Doktori (Ph.D.) értekezés Készült: Semmelweis Egyetem, Farmakognózia Intézet, Budapest, 2003. Témavezeto: Prof. Dr. Szoke Éva László Imre Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata Össze foglaló A Datura innoxia Mill. (orvosi maszlag) számos, gyógyászati szempontból fontos hatóanyagot tartalmaz. A növényben több mint 30 tropán- és pirrolidinvázas alkaloidot azonosítottak, melyek együttesen 0,05% -0,5% mennyiségben fordulhatnak elo. Foalkaloidok a hioszciamin és szkopolamin, melyek paraszimpatolitikus hatásúak. Tanulmányoztuk az in vitro D. innoxia növények, valamint a felhasználásukkal nyert kallusz- és géntranszformált, ún. hairy root kultúrák növekedését, tropán alkaloid összetételét (MALDI-MS) és hioszciamin, szkopolamin, apoatropin tartalmát (HPLC). Az A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított hairy root kultúrák géntranszformált sajátságát PCR technikával és a termelt opinok kimutatásával igazoltuk. A vizsgált hairy root klónok (? 410, ? 411 és ? 415) alkaloid tartalma (0,23% hioszciamin és 0,21% szkopolamin) elérte az in vivo növény gyökerében mért értékeket. Eredményeink ugyanakkor azt jelzik, hogy a véletlenszeru bakteriális tDNS beépülés eredményeként kialakuló, eltéro genetikai felépítésu klónok hasonló növekedési jellemzoi mellett nagy mértéku eltéréseket észlelhetok a kultúrák speciális anyagcseréjében, alkaloid termelésében. A kultúrák növekedését és alkaloid tartalmát számos körülmény befolyásolhatja kedvezoen, így részletesebben vizsgáltuk a megvilágítás, továbbá az MS tápközeg szacharóz és Mg 2+ tartalmának hatását a géntranszformált szövetek fejlodésére, és tropán alkaloid tartalmára. A különbözo szövetkultúrákban lezajló apoptotikus folyamatokat TUNEL reakció alkalmazásával mutattuk ki. Abiogén stresszhatások és a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki – a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókat befolyásoló, – a tenyészetek tápközegébe különbözo koncentrációban adagolt vegyületek (dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin, vagy hidralazin, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm) hatásának vizsgálatát [1]. A kallusz- (4,6? g/g - 27,0? g/g) és hairy root kultúrák endogén HCHO tartalmát (345,0?g/g) MALDI-MS módszerrel mutattuk ki, valamint OPLC és HPLC technikák alkalmazásával határoztuk meg, formaldimedon formájában [2]. A dimedon és szemikarbazid alkalmazását követoen TUNEL reakció segítségével részletesebben tanulmányoztuk a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatását [3]. A 4 hetes géntranszformált gyökérkultúrákban (kontroll és dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt) nem tudtunk kimutatni apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat, továbbá DNS fragmentálódást, mely arra utal, hogy a hairy root szövetek fejlodése eltér a korábban vizsgált kultúrákétól. Eredményeinkkel hozzá kívánunk járulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez. 1. László, I., Szoke, É., Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 3. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33, 231-236.
1
Ph.D. Thesis Prepared under the guidance of Prof. Éva Szoke, D.Sc., in the Institute of Pharmacognosy, Semmelweis University, Budapest, 2003 Imre László Investigation on primary and secondary metabolism of Datura innoxia Mill. tissue cultures Summary Datura innoxia Mill. contains several secondary metabolites with pharmacological and toxicological importance, including more than 30 tropane- and pirrolidin-base alkaloids. Total amount of these alkaloids varies between 0.05%-0.5% in different organs of the plant. Main alkaloids are scopolamine and hyoscyamine which have parasympatholytic effect. The aim of our experiments was to study different – genetically modified and non-transformed – in vitro cultures of D. innoxia. The growth (fresh and dry weight, dry matter content, growth value and pH of liquid culture media) and tropane alkaloid content (scopolamine, hyoscyamine and apoatropine, using HPLC technique) of in vitro plants, callus tissues and genetically modified, so called hairy root cultures were investigated. The transferred character of hairy root tissues obtained by Agrobacterium rhizogenes A4 microinje ction was demonstrated by using polimerase chain reaction (PCR) and opine detection (paper electrophoresis). We have established that the total alkaloid content of hairy root clones (#410, #411 and #415, 0.23% hyoscyamine and 0.21% scopolamine) reached tha t of the root of the in vivo plants. Growth and alkaloid content of in vitro cultures has been effected by several circumstances. We studied the effects of culturing in light, the sucrose and Mg 2+ content of liquid MS basal medium on the growth, biomass production and tropane alkaloid content of the tissues. The presence of apoptotic processes in cells of different tissues (callus and root) accompanied with the shrinkage of the nuclei was investigated by TUNEL reaction. To study the relationship among abiotic stress, growth, alkaloid metabolism and measurable endogenous HCHO concentration different molecules affecting transmethylation reactions have been administered to the culture media (dimedone, semicarbazide, aminoguanidine and hidralazine, 1ppm1000ppm) of tissues [1]. The endogenous HCHO concentration of callus (4.6? g-27.0? g) and hairy root cultures (345.0? g) was determined by OPLC and HPLC techniques as formaldemethone [2]. Following administration of dimedone and semicarbazide the apoptotic processes were investigated by TUNEL reaction [3]. The results obtained might help deepening our knowledge about the growth of D. innoxia in vitro cultures, tropane alkaloid metabolism, apoptotic processes in plant cells and the effect of abiotic stress (special che mical stress). 1. László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 3. László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33, 231-236.
2
1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉS A növényi speciális anyagcsere termékei fontos alapanyagforrást jelentenek az élelmiszer-, kozmetikai- és gyógyszeripar számára. Ezek a vegyületek a legtöbbször csupán kis mennyiségben találhatók meg a növényekben, felépítésük pedig a legtöbbször bonyolult, így szintézis útján történo ipari méretu eloállításuk – néhány kivételtol eltekintve - nem megoldott. Az analitikai módszerek fejlodésével ugyanakkor egyre nagyobb számú növényi anyagcseretermék feltárására és megismerésére van lehetoség. A biotechnológiai módszerek és molekuláris biológiai ismeretek bovülésével párhuzamosan új lehetoségek nyíltak a növényi sejtek univerzális és speciális anyagcseréjének jobb megismerésére laboratóriumi körülmények között, így egyes sejt- és szövetkultúrák ma már reális lehetoséget nyújtanak bizonyos növényi vegyületek ipari méretu eloállításához is. Az in vitro fenntartott növényi sejtek és szövetek vizsgálata – hasonlóan a humán/állati sejt- és szövetkultúrákhoz – információt adhat egyes vegyületek univerzális és speciális anyagcserére, apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatásának jobb megértéséhez (pl. rákkelto hatás vizsgála ta). A növényi sejtekben, szövetekben lezajló programozott sejthalál (PCD) folyamatáról rendelkezésre álló, rohamosan bovülo ismeretanyag alapján feltételezheto, hogy - a humán/állati és növényi sejtek felépítésében lévo alapveto különbségek ellenére – egyes alapveto szabályozó folyamatok közösek maradtak az evolúció során. Vizsgálataink során Datura innoxa Mill. (orvosi maszlag) különbözo – genetikailag nem módosított és géntranszformált – szövetkultúráit használtuk fel. A növény – sok más speciális anyagcseretermék mellett – gyógyászati szempontból fontos tropánvázas alkaloidokat, többek között szkopolamint és hioszciamint tartalmaz. Mindkét vegyület paraszimpatolitikus hatású (pl. spazmolitikus, nyál és gyomornedv szekréciót csökkento, midriatikus hatás), így szélesköruen alkalmazzák oket a szemészetben, továbbá szívbetegségekben és gyomor-, bélrendszeri panaszok esetén. Munkánk során vizsgálni kívánjuk az in vitro D. innoxia növények felhasználásával nyert kallusz-, valamint géntranszformált gyökérkultúrák (ún. hairy root tenyészetek) növekedését és tropán alkaloid tartalmát. A kultúrák növekedését és alkaloid bioszintetizáló képességét számos körülmény befolyásolhatja kedvezoen, így tanulmányozni kívánjuk a megvilágítás, továbbá a tápközeg szacharóz (szénforrás) és Mg 2+ (makroelem) tartalmának hatását a szövetek fejlodésére, biomassza produkciójára, hioszciamin és szkopolamin tartalmára. A különbözo szövetkultúrák sejtjeiben lezajló, jellegzetes morfológiai változásokkal kísért apoptotikus folyamatokat is kiemelt figyelemmel kísérjük. Irodalmi adatok támasztják alá, hogy a különbözo humán, állati és növényi sejtek, szövetek mérheto mennyiségu endogén formaldehidet (HCHO) tartalmaznak, valamint a mérheto HCHO tartalom
3
szoros kapcsolatban áll a különbözo biogén és abiogén stresszhatásokkal. A D. innoxia kallusz és hairy root szövetek endogén HCHO tartalmát dimedon alkalmazásával tervezzük kimutatni és mérni, mely irreverzibilisen reagál a HCHO-el, és a keletkezo reakciótermék (formaldimedon) több analitikai módszerrel is kimutatható és mérheto. Abiogén stresszhatások, valamint a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki – a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókra alapveto hatást gyakorló – a tenyészetek tápközegébe adagolt vegyületek hatásának (pl. dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin) vizsgálatát. A dimedon és szemikarbazid adagolását követoen részletesebben kívánjuk tanulmányozni a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt esetleges hatását. Eredményeinkkel szeretnénk hozzájárulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez.
2. VIZSGÁLATI ANYAG ÉS MÓDSZER Biotechnológiai kísérleteink során alkalmazott in vitro kultúrák létrehozásához a Magyar Tudományos Akadémia Vácrátóti Botanikai Kutatóintézetébol származó, szabadföldön nevelt D. innoxia Mill. növények magjait használtuk fel. 2.1. D. innoxia in vitro növények létrehozása tenyésztése A D. innoxia magokat diocid oldattal sterilizáltuk, majd steril desztillált vízzel mostuk. A fényen végzett csíráztatás után, a csíranövényeket Ca-pantotenátot tartalmazó szilárd Murashige és Skoog (MS) táptalajra helyeztük és fényen neveltük. 2.2. Szövetkultúrák eloállítása és fenntartása ? A D. innoxia in vitro növények hajtásán spontán képzodött kalluszszöveteket izoláltuk és 3% szacharózt, valamint növényi növekedésszabályozó anyagokat tartalmazó, módosított szilárd MS tápközegen (AMS) tenyésztettük tovább sötétben és fényen (2500Lux, 12 óra/nap). ? Az S táptalajon tenyésztett D. innoxia növények szárát Agrobacterium rhizogenes A4 törzzsel fertoztük mikroinjektálással. Két héttel a fertozést követoen 26 hairy root klónt izoláltunk, melyeket cefotaxim és ampicillin tartalmú szilárd MS táptalajra helyeztünk baktériummentesítés céljából. Az antibiotikum mentes, szilárd MS tápközegen nevelt kultúrák közül növekedésük és alkaloid tartalmuk alapján 3 klónt (#410, #411 és #415) használtunk fel további vizsgálatok céljából, melyeket folyékony
4
MS táptalajon tenyésztettünk tovább rázatott lombikban (100rpm, 24?1o C) sötétben és fényen (2500Lux, 12 óra/nap). 2.3. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban ? D. innoxia in vitro növény és hairy root kultúrák vizsgálata PCR technikával A növényi DNS izoláláshoz a növényi mintákat folyékony nitrogénben (-196o C) porítottuk el. A DNS-t QIAshredder oszlopok (2ml, Qiagen) segítségével választottuk el és tisztítottuk. A PCR során képzodött DNS fragmentumokat agarózgél elektroforézis segítségével választottuk el, a kiértékelést UV fényben (?? 302nm) végeztük. ? A szövetek opin termelésének vizsgá lata papír elektroforézissel Az A. rhizogenes A4 fertozéssel nyert #410, #411, és #415 hairy root klónok opin szintézisét Petit módszere alapján mutattuk ki, papír elektroforézis segítségével. A transzformált növényi szövetekben kimutattuk az agropint és mannopint, valamint agropin - és mannopinsavat. 2.4. A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése A kultúrák növekedésének jellemzése során a következo paramétereket mértük és számítottuk ki: friss és szárazsúly, szárazanyag tartalom, növekedési érték. A hairy root kultúrák folyékony MS tápközegének pH meghatározását Radelkis Laboratory Digital pH Meter OP-211/1-es készülékkel végeztük (23? 1o C-on 20ml). 2.5. Az AMS és MS tápközegek összetételének módosítása ? Szacharóz és MgSO4 tartalom változtatása A folyékony MS tápközegben nevelt D. innoxia #410 hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg szacharóz tartalmának (0%, 1,0%, 2,0%, 3,0% és 6,0%) és MgSO 4 koncentrációjának (0 mg/l, 185 mg/l, 370 mg/l, 740 mg/l és 1480 mg/l) hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. ? Dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin alkalmazása A szilárd AMS tápközegen nevelt D. innoxia kallusz kultúrák esetében vizsgáltuk a tápközeg dimedon tartalmának, valamint a folyékony MS tápközegen nevelt #410 hairy root klón esetében a tápközeg dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin, vagy hidralazin tartalmának hatását a tenyészetek növekedésére, endogén HCHO koncentrációjára és tropán alkaloid tartalmára. A vegyületeket 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm mennyiségben alkalmaztuk. A kultúrákat sötétben és a dimedon, ill. szemikarbazid esetében fényen (2500Lux, 12 óra/nap) neveltük.
5
2.6. Tropán alkaloidok kimutatása és meghatározása ? Növényi szövetek hisztokémiai vizsgálata Dragendorff-reagens alkalmazásával Az alkaloidok gyökereken belüli lokalizációjának vizsgálata céljából in vitro D. innoxia növény gyökerét, valamint a #410 hairy root klónt használtuk fel. ? MALDI-MS módszer A tropán alkaloidok (hioszciamin és szkopolamin) kimutatására/azonosításra Finnigan LASERMAT 2000 készüléket alkalmaztunk. Mátrixként ? –ciano-4-hidroxi szinnapinsavat (ACH) alkalmaztunk. ? HPLC módszer A minták kivonását követoen a tisztítás szilárdfázisú extrakcióval történt (SUPELCO Supelclean LC18 SPE). A meghatározáshoz Surveyor moduláris HPLC rendszert használtunk (Thermo Finnigan, USA). Az elválasztást LUNA C18 fordított fázisú oszlopon végeztük (Phenomenex, USA), elotétoszlopot alkalmazva. Eluensként acetonitril : 30mM foszfát puffer (pH ? 6.00) : metanol elegyet használtunk (12 : 80,1 : 7,9 , v/v/v, 1,00 ml/perc). A csúcsok azonosítását autentikus standardok retenciós idejének és a megfelelo UV spektrumok adatainak alapján végeztük. A kvantitatív meghatározás ?? 210nm-en történt. 2.7. Endogén HCHO kimutatása és meghatározása ? MALDI-MS módszer A kimutatás formaldimedon formájában történt Finnigan LASERMAT 2000 készülékben. A frissen begyujtött szövetmintákat folyékony nitrogénben fagyasztottuk, porítottuk, majd 0,2 % metanolos dimedon oldatot adtunk hozzájuk (mátrix: ACH). A formaldimedo nt autentikus standard alkalmazásával azonosítottuk. ? OPLC eljárás A megfeleloen elokészített D. innoxia kallusz és hairy root mintákhoz adott 0,2 % metanolos dimedon oldat alkalmazását követoen képzodo formaldimedon elválasztása OPLC készülékkel (OPLC-NIT CO., Ltd., Budapest, Hungary) történt. Kifejleszto: kloroform – metilén-klorid (35:65, v/v). A kvalitatív és kvantitatív analízis denzitometriás (Shimadzu CS 930, Kyoto, Japan) értékelés alapján történt (? = 260nm). A formaldimedont autentikus standard retenciós idejének és UV spektrumának alapján azonosítottuk.
? HPLC módszer A meghatározáshoz használt HPLC készülék Gynkotec M 480 pumpából, TOSOH 6040 UV
6
detektorból és Rheodyne 8125 injektorból (20 ? l loop) állt. Az alkalmazott oszlop Chrompack ChromSpher C-18 (150 x 4,6 mm i.d., 5?m), a mobil fázis pedig CH3 OH : 0,01M HCl 76:24 (v/v) arányú elegye volt. A detektálás ? = 260nm-en történt. 2.8. TUNEL reakció alkalmazása az apoptotikus sejtek kimutatására A TUNEL reakciót Apop-Tag (Oncor, Gaithersburg, MD , USA) alkalmazásával végeztük. A kalluszszövetekben meghatároztuk az apoptotikus sejtmagok arányát (apoptotikus index, Ai). 2.9. A kísérleti eredmények statisztikai kiértékelése A párhuzamos mérések (n=7 és 20) eredményeit átlagoltuk. Az adatok statisztikai kiértékeléséhez kiszámítottuk a szórást és a megbízhatóságot (± SD, p<0,05), valamint T-próbát végeztünk.
3. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 3.1. D. innoxia IN VITRO KULTÚRÁK VIZSGÁLATA ? In vitro növénykultúrák A különbözo szövetkultúrák létrehozásához felhasznált, steril magokból eloállított és vegetatív mikroszaporítással fenntartott D. innoxia in vitro növénykultúrák jól fejlodtek a szilárd S - Capantotenátot és kazein -hidrolizátumot is tartalmazó MS - táptalajon. Az alkaloid tartalom vizsgálata során, a 8 hetes hajtásokban csupán az apoatropint sikerült mérheto mennyiségben kimutatni. Az azonos korú gyökerek ezzel szemben hioszciamint (3,0‰) és szkopolamint (1,04‰) is tartalmaztak mérheto mennyiségben, mely értékek azonban nem érték el az in vivo növényekben kapott adatokat (0,05%-0,5%). A D. innoxia in vitro kultúrák gyökereinek szövettani vizsgálata céljából metszeteket készítettünk a fiatal gyökerek felhasználásával, melyeket HE festést követoen vizsgáltuk. A hajtástól elválasztott és megfeleloen fixált, 8. hetes gyökereket használtuk fel, melyek szöveti felépítése a fiatal gyökerekre jellemzo képet mutatta. A D. innoxia in vitro növények gyökereiben, Dragendorff reagens alkalmazásával sikerült kimutatni alkaloidok ej lenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot. A csapadékkristályok – az irodalmi adatokkal összhangban - minden esetben a sejtfal közelében fordultak elo, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben. A TUNEL reakció elvégzését követoen sikerült szelektíven kimutatnunk az apoptotikus sejtmagokat, melyeket jellemzoen a rhizodermiszben, a hipodermiszben és a kéregparenchima külso sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok sejtjeiben találtunk.
7
? Kallusz tenyészetek Mind a sötétben, mind pedig a fényen nevelt szövetek egyenletesen fejlodtek a 6. hét végéig a kinetin és 2,4-D tartalmú szilárd AMS táptalajon, friss súlyuk mintegy 14-16-szorosára (szárazsúlyuk kb. ötszörösére) nott. A fényen tenyésztett kultúrák friss súlya már a második hét után meghaladta a sötétben nevelt szövetekét, mely eltérés egészen a vizsgált 6 hetes idotartam végéig megmaradt. A kalluszszövetek szövettani vizsgálata céljából készített metszeteket HE festést követoen vizsgáltuk. A sötétben és fényen tenyésztett szövetek között nem észleltünk morfológiai eltérést, a sejtek parenchimatikusak voltak, szöveti differenciálódás jeleit nem mutatták. Kisebb sejtekbol álló, jól festodo sejtmagokat tartalmazó sejtcsoportok minden metszetben megfigyelhetok voltak. A HE festést követoen észlelt, jellegzetesen zsugorodott sejtmagok a TUNEL reakció elvégzése után szelektíven festodtek, mely igazolta az apoptotikus folyamatok lezajlását ezekben a sejtekben. A TUNEL pozitív sejtmagok száma a tenyészet felszínéhez közeli 10-20 sejtrétegben magasabb volt (a sejteknek akár 30%-a), míg arányuk a mélyebben található sejtrétegek felé haladva gyorsan csökkent. ? Géntranszformált gyökérkultúrák A D. innoxia in vitro növények hajtásának A. rhizogenes A4 törzzsel történt fertozését követoen számos hairy root klónt állítottunk elo. A szövetek géntranszformált sajátságai, fejlodése és alkaloid tartalma szempontjából 3 klónt (? 410, ? 411 és ? 415) vizsgáltunk részletesebben. A bakteriális DNS állomány (tDNS) meghatározott szakaszának (rolB gén bizonyos szekvenciáinak) D. innoxia ? 410 hairy root klón szöveteinek sejtjeiben történo kimutatására PCR technikát alkalmaztunk. A tDNS növényi sejtben történo muködését a transzformált növényi sejtekben termelt és az Agrobacterium-ok által felhasznált speciális anyagcseretermékek, az ún. opinok kimutatásával bizonyítottuk. Papír elektroforézist követoen mindhárom hairy root klónban (? 410, ? 411 és ? 415) kimutattunk opin molekulákat. A ? 410 és ? 411 klónok agropint (Rf = 0,56) és agropinsavat (Rf = 0,25), továbbá az azonos Rf értékekkel jelentkezo mannopint és mannopinsavat (Rf = 0,46) egyaránt tartalmaztak, a ? 415 klón szöveteiben azonban kiemelten az agropinsavat sikerült kimutatni, mely opinok mindegyike jellemzo az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozött növényi szövetekre. Fenti módszerekkel egyértelmuen bizonyítottuk, hogy a vizsgált hairy root klónok bakteriális géneket tartalmaznak, melyek az opinok termelése révén megfeleloen muködnek a D. innoxia sejtekben. A szövetek fejlodését összefoglalva megállapítottuk, hogy a D. innoxia ? 410, ? 411 és ? 415 hairy root klónok fejlodése nem tért el jelentosen egymástól. A fényen nevelt szövetek esetében – különösen a 3. hetet követoen – magasabb friss súlyokat mértünk, mely kisebb szárazanyag tartalommal párosult, a táptalajok pH értéke pedig már az átoltást követo 1. héttol felülmúlta a sötétben nevelt szöveteknél kapott adatokat.
8
A hairy root klónok tropán alkaloid (hioszciamin, szkopolamin és apoatropin) tartalmának vizsgálata azt mutatta, hogy a különbözo klónok között – a szövetek fejlodésével ellentétben - jelentos eltérések észlelhetok. A ? 410 klón hioszcaimin foalkaloidot tartalmaz, melybol a 4 hetes szövetekben mértünk a legnagyobb mennyiségben, sötétben (0,20%, szárazsúlyra vonatkoztatva-) és fényen (0,21%) egyaránt. A legnagyobb szkopolamin tartalom 0,16% illetve 0,17% volt sötétben és fényen, az apoatropin tartalom jelentosen kisebb volt (általában 0,01-0,02%). Az elvégzett mérések azt mutatták, hogy a ? 411 klón kisebb hioszciamin tartalommal rendelkezik sötétben (0,11%) és fényen (0,01%) egyaránt, ezek az értékek azonban a sötétben nevelt szövetek esetében a ? 410 klónban mérthez hasonló szkopolamin tartalommal párosultak. A fényen nevelt kultúrák is a hioszciaminnál nagyobb mennyiségu szkopolamint tartalmaztak (a 2. héten 0,12%) egészen az alkaloid tartalom 6. hétre mért csökkenéséig, így eredményeink azt igazolták, hogy a ? 411 klón szkopolamin foalkaloidos. A ? 410 klónhoz hasonlóan hioszciamin foalkaloidos ? 415 klón esetében jelentosen eltért a sötétben és fényen nevelt szövetek alkaloid tartalmának alakulása. A legnagyobb hioszciamin (0,23%) és szkopolamin tartalmat (0,13%) a 6. héten mértük sötétben. A fényen nevelt kultúrákban a 3. és 5. héten mértünk nagyobb hioszciamin (0,18-0,19%) és szkopolamin (0,11%) tartalmat. Az alkaloid produkciós értékek azt mutatták, hogy a fényen nevelt kultúrák – nagyobb biomassza produkciójuk révén – a sötétben tenyésztett szövetekhez hasonló, vagy kisebb alkaloid tartalmuk ellenére nagyobb mennyiségu tropán alkaloidot képesek eloállítani. A legnagyobb hioszciamin és szkopolamin produkciót sötétben a ? 415 klón 6 hetes szöveteiben (0,63mg és 0,37mg/kultúra), míg fényen a ? 410 klón 3 és 4 hetes kultúráiban kaptuk (3 hét után 0,60mg szkopolamin, valamint 4 hét után 0,77mg hioszciamin/kultúra). A vizsgált D. innoxia hairy root klónok (? 410, ? 411 és ? 415) alkaloid tartalmát és produkciós értékeit figyelembe véve megállapítottuk, hogy a ? 410 és ? 415 klónok hioszciamin, míg a ? 411 klón szkopolamin foalkaloidot tartalmaz. Eredményeink azt jelzik, hogy a véletlenszeru bakteriális tDNS beépülés eredményeként kialakuló, eltéro genetikai felépítésu klónok hasonló növekedési jellemzoi (pl. friss súly, szárazanyag tartalom) mellett nagy mértéku eltéréseket észlelhetok a kultúrák speciális anyagcseréjében, alkaloid termelésében. Bár a sötétben nevelt szövetek közül a ? 415 klón hioszciamin és szkopolamin tartalma volt a legnagyobb, a fényen kapott eredmények, továbbá az egyenletesebb alkaloid termelés alapján a ? 410 klónt választottuk további kísérleteinkhez. A 4 hetes D. innoxia ? 410 hairy root klón szöveteibol készült metszetek HE festést követo mikroszkópos vizsgálata során – az in vitro növények gyökereihez hasonlóan – a fiatal gyökerekre jellemzo szöveti felépítést figyeltük meg. A sötétben és a fényen nevelt szövetek között – a HE festés elvégzését követoen – nem tudtunk morfológiai különbségeket kimutatni. A szövetekben,
9
Dragendorff reagens alkalmazását követoen sikerült kimutatni csapadékkristályokat, melyek elhelyezkedése megegyezett a D. innoxia in vitro növény gyökereinél leírtakkal. 3.2. A TÁPKÖZEG ÖSSZETEVOINEK HATÁSA A HAIRY ROOT TENYÉSZETEKRE ? Szacharóz hatása Az általunk részletesebben vizsgált 4 hetes D. innoxia ? 410 hairy root klón szöveteit sötétben tenyésztettük 0-6% szacharózt tartalmaz folyékony MS tápközegen. A szövetek friss súlya 1-2% szacharóz, míg szárazsúlya 2-6% szacharóz hatására volt magasabb. A tenyészetek szárazanyag tartalma egyértelmuen az általunk alkalmazott legmagasabb, 6%-os szacharóz tartalom mellett érte el a maximumát, mely a tápközeg hipertóniás viszonyaira és vízelvonó hatására utalhat. Legnagyobb növekedési értéket a magas friss és szárazsúllyal rendelkezo, az MS alaptáptalajnak megfelelo 2% -os szacharóz tartalom melle tt kaptuk. A hioszciamin és szkopolamin tartalom (0,18% hioszciamin és 0,16% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva), valamint produkció szempontjából 2-3% szacharóz bizonyult optimálisnak az általunk vizsgált 3 tropán alkaloid (hioszciamin, szkopolamin és apoatropin) egymáshoz viszonyított mennyiségét azonban nem befolyásolta jelentosen egyik vizsgált cukortartalom sem. ? MgSO4 hatása Kísérleteink során sötétben és fényen egyaránt vizsgáltuk, hogy a 2% szacharózt tartalmazó folyékony MS alaptápközeg Mg2+ tartalma milyen hatással van a 4 hetes D. innoxia ? 410 hairy root klón fejlodésére és alkaloid termelésére. A legnagyobb friss súlyt sötétben az alaptápközegnek megfelelo 370mg/l, míg fényen a 740mg/l MgSO 4 tartalom mellett mértük. A szárazanyag tartalom mindkét esetben a legkisebb friss súllyal rendelkezo, 185mg/l MgSO 4 tartalmú táptalajon nevelt szövetek esetében volt a legnagyobb. A növekedési értékek 370mg/l MgSO4 tartalom mellett érték el a maximális értékeket sötétben és fényen egyaránt. Annak ellenére, hogy a szövetek fejlodése nem tért el jelentosen, a sötétben és fényen fenntartott kultúrák alkaloid tartalmának és produkciójának optimuma egyértelmuen eltért egymástól. Míg sötétben a 370mg/l MgSO4 bizonyult optimálisnak (0,054% hioszciamin és 0,049% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva), fényen a 740mg/l MgSO4 tartalmú táptalajon fejlodo szövetek alkaloid tartalma (0,062% hioszciamin és 0,060% szkopolamin szárazsúlyra vonatkoztatva) és produkciós értékei voltak a legmagasabbak. Bár a tenyészetek fejlodése (friss és szárazsúlyok, NÉ) nem tért el szignifikánsan sötétben és fényen, az alkaloid tartalom és produkció alakulása szempontjából elonyösebbnek bizonyult a fényen történo tenyésztés.
10
3.3. ABIOGÉN STRESSZ HATÁSA A KALLUSZ ÉS HAIRY ROOT KULTÚRÁKRA Az endogén HCHO transzmetilezési és oxidációs/redukciós reakciókban játszott alapveto szerepének, illetve a növényi sejtek univerzális és speciális anyagcseréjében betöltött funkcióinak jobb megismerése céljából több, az endogén HCHO tartalomra és azon keresztül a sejtek/szövetek anyagcseréjére (pl. szövetek fejlodése, öregedése, tropán alkaloid termelése) potenciálisan hatással bíró vegyületet vizsgáltunk meg. A vegyületeket – kontroll szövetek alkalmazása mellett – nagyobb koncentráció tartományban: 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm mennyiségben adagoltuk a kultúrák szilárd, vagy folyékony tápközegébe. ? Dimedon hatása a kalluszkultúrákra A dimedont - mely a HCHO-el történo irreverzibilis reakciója révén jól alkalmazható az endogén HCHO kimutatására és meghatározására - növekvo mennyiségben adagoltuk sötétben és fényen nevelt D. innoxia kalluszszövetek szilárd AMS tápközegébe a vegyület in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt – endogén HCHO elvonáson alapuló – hatásának tanulmányozása céljából. A szöveteket 2, 4 és 6 hét után vizsgáltuk. Az 1ppm, 10ppm és 100ppm dimedon tartalom mellett a kultúrák friss súlya elérte, vagy kis mértékben meghaladta a kontroll szövetek megfelelo értékeit, 1000ppm hatására azonban jelentosen csökkenést észleltünk. Nem észleltünk eltérést a sötétben és fényen nevelt szövetek friss súlyának alakulása között, a 6 hetes, sötétben, 1000ppm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek friss súlya azonban – a fényen tenyésztett szövetekkel ellentétben - csaknem elérték a megfelelo korú kontroll értékét. A szövetek növekedésével összhangban 1ppm-100ppm dimedon tartalom mellet a kontrollnak megfelelo, vagy kissé alacsonyabb volt a szövetek szárazanyag tartalma, 1000ppm mellett azonban – a 6 hetes sötétben tartott szövetek kivételével - jelentos szárazanyag tartalom növekedést (20-80%) észleltünk. A növekedési értékek 10ppm dimedon alkalmazása mellett haladták meg legjobban a kontroll értékeket (50-200%-al) sötétben és fényen egyaránt. A formaldimedon adduktum formájában történt mérés eredmé nyei alapján a vizsgált D. innoxia kalluszszövetek 4,6?g/g - 27,0?g/g mennyiségben tartalmaztak mérheto endogén HCHO-et. Dimedon kezelés, különösen 10ppm és 100ppm hatására csökkent az endogén HCHO mennyisége. 1000ppm hatására nagyobb értékeket kaptunk, me lyek a sötétben, különösen pedig a fényen nevelt 4 hetes szövetekben meg is haladták a kontroll tenyészetekben kapott eredményeket, a 6. hétre azonban közel 60-70%-al csökkent a mérheto HCHO mennyisége. A fényen nevelt szövetekben minden esetben szignifikánsan nagyobb endogén HCHO koncentrációkat mértünk. A HE festés elvégzését követoen megállapítottuk, hogy kallusz kultúrák tápközegébe adagolt dimedon nem befolyásolta a szöveti szerkezetet, jellegzetes hatást gyakorolt azonban az apoptotikus
11
sejtek számára. A TUNEL reakció elvégzése után meghatározott Ai értéke nott az alkalmazott dimedon mennyiségével párhuzamosan, de 1000ppm dimedon tartalom mellett csaknem teljesen megszunt a DNS fragmentálódás, különösen a fényen nevelt szövetek esetében. Megfigyeltük, hogy a fényen nevelt szövetekben – 10ppm dimedon tartalom kivételével – minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett jelentosen kevesebb apoptotikus sejtmag volt kimutatható. ? Dimedon hatása a hiry root tenyészetekre A sötétben és fényen nevelt D. innoxia ? 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe adagolt dimedon, 4 hetet követoen 1ppm, 10ppm és 100ppm alkalmazása mellett 30-40%-al csökkentette a szövetek friss súlyát. 1000ppm dimedon hatására jelentosen, a kontroll értékének 15-20%-ra csökkentek a mért friss súlyok. A tenyészetek szárazanyag tartalma – a sötétben 100ppm dimedont tartalmazó MS táptalajon nevelt szövetek kivételével - szintén csökkent a dimedon koncentráció emelésével sötétben és fényen. A számított növekedési értékek már 1ppm dimedon hatására is jelentosen, 60-75%-al csökkentek. 10ppm és 100ppm további kis mértéku csökkenést, 1000ppm azonban a növekedés teljes leállását idézte elo. A tápközegek pH értékének meghatározását követoen azt tapasztaltuk, hogy fényen – hasonlóan a klónok MS alaptáptalajon történt fejlodésének vizsgálata során észleltekhez – magasabb pH értékeket kaptunk mind a kontroll, mind pedig a dimedonnal kezelt szöveteknél. A táptalaj pH értékek ugyanakkor a dimedon tartalom emelkedésével összhangban egyre alacsonyabbak voltak, annak ellenére, hogy a kezdeti pH minden esetben pH 5,7-re került beállításra. A 4 hetes, sötétben nevelt kultúrák hioszcaimin és apoatropin tartalma fokozatosan csökkent a dimedon koncentráció emelésével, a szkopolamin mennyisége azonban 1ppm és 10ppm dimedon hatására jelentosen, mintegy 150-180% -al megnott. Fényen 10ppm és 100ppm dimedon idézett elo kisebb mértéku hioszciamin, illetve szkopolamin tartalom emelkedést, mely azonban nem haladta meg a kontroll értékeit. 1000ppm dimedon adagolását követoen a vizsgát tropán alkaloidok termelése gyakorlatilag leállt. Az alkaloid produkciós eredmények egységesebb képet mutattak, mivel sötétben és fényen egyaránt jelentosen, 45-85%-al csökkentek a produkciós értékek már 1ppm dimedon hatására is. 10ppm további csökkenést, 100ppm azonban kisebb arányú emelkedést idézett elo, 1000ppm mellett a szövetek már nem termeltek alkaloidokat. A fényen nevelt szövetek esetében elvégzett endogén HCHO tartalom meghatározásának eredményei azt mutatták, hogy a hairy root szö vetek a kallusz tenyészeteknél egy nagyságrenddel nagyobb mennyiségben (kontroll szövetekben 345,0? g/g) tartalmaznak mérheto HCHO-et, melyben szerepe lehet a hairy root szövetek komplexebb anyagcseréjének, vagy géntranszformált sajátságainak is.
12
? Szemikarbazid alkalmazása A sötétben és fényen nevelt D. innoxia ? 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe adagolt 1ppm szemikarbazid – mely reverzibilis reakcióba léphet a jelenlévo HCHO molekulákkal –, 4 hét után jelentos friss súly gyarapodást eredményezett, mely a kontroll értékeket 80-100%-al múlta felül. Nagyobb tápközeg szemikarbazid tartalom hatására (10ppm, 100ppm és 1000ppm) a friss súlyok hirtelen csökkentek. A kapott eredményekkel összhangban a szövetek szárazanyag tartalma 1ppm szemikarbazid hatására csökkent, majd a friss súlyok csökkenésével párhuzamosan nott. Az 1000ppm szemikarbazid tartalmú MS tápközegen fejlodött szövetek szárazanyag tartalma azonban ismét, az 1ppm mellett kapott értékekhez hasonló szintre csökkent. A 4 hetes hairy root kultúrák növekedési értékei – eltéroen a dimedon kezeléstol - jelentosen megnottek 1ppm szemikarbazid alkalmazása után, 10ppm és 100ppm hatására azonban hirtelen csökkent, majd 1000ppm mellett teljesen leállt a szövetek növekedése. A szemikarbazid alkalmazása során fényen – a korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan – magasabb tápközeg pH értékeket kaptunk. 1ppm és 10ppm hatására pH emelkedést mértünk, majd 100ppm és 1000ppm alkalmazása után fokozatosan a kontroll értékek alá csökkent a tápközegek pH-ja. A szövetek tropán alkaloid tartalma fokozatosan csökkent az alkalmazott szemikarbazid mennyiségének növekedésével, csupán a sötétben, 10ppm és 100ppm hatására nott meg kissé a hioszciamin és szkopolamin mennyisége. 1000ppm szemikarbazid mellett – a dimedon alkalmazásánál megfigyeltekhez hasonlóan – mellett sötétben és fényen sem tudtunk a kultúrákban tropán alkaloidokat mérheto mennyiségben kimutatni. Az alkaloid produkciós értékek egyik esetben sem haladták meg a kontroll tenyészetekben kapott értékeket, egyenletes csökkenést mutattak 1000ppm szemikarbazid alkalmazásáig, mely már teljes tropán alkaloid produkció gátlást idézett elo. A fényen nevelt szövetek endogén HCHO tartalma egyenletesen csökkent a kontroll tenyészetekben mért 345,0? g/g-tól a 100ppm szemikarbaziddal kezelt szövetekben meghatározott 286,4? g/g értékig, azonban a dimedonnal kezelt kultúrákhoz hasonlóan, 1000ppm adagolását követoen, a szövetek rossz növekedése következtében nem állt rendelkezésünkre elég minta a mérések elvégzéséhez. ? A dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt hairy root kultúrák szövettani vizsgálata A HE festést követoen megállapítottuk, hogy a szövetek morfológiailag – a sejtmagok jelenlétét kivéve – nem különböztek a dimedon és szemikarbazid mentes folyékony MS alaptápközegen nevelt hairy root-ok felépítésétol sem a sötétben, sem pedig a fényen történt tenyésztés után. A sötétben és fényen nevelt hairy root szövetek között – hasonlóan a szövettani felépítéshez – az alkaloidok lokalizációja tekintetében sem sikerült különbségeket észlelnünk. A vizsgált szövetek csaknem mindegyikében sikerült alkaloidokat kimutatni, csupán az 1000ppm dimedont és 1000ppm
13
szemikarbazidot tartalmazó táptalajon nevelt szövetekben nem észleltünk Dragendorff pozitív reakciót, mely összhangban volt az alkaloid tartalom meghatározásánál kapott eredményekkel. A TUNEL reakció eredménye igazolta, hogy sem az MS alaptáptalajon nevelt kultúrákban, sem pedig a dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt szövetekben nem lehet apoptotikus sejtmagokat kimutatni. ? Aminoguanidin hatása A hidrazin származék aminoguanidint sötétben nevelt D. innoxia ? 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe adagoltuk a vegyület növekedésre és tropán alkaloid termelésre gyakorolt hatásának vizsgálata céljából. A molekula erosen elektrofil reagens, képes reagálni a sejtekben kötött formában jelenlévo HCHO-el. Eredményeink azt mutatták, hogy a növekedési értékek 1ppm és 10ppm aminoguanidin alkalmazását követoen jelentosen, 70% és 46% -al múlták felül a kontroll tenyészetek esetében kapott értéket, majd 100ppm és 1000ppm adagolását követoen fokozatosan csökkentek. Utóbbi esetben a szövetek növekedése gyakorlatilag teljesen leállt. Az alkaloid tartalom alakulása is érdekes képet mutatott. A legnagyobb hioszciamin (0,17%), szkopolamin (0,13%) és apoatropin tartalmat (0,02%) 10ppm és 100ppm aminoguanidin alkalmazása mellett mértük, mely mintegy duplája -háromszorosa volt a kontroll szövetekben mért értékeknek. A legnagyobb alkaloid produkciós eredményeket – a tartalmi adatoknak megfeleloen – 10ppm és 100ppm aminoguanidin adagolását követoen kaptuk. A 10ppm és 100ppm aminoguanidin alkalmazását követo jelentos tropán alkaloid tartalom és produkció növekedés felveti annak lehetoségét, hogy a folyamat specifikus hatások, így pl. a génaktivitás DNS metilezésen keresztül történt megváltozásának eredménye. ? Hidralazin hatása A hidralazint sötétben nevelt D. innoxia ? 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe adagoltuk a vegyület növekedésre és tropán alkaloid termelésre gyakorolt hatásainak vizsgálata céljából. A hidralazin – az aminoguanidinhez hasonlóan – hidrazin származék, mely erosen nukleofil sajátsága révén szintén képes reagálni a sejtekben kötött formában jelenlévo HCHO-el. A szövetek fejlodése, a növekedési értékek alakulása az minoguanidin alkalmazásához hasonlóan alakult, ebben az esetben azonban csupán az 1ppm hidralazin idézett elo a kontrollnál nagyobb – azonban nem szignifikáns mértéku – növekedési érték gyarapodást. 10ppm, 100ppm és 1000ppm alkalmazása után gyorsan csökkentek a növekedési értékek, 1000ppm hatására pedig a hidralazin esetében is leállt a szövetek fejlodése.
14
A szövetek fejlodését negatív módon befolyásoló 10ppm és 100ppm hidralazin kezelés a kultúrák tropán alkaloid termelését egyértelmuen elosegítette. A legnagyobb hioszciamin (0,24%), szkopolamin (0,14%) és apoatropin tartalmat (0,03%) 10ppm adagolását követoen mértük, mely értékek átlagosan 135% -al haladták meg a kontrollban mért alkaloid tartalmat, de 100ppm adagolását követoen is a kontrollnál mintegy 100%-al magasabb értékeket mértünk. Ezek a hidralazin kezelések – az alkaloid tartalom emelése mellett – drámai alkaloid produkció növekedést eredményeztek, mely értékek a hioszciamin esetében közel 6-7-szeresen múlták felül a kontroll adatokat. 1000ppm hidralazin hatására nem tudtunk a szövetekben mérheto mennyiségben hioszciamint, szkopolamint, vagy apoatropint kimutatni.
Összefoglalva eredményeinket megállapítható, hogy az általunk létrehozott D. innoxia in vitro kultúrák (növény, kallusz és ún. hairy root tenyészetek) mindegyike jól fejlodik, tropán alkaloidokat azonban csupán a géntranszformált gyökérkultúrák szintetizálnak nagyobb mennyiségben (0,23% hioszciamin és 0,21% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva), mely elérte az in vivo D. innoxia növények gyökereiben mért értékeket. A tenyésztési körülmények (pl. fényen történo tenyésztés), a táptalaj összetételének (pl. szacharóz és MgSO4 tartalom) módosítása ugyanakkor további ígéretes lehetoségeket kínál a hioszciamin foalkaloidos ? 410 és ? 415 klónok és a szkopolamin foalkaloidos ? 411 klón alkaloid termelésének további, jelentos fokozására is. Az abiogén stresszhatások (dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin alkalmazása) részletes vizsgálata azt mutatta, hogy a szövetek fejlodése, mérheto endogén HCHO tartalma és tropán alkaloid termelése jelentos mértékben megváltozhat. A vegyületeket kisebb mennyiségben felhasználva (általában 1-100ppm) több esetben a biomassza produkció, vagy a tropán alkaloid termelés nagy arányú növekedését észleltük, mely felveti specifikus hatások (pl. génexpressiós változások) lehetoségét. Nagyobb mennyiségek (1000ppm) azonban már jelentos növekedés gátlást és alkaloid tartalom csökkenést okoztak. Az általunk vizsgált in vitro szövetek felépítése megfelelt az irodalomban leírtaknak. Megállapítottuk, hogy a különbözo tenyésztési körülmények (sötét, fény, különbözo abiogén stresszhatások) nem voltak hatással a szövetek felépítésére. A D. innoxia kalluszszövetekben, valamint az in vitro növények gyökereiben elvégzett TUNEL reakcióval sikerült kimutatni az apoptózisra jellemzo DNS fragmentálódást. A 4 hetes D. innoxia ? 410 hairy root klón szöveteiben (kontroll és dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt kultúrákban) nem tudtunk kimutatni apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat, továbbá DNS fragmentálódást, mely arra utal, hogy a hairy root szövetek fejlodése eltér a korábban vizsgált kultúrákétól.
15
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZÕ SAJÁT KÖZLEM ÉNYEK Folyóiratban megjelent cikk: 1, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2, Kiss, A.S., Galbács, Z., László, I., Szoke, É., Galbács, G. (1998) A deutériumtartalom változásának biológiai, biokémiai hatásai. Múzeumi füzetek, az Erdélyi Múzeum-Egyesület Természettudományi és Matematikai Szakosztályának közleményei, 7, 72-76. 3, László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Albert, L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. Acta Biologica Hungarica, 49 (2-4), 247-252. 4, Szende, B., Tyihák, E., Trézl, L., Szoke, É., László, I., Kátay, Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Formaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. Acta Biologic a Hungarica, 49 (2-4), 323-330. 5, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33 (3), 231-236. 6, László I., Szoke, É. (2002): Biotechnológiai módszerek alkalmazása terápiás szempontból fontos, növényi eredetu hatóanyagok eloállítására. Képzés egy életen át, II/10, 10-16. 7, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 8, Hank, H., László I., Bálványos, I. and Tóth, E. (2003) : Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy root cultures. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, 271-274.
Folyóiratban megjelent absztrakt: 1, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. Magnesium Research, 11, 236-237.
Könyvfejezetek: 1, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. In: Magnesium: Current Status and New Developments (Theophanides, T. and Anastassopoulou, J. editors) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 81-84. 2, László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Kursinszki, L., Albert, L., and Tyihák, E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. In: Magnesium: Magnesium and Interaction of Magnesium with Trace Elements (Kiss, A.S. editor) Hungarian Chemical Society, Budapest, Hungary, 353-357.
16
3, Szoke, É., László, I., Liszt, K. (2001) A mákalkaloidok képzodése szövettenyészetekben (a mák alkaloidjainak in vitro bioszintézise). In: Magyarország Kultúrflórája, A mák (Papaver somniferum L.). (Sárkány, S., Bernáth, J., Tétényi, P. editors) Akadémiai Kiadó, Budapest, 135154.
Eloadások jegyzéke nemzetközi és hazai konferenciákon (eloadás/poszter): 1, Szoke, É., Lemberkovics, É. and László, I. (1995) Bioactive Compounds of Chamomile Hairy Root Cultures. 43rd Ann. Congr. on Med. Plant Res. Abstracts, p. 40. Halle (Germany). 2, Szoke, É., Lemberkovics, É., Troilina, J. and László, I. (1995) Essential Oil Formation in Chamomile Hairy Root Cultures. 26th International Symposium on Essential Oils, Abstracts, p. 52. Hamburg (Germany). 3, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. VIII. International Symposium on Magnesium, Book of Abstracts. p. 26. Heraklion, Crete (Greece). 4, László, I. and Szoke, É. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. Stress of Life, International Congress of Stress, Abstracts, p. 186. Budapest. 5, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) The Effect of Abiotis Stresses on Formaldehyde Level in Datura innoxia Mill Tissue Culture. Second International Symposium on Natural Drugs, Abstracts p. 144. Maratea (Italy). 6, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. VI. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 38. Budapest. 7, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Tropánvázas alkaloidok vizsgálata genetikailag módosított növényi szövettenyészetekben. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpozium, Abstracts p. 23. Mátraháza. 8, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. 6th European Magnesium Congress, Book of Abstracts p. 79. Budapest. 9, László I., Szoke É., Tyihák E. (1998) Abiotikus stresszkörülmények hatása Datura innoxia Mill. szövettenyészetek formaldehid tartalmára. Pécsi Fitoterápiás Napok, Abstracts p. 30. Pécs. 10, Szende B., Tyihák E., Trézl L., Szoke É., László I., Kátay Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Foemaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 18. Budapest. 11, László I., Szoke É., Németh Zs., Albert L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 26. Budapest.
17
12, László I., Szoke É., Tyihák E., Kursinszki L., Németh Zs., Albert L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. 46th Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Abstracts C30 Vienna (Austria). 13, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Kursinszki, L., Németh, Zs., Albert, L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. VII. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 31. Budapest. 14, László I., Szoke É., Tyihák E. and Szende B. (1999) Programozott sejt halál vizsgálata növényi szövettenyészetek sejtjeiben. SOTE PhD Tudományos Napok '99 Abstracts p. 44-45. Budapest. 15, László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (1999) Programmed cell death in plant tissue cultures cultivated in light and in dark. 2000 Years of Natural Products Research, Joint Meeting of: American Society of Pharmacognosy, Association Francaise pour l‘Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie, Gesellschaft für Arzneipflanzenforschung and Phytochemical Society of Europe, Book of Abstracts P 325 Amsterdam (The Netherlands). 16, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. X. Symposium of Plant Anatomy in Hungary, Programme and Abstracts of Papers pp. 98-99. Debrecen. 17, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Sze nde, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. Gyógyszerészek Országos Kongresszusa IX., Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI., Programme and Abstracts p. 66. Siófok. 18, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2000) Biochemical and morphological investigation of Datura innoxia Mill. tissue cultures. 1st International Colloquium “Health, Environment and Natural Substances”, Programme and Abstracts of Papers p. 80. Metz (France). 19, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Szende, B., Tyihák, E. (2000) Investigation of genetically modified and non-transformed Datura innoxia tissue cultures. The 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Final Program p. 15. Budapest. 20, László, I., Szoke, É., Szende, B. (2000) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of D. innoxia tissue cultures. 5th International, Jubilee Conference on Role of Formaldehyde in Biological Systems, Scientific Program and Abstracts p. 7. Sopron. 21, László, I., Kursinszki, L., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Datura innoxia Mill. szövettenyészetek biokémiai és morfológiai vizsgálata. Dr. Mozsonyi Sándor Alapítvány emlékülése Díjkiosztása és Tudományos Ülése, Program p.8. Budapest. 22, Bálványos, I., László, I., Vida, K., Hank, H., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (2001) Effect of magnesium on the genetically modified Atropa belladonna cultures. 7th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp. 13-14. Siófok. 23, Kiss, A.S., László, I., Stefanovits-Bányi, É., Galbávs, Z., Szoke, É. (2001) Effect of magnesium on the growth of of plant tumors cultivated on culture media with reduced deuterium content. 7th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp. 24-25. Siófok.
18
24, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of plant tissue cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 164. Budapest. 25, Kursinszki, L., László, I., Albert, L., Németh, Zs., Szoke, É. (2001) Determination of tropane alkaloids in plant samples using extrelut column and high-performance liquid chromatography. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 170. Budapest. 26, Hank, H., Vida, K., László, I., Bálványos, I., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (2001) Investigation on the tropane alkalid production of genetically modified Atropa belladonna L. in vitro cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 265. Budapest. 27, Hank H., László I., Bálványos I., Kursinszki L., Vida K., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Influence of culturing conditions on the primary and secondary metabolism of genetically modified Atropa belladonna L. tissues. PhD Tudományos Napok, P 34, Budapest. 28, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures, P 29. The IIIrd Romanian Magnesium Symposium With International Participation, Iasi (Romania). 29, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures. Medical plant research and utilization 2002, Program and Book of Abstracts p. 92. Kecskemét.
19
