3.3. Mikroskopie Různé mikroskopické metody dosáhly obrovských možností při pozorování nejen biologických objektů. Na pozorování neživých struktur lze použít v podstatě jakoukoliv metodu, ovšem na pozorování biologických objektů jen některou. Ještě menší je výběr, když je potřeba pozorovat živé biologické objekty v jejich růstu, zániku, nebo při dlouhodobém pozorování. Mikroskopické metody jsou nejrozšířenější metodou studia mikroorganizmů. K tomuto účelu slouží hlavně světelná mikroskopie a její případné modifikace. Dále je obrazově výhodná elektronová mikroskopie, která ale není možná v použití na sledování živých organizmů. Proto se v této částí budeme zabývat hlavně světelnou mikroskopií a případným užitím jiných metod, které by v budoucnu bylo možné použít na tyto biologické aplikace. 3.3.1. Základní součásti světelného mikroskopu Úplný mikroskop se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme pak o stavebnicových mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají moduly. Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější (větší) knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní (menší) knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti, což ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně vzorků. Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů děje svislým pohybem stolku. Stolek mikroskopu slouží pro uložení pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76 × 26 × 1 mm), bývají většinou zakryty krycím sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17 mm, být zcela čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17 mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí na tloušťku krycího skla. Moderní mikroskopy mají vodič objektu (vodič preparátu), do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat. Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární nebo binokulární tubus), případně s dalším optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka tubusu patří k základním parametrům mikroskopu. Tubus se dvěma okuláry se nazývá binokulární tubus. Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny tubusy s dalším výstupem, které se nazývají trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly.
Osvětlovací souprava se skládá ze síťového transformátoru na 220 V/50 Hz s regulací výstupního napětí (6 nebo 12 V), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 - 100 W. Mikroskopy s vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké mikroskopy mají v samostatné skříňce také napájecí transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo je přenesena do stativu. Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve světelné záření a zbytek (kolem 90 %) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl volně proudit vzduch. Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují závitem. Revolverový nosič je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je výhodný při používání více druhů objektivů. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře. Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru. Toho dosáhneme přesným vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu kondenzoru. Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4 × až do 100 × . Při použití objektivů s malým zvětšením mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi, na ně se (podobně jako na preparát) nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem lomu. Obraz v mikroskopu pozorujeme okulárem. Novější mikroskopy jsou vybaveny tubusem pro dva okuláry (binokulární tubus), takže obraz pozorujeme současně oběma očima. Okuláry jsou výměnné. Mohou být rozděleny podle optické konstrukce, podle zvětšení a podle velikosti pozorovaného obrazového pole (které je kruhové). Kritériem pro jakost okulárů je stupeň odstranění tzv. zbytkových vad: barevné vady, sklenutí a astigmatismu. Běžné okuláry mají zvětšení 10x, jsou však okuláry se zvětšením 5 × , 12,5 × , 15 × a jiné. Dobré okuláry mají možnost nastavit dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle. Zaostření obrazu pak závisí též na nastavení dioptrických korekcí v okulárech. Tato okolnost má vliv na správné zaostření mikrofotografického snímku, nemá-li mikrofotografický přístroj samostatný zaostřovací okulár. Objektivy jsou nejvýznamnější částí mikroskopu, která rozhoduje o jeho kvalitě. Jejich vlastnosti prošly dlouhým vývojem - od jednoduché čočky až k dnešním dokonalým objektivům. Na jejich kvalitě závisí výsledný obraz. Názvy objektivů se u různých výrobců liší, přesto však mají hlavní skupiny podobné názvy, popisující jejich vlastnosti. Podle toho rozeznáváme: 1. Achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček, takže pohlcují méně ultrafialového záření. 2. Plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů.
2
3. Apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra. Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů. 4. Planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším a k nejdražším objektivům. 5. Fluoritové objektivy - např. plan fluory využívají vynikajících optických vlastností fluoritového skla, které dobře propouští ultrafialové záření. Používají se hlavně pro speciální účely, např. při fluorescenční mikroskopii. Fluoritové objektivy fluory spojují vlastnosti kvalitních planachromátů s vysokou propustností pro krátkovlnné záření a jsou vhodné nejen pro fluorescenci, ale též pro pozorování ve světlém poli. Objektivy Plan Fluor lze použít pro fázový kontrast, epifluorescenci, světlé pole i pro diferenciální interferenční kontrast. 6. Imerzní objektivy. Objektivy se dále mohou lišit tím, zda jsou “suché” nebo určené pro imerzi. U suchých objektivů je korekce provedena tak, že mezi objektivem a krycím sklem preparátu se předpokládá vrstva vzduchu. K imerzi se nejčastěji používá zvláštní imerzní olej, méně často voda. Imerzní olej má podobný index lomu jako sklo, takže vznikne opticky homogenní prostředí: krycí sklo › imerzní olej › objektiv, ve kterém objektiv zachytí maximum světla, které tvoří obraz v mikroskopu Tento olej má být dobré kvality, předepsaný index lomu má být 1,5130. Dříve často užívaný cedrový olej zanechává nepříjemné zbytky na objektivu. Olejová imerze se používá u objektivů s vyšším zvětšením, nejčastěji u zvětšení 100 × . Podobný - i když slabší účinek má vodní imerze. Index lomu vody je vyšší, než vzduchu, avšak nižší, než u imerzního oleje. Objektivy pro vodní imerzi mají význam hlavně tehdy, pozorujeme-li objekty, plovoucí ve vodě. Práce s vodní imerzí je méně náročná, objektivy není třeba pracně čistit od imerzního oleje. 7. Objektivy pro práci bez krycího skla. Dále můžeme rozlišovat objektivy, vyžadující krycí sklo a objektivy pro práci bez krycího skla, označované NCG (No Cover Glass). Krycí sklo je součástí optické soustavy mikroskopu a musí mít tloušťku, na kterou jsou objektivy korigovány (0,17 mm). Rozdíly v tloušťce krycího skla mohou být příčinou pro snížení jakosti pozorovaného obrazu. Objektivy, korigované na práci bez krycího skla se používají hlavně v hematologii. 8. Objektivy s irisovou clonou. Některé velmi kvalitní objektivy mohou být opatřeny irisovou clonou, která má podobnou funkci jako u fotografických objektivů. Vliv zaclonění objektivu mikroskopu na hloubku ostré kresby je však vzhledem k malým pozorovacím vzdálenostem velmi omezený, irisová clona se používá hlavně k omezení světelného toku objektivem. Výstupní čočka objektivů s velkým zvětšením je při zaostření na preparát velmi blízko krycímu sklu a může dojít k mechanickému dotyku. Proto jsou objektivy s velkým zvětšením vybaveny pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Takovým objektivům se říká odpružené [9, E]. 3.3.2. Světelná mikroskopie Světelná mikroskopie umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do 2000 násobného zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě vzorků broušením a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce. Optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu včetně vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách. [15, 16, F] Světelné mikroskopii je vyhrazena především oblast od 0,2 – 10 µm. Využívá se hlavně bíle smíšené světlo v oblasti 400 – 700 nm. 3
Obr. 3. 20.: Schéma Abbeova kondenzoru při průchodu paprsků ve světlém a temném poli [F, O]. Vznik obrazu v mikroskopu je vysvětlen na základě Abbeova teorie, pomocí jevů, které jsou spjaty s působením předmětu na obraz světelného zdroje vytvářený objektivem. Předmětová rovina je prosvětlena rovnoběžným paprskovým svazkem, na který působí předmět jako plošná nepravidelná mřížka. Proto se v obrazové ohniskové rovině vytvoří obraz světelného zdroje, který je charakterizován řadou ohybových maxim a minim. Maxima jsou pak zdrojem sekundárního vlnění, tyto vlny pak spolu interferují a tvoří tak v obrazové rovině objektu obraz předmětu. Aby se např. světelným paprskům usnadnila cesta skrz vzorek do objektivu, používá se u větších zvětšení tzv. imerze - mezi krycím sklíčkem a objektivem není vzduch, ale např. speciální olej, který má stejný index lomu jako sklo. Světlo tak nemusí přestupovat z jednoho prostředí do druhého a do objektivu ho pronikne výrazně více. Metoda světlého pole Světelný kužel prochází (v procházejícím světle), nebo se odráží (v odrážejícím světle) a vstupuje do objektivu. Metoda temného pole (zástin) Osvětlovací soustava je upravena tak, že paprsky osvětlující preparát nevstupují do objektivu. Paprsky se odrážejí, lámou, rozptylují či ohýbají, pak vstupují do objektivu a na temném pozadí jsou patrné obrysy struktur preparátu. Je vyloučeno nulté maximum a na vytvoření obrazu se podílí boční ohybová maxima (viz obr.3. 20.). Výsledné kvalita pozorovaného objektu je dána zrakem, technická dokonalostí mikroskopu, ale také psychofyziologickou kondicí uživatele [9, 15, F]. 3.3.3. Mikroskopie fázového kontrastu V neobarvených preparátech živých tkání je fázový kontrast způsoben rozdílem indexu lomu pozadí a indexu lomu jednotlivých částí nebarevného preparátu. Jelikož nelze pozorovat přímo fázový kontrast, je nutné převést fázový kontrast na rozdíl v intenzitě světla nebo na rozdíl v barvě. K tomu slouží metoda fázového kontrastu. V optickém systému fázového kontrastu prochází světlo prstencem kondenzoru. Pomocí čtvrtvlnné destičky ve fázovém kroužku objektivu vzniká kontrast jako výsledek interference fázově posunutých paprsků přímého světla z pozadí a paprsků odchýlených ve vzorku (viz obr. 3. 21). Intenzita přímého 4
světla z pozadí je redukována pomocí neutrálního materiálu ve fázovém kroužku objektivu. Tím se zvyšuje kontrastní efekt. Bohužel je však při klasickém fázovém kontrastu kvalita obrazu snížena halací. Halace znamená vytváření nežádoucích světlých kroužků na okraji objektů. Tyto světlé kroužky jsou způsobeny velkým fázovým rozdílem. V klasickém fázovém kontrastu vzniká halace tam, kde je fázový rozdíl tak veliký, že dojde k pozitivní interferenci mezi světlem z pozadí a světlem ze vzorku. V takovém případě vzniká nežádoucí jasné světlo, protože odchýlené světlo má větší amplitudu, než světlo přímé. Index lomu (n) živých buněk, je obvykle 1,36 až 1,37. Budeme-li předpokládat kulové objekty, bude s rostoucí tloušťkou pozorovaných objektů růst fázový rozdíl a úhel difrakce bude menší. [9, 15, G].
Obr. 3. 21.: Optické schéma fázového kontrastu, halo efekt [H]. Pomocí apodizovaného fázového kontrastu pozorovat detaily uvnitř živých buněk. Toto je hlavní předností této metody [G]. Při pozorování silně lomivých objektů (kvasinek) vzniká tzv. halo efekt, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné, proto se zkoumají jen neobarvené vzorky. V některých případech je halo efekt žádoucí, protože při obrazové analýze se snadněji odliší zkoumaný objekt od rušivého prostředí. Objektivy firmy NIKON mají na jedné ze svých čoček mají nanesený neprůhledný fázový prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny, jsou to speciální ADL objektivy snižující vzniku halace. Na zvýšení kontrastu se užívá zelený interferenční filtr, který propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm. Oko má v této oblasti maximální citlivost [H]. 3.3.4. Polarizační mikroskopie Polarizační mikroskop je oproti běžnému biologickému mikroskopu vybaven polarizačním zařízením, které umožňuje studovat i ty vlastnosti minerálů, které nejsou patrné v obyčejném (nepolarizovaném světle) [CH]. Metoda využívá interakce polarizovaného světla s opticky anizotropními látkami, při které dochází k tzv. dvojlomu. Původní paprsek se po průchodu vzorkem rozdělí na dva nové, řádný a mimořádný, které jsou navzájem fázově posunuté (šíří se různou rychlostí) a kmitají v různých rovinách. 5
V analyzátoru mikroskopu se oba paprsky složí do stejné roviny kmitu a jejich fázový posun se projeví vznikem interferenčních barev. Polarizační mikroskopii lze proto charakterizovat jako metodu zvýšení kontrastu mikroskopického obrazu [I].
Obr. 3. 22.: Schéma polarizačního mikroskopu [I]. Polarizační mikroskop je kombinací světelného mikroskopu a polarimetru (viz obr. 3. 22.). V osvětlovací soustavě je zařazen polarizátor a za objektiv se dává analyzátor. Mikroskop je vybaven přesným úhlovým nastavením polarizátoru, analyzátoru a otočného stolku s preparátem. Tak je možné přesně odečíst úhel stáčení polarizovaného roviny světla v anizotropních částech preparátu. Tato mikroskopie se používá hlavně v mineralogii. V biologii je možné studovat některé anizotropní systémy např. příčně pruhovaný sval, buněčné stěny, jaderná membrána, dělící vřeténko atd. [9, 15, 16]. 3.3.4. Fluorescenční (luminiscenční) mikroskopie Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence) a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím světle se v současné době téměř nepoužívá. Podstatou fluorescence je buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny (fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové, nebo infračervené záření na odražené barevné viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), zde se jedná o primární luminiscenci, jiným je musíme dodávat specifickým barvením, jedná se o sekundární luminiscenci. Takové preparáty jsou často zdrojem viditelného záření pouze dočasně. Fluorochromy jsou sloučeniny schopné fluorescence. Navážou se na některou látku ve vzorku např. na DNA, a tím ji zviditelní. V mikroskopu pozorujeme vlastně pouze fluorochrom, který se však nachází jedině tam, kde je i námi zkoumaná látka. Pozorovaný obraz je vytvářen pouze světlem vyzářeným sledovanou látkou, obraz neruší nic dalšího. Můžou se studovat např. chromozomy, bílkoviny tvořící buněčnou kostru nebo organely, které by jinak nebylo možno odhalit 6
Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti UV a IR záření. Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového štítu. Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka, méně často halogenová žárovka. Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 220V/50H, obecně zvaný startér. Je umístěna v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle vyroben jako kostka, která se skládá z excitačního filtru, závěrného filtru a dichroického zrcadla. Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti excitačního a závěrného filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové. Princip fluorescenční mikroskopie je na obr. 3. 23.
Obr. 3. 23.: Principy a základní součásti fluorescenčního mikroskopu [K] Excitační filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především obvykle s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. Bariérový filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část [6, 9, 15, 17, 18, J]. 3.3.5. Konfokální mikroskopie Pomocí konfokálního mikroskopu se lze zbavit neostrostí v důsledku překrývání se zaostřeného obrazu s rozmazanými obrazy struktur, které se nacházejí mimo zaostřenou rovinu, což je obzvlášť rušivý jev při fluorescenční mikroskopii. Při konfokální mikroskopii je pozorovaný objekt osvětlen bodovým zdrojem, nejčastěji k tomu slouží laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek rovněž v podobě bodu. Stejný objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené a rozptýlené, případně fluorescenci. Při zpětném průchodu tohoto záření objektivem vznikne další obraz bodové clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič (viz obr. 3. 24.). V místě tohoto obrazu se nachází druhá konfokální bodová clonka, která blokuje detekci záření pocházejícího z míst vzorku mimo rovinu právě zaostřenou. Obraz celé této roviny získáme rastrováním bod po bodu.
7
Existují tři různé způsoby rastrování: 1. cestou rozmítání laserového paprsku 2. příčným posouváním vzorku před objektivem 3. posouváním objektivu před vzorkem Při rastrování je signál z fotonásobiče registrován počítačem spolu s informací o souřadnicích analyzovaných bodů. Celý soubor těchto dat je pak převeden na obraz pozorovaného vzorku. Tento obraz již díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje neostré pozadí mimofokálních oblastí vzorky. Konfokální obrazy jsou proto vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem [9, 15, K]. Mezi hlavní přednosti konfokální mikroskopie ve srovnání s klasickou optickou mikroskopií patří možnost zaznamenávat série digitalizovaných obrazů relativně tenkých optických řezů vedených i tlustším vzorkem, tloušťka optických řezů jsou pouhé desetiny mikronu [L].
Obr. 3. 24.: Princip konfokální mikroskopie [M]. Ze série optických řezů uložených v paměti počítače můžeme sestrojit trojrozměrný obraz studovaného objektu. Jednotlivé optické řezy však také můžeme přes sebe jednoduše přeložit. Pak uvidíme studovaný objekt zobrazený s hloubkou ostrosti, která je zcela mimo technické možnosti obyčejného mikroskopu [M]. 3.3.6. Mikroskopie v blízkém poli Během posledních dvou desetiletí se objevila řada konstrukčních řešení mikroskopů pro blízké pole. Z těchto mikroskopů jsou nejrozšířenější STM (skenující tunelová mikroskopie, Scanning Tunneling Microscopy), AFM (mikroskopie atomárních sil, Atomic Force Microscopy) a alternativy těchto dvou metod STOM (skenující tunelová optická mikroskopie, Scanning Tunneling Optical Microscopy), SNOM (skenující optická mikroskopie v blízkém poli, Scanning Near-field Optical Microscopy) a NSOM (skenující optická mikroskopie v blízkém poli, Near-field Scanning Optical Microscopy). 8
Blízké pole je oblast v okolí vzorku menším než je vlnová délka dopadajícího světla (řádově nm). Všechny tyto typy mikroskopů pracují s lokální sondou (viz obr. 3. 25.). Pracuje se ve dvou módech: 1. Reflexní mód - detekce se provádí prostřednictvím malého otvoru. 2. Transmisní mód - na detekci se užívá vlnovod registrující evanescentní vlny z blízké oblasti. Zkoumaný předmět může být osvětlen několika způsoby. Každý z těchto způsobů definuje jednu variantu mikroskopu. STOM Je charakterizován osvětlením pomocí úplného vnitřního odrazu. Je určen pro transparentní předměty. V současné době je nejužívanějším typem pro laboratorní experimenty. Detekovaná intenzita světelné evanescentní vlny exponenciálně klesá s rostoucí vzdáleností sondy od předmětu. SNOM Pracuje buď při osvětlení předmětu vnějším odrazem, kde sonda představuje buď současně vysílač i přijímač, nebo při vnějším šikmém osvětlení. Umožňuje analýzu všech typů předmětů, transparentních i netransparentních a má výhodu, že ve srovnání se STOM osvětlení izotropní. NSOM Pracuje pouze v transmisním režimu, hrot který má pouze funkci vysílače osvětluje předmět. V tomto případě je signál detekován ve vzdáleném poli, přičemž se používá spojná čočka jako kolektor.
Obr. 3. 25.: Schéma optických mikroskopů pracujících v blízkém poli. Chalkogenidová sonda s pozlacenou špičkou [N]. Hlavní prvky těchto mikroskopů jsou sonda (v praxi se užívají tři typy sond – optické vlákno, AFM hrot a kovový hrot), řídící systém a nanokolektor, nebo nanodetektor. Řádkování (v rozsahu několik nm – 110 µm) se uskutečňuje pomocí trojrozměrnému ohybu piezotrubičky, je-li na ni přiloženo vhodné napětí. Nanodetektor je většinou špičaté optické vlákno, jehož druhý konec je spojen se vzdáleným detektorem. Kolektor naruší pole jen velmi málo, aby se příliš nenarušilo chování evanescentního pole. Tím je tato analýza velice přesná a vysoce využívána. Elektronické zařízení je složeno z nízkošumových zesilovačů (pro 9
zesílení velmi slabého optického signálu od fotonásobiče), z ovládání piezoposuvů pro řádkování a přibližování sondy k povrchu vzorku. Velkou předností kterou nabízí optika blízkého pole je snadnost změny vlnové délky. Pro výběr jedné vlnové délky, nebo pro potlačení určitých pásem vlnových délek stačí jednoduchý interferenční filtr, nebo použití laditelného laseru. V optické mikroskopii s lokální sondou se užívají v principu dva způsoby detekce. První je režim konstantní výšky, spočívá v řádkování předmětu sondou jejíž hrot má konstantní vzdálenost od určité vztažné roviny z. Sonda detekuje rozložení intenzity světla ve vztažné rovině nad povrchem vzorku. Druhý, režim konstantního proudu spočívá v nastavení sondy tak, že zpětná vazba řídící elektroniky udržuje hrot sondy v konstantní vzdálenosti od povrchu předmětu. Registrovaným signálem je elektrické napětí na ovládací piezoelektronice, což je přímo spojeno s polohou sondy detektoru. Nevýhodou je nemožnost oddělit topografický obraz od optického. Tato mikroskopie se používá ke zkoumání charakteristik propustných i odrazných předmětů za pokojové teploty a normálního tlaku (výhoda před elektronovou mikroskopií, kde je nutné užívat absolutně vysušené vzorky ve vakuu), k lokální diagnostice polovodičových struktur, nanolitografie, studium povrchových plazmonů, a pro biologické aplikace, což se teprve začíná rozvíjet (speciální úprava AFM, raménka plně ponořená do kapaliny). Nejdůležitější argument pro užití této metody je schopnost blízkého pole překonat hranici rozlišovací schopnosti klasických optických zařízení a tím získat vysoké rozlišení, které není možno v žádném případě dosáhnout s konvenčními optickými přístroji [15, 17, 18, 24, N].
10
