1. Bevezetés Integrinek, Fc-receptorok és G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének mechanizmusa neutrofil granulocitákban Doktori tézisek Dr. Jakus Zoltán Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
A neutrofil granulocitáknak fontos szerepük van a kórokozók
elpusztításában,
valamint számos autoimmun
betegség patogenezisében. A szabadgyök-termelés és a degranuláció
folyamata
együttesen
vezet
a
kórokozók
pusztulásához a neutrofilek antibakteriális funkciói során. A sejtek aktivációja több különböző receptor közvetítésével valósul meg. Ph.D. munkámban az integrinek, az Fc-receptorok és
a
G-fehérje-kapcsolt
receptorok
jelátvitelének
mechanizmusát vizsgáltam neutofilekben. A
gyulladásos
környezetben
létrejövő
neutrofil-
aktiválódáshoz mind integrin, mind nem-integrin receptorok Témavezető: Dr. Mócsai Attila Dr. Ligeti Erzsébet Hivatalos bírálók: Dr. Kacskovics Imre Dr. Csala Miklós Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Faragó Anna Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Enyedi Péter Dr. Madarász Emília Budapest 2006.
szükségesek. Korábbi elképzelések szerint a nem-integrin szignálok kizárólag az integrinek ligandkötő képességének növeléséhez szükségesek, a tényleges sejtválaszokat az integrinek ligandkötést követő keresztkötése önmagában váltja ki (tehát a két szignál között alá-fölérendeltségi viszony van). Ez az elképzelés azon a megfigyelésen alapszik, hogy antiintegrin antitestekkel történő stimuláció a neutrofilek teljes aktiválódását hozza létre, arra utalva, hogy az integrinek keresztkötése önmagában is elégséges a neutrofilek teljes aktiválódásához. Kísérleteink első részében arra kerestük a
választ, hogy hogyan valósul meg a neutrofilek adhézió-függő
2. Célkitűzések
aktivációja, milyen az integrin és nem-integrin szignálok relatív hozzájárulása a sejtválaszok létrejöttéhez, ezen szignálok milyen viszonyban állnak egymással. Az opszonizált kórokozók elpusztításában és számos autoimmun kórfolyamat patogenezisében lényeges szerepet tölt be a neutrofilek Fcγ-receptorokon keresztüli stimulációja. Az autoimmun
kórfolyamatokban
létrejövő
szövetkárosodás
jelentős hányadáért a neutrofilek felelősek. Neutrofilekben az Fc-receptorok
jelátvitelének
mechanizmusa
kísérleteink
kezdete előtt ismeretlen volt. Kísérleteim második részében az Fc-receptorok jelátvitelét vizsgáltam neutrofil granulocitákban. Témavezetőim
korábban
széles
specificitással
rendelkező gátlószerek felhasználásával igazolták, hogy tirozinkinázok szerepet játszanak a neutrofilek fMLP-vel indukált, Gfehérje-kapcsolt
receptorok
közvetítésével
megvalósuló
effektor válaszaiban. Munkánk kezdetén azonban nem volt tisztázott, hogy mely kinázjelpályák vesznek részt az fMLP hatására kialakuló sejtválaszokban. Ph.D.-munkám harmadik részében a különböző tirozin-kináz jelátviteli utak szerepét vizsgáltam a neutrofilek G-fehérje-kapcsolt receptorainak működésében.
Kísérleteinkben neutrofil granulocitákban vizsgáltuk, hogy: 1., milyen az integrin és a nem-integrin szignálok egymáshoz való viszonya az adhézió-függő aktiváció során: elégséges-e az integrinek
keresztkötése
a
neutrofilek
maximális
aktiválódásához 2., milyen jelátviteli folyamatokon keresztül valósul meg az Fcreceptorok működése 3., mi a jelentőségük az Src-típusú tirozin-kinázoknak, a MAPkinázoknak, illetve a Syk tirozin-kináznak a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében
Adhézió meghatározása: A neutrofileket adhéziós felszínen
3. Módszerek
stimuláltuk, majd a szuszpenzióban maradt sejtek eltávolítása Kísérleti állatok, csontvelő-kimérák: Fc-receptor γ-lánc; Fcγreceptor III; Hck/Fgr/Lyn és Syk hiányos egereket használtunk kísérleteinkben. A Syk tirozin-kináz jelátvitelben betöltött szerepének vizsgálata speciális megközelítést igényelt, mivel a syk–/– egerek perinatálisan elpusztulnak. A fenti problémát úgy oldottuk meg, hogy csontvelő-kimérákat hoztunk létre Syk–/– embriók májának felhasználásával, ezen kimérákból származó Syk–/– neutrofileket vizsgáltuk kísérleteinkben. A neutrofilek preparálása: Az egér neutrofileket csontvelőből, a humán neutrofileket önkéntesek vénás véréből izoláltuk gradiensen történő centrifugálással. A
neutrofilek
stimulálása:
A
adherens
neutrofileket
immbobilizált anti-integrin antitestekkel, fibrinogén vagy rekombináns ICAM-1 felszínen TNF-fel, vagy felülethez rögzített immunkomplexekkel aktiváltuk. Szuszpenzióban Gfehérje-kapcsolt
receptorok
agonistáival
(fMLP,
MIP-2)
stimuláltunk. Szuperoxid-termelés termelését detektáltuk.
citokróm
mérése: c
A
redukció
neutrofilek alapján
szuperoxidfotométerrel
után az adott felszínhez tapadt sejtek arányát savas foszfatáz tartalmuk fotometriás detektálásával határoztuk meg. Degranuláció mérése: Az aktivált neutrofilek felülúszójából mértük az egyes granulumok ürítésének markereit. A primer granulummarker β-glukuronidáz exocitózisát fluorimetriás enzimaktivitás-méréssel,
a
szekunder
granulummarker
laktoferrin és a szekretoros vezikula marker humán szérum albumin leadását ELISA technikával mértük. Áramlási citometria: A sejtfelszíni fehérjék kifejeződését áramlási citometriával vizsgáltuk. Kalciumjel meghatározása: A kalciumjelet FURA-2 festék segítségével fluorimetriásan detektáltuk. Jelátviteli folyamatok vizsgálata: Stimulálást követően a neutrofilekből triton alapú lízis puffer felhasználásával lizátumot készítettük. Immunoprecipitációt követű immunoblot módszerrel mutattuk ki a Syk foszforilációját. Az Fc-receptor γlánc foszforilációját GST-Syk(SH2)2-vel végzett precipitációs kísérletekben határoztuk meg. Továbbá immunoblot technikát használtunk a p38 és az ERK MAP-kináz aktivációjának, és a tirozin foszforiláció detektálásához.
egerek
4. Eredmények és következtetések
és
egy
újonnan
beállított
stimulálási
rendszer
segítségével kimutattuk, hogy az Fc-receptorokat aktiváló Ph.D.
dolgozatomban
folyamatainak
a
feltérképezésével
neutrofilek
immunkomplexek
által
kiváltott
neutrofil-válaszokhoz
munkánkat
elengedhetetlenek az Src-típusú tirozin-kinázok, az Fc-receptor
ismertettem. Karakterizáltam az anti-integrin antitestek hatására
γ-lánc, a Syk, valamint az ERK és a p38 MAP-kinázok.
létrejövő
Eredményeink alapján ezen fehérjék egy olyan jelpályába
válaszokat,
az
kapcsolatos
jelátviteli
adhézió-függő
stimuláció
mechanizmusát, az Fc-receptorok jelátviteli folyamatait, illetve
illeszthetők,
a kinázok szerepét a G-fehérje-kapcsolt receptorokon keresztül
foszforilálják az Fc-receptor γ-lánc ITAM-tirozinjait, ami a Syk
indukált effektor funkciókban.
kihorgonyzódásához, illetve az ERK és a p38 MAP-kináz
Ph.D.-munkám első részében génhiányos (knockout) egerek,
következményes aktiválódásához vezet.
gátló antitestek és Fab antitest-fragmentumok felhasználásával
Ph.D.-munkám harmadik részében a különböző tirozin-kináz
kimutattuk, hogy az anti-integrin antitestek által kiváltott
jelátviteli utak szerepét vizsgáltam a neutrofilek G-fehérje-
neutrofil-válaszokhoz elengedhetetlenek az alacsony affinitású
kapcsolt
Fcγ-receptorok is. Ezen eredményeink kétségessé tették azt a
génhiányos (knockout) egerek segítségével kimutattuk, hogy a
korábbi
keresztkötése
bakteriális tripeptid fMLP hatására létrejövő degranulációs
önmagában is elégséges a neutrofilek teljes aktiválásához, és
folyamatokban elengedhetetlen szerepe van az Src-kinázok
egyben az integrin és nem-integrin szignálok mellérendeltségét
közvetítésével aktiválódó p38 MAP-kináznak. Syk-hiányos
valószínűsítették. Kimutattuk továbbá, hogy a különböző (TNF,
neutrofilek alkalmazásával megcáfoltuk viszont azon korábbi
Fc-receptor) nem-integrin szignálok egymást helyettesíthetik,
feltételezéseket, melyek szerint a Syk központi szerepet töltene
és
be a G-fehérje-kapcsolt (pl. fMLP, kemokin) receptorok
elképzelést,
feltételezhetően
hogy
a
p38
az
integrinek
MAP-kináz
aktiválásában
melyben
receptorainak
az
Src-típusú
működésében.
tirozin-kinázok
Gátlószerek
és
konvergálnak.
jelátvitelében.
Kísérleteim második részében az Fc-receptorok jelátvitelét
Eredményeink fontos segítséget jelentenek az immunrendszer
vizsgáltam neutrofil granulocitákban. Génhiányos (knockout)
működésének
megértéséhez.
Az
általunk
feltérképezett
jelátviteli utak komponensei új támadáspontjai lehetnek az
5. Saját közlemények jegyzéke
autoimmun betegségek gyógyszeres kezelésének. I. Jakus Z, Berton G, Ligeti E, Lowell CA and Mócsai A. Responses of neutrophils to anti-integrin antibodies depends on costimulation through low affinity FcγRs: full activation requires both integrin and nonintegrin signals. J Immunol. 2004 Aug 1;173(3):2068-77. IF: 6,486 II. Mócsai A, Jakus Z, Vantus T, Berton G, Lowell CA, Ligeti E. Kinase pathways in chemoattractant-induced degranulation of neutrophils: the role of p38 mitogen-activated protein kinase activated by Src family kinases. J Immunol. 2000 Apr 15;164(8):4321-31. IF: 6,834 III. Mócsai A, Zhang H, Jakus Z, Kitaura J, Kawakami T and Lowell CA. G-protein-coupled receptor signaling in Syk-deficient neutrophils and mast cells. Blood. 2003 May 15;101(10):4155-63. IF: 10,12 IV. Fodor Sz, Jakus Z and Mócsai A. ITAM-based Signaling beyond the Adaptive Immune Response Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):29-37. IF: 2,136
