(3): 398 406. Dumont, M., Ho, D. J., Calingasan, N. Y., Xu, H., Gibson, G., Beal, M. F. (2009). "Mitochondrial dihydrolipoyl succinyltransferase deficiency accelerates amyloid pathology and memory deficit in a transgenic mouse model of amyloid deposition." Free Radic Biol Med 47(7): 1019 -1027. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Heath, J. W., Kidd, G. J., Rostas, J. A. (1986). "A rapid method for isolation of synaptosomes on Percoll gradients." Brain Res 372(1): 115 -129. Eaton, S. L., Roche, S. L., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K. J., Farquharson, C., Gillingwater, T. H., Wishart, T. M. (2013). "Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting." PLoS One 8(8): e72457. Echeverria, V., Ducatenzeiler, A., Alhonen, L., Janne, J., Grant, S. M., Wandosell, F., Muro, A., Baralle, F., Li, H., Duff, K., Szyf, M., Cuello, A. C. (2004). "Rat transgenic models with a phenotype of intracellular Abeta accumulation in hippocampus and cortex." J Alzheimers Dis 6(3): 209-219. Echeverria, V., Ducatenzeiler, A., Chen, C. H., Cuello, A. C. (2005). "Endogenous beta-amyloid peptide synthesis modulates cAMP response element-regulated gene expression in PC12 cells." Neuroscience 135(4): 1193-1202. Eckert, A., Hauptmann, S., Scherping, I., Rhein, V., Muller-Spahn, F., Gotz, J., Muller, W. E. (2008). "Soluble betaamyloid leads to mitochondrial defects in amyloid precursor protein and tau transgenic mice." Neurodegener Dis 5(3-4): 157-159. Ellis, C. E., Murphy, E. J., Mitchell, D. C., Golovko, M. Y., Scaglia, F., Barcelo-Coblijn, G. C., Nussbaum, R. L. (2005). "Mitochondrial lipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking alpha-synuclein." Mol Cell Biol 25(22): 10190-10201. Emerit, J., Edeas, M., Bricaire, F. (2004). "Neurodegenerative diseases and oxidative stress." Biomed Pharmacother 58(1): 39-46. Enns, G. M., Kinsman, S. L., Perlman, S. L., Spicer, K. M., Abdenur, J. E., Cohen, B. H., Amagata, A., Barnes, A., Kheifets, V., Shrader, W. D., Thoolen, M., Blankenberg, F., Miller, G. (2012). "Initial experience in the treatment of inherited mitochondrial disease with EPI-743." Mol Genet Metab 105(1): 91-102. Erecinska, M., Cherian, S., Silver, I. A. (2004). "Energy metabolism in mammalian brain during development." Prog Neurobiol 73(6): 397-445. Erickson, C. A., Barnes, C. A. (2003). "The neurobiology of memory changes in normal aging." Exp Gerontol 38(1-2): 61-69. Falkevall, A., Alikhani, N., Bhushan, S., Pavlov, P. F., Busch, K., Johnson, K. A., Eneqvist, T., Tjernberg, L., Ankarcrona, M., Glaser, E. (2006). "Degradation of the amyloid beta -protein by the novel mitochondrial peptidasome, PreP." J Biol Chem 281(39): 29096 -29104. Feldmann, M., Maini, R. N. (2003). "Lasker Clinical Medical Research Award. TNF defined as a therapeutic target for rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases." Nat Med 9(10): 1245 -1250. Finder, V. H., Glockshuber, R. (2007). "Amyloid-beta aggregation." Neurodegener Dis 4(1): 13-27. Fisher, N. J., Rourke, B. P., Bieliauskas, L. A., Giordani, B., Berent, S., Foster, N. L. (1997). "Unmasking the heterogeneity of Alzheimer's disease: case studies of individuals from distinct neuropsychological subgroups." J Clin Exp Neuropsychol 19(5): 713-754. Fladby, T., Maehlen, J. (1999). "[The amyloid and tau hypothesis in degenerative dementia]." Tidsskr Nor Laegeforen 119(7): 976-979. Fonseca, M. I., Zhou, J., Botto, M., Tenner, A. J. (2004). "Absence of C1q leads to less neuropathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease." J Neurosci 24(29): 6457 -6465.
116
Fougner, S. L., Bollerslev, J., Latif, F., Hald, J. K., Lund, T., Ramm-Pettersen, J., Berg, J. P. (2008). "Low levels of raf kinase inhibitory protein in growth hormone-secreting pituitary adenomas correlate with poor response to octreotide treatment." J Clin Endocrinol Metab 93(4): 1211 -1216. Francis, P. T., Palmer, A. M., Snape, M., Wilcock, G. K. (1999). "The cholinergic hypothesis of Alzheimer's disease: a review of progress." J Neurol Neurosurg Psychiatry 66(2): 137 -147. Frautschy, S. A., Yang, F., Calderon, L., Cole, G. M. (1996). "Rodent models of Alzheimer's disease: rat A beta infusion approaches to amyloid deposits." Neurobiol Aging 17(2): 311 -321. Frieden, C. (2007). "Protein aggregation processes: In search of the mechanism." Protein Sci 16(11): 2334-2344. Friedland, R. P., Koss, E., Haxby, J. V., Grady, C. L., Luxenberg, J., Schapiro, M. B., Kaye, J. (1988). "NIH conference. Alzheimer disease: clinical and biological heterogeneity." Ann Intern Med 109(4): 298 -311. Games, D., Adams, D., Alessandrini, R., Barbour, R., Berthelette, P., Blackwell, C., Carr, T., Clemens, J., Donaldson, T., Gillespie, F., et al. (1995). "Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein." Nature 373(6514): 523-527. Gan, X., Wu, L., Huang, S., Zhong, C., Shi, H., Li, G., Yu, H., Howard Swerdlow, R., Xi Chen, J., Yan, S. S. (2014). "Oxidative stress-mediated activation of extracellular signal -regulated kinase contributes to mild cognitive impairment-related mitochondrial dysfunction." Free Radic Biol Med 75C: 230 -240. Gardiol, A., Racca, C., Triller, A. (2001). "RNA transport and local protein synthesis in the dendritic compartment." Results Probl Cell Differ 34: 105-128. Gatto, L., Vizcaino, J. A., Hermjakob, H., Huber, W., Lilley, K. S. (2010). "Organelle proteomics experimental designs and analysis." Proteomics 10(22): 3957-3969. Gearing, M., Tigges, J., Mori, H., Mirra, S. S. (1997). "beta -Amyloid (A beta) deposition in the brains of aged orangutans." Neurobiol Aging 18(2): 139-146. George, A. J., Gordon, L., Beissbarth, T., Koukoulas, I., Holsinger, R. M., Perreau, V., Cappai, R., Tan, S. S., Masters, C. L., Scott, H. S., Li, Q. X. (2010). "A serial analysis of gene expression profile of the Alzheimer's disease Tg2576 mouse model." Neurotox Res 17(4): 360-379. George, A. J., Holsinger, R. M., McLean, C. A., Tan, S. S., Scott, H. S., Cardamone, T., Cappai, R., Masters, C. L., Li, Q. X. (2006). "Decreased phosphatidylethanolamine binding protein expression correlates with Abeta accumulation in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 27(4): 614 -623. Ghanbari, H. A., Ghanbari, K., Harris, P. L., Jones, P. K., Kubat, Z., Castellani, R. J., Wolozin, B. L., Smith, M. A., Perry, G. (2004). "Oxidative damage in cultured human olfactory neurons from Alzheimer's disease patients." Aging Cell 3(1): 41-44. Ghebrehiwet, B., Lim, B. L., Kumar, R., Feng, X., Peerschke, E. I. (2001). "gC1q-R/p33, a member of a new class of multifunctional and multicompartmental cellular proteins, is involved in inflammation and infection." Immunol Rev 180: 65-77. Gibson, G. E., Blass, J. P., Beal, M. F., Bunik, V. (2005). "The alpha-ketoglutarate-dehydrogenase complex: a mediator between mitochondria and oxidative stress in neurodegeneration." Mol Neurobiol 31(1-3): 43-63. Gibson, G. E., Sheu, K. F., Blass, J. P. (1998). "Abnormalities of mitochondrial enzymes in Alzheimer disease." J Neural Transm 105(8-9): 855-870. Gillardon, F., Rist, W., Kussmaul, L., Vogel, J., Berg, M., Danzer, K., Kraut, N., Hengerer, B. (2007). "Proteomic and functional alterations in brain mitochondria from Tg2576 mice occur before amyloid plaque deposition." Proteomics 7(4): 605-616. Gimbel, D. A., Nygaard, H. B., Coffey, E. E., Gunther, E. C., Lauren, J., Gimbel, Z. A., Strittmatter, S. M. (2010). "Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein." J Neurosci 30(18): 6367-6374. Gioio, A. E., Eyman, M., Zhang, H., Lavina, Z. S., Giuditta, A., Kaplan, B. B. (2001). "Local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins in the presynaptic nerve terminal." J Neurosci Res 64(5): 447-453. Giuditta, A., Kaplan, B. B., van Minnen, J., Alvarez, J., Koenig, E. (2002). "Axonal and presynaptic protein synthesis: new insights into the biology of the neuron." Trends Neurosci 25(8): 400-404. Glenn, M. J., Nesbitt, C., Mumby, D. G. (2003). "Perirhinal cortex lesions produce variable patterns of retrograde amnesia in rats." Behav Brain Res 141(2): 183-193. Glenner, G. G., Wong, C. W. (1984). "Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein." Biochem Biophys Res Commun 120(3): 885 -890. Gong, Y., Chang, L., Viola, K. L., Lacor, P. N., Lambert, M. P., Finch, C. E., Krafft, G. A., Klein, W. L. (2003). "Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss." Proc Natl Acad Sci U S A 100(18): 10417-10422.
117
Gong, Y., Meyer, E. M., Meyers, C. A., Klein, R. L., King, M. A., Hughes, J. A. (2006). "Memory-related deficits following selective hippocampal expression of Swedish mutation amyloid precursor protein in the rat." Exp Neurol 200(2): 371-377. Gotz, J., Deters, N., Doldissen, A., Bokhari, L., Ke, Y., Wiesner, A., Schonrock, N., Ittner, L. M. (2007). "A decade of tau transgenic animal models and beyond." Brain Pathol 17(1): 91 -103. Gotz, J., Schild, A., Hoerndli, F., Pennanen, L. (2004). "Amyloid-induced neurofibrillary tangle formation in Alzheimer's disease: insight from transgenic mouse and tissue-culture models." Int J Dev Neurosci 22(7): 453-465. Gray, J. A., McNaughton, N. (1983). "Comparison between the behavioural effects of septal and hippocampal lesions: a review." Neurosci Biobehav Rev 7(2): 119-188. Gray, C. W., Ward, R. V., Karran, E., Turconi, S., Rowles, A., Viglienghi, D., Southan, C., Barton, A., Fantom, K. G., West, A., Savopoulos, J., Hassan, N. J., Clinkenbeard, H., Hanning, C., Amegadzie, B., Davis, J. B., Dingwall, C., Livi, G. P., Creasy, C. L. (2000). "Characterization of human HtrA2, a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response." Eur J Biochem 267(18): 5699 -5710. Gray, E. G., Whittaker, V. P. (1962). "The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation." J Anat 96: 79 -88. Guix, F. X., Ill-Raga, G., Bravo, R., Nakaya, T., de Fabritiis, G., Coma, M., Mis cione, G. P., Villa-Freixa, J., Suzuki, T., Fernandez-Busquets, X., Valverde, M. A., de Strooper, B., Munoz, F. J. (2009). "Amyloid-dependent triosephosphate isomerase nitrotyrosination induces glycation and tau fibrillation." Brain 132(Pt 5): 1335-1345. Gunn-Moore, D. A., McVee, J., Bradshaw, J. M., Pearson, G. R., Head, E., Gunn-Moore, F. J. (2006). "Ageing changes in cat brains demonstrated by beta -amyloid and AT8-immunoreactive phosphorylated tau deposits." J Feline Med Surg 8(4): 234-242. Guo, C., Wang, T., Zheng, W., Shan, Z. Y., Teng, W. P., Wang, Z. Y. (2013a). "Intranasal deferoxamine reverses iron-induced memory deficits and inhibits amyloidogenic APP processing in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 34(2): 562-575. Guo, L., Du, H., Yan, S., Wu, X., McKhann, G. M., Chen, J. X., Yan, S. S. (2013 b). "Cyclophilin D deficiency rescues axonal mitochondrial transport in Alzheimer's neurons." PLoS One 8(1): e54914. Gupta, S., Singh, R., Datta, P., Zhang, Z., Orr, C., Lu, Z., Dubois, G., Zervos, A. S., Meisler, M. H., Srinivasula, S. M., Fernandes-Alnemri, T., Alnemri, E. S. (2004). "The C-terminal tail of presenilin regulates Omi/HtrA2 protease activity." J Biol Chem 279(44): 45844-45854. Gyorffy, B., Kovacs, Z., Gulyassy, P., Simor, A., Volgyi, K., Orban, G., Baracskay, P., Szabo, Z., Janaky, T., Dobolyi, A., Juhasz, G., Czurko, A., Kekesi, K. A. (2013). "Brain protein expression changes in WAG/Rij rats, a genetic rat model of absence epilepsy after peripheral lipopolysaccharide treatment." Brain Behav Immun. Hall, C. N., Klein-Flugge, M. C., Howarth, C., Attwell, D. (2012). "Oxidative phosphorylation, not glycolysis, powers presynaptic and postsynaptic mechanisms underlying brain information processing." J Neurosci 32(26): 8940-8951. Hammerschmidt, T., Kummer, M. P., Terwel, D., Martinez, A., Gorji, A., Pape, H. C., Rommelfanger, K. S., Schroeder, J. P., Stoll, M., Schultze, J., Weinshenker, D., Heneka, M. T. (2013). "Selective loss of noradrenaline exacerbates early cogniti ve dysfunction and synaptic deficits in APP/PS1 mice." Biol Psychiatry 73(5): 454-463. Hamilton, R. L. (2000). "Lewy bodies in Alzheimer's disease: a neuropathological review of 145 cases using alpha-synuclein immunohistochemistry." Brain Pathol 10(3): 378 -384. Hamilton, A., Holscher, C. (2012). "The effect of ageing on neurogenesis and oxidative stress in the APP(swe)/PS1(deltaE9) mouse model of Alzheimer's disease." Brain Res 1449: 83 -93. Hansson Petersen, C. A., Alikhani, N., Behbahani, H., Wiehager, B., Pavlov, P. F., Alafuzoff, I., Leinonen, V., Ito, A., Winblad, B., Glaser, E., Ankarcrona, M. (2008). "The amyloid beta -peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae." Proc Natl Acad Sci U S A 105(35): 13145-13150. Hardy, J., Allsop, D. (1991). "Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease." Trends Pharmacol Sci 12(10): 383-388. Hardy, J., Selkoe, D. J. (2002). "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progr ess and problems on the road to therapeutics." Science 297(5580): 353-356. Harkany, T., Abraham, I., Timmerman, W., Laskay, G., Toth, B., Sasvari, M., Konya, C., Sebens, J. B., Korf, J., Nyakas, C., Zarandi, M., Soos, K., Penke, B., Luiten, P. G. (2000). "beta-amyloid neurotoxicity is
118
mediated by a glutamate-triggered excitotoxic cascade in rat nucleus basalis." Eur J Neurosci 12(8): 2735-2745. Harkany, T., O'Mahony, S., Kelly, J. P., Soos, K., Toro, I., Penke, B., Luiten, P. G., Nyakas, C., Gulya, K., Leon ard, B. E. (1998). "Beta-amyloid(Phe(SO3H)24)25-35 in rat nucleus basalis induces behavioral dysfunctions, impairs learning and memory and disrupts cortical cholinergic innervation." Behav Brain Res 90(2): 133-145. Harrison, P. M., Kumar, A., Lang, N., Snyder, M., Gerstein, M. (2002). "A question of size: the eukaryotic proteome and the problems in defining it." Nucleic Acids Res 30(5): 1083 -1090. Hassel, B. (2000). "Carboxylation and anaplerosis in neurons and glia." Mol Neurobiol 22(1-3): 21-40. Hattingen, E., Magerkurth, J., Pilatus, U., Mozer, A., Seifried, C., Steinmetz, H., Zanella, F., Hilker, R. (2009). "Phosphorus and proton magnetic resonance spectroscopy demonstrates mitochondrial dysfunction in early and advanced Parkinson's disease." Brain 132(Pt 12): 3285-3297. Hauss-Wegrzyniak, B., Lukovic, L., Bigaud, M., Stoeckel, M. E. (1998). "Brain inflammatory response induced by intracerebroventricular infusion of lipopolysaccharide: an immunohistochemical study." Brain Res 794(2): 211-224. Head, E., Moffat, K., Das, P., Sarsoza, F., Poon, W. W., Landsberg, G., Cotman, C. W., Murphy, M. P. (2005). "Beta-amyloid deposition and tau phosphorylation in clinically characterized aged cats." Neurobiol Aging 26(5): 749-763. Hebb, C. O., Whittaker, V. P. (1958). "Intracellular distributions of acetylcholine and choline acetylase." J Physiol 142(1): 187-196. Hernandez-Zimbron, L. F., Luna-Munoz, J., Mena, R., Vazquez-Ramirez, R., Kubli-Garfias, C., Cribbs, D. H., Manoutcharian, K., Gevorkian, G. (2012). "Amyloid-beta peptide binds to cytochrome C oxidase subunit 1." PLoS One 7(8): e42344. Hertz, L., Kala, G. (2007). "Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia concentrations." Metab Brain Dis 22(3-4): 199-218. Hetz, C., Mollereau, B. (2014). "Disturbance of endoplasmic reticulum proteostasis in neurodegenerative diseases." Nat Rev Neurosci 15(4): 233-249. Higashitsuji, H., Masuda, T., Liu, Y., Itoh, K., Fujita, J. (2007). "Enhanced deacetylation of p53 by the anti apoptotic protein HSCO in association with histone deacetylase 1." J Biol Chem 282(18): 13716 -13725. Higashitsuji, H., Nagao, T., Nonoguchi, K., Fujii, S., Itoh, K., Fujita, J. (2002). "A novel protein overexpressed in hepatoma accelerates export of NF-kappa B from the nucleus and inhibits p53-dependent apoptosis." Cancer Cell 2(4): 335-346. Hillefors, M., Gioio, A. E., Mameza, M. G., Kaplan, B. B. (2007). "Axon viability and mitochondrial function are dependent on local protein synthesis in sympathetic neurons." Cell Mol Neurobiol 27(6): 701 -716. Hirai, K., Aliev, G., Nunomura, A., Fujioka, H., Russell, R. L., Atwood, C. S., Johnson, A. B., Kress, Y., Vinters, H. V., Tabaton, M., Shimohama, S., Cash, A. D., Siedlak, S. L., Harris, P. L., Jones, P. K., Petersen, R. B., Perry, G., Smith, M. A. (2001). "Mitochondrial abnormalities in Alzheimer's disease." J Neurosci 21(9): 3017 3023. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. (2010). "Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease." Neuron 68(4): 6 10-638. Hollenbeck, P. J. (1996). "The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons." Front Biosci 1: d91 102. Hollenbeck, P. J. (2005). "Mitochondria and neurotransmission: evacuating the synapse." Neuron 47(3): 331 333. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. (2005). "The axonal transport of mitochondria." J Cell Sci 118(Pt 23): 5411 5419. Hongpaisan, J., Sun, M. K., Alkon, D. L. (2011). "PKC epsilon activation prevents synaptic loss, Abeta elevation, and cognitive deficits in Alzheimer's disease transgenic mice." J Neurosci 31(2): 630-643. Hooijmans, C. R., Graven, C., Dederen, P. J., Tanila, H., van Groen, T., Kiliaan, A. J. (2007). "Amyloid beta deposition is related to decreased glucose transporter-1 levels and hippocampal atrophy in brains of aged APP/PS1 mice." Brain Res 1181: 93-103. Hrnkova, M., Zilka, N., Minichova, Z., Koson, P., Novak, M. (2007). "Neurodegeneration caused by expression of human truncated tau leads to progressive neurobehavioural impairment in transgenic rats." Brain Res 1130(1): 206-213. Hroudova, J., Singh, N., Fisar, Z. (2014). "Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases: relevance to Alzheimer's disease." Biomed Res Int 2014: 175062.
119
Hsiao, K., Chapman, P., Nilsen, S., Eckman, C., Harigaya, Y., Younkin, S., Yang, F., Cole, G. (1996). "Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice." Science 274(5284): 99 102. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. (2003). "Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics." Circ Res 92(9): 962-968. Huntley, J. D., Howard, R. J. (2010). "Working memory in early Alzheimer's disease: a neuropsychological review." Int J Geriatr Psychiatry 25(2): 121-132. Hur, J. Y., Teranishi, Y., Kihara, T., Yamamoto, N. G., Inoue, M., Hosia, W., Hashimoto, M., Winblad, B., Frykman, S., Tjernberg, L. O. (2012). "Identification of novel gamma -secretase-associated proteins in detergentresistant membranes from brain." J Biol Chem 287(15): 11991 -12005. Hussain, I., Powell, D., Howlett, D. R., Tew, D. G., Meek, T. D., Chapman, C., Gloger, I. S., Murphy, K. E., Southan, C. D., Ryan, D. M., Smith, T. S., Simmons, D. L., Walsh, F. S., Dingwall, C., Christie, G. (1999). "Identification of a novel aspartic protease (Asp 2) as beta -secretase." Mol Cell Neurosci 14(6): 419427. Irwin, D. J., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. (2013). "Parkinson's disease dementia: convergence of alpha synuclein, tau and amyloid-beta pathologies." Nat Rev Neurosci 14(9): 626-636. Ishrat, T., Hoda, M. N., Khan, M. B., Yousuf, S., Ahmad, M., Khan, M. M., Ahmad, A., Islam, F. (2009). "Amelioration of cognitive deficits and neurodegeneration by curcumin in rat model of sporadic dementia of Alzheimer's type (SDAT)." Eur Neuropsychopharmacol 19(9): 636 -647. Iwai, A., Masliah, E., Yoshimoto, M., Ge, N., Flanagan, L., de Silva, H. A., Kittel, A., Saitoh, T. (1995). "The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system." Neuron 14(2): 467-475. Iwatsubo, T. (2004). "The gamma-secretase complex: machinery for intramembrane proteolysis." Curr Opin Neurobiol 14(3): 379-383. Jankowsky, J. L., Fadale, D. J., Anderson, J., Xu, G. M., Gonzales, V., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Lee, M. K., Younkin, L. H., Wagner, S. L., Younkin, S. G., Borchelt, D. R. (2004). "Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta -amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42 specific gamma secretase." Hum Mol Genet 13(2): 159-170. Janocko, N. J., Brodersen, K. A., Soto-Ortolaza, A. I., Ross, O. A., Liesinger, A. M., Duara, R., Graff-Radford, N. R., Dickson, D. W., Murray, M. E. (2012). "Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease differ significantly from neurofibrillary tangle-predominant dementia." Acta Neuropathol 124(5): 681692. Jardanhazi-Kurutz, D., Kummer, M. P., Terwel, D., Vogel, K., Thiele, A., Heneka, M. T. (2011). "Distinct adrenergic system changes and neuroinflammation in response to induced locus ceruleus degeneration in APP/PS1 transgenic mice." Neuroscience 176: 396 -407. Jellinger, K. A., Alafuzoff, I., Attems, J., Beach, T. G., Cairns, N. J., Crary, J. F., Dickson, D. W., Hof, P. R., Hyman, B. T., Jack, C. R., Jr., Jicha, G. A., Knopman, D. S., Kovacs, G. G., Mackenzie, I. R., Masliah, E., Montine, T. J., Nelson, P. T., Schmitt, F., Schneider, J. A., Serrano-Pozo, A., Thal, D. R., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Troncoso, J. C., Vonsattel, J. P., Wisniewski, T. (2015). "PART, a distinct tauopathy, differen t from classical sporadic Alzheimer disease." Acta Neuropathol. Jellinger, K. A., Attems, J. (2012). "Neuropathology and general autopsy findings in nondemented aged subjects." Clin Neuropathol 31(2): 87-98. Johnson, D. T., Harris, R. A., Blair, P. V., Bal aban, R. S. (2007). "Functional consequences of mitochondrial proteome heterogeneity." Am J Physiol Cell Physiol 292(2): C698 -707. Jomova, K., Vondrakova, D., Lawson, M., Valko, M. (2010). "Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders." Mol Cel l Biochem 345(1-2): 91-104. Kann, O., Kovacs, R. (2007). "Mitochondria and neuronal activity." Am J Physiol Cell Physiol 292(2): C641 -657. Kaplan, B. B., Gioio, A. E., Hillefors, M., Aschrafi, A. (2009). "Axonal protein synthesis and the regulation of loca l mitochondrial function." Results Probl Cell Differ 48: 225 -242. Kawamoto, Y., Ito, H., Kobayashi, Y., Suzuki, Y., Takahashi, R. (2010). "Localization of HtrA2/Omi immunoreactivity in brains affected by Alzheimer's disease." Neuroreport 21(17): 1121-1125. Keil, U., Hauptmann, S., Bonert, A., Scherping, I., Eckert, A., Muller, W. E. (2006). "Mitochondrial dysfunction induced by disease relevant AbetaPP and tau protein mutations." J Alzheimers Dis 9(2): 139 -146. Keller, J. N., Lauderback, C. M., Butterfield, D. A., Kindy, M. S., Yu, J., Markesbery, W. R. (2000). "Amyloid beta peptide effects on synaptosomes from apolipoprotein E-deficient mice." Journal of Neurochemistry 74(4): 1579-1586.
120
Kim, I., Xu, W., Reed, J. C. (2008). "Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 7(12): 1013 -1030. Kim, S. H., Fountoulakis, M., Cairns, N. J., Lubec, G. (2002). "Human brain nucleoside diphosphate kinase activity is decreased in Alzheimer's disease and Down syndrome." Biochem Biophys Res Commun 296(4): 970-975. Kim, S. H., Vlkolinsky, R., Cairns, N., Fountoulakis, M., Lubec, G. (2001). "The reduction of NADH ubiquinone oxidoreductase 24- and 75-kDa subunits in brains of patients with Down syndrome and Alzheimer's disease." Life Sci 68(24): 2741-2750. Kim, W. S., Kagedal, K., Halliday, G. M. (2014). "Alpha -synuclein biology in Lewy body diseases." Alzheimers Res Ther 6(5): 73. Kimura, R., Devi, L., Ohno, M. (2010). "Partial reduction of BACE1 improves synaptic plasticity, recent and remote memories in Alzheimer's disease transgenic mice." J Neurochem 113(1): 248 -261. King, J. S. (1988). "Chemical synapses in the mammalian central nervous system: an introduction." J Electron Microsc Tech 10(2): 205-210. Kish, S. J., Bergeron, C., Rajput, A., Dozic, S., Mastrogiacomo, F., Chang, L. J., Wilson, J. M., DiStefano, L. M., Nobrega, J. N. (1992). "Brain cytochrome oxidase in Alzheimer's disease." J Neurochem 59(2): 776 -779. Kittel, R. J., Hallermann, S., Thomsen, S., Wichmann, C., Sigrist, S. J., Heckmann, M. (2006). "Active zone assembly and synaptic release." Biochem Soc Trans 34(Pt 5): 939 -941. Klegeris, A., Walker, D. G., McGeer, P. L. (1997). "Interaction of Alzheimer beta -amyloid peptide with the human monocytic cell line THP-1 results in a protein kinase C-dependent secretion of tumor necrosis factor-alpha." Brain Res 747(1): 114-121. Kloskowska, E., Pham, T. M., Nilsson, T., Zhu, S., Oberg, J., Codita, A., Pedersen, L. A., Pedersen, J. T., Malkiewicz, K., Winblad, B., Folkesson, R., Benedikz, E. (2010). "Cognitive impairment in the Tg6590 transgenic rat model of Alzheimer's disease." J Cell Mol Med 14(6B): 1816 -1823. Klyubin, I., Betts, V., Welzel, A. T., Blennow, K., Zetterberg, H., Wallin, A., Lemere, C. A., Cullen, W. K., Peng, Y., Wisniewski, T., Selkoe, D. J., Anwyl, R., Walsh, D. M., Rowan, M. J. (2008). "Amyloid beta protein dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity: prevention by systemic passive immunization." J Neurosci 28(16): 4231-4237. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. (2008). "Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration." Nat Rev Neurosci 9(7): 505-518. Kooistra, J., Milojevic, J., Melacini, G., Ortega, J. (2009). "A new function of human HtrA2 a s an amyloid-beta oligomerization inhibitor." J Alzheimers Dis 17(2): 281-294. Koson, P., Zilka, N., Kovac, A., Kovacech, B., Korenova, M., Filipcik, P., Novak, M. (2008). "Truncated tau expression levels determine life span of a rat model of tauopathy without causing neuronal loss or correlating with terminal neurofibrillary tangle load." Eur J Neurosci 28(2): 239 -246. Kovács, G. (2014). "Current concepts of neurodegenerative disease." EMJ Neurology: 1:78 -86. Krapfenbauer, K., Engidawork, E., Cairns, N., Fountoulakis, M., Lubec, G. (2003). "Aberrant expression of peroxiredoxin subtypes in neurodegenerative disorders." Brain Res 967(1 -2): 152-160. Kristian, T. (2010). "Isolation of mitochondria from the CNS." Curr Protoc Neurosci Chapter 7: Unit 7 22. Kudin, A. P., Kudina, T. A., Seyfried, J., Vielhaber, S., Beck, H., Elger, C. E., Kunz, W. S. (2002). "Seizuredependent modulation of mitochondrial oxidative phosphorylation in rat hippocampus." Eur J Neurosci 15(7): 1105-1114. Kuninaka, S., Iida, S. I., Hara, T., Nomura, M., Naoe, H., Morisaki, T., Nitta, M., Arima, Y., Mimori, T., Yonehara, S., Saya, H. (2007). "Serine protease Omi/HtrA2 targets WARTS kinase to control cell proliferation." Oncogene 26(17): 2395-2406. Kurt, M. A., Davies, D. C., Kidd, M., Duff, K., Howlett, D. R. (2003). "Hyperphosphorylated tau and paired helical filament-like structures in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes." Neurobiol Dis 14(1): 89-97. Kurt, M. A., Davies, D. C., Ki dd, M., Duff, K., Rolph, S. C., Jennings, K. H., Howlett, D. R. (2001). "Neurodegenerative changes associated with beta -amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes." Exp Neurol 171(1): 59-71. Lacor, P. N., Buniel, M. C., Chang, L., Fernandez, S. J., Gong, Y., Viola, K. L., Lambert, M. P., Velasco, P. T., Bigio, E. H., Finch, C. E., Krafft, G. A., Klein, W. L. (2004). "Synaptic targeting by Alzheimer's -related amyloid beta oligomers." J Neurosci 24(45): 10191-10200. Lacor, P. N., Buniel, M. C., Furlow, P. W., Clemente, A. S., Velasco, P. T., Wood, M., Viola, K. L., Klein, W. L. (2007). "Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease." J Neurosci 27(4): 796 -807.
121
LaFerla, F. M., Green, K. N., Oddo, S. (2007). "Intracellular amyloid-beta in Alzheimer's disease." Nat Rev Neurosci 8(7): 499-509. Lagadec, S., Rotureau, L., Hemar, A., Macrez, N., Delcasso, S., Jeantet, Y., Cho, Y. H. (2012). "Early temporal short-term memory deficits in double transgenic APP/PS1 mice." Neurobiol Aging 33(1): 203 e201 -211. Lai, A., Sisodia, S. S., Trowbridge, I. S. (1995). "Characterization of sorting signals in the beta-amyloid precursor protein cytoplasmic domain." J Biol Chem 270(8): 3565 -3573. Lam, B., Masellis, M., Freedman, M., Stuss, D. T., Black, S. E. (2013). "Clinical, imaging, and pathological heterogeneity of the Alzheimer's disease syndrome." Alzheimers Res Ther 5(1): 1. Lammich, S., Kojro, E., Postina, R., Gilbert, S., Pfeiffer, R., Jasionowski, M., Haass, C., Fahrenholz, F. (1999). "Constitutive and regulated alpha-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by a disintegrin metalloprotease." Proc Natl Acad Sci U S A 96(7): 3922-3927. Larson, M. E., Sherman, M. A., Greimel, S., Kuskowski, M., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Lesne, S. E. (2012). "Soluble alpha-synuclein is a novel modulator of Alzheimer's disease pathophysiology." J Neurosci 32(30): 10253-10266. Lee, S. H., Kim, K. R., Ryu, S. Y., Son, S., Hong, H. S., Mook-Jung, I., Ho, W. K. (2012). "Impaired short-term plasticity in mossy fiber synapses caused by mitochondrial dysfunction of dentate granule cells is the earliest synaptic deficit in a mouse model of Alzheimer's disease." J Neurosci 32(17): 5953-5963. Leenders, K. L., Frackowiak, R. S., Quinn, N., Marsden, C. D. (1986). "Brain energy metabolism and dopaminergic function in Huntington's disease measured in vivo using positron emission tomography." Mov Disord 1(1): 69-77. Leyssen, M., Ayaz, D., Hebert, S. S., Reeve, S., De Strooper, B., Hassan, B. A. (2005). "Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain." EMBO J 24(16): 2944 2955. Leon, W. C., Canneva, F., Partridge, V., Allard, S., Ferretti, M. T., DeWilde, A., Vercauteren, F., Atifeh , R., Ducatenzeiler, A., Klein, W., Szyf, M., Alhonen, L., Cuello, A. C. (2010). "A novel transgenic rat model with a full Alzheimer's-like amyloid pathology displays pre-plaque intracellular amyloid-betaassociated cognitive impairment." J Alzheimers Dis 20(1): 113-126. Leroy, K., Ando, K., Laporte, V., Dedecker, R., Suain, V., Authelet, M., Heraud, C., Pierrot, N., Yilmaz, Z., Octave, J. N., Brion, J. P. (2012). "Lack of tau proteins rescues neuronal cell death and decreases amyloidogenic processing of APP in APP/PS1 mice." Am J Pathol 181(6): 1928-1940. Li, F., Calingasan, N. Y., Yu, F., Mauck, W. M., Toidze, M., Almeida, C. G., Takahashi, R. H., Carlson, G. A., Flint Beal, M., Lin, M. T., Gouras, G. K. (2004a). "Increased plaque burden in brains of APP mutant MnSOD heterozygous knockout mice." J Neurochem 89(5): 1308-1312. Li, J. Q., Yu, J. T., Jiang, T., Tan, L. (2015). "Endoplasmic reticulum dysfunction in Alzheimer's disease." Mol Neurobiol 51(1): 383-395. Li, W. W., Yang, R., Guo, J. C., Ren, H. M., Zha, X. L., Cheng, J. S., Cai, D. F. (2007). "Localization of alpha synuclein to mitochondria within midbrain of mice." Neuroreport 18(15): 1543 -1546. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. (2004b). "The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses." Cell 119(6): 873 -887. Lin, M. T., Beal, M. F. (2006). "Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases." Nature 443(7113): 787-795. Liu, H. L., Zhao, G., Cai, K., Zhao, H. H., Shi, L. D. (2011). "Treadmill exercise prevents decline in spatial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice through improvement of hippocampal long -term potentiation." Behav Brain Res 218(2): 308-314. Liu, L., Orozco, I. J., Planel, E., Wen, Y., Bretteville, A., Krishnamurthy, P., Wang, L., Herman, M., Figueroa, H., Yu, W. H., Arancio, O., Duff, K. (2008). "A transgenic rat that develops Alzheimer's disease-like amyloid pathology, deficits in synaptic plasticity and cognitive impairment." Neurobiol Dis 31(1): 46-57. Liu, X., Hajnoczky, G. (2009). "Ca2+-dependent regulation of mitochondrial dynamics by the Miro-Milton complex." Int J Biochem Cell Biol 41(10): 1972-1976. Lopez, N., Tormo, C., De Blas, I., Llinares, I., Alom, J. (2013). "Oxidative stress in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment with high sensitivity and specificity." J Alzheimers Dis 33(3): 823 -829. Lustbader, J. W., Cirilli, M., Lin, C., Xu, H. W., Takuma, K., Wang, N., Caspersen, C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M., Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F., Lue, L. F., Walker, D. G., Kuppusamy, P., Zewier, Z. L., Arancio, O., Stern, D., Yan, S. S., Wu, H. (2004). "ABAD directly links Abeta to mitochondrial toxicity in Alzheimer's disease." Science 304(5669): 448-452. Ly, C. V., Verstreken, P. (2006). "Mitochondria at the synapse." Neuroscientist 12(4): 291-299.
122
Ma, Q. L., Chan, P., Yoshii, M., Ueda, K. (2003). "Alpha -synuclein aggregation and neurodegenerative diseases." J Alzheimers Dis 5(2): 139-148. MacAskill, A. F., Kittler, J. T. (2010). "Control of mitochondrial transport and localization in neurons." Trends Cell Biol 20(2): 102-112. Macia, E., Ehrlich, M., Massol, R., Boucrot, E., Brunner, C., Kirchhausen, T. (2006). "Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin." Dev Cell 10(6): 839-850. Magistretti, P. J., Pellerin, L. (1999). "Astrocytes Couple Synaptic Activity to Glucose Utilization in the Brain." News Physiol Sci 14: 177-182. Magistretti, P. J., Sorg, O., Naichen, Y., Pellerin, L., de Rham, S., Martin, J. L. (19 94). "Regulation of astrocyte energy metabolism by neurotransmitters." Ren Physiol Biochem 17(3 -4): 168-171. Maki, M., Matsukawa, N., Yuasa, H., Otsuka, Y., Yamamoto, T., Akatsu, H., Okamoto, T., Ueda, R., Ojika, K. (2002). "Decreased expression of hippoca mpal cholinergic neurostimulating peptide precursor protein mRNA in the hippocampus in Alzheimer disease." J Neuropathol Exp Neurol 61(2): 176 -185. Malm, T. M., Iivonen, H., Goldsteins, G., Keksa -Goldsteine, V., Ahtoniemi, T., Kanninen, K., Salminen, A., Auriola, S., Van Groen, T., Tanila, H., Koistinaho, J. (2007). "Pyrrolidine dithiocarbamate activates Akt and improves spatial learning in APP/PS1 mice without affecting beta -amyloid burden." J Neurosci 27(14): 3712-3721. Malviya, M., Kumar, Y. C., Asha, D., Chandra, J. N., Subhash, M. N., Rangappa, K. S. (2008). "Muscarinic receptor 1 agonist activity of novel N-arylthioureas substituted 3-morpholino arecoline derivatives in Alzheimer's presenile dementia models." Bioorg Med Chem 16(15): 7095 -7101. Mancuso, M., Filosto, M., Bosetti, F., Ceravolo, R., Rocchi, A., Tognoni, G., Manca, M. L., Solaini, G., Siciliano, G., Murri, L. (2003). "Decreased platelet cytochrome c oxidase activity is accompanied by increased blood lactate concentration during exercise in patients with Alzheimer disease." Exp Neurol 182(2): 421-426. Manczak, M., Anekonda, T. S., Henson, E., Park, B. S., Quinn, J., Reddy, P. H. (2006). "Mitochondria are a direct site of A beta accumulation in Alzheimer's disease neurons: implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression." Hum Mol Genet 15(9): 1437 -1449. Manczak, M., Calkins, M. J., Reddy, P. H. (2011). "Impaired mitochondrial dynamics and abnormal interaction of amyloid beta with mitochondrial protein Drp1 in neurons from patients with Alzheimer's disease: implications for neuronal damage." Hum Mol Genet 20(13): 2495 -2509. Manczak, M., Mao, P., Calkins, M. J., Cornea, A., Reddy, A. P., Mur phy, M. P., Szeto, H. H., Park, B., Reddy, P. H. (2010). "Mitochondria-targeted antioxidants protect against amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease neurons." J Alzheimers Dis 20 Suppl 2: S609-631. Manczak, M., Reddy, P. H. (2012). "Abnormal interacti on of VDAC1 with amyloid beta and phosphorylated tau causes mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 21(23): 5131-5146. Manczak, M., Sheiko, T., Craigen, W. J., Reddy, P. H. (2013). "Reduced VDAC1 protects against Alzheimer's disease, mitochondria, and synaptic deficiencies." J Alzheimers Dis 37(4): 679 -690. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. (2005). "The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology." Anal Bioanal Chem 382(3): 669 -678. Marcello, E., Epis, R., Saraceno, C., Di Luca, M. (2012). "Synaptic dysfunction in Alzheimer's disease." Adv Exp Med Biol 970: 573-601. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Kaplowitz, N., Fernandez-Checa, J. C. (2013). "Mitochondrial glutathione: features, regulation and role in disease." Biochim Biophys Acta 1830(5): 3317 -3328. Martin, E. M., Wilson, R. S., Penn, R. D., Fox, J. H., Clasen, R. A., Savoy, S. M. (1987). "Cortical biopsy results in Alzheimer's disease: correlation with cognitive deficits ." Neurology 37(7): 1201-1204. Martin, L. J., Pan, Y., Price, A. C., Sterling, W., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Price, D. L., Lee, M. K. (2006). "Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death." J Neurosci 26(1): 41-50. Martins, L. M., Iaccarino, I., Tenev, T., Gschmeissner, S., Totty, N. F., Lemoine, N. R., Savopoulos, J., Gray, C. W., Creasy, C. L., Dingwall, C., Downward, J. (2002). "The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif." J Biol Chem 277(1): 439-444. Marui, W., Iseki, E., Ueda, K., Kosaka, K. (2000). "Occurrence of human alpha-synuclein immunoreactive neurons with neurofibrillary tangle formation in the limbic areas of patients with Alzheimer's disease." J Neurol Sci 174(2): 81-84. Masters, C. L., Simms, G., Weinman, N. A., Multhaup, G., McDonald, B. L., Beyreuther, K. (1985). "Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome." Proc Natl Acad Sci U S A 82(12): 4245 4249.
123
Mattiasson, G., Friberg, H., Hansson, M., Elmer, E., Wieloch, T. (2003). "Flow cytometric analysis of mitochondria from CA1 and CA3 regions of rat hippocampus reveals differences in permeability transition pore activation." J Neurochem 87(2): 532-544. Mattson, M. P. (2004). "Pathways towards and away from Alzheimer's disease." Nature 430(7000): 631 -639. Mattson, M. P., Gleichmann, M., Cheng, A. (2008). "Mitochondria in neuroplasticity and neurological disorders." Neuron 60(5): 748-766. Maurer, I., Zierz, S., Moller, H. J. (2000). "A selective defect of cytochrome c oxidase is present in brain of Alzheimer disease patients." Neurobiol Aging 21(3): 455-462. McAlpine, F. E., Lee, J. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Blurton-Jones, M., Hong, J., Das, P., Golde, T. E., LaFerla, F. M., Oddo, S., Blesch, A., Tansey, M. G. (2009). "Inhibition of soluble TNF signaling in a mouse model of Alzheimer's disease prevents pre-plaque amyloid-associated neuropathology." Neurobiol Dis 34(1): 163-177. Mager, P. P., Penke, B., Walter, R., Harkany, T., Hartignny, W. (2002). "Pathological peptide folding in Alzheimer's disease and other conformational disorders." Curr Med Chem 9(19): 1763 -1780. McGee, A. M., Baines, C. P. (2011). "Complement 1q-binding protein inhibits the mitochondrial permeability transition pore and protects against oxidative stress -induced death." Biochem J 433(1): 119-125. McKenna, M. C., Stevenson, J. H., Huang, X., Hopkins, I. B. (2000). "Differential distribution of the enzymes glutamate dehydrogenase and aspartate aminotransferase in cortical synaptic mitochondria contributes to metabolic compartmentation in cortical synaptic terminals." Neurochem Int 37(2-3): 229-241. McLachlan, D. R., Smith, W. L., Kruck, T. P. (1993). "Desferrioxamine and Alzheimer's disease: video home behavior assessment of clinical course and measures of brain aluminum." Ther Drug Monit 15(6): 602 607. Mega, M. S., Cummings, J. L., Fiorello, T., Gornbein, J. (1996). "The spectrum of behavioral changes in Alzheimer's disease." Neurology 46(1): 130-135. Meir, A., Ginsburg, S., Butkevich, A., Kachalsky, S. G., Kaiserman, I., Ahdut, R., Demirgoren, S., Rahamimoff, R. (1999). "Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release." Physiol Rev 79(3): 1019-1088. Melanson, J. E., Avery, S. L., Pinto, D. M. (2006). "High-coverage quantitative proteomics using amine-specific isotopic labeling." Proteomics 6(16): 4466-4474. Melov, S., Doctrow, S. R., Schneider, J. A., Haberson, J., Patel, M., Coskun, P. E., Huffman, K., Wallace, D. C., Malfroy, B. (2001). "Lifespan extension and rescue of spongiform encephalopathy in superoxide dismutase 2 nullizygous mice treated with superoxide dismutase-catalase mimetics." J Neurosci 21(21): 8348-8353. Miao, L., St Clair, D. K. (2009). "Regulation of superoxide dismutase genes: implications in disease." Free Radic Biol Med 47(4): 344-356. Minkeviciene, R., Banerjee, P., Tanila, H. (2004). "Memantine improves spatial learning in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease." J Pharmacol Exp Ther 311(2): 677-682. Molnar, Z., Soos, K., Lengyel, I., Penke, B., Szegedi, V., Budai, D. (2004). "Enhancement of NMDA responses by beta-amyloid peptides in the hippocampus in vivo." Neuroreport 15(10): 1649 -1652. Monteiro-Cardoso, V. F., Oliveira, M. M., Melo, T., Domingues, M. R., Moreira, P. I., Ferreiro, E., Peixoto, F., Videira, R. A. (2014). "Cardiolipin Profile Changes are Associated to the Early Synaptic Mitochondrial Dysfunction in Alzheimer's Disease." J Alzheimers Dis. Moreira, P. I., Cardoso, S. M., Santos, M. S., Oliveira, C. R. (2006). "The key role of mitochondria in Alzheimer's disease." J Alzheimers Dis 9(2): 101-110. Moreira, P. I., Siedlak, S. L., Wang, X., Santos, M. S., Oliveira, C. R., Tabaton, M., Nunomura, A., Szweda, L. I., Aliev, G., Smith, M. A., Zhu, X., Perry, G. (2007). "Autophagocytosis of mitochondria is prominent in Alzheimer disease." J Neuropathol Exp Neurol 66(6): 525-532. Moreira, P. I., Zhu, X., Wang, X., Lee, H. G., Nunomura, A., Petersen, R. B., Perry, G., Smith, M. A. (2010). "Mitochondria: a therapeutic target in neurodegeneration." Biochim Biophys Acta 1802(1): 212 -220. Mosconi, L., Brys, M., Glodzik-Sobanska, L., De Santi, S., Rusinek, H., de Leon, M. J. (2007). "Early detection of Alzheimer's disease using neuroimaging." Exp Gerontol 42(1-2): 129-138. Mosconi, L., Tsui, W. H., De Santi, S., Li, J., Rusinek, H., Convit, A., Li, Y., Boppana, M., de Leon, M. J. (2005). "Reduced hippocampal metabolism in MCI and AD: automated FDG-PET image analysis." Neurology 64(11): 1860-1867. Mouton, P. R., Chachich, M. E., Quigley, C., Spangler, E., Ingram, D. K. (2009). "Caloric restriction attenuates amyloid deposition in middle-aged dtg APP/PS1 mice." Neurosci Lett 464(3): 184-187.
124
Mucke, L. (2009). "Neuroscience: Al zheimer's disease." Nature 461(7266): 895-897. Mungarro-Menchaca, X., Ferrera, P., Moran, J., Arias, C. (2002). "beta -Amyloid peptide induces ultrastructural changes in synaptosomes and potentiates mitochondrial dysfunction in the presence of ryanodine." J Neurosci Res 68(1): 89-96. Mutisya, E. M., Bowling, A. C., Beal, M. F. (1994). "Cortical cytochrome oxidase activity is reduced in Alzheimer's disease." J Neurochem 63(6): 2179-2184. Nag, S., Yee, B. K., Tang, F. (1999). "Reduction in somatostatin and sub stance P levels and choline acetyltransferase activity in the cortex and hippocampus of the rat after chronic intracerebroventricular infusion of beta -amyloid (1-40)." Brain Res Bull 50(4): 251-262. Naga, K. K., Sullivan, P. G., Geddes, J. W. (2007). "High cyclophilin D content of synaptic mitochondria results in increased vulnerability to permeability transition." J Neurosci 27(28): 7469 -7475. Naiki, H., Higuchi, K., Hosokawa, M., Takeda, T. (1989). "Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1." Anal Biochem 177(2): 244 -249. Nakamura, S., Murayama, N., Noshita, T., Annoura, H., Ohno, T. (2001). "Progressive brain dysfunction following intracerebroventricular infusion of beta(1-42)-amyloid peptide." Brain Res 912(2): 128-136. Nandi, P. K. (1996). "Protein conformation and disease." Vet Res 27(4 -5): 373-382. Nisbet, R. M., Polanco, J. C., Ittner, L. M., Gotz, J. (2015). "Tau aggregation and its interplay with amyloid -beta." Acta Neuropathol 129(2): 207-220. Oakley, H., Cole, S. L., Logan, S., Maus, E., Shao, P., Craft, J., Guillozet-Bongaarts, A., Ohno, M., Disterhoft, J., Van Eldik, L., Berry, R., Vassar, R. (2006). "Intraneuronal beta -amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation." J Neurosci 26(40): 10129 -10140. Oddo, S., Caccamo, A., Kitazawa, M., Tseng, B. P., LaFerla, F. M. (2003). "Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple transgenic model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 24(8): 1063 -1070. Ohyagi, Y., Yamada, T., Nishioka, K., Clarke, N. J., Tomlinson, A. J., Naylor, S., Nakabeppu, Y., Kira, J., Younkin, S. G. (2000). "Selective increase in cellular A beta 42 i s related to apoptosis but not necrosis." Neuroreport 11(1): 167-171. Olah, J., Vincze, O., Virok, D., Simon, D., Bozso, Z., Tokesi, N., Horvath, I., Hlavanda, E., Kovacs, J., Magyar, A., Szucs, M., Orosz, F., Penke, B., Ovadi, J. (2011). "Interactions of pathological hallmark proteins: tubulin polymerization promoting protein/p25, beta -amyloid, and alpha-synuclein." J Biol Chem 286(39): 34088-34100. Olariu, A., Yamada, K., Mamiya, T., Hefco, V., Nabeshima, T. (2002). "Memory impairment induced by chronic intracerebroventricular infusion of beta -amyloid (1-40) involves downregulation of protein kinase C." Brain Res 957(2): 278-286. O'Neil, J. N., Mouton, P. R., Tizabi, Y., Ottinger, M. A., Lei, D. L., Ingram, D. K., Manaye, K. F. (2007). "Catecholaminergic neuronal loss in locus coeruleus of aged female dtg APP/PS1 mice." J Chem Neuroanat 34(3-4): 102-107. Orbán, G., Völgyi, K., Juhász, G., Penke, B., Kékesi, K. A., Kardos, J., Czurkó, A. (2010). "Different electrophysiological actions of 24- and 72-hour aggregated amyloid-beta oligomers on hippocampal field population spike in both anesthetized and awake rats." Brain Res 1354: 227 -235. Pagani, L., Eckert, A. (2011). "Amyloid-Beta interaction with mitochondria." Int J Alzheimers Dis 2011: 925050. Palay, S. L. (1956). "Synapses in the central nervous system." J Biophys Biochem Cytol 2(4 Suppl): 193 -202. Parachikova, A., Nichol, K. E., Cotman, C. W. (2008). "Short-term exercise in aged Tg2576 mice alters neuroinflammation and improves cognition." Neurobiol Dis 30(1): 121-129. Park, H., Kam, T. I., Kim, Y., Choi, H., Gwon, Y., Kim, C., Koh, J. Y., Jung, Y. K. (2012). "Neuropathogenic role of adenylate kinase-1 in Abeta-mediated tau phosphorylation via AMPK and GSK3beta." Hum Mol Genet 21(12): 2725-2737. Park, H. J., Kim, S. S., Seong, Y. M., Kim, K. H., Goo, H. G., Yoon, E. J., Min do, S., Kang, S., Rhim, H. (2006). "Beta amyloid precursor protein is a direct cleavage target of HtrA2 serine protease. Implications for the physiological function of HtrA2 in the mitochondria." J Biol Chem 281(45): 34277-34287. Park, H. J., Seong, Y. M., Choi, J. Y., Kang, S., Rhim, H. (2004). "Alzheimer's disease-associated amyloid beta interacts with the human serine protease HtrA2/Omi." Neurosci Lett 357(1): 63 -67. Parker, W. D., Jr., Filley, C. M., Parks, J. K. (1990). "Cytochrome oxidase deficiency in Alzheimer's disease." Neurology 40(8): 1302-1303. Parker, W. D., Jr., Mahr, N. J., Filley, C. M., Parks, J. K., Hughes, D., Young, D. A., Cullum, C. M. (1994). "Reduced platelet cytochrome c oxidase activity in Alzheimer's disease." Neurology 44(6): 1086 -1090.
125
Pavlov, P. F., Wiehager, B., Sakai, J., Frykman, S., Behbahani, H., Winblad, B., Ankarcrona, M. (2011). "Mitochondrial gamma-secretase participates in the metabolism of mitochondria-associated amyloid precursor protein." FASEB J 25(1): 78-88. Paxinos, A., Watson, C. (1982). "The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates." Academic Press, San Diego. Perez, R. G., Soriano, S., Hayes, J. D., Ostaszewski, B., Xia, W., Selkoe, D. J., Chen, X., Stokin, G. B., Koo, E. H. (1999). "Mutagenesis identifies new signals for beta -amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42." J Biol Chem 274(27): 18851 -18856. Perry, E. K., Perry, R. H., Tomlinson, B. E., Blessed, G., Gibson, P. H. (1980). "Coenzyme A-acetylating enzymes in Alzheimer's disease: possible cholinergic 'compartment' of pyruvate dehydrogenase." Neurosci Lett 18(1): 105-110. Petit, J. M., Huet, O., Gallet, P. F., Maftah, A., Ratinaud, M. H., Julien, R. (1994). "Direct analysis and significance of cardiolipin transverse distribution in mitochondrial inner membranes." Eur J Biochem 220(3): 871 879. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. (2011). "Mitochondria: isolation, structure and function." J Physiol 589(Pt 18): 4413-4421. Picone, P., Nuzzo, D., Caruana, L., Scafidi, V., Di Carlo, M. (2014). "Mitochondrial dysfunction: different routes to Alzheimer's disease therapy." Oxid Med Cell Longev 2014: 780179. Pigino, G., Morfini, G., Pelsman, A., Mattson, M. P., Brady, S. T., Busciglio, J. (2003). "Alzheimer's presenilin 1 mutations impair kinesin-based axonal transport." J Neurosci 23(11): 4499-4508. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. (2006). "Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons." Mol Biol Cell 17(4): 2057 -2068. Pinho, C. M., Teixeira, P. F., Glaser, E. (2014). "Mitochondrial import and degradation of amyloid -beta peptide." Biochim Biophys Acta 1837(7): 1069-1074. Placido, A. I., Pereira, C. M., Duarte, A. I., Candeias, E., Correia, S. C., Santos, R. X., Carvalho, C., Cardoso, S., Oliveira, C. R., Moreira, P. I. (2014). "The role of endoplasmic reticulum in amyloid precursor pr otein processing and trafficking: Implications for Alzheimer's disease." Biochim Biophys Acta 1842(9): 1444 1453. Plun-Favreau, H., Klupsch, K., Moisoi, N., Gandhi, S., Kjaer, S., Frith, D., Harvey, K., Deas, E., Harvey, R. J., McDonald, N., Wood, N. W., Martins, L. M., Downward, J. (2007). "The mitochondrial protease HtrA2 is regulated by Parkinson's disease-associated kinase PINK1." Nat Cell Biol 9(11): 1243-1252. Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Kadish, I., Van Groen, T. (2008). "Subfield and layer -specific depletion in calbindin-D28K, calretinin and parvalbumin immunoreactivity in the dentate gyrus of amyloid precursor protein/presenilin 1 transgenic mice." Neuroscience 155(1): 182 -191. Power, J. H., Asad, S., Chataway, T. K., Chegini, F., Manavis, J., Temlett, J. A., Jensen, P. H., Blumbergs, P. C., Gai, W. P. (2008). "Peroxiredoxin 6 in human brain: molecular forms, cellular distribution and association with Alzheimer's disease pathology." Acta Neuropathol 115(6): 611 -622. Pratico, D., Uryu, K., Leight, S., Trojanoswki, J. Q., Lee, V. M. (2001). "Increased lipid peroxidation precedes amyloid plaque formation in an animal model of Alzheimer amyloidosis." J Neurosci 21(12): 4183 4187. Preston, G. C., Ward, C., Lines, C. R., Poppleton, P., Haigh, J. R., Tr aub, M. (1989). "Scopolamine and benzodiazepine models of dementia: cross -reversals by Ro 15-1788 and physostigmine." Psychopharmacology (Berl) 98(4): 487-494. Pugh, P. L., Richardson, J. C., Bate, S. T., Upton, N., Sunter, D. (2007). "Non-cognitive behaviours in an APP/PS1 transgenic model of Alzheimer's disease." Behav Brain Res 178(1): 18 -28. Puzzo, D., Privitera, L., Leznik, E., Fa, M., Staniszewski, A., Palmeri, A., Arancio, O. (2008). "Picomolar amyloid beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus." J Neurosci 28(53): 14537 14545. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. (2013). "A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity." J Cell Sci 126(Pt 3): 789-802. Radde, R., Bolmont, T., Kaeser, S. A., Coomaraswamy, J., Lindau, D., Stoltze, L., Calhoun, M. E., Jaggi, F., Wolburg, H., Gengler, S., Haass, C., Ghetti, B., Czech, C., Holscher, C., Mathews, P. M., Jucker, M. (2006). "Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology." EMBO Rep 7(9): 940-946. Raichle, M. E. (2010). "The brain's dark energy." Sci Am 302(3): 44 -49. Ralay Ranaivo, H., Craft, J. M., Hu, W., Guo, L., Wing, L. K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M. (2006). "Glia as a therapeutic target: selective suppression of human amyloid-beta-induced upregulation of brain proinflammatory cytokine production attenuates neurodegeneration." J Neurosci 26(2): 662 -670.
126
Rao, A. V., Balachandran, B. (2002). "Role of oxidative stress and antioxidants in neurodegenerative diseases." Nutr Neurosci 5(5): 291-309. Raukas, M., Rebane, R., Mahlapuu, R., Jefremov, V., Zilmer, K., Karelson, E., Bogdanovic, N., Zilmer, M. (2012). "Mitochondrial oxidative stress index, activity of redox-sensitive aconitase and effects of endogenous anti- and pro-oxidants on its activity in control, Alzheimer's disease and Swedish Familial Alzheimer's disease brain." Free Radic Res 46(12): 1490-1495. Reddy, P. H. (2008). "Mitochondrial medicine for aging and neurodegenerative diseases." Neuromolecular Med 10(4): 291-315. Reddy, P. H. (2013). "Is the mitochondrial outermembrane protein VDAC1 therapeutic target for Alzheimer's disease?" Biochim Biophys Acta 1832(1): 67-75. Reddy, P. H., McWeeney, S., Park, B. S., Manczak, M., Gutala, R. V., Partovi, D., Jung, Y., Yau, V., Searles, R., Mori, M., Quinn, J. (2004). "Gene expression profiles of transcripts in amyloid precursor protein transgenic mice: up-regulation of mitochondrial metabolism and apoptotic genes is an early cellular change in Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 13(12): 1225-1240. Reddy, P. H., Reddy, T. P. (2011). "Mitochondria as a therapeutic target for aging and neurodegenerative diseases." Curr Alzheimer Res 8(4): 393-409. Reddy, P. H., Reddy, T. P., Manczak, M., Calki ns, M. J., Shirendeb, U., Mao, P. (2011). "Dynamin-related protein 1 and mitochondrial fragmentation in neurodegenerative diseases." Brain Res Rev 67(1 -2): 103-118. Reed, T., Perluigi, M., Sultana, R., Pierce, W. M., Klein, J. B., Turner, D. M., Coccia, R., Markesbery, W. R., Butterfield, D. A. (2008). "Redox proteomic identification of 4 -hydroxy-2-nonenal-modified brain proteins in amnestic mild cognitive impairment: insight into the role of lipid peroxidation in the progression and pathogenesis of Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 30(1): 107-120. Reinhard, C., Hebert, S. S., De Strooper, B. (2005). "The amyloid-beta precursor protein: integrating structure with biological function." EMBO J 24(23): 3996-4006. Rey, N. L., Jardanhazi-Kurutz, D., Terwel, D., Kummer, M. P., Jourdan, F., Didier, A., Heneka, M. T. (2012). "Locus coeruleus degeneration exacerbates olfactory deficits in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging 33(2): 426 e421-411. Ribe, E. M., Perez, M., Puig, B., Gich, I., Lim, F., Cuadrado, M., Sesma, T., Catena, S., Sanchez, B., Nieto, M., Gomez-Ramos, P., Moran, M. A., Cabodevilla, F., Samaranch, L., Ortiz, L., Perez, A., Ferrer, I., Avila, J., Gomez-Isla, T. (2005). "Accelerated amyloid deposition, neurofibrillary degeneration and neuronal loss in double mutant APP/tau transgenic mice." Neurobiol Dis 20(3): 814 -822. Roach, K. E., Tappen, R. M., Kirk-Sanchez, N., Williams, C. L., Loewenstein, D. (2011). "A randomized controlled trial of an activity specific exercise program for individuals with Alzheimer disease in long-term care settings." J Geriatr Phys Ther 34(2): 50-56. Roch, J. M., Masliah, E., Roch-Levecq, A. C., Sundsmo, M. P., Otero, D. A., Veinbergs, I., Saitoh, T. (1994). "Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid beta/A4 protein precursor." Proc Natl Acad Sci U S A 91(16): 7450 -7454. Rodrigues, C. M., Sola, S., Brito, M. A., Brondino, C. D., Brites, D., Moura, J. J. (2001). "Amyloid beta -peptide disrupts mitochondrial membrane lipid and protein structure: protective role of tauroursodeoxycholate." Biochem Biophys Res Commun 281(2): 468 -474. Roertgen, K. E., Parisi, J. E., Clark, H. B., Barnes, D. L., O'Brien, T. D., Johnson, K. H. (1996). "A beta -associated cerebral angiopathy and senile plaques with neurofibrillary tangles and cerebral hemorrhage in an aged wolverine (Gulo gulo)." Neurobiol Aging 17(2): 243 -247. Rofina, J. E., van Ederen, A. M., Toussaint, M. J., Secreve, M., van der Spek, A., van der Meer, I., Van Eerdenburg, F. J., Gruys, E. (2006). "Cognitive disturbances in old dogs suffering from the canine counterpart of Alzheimer's disease." Brain Res 1069(1): 216 -226. Rosenberg, P. B. (2005). "Clinical aspects of inflammation in Alzheimer's disease." Int Rev Psyc hiatry 17(6): 503514. Rostovtseva, T. K., Antonsson, B., Suzuki, M., Youle, R. J., Colombini, M., Bezrukov, S. M. (2004). "Bid, but not Bax, regulates VDAC channels." J Biol Chem 279(14): 13575 -13583. Roussel, B. D., Kruppa, A. J., Miranda, E., Crowther, D. C., Lomas, D. A., Marciniak, S. J. (2013). "Endoplasmic reticulum dysfunction in neurological disease." Lancet Neurol 12(1): 105 -118. Rowan, M. J., Klyubin, I., Wang, Q., Anwyl, R. (2004). "Mechanisms of the inhibitory effects of amyloid beta protein on synaptic plasticity." Exp Gerontol 39(11-12): 1661-1667. Rowan, M. J., Klyubin, I., Wang, Q., Anwyl, R. (2004). "Mechanisms of the inhibitory effects of amyloid beta protein on synaptic plasticity." Exp Gerontol 39(11-12): 1661-1667.
127
Rui, Y., Tiwari, P., Xie, Z., Zheng, J. Q. (2006). "Acute impairment of mitochondrial trafficking by beta -amyloid peptides in hippocampal neurons." J Neurosci 26(41): 10480 -10487. Ruiz-Opazo, N., Kosik, K. S., Lopez, L. V., Bagamasbad, P., Ponce, L. R., Herrera, V. L. (2004). "Attenuated hippocampus-dependent learning and memory decline in transgenic TgAPPswe Fischer -344 rats." Mol Med 10(1-6): 36-44. Sambamurti, K., Greig, N. H., Utsuki, T., Barnwell, E. L., Sharma, E., Mazell, C., Bhat, N. R., Kindy, M. S., Lahiri, D. K., Pappolla, M. A. (2011). "Targets for AD treatment: conflicting messages from gamma -secretase inhibitors." J Neurochem 117(3): 359-374. Sarasa, M., Pesini, P. (2009). "Natural non-trasgenic animal models for research in Alzheimer's disease." Curr Alzheimer Res 6(2): 171-178. Schade, S., Mollenhauer, B. (2014). "Biomarkers in biological fluids for dementia with Lewy bodies." Alzheimers Res Ther 6(5-8): 72. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. (2010). "Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms." Nat Rev Mol Cell Biol 11(9): 655-667. Schon, E. A., DiMauro, S., Hirano, M. (2012). "Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations." Nat Rev Genet 13(12): 878-890. Schonberger, S. J., Edgar, P. F., Kydd, R., Faul l, R. L., Cooper, G. J. (2001). "Proteomic analysis of the brain in Alzheimer's disease: molecular phenotype of a complex disease process." Proteomics 1(12): 1519 1528. Schousboe, A., Bak, L. K., Waagepetersen, H. S. (2013). "Astrocytic Control of Biosynth esis and Turnover of the Neurotransmitters Glutamate and GABA." Front Endocrinol (Lausanne) 4: 102. Scullion, G. A., Kendall, D. A., Marsden, C. A., Sunter, D., Pardon, M. C. (2011). "Chronic treatment with the alpha2-adrenoceptor antagonist fluparoxan prevents age-related deficits in spatial working memory in APPxPS1 transgenic mice without altering beta -amyloid plaque load or astrocytosis." Neuropharmacology 60(2-3): 223-234. Selfridge, J. E., E, L., Lu, J., Swerdlow, R. H. (2013). "Role of mitochondrial homeostasis and dynamics in Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 51: 3-12. Selkoe, D. J. (2008). "Soluble oligomers of the amyloid beta -protein impair synaptic plasticity and behavior." Behav Brain Res 192(1): 106-113. Sengupta, A., Banerjee, B., Tyagi, R. K., Datta, K. (2005). "Golgi localization and dynamics of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/C1QBP) during the cell cycle." Cell Res 15(3): 183 -186. Sergeant, N., Wattez, A., Galvan-valencia, M., Ghestem, A., David, J. P., Lemoine, J., Sautiere, P. E., Dachary, J., Mazat, J. P., Michalski, J. C., Velours, J., Mena -Lopez, R., Delacourte, A. (2003). "Association of ATP synthase alpha-chain with neurofibrillary degeneration in Alzheimer's disease." Neuroscience 117(2): 293-303. Shank, R. P., Campbell, G. L. (1984). "Alpha-ketoglutarate and malate uptake and metabolism by synaptosomes: further evidence for an astrocyte-to-neuron metabolic shuttle." J Neurochem 42(4): 1153-1161. Shankar, G. M., Li, S., Mehta, T. H., Garcia-Munoz, A., Shepardson, N. E., Smith, I., Brett, F. M., Farrell, M. A., Rowan, M. J., Lemere, C. A., Regan, C. M., Walsh, D. M., Sabatini, B. L., Selkoe, D. J. (2008). "Amyloid beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory." Nat Med 14(8): 837-842. Sheng, Z. H., Cai, Q. (2012). "Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration." Nat Rev Neurosci 13(2): 77-93. Shibata, N., Kobayashi, M. (2008). "[The role for oxidative stress in neurodegenerative diseases]." Brain Nerve 60(2): 157-170. Shimizu, S., Ide, T., Yanagida, T., Tsujimoto, Y. (2000). "Electrophysiological study of a novel large pore formed by Bax and the voltage-dependent anion channel that is permeable to cytochrome c." J Biol Chem 275(16): 12321-12325. Shin, R. W., Saido, T. C., Maeda, M., Kitamoto, T. (2005). "Novel alpha -secretase cleavage of Alzheimer's amyloid beta precursor protein in the endoplasmic reticulum of COS7 cells." Neurosci Lett 376(1): 14 19. Shiozaki, A., Tsuji, T., Kohno, R., Kawamata, J., Uemura, K., Teraoka, H., Shimohama, S. (2004). "Proteome analysis of brain proteins in Alzheimer's disease: subproteomics following sequentially extracted protein preparation." J Alzheimers Dis 6(3): 257-268. Shirendeb, U., Reddy, A. P., Manczak, M., Calkins, M. J., Mao, P., Tagle, D. A., Reddy, P. H. (2011). "Abnormal mitochondrial dynamics, mitochondrial loss and mutant huntingtin oligomers in Huntington's disease: implications for selective neuronal damage." Hum Mol Genet 20(7): 1438-1455.
128
Schousboe, A., Bak, L. K., Waagepetersen, H. S. (2013). "Astrocytic Control of Biosynthesis and Turnover of the Neurotransmitters Glutamate and GABA." Front Endocrinol (Lausanne) 4: 102. Silva, P. N., Furuya, T. K., Braga, I. L., Rasmussen, L. T., Labio, R. W., Bertolucci, P. H., Chen, E. S., Turecki, G., Mechawar, N., Payao, S. L., Mill, J., Smith, M. C. (2014). "Analysis of HSPA8 and HSPA9 mRNA expression and promoter methylation in the brain and blood of Alzheimer's disease patients." J Alzheimers Dis 38(1): 165-170. Sims, N. R., Anderson, M. F. (2008). "Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation." Nat Protoc 3(7): 1228-1239. Singh, N. K., Banerjee, B. D., Bala, K., Basu, M., Chhillar, N. (2014). "Polymorphism in Cytochrome P450 2D6, Glutathione S-Transferases Pi 1 Genes, and Organochlorine Pesticides in Alzheimer Disease: A CaseControl Study in North Indian Population." J Geriatr Psychiatry Neurol 27(2): 119-127. Sinha, S., Anderson, J. P., Barbour, R., Basi, G. S., Caccavello, R., Davis, D., Doan, M., Dovey, H. F., Frigon, N., Hong, J., Jacobson-Croak, K., Jewett, N., Keim, P., Knops, J., Lieberburg, I., Power, M., Tan, H., Tatsuno, G., Tung, J., Schenk, D., Seubert, P., Suomensaari, S. M., Wang, S., Walker, D., Zhao, J., McConlogue, L., John, V. (1999). "Purification and cloning of amyloid precursor protein beta -secretase from human brain." Nature 402(6761): 537-540. Sipos, E., Kurunczi, A., Kasza, A., Horvath, J., Felszeghy, K., Laroche, S., Toldi, J., Parducz, A., Penke, B., Penke, Z. (2007). "Beta-amyloid pathology in the entorhinal cortex of rats induces memory deficits: implications for Alzheimer's disease." Neuroscience 147(1): 28-36. Sloan, H. L., Good, M., Dunnett, S. B. (2006). "Double dissociation between hippocampal and prefrontal lesions on an operant delayed matching task and a water maze reference memory task." Behav Brain Res 171(1): 116-126. Small, S. A., Duff, K. (2008). "Linking Abeta and tau in late-onset Alzheimer's disease: a dual pathway hypothesis." Neuron 60(4): 534-542. Sonnewald, U., Muller, T. B., Westergaard, N., Unsgard, G., Petersen, S. B., Schousboe, A. (1994). "NMR spectroscopic study of cell cultures of astrocytes and neurons exposed to hypoxia: compartmentation of astrocyte metabolism." Neurochem Int 24(5): 473-483. Sorbi, S., Bird, E. D., Blass, J. P. (1983). "Decreased pyruvate dehydrogenase complex activity in Huntington and Alzheimer brain." Ann Neurol 13(1): 72-78. Stacpoole, P. W. (2012). "The pyruvate dehydrogenase complex as a therapeutic target for age-related diseases." Aging Cell 11(3): 371-377. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. (2011). "Impaired mitochondrial transport and Parkinindependent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A 108(31): 12937-12942. Stine, W. B., Jr., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. (2003). "In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis." J Biol Chem 278(13): 11612-11622. Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A., Wolburg, H., Downward, J., Riess, O., Schulz, J. B., Kruger, R. (2005). "Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease." Hum Mol Genet 14(15): 2099-2111. Sturchler-Pierrat, C., Abramowski, D., Duke, M., Wiederhold, K. H., Mistl, C., Rothacher, S., Ledermann, B., Burki, K., Frey, P., Paganetti, P. A., Waridel, C., Calhoun, M. E., Jucker, M., Probst, A., Staufenbiel, M., Sommer, B. (1997). "Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer diseaselike pathology." Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 13287-13292. Sultana, R., Poon, H. F., Cai, J., Pierce, W. M., Merchant, M., Klein, J. B., Markesbery, W. R., Butterfield, D. A. (2006). "Identification of nitrated proteins in Alzheimer's disease brain using a redox proteomics approach." Neurobiol Dis 22(1): 76-87. Sunayama, J., Ando, Y., Itoh, N., Tomiyama, A., Sakurada, K., Sugiyama, A., Kang, D., Tashiro, F., Gotoh, Y., Kuchino, Y., Kitanaka, C. (2004). "Physical and functional interaction between BH3 -only protein Hrk and mitochondrial pore-forming protein p32." Cell Death Differ 11(7): 771-781. Sunderland, T., Tariot, P. N., Weingartner, H., Murphy, D. L., Newhouse, P. A., Mueller, E. A., Cohen, R. M. (1986). "Pharmacologic modelling of Alzheimer's disease." Prog Neuropsychopharmacol Bio l Psychiatry 10(3-5): 599-610. Sutton, M. A., Schuman, E. M. (2006). "Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory." Cell 127(1): 49-58. Swerdlow, R. H. (2011). "Brain aging, Alzheimer's disease, and mitochondria." Biochim Biophys Acta 1812 (12): 1630-1639.
129
Swerdlow, R. H., Khan, S. M. (2004). "A "mitochondrial cascade hypothesis" for sporadic Alzheimer's disease." Med Hypotheses 63(1): 8-20. Swerdlow, R. H., Khan, S. M. (2009). "The Alzheimer's disease mitochondrial cascade hypothesis: an up date." Exp Neurol 218(2): 308-315. Sy, M., Kitazawa, M., Medeiros, R., Whitman, L., Cheng, D., Lane, T. E., Laferla, F. M. (2011). "Inflammation induced by infection potentiates tau pathological features in transgenic mice." Am J Pathol 178(6): 2811-2822. Szabados, T., Dul, C., Majtenyi, K., Hargitai, J., Penzes, Z., Urbanics, R. (2004). "A chronic Alzheimer's model evoked by mitochondrial poison sodium azide for pharmacological investigations." Behav Brain Res 154(1): 31-40. Szego, E. M., Janaky, T., Szabo, Z., Csorba, A., Kompagne, H., Muller, G., Levay, G., Simor, A., Juhasz, G., Kekesi, K. A. (2010). "A mouse model of anxiety molecularly characterized by altered protein networks in the brain proteome." Eur Neuropsychopharmacol 20(2): 96-111. Takahashi, H., Brasnjevic, I., Rutten, B. P., Van Der Kolk, N., Perl, D. P., Bouras, C., Steinbusch, H. W., Schmitz, C., Hof, P. R., Dickstein, D. L. (2010). "Hippocampal interneuron loss in an APP/PS1 double mutant mouse and in Alzheimer's disease." Brain Struct Funct 214(2-3): 145-160. Takahashi, R. H., Nam, E. E., Edgar, M., Gouras, G. K. (2002). "Alzheimer beta -amyloid peptides: normal and abnormal localization." Histol Histopathol 17(1): 239 -246. Takami, M., Nagashima, Y., Sano, Y., Ishihara, S., Morishima -Kawashima, M., Funamoto, S., Ihara, Y. (2009). "gamma-Secretase: successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of beta-carboxyl terminal fragment." J Neurosci 29(41): 13042-13052. Tamagno, E., Parola, M., Bardini, P., Piccini, A., Borghi, R., Guglielmotto, M., Santoro, G., Davit, A., Danni, O., Smith, M. A., Perry, G., Tabaton, M. (2005). "Beta -site APP cleaving enzyme up-regulation induced by 4-hydroxynonenal is mediated by stress -activated protein kinases pathways." J Neurochem 92(3): 628636. Tani, H., Dulla, C. G., Farzampour, Z., Taylor-Weiner, A., Huguenard, J. R., Reimer, R. J. (2014). "A local glutamate-glutamine cycle sustains synaptic excitatory transmitter release." Neuron 81(4): 888 -900. Tanzi, R. E. (2005). "The synaptic Abeta hypothesis of Alzheimer disease." Nat Neurosci 8(8): 977 -979. Tarkowski, E., Liljeroth, A. M., Minthon, L., Tarkowski, A., Wallin, A., Blennow, K. (2003). "Cerebral pattern of pro- and anti-inflammatory cytokines in dementias." Brain Res Bull 61(3): 255-260. Terni, B., Boada, J., Portero-Otin, M., Pamplona, R., Ferrer, I. (2010). "Mitochondrial ATP-synthase in the entorhinal cortex is a target of oxidative stress at stages I/II of Alzheimer's disease pathology." Brain Pathol 20(1): 222-233. Thal, D. R., Rub, U., Orantes, M., Braak, H. (2002). "Phases of A beta -deposition in the human brain and its relevance for the development of AD." Neurology 58(12): 1791 -1800. Thal, D. R., von Arnim, C. A., Griffin, W. S., Mrak, R. E., Walker, L., Attems, J., Arzber ger, T. (2015). "Frontotemporal lobar degeneration FTLD-tau: preclinical lesions, vascular, and Alzheimer-related copathologies." J Neural Transm. Thinakaran, G., Koo, E. H. (2008). "Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function." J Biol Chem 283(44): 29615-29619. Thompson, C. A., Spilsbury, K., Hall, J., Birks, Y., Barnes, C., Adamson, J. (2007). "Systematic review of information and support interventions for caregivers of people with dementia." BMC Geriatr 7: 18. Tiranti, V., Viscomi, C., Hildebrandt, T., Di Meo, I., Mineri, R., Tiveron, C., Levitt, M. D., Prelle, A., Fagiolari, G., Rimoldi, M., Zeviani, M. (2009). "Loss of ETHE1, a mitochondrial dioxygenase, causes fatal sulfide toxicity in ethylmalonic encephalopathy." Nat Med 15(2): 200-205. Tiwari, V., Ambadipudi, S., Patel, A. B. (2013). "Glutamatergic and GABAergic TCA cycle and neurotransmitter cycling fluxes in different regions of mouse brain." J Cereb Blood Flow Metab 33(10): 1523 -1531. Tobinick, E. (2009). "Tumour necrosis factor modulation for treatment of Alzheimer's disease: rationale and current evidence." CNS Drugs 23(9): 713-725. Tobinick, E., Gross, H., Weinberger, A., Cohen, H. (2006). "TNF-alpha modulation for treatment of Alzheimer's disease: a 6-month pilot study." MedGenMed 8(2): 25. Toledano, A., Alvarez, M. I. (2004). "Lesions and dysfunctions of the nucleus basalis as Alzheimer's disease models: general and critical overview and analysis of the long-term changes in several excitotoxic models." Curr Alzheimer Res 1(3): 189-214. Toney, M. D. (2014). "Aspartate aminotransferase: an old dog teaches new tricks." Arch Biochem Biophys 544: 119-127.
130
Torres, L. L., Quaglio, N. B., de Souza, G. T., Garcia, R. T., Dati, L. M., Moreira, W. L., Loureiro, A. P., de Souza Talarico, J. N., Smid, J., Porto, C. S., Bottino, C. M., Nitrini, R., Barros, S. B., Camarini, R., Marcourakis, T. (2011). "Peripheral oxidative stress biomarkers in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease." J Alzheimers Dis 26(1): 59-68. Torres, M., Jimenez, S., Sanchez-Varo, R., Navarro, V., Trujillo-Estrada, L., Sanchez-Mejias, E., Carmona, I., Davila, J. C., Vizuete, M., Gutierrez, A., Vitorica, J. (2012). "Defective lysosomal proteolysis and axonal transport are early pathogenic events that worsen with age leading to increased APP metabolism and synaptic Abeta in transgenic APP/PS1 hippocampus." Mol Neurodegener 7: 59. Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2006). "Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers." J Physiol 572(Pt 2): 477-492. Trinchese, F., Fa, M., Liu, S., Zhang, H., Hidalgo, A., Schmidt, S. D., Yamaguchi, H., Yoshii, N., Mathews, P. M., Nixon, R. A., Arancio, O. (2008). "Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease." J Clin Invest 118(8): 2796 -2807. Trushina, E., Nemutlu, E., Zhang, S., Christensen, T., Camp, J., Mesa, J., Siddiqui, A., Tamura, Y., Sesaki, H., Wengenack, T. M., Dzeja, P. P., Poduslo, J. F. (2012). "Defects in mitochondrial dynamics and metabolomic signatures of evolving energetic stress in mouse models of familial Alzheimer's disease." PLoS One 7(2): e32737. Turner, P. R., O'Connor, K., Tate, W. P., Abraham, W. C. (2003). "Roles of amyloid precursor protein and its fragments in regulating neural activity, plasticity and memory." Prog Neurobiol 70(1): 1 -32. Tweedie, D., Sambamurti, K., Greig, N. H. (2007). "TNF-alpha inhibition as a treatment strategy for neurodegenerative disorders: new drug candidates and targets." Curr Alzheimer Res 4(4): 378 -385. Uchida, K., Yoshino, T., Yamaguchi, R., Tateyama, S., Kimoto, Y., Nakayama, H., Goto, N. (1995). "Senile plaques and other senile changes in the brain of an aged Americ an black bear." Vet Pathol 32(4): 412-414. Urano, T., Tohda, C. (2010). "Icariin improves memory impairment in Alzheimer's disease model mice (5xFAD) and attenuates amyloid beta-induced neurite atrophy." Phytother Res 24(11): 1658-1663. Van Dam, D., Vloeberghs, E., Abramowski, D., Staufenbiel, M., De Deyn, P. P. (2005). "APP23 mice as a model of Alzheimer's disease: an example of a transgenic approach to modeling a CNS disorder." CNS Spectr 10(3): 207-222. Van Der Bliek, A. M., Shen, Q., Kawajiri, S. (2013). "Mechanisms of mitochondrial fission and fusion." Cold Spring Harb Perspect Biol 5(6). Vangavaragu, J. R., Valasani, K. R., Fang, D., Williams, T. D., Yan, S. S. (2014). "Determination of Small Molecule ABAD Inhibitors Crossing Blood-Brain Barrier and Pharmacokinetics." J Alzheimers Dis 42(1): 333-344. Venditti, P., Di Stefano, L., Di Meo, S. (2013). "Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species." Mitochondrion 13(2): 71-82. Vercauteren, F. G., Clerens, S., Roy, L., Hamel, N., Arckens, L., Vandesande, F., Alhonen, L., Janne, J., Szyf, M., Cuello, A. C. (2004). "Early dysregulation of hippocampal proteins in transgenic rats with Alzheimer's disease-linked mutations in amyloid precursor protein and presenilin 1." Brain Res Mol Brain Res 132(2): 241-259. Verdier, Y., Penke, B. (2004). "Binding sites of amyloid beta -peptide in cell plasma membrane and implications for Alzheimer's disease." Curr Protein Pept Sci 5(1): 19-31. Vetrivel, K. S., Thinakaran, G. (2010). "Membrane rafts in Alzheimer's disease beta-amyloid production." Biochim Biophys Acta 1801(8): 860-867. Vickers, J. C., Dickson, T. C., Adlard, P. A., Saunders, H. L., King, C. E., McCormack, G. (2000). "The cause of neuronal degeneration in Alzheimer's disease." Prog Neurobiol 60(2): 139 -165. Villanueva, S., Steward, O. (2001). "Protein synthesis at the synapse: developmental changes, subcellular localization and regional distribution of polypeptides synthesized in isolated dendritic fragments." Brain Res Mol Brain Res 91(1-2): 148-153. Vos, M., Lauwers, E., Verstreken, P. (2010). "Synaptic mitochondria in synaptic transmission and organization of vesicle pools in health and disease." Front Synaptic Neurosci 2: 139. Votyakova, T. V., Reynolds, I. J. (2001). "DeltaPsi(m)-Dependent and -independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria." J Neurochem 79(2): 266 -277. Völgyi, K., Gulyássy, P., Háden, K., Kis, V., Badics, K., Kékesi, K. A., Simor, A., Györffy, B., Tóth, E. A., Lubec, G., Juhász, G., Dobolyi, A. (2015b). "Synapti c mitochondria: a brain mitochondria cluster with a specific proteome." J Proteomics 120: 142-157.
131
Völgyi, K., Juhász, G., Kovács, Z., Penke, B. (2015a). "Dysfunction of Endoplasmic Reticulum (ER) and Mitochondria (MT) in Alzheimer's Disease: The Role of the ER-MT Cross-Talk." Current Alzheimer Research 12(7). Walker, D. G., McGeer, P. L. (1992). "Compl ement gene expression in human brain: comparison between normal and Alzheimer disease cases." Brain Res Mol Brain Res 14(1 -2): 109-116. Walsh, D. M., Klyubin, I., Fadeeva, J. V., Cullen, W. K., Anwyl, R., Wolfe, M. S., Rowan, M. J., Selkoe, D. J. (2002). "Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long -term potentiation in vivo." Nature 416(6880): 535-539. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2004). "Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease." Neuron 44(1): 181-193. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2007). "A beta oligomers - a decade of discovery." J Neurochem 101(5): 1172-1184. Wang, J., Tanila, H., Puolivali, J., Kadish, I., van Groen, T. (2003). "Gender differences in the amount and deposition of amyloidbeta in APPswe and PS1 double transgenic mice." Neurobiol Dis 14(3): 318 -327. Wang, X., Schwarz, T. L. (2009). "Imaging axonal transport of mitochondria." Methods Enzymol 457: 319 -333. Wang, X., Su, B., Lee, H. G., Li, X., Perry, G., Smith, M. A., Zhu, X. (2009). "Impaired balance of mitochondrial fission and fusion in Alzheimer's disease." J Neurosci 29(28): 9090 -9103. Wang, X., Su, B., Siedlak, S. L., Moreira, P. I., Fujioka, H., Wang, Y., Casadesus, G., Zhu, X. (2008). "Amyloid -beta overproduction causes abnormal mitochondrial dynamics via differential modulation of mitochondrial fission/fusion proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 105(49): 19318 -19323. Weldon, D. T., Rogers, S. D., Ghilardi, J. R., Finke, M. P., Cleary, J. P., O'Hare, E., Esler, W. P ., Maggio, J. E., Mantyh, P. W. (1998). "Fibrillar beta -amyloid induces microglial phagocytosis, expression of inducible nitric oxide synthase, and loss of a select population of neurons in the rat CNS in vivo." J Neurosci 18(6): 2161-2173. Wenk, G. L., McGann, K., Hauss-Wegrzyniak, B., Rosi, S. (2003). "The toxicity of tumor necrosis factor-alpha upon cholinergic neurons within the nucleus basalis and the role of norepinephrine in the regulation of inflammation: implications for Alzheimer's disease." Neuroscience 121(3): 719-729. Westerlund, M., Behbahani, H., Gellhaar, S., Forsell, C., Belin, A. C., Anvret, A., Zettergren, A., Nissbrandt, H., Lind, C., Sydow, O., Graff, C., Olson, L., Ankarcrona, M., Galter, D. (2011). "Altered enzymatic activity and allele frequency of OMI/HTRA2 in Alzheimer's disease." FASEB J 25(4): 1345 -1352. Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Coyle, J. T., DeLong, M. R. (1981). "Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis." Ann Neurol 10(2): 122-126. Wilkins, M. (2009). "Proteomics data mining." Expert Rev Proteomics 6(6): 599 -603. Wirths, O., Weis, J., Szczygielski, J., Multhaup, G., Bayer, T. A. (2006). "Axonopathy in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease." Acta Neuropathol 111(4): 312-319. Wong, K. K., Ho, M. T., Lin, H. Q., Lau, K. F., Rudd, J. A., Chung, R. C., Fung, K. P., Shaw, P. C., Wan, D. C. (2010). "Cryptotanshinone, an acetylcholinesterase inhibitor from Salvia miltiorrhiza, ameliorates scopolamine-induced amnesia in Morris water maze task." Planta Med 76(3): 228 -234. Wu, J., Anwyl, R., Rowan, M. J. (1995). "beta-Amyloid-(1-40) increases long-term potentiation in rat hippocampus in vitro." Eur J Pharmacol 284(3): R1 -3. Wyss, M. T., Jolivet, R., Buck, A., Magistretti, P. J., Weber, B. (2011). "In vivo evidence for lactate as a neuronal energy source." J Neurosci 31(20): 7477-7485. Xie, A., Gao, J., Xu, L., Meng, D. (2014). "Shared mechanisms of neurodegeneration in Alzhei mer's disease and Parkinson's disease." Biomed Res Int 2014: 648740. Xu, X. (2009). "Gamma-secretase catalyzes sequential cleavages of the AbetaPP transmembrane domain." J Alzheimers Dis 16(2): 211-224. Yagi, H., Katoh, S., Akiguchi, I., Takeda, T. (1988). "Age-related deterioration of ability of acquisition in memory and learning in senescence accelerated mouse: SAM-P/8 as an animal model of disturbances in recent memory." Brain Res 474(1): 86-93. Yamada, M., Chiba, T., Sasabe, J., Nawa, M., Tajima, H., Ni ikura, T., Terashita, K., Aiso, S., Kita, Y., Matsuoka, M., Nishimoto, I. (2005). "Implanted cannula -mediated repetitive administration of Abeta25-35 into the mouse cerebral ventricle effectively impairs spatial working memory." Behav Brain Res 164(2): 139 146. Yan, P., Bero, A. W., Cirrito, J. R., Xiao, Q., Hu, X., Wang, Y., Gonzales, E., Holtzman, D. M., Lee, J. M. (2009). "Characterizing the appearance and growth of amyloid plaques in APP/PS1 mice." J Neurosci 29(34): 10706-10714.
132
Yan, J., Liu, X. H., Han, M. Z., Wang, Y. M., Sun, X. L., Yu, N., Li, T., Su, B., Chen, Z. Y. (2015). "Blockage of GSK3beta-mediated Drp1 phosphorylation provides neuroprotection in neuronal and mouse models of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 36(1): 211-227. Yao, J., Du, H., Yan, S., Fang, F., Wang, C., Lue, L. F., Guo, L., Chen, D., Stern, D. M., Gunn Moore, F. J., Xi Chen, J., Arancio, O., Yan, S. S. (2011). "Inhibition of amyloid-beta (Abeta) peptide-binding alcohol dehydrogenase-Abeta interaction reduces Abeta accumulation and improves mitochondrial function in a mouse model of Alzheimer's disease." J Neurosci 31(6): 2313 -2320. Yao, J., Irwin, R. W., Zhao, L., Nilsen, J., Hamilton, R. T., Brinton, R. D. (2009). "Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease." Proc Natl Acad Sci U S A 106(34): 14670-14675. Ye, C., Walsh, D. M., Selkoe, D. J., Hartley, D. M. (2004). "Amyloid beta -protein induced electrophysiological changes are dependent on aggregation state: N-methyl-D-aspartate (NMDA) versus non-NMDA receptor/channel activation." Neurosci Lett 366(3): 320-325. Yeung, K. C., Rose, D. W., Dhillon, A. S., Yaros, D., Gustafsson, M., Chatterjee, D., McFerran, B., Wyche, J., Kolch, W., Sedivy, J. M. (2001). "Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-kappaB-inducing kinase and TAK1 and inhibits NF-kappaB activation." Mol Cell Biol 21(21): 7207-7217. Yoo, B. C., Fountoulakis, M., Cairns, N., Lubec, G. (2001). "Changes of voltage-dependent anion-selective channel proteins VDAC1 and VDAC2 brain levels in patients with Alzheimer's disease and Down syndrome." Electrophoresis 22(1): 172-179. Yudkoff, M., Nelson, D., Daikhin, Y., Erecinska, M. (1994). "Tricarboxylic acid cycle in rat brain synaptosomes. Fluxes and interactions with aspartate aminotransferase and malate/aspartate shuttle." J Biol Chem 269(44): 27414-27420. Zahid, S., Oellerich, M., Asif, A. R., Ahmed, N. (2014). "Differential expression of proteins in brain regions of Alzheimer's disease patients." Neurochem Res 39(1): 208-215. Zhang, L., Zhang, C., Zhu, Y., Cai, Q., Chan, P., Ueda, K., Yu, S., Yang, H. (2008). "Semi-quantitative analysis of alpha-synuclein in subcellular pools of rat brain neurons: an immunogold electron microscopic study using a C-terminal specific monoclonal antibody." Brain Res 1244: 40-52. Zhang, Q. L., Jia, L., Jiao, X., Guo, W. L., Ji, J. W., Yang, H. L., Niu, Q. (2012). "APP/PS1 transgenic mice treated with aluminum: an update of Alzheimer's disease model." Int J Immunopathol Phar macol 25(1): 49-58. Zarandi, M., Soos, K., Fulop, L., Bozso, Z., Datki, Z., Toth, G. K., Penke, B. (2007). "Synthesis of Abeta[1 -42] and its derivatives with improved efficiency." J Pept Sci 13(2): 94 -99. Zheng, H., Koo, E. H. (2006). "The amyloid precursor protein: beyond amyloid." Mol Neurodegener 1: 5. Zhu, X., Perry, G., Moreira, P. I., Aliev, G., Cash, A. D., Hirai, K., Smith, M. A. (2006). "Mitochondrial abnormalities and oxidative imbalance in Alzheimer disease." J Alzheimers Dis 9(2): 147 -153. Zilka, N., Filipcik, P., Koson, P., Fialova, L., Skrabana, R., Zilkova, M., Rolkova, G., Kontsekova, E., Novak, M. (2006). "Truncated tau from sporadic Alzheimer's disease suffices to drive neurofibrillary degeneration in vivo." FEBS Lett 580(15): 3582-3588. Zinsmaier, K. E., Babic, M., Russo, G. J. (2009). "Mitochondrial transport dynamics in axons and dendrites." Results Probl Cell Differ 48: 107-139.
133
Összefoglalás Az Alzheimer-kór (AK) egy multifaktoriális, szinaptikus funkcióvesztéssel, majd neuronpusztulással
és
memóriahanyatlással
járó
fehérjekonformációs
neurodegeneratív
betegség. Az APP, valamint az Aβ és tau fehérjék felgyülemlése az AK legfőbb neuropatológiai elváltozásai. Az AK korai patomechanizmusának feltárása elengedhetetlen a korai,
diagnosztizálható
biomarkerek
azonosításához.
Az egyik
legkorábbi detektálható
klinikai elváltozás az AK-os betegeknél a csökkent agyi metabolizmus, ami mitokondriális zavarokra vezethető vissza. A szinaptikus mitokondriumok (sMito-ok) a neurodegeneratív és pszichiátriai betegségekben fokozott érzékenységet mutatnak. Az azonban, hogy a szinaptikus mitokondriális fehérjék milyen, szinapszisra specifikus funkcióval rendelkeznek, nem ismert. A sMito-ok proteomikai jellemzéséhez teljes egéragyból izolált sMito és nem-szinaptikus mitokondrium
(nsMito)
preparátumokat
állítottunk
elő,
melyek
tisztaságát
elektronmikroszkópiával és fluoreszcencia aktivált sejt analízis és szétválogatás módszerekkel validáltuk.
A
proteomikai
vizsgálatok
alapján
22
szignifikánsan
magasabb
és
34
szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű fehérjét azonosítottunk az sMito-okban a nsMitookhoz
képest,
melyek
közül
a
legjelentősebb
fehérjéket
Western
blottal,
illetve
immunhisztokémiával is igazoltuk. Eredményeink alapján elmondható, hogy a szinapszis energiaellátását
szolgáló
citrát-kör
jelentősen
különbözik
a
kétféle
mitokondrium
populációban, továbbá a sMito-ok fokozottabb érzékenységet mutatnak az oxidatív stresszre. A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a sMito-okban és a nsMito-okban
eltérő folyamatokban szerepet játszó fehérjék dúsulnak fel. A különböző
mitokondrium populációk proteomikai jellemzését követően az Aβ progresszió sMito-okra és nsMito-okra gyakorolt hatását vizsgáltuk 3, 6 illetve 9 hónapos APP/PS1 egerekben. A proteomikai vizsgálatok mellett a mitokondriumok funkcionális változásait is vizsgáltuk a hidrogén-peroxid metabolizmus és oxigénfogyasztás szintjén. A proteomikai analízis során 60 különböző fehérjeváltozást azonosítottunk, melyek az APP túltermelés és Aβ felgyülemlés mitokondriális folyamatokra gyakorolt hatását tükrözik. A legtöbb, Aβ hatására szignifikáns változást mutató fehérje az elektrontranszport-lánc, citrát-kör, oxidatív stressz és apoptózis folyamataiban játszik szerepet. A Htra2 és Ethe1 fehérjeváltozásokat Western blottal is igazoltuk. A bioinformatikai analízisek felvetik a Tnf-α szabályozó szerepét a Aβ hatására megváltozott mitokondriális fehérjékre. Adataink egy új kutatási megközelítést adnak az Aβ progresszió hatására bekövetkező korai mitokondriális elváltozások vizsgálatában, ami az AK korai, tünetmentes fázisának megértésében jelentős előrelépés lehet.
134
Summary Alzheimer’s neurodegenerative
disease disease
(AD) correlating
is
a
with
multifactorial synaptic
failure
protein and
misfolding memory
based
impairment.
Overproduction of APP and accumulation of β-amyloid (Aβ) and tau proteins are important neuropathological hallmarks of AD. The identification of early pathomechanisms of AD is critically important for discovery of early diagnosis markers. Decreased brain metabolism is one of the earliest clinical symptoms of AD that indicate mitochondrial dysfunction in the brain. Synaptic mitochondria (sMitos) are more vulnerable in several neurodegenerative and psychiatric disorders. However, the specific synaptic functions of the synaptic mitochondrial proteins are unknown. To reveal sMito’s molecular characteristics, we isolated whole brain sMito and non-synaptic mitochondria (nsMito) from mouse brain and sample purity was validated by electron microscopy and fluorescence activated cell analysis and sorting. Proteomic analysis revealed 22 proteins with significantly higher and 34 proteins with significantly lower level in synaptic compared to non-synaptic mitochondria. The most abundant protein differences were verified by Western blot and immunohistochemistry. The proteomics data suggest altered tricarboxylic acid metabolism in energy supply of synapse and
high sensitivity of synapses to oxidative stress. Further functional clustering
demonstrated that proteins enriched in sMito or nsMito involved in different biological processes. After proteomic characterization of the different mitochondrial populations we performed
a comprehensive study integrating synaptic and non-synaptic mitochondrial
proteome analysis in correlation with Aβ progression in APP/PS1 mice (3, 6 and 9 months of age). In parallel with proteomics studies, functional changes in mitochondria via peroxide metabolism and oxygen consumption were also recorded. We identified the changes of the level of 60 different mitochondrial proteins, which reflect the progressive effect of APP overproduction and Aβ accumulation on mitochondrial processes. Most of the proteins that were significantly affected by Aβ play role in the mitochondrial electron transport chain, citric acid cycle, oxidative stress or apoptosis. Altered expression levels of Htra2 and Ethe1 were confirmed also by Western blot analysis. The result of bioinformatical analysis suggests a possible regulatory role of Tnf-α as a common regulator in Aβ mediated mitochondrial protein changes. We hope to open a new path of research aiming early mitochondrial molecular mechanisms of Aβ accumulation as a prodromal stage of human AD.
135
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Juhász Gábornak, aki lehetővé tette számomra, hogy már szakdolgozó korom óta a kutatócsoportjában dolgozhassak. Különösen hálás vagyok azért, hogy mindig támogatott önálló ötleteim megvalósításában, miközben tanácsaival segítette kutatói munkámat és alakította tudományos szemléletmódomat. Köszönöm Dr. Erdei Annának és Dr. Sass Miklósnak, hogy tanulmányaimat a Biológia
Doktori
Iskola
Molekuláris
sejt-
és
neurobiológiai
doktori
Programjában
végezhettem el. Szeretném megköszönni Dr. Penke Botondnak az inspiráló szakmai konzultációkat és az átadott tudást az Alzheimer-kór hátterében álló folyamatok megértésével kapcsolatban. Köszönettel tartozom Dr. Kékesi Adrienna Katalinnak, Dr. Dobolyi Árpádnak és Dr. Czurkó Andrásnak a kísérleti munkákban és a kéziratok megírásában nyújtott szakmai segítségükért és áldozatos munkájukért. Szeretném megköszönni Gulyássy Péternek, Háden Krisztinának, Badics Katának, Györffy Balázsnak, Todorov Mihailnak, Dr. Simor Attilának, Dr. Orbán Gergelynek, valamint a Proteomika Labor összes korábbi és jelenlegi munkatársának és szakdolgozójánák az éveken át tartó közös munkát, szakmai segítséget és nem utolsó sorban a baráti légkört. Külön köszönet illeti Kis Viktort a mikroszkópos munkákban nyújtott segítségéért, lelkes
együttműködésére
bármikor
számíthattam.
Szeretnék
köszönetet
mondani
Tóth
Eszternek és Dr. Matkó Jánosnak, akik nélkül a mitokondrium szortolás beállítása nem valósulhatott volna meg. Köszönet illeti Dr. Szabó Zoltán, Dr. Janáky Tamás, Dr. Drahos László és Dr. Gert Lubec együttműködő partnereinket a tömegspektrometriás mérésekért, Dr. Tretter Lászlót a mitokondriumok funkcionális vizsgálatában valamint Dr. Kardos Józsefet az amyloid oldatok karakterizálásában nyújtott segítségéért. Szeretnék köszönetet mondani szüleimnek, Völgyi Lászlóné sz. Komáromi Editnek és Völgyi
Lászlónak,
akik
gyerekkorom óta
bíztattak,
támogattak
és lehetővé tették
tanulmányaim elvégzését. Külön köszönet illeti páromat, Dr. Radnai Lászlót, aki végig lelkesített a doktori tanulmányaim elvégzése során, támogatására és segítségére mindig számíthattam.
136
Publikációs lista Az értekezéshez kapcsolódó saját közlemények Völgyi K, Gulyássy P, Háden K, Kis V, Badics K, Kékesi KA, Simor A, Györffy B, Tóth EA, Lubec G, Juhász G, Dobolyi A. Synaptic mitochondria: A brain mitochondria cluster with a specific proteome. J Proteomics. 2015 Apr 29;120:142-57. doi: 10.1016/j.jprot.2015.03.005. Epub 2015 Mar 14. PMID: 25782751 Völgyi K; Juhász G; Kovács Zs; Penke B Dysfunction of Endoplasmic Reticulum (ER) and Mitochondria (MT) in Alzheimer's Disease: the Role of the ERMT cross-talk. Curr Alzheimer Res. 2015 Jul 9. Epub ahead of print PMID: 26159206 Orbán G, Völgyi K, Juhász G, Penke B, Kékesi KA, Kardos J, Czurkó A. Different electrophysiological actions of 24- and 72-hour aggregated amyloid-beta oligomers on hippocampal field population spike in both anesthetized and awake rats. Brain Res. 2010 Oct 1;1354:227-35. doi: 10.1016/j.brainres.2010.07.061. Epub 2010 Jul 24. PMID: 20659435 Völgyi K; Háden K; Kis V; Gulyássy P; Badics K; Györffy B A; Simor A; Szabó Z; Janáky T; Drahos L; Tretter L; Dobolyi Á; Penke B; Juhász G; Kékesi AK Mitochondrial proteome and oxidative metabolism changes correlating with amyloid -β accumulation Kézirat elbírálás alatt
Egyéb közlemények Györffy B, Kovács Z, Gulyássy P, Simor A, Völgyi K, Orbán G, Baracskay P, Szabó Z, Janáky T, Dobolyi A, Juhász G, Czurkó A, Kékesi KA. Brain protein expression changes in WAG/Rij rats, a genetic rat model of absence epilepsy after peripheral lipopolysaccharide treatment. Brain Behav Immun. 2014 Jan;35:86-95. doi: 10.1016/j.bbi.2013.09.001. Epub 2013 Sep 8. PMID: 24021561
137
