Integrinek, Fc-receptorok és G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének mechanizmusa neutrofil granulocitákban

Integrinek, Fc-receptorok és G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének mechanizmusa neutrofil granulocitákban Doktori értekezés

Dr. Jakus Zoltán

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezetők: Dr. Mócsai Attila Dr. Ligeti Erzsébet Hivatalos bírálók: Dr. Kacskovics Imre Dr. Csala Miklós Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Faragó Anna Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Enyedi Péter Dr. Madarász Emília

Budapest 2006.

1. Tartalomjegyzék 1. TARTALOMJEGYZÉK ........................................................................................... 2 2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK............................................................................................. 4 3. IRODALMI HÁTTÉR ............................................................................................... 6 3.1. A neutrofil granulociták szerepe az immunrendszer működésében ................................ 6 3.2. Az integrinek szerepe a neutofilek működésében .......................................................... 11 3.3. Az adhézió-függő folyamatok vizsgálata a neutrofilek működésében ........................... 12 3.4. Az Fc-receptorok jelátvitele .......................................................................................... 16 3.5. Kinázok szerepe a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében.................................. 20

4. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................... 22 5. MÓDSZEREK .......................................................................................................... 23 5.1. A munkánk során használt kísérleti állatok; csontvelő-kimérák létrehozása................ 23 5.2. A kísérleteinkben alkalmazott monoklonális antitestek................................................. 25 5.3. A neutrofil granulociták preparálása, a funkcionális vizsgálatok körülményei ........... 27 5.4. A neutrofileket aktiváló immobilizált monoklonális antitest, integrin-ligand és immunkomplex felszínek kialakítása .................................................................................... 28 5.5. A neutrofilek szuperoxid-termelésének meghatározása ................................................ 29 5.6. A neutrofilek felszínhez történő adhéziójának meghatározása ..................................... 30 5.7. A degranulációs folyamatok mérése humán és egér neutrofilekben ............................. 31 5.8. A sejtfelszíni fehérjék kifejeződésének vizsgálata áramlási citometriával .................... 33 5.9. Kalcium-jel mérése egér neutrofilekben ....................................................................... 33 5.10. Az intracelluláris jelátviteli folyamatok vizsgálata..................................................... 34 5.11. A neutrofilek stimulálása TNF-fel és Fcγ-receptorokon keresztül szuszpenzióban .... 35 5.12. Az értekezésben bemutatott eredmények prezentációja .............................................. 35

6. EREDMÉNYEK ....................................................................................................... 37 6.1. INTEGRIN- ÉS NEM-INTEGRIN SZIGNÁLOK SZEREPE A NEUTROFILEK AKTIVÁLÁSÁBAN ........... 37 6.1.1. Az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszok jellemzése ....................................... 37 6.1.2. Az Fc-receptor γ-lánc szerepe az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszokban .. 39 6.1.3. Az FcγRIII szerepe az integrin ellenes antitestekkel indukált válaszokban ............... 40 6.1.4. Az anti-integrin antitestek Fc részének jelentősége a válaszokban............................ 43 6.1.5. Az Fcγ-receptorok blokkolásának hatása az effektor funkciókra............................... 44 6.1.6. A "klasszikus" adherens aktivációban nem vesznek részt az Fcγ-receptorok ............ 47 6.1.7. A károsodott szuperoxid-termelés helyreállítható FcγR3–/– neutrofilekben ............... 48 6.1.8. A p38 MAP-kináz szerepe a nem-integrin szignálok kialakulásában ........................ 49 6.2. AZ FC-RECEPTOROK JELÁTVITELE NEUTROFIL GRANULOCITÁKBAN .................................... 52 6.2.1. Az immobilizált immunkomplex stimulus erősen aktiválja a neutrofileket ................ 52 6.2.2. Az Fc-receptor γ-lánc, az Src-típusú kinázok és a Syk szerepe az immunkomplex stimulálás hatására kialakuló válaszokban ......................................................................... 53 6.2.3. A Syk foszforilációja Src-kinázok és az Fc-receptor γ-lánc hiányában ..................... 54 6.2.4. Az Fc-receptor γ-lánc foszforilációja......................................................................... 55 6.2.5. MAP-kinázok az immunkomplexek jelátvitelében neutrofilekben .............................. 58 6.3. KINÁZOK SZEREPE A G-FEHÉRJE-KAPCSOLT RECEPTOROK JELÁTVITELÉBEN....................... 60 6.3.1. Az Src-típusú tirozin-kinázok szerepe a degranulációs folyamatokban..................... 60 6.3.2. A MAP-kinázok szerepe az fMLP-kiváltotta degranulációban .................................. 61

2

6.3.3. A Syk nem játszik szerepet az fMLP hatására létrejövő degranulációban ................ 63 6.3.4. A Syk nem szükséges az fMLP-vel és MIP-2-vel indukált jelátviteli folyamatokhoz.. 64

7. MEGBESZÉLÉS ...................................................................................................... 66 8. KÖVETKEZTETÉSEK........................................................................................... 75 9. ÖSSZEFOGLALÓ ................................................................................................... 76 10. SUMMARY............................................................................................................. 77 11. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................ 78 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ............................................................. 91 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................ 92

3

2. Rövidítésjegyzék ADCC

Antigén-függő sejtmediált citotoxicitás

BCR

B limfocita receptor

β-Glu

β-glukuronidáz

CB

Citokalazin B

CD11a

αL integrin lánc

CD11b

αM integrin lánc

CD18

β2 integrin lánc

CD49d

α4 integrin lánc

CD61

β1 integrin lánc

CGD

Krónikus granulomatózis

ELISA

Enzim-kötött immunszorbens meghatározás

FcRγ∗

Fc-receptor γ-lánc

FcγR*

Fcγ-receptor

FCS

Magzati borjúszérum

Fgr

Gardner-Rasheed macskaszarkóma-vírus kináz

fMLP

formil-Met-Leu-Phe

G-CSF

Granulocita kolónia-stimuláló faktor

GM-CSF

Granulocita-monocita kolónia-stimuláló faktor

GPI

Glikozil-foszfatidil-inozitol

Hck

Hemopoetikus-sejt kináz

HSA

Humán szérum albumin

IC

Immunkomplex

ICAM-1

Intercelluláris adhéziós molekula 1

IgG

Immunoglobulin G

IL-8

Interleukin 8

ITAM

Immunoreceptorok tirozin-alapú aktivációs motívuma

* Vigyázat: Az Fcγ-receptorok (FcγR) és az Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) rövidítése hasonló

4

kDa

Kilodalton

KO

Knockout

LAD

Leukocita adhéziós defektus

LFA-1

Limfocita funkcióval asszociált antigén (CD11a/CD18; αLβ2)

Lfr

Laktoferrin

LPS

Lipopoliszacharid

LTB4

Leukotrién B4

Lyn

Yamaguchi szarkóma-vírus kináz

Mac-1

Makrofág differenciációs antigén (CD11b/CD18; CR3)

MAP-kináz

Mitogén-aktivált protein-kináz

M-CSF

Monocita kolónia-stimuláló faktor

MIP-2

Makrofág inflammatorikus protein 2

NADPH-oxidáz

Nikotinsavamid-adenin-dinukeotid-foszfát-oxidáz

NK sejtek

Természetes ölő sejtek

OVA

Ovalbumin

PAF

Trombocita aktiváló faktor

PMA

Forbol-12-mirisztát-13-acetát

RANK

NF-κB receptor aktivátora

SH2

Src homológia domén 2

Src

Madárszarkóma-vírus-kináz

Syk

Lép tirozin-kináz

TCR

T limfocita receptor

TNF

Tumornekrózis faktor α

VT

Vad típusú

ZAP-70

ζ-lánc asszociált protein-kináz 70

5

3. Irodalmi háttér 3.1. A neutrofil granulociták szerepe az immunrendszer működésében A neutrofil granulociták fontos szerepet játszanak az immunrendszer működésében [1-3], így a kórokozók elleni védekezésben. A neutrofilek az immunrendszer

legkorábban

aktiválódó

sejtes

elemét

képezik

a

szervezet

antimikrobiális folyamatai során, a fehérvérsejtek közül elsőként jutnak a kórokozók behatolásának helyére, és próbálják azokat elpusztítani, valamint szaporodásukat gátolni. A vérpályában keringő érett neutrofil granulociták több lépésen keresztül jutnak el az elpusztítandó mikroorganizmusokhoz, melyeket számos párhuzamosan aktiválódó mechanizmus segítségével próbálnak eliminálni. A granulociták a keringésben csupán 10-12 órát töltenek. A neutrofilek a veleszületett (aspecifikus) immunitás alapvető elemét képezik, amely nem antigénspecifikus, nem rendelkezik memóriával és lineárisan erősített. A veleszületett immunitás lényeges szerepét emeli ki az immunvédekezésben, hogy a limfoid sejtekre épülő szerzett (specifikus) immunitás a törzsfejlődés során csak viszonylag későn, a halaknál jelent meg az élővilágban. A vérrel sodródó neutrofil nyugalmi (kórokozóktól mentes), tehát „steril” körülmények között gyakorlatilag nem lép kölcsönhatásba a környező, nyugalomban lévő endotélsejtekkel. Ezzel szemben fertőzés kialakulása esetén a szöveti gyulladás részfolyamataként a környező szövetek érendotéljének gyulladásos átalakulása zajlik le. A vérben sodródó neutrofil felismeri a gyulladásos endotélt, szelektineken keresztül reverzibilis kölcsönhatásokat képez annak sejtjeivel, átmenetileg letapad, rövid szakaszon az endotél felszínén gördül tovább. A gyulladásos endotél a bakteriális termékekkel és a gyulladásos mediátorokkal együtt a neutrofil működésének jelentős változását hozza létre. A változás először (a degranuláció során) jelátvivő receptoroknak és adhéziós fehérjéknek nagy számban a sejtfelszínen való megjelenésében nyilvánul meg, miáltal az eddig nyugvó neutrofil a környezet ingereire különösen érzékeny sejtté alakul át. A folyamatot szenzitizációnak nevezzük. A plazmamembránban megjelenő adhéziós receptorok az integrinek családjába tartozó molekulák. A továbbra is fennálló ingerlés hatására az integrin

6

fehérjéken keresztül a granulocita tartósan kitapad az endotélsejtekhez. Ezt követően az aktinhálózat, a citoszkeleton átrendeződése révén rásimul az endotél felszínére, tehát kialakul a sejt szétterülése. A neutrofil ezután átkúszik az endotélsejtek között a szövetközti térbe (diapedezis), majd a környező sejtközti állomány lebontása útján, a gyulladásos mediátorok grádiensének (mint kemotaktikus ingernek) megfelelően a kórokozók behatolásának helye felé vándorol. Ezen folyamatok szintén adhézió-függőek. A vándorlás során, majd leginkább a gyulladásos góc területén a sejt a baktériumok működését és szaporodását gátló anyagokat ürít a sejtközötti térbe. Az opszonizált patogéneket elérve a neutrofil bekebelezi azokat (a folyamatban lényeges szerepet töltenek be az Fc-receptorok), majd a fagoszóma terén belül (szabadgyökök és lizoszómális enzimek segítségével) a kórokozót elpusztítja (1. ábra).

1. ábra A neutrofil granulociták működése

A szabadgyök-termelés és a degranuláció folyamata együttesen vezet a kórokozók pusztulásához a neutrofilek antibakteriális funkciói során. A szuperoxidtermelés a plazma- és fagoszóma-mebránban található NADPH-oxidáz enzimrendszer aktiválódásán keresztül jön létre, melynek egyes komponensei a stimuláció hatására

7

tevődnek át a citoszólból a sejtmembránba. A NADPH-oxidáz a szuperoxid-anion keletkezését katalizálja, amely további erősen toxikus termékekké alakulhat (hidrogénperoxid, hipoklórsav-anion). A degranuláció során ürülő fehérjék a neutrofilek intracelluláris granulumai és szekretoros vezikulái mátrixában és membránjában helyezkednek el (a nagyszámú granulum jelenléte okozza a neutrofilek fény- és elektronmikroszkópos képen jól látható jellegzetes szemcsézettségét, ami alapján granulocitáknak nevezik őket). A granulumokból és a szekretoros vezikulákból bakteriosztatikus hatású fehérjék és hidrolitikus enzimek kerülnek leadásra a fagoszómába vagy a külső térbe. A sejt az aktiválódása során szigorú sorrendben üríti ki a granulumok és a szekretoros vezikulák tartalmát. A degranuláció és a szuperoxidtermelés egymással szoros kapcsolatban van: az egyes granulumok ürítése jelentős mértékben

hozzájárul

a

NADPH-oxidáz

membrán-kötött

komponenseinek

a

fagoszómamembránba vagy a plazmamembránba való kihelyeződéséhez. Bár a NADPH-oxidáznak a kórokozók elpusztításában betöltött szerepe régóta ismert volt, hosszú ideig a keletkezett toxikus szabadgyököket tartották a NADPHoxidáz részvételével történő baktériumölés egyedüli lényeges szereplőinek [4]. Újabb tanulmányok szerint azonban a NADPH-oxidáz hatására kialakuló depolarizáció káliumionokat hajt a fagoszómába, amelyek felszabadítják a gátlás alól az addig inaktív proteolitikus enzimeket [5, 6]. Ezen elképzelés szerint tehát a NADPH-oxidáznak az lenne a szerepe, hogy hajtóerőt biztosítson a granulum-enzimek aktiválódásához szükséges káliumionok transzportjához. Rada és munkatársai szerint a fenti két mechanizmus egymással párhuzamosan működik: alacsonyabb NADPH-oxidáz aktivitás inkább a káliumionok hajtóerejét befolyásolja, míg az enzim magasabb aktivitása már jelentős kémiai toxicitást is eredményez [7]. A granulumok a neutrofilek exocitotikus működése (degranulációja) során a plazmamembránnal vagy a fagoszóma-membránnal fúzionálnak, ebből következően a granulumok belső terének (mátrixának) tartalma vagy az extracelluláris térbe, vagy a fagoszómába ürül. A granulumok mátrixának falában megtalálható membránfehérjék áttevődése is fontos eleme a neutrofilek degranulációjának (például adhéziós receptorok, a NADPH-oxidáz komponensei).

8

Irodalmi adatok alapján a neutrofilek exocitotikus kompartmentjeit négy fő csoportba

sorolhatjuk:

primer

(azurofil)

granulumok,

szekunder

(specifikus)

granulumok, zselatináz (tercier) granulumok, valamint szekretoros vezikulák [8, 9] A primer granulumok lizoszóma-szerűek, hidrolitikus enzimeket tartalmaznak, amelyek jellegzetes alkotóeleme a szabadgyök-termelésben részt vevő mieloperoxidáz, ezért peroxidáz-pozitív granulumoknak is nevezik őket. A primer granulumok a szervezetben gyakorlatilag kizárólag a fagoszómába ürülnek, és a bekebelezett mikroorganizmusok emésztésében, elpusztításában játszanak fontos szerepet. A szekunder granulum-populáció elsősorban olyan antibakteriális hatású fehérjéket tartalmaz, melyek a környező szövetekre kevésbé káros hatásúak, mint a primer granulumok hidrolitikus enzimei. Ez összhangban van azzal, hogy a szekunder granulumok nem csupán a fagoszómába, de a gyulladásos góc közelében a sejtközti térbe is ürülnek, ezáltal is gátolva a baktériumok szaporodását. Ezen granulumok falában jelen van továbbá a szabadgyököt termelő NADPH-oxidáz enzimkomplex több komponense, mely az exocitózis során a plazmamembránba vagy a fagoszóma membránjába helyeződik át. A zselatináz vagy tercier granulumok legfontosabb alkotórésze a mátrixukban található zselatináz, mely a diapedezis során a külső térbe ürülve valószínűleg lényeges szerepet tölt be az érfal bazális membránját alkotó kollagén lebontásában, ezáltal a neutrofilnek az extravazális térbe való, illetve azon belüli vándorlásában. A szekretoros vezikulák esetén a neutrofil-aktiválódás első lépéseiben alapvető szerepet játszó sejtorganellumokkal állunk szemben: a szekretoros vezikulák membránjából a plazmamembránba áttevődő szignalizációs receptorok és adhéziós fehérjék fontosak a neutrofilnek a gyulladásos endotélhez való letapadásában és a szenzitizáció folyamatában. Számos különböző receptor irányából érkező inger jelentős szerepet tölt be a neutrofil granulociták aktiválásában, a korábban ismertetett effektor funkciók kiváltásában. Stimulusként hat a leukocitákra heterotrimer G-fehérje-kapcsolt receptoron keresztül az fMLP, a PAF, az IL-8, a C5a, az LTB4, a MIP-1α, a MIP-2; citokin receptorok közvetítésével a TNF, a GM-CSF, a G-CSF; adhéziós molekulák közül az integrinek; Fc-receptorok által mediált módon immunkomplexek és

9

opszonizált kórokozók; mintázat felismerő receptorokon keresztül LPS és egyéb Tolllike receptor ligandok. Számos öröklött betegség ismert, amelyben a neutrofilek patogénellenes rendszerének egyes komponensei károsodnak, ezáltal súlyos immunhiányos állapotok alakulnak ki. A legismertebb, széles körben vizsgált ilyen betegség a krónikus granulomatózis (CGD), melyben a NADPH-oxidáz komponenseinek a genetikai eredetű hiánya vezet a folyamatosan fennálló, rendszeres infekciók jelenlétéhez [10, 11]. Chediak-Higashi szindrómában a lizoszómális rendszer, a granulumok károsodnak a neutrofilekben [12]. Az adhéziós receptorok (integrinek) hiányából eredő leukocita adhéziós defektust (LAD; ld. később) is leírták [13, 14]. Ezen betegség súlyos fertőzéseket (baktériumok, gombák, vírusok, paraziták által) eredményez már a gyermekkorban,

és

általában

korai

letalitást

hoz

létre,

amelyet

(a

csontvelőtranszplantáción kívül) csak antibiotikum profilaxissal lehet megelőzni, késleltetni. Léteznek olyan kórfolyamatok (ellentétben a fent ismertetett betegségekkel), amelyek esetén a neutrofilek fokozott aktivációja okoz jelentős szövetkárosodást, így számos autoimmun betegségben (pédául a rheumatoid arthritis, a glomerulonephritis és a gyulladásos bélbetegségek), ahol felületekhez rögzült immunkomplexek stimulálják a neutrofileket [15]. Myocardiális ischemia esetén a reperfúzió hatására kialakuló szívizomelhalás mértéke jelentősen csökkenthető a neutrofilek felszaporodásának, illetve adhéziójának gátlásával [16]. Cerebrális ischaemia-reperfúzió kapcsán, valamint a legtöbb akut és krónikus vesebetegségekben (például diabeteses nephropathiában) szintén

lényeges

tényező

a

neutrofilek

aktivációjának

hatására

kialakuló

szövetkárosodás [17-19]. A fenti adatok alapján kijelenthetjük, hogy nagyon fontos feladat a neutrofilek működésének pontos megismerése, az egyes aktiváló receptorok irányából induló jelátviteli utak feltérképezése, hiszen ezáltal lehetőség nyílhat számos kóros állapot befolyásolására, illetve gyógyszeres terápiájára. Ph.D. munkám során az integrinek, az Fc-receptorok és a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének mechanizmusát vizsgáltam neutrofil granulocitákban.

10

3.2. Az integrinek szerepe a neutofilek működésében A legtöbb emlőssejt felszínén megtalálhatók adhéziós molekulák, így integrinek. Az integrinek hetetrodimer transzmembrán proteinek, amelyek egy α és egy β láncból épülnek fel. A sejtek felszínén bizonyos α lánc csak bizonyos β lánccal tud párt alkotni. Jelenleg tizennyolc különböző α láncot és nyolc β láncot ismerünk, ezek kombinációiból összesen huszonnégy különböző α/β heterodimer jöhet létre (egy adott α lánc csak bizonyos β lánccal alkothat párt) [20]. Régen azt gondolták, hogy az integrinek kizárólag úgynevezett „molekuláris ragasztóként” működnek a sejt-sejt, illetve sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatokban. Azonban bebizonyosodott, hogy az integrinek aktívan indukálnak különféle jelátviteli folyamatokat is. Már régen ismert volt, hogy normál sejtek növekedési faktorok jelenlétében csak letapadva képesek megfelelő módon növekedni, ellentétben a daganatos átalakuláson átesett sejtekkel, amelyek jól fenntarthatók szuszpenzióban is [21, 22]. A daganatképződés során egyes onkogének specifikusan az integrin-független sejtnövekedést teszik lehetővé, miközben a növekedési faktoroktól való függés megmarad [23]. Integrineken keresztül adhéziófüggő módon citoszkeleton átrendeződés, génexpresszió szabályozás és a sejtek differenciációja jön létre, valamint számos jelpálya aktiválódik. Az integrineknek nincs enzimaktivitása,

másodlagos

mechanizmusokon

keresztül

szignalizálnak.

Az

integrineknek jelentős szerepet töltenek be szinte valamennyi emlőssejt működésében. Amint már korábban utaltam rá, a neutrofilek életciklusának, különösen aktív működéseinek legnagyobb része más sejtekkel vagy az extracelluláris mátrixszal kialakított adhéziós kapcsolat jelenlétében zajlik (így az endotél sejtekhez történő tapadás, a gyulladásos góc felé vándorlás). Az adhéziós folyamatok jelentőségét jól mutatják azon öröklött genetikai betegségek, amelyekben a neutrofilek aktivációja károsodik az integrinek (vagy egyéb sejtadhéziós molekulák) hiánya vagy működésének zavara miatt. Ennek a funkcionális károsodásnak a következtében gyakran fatális fertőzések alakulnak ki a betegekben. Leukocita adhéziós defektusokban (LAD) károsodott a neutrofilek érfalon keresztüli vándorlása, ezért lényegében nincs gennyképződés. A betegségre jellemző, hogy magas a keringő leukociták száma az érpályában. Ennek az a magyarázata, hogy a leukociták a sejtadhézió zavara miatt nem tudnak kilépni az érrendszerből, illetve hogy nagyobb mértékben is képződnek a

11

folyamatosan fennálló fertőzések miatt. LAD-I-ben szenvedő betegekben súlyos betegség jön létre a β2 integrinek kifejezésének teljes hiánya miatt [13, 14]. Eddig körülbelül 200 LAD-I-es beteget találtak. LAD-II esetén a fukozilált szelektin-ligandok (például szialil Lewis X glikán) hiánya okozza a LAD-I-hez nagyon hasonló tüneteket [24]. Létezik egy harmadik kórfolyamat (LAD-III), amely szintén hajlamosít fertőzések kialakulására: ekkor több integrincsalád (β1, β2, β3) együttes működési zavara áll fenn, megtartott azonban az integrinek sejtfelszíni expressziója. Feltehetően LAD-III-ban az integrinek ligandjaikhoz való kötődésének szabályozása károsodott, a betegség kialakulásának pontos molekuláris mechanizmusa nem ismert, valószínűleg a Ran kis GTP-kötő fehérje működése nem megfelelő [25]. Leírták a LAD-I állatmodelljét, amely lehetővé tette a β2 integrinek vizsgálatát génhiányos egerekben [26]. Genetikailag β2 integrin hiányos egerek sokkal hajlamosabbak fertőzésekre mint vad típusú társaik, azonban a LAD-I-es egyének infekcióra való hajlamával összevetve a kialakuló fertőzések kevésbé súlyosak [26]. Léteznek irodalmi adatok amelyek arra utalnak, hogy meglepő módon β2 integrin knockout egér neutrofilekben nem szenved zavart a neutrofilek transzendoteliális migrációja [27]. A fenti eredményekkel ellentétben témavezetőm és munkatársai szigorúan kontrollált kísérletekben kimutatták, hogy β2 integrinek hiányában nagymértékben károsodik a neutrofileknek az érpályából a gyulladásos góc felé történő vándorlása [28]. Megegyező következtetésre jutottak (vagyis a neutrofilek vándorlása zavart volt), ha az endotélsejtek felszínen megtalálható intercelluláris adhéziós molekula 1 (ICAM-1) knockout egerekben vizsgálták a folyamatot, vagy ha ICAM-1-et vagy β2 integrineket blokkoló antitesteket juttattak a kísérleti állatok keringésébe a migráció vizsgálata előtt [29, 30]. 3.3. Az adhézió-függő folyamatok vizsgálata a neutrofilek működésében A

korábban

ismertetettek

alapján

elmondhatjuk,

hogy

az

integrinek

elengedhetetlenek a neutofilek megfelelő működéséhez. A neutrofilek felszínén megtalálható integrineknek számos ligandja van, így különböző extracelluláris mátrix fehérjék (fibrinogén, fibronektin, vitronektin, laminin), valamint az endotélsejtek felszínén jelen levő adhéziós molekulák (intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1)).

12

A legnagyobb mennyiségben a β2 integrinek találhatók meg a leukociták felszínén [31, 32]. A neutrofileken a β2 integrinek αLβ2 (CD11a/CD18 vagy LFA-1) és αMβ2 (CD11b/CD18, Mac-1 vagy CR3) heterodimer formában vannak jelen. αL integrin knockout neutrofileken igazolták, hogy hiányában jelentős zavart szenved a sejtek vándorlása [33-35]. Az αLβ2 integrin leginkább az érfalhoz való kötődésben, a diapedezisben és a gyulladásos góchoz történő sejtmigrációban fontos. Az αMβ2 integrinek elsősorban az extracelluláris mátrixszal kialakított kapcsolat létrehozásában, illetve a neutrofilek kórokozó ellenes funkcionális válaszainak kialakításában (de nem a sejtmigrációban) játszanak alapvető szerepet [33, 36, 37]. A funkcionálisan legfontosabb β2 integrin heterodimereken kívül, ezekhez viszonyítva kisebb mennyiségben, a neutrofil granulociták felszínén β1 (amelyek α4 , α5, α6 láncokkal alkotnak párt), illetve β3 integrinek (amelyek αV láncokkal alakítanak ki párokat) is jelen vannak [32]. Nathan kifejlesztett egy modellrendszert az adhézió szerepének vizsgálatára a neutrofilek

működésében [38]. Méréseiben biológiai felszíneken

aktiválta a

neutrofileket szolubilis agonistákkal (extracelluláris mátrix fehérjék, endothel sejtek) in vitro (2. ábra). Azt tapasztalta, hogy a felülethez tapadt, adherens sejtek szuperoxidtermelése lényegesen különbözik a szuszpenzióban megfigyelhető válaszoktól (korábban a neutrofilek működésének vizsgálatát nagyrészt szuszpenzióban végezték). Kimutatta, hogy az adherens szabadgyök-termelés a neutrofilek szétterülésével párhuzamosan jön létre, és a szétterülést gátló (az aktin-citoszkeletont roncsoló) citokalazin B (CB) segítségével felfüggeszthető volt. Az adherens sejtek lassú kinetikájú, de tartós reaktív oxigénmetabolit-termelést mutattak. A válasz olyan stimulusok hatására is kialakult, amelyek szuszpenzióban nem indukálják a folyamatot (tumor nekrózis faktor α (TNF), granulocita-monocita kolónia-stimuláló faktor (GMCSF)) [38, 39].

13

2. ábra A neutrofilek adhézió-függő aktivációja integrin-ligand felszínen szolubilis agonistával ( a klasszikus stimulációs rendszer)

Nathan és munkatársai további kísérleteikben igazolták, hogy a fenti rendszer alkalmazásával kiváltott, adhézió-függő szabadgyök-leadás nem alakul ki a β2 integrinek

genetikai

hiánya

esetén

(LAD-I

szindrómában

szenvedő

betegek

neutrofileiben), illetve a β2 integrinek ligandkötését blokkoló antitestek jelenlétében [40]. β2 integrin hiányos egér neutofilekben sem detektálható szuperoxid-termelés a fenti aktivációs rendszer segítségével stimulálva [28]. Mindezen eredmények arra utaltak, hogy az integrin-ligand felszín felőli szignalizáció β2 integrineken keresztül történő megvalósulása szükséges a neutrofilek adhézió-függő válaszainak létrejöttéhez. Tehát a Nathan által leírt „klasszikus” aktivációs rendszerben az effektor funciók kialakulásához két, egymástól független tényező szükséges: egy szolubilis agonista (nem-integrin szignál) és egy integrinek közvetítésévek kialakuló (integrin) szignál; e két szignál általi kostimuláció hozza létre a neutrofilek aktivációját a klasszikus stimulációs rendszerben. Nem volt tisztázott azonban, hogy pontosan milyen az integrin és a nem-integrin szignálok relatív hozzájárulása a neutrofilek teljes aktiválásának kialakulásához, illetve hogy milyen (alá-fölérendelt vagy mellérendelt) viszony áll fenn a két szignál között. Berton és munkatársai kidolgoztak egy másik adhézió-függő stimulációs rendszert, mely szintén a neutrofilek nagymértékű aktivációját képes kiváltani. Ennek a módszernek az a lényege, hogy felszínhez rögzített, immobilizált anti-integrin antitestek segítségével további szolubilis agonista (kostimulus) nélkül is létrehozható a neutrofilek

14

nagymértékű aktivációja (szétterülés, szabadgyök-termelés, degranuláció) (3. ábra) [41]. Mivel Berton és munkatársai feltételezték, hogy ebben a rendszerben az integrineken kívül nem szükséges egyéb stimulus hatására bekövetkező folyamatokkal számolni, arra következtettek, hogy a sejtfelszíni integrinek keresztkötése önmagában is képes létrehozni a neutrofilek teljes aktivációját. Ezen eredmények alapján elfogadottá vált, hogy az integrin ellenes antitestekkel való stimulálás a legalkalmasabb módszer a neutrofil-integrinek aktiválódásának hatására létrejövő intracelluláris jelátvitel (ún. „outside-in” signaling) vizsgálatára. Az integrinek anti-integrin antitestekkel való keresztkötését ezután számos munkacsoport rutinszerűen használta a neutrofilek integrin-függő („outside-in”) aktivációjának funkcionális vizsgálatára, illetve ezen sejtek integrineken keresztüli jelátvitelének tanulmányozására [28, 42-53].

3. ábra A neutrofilek aktivációja immobilizált anti-integrin antitestekkel (a korábbi elképzelés szerint önmagában az integrinek keresztkötése hozza létre a teljes aktivációt)

A fenti eredmények alapján elfogadottá vált egy hierarchikus, lineáris jelátviteli modell, amely szerint a klasszikus, adhézió-függő modellrendszerben a szolubilis agonistának (például a TNF-nek) csupán az a szerepe, hogy elősegítse az integrinek ligandkötő-képességét (ún. „inside-out” szignál), melynek részfolyamatai az egyes integrinmolekulák ligand iránti affinitásának, illetve az egyszerre kötni képes receptorok számának a szabályozása (utóbbi a receptorok összecsapzódásában nyilvánul meg), de ide tartozik a sejtfelszínen található adhéziós receptorok számának emelkedése és a sejtalak változása is [20, 31]. A fenti folyamatok következtében tehát az integrinek „aktív”, ligandkötésre képes állapotba kerülnek. A ligandkötés ezután lehetővé teszi a neutrofilek integrineken keresztüli aktivációját, az úgynevezett „outside-in” szignált. Az

15

„outside-in” szignál hozza létre a neutrofilek funkcionális válaszait, így a sejtek szétterülését, a szuperoxid-termelést, és a degranulációt. Berton és munkatársai eredményei alapján arra következtettek, hogy az intergin- és nem-integrin szignálok között alá-fölérendeltségi viszony van. Az egyetlen érv, amely ezen hierarchikus jelátviteli modellt támogatta, az anti-integrin antitesteknek a neutrofilek maximális aktiválódását kiváltó képessége volt. Annak ellenére, hogy a fenti munkákban a neutrofileket a teljes (Fab és Fc részt is tartalmazó) anti-integrin antitestekkel aktiválták, eddig senki sem vizsgálta részletesen az Fc-receptorok esetleges részvételét a folyamatban. Ph.D. munkám során kísérleteink első részében arra kerestük a választ, hogy hogyan valósul meg a neutrofilek adhézió-függő aktivációja, milyen az integrin és nemintegrin szignáloknak a relatív hozzájárulása a sejtválaszok létrejöttéhez, ezen szignálok milyen viszonyban állnak egymással. Ezen kísérletek központi részét képezte az Fcreceptorok szerepének vizsgálata az anti-integrin antitestekkel kiváltott sejtáktiváció során. 3.4. Az Fc-receptorok jelátvitele A neutrofilek Fc-receptorokon keresztüli aktivációja alapvető jelentőségű a kórokozók elleni védekezésben. Az Fc-receptor-függő mechanizmusok jelentős szerepet töltenek be az opszonizált baktériumok bekebelezésében, ezáltal kapcsolatot teremtenek a természetes és a szerzett immunitás között [1]. Autoimmun betegségekben Fcreceptorok közvetítésével autoantitestek (amelyek a különböző kórfolyamatokban keletkeznek), illetve az immunkomplexek aktiválnak számos immunsejtet, ami jelentős szövetkárosodást eredményez a szervezetben. Az Fc-receptorokat az immunreceptorok családjába sorolhatjuk. A klasszikus immunreceptorok közé tartoznak az adaptív immunrendszer fő receptorai, így a B limfociták B-sejt receptora, a T limfociták T-sejt receptora. Az eddig vizsgált sejttípusokban a klasszikus immunreceptorok jelátvitele egymáshoz nagyon hasonló módon zajlik [54] (4. ábra). Ezen jelátvitel szerkezeti alapja a receptorok komplexében található, két foszforilálható tirozint jellegzetes (YxxI/Lx6-8YxxI/L) környezetben (ún. immunreceptor tirozin-bázisú aktivációs motívum, ITAM) hordozó oldallánc jelenléte.

16

Az antigéneknek (a receptorok ligandjainak) a kötődése a receptorhoz a receptor keresztkötését hozza létre, ami kiváltja az ITAM-tartalmú adapter fehérjék Src-típusú tirozin-kinázok általi foszforilációját a receptorkomplexben. A foszforilálódott ITAM tartalmú proteinhez SH2 doménjein keresztül kihorgonyzásra kerül a Syk tirozin-kináz vagy a rokon szerkezetű ZAP-70. Ezután a Syk vagy a ZAP-70 aktiválódik, és további fehérjéket foszforilál.

4. ábra A klasszikus immunreceptorok (BCR, TCR) jelátvitele

Számos in vivo és in vitro vizsgálatban igazolták, hogy az immunreceptor szignalizáció bármely lépésében szerepet játszó fehérje hiánya vagy mutációja jelentősen károsítja a jelátviteli folyamatot. Az ITAM tartalmú fehérjék kritikus szerepet töltenek be a klasszikus immunreceptorok jelátvitelében [55]. Az Fc-receptor γlánc egy ITAM tartalmú fehérje, amely szignalizációs lánca számos Fc-receptornak (FcγRI-nek, FcγRIIIA-nak, FcγRIV-nek makrofágokban és NK sejtekben; Fcεreceptornak hízósejteken). Fc-receptor γ-lánc hiányában erősen károsodott a Fcreceptorok közvetítésével kialakuló fagocitózis, ADCC, illetve az allergiás reakciók [56, 57]. Az Fc-receptor γ-lánc kritikus tirozinjainak mutációja esetén funkciójukat ellátni képtelen Fc-receptorok alakulnak ki. A receptor stimulációja kiváltja az Fc-receptor γlánc ITAM-ban elhelyezkedő tirozinjainak foszforilációját. Ellentétben a korábbi nézettel, mely csak Fc-receptor funkciókhoz kapcsolta az Fc-receptor γ-láncot, számos újabb közleményben kísérletes adatokkal támasztották alá, hogy az Fc-receptor γ-lánc az Fc-receptorok mellett szignalizációs lánca számos egyéb receptornak is [IV]. Az Fc-

17

receptor γ-lánc elengedhetetlen szignalizációs lánca trombocitákban a kollagén GpVI receptorának [58, 59]; neutrofilekben az immonoglobulin szerkezetű PIR-A receptornak [60-62], az ILT/LILRA-nak [63] és a LILRC-nek [64]; az oszteoklasztokban [65, 66], monocitákban és dendritikus sejtekben [67, 68] az OSCAR fehérjének; illetve dendritikus sejtekben a DCAR-nak [69] is. A klasszikus immunreceptorok jelátvitelében központi szereplő az Fc-receptor γlánc mellett egy 72 kDa-os nem receptor tirozin-kináz, a Syk is. A Syk rendelkezik két SH2 doménnel (ezeken keresztül kapcsolódhat foszfotirozinokhoz) és egy kináz doménnel. A Syk SH2 doménjei teszik lehetővé, hogy kapcsolatot tud kialakítani tirozinon foszforilálódott ITAM tartalmú fehérjékkel, így az Fc-receptor γ-lánccal. A Syk tirozin-kináz aktivációja során mind a kináz doménben, mind a domének közötti régióban több tirozin aminósav foszforilálódhat [70, 71]. A Syk elengedhetetlen a BCR közvetítésével kialakuló jelátviteli folyamatban, köztük a B limfociták érése során a pozitív szelekció létrejöttében. Syk tirozin-kináz hiányában ezért megreked a B limfociták fejlődése [72-74]. Makrofágokban az Fcγ-receptorokon keresztül kialakuló válaszokban [75], illetve hízósejtekben az Fcε-receptorok közvetítésével létrejövő funkciókban is alapvető fontosságú a Syk tirozin-kináz [76, 77]. Az irodalomból ismert, hogy a Syk tirozin-kináz központi szerepet játszik az integrinek jelátvitelében is trombocitákban [78, 79], monocitákban [80] és neutrofilekben [28]. Az opszonizált, fagocitózisra kerülő patogén (például IgG fedett részecske) az Fc-receptorhoz kötődés után létrehozza az Fc-receptor γ-lánc foszforilációját makrofágokban [81]. Fc-receptor γ-lánc hiányában nem jelennek meg az Fcγ-receptorok a makrofágok felszínén, valamint teljes mértékben károsodik a sejtek fagocitáló képessége [56]. Src-típusú tirozin-kinázok (Hck, Fgr és Lyn) hiányában jelentős mértékű zavart szenved a fagocitózis folyamata makrofágokban, feltételezhetően amiatt, mert a jelátvitel során ezen kinázok végzik az Fc-receptor γ-lánc foszforilációját [82]. Syk knockout makrofágokban is teljesen károsodik a fagocitózis folyamata [75, 83]. Tehát makrofágokban az Fcγ-receptorok által mediált fagocitózishoz elengedhetetlenek a klasszikus immunreceptorok jelátvitelében szerepet játszó komponensek. Az Fc-receptorok jelátvitele neutrofilekben nem tisztázott. Állatkísérletekben kimutatták, hogy a bazális membránhoz lokalizált immunkomplexekkel kiváltott akut glomerulonephritisben (nephrotoxicus nephritis) a vesekárosodás a neutrofilek

18

aktivációjának következménye [84]. Fc-receptor γ-lánc hiányos egerekben viszont nem alakult ki az immunkomplexekkel indukált autoimmun betegség. Olyan vad típusú, letálisan besugárzott állatokban sem jött létre vesekárosodás, amelyeket Fc-receptor γlánc hiányos csontvelővel transzplantáltak. Abban az esetben, ha Fc-receptor γ-lánc knockout egerek vad típusú netrofileket kaptak a csontvelő-transzplantációban, a szövetkárosodás mértéke megegyezett a vad típusú egerekben tapasztaltakkal. Egy artritis modellben (melyben a destruktív izületi gyulladást immunkomplexek felhalmozódása hozza létre a szinoviális membránban) kimutatták, hogy a neutrofilek depléciója után, illetve Fc-receptor γ-lánc hiányos egerekben lényegesen enyhébb lefolyású volt a betegség [85]. Looney és munkatársai in vivo mérésekben igazolták, hogy neutrofilek hiányában, valamint Fc-receptor γ-lánc knockout granulociták jelenlétében jelentősen csökkent a transzfúziót követő tüdőoedéma (ami a transzfúzió leggyakoribb szövődménye) [86]. Ismert, hogy az immunkomplexekkel történő stimulálás jelentősen aktiválja az effektor

válaszokat

neutrofilekben.

Opszonizált

zimozánszemcsékkel

indukált

szuperoxid-termelés alapján a Syk tirozin-kináz szükségesnek tűnt az Fc-receptorok jelátviteléhez [83]. Fc-receptor γ-lánc hiányos neutrofilekben nem alakul ki reaktív oxigénmetabolit termelés felszínhez kötött immunkomplexekkel indukálva a választ [84]. Az Src-típusú tirozin-kinázok közül neutrofilekben a Hck, az Fgr és a Lyn kerül kifejezésre [87]. Ha szolubilis immunkomplexekkel stimulálták a Hck–/–Fgr–/– neutrofileket, nem találtak különbséget vad típusú sejtekkel összehasonlítva a szabadgyökök leadásában [42]. Azonban nem vizsgálták a választ a Hck, az Fgr és a Lyn (tehát mindhárom neutrofilekben megtalálható Src-típusú tirozin-kináz) egyidejű hiányában. A neutrofilek Fc-receptor jelátvitelével kapcsolatban tehát létezik számos, különböző stimulációs rendszerekben végzett, egymással nem teljesen össehasonlítható és összeegyeztethető kísérleti adat. Eddig nem történt meg azonban az Fc-receptorok szignalizációs útjának részletes jellemzése izolált neutrofilekben. Az in vivo betegségmodellekben kapott eredmények alapján elmondhatjuk, hogy nagyon lényeges feladat a neutrofilek Fc-receptor jelátvitelének feltérképezése. A szignalizációs mechanizmus megismerésének segítségével jobban megérthetjük az immunrendszer

19

normál és kóros működését, valamint a jelátviteli folyamatban résztvevő komponensek potenciális támadáspontjai lehetnek az autoimmun betegségek terápiájának is. Kísérleteim második részében az Fc-receptorok jelátvitelét vizsgáltuk neutrofil granulocitákban

egy

általunk

beállított

immunkomplex-stimulációs

rendszer

felhasználásával. 3.5. Kinázok szerepe a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében Neutrofilekben a bakteriális tripeptid fMLP számos effektor választ indukál Gi/o családba tartozó, pertussis toxin szenzitív heterotrimer G-fehérje-kapcsolt receptoron keresztül [9]. Korábban kimutatták, hogy fMLP hatására aktiválódik számos tirozinkináz, illetve a MAP-kináz kaszkád is [88-90]. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy fMLP-vel stimulálva a sejteket általános tirozin-kináz gálószerek erősen gátolják a primer granulumok leadását, illetve a szuperoxid-termelést [91]. Kísérletes munkánk kezdetén nem állt rendelkezésre adat, hogy pontosan milyen szerepet töltenek be a kinázok (így az Src-típusú tirozin-kinázok és a MAP-kinázok) a pályarendszerek aktiválásában, vagyis hogy hogyan valósul meg a jelátvitel a neutrofilek G-fehérjekapcsolt receptorok közvetítésével kialakuló sejtválaszainak szabályozása során. A Syk tirozin-kináz lényeges szerepet játszik a klasszikus immunreceptorok és az integrinek szignalizációjában, vitatott viszont a részvétele a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében. Számos munkacsoport különböző kísérleti rendszerekben megmutatta [92-97], hogy a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok stimulálásának következtében aktiválódik a Syk tirozin-kináz. A fenti adatokkal ellentétben más munkacsoportok (köztük saját munkacsportunk) nem tudták kimutatni a Syk aktiválódását a G-fehérje-kapcsolt receptorok stimulálásakor [98] [II]. A Syk tirozin-kináz szerepének tisztázására több munkacsoport funkcionális vizsgálatokat végzett a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének feltérképezése érdekében. Leírtak egy olyan kísérleti megközelítést, amelyben egy bazofil sejtvonalat muszkarinos acetilkolin-receptorral transzfektáltak, majd ezen a receptoron keresztül stimulálták agonistával a sejteket [98]. A Syk tirozin-kináz SH2 doménjeinek overexpressziója nem gátolta az effektor választ (arachidonsav leadás) ebben a kísérleti felállásban. Ha ugyanezen acetilkolin-receptorral transzfektált sejtvonalban az Fcε-

20

receptorok irányából aktiváltak, akkor a Syk SH2 doménjeinek overexpresszója kivédte a választ. Az eredményeik alapján azt a következtetést vonták le, hogy a Syk tirozinkináz nem játszik szerepet a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok jelátvitelében. Ezen konklúzióval ellentétes megfigyelést tett egy másik munkacsoport [92, 93]. Méréseikben azt találták, hogy Syk hiányában erősen károsodott a MAP-kinázok Gq kapcsolt M1, valamint Gi kapcsolt M2 mAch-receptoron keresztüli aktivációja DT40 csirke B limfocita sejtvonalban. Adataik tehát arra utaltak, hogy ezen sejttípusban a Syk részt vesz a G fehérjék által mediált MAP-kináz aktiválásban. Számos munkacsoport (köztük saját munkacsoportunk is) kimutatta továbbá, hogy a piceatannol nevű Sykgátlószer kivédi a G-fehérje-kapcsolt receptorok által létrehozott sejtválaszokat, ami a Syk szerepét valószínűsíti a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében [95-97] [II]. A piceatannolról kiderült azonban, hogy a Syk-en kívül számos más jelátviteli utat (például az Src-típusú tirozin-kinázokat) is hatékonyan gátol, tehát nem tekinthető a Syk specifikus inhibitorának [99]. A bemutatott, egymásnak ellentmondó irodalmi adatok alapján megállapíthatjuk, hogy nem tisztázott a Syk szerepe a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében. Bár a kérdés megközelítésére kézenfekvő megoldás lenne a Syk-hiányos (Syk–/–) egerek alkalmazása, ezen egerek perinatális elhullása jelentősen megnehezíti a kérdés tisztázását [72, 73]. Feltehetőleg ezen nehézségek miatt korábban még egyetlen munkacsoport sem közelítette meg a problémát úgy, hogy primer, génhiányos sejteket alkalmazott volna a Syk tirozin-kináz esetleges részvételének vizsgálatára a G-fehérjekapcsolt receptorok jelátvitelében. Ph.D.-munkám harmadik részében különböző kinázok szerepét vizsgáltuk a neutrofilek G-fehérje-kapcsolt receptorainak működésében.

21

4. Célkitűzések Kísérleteinkben neutrofil granulocitákban vizsgáltuk, hogy: 1., milyen az integrin és a nem-integrin szignálok egymáshoz való viszonya az adhéziófüggő aktiváció során: elégséges-e az integrinek keresztkötése a neutrofilek maximális aktiválódásához 2., milyen jelátviteli folyamatokon keresztül valósul meg az Fc-receptorok működése 3., mi a jelentőségük az Src-típusú tirozin-kinázoknak, a MAP-kinázoknak, illetve a Syk tirozin-kináznak a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében

22

5. Módszerek 5.1. A munkánk során használt kísérleti állatok; csontvelő-kimérák létrehozása Kísérleteinkben számos olyan génhiányos (knockout) egértörzset alkalmaztunk, melyekből genetikailag hiányoztak bizonyos Fc-receptorok, illetve egyes intracelluláris jelátviteli molekulák. Az Fc-receptor γ-lánc-hiányos (FcRγ–/–) egereket [56] a Taconic Farms-tól vásároltuk. Az Fcγ-receptor III-hiányos (FcγR3–/–) törzset [100] Dr. Sjef Verbeek (Leiden, Hollandia), a Hck–/–Fgr–/–Lyn–/– hármas mutáns egereket [101] Dr. Clifford Lowell (San Francisco, CA, USA), a Syk+/– egértörzset [72] Dr. Victor Tybulewicz (London, Egyesült Királyság) bocsátotta rendelkezésünkre. Mindegyik egérkolóniát a C57BL/6 genetikai háttér jellemezte. A Syk-mutáns egerek (ld. alább) kivételével mindegyik törzset homozigóta formában tartottuk fenn és C57BL/6 kontrollokkal összehasonlítva vizsgáltuk. A Syk-hiányos (Syk–/–) egerek (feltehetően a nyirokerek és a vérerek szeparációjának zavara miatt [102]) születésük után nem sokkal elpusztulnak [72]. A Syk gén mutációját hordozó egértörzset ezért heterozigóta (Syk+/–) formában tenyésztettük a C57BL/6 genetikai háttéren (5/A ábra). Munkánk során beállítottunk egy speciális kísérleti megközelítést, amely lehetővé tette Syk-hiányos neutrofilek vizsgálatát [28]. A módszer lényege csontvelő-kimérák létrehozása volt Syk–/– embriók májának felhasználásával. A következő szakaszban részletesen ismertetem ezt a megközelítést. Heterozigóta (Syk+/–) egerek keresztezésével nyertünk Syk hiányos embriókat. A terhesség 15-17. napján a magzatokat eltávolítottuk a nőstényből. A Syk knockout embriókra jellemzőek a testszerte megjelenő bevérzések és ödéma (5/A ábra), már ezen makroszkópos jegyek alapján lehetőség nyílt a Syk–/– magzatok valószínű azonosítására. Emellett a magzatokból preparált genomiális DNS-mintákon allél-specifikus PCR reakciókat futtattunk, majd a kapott termékeket agaróz gélelektroforézissel választottuk szét. A vad típusú embrió szöveteiben jelen van a vad típusú Syk allél, a knockout allélt felerősítő reakcióban ezzel szemben nem láttunk jelet. A Syk–/– magzatban ezzel szemben jelen van a mutáns allél, hiányzik viszont a vad típusú allél (5/A ábra). A

23

heterozigóta egerek pároztatásával kapott génhiányos embriók megoszlása követte a mendeli öröklődés szabályait.

5. ábra Syk–/– csontvelőkimérák létrehozása A, Vad típusú és Syk hiányos embrió, és az embriók genotipizálásának (PCR) eredménye B, Az embrionális máj felhasználásával végzett csontvelő-transzplantáció elve [83] C, Az Ly5.2 sejtfelszíni marker kifejeződése a recipiens (C57BL6.SJL) egér, a donor (C57/BL6) egér és a kiméra egér neutrofileinek a felszínén áramlási citometriával vizsgálva D, A Syk fehérje expressziója vad típusú és Syk–/– csontvelő-kimérák neutrofileiben Western blot módszerrel vizsgálva

A magzatok genotipizálása után eltávolítottuk és homogenizáltuk a Syk–/– (és vad típusú kontroll) magzatok máját (amely a magzati vérképzés fő szerve, így tartalmazza a magzatok hemopoetikus őssejtjeit is). Letális sugárdózissal elpusztítottuk a recipiens egerek teljes vérképző rendszerét (10 Grey sugárzás Co60-as sugárforrás felhasználásával), majd intravénásan beadtuk nekik a donor magzatokból származó májsejtszuszpenziót (5/B ábra). A transzplantációt követő néhány hét alatt a donor sejtekből a recipiens egerekben új vérképző rendszer alakult ki, amely genetikailag a donor sejteknek felelt meg. Ezen egereket a továbbiakban csontvelőkiméráknak nevezzük.

24

A fenti transzplantáció során recipensként egy olyan C57BL/6 genetikai hátterű egértörzset (C57BL6.SJL) használtunk, amelyek neutrofiljei Ly5.1-es sejtfelszíni markert hordoznak, míg a donor sejtekre a Ly5.2-es marker jelenléte volt jellemző. A recipiens és donor sejtek közötti különbség lehetőséget teremtett arra, hogy ellenőrizni tudjuk a csontvelő-transzplantáció hatékonyságát. Ezt körülbelül egy hónappal a transzplantáció után anti-Ly5.2-FITC antitest (BD Pharmingen) felhasználásával, áramlási citometria segítségével végeztük. A kimérák neutrofilei (a donor sejtekhez hasonlóan) négy héttel a transzplantáció után 100 %-ban a Ly5.2 markert hordozták (5/C ábra), igazolva, hogy a kapott kimérák kizárólag a donor embriókból származó neutrofileket termeltek. Méréseinkben Western blot módszerrel megmutattuk továbbá, hogy a Syk hiányos csontvelőkimérák neutrofiljeiből teljesen hiányzik a Syk tirozinkináz, tehát valóban teljes mértékben lecseréltük a recipiens egerek vérképző rendszerét a csontvelő-transzplantáció során (5/D ábra). Vad típusú magzatok májának felhasználásával létrehozott vad típusú csontvelőkimérákat használtunk méréseinkben kontrollként. 5.2. A kísérleteinkben alkalmazott monoklonális antitestek A

méréseinkhez

használt

monoklonális

antitesteket

hibridóma

sejtek

felülúszójából tisztítottuk [103], vagy a BD Pharmingen cégtől szereztük be (1. táblázat).

Az

antitest-preparátumok

szarvasmarha

immunglobulinnal

való

szennyeződésének elkerülése érdekében a hibridóma sejtvonalakat speciális Hybrimax (Sigma-Aldrich) médiumban tenyésztettük szérummentes körülmények között. A Hybrimax médiumban növesztett hibridóma sejtvonalak felülúszóját Sepharose 4B-hez kötött protein A (Zymed) vagy protein G (Invitrogen) oszlopon tisztítottuk. A sejtfelülúszó átáramoltatása közben az antitesteket megkötötte a protein A, illetve a protein G. Az oszlop erős mosása után a pH jelentős csökkentésével (glicin-HCl puffer, pH 2,7) eluáltuk az antitesteket. Dialízist követően SDS gélen történő elektroforézissel ellenőriztük preparátumaink tisztaságát. A tisztított antitest preparátumok fehérje koncentrációját Bradford módszerrel határoztuk meg. Egyes

kísérleteinkhez

ImmunoPure

F(ab’)2

(Pierce)

preparáló

kit

felhasználásával F(ab’)2 fragmentumokat állítottunk elő anti-humán CD18-ból (IB4),

25

valamint annak izotípus kontrolljából (K9). Ezen antitesteket a gyári előírásoknak megfelelően gyöngyhöz kötött pepszin segítségével emésztettük. A humán-FcγRIIA blokkoló antitestekből szintén ImmunoPure F(ab’)2 kit segítségével készítettünk Fab fragmentumokat, kihasználva azt a megfigyelést, hogy hosszabb emésztési idő alatt a pepszin a két Fab fragmens közti összeköttetést is képes megszüntetni [104]. Az emésztés hatékonyságát SDS gélen történő elektroforézissel teszteltük mind redukáló, mind nem redukáló körülmények között. Utóbbira azért volt szükség, mert az F(ab’)2-t és az Fab-t csak nem redukáló feltételek mellett tudtuk elkülöníteni egymástól [105].

Klón

Specificitás

Izotípus

Forrás

Y13-238

– (izotípus kontroll)

rat IgG2a

Hibridómaa

C71/16

egér CD18 (integrin β2)

patkány IgG2a

Hibridómab

1A8

egér Gr1

patkány IgG2a

BD Pharmingen

MEL-14

egér CD62L (L-szelektin)

patkány IgG2a

BD Pharmingen

A19-3

– (izotípus kontroll)

hörcsög IgG1

BD Pharmingen

2C9.G2

egér CD61 (integrin β3)

hörcsög IgG1

BD Pharmingen

R35-38

– (izotípus kontroll)

patkány IgG2b

BD Pharmingen

R1-2

egér CD49d (integrin α4)

patkány IgG2b

BD Pharmingen

RB6-8C5

mouse Gr1

patkány IgG2b

BD Pharmingen

2.4G2

egér CD32/CD16 (FcγRII/III)

patkány IgG2b

BD Pharmingen

K9

– (izotípus kontroll)

egér IgG2a

Hibridómac

IB4

humán CD18 (integrin β2)

egér IgG2a

Hibridómaa

HI30

Humán CD45

egér IgG1

BD Pharmingen

3G8

humán CD16 (FcγRIII)

egér IgG1

BD Pharmingen

IV.3d

humán CD32A (FcγRIIA)

egér IgG2b

Hibridómaa

1. táblázat A munkánkban során használt monoklonális antitestek a

ATCC-től (American Type Culture Collection), Manassas, VA, USA; bSalk Institutetól, La Jolla, CA,

USA; cDr. László Glóriától, Eötvös Loránd Tudomány Egyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest; dcsak Fab formában használtuk

26

5.3. A neutrofil granulociták preparálása, a funkcionális vizsgálatok körülményei Az egér neutrofil granulocitákat csontvelőből izoláltuk szobahőmérsékleten. A cervicalis diszlokációval leölt állatokból eltávolítottuk a femurokat és tibiákat, majd kimostuk a csontvelőt. A kapott sejtszuszpenzióból ozmotikus hemolízissel távolítottuk el a vörösvértesteket, majd a neutrofileket 62,5%-os Percoll gradiensen (Amersham Biosciences) történő centrifugálással választottuk el a mononukleáris sejtektől. Az így kapott sejteket 20 mM Na-HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó kalcium- és magnéziumion mentes HBSS oldatban vettük fel. A preparálás teljes folyamatát endotoxinmentes körülmények között végeztük, ezáltal gátolva a sejtek előaktivációját. A kapott neutrofil preparátumok homogenitását áramlási citometriával is ellenőriztük. Az érett neutrofil granulociták felszínén megtalálható egy specifikus érési marker, a Gr1. Az izolált sejtek 95%-a anti-Gr1 immunfestéssel erős pozitivitást mutatott, tehát valóban érett granulocitákat nyertünk a preparálás során [106]. Erythrosin-B festék kizárásának vizsgálatával a sejtek legalább 98%-a életképesnek bizonyult. A humán neutrofil granulocitákat önkéntesek vénás véréből preparáltuk szobahőmérsékleten, endotoxinmentes körülmények között. A vért 5% dextrán jelenlétében ülepítettük, majd a felülúszó eltávolítása után Ficoll (Amersham Biosciences) gradiensen történő centrifugálással választottuk el a neutrofileket a mononukleáris sejtektől. A vörösvérsejteket ozmotikus hemolízissel távolítottuk el. Az így kapott polimorfonukleáris sejteket 20 mM Na-HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó kalcium- és magnéziumion mentes HBSS oldatban vettük fel. A kapott humán neutrofil preparátumokban 98%-nál több granulocita volt megtalálható, amelyek közül legalább 98% életképesnek bizonyult [91]. A neutrofileket 20 mM Na-HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó kalcium- és magnéziumion mentes HBSS-ben tartottuk egészen a felhasználásukig. A funkcionális vizsgálatok előtt 37 °C-on 10 percig előinkubáltuk a sejteket, majd 0,5 mM CaCl2-t és 1 mM MgCl2-t adva 20 mM Na-HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó HBSS-ben 37 °C-on végeztük a méréseinket.

27

5.4. A neutrofileket aktiváló immobilizált monoklonális antitest, integrin-ligand és immunkomplex felszínek kialakítása A sejtfelszíni integrinek keresztkötéséhez (3. ábra) a monoklonális antitesteket általában 96 üregű ELISA lemezeken (Maxisorp F96, Nalge Nunc International) immobilizáltuk (az ELISA lemezek nagyon hatékonyan meg tudják kötni az antitestek Fc részének szénhidrát oldalláncait). Az egér, illetve a humán integrinek elleni antitesteket és azok izotípus kontrolljait 20 µg/ml koncentrációban karbonát pufferben (pH 9,6) hígítva kötöttük az ELISA lemez üregeihez, majd PBS-ben oldott 10% FCSsel blokkoltuk a felületet. Többszöri mosást követően adtuk a neutrofileket stimulálás céljából a kapott felszínhez (3. ábra). A kísérleteinkben használt F(ab’)2 fragmentum nem tartalmazza az antitestek szénhidrátban gazdag Fc részét, így várhatóan kisebb hatékonysággal kötődik az ELISA lemez üregeinek felületéhez. Ezért azokban a méréseinkben, ahol antitestek F(ab’)2 részét használtuk, egy alternatív módszerrel kötöttük a fragmenseket a felszínhez. Mivel ELISA lemez csak 96 üregű lemez formájában van forgalomban, az alábbiakban ismertetésre kerülő megközelítést alkalmaztuk abban az esetben is, ha nagyobb felület használatára volt szükség biokémiai kísérletekhez. Az alternatív módszer lényege az, hogy (Berton és munkatársai protokollját [41] módosítva) szövetkultúra-kezelt felszínre kötött poly-L-lizinhez kovalensen kapcsoltuk az antitestet vagy annak F(ab’)2 fragmentumát. A szövetkultúra lemezeket 30 percig 0,1 mg/ml poly-L-lizinnel inkubáltuk, majd mosást követően 15 percen keresztül 2,5% glutáraldehiddel kezeltük. Ismételt mosás után a felszínt a 20 µg/ml koncentrációban alkalmazott monoklonális antitestekkel, illetve az F(ab’)2 fragmentummal karbonát pufferben 4 órán keresztül inkubáltuk. Ezután 10% FCS-t tartalmazó PBS-sel blokkoltunk, majd mosás után adtuk a neutrofileket az előkészített felülethez. Méréseink során nem tapasztaltunk különbséget a neutrofilek aktiválódásának mértékében attól függően, hogy az általunk módosított módszert, vagy Berton és munkatársai eredeti protokollját (protein G-hez kötött antitestek immobilizálása kovalens kötéssel) alkalmaztuk-e (nem mutatott adat). A „klasszikus” adhézió-függő stimulációhoz a felszínt 150 µg/ml fibrinogénnel vagy 1 µg/ml rekombináns ICAM-1-gyel (Dr. C. M. Vinestól, Albuquerque, USA) kezeltük (2. ábra). A neutrofileket ebben az aktivációs rendszerben is mosás után adtuk a felülethez, miközben 50 ng/ml rekombináns TNF-fel (Peprotech) aktiváltuk őket.

28

Méréseink egy részében a neutrofileket immobilizált immunkomplexekkel (IC) aktiváltuk (6. ábra). Ebben az esetben 20 µg/ml koncentrációban karbonát pufferben hígítva közvetlenül ELISA lemezhez kötöttük az antigéneket (humán szérumalbumin (HSA), laktoferrin (Lfr) vagy ovalbumin (OVA)), majd az aspecifikus kötőhelyek blokkolása után 1:400 arányban hígított poliklonális antitestek (anti-HSA, anti-Lfr, antiOVA) hozzáadásával képeztük az immunkomplexeket. Mosás után a kapott immunkomplex felszínre ültetve aktiváltuk a humán, illetve egér neutrofileket. Egyes párhuzamos mintákban a felszín előkészítése során kihagytuk az antigént, ezeket használtuk nem aktiváló, kontroll felületként. A biokémiai mérésekhez (ahol az ELISA lemezek üregénél nagyobb felületre volt szükség) eltérő megközelítéssel kötöttük az immunkomplexeket. Ilyenkor szövetkultúra-kezelt csészék felszínét 30 percig 0,1 mg/ml poli-L-lizint tartalmazó oldattal kezeltük, majd glutáraldehiden keresztül fixáltuk az antigéneket. A felületet ezután FCS-sel blokkoltuk, majd hozzáadtuk az antitesteket. Ebben az esetben tehát kovalensen kötöttük az immunkomplexek antigén-komponensét a szövetkultúra lemezekhez.

6. ábra A neutrofilek stimulálása immobilizált immunkomplexekkel

5.5. A neutrofilek szuperoxid-termelésének meghatározása Az egér neutrofileket 4×106/ml, a humán neutrofileket 106/ml koncentrációban adtuk a korábban ismertetett felszínekhez (immobilizált integrin ellenes antitestek, természetes integrin-ligandok, illetve immobilizált immunkomplexek) és szükség szerint (természetes integrin-ligand felszín esetében) 50 ng/ml rekombináns humán

29

vagy egér TNF-et (Peprotech) adtunk a sejtekhez. A sejtek szuperoxid-termelését ferricitokróm c redukció alapján határoztuk meg fotometriás módszerrel Labsytems iEMS lemezleolvasó felhasználásával. A ferricitrokróm c-t (Sigma) 10 µM koncentrációban alkalmaztuk, az abszorbció változásait 120 percen keresztül követtük 550 és 492 nm-en. A mérés folyamán kapott értékekből számoltuk ki a keletkezett szuperoxid anionok pontos mennyiségét a citokróm c redukciójának ismert abszorpciós koefficiense (550 nm-en 21 mM-1cm-1) alapján [42]. Azon kísérletekben, amelyekben blokkoló antitestet alkalmaztunk, az egér neutrofileket 4 µg/106 sejt anti-FcγRII/III blokkoló antitesttel vagy anti-Gr1 izotípus kontroll antitesttel inkubáltuk elő. A humán neutrofileket 4 µg/106 sejt anti-FcγRIII antitesttel, illetve anti-CD45 izotípus kontroll antitesttel kezeltük. A humán FcγRIIA ellenes antitestből nem létezett megfelelő izotípus kontroll antitest, ezért (az Fcfragmens okozta műtermékeket elkerülendő) Fab fragmentumot preparáltunk belőle, s ezzel inkubáltuk a humán neutrofil granulocitákat 6 µg/106 sejt mennyiségben. A p38 MAP-kináz reaktív oxigénmetabolit termelésben betöltött szerepének vizsgálatára a p38 MAP-kinázt specifikusan gátló SB203580 inhibitort alkalmaztuk [107]. A humán és egér neutrofileket a stimulálás előtt 20 percen keresztül különböző koncentrációjú SB203580-nal inkubáltuk elő. Erythrosin B-vel ellenőriztük, hogy az SB203580 az általunk használt legmagasabb koncentrációban (100 µM) sem változtatta meg a sejtek életképességét. Igazoltuk továbbá, hogy a méréseinkben használt gátlószer oldószere (DMSO) az alkalmazott legmagasabb (0,1%) koncentrációban sem befolyásolta a neutrofilek működését (nem mutatott adat). Az ERK MAP-kináz kaszkád blokkolásásához a neutrofileket PD98059-cel [108] kezeltük elő. A vegyület nem csökkentette a sejtek életképességét. 5.6. A neutrofilek felszínhez történő adhéziójának meghatározása Az antitestekkel történő aktiváláshoz anti-integrin vagy izotípus kontroll antitesteket immobilizáltunk 96 üregű ELISA lemezek üregeibe a korábban ismertetett módon. A neutrofileket 37 °C-on 60 percig stimuláltuk az antitest-felszínen, majd jégen állítottuk le a folyamatot. A szuszpenzióban maradt sejteket alacsony sebességre állított elektromos pipetta (Labsystems) segítségével, 4 °C-os PBS-sel való többszöri mosás

30

során távolítottuk el. Ezt követően az adott felülethez tapadt sejtek arányát savas foszfatáz aktivitásának mérésével határoztuk meg (az enzim a neutrofilek stimulálása során nem kerül leadásra) [109]. Az alkalmazott mérési módszernek az a lényege, hogy a mosás után a felszínhez tapadt sejteket detergenssel feltártuk, ezt követően a savas foszfatáz enzim szubsztátját (p-nitrofenil foszfát) adtuk a rendszerhez, amelyet a savanyú foszfatáz enzim 37 °C-on színes termékké (p-nitrofenol) alakít át. A termék optikai denzitását Labsystems iEMS lemezleolvasó felhasználásával 405 nm-en mértük. A letapadt sejtek arányát ismert mennyiségű neutrofilt tartalmazó lizátumokból készített minták savas foszfatáz tartalma alapján felvett kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg. 5.7. A degranulációs folyamatok mérése humán és egér neutrofilekben A degranulációs mérések előtt a neutrofileket 10 percig inkubáltuk citokalazin B (ld. alább) és/vagy kináz-gátlószerek jelenlétében. A neutrofileket ezután 37 °C-on 10 percig stimuláltuk fMLP-vel (humán sejtek esetén 100 nM, egér sejtek esetén 3 µM koncentrációban), majd jégen állítottuk le a folyamatot. Az egyes garanulumok és szekretoros vezikulák ürítését a centrifugálással elválasztott sejtfelülúszóból határoztuk meg. A primer granulumok leadását a mátrixban megtalálható β-glukuronidáz fehérje enzimaktivitásának meghatározásával detektáltuk fluorimetriás enzimaktivitás-mérés segítségével [110]. A sejtfelülúszót 4-metilumbelliferil-β-D-glukuronid szubsztráttal inkubáltuk amelyből β-glukuronidáz hatására 4-metilumbelliferon keletkezik. A enzimreakció linearitása érdekében a szubsztrátot többszörös feleslegben adtuk a reakcióelegyhez. A reakció leállítása után a keletkezett termék flureszcenciáját 460 nmes emissziós és 365 nm-es excitációs hullámhosszokon határoztuk meg. A neutrofilek maximális β-glukuronidáz mennyiségét a detergenssel feltárt sejtek lizátumából mértük. A stimulált enzimleadást a stimulálatlan minták fluoreszcenciájának levonása után a teljes (detergenssel felszabadítható) aktivitás százalékában adtuk meg. A humán neutrofilek szekunder granulumaiból felszabaduló laktoferrin (Lfr), illetve a szekretoros vezikuláikból ürülő humán szérumalbumin (HSA) mennyiségét kettős szendvics ELISA technikával mértük [111]. Az ELISA lemezt anti-humán-Lfr

31

vagy anti-humán-HSA antitesttel fedtük, blokkoltuk a felszínt, majd hozzáadtuk a hígított humán sejtfelülúszót. A felületet ezután peroxidáz jelölt anti-Lfr, illetve antiHSA antitesttel inkubáltuk. A megkötött peroxidáz aktivitását hidrogénperoxid és ophenylenediamine szubsztrát adását követően, a Labsystems iEMS mikrolemezleolvasó segítségével 492 nm-en mért extinkcióból határoztuk meg. Az így mért enzimaktivitás a minta Lfr, illetve HSA koncentrációjával arányosnak adódott. A pontos kalibrációhoz ismert hígításokat készítettünk tisztított humán Lfr-ből és humán HSAból. A szekunder granulumok és szekretoros vezikulák markereinek maximális mennyiségét (ez a teljes felszabadítható enzimtartalom a sejtekben) detergensnek a mintákhoz adásával képeztük. Az egerekből izolált neutrofilek Lfr ürítését szintén ELISA módszerrel vizsgáltuk. Ezen kísérleteink során nehézséget jelentett, hogy nem volt elérhető antiegér-Lfr antitest és a humán Lfr mérésére beállított kettős szendvics ELISA nem volt elég érzékeny az egér Lfr kimutatására [106]. Ezért egy, témavezetőm által beállított egyszerűsített ELISA rendszert alkalmaztunk, melyben magát a karbonát pufferben hígított sejtfelülúszót vittük az ELISA-lemezre, majd blokkolás után anti-humán Lfr elsődleges és peroxidáz jelölt anti-nyúl másodlagos antitesttel inkubáltuk a lemezeket [106]. Ez a módszer megfelelően érzékenynek és specificikusnak bizonyult az egér Lfr méréséhez. További nehézséget jelentett, hogy nem létezett tisztított egér Lfr, ezért humán Lfr-t használtunk a kalibrációs görbe felvételéhez. Mivel a humán Lfr felhasználásával végzett kalibrálás nem teszi lehetővé az egér Lfr koncentrációjának pontos meghatározását, ezen kísérleteinkben a laktoferrin ürítését a stimulálatlan sejtekhez viszonyított relatív értékben adjuk meg. A degranulációs módszerekkel kapcsolatban fontos megjegyezni, hogy in vivo körülmények között a neutrofilek granulumai döntő részben a fagoszómába, és csak kisebb részben az extracelluláris térbe ürülnek. Mivel a fagoszómába történő granulumürülés központi lépése a fagoszóma alatti aktinháló lebomlása, az aktin-polimerizációt gátló citokalazin B-vel (CB) való előkezelés szuszpenzióban is lehetővé teszi a granulumok extracelluláris térbe való ürülését (a granulumok CB jelenlétében a stimulációt követően a plazmamembránnal, nem pedig a fagoszómamembránnal fúzionálnak). A primer granulumok külső térbe való leadása kizárólag CB jelenlétében jön létre, így ezt kísérleteinkben is csak CB jelenlétében vizsgáltuk. Ezzel szemben a

32

szekunder granulumok egy része CB hiányában is a külső térbe ürül, de a CB ezt a választ is nagymértékben fokozza. Kísérleteinkben a szekunder granulumok ürülését mind CB jelenlétében, mind CB hiányában vizsgáltuk, hogy megkülönböztethessük az egyes mutációk vagy gátlószerek hatását az fMLP-szignalizációra és a CB permisszív hatására. A fentiekkel ellentétben a CB lényegében nem befolyásolta a szekretoros vezikulák fMLP stimulálta leadását [88, 90] [II]. Ezen méréseinket ezért CB-előkezelés nélkül végeztük. 5.8. A sejtfelszíni fehérjék kifejeződésének vizsgálata áramlási citometriával 106 egér neutrofilt 2 µg jelöletlen anti-integrin, anti-Fc-receptor vagy izotípus kontroll antitesttel inkubáltunk jégen, majd mosás után FITC jelölt anti-patkány másodlagos antitesttel inkubáltuk a sejteket (MAR 7/5-ös klón László Glóriától, ELTE Immunológiai Tanszék). Az előkészített mintákat FACScan áramlási citométerrel vizsgáltuk (BD Bioscences). 5.9. Kalcium-jel mérése egér neutrofilekben Kísérleteinkben a kalcium-jelet FURA-2 festék felhasználásával mértük. A neutrofileket 5 µM FURA-2-acetoximetilészterrel töltöttük 20 mM Na-HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó kalcium- és magnézium-mentes HBSS-ben 30 percen keresztül 37 °Con. A külső festéket kétszeri mosással távolítottuk el. A sejteket 2×106/ml koncentrációban 0,5 mM kalciumion jelenlétében 3 µM fMLP-vel, illetve 100 ng/ml MIP-2-vel stimulálva mértük a fluoreszencia változásait 340 nm és 380 nm excitációs, és 510 nm-es emissziós hullámhosszokon Deltascan kétfényutas fluoriméteren (Photon Technology International). Minden minta futtatását a detergenssel kiváltott telítéskori, majd EDTA hozzáadása után mért Ca2+-mentes fluoreszcencia meghatározásával fejeztük be. A két excitációs hullámhosszon kapott fluoreszcenciák hányadosának (F340/F380) görbéjéből számoltuk ki az adott pillanatban intracellulárisan jelen levő kalciumion koncentrációt [112].

33

5.10. Az intracelluláris jelátviteli folyamatok vizsgálata A Syk tirozin-kináz foszforilációját immunoprecipitációs megközelítéssel mutattuk ki [28]. Az egér neutrofileket 10 percig stimuláltuk immobilizált anti-CD18 vagy izotípus kontroll felszínen, illetve immobilizált immunkomplex felületen, majd jégen leállítottuk a reakciót. A sejteket radioimmunoprecipitációs vizsgálatokhoz használt, Triton-X-100 detergens alapú, 0,1% SDS-t és 0,5% deoxikolátot, valamint foszfatáz- és proteáz-gátlószereket tartalmazó lízis pufferrel (RIPA) tártuk fel. A kapott sejtlizátumok inszolubilis frakcióját centrifugálással eltávolítottuk, majd poliklonális anti-Syk antitesttel (Santa Cruz N-19 vagy Dr. Victor Tybulewicztől származó anti-Syk antiszérum [72]) precipitáltuk a Syk-et, végül az antitest-antigén komplexet gyöngyhöz kötött protein A-val nyertük ki a mintákból. Minta pufferben történő főzés után a mintákat SDS gélen futtattuk meg, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk. Az immunoprecipitációs Biotechnology)

és

mintákat anti-Syk

tartalmazó elsődleges

blottokat

anti-foszfotirozin

antitestekkel,

Amersham

(Upstate

másodlagos

reagensekkel (peroxidáz-jelölt antitestek és ECL szubsztrát) hívtuk elő. Az termeltetett

Fc-receptor Sepharose

γ-lánc 4B

foszforilációjának

gyöngyhöz

kötött

az

igazolására

GST-Syk(SH2)2

baktériumban fúziós

fehérje

felhasználásával végeztünk precipitációs kísérleteket neutrofilekből. Az Anthony DeFranco-tól (San Francisco, USA) kapott, az egér Syk két SH2 doménjét kódóló cDNS-t tartalmazó pGEX-3X prokarióta expressziós vektort BL21 Escherichia coli baktériumokba juttattuk, majd IPTG-vel indukáltuk a GST fúziós fehérje termelését. A baktériumokat szonikálással tártuk fel, majd glutation tartalmú Sepharose gyöngyök segítségével izoláltuk a GST-Syk(SH2)2 fehérjét. Stratagene Quikchange mutageneziskit segítségével előállítottunk továbbá egy olyan GST-Syk(SH2)2 fúziós fehérjét kódoló vektort is, melyben az R41A és R194A mutációk révén mindkét SH2-domént működésképtelenné tettük, ezáltal gátolva a fúziós fehérjének a foszforilált ITAM-hoz való kötődését. Kísérleteinkben a neutrofileket immobilizált immunkomplex felszínen 10 percig 37 °C-on stimuláltuk, majd Triton-X-100 alapú lízis pufferben készítettünk sejtlizátumokat belőlük. Ezt követően a lizátumokból gyöngyhöz kötött vad típusú vagy mutáns GST-Syk(SH2)2-vel precipitáltunk. A kapott precipitációs minták futtatása után a blottokat anti-foszfotirozin és anti-Fc-receptor γ-lánc antitesttel hívtuk elő.

34

A neutrofil lizátumokban megjelenő teljes tirozin-foszforiláció detektálásához a triton alapú lízis pufferrel feltárt teljes sejtlizátumok triton-szolubilis frakcióját mintapufferben megfőztük, SDS gélen megfuttattuk, nitrocellulózra blottoltuk, majd anti-foszfotirozin antitesttel hívtuk elő. A p38 és az ERK1/2 MAP-kináz aktivációját az ezen kinázok foszforilált formáját felismerő poliklonális antitesttel (Cell Signaling Technology) vizsgáltuk, a sejtlizátumokban jelen levő összes ERK1/2 és p38 MAPkinázok mennyiségét ERK1/2 (C-16 és C-14, Santa Cruz) és p38 (C-20, Santa Cruz) MAP-kináz ellenes antitestek felhasználásával határoztuk meg. 5.11. A neutrofilek stimulálása TNF-fel és Fcγ-receptorokon keresztül szuszpenzióban Annak érdekében, hogy elkerüljük a neutrofilek adhézió-függő aktivációját, ezeket a kísérleteket 20 mM HEPES-t (pH 7,4) tartalmazó magnéziumion mentes HBSS-ben végeztük. A TNF hatásának vizsgálata érdekében a sejteket 5 percig inkubáltuk 50 ng/ml rekombináns egér TNF-fel. A Fcγ-receptorok szuszpenzióban való keresztkötéséhez [51] a neutrofileket 30 percig jégen inkubáltuk 1 µg/106 sejt anti-egér FcγRII/III (2.4G2) antitesttel, majd mosást követően 12,5 µg/106 sejt anti-patkány IgGvel (MAR 7/5-ös klón László Glóriától, ELTE Immunológiai tanszék) hoztuk létre az antitestek keresztkötését. 37 °C-on történő 5 perces inkubálás után a folyamatot a minták hűtésével állítottuk le. A sejteket Triton-alapú lízis pufferben feltártuk, és a kapott teljes sejtlizátumokból a korábban már ismertetett módon, Western blot technikával határoztuk meg a p38 MAP-kináz foszforilációját. 5.12. Az értekezésben bemutatott eredmények prezentációja Az értekezésben legalább három független kísérlet közül kiválasztott reprezentatív eredményeket mutatunk be. A diagrammokon feltüntetett szórások egy kísérlet párhuzamosainak (általában 4) szórását (S.D.) mutatják. Az adott stimulus hatására kialakuló válaszból levontuk a hátteret minden független kísérletben, majd a knockout, a blokkoló antitestekkel vagy a gátlószerrel előinkubált sejteben kapott értékeket a vad típusú vagy kezeletenekben kapott értékek

35

százalékában adtuk meg (maradék aktivitás), ezután átlagot és szórást számoltunk (S.D.). A statisztikai értékelését párosított kétmintás t-próbával végeztük. Ezen számításokból az átlagot, a szórást (S.D.), a p értéket, valamint a független kísérletek számát a szövegben tüntettem fel a dolgozatban.

36

6. Eredmények

6.1. Integrin- és nem-integrin szignálok szerepe a neutrofilek aktiválásában 6.1.1. Az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszok jellemzése A neutrofilek adhézió-függő módon való aktiválásának klasszikus módja az, hogy a sejteket gyulladásos agonistával (például TNF-fel) kezeljük integrin-ligand (pédául fibrinogén) felszínen, melynek következtében létrejönnek a neutrofilek effektor válaszai [38, 40]. Egy másik (a bevezetésben ismertetett) aktivációs rendszerben a neutrofileket immobilizált anti-integrin antitestekkel is stimulálhatjuk [41], amelyek szolubilis agonista hozzáadása nélkül is képesek létrehozni a sejtek nagymértékű aktivációját. Mind a klasszikus módon, mind az anti-integrin antitestekkel történő stimuláció esetén adhézió-függő aktiváció jön létre, hiszen mindkét folyamathoz szükséges az integrinek jelenléte a sejtek felszínén [38, 40, 41]. Kísérleteinkben először ezt a két integrin-függő aktiválási rendszert próbáltuk jellemezni. Az irodalomból ismert, hogy szerkezeti okok miatt az integrinek természetes ligandjaikhoz csak magnéziumionok jelenlétében tudnak kötődni. Méréseinkben kimutattuk, hogy a "klasszikus" aktiválás (TNF-stimuláció fibrinogén-felszínen) során magnéziumion hiányában nem jön létre a neutrofilek szuperoxid-termelése, kialakult viszont a sejtválasz magnéziumion jelenléte esetén (7/A ábra). Az immobilizált β2 integrin ellenes antitesttel kezelt felületen ezzel szemben a magnézium jelenléte nem befolyásolta lényegesen a szabadgyök-leadást (7/B ábra). Ennek a megfigyelésnek az a legvalószínűbb magyarázata, hogy az utóbbi esetben antigén-antitest kölcsönhatáson keresztül alakul ki az integrinek keresztkötése, amely (ellentétben a természetes ligandokkal létrejövő kapcsolattal) nem igényli magnéziumion jelenlétét. Méréseinkben tehát kimutattuk, hogy lényeges különbség van a két aktiválási

rendszer

magnéziumionoktól való függésében. Az integrinek természetes (pl. a blokkoláshoz használt FCS-ben jele levő) ligandjain keresztül kialakuló másodlagos aktivációt

37

elkerülendő,

az

anti-integrin

antitestekkel

végzett

további

kísérleteinkben

a

stimulációhoz magnéziumion-mentes médiumot használtunk.

7. ábra Az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszok jellemzése neutrofilekben A, Szuperoxid-temelés magnéziumion jelenlétében és hiányában fibrinogén felszínen TNF-fel stimulálva B, Szuperoxid-termelés anti-CD18, illetve izotípus kontroll (C71/16 és Y13-238) felületen magnéziumion jelenlétében és hiányában C, Szuperoxid-termelés anti-CD18 (C71/16), sejtfelszínhez nem kötődő izotípus kontroll (Y13-238), illetve kötődő anti-L-szelektin (MEL-14) és anti-Gr1 (1A8) felületen D, Az anti-CD18, a nem kötődő izotípus kontroll, illetve a sejtfelszínhez kötődő anti-L-szelektin és antiGr1 neutrofilek felszínéhez való kapcsolódásának ellenőrzése áramlási citometriával E, A neutrofilek adhéziója anti-CD18, izotípus kontroll és anti-L-szelektin felületen

A fenti kísérletben a felszínhez kötött anti-CD18 kontrolljaként olyan antitestet használtunk, amely nem ismer fel antigént a neutrofilek felszínén. Ez nem zárta ki azonban annak a lehetőségét, hogy nem csak az anti-CD18, hanem bármilyen, a sejtek felszínéhez kötődni képes antitest kiváltja a neutrofilek aktiválódását. Ennek tisztázására a következőkben olyan kontroll antitestek hatását is megvizsgáltuk,

38

amelyek más, a neutrofilek felszínén jelen lévő fehérjékhez kötődnek. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a nem-kötő izotípus kontrollhoz hasonlóan nem jött létre szabadgyöktermelés akkor sem, ha immobilizált L-szelektin ellenes, vagy a neutrofil fejlődési marker Gr1 ellenes antitestet alkalmaztunk, míg –a korábbiaknak megfelelően– az azonos

immunoglobulin

alosztályba

tartozó

anti-CD18

nagymértékű

választ

eredményezett (7/C ábra). A különböző kontroll antitesteknek a szuszpenzióban levő neutrofilek felszínéhez való kötődése (7/D ábra) és a sejteknek az immobilizált kontroll antitestekhez való letapadása (7/E ábra) ugyanakkor hasonló, vagy még nagyobb mértékű is volt, mint az anti-CD18 esetében. Ezek a kísérletek tehát arra utaltak, hogy az immobilizált anti-integrin antitestekkel ellentétben egyéb, nem-integrin sejtfelszíni molekulák keresztkötése nem képes kialakítani a neutrofilek válaszait, vagyis az integrinek keresztkötése elengedhetetlen a neutrofilek anti-CD18 antitesttel kiváltott aktivációjához. 6.1.2. Az Fc-receptor γ-lánc szerepe az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszokban Az anti-integrin antitestekkel való stimulálásról korábban azt gondolták, hogy kizárólag az integrinek keresztkötésén keresztül hozza létre a neutrofilek aktivációját, tehát más sejtfelszíni molekulán keresztül kialakuló stimuláció nem vesz részt a folyamatban. Mivel azonban ezekben a kísérletekben intakt antitesteket használtak, az antitestek Fc részének jelenléte miatt felmerült bennünk az Fc-receptorokon keresztül kialakuló stimuláció esetleges közreműködése a folyamatban. Az Fc-receptorok esetleges részvételének vizsgálatára első megközelítésként a legtöbb Fc-receptor jelátviteléhez elengedhetetlen Fc-receptor γ-lánc szerepét vizsgáltuk az immobolizált anti-integrin antitestek által kiváltott sejtválaszokban. Fc-receptor γlánc hiányos neutrofilekben azt találtuk, hogy immobilizált anti-CD18 felszínen teljesen megszűnt a szuperoxid-termelés (8/A ábra; 5,2 ± 0,4% maradék aktivitás, p = 6,0 × 10-6, n = 3). Abban az esetben sem jött létre a reaktív oxigénmetabolitok leadása, amikor a β2 lánccal heterodimert alkotó α láncok (CD11a vagy CD11b) elleni antitestekkel végeztük a sejtek aktiválását (nem mutatott eredmény). Fc-receptor γ-lánc knockout sejtekben teljes károsodást láttunk akkor is, ha nem β2 integrinek keresztkötésével,

39

hanem felülethez rögzített anti-CD49d-vel (bizonyos β1-integrinek α-láncát képező α4integrin [48] elleni antitest) vagy anti-CD61-gyel (anti-β3 integrin) aktiváltuk a sejteket (8/B ábra).

8. ábra Az anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszokhoz szükséges az Fc-receptor γ-lánc A, Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) és vad típusú (VT) egér neutrofilek szuperoxid-termelése anti-CD18 (C71/16) és izotípus kontroll (Y13-238) felszínen B, Nem β2 integrin (R1-2 és R35-38; 2C9.G2 és A19-3) ellenes antitestekkel kiváltott szabadgyöktermelés Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) hiányos és vad típusú neutrofilekben

Ezen méréseink felvetették annak a lehetőségét, hogy az anti-integrin antitestekkel kiváltott sejtválaszokban szerepet játszik az Fc-receptorokon keresztül létrejövő aktiválás is. Az irodalomból ismert azonban, hogy az Fc-receptor γ-lánc számos egyéb (nem Fc-receptor) sejtfelszíni molekula jelátvitelében is lényeges szerepet tölt be [IV]. Ezért további vizsgálatokra volt szükség annak alátámasztására, hogy az anti-integrin antitestekkel indukált válaszokban Fc-receptorok is szerepet játszanak. 6.1.3. Az FcγRIII szerepe az integrin ellenes antitestekkel indukált válaszokban Előző eredményeinkből kiindulva szerettük volna megtudni, hogy az integrin ellenes antitestekkel történő stimuláció hatására létrejövő jelátvitel során milyen sejtfelszíni (feltételezhetően Fc-) receptor jelátviteli adaptere az Fc-receptor γ-lánc. Mivel egér neutrofilek felszínén a legnagyobb mennyiségben megtalálható, az Fcreceptor

γ-lánchoz

kötődő

receptor

az

40

FcγRIII,

következő

kísérleteinkben

megvizsgáltuk az FcγRIII-hiányos (FcγR3–/–) neutrofilek sejtválaszait. FcγR3–/– sejtekben nem alakult ki szuperoxid-termelés anti-CD18 felszínen (9/A ábra; 2,3 ± 8,6% maradék aktivitás, p = 1,5 × 10-18, n = 17), annak ellenére, hogy áramlási citometriával nem találtunk különbséget a β2 integrinek sejtfelszíni expressziójában a vad típusú és a génhiányos neutrofilek között (9/B ábra), és a vad típusú és a knockout sejtek hasonló mértékben kötődtek az immobilizált anti-CD18 felszínhez is (9/C ábra). Abban az esetben is megszűnt a reaktív oxigénmetabolit-leadás, amikor a β2 integrin lánccal párt alkotó α láncokat (CD11a és CD11b) keresztkötöttük felülethez rögzített antitestekkel (nem mutatott adat).

9. ábra Az anti-integrin antitestekkel indukált szuperoxid-termelés károsodott FcγRIII hiányában A, Vad típusú és FcγR3–/– neutrofilek szabadgyök-termelése anti-CD18 (C71/16) és izotípus kontroll (Y13-238) felszínen B, Az anti-CD18 sejtfelszínhez való kötődésének vizsgálata vad típusú és FcγRIII hiányos neutrofilekben C, Vad típusú és FcγR3–/– neutrofilek adhéziója az immobilizált anti-CD18-hoz (illetve izotípus kontrollhoz) D, Nem β2 integrin ellenes antitestekkel (R1-2 és R35-38; 2C9.G2 és A19-3) kiváltott szabadgyöktermelés FcγRIII hiányos és vad típusú neutrofilekben

41

Teljes károsodást mértünk akkor is, ha nem β2 integrineken keresztül stimuláltunk, hanem felülethez kötött anti-CD49d-vel vagy anti-CD61-gyel (9/D ábra). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az immobilizált anti-integrin antitestekkel kiváltott szabadgyök-leadás létrejöttéhez egér neutrofilekben szükséges az alacsony affinitású Fcγ-receptor, az FcγRIII. Az intracelluláris jelátviteli folyamatok vizsgálata során azt találtuk, hogy antiCD18-cal létrehozott aktiváció számos fehérje tirozinon való foszforilációját indukálja, amely jelentősen károsodott FcγR3–/– neutrofilekben (10/A ábra). Ezen eredmény szintén alátámasztotta, hogy az FcγRIII részt vesz az integrin ellenes antitestekkel kiváltott válaszokban. Anti-CD18 antitestek hatására vad típusú sejtekben jelentős tirozin foszforiláció alakult ki a Syk tirozin-kináz molekulatömegének (72 kDa) megfelelő 65-75 kDa tartományban, míg ugyanez a foszforiláció FcγR3–/– sejtekben alig volt megfigyelhető (10/A ábra). Következő méréseinkben ezért megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul felülethez rögzített anti-CD18 stimuláció hatására a Syk tirozin-kináz aktivációja. Eredményeink azt mutatták, hogy a kontrollhoz viszonyítva vad típusú neutrofilekben nagymértékben foszforilálódik a Syk tirozin-kináz, míg a folyamat erősen károsodott FcγR3–/– sejtekben (10/B ábra). A stimulált mintákból készített lizátumok foszfotirozin blottjain a 35-40 kDa tartományban is jelentős tirozin foszforilációt figyeltünk meg, amely gyakorlatilag teljesen hiányzott FcγRIII-hiányos neutrofilekben (10/A ábra). Ezért felvetődött az ebben a magasságban található p38 MAP-kináz aktiválódása a jelátvitel során. Következő kísérleteinkben kimutattuk, hogy a sejtfelszíni integrinek keresztkötésének hatására vad típusú neutrofilekben létrejön a p38 MAP-kináz foszforilációja, míg ugyanez a válasz jelentősen csökkent FcγR3–/– sejtekben (10/C ábra). Fenti kísérleteink arra utalnak, hogy az anti-integrin anitestekkel való sejtaktiválás során az integrinek keresztkötése nem elégséges a neutrofilek szuperoxidtermelésének létrejöttéhez és az intracelluláris jelátviteli folyamatok aktiválódásához: mindezekhez szükség van az FcγRIII részvételére (az azon keresztüli ko-stimulációra) is.

42

10. ábra Intracelluláris jelátviteli folyamatok FcγRIII hiányos neutrofilekben anti-integrin antitestekkel stimulálva A, Anti-integrin antitest (és izotípus kontroll) (C71/16, Y13-238) hatására kialakuló teljes tirozin foszforiláció FcγR3–/– és vad típusú neutrofilekben B,

A Syk tirozin-kináz foszforilációjának alakulása FcγR3–/– és vad típusú neutrofilekben

immunoprecipitációval vizsgálva az A panelen bemutatott módon stimulálva C,

A p38 MAP-kináz foszforilációja a sejtekben az A panelen bemutatott módon stimulálva

foszfospecifikus anti-p38 MAP kináz antitest segítségével meghatározva

6.1.4. Az anti-integrin antitestek Fc részének jelentősége a válaszokban Az eddigiekben ismertetett kísérleteink arra utaltak, hogy a neutrofilek antiintegrin antitestekkel való aktiválása során fontos szerepet töltenek be a sejtfelszíni alacsony affinitású Fcγ-receptorok. Ennek egyik kézenfekvő (bár nem egyedüli lehetséges) magyarázata az Fcγ-receptorok aktiválódása az immobilizált anti-integrin antitestek Fc-részéhez való kötődés által. Ezt a lehetőséget úgy vizsgáltuk meg, hogy az anti-CD18 antitestről leemésztettük annak Fc-részét és az így kapott F(ab’)2 fragmentummal is elvégeztük a sejtaktiválást. Mivel ezen megközelítés nem igényelte genetikailag módosított neutrofilek felhasználását, a kísérletet humán CD18 ellenes antitesttel (illetve annak F(ab')2 fragmensével) stimulált humán neutrofileken végeztük. Ez egyben lehetőséget teremtett a korábbi, egér sejteken tett megfigyeléseink humán sejtekre való kiterjesztésére is.

43

Amint az a 11/A ábrán látható, az immobilizált intakt anti-CD18 antitestek a humán neutrofilek jelentős szuperoxid-termelését hozták létre. Az anti-CD18 antitestek F(ab’)2 fragmentumaival stimulált sejteken ugyanakkor nem volt megfigyelhető a szabadgyök-termelés fokozódása (11/A ábra; 1,5 ± 1,7% maradék aktivitás, p = 9,9 × 10-5, n = 3). A különbség oka feltehetőleg nem a kétféle antitest-preparátum eltérő mértékű felszínhez kötődése vagy a sejtek eltérő mértékű letapadása volt, mivel a humán neutrofilek hasonló mértékben kötődtek a felszínhez rögzített intakt anti-CD18 antitesthez és annak F(ab’)2 fragmentumához (11/B ábra). Ezen eredményeink arra utalnak, hogy az integrin ellenes antitestek Fc része feltétlenül szükséges a neutrofilek aktivációjának létrejöttéhez.

11. ábra Az immobilizált anti-CD18 F(ab’)2 nem váltja ki a humán neutrofilek aktiválódását A, Szuperoxid-termelés teljes anti-CD18 antitest és anti-CD18 F(ab’)2 fragmentum felületen humán neutrofilekben (IB4 anti-CD18-at és K9 izotípus kontrollt használva) B, Humán neutrofilek adhéziója teljes anti-CD18 antitest és anti-CD18 F(ab’)2 fragmentum felszínhez

6.1.5. Az Fcγ-receptorok blokkolásának hatása az effektor funkciókra Ha az immobilizált integrin ellenes antitestekkel kiváltott válaszokban valóban az antitest Fc részének Fcγ-receptorokkal való közvetlen kölcsönhatása játszik szerepet, akkor feltételezhetően a sejtfelszíni Fcγ-receptorok blokkolásával ki lehet védeni a neutrofilek aktiválódását. A következőkben ezt a lehetőséget vizsgáltuk mind egér, mind humán sejteken. A vad típusú egér neutrofilek FcγRII/III-at blokkoló antitesttel való előkezelése az izotípus kontroll antitesttel (anti-Gr1) való előkezeléshez képest jelentősen csökkentette a felszínhez kötött anti-CD18 antitest hatására létrejövő

44

szuperoxid-termelést (12/A ábra; 52 ± 11% maradék aktivitás, p = 4,2 × 10-5, n = 7). Az anti-Gr1-gyel kezelt sejtekhez képesti gátlás oka nem az izotípus kontroll antitest elégtelen kötődése volt a sejtfelszínhez, mivel az anti-Gr-1 nagyobb mennyiségben kötődött a sejtek felszínéhez, mint az anti-FcγRII/III antitest (12/B ábra). Az antiFcγRII/III antitest feltételezhetően az FcγRIII blokkolásán keresztül fejtette ki a gátló hatást, mert egerekből genetikailag hiányzik az FcγRIIA molekula, az FcγRIIB pedig gátló jellegű jeltovábbításban vesz részt. Ezen blokkoló antitesttel végzett kísérleteink tehát újabb, független megerősítését adták annak, hogy egér neutrofilekben az FcγRIIIon keresztüli ko-stimuláció lényeges szerepet tölt be az anti-integrin antitestekkel kiváltott sejtaktivációban.

12. ábra Az anti-CD18 antitesttel kiváltott szuperoxid-termelést gátolja az FcγRII/III blokkolása egér neutrofilekben A, Vad típusú neutrofilek anti-FcγRII/III (2.4G2) blokkoló vagy izotípus kontroll anti-Gr1 (RB6-8C5) antitesttel történő előinkubációt követő szabadgyök-leadása anti-CD18 (C71/16) és izotípus kontroll (Y13-238) felszínen B, Az anti-FcγRII/III és az anti-Gr1 kötődése a neutrofilek felszínéhez áramlási citometriával vizsgálva

A következőkben azt vizsgáltuk, hogy hogyan befolyásolja humán granulociták anti-integrin antitestekkel kiváltott aktivációját a humán Fc-receptorok antitestekkel történő blokkolása. Ellentétben az egér sejtekkel, ahol alacsony affinitású Fcγreceptorként munkánk idején csak az FcγRIII volt ismert (azóta egy újabb Fcγ-receptort,

45

az FcγRIV-et is azonosították), humán neutrofilekben két ilyen receptor található: az FcγRIIA és az FcγRIII (méghozzá az FcγRIII két izoformája közül a GPI-kapcsolt FcγRIIIB). Első megközelítésként, az egér neutrofilekben kapott eredmények alapján, az FcγRIII szerepét vizsgáltuk a folyamatban. Várakozásainkkal ellentétben a humán neutrofilek FcγRIII-blokkoló antitesttel való előinkubálása nem befolyásolta a felülethez kapcsolt anti-CD18 antitesttel kiváltott szuperoxid-termelést (13/A ábra; 99 ± 11% maradék aktivitás, p = 0,99 , n = 3). Ez valószínűleg nem a használt FcγRIIIellenes

antitest

receptor-blokkoló

hatásának

hiánya

miatt

volt,

mivel

az

immunkomplexek által mediált neutrofil aktivációt jelentősen gátolta az antitest (nem mutatott eredmény). Méréseink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy humán neutrofilekben az immobilizált anti-integrin antitestekkel kiváltott szuperoxidtermelésben nem játszik lényeges szerepet az FcγRIII. Ezek után arra kerestünk választ, hogy a másik alacsony affinitású Fcγ-receptor, az FcγRIIA blokkolásával gátolhatók-e humán neutrofilek anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszai. Mivel nem állt rendelkezésünkre azonos izotípusba tartozó kontroll antitest, a blokkoló antitest Fc-része által kiváltott esetleges mellékhatások elkerülése érdekében az anti-FcγRIIA-ból Fab fragmentumot preparáltunk, és ennek a hatását vizsgáltuk humán neutrofileken. Az így preparált anti-humán FcγRIIA blokkoló Fab fragmentummal előkezelt humán neutrofilekben a szuperoxid-termelés nagymértékű gátlása jött létre anti-CD18 felületen (13/B ábra; 25 ± 15% maradék aktivitás, p = 0,013, n = 3). A humán neutrofileken blokkoló antitesttel végzett kísérleteink eredményei megerősítik, hogy az alacsony affinitású aktiváló Fcγ-receptorokon keresztül létrejövő ko-stimuláció elengedhetetlen az

anti-integrin antitestekkel kiváltott válaszok

kialakulásához. Az egér sejtekkel ellentétben azonban humán granulocitákban a kostimuláció feltételezhetően az FcγRIIA közvetítésével jön létre.

46

13. ábra Az anti-CD18 antitesttel kiváltott szabadgyök-termelést gátolja az FcγRIIA blokkolása humán neutrofilekben (az FcγRIII blokkolása nem befolyásolja) A, Humán neutrofilek anti-FcγRIII (3G8) blokkoló vagy izotípus kontroll anti-CD45 (HI30) antitesttel történő előinkubáció utáni szabadgyök-leadása anti-CD18 (IB4) és izotípus kontroll (K9) felszínen B, Humán neutrofilek anti-FcγRIIA Fab (IV.3) blokkoló antitesttel történő előinkubáció utáni szabadgyök- leadása anti-CD18 (IB4) és izotípus kontroll (K9) felszínen

6.1.6. A "klasszikus" adherens aktivációban nem vesznek részt az Fcγ-receptorok Amint azt korábban említettem, a neutrofilek klasszikus integrin-függő aktiválása során a sejteket integrin-ligand felszínen (pl. fibrinogén vagy ICAM-1) szolubilis gyulladásos agonistákkal (pl. TNF-α citokinnel) aktiváljuk [38, 40]. A következőkben megvizsgáltuk az Fcγ-receptorok esetleges szerepét ezen "klasszikus" adherens aktiválási rendszerben. Kísérleteinkben nem találtunk különbséget a fibrinogén (14/A ábra; 105 ± 29% maradék aktivitás, p = 0,58, n = 10) vagy ICAM-1 (14/B ábra) felszínen TNF-fel stimulált vad típusú és FcγR3–/– egér neutrofilek szuperoxid-termelése között, és nem tapasztaltunk eltérést az izotípus kontrollal és a FcγRII/III blokkoló antitesttel előkezelt vad típusú egér neutrofilek között sem (ld. [I]). A humán FcγRIIA blokkolása szintén nem befolyásolta a fibrinogén-felszínen TNF-fel aktivált humán neutrofilek válaszait (14/C ábra; 110 ± 35% maradék aktivitás, p = 0,67, n = 3). Mindezen mérési eredményeink arra utalnak, hogy az Fcγ-receptorok nem játszanak

szerepet

az

integrin-ligand

felületen

47

TNF-fel

aktivált

neutrofilek

sejtválaszaiban, és egyben igazolták, hogy a kísérleteinkben alkalmazott génhiányos és blokkoló antitesttel kezelt neutrofilek Fc-receptor-független körülmények között képesek adhézió-függő módon aktiválódni és szabadgyököt termelni.

14. ábra Az alacsony affinitású Fcγ-receptorok nem szükségesek a TNF-fel integrin-ligand felületen kiváltott szuperoxid-termeléshez A, TNF hatására fibrinogén felszínen kialakuló szabadgyök-termelés FcγRIII hiányos neutrofilekben B, TNF hatására ICAM-1 felületen létrejövő szabadgyök-termelés FcγRIII hiányos neutrofilekben C, Anti-FcγRIIA blokkoló antitest Fab-vel történő előinkubáció utáni szuperoxid-termelés humán neutrofilekben fibrinogén felszínen TNF-fel indukálva

6.1.7. A károsodott szuperoxid-termelés helyreállítható FcγR3–/– neutrofilekben Eddigi eredményeink arra utaltak, hogy a sejtfelszíni integrinek keresztkötése önmagában nem elégséges a neutrofilek teljes aktivációjához: egy második (például TNF- vagy Fcγ-receptorok közvetítésével kialakuló) szignál jelenléte mindenképpen szükséges az adhézió-függő neutrofil válaszok létrejöttéhez. A következőkben arra kerestünk választ, hogy ezen "második" szignálok felcserélhetők-e, illetve mennyire

48

képesek helyettesíteni egymást. Ennek érdekében megkíséreltük TNF-fel helyreállítani az FcγR3–/– neutrofilek szabadgyök-termelését anti-CD18 felületen. Ezeket a méréseket magnéziumion hiányában végeztük, hogy megakadályozzuk az integrinek és természetes ligandjaik között létrejövő interakciót, tehát az integrinek csak antigénantitest kapcsolaton keresztül kötődhettek a felszínhez. A korábbiaknak megfelelően TNF hiányában a neutrofilek nem termeltek szuperoxidot az anti-CD18 antitesttel fedett felszínen (15. ábra). Az FcγR3–/– sejtekhez adott TNF azonban képes volt helyreállítani a sejtek szuperoxid-termelését az anti-CD18 felszínen, míg az izotípus kontroll felszínen továbbra sem jött létre sejtválasz (15. ábra; 75 ± 12% maradék aktivitás, n = 4). A TNF adása tehát helyettesítette az FcγR3–/– neutrofilekben hiányzó, FcγRIII-on keresztül kialakuló nem-integrin szignált. Ez a mérésünk arra utal, hogy a "második" (nem-integrin) szignálok egyenrangúak és egymással felcserélhetők. Megerősíti továbba azt, hogy az integrin- és nem-integrin szignálok együttesen szükségesek a sejtek aktiválódásához, önmagukban egyik sem elegendő a maximális sejtválasz létrejöttéhez.

15. ábra A TNF stimuláció helyreállította a károsodott szuperoxid-termelést anti-CD18 felületen FcγRIII hiányos neutrofilekben Szabadgyök-termelés anti-CD18 (C71/16), izotípus kontroll (Y13-238) antitest felszínen vad típusú és FcγR3–/– neutrofilekben TNF ko-stimuláció alkalmazásával, illetve nélküle

6.1.8. A p38 MAP-kináz szerepe a nem-integrin szignálok kialakulásában Előző eredményeink alapján arra következtethettünk, hogy a neutrofilek adhézió-függő aktivációjához két párhuzamos szignál szükséges: az első az integrinek

49

felől, míg a második (nem-integrin szignál) vagy szolubilis citokinreceptorok (TNF) vagy Fcγ-receptorok (egér FcγRIII vagy humán FcγRIIA) felől aktiválja a sejteket. Felmerült annak a lehetősége, hogy a két nem-integrin szignál közös jelpályában, esetleg (irodalmi adatok alapján) a p38 MAP-kinázban konvergálna. A következőkben ezen hipotézisünket vizsgáltuk meg. Eredményeink azt mutatták, hogy magnéziumionmentes oldatban szuszpenzióban tartott neutrofileken (ahol nem jön létre integrin-függő aktiváció) mind a TNF hozzáadása, mind az FcγRII/III keresztkötése jelentős p38 MAPkináz foszforilációt váltott ki (16/A és B ábra). Valószínű tehát, hogy mindkét nemintegrin szignál képes kiváltani a p38 MAP-kináz aktiválódását. A p38 MAP-kináznak a nem-integrin "második" szignálok kialakulásában betöltött szerepére utal a dolgozatban korábban mutatott eredményünk is, mely szerint FcγR3–/– neutrofilekben nem alakul ki a p38 MAP-kináz foszforilációja anti-CD18 felszínen (10/C ábra), tehát az integrinek keresztkötése

önmagában

valószínűleg

nem

elégséges

a

p38

MAP-kináz

aktiválódásához. A következőkben megvizsgáltuk, hogy hogyan befolyásolja a fibrinogén felszínen TNF hatására kialakuló, illetve immobilizált anti-CD18 által kiváltott szuperoxid-termelést a p38 MAP-kináz gátlószere, az SB203580 [107]. A vegyület mindkét stimulációs rendszerben erősen gátolta mind az egér (16/C ábra), mind a humán (16/D ábra) neutrofilek szabadgyök-termelését (100 µM SB203580 hatására anti-CD18-cal stimulálva egér neutrofileket 29 ± 6% maradék aktivitás, p = 1,9 ×10-4, n = 4; humán sejteket 4,2 ± 2% maradék aktivitás, p = 0,011 , n = 3) (100 µM SB203580 hatására fibrinogén felszínen TNF-fel stimulálva egér neutrofileket 4,4 ± 3% maradék aktivitás, p = 1,2 ×10-3, n = 3; humán sejteket 2,3 ± 2% maradék aktivitás, p = 1,8 ×10-3, n = 3). A p38 MAP-kináz tehát valószínűleg tényleg fontos szerepet tölt be a neutrofilek adhézió-függő aktivációjában.

50

16. ábra A p38 MAP-kináz szerepe az adhézió-függő neutrofil válaszokban A, A p38 MAP-kináz foszforilációja TNF hatására szuszbenzióban magnéziumion mentes körülmények között B, A p38 MAP-kináz foszforilációjának alakulása az FcγRII/III keresztkötésének hatására vad típusú és FcγRIII hiányos neutrofilekben magnéziumion mentes körülmények között C, Szabadgyök-termlés különböző koncentrációjú SB203580-nal előinkubált egér neutrofilekben antiCD18-al, illetve fibrinogén felszínen TNF-fel stimulálva D, Szabadgyök-termlés különböző koncentrációjú SB203580-nal előinkubált humán neutrofilekben antiCD18-cal, illetve fibrinogén felszínen TNF-fel stimulálva A C és D panel mérései során a kontroll értékek levonásra kerültek a stimulálás hatására kapott értékekből, majd százalékos arányban lettek megadva a gátlószerrel nem előinkubált mintákhoz (100%) viszonyítva

51

6.2. Az Fc-receptorok jelátvitele neutrofil granulocitákban∗ 6.2.1. Az immobilizált immunkomplex stimulus erősen aktiválja a neutrofileket A

kórokozók

elpusztításában

és

különböző

autoimmun

betegségek

kialakulásában központi szerepe van a granulociták Fc-receptorok közvetítésével kialakuló aktivációjának. Neutrofilekben a jelátviteli folyamat

mechanizmusa

kísérleteink kezdete előtt nagyrészt ismeretlen volt. Ezért a neutrofilek Fc-receptor szignalizációjának vizsgálatára beállítottunk egy speciális stimulálási rendszert, melynek lényege a sejtek felülethez kötött immunkomplexekkel (IC) való aktiválása. Ennek érdekében ELISA-lemezek üregeit humán szérumalbuminnal (HSA) fedtük, majd

blokkolás

után

anti-HSA

antitestekkel

hoztunk

létre

immobilizált

immunkomplexeket. Más természetes receptoron ható stimulusokkal összehasonlítva (TNF-stimulálás fibrinogén felszínen, fMLP-stimulálás citokalazin B (CB) jelenlétében) az ilymódon készült immunkomplexek-felszín általi sejtaktiválás a legnagyobb mértékű szuperoxid-termelést eredményezte, amely még az ismert legerősebb, nem-fiziológiás stimulus, a PKC-aktivátor PMA hatását is megközelítette (17/A ábra). Az általunk beállított,

immobilizált

immunkomplexek

által

közvetített

sejtaktiváció

tehát

természetes receptorokon keresztül képes igen erőteljes sejtválaszok kiváltására. A következőkben azt vizsgáltuk, hogy más antigén-antitest-párokkal képzett immunkomplexszel is ki lehet-e váltani a neutrofilek aktiválódását. Amint a 17/B ábrán látható,

a

laktoferrin–anti-laktoferrin

és

az

ovalbumin–anti-ovalbumin

immunkomplexek a HSA–anti-HSA komplexekhez hasonlóan erőteljesen aktiválták a neutrofileket. Az immobilizált immunkomplexek tehát a bennük található antigén specificitásától függetlenül jelentős neutrofil-aktivációt eredményeznek.

∗

Ebben a fejezetben publikálás előtt álló eredményeket mutatok be.

52

17. ábra Az immobilizált immunkomplexek (IC) erősen aktiválják a neutrofileket A, Különböző stimulációs rendszerek (PMA, fibrinogén + TNF, fMLP, IC) alkalmazása esetén kialakuló szuperoxid-termelés neutrofilekben (a jobb áttekinthetőség érdekében a kontroll kinetikai görbék levonásra kerültek) B, Különböző immunkomplexekkel indukált szabadgyök-leadás neutrofilekben (HSA+anti-HSA, Lfr+anti-Lfr, OVA+anti-OVA)

6.2.2. Az Fc-receptor γ-lánc, az Src-típusú kinázok és a Syk szerepe az immunkomplex stimulálás hatására kialakuló válaszokban Irodalmi adatok alapján (ahogy ezt már a dolgozat bevezetésében tárgyaltam) felmerült, hogy neutrofilekben az Fc-receptorok jelátvitelében szerepet játszhat az Fcreceptor γ-lánc, az Src-típusú tirozin-kinázok és a Syk tirozin-kináz. Kísérleteinkben ezért megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul az immobilizált immunkomplexek által kiváltott szabadgyök-termelés ezen fehérjék genetikai hiánya esetén. A számos Fcreceptor szignalizációs láncaként működő Fc-receptor γ-lánc hiányában teljesen megszűnt a neutrofil granulociták immunkomplexek által kiváltott szabadgyöktermelése (18/A ábra; 2,2 ± 3% maradék aktivitás, p = 3,7 ×10-4, n = 3). Hasonló károsodást láttunk olyan hármas mutáns sejtekben is, melyekből hiányzott a neutrofilekben kifejeződő mindhárom Src-típusú tirozin-kináz, a Hck, az Fgr és a Lyn (18/B ábra; -0,8 ± 2% maradék aktivitás, p = 1,5 ×10-4, n = 3). Végül az immunkomplex-felszínen kiváltott szabadgyök-termelés teljes hiányát tapasztaltuk Sykhiányos hemopoetikus rendszerrel rendelkező csontvelő-kimérák neutrofiljeiben is (18/ C ábra; -3,5 ± 4% maradék aktivitás, p = 2,1 ×10-5, n = 4).

53

18. ábra Fc-receptor γ-lánc (FcRγ), Hck/Fgr/Lyn (HFL) és Syk knockout neutrofilekben teljesen károsodott az immunkomplexekkel indukált szuperoxid-termelés A, Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) B, Hck/Fgr/Lyn (HFL) C, Syk hiányos neutrofilek szabadgyök-termelése immunkomplexszel aktiválva a sejteket

A fenti károsodások nem voltak specifikusak az immunkomplex-kiváltotta szabadgyök-termelésre, mivel az immunkomplex-felszínen történő szétterülés és a zselatináz granulumok ürülése szintén károsodott mindhárom mutánsban (nem mutatott adat).

A

funkcionális

válaszok

hiánya

azonban

nem

a

sejtek

eredendő

válaszképtelenségének következménye, mivel a PKC-aktivátor PMA-val mindhárom törzsben a vad típushoz hasonló szuperoxid-termelést lehetett kiváltani (nem mutatott adat). Eredményeink tehát arra utalnak, hogy az Fc-receptor γ-lánc, a Hck/Fgr/Lyn és a Syk tirozin-kináz lényeges szerepet játszik a neutrofilek immunkomplex-mediált (feltételezhetően Fc-receptoron keresztül létrejövő) sejtválaszaiban. 6.2.3. A Syk foszforilációja Src-kinázok és az Fc-receptor γ-lánc hiányában Mivel az Src-típusú kinázok, az Fc-receptor γ-lánc és a Syk elengedhetetlenek az immunkomplex kiváltotta sejtválaszok kialakulásához, felvetődött, hogy ezek a válaszok a klasszikus immunreceptorokra jellemző jelátviteli folyamatokon keresztül, tehát az Fc-receptor γ-lánc Src-kinázok általi foszforilációja és a Syk következményes kihorgonyzódása révén jönnek létre neutrofilekben. Ezért következő kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy milyen szerepet töltenek be az Src-típusú tirozin-kinázok és az Fcreceptor γ-lánc a Syk aktivációjában. Felülethez rögzített immunkomplexszel való stimulálást követően a vad típusú neutrofilekből precipitált Syk erőteljes tirozin-foszforilációját figyeltük meg (19 ábra).

54

Ez a foszforilációs válasz nem jött létre az Src-típusú tirozin-kinázokat gátló PP1-gyel [113, 114] való előkezelés után, illetve Src-kináz-hiányos (Hck–/–Fgr–/–Lyn–/–) sejtekben (19/A ábra). Fc-receptor γ-lánc hiányos neutrofilekben is a Syk foszforilációjának teljes károsodását találtuk (19/B ábra). Ezekből az eredményekből arra következethettünk, hogy mind az Src-típusú tirozin-kinázok, mind az Fc-receptor γ-lánc szükséges a Syk tirozin-kináz immunkomplex mediált aktiválásához neutrofilekben.

19. ábra A Syk-tirozin-kináz immunkomplex stimulálás hatására kialakuló foszforilációja nem jön létre Hck/Fgr/Lyn és Fc-receptor γ-lánc hiányában Immunkomplexszel stimulált (és kontroll) neutrofilekben a Syk tirozin-kináz foszforilációjának vizsgálata immunoprecipitációs megközelítéssel A, 10 µM PP1 jelenlétében, valamint Hck/Fgr/Lyn hiányában B, Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) knockout sejtekben

6.2.4. Az Fc-receptor γ-lánc foszforilációja A következőkben meg szerettük volna vizsgálni, hogy létrejön-e az Fc-receptor γ-lánc foszforilációja, illetve az Fc-receptor γ-lánc és a Syk kapcsolódása immunkomplexek által aktivált neutrofil granulocitákban, illetve hogy milyen viszonyban áll az Fc-receptor γ-lánc, az Src-típusú kinázok és a Syk a folyamat során. Ezen vizsgálataink kezdetén problémaként merült fel, hogy nem állt rendelkezésre

az

Fc-receptor

γ-lánc

foszforilációját

specifikusan

detektáló

(foszforiláció-specifikus) antitest, valamint nem találtunk olyan antitestet, amellyel a sejtekben megtalálható endogén Fc-receptor γ-láncot megfelelő hatékonysággal precipitálni tudtuk volna, ezáltal lehetővé téve az Fc-receptor γ-lánc foszforilációjának kimutatását. Ezért egy alternatív megközelítést alkalmaztunk, melyben a Syk két SH2-

55

doménjét tartalmazó fúziós fehérjével (GST-Syk(SH2)2) végzett precipitáció révén vizsgáltuk a Syk SH2-doménjeihez kötődni képes fehérjék (kötük az Fc-receptor γ-lánc) jelenlétét. A mérések során a gyöngyhöz kötött GST-Syk(SH2)2 fúziós fehérjével végeztünk precipitációt az immunkomplex felületen stimulált vagy kontroll neutrofilek lizátumaiból, majd a mintákat nem redukáló SDS-gélen történő futtatás után foszfotirozin-antitesttel hívtuk elő. Immobilizált immunkomplex stimulus hatására vad típusú sejtekből precipitálva jelentős mennyiségű tirozinon foszforilált fehérje jelent meg az Fc-receptor γ-lánc molekulatömege (nem redukáló körülmények között kb. 30 kDa) alapján várható magasságban (20. ábra, felső blot). Ezek a fehérjék feltételezhetően a foszforilált Fc-receptor γ-láncnak feleltek meg, a többszörös csíkok feltételezett magyarázata a több (legalább négy darab) foszforilációs hely lépésenkénti foszforilációjából adódó eltérő elektroforetikus mobilitás. Annak kizárása érdekében, hogy a GST-Syk(SH2)2 nem specifikusan precipitál a mintákból tirozinon foszforilált fehérjéket, irányított mutagenezis segítségével létrehoztuk a GST-Syk(SH2)2 fúziós fehérjének két pontmutációt tartalmazó formáját (a 41-es és a 194-es argininokat alaninra cseréltük), amelynek SH2 doménjei képtelenek kapcsolódni a tirozinon foszforilált Fc-receptor γ-lánchoz. Azt tapasztaltuk, hogy a működésképtelen SH2doméneket tartalmazó fúziós fehérjével precipitálva nem jelentek meg tirozinon foszforilált fehérjék 30 kDa-os magasságban a precipitátumokban (20. ábra, felső blot). A méréseinkben kapott eredményeink alátámasztják, hogy a módszerrel valóban specifikusan a Syk SH2 doménjeinek foszfotirozinokkal való interakcióját tudtuk meghatározni. Az immunkomplexszel stimulált neutrofil-lizátumokból végzett GST-Syk(SH2)2 precipitátumok Fc-receptor γ-lánc-ellenes antitesttel való előhívása során szintén számos csík megjelenését tapasztaltuk a foszforilált Fc-receptor γ-láncnak megfelelő 30 kDa körüli magasságban (20. ábra, alsó blot). Ezekről a (a blotton magasabban látható) csíkokról megállapíthattuk, hogy megfelelnek a stimulált mintákban a foszforilált Fcreceptor γ-láncnak. Az alacsonyabban látható csík feltehetően a nem-foszforilált Fcreceptor γ-láncnak a GST-hez vagy a gyöngyökhöz való nem specifikus kötődése miatt jelennek meg, hiszen ez a csík GST-t tartalmazó gyöngyökkel végzett precipitáció során is kimutatható (nem mutatott adat). A magasabban elhelyezkedő csíkok nem voltak jelen a működésképtelen SH2-doméneket tartalmazó GST-Syk(SH2)2 mutáns fehérjével

56

precipitált mintákban (20. ábra, alsó blot), megerősítve azt a feltételezésünket, hogy ezek a csíkok a Syk SH2-doménjeihez kapcsolódni képes, foszforilált Fc-receptor γláncnak feleltek meg.

20. ábra Immunkomplex stimulus hatására Src-típusú tirozin-kináz-függő módon foszforilálódik az Fc-receptor γ-lánc 10 µM PP1 gátlószerrel előinkubált vagy kezeletlen vad típusú neutrofilek aktiválása immunkomplex felületen, a kapott lizátumokból precipitációt végeztünk vad típusú vagy két pontmutációt tartalmazó (R41A és R194A) GST-Syk(SH2)2-vel, a blottok foszfotirozinra és Fc-receptor γ-láncra (FcRγ) lettek előhívva

A fenti kísérlettel párhuzamosan megvizsgáltuk, hogy szükségesek-e az Srctípusú tirozin-kinázok az Fc-receptor γ-lánc foszforilációjához és a Syk SH2doménjeihez való kapcsolódásához. Amint az a 20. ábrán látható, a GST-Syk(SH2)2 precipitátumokban megfigyelhető foszfotirozin- és magasabb molekulatömegű Fcreceptor γ-lánc-csíkok nem voltak megfigyelhetők PP1-gyel előkezelt neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódását követően. Ez a megfigyelésünk arra utal, hogy a az Src-típusú tirozin-kinázok elengedhetetlenek az Fc-receptor γ-lánc foszforilációjához neutrofilek immunkomplexek általi aktivációja során. Fent ismertetett eredményeink arra utalnak, hogy az immunkomplexek általi neutrofil-aktiválódás során az Src-típusú tirozin-kinázok foszforilálják az Fc-receptor γláncot, amely a Syk SH2-doménjein keresztül kihorgonyozza a Syk-et a receptorkomplexhez. Ez az immunreceptorok jelátviteléhez hasonló folyamatok szerepét valószínűsíti a neutrofil granulociták aktiválódása során.

57

6.2.5. MAP-kinázok az immunkomplexek jelátvitelében neutrofilekben Irodalmi adatokból ismert, hogy az IgG-vel fedett vörösvértestek fagocitózisa indukálja a MAP-kinázok aktiválódását [115]. Ez a megfigyelés felvetette a különböző MAP-kinázok (ERK és p38 MAP-kináz) szerepét az Fc-receptorokból kiinduló jelpályákban neutrofil granulocitákban. A

különböző

MAP-kinázok

szerepének

tisztázása

érdekében

először

megvizsgáltuk, hogyan alakul az ERK és a p38 MAP-kinázok foszforilációja neutrofil granulociták immunkomplex általi aktivációja során. Kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy immunkomplex stimulus hatására mind az ERK1/2, mind a p38 MAP-kináz jelentős foszforilációja jött létre vad típusú neutrofilekben (21. ábra). Mindkét foszforilációs válasz nagymértékben károsodott Fc-receptor γ-lánc hiányos, Src-családhiányos (Hck–/–Fgr–/–Lyn–/–), valamint Syk-hiányos neutrofilekben (21/A, B és C ábra). Eredményeink azt támasztják alá, hogy az Fc-receptorok jelátvitele során az Fc-receptor γ-lánc, az Src-típusú tirozin-kinázok és a Syk közvetítésével jön létre a MAP-kináz kaszkádok aktivációja. Mivel mind az ERK1/2, mind a p38 MAP-kináz erősen foszforilálódott a felszínhez kötött immunkomplexek hatására, felmerült bennünk ezen fehérjék funkcionális szerepe a neutrofilek sejtválaszaiban is. Ezt a lehetőséget az ERK, illetve a p38 MAP-kináz kaszkád gátlószerei segítségével vizsgáltuk.

21. ábra A p38 és az ERK1/2 MAP-kináz foszforilációja zavart szenved Fcreceptor γ-lánc, Hck/Fgr/Lyn és Syk hiányában Az p38 és az ERK1/2 foszforilációja immunkomplex felszínen stimulált Fc-receptor γ-lánc (FcRγ) (A), Hck/Fgr/Lyn (B), Syk (C) knockout és vad típusú neutrofilek lizátumaiból Western blot technikával meghatározva

58

Humán neutrofilekben a p38 MAP-kináz gátlószere (SB205380) már 10 µM koncentrációnál jelentős mértékben gátolta az immunkomplexek által kiváltott szabadgyök-termelést, a szer koncentrációjának további emelése pedig a gátlás fokozódását eredményezte. Az ERK1/2 aktiválódását gátló PD98059 ezzel szemben csak magasabb (50 µM) koncentrációnál okozott jelentős gátlást. A két szer együttadása további gátlást eredményezett és a legmagasabb koncentrációnál teljesen megszűntette a sejtválaszt (22/A ábra; 50 µM SB203580 és 50 µM PD98059 együttadása esetén 0,8 ± 2% maradék aktivitás, p = 8,2 ×10-4, n = 3). Hasonló, bár mértékében eltérő gátlást kaptunk az egér neutrofilek SB203580nal, illetve PD98059-cel való előkezelése során. Ezen sejteken nem volt lényeges különbség az SB203580 és a PD98059 hatása között, mindkét szer az immunkomplexkiváltotta

válaszok

részleges,

koncentráció-függő

módon

emelkedő

gátlását

eredményezte. A két szer együttadása itt is nagyobb mértékű gátlás hozott létre, amely a legnagyobb tesztelt koncentráció (50 µM) mellett nagymértékű, bár –a humán eredményekkel ellentétben– továbbra sem teljes gátlást eredményezett (22/B ábra; 50 µM SB203580 és 50 µM PD98059 együttadása esetén 23 ± 11% maradék aktivitás, p = 0,01, n = 3).

22. ábra A MAP-kinázok szerepe a neutrofilek immunkomplexszel kiváltott szuperoxidtermelésében Humán (A) és egér (B) neutrofilek immunkomplexekkel idukált szuperoxid-leadása MAP-kináz gátlószerek (SB203580 és PD98059) jelenlétében

A MAP-kináz-kaszkádok gátlószereivel kapott eredmények arra utalnak, hogy részben átfedő módon mind az ERK, mind a p38 MAP-kináz részt vesz a neutrofilek

59

immunkomplexek-kiváltotta szabadgyök-termelésében. Humán neutrofileken ezen belül dominál az SB203580-érzékeny p38 MAP-kináz(ok) szerepe (egér neutrofilekben nem tapasztaltunk hasonló dominanciát).

6.3. Kinázok szerepe a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében 6.3.1. Az Src-típusú tirozin-kinázok szerepe a degranulációs folyamatokban Témavezetőim korábban általános tirozin-kináz gátlószerek felhasználásával igazolták, hogy tirozin-kinázok szerepet játszanak a neutrofilek fMLP-vel indukált, Gfehérje-kapcsolt receptorok közvetítésével megvalósuló effektor válaszaiban [91]. Munkánk kezdetén nem volt ismert azonban, hogy mely kinázok vesznek részt az fMLP hatására kialakuló sejtválaszokban. Az fMLP jelátvitelében először az Src-típusú tirozin-kinázok szerepét vizsgáltuk a korábban említett PP1 gátlószer alkalmazásával. Ezen kísérleteinkben a neutrofilek válaszai közül a különböző granulumtípusok ürülését vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a PP1 [113, 114] koncentrációfüggő módon gátolta mind a primer granulum marker βglukuronidáz (30 µM PP1 hatására 52 ± 12% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 6), mind a szekunder granulum marker laktoferrin fMLP-kiváltotta ürülését (30 µM PP1 hatására CB-vel 42 ± 11% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 6; CB nélkül 17 ± 11% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 4) (23. ábra). A laktoferrin exocitózisát a PP1 mind CB jelenlétében, mind CB hiányában gátolta, az Src-kinázok részvétele a folyamatban tehát független attól, hogy elősegítjük-e a granulomok külső térbe ürülését a kérgi aktin citoszkeleton lebontásával. A primer és szekunder granulumokkal ellentétben a PP1 nem befolyásolta a szekretoros vezikulák markerének, a humán szérum-albuminnak a leadását (30 µM PP1 hatására 92 ± 26% maradék aktivitás, p > 0,05, n = 6) (23. ábra). Ezen eredményeink azt mutatták, hogy az Src-típusú tirozin-kinázok alapvető szerepet játszanak a primer és szekunder granulumok leadásában (ezt a következtetést témavezetőm Src-kináz-hiányos egereken végzett mérései [II] is megerősítették), nem szükségesek viszont a szekretoros vezikulák exocitózisához.

60

23. ábra Az Src-típusú tirozin-kinázok szerepe a neutrofilek degranulációs folyamataiban CB+fMLP hatására kialakuló válasz százalékában ábrázoltuk a primer és szekunder granulumok, valamint szekretoros vezikulák ürítését (β-Glu: primer granulum; Lfr: szekunder granulum; HSA: szekretoros vezikula marker)

6.3.2. A MAP-kinázok szerepe az fMLP-kiváltotta degranulációban Több

munkacsoport

kimutatta,

hogy

fMLP

hatására

szuszpenzióban

aktiválódnak az ERK és p38 MAP-kinázok [88-90], ismeretlen volt azonban a MAPkinázok szerepe a neutrofilek funkcionális válaszaiban. Következő méréseinkben ezért gátlószerek alkalmazásával vizsgáltuk, hogy miként vesznek részt a MAP-kinázok a neutrofilek degranulációs folyamataiban. A p38 MAP-kinázt gátló SB203580 szignifikánsan csökkentette a βglukuronidáz (100 µM SB203580 hatására 52 ± 13% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 4) és a laktoferrin fMLP-kiváltotta leadását (100 µM SB203580 hatására CB-vel 49 ± 19% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 4; CB nélkül (100 µM SB203580 hatására 38 ± 5% maradék aktivitás, p < 0,05, n = 3), bár a gátlás mértéke a legmagasabb alkalmazott koncentrációknál is csak közel 50%-os volt (24. ábra). A laktoferrin-leadás mind CB jelenlétében, mind CB hiányában SB203580-érzékenynek bizonyult, tehát a p38gátlószer hatását nem befolyásolta a kortikális aktin-citoszkeleton jelenléte. A primer és szekunder granulumokkal szemben az SB203580 nem gátolta a szekretoros vezikulák ürülését (100 µM SB203580 hatására 102 ± 27% maradék aktivitás, p > 0,05, n = 4) (24. ábra). Az SB203580-nal ellentétben az ERK1/2-t gátló PD98059 egyik

61

exocitotikus kompartment fMLP-kiváltotta ürülését sem befolyásolta (nem mutatott adat) [II]. Méréseink arra utalnak, hogy a p38 MAP-kináz szerepet játszik az fMLPkiváltotta primer és szekunder granulum-ürülésben, de nem vesz részt a szekretoros vezikulák exocitózisában. Az ERK1/2 ezzel szemben nem szükséges egyik kompartment ürüléséhez sem.

24. ábra A p38 MAP-kináz szerepe a neutrofilek degranulációs folyamataiban CB+fMLP hatására kialakuló válasz százalékában ábrázoltuk a primer és szekunder granulumok, valamint szekretoros vezikulák ürítését a p38 MAP-kináz gátlószer SB203580 jelenlétében és hiányában (β-Glu: primer granulum; Lfr: szekunder granulum; HSA: szekretoros vezikula marker)

Mivel a primer és a szekunder granulumok fMLP-kiváltotta leadásában feltételezhetően mind a p38 MAP-kináz, mind az Src-kinázok fontos szerepet játszanak (21. és 24. ábra), felvetődött, hogy a p38 MAP-kináz aktivációja az Src-típusú tirozinkinázok közvetítésével jön létre. Ezt a lehetőséget vizsgálva sikerült kimutatnunk, hogy az Src-kinázokat gátló PP1 nagymértékben csökkentette a p38 MAP-kináz fMLP-vel kiváltott

foszforilációját

(25.

ábra),

tehát

a

p38

MAP-kináz

aktiválódása

feltételezhetően tényleg az Src-típusú tirozin-kinázok közvetítésével jön létre. Ezt a következtetést

témavezetőm genetikailag

Src-család-hiányos

neutrofileken végzett kísérletei is megerősítették [II].

62

(Hck–/–Fgr–/–Lyn–/–)

25. ábra Az Src-típusú tirozin-kináz inhibitor (PP1) jelentősen gátolta a p38 MAP-kináz foszforilációját szuszpenzióban fMLP-vel kiváltott p38 MAP-kináz foszforiláció humán neutrofilekben Src-kináz inhibitor (30µM PP1) jelenlétében és hiányában

Összességében

tehát

úgy

tűnik,

hogy

fMLP-vel

stimulált

neutrofil

granulocitákban a primer és szekunder granulumok ürülése az Src-kinázokon keresztül aktiválódó p38 MAP-kináz közvetítésével jön létre. 6.3.3. A Syk nem játszik szerepet az fMLP hatására létrejövő degranulációban Heterológ expressziós rendszerekben kapott eredmények, illetve a piceatannol gátlószerrel nyert adatok alapján több munkacsoport felvetette, hogy a G-fehérjekapcsolt receptorok jelátvitele a Syk tirozin-kináz közvetítésével valósul meg [92, 93, 95-97]. Korábban mi is kimutattuk, hogy a piceatannol gátolja a primer és szekunder granulumok fMLP-kiváltotta leadását, bár a Syk aktivációjának hiánya megnehezítette a gátlószerrel kapott eredmények interpretálását [II]. Más munkacsoportok adatai ugyanakkor arra utaltak, hogy a Syk tirozin-kináz nem vesz részt a G-fehérje-kapcsolt receptorok

szignalizációjában

[98].

A

kérdés

tisztázását

megnehezítette

a

piceatannolnak a Syk-től független folyamatokra való nem-specifikus gátló hatása is [99]. Mindezen eredmények tükrében elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk a különböző endogén G-fehérje-kapcsolt receptorok által kiváltott sejtválaszokat genetikailag Sykhiányos primer sejtekben (neutrofil granulocitákban és hízósejtekben) is.

63

26. ábra A Syk nem tölt be lényeges szerepet a neutrofilek fMLP-vel kiváltott degranulációjában fMLP-vel indukált laktoferrin (Lfr: a szekunder granulumok markere) leadás Syk hiányos és vad típusú neutrofilekben a CB+fMLP hatására kialakuló válasz százalékában

Amint azt a 26. ábra mutatja, Syk-hiányos csontvelő-kimérákból izolált neutrofilek fMLP hatására a vad típusú sejtekhez hasonló mértékben ürítették a szekunder granulum marker laktoferrint (87,7 ± 27,2% maradék aktivitás, p = 0,41, n = 6). Hasonló eredményre vezetett a primer granulumok exocitózisának vizsgálata is [III]. A Syk tehát nem szükséges a neutrofil granulociták fMLP-kiváltotta degranulációs folyamatainak létrejöttéhez. 6.3.4. A Syk nem szükséges az fMLP-vel és MIP-2-vel indukált jelátviteli folyamatokhoz Következő kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul a különböző MAP-kinázok foszforilációja fMLP-vel vagy MIP-2 kemokinnel aktivált Syk-hiányos neutrofilekben. Méréseink során egyik agonista esetében sem találtunk különbséget az ERK1/2 vagy a p38 MAP-kináz foszforilációjában a vad típusú és a Syk–/– sejtek között (27/A ábra). Egér neutrofilekben fMLP hatására bifázisos kalcium-jel alakult ki: az első csúcs a belső raktárakból felszabaduló kalciumnak, míg a második a kapacitatív kalcium influxnak felel meg. Kísérleteinkben nem találtunk különbséget a vad típusú és a Syk hiányos neutrofilek között az fMLP kiváltotta kalciumjel egyik fázisának a lefutásában sem (27/B ábra). Az fMLP-vel szemben a MIP-2 kemokin nagymértékű és gyors citoplazmatikus kalciumemelkedést hozott létre, a második (fMLP stimulus esetén

64

tapasztalható) fázis viszont lényegében elmarad. Amint a 27/C ábra mutatja, a MIP-2 által kiváltott kalciumjel lefutását szintén nem befolyásolta a Syk–/– mutáció.

27. ábra Normál intracelluláris jelátvitel syk–/– neutrofilekben A, A p38 és az ERK MAP kinázok foszforiációja vad típusú és Syk hiányos neutrofilekben fMLP és MIP-2 stimulus hatására szuszpenzióban foszfospecifikus antitestekkel vizsgálva a folyamatot A kalciumjel alakulása szuszpendált vad típusú és syk–/– neutrofilekben fMLP-vel (B), illetve MIP-2-vel (C) indukálva

A fenti eredmények, valamint témavezetőm további kísérletei [III] alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a Syk tirozin-kináz sem neutrofilekben, sem hízósejtekben nem vesz részt a G-fehérje-kapcsolt receptorok által kiváltott sejtválaszokban. A korábbi feltételezésekkel ellentétben tehát a Syk nem képezi központi elemét a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelének.

65

7. Megbeszélés Ph.D.-munkám során a neutrofil granulociták különböző receptorok irányából történő aktiválódásának mechanizmusát és az abban résztvevő intracelluláris jelátviteli folyamatokat vizsgáltam. A bemutatott kísérletek három témakör köré csoportosultak: 1) az integrin és a nem-integrin szignálok viszonya az adherens aktiváció során; 2) az Fc-receptorok jelátvitele; és 3) kinázok részvétele a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében. A neutrofilek működése során számos funkcionális válasz (letapadás, vándorlás, antimikrobiális folyamatok) integrinek közvetítésével alakul ki. Bár ezen válaszok létrejöttéhez mind integrin, mind nem-integrin receptorok aktiválódása szükséges, az integrin, illetve a nem-integrin szignálok egymáshoz való viszonya (hierarchiája) nem volt teljesen tisztázott. A neutrofilek adhézió-függő aktiválódásának klasszikus módja az integrin-ligand felszínre helyezett neutrofilek egyidejű aktiválása szolubilis agonista hozzáadásával [38]. A két különböző szignál (integrin-ligand felszín és szolubilis agonista) a sejtaktivációhoz való relatív hozzájárulása és egymáshoz való viszonya azonban sokáig ismeretlen volt. Mivel, szemben a fenti "klasszikus" adherens aktivációval, immobilizált anti-integrin antitestek segítségével további (szolubilis) stimulus nélkül is sikerült nagymértékű sejtaktivációt kiváltani [41], elterjedt az a nézet, hogy az integrinek keresztkötése önmagában elegendő a sejtválaszok létrejöttéhez. Ezen eredmények alapján feltételezték, hogy a "klasszikus" adherens aktiválás során a szolubilis agonistáknak kizárólag az a szerepe, hogy (az ún. "inside-out" jeltovábbítás során) elősegítsék az integrinek ligandjaikhoz való kapcsolódását az integrinek affinitásának és/vagy aviditásának a növelése által. Ennek alapján tehát egy lineáris aktivációs modellt valószínűsítettek, amelyben a két szignál között alá-fölérendelt (hierarchikus) viszony van. Elfogadottá vált az is, hogy az integrinek által létrehozott (ún. "outside-in") jeltovábbítás vizsgálatára a legalkalmasabb módszer az anti-integrin antitestekkel történő stimulálás, mivel ebben az esetben nem szükséges egyéb stimulusok hatására bekövetkező folyamatokkal számolni.

66

A fenti elképzeléssel szemben a dolgozat első részében bemutatott adataink az integrin és nem-integrin szignálok mellérendeltségét valószínűsítik. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a korábbi feltételezésekkel ellentétben az anti-integrin antitesttel történő stimulálás során a neutrofilek teljes aktivációja szintén két, egymástól független szignál révén alakul ki. Ebben az esetben azonban a második szignál nem a szolubilis agonisták (pl. TNF) felől, hanem az alkalmazott anti-integrin antitestek Fcrésze által aktivált alacsony affinitású Fcγ-receptorok (egér sejtekben az FcγRIII, humán granulocitákban az FcγRIIA) felől indul ki. Eredményeink egyben arra utalnak, hogy az integrinek keresztkötése önmagában nem elegendő a neutrofilek teljes aktivációjához, illetve a második, nem-integrin szignálnak nem csupán az a funkciója, hogy elősegítse az integrinek ligandkötését, tehát nem helytálló a korábbi, lináris jelpályáról kialakított elképzelés sem. Eredményeink az integrin és nem-integrin szignálok mellérendeltségét valószínűsítik az adhézió-függő aktivációban. Munkánk folyamán az első érvünk amellett, hogy az Fcγ-receptorok is részt vesznek az anti-integrin antitestek hatására kialakuló effektor funkciókban az volt, hogy az Fc-receptor γ-lánc hiányában teljesen károsodott az adhézió-függő szuperoxidtermelés. Sokáig azt tartották, hogy az Fc-receptor γ-lánc csupán az Fc-receptorok szignalizációs lánca. Azonban mostanra ismertté vált, hogy számos egyéb receptor is az Fc-receptor γ-lánc közvetítésével indukál jelátviteli folyamatokat [58-69] [IV]. Ezért Fc-receptor

γ-lánc

knockout

neutrofileken

végzett

méréseink

alapján

nem

következtethettünk egyértelműen arra, hogy az Fc-receptorok szerepet játszanak a sejtválaszok kialakításában. További kísérleteinkben azonban három, egymástól független megközelítéssel megerősítettük, hogy az Fcγ-receptorok közvetítésével kialakuló stimuláció elengedhetetlen a neutrofilek anti-integrin antitestekkel indukált teljes aktivációjához: FcγRIII-hiányos neutrofilekben megszűnt, az Fcγ-receptorokat blokkoló antitestek jelenlétében pedig erősen csökkent a szabadgyök-termelés, és a teljes antitestekkel szemben az anti-CD18 antitestek F(ab’)2 fragmentuma nem volt képes a sejtválasz kiváltására. Az FcγR3–/– neutrofilekben kimutatott károsodás lehet annak a következménye, hogy a receptor hiányában az antitest Fc része nem képes kötődni FcγRIII-hoz, vagy hogy az Fcγ-receptor valamilyen jelátviteli funkciót tölt be a folyamatban (például az integrin-receptor komplex részeként játszik jelátvivő szerepet anélkül, hogy közvetlen

67

kapcsolatot alakítana ki az extracelluláris immunglobulinnal). A felszínhez kötött antiCD18 F(ab’)2 fragmentumok általi sejtaktiválás hiánya és az Fcγ-receptor-blokkoló antitestek gátló hatása az előbbi lehetőséget valószínűsítik, tehát az anti-integrin antitestek általi stimuláció során egymástól függetlenül az antitest Fab része az integrinekhez, míg az Fc része az Fcγ-receptorokhoz kötődik, ezáltal (két párhuzamos szignál révén) kiváltva a neutrofilek teljes aktivációját. Méréseinkben kimutattuk, hogy egér neutrofilekben az FcγRIII szükséges az anti-integrin antitestekkel indukált sejtválaszokhoz. Egér neutrofilekben az aktiváló, alacsony affinitású Fcγ-receptorok közül az FcγRIII és a –nemrég azonosított– FcγRIV van jelen [116], eredményeink alapján azonban úgy tűnik, hogy az utóbbinak nincs szerepe

az

anti-integrin

antitestek

által

létrejött

sejtaktivációban.

Emberi

fehérvérsejtekben három aktiváló Fcγ-receptor ismert: az FcγRIIIA (amely megfelel az egér FcγRIII-nak), az FcγRIIA és az FcγRIIIB. Ezen alacsony affinitású receptorok szignalizációs mechanizmusában lényeges különbségek vannak. Az FcγRIIA saját ITAM motívumot tartalmaz, míg az FcγRIIIA (megegyezően az egér FcγRIII-al) a nem kovalensen kapcsolt Fc-receptor γ-láncot használja szignalizációs oldalláncként. Az FcγRIIIB-nek nincs transzmembrán vagy intracelluláris doménje (GPI-hez kapcsolódva horgonyzódik a plazmamembránhoz) és nem kapcsolódik az Fc-receptor γ-lánchoz sem. Az FcγRIIIB pontos szerepe és működésének mechanizmusa nem ismert. Többen azt valószínűsítik, hogy a FcγRIIIB funkcionálisan kapcsolódik az FcγRIIA-hoz és annak közvetítésével szignalizál [117, 118]. A humán neutrofilek felszínén a fenti alacsony affinitású receptorok közül az FcγRIIA és az FcγRIIIB kerül kifejezésre. Kísérleteinken FcγRIII blokkoló antitest felhasználásával (amely mind az FcγRIIIA-t, mind az FcγRIIIB-t blokkolja) azt találtuk, hogy az FcγRIIIB nem tölt be lényeges funkciót humán neutrofilek integrin-ellenes antitestekkel kiváltott válaszaiban. Az FcγRIIA blokkolásával kapott eredményeink ehelyett azt támasztják alá, hogy humán sejtekben a másodlagos, nem-integrin szignál az FcγRIIA közvetítésével jön létre. Érdekes kérdésként merül fel, hogy hogyan alakulnának a fenti válaszok Fc-receptor γ-lánc hiányos humán neutrofilekben, hiszen FcγRIIA feltételezhetően saját ITAM motívumának (nem pedig az Fc-receptor γ-lánc ITAM-jének) közvetítésével aktiválja a jelátviteli folyamatokat.

68

A

neutrofilek

anti-integrin

antitestekkel

történő

aktiválását

számos

munkacsoport alkalmazta az integrinek jelátvitelének jellemzésére [28, 42-53]. A dolgozatom első részében bemutatott eredményeink alapján azonban szükségessé válik a korábbi kísérletekből levont következtetések újraértelmezése, mivel az Fcγ-receptorok is közreműködnek a sejtaktivációban, tehát az anti-integrin antitestekkel történő stimuláció során nem csak az integrineken keresztüli stimuláció hozza létre a neutrofilek effektor válaszait. Adataink összhangban vannak más sejttípusokban kapott eredményekkel is. Számos különböző rendszerben és sejttípusban igazolták, hogy az integrineken keresztül kialakuló szignálok

önmagukban nem elegendőek a sejtek teljes

aktiválódásához, szükséges egy második, nem-integrin jel is. A T limfociták T-sejtreceptoron keresztül indukált citotoxicitásához elengedhetetlen az αLβ2 integrin [119], a fibroblasztok β1 integrin-függő proliferációja növekedési faktorok hiányában nem alakul ki [22], az oszteoklasztok differenciációja, valamint fúziója αVβ3 integrinek közvetítésével jön létre M-CSF és RANK-ligand jelenlétében [120, 121]. Méréseinkben kimutattuk, hogy a TNF képes helyreállítani FcγRIII-hiányos neutrofilek szabadgyök-termelését immobilizált anti-CD18 felszínen. Ezen eredmény alátámasztja, hogy az anti-CD18 FcγRIII hiányában is képes kiváltani a sejtaktiváció integrinen keresztüli komponensét, ha egy másik szignál (pl. TNF) jelen van. Kimondhatjuk továbbá, hogy a nem-integrin, második szignálok felcserélhetőek, egymással helyettesíthetőek. A p38 MAP-kináz az interginek ligandkötése nélkül (szuszpenzióban, magnéziumion-mentes oldatban) is aktiválható az Fcγ-receptorok keresztkötésével vagy TNF hozzáadásával. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy a TNF-fel vagy Fcγreceptorokon keresztül kialakuló "második" szignálok a p38 MAP-kinázban konvergálnak. Az is alátámasztja a p38 MAP-kináz részvételét a folyamatban, hogy annak gátlószere, az SB203580 mind a fibrinogén felszínen TNF-fel, mind az immobilizált anti-CD18-cal kiváltott neutrofil-válaszokat hatékonyan gátolta. Összefoglalva tehát a neutrofilek maximális adhézió-függő aktivációjához két egymás mellé rendelt szignál szükséges: az egyik az integrinek felől, míg egy másik valamely nem-integrin receptor felől (pl. TNF-en vagy Fc-receptoron keresztül). Mindkét szignál egyidejű jelenléte elengedhetetlen az adhézió-függő effektor funkciók

69

kialakulásához. A második, nem-integrin szignálok valószínűleg a p38 MAP-kinázban konvergálnak (28. ábra). Nem-integrin szignál

Integrin-függő szignál Integrinek

Fcγ-recptorok

TNF

p38 MAP-kináz

A neutrofilek teljes aktiválódása 28. ábra Az adhézió-függő válaszokhoz ko-stimuláció szükséges (egy integrin és egy nem-integrin szignál egyidejű jelenléte elengedhetetlen)

Jól ismert, hogy az opszonizált kórokozók elpusztításában és számos autoimmun kórfolyamat kialakulásában alapvető szerepet játszik a neutrofilek Fcγ-receptorokon keresztüli stimulációja. Így glomerulonephritisben a bazális membránhoz, arthritisben a szinoviális membránhoz lokalizálódnak immunkomplexek, amelyek nagymértékben képesek aktiválni a különböző immunsejteket, köztük a neutrofil granulocitákat [84, 85, 122]. Az ezekben a kórfolyamatokban létrejövő szövetkárosodás jelentős hányadáért a neutrofilek felelősek. Ph.D. munkám második részében kidolgoztunk egy mérési módszert, amely lehetővé tette a neutrofilek immunkomplexekkel kiváltott, Fcreceptorokon keresztüli aktiválódását, és jellemeztük az ebben a kísérleti rendszerben szerepet játszó intracelluláris jelátviteli folyamatokat. Modellrendszerünkben felülethez rögzített immunkomplexekkel a neutrofilek nagymértékű aktiválódását tudtuk kiváltani, amely jelentősen meghaladta az egyéb természetes stimulusokkal (TNF-fel fibrinogén felszínen, fMLP-vel szuszpenzióban) indukálható válaszokat. A jelátvitel feltérképezése során génhiányos egerek segítségével kimutattuk, hogy az Fc-receptor γ-lánc, az Src-típusú tirozin-kinázok (Hck, Fgr és Lyn), valamint a Syk tirozin-kináz alapvető jelentőséggel bír az immunkomplexekkel létrehozott

neutrofil-válaszokban.

Igazoltuk

70

továbbá,

hogy

immobilizált

immunkomplexek hatására Src-kinázok közvetítésével foszforilálódik az Fc-receptor γlánc, valamint hogy a Syk aktivációjához elengedhetetlenek mind az Src-típusú tirozinkinázok, mind az Fc-receptor γ-lánc. Összességében tehát sikerült azonosítanunk egy, feltehetően az Fc-receptorokhoz közeli ("proximális") jelátviteli kaszkádot, melyben az Src-típusú tirozin-kinázok által foszforilált Fc-receptor γ-lánc kihorgonyozza és aktiválja a Syk tirozin-kinázt. Ez a proximális jelkaszkád elengedhetetlen a neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódásához. További kísérleteink azt mutatták, hogy az immunkomplexek létrehozzák mind az ERK, mind a p38 MAP-kinázok aktiválódását, amihez elengedhetetlenek a fenti "proximális" jelkaszkád elemei. Gátlószererekkel végzett funkcionális méréseink arra utaltak, hogy bár egymást részben átfedve, de mind az ERK, mind a p38 MAP-kinázok fontos szerepet töltenek be a neutrofilek immunkomplex-kiváltotta aktiválódásában. Ezen kísérleteinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a neutrofil granulociták immunkomplexek által, Fc-receptorokon keresztül kialakuló sejtválaszai egyrészt egy proximális, Src-kinázok Ö Fc-receptor γ-lánc Ö Syk kaszkádon, másrészt egy disztális, az ERK és a p38 MAP-kináz részvételével zajló jelátviteli lépésen keresztül jön létre.

29. ábra Az Fc-receptorok jelátvitele neutrofilekben

A fenti "proximális" kaszkád elemeinek esetleges szerepét már más munkacsoportok is vizsgálták a neutrofilek Fc-receptorainak jelátvitelében, bár az eltérő

71

kísérleti körülmények és a sejtaktiválás módja megnehezíti a kapott eredmények egységes és egyértelmű interpretációját. Kiefer és munkatársainak eredményei szerint a szérummal opszonizált zimozánszemcsékkel indukált szuperoxid-termelés nem jön létre Syk-hiányos neutrofil granulocitákban [83]. Bár ebben a rendszerben egyértelműen szerepet játszanak az Fc-receptorok, a zimozán (élesztőgomba sejtfal-poliszacharid) jelenléte miatt egyéb receptorok (Toll-szerű receptorok, αMβ2 integrinek) funkcionális szerepével is számolni kell. Az általunk alkalmazotthoz hasonló kísérleti rendszerben mások is kimutatták, hogy az Fc-receptor γ-lánc elengedhetetlen a neutrofilek Fcreceptorokon keresztüli aktiválásához [84], saját kísérleteink ezen eredmények megerősítésének tekinthetők. Saját kísérleteink részben ellentmondanak azonban Lowell és munkatársai azon eredményeinek, mely szerint az immunkomplexek által kiváltott neutrofil-aktiváció nem károsodott két Src-típusú tirozin-kináz, a Hck és az Fgr genetikai hiánya esetén [42]. Ezen látszólagos ellentmondás legvalószínűbb magyarázata az, hogy az általunk vizsgált Hck–/–Fgr–/–Lyn–/– hármas knockout sejtekből mindhárom neutrofilekben kifejeződő Src-típusú kináz hiányzott, míg a Lowell és munkatársai által alkalmazott Hck–/–Fgr–/– sejtekben jelen levő Lyn a másik két kináz hiányában önmagában is elégséges lehet közel normális Fc-receptor-jelátvitel beindításához (bár a részben eltérő kísérleti körülmények is magyarázhatják a két eredmény közti különbséget). Az Src-kinázok aktív szerepét valószínűsíti továbbá a PP1 gátló hatása az immunkomplex-kiváltotta szuperoxid-termelésre is (nem mutatott adat). A fenti, saját kísérleteinkkel részben átfedő eredmények ellenére kijelenthetjük, hogy elsőként igazoltuk egy tisztán immunkomplex-mediált kísérleti rendszerben az Srckinázok, az Fc-receptor γ-lánc és a Syk elengedhetetlen szerepét, és biokémiai módszerekkel azonosítottuk ezek egymáshoz képesti elhelyezkedését a jelpályában. Fenti eredényeink alapján felmerül a kérdés, hogy melyik Fc-receptor közvetítésével jönnek létre a neutrofilek immunkomplexek által kiváltott sejtválaszai. Az értekezésben nem tárgyalt, blokkoló antitestekkel végzett kísérleteink azt támasztják alá, hogy humán neutrofilekben az immunkomplex kiváltotta funkcionális válaszokban mind az FcγRIII, mind az FcγRIIA szerepet játszik. Egér neutrofilekben nem kerül kifejezésre az FcγRIIA, az Fc-receptor γ-lánchoz kapcsolódó stimuláló Fc-receptorok közül jelen van azonban a korábban említett FcγRIII, a nagy affinitású FcγRI, valamint a nemrégiben azonosított FcγRIV is. Legújabb, nem bemutatott eredményeink szerint az

72

FcγRI és az FcγRIII együttes hiánya sem okozza a neutrofilek immunkomplex-aktiválta szabadgyök-termelésének a gátlását, ami felveti az FcγRIV szerepét a válaszban. A neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódása központi szerepet játszik számos autoimmun és gyulladásos betegség kialakulásában. Az általunk feltérképezett Fc-receptor-jelpálya elemei potenciális támadáspontjai lehetnek ezen betegségek gyógyszeres terápiájának is. Ph.D. munkám harmadik részében kimutattuk, hogy a neutrofilek primer és szekunder granulumainak fMLP hatására kialakuló leadásában fontos szerepet töltenek be az Src-típusú tirozin-kinázok és a p38 MAP-kináz. Meg kell azonban jegyezni, hogy míg az Src-típusú kinázok genetikai hiánya a válasz teljes megszűnését eredményezte [II], addig a p38 MAP-kináz inhibitor SB203580 még az alkalmazott legmagasabb koncentrációban is csak részleges gátlást hozott létre annak ellenére, hogy a gátlószer szinte teljesen blokkolta a p38 MAP-kináz működését [II]. Ez a megfigyelés felveti, hogy további, az Src-kinázok által közvetített, de az SB203580-nal gátolható p38 MAPkináztól független jelpályák is fontos szerepet töltenek be a G-fehérje-kapcsolt receptorokon keresztüli aktiválódás során. Ilyen lehet egy SB203580-rezisztens p38 MAP-kináz izoforma (pl. a p38δ) vagy akár az ERK MAP-kinázok is, bár az utóbbiak szerepe ellen szól, hogy a PD98059 még magas koncentrációban sem befolyásolta a primer és szekunder granulumok fMLP-kiváltotta exocitózisát. Az Src-kinázok és a p38 MAP-kináz viszonyát vizsgálva azt találtuk, hogy fMLP hatására erősen és gyorsan aktiválódik a p38 MAP-kináz, és hogy a fehérje foszforilációja jelentős mértékben gátolható volt az Src-típusú kinázokat gátló PP1gyel, illetve teljesen mértékben elmaradt a Hck–/–Fgr–/–Lyn–/– neutrofilekben. Eredményeink tehát arra utalnak, hogy a neutrofilek primer és szekunder granulumainak degranulációjában az fMLP hatására az Src-típusú tirozin-kinázok közvetítésével aktiválódó p38 MAP-kináz fontos szerepet játszik a primer és szekunder granulumok ürülésében. A fentiekkel ellentétben sem az Src-kinázok, sem a p38 MAP-kináz nem vesz részt a szekretoros vezikulák leadásában, sőt az általános tirozin-kináz-gátlószer genistein hatástalansága [II] arra utal, hogy a szekretoros vezikulák ürülése más tirozinkinázoktól is független módon zajlik.

73

Egy további kísérletsorozatban megvizsgáltuk a Syk szerepét a neutrofilek Gfehérje-kapcsolt receptorainak a jeltovábbításában. Ezen kísérleteinket azon korábbi, sejtvonalakban, nem endogén receptorok transzfekciójával [92, 93], illetve a piceatannol gátlószerrel nyert [95-97] adatok inspirálták, melyek szerint a Syk központi szerepet játszik a G-fehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében. A kérdéskör vizsgálata érdekében egy olyan, csontvelőtranszplantációra épülő módszert alkalmaztunk, ami lehetővé tette primer, Syk hiányos neutrofilek vizsgálatát, illetve a sejtek endogén receptorainak közvetítésével kiváltott válaszok tanulmányozását (ezáltal elkerülhettük számos potenciális műtermék kialakulását). Az így nyert Syk–/– neutrofilekben nem tapasztaltunk lényeges különbséget a kemoattraktánsok (fMLP, LTB4, C5a) és kemokinek (MIP-1α, MIP-2) hatására G-fehérjék közvetítésével kialakuló funkcionális válaszokban (szuperoxid-termelés, primer és szekunder granulumok degranulációja, migráció), valamint az intracelluláris szignalizációs folyamatokban (kalciumjel, MAPkinázok aktivációja, aktin-polimerizáció) [III]. Hasonlóképpen nem károsodtak az adenozin-kiváltotta sejtválaszok sem Syk–/– hízósejtekben [III]. Eredményeink tehát azt támasztják alá, hogy a Syk tirozin-kináz nem játszik fontos szerepet a heterotrimer Gfehérje-kapcsolt receptorok jelátvitelében. Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy az Src-kinázok és a p38 MAP-kináz mind az adhézió-függő, mind az Fc-receptor-függő, mind a G-fehérjék közvetítésével elinduló jelátviteli folyamatokban szerepel, míg a Syk tirozin-kináz csak az első két válaszhoz szükséges. Ezen eredmények nagyban hozzájárultak a neutrofil granulociták működésének megértéséhez és alapját képezhetik közös vagy szelektív támadáspontú gyógyszerek kifejlesztésének.

74

8. Következtetések Ph.D. dolgozatomban a neutrofilek jelátviteli folyamatainak feltérképezésével kapcsolatos munkánkat ismertettem. Karakterizáltam az anti-integrin antitestek hatására létrejövő válaszokat, az adhézió-függő stimuláció mechanizmusát, az Fc-receptorok jelátviteli folyamatait, illetve a kinázok szerepét a G-fehérje-kapcsolt receptorokon keresztül indukált effektor funkciókban. Ph.D. munkám első részében génhiányos (knockout) egerek, gátló antitestek és Fab antitest-fragmentumok felhasználásával kimutattuk, hogy az anti-integrin antitestek által kiváltott neutrofil-válaszokhoz elengedhetetlenek az alacsony affinitású Fcγreceptorok. Ezen eredményeink kétségbe vonták azt a korábbi elképzelést, hogy az integrinek keresztkötése önmagában is elégséges a neutrofilek teljes aktiválásához, és egyben az integrin- és nem-integrin szignálok mellérendeltségét valószínűsítették. Kimutattuk továbbá, hogy a különböző (TNF, Fc-receptor) nem-integrin szignálok egymást helyettesíthetik, és feltételezhetően a p38 MAP-kinázban konvergálnak. Kísérleteim második részében az Fc-receptorok jelátvitelét vizsgáltuk neutrofil granulocitákban. Génhiányos (knockout) egerek és egy újonnan beállított stimulálási rendszer segítségével kimutattuk, hogy az immunkomplexekkel való sejtaktiválás létrehozza az Fc-receptor γ-lánc Src-típusú kinázok általi foszforilációját. Ezen foszforiáció lehetővé teszi a Syk tirozin-kináz kihorgonyzását az Fc-receptor γ-lánchoz, ezáltal indukálva a további szignalizációs lépéseket. A disztális pályarendszerek részeként aktiválódik az ERK és a p38 MAP-kináz, ezek indukálják a neutrofilek effektor funkcióit. A Ph.D. munkám harmadik részében kapott eredményeink azt támasztják alá, hogy a G-fehérje-kapcsolt fMLP receptor stimulálásakor az Src-típusú tirozin-kinázok közvetítésével aktiválódó p38 MAP-kináz elengedhetetlen a primer és a szekunder granulumok leadásához, nem szükséges viszont a szekretoros vezikulák exocitózisához. Génhiányos neutrofilekben igazoltuk továbbá, hogy a Syk tirozin-kináz nem vesz részt a G-fehérjéhez kötött receptorokon keresztül indukált válaszok létrejöttében.

75

9. Összefoglaló

A neutrofil granulociták fontos szerepet töltenek be a kórokozók elpusztításában és számos autoimmun betegség patogenezisében. A sejtek aktivációja több különböző receptor közvetítésével valósul meg. Ph.D. munkámban az integrinek, az Fc-receptorok és a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok jelátvitelének mechanizmusát vizsgáltam neutofilekben. A gyulladásos környezetben létrejövő neutrofil-aktiválódáshoz mind integrin, mind nem-integrin receptorok szükségesek. Korábbi elképzelések szerint a nem-integrin szignálok kizárólag az integrinek ligandkötő képességének növeléséhez szükségesek, a tényleges sejtválaszokat az integrinek ligandkötést követő keresztkötése önmagában váltja ki (tehát a két szignál között alá-fölérendeltségi viszony van). Ez az elképzelés azon a megfigyelésen alapszik, hogy anti-integrin antitestekkel történő stimuláció a neutrofilek teljes aktiválódását hozza létre, arra utalva, hogy az integrinek keresztkötése önmagában is elégséges a neutrofilek teljes aktiválódásához. Ph.D.-munkám első részében génhiányos (knockout) egerek, gátló antitestek és Fab antitest-fragmentumok felhasználásával kimutattuk, hogy az anti-integrin antitestek által kiváltott neutrofilválaszokhoz elengedhetetlenek az alacsony affinitású Fcγ-receptorok is. Ezen eredményeink kétségessé tették azt a korábbi elképzelést, hogy az integrinek keresztkötése önmagában is elégséges a neutrofilek teljes aktiválásához, és egyben az integrin és nem-integrin szignálok mellérendeltségét valószínűsítették. Kimutattuk továbbá, hogy a különböző (TNF, Fc-receptor) nem-integrin szignálok egymást helyettesíthetik, és feltételezhetően a p38 MAP-kináz aktiválásában konvergálnak. Kísérleteim második részében az Fc-receptorok jelátvitelét vizsgáltam neutrofil granulocitákban. Génhiányos (knockout) egerek és egy újonnan beállított stimulálási rendszer segítségével kimutattuk, hogy az Fc-receptorokat aktiváló immunkomplexek által kiváltott neutrofil-válaszokhoz elengedhetetlenek az Src-típusú tirozin-kinázok, az Fc-receptor γ-lánc, a Syk, valamint az ERK és a p38 MAP-kinázok. Eredményeink alapján ezen fehérjék egy olyan jelpályába illeszthetők, melyben az Src-típusú tirozinkinázok foszforilálják az Fc-receptor γ-lánc ITAM-tirozinjait, ami a Syk kihorgonyzódásához, illetve az ERK és a p38 MAP-kináz következményes aktiválódásához vezet. Ph.D.-munkám harmadik részében a különböző tirozin-kináz jelátviteli utak szerepét vizsgáltam a neutrofilek G-fehérje-kapcsolt receptorainak működésében. Gátlószerek és génhiányos (knockout) egerek segítségével kimutattuk, hogy a bakteriális tripeptid fMLP hatására létrejövő degranulációs folyamatokban elengedhetetlen szerepe van az Src-kinázok közvetítésével aktiválódó p38 MAPkináznak. Syk-hiányos neutrofilek alkalmazásával megcáfoltuk viszont azon korábbi feltételezéseket, melyek szerint a Syk központi szerepet töltene be a G-fehérje-kapcsolt (pl. fMLP, kemokin) receptorok jelátvitelében. Eredményeink fontos segítséget jelentenek az immunrendszer működésének megértéséhez. Az általunk feltérképezett jelátviteli utak komponensei új támadáspontjai lehetnek az autoimmun betegségek gyógyszeres kezelésének.

76

10. Summary Neutrophils play an essential role in the destruction of invading microorganisms and in the pathogenesis of several autoimmune diseases. In these processes, the activation of the cells is mediated by several different neutrophil cell surface receptors. In my Ph.D. work, the signaling mechanisms utilized by integrins, Fc receptors and G protein coupled receptors were investigated in neutrophils. Both integrin and nonintegrin receptors are required for neutrophil activation in the inflamed environment. Prior findings suggested that the nonintegrin signals are only required for increasing the binding capacity of integrins, while the eventual cellular responses are mediated by integrin crosslinking upon their ligand binding (i. e., suggesting a serial hierarchical relationship between the two signals). This hypothesis was based on the fact that neutrophil activation by anti-integrin antibodies results in full activation of the cells without any additional stimulus, indicating that integrin crosslinking by itself is sufficient for full activation of neutrophils. In the first part of my Ph.D. work, using gene deficient (knockout) mice, blocking antibodies and antibody Fab fragments we showed that low affinity Fcγ receptors are indispensable for neutrophil responses induced by anti-integrin antibodies. These findings challange the earlier hypothesis that crosslinking of integrins is sufficient for full activation of neutrophils, and suggest that integrin and nonintegrin signals function in a parallel fashion. Furthermore, we showed that the different nonintegrin signals (TNF, Fc receptor) are interchangeable and likely converge on the p38 MAP kinase. In the second part of my experiments, the mechanism of Fc receptor signaling was investigated in neutrophils. Using gene deficient (knockout) mice and a newly set up activation system, we found that Src family tyrosine kinases, the Fc receptor γ chain, Syk, as well as the ERK and p38 MAP kinases are indispensable for neutrophil responses induced by immune complexes that act through Fc-receptors. These proteins could be placed into a signaling pathway where Src family tyrosine kinases phosphorylate the Fc receptor γ chain, which then recruits Syk, eventually leading to activation of the ERK and p38 MAP kinases. In the third part of my Ph.D. work, the contribution of tyrosine kinase pathways to G protein coupled receptor signaling was investigated. Using pharmacological inhibitors and gene deficient (knockout) mice, we showed that the p38 MAP kinase activated via Src-family kinases is indispensable for the degranulation induced by the bacterial tripeptide fMLP. Using Syk deficient neutrophils, we also disproved prior assumptions that Syk is crucial for G protein coupled receptor (e. g. fMLP, chemokine) signaling. These results help us to understand the working paradigms of the immune system, and they may point to possible novel targets for pharmacological control of autoimmune diseases.

77

11. Irodalomjegyzék 1.

Fearon, D.T., Locksley, R.M. (1996) The instructive role of innate immunity in the acquired immune response. Science 272, 50-3.

2.

Medzhitov, R., Janeway, C.A., Jr. (1997) Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell 91, 295-8.

3.

Nathan, C. (2006) Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol 6, 173-182.

4.

Baggiolini, M., Wymann, M.P. (1990) Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 15, 69-72.

5.

Reeves, E.P., Lu, H., Jacobs, H.L., Messina, C.G., Bolsover, S., Gabella, G., Potma, E.O., Warley, A., Roes, J., Segal, A.W. (2002) Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature 416, 291-7.

6.

Ahluwalia, J., Tinker, A., Clapp, L.H., Duchen, M.R., Abramov, A.Y., Pope, S., Nobles, M., Segal, A.W. (2004) The large-conductance Ca2+-activated K+ channel is essential for innate immunity. Nature 427, 853-8.

7.

Rada, B.K., Geiszt, M., Kaldi, K., Timar, C., Ligeti, E. (2004) Dual role of phagocytic NADPH oxidase in bacterial killing. Blood 104, 2947-53.

8.

Borregaard, N., Lollike, K., Kjeldsen, L., Sengelov, H., Bastholm, L., Nielsen, M.H., Bainton, D.F. (1993) Human neutrophil granules and secretory vesicles. Eur J Haematol 51, 187-98.

9.

Borregaard, N., Cowland, J.B. (1997) Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 89, 3503-21.

10.

Dinauer, M.C., Orkin, S.H. (1992) Chronic granulomatous disease. Annu Rev Med 43, 117-24.

11.

Heyworth, P.G., Cross, A.R., Curnutte, J.T. (2003) Chronic granulomatous disease. Curr Opin Immunol 15, 578-84.

12.

Introne, W., Boissy, R.E., Gahl, W.A. (1999) Clinical, molecular, and cell biological aspects of Chediak-Higashi syndrome. Mol Genet Metab 68, 283-303.

78

13.

Bunting, M., Harris, E.S., McIntyre, T.M., Prescott, S.M., Zimmerman, G.A. (2002) Leukocyte adhesion deficiency syndromes: adhesion and tethering defects involving β2 integrins and selectin ligands. Curr Opin Hematol 9, 30-5.

14.

Anderson, D.C., Springer, T.A. (1987) Leukocyte adhesion deficiency: an inherited defect in the Mac-1, LFA-1, and p150,95 glycoproteins. Annu Rev Med 38, 175-94.

15.

Dallegri, F., Ottonello, L. (1997) Tissue injury in neutrophilic inflammation. Inflamm Res 46, 382-91.

16.

Saeed, S.A., Waqar, M.A., Zubairi, A.J., Bhurgri, H., Khan, A., Gowani, S.A., Waqar, S.N., Choudhary, M.I., Jalil, S., Zaidi, A.H., Ara, I. (2005) Myocardial ischaemia and reperfusion injury: reactive oxygen species and the role of neutrophil. J Coll Physicians Surg Pak 15, 507-14.

17.

Prestigiacomo, C.J., Kim, S.C., Connolly, E.S., Jr., Liao, H., Yan, S.F., Pinsky, D.J. (1999) CD18-mediated neutrophil recruitment contributes to the pathogenesis of reperfused but not nonreperfused stroke. Stroke 30, 1110-7.

18.

Galkina, E., Ley, K. (2006) Leukocyte recruitment and vascular injury in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 17, 368-77.

19.

Schaller, B., Graf, R. (2004) Cerebral ischemia and reperfusion: the pathophysiologic concept as a basis for clinical therapy. J Cereb Blood Flow Metab 24, 351-71.

20.

Hynes, R.O. (2002) Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110, 673-87.

21.

Stoker, M., O'Neill, C., Berryman, S., Waxman, V. (1968) Anchorage and growth regulation in normal and virus-transformed cells. Int J Cancer 3, 683-93.

22.

Miranti, C.K., Brugge, J.S. (2002) Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. Nat Cell Biol 4, E83-90.

23.

Schwartz, M.A., Toksoz, D., Khosravi-Far, R. (1996) Transformation by Rho exchange factor oncogenes is mediated by activation of an integrin-dependent pathway. Embo J 15, 6525-30.

24.

Etzioni, A., Frydman, M., Pollack, S., Avidor, I., Phillips, M.L., Paulson, J.C., Gershoni-Baruch, R. (1992) Brief report: recurrent severe infections caused by a novel leukocyte adhesion deficiency. N Engl J Med 327, 1789-92.

79

25.

Alon, R., Aker, M., Feigelson, S., Sokolovsky-Eisenberg, M., Staunton, D.E., Cinamon, G., Grabovsky, V., Shamri, R., Etzioni, A. (2003) A novel genetic leukocyte adhesion deficiency in subsecond triggering of integrin avidity by endothelial chemokines results in impaired leukocyte arrest on vascular endothelium under shear flow. Blood 101, 4437-45.

26.

Scharffetter-Kochanek, K., Lu, H., Norman, K., van Nood, N., Munoz, F., Grabbe, S., McArthur, M., Lorenzo, I., Kaplan, S., Ley, K., Smith, C.W., Montgomery, C.A., Rich, S., Beaudet, A.L. (1998) Spontaneous skin ulceration and defective T cell function in CD18 null mice. J Exp Med 188, 119-31.

27.

Mizgerd, J.P., Kubo, H., Kutkoski, G.J., Bhagwan, S.D., Scharffetter-Kochanek, K., Beaudet, A.L., Doerschuk, C.M. (1997) Neutrophil emigration in the skin, lungs, and peritoneum: different requirements for CD11/CD18 revealed by CD18-deficient mice. J Exp Med 186, 1357-64.

28.

Mocsai, A., Zhou, M., Meng, F., Tybulewicz, V.L., Lowell, C.A. (2002) Syk is required for integrin signaling in neutrophils. Immunity 16, 547-58.

29.

Berton, G., Yan, S.R., Fumagalli, L., Lowell, C.A. (1996) Neutrophil activation by adhesion: mechanisms and pathophysiological implications. Int J Clin Lab Res 26, 160-77.

30.

Sligh, J.E., Jr., Ballantyne, C.M., Rich, S.S., Hawkins, H.K., Smith, C.W., Bradley, A., Beaudet, A.L. (1993) Inflammatory and immune responses are impaired in mice deficient in intercellular adhesion molecule 1. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 8529-33.

31.

Lowell, C.A., Berton, G. (1999) Integrin signal transduction in myeloid leukocytes. J Leukoc Biol 65, 313-20.

32.

Berton, G., Lowell, C.A. (1999) Integrin signalling in neutrophils and macrophages. Cell Signal 11, 621-35.

33.

Ding, Z.M., Babensee, J.E., Simon, S.I., Lu, H., Perrard, J.L., Bullard, D.C., Dai, X.Y., Bromley, S.K., Dustin, M.L., Entman, M.L., Smith, C.W., Ballantyne, C.M. (1999) Relative contribution of LFA-1 and Mac-1 to neutrophil adhesion and migration. J Immunol 163, 5029-38.

80

34.

Lu, H., Smith, C.W., Perrard, J., Bullard, D., Tang, L., Shappell, S.B., Entman, M.L., Beaudet, A.L., Ballantyne, C.M. (1997) LFA-1 is sufficient in mediating neutrophil emigration in Mac-1-deficient mice. J Clin Invest 99, 1340-50.

35.

Andrew, D.P., Spellberg, J.P., Takimoto, H., Schmits, R., Mak, T.W., Zukowski, M.M. (1998) Transendothelial migration and trafficking of leukocytes in LFA-1deficient mice. Eur J Immunol 28, 1959-69.

36.

Tang, T., Rosenkranz, A., Assmann, K.J., Goodman, M.J., Gutierrez-Ramos, J.C., Carroll, M.C., Cotran, R.S., Mayadas, T.N. (1997) A role for Mac-1 (CDIIb/CD18) in immune complex-stimulated neutrophil function in vivo: Mac1 deficiency abrogates sustained Fcgamma receptor-dependent neutrophil adhesion and complement-dependent proteinuria in acute glomerulonephritis. J Exp Med 186, 1853-63.

37.

Coxon, A., Rieu, P., Barkalow, F.J., Askari, S., Sharpe, A.H., von Andrian, U.H., Arnaout, M.A., Mayadas, T.N. (1996) A novel role for the β2 integrin CD11b/CD18 in neutrophil apoptosis: a homeostatic mechanism in inflammation. Immunity 5, 653-66.

38.

Nathan, C.F. (1987) Neutrophil activation on biological surfaces. Massive secretion of hydrogen peroxide in response to products of macrophages and lymphocytes. J Clin Invest 80, 1550-60.

39.

Nathan, C.F. (1989) Respiratory burst in adherent human neutrophils: triggering by colony-stimulating factors CSF-GM and CSF-G. Blood 73, 301-6.

40.

Nathan, C., Srimal, S., Farber, C., Sanchez, E., Kabbash, L., Asch, A., Gailit, J., Wright, S.D. (1989) Cytokine-induced respiratory burst of human neutrophils: dependence on extracellular matrix proteins and CD11/CD18 integrins. J Cell Biol 109, 1341-9.

41.

Berton, G., Laudanna, C., Sorio, C., Rossi, F. (1992) Generation of signals activating neutrophil functions by leukocyte integrins: LFA-1 and gp150/95, but not CR3, are able to stimulate the respiratory burst of human neutrophils. J Cell Biol 116, 1007-17.

42.

Lowell, C.A., Fumagalli, L., Berton, G. (1996) Deficiency of Src family kinases p59/61hck and p58c-fgr results in defective adhesion-dependent neutrophil functions. J Cell Biol 133, 895-910.

81

43.

Laudanna, C., Rossi, F., Berton, G. (1993) Effect of inhibitors of distinct signalling pathways on neutrophil Q2- generation in response to tumor necrosis factor-alpha, and antibodies against CD18 and CD11a: evidence for a common and unique pattern of sensitivity to wortmannin and protein tyrosine kinase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 190, 935-40.

44.

Berton, G., Fumagalli, L., Laudanna, C., Sorio, C. (1994) β2 integrin-dependent protein tyrosine phosphorylation and activation of the FGR protein tyrosine kinase in human neutrophils. J Cell Biol 126, 1111-21.

45.

Zheng, L., Sjolander, A., Eckerdal, J., Andersson, T. (1996) Antibody-induced engagement of β2 integrins on adherent human neutrophils triggers activation of p21ras through tyrosine phosphorylation of the protooncogene product Vav. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 8431-6.

46.

Yan, S.R., Berton, G. (1998) Antibody-induced engagement of β2 integrins in human neutrophils causes a rapid redistribution of cytoskeletal proteins, Srcfamily tyrosine kinases, and p72syk that precedes de novo actin polymerization. J Leukoc Biol 64, 401-8.

47.

Menegazzi, R., Busetto, S., Decleva, E., Cramer, R., Dri, P., Patriarca, P. (1999) Triggering of chloride ion efflux from human neutrophils as a novel function of leukocyte β2 integrins: relationship with spreading and activation of the respiratory burst. J Immunol 162, 423-34.

48.

Pereira, S., Zhou, M., Mocsai, A., Lowell, C. (2001) Resting murine neutrophils express functional α4 integrins that signal through Src family kinases. J Immunol 166, 4115-23.

49.

Dib, K., Melander, F., Andersson, T. (2001) Role of p190RhoGAP in β2 integrin regulation of RhoA in human neutrophils. J Immunol 166, 6311-22.

50.

Chen, H., Mocsai, A., Zhang, H., Ding, R.X., Morisaki, J.H., White, M., Rothfork, J.M., Heiser, P., Colucci-Guyon, E., Lowell, C.A., Gresham, H.D., Allen, P.M., Brown, E.J. (2003) Role for plastin in host defense distinguishes integrin signaling from cell adhesion and spreading. Immunity 19, 95-104.

51.

Newbrough, S.A., Mocsai, A., Clemens, R.A., Wu, J.N., Silverman, M.A., Singer, A.L., Lowell, C.A., Koretzky, G.A. (2003) SLP-76 regulates Fcγ receptor and integrin signaling in neutrophils. Immunity 19, 761-9.

82

52.

Melander, F., Andersson, T., Dib, K. (2003) Fgr but not Syk tyrosine kinase is a target for β2 integrin-induced c-Cbl-mediated ubiquitination in adherent human neutrophils. Biochem J 370, 687-94.

53.

Raptis, S.Z., Shapiro, S.D., Simmons, P.M., Cheng, A.M., Pham, C.T. (2005) Serine protease cathepsin G regulates adhesion-dependent neutrophil effector functions by modulating integrin clustering. Immunity 22, 679-91.

54.

Turner, M., Schweighoffer, E., Colucci, F., Di Santo, J.P., Tybulewicz, V.L. (2000) Tyrosine kinase SYK: essential functions for immunoreceptor signalling. Immunol Today 21, 148-54.

55.

Tamir, I., Cambier, J.C. (1998) Antigen receptor signaling: integration of protein tyrosine kinase functions. Oncogene 17, 1353-64.

56.

Takai, T., Li, M., Sylvestre, D., Clynes, R., Ravetch, J.V. (1994) FcR γ chain deletion results in pleiotrophic effector cell defects. Cell 76, 519-29.

57.

Nimmerjahn, F., Bruhns, P., Horiuchi, K., Ravetch, J.V. (2005) FcgammaRIV: a novel FcR with distinct IgG subclass specificity. Immunity 23, 41-51.

58.

Poole, A., Gibbins, J.M., Turner, M., van Vugt, M.J., van de Winkel, J.G., Saito, T., Tybulewicz, V.L., Watson, S.P. (1997) The Fc receptor γ-chain and the tyrosine kinase Syk are essential for activation of mouse platelets by collagen. Embo J 16, 2333-41.

59.

Gibbins, J.M., Okuma, M., Farndale, R., Barnes, M., Watson, S.P. (1997) Glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain. FEBS Lett 413, 255-9.

60.

Kubagawa, H., Burrows, P.D., Cooper, M.D. (1997) A novel pair of immunoglobulin-like receptors expressed by B cells and myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 5261-6.

61.

Maeda, A., Kurosaki, M., Kurosaki, T. (1998) Paired immunoglobulin-like receptor (PIR)-A is involved in activating mast cells through its association with Fc receptor γ chain. J Exp Med 188, 991-5.

62.

Taylor, L.S., McVicar, D.W. (1999) Functional association of FcεRIγ with arginine(632) of paired immunoglobulin-like receptor (PIR)-A3 in murine macrophages. Blood 94, 1790-6.

83

63.

Nakajima, H., Samaridis, J., Angman, L., Colonna, M. (1999) Human myeloid cells express an activating ILT receptor (ILT1) that associates with Fc receptor gamma-chain. J Immunol 162, 5-8.

64.

Hoelsbrekken, S.E., Fossum, S., Dissen, E. (2005) Molecular cloning of LILRC1 and LILRC2 in the mouse and the rat, two novel immunoglobulin-like receptors encoded by the leukocyte receptor gene complex. Immunogenetics 57, 479-86.

65.

Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. (2002) A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. J Exp Med 195, 201-9.

66.

Koga, T., Inui, M., Inoue, K., Kim, S., Suematsu, A., Kobayashi, E., Iwata, T., Ohnishi, H., Matozaki, T., Kodama, T., Taniguchi, T., Takayanagi, H., Takai, T. (2004) Costimulatory signals mediated by the ITAM motif cooperate with RANKL for bone homeostasis. Nature 428, 758-63.

67.

Merck, E., de Saint-Vis, B., Scuiller, M., Gaillard, C., Caux, C., Trinchieri, G., Bates, E.E. (2005) Fc receptor γ-chain activation via hOSCAR induces survival and maturation of dendritic cells and modulates Toll-like receptor responses. Blood 105, 3623-32.

68.

Merck, E., Gaillard, C., Gorman, D.M., Montero-Julian, F., Durand, I., Zurawski, S.M., Menetrier-Caux, C., Carra, G., Lebecque, S., Trinchieri, G., Bates, E.E. (2004) OSCAR is an FcRγ-associated receptor that is expressed by myeloid cells and is involved in antigen presentation and activation of human dendritic cells. Blood 104, 1386-95.

69.

Kanazawa, N., Tashiro, K., Inaba, K., Miyachi, Y. (2003) Dendritic cell immunoactivating receptor, a novel C-type lectin immunoreceptor, acts as an activating receptor through association with Fc receptor γ chain. J Biol Chem 278, 32645-52.

70.

Taniguchi, T., Kobayashi, T., Kondo, J., Takahashi, K., Nakamura, H., Suzuki, J., Nagai, K., Yamada, T., Nakamura, S., Yamamura, H. (1991) Molecular cloning of a porcine gene syk that encodes a 72-kDa protein-tyrosine kinase showing high susceptibility to proteolysis. J Biol Chem 266, 15790-6.

84

71.

Law, C.L., Sidorenko, S.P., Chandran, K.A., Draves, K.E., Chan, A.C., Weiss, A., Edelhoff, S., Disteche, C.M., Clark, E.A. (1994) Molecular cloning of human Syk. A B cell protein-tyrosine kinase associated with the surface immunoglobulin M-B cell receptor complex. J Biol Chem 269, 12310-9.

72.

Turner, M., Mee, P.J., Costello, P.S., Williams, O., Price, A.A., Duddy, L.P., Furlong, M.T., Geahlen, R.L., Tybulewicz, V.L. (1995) Perinatal lethality and blocked B-cell development in mice lacking the tyrosine kinase Syk. Nature 378, 298-302.

73.

Cheng, A.M., Rowley, B., Pao, W., Hayday, A., Bolen, J.B., Pawson, T. (1995) Syk tyrosine kinase required for mouse viability and B-cell development. Nature 378, 303-6.

74.

Turner, M., Gulbranson-Judge, A., Quinn, M.E., Walters, A.E., MacLennan, I.C., Tybulewicz, V.L. (1997) Syk tyrosine kinase is required for the positive selection of immature B cells into the recirculating B cell pool. J Exp Med 186, 2013-21.

75.

Crowley, M.T., Costello, P.S., Fitzer-Attas, C.J., Turner, M., Meng, F., Lowell, C., Tybulewicz, V.L., DeFranco, A.L. (1997) A critical role for Syk in signal transduction and phagocytosis mediated by Fcγ receptors on macrophages. J Exp Med 186, 1027-39.

76.

Lin, S., Cicala, C., Scharenberg, A.M., Kinet, J.P. (1996) The FcεRIβ subunit functions as an amplifier of FcεRIγ-mediated cell activation signals. Cell 85, 985-95.

77.

Costello, P.S., Turner, M., Walters, A.E., Cunningham, C.N., Bauer, P.H., Downward, J., Tybulewicz, V.L. (1996) Critical role for the tyrosine kinase Syk in signalling through the high affinity IgE receptor of mast cells. Oncogene 13, 2595-605.

78.

Clark, E.A., Shattil, S.J., Ginsberg, M.H., Bolen, J., Brugge, J.S. (1994) Regulation of the protein tyrosine kinase pp72syk by platelet agonists and the integrin αIIbβ3. J Biol Chem 269, 28859-64.

79.

Obergfell, A., Eto, K., Mocsai, A., Buensuceso, C., Moores, S.L., Brugge, J.S., Lowell, C.A., Shattil, S.J. (2002) Coordinate interactions of Csk, Src, and Syk

85

kinases with αIIbβ3 initiate integrin signaling to the cytoskeleton. J Cell Biol 157, 265-75. 80.

Lin, T.H., Rosales, C., Mondal, K., Bolen, J.B., Haskill, S., Juliano, R.L. (1995) Integrin-mediated tyrosine phosphorylation and cytokine message induction in monocytic cells. A possible signaling role for the Syk tyrosine kinase. J Biol Chem 270, 16189-97.

81.

Ravetch, J.V. (1994) Fc receptors: rubor redux. Cell 78, 553-60.

82.

Fitzer-Attas, C.J., Lowry, M., Crowley, M.T., Finn, A.J., Meng, F., DeFranco, A.L., Lowell, C.A. (2000) Fcγ receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J Exp Med 191, 66982.

83.

Kiefer, F., Brumell, J., Al-Alawi, N., Latour, S., Cheng, A., Veillette, A., Grinstein, S., Pawson, T. (1998) The Syk protein tyrosine kinase is essential for Fcγ receptor signaling in macrophages and neutrophils. Mol Cell Biol 18, 420920.

84.

Suzuki, Y., Gomez-Guerrero, C., Shirato, I., Lopez-Franco, O., GallegoDelgado, J., Sanjuan, G., Lazaro, A., Hernandez-Vargas, P., Okumura, K., Tomino, Y., Ra, C., Egido, J. (2003) Pre-existing glomerular immune complexes induce polymorphonuclear cell recruitment through an Fc receptor-dependent respiratory burst: potential role in the perpetuation of immune nephritis. J Immunol 170, 3243-53.

85.

Wipke, B.T., Wang, Z., Nagengast, W., Reichert, D.E., Allen, P.M. (2004) Staging the initiation of autoantibody-induced arthritis: a critical role for immune complexes. J Immunol 172, 7694-702.

86.

Looney, M.R., Su, X., Van Ziffle, J.A., Lowell, C.A., Matthay, M.A. (2006) Neutrophils and their Fcγ receptors are essential in a mouse model of transfusion-related acute lung injury. J Clin Invest 116, 1615-23.

87.

Lowell, C.A. (2004) Src-family kinases: rheostats of immune cell signaling. Mol Immunol 41, 631-43.

88.

Krump, E., Sanghera, J.S., Pelech, S.L., Furuya, W., Grinstein, S. (1997) Chemotactic peptide N-formyl-met-leu-phe activation of p38 mitogen-activated

86

protein kinase (MAPK) and MAPK-activated protein kinase-2 in human neutrophils. J Biol Chem 272, 937-44. 89.

Ptasznik, A., Traynor-Kaplan, A., Bokoch, G.M. (1995) G protein-coupled chemoattractant receptors regulate Lyn tyrosine kinase.Shc adapter protein signaling complexes. J Biol Chem 270, 19969-73.

90.

Grinstein, S., Furuya, W. (1992) Chemoattractant-induced tyrosine phosphorylation and activation of microtubule-associated protein kinase in human neutrophils. J Biol Chem 267, 18122-5.

91.

Mocsai, A., Banfi, B., Kapus, A., Farkas, G., Geiszt, M., Buday, L., Farago, A., Ligeti, E. (1997) Differential effects of tyrosine kinase inhibitors and an inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade on degranulation and superoxide production of human neutrophil granulocytes. Biochem Pharmacol 54, 781-9.

92.

Wan, Y., Kurosaki, T., Huang, X.Y. (1996) Tyrosine kinases in activation of the MAP kinase cascade by G-protein-coupled receptors. Nature 380, 541-4.

93.

Wan, Y., Bence, K., Hata, A., Kurosaki, T., Veillette, A., Huang, X.Y. (1997) Genetic evidence for a tyrosine kinase cascade preceding the mitogen-activated protein kinase cascade in vertebrate G protein signaling. J Biol Chem 272, 17209-15.

94.

Wang, H., Malbon, C.C. (1999) G(s)α repression of adipogenesis via Syk. J Biol Chem 274, 32159-66.

95.

Cambien, B., Pomeranz, M., Schmid-Antomarchi, H., Millet, M.A., Breittmayer, V., Rossi, B., Schmid-Alliana, A. (2001) Signal transduction pathways involved in soluble fractalkine-induced monocytic cell adhesion. Blood 97, 2031-7.

96.

Cambien, B., Pomeranz, M., Millet, M.A., Rossi, B., Schmid-Alliana, A. (2001) Signal transduction involved in MCP-1-mediated monocytic transendothelial migration. Blood 97, 359-66.

97.

Shefler, I., Sagi-Eisenberg, R. (2001) Gi-mediated activation of the Syk kinase by the receptor mimetic basic secretagogues of mast cells: role in mediating arachidonic acid/metabolites release. J Immunol 167, 475-81.

98.

Hirasawa, N., Scharenberg, A., Yamamura, H., Beaven, M.A., Kinet, J.P. (1995) A requirement for Syk in the activation of the microtubule-associated protein

87

kinase/phospholipase A2 pathway by FcεR1 is not shared by a G proteincoupled receptor. J Biol Chem 270, 10960-7. 99.

Miura, K., Lavens-Phillips, S., MacGlashan, D.W., Jr. (2001) Piceatannol is an effective inhibitor of IgE-mediated secretion from human basophils but is neither selective for this receptor nor acts on syk kinase at concentrations where mediator release inhibition occurs. Clin Exp Allergy 31, 1732-9.

100.

Hazenbos, W.L., Gessner, J.E., Hofhuis, F.M., Kuipers, H., Meyer, D., Heijnen, I.A., Schmidt, R.E., Sandor, M., Capel, P.J., Daeron, M., van de Winkel, J.G., Verbeek, J.S. (1996) Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity 5, 181-8.

101.

Meng, F., Lowell, C.A. (1997) Lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophage activation and signal transduction in the absence of Src-family kinases Hck, Fgr, and Lyn. J Exp Med 185, 1661-70.

102.

Abtahian, F., Guerriero, A., Sebzda, E., Lu, M.M., Zhou, R., Mocsai, A., Myers, E.E., Huang, B., Jackson, D.G., Ferrari, V.A., Tybulewicz, V., Lowell, C.A., Lepore, J.J., Koretzky, G.A., Kahn, M.L. (2003) Regulation of blood and lymphatic vascular separation by signaling proteins SLP-76 and Syk. Science 299, 247-51.

103.

Trowbridge, I.S., Omary, M.B. (1981) Molecular complexity of leukocyte surface glycoproteins related to the macrophage differentiation antigen Mac-1. J Exp Med 154, 1517-24.

104.

Parham, P. (1983) On the fragmentation of monoclonal IgG1, IgG2a, and IgG2b from BALB/c mice. J Immunol 131, 2895-902.

105.

Rousseaux, J., Biserte, G., Bazin, H. (1980) The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain and pepsin. Mol Immunol 17, 469-82.

106.

Mocsai, A., Ligeti, E., Lowell, C.A., Berton, G. (1999) Adhesion-dependent degranulation of neutrophils requires the Src family kinases Fgr and Hck. J Immunol 162, 1120-6.

107.

Cuenda, A., Rouse, J., Doza, Y.N., Meier, R., Cohen, P., Gallagher, T.F., Young, P.R., Lee, J.C. (1995) SB 203580 is a specific inhibitor of a MAP kinase

88

homologue which is stimulated by cellular stresses and interleukin-1. FEBS Lett 364, 229-33. 108.

Alessi, D.R., Cuenda, A., Cohen, P., Dudley, D.T., Saltiel, A.R. (1995) PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J Biol Chem 270, 27489-94.

109.

Bellavite, P., Chirumbolo, S., Mansoldo, C., Gandini, G., Dri, P. (1992) Simultaneous assay for oxidative metabolism and adhesion of human neutrophils: evidence for correlations and dissociations of the two responses. J Leukoc Biol 51, 329-35.

110.

Dewald, B., Baggiolini, M. (1986) Methods for assessing exocytosis by neutrophil leukocytes. Methods Enzymol 132, 267-77.

111.

Borregaard, N., Kjeldsen, L., Rygaard, K., Bastholm, L., Nielsen, M.H., Sengelov, H., Bjerrum, O.W., Johnsen, A.H. (1992) Stimulus-dependent secretion of plasma proteins from human neutrophils. J Clin Invest 90, 86-96.

112.

Rebres, R.A., Green, J.M., Reinhold, M.I., Ticchioni, M., Brown, E.J. (2001) Membrane raft association of CD47 is necessary for actin polymerization and protein kinase C theta translocation in its synergistic activation of T cells. J Biol Chem 276, 7672-80.

113.

Hanke, J.H., Gardner, J.P., Dow, R.L., Changelian, P.S., Brissette, W.H., Weringer, E.J., Pollok, B.A., Connelly, P.A. (1996) Discovery of a novel, potent, and Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Study of Lck- and FynT-dependent T cell activation. J Biol Chem 271, 695-701.

114.

Schindler, T., Sicheri, F., Pico, A., Gazit, A., Levitzki, A., Kuriyan, J. (1999) Crystal structure of Hck in complex with a Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Mol Cell 3, 639-48.

115.

Suchard, S.J., Mansfield, P.J., Boxer, L.A., Shayman, J.A. (1997) Mitogenactivated protein kinase activation during IgG-dependent phagocytosis in human neutrophils: inhibition by ceramide. J Immunol 158, 4961-7.

116.

Nimmerjahn, F., Ravetch, J.V. (2006) Fcγ receptors: old friends and new family members. Immunity 24, 19-28.

89

117.

Zhou, M.J., Brown, E.J. (1994) CR3 (Mac-1, αMβ2, CD11b/CD18) and FcγRIII cooperate in generation of a neutrophil respiratory burst: requirement for FcγRIII and tyrosine phosphorylation. J Cell Biol 125, 1407-16.

118.

Chuang, F.Y., Sassaroli, M., Unkeless, J.C. (2000) Convergence of FcγRIIA and FcγRIIIB signaling pathways in human neutrophils. J Immunol 164, 350-60.

119.

Davignon, D., Martz, E., Reynolds, T., Kurzinger, K., Springer, T.A. (1981) Lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1): a surface antigen distinct from Lyt-2,3 that participates in T lymphocyte-mediated killing. Proc Natl Acad Sci U S A 78, 4535-9.

120.

McHugh, K.P., Hodivala-Dilke, K., Zheng, M.H., Namba, N., Lam, J., Novack, D., Feng, X., Ross, F.P., Hynes, R.O., Teitelbaum, S.L. (2000) Mice lacking β3 integrins are osteosclerotic because of dysfunctional osteoclasts. J Clin Invest 105, 433-40.

121.

Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F.P., Teitelbaum, S.L. (2003) c-Fms and the alphavbeta3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. J Clin Invest 111, 749-58.

122.

Lally, F., Smith, E., Filer, A., Stone, M.A., Shaw, J.S., Nash, G.B., Buckley, C.D., Rainger, G.E. (2005) A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis Rheum 52, 3460-9.

90

12. Saját közlemények jegyzéke A tézisek alapjául szolgáló publikációk

I. Jakus Z, Berton G, Ligeti E, Lowell CA and Mócsai A. Responses of neutrophils to anti-integrin antibodies depends on costimulation through low affinity FcγRs: full activation requires both integrin and nonintegrin signals. J Immunol. 2004 Aug 1;173(3):2068-77. IF: 6,486 II. Mócsai A, Jakus Z, Vantus T, Berton G, Lowell CA, Ligeti E. Kinase pathways in chemoattractant-induced degranulation of neutrophils: the role of p38 mitogen-activated protein kinase activated by Src family kinases. J Immunol. 2000 Apr 15;164(8):4321-31. IF: 6,834 III. Mócsai A, Zhang H, Jakus Z, Kitaura J, Kawakami T and Lowell CA. G-protein-coupled receptor signaling in Syk-deficient neutrophils and mast cells. Blood. 2003 May 15;101(10):4155-63. IF: 10,12 IV. Fodor Sz, Jakus Z and Mócsai A. ITAM-based Signaling beyond the Adaptive Immune Response Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):29-37. IF: 2,136

Ezen publikációkra a dolgozatban a fenti római számokkal hivatkozom.

91

13. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt témavezetőimnek, Dr. Mócsai Attilának és Dr. Ligeti Erzsébetnek szeretnék köszönetet mondani, akik elindítottak és vezettek eddigi tudományos pályámon. Munkám során mindig számíthattam segítségükre és támogatásukra. Dr. Mócsai Attila kezdetben tudományos diákköri vezetőm, majd munkám közvetlen irányítója volt. Nemcsak a közös sikereinket, ötleteit, hasznos tanácsait, beszélgetéseinket köszönöm, hanem barátságát is. Köszönettel tartozom Dr. Spät Andrásnak és Dr. Hunyady Lászlónak, hogy intézetvezetőként lehetővé tették és támogatták tudományos tevékenységemet. Hálával tartozom Dr. Szászi Katalinnak, hogy felfigyelt rám és tudományos diákköri hallgatónak hívott a Semmelweis Egyetem Élettani Intézetébe. Köszönettel tartozom Dr. Clifford Lowellnek, mert a laboratóriumában eltöltött hónapok alatt nagyon sok újat tanulhattam. Köszönöm Dr. Káldi Krisztinának és Dr. Geiszt Miklósnak minden segítségüket. Hálával tartozom tudományos diákköri hallgatóinknak, különösen Németh Tamásnak a közös munkáért és barátságáért. Szeretném megköszönni Makara Krisztinának, Horváthné Seres Erzsébetnek, Sütő Krisztinának és Fedina Editnek segítőkészségüket és lelkiismeretes asszisztensi munkájukat, ami kísérleteink sikerének fontos része volt. Köszönet illeti közvetlen munkatársaimat, Dr. Rada Balázst, Dr. Sirokmány Gábort, Dr. Patryk Moskwát, Dr. Lévay Magdolnát és Kertész Zsuzsannát segítő jelenlétükért és azért a vidám légkörért, amelyben az évek alatt velük dolgozhattam. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Élettani Intézet valamennyi munkatársának. Végezetül szeretném megköszönni a családomnak, hogy mindig mellettem álltak és támogattak. Hálával tartozom barátaimnak, akikkel mindig megoszthattam örömeimet és gondjaimat.

92